JP5298876B2 - Plasmon excitation sensor and assay method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法に関する。さらに詳しくは、本発明は、金属薄膜の上に蛍光色素とリガンドとが固定化されているプラズモン励起センサ、および表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）の原理に基づき該センサを用いたアッセイ法に関する。 The present invention relates to a plasmon excitation sensor and assay method using it. More specifically, the present invention is based on the principle of a plasmon excitation sensor in which a fluorescent dye and a ligand are immobilized on a metal thin film, and surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) (Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy). based about the assay method using the sensor.
表面プラズモン励起増強蛍光分析法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。 Surface plasmon excitation-enhanced fluorescence analysis (SPFS) is performed by generating a dense wave (surface plasmon) on the surface of a metal thin film under the condition that the irradiated laser light is attenuated by total reflection (ATR) on the surface of the gold thin film. The amount of photons that the laser beam has is increased to several tens to several hundreds times (electric field enhancement effect of surface plasmon), and by this, the fluorescent dye in the vicinity of the gold thin film is efficiently excited, so that a trace amount and / or extremely low concentration can be obtained. It is a method that can detect an analyte.
このようなＳＰＦＳの原理に基づいたバイオセンサまたはバイオチップに関わる例として、特許文献１には、金属基板表面にカルボキシメチルデキストランを用いたリガンド（１次抗体）固定化膜を配し、表面プラズモンにより増強された電場で抗原に関係付けられた蛍光色素を検出する方法が示されている。 As an example related to a biosensor or biochip based on the principle of SPFS, Patent Document 1 discloses a surface plasmon in which a ligand (primary antibody) immobilization film using carboxymethyldextran is arranged on the surface of a metal substrate. A method for detecting a fluorescent dye associated with an antigen with an enhanced electric field is shown.
しかしながら、極微量アナライト(標的抗原)の検出においては、アッセイで抗原に関係付けられるコンジュゲート中の蛍光色素量も極微量であり、このことが蛍光発生量のボトルネックとなるため、プラズモン電場増強を用いても蛍光シグナル量が上がらず、アッセイ感度の向上は難しい。 However, in the detection of trace analytes (target antigens), the amount of fluorescent dye in the conjugate associated with the antigen in the assay is also extremely small, which becomes a bottleneck in the amount of fluorescence generated, and therefore the plasmon electric field Even if enhancement is used, the amount of fluorescence signal does not increase, and it is difficult to improve assay sensitivity.
一方、表面プラズモン励起増強において蛍光強度を効果的に増強する研究が行われており、特許文献２には、電場増強効果が高い金ナノ粒子（直径：２〜３０ｎｍ）を含むハイブリッド・プローブ粒子が開示されており、該ハイブリッド・プローブ粒子は、該金ナノ粒子の表面の一方において１〜１００の抗体タイプのタンパク質が金−硫黄結合により結合され、そして他方において少なくとも１０の蛍光有機色素が金−硫黄結合により結合している。 On the other hand, studies have been conducted to effectively enhance fluorescence intensity in enhancement of surface plasmon excitation. Patent Document 2 discloses hybrid probe particles including gold nanoparticles (diameter: 2 to 30 nm) having a high electric field enhancement effect. The hybrid probe particles are disclosed wherein 1 to 100 antibody-type proteins are bound by gold-sulfur bonds on one of the gold nanoparticle surfaces, and on the other hand at least 10 fluorescent organic dyes are gold- Bonded by sulfur bond.
また、特許文献３には、１００〜８００ｎｍの断面粒径と３０〜５０ｎｍの厚さを有する平板状銀粒子をアイランド膜として基板上に密に配列した表面上に、単層または多層に蛍光物質を担持させている蛍光素子が記載され、銀粒子表面と蛍光物質との距離を調節するために、金属粒子表面にスペーサを備えている。 Further, Patent Document 3 discloses that a fluorescent material is formed in a single layer or multiple layers on a surface in which flat silver particles having a cross-sectional particle size of 100 to 800 nm and a thickness of 30 to 50 nm are densely arranged on a substrate as an island film. In order to adjust the distance between the silver particle surface and the fluorescent material, a spacer is provided on the metal particle surface.
特許文献２および３に記載の発明は、蛍光色素層を金属近傍に配置することによりフォトンの利用効率を向上させて、蛍光発生の効率も改良される可能性があるが、蛍光色素の絶対量が少ない場合は対応できない。また、蛍光色素はコンジュゲートの形態に発展することは難しく、検出すべきアナライト量と関係付けられていないため、それ自体に特異性はなく、イムノアッセイに利用することもできない。 In the inventions described in Patent Documents 2 and 3, there is a possibility that the use efficiency of photons is improved by arranging the fluorescent dye layer in the vicinity of the metal, and the efficiency of fluorescence generation may be improved. If there are few, it cannot respond. Also, fluorescent dyes are difficult to evolve into conjugate forms and are not specific to themselves because they are not related to the amount of analyte to be detected and cannot be used for immunoassays.
本発明は、高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れたプラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a high-sensitivity and high-precision plasmon excitation sensor excellent in specificity that is indispensable for an immunoassay and an assay method using the same.
本発明者らは、上記の問題および従来のサンドイッチイムノアッセイ法（図１）が抱える問題、すなわち、極微量のアナライトを検出する場合、通常のサンドイッチイムノアッセイ法を行っても、コンジュゲート自体も理論的に極微量なため、しばしば増強電場に見合う蛍光プローブ量が存在せず、感度的に満足するものとはならないという問題を解決すべく鋭意研究した結果、従来のサンドイッチイムノアッセイ法（図１）と、表面プラズモン励起増強蛍光分析法とを組合わせ、さらにセンサと抗原との結合の有無により蛍光を消光する機構を設ける、すなわち発光と消光との機能を分担することによって、極微量のアナライト（例えば、標的抗原）であってもフォトン量に見合った蛍光発光と特異性とを両立できることを見出し、本発明を完成するに至った。 The inventors of the present invention have problems with the above problems and the conventional sandwich immunoassay method (FIG. 1), that is, when detecting a very small amount of analyte, the conventional sandwich immunoassay method is used, and the conjugate itself is theoretical. As a result of diligent research to solve the problem that the amount of fluorescent probe that often corresponds to the enhanced electric field does not exist and is not satisfactory in terms of sensitivity, the conventional sandwich immunoassay method (FIG. 1) and In combination with surface plasmon excitation enhanced fluorescence analysis, a mechanism for quenching fluorescence by the presence or absence of binding between the sensor and the antigen is provided, that is, by sharing the functions of light emission and quenching, a very small amount of analyte ( For example, even if it is a target antigen), it has been found that both fluorescence emission and specificity commensurate with the amount of photons can be achieved. It has been completed.
すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素層と、該蛍光色素層の、該スペーサ層とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドとを含むことを特徴としている。 That is, the plasmon excitation sensor of the present invention includes a transparent flat substrate, a metal thin film formed on one surface of the substrate, and a dielectric formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the substrate. A spacer layer made of a body, a fluorescent dye layer formed on the other surface of the spacer layer not in contact with the metal thin film, and the other of the fluorescent dye layer not in contact with the spacer layer And a ligand immobilized on the surface.
上記金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されていることが好ましく、特に金が好ましい。
上記誘電体は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
The metal thin film is preferably formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum, and gold is particularly preferable.
The dielectric preferably includes silicon dioxide (SiO 2 ) or titanium dioxide (TiO 2 ).
上記蛍光色素層は、上記誘電体層に蛍光色素とポリマーとを含有する組成物を、上記スペーサ層の、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に塗工する、または上記蛍光色素層は、上記スペーサ層の、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面にシランカップリング剤を介して結合することができる。 The fluorescent dye layer is formed by applying a composition containing a fluorescent dye and a polymer to the dielectric layer on the other surface of the spacer layer that is not in contact with the metal thin film, or the fluorescent dye layer. Can be bonded to the other surface of the spacer layer not in contact with the metal thin film via a silane coupling agent.
上記リガンドは、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原を認識し結合する抗体が好ましい。
また、本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）からなることを特徴とする。
The ligand is preferably an antibody that recognizes and binds to a tumor marker or carcinoembryonic antigen.
The assay method of the present invention is characterized by comprising the following steps (a) to (d).
工程（ａ）：本発明のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明平面基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
Step (a): a step of bringing a specimen into contact with the plasmon excitation sensor of the present invention,
Step (b): The plasmon excitation sensor obtained through the step (a) is further quenched or absorbed with a ligand that may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor. Reacting a conjugate with the resulting compound;
Step (c): The plasmon excitation sensor obtained through the step (b) is irradiated with a laser beam via a prism from the other surface of the transparent flat substrate on which the metal thin film is not formed. A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye, and a step (d): a step of calculating the amount of analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (c).
上記アナライトに、上記コンジュゲートが結合することが好ましい。
また、上記アナライトとは異なるアナライトであって、上記アナライトと競合するアナライトが、上記コンジュゲートと予め結合していることが好ましい。
The conjugate is preferably bound to the analyte.
Moreover, it is preferable that the analyte which is different from the above-mentioned analyte and which competes with the above-mentioned analyte is bound to the conjugate in advance.
上記検体は、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液であることが好ましい。
上記アナライトは、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原が好ましい。
The specimen is preferably at least one body fluid selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva.
The analyte is preferably a tumor marker or carcinoembryonic antigen.
従来、極微量のアナライトを測定する超高感度な系において、表面プラズモンの電場増強（電場増強フォトン量の例）と微量な蛍光色素量（蛍光フォトン量の例）のミスマッチが起こり感度の限界が生じる。 Conventionally, in ultra-sensitive systems that measure extremely small amounts of analyte, there is a mismatch between the surface plasmon electric field enhancement (example of electric field-enhanced photons) and a minute amount of fluorescent dye (example of fluorescence photons). Occurs.
それに対して、本発明のプラズモン励起センサは、本発明のアッセイ法に用いた場合、図２によれば、蛍光色素層を設けることにより電場増強に見合う蛍光を発生（シグナル量＝色素層で発生可能なフォトン量の例）させることができ、かつ蛍光をアナライトの量に応じて消光剤により調整(ノイズ量＝消光剤で消光可能なフォトン量の例)することができるため、ノイズが少なく、シグナルが多い高Ｓ／Ｎ比のアッセイが可能となる。 On the other hand, when used in the assay method of the present invention, the plasmon excitation sensor of the present invention generates fluorescence commensurate with the electric field enhancement by providing a fluorescent dye layer (signal amount = generated in the dye layer). Example of possible photon amount), and fluorescence can be adjusted with a quencher according to the amount of analyte (noise amount = example of photon amount quenchable with quencher), so there is less noise , Assay with high signal-to-noise ratio and high signal / noise ratio is possible.
すなわち、本発明は、１リットル当り１０-18モル（１ａｍｏｌ/Ｌ）〜１０-12モル（１ｐｍｏｌ/Ｌ）レベルの濃度のアナライト（例えば、標的抗原）を含む検体から、高感度かつ高精度で該アナライトを検出できるプラズモン励起センサを提供することができる。 That is, the present invention is highly sensitive and accurate from a specimen containing an analyte (eg, target antigen) at a concentration of 10 −18 mol (1 amol / L) to 10 −12 mol (1 pmol / L) per liter. Thus, a plasmon excitation sensor capable of detecting the analyte can be provided.
