JP2007255947A - Localized surface plasmon sensor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は局在化表面プラズモンセンサに関する。詳しくは、バイオセンシング等を行なう超小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモン及び光第２高調波発生を用いて改良した、局在化表面プラズモンセンサに関する。また、局在化表面プラズモンを用いた新規な分子検出方法に関する。 The present invention relates to a localized surface plasmon sensor. More specifically, the present invention relates to a localized surface plasmon sensor improved by using localized surface plasmon and optical second harmonic generation in an ultra-compact and highly sensitive sensor for performing biosensing and the like. The present invention also relates to a novel molecular detection method using localized surface plasmons.
遺伝子解析などの進歩に伴い、タンパクやＤＮＡなど生体分子の検出方法の開発が重要となっている。これらの分子を検出する方法の一つにアフィニティーバイオセンシングがある。これは、分子間の相互作用を利用して検出対象分子を選択的に検出するものである。小型で高性能なバイオセンシング装置ができれば、生化学や遺伝子工学の分野をはじめ、製薬や医療、そして情報工学の分野で重要なツールとなる。
現在実用化されているアフィニティーバイオセンシングの手法に全反射減衰法（ＡＴＲ法：Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ法）を利用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）がある。
With advances in gene analysis and the like, it has become important to develop methods for detecting biomolecules such as proteins and DNA. One method for detecting these molecules is affinity biosensing. In this method, a molecule to be detected is selectively detected using an interaction between molecules. If a small and high-performance biosensing device can be achieved, it will become an important tool in the fields of biochemistry and genetic engineering, as well as in the fields of pharmaceuticals, medicine, and information engineering.
As a method of affinity biosensing currently in practical use, there is a surface plasmon resonance (SPR) using an attenuated total reflection method (ATR method: Attenuated total reflection method).
図１２は全反射減衰（ＡＴＲ）法による表面プラズモンセンサを説明するための図である。図１２（ａ）にその構成を概略的に示す。プリズム２１の底面に金（Ａｕ）などの金属薄膜２２を形成する。膜厚は例えば４６．５ｎｍである。全反射条件で単色光２３を入射（入射角θ）するとある共鳴角θＲで金属薄膜２２中の電子波の一種である表面プラズモンが励起される。図１２（ｂ）は表面プラズモンの反射光の検出例を示す。横軸に入射角θ（ｄｅｇ）を、縦軸に反射率を示す。共鳴角θＲでＡＴＲ配置により生じる減衰波（エヴァネッセント光）２４の波数が表面プラズモン波の波数と一致するため、共鳴吸収が生じ、反射光にディップが生じる。図１２（ａ）にはエヴァネッセント光２４が放射され、その電場Ｅが金属薄膜２２からの距離ｚが遠ざかるにつれて減衰していく様子が示されている。共鳴角θＲは金属薄膜２２上に結合している分子の数や屈折率、厚さなどに敏感である。そのため、分子間の相互作用を利用して検出対象分子を選択的に検出し、また、共鳴角θＲの変化やそれに伴って生じる反射率や偏光状態の変化を観測することにより、検出対象分子のアフィニティー（親和性）を知ることができる。 FIG. 12 is a diagram for explaining a surface plasmon sensor based on the total reflection attenuation (ATR) method. FIG. 12A schematically shows the configuration. A metal thin film 22 such as gold (Au) is formed on the bottom surface of the prism 21. The film thickness is, for example, 46.5 nm. Surface plasmon is a kind of electron waves in the metal thin film 22 is excited by monochromatic light 23 incident (incident angle theta) Then there resonance angle theta R by the total reflection condition. FIG. 12B shows an example of detection of reflected light from surface plasmons. The horizontal axis represents the incident angle θ (deg), and the vertical axis represents the reflectance. Since the wave number of the evanescent wave (evanescent light) 24 generated by the ATR arranged in the resonance angle theta R matches the wave number of the surface plasmon wave, occurs resonance absorption, dips occur in the reflected light. FIG. 12A shows a state in which the evanescent light 24 is emitted and the electric field E attenuates as the distance z from the metal thin film 22 increases. The resonance angle θ R is sensitive to the number of molecules bonded to the metal thin film 22, the refractive index, the thickness, and the like. Therefore, by utilizing the interaction between molecules detected molecules selectively detected, also observes the changes in the change and reflectance and the polarization state that occurs with that of the resonance angle theta R, detected molecules Can be known.
ＳＰＲを利用して多くの試料を一度に検出するマルチチャンネルバイオセンシングを行うためには、金属表面上に様々な分子をドット状に塗布して各々のドットにおける反射率変化を測定することになる。プラズマ波は金属薄膜中を伝搬するため、ドットを小さくした場合には、ドットの界面等でプラズマ波の干渉等が起きるためその測定は易しいものではない。波長や金薄膜の表面状態によっても異なるが、プラズモンの伝搬長は金の場合５μｍ〜１０μｍ程度であり、実際には１００μｍを切るドットにおいては、干渉の効果により信頼性の高いセンシングは難しい。 In order to perform multi-channel biosensing that detects many samples at once using SPR, various molecules are coated on the metal surface in the form of dots, and the change in reflectance at each dot is measured. . Since the plasma wave propagates through the metal thin film, when the dot is made small, the plasma wave interference or the like occurs at the dot interface or the like, so that measurement is not easy. Although it depends on the wavelength and the surface state of the gold thin film, the propagation length of plasmon is about 5 μm to 10 μm in the case of gold.
これを解決するために、ナノ微粒子やナノ構造中で生じる局在化表面プラズモン（ＬＳＰ：Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ）共鳴を利用したバイオセンシング手法がある。ＡＴＲ条件を用いて表面プラズモン（ＳＰ：Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ）を励起する代わりに、ナノ構造による光の散乱時に生じるエヴァネッセント波によって表面プラズモンを励起する方法である。共鳴条件は金属薄膜上に結合している分子の数や屈折率、厚さなどに敏感であるため、これを利用したバイオセンシングも可能である。一般にＬＳＰを励起するためにはどのような入射角で光を入射してもよく、共鳴条件の変化は散乱光や透過光の強度変化を検出することになる。ＬＳＰを用いたバイオセンシングの大きな特徴として、センシングプローブを小さくできる利点がある。たとえば、ナノ微粒子１つからの散乱光が観測可能であれば、原理的にはナノ微粒子１つでもセンシングプローブを作成することが可能である。（特許文献１参照） In order to solve this problem, there is a biosensing technique using localized surface plasmon (LSP) resonance that occurs in nanoparticles or nanostructures. Instead of exciting surface plasmons (SP) using ATR conditions, surface plasmons are excited by evanescent waves generated when light is scattered by nanostructures. The resonance condition is sensitive to the number of molecules bound on the metal thin film, the refractive index, the thickness, etc., and biosensing using this is also possible. In general, in order to excite the LSP, light may be incident at any incident angle, and a change in resonance condition detects a change in intensity of scattered light or transmitted light. A major feature of biosensing using LSP is the advantage that the sensing probe can be made smaller. For example, if the scattered light from one nano fine particle can be observed, in principle, it is possible to create a sensing probe with only one nano fine particle. (See Patent Document 1)
これまでバイオセンシング等の分野で、超小型、高感度のセンサを得る工夫が求められている。ところで、ＬＳＰを用いたバイオセンサは小型化が可能でありそれをアレイ化したマルチチャンネルバイオセンシングにおいて、単位面積あたりのドット数を飛躍的に大きくすることができる。 So far, in the field of biosensing and the like, a device for obtaining an ultra-small and highly sensitive sensor has been demanded. By the way, the biosensor using the LSP can be miniaturized, and the number of dots per unit area can be dramatically increased in multichannel biosensing in which the biosensor is arrayed.
本発明は、小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモン及び光第２高調波発生を用いてさらに高感度のセンサを提供することを目的とする。また、局在化表面プラズモンを用いる新規な分子検出方法を提供することを別の目的とする。 An object of the present invention is to provide a sensor with higher sensitivity by using localized surface plasmon and optical second harmonic generation in a small and highly sensitive sensor. Another object is to provide a novel molecular detection method using localized surface plasmons.
