JP2010145272A - Assay method using plasmon exciting sensor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、検体中のアナライトを高感度に検出するアッセイ法に関する。より詳細には、検体を基板に接触させ、これにより固定化された検体中のアナライトをプラズモン蛍光測定を用いて高感度に検出するアッセイ法に関する。 The present invention relates to an assay method for detecting an analyte in a specimen with high sensitivity. More specifically, the present invention relates to an assay method in which a specimen is brought into contact with a substrate and an analyte in the specimen immobilized thereby is detected with high sensitivity using plasmon fluorescence measurement.
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。 With surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS), irradiation is performed by generating a dense wave (surface plasmon) on the surface of the metal thin film under the condition that the irradiated laser light is attenuated by total reflection (ATR) on the gold thin film surface. The amount of photons that the laser beam has is increased to several tens to several hundreds times (electric field enhancement effect of surface plasmon), and by this, the fluorescent dye in the vicinity of the gold thin film is efficiently excited, so that a trace amount and / or extremely low concentration can be obtained. It is a method that can detect an analyte.
一方、固体表面上に金属微粒子を配置・固定する研究もまた、多くの研究者等により行われてきた。
例えば、特開２００６−８８３１０号公報（特許文献１）に、金属微粒子をミクロ層分離膜上に配列して得られる微粒子配列シートが開示されている。しかし、この特許文献１では、単に金属微粒子を配列したシートを作製したことが開示されているのみであり、バイオセンサやバイオアッセイ法等への応用については、示唆すらされていない。
On the other hand, research on arranging and fixing metal fine particles on a solid surface has also been performed by many researchers.
For example, JP 2006-88310 A (Patent Document 1) discloses a fine particle arrangement sheet obtained by arranging metal fine particles on a micro layer separation membrane. However, this Patent Document 1 merely discloses that a sheet in which metal fine particles are arranged is produced, and no application is suggested for a biosensor, a bioassay method, or the like.
また、特開２００６−２１３０５号公報（特許文献２）には、固体表面上の微小金属領域に化学結合した単鎖ＤＮＡに、この単鎖ＤＮＡと相補的な配列を有する、金微粒子と結合させた別の単鎖ＤＮＡをハイブリダイズすることにより、金微粒子を固体表面上の微小金属領域に固定する発明が開示されている。しかし、この特許文献２もまた、ＳＰＦＳ等の具体的なバイオアッセイ法への応用について何ら示唆するものではない。 Japanese Patent Laid-Open No. 2006-21305 (Patent Document 2) discloses that single-stranded DNA chemically bonded to a fine metal region on a solid surface is bonded to gold fine particles having a sequence complementary to this single-stranded DNA. An invention has been disclosed in which gold microparticles are immobilized on a fine metal region on a solid surface by hybridizing another single-stranded DNA. However, this Patent Document 2 also does not suggest any application to a specific bioassay method such as SPFS.
その後、ＳＰＦＳの原理に基づいたバイオセンサまたはバイオチップの表面に、金属微粒子を配置することを企図した研究も種々行われてきた。
例えば、特開２００７−２５５９４７号公報（特許文献３）に、基板上に形成した金属層上に、自己組織化膜を介して金ナノ微粒子を固定化して得られる局在化表面プラズモンセンサが開示されている。その他、金属微粒子を用いた局在化表面プラズモンセンサについての発明が学術論文等を含めて数多く開示されてきているが、そのいずれも金属微粒子を基板上に固定した状態でその他の条件を種々検討したものである。また、それらの発明の目的も、局在化プラズモン共鳴（ＬＰＲ）への応用を意図したものである。
Since then, various studies have been conducted with the aim of arranging metal fine particles on the surface of a biosensor or biochip based on the principle of SPFS.
For example, Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2007-255947 (Patent Document 3) discloses a localized surface plasmon sensor obtained by immobilizing gold nanoparticles on a metal layer formed on a substrate via a self-assembled film. Has been. In addition, many inventions on localized surface plasmon sensors using fine metal particles have been disclosed, including academic papers, etc., all of which have various other studies with metal fine particles fixed on a substrate. It is what. The objects of the invention are also intended for application to localized plasmon resonance (LPR).
ここで、ＬＰＲによる感度向上を企図して、金属微粒子を基板表面一面に配置、固定しようとすると、大面積にわたり精密に金属微粒子を配置する必要があることから、基板作成の再現性に問題がある。さらに、金属微粒子の配置にばらつきがあると、センサとして用いたときに得られる測定データの精度が向上しないという問題点もある。そのため、このような問題点を解決すべく種々の試みがなされているが、未だ決定的な解決法を見出すに至っていない。 Here, when trying to arrange and fix the metal fine particles on the entire surface of the substrate in an attempt to improve the sensitivity by LPR, it is necessary to precisely arrange the metal fine particles over a large area, which causes a problem in the reproducibility of the substrate creation. is there. Furthermore, if the arrangement of the metal fine particles varies, there is a problem that the accuracy of measurement data obtained when used as a sensor is not improved. For this reason, various attempts have been made to solve such problems, but no definitive solution has yet been found.
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したセンサにおいて、抗原抗体反応の標識体として金コロイドを利用することでＳＰＲ−ＬＰＲ系を構築し、高感度化を図る試みもなされている。この系においては、感度向上がなされていることが学術論文等に報告されているが、依然として、大面積にわたり精密に金属微粒子を配置するための決定的な解決手段を見出すに至っていないことから、測定データの精度に未だ課題が残っている。さら
に、金属微粒子の密度条件設定に困難があることから、金属微粒子を基板上に多数配置してもＬＰＲによる感度向上につながらない場合があるという問題点もある。
本発明は、金属コロイド粒子を分散浮遊状態で用いることによって、表面プラズモン励起増強蛍光分光法と局在プラズモン励起増強蛍光分光法とを組み合わせた高感度且つ高精度なアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。 The present invention provides a highly sensitive and highly accurate assay method combining surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy and localized plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy by using metal colloid particles in a dispersed suspended state, the assay apparatus, and An object is to provide the assay kit.
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いたアッセイ系において、金属コロイド粒子を分散させたコロイド液をプラズモン励起センサ上に流しつつ接触させながら蛍光測定を行うと、表面プラズモン励起による電場増強効果に加えて、金属コロイド粒子による局所電場増強効果も得られることにより、蛍光の強度が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made contact in a assay system using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy while flowing a colloidal liquid in which metal colloidal particles are dispersed on the plasmon excitation sensor. In addition to the electric field enhancement effect due to surface plasmon excitation, the local electric field enhancement effect due to the metal colloidal particles is obtained, and thus the intensity of the fluorescence is increased, and the present invention is completed. It was.
すなわち、本発明のアッセイ法は、
工程（ａ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは反対側の表面に形成された自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」と称す。）と、該ＳＡＭの、該金属薄膜とは反対側の表面に固定化された第１のリガンドとからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光標識とからなるコンジュゲートを接触させ、これらを反応させる工程；
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、金属コロイド粒子を分散させたコロイド液を流しつつ接触させ、該状態で、前記透明平面基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程
を含むことを特徴とする。
That is, the assay method of the present invention comprises:
Step (a): a transparent flat substrate, a metal thin film formed on one surface of the substrate, and a self-assembled monomolecular film (hereinafter referred to as “the surface of the metal thin film opposite to the substrate”). SAM ”)) and a plasmon excitation sensor comprising a first ligand immobilized on the surface of the SAM opposite to the metal thin film;
Step (b): A step of bringing the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) into contact with a conjugate comprising a second ligand and a fluorescent label, and reacting them;
Step (c): The plasmon excitation sensor obtained through the step (b) is brought into contact with the colloid liquid in which metal colloid particles are dispersed while flowing, and in this state, what is the metal thin film of the transparent flat substrate? Irradiating laser light from the opposite surface via a prism and measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye; and
Step (d): The method includes a step of calculating the amount of the analyte contained in the sample from the measurement result obtained in the step (c).
本発明のアッセイ法において、金属コロイド粒子は、金、銀および白金のいずれかから選ばれる金属、またはその合金からなることが好ましく、金からなることがさらに好ましい。 In the assay method of the present invention, the metal colloidal particles are preferably made of a metal selected from gold, silver and platinum, or an alloy thereof, more preferably gold.
ここで、この金属コロイド粒子の表面は、ポリエチレングリコールからなる層で被覆されていることが好ましい。
この金属コロイド粒子の粒径は、０．１〜１００００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。
Here, the surface of the metal colloid particles is preferably coated with a layer made of polyethylene glycol.
The metal colloid particles preferably have a particle size in the range of 0.1 to 10,000 nm.
前記コロイド液における金属コロイド粒子の濃度は、０．００００００１〜０．１％の範囲内にあることが好ましい。
前記工程（ａ）に記載のプラズモン励起センサにおいて、誘電体からなるスペーサ層が前記金属薄膜と前記ＳＡＭとの間に配置されていると好ましく、さらに、この誘電体が、
二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むとさらに好ましい。
The concentration of the metal colloid particles in the colloid liquid is preferably in the range of 0.0000001 to 0.1%.
In the plasmon excitation sensor described in the step (a), it is preferable that a spacer layer made of a dielectric is disposed between the metal thin film and the SAM.
More preferably, it contains silicon dioxide (SiO 2 ) or titanium dioxide (TiO 2 ).
前記検体については、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液であると好ましい。
また、本発明は、前記工程（ｃ）に用いられる装置をも提供する。
The specimen is preferably at least one body fluid selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva.
Moreover, this invention also provides the apparatus used for the said process (c).
また、本発明は、前記アッセイ法に用いられるキットをも提供する。 The present invention also provides a kit for use in the assay method.
