JP2010136632A - Method for preparing nucleic acid complex and nucleic acid complex - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸複合体の調製方法、及びこの核酸複合体の調製方法により調製した核酸複合体に関する。 The present invention relates to a method for preparing a nucleic acid complex and a nucleic acid complex prepared by the method for preparing the nucleic acid complex.
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。 In recent years, gene therapy research has become more and more important as the molecular genetic factors of human diseases become clear. Gene therapy is aimed at the expression of DNA at the target site, how to make the DNA reach the target site, how to efficiently introduce the DNA into the target site and make it functionally expressed at the site It becomes important. As vectors for the introduction of foreign DNA, many viruses, including retroviruses, adenoviruses or herpes viruses, have been modified to carry therapeutic genes and are used in human clinical trials for gene therapy. However, the risk of infection and immune response remains.
本出願人らは、ＤＮＡを細胞中に運搬するための合成高分子ベクターとして、ベンゼンなど芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１，２）。 As a synthetic polymer vector for transporting DNA into cells, the present applicants have developed a branched structure vector in which a cationic polymer chain radially extends with an aromatic ring as a nucleus, such as benzene, to condense DNA at high density. It was found that small nucleic acid complex microparticles can be formed and genes can be efficiently introduced into cells, and a patent application was filed earlier (Patent Documents 1 and 2 below).
本出願人らはまた、感温性ポリマーとしてのＮ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと、カチオン性ポリマーブロックとしての３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックとを有する感温性−カチオン性ブロックコポリマーを遺伝子導入剤とし、この感温性−カチオン性ブロックコポリマーを基材へ塗布してから温度を上げて不溶化し、ここへ核酸を加えて基材上でブラウン運動するカチオン性ポリマー鎖にイオン結合性に核酸を包接させ、次いでここへ細胞を播種する遺伝子導入方法を提案した（下記特許文献３）。 Applicants also have a thermosensitive-cationic property having a polymer block of N-isopropylacrylamide as the temperature-sensitive polymer and a polymer block of 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide as the cationic polymer block. Using a block copolymer as a gene transfer agent, this temperature-sensitive-cationic block copolymer is applied to a substrate, then the temperature is raised to insolubilize, and a nucleic acid is added thereto to form a cationic polymer chain that undergoes Brownian motion on the substrate. A gene introduction method was proposed in which a nucleic acid was included in an ion binding property and cells were then seeded (Patent Document 3 below).
また、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのホモポリマーからなる遺伝子導入剤の研究については下記非特許文献１に報告されている。
この非特許文献１で報告されている研究の背景は次の通りである。
即ち、ＤＮＡの凝集力に関しては、高分子量、高ｐＫａのカチオン性ポリマーほど強く、このようなポリマーであれば、よりＤＮＡをコンパクトに凝集して高密度な核酸複合体の微粒子を形成させることができる。
一方で、過度の凝集は、細胞内でのＤＮＡの放出効率が悪く（所謂オーバーコンデンス状態）、結果的には遺伝子発現効率を悪くしてしまう。
Non-patent document 1 below reports a study on a gene introduction agent comprising a homopolymer of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate.
The background of the research reported in this non-patent document 1 is as follows.
That is, regarding the aggregating power of DNA, a cationic polymer having a high molecular weight and a high pKa is stronger. With such a polymer, DNA can be aggregated more compactly to form fine particles of a high-density nucleic acid complex. it can.
On the other hand, excessive aggregation results in poor release efficiency of DNA in cells (so-called overcondensed state), resulting in poor gene expression efficiency.
そこで、低ｐＫａのカチオン性ポリマーを使用する研究が古くから検討されていた。中性条件下で完全にカチオン化されていないこれらのポリマーで核酸複合体の微粒子を形成させれば、エンドサイトーシス後、酸性のエンドソーム内でプロトンとの結合容量に余裕があり、プロトンスポンジ効果を増強できることが期待されている。また、凝集力が低いために、細胞内でのＤＮＡの放出も容易に行われることも期待される。 Therefore, research using a low pKa cationic polymer has been studied for a long time. By forming nucleic acid complex microparticles with these polymers that are not fully cationized under neutral conditions, there is room for proton binding capacity in acidic endosomes after endocytosis, and the proton sponge effect. It is expected that it can be enhanced. In addition, since the cohesive force is low, it is expected that DNA is easily released in the cell.
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートはｐＫａが約７の低ｐＫａのカチオン性モノマーであり、非特許文献１では、これを用いた低ｐＫａのカチオン性ポリマーについての研究が報告されている。
上記特許文献１，２に記載されるベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延する遺伝子導入剤は、同じモノマーユニットからなる線形ポリマーと比較して、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能である。このため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との複合体をより強く凝集させることが可能であり、より粒子径の小さい微細なポリプレックス粒子を形成させることができる。このため、ポリプレックス粒子の細胞膜透過性が高くなり、遺伝子導入活性が向上したが、下記(１),(２)に挙げる不具合があった。 The gene introduction agent in which the polymer chain extends radially from the benzene ring described in Patent Documents 1 and 2 can be arranged with a higher charge density due to its structure compared to a linear polymer composed of the same monomer unit. It is. Therefore, a complex with a nucleic acid such as DNA or RNA can be more strongly aggregated, and fine polyplex particles having a smaller particle diameter can be formed. For this reason, the cell membrane permeability of polyplex particles was increased and the gene transfer activity was improved, but there were problems listed in (1) and (2) below.
（１）ＤＮＡを小さく凝集させるために電荷密度を上げる工夫がされてきたが、一方で、一度頑強に凝集された微粒子は容易には解離することなく安定に存在することになる（所謂、オーバーコンデンスの状態になる）ため、細胞内でＤＮＡを放出しにくくなる。放出されなかったＤＮＡは当然ｍＲＮＡへ転写されることはなく、タンパクの発現には至らない。
（２）一般に細胞培養及び遺伝子の導入は、中性条件下で行われる。そのため中性条件下でも十分にイオン強度の高いカチオン性高分子の原料として、ｐＫａの高いモノマーが選択される。しかしながら、このような高ｐＫａモノマーからなるカチオン性ポリマーは、中性条件下において、その側鎖の窒素原子のほぼ１００％がカチオン化されており、細胞内へ取り込まれた後にエンドソーム内で、酸性となってもプロトンを呼び込むキャパシティーに欠ける。このため、前述のプロトンスポンジ現象が得られない。
(1) In order to agglomerate the DNA into small pieces, a device for increasing the charge density has been devised. On the other hand, the finely agglomerated fine particles once exist stably without being dissociated (so-called over). Therefore, it becomes difficult to release DNA inside the cell. Unreleased DNA is naturally not transcribed into mRNA, leading to protein expression.
