JP2008195687A - Nucleic acid complex - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a nucleic acid complex with gene transfer activity having a temperature-responding polymer block which is hydrophilic at temperatures lower than a prescribed temperature (T) lower than the temperature of a living body and is hydrophobic at temperatures higher than the prescribed temperature (T). <P>SOLUTION: This nucleic acid complex uses a gene transfer agent comprising a branched chain-having polymer material having a temperature-responding polymer block which is hydrophilic at temperatures lower than a prescribed temperature (T) lower than the temperature of a living body and is hydrophobic at temperatures higher than the prescribed temperature (T). The polymer material is obtained by living-polymerizing a vinylic monomer in the presence of an iniferter comprising a compound having three or more N,N-dialkyl-dithiocarbamoylmethyl molecular groups in the same molecule under irradiation of light to produce a homopolymer comprising the branched polymer and then block-polymerizing N-isopropylacrylamide to the obtained homopolymer. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、遺伝子導入剤を用いた核酸複合体に関する。   The present invention relates to a nucleic acid complex using a gene introduction agent.

安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
本出願人らは合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
これに対して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００に代表されるカチオン性脂質ベクターはＤＮＡと形成させたリポソーム粒子表面の脂質が疎水性相互作用より細胞の細胞膜へ溶解又は融合するように膜を透過することで高い発現性を発揮している。
近年、合成高分子ベクターでもカチオン性ポリマー鎖へコレステロールなどの疎水性のセグメントを導入することで疎水性相互作用を付与する検討が盛んに行われている。しかしながら、カチオン性ポリマー鎖へコレステロールなどの疎水性物質を導入した合成高分子は水溶液中では親水性のカチオン性ポリマー鎖が外周側へ多く、疎水性物質が内殻へ多く存在するミセル類似構造またはミセル構造を形成すると考えられ、従って、ＤＮＡと形成させた複合体においてもカチオン性ブロックが優先的に水溶液側へ配向し、ポリイオン複合体の疎水性相互作用は非常に効率が悪くなるものと考えられる。
ＷＯ２００４／０９２３８８ Synthetic polymer vectors and cationic lipid vectors have been researched and developed as gene transfer techniques to replace virus vectors that have problems with safety, quality stability, and production costs.
Applicants have a synthetic polymer vector with a branched structure in which a cationic polymer chain radially extends with an aromatic ring such as benzene as a nucleus, condensing DNA at high density to form small nucleic acid complex microparticles. Invented that gene can be introduced into cells well (Patent Document 1 below). The mechanism by which the composite microparticles permeate the cell membrane is largely dependent on the action that the positive charge due to the cationic polymer chain electrostatically binds to the negative charge on the cell membrane surface and is taken into the cell by endocytosis. Conceivable.
In contrast, the cationic lipid vector represented by Lipofectamine 2000 has high expression by permeating the membrane so that the lipid on the surface of the liposome particles formed with DNA dissolves or fuses to the cell membrane of the cell by hydrophobic interaction. Is demonstrating.
In recent years, studies on imparting hydrophobic interaction by introducing a hydrophobic segment such as cholesterol into a cationic polymer chain have been actively conducted even in synthetic polymer vectors. However, a synthetic polymer in which a hydrophobic substance such as cholesterol is introduced into a cationic polymer chain has a micelle-like structure in which an aqueous solution contains a large number of hydrophilic cationic polymer chains on the outer peripheral side and a large amount of hydrophobic substances in the inner shell. It is thought that a micelle structure is formed. Therefore, in the complex formed with DNA, the cationic block is preferentially oriented to the aqueous solution side, and the hydrophobic interaction of the polyion complex is considered to be very inefficient. It is done.
WO2004 / 092388

本発明は、上記従来の問題点を解消し、細胞膜との疎水性相互作用とカチオン性ブロックの静電作用の両方の作用を発現し、より効率よく細胞膜を透過することができる核酸複合体を提供することを目的とする。   The present invention eliminates the above-mentioned conventional problems, expresses both the hydrophobic interaction with the cell membrane and the electrostatic action of the cationic block, and provides a nucleic acid complex that can permeate the cell membrane more efficiently. The purpose is to provide.