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法に、局在プラズモン励起による電場増強効果を組み合わせることにより、さらなる蛍光増幅を図ることができ、また、蛍光シグナルの安定性向上をも図ることができるので、極めて高感度かつ高精度のアッセイ法を提供することができる。さらに、金属コロイド粒子がコロイド液中に分散した状態でプラズモン励起センサと接触することから、アッセイ法に用いられる装置およびキットの簡素化および製造コストの低廉化を図ることができる。 In the present invention, by combining the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy with the electric field enhancement effect by localized plasmon excitation, further fluorescence amplification can be achieved, and the stability of the fluorescence signal can be improved. An extremely sensitive and highly accurate assay method can be provided. Furthermore, since the metal colloid particles are in contact with the plasmon excitation sensor in a state of being dispersed in the colloid liquid, the apparatus and kit used in the assay method can be simplified and the manufacturing cost can be reduced.
以下、本発明について、図１を参照しながら具体的に説明する。
〔アッセイ法〕
本発明の第１の態様は、
工程（ａ）：透明平面基板１１と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜１２と、該金属薄膜１２の、該基板とは反対側の表面に形成された自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」と称す。）１３と、該ＳＡＭ１３の、該金属薄膜１２とは反対側の表面に固定化された第１のリガンド２１とからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンド２３と蛍光標識２４とからなるコンジュゲートを接触させ、これらを反応させる工程；
工程（ｃ）：工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、金属コロイド粒子３１を分散させたコロイド液を流しつつ接触させ、該状態で、前記透明平面基板１１の、前記金属薄膜１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光標識２４から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライト２２の量を算出する工程
を含むことを特徴とするアッセイ法である。
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to FIG.
[Assay Method]
The first aspect of the present invention is:
Step (a): Transparent flat substrate 11, metal thin film 12 formed on one surface of the substrate, and self-assembled monolayer formed on the surface of metal thin film 12 opposite to the substrate (Hereinafter referred to as “SAM”) 13 and a step of bringing a specimen into contact with a plasmon excitation sensor comprising the first ligand 21 immobilized on the surface of the SAM 13 opposite to the metal thin film 12;
Step (b): a step of bringing a conjugate consisting of the second ligand 23 and the fluorescent label 24 into contact with the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) and causing them to react;
Step (c): The plasmon excitation sensor obtained through the step (b) is brought into contact with the colloidal liquid in which the metal colloid particles 31 are dispersed while flowing, and in this state, the metal thin film 12 of the transparent flat substrate 11 is contacted. Irradiating a laser beam through a prism from the opposite surface to measure the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent label 24; and
Step (d): An assay method comprising a step of calculating the amount of the analyte 22 contained in the sample from the measurement result obtained in the step (c).
＜工程（ａ）＞
本発明のアッセイ法において、工程（ａ）は、透明平面基板１１と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜１２と、この金属薄膜１２の、透明平面基板１１とは反対側の表面に形成された金属薄膜１３と、この金属薄膜１３の、金属薄膜１２とは反対側の表面に固定化された第１のリガンド２１とからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程である。
<Process (a)>
In the assay method of the present invention, the step (a) comprises a transparent flat substrate 11, a metal thin film 12 formed on one surface of the substrate, and a surface of the metal thin film 12 opposite to the transparent flat substrate 11. In this step, the specimen is brought into contact with a plasmon excitation sensor comprising the metal thin film 13 formed on the surface of the metal thin film 13 and the first ligand 21 immobilized on the surface of the metal thin film 13 opposite to the metal thin film 12.
本発明の１態様において、金属薄膜１２とＳＡＭ１３との間に、誘電体からなるスペーサ層を設けることが望ましい。
透明平面基板
本発明において、プラズモン励起センサの構造を支持する平面基板として透明平面基板１１が用いられる。本発明において、平面基板として透明平面基板１１を用いるのは、後述する金属薄膜１２への光照射をこの平面基板を通じて行うからである。
In one aspect of the present invention, it is desirable to provide a spacer layer made of a dielectric between the metal thin film 12 and the SAM 13.
Transparent plane substrate In the present invention, the transparent plane substrate 11 is used as a plane substrate that supports the structure of the plasmon excitation sensor. In the present invention, the transparent flat substrate 11 is used as the flat substrate because light irradiation to the metal thin film 12 described later is performed through the flat substrate.
本発明で用いられる透明平面基板１１について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明平面基板１１が、ガラス製であってもよく、また、
ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよい。
The transparent flat substrate 11 used in the present invention is not particularly limited in material as long as the object of the present invention is achieved. For example, the transparent flat substrate 11 may be made of glass,
It may be made of plastic such as polycarbonate (PC) and cycloolefin polymer (COP).
また、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０〜２．２０で
あり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
The refractive index at the d-line (588 nm) [n d] is preferably from 1.40 to 2.20, is preferably thick 0.01 to 10 mm, more preferably if 0.5 to 5 mm, The size (vertical x horizontal) is not particularly limited.
なお、ガラス製の透明平面基板１１は、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎd〕１．５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎd〕 １．８５）、（株）
住田光学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎd〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（
屈折率〔ｎd〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎd〕１．９０）、並びに（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄
性との観点から好ましい。
The glass-made flat transparent substrate 11, commercially, SCHOTT AG Corp. BK7 (refractive index [n d] 1.52) and LaSFN9 (refractive index [n d] 1.85, Ltd.)
K-PSFn3 (refractive index [n d ] 1.84) made by Sumita Optical Glass, K-LaSFn17 (
Refractive index [n d ] 1.88) and K-LaSFn22 (refractive index [n d ] 1.90), and S-LAL10 (refractive index [n d ] 1.72) manufactured by OHARA INC. It is preferable from the viewpoint of optical characteristics and cleanability.
透明平面基板１１は、その表面に金属薄膜１２を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
The transparent flat substrate 11 is preferably cleaned with acid and / or plasma before forming the metal thin film 12 on the surface.
As the cleaning treatment with an acid, it is preferable to immerse in 0.001 to 1N hydrochloric acid for 1 to 3 hours.
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
金属薄膜
本発明に係るアッセイ法では、前記透明平面基板１１の一方の表面に金属薄膜１２を形成する。この金属薄膜１２は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光標識２４の発光をもたらす役割を有する。また、この電場は、金属コロイド粒子３１にさらに表面プラズモン励起を生じさせるとともに、金属薄膜１２と金属コロイド粒子３１との間の局在電場を強化させるもとともなり、蛍光標識２４からの発光をさらに増強させる。
Examples of the plasma cleaning treatment include a method of immersing in a plasma dry cleaner (PDC200 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
Metal Thin Film In the assay method according to the present invention, a metal thin film 12 is formed on one surface of the transparent flat substrate 11. The metal thin film 12 has a role of causing surface plasmon excitation by irradiation light from a light source, generating an electric field, and causing light emission of the fluorescent label 24. This electric field also causes surface plasmon excitation in the metal colloidal particles 31 and also enhances the local electric field between the metal thin film 12 and the metal colloidal particles 31, and emits light from the fluorescent label 24. Further strengthen.
上記透明平面基板１１の一方の表面に形成された金属薄膜１２としては、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。 The metal thin film 12 formed on one surface of the transparent flat substrate 11 is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, and is made of gold. Is more preferable. These metals may be in the form of their alloys. Such metal species are preferable because they are stable against oxidation and increase in electric field due to surface plasmons increases.
なお、透明平面基板１１としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜１２とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。 When a glass flat substrate is used as the transparent flat substrate 11, it is preferable to form a thin film of chromium, nickel chromium alloy or titanium in advance in order to bond the glass and the metal thin film 12 more firmly.
透明平面基板１１上に金属薄膜１２を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜１２を形成することが好ましい。 Examples of the method for forming the metal thin film 12 on the transparent flat substrate 11 include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. Since it is easy to adjust the thin film formation conditions, it is preferable to form the chromium thin film and / or the metal thin film 12 by sputtering or vapor deposition.
金属薄膜１２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。 The thickness of the metal thin film 12 is preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm. The thickness of the chromium thin film is preferably 1 to 20 nm.
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１
０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
From the viewpoint of the electric field enhancement effect, gold: 20-70 nm, silver: 20-70 nm, aluminum: 10-50 nm, copper: 20-70 nm, platinum: 20-70 nm, and alloys thereof: 1
0 to 70 nm is more preferable, and the thickness of the chromium thin film is more preferably 1 to 3 nm.
金属薄膜１２の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。 When the thickness of the metal thin film 12 is within the above range, it is preferable because surface plasmons are easily generated. Moreover, if it is the metal thin film 12 which has such thickness, a magnitude | size (length x width) will not be specifically limited.
誘電体からなるスペーサ層
本発明に係るアッセイ法では、この金属薄膜１２による蛍光標識２４の金属消光を防止することを目的として、誘電体からなるスペーサ層を形成することが望ましい。このスペーサ層は、金属薄膜１２の、上記透明平面基板１１と接していないもう一方の表面に形成される。
Dielectric Spacer Layer In the assay method according to the present invention, it is desirable to form a dielectric spacer layer for the purpose of preventing metal quenching of the fluorescent label 24 by the metal thin film 12. The spacer layer is formed on the other surface of the metal thin film 12 that is not in contact with the transparent flat substrate 11.
このスペーサ層の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（Ｔ
ｉＯ2）を含むことが好ましい。
As the dielectric used for forming the spacer layer, various optically transparent inorganic substances, natural or synthetic polymers can be used. Among them, since it is excellent in chemical stability, production stability and optical transparency, silicon dioxide (SiO 2 ) or titanium dioxide (T
iO 2 ) is preferably included.
