JP2009273422A - Gene-inducing agent and nucleic acid complex - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子導入剤及び核酸複合体に係り、特にカチオン性分岐型重合体を有する遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤と核酸とを複合させた核酸複合体とに関する。 The present invention relates to a gene introduction agent and a nucleic acid complex, and particularly to a gene introduction agent having a cationic branched polymer and a nucleic acid complex in which the gene introduction agent and a nucleic acid are complexed.
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。 Synthetic polymer vectors and cationic lipid vectors have been researched and developed as gene transfer techniques to replace virus vectors that have problems with safety, quality stability, and production costs.
本出願人らは、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のスター型ポリマーよりなるベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
これらの特許文献１，２では、分岐鎖が３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを光照射により重合したものよりなり、分岐鎖は芳香環に対し３〜６本設けられる。 In these Patent Documents 1 and 2, the branched chain consists of 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide polymerized by light irradiation, and 3 to 6 branched chains are provided for the aromatic ring.
この分岐鎖は、ＤＮＡを捕捉して包蔵するものであるから、分岐鎖の数が多いほどＤＮＡの包蔵能力が高くなることが期待される。しかしながら、種々の研究の結果、６本の分岐鎖を有する遺伝子導入剤が必ずしも４本の分岐鎖を有する遺伝子導入剤よりも高いＤＮＡ包蔵能力を示す訳ではないことが認められた。このことは、分岐鎖同士の電気的反発により、特に分岐鎖の基端側において分岐鎖の運動自由度が小さくなるためであると考えられる。 Since this branched chain captures and stores DNA, it is expected that the greater the number of branched chains, the higher the capacity for storing DNA. However, as a result of various studies, it was confirmed that a gene introduction agent having 6 branched chains does not necessarily exhibit a higher DNA occluding ability than a gene introduction agent having 4 branched chains. This is considered to be because the degree of freedom of movement of the branched chain is reduced particularly on the base end side of the branched chain due to electrical repulsion between the branched chains.
即ち、上記特許文献１，２のように、芳香環に直接に３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて分岐鎖を形成したスター型ポリマーの場合、分岐鎖の基端側にあっては、分岐鎖同士の距離が近いため、電気的斥力（カチオン同士の反発力）によって、分岐鎖の動きが制限され易いと考えられる。即ち、この分岐鎖は、芳香環を回動中心として、動き得るものであるが、分岐鎖基端側において分岐鎖同士が反発すると、分岐鎖の基端側回動方向に動き得る範囲が狭くなる。換言するならば、分岐鎖の運動自由度が小さくなる。そして、このように分岐鎖の運動自由度が小さいと、分岐鎖がＤＮＡを包蔵する能力が低下するおそれがある。 That is, as in the above-mentioned Patent Documents 1 and 2, in the case of a star polymer in which a branched chain is formed by polymerizing 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide directly on an aromatic ring, it is located on the base end side of the branched chain. Since the distance between the branched chains is short, it is considered that the movement of the branched chain is likely to be limited by the electric repulsive force (repulsive force between cations). In other words, this branched chain can move around the aromatic ring as a rotation center, but if the branched chains repel each other at the branch chain base end side, the range in which the branch chain can move in the base end side rotation direction is narrow. Become. In other words, the degree of freedom of movement of the branched chain is reduced. If the degree of freedom of movement of the branched chain is small, the ability of the branched chain to embed DNA may be reduced.
このように、分岐鎖の数を多くすると、分岐鎖の運動自由度が制限されるところから、分岐鎖の数を多くしてもＤＮＡの包蔵能力は直ちには増大しない。 As described above, when the number of branched chains is increased, the degree of freedom of movement of the branched chains is limited. Therefore, even if the number of branched chains is increased, the DNA storage capacity does not increase immediately.
本発明は、上記問題点を解消し、ＤＮＡの包蔵能力が大きい遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a gene introduction agent having a large DNA storage ability and a nucleic acid complex obtained by combining the gene introduction agent and a nucleic acid.
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、それから伸延した複数のカチオン性の分岐鎖を有するカチオン性分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、該カチオン性分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させて非イオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性ビニル系モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。 The gene transfer agent of the present invention (Claim 1) is a gene transfer agent having a cationic branched polymer having a plurality of cationic branched chains extending from an aromatic ring as a nucleus, the cationic branching Type polymer uses an iniferter as a compound having 3 or more N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule, and a nonionic monomer is photoirradiated by living polymerization to form a nonionic polymer block chain. Is a branched polymer in which a cationic vinyl monomer is further subjected to light irradiation living polymerization to form a cationic polymer block chain.
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。 The gene transfer agent according to claim 2 is the compound according to claim 1, wherein the compound having three or more N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule has a benzene ring as a nucleus and a branch chain in the nucleus. Three or more of the N, N-disubstituted dithiocarbamylmethyl groups are bonded to each other.
