CN111856737A - 一种双光子光场计算显微物镜 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双光子光场计算显微物镜，为配合扫描激发***，采用了反向设计思路，包括沿光轴依次布置的扩束镜组BE、二向色镜D、水镜O和介质W；该物镜是激发孔径与收集孔径非对称结构，采用了分孔径设计，以小数值孔径激发荧光，大数值孔径收集能量，在达到近衍射极限分辨率的同时大大降低光学设计与制造压力；所述扩束镜组BE包括聚焦镜组G1和准直镜组G2，用于将入射平行光一次聚焦再扩束准直，所述二向色镜D用于将激发光与被激发荧光分到各自光路中，所述水镜O包括类扩束镜组G3和聚焦镜组G4，将入射光进行扩束后再聚焦成像，提高成像质量,所述介质W用于增大数值孔径；据此所得物镜与同等视场传统物镜相比有更高的分辨率。

Description

一种双光子光场计算显微物镜

技术领域

本发明属于光学领域，尤其涉及一种双光子光场计算显微物镜。

背景技术

肿瘤治疗方法的进一步突破需要从细胞群组层面理解细胞微环境中发生的免疫过程，这就需要成像仪器能够进行较大视野的高分辨三维成像。目前已有的显微镜因空间带宽积受限，导致视场-分辨率“此消彼长”，在追求高分辨率的前提下，视场范围难以提高；双光子激发中，可通过提高物镜数值孔径达到提高分辨率的目的，但这是以损失穿透深度为代价的；此外，传统的“激发-成像”共用物镜机制需要小数值孔径提高穿透深度，但需要大数值孔径提高成像分辨率，存在不可调和的矛盾。总之，现有物镜在大视场、穿透深度和高分辨率指标上存在相互制约，不能同时兼顾，无法满足生命科学的研究需要，亟待改进与突破。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种双光子光场计算显微物镜，以解决现有物镜在大视场、穿透深度和高分辨率指标上存在相互制约，不能同时兼顾的问题。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种双光子光场计算显微物镜，所述双光子光场计算显微物镜是激发孔径与收集孔径非对称结构，采用分孔径设计，以小数值孔径激发荧光，大数值孔径收集能量；所述双光子光场计算显微物镜包括沿光轴依次布置的扩束镜组BE、二向色镜D、水镜O和介质W；所述扩束镜组BE包括聚焦镜组G1和准直镜组G2，用于将入射平行光一次聚焦再扩束准直，所述二向色镜D用于将激发光与被激发荧光分到各自光路中，所述水镜O包括类扩束镜组G3和聚焦镜组G4，将入射光进行扩束后再聚焦成像，提高成像质量，所述介质W用于增大数值孔径。

进一步地，所述双光子光场计算显微物镜的数值孔径0.3-1.0，物方视场直径1mm-10mm，物方横向分辨率0.3μm-2μm，激发光波长范围400nm-1000nm，荧光波长范围460nm-700nm，轴向分辨率1μm-10μm。

进一步地，所述聚焦镜组G1包括沿光轴方向依次布置的第一凸凹透镜L1、第一双凸透镜L2、第二双凸透镜L3和第二凸凹透镜L4。

进一步地，所述准直镜组G2包括沿光轴方向依次布置的第一双凹透镜L5、第一凹凸透镜L6和第三双凸透镜L7。

进一步地，所述类扩束镜组G3包括沿光轴方向依次布置的第四双凸透镜L8、第二双凹透镜L9、第三双凹透镜L10、第二凹凸透镜L11和第五双凸透镜L12。

进一步地，所述聚焦镜组G4包括沿光轴方向依次布置的第一凸平透镜L13、第一平凹透镜L14、第六双凸透镜L15和第二凸平透镜L16。

进一步地，所述扩束镜组BE能够有效调整光束直径和发散角，使扩束镜组BE出射的光束在满足匹配可加工二向色镜D的尺寸的条件下，发散角越小越好。

进一步地，所述扩束镜组BE能够联合水镜O校正以球差、彗差为主的各像差，使各视场分辨率接近衍射极限。

进一步地，所述介质W采用的是水、香柏油或杉木油。

根据以上技术方案，通过对各镜组的位置和参数进行优化设计，可以得到一种激发孔径与收集孔径非对称结构的物镜，该物镜能够以小数值孔径激发荧光，大数值孔径收集能量，在达到工作波段内全视场近衍射极限分辨率的同时大大降低光学设计与制造压力，相比于同等视场的传统物镜具有更高的成像分辨率；此外，分孔径设计提高了对散射的鲁棒性，且有助于增大***信噪比。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明一较佳实施例的双光子光场计算显微物镜的光学***图；