(2) Generally, cell culture and gene introduction are performed under neutral conditions. Therefore, a monomer having a high pKa is selected as a raw material for a cationic polymer having a sufficiently high ionic strength even under neutral conditions. However, a cationic polymer composed of such a high pKa monomer, under neutral conditions, has almost 100% of its side chain nitrogen atoms cationized, and after incorporation into the cell, it is acidic within the endosome. Even so, it lacks capacity to attract protons. For this reason, the above-mentioned proton sponge phenomenon cannot be obtained.
特許文献３に記載される感温性−カチオン性ブロックコポリマーであれば、感温性ポリマーブロック部の導入により、上記(１)，(２)の問題が軽減されることが考えられるが、この感温性−カチオン性ブロックコポリマーでは、カチオン性ポリマーブロックと感温性ポリマーブロックとが必須であり、核酸の包接に関与しない部分があって効率が悪い。また２種類のモノマーを用い、重合を２段階で行う必要があり、合成が煩雑になり高コストとなる。また、核酸複合体内において、核酸と親和していないＮ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーブロックの強い凝集力で不溶化して基材表面へ析出するので、培養基材も必須の構成要素である。即ち、無形の薬剤としての用法には適用し得ず、血管内や皮下或いは腹腔へ注射して投与したり、飲用したりすることができないという不具合もある。 In the case of the thermosensitive-cationic block copolymer described in Patent Document 3, the introduction of the thermosensitive polymer block portion may reduce the above problems (1) and (2). In the thermosensitive-cationic block copolymer, the cationic polymer block and the thermosensitive polymer block are essential, and there is a portion that is not involved in the inclusion of nucleic acid, and the efficiency is poor. In addition, it is necessary to perform polymerization in two stages using two types of monomers, which makes the synthesis complicated and expensive. Further, in the nucleic acid complex, the culture substrate is also an essential component because it is insolubilized by the strong cohesive force of the polymer block of N-isopropylacrylamide that is not compatible with nucleic acid and deposited on the substrate surface. That is, it cannot be applied to the usage as an intangible drug, and there is a problem that it cannot be administered by injecting into the blood vessel, subcutaneously or abdominal cavity, or ingested.
非特許文献１に報告されている２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのホモポリマーは、カチオン性ポリマーの範疇であるが、そのｐＫａが７程度で、実際のところ、細胞培養環境である中性条件下ではほとんど電荷を持っていない。このため、核酸の凝集力は低く、３０万以上の超高分子量体でなければ遺伝子導入剤として全く機能しない。しかし、高分子量体では、分解、代謝、***等の面において不利であり、生体内使用には不適当で、医薬品としての実用化が困難である。また、細胞毒性も高分子量体では強く現れる。 The homopolymer of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate reported in Non-Patent Document 1 is a category of cationic polymer, but its pKa is about 7 and is actually a cell culture environment. It has almost no charge under sexual conditions. For this reason, the cohesive strength of nucleic acid is low, and it does not function as a gene introduction agent unless it is an ultra high molecular weight body of 300,000 or more. However, high molecular weight substances are disadvantageous in terms of degradation, metabolism, excretion, etc., are unsuitable for in vivo use, and are difficult to put into practical use as pharmaceuticals. Cytotoxicity also appears strongly in high molecular weight products.
本発明は、上記従来の問題点を解消し、低ｐＫａの２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーからなる低分子量体を遺伝子導入剤として用い、これに核酸を効率的に複合させる核酸複合体の調製方法と、この方法により調製された、低分子量で遺伝子導入効率に優れた核酸複合体を提供することを目的とする。 The present invention solves the above-mentioned conventional problems, uses a low molecular weight substance composed of a low pKa 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof as a gene introduction agent, and efficiently uses a nucleic acid for this. It is an object of the present invention to provide a method for preparing a nucleic acid complex to be complexed and a nucleic acid complex prepared by this method and having a low molecular weight and excellent gene transfer efficiency.
本発明（請求項１）の核酸複合体の調製方法は、遺伝子導入剤と核酸とを溶液中で混合することにより核酸を遺伝子導入剤に複合させる核酸複合体の調製方法であって、該遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料を含んでなり、該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックを含むものであり、該混合系内に低級アルコールが存在することを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex of the present invention (Claim 1) is a method for preparing a nucleic acid complex in which a nucleic acid is complexed with a gene introduction agent by mixing the gene introduction agent and the nucleic acid in a solution. The introduction agent comprises a polymer material having a branched chain, and the branched chain contains at least a polymer block of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof, It is characterized by the presence of a lower alcohol.
請求項２の核酸複合体の調製方法は、請求項１において、前記低級アルコールは、炭素数が１〜５のアルコールであることを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex according to claim 2 is characterized in that, in claim 1, the lower alcohol is an alcohol having 1 to 5 carbon atoms.
請求項３の核酸複合体の調製方法は、請求項２において、前記低級アルコールは、エタノールであることを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex of claim 3 is characterized in that, in claim 2, the lower alcohol is ethanol.
請求項４の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記混合系内に存在する低級アルコールの量は、前記混合系内の遺伝子導入剤の量に対して３００〜３００，０００重量％であることを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex according to claim 4 is the method according to any one of claims 1 to 3, wherein the amount of the lower alcohol present in the mixed system is based on the amount of the gene introduction agent in the mixed system. 300 to 300,000% by weight.
請求項５の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させた分岐型重合体よりなるものであることを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex according to claim 5 is the compound according to any one of claims 1 to 4, wherein the polymer material has three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule. Is a branched polymer obtained by light-irradiating living polymerized with at least 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof.
請求項６の核酸複合体の調製方法は、請求項５において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex according to claim 6 is the method according to claim 5, wherein the compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule has a benzene ring as a nucleus and branches to this nucleus. It is characterized in that three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups are bonded as a chain.
請求項７の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記分岐鎖が、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックのみからなることを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex according to claim 7 is the method according to any one of claims 1 to 6, wherein the branched chain consists only of a polymer block of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof. It is characterized by this.
請求項８の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックの分子量が５，０００〜１００，０００であることを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex according to claim 8 is the method according to any one of claims 1 to 7, wherein the molecular weight of the polymer block of the 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or derivative thereof is from 5,000 to It is characterized by being 100,000.
請求項９の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量が１０，０００〜１５０，０００であることを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex according to claim 9 is characterized in that, in any one of claims 1 to 8, the gene introduction agent has a molecular weight of 10,000 to 150,000.
本発明（請求項１０）の核酸複合体は、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸複合体の調製方法により調製したものである。 The nucleic acid complex of the present invention (invention 10) is prepared by the method for preparing a nucleic acid complex according to any one of claims 1 to 9.