また、微量のアナライトを検出する際、従来のサンドイッチイムノアッセイ法では蛍光信号（蛍光シグナル）量が少なくＳ／Ｎ比が劣化するが、本発明は、プラズモン励起センサ、およびリガンド（例えば、２次抗体）と消光剤とのコンジュゲートを用いて本発明のアッセイ法に適用した場合、標的抗原量と比例するのが消光剤であるためＳ／Ｎ比が劣化しないプラズモン励起センサを提供することができる。 Further, when detecting a very small amount of analyte, the conventional sandwich immunoassay method has a small amount of fluorescence signal (fluorescence signal) and the S / N ratio is deteriorated. However, the present invention provides a plasmon excitation sensor and a ligand (for example, secondary). It is possible to provide a plasmon excitation sensor in which the S / N ratio does not deteriorate when applied to the assay method of the present invention using a conjugate of an antibody) and a quencher because the quencher is proportional to the target antigen amount. it can.
また、本発明は、消光剤の能力次第で蛍光信号量を調整できるため、本発明のアッセイ法が最適なＳ／Ｎ比で実施可能なプラズモン励起センサを提供することができる。
さらに、本発明は、本発明のアッセイ法において、アナライト（標的抗原）と、該アナライトと競合する抗原を予め結合させた２次抗体（リガンド）と消光剤とのコンジュゲートとを競合させることにより、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるプラズモン励起センサを提供することができる。
In addition, since the present invention can adjust the amount of fluorescence signal depending on the ability of the quencher, it can provide a plasmon excitation sensor in which the assay method of the present invention can be carried out with an optimum S / N ratio.
Furthermore, in the assay method of the present invention, the present invention allows an analyte (target antigen) to compete with a conjugate of a quencher with a secondary antibody (ligand) that has previously bound an antigen that competes with the analyte. Thus, it is possible to provide a plasmon excitation sensor that can make the amount of fluorescent signal (fluorescent signal) proportional to the amount of target antigen.
以下、本発明について具体的に説明する。
＜プラズモン励起センサ＞
本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素層と、該蛍光色素層の、該スペーサ層とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドとを含むことを特徴とするものである。
Hereinafter, the present invention will be specifically described.
<Plasmon excitation sensor>
The plasmon excitation sensor of the present invention includes a transparent flat substrate, a metal thin film formed on one surface of the substrate, and a dielectric formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the substrate. A spacer layer, a fluorescent dye layer formed on the other surface of the spacer layer not in contact with the metal thin film, and another surface of the fluorescent dye layer not in contact with the spacer layer. And an immobilized ligand.
本発明のプラズモン励起センサは、例えば、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製のＢｉａｃｏｒｅシステムに用いられるセンサーチップなどのように金薄膜を有するものも、本発明のプラズモン励起センサに利用することができる。 As the plasmon excitation sensor of the present invention, for example, a sensor chip having a gold thin film such as a sensor chip used in a Biacore system manufactured by GE Healthcare Biosciences can be used for the plasmon excitation sensor of the present invention. .
（透明平面基板）
本発明で用いられる透明平面基板としては、ガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
(Transparent flat substrate)
The transparent flat substrate used in the present invention may be made of glass or plastic such as polycarbonate (PC) or cycloolefin polymer (COP), and the refractive index [nd] is preferably 1.40. The size (length × width) is not particularly limited as long as it is ˜2.20 and the thickness is preferably 0.01 to 10 mm, more preferably 0.5 to 5 mm.
なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎｄ〕１.５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎｄ〕1.８５）、（株）住田光学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎｄ〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎｄ〕１．９０）、（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。 The transparent glass substrate made of glass is commercially available from BK7 (refractive index [nd] 1.52) and LaSFN9 (refractive index [nd] 1.85) manufactured by SCHOTT AG, manufactured by Sumita Optical Glass Co., Ltd. K-PSFn3 (refractive index [nd] 1.84), K-LaSFn17 (refractive index [nd] 1.88) and K-LaSFn22 (refractive index [nd] 1.90), manufactured by OHARA INC. -LAL10 (refractive index [nd] 1.72) or the like is preferable from the viewpoint of optical characteristics and detergency.
透明平面基板は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
The transparent flat substrate is preferably cleaned with acid and / or plasma before forming a metal thin film on the surface.
As the cleaning treatment with an acid, it is preferable to immerse in 0.001 to 1N hydrochloric acid for 1 to 3 hours.
Examples of the plasma cleaning treatment include a method of immersing in a plasma dry cleaner (PDC200 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
（金属薄膜）
上記「透明平面基板」の一方の表面に形成された金属薄膜としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
(Metal thin film)
The metal thin film formed on one surface of the “transparent flat substrate” is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably gold. It is desirable to consist of these, and the alloy of these metals may be sufficient. Such metal species are preferable because they are stable against oxidation and increase in electric field due to surface plasmons increases.
なお、上記「透明平面基板」としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。 In addition, only when a glass flat substrate is used as the “transparent flat substrate”, the glass and the metal thin film can be bonded more firmly, so that a thin film of chromium, nickel chromium alloy or titanium is formed in advance. Is preferred.
透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。 Examples of the method for forming a metal thin film on a transparent flat substrate include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. Since it is easy to adjust the thin film formation conditions, it is preferable to form a chromium thin film and / or a metal thin film by sputtering or vapor deposition.
金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。 The thickness of the metal thin film is preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm. The thickness of the thin film is preferably 1 to 20 nm.
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。 From the viewpoint of the electric field enhancing effect, gold: 20-70 nm, silver: 20-70 nm, aluminum: 10-50 nm, copper: 20-70 nm, platinum: 20-70 nm, and alloys thereof: 10-70 nm are more preferable, and chromium The thickness of the thin film is more preferably 1 to 3 nm.
金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。 When the thickness of the metal thin film is within the above range, surface plasmons are easily generated, which is preferable. Moreover, if it is a metal thin film which has such thickness, a magnitude | size (length x width) will not be specifically limited.
（誘電体からなるスペーサ層）
「誘電体からなるスペーサ層」は、上記「金属薄膜」による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、該金属薄膜の、上記「透明平面基板」と接していないもう一方の表面に形成したものであって、該誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできるが、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
(Spacer layer made of dielectric)
The “dielectric spacer layer” is formed on the other surface of the metal thin film not in contact with the “transparent flat substrate” for the purpose of preventing the metal quenching of the fluorescent dye by the “metal thin film”. As the dielectric, various optically transparent inorganic substances, natural or synthetic polymers can be used, but they are excellent in chemical stability, manufacturing stability and optical transparency. It is preferable to contain silicon dioxide (SiO 2 ) or titanium dioxide (TiO 2 ).
該スペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、３０ｎｍ以下が好ましく、１０〜２０ｎｍがより好ましい。また、電場増強の観点からは、２００ｎｍ〜１ｍｍが好ましく、電場増強効果の安定性の観点からは、４００〜１,６００ｎｍが好ましい。本発明のプラズモン励起センサが、今後、大量生産される際、該センサが有するスペーサ層の厚さが変動することが想定され、特に４００ｎｍ以上の厚さを有すると共鳴角の変動が一層大きくなる可能性があるため、測定の安定性を確保する目的から、該スペーサ層の厚さとして、特に１０〜２０ｎｍが好ましい。 The thickness of the spacer layer is usually 10 nm to 1 mm, and is preferably 30 nm or less and more preferably 10 to 20 nm from the viewpoint of resonance angle stability. Moreover, from the viewpoint of electric field enhancement, 200 nm to 1 mm is preferable, and from the viewpoint of stability of the electric field enhancement effect, 400 to 1,600 nm is preferable. When the plasmon excitation sensor of the present invention is mass-produced in the future, it is assumed that the thickness of the spacer layer included in the sensor will fluctuate. Since there is a possibility, the thickness of the spacer layer is particularly preferably 10 to 20 nm for the purpose of ensuring measurement stability.
該スペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。 Examples of the method for forming the spacer layer include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction using a material such as polysilazane, or a coating method using a spin coater.
（蛍光色素層）
「蛍光色素層」とは、上記「スペーサ層」の、上記「金属薄膜」とは接していないもう一方の表面に、蛍光色素を固定化した層であって、（Ａ）蛍光色素とポリマーとを含有する組成物を該スペーサ層上に塗工することによって形成することもでき、（Ｂ）シランカップリング剤を介して、蛍光色素を該スペーサ層上に結合することによって形成することもできる。
(Fluorescent dye layer)
The “fluorescent dye layer” is a layer in which the fluorescent dye is immobilized on the other surface of the “spacer layer” that is not in contact with the “metal thin film”. Can be formed by coating the spacer layer with a composition containing a fluorescent dye, and (B) it can also be formed by bonding a fluorescent dye onto the spacer layer via a silane coupling agent. .
（Ａ）の場合、蛍光色素とポリマーとは化学的結合をしていても、していなくてもよく、また（Ａ’）重合性基を有するシランカップリング剤を上記スペーサ層に結合させて、他の重合性モノマー、蛍光色素および重合開始剤を加えて共重合させることにより蛍光色素とポリマーとを含有する組成物を形成することもできる。 In the case of (A), the fluorescent dye and the polymer may or may not be chemically bonded, and (A ′) a silane coupling agent having a polymerizable group is bonded to the spacer layer. A composition containing a fluorescent dye and a polymer can also be formed by adding and copolymerizing another polymerizable monomer, a fluorescent dye and a polymerization initiator.
（Ｂ）の場合、アミノ基またはカルボキシル基を有するシランカップリング剤と、それらの基と反応して共有結合する基を有するリガンドとを結合することによって、蛍光色素を上記スペーサ層に固定化することができる。 In the case of (B), the fluorescent dye is immobilized on the spacer layer by binding a silane coupling agent having an amino group or a carboxyl group and a ligand having a group that reacts with these groups and is covalently bonded. be able to.
このように、蛍光色素とポリマーとを含有してなる層を形成する（Ａ）の場合は、固定化できる蛍光色素量が多く、得られる層の強度が高いことから好ましい。
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
Thus, in the case of (A) which forms a layer containing a fluorescent dye and a polymer, the amount of the fluorescent dye that can be immobilized is large, and the strength of the resulting layer is high, which is preferable.
The “fluorescent dye” is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating predetermined excitation light in the present invention, or excited by using an electric field effect. Including luminescence.
本発明で用いられる「蛍光色素」は、特に限定されず、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。 The “fluorescent dye” used in the present invention is not particularly limited and may be any known fluorescent dye. In general, fluorescent dyes with large Stokes shifts that allow the use of a fluorometer with a filter rather than a monochromator and also increase the efficiency of detection are preferred.
このような「蛍光色素」としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。 Examples of such “fluorescent dyes” include fluorescein family fluorescent dyes (integrated DNA Technologies), polyhalofluorescein family fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), and hexachlorofluorescein family. Fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan), Coumarin family fluorescent dyes (Invitrogen), Rhodamine family fluorescent dyes (GE Healthcare Biosciences), cyanine family fluorescence Dyes, indocarbocyanine family fluorescent dyes, oxazine family fluorescent dyes, thiazine family fluorescent dyes, squaraine family fluorescent dyes, chelated lanthanide dyes Millie's fluorescent dye, BODIPY® family fluorescent dye (manufactured by Invitrogen), naphthalenesulfonic acid family fluorescent dye, pyrene family fluorescent dye, triphenylmethane family fluorescent dye, Alexa Fluor (Registered trademark) dye series (manufactured by Invitrogen Corp.) and the like, and further, U.S. Patent Nos. 6,406,297, 6,221,604, 5,994,063, The fluorescent dyes described in 5,808,044, 5,880,287, 5,556,959, and 5,135,717 can also be used in the present invention.