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とするものである。 The gene introduction agent according to claim 3, wherein the N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl group is an N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl group according to claim 1 or 2. It is.
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記非イオン性モノマーは、炭素数が１０以下であることを特徴とするものである。 The gene transfer agent according to claim 4 is characterized in that, in any one of claims 1 to 3, the nonionic monomer has 10 or less carbon atoms.
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記非イオン性モノマーは、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート及び２−メトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
The gene transfer agent according to
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記非イオン性ポリマーブロック鎖の分子量は１００〜５００００であることを特徴とするものである。 The gene introduction agent according to claim 6 is characterized in that, in any one of claims 1 to 5, the nonionic polymer block chain has a molecular weight of 100 to 50,000.
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記カチオン性ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートであることを特徴とするものである。 A gene transfer agent according to claim 7 is the method according to any one of claims 1 to 6, wherein the cationic vinyl monomer is 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide and / or 2-N, N-dimethylamino. It is ethyl methacrylate.
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記カチオン性分岐型重合体の分子量は、３０００〜６００００であることを特徴とするものである。 The gene introduction agent according to claim 8 is characterized in that, in any one of claims 1 to 7, the molecular weight of the cationic branched polymer is 3000 to 60000.
本発明（請求項９）の核酸複合体は、請求項１ないし８のいずれか１項の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。 The nucleic acid complex of the present invention (invention 9) is obtained by combining the gene introduction agent according to any one of claims 1 to 8 and a nucleic acid.
請求項１０の核酸複合体は、請求項９において、前記遺伝子導入剤の粒径が２００ｎｍ以下であることを特徴とするものである。
The nucleic acid complex according to
本発明の遺伝子導入剤は、核となる芳香環に非イオン性モノマーを重合した後、カチオン性ビニル系モノマーを重合したものであり、スター型ポリマーの分岐鎖の基端側は非イオン性ポリマーブロック鎖にて構成され、それよりも先端側はカチオン性ポリマーブロック鎖にて構成されている。 The gene transfer agent of the present invention is obtained by polymerizing a nonionic monomer on a core aromatic ring and then polymerizing a cationic vinyl monomer, and the base end side of the branched chain of the star polymer is a nonionic polymer. It is composed of block chains, and the tip side is composed of cationic polymer block chains.
この遺伝子導入剤は、分岐鎖の基端側が非イオン性ポリマーブロックによって構成されているため、分岐鎖の基端側において、分岐鎖同士が電気的斥力によって反発することがなく、分岐鎖の動きが制限されにくく、各分岐鎖の運動自由度が大きい。 In this gene transfer agent, since the proximal end side of the branched chain is composed of a nonionic polymer block, the branched chain is not repelled by an electric repulsive force on the proximal end side of the branched chain. Is difficult to restrict and the degree of freedom of movement of each branched chain is large.
また、各分岐鎖の末端側は、カチオン性モノマーにより構成されているが、非イオン性ポリマーブロック鎖の長さの分だけ核から離れているため、カチオン性ポリマーブロック鎖の相互間の距離が遠くなっている。従って、カチオン性ポリマーブロック同士の反発力が小さく、カチオン性ポリマーブロック鎖の運動自由度が大きい。 In addition, the terminal side of each branched chain is composed of a cationic monomer, but since it is separated from the nucleus by the length of the nonionic polymer block chain, the distance between the cationic polymer block chains is It ’s far away. Therefore, the repulsive force between the cationic polymer blocks is small, and the degree of freedom of movement of the cationic polymer block chain is large.
このように、本発明の遺伝子導入剤は、核に直接カチオン性モノマーを重合した遺伝子導入剤よりもカチオン性ポリマーブロック鎖の運動自由度が大きく、核酸の包蔵能力が高いものである。 Thus, the gene transfer agent of the present invention has a higher degree of freedom of movement of the cationic polymer block chain and a higher nucleic acid inclusion ability than the gene transfer agent in which a cationic monomer is directly polymerized in the nucleus.
なお、この遺伝子導入剤の非イオン性ポリマーブロック鎖及びカチオン性ポリマーブロック鎖は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を光開裂性官能基とする光リビング重合により、２段階の反応で容易に合成できる。 In addition, the nonionic polymer block chain and the cationic polymer block chain of this gene introduction agent are reacted in two steps by photo-living polymerization using an N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl group as a photocleavable functional group. Can be easily synthesized.
上記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい。 The compound having three or more N, N-disubstituted dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule has a benzene ring as a nucleus and three or more N, N-disubstituted- as branched chains in this nucleus. Those having a dithiocarbamylmethyl group are preferred.
また、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジ置換部分は、アルキル基であることが好ましい。即ち、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が好ましい。 The di-substituted moiety contained in the N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl group is preferably an alkyl group. That is, the N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl group is preferably an N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl group.
前記非イオン性モノマーとしては、炭素数が１０以下のものが好ましく、特にメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート及び２−メトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。 As the nonionic monomer, those having 10 or less carbon atoms are preferable, and at least one selected from the group consisting of methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate and 2-methoxyethyl (meth) acrylate is particularly preferable. preferable.