本発明（請求項１）の核酸複合体の調製方法によれば、分岐鎖に２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックを含むポリマー材料を遺伝子導入剤として用い、さらに、遺伝子導入剤と核酸とを含む混合系内に低級アルコールが存在しているため、遺伝子導入剤に核酸を効率的に複合させることができる。 According to the method for preparing a nucleic acid complex of the present invention (Claim 1), a polymer material containing a polymer block of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof in a branched chain is used as a gene introduction agent. Furthermore, since the lower alcohol exists in the mixed system containing the gene introduction agent and the nucleic acid, the nucleic acid can be efficiently combined with the gene introduction agent.
これは、低ｐＫａのポリマーである２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体からなるポリマーを分岐鎖に有する遺伝子導入剤の溶液と、低級アルコールとを混合すると、前記ポリマー主鎖と、側鎖のジメチルアミノ基との擬似的な結合が解離する、或いは、前記ポリマー分子間の会合が解離し、この結果、前記ポリマーが核酸を包接するのに十分な塩基性を具備するようになることによるものと推察される。 This is because, when a solution of a gene introduction agent having a polymer comprising 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof, which is a low pKa polymer, in a branched chain is mixed with a lower alcohol, the polymer main chain is mixed. And the dimethylamino group of the side chain dissociate, or the association between the polymer molecules dissociates, and as a result, the polymer has sufficient basicity to include the nucleic acid. It is guessed that this is due to
上述の如く、本発明において、遺伝子導入剤として用いる２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体からなるポリマーは、低級アルコールの存在下では、塩基性が向上し、核酸を包接するようになるが、本来低ｐＫａであり、高ｐＫａのポリマーほど核酸を包接する力が強くないため特許文献１，２に比べて核酸の放出性に優れる。 As described above, in the present invention, a polymer comprising 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof used as a gene introduction agent is improved in basicity in the presence of a lower alcohol and includes a nucleic acid. However, the inherently low pKa and the higher pKa polymer have less nucleic acid inclusion force, so that the nucleic acid release is superior to Patent Documents 1 and 2.
また、塩基性ポリマーブロックの他に感温性ポリマーブロックを別途導入する特許文献３のものに比べて効率がよく、１種のモノマーを用いて１回の重合反応で合成することができるため、合成が容易で低コストである。 Moreover, since it is more efficient than that of Patent Document 3 in which a temperature-sensitive polymer block is separately introduced in addition to the basic polymer block, and can be synthesized by one polymerization reaction using one kind of monomer, Easy to synthesize and low cost.
しかも、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を用いた遺伝子導入剤と核酸とを低級アルコールの存在下で複合した場合、１万〜３万程度の低分子量体で十分に高いζ−電位を有する核酸複合体になるため、非特許文献１で報告されている超高分子量体の細胞毒性などの問題もなく、生体内使用の適合性に優れる。 Moreover, when a gene introduction agent using 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or its derivative and a nucleic acid are combined in the presence of a lower alcohol, a low molecular weight of about 10,000 to 30,000 is sufficient. Since it becomes a nucleic acid complex having a high ζ-potential, there is no problem such as the cytotoxicity of the ultrahigh molecular weight substance reported in Non-Patent Document 1, and it is excellent in adaptability for in vivo use.
本発明において用いる前記低級アルコールは、炭素数が１〜５のアルコールであることが好ましく（請求項２）、特にエタノールであることが好ましい（請求項３）。 The lower alcohol used in the present invention is preferably an alcohol having 1 to 5 carbon atoms (Claim 2), and particularly preferably ethanol (Claim 3).
また、前記混合系内に存在する低級アルコールの量は、前記混合系内の遺伝子導入剤の量に対して３００〜３００，０００重量％であることが好ましい（請求項４）。低級アルコールの量が前記範囲内であると、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体からなるポリマーブロックが核酸を複合するのに十分な塩基性を備えるようになる。 Further, the amount of the lower alcohol present in the mixed system is preferably 300 to 300,000% by weight with respect to the amount of the gene introduction agent in the mixed system (claim 4). When the amount of the lower alcohol is within the above range, the polymer block composed of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof has sufficient basicity to complex the nucleic acid.
本発明において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させた分岐型重合体よりなるものが好ましく（請求項５）、このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が結合しているものであることが好ましい（請求項６）。 In the present invention, the polymer material uses an iniferter as a compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule, and includes at least 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or A branched polymer obtained by photoirradiation living polymerization of the derivative is preferable (Claim 5), and the compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule is a benzene ring. It is preferable that three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups are bonded as a branched chain to the nucleus.
また、前記分岐鎖は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックのみからなることが好ましい（請求項７）。 The branched chain preferably comprises only a polymer block of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof (Claim 7).
本発明において、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックの分子量が５，０００〜１００，０００であることが好ましく（請求項８）、遺伝子導入剤の分子量は、１０，０００〜１５０，０００であることが好ましい（請求項９）。 In the present invention, the molecular weight of the polymer block of the 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or derivative thereof is preferably 5,000 to 100,000 (Claim 8), and the molecular weight of the gene introduction agent is It is preferable that it is 10,000-150,000 (Claim 9).
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロック、並びに遺伝子導入剤の分子量が上記範囲内であると、高分子量化を抑えた上でより効率的に遺伝子導入剤と核酸とを複合させて、低分子量で遺伝子導入効率に優れた核酸複合体を得ることができる。 When the molecular weight of the polymer block of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or its derivative and the gene introduction agent is within the above range, the gene introduction agent and the nucleic acid can be more efficiently suppressed while suppressing high molecular weight. Can be combined to obtain a nucleic acid complex having a low molecular weight and excellent gene transfer efficiency.
本発明（請求項１０）の核酸複合体は、上記の核酸複合体の調製方法により調製したものであり、低分子量化による細胞毒性の低減が可能であり、生体使用に好適な遺伝子導入効率に優れたものである。 The nucleic acid complex of the present invention (Claim 10) is prepared by the above-described method for preparing a nucleic acid complex, and is capable of reducing cytotoxicity by lowering the molecular weight, resulting in gene transfer efficiency suitable for biological use. It is excellent.
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
本発明の核酸複合体の調製方法は、遺伝子導入剤と核酸とを溶液中で混合することにより核酸を遺伝子導入剤に複合させる核酸複合体の調製方法であって、該遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料を含んでなり、該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックを含むものであり、該混合系内に低級アルコールが存在することを特徴とするものである。 The method for preparing a nucleic acid complex of the present invention is a method for preparing a nucleic acid complex in which a nucleic acid is mixed with a gene introduction agent by mixing the gene introduction agent and the nucleic acid in a solution, and the gene introduction agent is branched. A polymer material having a chain, wherein the branched chain contains a polymer block of at least 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof, and a lower alcohol is present in the mixed system. It is characterized by this.
上記のポリマー材料としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合させた分岐型重合体よりなるものが好適である。 As the polymer material, a compound having three or more N, N-dialkyldithiocarbamylmethyl groups in the same molecule is used as an iniferter, and at least 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof is added thereto. What consists of the polymerized branched polymer is suitable.