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。 Table 1 shows the absorption wavelength (nm) and emission wavelength (nm) of typical fluorescent dyes included in these families.
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
「ポリマー」としては、例えば、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン-アクリレート、ポリスチレン、ポリビニルブチラール、ポリエステルなどが挙げられる。これらのうち、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリビニルブチラールは、蛍光色素との相溶性に優れ、非特異的な吸着（例えば、蛋白質（アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン）、脂質、糖類（グルコース））を抑制することができるため好適である。
These fluorescent dyes may be used alone or in combination of two or more.
Examples of the “polymer” include polyacrylate, polymethacrylate, polystyrene-acrylate, polystyrene, polyvinyl butyral, polyester, and the like. Of these, polyacrylates and polymethacrylates, polystyrene, and polyvinyl butyral have excellent compatibility with fluorescent dyes and nonspecific adsorption (eg, proteins (albumin, fibrinogen, immunoglobulin), lipids, saccharides (glucose)). Can be suppressed, which is preferable.
「組成物」は、蛍光色素およびポリマー以外に、溶媒、必要に応じて酸化防止剤などの添加剤も含有することができる。
「溶媒」としては、揮発性が高ければ特に限定されず、例えば、含ハロゲン系炭化水素類（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、テトラフルオロプロパン等）、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ターシャリブタノール、テトラフルオロプロパノール）、芳香族類（例えば、トルエン、キシレン等）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル等）、エステル類（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、グリコール類（例えば、エチレングリコール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）などが挙げられる。これらのうち、用いられるポリマーの溶解安定性の観点から、芳香族類、含ハロゲン系炭化水素類、エステル類、ケトン類が好ましい。
In addition to the fluorescent dye and polymer, the “composition” can also contain a solvent and, if necessary, additives such as an antioxidant.
The “solvent” is not particularly limited as long as it has high volatility. For example, halogen-containing hydrocarbons (eg, dichloromethane, dichloroethane, tetrafluoropropane), alcohols (eg, methanol, ethanol, propanol, butanol, Tertiary butanol, tetrafluoropropanol), aromatics (eg, toluene, xylene, etc.), ethers (eg, diethyl ether, diethylene glycol monomethyl ether, etc.), esters (eg, ethyl acetate, butyl acetate, etc.), glycols (For example, ethylene glycol etc.), ketones (acetone, methyl ethyl ketone, etc.) etc. are mentioned. Of these, aromatics, halogen-containing hydrocarbons, esters, and ketones are preferable from the viewpoint of the dissolution stability of the polymer used.
「酸化防止剤」としては、例えば、ペンタエリスリチルテトラキス［３−(３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)］プロピオネート、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，２’−ジオキシ−３，３’−ジ−ｔ−ブチル−５，５’−ジメチルジフェニルメタン、テトラキス［メチレン−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］メタンなどが挙げられる。 Examples of the “antioxidant” include pentaerythrityl tetrakis [3- (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)] propionate, 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol. 2,2′-dioxy-3,3′-di-t-butyl-5,5′-dimethyldiphenylmethane, tetrakis [methylene-3- (3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl) propionate ] Methane etc. are mentioned.
組成物の総量（１００重量％）に対して、蛍光色素は１〜７５重量％が好ましく、３０〜７０重量％がより好ましく、ポリマーは２５〜９９重量％が好ましく、７０〜３０重量％がより好ましい。蛍光色素およびポリマーが上記含有量であると、消光の効率が良好である。 The fluorescent dye is preferably 1 to 75% by weight, more preferably 30 to 70% by weight, and the polymer is preferably 25 to 99% by weight, more preferably 70 to 30% by weight, based on the total amount of the composition (100% by weight). preferable. When the fluorescent dye and the polymer have the above contents, the quenching efficiency is good.
また、溶媒は、組成物１００重量部に対して、１００〜１,０００重量部が好ましく、１００〜５００重量部がより好ましい。添加剤は、組成物１００重量部に対して、０．１〜１０重量部が好ましく、１〜５重量部がより好ましい。溶媒または添加剤が上記配合量であると、塗布性が良く、蛍光量子収率の低下を起さないため好適である。 Moreover, 100-1,000 weight part is preferable with respect to 100 weight part of compositions, and 100-500 weight part is more preferable. 0.1-10 weight part is preferable with respect to 100 weight part of compositions, and 1-5 weight part is more preferable. It is preferable that the solvent or additive has the above blending amount because the coating property is good and the fluorescence quantum yield is not lowered.
「塗工」する方法としては、特に限定されないが、例えば、スピンコート法、ワイヤーコート法、バーコート法、ロールコート法、ブレードコート法、カーテンコート法、スクリーン印刷法などで塗布後、通常２０〜１００℃で、５〜３０分間乾燥させる。 The method of “coating” is not particularly limited, but for example, after applying by spin coating method, wire coating method, bar coating method, roll coating method, blade coating method, curtain coating method, screen printing method, etc. Dry at ~ 100 ° C for 5-30 minutes.
（リガンド）
リガンドとは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などであれば、特に限定されない。
(Ligand)
A ligand is a molecule or molecular fragment capable of specifically recognizing (or recognizing) and binding an analyte contained in a specimen. Examples of such a “molecule” or “molecular fragment” include, for example, , Nucleic acids (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., or nucleosides, nucleotides and modified molecules thereof), proteins (polypeptides , Oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules or complexes thereof, etc.
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。 Examples of the “protein” include antibodies and the like, specifically, anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (available from Japan Medical Laboratory), anti-carcinoembryonic antigen (CEA) ) Monoclonal antibody, anti-CA19-9 monoclonal antibody, anti-PSA monoclonal antibody and the like.
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
リガンドの固定化方法としては、上記（Ａ）の場合、ポリマーが有する水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基等の官能基（好ましくは、水酸基、アミノ基およびカルボキシル基）とリガンドが有する官能基（免疫反応促進能や非特異吸着反応抑制能を勘案し、ポリマーが有する官能基と適宜組み合わせることが好ましい。）とで反応させて化学結合を形成する方法、または２感応性反応基を有する化合物（例えば、シランカップリング剤など）を介して上記蛍光色素層に固定化する方法が挙げられる。
In the present invention, the term “antibody” includes polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, antibodies obtained by gene recombination, and antibody fragments.
As the method for immobilizing the ligand, in the case of (A) above, the functional group (preferably, hydroxyl group, amino group and carboxyl group) such as hydroxyl group, amino group, carboxyl group and isocyanate group possessed by the polymer and the functional group possessed by the ligand. (In consideration of immunoreaction promoting ability and nonspecific adsorption reaction inhibiting ability, it is preferable to combine with the functional group of the polymer as appropriate.) Or a compound having a 2-sensitive reactive group Examples thereof include a method of immobilizing the fluorescent dye layer via a silane coupling agent (for example, silane coupling agent).
２感応性反応基を有するシランカップリング剤としては、加水分解でシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。 As a silane coupling agent having a 2-sensitive reactive group, it has an ethoxy group (or methoxy group) which gives a silanol group (Si-OH) by hydrolysis, and an amino group, a glycidyl group, a carboxyl group, etc. at the other end It will not specifically limit if it is a silane coupling agent which has a reactive group, A conventionally well-known silane coupling agent can be used.
「２感応性反応基を有するシランカップリング剤」以外に、リガンドの固定化能に優れることから、例えば、カルボキシメチルデキストラン、ポリエチレングリコール、イミノジ酢酸誘導体（（Ｎ−５−ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ等）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧなども好適である。 In addition to “a silane coupling agent having a 2-sensitive reactive group”, since it has excellent ligand immobilization ability, for example, carboxymethyl dextran, polyethylene glycol, iminodiacetic acid derivatives ((N-5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid), biotin, avidin, streptavidin, protein A, protein G and the like are also suitable.
（Ａ）のうち、２感応性反応基を有する化合物としてシランカップリング剤を用いる場合、リガンドの固定化方法の具体例として、まず金薄薄膜、誘電体からなるスペーサ層および蛍光色素層が、その一方の表面に順に形成された透明平面基板を、シランカップリング剤を通常０．１〜１０％、好ましくは０．５％の濃度で含む水溶液に、３０分〜２時間浸漬後、室温の場合、通常１〜２４時間、好ましくは１０時間、１００℃の場合、通常１０分〜１時間、好ましくは３０分の乾燥を行い、この後、通常、上記基板を水で洗浄する。この時点で、シランカップリング剤の一方の末端が加水分解して得られたシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を蛍光色素層側にして並べた単分子膜が形成されている。シランカップリング剤からなる単分子膜の外側には、シランカップリング剤が有するアミノ基やカルボキシル基が露出している状態となっている。 In the case of using a silane coupling agent as the compound having a 2-sensitive reactive group in (A), as a specific example of a method for immobilizing a ligand, first, a thin gold film, a spacer layer made of a dielectric, and a fluorescent dye layer are: The transparent flat substrate formed on one surface in order is immersed in an aqueous solution containing a silane coupling agent in a concentration of usually 0.1 to 10%, preferably 0.5% for 30 minutes to 2 hours, and then at room temperature. In this case, drying is usually performed for 1 to 24 hours, preferably 10 hours, and at 100 ° C., usually for 10 minutes to 1 hour, preferably 30 minutes. Thereafter, the substrate is usually washed with water. At this point, a monomolecular film is formed in which silanol groups (Si—OH) obtained by hydrolysis of one end of the silane coupling agent are arranged on the fluorescent dye layer side. The amino group and carboxyl group of the silane coupling agent are exposed on the outside of the monomolecular film made of the silane coupling agent.
次に、リガンドが有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、上記シランカップリング剤が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる。 Next, the carboxyl group of the ligand is converted into water-soluble carbodiimide (WSC) (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)) and N-hydroxysuccinimide (NHS). Then, the carboxyl group thus activated and the amino group of the silane coupling agent are dehydrated and immobilized using water-soluble carbodiimide.
その他の好ましい方法の具体例としては、蛍光色素層内のポリマーのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、上記リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる。 As a specific example of another preferable method, the carboxyl group of the polymer in the fluorescent dye layer is converted into a water-soluble carbodiimide (WSC) (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)). And N-hydroxysuccinimide (NHS), and the amino group of the ligand is dehydrated and immobilized using water-soluble carbodiimide.
リガンドの固定化方法として、上記（Ｂ）の場合、リガンド（例えば、１次抗体など）を蛍光色素層に物理吸着で固定化する方法が挙げられる。
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。
As the method for immobilizing the ligand, in the case of (B) above, a method of immobilizing a ligand (for example, a primary antibody) on the fluorescent dye layer by physical adsorption can be mentioned.
Examples of the “specimen” include blood (serum / plasma), urine, nasal fluid, saliva, feces, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.), etc., and appropriately diluted in a desired solvent, buffer solution, etc. May be used. Of these samples, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva are preferred.
「アナライト（標的抗原）」としては、上記「蛍光色素層」に固定化されたリガンドを特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。 “Analyte (target antigen)” is a molecule or molecular fragment capable of specifically recognizing (or recognizing) and binding to a ligand immobilized on the “fluorescent dye layer”. “Molecules” or “molecular fragments” include, for example, nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., which may be single-stranded or double-stranded, or nucleosides, nucleotides And modified molecules thereof), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules and complexes thereof. Specifically, it may be a carcinoembryonic antigen such as AFP (α-fetoprotein), a tumor marker, a signal transmitter, a hormone, etc. It is not particularly limited.
＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）からなることを特徴とするものである。
<Assay method>
The assay method of the present invention is characterized by comprising the following steps (a) to (d).
工程（ａ）：本発明のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明平面基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
Step (a): a step of bringing a specimen into contact with the plasmon excitation sensor of the present invention,
Step (b): The plasmon excitation sensor obtained through the step (a) is further quenched or absorbed with a ligand that may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor. Reacting a conjugate with the resulting compound;
Step (c): The plasmon excitation sensor obtained through the step (b) is irradiated with a laser beam via a prism from the other surface of the transparent flat substrate on which the metal thin film is not formed. A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye, and a step (d): a step of calculating the amount of analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (c).
（工程（ａ））
工程（ａ）とは、本発明のプラズモン励起センサに、上記検体を接触させる工程である。
(Process (a))
Step (a) is a step of bringing the specimen into contact with the plasmon excitation sensor of the present invention.
「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサの蛍光色素およびリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。 “Contact” means that the specimen is contained in the liquid supply circulating in the flow path, and the plasmon excitation is performed when only one surface on which the fluorescent dye and the ligand of the plasmon excitation sensor are immobilized is immersed in the liquid supply. An embodiment in which the sensor and the specimen are brought into contact is preferable.
「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。 The “flow channel” is a rectangular parallelepiped or a tube that can efficiently deliver a small amount of a chemical solution and can change the liquid feeding speed or circulate in order to promote the reaction. The vicinity of the place where the plasmon excitation sensor is installed preferably has a rectangular parallelepiped structure, and the vicinity of the place where the drug solution is delivered preferably has a tubular shape.
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体、ポリエチレン、ポリオレフィン等からなり、薬液送達部ではシリコンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。 As the material, the plasmon excitation sensor part is composed of a homopolymer or copolymer, polyethylene, polyolefin, etc. containing methyl methacrylate, styrene or the like as a raw material, and the chemical solution delivery part is made of silicon rubber, Teflon (registered trademark), polyethylene, polypropylene. Etc. are used.
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。 In the plasmon excitation sensor unit, from the viewpoint of increasing the contact efficiency with the specimen and shortening the diffusion distance, it is preferable that the cross section of the channel of the plasmon excitation sensor unit is independently about 100 nm to 1 mm in length and width.
流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。 As a method of fixing the plasmon excitation sensor to the flow path, in a small-scale lot (laboratory level), first, on the surface on which the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed, A dimethylsiloxane (PDMS) sheet is pressure-bonded so as to surround a portion where the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed, and then the polydimethylsiloxane (PDMS) sheet and the plasmon excitation sensor are closed with screws or the like. A method of fixing with a tool is preferred.
工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に金基板を形成、または別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、蛍光色素層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。 In large lots (factory level) manufactured industrially, as a method of fixing the plasmon excitation sensor to the flow path, a gold substrate is formed on a plastic integrally molded product, or a separately manufactured gold substrate is fixed, and the gold surface is fixed. Further, after the dielectric layer, the fluorescent dye layer, and the ligand are immobilized, it can be manufactured by covering with a plastic integrally formed product corresponding to the top plate of the flow path. If necessary, the prism can be integrated into the flow path.
「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。 The “liquid feeding” is preferably the same as the solvent or buffer in which the specimen is diluted, and examples thereof include phosphate buffered saline (PBS) and Tris buffered saline (TBS), but are not particularly limited. It is not something.
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。 The temperature and time for circulating the liquid supply vary depending on the type of specimen and are not particularly limited, but are usually 20 to 40 ° C. × 1 to 60 minutes, preferably 37 ° C. × 5 to 15 minutes.
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
The initial concentration of the analyte contained in the specimen being sent may be 100 μg / mL to 0.001 pg / mL.
The total amount of liquid feeding, that is, the volume of the flow path is usually 0.001 to 20 mL, preferably 0.1 to 1 mL.
The flow rate of liquid feeding is usually 1 to 2,000 μL / min, preferably 5 to 500 μL / min.
（洗浄工程）
洗浄工程とは、下記工程（ｂ）の前および／または後に含まれることが好ましく、上記工程（ａ）で得られた粒子または下記工程（ｂ）で得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程である。
(Washing process)
The washing step is preferably included before and / or after the following step (b), and the particles obtained in the step (a) or the surface of the plasmon excitation sensor obtained in the following step (b) are washed. It is a process.
該工程に使用される洗浄液としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。 As the washing solution used in the step, a surfactant such as Tween 20 or Triton X100 is dissolved in the same solvent or buffer used in the reaction of steps (a) and (b), preferably 0.00001 to Those containing 1% by weight are desirable.
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の「送液を循環させる温度および流速」に等しいことが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
The temperature and flow rate at which the cleaning liquid is circulated are preferably equal to the “temperature and flow rate at which the liquid feed is circulated” in step (a).
The time for circulating the cleaning liquid is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.
（工程（ｂ））
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲートを反応させる工程である。
(Process (b))
The step (b) may be the same as or different from the plasmon excitation sensor obtained through the step (a), preferably the washing step, and the ligand contained in the plasmon excitation sensor. This is a step of reacting a conjugate of a ligand and a compound capable of quenching or absorbing fluorescence.
「蛍光を消光または吸収し得る化合物」、すなわち「消光剤（消光色素）」または「クエンチャー」とは、上記「蛍光色素」の励起されたエネルギーを吸収できる適切なエネルギー準位を有する化合物であって、ある蛍光色素に対して適切な消光剤を添加すると、蛍光が消失する。 “Compound capable of quenching or absorbing fluorescence”, that is, “quenching agent (quenching dye)” or “quencher” is a compound having an appropriate energy level capable of absorbing the excited energy of the “fluorescent dye”. If an appropriate quencher is added to a certain fluorescent dye, the fluorescence disappears.
「消光剤」としては、フルオレセイン・ファミリーの消光色素、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの消光色素、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの消光色素、クマリン・ファミリーの消光色素、ローダミン・ファミリーの消光色素、シアニン・ファミリーの消光色素、オキサジン・ファミリーの消光色素、チアジン・ファミリーの消光色素、スクアライン・ファミリーの消光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの消光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの消光色素などが挙げられ、より具体的には、例えば、ＢＨＱ（登録商標）・ファミリーの色素（国際公開第０１／８６００１号パンフレットに記載されているクエンチャー：ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３を含む。）（バイオサーチテクノロジーズ ジャパンＢＴＪ（株）製）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴＡＭＲＡ（Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）（インビトロジェン（株）製）、Ｃｙ３（登録商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、Ｃｙ５（登録商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、１−ベンジル−１，４−ジヒドロニコチンアミド（ＢＮＡＨ）、９−アントラセンカルボニトリル、２−ナフトール、２−メトキシナフタレン、１，４−ナフトキノン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−１，４−ベンゾキノン、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−１，２−ベンゾキノン、１−ナフトエ酸（１−ＮＡ）、２−ナフトエ酸（２−ＮＡ）、１−ピレン酪酸（ＰｙＢＡ）、４−ニトロ安息香酸（ＰＮＢＡ）、アントラキノン−２−カルボン酸（ＡＱＣＡ）、ピレンなどが挙げられる。また、本発明は、米国特許番号第６,３９９,３９２号、同第６,３４８,５９６号、同第６,０８０,０６８号および同第５,７０７,８１３号に記載の消光剤を用いることもできる。 “Quenchers” include fluorescein family quenching dyes, polyhalofluorescein family quenching dyes, hexachlorofluorescein family quenching dyes, coumarin family quenching dyes, rhodamine family quenching dyes, cyanine family quenching dyes Dyes, oxazine family quenching dyes, thiazine family quenching dyes, squarain family quenching dyes, chelated lanthanide family quenching dyes, BODIPY® family quenching dyes, and more Specifically, for example, BHQ (registered trademark) family dyes (including quenchers described in WO 01/86001: BHQ-1, BHQ-2 and BHQ-3) (Biosearch) technology Japan BTJ Co., Ltd.), Iowa Black (registered trademark) (manufactured by Integrated DNA Technologies), DABCYL (4- (4′-dimethylaminophenylazo) benzoic acid) (manufactured by Integrated DNA Technologies), TAMRA (N, N, N ′, N′-tetramethyl-6-carboxyrhodamine) (manufactured by Invitrogen), Cy3 (registered trademark) (manufactured by GE Healthcare Biosciences), Cy5 (registered trademark) (GE Healthcare) Bioscience Co., Ltd.), 1-benzyl-1,4-dihydronicotinamide (BNAH), 9-anthracenecarbonitrile, 2-naphthol, 2-methoxynaphthalene, 1,4-naphthoquinone, 2,6-di- tert-butyl-1,4-be Zoquinone, 3,5-di-tert-butyl-1,2-benzoquinone, 1-naphthoic acid (1-NA), 2-naphthoic acid (2-NA), 1-pyrenebutyric acid (PyBA), 4-nitrobenzoic acid An acid (PNBA), anthraquinone-2-carboxylic acid (AQCA), pyrene, etc. are mentioned. Further, the present invention uses the quencher described in US Pat. Nos. 6,399,392, 6,348,596, 6,080,068, and 5,707,813. You can also.
これらの消光剤のうち、バイオサーチテクノロジーズ ジャパンＢＴＪ（株）製のＢＨＱ−１（最大波長５３４ｎｍ）、ＢＨＱ−２（最大波長５７９ｎｍ）、ＢＨＱ−３（最大波長６７２ｎｍ）等のシリーズが広い波長領域をカバーするダーククエンチャー（自らは発光しない消光剤）として好ましい。 Among these quenchers, BHQ-1 (maximum wavelength 534 nm), BHQ-2 (maximum wavelength 579 nm), BHQ-3 (maximum wavelength 672 nm), etc., manufactured by Biosearch Technologies Japan BTJ, Inc. have a wide wavelength range. Is preferable as a dark quencher (quenching agent that does not emit light itself).
上記以外の「消光剤」の系統としては、通常、テトラシアノキノジメタン類、アミニウム類、ジインモニウム類、ヒドラジン類、ヒドラジド類、ヒドロキシルアミン類、ハイドロキノン類、四置換ホウ素陰イオン類、またはニッケル類、アゾ色素の重金属錯体類、フォルマザン重金属錯体、ジピロメテン金属錯体類、ポルフィリン重金属錯体類、重金属フタロシアニン類、重金属ナフタロシアニン類、メタロセン類等の金属錯体などが挙げられる。 Other than the above-mentioned "quenching agents", tetracyanoquinodimethanes, aminiums, diimmoniums, hydrazines, hydrazides, hydroxylamines, hydroquinones, tetrasubstituted boron anions, or nickels And metal complexes such as heavy metal complexes of azo dyes, formazan heavy metal complexes, dipyrromethene metal complexes, porphyrin heavy metal complexes, heavy metal phthalocyanines, heavy metal naphthalocyanines, metallocenes, and the like.