本発明の核酸複合体は、芳香族環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤と核酸との微粒子状の複合体よりなる核酸複合体において、該ポリマー材料は、少なくとも、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有しており、前記微粒子の表面に、核酸と、カチオン性ポリマーブロックと、温度感応性ポリマーブロックとが存在していることを特徴とするものである。なお、本発明でいうポリマーとは、モノマーの２量体などのオリゴマーも包含するものとする。   The nucleic acid complex of the present invention is a nucleic acid complex comprising a fine particle complex of a gene introduction agent and a nucleic acid comprising a polymer material having a plurality of branched chains radially extending from an aromatic ring as a nucleus. The polymer material is at least a cationic polymer block and a temperature sensitive material that is hydrophilic at a temperature lower than a predetermined temperature (T) lower than a living body temperature and is hydrophobic at a temperature higher than the predetermined temperature (T). And a nucleic acid, a cationic polymer block, and a temperature-sensitive polymer block are present on the surface of the fine particles. The polymer referred to in the present invention includes oligomers such as monomer dimers.

前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることが好ましく、カチオン性モノマーと非イオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であっても良い。   The polymer material is preferably a block copolymer of a cationic monomer and N-isopropylacrylamide or a derivative thereof, and is a block copolymer of a cationic monomer, a nonionic monomer, and N-isopropylacrylamide or a derivative thereof. It may be.

このカチオン性ホモポリマーブロックの分子量は、2,000〜500,000が好ましく、非イオン性ポリマーブロックの分子量は2,000〜500,000が好ましい。   The molecular weight of the cationic homopolymer block is preferably 2,000 to 500,000, and the molecular weight of the nonionic polymer block is preferably 2,000 to 500,000.

このブロック共重合体の分子量は、3,000〜600,000であることが好ましい。   The molecular weight of this block copolymer is preferably 3,000 to 600,000.

前記所定温度（Ｔ）は、25〜35℃の間の温度であることが好ましい。   The predetermined temperature (T) is preferably a temperature between 25 and 35 ° C.

前記カチオン性ホモポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。   The cationic homopolymer is a branched polymer in which a compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl molecular groups in the same molecule is used as an iniferter, and a vinyl-based monomer is subjected to light irradiation living polymerization. Preferably there is.

このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。   The compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule has a benzene ring as a nucleus and three or more N, N-dialkyl-dithio as a branched chain in this nucleus. Those having a carbamylmethyl molecular group bonded thereto are preferred.

このビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。   The vinyl monomer is at least selected from the group consisting of 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide, 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylacrylamide, and methoxyethyl (meth) acrylate. One is preferred.

本発明の核酸複合体に用いられている遺伝子導入剤は、温度感応性ポリマーブロックを有しており、上記所定温度よりも低い温度では親水性であり、水溶性であるため、これを水に溶解させて核酸と複合させることができる。この遺伝子導入剤は、所定温度よりも高い温度になると疎水性となる。   The gene introduction agent used in the nucleic acid complex of the present invention has a temperature-sensitive polymer block, and is hydrophilic and water-soluble at a temperature lower than the predetermined temperature. It can be dissolved and complexed with the nucleic acid. This gene introduction agent becomes hydrophobic when the temperature is higher than a predetermined temperature.

本発明で用いられる遺伝子導入剤は、ベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造の合成高分子ベクターである。この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、ＤＮＡを高密度に凝縮することができる。この遺伝子導入剤と核酸とを複合させた本発明の核酸複合体の微粒子の表面にはＤＮＡ、カチオン性ポリマー鎖ブロック、温度官能性ポリマー鎖ブロックガランダムに配向している。この核酸複合体を使用して細胞への遺伝子導入する際は、培養条件下で核酸複合体微粒子の表面に露出している温度官能性ブロック鎖が疎水性ブロックへ相転移し、細胞膜との疎水性相互作用とカチオン性ブロックの静電作用の両方の作用を発現し、効率よく細胞膜を透過することができる。   The gene introduction agent used in the present invention is a synthetic polymer vector having a branched structure in which a cationic polymer chain radially extends with an aromatic ring such as benzene as a nucleus. This gene introduction agent can condense DNA with high density due to its structural advantage. On the surface of the fine particles of the nucleic acid complex of the present invention in which the gene introduction agent and the nucleic acid are complexed, DNA, a cationic polymer chain block, and a temperature functional polymer chain block are randomly aligned. When this nucleic acid complex is used to introduce a gene into a cell, the temperature-functional block chain exposed on the surface of the nucleic acid complex microparticles under the culture condition undergoes a phase transition to a hydrophobic block, resulting in hydrophobicity with the cell membrane. It exhibits both the sex interaction and the electrostatic action of the cationic block, and can efficiently penetrate the cell membrane.