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。本発明のアッセイ法では、測定時にプラズモン励起センサとコロイド液中の金属コロイド粒子３１との間に生じる電場をより効果的に増強させる目的から、スペーサ層の厚さが１０〜１００ｎｍであることが望ましい。 The thickness of the spacer layer made of a dielectric is usually 10 nm to 1 mm, and preferably 30 nm or less, more preferably 10 to 20 nm from the viewpoint of resonance angle stability. On the other hand, it is preferably 200 nm to 1 mm from the viewpoint of electric field enhancement, and more preferably 400 nm to 1,600 nm from the stability of the effect of electric field enhancement. In the assay method of the present invention, the thickness of the spacer layer should be 10 to 100 nm for the purpose of more effectively enhancing the electric field generated between the plasmon excitation sensor and the metal colloid particles 31 in the colloid liquid during measurement. desirable.
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。 Examples of the method for forming a spacer layer made of a dielectric include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction using a material such as polysilazane, or an application with a spin coater.
ＳＡＭ
自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：ＳＡＭ）１３は、金属薄膜１２、あるいは必要により金属薄膜１２上に形成された前記スペーサ層の透明平面基板１１とは反対側の面に形成される。本発明のアッセイ法では、後述する検体及び蛍光ラベルを後述するリガンド２１および２３を介して金属薄膜１２（あるいは、その上に形成したスペーサ層）に固定した状態で、蛍光測定を行うが、このとき、リガンド２１を、ＳＡＭ１３を介して金属薄膜１２等に固定する。すなわち、ＳＡＭ１３は、リガンド２１を金属薄膜１２等に固定する際の土台としての役割を有する。
SAM
A self-assembled monolayer (SAM) 13 is formed on the surface of the metal thin film 12 or, if necessary, on the side opposite to the transparent flat substrate 11 of the spacer layer formed on the metal thin film 12. In the assay method of the present invention, fluorescence measurement is performed in a state where a specimen and a fluorescent label described later are fixed to the metal thin film 12 (or a spacer layer formed thereon) via ligands 21 and 23 described later. At this time, the ligand 21 is fixed to the metal thin film 12 or the like via the SAM 13. That is, the SAM 13 has a role as a base when the ligand 21 is fixed to the metal thin film 12 or the like.
本発明において、誘電体層からなるスペーサ層を有する場合では、ＳＡＭ１３がシランカップリング剤からなることが好ましく、このようなシランカップリング剤として、アミノ基またはカルボキシル基を有するシランカップリング剤であれば、特に限定せずに従来公知のものを用いることができる。このＳＡＭ１３が含む単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭ１３の光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。 In the present invention, in the case of having a spacer layer made of a dielectric layer, the SAM 13 is preferably made of a silane coupling agent. Such a silane coupling agent may be a silane coupling agent having an amino group or a carboxyl group. For example, a conventionally known one can be used without particular limitation. The SAM13 contains a single molecule, usually a carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms (for example, available from Dojindo Laboratories, Sigma-Aldrich Japan, etc.), particularly preferably 10- Carboxy-1-decanethiol is used. Carboxyalkanethiol having 4 to 20 carbon atoms has properties such as little optical influence of SAM13 formed using it, that is, high transparency, low refractive index, and thin film thickness. Therefore, it is preferable.
ＳＡＭ１３の形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ
る。具体例として、金属薄膜１２がその表面に形成されたガラス製透明平面基板１１を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭ１３を形成する。
A method for forming the SAM 13 is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. As a specific example, there is a method of immersing a transparent glass substrate 11 having a metal thin film 12 formed on the surface thereof in an ethanol solution containing 10-carboxy-1-decanethiol (manufactured by Dojindo Laboratories). Can be mentioned. In this way, the thiol group of 10-carboxy-1-decanethiol binds to the metal and is immobilized, and self-assembles on the surface of the gold thin film to form SAM13.
リガンド
本発明では、前記ＳＡＭ１３を形成後に得られるプラズモン励起センサのうち、ＳＡＭ１３を形成した側の表面に第１のリガンド２１を結合させる。この第１のリガンド２１は、プラズモン励起センサに、検体中のアナライト２２を固定させる目的で用いられるものである。本発明において、工程（ａ）で用いられるリガンドを「第１のリガンド」２１と称するのは、後述する工程（ｂ）で用いられるリガンド（「第２のリガンド」）２３）と区別するためである。
Ligand In the present invention, of the plasmon excitation sensor obtained after forming the SAM 13, the first ligand 21 is bound to the surface on the side where the SAM 13 is formed. The first ligand 21 is used for the purpose of fixing the analyte 22 in the specimen to the plasmon excitation sensor. In the present invention, the ligand used in step (a) is referred to as “first ligand” 21 in order to distinguish it from the ligand (“second ligand”) 23) used in step (b) described later. is there.
本発明において、「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライト２２を特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 In the present invention, “ligand” refers to a molecule or molecular fragment that can specifically recognize (or be recognized) and bind to the analyte 22 contained in a specimen. Examples of such “molecule” or “molecular fragment” include nucleic acids (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., Alternatively, nucleosides, nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modifications thereof Examples include, but are not limited to, molecules and complexes.
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。 Examples of the “protein” include antibodies and the like, specifically, anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (available from Japan Medical Laboratory), anti-carcinoembryonic antigen (CEA) ) Monoclonal antibody, anti-CA19-9 monoclonal antibody, anti-PSA monoclonal antibody and the like.
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
この第１のリガンド２１の固定化方法としては、例えば、上記ＳＡＭ１３を形成するシランカップリング剤などが有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、上記リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
In the present invention, the term “antibody” includes polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, antibodies obtained by gene recombination, and antibody fragments.
As a method for immobilizing the first ligand 21, for example, a carboxyl group included in the silane coupling agent or the like that forms the SAM 13 is converted into a water-soluble carbodiimide (WSC) (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethyl). Aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and the like and active esterification with N-hydroxysuccinimide (NHS), and the carboxyl group thus active esterified and the amino group of the ligand are converted into water-soluble carbodiimide. Examples of the method include dehydration reaction and immobilization.
なお、後述する検体等がプラズモン励起センサに非特異的に吸着することを防止するため、上記第１のリガンド２１を固定化させた後に、プラズモン励起センサの表面を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のブロッキング剤により処理することが好ましい。 In order to prevent non-specific adsorption of a specimen or the like, which will be described later, to the plasmon excitation sensor, after immobilizing the first ligand 21, the surface of the plasmon excitation sensor is made of bovine serum albumin (BSA) or the like. It is preferable to treat with a blocking agent.
検体
本発明において、「検体」とは、本発明のアッセイ法による測定対象となる種々の試料をいう。
Specimen In the present invention, “specimen” refers to various samples to be measured by the assay method of the present invention.
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。 Examples of the “specimen” include blood (serum / plasma), urine, nasal fluid, saliva, feces, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.), etc., and appropriately diluted in a desired solvent, buffer solution, etc. May be used. Of these samples, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva are preferred. These may be used alone or in combination of two or more.
接触
本発明において、「接触」とは、プラズモン励起センサのリガンド２１等が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこのプラズモン励起センサと接触させることをいう。工程（ａ）では、上記検体とプラズモン励起センサとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
Contact In the present invention, “contact” means that the surface on which the ligand 21 of the plasmon excitation sensor is immobilized is immersed in the liquid supply, and an object contained in the liquid supply is excited by the plasmon excitation. Contacting a sensor. In the step (a), the “contact” between the specimen and the plasmon excitation sensor means that the specimen is included in the liquid feed circulating in the flow path, and only the one surface on which the ligand of the plasmon excitation sensor is immobilized is the liquid feed. A mode in which the plasmon excitation sensor and the specimen are brought into contact with each other in a state of being immersed therein is preferable.
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。本発明のアッセイ法においては、後述するように蛍光測定時に導入される金属コロイド粒子を分散させたコロイド液もまた、この流路を通じてプラズモン励起センサに送達される。また、この流路の形状として、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。 The “channel” is a rectangular parallelepiped or a tube that can efficiently deliver a small amount of a chemical solution, and can change or circulate the solution feeding speed in order to promote the reaction. . In the assay method of the present invention, as will be described later, a colloid liquid in which metal colloid particles introduced at the time of fluorescence measurement are dispersed is also delivered to the plasmon excitation sensor through this flow path. As the shape of the flow path, the vicinity of the place where the plasmon excitation sensor is installed preferably has a rectangular parallelepiped structure, and the vicinity of the place where the chemical solution is delivered preferably has a tubular shape.
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン(登録商標)、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。 The material is a homopolymer or copolymer containing methyl methacrylate, styrene or the like as a raw material in the plasmon excitation sensor part; a light-transmitting material such as polyolefin such as polyethylene, and a silicone rubber, Teflon ( (Registered trademark), polyethylene, polypropylene, and other polymers are used.
ただし、プラズモン励起センサ部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、且つプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路構造の全てを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、プラズモン励起センサ部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜１２およびＳＡＭ１３が表面に存在するプラズモン励起センサの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。 However, for the plasmon excitation sensor unit, the flow channel structure is not necessarily made of a light-transmitting material unless the flow channel is kept in a fixed shape at the time of fluorescence measurement and the detection of fluorescence generated by plasmon excitation is not hindered. There is no need to consist only of. That is, of the flow path of the plasmon excitation sensor part, a part necessary for transmitting the fluorescence generated by plasmon excitation and guiding it to the detection part, specifically, a part including a transparent window necessary for collecting the fluorescence. However, other parts may be partially or entirely made of a chemically stable material other than the light transmissive material. When the flow path of the plasmon excitation sensor unit has a rectangular parallelepiped structure, when the surface of the plasmon excitation sensor where the metal thin film 12 and the SAM 13 are present is the bottom surface, for example, the ceiling surface at a position facing the bottom surface is light It may be made of a transmissive material, and the side surface may be made of a chemically stable material other than the light transmissive material.
ここで、前記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、プラズモン励起センサ部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。 Here, the other part, for example, the side surface does not necessarily need to be a rigid body as long as a certain shape is maintained at the time of fluorescence measurement, and may have an appropriate elasticity to ensure a sealing property. For example, regarding the flow path of the plasmon excitation sensor unit, the ceiling surface may be made of polymethyl methacrylate (PMMA) and the side surface may be made of silicone rubber.