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。 In this specification, the iniferter is a polymerization initiator that generates radicals upon irradiation with light, a function as a chain transfer agent, a function that bonds with the growth terminal to stop the growth, and a polymerization when light irradiation stops. It is a molecule that functions as a polymerization initiator / termination agent for stopping.
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。 As a compound having three or more N, N-dialkyldithiocarbamylmethyl groups in the same molecule as an iniferter, three or more N, N-dialkyldithiocarbamylmethyl groups are bonded to the benzene ring as a branched chain. It is preferable that the following is exemplified. That is, the tri-branched compound is obtained by addition reaction of 1,3,5-tri (bromomethyl) benzene and sodium N, N-dialkyldithiocarbamate (sodium N, N-dialkyldithiocarbamate) in ethanol. 1,3,5-tri (N, N-dialkyldithiocarbamylmethyl) benzene, and four-branched compounds include 1,2,4,5-tetrakis (bromomethyl) benzene and N, N-dialkyldithiocarbamic acid 1,2,4,5-tetrakis (N, N-dialkyldithiocarbamylmethyl) benzene obtained by addition reaction of sodium (sodium N, N-dialkyldithiocarbamate) in ethanol, 6-branched compound As hexakis (bromomethyl) benzene and N, N-dialkyldithio Rubamin sodium (sodium N, N-dialkyldithiocarbamate) and the hexakis obtained by addition reaction in ethanol (N, N-dialkyldithiocarbamate carbamylmethyl) include benzene. Here, the alkyl group of the dialkyl moiety contained in the N, N-dialkyldithiocarbamylmethyl group is preferably an alkyl group having 2 to 18 carbon atoms such as an ethyl group, but an aromatic group such as a phenyl group. It may be a hydrocarbon group. That is, not only N, N-dialkyldithiocarbamylmethyl group but also N, N substituted with aliphatic hydrocarbon group and / or aromatic hydrocarbon group including N, N-diaryldithiocarbamylmethyl group and the like. A di-substituted dithiocarbamylmethyl group can achieve the object.
なお、以下においては、イニファターとして上述のような分岐鎖を有するものを用いて光照射リビング重合を行う場合を例示して、本発明に用いる遺伝子導入剤を説明するが、本発明に用いる遺伝子導入剤は何らこのようなものに限定されるものではない。 In the following, the case of performing light irradiation living polymerization using an iniferter having the above-mentioned branched chain will be described as an example, and the gene introduction agent used in the present invention will be described. The agent is not limited to such a thing.
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。 The above iniferter is almost insoluble in polar solvents such as alcohol, but is easily soluble in nonpolar solvents. As this nonpolar solvent, hydrocarbons and halogenated hydrocarbons are suitable, and in particular, benzene, toluene, chloroform or methylene chloride, particularly toluene is preferred.
このイニファターに少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合させることにより、本発明に用いる遺伝子導入剤を得ることができる。 The gene introduction agent used in the present invention can be obtained by polymerizing at least 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof to this iniferter.
前記イニファターに対しては、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合させれば良いが、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体以外のモノマーを重合させてもよい。２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体以外のモノマーとしては、例えば、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーを挙げることができる。上記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体以外のモノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いても良い。 For the iniferter, at least 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or its derivative may be polymerized, but monomers other than 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and its derivative are polymerized. May be. Examples of monomers other than 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and derivatives thereof include vinyl monomers such as acrylic acid derivatives and styrene derivatives. Monomers other than the 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and derivatives thereof may be used alone or in combination of two or more.
ただし、１種のみのモノマーを用いて合成の簡素化、低コスト化を図るためには、本発明に用いる遺伝子導入剤として、前記イニファターに対して２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のみを重合させたものが好ましい。 However, in order to simplify the synthesis and reduce the cost using only one kind of monomer, 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or the above-mentioned iniferter as a gene introduction agent used in the present invention. Or what superposed | polymerized only the derivative (s) is preferable.
イニファターと２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体（以下、単に「モノマー」と称す場合がある。）とを反応させるには、イニファター及び２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体を含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を得る。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化炭化水素が好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。 Iniferter and 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof (hereinafter sometimes simply referred to as “monomer”) are reacted with each other. And a derivative solution containing the derivative thereof is prepared and irradiated with light to obtain a reaction product in which a monomer is bound to an iniferter. As the solvent of this solution, alkanes, alkenes, aromatics, and halogenated hydrocarbons are preferable, and specific examples include benzene, toluene, chloroform, carbon tetrachloride, and methylene chloride. Among these, toluene or chloroform is preferable. is there.
この２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体の該原料溶液中の濃度は０．１Ｍ以上、例えば０．１〜５．０Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。 The concentration of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and derivatives thereof in the raw material solution is preferably 0.1 M or more, for example, 0.1 to 5.0 M. The concentration of the iniferter is preferably about 0.1 to 100 mM.
照射する光の波長は２００〜４００ｎｍが好適であり、例えば、低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜２００分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３６０分程度が特に好適である。 200-400 nm is suitable for the wavelength of the light to irradiate, for example, a low pressure mercury lamp, a high pressure mercury lamp, etc. can be used. The irradiation time of the light depends on the irradiation intensity is preferably about 1 to 200 minutes, about 1 minute to 360 minutes with a low irradiation intensity of about 1μW / cm 2 ~10mW / cm 2 is particularly preferred.
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。 In addition, you may perform a 2nd light irradiation process further after this light irradiation process (1st light irradiation process). That is, the solution containing the reaction product is diluted with an alcohol, preferably an alcohol solution of the above monomer. As the alcohol, methanol or ethanol, particularly methanol is preferable. The monomer concentration in the alcohol solution is preferably about 100 mM to 5 M as the final concentration.
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。 It is preferable to add 5 to 500 parts by volume of the alcohol solution to 1 part by volume of the reaction product-containing liquid from the first light irradiation step.
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。 The diluted solution thus diluted with the alcohol solution is subjected to the second light irradiation step, and the monomer is further polymerized with respect to the reaction product. In this case, any irradiation light source may be used as long as it includes light having a wavelength of 240 to 400 nm. For example, a low-pressure mercury lamp or a high-pressure mercury lamp can be used. The light irradiation time is preferably about 10 minutes to 120 minutes.
このような光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して遺伝子導入剤を得る。 Since the target branched polymer is produced in the reaction solution by such light irradiation, it is purified as necessary to obtain a gene introduction agent.