本発明で用いる遺伝子導入剤は、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有するポリマー材料よりなる。   The gene introduction agent used in the present invention is hydrophilic at a temperature lower than a predetermined temperature (T) lower than the living body temperature and is hydrophobic at a temperature higher than the predetermined temperature (T). It consists of a polymer material having a temperature sensitive polymer block.

上記のポリマー材料としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させ、さらに温度感応性ポリマーブロックを導入した分岐型重合体が好適である。   As the above polymer material, a compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl molecular groups in the same molecule is used as an iniferter, and a vinyl monomer is irradiated with the light by living polymerization, and further a temperature sensitive polymer. A branched polymer into which a block is introduced is preferred.

なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。   In this specification, the iniferter is a polymerization initiator that generates radicals upon irradiation with light, a function as a chain transfer agent, a function that bonds with the growth terminal to stop the growth, and a polymerization when light irradiation stops. It is a molecule that functions as a polymerization initiator / termination agent for stopping.

Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。   As a compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl molecular groups in the same molecule, three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl molecular groups are bonded as a branched chain to the benzene ring. These are preferred, and specific examples are as follows. That is, as a 3-branched chain, 1,3,5-tri (bromomethyl) benzene and sodium N, N-dithiocarbamate (sodium N, N-dithiocarbamate) can be obtained by addition reaction in ethanol. , 3,5-tri (N, N-dithiocarbamylmethyl) benzene, and four branched chains include 1,2,4,5-tetrakis (bromomethyl) benzene and sodium N, N-dithiocarbamylate ( 1,2,4,5-tetrakis (N, N-dithiocarbamylmethyl) benzene obtained by addition reaction with sodium N, N-dithiocarbamate) in ethanol. Hexakis (N, N-dithio) obtained by addition reaction of bromomethyl) benzene and sodium N, N-dithiocarbamate in ethanol Rubamirumechiru) is a benzene.

上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。   The above iniferter is almost insoluble in polar solvents such as alcohol, but is easily soluble in nonpolar solvents. The nonpolar solvent is preferably a hydrocarbon, an alkyl halide or an alkylene halide, and particularly preferably benzene, toluene, chloroform or methylene chloride, particularly toluene.

このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種とりわけ３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＣ_３Ｈ_６Ｎ（ＣＨ_３）_２が好ましい。 As the monomer to be polymerized to this iniferter, vinyl monomers such as vinyl monomers, acrylic acid derivatives, styrene derivatives and the like are particularly suitable. Specifically, 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide, 2-N, N - dimethylaminoethyl methacrylate, N, N- dimethylacrylamide, and at least one especially 3-N is selected from the group consisting of methoxyethyl (meth) acrylate, N- dimethylaminopropyl acrylamide _{CH 2 = CHCONHC 3 H 6 N} ( CH ₃ ) ₂ is preferred.

イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。   In order to cause the iniferter to react with the monomer, a raw material solution containing the iniferter and the monomer is prepared, and a reaction product in which the monomer is bonded to the iniferter is generated by irradiating the material solution with light.

このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ％以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。   The concentration of this monomer in the raw material solution is preferably 0.5 M% or more, for example, 0.5 M to 2.5 M.

イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。   The concentration of the iniferter is preferably about 0.1 to 100 mM.