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。 In the plasmon excitation sensor unit, from the viewpoint of increasing the contact efficiency with the specimen and shortening the diffusion distance, it is preferable that the cross section of the channel of the plasmon excitation sensor unit is independently about 100 nm to 1 mm in length and width.
流路において、薬物送達部からプラズモン励起センサ部に送液を導入する送液導入口、及びその送液をプラズモン励起センサ部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作成上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。 In the flow path, the position of the liquid feeding inlet for introducing the liquid feeding from the drug delivery section to the plasmon excitation sensor section and the position of the liquid feeding outlet for discharging the liquid feeding from the plasmon excitation sensor section are both obstructing the fluorescence measurement. Unless it becomes, it will not specifically limit. For example, when the flow path of the plasmon excitation sensor unit has a rectangular parallelepiped structure, it is convenient in creating the flow path to provide both the liquid feeding inlet and the liquid feeding outlet on the ceiling surface. Either one or both of the liquid discharge ports may be provided on the side surface.
流路にプラズモン励起センサを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、且つ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズ
モン励起センサの金属薄膜１２が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周がプラズモン励起センサ部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜１２が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートの上に、予め送液導入口及び送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、プラズモン励起センサに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサーを併用してもよい。
The method for fixing the plasmon excitation sensor to the flow path is not particularly limited as long as the flow path is kept in a fixed shape and the fluorescence measurement is not hindered.
As an example of such a fixing method, in a small lot (laboratory level), first, a silicone rubber sheet or O having a certain thickness is formed on the surface on which the metal thin film 12 of the plasmon excitation sensor is formed. A side structure of the flow path is formed by placing a ring, and then a light transmitting top plate (for example, a PMMA substrate) provided with a liquid feeding inlet and a liquid feeding outlet is disposed thereon. Examples include a method of forming a ceiling surface of a road, and then crimping and fixing them with an appropriate fastener. At this time, if a silicone rubber sheet having an appropriate thickness and having a hole having an arbitrary shape and size is used as a material constituting the side surface structure, the inner periphery of the hole has a plasmon. Since it becomes the side structure of the flow path of an excitation sensor part, since the flow path which has a required shape and a size can be formed easily, it is preferable. For example, first, the metal thin film 12 of the plasmon excitation sensor is formed with a perforated polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a flow path height of 0.5 mm on the surface where the metal thin film 12 of the plasmon excitation sensor is formed. Then, a PMMA substrate provided with a liquid feeding inlet and a liquid feeding outlet in advance is placed on the polydimethylsiloxane (PDMS) sheet, and then the PMMA substrate is placed. And a sheet made of polydimethylsiloxane (PDMS) and the plasmon excitation sensor are preferably pressed and fixed with a fastener such as a screw. In addition, when a silicone rubber sheet or O-ring and a light-transmitting top plate are pressure-bonded and fixed to the plasmon excitation sensor, an appropriate spacer made of a material such as silicone rubber or stainless steel is attached as necessary. You may use together.
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成するか或いは別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、ＳＡＭ層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。 Also, in large lots (factory level) manufactured industrially, as a method of fixing the plasmon excitation sensor to the flow path, a gold substrate is directly formed on a plastic integrally molded product, or a separately manufactured gold substrate is fixed. Then, after the dielectric layer, the SAM layer, and the ligand are immobilized on the gold surface, it can be manufactured by covering with a plastic integrally molded product corresponding to the top plate of the flow path. If necessary, the prism can be integrated into the flow path.
このような「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。 Such “liquid feeding” is preferably the same as the solvent or buffer in which the specimen is diluted, and examples thereof include phosphate buffered saline (PBS) and Tris buffered saline (TBS). It is not particularly limited.
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。 The temperature and time for circulating the liquid supply vary depending on the type of specimen and are not particularly limited, but are usually 20 to 40 ° C. × 1 to 60 minutes, preferably 37 ° C. × 5 to 15 minutes.
送液中の検体中に含有されるアナライト２２の初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
The initial concentration of the analyte 22 contained in the specimen being sent may be 100 μg / mL to 0.0001 pg / mL.
The total amount of liquid feeding, that is, the volume of the flow path is usually 0.0001 to 20 mL, preferably 0.01 to 1 mL.
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎ
である。
洗浄工程
洗浄工程とは、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および後述する工程（ｂ）を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程である。この洗浄工程は、工程（ｂ）の前後のうち少なくともいずれか一方に含まれることが好ましい。
The flow rate of liquid feeding is usually 1 to 2,000 μL / min, preferably 5 to 500 μL / min.
It is.
Cleaning step The cleaning step is a step of cleaning at least one of the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) and the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the step (b) described later. . This washing step is preferably included in at least one of before and after step (b).
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。 As the washing solution used in the washing step, for example, a surfactant such as Tween 20 or Triton X100 is dissolved in the same solvent or buffer solution used in the reaction of steps (a) and (b), What contains 00001-1 weight% is desirable.
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
The temperature and flow rate at which the cleaning liquid is circulated are preferably the same as the “temperature and flow rate at which the liquid feed is circulated” in step (a).
The time for circulating the cleaning liquid is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.
＜工程（ｂ）＞
本発明のアッセイ法において、工程（ｂ）は、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサ、好ましくは工程（ａ）の後に上記洗浄工程をさらに経て得られたプラズモン励起センサに第２のリガンドと蛍光標識２４とからなるコンジュゲートを接触させ、これらを反応させる工程である。
<Step (b)>
In the assay method of the present invention, the step (b) includes a plasmon excitation sensor obtained through the step (a), preferably a plasmon excitation sensor obtained through the washing step after the step (a). In this step, a conjugate consisting of a ligand and a fluorescent label 24 is brought into contact with each other and reacted.
蛍光標識
「蛍光標識」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質による標識の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
In the present invention, the fluorescent label "fluorescent label" is a generic term for labels of substances that emit fluorescence by irradiating predetermined excitation light or exciting using the field effect, and the "fluorescence" Various light emission such as phosphorescence is also included.
本発明で蛍光標識２４として用いられる蛍光色素は、後述する金属コロイド粒子による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。 The type of the fluorescent dye used as the fluorescent label 24 in the present invention is not particularly limited as long as it is not quenched due to light absorption by the metal colloid particles described later, and may be any known fluorescent dye. In general, fluorescent dyes with large Stokes shifts that allow the use of a fluorometer with a filter rather than a monochromator and also increase the efficiency of detection are preferred.
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,
９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,
９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
Examples of such fluorescent dyes include fluorescein family fluorescent dyes (Integrated DNA Technologies), polyhalofluorescein family fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), and hexachlorofluorescein family fluorescent dyes. (Applied Biosystems Japan), Coumarin family fluorescent dye (Invitrogen), Rhodamine family fluorescent dye (GE Healthcare Biosciences), Cyanine family fluorescent dye, Indocarbocyanine family fluorescent dye, oxazine family fluorescent dye, thiazine family fluorescent dye, squaraine family fluorescent dye, chelated lanthanide family Fluorescent dyes of BODIPY (registered trademark) family (manufactured by Invitrogen), naphthalenesulfonic acid family fluorescent dyes, pyrene family fluorescent dyes, triphenylmethane family fluorescent dyes, Alexa Fluor ( Registered trademark) dye series (manufactured by Invitrogen Corp.) and the like, and further, U.S. Pat. Nos. 6,406,297, 6,221,604, 5,
No. 994,063, No. 5,808,044, No. 5,880,287, No. 5,556,
Fluorescent dyes described in 959 and 5,135,717 can also be used in the present invention.
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。 Table 1 shows the absorption wavelength (nm) and emission wavelength (nm) of typical fluorescent dyes included in these families.
また、蛍光標識２４として用いられる蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光標識２４となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。 The fluorescent dye used as the fluorescent label 24 is not limited to the organic fluorescent dye. For example, rare earth complex fluorescent dyes such as Eu and Tb can be used as the fluorescent label 24 used in the present invention. In general, rare earth complexes have a large wavelength difference between an excitation wavelength (about 310 to 340 nm) and an emission wavelength (about 615 nm for an Eu complex and 545 nm for a Tb complex), and a long fluorescence lifetime of several hundred microseconds or more. is there. An example of a commercially available rare earth complex-based fluorescent dye is ATBTA-Eu 3+ .
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属コロイド粒子を含むコロイド液を流しながら行うことから、この金属コロイド粒子に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属コロイド粒子として金を用いる場合には、金コロイド粒子による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ ６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属コロイド粒子として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。 In the present invention, when the fluorescence measurement described later is performed while the colloid liquid containing the metal colloid particles is flowing, the fluorescent dye having the maximum fluorescence wavelength in the wavelength region where light absorption by the metal contained in the metal colloid particles is small It is desirable to use For example, when gold is used as the metal colloid particles, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 600 nm or more in order to minimize the influence of light absorption by the gold colloid particles. Therefore, in this case, it is particularly desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in the near-infrared region, such as Cy5 and Alexa 647. The use of a fluorescent dye having the maximum fluorescence wavelength in the near-infrared region can minimize the influence of light absorption by iron derived from blood cell components in the blood. Is also useful. On the other hand, when silver is used as the metal colloid particles, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 400 nm or more.
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
第２のリガンドと蛍光標識からなるコンジュゲート
「第２のリガンドと蛍光標識からなるコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）２２を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。
These fluorescent dyes may be used alone or in combination of two or more.
The conjugate consisting of the second ligand and the fluorescent label “ conjugate consisting of the second ligand and the fluorescent label” recognizes the analyte (target antigen) 22 contained in the specimen when a secondary antibody is used as the ligand. It is preferable that the antibody be capable of binding.