得られる遺伝子導入剤における２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体よりなるポリマーブロックの分子量は、５，０００〜１００，０００程度、特に１０，０００〜８０，０００程度が好ましく、また、分岐鎖中の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体からなるポリマーブロックは５〜１５０個程度のモノマー単位からなることが好ましい。この２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体よりなるポリマーブロックの分子量が小さすぎると、低級アルコールを併用した場合であっても核酸を十分に凝集することができず、大きすぎると核酸複合体が高分子量化して不利である。 The molecular weight of the polymer block comprising 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof in the gene introduction agent to be obtained is preferably about 5,000 to 100,000, particularly preferably about 10,000 to 80,000, Moreover, it is preferable that the polymer block which consists of 2-N, N- dimethylamino ethyl methacrylate and / or its derivative in a branched chain consists of about 5-150 monomer units. If the molecular weight of the polymer block comprising 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or its derivative is too small, the nucleic acid cannot be sufficiently aggregated even when a lower alcohol is used in combination, and is too large. And the nucleic acid complex is disadvantageous because of its high molecular weight.
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量を指す。 In addition, in this specification, molecular weight refers to the number average molecular weight of polyethylene glycol conversion by GPC (gel permeation chromatography).
また、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体よりなるポリマーブロックのみを有する遺伝子導入剤の分子量は、分岐鎖の鎖数にもよるが１０，０００〜１５０，０００程度、特に２０，０００〜１００，０００程度、とりわけ３０，０００〜８０，０００程度が好ましい。この遺伝子導入剤の分子量が小さすぎると、ポリマー同士が疎水結合的に凝集しにくくなり、核酸複合体を形成しにくくなる。また、分子量が大きすぎると、分解、代謝、***等の面において不利であり、生体内使用には不適当で、医薬品としての実用化が困難であり、また、細胞毒性も現れる。 The molecular weight of the gene introduction agent having only a polymer block composed of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof is about 10,000 to 150,000, although it depends on the number of branched chains. About 20,000 to 100,000, especially about 30,000 to 80,000 is preferable. If the molecular weight of the gene introduction agent is too small, the polymers are less likely to aggregate in a hydrophobic bond, making it difficult to form a nucleic acid complex. On the other hand, if the molecular weight is too large, it is disadvantageous in terms of degradation, metabolism, excretion, etc., unsuitable for in vivo use, difficult to put into practical use as a pharmaceutical product, and cytotoxicity also appears.
なお、本発明に用いる遺伝子導入剤は、分子量が上記範囲内の低分子量であっても、核酸と複合させた場合、＋２０ｍＶ〜＋５０ｍＶ程度の高いζ−電位を示す。 The gene introduction agent used in the present invention exhibits a high ζ-potential of about +20 mV to +50 mV when complexed with a nucleic acid even when the molecular weight is a low molecular weight within the above range.
本発明の核酸複合体の調製方法は、上記のように合成した遺伝子導入剤と核酸とを低級アルコールが存在する系で混合することにより複合させるものである。 In the method for preparing a nucleic acid complex of the present invention, the gene introduction agent synthesized as described above and a nucleic acid are mixed together in a system in which a lower alcohol is present.
前記低級アルコールとしては、炭素数１〜５のアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール等が好ましく、この中でも特にエタノールが好ましい。炭素数が上記範囲を超えるアルコールでは、前述の遺伝子導入剤のポリマーの主鎖と側鎖のジメチルアミノ基との擬似的な結合の解離や、ポリマー同士の解離が起こらず、核酸との複合を行うことができない。また、このようなアルコールでは、前記混合系内に存在する他の溶媒、例えば水等と均一に混ざらない場合がある。なお、これらの低級アルコールは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。 The lower alcohol is preferably an alcohol having 1 to 5 carbon atoms, such as methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol, etc. Among them, ethanol is particularly preferable. Alcohols with more than the above range do not dissociate the pseudo bond between the polymer main chain and the dimethylamino group on the side chain of the above-mentioned gene introduction agent, or dissociate the polymers, so that they can be combined with nucleic acids. I can't do it. In addition, such an alcohol may not be mixed uniformly with other solvents such as water present in the mixed system. In addition, these lower alcohols may be used individually by 1 type, and 2 or more types may be mixed and used for them.
前記遺伝子導入剤よりなるベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍｌ程度の分散液に対し、常温にて低級アルコールを添加し、次いで核酸を添加して混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤を核酸に対して飽和状態にして核酸複合体として複合させるのが好ましい。 In order to complex the vector comprising the gene introduction agent and the nucleic acid, a lower alcohol is added at room temperature to the dispersion having a concentration of about 1 to 1000 μg / ml, and then the nucleic acid is added and mixed. Good. It is preferable that an excessive amount of a gene introduction agent is added to the nucleic acid, and the gene introduction agent is saturated with respect to the nucleic acid to form a nucleic acid complex.
この遺伝子導入剤と核酸とを含む混合系内に存在する低級アルコールの量としては、この混合系内の遺伝子導入剤の量に対して３００〜３００，０００重量％程度、特に５００〜２００，０００重量％程度であることが好ましい。低級アルコールの量が少なすぎると、遺伝子導入剤の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体からなるポリマー鎖が十分にカチオン性に変化しないため、核酸と２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックからなる分岐鎖を有する遺伝子導入剤とが複合しにくくなる。また、低級アルコールの量が多すぎるとアルコールの細胞傷害性が強く現れてしまう。 The amount of the lower alcohol present in the mixed system containing the gene introduction agent and the nucleic acid is about 300 to 300,000% by weight, particularly 500 to 200,000, based on the amount of the gene introduction agent in the mixture system. It is preferable that it is about weight%. If the amount of the lower alcohol is too small, the polymer chain composed of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or its derivative, which is a gene introduction agent, will not be sufficiently cationic, so that the nucleic acid and 2-N, N- It becomes difficult to complex with a gene introduction agent having a branched chain composed of a polymer block of dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof. Moreover, when there is too much quantity of a lower alcohol, the cytotoxicity of alcohol will appear strongly.
なお、この混合系は、実用的には、前記遺伝子導入剤と核酸と低級アルコールと緩衝系成分と無機塩類とを含む水溶液であり、核酸の濃度としては１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ程度であることが好ましく、水と低級アルコールとの重量比は、水／アルコール＝９５／５〜３０／７０程度であることが好ましい。 This mixed system is practically an aqueous solution containing the gene introduction agent, nucleic acid, lower alcohol, buffer system component, and inorganic salts, and the concentration of the nucleic acid is about 10 μg / mL to 100 μg / mL. The weight ratio of water and lower alcohol is preferably about water / alcohol = 95/5 to 30/70.
このように、混合系内に低級アルコール存在すると低ｐＫａモノマーである２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックからなる分岐鎖を有する遺伝子導入剤であっても核酸を包接することができる。 Thus, if a lower alcohol is present in the mixed system, the nucleic acid can be introduced even if it is a gene transfer agent having a branched chain composed of a polymer block of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or its derivative, which is a low pKa monomer. Can be included.