表面プラズモンによって励起された蛍光色素によって放射されるフォトンは、電子励起状態で消光剤にエネルギー移動されてクエンチされると考えられる。すなわち、電子励起状態のエネルギーを吸収した消光剤は、異なった波長のフォトンまたは熱としてエネルギーを放出すると考えられる。したがって、消光剤は蛍光色素でもあってもよい。 Photons emitted by fluorescent dyes excited by surface plasmons are believed to be quenched by energy transfer to the quencher in the electronically excited state. That is, it is considered that a quencher that absorbs energy in an electronically excited state releases energy as photons or heat having different wavelengths. Thus, the quencher may be a fluorescent dye.
一般に、蛍光色素と消光剤とのエネルギー転移は、蛍光色素と消光剤との間の距離、すなわち臨界転移距離に依存する。「臨界転移距離」とは、蛍光色素の電子励起準位（通常1重項）と消光剤の最低空軌道とが相互作用できる距離であり、消光剤が有機物の場合、通常１０ｎｍ前後の距離、金属含有物の場合では通常３０ｎｍ程度の距離である。特定の蛍光色素と消光剤との臨界転移距離については、当該技術分野において周知であり、例えば、ＷｕおよびＢｒａｎｄ、１９９４年、Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２１８：１〜３ページの論文に記載の臨界転移距離を参照することができる。 In general, the energy transfer between the fluorescent dye and the quencher depends on the distance between the fluorescent dye and the quencher, that is, the critical transition distance. “Critical transition distance” is the distance at which the electronic excitation level (usually singlet) of the fluorescent dye can interact with the lowest unoccupied orbital of the quencher. When the quencher is an organic substance, the distance is usually around 10 nm. In the case of a metal-containing material, the distance is usually about 30 nm. The critical transition distance between a specific fluorescent dye and a quencher is well known in the art and is described, for example, in Wu and Brand, 1994, Anal. Biochem. 218: 1-3 pages. Can be referred to.
特定の蛍光色素と消光剤との組み合わせの基準としては、例えば、蛍光色素による蛍光発光の量子収率；蛍光色素によって放たれる蛍光波長；消光剤の減衰係数；消光剤によって放たれる蛍光波長；消光剤による蛍光発光の量子収率などが挙げられる。また、消光剤が蛍光色素でもある場合、消光剤と蛍光色素とが、一方によって放射された蛍光がもう片方によって放射された蛍光と容易に区別できるように組み合わせることが好ましい。特定の蛍光色素と消光剤との組み合わせの選択については、ＫｌｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒおよびＭｉｌｌａｒ、２００２年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ６１：１５９〜１７９ページの総論を参照することができる。 The standard of the combination of a specific fluorescent dye and a quencher includes, for example, the quantum yield of fluorescence emission by the fluorescent dye; the fluorescence wavelength emitted by the fluorescent dye; the extinction coefficient of the quencher; the fluorescence wavelength emitted by the quencher And the quantum yield of fluorescence emission by the quencher. When the quencher is also a fluorescent dye, the quencher and the fluorescent dye are preferably combined so that the fluorescence emitted by one can be easily distinguished from the fluorescence emitted by the other. Reference can be made to the general review of Klostermeier and Millar, 2002, Biopolymers 61: 159-179 for the selection of specific fluorescent dye and quencher combinations.
本発明で用いられる蛍光色素と消光剤との例示的な組み合わせは、蛍光色素として６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）と消光剤としてＣｙ５（登録商標）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（蛍光色素）とＢＨＱ−３（消光剤）；ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸおよびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（蛍光色素）とＢＨＱ−１（消光剤）；ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、ＣＡＬ ＲｅｄおよびＲｅｄ ６４０（蛍光色素）とＢＨＱ−２（消光剤）；Ｃｙ５およびＣｙ５.５（蛍光色素）とＢＨＱ−３（消光剤）、米国特許番号第６,２４５,５１４号に記載されている組み合わせ、表２に記載の組合わせなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。 Exemplary combinations of fluorescent dyes and quenchers used in the present invention include 6-carboxyfluorescein (FAM) as the fluorescent dye and Cy5® as the quencher; Alexa Fluor® 647 (fluorescent dye) BHQ-3 (quenching agent); FAM, TET, JOE, HEX and Oregon Green (fluorescent dye) and BHQ-1 (quenching agent); FAM, TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, CAL Red and Red 640 (fluorescence) Dye) and BHQ-2 (quenching agent); Cy5 and Cy5.5 (fluorescent dye) and BHQ-3 (quenching agent), combinations described in US Pat. No. 6,245,514, listed in Table 2 However, the present invention is not limited to these combinations.
「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、以下の態様（Ｉ）または（ＩＩ）が好ましい。 “Conjugation of a ligand that may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor and a compound that can quench or absorb fluorescence” refers to the following embodiment (when a secondary antibody is used as the ligand: I) or (II) is preferred.
態様（Ｉ）：２次抗体は、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体である。ただし、本発明のプラズモン励起センサに固定化されているリガンドとして用いる１次抗体抗がポリクローナル抗体である場合、２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。 Aspect (I): The secondary antibody is an antibody capable of recognizing and binding to an analyte (target antigen) contained in a specimen. However, when the primary antibody used as a ligand immobilized on the plasmon excitation sensor of the present invention is a polyclonal antibody, the secondary antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. When the secondary antibody is a monoclonal antibody, the secondary antibody is preferably a monoclonal antibody that recognizes an epitope that the primary antibody does not recognize, or a polyclonal antibody.
本発明のプラズモン励起センサに固定化されているリガンドとして用いる１次抗体抗が、例えば、ＡＦＰモノクローナル抗体である場合、態様（Ｉ）の２次抗体としては、検体中に含有されるＡＦＰに競合する抗原を認識し結合することができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を必要とする。 When the primary antibody used as a ligand immobilized on the plasmon excitation sensor of the present invention is, for example, an AFP monoclonal antibody, the secondary antibody of embodiment (I) competes with AFP contained in the specimen. A monoclonal or polyclonal antibody capable of recognizing and binding to the antigen of interest.
態様（Ｉ）は、消光剤の能力次第で蛍光信号量を調整できるため、本発明のアッセイ法が最適なＳ／Ｎ比で実施可能であるから好適である。
態様（ＩＩ）：２次抗体は、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合するアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）を予め結合した抗体である。検体中に含有される競合抗原は０種または１種以上であるから、２次抗体自体を必要としないか、または１種以上の２次抗体を必要とする。
Aspect (I) is preferable because the amount of fluorescence signal can be adjusted depending on the ability of the quencher, and therefore the assay method of the present invention can be carried out at an optimum S / N ratio.
Aspect (II): The secondary antibody is an antibody in which an analyte competing with the analyte (target antigen) contained in the specimen (competitive antigen; however, different from the target antigen) is bound in advance. . Since the competing antigens contained in the specimen are zero or one or more, the secondary antibody itself is not required, or one or more secondary antibodies are required.
態様（ＩＩ）は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。
上記１次抗体が抗ＡＦＰモノクローナル抗体である場合、態様（ＩＩ）の２次抗体としては、抗ＡＦＰポリクローナル抗体、または該抗ＡＦＰモノクローナル抗体が認識しないエピトープを認識し結合することができる抗ＡＦＰモノクローナル抗体を必要とする。
Aspect (II) is preferable because the amount of fluorescent signal (fluorescent signal) and the amount of target antigen can be proportional.
When the primary antibody is an anti-AFP monoclonal antibody, the secondary antibody of embodiment (II) is an anti-AFP polyclonal antibody or an anti-AFP monoclonal antibody that can recognize and bind to an epitope that the anti-AFP monoclonal antibody does not recognize. Requires antibody.
「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲート」の作製方法としては、リガンドとして上記「２次抗体」を用いる場合、例えば、まず消光剤にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および消光剤を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および消光剤を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および消光剤を反応させ固定化する方法；ビオチン化された消光剤とストレプトアビジン化された２次抗体とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。 As a production method of “a conjugate of a ligand that may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor and a compound capable of quenching or absorbing fluorescence”, the “secondary antibody” is used as the ligand. When used, for example, a carboxyl group is first imparted to the quencher, and the carboxyl group is converted into a water-soluble carbodiimide (WSC) (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) or the like). And N-hydroxysuccinimide (NHS), which is then active esterified, and then the active esterified carboxyl group and the amino group of the secondary antibody are dehydrated and immobilized using water-soluble carbodiimide; isothiocyanate and Reacting and immobilizing a secondary antibody and a quencher each having an amino group Method: Method of reacting and immobilizing a secondary antibody and a quencher having a sulfonyl halide and an amino group, respectively; Method of reacting and immobilizing a secondary antibody and a quencher having an iodoacetamide and a thiol group, respectively; Biotinylated Examples thereof include a method of reacting and immobilizing a quencher with a streptavidinated secondary antibody.
このように作製された「プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲート」の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００）μｇ／ｍＬがより好ましい。 The concentration of the thus-prepared “conjugate of a ligand that may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor and a compound capable of quenching or absorbing fluorescence” in the solution is 0 0.001 to 10,000 μg / mL is preferable, and 1 to 1,000) μg / mL is more preferable.
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
また、工程（ｂ）と下記工程（ｃ）との間に、上記洗浄工程を含むことが好ましい。
The temperature, time, and flow rate at which the liquid is circulated are the same as in step (a).
Moreover, it is preferable to include the said washing | cleaning process between a process (b) and the following process (c).
（工程（ｃ））
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたプラズモン励起センサに、上記金属薄膜を形成していない上記透明平面基板の片面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
(Process (c))
The step (c) means that the plasmon excitation sensor obtained through the above step (b), preferably the above washing step, is subjected to laser from one side of the transparent flat substrate on which the metal thin film is not formed via a prism. This is a step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye by irradiating light.
レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、基板となるガラスの屈折率、金属薄膜の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
It is desirable to adjust the energy and photon amount immediately before the laser light enters the prism through the optical filter.
Irradiation with laser light generates surface plasmons on the surface of the metal thin film under the total reflection attenuation condition (ATR). Due to the electric field enhancement effect of the surface plasmon, the fluorescent dye is excited by photons increased to several tens to several hundred times the amount of photons irradiated. The amount of increase in photons due to the electric field enhancement effect depends on the refractive index of the glass serving as the substrate, the metal species and the film thickness of the metal thin film, but is usually about 10 to 20 times that of gold.
蛍光色素は光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。 In the fluorescent dye, the electrons in the molecule are excited by light absorption, move to the first electronic excited state in a short time, and when returning from this state (level) to the ground state, the fluorescent dye has a wavelength corresponding to the energy difference. To emit.
しかしながら、蛍光色素の基底状態から第一電子励起状態に移行する際に必要なエネルギーに相当するエネルギーを吸収することができる消光剤が近傍にあると、蛍光色素から消光剤へエネルギーが移動し、蛍光色素は蛍光を発生することなく第一電子励起状態から基底状態に戻ってしまう。この現象を消光という。 However, if there is a quencher in the vicinity that can absorb the energy corresponding to the energy required for transition from the ground state of the fluorescent dye to the first electronic excited state, the energy is transferred from the fluorescent dye to the quencher, The fluorescent dye returns from the first electron excited state to the ground state without generating fluorescence. This phenomenon is called quenching.
消光剤により消光されなかった蛍光は、カットフィルタを通して、集光レンズによりＳＰＦＳ検出部に入射し、入射光のカウント値を測定する。
「レーザ光」の光源としては、例えば、波長４００〜８４０ｎｍ、入射光量として１ｍＷ程度のレーザ光を照射できるＬＥＤ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷのレーザ光を照射できる半導体レーザ（ＬＤ）などが挙げられる。これら光源のうち、ＳＰＲではＬＥＤ、ＬＤともに用いることができるが、ＳＰＦＳでは蛍光色素を励起するために高エネルギーが必要であり、高感度の観点から、ＬＤが好ましい。
The fluorescence that has not been quenched by the quencher enters the SPFS detector through the cut filter by the condenser lens, and measures the count value of the incident light.