上記課題を解決するために、請求項１に記載の局在化表面プラズモンセンサＰＳ１は、例えば図１及び図４に示すように、金属層２上に光透過性絶縁性薄膜３を介して、局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子４を固定化し、金属微粒子４の表面に検出対象分子９に相補的な分子の分子層７を形成し、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出して、相補的な分子に吸着又は結合した検出対象分子９を検出する。 In order to solve the above-mentioned problem, the localized surface plasmon sensor PS1 according to claim 1 has a light-transmitting insulating thin film 3 on a metal layer 2 as shown in FIGS. 1 and 4, for example. The metal fine particle 4 having a size for exciting the localized surface plasmon is fixed, and a molecular layer 7 of a molecule complementary to the detection target molecule 9 is formed on the surface of the metal fine particle 4. A change in the second harmonic wave 8 caused by the interaction between the plasmon and the light 6 incident on the metal fine particle 4 is detected, and the detection target molecule 9 adsorbed or bound to the complementary molecule is detected.
ここにおいて、金属層には、金属基板、金属膜等が含まれる。また、必ずしも純金属である必要はなく。不純物や結晶欠陥があっても良い。また、金属層には合金層が含まれるものとする。また、光透過性絶縁性薄膜３は金属層２と金属微粒子４とを微小距離離すためのものであり、光透過性かつ絶縁性であれば良く、例えば高分子ポリマー、透明な誘電体等を使用できる。また、局在化表面プラズモンが励起される金属微粒子４の寸法は１０〜１５０ｎｍ程度であり、金属微粒子４は、金、銀の球状微粒子が好ましいが、これに限定されず、任意の形状でも良い。また、金属層２上に固定化される金属微粒子４は単数でも複数でも良く、複数の金属微粒子４が例えばドット状に集められて固定化されても良い。また、局在化表面プラズモンと入射光との相互作用とは、入射光により局在化表面プラズモンが励起され、共鳴する相互作用をいう。その結果、金属微粒子４の表面近傍、特に金属層２と金属微粒子４の間に増強された光電場が発生し、光第２高調波発生（ＳＨＧ：Ｓｅｃｏｎｄ ｈａｒｍｏｎｉｃ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の増強がもたらされる。また、検出対象分子に相補的な分子とは、検出対象分子（アナライト）と良く結合し、それ以外の分子とは結合し難い分子（リガンド）をいう。このように構成すると、小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモンの第２高調波を用いてさらに高感度のセンサを提供できる。 Here, the metal layer includes a metal substrate, a metal film, and the like. Moreover, it is not necessarily required to be a pure metal. There may be impurities and crystal defects. The metal layer includes an alloy layer. The light transmissive insulating thin film 3 is for separating the metal layer 2 and the metal fine particles 4 from each other by a small distance, and may be light transmissive and insulating. For example, a polymer polymer, a transparent dielectric, etc. Can be used. In addition, the size of the metal fine particles 4 to which the localized surface plasmon is excited is about 10 to 150 nm, and the metal fine particles 4 are preferably gold or silver spherical fine particles, but are not limited thereto, and may be any shape. . Further, the metal fine particles 4 immobilized on the metal layer 2 may be singular or plural, and a plurality of metal fine particles 4 may be collected in a dot shape and immobilized, for example. The interaction between the localized surface plasmon and the incident light means an interaction in which the localized surface plasmon is excited by the incident light and resonates. As a result, an enhanced photoelectric field is generated in the vicinity of the surface of the metal fine particle 4, particularly between the metal layer 2 and the metal fine particle 4, resulting in enhanced second harmonic generation (SHG). A molecule complementary to a molecule to be detected means a molecule (ligand) that binds well to the molecule to be detected (analyte) and hardly binds to other molecules. If comprised in this way, in a small and highly sensitive sensor, a still more sensitive sensor can be provided using the 2nd harmonic of a localized surface plasmon.
また、請求項２に記載の局在化表面プラズモンセンサは、金属層２上に光透過性絶縁性薄膜３を介して、局在化表面プラズモンが励起される寸法で、検出対象分子９に相補的な分子の機能を有する金属微粒子４を固定化し、金属微粒子層４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出して、金属微粒子４に吸着又は結合した検出対象分子９を検出する。このように構成すると、金属微粒子が検出対象分子と直接結合できる場合にも適用できる。 Further, the localized surface plasmon sensor according to claim 2 is complementary to the detection target molecule 9 in such a dimension that the localized surface plasmon is excited on the metal layer 2 through the light-transmitting insulating thin film 3. Of the second harmonic wave 8 caused by the interaction between the localized surface plasmon in the metal fine particle layer 4 and the light 6 incident on the metal fine particle 4. By detecting the change, the detection target molecule 9 adsorbed or bound to the metal fine particle 4 is detected. With this configuration, the present invention can also be applied when the metal fine particles can be directly bonded to the detection target molecule.
また、請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載の局在化表面プラズモンセンサにおいて、第２高調波８の変化は、金属微粒子４から反射又は散乱された第２高調波８の強度、位相又は波長の変化である。このように構成すると、第２高調波８の変化を確実に検出でき、好適である。 The invention according to claim 3 is the localized surface plasmon sensor according to claim 1 or 2, wherein the change of the second harmonic 8 is reflected or scattered from the metal fine particle 4. This is a change in the intensity, phase or wavelength of the wave 8. If comprised in this way, the change of the 2nd harmonic 8 can be detected reliably, and it is suitable.
また、請求項４に記載の発明は、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサにおいて、金属微粒子４が金を主成分とする直径１０〜１５０ｎｍの球状微粒子であり、光透過性絶縁性薄膜３の膜厚が０．３〜５ｎｍである。このように構成すると、金属微粒子の鏡像ができやすく、第２高調波８の感度を向上するのに好適である。 According to a fourth aspect of the present invention, in the localized surface plasmon sensor according to any one of the first to third aspects, the metal fine particles 4 are spherical with a diameter of 10 to 150 nm mainly composed of gold. It is a fine particle, and the film thickness of the light-transmissive insulating thin film 3 is 0.3 to 5 nm. With this configuration, it is easy to form a mirror image of the metal fine particles, which is suitable for improving the sensitivity of the second harmonic wave 8.
また、請求項５に記載の発明は、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサにおいて、光透過性絶縁性薄膜３としてメロシアニン単分子膜又はヘミシアニン単分子膜等の非線形光学材料を用いる。このように構成すると、金属のみで発生するＳＨＧに、非線形光学材料からのＳＨＧが加わり信号強度が上がるため、Ｓ／Ｎ比や感度を向上でき好適である。非線型光学材料からのＳＨＧは、局在化表面プラズモンと入射光との相互作用による強い増強電場により励起されるため、著しく増強されている。特にメロシアニン単分子膜又はヘミシアニン単分子膜が好適である。 The invention according to claim 5 is the localized surface plasmon sensor according to any one of claims 1 to 4, wherein the light-transmissive insulating thin film 3 is a merocyanine monomolecular film or a hemicyanine monomolecule. A nonlinear optical material such as a film is used. With such a configuration, SHG generated from a metal alone is added to SHG from a non-linear optical material to increase the signal intensity, which is preferable because the S / N ratio and sensitivity can be improved. SHG from nonlinear optical materials is significantly enhanced because it is excited by a strong enhanced electric field due to the interaction of localized surface plasmons and incident light. In particular, a merocyanine monolayer or a hemicyanine monolayer is suitable.
また、請求項６に記載の発明は、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサにおいて、金属微粒子４がドットアレイ状に配置され、相補的な分子の種類がドット単位に定められている。ここにおいて、ドット単位とはドット内では同種の分子を用いるが、異なるドットについては異なる分子を用いても良い意味であり、ドット毎に全て異種の分子としても良く、複数のドットに同種の分子を用いても良い。このように構成すると、局在化表面プラズモンセンサの高感度性を利用して、単位面積あたりのドット数を飛躍的に大きくできる。 The invention according to claim 6 is the localized surface plasmon sensor according to any one of claims 1 to 5, wherein the metal fine particles 4 are arranged in a dot array, and The type is determined in dot units. Here, the dot unit means that the same type of molecule is used in the dot, but different molecules may be used for different dots, and each dot may be a different type of molecule. May be used. With this configuration, the number of dots per unit area can be dramatically increased by utilizing the high sensitivity of the localized surface plasmon sensor.
また、請求項７に記載の局在化表面プラズモンセンシング装置は、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサと、表面プラズモンを励起する光６を発光する光源と、第２高調波８を検出する光検出器と、第２高調波８の変化から相補的な分子に吸着又は結合した検出対象分子９の屈折率、吸着量、結合量又は膜厚を算定する演算装置とを備える。このように構成すると、高感度の局在化表面プラズモンを用いる高感度センシング装置を提供できる。 A localized surface plasmon sensing device according to claim 7 emits the localized surface plasmon sensor according to any one of claims 1 to 6 and light 6 for exciting the surface plasmon. The refractive index, the amount of adsorption, the amount of binding, or the film thickness of the detection target molecule 9 adsorbed or bound to the complementary molecule from the change of the second harmonic 8 by the light source, the photodetector for detecting the second harmonic 8 And an arithmetic unit for calculation. If comprised in this way, the highly sensitive sensing apparatus using a highly sensitive localized surface plasmon can be provided.