照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ^２〜１０ｍＷ／ｃｍ^２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。 The wavelength of the irradiated light is preferably 300 to 400 nm. The irradiation time of the light depends on the irradiation intensity, about 1 to 60 minutes are preferred, about 1 to 30 minutes at a low irradiation intensity of about 1μW ^/ cm ² ~10mW ^/ cm 2 is particularly preferred.

なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。   In addition, you may perform a 2nd light irradiation process further after this light irradiation process (1st light irradiation process). That is, the solution containing the reaction product is diluted with an alcohol, preferably an alcohol solution of the above monomer. As the alcohol, methanol or ethanol, particularly methanol is preferable. The monomer concentration in the alcohol solution is preferably about 100 mM to 5 M as the final concentration.

上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。   It is preferable to add 5 to 500 parts by volume of the alcohol solution to 1 part by volume of the reaction product-containing liquid from the first light irradiation step.

このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。   The diluted solution thus diluted with the alcohol solution is subjected to the second light irradiation step, and the monomer is further polymerized with respect to the reaction product. In this case, any irradiation light source may be used as long as it includes light having a wavelength of 240 to 400 nm. For example, a low-pressure mercury lamp or a high-pressure mercury lamp can be used. The light irradiation time is preferably about 10 minutes to 120 minutes.

この光照射により、反応液中に分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得る。   By this light irradiation, a branched polymer is produced in the reaction solution, and thus a cationic homopolymer comprising the branched polymer is obtained by purification as necessary.

この分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。   The molecular weight of this branched polymer depends on the number of branched chains, but is preferably 2,000 to 500,000, particularly 2,000 to 150,000, and particularly 2,000 to 100,000.

本発明では、まず分岐型重合体よりなるカチオン性ポリマーに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入し、目的とするポリマー材料とするのが好ましい。ただし、先に温度感応性ポリマーブロックを有した分岐型重合体を形成し、その後、カチオン性ポリマーブロックを導入するようにしてもよい。   In the present invention, it is preferable to first block-polymerize N-isopropylacrylamide or a derivative thereof to a cationic polymer made of a branched polymer to introduce a temperature-sensitive polymer block to obtain a target polymer material. However, a branched polymer having a temperature sensitive polymer block may be formed first, and then a cationic polymer block may be introduced.

いずれの場合でも、このＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。なお、これにより上記ポリマー材料が上記温度応答性を具備するようになる。   In any case, the polymer chain of N-isopropylacrylamide or a derivative thereof has a temperature dependency that becomes hydrophilic at a low temperature and hydrophobic at a high temperature. As a result, the polymer material has the temperature responsiveness.

カチオン性ポリマーブロックにＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型重合体をメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ−イソプロピルアクリルアミドを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型ポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ^２程度が好適である。 In order to block copolymerize N-isopropylacrylamide or a derivative thereof with a cationic polymer block, the branched polymer synthesized as described above is dissolved in a solvent such as methanol, and N-isopropylacrylamide is mixed therein. What is necessary is just to superpose | polymerize by irradiating light. The concentration of the branched polymer in the solution at the start of this polymerization reaction is preferably about 0.01 to 10% by weight, and the concentration of N-isopropylacrylamide is preferably about 0.3 to 30% by weight. The light irradiation conditions are preferably a light wavelength of 250 to 400 nm, an irradiation time of 1 to 150 minutes, and an irradiation intensity of about 100 to 10,000 μW / cm ² .

本発明の別の一態様では、モノマーとして、カチオン性モノマーと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体と、非イオン性モノマーとを用いる。イニファターに対する重合の順序は、任意である。即ち、１つの分岐鎖を構成するカチオン性ブロック、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドブロック又はその誘導体、非イオン性ポリマーブロックの配列順序は任意である。   In another embodiment of the present invention, as the monomer, a cationic monomer, N-isopropylacrylamide or a derivative thereof, and a nonionic monomer are used. The order of polymerization with respect to the iniferter is arbitrary. That is, the order of arrangement of the cationic block, N-isopropylacrylamide block or derivative thereof, and nonionic polymer block constituting one branched chain is arbitrary.