本発明のアッセイ法において、第２のリガンド２３は、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、前記第１のリガンド２１と同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンド２１として用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンド２３として用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。 In the assay method of the present invention, the second ligand 23 is a ligand used for the purpose of labeling an analyte with a fluorescent dye, and may be the same as or different from the first ligand 21. However, when the primary antibody used as the first ligand 21 is a polyclonal antibody, the secondary antibody used as the second ligand 23 may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. When is a monoclonal antibody, the secondary antibody is preferably a monoclonal antibody that recognizes an epitope that the primary antibody does not recognize, or a polyclonal antibody.
さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）２２と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。 Further, a complex in which a second analyte that competes with the analyte (target antigen) 22 contained in the specimen (competitive antigen; however, is different from the target antigen) and the secondary antibody are bound in advance. An embodiment using is also preferable. Such an embodiment is preferable because the amount of fluorescent signal (fluorescent signal) and the amount of target antigen can be proportional.
「第２のリガンドと蛍光色素とからなるコンジュゲート」の作製方法としては、第２のリガンド２３として２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。 As a method for producing a “conjugate comprising a second ligand and a fluorescent dye”, when a secondary antibody is used as the second ligand 23, for example, first, a carboxyl group is added to the fluorescent dye, Active esterification with water-soluble carbodiimide (WSC) (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) etc.) and N-hydroxysuccinimide (NHS), followed by active esterification A method of immobilizing the carboxyl group and the amino group of the secondary antibody by dehydration using water-soluble carbodiimide; a method of immobilizing the secondary antibody having an isothiocyanate and amino group and a fluorescent dye, respectively; Secondary antibody and fluorescent dye having halide and amino group respectively A method of reacting and immobilizing a secondary antibody having an iodoacetamide and a thiol group and a fluorescent dye, respectively; a method of immobilizing a biotinylated fluorescent dye and a streptavidinized secondary antibody (or streptavidinization) And a method of immobilizing the fluorescent dye by reacting with a biotinylated secondary antibody).
このように作製された「蛍光色素と第２のリガンドとからなるコンジュゲート」の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬ
がより好ましい。
The concentration of the thus-produced “conjugate comprising a fluorescent dye and a second ligand” in the solution is preferably 0.001 to 10,000 μg / mL, and preferably 1 to 1,000 μg / mL.
Is more preferable.
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
＜工程（ｃ）＞
本発明のアッセイ法において、工程（ｃ）は、工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、金属コロイド粒子３１を分散させたコロイド液を流しつつ接触させ、該状態で、透明平面基板１１の、金属薄膜１２とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
The temperature, time, and flow rate at which the liquid is circulated are the same as in step (a).
<Step (c)>
In the assay method of the present invention, in the step (c), the plasmon excitation sensor obtained through the step (b) is brought into contact with the colloid liquid in which the metal colloid particles 31 are dispersed while flowing, and in this state, the transparent flat substrate 11 is a step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye by irradiating laser light from the surface opposite to the metal thin film 12 via a prism.
本発明のアッセイ法は、前記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに金属コロイド粒子３１を分散させたコロイド液を流しつつ接触させた状態で蛍光測定を行う点に最大の特徴がある。これにより、プラズモン励起センサに金属コロイド粒子を固定させる場合と比べて測定データの精度が向上する利点がある。また、金属コロイド粒子３１がコロイド液中に分散していることから、検体に合わせて金属コロイド粒子３１の濃度の制御も容易であるという利点もある。 The assay method of the present invention has the greatest feature in that the fluorescence measurement is performed in a state where the colloid liquid in which the metal colloid particles 31 are dispersed is in contact with the plasmon excitation sensor obtained through the step (b). . Thereby, there is an advantage that the accuracy of the measurement data is improved as compared with the case where metal colloid particles are fixed to the plasmon excitation sensor. Further, since the metal colloid particles 31 are dispersed in the colloid liquid, there is an advantage that the concentration of the metal colloid particles 31 can be easily controlled according to the specimen.
ここで、「金属コロイド粒子を分散させたコロイド液」とは、実際にプラズモン励起センサと接触させる状態にあるコロイド溶液またはコロイド懸濁液をいい、以下「コロイド液」と称する場合がある。また、「分散」とは、金属コロイド粒子がコロイド液の中で浮遊しており、全体として凝集および沈降を引き起こしていない状態をいう。 Here, the “colloidal liquid in which metal colloidal particles are dispersed” refers to a colloidal solution or a colloidal suspension that is actually in contact with the plasmon excitation sensor, and may be hereinafter referred to as “colloidal liquid”. “Dispersion” refers to a state in which the metal colloidal particles are floating in the colloidal liquid and do not cause aggregation and sedimentation as a whole.
金属コロイド粒子
本発明において、金属コロイド粒子３１は、光源からの光照射によって表面プラズモン励起した金属薄膜１２からもたらされる電場を受け、この電場により表面プラズモン励起を生じるとともに、金属薄膜１２との間に強い局所電場を生じさせることにより、前記プラズモン励起センサに固定された蛍光標識２４からの発光を増強する役割を果たす。このとき、表面プラズモンによる電場増強効果、およびこの金属コロイド粒子３１と金属薄膜１２との間に生じる局在電場による電場増強効果は、金属コロイド粒子３１が存在しない
場合と比べてそれぞれ１５倍程度および７０倍程度に上る。また、原因は不明であるものの、金属コロイド粒子３１が存在しない場合には、ＳＰＦＳによる蛍光測定の際の蛍光標識２４からの発光強度が経時的に消光する傾向にあるが、金属コロイド粒子３１が存在する場合には、蛍光標識２４からの発光強度における経時的な消光の度合いが少なくなる効果が再現性よく現れる。
Metal colloidal particles In the present invention, the metal colloidal particles 31 receive an electric field generated from the metal thin film 12 that has been surface plasmon excited by light irradiation from a light source, cause surface plasmon excitation by this electric field, and between the metal thin film 12. By generating a strong local electric field, it plays a role of enhancing light emission from the fluorescent label 24 fixed to the plasmon excitation sensor. At this time, the electric field enhancement effect by the surface plasmon and the electric field enhancement effect by the localized electric field generated between the metal colloid particles 31 and the metal thin film 12 are about 15 times as compared with the case where the metal colloid particles 31 do not exist, and It is about 70 times higher. Moreover, although the cause is unknown, when the metal colloid particles 31 are not present, the emission intensity from the fluorescent label 24 at the time of fluorescence measurement by SPFS tends to quench with time. When present, the effect of reducing the degree of quenching with time in the emission intensity from the fluorescent label 24 appears with good reproducibility.
本発明で用いられる金属コロイド粒子３１を構成する金属種には、特に制限はないものの、試料等に対する化学的安定性が高く、可視光によりプラズモン共鳴が効率的に発生することから、金、銀、白金等の貴金属、あるいはこれらの合金が好ましく、その中で、金が特に好ましい。また、この金属コロイド粒子３１を構成する金属は、金属薄膜１２を構成する金属と同じでもよく、あるいは異なっていてもよい。 The metal species constituting the metal colloidal particles 31 used in the present invention are not particularly limited, but have high chemical stability with respect to a sample and the like, and plasmon resonance is efficiently generated by visible light. In addition, noble metals such as platinum or alloys thereof are preferable, and gold is particularly preferable. The metal constituting the metal colloidal particles 31 may be the same as or different from the metal constituting the metal thin film 12.
金属コロイド粒子３１の粒径については、上記「コロイド液」中でコロイドとして分散状態を維持でき、且つ本発明の作用・効果を発揮できる程度に局在表面プラズモン共鳴を十分に起こすことができる限り特に制限はない。しかし、一般的に、金属コロイド粒子３１の最大吸光波長は、構成金属種により変わるほか、構成金属種が同じであっても、金属コロイド粒子３１の粒径が大きくなるほど大きくなる傾向にある。そのため、金属コロイド粒子３１の粒径は、前記プラズモン励起センサに固定された蛍光標識２４の最大蛍光波長との関係で、蛍光標識２４からの蛍光が金属コロイド粒子３１による吸光により消光されないような粒径であることが望ましい。具体的には、その粒径が０．１〜１００００ｎｍの範囲内にあることが好ましく、１ｎｍ〜１００ｎｍであるとより好ましい。 As for the particle size of the metal colloidal particles 31, as long as it can maintain a dispersed state as a colloid in the “colloid liquid” and can sufficiently cause localized surface plasmon resonance to the extent that it can exhibit the functions and effects of the present invention. There is no particular limitation. However, generally, the maximum absorption wavelength of the metal colloid particles 31 varies depending on the constituent metal species, and even if the constituent metal species are the same, the maximum colloidal particle 31 tends to increase as the particle size of the metal colloid particles 31 increases. Therefore, the particle diameter of the metal colloidal particles 31 is a particle whose fluorescence from the fluorescent label 24 is not quenched by absorption by the metal colloidal particles 31 in relation to the maximum fluorescence wavelength of the fluorescent label 24 fixed to the plasmon excitation sensor. The diameter is desirable. Specifically, the particle size is preferably in the range of 0.1 to 10,000 nm, more preferably 1 nm to 100 nm.
金属コロイド粒子３１の形状については、任意の形状のものであってもよく、例えば、球状、楕円状、円柱状などの形状を有するものが挙げられる。
このような金属コロイド粒子３１は、様々な粒径を有する金属コロイド粒子のコロイド溶液の形態で市販品として入手可能である。あるいは、このような金属コロイド粒子３１を、従来公知の方法、例えば、ＨＡｕＣｌ4、Ｈ2ＰｔＣｌ4、硝酸銀などの金属化合物の
溶液を還元することによって得ることもできる。
The shape of the metal colloidal particles 31 may be any shape, and examples include those having a spherical shape, an elliptical shape, a cylindrical shape, and the like.