また、請求項８に記載の局在化表面プラズモンを用いるセンシング方法は、例えば図５に記載のように、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサＰＳ１を準備する（Ｓ００１）工程と、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１の金属微粒子４内に局在化表面プラズモンを励起し（Ｓ００２）、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８を検出する（Ｓ００３）工程と、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１に検出対象分子９を吸着又は結合させる（Ｓ００４）工程と、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１の金属微粒子４内に局在化した表面プラズモン共鳴を励起し（Ｓ００５）、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出する（Ｓ００６）工程と、第２高調波８の変化から吸着又は結合した検出対象分子９を検出する（Ｓ００７）工程とを備える。 The sensing method using the localized surface plasmon according to claim 8 is a localized surface plasmon sensor PS1 according to any one of claims 1 to 6, for example, as shown in FIG. (S001) and exciting the localized surface plasmon in the metal fine particle 4 of the localized surface plasmon sensor PS1 (S002), and entering the localized surface plasmon in the metal fine particle 4 and the metal fine particle 4 Detecting the second harmonic 8 generated due to the interaction with the light 6 (S003), adsorbing or binding the detection target molecule 9 to the localized surface plasmon sensor PS1 (S004), The surface plasmon resonance localized in the metal fine particle 4 of the localized surface plasmon sensor PS1 is excited (S005), and the localized surface plasmon in the metal fine particle 4 and the metal fine particle 4 are excited. A step of detecting a change in the second harmonic 8 caused by the interaction with the emitted light 6 (S006), and detecting a molecule 9 to be detected adsorbed or bound from the change in the second harmonic 8 ( S007).
ここにおいて、工程Ｓ００２における、局在化表面プラズモンの励起を工程Ｓ００５まで持続したまま、工程Ｓ００４で検出対象分子９を吸着又は結合させても良い。このように構成すると、小型、高感度のセンサの分野において、局在化表面プラズモンの第２高調波を用いてさらに高感度のセンシング方法を提供できる。 Here, the molecule 9 to be detected may be adsorbed or bound in step S004 while the localized surface plasmon excitation in step S002 is continued until step S005. If comprised in this way, in the field | area of a small and highly sensitive sensor, the still more sensitive sensing method can be provided using the 2nd harmonic of a localized surface plasmon.
また、請求項９に記載の局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法は、例えば図１１に記載のように、金属層１２上に検出対象分子１４に相補的な分子１３の分子層を形成する工程（Ｓ０１１）と、相補的な分子１３の分子層に検出対象分子１４を吸着又は結合させて検出対象分子層を形成する工程（Ｓ０１２）と、検出対象分子層に局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子１５を吸着または結合させて、金属層１２の表面に薄膜１４を介して金属微粒子１５を固定化した金属微粒子固定化構造を形成する工程（Ｓ０１３）と、金属微粒子固定化構造に光を入射して、金属微粒子１５と金属層１２との間に生じる相互作用により生じる反射光の吸収や散乱の変化を検出することにより、吸着又は結合した検出対象分子１４を検出する工程（Ｓ０１４）とを備える。このように構成すると、検出対象分子層の膜厚を高感度で測定できる新規な分子検出方法を提供できる。 The molecular detection method using the localized surface plasmon according to claim 9 forms a molecular layer of the molecule 13 complementary to the detection target molecule 14 on the metal layer 12 as shown in FIG. 11, for example. A step (S011), a step (S012) of forming a detection target molecule layer by adsorbing or binding the detection target molecule 14 to the molecular layer of the complementary molecule 13, and a localized surface plasmon excited in the detection target molecular layer Forming a metal fine particle fixed structure in which the metal fine particles 15 having the dimensions as described above are adsorbed or bonded to each other to fix the metal fine particles 15 on the surface of the metal layer 12 via the thin film 14 (S013); By entering light into the structure and detecting changes in the reflected light absorption and scattering caused by the interaction between the metal fine particles 15 and the metal layer 12, the adsorbed or bound molecules 14 to be detected are detected. And a step (S014) for. If comprised in this way, the novel molecular detection method which can measure the film thickness of a detection object molecular layer with high sensitivity can be provided.
また、請求項１０に記載の局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法は、金属層１２上に検出対象分子１４に相補的な分子１３の分子層を形成する工程（Ｓ０１１）と、相補的な分子１３の分子層に検出対象分子１４を吸着又は結合させて検出対象分子層を形成する工程（Ｓ０１２）と、検出対象分子層に局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子１５を吸着または結合させて、金属層１２の表面に薄膜１４を介して金属微粒子１５を固定化した金属微粒子固定化構造を形成する工程（Ｓ０１３）と、金属微粒子固定化構造に光を入射して、金属微粒子１５と金属層１２との間に生じる相互作用に起因して生じる第２高調波を検出することにより、吸着又は結合した検出対象分子１４を検出する工程（Ｓ０１５）とを備える。このように構成すると、超小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモンの第２高調波を用いてさらに高感度の分子検出方法を提供できる。 The molecular detection method using the localized surface plasmon according to claim 10 is complementary to a step (S011) of forming a molecular layer of molecules 13 complementary to the detection target molecules 14 on the metal layer 12. A step of forming a detection target molecule layer by adsorbing or binding the detection target molecule 14 to the molecular layer of the molecule 13 (S012), and adsorbing the metal fine particle 15 having a size capable of exciting the localized surface plasmon to the detection target molecular layer Alternatively, a step (S013) of forming a metal fine particle fixed structure in which the metal fine particles 15 are fixed to the surface of the metal layer 12 via the thin film 14 is combined, and light is incident on the metal fine particle fixed structure to A step (S015) of detecting the adsorbed or bound molecule 14 to be detected by detecting the second harmonic generated due to the interaction between the fine particles 15 and the metal layer 12. If comprised in this way, in an ultra-small and highly sensitive sensor, a more sensitive molecular detection method can be provided using the second harmonic of the localized surface plasmon.
本発明のセンサによれば、小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモン及び光第２高調波発生を用いてさらに高感度のセンサを提供できる。また、本発明の分子検出方法によれば、局在化表面プラズモンセンサを用いた新規な分子検出方法を提供できる。 According to the sensor of the present invention, a highly sensitive sensor can be provided using a localized surface plasmon and optical second harmonic generation in a small and highly sensitive sensor. Moreover, according to the molecular detection method of the present invention, a novel molecular detection method using a localized surface plasmon sensor can be provided.
〔発明の要点〕
まず、本発明の原理的側面を説明する。ＬＳＰバイオセンシング材料として金属基板表面に固定化された金ナノ微粒子を用いる。ナノ微粒子の形状はどのようなものでも良いが、球状のナノ微粒子はよく規定された材料が入手できるので、球状とするのは現実的な選択である。また、微粒子の固定化には、数ナノメートル以下で、かつ、微粒子と結合するような材料を用いる。結合は、共有結合、静電的結合等どのようなものでも良い。ここでは、末端をアミノ基やチオール基などの含窒素化合物、電荷を有する基などで修飾された自己組織化単分子膜を用いる。自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）は、基板を試料溶液に浸積するだけで形成できるため簡単なプロセスで作製が可能である。
[Key points of the invention]
First, the principle aspect of the present invention will be described. As the LSP biosensing material, gold nano-particles immobilized on the surface of a metal substrate are used. The shape of the nanoparticles can be any shape, but since well-defined materials are available for spherical nanoparticles, it is a realistic choice to make them spherical. For fixing the fine particles, a material having a size of several nanometers or less and bonded to the fine particles is used. The bond may be any bond such as a covalent bond and an electrostatic bond. Here, a self-assembled monolayer whose end is modified with a nitrogen-containing compound such as an amino group or a thiol group or a group having a charge is used. A self-assembled monolayer (SAM) can be formed by simply immersing a substrate in a sample solution, and thus can be manufactured by a simple process.