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、それから伸延した複数のカチオン性の分岐鎖を有するカチオン性分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、該カチオン性分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させて非イオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性ビニル系モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。 The gene introduction agent of the present invention is a gene introduction agent having a cationic branched polymer having a plurality of cationic branched chains extending from an aromatic ring as a nucleus, wherein the cationic branched polymer is: After a compound having three or more N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule is used as an iniferter, a nonionic monomer is irradiated with light by polymerization to form a nonionic polymer block chain. Furthermore, it is a branched polymer in which a cationic vinyl monomer is subjected to light irradiation living polymerization to form a cationic polymer block chain.
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。 In this specification, the iniferter is a polymerization initiator that generates radicals upon irradiation with light, a function as a chain transfer agent, a function that bonds with the growth terminal to stop the growth, and a polymerization when light irradiation stops. It is a molecule that functions as a polymerization initiator / termination agent for stopping.
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基、特にＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基又はＮ，Ｎ−ジフェニル−ジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−ジチオカルバミルメチルなどのＮ，Ｎ−ジアリール−ジチオカルバミルメチル基等であってもよいが、特にエチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基で置換されたＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が好ましい。 As a compound having three or more N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule as an iniferter, the N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl group, particularly N, N- Those in which three or more dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups or N, N-diphenyl-dithiocarbamylmethyl groups are bonded as branched chains are preferred, and specific examples thereof are as follows. That is, as a three-branched compound, 1,3,5-tri (bromomethyl) benzene and sodium N, N-dialkyl-dithiocarbamate (sodium N, N-dialkyl-dithiocarbamate) are subjected to an addition reaction in ethanol. The resulting 1,3,5-tri (N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl) benzene, and as the 4-branched compound, 1,2,4,5-tetrakis (bromomethyl) benzene and N, N- 1,2,4,5-tetrakis (N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl) benzene obtained by addition reaction of sodium dialkyl-dithiocarbamate (sodium N, N-dialkyl-dithiocarbamate) in ethanol Yes, as 6-branched compounds, hexakis (bromomethyl) benzene and N, N-dia Kill - Sodium dithiocarbamate (sodium N, N-dialkyl - dithiocarbamate) and the hexakis obtained by addition reaction in ethanol (N, N-dialkyl - dithiocarbamyl methyl) include a benzene. Here, the N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl group is not limited to the N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl group, but N, N- such as N, N-diphenyl-dithiocarbamylmethyl group. Although it may be a diaryl-dithiocarbamylmethyl group or the like, an N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl group substituted with an alkyl group having 2 to 18 carbon atoms such as an ethyl group is particularly preferable.
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。 The above iniferter is almost insoluble in polar solvents such as alcohol, but is easily soluble in nonpolar solvents. As this nonpolar solvent, hydrocarbons and halogenated hydrocarbons are suitable, and in particular, benzene, toluene, chloroform or methylene chloride, particularly toluene is preferred.
このイニファターに重合させる非イオン性モノマーとしては、この非イオン性モノマーの重合体が水溶液中において静電気的、疎水結合的又は立体的に干渉し合うことがないものであればどのようなモノマーでもよく、例えば、炭素数が１０以下、特に５〜８の非イオン性モノマーを挙げることができ、具体的には、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート及び２−メトキシエチル（メタ）アクリレート等を挙げることができる。特にエチル（メタ）アクリレート及び２−メトキシエチル（メタ）アクリレートは上記したようにポリマー鎖同士の干渉性が低いだけでなく、ポリマー側鎖が水和した後の排除体積が小さく、結果、各分岐鎖の運動自由度が高いので好ましいモノマーである。 The nonionic monomer to be polymerized to the iniferter may be any monomer as long as the polymer of the nonionic monomer does not interfere electrostatically, hydrophobically or sterically in an aqueous solution. Examples thereof include nonionic monomers having 10 or less carbon atoms, particularly 5 to 8, specifically, methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, 2-methoxyethyl (meth) acrylate, and the like. Can be mentioned. In particular, ethyl (meth) acrylate and 2-methoxyethyl (meth) acrylate not only have low interference between the polymer chains as described above, but also have a small excluded volume after hydration of the polymer side chain, resulting in each branching. It is a preferred monomer because of its high degree of freedom of chain movement.
これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。即ち、非イオン性ポリマーブロック鎖は、２種以上の非イオン性モノマーの共重合体であってもよい。 These nonionic monomers may be used individually by 1 type, and 2 or more types may be mixed and used for them. That is, the nonionic polymer block chain may be a copolymer of two or more nonionic monomers.
本発明では、上記イニファターに対し、まず、上記非イオン性モノマーを重合させて、非イオン性ホモポリマーを得、これにカチオン性ビニル系モノマーを重合させる。 In the present invention, first, the nonionic monomer is polymerized with respect to the iniferter to obtain a nonionic homopolymer, which is then polymerized with a cationic vinyl monomer.