As a light source of “laser light”, for example, an LED capable of irradiating laser light having a wavelength of 400 to 840 nm and an incident light amount of about 1 mW, a wavelength of 230 to 800 nm (resonance wavelength is determined by a metal type used for the metal thin film) Examples thereof include a semiconductor laser (LD) that can irradiate a laser beam of 01 to 100 mW. Among these light sources, both LED and LD can be used in SPR, but SPFS requires high energy to excite the fluorescent dye, and LD is preferable from the viewpoint of high sensitivity.
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が上記「透明平面基板」と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。 The “prism” is intended to allow the laser light through various filters to efficiently enter the plasmon excitation sensor, and the refractive index is preferably the same as that of the “transparent flat substrate”. In the present invention, various prisms for which total reflection conditions can be set can be selected as appropriate, and therefore, there is no particular limitation on the angle and shape. For example, a 60-degree dispersion prism may be used. Examples of such commercially available prisms include those similar to the above-mentioned commercially available “glass-made transparent flat substrate”.
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
Examples of the “optical filter” include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens.
The “darkening (ND) filter” (or neutral density filter) is intended to adjust the amount of incident laser light. In particular, when a detector with a narrow dynamic range is used, it is preferable to use it for carrying out a highly accurate measurement.
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
The “polarizing filter” is used to make the laser light P-polarized light that efficiently generates surface plasmons.
“Cut filters” are external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), plasmon scattering light (excitation light originated from plasmon A filter that removes various types of noise light such as scattered light generated by the influence of structures or deposits on the surface of the excitation sensor), autofluorescence of the enzyme fluorescent substrate, and examples thereof include interference filters and color filters. It is done.
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。 The “collecting lens” is intended to efficiently collect the fluorescent signal on the detector, and may be an arbitrary condensing system. As a simple condensing system, a commercially available objective lens (for example, manufactured by Nikon Corporation or Olympus Corporation) used in a microscope or the like may be used. The magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。 As the “SPFS detection unit”, a photomultiplier (a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) is preferable from the viewpoint of ultrahigh sensitivity. Also, although the sensitivity is lower than these, a CCD image sensor capable of multipoint measurement is also suitable because it can be viewed as an image and noise light can be easily removed.
（工程（ｄ））
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
(Process (d))
The step (d) is a step of calculating the amount of analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (c).
より具体的には、既知濃度のアナライトでの測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（標的抗原）を測定シグナルから算出する工程である。 More specifically, a calibration curve is created by performing measurement with an analyte having a known concentration, and the analyte (target antigen) in the sample to be measured is calculated from the measurement signal based on the created calibration curve. It is a process.
さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）の前に測定したブランク蛍光シグナル、上記工程（ｃ）で得られたアッセイ蛍光シグナル、および何も修飾していない金基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを初期ノイズとしたとき、下記式で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる。
アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜／（初期ノイズ）
Further, in the step (d), the blank fluorescence signal measured before the step (c), the assay fluorescence signal obtained in the step (c), and the gold substrate not modified at all are fixed to the channel. When the signal obtained by measuring SPFS while flowing ultrapure water is used as initial noise, the assay S / N ratio represented by the following formula can be calculated.
Assay S / N ratio = | (assay fluorescence signal) − (blank fluorescence signal) | / (initial noise)
＜装置＞
本発明の装置は、上記工程（ｃ）に用いられることを特徴とするものである。
すなわち、本発明の装置は、本発明のプラズモン励起センサを用いて、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。
<Device>
The apparatus of the present invention is used in the step (c).
That is, the apparatus of the present invention is for carrying out the assay method of the present invention using the plasmon excitation sensor of the present invention.
「装置」としては、少なくとも光源、光学フィルタ、プリズム、流路とプラズモン励起センサと送液ポンプと、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、３０°〜８５°の角度変更する。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。 The “apparatus” includes at least a light source, an optical filter, a prism, a flow path, a plasmon excitation sensor, a liquid feed pump, a cut filter, a condenser lens, and an SPFS detection unit. In addition, a surface plasmon resonance (SPR) detection unit, that is, a photodiode as a light receiving sensor dedicated to SPR, an angle variable unit for adjusting the optimum angle of SPR and SPFS (to determine total reflection attenuation (ATR) conditions with a servomotor) In addition, the photodiode and the light source are synchronized with each other and the angle is changed from 30 ° to 85 °. The resolution is preferably 0.01 ° or more.), Including a computer for processing information input to the SPFS detector But you can.
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
Preferred embodiments of the light source, the optical filter, the cut filter, the condensing lens, and the SPFS detection unit are the same as those described above.
As the “liquid feed pump”, for example, a micro pump suitable for a small amount of liquid feed, a syringe pump with high feed accuracy and low pulsation, which is preferable but cannot be circulated, a simple and excellent handleability but a small amount of liquid feed For example, a tube pump may be difficult.
＜キット＞
本発明のキットは、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とするものであって、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、検体、１次抗体および２次抗体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
<Kit>
The kit of the present invention is characterized in that it is used in the assay method of the present invention, and everything necessary other than the specimen, the primary antibody and the secondary antibody in carrying out the assay method of the present invention. Are preferably included.
例えば、本発明のキットと、検体として血液と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。 For example, by using the kit of the present invention, blood as a specimen, and an antibody against a specific tumor marker, the content of the specific tumor marker can be detected with high sensitivity and high accuracy. From this result, the presence of a preclinical noninvasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by palpation or the like can be predicted with high accuracy.
このような「キット」としては、具体的に、透明平面基板上に金属薄膜、誘電体からなるスペーサ層、蛍光色素層この順に形成させたもの；リガンドを固定化するための試薬類（例えば、シランカップリング剤、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）など）；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬；蛍光を消光または吸収し得る化合物（例えば、ＢＨＱ−３など）；２次抗体に、蛍光を消光または吸収し得る化合物を固定化するための各種試薬（例えば、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）など）が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。 As such a “kit”, specifically, a metal thin film, a dielectric spacer layer, and a fluorescent dye layer formed in this order on a transparent flat substrate; reagents for immobilizing a ligand (for example, Silane coupling agent, water-soluble carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), etc.); dissolved or diluted solution for dissolving or diluting the sample; various types for reacting the plasmon excitation sensor with the sample Reaction reagent and washing reagent; compound capable of quenching or absorbing fluorescence (for example, BHQ-3); various reagents for immobilizing a compound capable of quenching or absorbing fluorescence on secondary antibody (for example, water-soluble carbodiimide) (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), etc.) and are required to carry out the assay method of the invention It is also possible to include a seed equipment or materials and the "device".
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。 Further, the kit element may include a standard material for preparing a calibration curve, instructions, a necessary set of equipment such as a microtiter plate capable of simultaneously processing a large number of samples, and the like.
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、実施例１〜７および比較例１，２は、サンドイッチイムノアッセイ法を、実施例８〜１４および比較例３，４は、競合イムノアッセイ法を実施した。 Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited by these. In Examples 1 to 7 and Comparative Examples 1 and 2, sandwich immunoassay was performed, and in Examples 8 to 14 and Comparative Examples 3 and 4, competitive immunoassay was performed.
［作製例１］（２次抗体と消光剤とのコンジュゲートの作製）
ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３（バイオサーチテクノロジーズ ジャパンＢＴＪ（株）製／（株）日本バイオサービス製）またはＤＡＢＣＹＬ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）に固定化した。
具体的には、消光剤のカルボキシル基と抗体のアミノ基とをアミノカップリング法により固定化した。
[Preparation Example 1] (Preparation of conjugate of secondary antibody and quencher)
BHQ-2, BHQ-3 (manufactured by Biosearch Technologies Japan BTJ Co., Ltd./manufactured by Nippon Bioservice Co., Ltd.) or DABCYL (manufactured by Integrated DNA Technologies) are mixed with anti-alpha fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (1D5, 2. 5 mg / mL, immobilized on Japan Medical Clinical Laboratory Laboratories).
Specifically, the carboxyl group of the quencher and the amino group of the antibody were immobilized by an amino coupling method.
［作製例２］（競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲートの作製）
まず、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３（バイオサーチテクノロジーズ ジャパンＢＴＪ（株）製／（株）日本バイオサービス製）またはＤＡＢＣＹＬ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）にアミノカップリング法により固定化した。
次いで、過剰量のＡＦＰを混合し、得られた２次抗体と消光剤とのコンジュゲートに複合化した後、遠心分離とクロマトグラフィーとを用いて精製した。
[Preparation Example 2] (Preparation of conjugate of secondary antibody and quencher combined with competitive antigen)
First, BHQ-2, BHQ-3 (manufactured by Biosearch Technologies Japan BTJ Co., Ltd./manufactured by Nippon Bioservice Co., Ltd.) or DABCYL (manufactured by Integrated DNA Technologies) are mixed with anti-α fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (1D5, 2.5 mg / mL, manufactured by Nippon Medical Laboratory Co., Ltd.) by an amino coupling method.
Next, an excess amount of AFP was mixed and complexed with the obtained conjugate of the secondary antibody and the quencher, and then purified using centrifugation and chromatography.
［実施例１］
ＡＦＰ（抗原）が微量な領域(ｐｍｏｌ／Ｌ〜ｆｍｏｌ／Ｌ)でＳＰＦＳを用いてアッセイを行った。
[Example 1]
The assay was performed using SPFS in a region with a small amount of AFP (antigen) (pmol / L to fmol / L).
(プラズマ励起センサの作製)
屈折率〔ｎｄ〕１．５２、厚さ１ｍｍで外形が２０ｍｍ×２０ｍｍのガラス製の透明平面基板（ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさら金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１ｎｍ、金薄膜の厚さは５０ｎｍであった。
(Production of plasma excitation sensor)
A glass transparent flat substrate (BK7 manufactured by SCHOTT AG) having a refractive index [nd] of 1.52, a thickness of 1 mm and an outer shape of 20 mm × 20 mm is plasma-cleaned, and a chromium thin film is formed on one surface of the substrate by a sputtering method. After that, a thin gold film was formed on the surface by sputtering. The chromium thin film had a thickness of 1 nm, and the gold thin film had a thickness of 50 nm.
金薄膜の、クロム薄膜とは接していない片面に対して、誘電体として二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなるスペーサ層をスパッタリング法により形成した。該スペーサ層の厚さは、１５ｎｍであった。 A spacer layer made of silicon dioxide (SiO 2 ) as a dielectric was formed by sputtering on one side of the gold thin film that was not in contact with the chromium thin film. The spacer layer had a thickness of 15 nm.
該スペーサ層の、金薄膜とは接していない片面に対して、蛍光色素としてＣｙ５（登録商標）のフェネチルアミン反応物５重量部、ポリマーとして積水化学工業（株）製のＢＬ−Ｓ（ポリビニルブチラール）５重量部、および溶媒としてメチルエチルケトン２５重量部を含有する組成物をスピンコーター法により塗布し、暗所にて５０℃で１０分間乾燥させ、溶媒を揮散させた。得られた蛍光色素層の厚さは１０ｎｍであった。 5 parts by weight of a phenethylamine reactant of Cy5 (registered trademark) as a fluorescent dye and BL-S (polyvinyl butyral) manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd. as a polymer with respect to one side of the spacer layer that is not in contact with the gold thin film A composition containing 5 parts by weight and 25 parts by weight of methyl ethyl ketone as a solvent was applied by a spin coater method and dried at 50 ° C. for 10 minutes in the dark to volatilize the solvent. The thickness of the obtained fluorescent dye layer was 10 nm.