図１に、金属微粒子固定化構造を概略的に示す。基板１上に金（Ａｕ）などの金属層として金属膜２が形成され、その上に光透過性絶縁性薄膜として膜厚０．３〜５ｎｍの薄い自己組織化単分子膜３が形成されている。更にその上に、直径数１０〜１５０ｎｍ程度の金ナノ微粒子４が固定されている。金属膜２は約５０ｎｍ以上が好ましく、基板１と金属膜２の代わりに金属基板を用いても良い。ここにおいて、このような金属層２の表面に薄膜３を介して金属微粒子４を固定化した構造を金属微粒子固定化構造と称することとする。 FIG. 1 schematically shows a metal fine particle fixing structure. A metal film 2 is formed on the substrate 1 as a metal layer such as gold (Au), and a thin self-assembled monolayer 3 having a thickness of 0.3 to 5 nm is formed thereon as a light-transmissive insulating thin film. Yes. Furthermore, gold nanoparticle 4 having a diameter of about 10 to 150 nm is fixed thereon. The metal film 2 is preferably about 50 nm or more, and a metal substrate may be used instead of the substrate 1 and the metal film 2. Here, the structure in which the metal fine particles 4 are immobilized on the surface of the metal layer 2 via the thin film 3 is referred to as a metal fine particle fixed structure.
図２は、金属微粒子固定化構造の作用を説明するための図である。図１と同じ部位については同一の符号を付して重複する説明を省略する（以下の図面について同じ）。なお、金属膜２の表面に対して金ナノ微粒子４の鏡像５が生じるため、２連球と同様の光学応答を示す。このため、孤立球に対してレッドシフトした強い共鳴吸収線が生じ、また、ギャップ中（ＳＡＭ３の部分）には増強磁場が生じる。これらの性質を積極的に利用することにより、孤立球を用いた場合より高感度の局在化表面プラズモン（ＬＳＰ）バイオセンシングを行うことができる。なお、１０はエヴァネッセント光、Ｒは金ナノ微粒子４の半径である。 FIG. 2 is a diagram for explaining the operation of the metal fine particle fixed structure. The same parts as those in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals and redundant description is omitted (the same applies to the following drawings). In addition, since the mirror image 5 of the gold nanoparticle 4 is generated on the surface of the metal film 2, an optical response similar to that of a double ball is shown. For this reason, a strong resonance absorption line red-shifted with respect to the isolated sphere is generated, and an enhanced magnetic field is generated in the gap (SAM3 portion). By actively utilizing these properties, localized surface plasmon (LSP) biosensing can be performed with higher sensitivity than when isolated spheres are used. Note that 10 is evanescent light, and R is the radius of the gold nanoparticle 4.
ＬＳＰバイオセンシングの原理は、アナライトと呼ばれる検出対象分子に対してリガンドと呼ばれる相補的な分子を固体基板表面上に塗布し、それをアナライトを含む試料溶液に浸漬することによりそれらの間の相互作用を検出する。アナライトとリガンドの関係はちょうど鍵と鍵穴の関係になっており、適切なリガンドを用いるとアナライトとの強い相互作用を有するが、アナライト以外の分子との相互作用が弱いため吸着速度や吸着量は小さく、これにより分子の選択的な認識を行うことができる。リガンド層へのアナライトの吸着は、光学的には表面における誘電体層の膜厚の増加に対応する。そのため、それを高い感度でリアルタイムにセンシングできれば試料溶液の分析や分子間の相互作用についての議論を行うことができる。例えば、アナライトとしての塩基配列に相補的なＤＮＡをリガンドとして用いれば、そのＤＮＡは２量体化を起こして検出される。また、リガンドとして抗原を用いると対応する抗体を検出することになる。同様の原理で、ＤＮＡ、脂質、糖、タンパク間の相互作用を利用してこれらの分子を測定することが可能である。 The principle of LSP biosensing is to apply a complementary molecule called a ligand to a molecule to be detected called an analyte on a solid substrate surface and immerse it in a sample solution containing the analyte between them. Detect interaction. The relationship between the analyte and the ligand is just a key-to-keyhole relationship, and if an appropriate ligand is used, it has a strong interaction with the analyte, but the interaction with molecules other than the analyte is weak, so the adsorption rate and The amount of adsorption is small, which allows selective recognition of molecules. The adsorption of the analyte to the ligand layer optically corresponds to an increase in the thickness of the dielectric layer on the surface. Therefore, if it can be sensed in real time with high sensitivity, analysis of the sample solution and discussion on the interaction between molecules can be performed. For example, when DNA complementary to the base sequence as an analyte is used as a ligand, the DNA is detected by causing dimerization. In addition, when an antigen is used as a ligand, the corresponding antibody is detected. Based on the same principle, it is possible to measure these molecules using the interaction between DNA, lipid, sugar and protein.
しかしながら、相互作用を起こして吸着する分子の量は高々単分子層程度でありその計測には工夫が必要である。すなわち、一般に１０ｐｇ／ｍｍ２程度の吸着分子量が検出できる感度が必要である。高い感度を実現するひとつの方法としては、蛍光分子などによりアナライトを標識する方法があり、現在使われているＤＮＡチップの検出システムは、蛍光標識されたＤＮＡが相補的な塩基配列で修飾された基板表面へ吸着する様子を蛍光顕微鏡を使って検出するものである。しかしながら、検出対象を標識することなく高い感度で検出する手法が実現できれば汎用性やコストの点で有利である。他方、非標識のバイオセンシング手法として、上述の全反射減衰法を用いた表面プラズモン共鳴を利用した手法や水晶振動子を利用した手法が開発されている。これらは優れた手法でありすでに実用化もされている。しかし、光学配置や試料構造上の制限が厳しいため微小化することは容易ではない。もし、単純な光学配置でセンシング部分が構築できれば、微小なセンサの作成やそれを２次元的に配列した高密度センシングアレイの作製が可能となる。 However, the amount of molecules that cause interaction and are adsorbed is at most about a monolayer, and some measure is required for the measurement. That is, a sensitivity that can detect an adsorbed molecular weight of about 10 pg / mm 2 is generally required. One way to achieve high sensitivity is to label the analyte with fluorescent molecules, etc., and currently used DNA chip detection systems have fluorescently labeled DNA modified with a complementary base sequence. The state of adsorbing on the surface of the substrate is detected using a fluorescence microscope. However, it is advantageous in terms of versatility and cost if a technique for detecting a detection target with high sensitivity without labeling can be realized. On the other hand, as an unlabeled biosensing method, a method using surface plasmon resonance using the above-described total reflection attenuation method and a method using a crystal resonator have been developed. These are excellent methods and have already been put into practical use. However, miniaturization is not easy due to severe restrictions on optical arrangement and sample structure. If the sensing portion can be constructed with a simple optical arrangement, it is possible to create a minute sensor or a high-density sensing array in which it is two-dimensionally arranged.
また、共鳴状態の変化を検出する具体的な方法としては、反射吸収スペクトルや散乱スペクトルを測定してそのピーク位置を測定する方法や変化量の大きいある波長に注目してその波長における反射や吸収スペクトルの変化量を読み取る方法がある。しかしながら、ドットからの散乱を利用したＬＳＰバイオセンシングは感度の点で満足できないことが多く、これを改善する方法が望まれている。本発明では、２次の非線形光学効果の一種である光第２高調波発生（ＳＨＧ）を用いてＬＳＰの状態を検出することによりバイオセンシングができる手法を開発した。以下、この手法をＳＨ−ＬＳＰバイオセンシングと称することとする。線形光学を利用したセンシングでは、微粒子近傍の増強電場に比例した線形分極が生じ、検出の際に生じる増強電場の変化を反射光や散乱光で検出する。一方、非線形光学を利用したセンシングでは、増強電場の２乗に比例した非線形分極が生じるため、変化量が大きく、上述のＬＳＰセンサの問題点を解決できるという特徴がある。以下に光第２高調波発生（ＳＨＧ）を用いる局在化表面プラズモンセンサの実施の形態及び局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法の実施の形態について説明する。 In addition, specific methods for detecting changes in the resonance state include measuring the reflection absorption spectrum and scattering spectrum and measuring the peak position, and focusing on a wavelength with a large amount of change, reflecting and absorbing at that wavelength. There is a method of reading the amount of change in the spectrum. However, LSP biosensing using scattering from dots is often unsatisfactory in terms of sensitivity, and a method for improving this is desired. In the present invention, a technique capable of biosensing has been developed by detecting the state of the LSP using optical second harmonic generation (SHG), which is a kind of second-order nonlinear optical effect. Hereinafter, this method is referred to as SH-LSP biosensing. In sensing using linear optics, linear polarization proportional to the enhanced electric field in the vicinity of the fine particles is generated, and a change in the enhanced electric field generated during detection is detected by reflected light or scattered light. On the other hand, in sensing using nonlinear optics, nonlinear polarization proportional to the square of the enhanced electric field is generated, so that the amount of change is large and the above-described problems of the LSP sensor can be solved. Hereinafter, an embodiment of a localized surface plasmon sensor using optical second harmonic generation (SHG) and an embodiment of a molecular detection method using the localized surface plasmon will be described.