图2为本发明一较佳实施例的双光子光场计算显微物镜的调制传递函数图；

图3为本发明一较佳实施例的双光子光场计算显微物镜的点列图，图中，不同形状表示不同波长，+表示910nm，方形表示920nm，三角表示930nm；

图4为本发明一较佳实施例的双光子光场计算显微物镜的场曲及畸变图，其中(a)为场曲图，(b)为畸变图；

图5～图13为一些具有代表性的视场及扫描角度的子孔径光学***图；

图14～图22为对应于图5～图13所示子孔径的调制传递函数图；

图23～图31为对应于图5～图13所示子孔径的点列图，波长说明与图3相同。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现在，将参照附图更详细地描述根据本申请的示例性实施方式。然而，这些示例性实施方式可以由多种不同的形式来实施，并且不应当被解释为只限于这里所阐述的实施方式。应当理解的是，提供这些实施方式是为了使得本申请的公开彻底且完整，并且将这些示例性实施方式的构思充分传达给本领域普通技术人员，在附图中，为了清楚起见，有可能扩大了层和区域的厚度，并且使用相同的附图标记表示相同的器件，因而将省略对它们的描述。

实施例1：

如图1所示，本实施例提供一种双光子光场计算显微物镜，所述双光子光场计算显微物镜是激发孔径与收集孔径非对称结构，采用分孔径设计，以小数值孔径激发荧光，大数值孔径收集能量，在达到近衍射极限分辨率的同时大大降低光学设计与制造压力；所述双光子光场计算显微物镜包括沿光轴依次布置的扩束镜组BE、二向色镜D、水镜O和介质W；所述扩束镜组BE包括聚焦镜组G1和准直镜组G2，用于将入射平行光一次聚焦再扩束准直，所述二向色镜D用于将激发光与被激发荧光分到各自光路中，所述水镜O包括类扩束镜组G3和聚焦镜组G4，将入射光进行扩束后再聚焦成像，提高成像质量，介质W用于增大数值孔径。

进一步地，所述双光子光场计算显微物镜的数值孔径0.3-1.0，物方视场直径1mm-10mm，物方横向分辨率0.3μm-2μm，激发光波长范围400nm-1000nm，荧光波长范围460nm-700nm，轴向分辨率1μm-10μm。本实施例以其中一个例子来进行说明，本领域技术人员通过以下例子能知道其余取值范围如何设计，具体如下：设定物镜数值孔径1.0，物方视场直径4mm，物方横向分辨率0.5μm，激发波长范围910nm-930nm，荧光波长范围460nm-700nm，轴向分辨率1.5μm。物镜初始结构以完整孔径的形式给出(图1)，设计过程中使用多重结构对各子孔径进行了优化设计，部分具代表性子孔径的光学***图与成像效果分析见图5-图31。显微镜使用过程中，采用波长910nm-930nm的飞秒激光以0.2的数值孔径对样本进行不同位置和角度的扫描，每次扫描面积为3mm×3mm，激光的不同出瞳位置对样本同一位置的扫描角度为-48°～48°,对于每个被激发的荧光点，以波长460nm-700nm荧光被NA＝1.0的高能采集***采集。***中间位置设置了二向色镜，扫描飞秒激光从二向色镜入射，以二向色镜为界，将光路分为两部分:二向色镜入射端，即扫描激发***；二向色镜出射端，即高能采集***。首先调整二向色镜出射端和入射端光路使主光线平行；其次对扫描激发***进行设计与优化，使其达到极限分辨率。由于能量收集探测器的尺寸较大，对高能采集***的光斑大小要求较低，因此***设计相对容易实现。总之，以小数值孔径实现极限分辨率扫描，以大数值孔径实现能量收集而非成像，使光学设计的难度与成本大大降低，在突破视场-分辨率“此消彼长”的同时，兼顾穿透深度。

具体地，所述聚焦镜组G1采用一组双胶合透镜、一个双凸透镜和一个弯月形厚透镜的结构对光线进行初步会聚，承担很大光焦度，包括沿光轴方向依次布置的第一凸凹透镜L1、第一双凸透镜L2、第二双凸透镜L3和第二凸凹透镜L4。

具体地，所述准直镜组G2使用一个双凹薄透镜、一个弯月形厚透镜和一个双凸薄透镜对初步会聚光束进行扩束和准直，并与聚焦镜组G1形成类对称结构，共同完成对入射光束直径和发散角的调整，包括沿光轴方向依次布置的第一双凹透镜L5、第一凹凸透镜L6和第三双凸透镜L7。

具体地，所述类扩束镜组G3使用由两组阿贝数相差较大的玻璃对组成的透镜组及一个双凸厚透镜对二向色镜引入的像差加以补偿，同时对光束进行进一步扩束和调整，以提高最终成像质量，包括沿光轴方向依次布置的第四双凸透镜L8、第二双凹透镜L9、第三双凹透镜L10、第二凹凸透镜L11和第五双凸透镜L12。

具体地，所述聚焦镜组G4采用多个厚透镜以及正负透镜相结合的结构对光线进行最终聚焦，同样承担很大光焦度，并校正之前各镜组引入的各像差，对各视场分辨率进行权衡与提升，包括沿光轴方向依次布置的第一凸平透镜L13、第一平凹透镜L14、第六双凸透镜L15和第二凸平透镜L16。