このようにして得られた基板の蛍光色素層の上に、３−アミノプロピルトリエトキシシランを５重量％含む水溶液をスピンコーターで塗布し、室温で２時間自然乾燥させた後、５０℃で１０分間加熱した。 An aqueous solution containing 5% by weight of 3-aminopropyltriethoxysilane was applied on the fluorescent dye layer of the substrate thus obtained with a spin coater, allowed to air dry at room temperature for 2 hours, and then 10 ° C. at 50 ° C. Heated for minutes.
蛍光色素層のシランカップリング剤処理を行った表面に、２ｍｍ×１０ｍｍの穴を有する、外形が２０ｍｍ×２０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製スペーサを設け、蛍光色素層表面が流路の内側となるように、基板を流路に配置した。そして、流路の外側から基板を覆うように厚さ４ｍｍでＰＤＭＳ製スペーサと同外形のポリメチルメタクリレート板を乗せ圧着し、ビスで流路と該ポリメチルメタクリレート板とを固定した。 The surface of the fluorescent dye layer treated with the silane coupling agent is provided with a spacer made of polydimethylsiloxane (PDMS) having a hole of 2 mm × 10 mm, an outer shape of 20 mm × 20 mm, and a thickness of 0.5 mm. The substrate was placed in the flow path so that is inside the flow path. Then, a polymethyl methacrylate plate having a thickness of 4 mm and the same outer shape as that of the PDMS spacer was put on the substrate so as to cover the substrate from the outside of the flow channel, and the flow channel and the polymethyl methacrylate plate were fixed with screws.
送液として超純水を１０分間、その後ＰＢＳを３０分間、ペリスタポンプにより、３０℃、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させた。送液の総量は１５ｍＬである。
ここで、光源としてＬＤレーザを用いて、波長６３３ｎｍのレーザ光を照射し、光学フィルタとして減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を用いてフォトン量を調節し、シグマ光機（株）製の６０度プリズムを通して、流路に固定されているリガンド固定化前のプラズモン励起センサに照射し、表面プラズモンの測定を開始した。
Ultrapure water was circulated for 10 minutes and then PBS was circulated for 30 minutes by a peristaltic pump at 30 ° C. and a flow rate of 500 μL / min. The total volume of liquid delivery is 15 mL.
Here, an LD laser is used as a light source, a laser beam having a wavelength of 633 nm is irradiated, a photon amount is adjusted using an attenuating filter (neutral density filter) as an optical filter, and 60 manufactured by Sigma Kogyo Co., Ltd. is used. The surface plasmon measurement was started by irradiating the plasmon excitation sensor before immobilization of the ligand fixed to the flow path through the degree prism.
さらに、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ添加し（終濃度はそれぞれＮＨＳ：５０ｍＭ、ＷＳＣ：１００ｍＭ）、２０分間循環させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）４０μＬ、を２時間循環させて、プラズモン励起センサを作製した。 Furthermore, 5 mL of PBS containing 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) and 100 mM water-soluble carbodiimide (WSC) was added (final concentrations were NHS: 50 mM and WSC: 100 mM, respectively) and circulated for 20 minutes. Later, 40 μL of anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (1D5, 2.5 mg / mL, manufactured by Japan Medical Laboratory) was circulated for 2 hours to produce a plasmon excitation sensor.
表面プラズモンで共鳴角のシフトを測定し、リガンドの固定化を確認した。固定化量は３ｎｇ／ｍｍ2であった。
また、１重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異吸着防止処理を行った。
The resonance angle shift was measured with surface plasmons to confirm the immobilization of the ligand. The immobilization amount was 3 ng / mm 2 .
Moreover, the nonspecific adsorption | suction prevention process was performed by circulating for 30 minutes in the PBS buffer physiological saline containing 1 weight% bovine serum albumin (BSA).
（アッセイ法の実施）
工程（ａ）：送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１０ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。
(Implementation of assay method)
Step (a): The solution was replaced with PBS, 5 mL of PBS containing 10 ng / mL of AFP was added and circulated for 30 minutes.
洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＰＢＳを送液として、１０分間循環させることによって洗浄した。ここで、表面プラズモンを測定し最適角に固定した後、ＬＤレーザを用いて流路に固定されているプラズモン励起センサに照射し、日本真空光学（株）製のカットフィルタ、集光レンズとして１０倍の対物レンズ（（株）ニコン製）を用いて、ＣＣＤイメージセンサ（日本テキサス・インスツルメンツ（株）製）を通してＳＰＦＳによる蛍光を検出し、「ブランク蛍光シグナル」とした。 Washing step: Washing was performed by circulating PBS for 10 minutes using PBS containing 0.05% by weight of Tween 20 as a solution. Here, after measuring the surface plasmon and fixing it at an optimum angle, it is irradiated with a plasmon excitation sensor fixed to the flow path using an LD laser, and a cut filter manufactured by Nippon Vacuum Optics Co., Ltd. Using a double objective lens (manufactured by Nikon Corporation), fluorescence by SPFS was detected through a CCD image sensor (manufactured by Texas Instruments Japan Ltd.) to obtain a “blank fluorescence signal”.
工程（ｂ）：作製例１で得られた２次抗体と消光剤とのコンジュゲートを１,０００ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。
洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＰＢＳを送液として２０分間循環させることによって洗浄した。
Step (b): 5 mL of PBS containing 1,000 ng / mL of the conjugate of the secondary antibody and the quencher obtained in Preparation Example 1 was added and circulated for 30 minutes.
Washing step: Washing was performed by circulating PBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 20 minutes.
工程（ｃ）：洗浄開始から２０分後のＣＣＤから観察したときのＳＰＦＳシグナル値を計測し「アッセイシグナル」とした。なお、金基板に何も修飾していないもう一方の流路をＳＰＦＳに別途設置し、超純水を流しながら表面プラズモン測定を元に共鳴角を再設定し、ＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを「初期ノイズ」とした。 Step (c): The SPFS signal value observed from the CCD 20 minutes after the start of washing was measured and used as an “assay signal”. In addition, the other flow path not modified on the gold substrate was separately installed in the SPFS, and the resonance angle was reset based on the surface plasmon measurement while flowing ultrapure water, and the SPFS was measured. The signal was defined as “initial noise”.
工程（ｄ）：作製して得られたプラズモン励起センサにおけるアッセイ測定開始前の「ブランク蛍光シグナル」、比較サンプルのアッセイ開始前のブランクシグナルを「初期シグナル」とし、およびアッセイ蛍光シグナルから、下記式のアッセイＳ／Ｎ比を評価した。アッセイＳ／Ｎ比は、抗原量に比例するコンジュゲート量により変化する蛍光シグナルの数値の絶対値が大きく、かつ初期ノイズに対して数値的に充分大きい場合、アッセイシグナルの信頼性が高いことを意味する。
アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜／（初期ノイズ）
得られた結果を表３に示す。
Step (d): “blank fluorescence signal” before starting assay measurement in the plasmon excitation sensor obtained by making, “blank signal before starting assay of comparison sample” as “initial signal”, and from the assay fluorescence signal, The assay S / N ratio was evaluated. The assay S / N ratio indicates that the reliability of the assay signal is high when the absolute value of the numerical value of the fluorescent signal that changes with the amount of conjugate proportional to the amount of antigen is large and sufficiently large relative to the initial noise. means.
Assay S / N ratio = | (assay fluorescence signal) − (blank fluorescence signal) | / (initial noise)
The obtained results are shown in Table 3.
［実施例２］
実施例１において、蛍光色素をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に変更した以外は実施例１と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。
[Example 2]
In Example 1, except that the fluorescent dye was changed to Alexa Fluor (registered trademark) 647, the plasmon excitation sensor of the present invention was produced and assayed in the same manner as in Example 1. The obtained results are shown in Table 3.
［実施例３］
(プラズマ励起センサの作製)
屈折率〔ｎｄ〕１．５２、厚さ１ｍｍで外形が２０ｍｍ×２０ｍｍのガラス製の透明平面基板（ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさら金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１ｎｍ、金薄膜の厚さは５０ｎｍであった。
[Example 3]
(Production of plasma excitation sensor)
A glass transparent flat substrate (BK7 manufactured by SCHOTT AG) having a refractive index [nd] of 1.52, a thickness of 1 mm and an outer shape of 20 mm × 20 mm is plasma-cleaned, and a chromium thin film is formed on one surface of the substrate by a sputtering method. After that, a thin gold film was formed on the surface by sputtering. The chromium thin film had a thickness of 1 nm, and the gold thin film had a thickness of 50 nm.
金薄膜の、クロム薄膜とは接していない片面に対して、誘電体としてＴｉＯ2からなるスペーサ層をスパッタリング法により形成した。該スペーサ層の厚さは、１５ｎｍであった。 A spacer layer made of TiO 2 as a dielectric was formed by sputtering on one side of the gold thin film that was not in contact with the chromium thin film. The spacer layer had a thickness of 15 nm.
該スペーサ層の金薄膜とは接していない片面に対して、３−アミノプロピルトリエトキシシランを５重量％含む水溶液をスピンコーターで塗布し、室温で２時間自然乾燥させた後、５０℃で１０分間加熱した。 An aqueous solution containing 5% by weight of 3-aminopropyltriethoxysilane was applied to one side of the spacer layer not in contact with the gold thin film with a spin coater, allowed to dry naturally at room temperature for 2 hours, and then 10 ° C. at 50 ° C. Heated for minutes.
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を５０ｍＭ含むＰＢＳを５ｍＬ調製し、スピンコーターで塗布して定法（５０℃×１０分間）で乾燥してポリマーを含有しない蛍光色素層を有するプラズモン励起センサを作製した。 5 mL of PBS containing 50 mM of N-hydroxysuccinimide (NHS), 100 mM of water-soluble carbodiimide (WSC) and 50 mM of Alexa Fluor (registered trademark) 647 was prepared and applied with a spin coater (50 ° C. × 10 Plasmon excitation sensor having a fluorescent dye layer containing no polymer.
（アッセイ法の実施）
実施例１と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。
［実施例４］
実施例１において、金属種を銀に、金属薄膜の厚さを４５ｎｍとし、蛍光色素をＴＲＩＴＣに、レーザ光の波長を５３２ｎｍとした以外は実施例１と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。
(Implementation of assay method)
The assay was carried out in the same manner as in Example 1. The obtained results are shown in Table 3.
[Example 4]
In Example 1, the plasmon excitation sensor of the present invention was prepared in the same manner as in Example 1 except that the metal species was silver, the thickness of the metal thin film was 45 nm, the fluorescent dye was TRITC, and the wavelength of the laser beam was 532 nm. Made and assayed. The obtained results are shown in Table 3.
［実施例５］
実施例４において、金属種をアルミニウムに、金属薄膜の厚さを１５ｎｍとした以外は実施例４と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。
[Example 5]
In Example 4, a plasmon excitation sensor of the present invention was prepared and assayed in the same manner as in Example 4 except that the metal species was aluminum and the thickness of the metal thin film was 15 nm. The obtained results are shown in Table 3.