〔第１の実施の形態〕
以下に図面に基づき本発明の第１の実施の形態について説明する。センサとして図１に記載の金属微粒子固定化構造を用い、金ナノ微粒子４にリガンドとしてビオチンを修飾し、アナライトとしてアビジンを結合する例を説明する。
[First Embodiment]
A first embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings. An example in which the metal fine particle fixed structure shown in FIG. 1 is used as a sensor, biotin is modified as a ligand on the gold nanoparticle 4 and avidin is bound as an analyte will be described.
図３に金属微粒子固定化構造の反射吸収スペクトルの例を示す。金属微粒子固定化構造の金ナノ微粒子の表面にはリガンドとしてビオチンが修飾され、これにアナライトとして生体由来分子であるアビジン蛋白質を吸着させた。実線はビオチンにアビジン吸着前のスペクトルを、破線はビオチンにアビジン吸着後のスペクトルを示す。ｐ−偏光の反射吸収スペクトルでは孤立金微粒子球の共鳴バンドである５２０ｎｍ付近の吸収に対して、６００ｎｍ付近にレッドシフトした強い吸収バンドがあらわれる。このバンドは金微粒子４と金属層２の相互作用によるものと考えられている。ｓ−偏光や垂直入射光の場合にはこのバンドはあらわれず、このことから、基板表面法線方向の励起電場に対して共鳴するバンドであることがわかる。アビジン吸着後は、吸収強度が大きくなっていること、ピーク波長がレッドシフトしていることがわかる。これらの測定から、金微粒子表面における分子の量を知ることができるため、センサとして使用できることがわかる。 FIG. 3 shows an example of the reflection absorption spectrum of the metal fine particle fixed structure. Biotin was modified as a ligand on the surface of the gold nanoparticle having a metal particle-immobilized structure, and an avidin protein as a biological molecule was adsorbed thereto as an analyte. The solid line shows the spectrum before avidin adsorption on biotin, and the broken line shows the spectrum after avidin adsorption on biotin. In the reflection absorption spectrum of p-polarized light, a strong absorption band red-shifted near 600 nm appears with respect to the absorption near 520 nm, which is the resonance band of the isolated gold fine particle sphere. This band is considered to be due to the interaction between the gold fine particles 4 and the metal layer 2. This band does not appear in the case of s-polarized light or normal incident light, and it can be seen from this that the band resonates with the excitation electric field in the normal direction of the substrate surface. It can be seen that the absorption intensity is increased and the peak wavelength is red-shifted after avidin adsorption. From these measurements, it can be seen that the amount of molecules on the surface of the gold fine particles can be known, so that it can be used as a sensor.
共鳴状態の変化は反射吸収スペクトルの変化としてあらわれたが、非線形感受率の変化として観測することにより高感度なセンシングを実現できる。金属微粒子固定化構造は反転中心を有さないためそれ自身が２次の非線形光学活性である。また、金属層表面と金ナノ微粒子間のギャップにおいて５０倍以上の増強電場が生じているため、強いＳＨＧが観測される。さらに、ＳＨ−ＬＳＰバイオセンシングでは、光透過性絶縁性薄膜としてメロシアニンチオールなどの非線形光学効果を示す材料を用いて、直径８０〜１５０ｎｍの球状金ナノ微粒子を金表面に固定化した金属微粒子固定化構造が最適であるとの結果を得た。メロシアニンチオールの膜厚は約１〜２ｎｍが好ましく、また、ＳＨＧ観測には波長約７００〜９００ｎｍの基本光で、波長約３５０〜４５０ｎｍの第２高調波を観測することが好ましい。 Although the change in the resonance state appeared as a change in the reflected absorption spectrum, highly sensitive sensing can be realized by observing the change in the nonlinear susceptibility. Since the metal fine particle fixed structure does not have an inversion center, it itself has a second-order nonlinear optical activity. Further, since an enhanced electric field of 50 times or more is generated in the gap between the metal layer surface and the gold nanoparticle, strong SHG is observed. Furthermore, in SH-LSP biosensing, metal fine particles are immobilized by using spherical gold nanoparticles having a diameter of 80 to 150 nm immobilized on the gold surface using a material having a nonlinear optical effect such as merocyanine thiol as a light transmissive insulating thin film. The result that the structure is optimal was obtained. The film thickness of merocyanine thiol is preferably about 1 to 2 nm. For SHG observation, it is preferable to observe the second harmonic wave with a wavelength of about 350 to 450 nm with a fundamental light of a wavelength of about 700 to 900 nm.
図４に、この系を用いて、ＳＨ−ＬＳＰセンシングを行った結果を示す。図４（ｂ）に本実施の形態における局在化表面プラズモンセンサ（センサ部を金属微粒子固定化構造とした）ＰＳ１の模式図を示す。上図では金ナノ微粒子４の表面にリガンド７が修飾されている。この局在化表面プラズモンセンサＰＳ１をアナライト９を含む試料溶液に浸漬し、角周波数ωの入射光６を照射すると、金属微粒子固定化構造において光第２高調波発生ＳＨＧが生じ、当該金属微粒子固定化構造から角周波数２ωの第２高調波８が反射方向に放射される。下図ではリガンド７にアナライト９が結合され、結合後の金属微粒子固定化構造から反射方向に放射される角周波数２ωの第２高調波８を検出する。図４（ａ）は第２高調波検出信号（以下、ＳＨＧ信号という）によるビオチン−アビジン反応の検出経過を示す。縦軸はＳＨＧ信号の相対的強度を、横軸は経過時間（ｓ）を示す。アビジンの注入（図中矢印で示す）と同時にビオチンへの結合が起こり、約３０分（１８００秒）後に反応が終了して一定値となる。このとき、水中で第２高調波光強度が１６％減少していることがわかる。これはアビジンの結合によるＬＳＰのわずかな共鳴波長変化により、基本光（λ＝８００ｎｍ）に対する共鳴効果が小さくなり、第２高調波光強度が大きく減少したと考えられる。この過程は、単純な反射スペクトルでも追跡できるが、その変化量はこの３分の１程度である。なお５０分後に水洗（図中矢印で示す）により、溶液中のアナライトが除去されている。 FIG. 4 shows the result of SH-LSP sensing using this system. FIG. 4B is a schematic diagram of the localized surface plasmon sensor PS1 (the sensor portion has a metal fine particle fixing structure) in the present embodiment. In the upper figure, the ligand 7 is modified on the surface of the gold nanoparticle 4. When this localized surface plasmon sensor PS1 is immersed in a sample solution containing the analyte 9 and irradiated with incident light 6 having an angular frequency ω, optical second harmonic generation SHG is generated in the metal particle fixed structure, and the metal particle A second harmonic wave 8 having an angular frequency of 2ω is radiated in the reflection direction from the fixed structure. In the figure below, the analyte 9 is bound to the ligand 7, and the second harmonic wave 8 having the angular frequency 2ω radiated in the reflection direction from the metal fine particle fixed structure after the binding is detected. FIG. 4A shows a detection process of biotin-avidin reaction by a second harmonic detection signal (hereinafter referred to as SHG signal). The vertical axis represents the relative strength of the SHG signal, and the horizontal axis represents the elapsed time (s). Simultaneously with the injection of avidin (indicated by an arrow in the figure), binding to biotin occurs, and after about 30 minutes (1800 seconds), the reaction ends and becomes a constant value. At this time, it can be seen that the second harmonic light intensity is reduced by 16% in water. This is thought to be because the resonance effect on the fundamental light (λ = 800 nm) is reduced by the slight change in the resonance wavelength of the LSP due to the avidin bond, and the second harmonic light intensity is greatly reduced. This process can be traced even with a simple reflection spectrum, but the amount of change is about one third of this. Note that the analyte in the solution was removed by washing with water (indicated by an arrow in the figure) after 50 minutes.