イニファターと上記非イオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化炭化水素が好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。 In order to cause the iniferter to react with the nonionic monomer, a raw material solution containing the iniferter and the monomer is prepared, and a reaction product in which the monomer is bonded to the iniferter is generated by irradiating the material solution with light. As the solvent of this solution, alkanes, alkenes, aromatics, and halogenated hydrocarbons are preferable, and specific examples include benzene, toluene, chloroform, carbon tetrachloride, and methylene chloride. Among these, toluene or chloroform is preferable. is there.
このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。 The concentration of the monomer in the raw material solution is preferably 0.5M or more, for example, 0.5 to 2.5M. The concentration of the iniferter is preferably about 0.1 to 100 mM.
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。 The wavelength of the irradiated light is preferably 250 to 400 nm. The irradiation time of the light depends on the irradiation intensity, about 1 to 60 minutes are preferred, about 1 to 30 minutes at a low irradiation intensity of about 1μW / cm 2 ~10mW / cm 2 is particularly preferred.
この光照射により、反応液中に目的とするイニファターに対し非イオン性ポリマーよりなる分岐鎖が結合した分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなる非イオン性ホモポリマーを得る。 This light irradiation produces a branched polymer in which a branched chain composed of a nonionic polymer is bonded to the target iniferter in the reaction solution, so it can be purified as necessary to produce a nonionic polymer composed of a branched polymer. A homopolymer is obtained.
この非イオン性ポリマーブロック鎖よりなる分岐鎖の好ましい分子量は１００〜５００００であり、特に好ましい分子量は１００〜１００００であり、さらに好ましい分子量は１００〜５０００である。この非イオン性ポリマーブロック鎖は、核酸とは結合しないポリマーブロック鎖であるので、生分解、代謝、***の観点から、できるだけ短いほうが好ましい。 The preferred molecular weight of the branched chain composed of this nonionic polymer block chain is 100 to 50,000, the particularly preferred molecular weight is 100 to 10,000, and the more preferred molecular weight is 100 to 5,000. Since this nonionic polymer block chain is a polymer block chain that does not bind to nucleic acid, it is preferably as short as possible from the viewpoint of biodegradation, metabolism, and excretion.
なお、本明細書において、分子量とは、特記しないかぎり、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。 In the present specification, the molecular weight means the number average molecular weight in terms of polyethylene glycol by GPC (gel permeation chromatography) unless otherwise specified.
このようにして生成した非イオン性ホモポリマーに対し、カチオン性ビニル系モノマーを重合させて目的とする遺伝子導入剤を生成させる。 The nonionic homopolymer thus produced is polymerized with a cationic vinyl monomer to produce the desired gene introduction agent.
このカチオン性ビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい。これらのカチオン性ビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。 As this cationic vinyl monomer, vinyl monomers such as acrylic acid derivatives and styrene derivatives are suitable, and in particular, since they are excellent in hydrolysis resistance, 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide CH 2 ═CHCONHC 3 H 6 N (CH 3) 2, 2-N, N- dimethylaminoethyl methacrylate are preferred. These cationic vinyl monomers may be used alone or in combination of two or more.
カチオン性ビニル系モノマーを重合させるには、上記のように合成した非イオン性ホモポリマーをメタノール等の溶媒に溶解させ、これにカチオン性ビニル系モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における非イオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、カチオン性ビニル系モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。 In order to polymerize the cationic vinyl monomer, the nonionic homopolymer synthesized as described above is dissolved in a solvent such as methanol, mixed with the cationic vinyl monomer, and polymerized by irradiation with light. That's fine. The concentration of the nonionic homopolymer in the solution when starting the polymerization reaction is preferably about 0.01 to 10% by weight, and the concentration of the cationic vinyl monomer is preferably about 0.3 to 30% by weight. It is. The light irradiation conditions are preferably a light wavelength of 250 to 400 nm, an irradiation time of 1 to 150 minutes, and an irradiation intensity of about 100 to 10,000 μW / cm 2 .
前記カチオン性ポリマーブロック鎖の分子量は１，０００〜１００，０００程度、特に３，０００〜６０，０００程度が好ましい。 The molecular weight of the cationic polymer block chain is preferably about 1,000 to 100,000, particularly preferably about 3,000 to 60,000.
カチオン性ポリマーブロック鎖の分子量が上記下限未満であると、カチオン性ポリマーブロックによる核酸の吸着効果を十分に得ることができず、分子量が上記上限を超えると代謝、***など生体内使用での重要な要件特性を損なうだけでなく、細胞障害性の面で好ましくない。 If the molecular weight of the cationic polymer block chain is less than the above lower limit, the effect of adsorbing nucleic acid by the cationic polymer block cannot be sufficiently obtained. If the molecular weight exceeds the above upper limit, it is important for in vivo use such as metabolism and excretion. In addition to impairing the required properties, it is not preferable in terms of cytotoxicity.