Such metal colloidal particles 31 are commercially available in the form of colloidal solutions of metal colloidal particles having various particle sizes. Alternatively, such metal colloidal particles 31 can be obtained by a conventionally known method, for example, by reducing a solution of a metal compound such as HAuCl 4 , H 2 PtCl 4 , silver nitrate.
また、この「コロイド液」中での金属コロイド粒子３１の分散性を向上させ、また、非特異吸着を防止するため、金属コロイド粒子３１の表面にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）修飾等の表面処理を施すことが望ましい。ＰＥＧ修飾金属コロイド粒子は、例えば、特開２００１−２０００５０号公報（特許文献４）および特開２００５−３２８８０９号公報（特許文献５）等に記載されているように、メルカプト基またはポリアミンを有するＰＥＧを金属微粒子と混合することによる調製することができる。あるいは、ＨＡｕＣｌ4、Ｈ2ＰｔＣｌ4、硝酸銀などの金属化合物の溶液を還元する際に、このような官能基を
有するＰＥＧを共存させることにより調製してもよい。
Further, in order to improve the dispersibility of the metal colloid particles 31 in this “colloid liquid” and prevent non-specific adsorption, the surface of the metal colloid particles 31 is subjected to a surface treatment such as PEG (polyethylene glycol) modification. It is desirable. PEG-modified metal colloidal particles are, for example, PEG having a mercapto group or a polyamine as described in JP2001-200050 (Patent Document 4) and JP2005-328809 (Patent Document 5). Can be prepared by mixing with fine metal particles. Alternatively, HAuCl 4, H 2 PtCl 4 , when the reduction of the solution of a metal compound such as silver nitrate, may be prepared in the coexistence of the PEG having such a functional group.
コロイド液
本発明において、金属コロイド粒子３１は、上記「コロイド液」として分散浮遊した状態で用いられる。そして、このコロイド液を測定系内に導入し、工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに流しつつ接触させた状態で蛍光測定が行われる。
Colloidal liquid In the present invention, the metal colloidal particles 31 are used in a dispersed and suspended state as the “colloidal liquid”. Then, this colloidal solution is introduced into the measurement system, and fluorescence measurement is performed in a state where the colloidal liquid is brought into contact with the plasmon excitation sensor obtained through the step (b).
このコロイド液は、金属コロイド粒子３１が分散浮遊した状態を保ち且つ金属コロイド粒子３１によるプラズモン励起を妨げない限り、どのような種類の溶剤に対するコロイド液として調製してもよい。通常は、市販の金属コロイド溶液、あるいは、前述の方法により調製した金属コロイド粒子３１の溶液を、適当なバッファ溶液で適当な濃度に稀釈することにより調製される。ここで用いられるバッファ溶液として、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モル
ホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）の各バッファ溶液が挙げられる。
This colloidal solution may be prepared as a colloidal solution for any type of solvent as long as the colloidal metal particles 31 remain dispersed and suspended and the plasmon excitation by the metal colloidal particles 31 is not hindered. Usually, it is prepared by diluting a commercially available metal colloid solution or a solution of metal colloid particles 31 prepared by the above-described method to an appropriate concentration with an appropriate buffer solution. Examples of the buffer solution used here include phosphate buffered saline (PBS), trishydroxymethylaminomethane (Tris), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES). ) And 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer solutions.
また、本発明のアッセイ法において、上記「コロイド液」に含まれる金属コロイド粒子３１の濃度が高くなるほど、金属コロイド粒子３１におけるプラズモン励起による蛍光標識２４からの発光強度の増大がより強く起こる傾向がある。この性質を利用して、検体中のアナライト２２の濃度に応じて、コロイド液中の金属コロイド粒子３１の濃度を加減することができ、検体に合わせて最適な条件で蛍光測定を行うことができる。本発明において、コロイド液中の金属コロイド粒子３１の濃度は０．００００００１〜０．１％の範囲内にあることが好ましい。 In the assay method of the present invention, as the concentration of the metal colloid particles 31 contained in the “colloid liquid” increases, the emission intensity from the fluorescent label 24 due to plasmon excitation in the metal colloid particles 31 tends to increase more strongly. is there. By utilizing this property, the concentration of the metal colloid particles 31 in the colloidal liquid can be adjusted according to the concentration of the analyte 22 in the sample, and fluorescence measurement can be performed under optimum conditions according to the sample. it can. In the present invention, the concentration of the metal colloid particles 31 in the colloid liquid is preferably in the range of 0.0000001 to 0.1%.
一方、このコロイド液に含まれる金属コロイド粒子３１の濃度が一定の濃度を超えて高くなると、発光が金属コロイドにより反射・散乱することで増強効果を効率よく検出できなくなる場合がある。また、このコロイド液の原料として市販の金属コロイド溶液を用いる場合、このコロイド液中の金属コロイド粒子３１の濃度は、使用する市販の金属コロイド溶液の原液の濃度によって決まることから、通常0.03％程度以上の濃度とすることは困難である。 On the other hand, if the concentration of the metal colloid particles 31 contained in the colloid liquid increases beyond a certain concentration, the enhancement effect may not be detected efficiently due to reflection / scattering of light emission by the metal colloid. Further, when a commercially available metal colloid solution is used as a raw material for this colloid solution, the concentration of the metal colloid particles 31 in this colloid solution is determined by the concentration of the stock solution of the commercially available metal colloid solution to be used, and is usually about 0.03%. It is difficult to achieve the above concentration.
以上の点を考慮すると、上記「コロイド液」中に含まれる金属コロイド粒子３１の濃度が、０．００００００１％〜０．０１％であることがより好ましい。
蛍光測定に用いられる「コロイド液」のｐＨは、金属コロイド粒子３１が分散浮遊した状態を保ち且つ金属コロイド粒子によるプラズモン励起を妨げない限り、特に制限がないものの、蛍光測定を行う測定環境としてｐＨ１〜１４、のぞましくはｐＨ４〜１０の範囲にあることが好ましい。
Considering the above points, the concentration of the metal colloid particles 31 contained in the “colloid liquid” is more preferably 0.0000001% to 0.01%.
The pH of the “colloid liquid” used for the fluorescence measurement is not particularly limited as long as the colloidal metal particles 31 are kept in a dispersed and suspended state and plasmon excitation by the metal colloid particles is not hindered. -14, preferably in the range of pH 4-10.
また、バッファ溶液に含まれる塩濃度は、金属コロイド粒子３１が凝集しない限り任意の濃度とすることができる。特に、金属コロイド粒子３１として表面処理を施している粒子を用いる場合には、各種アッセイ法で用いられるバッファ溶液として通常用いられる塩濃度であれば、特に問題とならない。 The salt concentration contained in the buffer solution can be set to any concentration as long as the metal colloid particles 31 are not aggregated. In particular, in the case of using surface-treated particles as the metal colloidal particles 31, there is no particular problem if the salt concentration is normally used as a buffer solution used in various assay methods.
上記「コロイド液」は、上記流路を通じてプラズモン励起センサに送達され、このコロイド液中の金属コロイド粒子３１とプラズモン励起センサとの接触がなされる。本発明によるアッセイ法においては、蛍光測定は、この「コロイド液」が常に流動しながら、その中の金属コロイド粒子３１とプラズモン励起センサとの接触がなされている状態で行われる。 The “colloid liquid” is delivered to the plasmon excitation sensor through the channel, and the metal colloid particles 31 in the colloid liquid and the plasmon excitation sensor are brought into contact with each other. In the assay method according to the present invention, the fluorescence measurement is performed in a state where the colloidal liquid 31 is constantly flowing and the metal colloid particles 31 in the liquid crystal 31 are in contact with the plasmon excitation sensor.
光学系
本発明のアッセイ法で用いる光源は、前記金属薄膜１２および前記金属コロイド粒子３１にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
Optical system The light source used in the assay method of the present invention is not particularly limited as long as it can cause plasmon excitation in the metal thin film 12 and the metal colloidal particles 31. In view of energy intensity, it is preferable to use laser light as a light source. It is desirable to adjust the energy and photon amount immediately before the laser light enters the prism through the optical filter.
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜１２の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光標識２４を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明平面基板１１の屈折率、金属薄膜１２の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。本発明のアッセイ法では、金属薄膜１２における表面プラズモン発生に加えて、金属コロイド粒子３１における表面プラズモン発生、および金属薄膜１２と金属コロイド粒子３１との間に生じる局在電場の増強も生じることから、さらに電場増強が誘起され、さらにフォトンが増加し、蛍光標識２
４をさらに強く励起する。
Irradiation with laser light generates surface plasmons on the surface of the metal thin film 12 under the total reflection attenuation condition (ATR). Due to the electric field enhancement effect of the surface plasmon, the fluorescent label 24 is excited by photons that have increased by several tens to several hundred times the amount of photons irradiated. In addition, although the photon increase amount by this electric field enhancement effect depends on the refractive index of the transparent flat substrate 11 and the metal species and film thickness of the metal thin film 12, it is usually about 10 to 20 times the increase amount in gold. In the assay method of the present invention, in addition to surface plasmon generation in the metal thin film 12, surface plasmon generation in the metal colloid particles 31 and enhancement of a localized electric field generated between the metal thin film 12 and the metal colloid particles 31 also occur. Further, electric field enhancement is induced, photons are increased, and fluorescent label 2
4 is excited more strongly.
蛍光標識２４は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。 In the fluorescent label 24, electrons in the molecule are excited by light absorption, move to the first electron excited state in a short time, and return to the ground state from this state (level), the wavelength corresponding to the energy difference. Emits fluorescence.
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤレーザ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜１２に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。 Examples of the “laser light” include an LD laser having a wavelength of 200 to 900 nm, 0.001 to 1,000 mW, a wavelength of 230 to 800 nm (the resonance wavelength is determined by the metal species used for the metal thin film 12), and 0.01 to 100 mW. And semiconductor lasers.