図５に本実施の形態における局在化表面プラズモンを用いるセンシングの処理フロー例を示す。まず、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１を準備する（Ｓ００１）。次に、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１の金属微粒子４内に局在化表面プラズモンを励起し（Ｓ００２）、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８を検出する（Ｓ００３）。次に、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１に検出対象分子９を吸着又は結合させる（Ｓ００４）。次に、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１の金属微粒子４内に局在化した表面プラズモン共鳴を励起し（Ｓ００５）、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出する（Ｓ００６）。次に、第２高調波８の変化から吸着又は結合した検出対象分子９を検出する（Ｓ００７）。ここにおいて、工程Ｓ００２における、局在化表面プラズモンの励起を工程Ｓ００５まで持続した状態で、工程Ｓ００４で検出対象分子９を吸着又は結合させても良い。 FIG. 5 shows a processing flow example of sensing using localized surface plasmons in the present embodiment. First, a localized surface plasmon sensor PS1 is prepared (S001). Next, the localized surface plasmon is excited in the metal fine particle 4 of the localized surface plasmon sensor PS1 (S002), and the localized surface plasmon in the metal fine particle 4 and the light 6 incident on the metal fine particle 4 are excited. The second harmonic 8 generated due to the interaction is detected (S003). Next, the detection target molecule 9 is adsorbed or bound to the localized surface plasmon sensor PS1 (S004). Next, the surface plasmon resonance localized in the metal particle 4 of the localized surface plasmon sensor PS1 is excited (S005), and the localized surface plasmon in the metal particle 4 and the light 6 incident on the metal particle 4 are excited. A change in the second harmonic wave 8 caused by the interaction with is detected (S006). Next, the detection target molecule 9 adsorbed or bound from the change of the second harmonic wave 8 is detected (S007). Here, the molecule 9 to be detected may be adsorbed or bound in step S004 in a state where the excitation of the localized surface plasmon in step S002 is continued until step S005.
以上により、本実施の形態によれば、小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモンの第２高調波を用いてさらに高感度のセンサを提供できる。 As described above, according to the present embodiment, it is possible to provide a highly sensitive sensor using the second harmonic of the localized surface plasmon in a small and highly sensitive sensor.
〔第２の実施の形態〕
第２の実施の形態は、ＳＨＧ顕微鏡を用いた光第２高調波発生（ＳＨＧ）バイオセンシングについて説明する。ドット状の複数の金属微粒子による金属微粒子固定化構造をアレイ状に配列し、多種のアナライトを含む試料溶液に対しチップ毎（ドット毎）に異なるリガンドを用いて、結合を生じさせ、顕微鏡で反射光の変化を観察する方法である。
前述のように、メロシアニンを使った金属微粒子固定化構造がＳＨ−ＬＳＰバイオセンシングに最適であることがわかったので、これを用いてチップ化を行った。
[Second Embodiment]
The second embodiment describes optical second harmonic generation (SHG) biosensing using an SHG microscope. A metal particle immobilization structure composed of a plurality of dot-shaped metal particles is arranged in an array, and a different ligand is used for each chip (for each dot) for a sample solution containing various analytes. This is a method of observing changes in reflected light.
As described above, since it was found that the metal fine particle immobilization structure using merocyanine is optimal for SH-LSP biosensing, a chip was formed using this.
図６に金属微粒子固定化構造のアレイチップを用いたセンシングの例を示す。図６（ａ）はアレイチップの顕微鏡写真であり、１２０μｍの金属微粒子固定化構造のチップが４列×４行のドットアレイ状に配列されている。ドットＢ２にはあらかじめビオチンが結合されており、これに対して特異結合したアビジンが検出されていることがわかる。図６（ｂ）に各バイオチップにおける局在化表面プラズモンセンサ（センサ部を金属微粒子固定化構造とした）ＰＳ２の模式図を示す。図４（ｂ）と同様であり説明を省略する。金属微粒子固定化構造を構成する金属微粒子は数１０ｎｍ〜１５０ｎｍの球状の金ナノ微粒子であり、複数の金ナノ微粒子をドット状にグループ化したチップをアレイ状に配置した。また、相補的な分子の種類がドット単位に定められている。すなわち、同一ドット内では同種の分子が用いられ、ドット毎に全て異種の分子としても良く、複数のドットに同種の分子を用いても良い。ビオチン−アビジン反応が進むと、センサ表面からの反射光に変化が生じる。 FIG. 6 shows an example of sensing using an array chip having a metal fine particle fixed structure. FIG. 6A is a micrograph of an array chip, in which chips having a metal fine particle fixing structure of 120 μm are arranged in a dot array of 4 columns × 4 rows. It can be seen that biotin is bound to the dot B2 in advance, and avidin specifically bound thereto is detected. FIG. 6B shows a schematic diagram of a localized surface plasmon sensor PS2 (with the sensor part having a metal fine particle fixed structure) in each biochip. The description is omitted because it is the same as FIG. Metal fine particles constituting the metal fine particle fixed structure are spherical gold nanoparticles of several tens to 150 nm, and chips in which a plurality of gold nanoparticles are grouped into dots are arranged in an array. In addition, the types of complementary molecules are determined in dot units. That is, the same kind of molecules are used in the same dot, and all the dots may be different kinds of molecules, or the same kind of molecules may be used for a plurality of dots. As the biotin-avidin reaction proceeds, the reflected light from the sensor surface changes.
図７に、金属微粒子固定化構造のアレイチップを用いた顕微鏡イメージングを示す。図７（ａ）に４×４配列の直径１２０μｍのＬＳＰドットアレイの顕微鏡イメージングを、図７（ｂ）に光第２高調波強度（ＳＨＧ強度）のドットＡ１からＡ４に対する位置依存性（（ａ）の破線に沿って測定）の結果を示す。図７（ａ）の４×４配列のうち、３ドット（Ａ１、Ｂ２、Ｃ３）にアビジンを吸着させ、これを第２高調波（ＳＨ）顕微鏡測定した。図７（ａ）によればＡ１、Ｂ２、Ｃ３の３ドットにおいて周囲のドットに比べて第２高調波光強度が低下しており、図７（ｂ）によれば、Ａ１について低下が約３０％であることが観測された。同様にしてＢ２、Ｃ３についても３０％の低下が観測された。これにより、この手法が誘電体の結合や吸着の検出に対して高感度であることが示された。 FIG. 7 shows microscopic imaging using an array chip having a metal fine particle fixed structure. FIG. 7A shows microscopic imaging of a 4 × 4 array of 120 μm diameter LSP dot arrays, and FIG. 7B shows the position dependence of optical second harmonic intensity (SHG intensity) on dots A1 to A4 ((a ) Shows the result of measurement) along the broken line. Avidin was adsorbed to 3 dots (A1, B2, C3) in the 4 × 4 array of FIG. 7A, and this was measured by a second harmonic (SH) microscope. According to FIG. 7A, the second harmonic light intensity is lower than the surrounding dots in three dots A1, B2, and C3, and according to FIG. 7B, the decrease is about 30% for A1. It was observed that Similarly, a decrease of 30% was observed for B2 and C3. This indicates that this technique is highly sensitive to detection of dielectric binding and adsorption.
図８に金属微粒子固定化構造のアレイチップの他の例を示す。直径３０μｍの金属微粒子固定化構造のチップがアレイ状に高密度に配列されている。このように微小ドットのアレイも形成可能である。 FIG. 8 shows another example of an array chip having a metal fine particle fixed structure. Chips having a metal fine particle fixing structure with a diameter of 30 μm are arranged in a high density in an array. In this way, an array of minute dots can be formed.
〔第３の実施の形態〕
第３の実施の形態では、金属微粒子固定化構造を利用し、検出対象分子を検出する例を説明する。
[Third Embodiment]
In the third embodiment, an example in which a detection target molecule is detected using a metal fine particle fixed structure will be described.