なお、本発明の別の態様としては、遺伝子導入剤の分散液に対し、常温にて核酸を混合し、次いで、この混合液と低級アルコールとを混合してもよく、また、予め核酸と低級アルコールとを混合し、次いで、この混合液と遺伝子導入剤の分散液とを混合しても良い。 As another embodiment of the present invention, nucleic acid may be mixed at room temperature with a dispersion of a gene introduction agent, and then this mixture and lower alcohol may be mixed. Alcohol may be mixed, and then this mixed solution and the gene introduction agent dispersion may be mixed.
ただし、遺伝子導入剤の分散液と、低級アルコールとを混合することにより遺伝子導入剤の分岐鎖の主鎖と、側鎖のジメチルアミノ基との擬似的な結合を解離する、或いは、前記ポリマー間の会合を解離することができると推察されるため、遺伝子導入剤の分散液と、低級アルコールとを混合し、次いで、この混合液と核酸とを混合することが好ましい。 However, by mixing a dispersion of the gene introduction agent and a lower alcohol, the pseudo bond between the branched main chain of the gene introduction agent and the dimethylamino group of the side chain is dissociated, or between the polymers Therefore, it is preferable to mix a dispersion of a gene introduction agent and a lower alcohol, and then mix this mixture and a nucleic acid.
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。 Preferred examples of the nucleic acid include herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV1-TK gene), p53 tumor suppressor gene, BRCA1 tumor suppressor gene and cytokine gene such as TNF-α gene, IL-2 gene, IL-4 gene, HLA- Cytokine genes such as B7 / IL-2 gene, HLA-B7 / B2M gene, IL-7 gene, GM-CSF gene, IFN-γ gene and IL-12 gene, and gp-100, MART-1 and MAGE-1 These cancer antigen peptide genes can be used for cancer treatment.
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡの導入、遺伝子発現のみならず、細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。 In addition, cytokine genes such as VEGF gene, HGF gene and FGF gene, c-myc antisense, c-myb antisense, cdc2 kinase antisense, PCNA antisense, E2F decoy and p21 (sdi-1) gene are used for vascular treatment. Available. Further, not only DNA introduction and gene expression as described above, but also RNA interference that destroys intracellular mRNA can be carried out by introduction of siRNA. Such a series of genes is well known to those skilled in the art.
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。 The particle size of the nucleic acid-containing complex is preferably about 50 to 400 nm. If it is smaller than this, there is a possibility that the action of the enzyme may reach the nucleic acid inside the nucleic acid-containing complex, or it may be filtered out by the kidney. Moreover, when larger than this, there exists a possibility that it may become difficult to introduce | transduce into a cell.
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。 The nucleic acid is used in such a form that when introduced into a cell, the function can be expressed in the cell. For example, in the case of DNA, it is used as a plasmid in which the DNA is placed so that the DNA is transcribed in the introduced cell and functionally expressed through production of the polypeptide encoded thereby. Preferably, a promoter region, a start codon, DNA encoding a protein having a desired function, a stop codon, and a terminator region are sequentially arranged.
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。 If desired, two or more nucleic acids can be included in one plasmid.
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。 In the present invention, “cells” that are desirable as a target for introduction of nucleic acids are those in which functional expression of the nucleic acids is desired. Examples thereof include cardiomyocytes, smooth muscle cells, fibroblasts, skeletal muscle cells, vascular endothelial cells, bone marrow cells, bone cells, blood cell stem cells, blood cell cells and the like. In addition, monocytes, dendritic cells, macrophages, histocytes, Kupffer cells, osteoclasts, synovial A cells, microglia, Langerhans cells, epithelioid cells, multinucleated giant cells, etc., gastrointestinal epithelial cells / tubule epithelium Such as cells.
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。 The nucleic acid-containing complex using the vector of the present invention can be administered to a living body by any method.
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。 As the administration method, intravenous or intraarterial injection is particularly preferable, but intramuscular, adipose tissue, subcutaneous, intradermal, intralymphatic, intralymphatic, body cavity (pericardial cavity, thoracic cavity, abdominal cavity, cerebrospinal cavity) Etc.) In addition to administration into the bone marrow, administration into the diseased tissue is also possible.
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。 The pharmaceutical comprising this nucleic acid-containing complex as an active ingredient is further a pharmaceutically acceptable carrier (osmotic pressure regulator, stabilizer, preservative, solubilizer, pH adjuster, thickener, etc.) as necessary. It is possible to mix with. Any known carrier can be used.
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。 Moreover, the medicine containing this nucleic acid-containing complex as an active ingredient also includes those containing two or more nucleic acid-containing complexes with different types of nucleic acids. Such a medicine having a plurality of therapeutic purposes is particularly useful in the field of diversifying gene therapy.
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。 As for the dosage, the dosage administered to animals, particularly humans, varies depending on various factors such as the target nucleic acid, the method of administration, and the specific site to be treated. However, the dosage should be sufficient to produce a therapeutic response.
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。 This nucleic acid-containing complex is preferably applied to gene therapy. Applicable diseases vary depending on the type of nucleic acid included in the complex, but in addition to diseases in the cardiovascular region that cause lesions such as peripheral arterial disease, coronary artery disease, restenosis after arterial dilation, cancer (malignant Melanoma, brain tumor, metastatic malignant tumor, breast cancer, etc.), infectious diseases (HIV, etc.), single genetic diseases (cystic fibrosis, chronic granulomas, α1-antitrypsin deficiency, Gaucher disease, etc.) .
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。 Further, an aqueous solution of the gene introduction agent combined with the nucleic acid is attached to a substrate by coating or the like, and dried as necessary, thereby forming a polymer coating or the like carrying the nucleic acid.
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。 When the nucleic acid complex gene introduction agent is attached to a substrate, the substrate is preferably a sheet. The thickness of the sheet-like substrate is preferably about 0.05 to 10 mm, and the size of the sheet surface is 1 to 20 mm on one side and 1 to 20 mm on the other side in the case of a square, In the case of an ellipse, the diameter is preferably about 1 to 20 mm. As a material for the base material, a synthetic resin such as polyolefin, polystyrene, polyester, polyamide, polyurethane, silicone resin, or fluororesin is suitable. This substrate may be porous.
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。 The adhesion amount of the nucleic acid complex gene introduction agent to the substrate is preferably about 0.001 to 10 mg per 1 cm 2 of the substrate surface.
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。 A gene transfer material comprising a substrate carrying a nucleic acid complex gene transfer agent is placed on a sheet-like substrate so as to surround a subcutaneous tissue, a myocardial tissue, a diseased tissue, or a diseased blood vessel, or is applied to a film of a covered stent. Therefore, it is used in such a manner that it is placed in the living body or is attached to the outer surface of the living body using an adhesive tape.
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
i）イニファターの合成
下記反応式に従って、イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを合成した。
i) Synthesis of iniferter 1,2,4,5-tetrakis (N, N-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene as an iniferter was synthesized according to the following reaction formula.