このようにして得られる本発明の遺伝子導入剤（ベクター）は、分岐鎖のカチオン性ポリマーブロック鎖が核酸を捕捉して包囲し、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。 The gene transfer agent (vector) of the present invention thus obtained has a branched cationic polymer block chain that captures and surrounds the nucleic acid, and suppresses inactivation and degradation of the nucleic acid by enzymes in the living body. it can.
本発明の核酸複合体は、上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。本発明の遺伝子導入剤が、上述の如く、運動自由度が大きいカチオン性ポリマーブロック鎖を有し、ポリアニオンである核酸を密に包蔵することができるため、本発明の核酸複合体の粒径は非常に小さいものとなる。このように粒径の小さい本発明の核酸複合体は、細胞膜を透過しやすいため、遺伝子導入活性が高いものとなる。また、核酸複合体同士の凝集が抑制されるため、経時的安定性が向上する。さらに、生体内において異物として認識されにくく、また、末梢血管での閉塞梗塞を起こしにくい。なお、本発明の核酸複合体は、従来の核酸複合体と比べ、カチオン性（陽電荷）を帯びたカチオン性ポリマーブロックを短くすることができるため、細胞傷害性も低下すると考えられる。 The nucleic acid complex of the present invention is obtained by combining the gene introduction agent and a nucleic acid. As described above, since the gene introduction agent of the present invention has a cationic polymer block chain having a high degree of freedom of movement and can tightly enclose a nucleic acid that is a polyanion, the particle size of the nucleic acid complex of the present invention is It will be very small. Thus, since the nucleic acid complex of the present invention having a small particle size easily penetrates the cell membrane, it has a high gene transfer activity. In addition, since aggregation of the nucleic acid complexes is suppressed, stability over time is improved. Furthermore, it is difficult to be recognized as a foreign substance in the living body, and obstructive infarction in peripheral blood vessels is difficult to occur. In addition, since the nucleic acid complex of the present invention can shorten the cationic polymer block having a cationic property (positive charge) as compared with the conventional nucleic acid complex, it is considered that the cytotoxicity is also reduced.
本発明の遺伝子導入剤（ベクター）と核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してベクターを過剰量添加し、ベクターを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。 In order to combine the gene introduction agent (vector) of the present invention with the nucleic acid, the nucleic acid may be added to the dispersion at a concentration of about 1 to 1000 μg / mL at room temperature and mixed. It is preferable to add an excessive amount of the vector to the nucleic acid so that the vector is complexed with the nucleic acid in a saturated state as a nucleic acid-containing complex.
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。 Preferred examples of the nucleic acid include herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV1-TK gene), p53 tumor suppressor gene, BRCA1 tumor suppressor gene and cytokine gene such as TNF-α gene, IL-2 gene, IL-4 gene, HLA- Cytokine genes such as B7 / IL-2 gene, HLA-B7 / B2M gene, IL-7 gene, GM-CSF gene, IFN-γ gene and IL-12 gene, and gp-100, MART-1 and MAGE-1 These cancer antigen peptide genes can be used for cancer treatment.
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡの導入、遺伝子発現のみならず、細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。 In addition, cytokine genes such as VEGF gene, HGF gene and FGF gene, c-myc antisense, c-myb antisense, cdc2 kinase antisense, PCNA antisense, E2F decoy and p21 (sdi-1) gene are used for vascular treatment. Available. Further, not only DNA introduction and gene expression as described above, but also RNA interference that destroys intracellular mRNA can be carried out by introduction of siRNA. Such a series of genes is well known to those skilled in the art.
核酸含有複合体の粒径は５０〜２００ｎｍ程度、特に５０〜１７０ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。 The particle size of the nucleic acid-containing complex is preferably about 50 to 200 nm, particularly about 50 to 170 nm. If it is smaller than this, there is a possibility that the action of the enzyme may reach the nucleic acid inside the nucleic acid-containing complex, or it may be filtered out by the kidney. Moreover, when larger than this, there exists a possibility that it may become difficult to introduce | transduce into a cell.
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドン及びターミネーター領域が連続的に配列されている。 The nucleic acid is used in such a form that when introduced into a cell, the function can be expressed in the cell. For example, in the case of DNA, the DNA is used as a plasmid in which the DNA is placed so that the DNA is transcribed in the introduced cell and functionally expressed through production of the polypeptide encoded thereby. Preferably, a promoter region, a start codon, DNA encoding a protein having a desired function, a stop codon, and a terminator region are sequentially arranged.
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。 If desired, two or more nucleic acids can be included in one plasmid.