図９は第３の実施の形態における局在化表面プラズモンセンサＰＳ３の構成を説明するための図である。金属層として金（Ａｕ）などの金属基板１２上にリガンド１３を塗布すると、これに特異結合するタンパク分子が結合する。一般にタンパク分子は金などの金属微粒子と相互作用を起こして結合するため、さらに金属微粒子１５を固定化することができる。その結果、タンパク分子を光透過性絶縁性薄膜３とする金属微粒子固定化構造が形成される。図９では、金基板１２上に、リガンドとしてビオチン１３を用いて検出対象分子としてアビジン１４を結合し、さらにその上に直径数１０〜１５０ｎｍの金ナノ微粒子１５を吸着し、金属微粒子固定化構造を形成している。この金属微粒子固定化構造をチップ毎にグループ化して、例えばその１２０μｍ大のチップをドットアレイ状に配列する。また、相補的な分子の種類がドット単位に形成され、これによりアナライトの種類もドット単位に形成される。また、金属微粒子固定化構造の共鳴条件は金ナノ微粒子１５の金属層１２表面からの距離に依存する。そのため、金属微粒子固定化構造からの反射スペクトルや第２高調波スペクトルを測定することによりたとえば、生物由来分子の結合構造、吸着構造に関する知見を得ることができる。 FIG. 9 is a diagram for explaining the configuration of the localized surface plasmon sensor PS3 according to the third embodiment. When a ligand 13 is applied on a metal substrate 12 such as gold (Au) as a metal layer, protein molecules that specifically bind to the ligand 13 are bound thereto. In general, protein molecules interact and bond with metal fine particles such as gold, so that the metal fine particles 15 can be further immobilized. As a result, a metal fine particle fixed structure having protein molecules as the light-transmissive insulating thin film 3 is formed. In FIG. 9, avidin 14 is bound as a molecule to be detected using biotin 13 as a ligand on a gold substrate 12, and gold nanoparticles 15 having a diameter of 10 to 150 nm are further adsorbed thereon to form a metal particle fixed structure. Is forming. This metal fine particle fixed structure is grouped for each chip, and for example, the 120 μm-sized chips are arranged in a dot array. In addition, complementary molecule types are formed in dot units, whereby analyte types are also formed in dot units. In addition, the resonance condition of the metal fine particle fixed structure depends on the distance from the surface of the metal layer 12 of the gold nanoparticle 15. Therefore, for example, knowledge about the binding structure and adsorption structure of biological molecules can be obtained by measuring the reflection spectrum and second harmonic spectrum from the metal fine particle fixed structure.
図１０に金属微粒子固定化構造を用いた分子検出の例を示す。図９のように金基板１２上に結合したアビジン１４にさらに金ナノ微粒子１５を吸着した金属微粒子固定化構造の反射スペクトルを図１０（ａ）に示す。金属微粒子固定化構造に由来する吸収バンドの位置（約６００ｎｍ）から金ナノ微粒子１５と基板１２表面のギャップの大きさｄを計算することができる。図１０（ａ）の例では、これをもとにアビジン層１４の厚さｄがおよそ２ｎｍであると見積もられた。実際の大きさより小さいので、吸着による構造変化がおこっていると考えられる。また、この系は金属微粒子固定化構造を形成しているため、強い第２高調波光を得ることができる。これを利用して、平坦な金属基板上に固定化されたリガンドアレイに結合したタンパク分子を金属微粒子固定化構造による電場増強を用いて高コントラストでイメージングしたものが図１０（ｂ）である。３ドット（Ａ３、Ｂ２、Ｃ１）以外のドットにタンパク分子が結合されている。金ナノ微粒子１５は多くのタンパク分子と相互作用して吸着し、タンパク分子を光透過性絶縁性薄膜３とする金属微粒子固定化構造が形成される。その結果、３ドット（Ａ３、Ｂ２、Ｃ１）以外のドットで光第２高調波が強くなっているのがわかる。多くのタンパクは金と相互作用することから、タンパクがある部分には金ナノ微粒子が結合する。これを利用するとＳＨ光のみでなくＳＥＲＳ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）等にも適用できるため、さらに多くの情報を得ることができると考えられる。 FIG. 10 shows an example of molecular detection using a metal fine particle fixed structure. FIG. 10A shows the reflection spectrum of the metal fine particle fixed structure in which the gold nanoparticle 15 is further adsorbed on the avidin 14 bonded on the gold substrate 12 as shown in FIG. The gap size d between the gold nanoparticle 15 and the surface of the substrate 12 can be calculated from the position of the absorption band (about 600 nm) derived from the metal fine particle fixed structure. In the example of FIG. 10A, based on this, the thickness d of the avidin layer 14 was estimated to be about 2 nm. Since it is smaller than the actual size, it is considered that the structure changes due to adsorption. Further, since this system forms a metal fine particle fixed structure, strong second harmonic light can be obtained. FIG. 10B shows an image obtained by imaging the protein molecules bound to the ligand array immobilized on the flat metal substrate with high contrast using the electric field enhancement by the metal particle immobilized structure. Protein molecules are bound to dots other than 3 dots (A3, B2, C1). The gold nanoparticle 15 interacts with and adsorbs many protein molecules to form a metal particle fixed structure in which the protein molecule is a light-transmissive insulating thin film 3. As a result, it can be seen that the optical second harmonic is strong at dots other than 3 dots (A3, B2, C1). Since many proteins interact with gold, gold nanoparticles bind to the protein. If this is used, since it can be applied not only to SH light but also to SERS (Surface enhanced Raman spectroscopy), it is considered that more information can be obtained.
図１１に本実施の形態における分子検出方法の処理フロー例を示す。図１１（ａ）に反射スペクトル又は散乱スペクトルの変化により検出する例を示す。まず、金属層１２上に検出対象分子１４に相補的な分子の分子層１３を形成する（Ｓ０１１）。次に、相補的な分子１３の分子層に微小膜厚の検出対象分子層１４を吸着又は結合させて形成する（Ｓ０１２）。次に、検出対象分子層１４上に局在化した表面プラズモン共鳴が励起される寸法の金属微粒子１５を吸着または結合させて固定化する（Ｓ０１３）。これにより、金属層１２、相補的な分子１３の分子層、検出対象分子層１４及び金属微粒子１５からなる金属微粒子固定化構造が形成される。次に、金属微粒子固定化構造に光を入射して、金属微粒子１５内に局在化した表面プラズモンと金属微粒子１５に入射された光との相互作用における反射スペクトル又は散乱スペクトルの変化を検出する（Ｓ０１４）。これにより、検出対象分子を検出できる。 FIG. 11 shows a processing flow example of the molecule detection method in the present embodiment. FIG. 11A shows an example of detection based on a change in the reflection spectrum or the scattering spectrum. First, a molecular layer 13 of molecules complementary to the detection target molecules 14 is formed on the metal layer 12 (S011). Next, the detection target molecular layer 14 having a small film thickness is formed by adsorbing or binding to the molecular layer of the complementary molecule 13 (S012). Next, the metal microparticles 15 having a size capable of exciting the surface plasmon resonance localized on the detection target molecular layer 14 are adsorbed or bonded and immobilized (S013). As a result, a metal fine particle fixed structure including the metal layer 12, the molecular layer of the complementary molecule 13, the detection target molecular layer 14, and the metal fine particles 15 is formed. Next, light is incident on the metal fine particle fixed structure, and a change in the reflection spectrum or the scattering spectrum in the interaction between the surface plasmon localized in the metal fine particle 15 and the light incident on the metal fine particle 15 is detected. (S014). Thereby, a molecule to be detected can be detected.
また、図１１（ｂ）に第２高調波の変化により検出する例を示す。図１１（ａ）の検出方法において、反射スペクトル、散乱スペクトルの変化を検出する工程Ｓ０１４に代えて、第２高調波８の変化を検出する（Ｓ０１５）。その他の工程は図１１（ａ）と同様である。この方法はＳＨＧを利用しており、より高感度の検出が可能である。 FIG. 11B shows an example of detection based on a change in the second harmonic. In the detection method of FIG. 11A, a change in the second harmonic 8 is detected instead of the step S014 for detecting a change in the reflection spectrum and the scattering spectrum (S015). Other steps are the same as those in FIG. This method uses SHG and can be detected with higher sensitivity.
この方法は、タンパクの検出や吸着構造の研究に有力な方法であり、単純なアフィニティーバイオセンシングと異なり様々な情報を得ることができる。
このように、本実施の形態によれば検出対象分子を高感度で検出できる。
This method is an effective method for protein detection and adsorption structure research, and can obtain a variety of information unlike simple affinity biosensing.
Thus, according to the present embodiment, the detection target molecule can be detected with high sensitivity.
以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明は以上の実施の形態に限定されるものではなく、実施の形態に種々変更を加えられることは明白である。 Although the embodiment of the present invention has been described above, the present invention is not limited to the above embodiment, and it is obvious that various modifications can be made to the embodiment.