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌した後、濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。 5.0 g of 1,2,4,5-tetrakis (bromomethylbenzene) and 34.0 g of sodium N, N-diethyldithiocarbamate were added to 100 mL of ethanol, and the mixture was stirred at room temperature for 4 days in the dark. The precipitate was filtered, poured into 3 liters of methanol, stirred for 30 minutes, and then filtered. This operation was repeated a total of 4 times. After the precipitate was dissolved in 200 mL of toluene, 100 mL of methanol was added and heated to 50 ° C., stored in a refrigerator for 15 hours for recrystallization, and the crystals were separated by filtration and washed with a large amount of methanol. The crystals were dried at room temperature under reduced pressure to obtain white needle-like crystals of 1,2,4,5-tetrakis (N, N-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene (yield 90%). High-performance liquid chromatography confirmed that the raw material peak disappeared and the purified product was a single substance.
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。 The measurement result of 1 H NMR (in CDCl 3 ) is δ1.26-1.31 ppm (t, 24H, CH 2 CH 3 ), δ 3.69-3.77 ppm (q, 8H, N (CH 2 CH 3 ) 2 ), Δ 3.99-4.07 ppm (q, 8H, N (CH 2 CH 3 ) 2 ), δ 4.57 ppm (s, 8H, Ar—CH 2 ), δ 7.49 ppm (s, 2H, Ar—H) It became.
ii)イニファターへの２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＥＭＡＡと記載することがある。）の合成を行った。
ii) Polymerization of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate to iniferter According to the following reaction formula, 1,2,4,5-tetrakis [(N, N-diethyldithiocarbamyl) poly (2-N, N- Dimethylaminoethyl methacrylate) -methyl] benzene (hereinafter sometimes referred to as pDMAEMAA) was synthesized.
即ち、上記i)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．５ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスを１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を１８０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。この重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ｎ−ヘキサン系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ｎ−ヘキサンを蒸散させた後に少量のベンゼンへ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＥＭＡＡを得た。ポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量は、ＧＰＣにより、３２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）と測定された。 Namely, 45.6 mg of 1,2,4,5-tetrakis (N, N-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene synthesized by i) above was dissolved in 20 mL of toluene, and 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate was dissolved. 8.5 g was added and mixed, and the total amount was adjusted to 50 mL with toluene. After purging high-purity nitrogen gas for 10 minutes with vigorous stirring in a 3 mm thick soft glass cell, irradiation with mixed ultraviolet rays having a wavelength of 250 nm to 400 nm was performed for 180 minutes with a 300 W short arc xenon lamp (manufactured by Asahi Spectroscopic Co., Ltd., MAX-301). . The irradiation intensity was adjusted to 2.5 mW / cm 2 by attaching UVD-C405 (detection wavelength range of 320 nm to 470 nm) to UIT-150 manufactured by USHIO. This polymerization solution is concentrated with an evaporator, the polymer is reprecipitated with n-hexane, purified by repeating reprecipitation three times with chloroform / n-hexane, and dissolved in a small amount of benzene after evaporating n-hexane. The solution was filtered through a 0.2 μm filter and freeze-dried to obtain a 4-branched star homopolymer pDMAEMAA. The number average molecular weight using polyethylene glycol as a standard substance was measured by GPC to be 32,000 (Mw / Mn = 1.5).
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ3ＯＤ）の測定結果は、δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２）となった。 The measurement result of 1 H NMR (in CD 3 OD) is δ0.8-1.2 ppm (br, 3H, —CH 2 —CH 3 —), δ 1.6-2.0 ppm (br, 2H, —CH 2). -CH 3 -), δ2.2-2.4ppm (br , 6H, N-CH 3), δ2.5-2.7ppm (br, 2H, CH 2 -N), δ4.0-4.2ppm ( br, it became 2H, O-CH 2) and.
iii）核酸複合体の調製（実施例１）
上記ii）で合成した分岐型スター型重合体を３２μｇ分取し、３０μＬのＴＥバッフアー（１０ｍＭ
Ｔｒｉ・ＨＣＬ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）へ溶解した。ここへ３０μＬのエタノールを混合した。プロメガ社のホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３コントロール）をＴＥバッフアーへ溶解し、０．０３３μｇ／μＬ濃度に調整した。この分岐型スター型重合体溶液９０μＬへカチオン性ポリマー溶液６０μＬを加えて緩やかに室温にて混合した。この混合系内のエタノールの量は、分岐型スター型重合体に対して約１，０００重量％であり、水／アルコールの重量比は５０／５０である。なお、分岐型スター型重合体中の単位重量あたりの陽電荷数はポリマー中のモノマー単位の分子量１５７から計算して求め、中性条件下でも１００％解離しているものとした。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。これにより、核酸複合体中の陽電荷と陰電荷の混合比は、陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるようになっている。
iii) Preparation of nucleic acid complex (Example 1)
32 μg of the branched star polymer synthesized in the above ii) was collected and 30 μL of TE buffer (10 mM)
Tri · HCL, 1 mM EDTA). 30 μL of ethanol was mixed here. Plasmid DNA (pGL3 control) encoding Promega firefly luciferase was dissolved in TE buffer and adjusted to a concentration of 0.033 μg / μL. 60 μL of the cationic polymer solution was added to 90 μL of this branched star polymer solution and gently mixed at room temperature. The amount of ethanol in this mixed system is about 1,000% by weight with respect to the branched star polymer, and the weight ratio of water / alcohol is 50/50. The number of positive charges per unit weight in the branched star polymer was calculated from the molecular weight 157 of the monomer unit in the polymer, and was assumed to be 100% dissociated even under neutral conditions. The number of negative charges per unit weight in DNA was calculated from the number of base pairs in the sequence map and the average molecular weight 660 of nucleobases. Thereby, the mixing ratio of the positive charge and the negative charge in the nucleic acid complex is such that the number of positive charges is 20 times the number of negative charges.
iv）核酸複合体の調製（比較例１）
分岐型スター型重合体３２μｇをＴＥバッファー６０μＬへ溶解した。ＤＮＡ溶液はiii）と同様に調製した。分岐型スター型重合体とＤＮＡ溶液を混合し、iii）と同様に室温に維持して核酸複合体を調製した。
iv) Preparation of nucleic acid complex (Comparative Example 1)
32 μg of branched star polymer was dissolved in 60 μL of TE buffer. The DNA solution was prepared in the same manner as iii). A branched star polymer and a DNA solution were mixed and maintained at room temperature as in iii) to prepare a nucleic acid complex.
v）ζ−電位の測定
上記iii）およびiv）で調製した核酸複合体を生理食塩水で１０倍に希釈し、ζ−電位を測定した。シスメックス社のゼーターサイザーＮａｎｏ-ＺＳ及び使い捨て式の１ｍＬ容量のセルを使用した。セル温度は２５℃に設定した。粒子の諸係数はポリスチレン粒子の値で計算した。
v) Measurement of ζ-potential The nucleic acid complex prepared in iii) and iv) was diluted 10-fold with physiological saline, and the ζ-potential was measured. A Sysmex Zetasizer Nano-ZS and a disposable 1 mL capacity cell were used. The cell temperature was set at 25 ° C. The various coefficients of the particles were calculated with the values of polystyrene particles.