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。 In the present invention, “cells” that are desirable as a target for introduction of nucleic acids are those in which functional expression of the nucleic acids is desired. Examples thereof include cardiomyocytes, smooth muscle cells, fibroblasts, skeletal muscle cells, vascular endothelial cells, bone marrow cells, bone cells, blood cell stem cells, blood cell cells and the like. In addition, monocytes, dendritic cells, macrophages, histocytes, Kupffer cells, osteoclasts, synovial A cells, microglia, Langerhans cells, epithelioid cells, multinucleated giant cells, etc., gastrointestinal epithelial cells / tubule epithelium Such as cells.
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。 The nucleic acid-containing complex using the vector of the present invention can be administered to a living body by any method.
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。 As the administration method, intravenous or intraarterial injection is particularly preferable, but intramuscular, adipose tissue, subcutaneous, intradermal, intralymphatic, intralymphatic, body cavity (pericardial cavity, thoracic cavity, abdominal cavity, cerebrospinal cavity) Etc.) In addition to administration into the bone marrow, administration into the diseased tissue is also possible.
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。 The pharmaceutical comprising this nucleic acid-containing complex as an active ingredient is further a pharmaceutically acceptable carrier (osmotic pressure regulator, stabilizer, preservative, solubilizer, pH adjuster, thickener, etc.) as necessary. It is possible to mix with. Any known carrier can be used.
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。 Moreover, the medicine containing this nucleic acid-containing complex as an active ingredient also includes those containing two or more nucleic acid-containing complexes with different types of nucleic acids. Such a medicine having a plurality of therapeutic purposes is particularly useful in the field of diversifying gene therapy.
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法及び治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。 As for the dosage, the dosage administered to animals, particularly humans, varies depending on various factors such as the target nucleic acid, the administration method and the specific site to be treated. However, the dosage should be sufficient to produce a therapeutic response.
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。 This nucleic acid-containing complex is preferably applied to gene therapy. Applicable diseases vary depending on the type of nucleic acid included in the complex, but in addition to diseases in the cardiovascular region that cause lesions such as peripheral arterial disease, coronary artery disease, restenosis after arterial dilation, cancer (malignant Melanoma, brain tumor, metastatic malignant tumor, breast cancer, etc.), infectious diseases (HIV, etc.), single genetic diseases (cystic fibrosis, chronic granulomas, α1-antitrypsin deficiency, Gaucher disease, etc.) .
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。 Further, an aqueous solution of the gene introduction agent combined with the nucleic acid is attached to a substrate by coating or the like, and dried as necessary, thereby forming a polymer coating or the like carrying the nucleic acid.
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。 When the nucleic acid complex gene introduction agent is attached to a substrate, the substrate is preferably a sheet. The thickness of the sheet-like substrate is preferably about 0.05 to 10 mm, and the size of the sheet surface is 1 to 20 mm on one side and 1 to 20 mm on the other side in the case of a square, In the case of an ellipse, the diameter is preferably about 1 to 20 mm. As a material for the base material, a synthetic resin such as polyolefin, polystyrene, polyester, polyamide, polyurethane, silicone resin, or fluororesin is suitable. This substrate may be porous.
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。 The adhesion amount of the nucleic acid complex gene introduction agent to the substrate is preferably about 0.001 to 10 mg per 1 cm 2 of the substrate surface.
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。 A gene transfer material comprising a substrate carrying a nucleic acid complex gene transfer agent is placed on a sheet-like substrate so as to surround a subcutaneous tissue, a myocardial tissue, a diseased tissue, or a diseased blood vessel, or is applied to a film of a covered stent. Therefore, it is used in such a manner that it is placed in the living body or is attached to the outer surface of the living body using an adhesive tape.
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and comparative examples. However, the present invention is not limited to the following examples unless it exceeds the gist.
＜実施例１＞
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
<Example 1>
i) Synthesis of Iniferter According to the following reaction formula, 1,2,4,5-tetrakis (N, N diethyldithiocarbamylmethyl) benzene as an iniferter was synthesized as follows.
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、熱濾過後、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。 5.0 g of 1,2,4,5-tetrakis (bromomethylbenzene) and 34.0 g of sodium N, N-diethyldithiocarbamate were added to 100 mL of ethanol and stirred at room temperature for 4 days under light shielding. The precipitate was filtered, poured into 3 liters of methanol, stirred for 30 minutes and filtered. This operation was repeated a total of 4 times. After the precipitate was dissolved in 200 mL of toluene, 100 mL of methanol was added and heated to 50 ° C., filtered hot, stored in a refrigerator for 15 hours for recrystallization, and the crystals were separated by filtration and washed with a large amount of methanol. . The crystals were dried at room temperature under reduced pressure to obtain white needle-like crystals of 1,2,4,5-tetrakis (N, N-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene (yield 90%). High-performance liquid chromatography confirmed that the raw material peak disappeared and the purified product was a single substance.