具体地，所述介质W可以是水、香柏油等，不损伤样本的同时提高了数值孔径。

在此结构基础上，通过更换玻璃材料、改变透镜和镜组的位置与参数以及更换观察介质(如水、甘油、香柏油、杉木油等)等方式，即可实现权利要求2中所述的不同指标，因以上所给出实施例1已经属于范围内较严格的指标，故将其调整到范围内其余值是没有问题的。

实施例1的透镜数据见下表：

表1实施例1透镜数据

双光子光场计算显微物镜采用了分孔径设计的形式，有以下优势：1、大大降低光学设计压力。将大数值孔径分割成小数值孔径的子孔径后，每个子孔径光学像差的优化难度将会大大降低。2、提高了对散射的鲁棒性。大数值孔径进行光照激发时因为有很多大角度的光照，所以更容易产生散射，不能穿透更深的样本，同时会降低成像质量；而小数值孔径能够减小光线入射角，对散射更加鲁棒，不仅能够提高穿透深度，而且成像质量更有保证。3、有助于提高***信噪比。三维体激发成像过程中，小数值孔径可以形成更大体积的光斑，从而采集到更多的光子数，***的信噪比因此得以提升，而对于轴向信息的多路复用，能够进一步提高信噪比。

此外，物镜中各透镜均为球面面型，共轴放置，便于加工和装调；透镜材料均为普通商用玻璃，降低了光学***材料采购难度及制造成本。

考虑到能量和稳定性，在设计过程中选择了高透过率的镜片材料，在保证高成像质量的同时减小镜片厚度，以确保***整体能量损耗较低；考虑到胶合工艺稳定性，所设计双胶合透镜胶合面直径小于75mm。

现有显微物镜多使用传统的“激发-收集”共用物镜机制，提高穿透深度需要小数值孔径，而提高成像分辨率需要大数值孔径，存在不可调和的矛盾。本设计创新采用激发与收集非对称式物镜结构，以小数值孔径的分区域扫描保证穿透深度，以大数值孔径收集能量提高分辨率，解决了这一矛盾。此外，由于是反向设计，物镜实际为像方远心***，使得像面照度十分均匀。

实施例1形成的双光子光场计算显微物镜的成像质量分析参阅图2-图4。如图2所示，双光子光场计算显微物镜的调制传递函数MTF值在工作波段全视场范围较高，为后续的装调留有较大余量；如图3所示，双光子光场计算显微物镜的弥散斑均方根半径在工作波段全视场范围内小于10μm；如图4所示，双光子光场计算显微物镜的场曲在工作波段全视场范围小于±12um，相对畸变在工作波段全视场范围内小于±0.3％。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述双光子光场计算显微物镜是激发孔径与收集孔径非对称结构，采用分孔径设计，以小数值孔径激发荧光，大数值孔径收集能量；所述双光子光场计算显微物镜包括沿光轴依次布置的扩束镜组BE、二向色镜D、水镜O和介质W；所述扩束镜组BE包括聚焦镜组G1和准直镜组G2，用于将入射平行光一次聚焦再扩束准直，所述二向色镜D用于将激发光与被激发荧光分到各自光路中，所述水镜O包括类扩束镜组G3和聚焦镜组G4，将入射光进行扩束后再聚焦成像，所述介质W用于增大数值孔径。

2.根据权利要求1所述的一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述双光子光场计算显微物镜的数值孔径0.3-1.0，物方视场直径1mm-10mm，物方横向分辨率0.3μm-2μm，激发光波长范围400nm-1000nm，荧光波长范围460nm-700nm，轴向分辨率1μm-10μm。

3.根据权利要求1所述的一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述聚焦镜组G1包括沿光轴方向依次布置的第一凸凹透镜L1、第一双凸透镜L2、第二双凸透镜L3、第二凸凹透镜L4。

4.根据权利要求1所述的一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述准直镜组G2包括沿光轴方向依次布置的第一双凹透镜L5、第一凹凸透镜L6和第三双凸透镜L7。

5.根据权利要求1所述的一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述类扩束镜组G3包括沿光轴方向依次布置的第四双凸透镜L8、第二双凹透镜L9、第三双凹透镜L10、第二凹凸透镜L11和第五双凸透镜L12。

6.根据权利要求1所述的一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述聚焦镜组G4包括沿光轴方向依次布置的第一凸平透镜L13、第一平凹透镜L14、第六双凸透镜L15和第二凸平透镜L16。

7.根据权利要求1所述的一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述扩束镜组BE能够有效调整光束直径和发散角，使扩束镜组BE出射的光束在满足匹配可加工二向色镜D的尺寸的条件下，发散角越小越好。

8.根据权利要求1所述的一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述扩束镜组BE能够联合水镜O校正以球差、彗差为主的各像差，使各视场分辨率接近衍射极限。

9.根据权利要求1所述的一种双光子光场计算显微物镜，其特征在于，所述介质W采用是水、香柏油或杉木油。

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