非イオン性モノマーとしては、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。   As the nonionic monomer, polyethylene glycol (meth) acrylate, polyethylene glycol alkyl ester (meth) acrylate, polyvinylpyrrolidone, or the like can be used.

このブロック共重合体（ポリマー材料）の分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。   The molecular weight of the block copolymer (polymer material) is preferably 3,000 to 600,000, particularly preferably 3,000 to 150,000.

このポリマー材料よりなる遺伝子導入剤中の温度感応性ポリマーブロックは、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。   The temperature sensitive polymer block in the gene transfer agent made of this polymer material is hydrophobic at a temperature higher than about 30 ° C. and hydrophilic at a temperature lower than about 30 ° C.

従って、約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有することになる。   Therefore, at a temperature higher than about 30 ° C., the gene introduction agent combined with the nucleic acid has a hydrophobic portion made of a temperature-sensitive nucleic acid.

このようにして生成した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。   The gene introduction agent (vector) generated in this way surrounds the nucleic acid as a nucleic acid-containing complex, whereby the inactivation and degradation of the nucleic acid by the enzyme in the living body can be suppressed.

上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、３０℃よりも低温度下において、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の水溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。   In order to combine the gene introduction agent and the nucleic acid, the nucleic acid may be added to and mixed with an aqueous solution having a concentration of about 1 to 1000 μg / mL of the gene introduction agent at a temperature lower than 30 ° C. It is preferable that an excessive amount of a gene introduction agent is added to the nucleic acid, and the cationic polymer in the gene introduction agent is complexed as a nucleic acid-containing complex in a saturated state with respect to the nucleic acid.

核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。   Preferred examples of the nucleic acid include herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSV1-TK gene), p53 tumor suppressor gene, BRCA1 tumor suppressor gene and cytokine gene such as TNF-α gene, IL-2 gene, IL-4 gene, HLA- Cytokine genes such as B7 / IL-2 gene, HLA-B7 / B2M gene, IL-7 gene, GM-CSF gene, IFN-γ gene and IL-12 gene, and gp-100, MART-1 and MAGE-1 These cancer antigen peptide genes can be used for cancer treatment.

また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡなどの導入、遺伝子発現、リプレッシング以外にも細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。   In addition, cytokine genes such as VEGF gene, HGF gene and FGF gene, c-myc antisense, c-myb antisense, cdc2 kinase antisense, PCNA antisense, E2F decoy and p21 (sdi-1) gene are used for vascular treatment. Available. In addition to the introduction of DNA and the like as described above, gene expression, and repressing, RNA interference that destroys intracellular mRNA can also be performed by introduction of siRNA. Such a series of genes is well known to those skilled in the art.

核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えば、動的光散乱装置によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは生体内使用の際には、腎臓にて速やかに濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、微粒子同士が凝集して沈降したり、細胞に導入されにくくなるおそれがある。   The particle size of the nucleic acid complex is preferably about 50 to 400 nm. This particle size is measured by, for example, a dynamic light scattering apparatus. When the particle size is smaller than this, there is a possibility that the enzyme action may reach the nucleic acid inside the nucleic acid complex, or when it is used in vivo, it may be quickly filtered out by the kidney. Moreover, when larger than this, there exists a possibility that microparticles may aggregate and settle, or it may become difficult to introduce | transduce into a cell.

核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。   The nucleic acid is used in such a form that when introduced into a cell, the function can be expressed in the cell. For example, in the case of DNA, it is used as a plasmid in which the DNA is placed so that the DNA is transcribed in the introduced cell and functionally expressed through production of the polypeptide encoded thereby. Preferably, a promoter region, a start codon, DNA encoding a protein having a desired function, a stop codon, and a terminator region are sequentially arranged.

所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。   If desired, two or more nucleic acids can be included in one plasmid.

本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。   In the present invention, “cells” that are desirable as a target for introduction of nucleic acids are those in which functional expression of the nucleic acids is desired. Examples thereof include cardiomyocytes, smooth muscle cells, fibroblasts, skeletal muscle cells, vascular endothelial cells, bone marrow cells, bone cells, blood cell stem cells, blood cell cells and the like. In addition, monocytes, dendritic cells, macrophages, histocytes, Kupffer cells, osteoclasts, synovial A cells, microglia, Langerhans cells, epithelioid cells, multinucleated giant cells, etc., gastrointestinal epithelial cells / tubule epithelium Such as cells.