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。 The measurement result of 1 H NMR (in CDCl 3 ) is δ1.26-1.31 ppm (t, 24H, CH 2 CH 3 ), δ 3.69-3.77 ppm (q, 8H, N (CH 2 CH 3 ) 2 ), Δ 3.99-4.07 ppm (q, 8H, N (CH 2 CH 3 ) 2 ), δ 4.57 ppm (s, 8H, Ar—CH 2 ), δ 7.49 ppm (s, 2H, Ar—H) It became.
ii) ４分岐型スター型非イオン性ホモポリマーの合成
エチルアクリレートを非イオン性モノマーとして用い、以下の反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−アクリル酸エチル−メチル］ベンゼンの合成を行った。
ii) Synthesis of 4-branched star type nonionic homopolymer 1,2,4,5-tetrakis [(N, N-diethyldithiocarbamyl) according to the following reaction formula using ethyl acrylate as a nonionic monomer -Poly-ethyl acrylate-methyl] benzene was synthesized.
即ち、上記ｉ）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン１８２．４ｍｇを３０ｍＬのトルエンへ溶解し、エチルアクリレート６．０グラムを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。この液を、３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量は２Ｌ／分）で１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を１０分間照射した。 That is, 182.4 mg of 1,2,4,5-tetrakis (N, N-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene synthesized by i) above was dissolved in 30 mL of toluene, and 6.0 g of ethyl acrylate was added and mixed. The total amount was adjusted to 50 mL with toluene. The solution was purged with high-purity nitrogen gas (G1 grade, flow rate 2 L / min) for 10 minutes with vigorous stirring in a 3 mm thick soft glass cell, and then a 300 W short arc xenon lamp (manufactured by Asahi Spectroscopic Co., Ltd., MAX-301). ) Was irradiated with mixed ultraviolet rays having a wavelength of 250 nm to 400 nm for 10 minutes.
照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に真空乾燥させて４分岐型スター型非イオン性ホモポリマーを得た（重合率１８％）。
このものの分子量はＧＰＣにより５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５３）と測定された。
The irradiation intensity was adjusted to 2.5 mW / cm 2 by attaching UVD-C405 (detection wavelength range of 320 nm to 470 nm) to UIT-150 manufactured by USHIO. The polymerization solution is concentrated with an evaporator, the polymer is reprecipitated with diethyl ether, purified by repeated reprecipitation three times with a chloroform / diethyl ether system, and the ether is evaporated, followed by vacuum drying to give a 4-branch star type An ionic homopolymer was obtained (polymerization rate 18%).
The molecular weight of this product was measured to be 5,000 (Mw / Mn = 1.53) by GPC.
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍと略記する場合がある。）をカチオン性ビニル系モノマーとして用い、下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−ポリ（アクリル酸エチル）−メチル］ベンゼンの合成を行った。
即ち、上記ii）で合成した非イオン性ホモポリマーの１．０ｇ及び３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド７．９グラムを約３０ｍＬのトルエンへ溶解した。 That is, 1.0 g of the nonionic homopolymer synthesized in the above ii) and 7.9 grams of 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide were dissolved in about 30 mL of toluene.
この液をガラス容器中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量は２Ｌ／分）で１０分間パージした後に、光照射時間を４０分とした以外はii）と同様の手法で光照射による重合を行い、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行い、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型非イオン性／カチオン性ブロック共重合体を得た（重合率３２％）。
このものの分子量はＧＰＣにより６３，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．８７）と測定された。
This solution was purged with high purity nitrogen gas (G1 grade, flow rate 2 L / min) for 10 minutes while stirring vigorously in a glass container, and then light was irradiated in the same manner as in ii) except that the light irradiation time was 40 minutes. Polymerization by irradiation, reprecipitation treatment with chloroform / diethyl ether system three times, evaporation of ether, dissolution in a small amount of water, filtration through a 0.2 μm filter, lyophilization, and four-branched star Type nonionic / cationic block copolymer was obtained (polymerization rate 32%).
The molecular weight of this product was measured to be 63,000 (Mw / Mn = 1.87) by GPC.
以上より、ベンゼンを中心核としてエチルアクリレートのポリマーブロック（分子量５，０００）と３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロック（分子量５８，０００）とが導入された４分岐型スター型ブロックコポリマーが合成されたことが確認された。 As described above, a 4-branched star block in which an ethyl acrylate polymer block (molecular weight 5,000) and a 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide polymer block (molecular weight 58,000) are introduced with benzene as the central core. It was confirmed that the copolymer was synthesized.
＜比較例１＞
iv） 実施例１のii）において、モノマーとしてエチルアクリレートの代わりにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを用いたこと以外はすべて実施例１のii)及びiii）のスキームに準拠して合成を行った。結果、ベンゼンを中心核として放射状にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドのポリマーブロック（分子量４，６００）と３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロック（分子量５７，０００）とが導入された４分岐型スター型ブロックコポリマーが合成されたことが確認された。
<Comparative Example 1>
iv) Synthesis was performed in accordance with the scheme of ii) and iii) of Example 1 except that N, N-dimethylacrylamide was used as a monomer instead of ethyl acrylate in Example ii). As a result, N, N-dimethylacrylamide polymer block (molecular weight 4,600) and 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide polymer block (molecular weight 57,000) were introduced radially with benzene as the core 4 It was confirmed that a branched star block copolymer was synthesized.