実施例１では、２８．０ｍＶのζ−電位が観測された。一方、比較例１では、ζ−電位が観測されず、帯電微粒子が形成されていないことが示唆された。 In Example 1, a ζ-potential of 28.0 mV was observed. On the other hand, in Comparative Example 1, no ζ-potential was observed, suggesting that charged fine particles were not formed.
vi）臭化エチジウムによるＤＮＡと遺伝子導入剤との複合化の確認
臭化エチジウムは、ＤＮＡへインターカレーションすることで強い蛍光を発する化合物として知られている。通常はＤＮＡの電気泳動でバンドを可視化する際に利用されており、ＤＮＡがフリーの状態にあれば臭化エチジウムを混合することで強い蛍光が観察される。遺伝子導入剤と核酸とが遺伝子導入剤の凝集により核酸複合体を形成していると、ＤＮＡ分子と臭化エチジウムとの結合が制限されて蛍光が観察されなくなる。この原理を利用し、ＤＮＡがコンデンスされているかどうかを評価する。操作はすべて室温で行った。
vi) Confirmation of complexation of DNA and gene introduction agent by ethidium bromide Ethidium bromide is known as a compound that emits strong fluorescence when intercalated into DNA. Usually, it is used to visualize bands by electrophoresis of DNA, and if the DNA is in a free state, strong fluorescence is observed by mixing ethidium bromide. If the gene introduction agent and the nucleic acid form a nucleic acid complex due to the aggregation of the gene introduction agent, the binding between the DNA molecule and ethidium bromide is limited, and fluorescence is not observed. This principle is used to evaluate whether the DNA is condensed. All operations were performed at room temperature.
iii）およびiv）で調製した核酸複合体を９６Ｗｅｌｌマイクロプレートへ移した。ここへ、２０μｇ／ｍＬ濃度の臭化エチジウム水溶液を４０μＬ加え１０分間静置した。１０分後、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｄｉａ−Ｌａｔｒｏｎ社，ＣＴ９０００Ｄ）を使用し、励起波長５６０ｎｍ，蛍光波長６２０ｎｍで蛍光強度を測定した。蛍光強度は、０．０３３μｇ／μＬのＤＮＡ溶液９０μＬとＴＥバッファー６０μＬとを混合した溶液へ２０μｇ／ｍＬ濃度の臭化エチジウム水溶液を４０μＬ加えた溶液の蛍光強度を１００％とし、ＴＥバッファー１５０μＬへ２０μｇ／ｍＬ濃度の臭化エチジウム水溶液を４０μＬ加えた溶液の蛍光強度を０％として計算した。 The nucleic acid complex prepared in iii) and iv) was transferred to a 96-well microplate. To this, 40 μL of an aqueous ethidium bromide solution having a concentration of 20 μg / mL was added and allowed to stand for 10 minutes. After 10 minutes, the fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 560 nm and a fluorescence wavelength of 620 nm using a fluorescence microplate reader (Dia-Latron, CT9000D). The fluorescence intensity is 100% of the solution obtained by adding 40 μL of 20 μg / mL aqueous ethidium bromide solution to a solution obtained by mixing 90 μL of 0.033 μg / μL DNA solution and 60 μL of TE buffer, and 20 μg to 150 μL of TE buffer. The fluorescence intensity of a solution obtained by adding 40 μL of an aqueous ethidium bromide solution at a concentration of / mL was calculated as 0%.
この結果、比較例１では、ＤＮＡ単体での溶液の蛍光強度と差がなく、ＤＮＡが凝集されていないことが分かった。実施例１では、相対値で３０％程度の強度となり、ＤＮＡが凝集されて臭化エチジウムのインターカレーションが制限されていることが分かった。この結果は、v）のζ−電位の結果と整合性があることが確認された。 As a result, in Comparative Example 1, it was found that there was no difference from the fluorescence intensity of the solution of DNA alone, and the DNA was not aggregated. In Example 1, the relative value was about 30%, indicating that DNA was aggregated and the intercalation of ethidium bromide was limited. This result was confirmed to be consistent with the result of ζ-potential of v).
vii）遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。上記iii）またはiv）にて調製した核酸複合体を遺伝子ベクターとして使用した。この遺伝子ベクター２５μＬを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭへ室温で加え３０分間インキュベートした。培養細胞は室温のＰＢＳで洗浄し、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
vii) Gene transfer activity COS-1 derived from African green monkey kidney cells was used as cells, and a pGL3 control vector was used as DNA. The number of COS-1 cells was adjusted to 40,000 cells / mL, seeded in a 24 Well culture dish, and gene transfer was performed after 24 hours of culture. The nucleic acid complex prepared in the above iii) or iv) was used as a gene vector. 25 μL of this gene vector was added to 200 μL of OPTI-MEM at room temperature and incubated for 30 minutes. Cultured cells were washed with room temperature PBS and transfected. Forty-eight hours after transfection, gene transfer activity was evaluated by luciferase assay (Promega, assay kit reagent). Correction was performed at protein concentration, and protein quantification was performed with Bradford reagent from BioRad.
この結果、実施例１では遺伝子導入活性が発現し、その活性は市販のリポフェクトアミン２０００に比べて約５０〜８０％程度高いものであった。一方、比較例１では、Ｎａｃｋｅｄ ＤＮＡを使用した系とほぼ同じ活性であり、核酸複合体が形成されず、遺伝子導入活性を示さなかったものと考えられる。 As a result, in Example 1, gene transfer activity was expressed, and the activity was about 50 to 80% higher than that of commercially available Lipofectamine 2000. On the other hand, in Comparative Example 1, it was considered that the activity was almost the same as that of the system using Nacked DNA, the nucleic acid complex was not formed, and the gene introduction activity was not exhibited.
Claims (10)
該遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料を含んでなり、
該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックを含むものであり、
該混合系内に低級アルコールが存在することを特徴とする核酸複合体の調製方法。 A method for preparing a nucleic acid complex in which a nucleic acid is complexed with a gene introduction agent by mixing the gene introduction agent and the nucleic acid in a solution,
The gene introduction agent comprises a polymer material having a branched chain,
The branched chain contains at least a polymer block of 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and / or a derivative thereof;
A method for preparing a nucleic acid complex, wherein a lower alcohol is present in the mixed system.
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