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明平面基板１１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。 The “prism” is intended to allow the laser light through various filters to efficiently enter the plasmon excitation sensor, and preferably has the same refractive index as that of the transparent flat substrate 11. In the present invention, various prisms for which total reflection conditions can be set can be selected as appropriate, and therefore, there is no particular limitation on the angle and shape. For example, a 60-degree dispersion prism may be used. Examples of such commercially available prisms include those similar to the above-mentioned commercially available “glass-made transparent flat substrate”.
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。 Examples of the “optical filter” include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens. The “darkening (ND) filter” (or neutral density filter) is intended to adjust the amount of incident laser light. In particular, when a detector with a narrow dynamic range is used, it is preferable to use it for carrying out a highly accurate measurement.
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
The “polarizing filter” is used to make the laser light P-polarized light that efficiently generates surface plasmons.
“Cut filters” are external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), plasmon scattering light (excitation light originated from plasmon A filter that removes various types of noise light such as scattered light generated by the influence of structures or deposits on the surface of the excitation sensor), autofluorescence of the enzyme fluorescent substrate, and examples thereof include interference filters and color filters. It is done.
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。 The “collecting lens” is intended to efficiently collect the fluorescent signal on the detector, and may be an arbitrary condensing system. As a simple condensing system, a commercially available objective lens (for example, manufactured by Nikon Corporation or Olympus Corporation) used in a microscope or the like may be used. The magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。 As the “SPFS detection unit”, a photomultiplier (a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) is preferable from the viewpoint of ultrahigh sensitivity. Also, although the sensitivity is lower than these, a CCD image sensor capable of multipoint measurement is also suitable because it can be viewed as an image and noise light can be easily removed.
＜工程（ｄ）＞
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト２２の量を算出する工程である。
<Step (d)>
Step (d) is a step of calculating the amount of analyte 22 contained in the specimen from the measurement result obtained in step (c).
より具体的には、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。 More specifically, a calibration curve is created by performing measurement with a target antigen or target antibody at a known concentration, and the target antigen amount or target antibody amount in the sample to be measured is measured based on the created calibration curve. This is a step of calculating from the signal.
アナライト
アナライト２２としては、上記「蛍光色素層」に固定化されたリガンドを特異的に認識
され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
The analyte analyte 22 is a molecule or molecular fragment capable of specifically recognizing (or recognizing) and binding to the ligand immobilized on the “fluorescent dye layer”, and the “molecule” or “Molecular fragments” include, for example, nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., which may be single-stranded or double-stranded, or nucleosides, nucleotides and their Modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or their modified molecules, complexes, etc. Specifically, it may be a carcinoembryonic antigen such as AFP (α-fetoprotein), a tumor marker, a signaling substance, a hormone, etc. It is not particularly limited.
アッセイＳ／Ｎ比
さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）の前に測定した“ブランク蛍光シグナル”、上記工程（ｃ）で得られた“アッセイ蛍光シグナル”、および何も修飾していない金基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを“初期ノイズ”としたとき、下記式（１ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa／Ｉo｜／Ｉn （１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉaはアッセイ蛍光シグナル、Ｉoはブランク蛍光シグナル、Ｉnは初期ノイズである）。
Assay S / N ratio In addition, step (d) is a “blank fluorescence signal” measured before step (c) above, “assay fluorescence signal” obtained in step (c) above, and nothing modified. An S / N ratio expressed by the following formula (1a) is calculated when the signal obtained by measuring SPFS while flowing ultrapure water while fixing a non-gold substrate to the flow path is defined as “initial noise”. can do:
Assay S / N ratio = | Ia / Io | / In (1a)
(In the above formula (1a), Ia is the assay fluorescence signal, Io is the blank fluorescence signal, and In is the initial noise).
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、検体中に含まれるアナライト２２の濃度が０の場合における“アッセイノイズシグナル”を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa｜／｜Ｉan｜ （１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉanはアッセイノイズシグナル、Ｉaは上記式（１ａ）の場
合と同様にアッセイ蛍光シグナルである）。
However, in calculating the assay S / N ratio, in practice, instead of the above formula (1a), the “assay noise signal” in the case where the concentration of the analyte 22 contained in the sample is 0 is used as a reference. It may be calculated according to equation (1b):
Assay S / N ratio = | Ia | / | Ian | (1b)
(In the above formula (1b), Ian is an assay noise signal and Ia is an assay fluorescence signal as in the above formula (1a)).
〔装置〕
本発明の装置は、上記工程（ｃ）に用いられることを特徴とするものである。すなわち、本発明の装置は、上記プラズモン励起センサを用いて、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。
〔apparatus〕
The apparatus of the present invention is used in the step (c). That is, the apparatus of the present invention is for carrying out the assay method of the present invention using the plasmon excitation sensor.
「装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。なお、検体液、洗浄液、標識抗体液、または金属コロイド粒子３１を分散させたコロイド液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。 The “apparatus” includes at least a light source, various optical filters, a prism, a cut filter, a condenser lens, and an SPFS detection unit. It is preferable to have a liquid feeding system combined with a plasmon excitation sensor when handling a sample liquid, a washing liquid, a labeled antibody liquid, or a colloid liquid in which metal colloid particles 31 are dispersed. The type of liquid feeding system is not limited as long as the object of the present invention can be achieved. For example, a microchannel device connected to a liquid pump may be used.
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。 In addition, a surface plasmon resonance (SPR) detection unit, that is, a photodiode as a light receiving sensor dedicated to SPR, an angle variable unit for adjusting the optimum angle of SPR and SPFS (to determine total reflection attenuation (ATR) conditions with a servomotor) The angle of 45 to 85 ° can be changed by synchronizing the photodiode and the light source with a resolution of preferably 0.01 ° or more.), A computer for processing information input to the SPFS detector May also be included.
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
Preferred embodiments of the light source, the optical filter, the cut filter, the condensing lens, and the SPFS detection unit are the same as those described above.
As the “liquid feed pump”, for example, a micro pump suitable for a small amount of liquid feed, a syringe pump with high feed accuracy and low pulsation, which is preferable but cannot be circulated, a simple and excellent handleability but a small amount of liquid feed For example, a tube pump may be difficult.
〔キット〕
本発明のキットは、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とするものであって、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、第１のリガンドと第２のリガンドと検体とを除き必要とされるすべてのもの、例えば、１次抗体、抗原などのリガンド（すなわち、検体中に含まれるアナライト２２は、抗原とは限らず、抗体であってもよい。）と検体と２次抗体とを除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
〔kit〕
The kit of the present invention is characterized in that it is used in the assay method of the present invention, and is necessary for carrying out the assay method of the present invention except for the first ligand, the second ligand, and the specimen. For example, a primary antibody, a ligand such as an antigen (that is, the analyte 22 contained in the specimen is not limited to an antigen, and may be an antibody), a specimen, and a secondary antibody. It is preferred to include everything needed except for.
例えば、本発明のキットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。 For example, by using the kit of the present invention, blood or serum as a specimen, and an antibody against a specific tumor marker, the content of the specific tumor marker can be detected with high sensitivity and high accuracy. From this result, the presence of a preclinical noninvasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by palpation or the like can be predicted with high accuracy.
このような「キット」としては、具体的に、透明平面基板１１の一方の表面に金属薄膜１２を形成したプラズモン励起センサ；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。 As such a “kit”, specifically, a plasmon excitation sensor in which a metal thin film 12 is formed on one surface of a transparent flat substrate 11; a solution or dilution liquid for dissolving or diluting a specimen; a plasmon excitation sensor; Examples include various reaction reagents and washing reagents for reacting with a specimen, and various devices or materials necessary for carrying out the assay method of the present invention and the above-mentioned “device” can also be included.
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。 Further, the kit element may include a standard material for preparing a calibration curve, instructions, a necessary set of equipment such as a microtiter plate capable of simultaneously processing a large number of samples, and the like.
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［作製例１］(プラズモン励起センサの作製)
屈折率〔ｎd〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ
−ＬＡＬ １０）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。
Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited by these.
[Production Example 1] (Production of plasmon excitation sensor)
A transparent glass substrate made of glass having a refractive index [n d ] of 1.72 and a thickness of 1 mm (S manufactured by OHARA INC.)
-LAL 10) was plasma-cleaned, a chromium thin film was formed on one surface of the substrate by sputtering, and a gold thin film was further formed on the surface by sputtering. The chromium thin film had a thickness of 1 to 3 nm, and the gold thin film had a thickness of 44 to 52 nm.
このようにして得られた基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。この基板を、前記エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。 The substrate thus obtained is immersed in an ethanol solution containing 1 mM of 10-carboxy-1-decanethiol for 24 hours or more to form a SAM (Self Assembled Monolayer) on one surface of a gold thin film. did. The substrate was taken out from the ethanol solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried using an air gun.
次に、このように基板上に形成したＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有し、且つ適当な形状および大きさを有する穴のあいたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサーを配置した（このシリコーンゴム製スペーサーは送液に触れない状態にある。）。このＰＤＭＳ製シート及び該シリコーンゴム製スペーサーの上に、送液導入用の穴及び送液排出用の穴を予めそれぞれ形成してあるＰＭＭＡ基板を、ＰＤＭＳ製シートで囲まれた領域の内側にこれらの穴が位置するように配置した（このとき、前記ＳＡＭ表面が流路の内側となるように、ＰＭＭＡ基板が配置されている）。これらを流路の外側から圧着し、ビスでＰＭＭＡ基板と流路シート（すなわち、前記ＰＤＭＳ製シート）とプラズモン励起センサ（すなわち、前記ＳＡＭを形成した基板）とを固定した。 Next, on the surface of the SAM formed on the substrate in this way, a polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a flow path height of 0.5 mm and having a suitable shape and size is provided, Further, a spacer made of silicone rubber was disposed around the PDMS sheet (the silicone rubber spacer is not in contact with the liquid feeding). On the PDMS sheet and the silicone rubber spacer, a PMMA substrate on which a hole for introducing a liquid and a hole for discharging a liquid are formed in advance are placed inside the area surrounded by the sheet made of PDMS. (The PMMA substrate is arranged so that the SAM surface is inside the flow path). These were pressure-bonded from the outside of the channel, and the PMMA substrate, the channel sheet (that is, the PDMS sheet) and the plasmon excitation sensor (that is, the substrate on which the SAM was formed) were fixed with screws.