例えば、以上の実施の形態においては、金属層が金であり、金属微粒子が球状の金ナノ微粒子である例を説明したが、銀でも局在化プラズモンを励起できるので使用可能であり、形状も球状に限られず任意で良い。また、以上の実施の形態では、光透過性絶縁性薄膜としてメロシアニンを使用する例を説明したが、その他の微小膜厚の光透過性絶縁性薄膜を使用しても良い。また、以上の実施の形態ではリガンドを介して金属微粒子にアナライトを結合させる例を説明したが、金属微粒子に直接アナライトを結合させても良く、また、アナライトとリガンドの組み合わせも、アビジン−ビオチンの組み合わせに限られず、オクタデカンチオールと金、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−糖、ＤＮＡ−有機化合物、タンパク質−タンパク質、脂質−タンパク質、糖−タンパク質、タンパク質−有機化合物、金、銀−チオールやジスルフィド基を持つ有機硫黄化合物、アミノ基を持つ１級アミン、２級アミン、３級アミン化合物等の組み合わせも可能である。また、以上の実施の形態に記載の局在化表面プラズモンセンサに、表面プラズモンを励起する光を発光する光源と、第２高調波を検出する光検出器と、第２高調波の変化から相補的な分子に吸着又は結合した検出対象分子の屈折率、吸着量、結合量又は膜厚を算定する演算装置と組み合わせることにより、局在化表面プラズモンセンシング装置を構成できる。また、入射光の波長、金属微粒子の寸法、ドットアレイの配列等は種々選択可能である。 For example, in the above embodiment, the example in which the metal layer is gold and the metal fine particles are spherical gold nano-particles has been described. However, since silver can excite localized plasmons, it can be used and has a shape. It is not limited to a spherical shape and may be arbitrary. Moreover, although the above embodiment demonstrated the example which uses merocyanine as a light-transmitting insulating thin film, you may use the light-transmitting insulating thin film of another micro film thickness. In the above embodiment, the example in which the analyte is bound to the metal fine particle via the ligand has been described. However, the analyte may be directly bound to the metal fine particle, and the combination of the analyte and the ligand may be avidin. -Not limited to the combination of biotin, octadecanethiol and gold, DNA-DNA, DNA-RNA (ribonucleic acid), DNA-protein, DNA-sugar, DNA-organic compound, protein-protein, lipid-protein, sugar-protein, Combinations of protein-organic compounds, gold, silver-thiol, organic sulfur compounds having disulfide groups, primary amines having amino groups, secondary amines, tertiary amine compounds, and the like are also possible. In addition, the localized surface plasmon sensor described in the above embodiment is complemented by a light source that emits light for exciting the surface plasmon, a photodetector that detects the second harmonic, and a change in the second harmonic. A localized surface plasmon sensing device can be configured by combining with a calculation device that calculates the refractive index, the adsorption amount, the binding amount, or the film thickness of a molecule to be detected that is adsorbed or bound to a specific molecule. In addition, the wavelength of incident light, the size of metal fine particles, the arrangement of dot arrays, and the like can be variously selected.
本発明は、高感度のバイオセンシング等に利用される。 The present invention is used for highly sensitive biosensing and the like.
１ 基板
２ 金属層（金属膜、金属基板）
３ 光透過性絶縁性薄膜（自己組織化膜）
４ 金属微粒子（金ナノ微粒子）
５ 鏡像
６ 入射光
７ リガンド
８ 第２高調波
９ アナライト
１０ エヴァネッセント光
１２ 金基板
１３ リガンド
１４ 検出対象分子
１５ 金ナノ微粒子
２１ プリズム
２２ 金属薄膜
２３ 入射光
２４ エヴァネッセント光
ｄ 膜厚
ＰＳ１〜ＰＳ３ 局在化表面プラズモンセンサ
θ 入射角
θＲ 共鳴角
1 Substrate 2 Metal layer (metal film, metal substrate)
3 Light-transmissive insulating thin film (self-assembled film)
4 Metal fine particles (gold nano-particles)
5 Mirror image 6 Incident light 7 Ligand 8 Second harmonic 9 Analyte 10 Evanescent light 12 Gold substrate 13 Ligand 14 Detection target molecule 15 Gold nanoparticle 21 Prism 22 Metal thin film 23 Incident light 24 Evanescent light d Film thickness PS1 ~ PS3 Localized surface plasmon sensor θ Incident angle θ R Resonance angle
Claims (10)
局在化表面プラズモンセンサ。 On the metal layer, a metal particle having a size capable of exciting localized surface plasmons is immobilized via a light-transmitting insulating thin film, and a molecular layer of a molecule complementary to the molecule to be detected is formed on the surface of the metal particle. And detecting a change in the second harmonic caused by the interaction between the localized surface plasmon in the metal fine particle and the light incident on the metal fine particle, and adsorbing or binding to the complementary molecule Detect detected molecules;
Localized surface plasmon sensor.
局在化表面プラズモンセンサ。 A metal fine particle having a function of a molecule complementary to a molecule to be detected having a size capable of exciting the localized surface plasmon is immobilized on the metal layer through a light-transmitting insulating thin film, Detecting a second harmonic change caused by the interaction between the activated surface plasmon and the light incident on the metal fine particle, and detecting a molecule to be detected adsorbed or bound to the metal fine particle;
Localized surface plasmon sensor.
請求項１又は請求項２に記載の局在化表面プラズモンセンサ。 The change of the second harmonic is a change in intensity, phase or wavelength of the second harmonic reflected or scattered from the metal fine particles;
The localized surface plasmon sensor according to claim 1 or 2.
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサ。 The metal fine particles are spherical fine particles having a diameter of 10 to 150 nm mainly composed of gold, and the film thickness of the light-transmissive insulating thin film is 0.3 to 5 nm;
The localized surface plasmon sensor according to any one of claims 1 to 3.
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサ。 A non-linear optical material such as a merocyanine monomolecular film or a hemicyanine monomolecular film is used as the light-transmissive insulating thin film;
The localized surface plasmon sensor according to any one of claims 1 to 4.
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサ。 The metal fine particles are arranged in a dot array, and the types of the complementary molecules are determined in dot units;
The localized surface plasmon sensor according to any one of claims 1 to 5.
局在化表面プラズモンセンシング装置。 The localized surface plasmon sensor according to any one of claims 1 to 6, a light source that emits light that excites the surface plasmon, a photodetector that detects the second harmonic, and An arithmetic unit that calculates the refractive index, the amount of adsorption, the amount of binding, or the film thickness of the molecule to be detected adsorbed or bound to the complementary molecule from the change of the second harmonic;
Localized surface plasmon sensing device.
前記局在化表面プラズモンセンサの前記金属微粒子内に局在化表面プラズモンを励起し、前記金属微粒子内の局在化表面プラズモンと前記金属微粒子に入射された光との相互作用に起因して生じる第２高調波を検出する工程と、
前記局在化表面プラズモンセンサに前記検出対象分子を吸着又は結合させる工程と、
前記局在化表面プラズモンセンサの前記金属微粒子内に局在化した表面プラズモン共鳴を励起し、前記金属微粒子内の局在化表面プラズモンと前記金属微粒子に入射された光との相互作用に起因して生じる第２高調波の変化を検出する工程と、
前記第２高調波の変化から前記検出対象分子を検出する工程とを備える；
局在化表面プラズモンを用いるセンシング方法。 Preparing a localized surface plasmon sensor according to any one of claims 1 to 6;
The localized surface plasmon of the localized surface plasmon sensor is excited due to the interaction between the localized surface plasmon in the metal fine particle and the light incident on the metal fine particle. Detecting a second harmonic;
Adsorbing or binding the molecule to be detected to the localized surface plasmon sensor;
Due to the interaction between the localized surface plasmon in the metal fine particle and the light incident on the metal fine particle, exciting the surface plasmon resonance localized in the metal fine particle of the localized surface plasmon sensor. Detecting a change in the second harmonic generated by
Detecting the molecule to be detected from a change in the second harmonic;
Sensing method using localized surface plasmons.
局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法。 Forming a molecular layer of a molecule complementary to the molecule to be detected on the metal layer; forming a molecule layer to be detected by adsorbing or binding the molecule to be detected to the molecular layer of the complementary molecule; and A step of forming a metal fine particle-immobilized structure in which a metal fine particle having a size capable of exciting localized surface plasmons is adsorbed or bonded to a molecular layer to be detected to immobilize the metal fine particle on the surface of the metal layer through a thin film Detecting the adsorbed or bound by detecting the change in absorption or scattering of reflected light caused by the incidence of light on the metal fine particle fixed structure and the interaction between the metal fine particle and the metal layer Detecting the molecule of interest;
Molecular detection method using localized surface plasmon.
局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法。
Forming a molecular layer of a molecule complementary to the molecule to be detected on the metal layer; forming a molecule layer to be detected by adsorbing or binding the molecule to be detected to the molecular layer of the complementary molecule; and A step of forming a metal fine particle-immobilized structure in which a metal fine particle having a size capable of exciting localized surface plasmons is adsorbed or bonded to a molecular layer to be detected to immobilize the metal fine particle on the surface of the metal layer through a thin film The object to be adsorbed or bound is detected by making light incident on the metal fine particle fixed structure and detecting a second harmonic generated due to an interaction generated between the metal fine particle and the metal layer. Detecting a molecule;
Molecular detection method using localized surface plasmon.
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