［実施例６］
実施例５において、金属薄膜の厚さを２０ｎｍとした以外は実施例５と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。
[Example 6]
In Example 5, a plasmon excitation sensor of the present invention was produced and assayed in the same manner as in Example 5 except that the thickness of the metal thin film was 20 nm. The obtained results are shown in Table 3.
［実施例７］
実施例６において、蛍光色素をＣｙ３に変更した以外は実施例６と同様にして本発明のプラズモン励起センサを作製し、アッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。
[Example 7]
In Example 6, except that the fluorescent dye was changed to Cy3, a plasmon excitation sensor of the present invention was prepared and assayed in the same manner as in Example 6. The obtained results are shown in Table 3.
［比較例１］
(プラズマ励起センサの作製)
屈折率〔ｎｄ〕１．５２、厚さ１ｍｍで外形が２０ｍｍ×２０ｍｍのガラス製の透明平面基板（ＳＣＨＯＴＴ ＡＧ社製のＢＫ７）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさら金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１ｎｍ、金薄膜の厚さは５０ｎｍであった。
[Comparative Example 1]
(Production of plasma excitation sensor)
A glass transparent flat substrate (BK7 manufactured by SCHOTT AG) having a refractive index [nd] of 1.52, a thickness of 1 mm and an outer shape of 20 mm × 20 mm is plasma-cleaned, and a chromium thin film is formed on one surface of the substrate by a sputtering method. After that, a thin gold film was formed on the surface by sputtering. The chromium thin film had a thickness of 1 nm, and the gold thin film had a thickness of 50 nm.
得られた基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。 The obtained substrate was immersed in an ethanol solution containing 1 mM 10-carboxy-1-decanethiol for 24 hours or more to form a SAM (Self Assembled Monolayer) on one side of the gold thin film. The substrate was removed from the solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.
ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、さらにポリメチルメタクリレート製天板を配置した。送液として超純水を１０分間、その後ＰＢＳを２０分間、ペリスタポンプにより、室温、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させ、その表面を平衡化した。 A polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a flow path height of 0.5 mm was provided on the surface of the SAM, and a polymethyl methacrylate top plate was further disposed. Ultrapure water was fed as a liquid for 10 minutes, and then PBS was circulated for 20 minutes with a peristaltic pump at room temperature and a flow rate of 500 μL / min to equilibrate the surface.
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。１重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異吸着防止処理を行い、プラズモン励起センサを作製した。 Subsequently, 5 mL of PBS containing 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) and 100 mM water-soluble carbodiimide (WSC) was fed and circulated for 20 minutes, and then anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal. The primary antibody was solid-phased on the SAM by circulating 2.5 mL of an antibody (1D5, 2.5 mg / mL, manufactured by Japan Medical Clinical Laboratory Laboratories) solution for 30 minutes. Non-specific adsorption prevention treatment was performed by circulating and feeding in PBS buffered saline containing 1% by weight of bovine serum albumin (BSA) for 30 minutes to produce a plasmon excitation sensor.
（アッセイ法の実施）
送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１０ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。
(Implementation of assay method)
Instead of PBS, 5 mL of a PBS solution containing 10 ng / mL of AFP was added and circulated for 30 minutes.
Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。
消光剤を標識しない２次抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を２．５ｍＬ添加し、３０分間循環させた。
Washing was carried out by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 10 minutes.
2.5 mL of a secondary antibody not labeled with a quencher (PBS solution adjusted to 1,000 ng / mL) was added and circulated for 30 minutes.
その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として２０分間循環させることによって洗浄した。
共鳴角を最適にしてＣＣＤイメージセンサから観察したときのシグナル値を計測し、「アッセイシグナル」とした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイＳ／Ｎ比を算出することで評価した。得られた結果を表３に示す。
Then, it was cleaned by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 20 minutes.
The signal value when observed from the CCD image sensor with the optimum resonance angle was measured and designated as “assay signal”. The SPFS measurement signal when AFP was 0 ng / mL was defined as “blank signal”. The assay was evaluated by calculating the same assay S / N ratio as in Example 1. The obtained results are shown in Table 3.
［比較例２］
比較例１において、金属種をアルミニウムに、金属薄膜の厚さを２０ｎｍに変更した以外は比較例１と同様にしてプラズモン励起センサを作製し、さらに蛍光色素をＣｙ３に変更した以外は比較例１と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表３に示す。
[Comparative Example 2]
Comparative Example 1 except that the plasmon excitation sensor was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 except that the metal species was changed to aluminum and the thickness of the metal thin film was changed to 20 nm, and the fluorescent dye was changed to Cy3. The assay was performed as described above. The obtained results are shown in Table 3.
本発明の蛍光色素層を設け、かつ消光剤を２次抗体に結合した試料においては、いずれも比較例１および２に較べて高い蛍光シグナル値を有しており、単位抗原当たり、より多くの蛍光色素で信号を担っており数値の信頼性が高いことがわかった。またアッセイＳ／Ｎ比が比較例よりも有意に高いため測定感度もより高く設定できることがわかった。 In the sample in which the fluorescent dye layer of the present invention was provided and the quencher was bound to the secondary antibody, both had higher fluorescent signal values than those in Comparative Examples 1 and 2, and more per unit antigen. It was found that the signal is carried by the fluorescent dye and the numerical reliability is high. Moreover, since the assay S / N ratio was significantly higher than that of the comparative example, it was found that the measurement sensitivity could be set higher.
［実施例８］
実施例１のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は実施例１と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Example 8]
In the implementation of the assay method of Example 1, instead of the “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, the “secondary antibody complexed with the competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 was used. A competitive immunoassay was carried out in the same manner as in Example 1 except that the “conjugate of antibody and quencher” was used. Table 4 shows the obtained results.
［実施例９］
実施例２のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は実施例２と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Example 9]
In the implementation of the assay method of Example 2, instead of the “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, the “secondary antibody complexed with the competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 was used. A competitive immunoassay was performed in the same manner as in Example 2 except that the conjugate of antibody and quencher was used. Table 4 shows the obtained results.
［実施例１０］
実施例３のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は実施例３と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Example 10]
In the implementation of the assay method of Example 3, instead of “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, “secondary antibody complexed with competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 was used. A competitive immunoassay was carried out in the same manner as in Example 3 except that the antibody-quencher conjugate was used. Table 4 shows the obtained results.
［実施例１１］
実施例４のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は実施例４と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Example 11]
In the execution of the assay method of Example 4, instead of “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, “secondary antibody complexed with competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 was used. A competitive immunoassay was carried out in the same manner as in Example 4 except that the “conjugate of antibody and quencher” was used. Table 4 shows the obtained results.
［実施例１２］
実施例５のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は実施例５と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Example 12]
In the execution of the assay method of Example 5, instead of “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, “secondary antibody complexed with competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 was used. A competitive immunoassay was carried out in the same manner as in Example 5 except that the conjugate of antibody and quencher was used. Table 4 shows the obtained results.
［実施例１３］
実施例６のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は実施例６と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Example 13]
In the execution of the assay method of Example 6, instead of “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, “secondary antibody complexed with competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 was used. A competitive immunoassay was carried out in the same manner as in Example 6 except that the conjugate of antibody and quencher was used. Table 4 shows the obtained results.
［実施例１４］
実施例７のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は実施例７と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Example 14]
In the implementation of the assay method of Example 7, instead of “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, “secondary antibody complexed with competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 was used. A competitive immunoassay was carried out in the same manner as in Example 7 except that the antibody-quencher conjugate was used. Table 4 shows the obtained results.
［比較例３］
比較例１のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は比較例１と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Comparative Example 3]
In the execution of the assay method of Comparative Example 1, instead of “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, “secondary antibody complexed with competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 was used. A competitive immunoassay was carried out in the same manner as in Comparative Example 1 except that the “conjugate of antibody and quencher” was used. Table 4 shows the obtained results.
［比較例４］
比較例２のアッセイ法の実施において、作製例１で得られた「２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」の代わりに、作製例２で得られた「競合抗原を複合化した、２次抗体と消光剤とのコンジュゲート」を用いた以外は比較例２と同様にして競合イムノアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。
[Comparative Example 4]
In the execution of the assay method of Comparative Example 2, instead of “conjugate of secondary antibody and quencher” obtained in Preparation Example 1, “secondary antibody complexed with competitive antigen” obtained in Preparation Example 2 A competitive immunoassay was carried out in the same manner as in Comparative Example 2 except that the “conjugate of antibody and quencher” was used. Table 4 shows the obtained results.
本発明のプラズモン励起センサは、高感度および高精度であるから、例えば、がん胎児性抗原や腫瘍マーカーなどの生体分子の分子認識反応を利用した選択的バイオセンサやバイオプローブに直接応用できる。 Since the plasmon excitation sensor of the present invention has high sensitivity and high accuracy, it can be directly applied to, for example, a selective biosensor or bioprobe using a molecular recognition reaction of a biomolecule such as carcinoembryonic antigen or tumor marker.
１・・・基板
２・・・１次抗体
３・・・検体中に含有される消光剤（標的抗原）
４・・・２次抗体
５・・・２次抗体と蛍光色素とのコンジュゲート
６・・・２次抗体と消光剤とのコンジュゲート
７・・・検体中に含有される標的抗原とは異なる、該標的抗原と競合する抗原（競合抗原）
１１・・・透明平面基板の一方の表面に形成された金属薄膜
１２・・・誘電体からなるスペーサ層の一方の表面に形成された蛍光色素層
１３・・・表面プラズモンにより励起された蛍光色素が発した蛍光
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Substrate 2 ... Primary antibody 3 ... Quenching agent (target antigen) contained in specimen
4 ... Secondary antibody 5 ... Conjugate of secondary antibody and fluorescent dye 6 ... Conjugate of secondary antibody and quencher 7 ... Different from target antigen contained in specimen , An antigen that competes with the target antigen (competitive antigen)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 ... Metal thin film 12 formed on one surface of transparent flat substrate 12 ... Fluorescent dye layer formed on one surface of spacer layer made of dielectric 13 ... Fluorescent dye excited by surface plasmon Fluorescence emitted from
Claims (12)
該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、
該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層と、
該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素層と、
該蛍光色素層の、該スペーサ層とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドと
を含むことを特徴とするプラズモン励起センサ。 A transparent planar substrate;
A metal thin film formed on one surface of the substrate;
A spacer layer made of a dielectric formed on the other surface of the metal thin film not in contact with the substrate;
A fluorescent dye layer formed on the other surface of the spacer layer not in contact with the metal thin film;
A plasmon excitation sensor comprising: a ligand immobilized on the other surface of the fluorescent dye layer not in contact with the spacer layer.
工程（ａ）：請求項１〜７のいずれかに記載のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光を消光または吸収し得る化合物とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明平面基板の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。 An assay method comprising the following steps (a) to (d):
Step (a): contacting the specimen with the plasmon excitation sensor according to any one of claims 1 to 7,
Step (b): The plasmon excitation sensor obtained through the step (a) is further quenched or absorbed with a ligand that may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor. Reacting a conjugate with the resulting compound;
Step (c): The plasmon excitation sensor obtained through the step (b) is irradiated with a laser beam via a prism from the other surface of the transparent flat substrate on which the metal thin film is not formed. A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye, and a step (d): a step of calculating the amount of analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (c).
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