＜比較例２＞
v） ４分岐型スター型カチオン性ホモポリマーの合成
実施例１のｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを３０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド１５．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。この液をガラス容器中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量は２Ｌ／分）で１０分間パージした後に、光照射時間を４０分としたこと以外は実施例１のii）と同様の手法で光照射による重合を行い、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行い、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型カチオン性ホモポリマーを得た（重合率３４％）。
このものの分子量はＧＰＣにより６８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３１）と測定された。
<Comparative Example 2>
v) Synthesis of 4-branched star-type cationic homopolymer 45.6 mg of 1,2,4,5-tetrasakis (N, N-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene synthesized according to i) of Example 1 was added to 30 mL of toluene. Then, 15.0 g of 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide was added and mixed, and the total amount was adjusted to 50 mL with toluene. Example ii) of Example 1 except that the liquid irradiation time was 40 minutes after purging with high purity nitrogen gas (G1 grade, flow rate 2 L / min) while vigorously stirring this liquid in a glass container. Polymerization by light irradiation is performed in the same manner, reprecipitation treatment is performed three times in a chloroform / diethyl ether system, ether is evaporated, dissolved in a small amount of water, filtered through a 0.2 μm filter, and freeze-dried. Thus, a 4-branched star-type cationic homopolymer was obtained (polymerization rate: 34%).
The molecular weight of this product was measured by GPC as 68,000 (Mw / Mn = 1.31).
＜遺伝子導入活性＞
インビトロでの細胞遺伝子導入実験を行った。細胞にはＣＯＳ-１細胞を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。いずれも２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
<Gene transfer activity>
In vitro cellular gene transfer experiments were performed. COS-1 cells were used as cells, and pGL3 control vector was used as DNA. All were seeded in a 24 Well culture dish, and gene transfer was performed 24 hours after the culture.
上記iii）〜ｖ）において合成した４分岐型スター型ブロックコポリマー又はホモポリマー（実施例１及び比較例１，２）を、それぞれ遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数は，ＧＰＣによる非イオン性ブロック及びカチオン性ブロックの各分子量或いはカチオン性ホモポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。 The 4-branched star block copolymer or homopolymer (Example 1 and Comparative Examples 1 and 2) synthesized in the above iii) to v) was used as a gene introduction agent. The number of positive charges per unit weight in the gene introduction agent was determined by calculating from the molecular weight 156 of each nonionic block and cationic block by GPC or the monomer unit molecular weight of the cationic homopolymer. The number of negative charges per unit weight in DNA was calculated from the number of base pairs according to the sequence map and the average molecular weight 660 of nucleobases.
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。 This gene introduction agent was incubated with DNA in 150 μL of OPTI-MEM for 30 minutes. The mixing ratio was adjusted so that the number of charges was 20 times the number of negative charges, and the solution was adjusted so that 0.5 μg of DNA was administered to each well, and added to the cultured cells. Forty-eight hours after transfection, gene transfer activity was evaluated by luciferase assay (Promega, assay kit reagent). Correction was performed at protein concentration, and protein quantification was performed with Bradford reagent from BioRad. The results are shown in FIG.
＜核酸複合体（ポリプレックス微粒子）の動態解析＞
上記の通り調製した各遺伝子導入剤とＤＮＡの核酸複合体（ポリプレックス微粒子）の粒子径及びその経時的安定性を測定し、結果を図２に示した。
<Dynamic analysis of nucleic acid complex (polyplex microparticle)>
The particle diameter and the temporal stability of each gene transfer agent-DNA nucleic acid complex (polyplex microparticle) prepared as described above were measured, and the results are shown in FIG.
図２より、本発明の遺伝子導入剤（実施例１）と核酸により形成されるポリプレックス微粒子は、比較例１，２のものに比べて粒子径が小さいこと、及び経時安定性に優れることが分かった。 From FIG. 2, it can be seen that the polyplex microparticles formed by the gene introduction agent of the present invention (Example 1) and the nucleic acid have a smaller particle size and superior stability over time than those of Comparative Examples 1 and 2. I understood.
Claims (10)
該カチオン性分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させて非イオン性ポリマーブロック鎖を形成させた後、さらに、カチオン性ビニル系モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロック鎖を形成させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。 A gene transfer agent having a cationic branched polymer having a plurality of cationic branched chains extending from an aromatic ring as a core,
The cationic branched polymer uses a compound having three or more N, N-disubstituted-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule as an iniferter, and a nonionic monomer is photoirradiated by living polymerization to produce a nonionic ion. A gene transfer agent, which is a branched polymer obtained by forming a cationic polymer block chain and then forming a cationic polymer block chain by subjecting a cationic vinyl-based monomer to light irradiation living polymerization.
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