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを３０分間循
環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。なお、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳにて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。
Subsequently, 5 mL of phosphate buffered saline (PBS) containing 50 mM of N-hydroxysuccinimide (NHS) and 100 mM of water-soluble carbodiimide (WSC) was fed and circulated for 20 minutes. By circulating 2.5 ml of anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (1D5, 2.5 mg / mL, manufactured by Japan Medical Clinical Laboratory Laboratories) solution for 30 minutes, the primary antibody was transferred onto the SAM. Solidified. In addition, the nonspecific adsorption | suction prevention process was performed by circulating and feeding for 30 minutes by PBS containing 1 weight% bovine serum albumin (BSA).
［作製例２］（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
２次抗体として、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）を、市販のビオチン化キット（（株）同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。
[Preparation Example 2] (Preparation of Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled secondary antibody)
Anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (available from Nippon Medical Laboratory, Inc.) as a secondary antibody is biotinylated using a commercially available biotinylation kit (manufactured by Dojindo Laboratories). did. The procedure followed the protocol attached to the kit.
次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。 Next, the obtained biotinylated anti-AFP monoclonal antibody solution and a streptavidin-labeled Alexa Fluor (registered trademark) 647 (manufactured by Molecular Probes) solution are mixed and reacted by stirring at 4 ° C. for 60 minutes. It was.
最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。 Finally, the unreacted antibody and the unreacted enzyme were purified using a molecular weight cut filter (manufactured by Nippon Millipore) to obtain an Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled anti-AFP monoclonal antibody solution. The obtained antibody solution was stored at 4 ° C. after protein quantification.
［実施例１］
工程（ａ）として、まず、作製例１で得られたプラズモン励起センサに標的抗原としてＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を０．５ｍＬ添加し、２５分間循環させた。
[Example 1]
As step (a), first, 0.5 mL of a PBS solution containing 1 ng / mL of AFP as a target antigen was added to the plasmon excitation sensor obtained in Preparation Example 1 and circulated for 25 minutes.
工程（ｂ）として、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢ
Ｓ）を送液として１０分間循環させることによって洗浄した後、作製例２で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬとなるよう
に調製したＰＢＳ溶液）を２．５ｍＬ添加し、２０分間循環させた。
As a step (b), Tris buffered saline (TB) containing 0.05% by weight of Tween 20 is used.
After washing by circulating S) for 10 minutes as a solution, Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled secondary antibody obtained in Preparation Example 2 (PBS solution prepared to be 1,000 ng / mL) was used. 2.5 mL was added and circulated for 20 minutes.
工程（ｃ）として、まず、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１
０分間循環させることによって洗浄した。その後、０．５ｍＬ、０．０００７５％金コロイド溶液（金コロイド平均粒径２０ｎｍ）を０．５ｍＬ／ｍｉｎで送液することでプラズモン励起センサに金コロイドを接触させた。プラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイシグナル」とした。
As the step (c), first, TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 is used as a liquid feed.
Washed by circulating for 0 minutes. Thereafter, the gold colloid was brought into contact with the plasmon excitation sensor by feeding 0.5 mL, 0.00075% colloidal gold solution (gold colloid average particle size 20 nm) at 0.5 mL / min. The plasmon excitation sensor is irradiated with laser light (640 nm, 40 μW) via a prism (manufactured by Sigma Koki Co., Ltd.) from the other surface of the glass transparent flat substrate on which the gold thin film is not formed. The signal value when the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye was observed from the CCD was measured and used as an “assay signal”.
なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬの場合におけるＳＰＦＳシグナルを「アッセイノイズシグナル」とした。
工程（ｄ）として、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、アッセイＳ／Ｎ比を以下の式を用いて算出し、各条件での感度に関して、金コロイドを使用しない測定結果（比較例１）を基準とした規格値（LP増強率）により評価した。
The SPFS signal when AFP was 0 ng / mL was defined as “assay noise signal”.
As the step (d), the assay S / N ratio is calculated from the measurement results obtained in the above step (c) by using the following formula, and the measurement results without using colloidal gold for the sensitivity under each condition (comparison) Evaluation was performed based on the standard value (LP enhancement rate) based on Example 1).
アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）｜／｜（アッセイノイズシグナル）｜
すなわち、規格値（LP増強率）が大きければアッセイＳ／Ｎ比が向上していることを意味し、イムノアッセイ測定の信頼性が高いことがわかる。
Assay S / N ratio = | (assay fluorescence signal) | / | (assay noise signal) |
That is, if the standard value (LP enhancement rate) is large, it means that the assay S / N ratio is improved, and it can be seen that the reliability of the immunoassay measurement is high.
得られた結果を後記表２に示す。
［実施例２］
実施例１のアッセイ法の実施において、０．５ｍＬ、０．０００７５％金コロイド溶液（金コロイド平均粒径２０ｎｍ）を０．５ｍＬ／ｍｉｎで送液する代わりに、０．５ｍＬ、０．００１５％金コロイド溶液（金コロイド平均粒径２０ｎｍ）を０．５ｍＬ／ｍｉｎ
で送液したことを除いて、実施例１と同様の条件にて実施した。得られた結果を後記表２に示す。
The obtained results are shown in Table 2 below.
[Example 2]
In carrying out the assay method of Example 1, instead of feeding 0.5 mL, 0.00075% colloidal gold solution (gold colloid average particle size 20 nm) at 0.5 mL / min, 0.5 mL, 0.0015% Gold colloid solution (gold colloid average particle size 20 nm) 0.5 mL / min
Was carried out under the same conditions as in Example 1 except that the liquid was fed in step 1. The obtained results are shown in Table 2 below.
［比較例１］
実施例１のアッセイ法の実施において、０．５ｍＬ、０．０００７５％金コロイド溶液（金コロイド平均粒径２０ｎｍ）を０．５ｍＬ／ｍｉｎで送液する代わりに、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを０．５ｍＬ／ｍｉｎで送液したことを除いて、実施例
１と同様の条件にて実施した。
[Comparative Example 1]
In carrying out the assay method of Example 1, instead of sending 0.5 mL, 0.00075% colloidal gold solution (gold colloid average particle size 20 nm) at 0.5 mL / min, 0.05% by weight of Tween 20 is contained. The test was carried out under the same conditions as in Example 1 except that TBS was fed at 0.5 mL / min.
得られた結果を下記表２に示す。 The obtained results are shown in Table 2 below.
表２から、表面プラズモン増強蛍光を使用したとき（比較例１）に較べて、金属コロイドを分散状態で使用した系（実施例１、２）では有意に感度が向上していることが明らかである。本発明では、金属コロイドが溶液中に分散状態であるため、金属コロイド密度は極めて均質である。そのため、従来報告されているような局在プラズモンを利用した方法と較べて高い再現性が見込まれ、本発明が高感度かつ高精度な測定方法であることがわかった。 From Table 2, it is clear that the sensitivity is significantly improved in the system (Examples 1 and 2) in which the metal colloid is used in a dispersed state as compared with the case where surface plasmon enhanced fluorescence is used (Comparative Example 1). is there. In the present invention, since the metal colloid is dispersed in the solution, the metal colloid density is extremely uniform. Therefore, high reproducibility is expected compared with a method using a localized plasmon as reported conventionally, and it was found that the present invention is a highly sensitive and highly accurate measurement method.
本発明のアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。 Since the assay method of the present invention can be detected with high sensitivity and high accuracy, for example, even a very small amount of tumor marker contained in blood can be detected. The presence of pre-clinical non-invasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by, for example, can be predicted with high accuracy.
１１・・・透明平面基板
１２・・・金属薄膜
１３・・・ＳＡＭ
２１・・・第１のリガンド
２２・・・アナライト
２３・・・第２のリガンド
２４・・・蛍光標識
３１・・・金属コロイド粒子
11 ... Transparent flat substrate 12 ... Metal thin film 13 ... SAM
DESCRIPTION OF SYMBOLS 21 ... 1st ligand 22 ... Analyte 23 ... 2nd ligand 24 ... Fluorescent label 31 ... Metal colloid particle
Claims (11)
工程（ａ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは反対側の表面に形成された自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」と称す。）と、該ＳＡＭの、該金属薄膜とは反対側の表面に固定化された第１のリガンドとからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光標識とからなるコンジュゲートを接触させ、これらを反応させる工程；
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、金属コロイド粒子を分散させたコロイド液を流しつつ接触させ、該状態で、前記透明平面基板の、前記金属薄膜とは反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された前記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程；および、
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、前記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。 An assay method comprising the following steps (a) to (d):
Step (a): a transparent flat substrate, a metal thin film formed on one surface of the substrate, and a self-assembled monomolecular film (hereinafter referred to as “the surface of the metal thin film opposite to the substrate”). SAM ”)) and a plasmon excitation sensor comprising a first ligand immobilized on the surface of the SAM opposite to the metal thin film;
Step (b): A step of bringing the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) into contact with a conjugate comprising a second ligand and a fluorescent label, and reacting them;
Step (c): The plasmon excitation sensor obtained through the step (b) is brought into contact with the colloid liquid in which metal colloid particles are dispersed while flowing, and in this state, what is the metal thin film of the transparent flat substrate? Irradiating laser light from the opposite surface via a prism and measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye; and
Step (d): A step of calculating the amount of the analyte contained in the sample from the measurement result obtained in the step (c).
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