本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。   The nucleic acid complex of the present invention can be administered to a living body by any method besides being used for a culture test.

生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。   Intravenous or intraarterial injection is particularly preferred as a method of administration to a living body, but intramuscular, adipose tissue, subcutaneous, intradermal, intralymphatic, intralymphatic, body cavity (pericardial cavity, thoracic cavity, abdominal cavity, brain) In addition to administration into the spinal cavity and the like, it is also possible to administer directly into the diseased tissue.

この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。   The pharmaceutical comprising this nucleic acid complex as an active ingredient further comprises a pharmaceutically acceptable carrier (osmotic pressure regulator, stabilizer, preservative, solubilizer, pH adjuster, thickener, etc.) if necessary. It is possible to mix. Any known carrier can be used.

また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。   Moreover, the medicine which contains this nucleic acid complex as an active ingredient includes those containing two or more kinds of nucleic acid-containing complexes having different types of nucleic acids. Such a medicine having a plurality of therapeutic purposes is particularly useful in the field of diversifying gene therapy.

投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。   As for the dosage, the dosage administered to animals, particularly humans, varies depending on various factors such as the target nucleic acid, the method of administration, and the specific site to be treated. However, the dosage should be sufficient to produce a therapeutic response.

この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。   This nucleic acid complex is preferably applied to gene therapy. Applicable diseases vary depending on the type of nucleic acid included in the complex, but in addition to diseases in the cardiovascular region that cause lesions such as peripheral arterial disease, coronary artery disease, restenosis after arterial dilation, cancer (malignant Melanoma, brain tumor, metastatic malignant tumor, breast cancer, etc.), infection (HIV, etc.), single genetic disease (cystic fibrosis, chronic granulomas, α1-antitrypsin deficiency, Gaucher disease, etc.), etc. .

実施例１
［遺伝子導入剤の合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。 Example 1
[Synthesis of gene transfer agent]
i) Synthesis of iniferter According to the following reaction formula, 1,2,4,5-tetrakis (NN-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene was synthesized as follows.

１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。   1.0 g of 1,2,4,5-tetrakis (bromomethylbenzene) and 4.0 g of sodium N, N-diethyldithiocarbamate were added to 100 mL of ethanol and stirred at room temperature for 4 days under light shielding. The precipitate was filtered, dried under reduced pressure, dissolved in 200 mL of chloroform, and extracted and separated by adding 150 mL of water to remove sodium bromide. After repeating this operation three times, the chloroform layer was dried over magnesium sulfate for 24 hours, filtered, added with n-hexane, recrystallized and purified, and white 1,2,4,5-tetrasakis ( Acicular crystals of (N, N-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene were obtained (yield 90%). High-performance liquid chromatography confirmed that the raw material peak disappeared and the purified product was a single substance.

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ_３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ_２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。 The measurement result of ¹ H NMR (in CDCl ₃ ) is δ1.26-1.31 ppm (t, 24H, CH ₂ CH ₃ ), δ 3.69-3.77 ppm (q, 8H, N (CH ₂ CH ₃ ) ₂ ), Δ 3.99-4.07 ppm (q, 8H, N (CH ₂ CH ₃ ) ₂ ), δ 4.57 ppm (s, 8H, Ar—CH ₂ ), δ 7.49 ppm (s, 2H, Ar—H) It became.

ii)光重合による４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。 ii) Synthesis of cationic homopolymer comprising 4-branched star polymer by photopolymerization According to the following reaction formula, 1,2,4,5-tetrakis [(N, N-diethyldithiocarbamyl) ) A cationic homopolymer comprising poly (3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide) -methyl] benzene (hereinafter sometimes referred to as pDMAPAAm) was synthesized.

即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）１９．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、２００Ｗ高圧水銀灯で紫外光を３５分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ^２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させて精製し、少量の水へ溶解し、0.2μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）よりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより５０，０００と測定された。 That is, 45.6 mg of 1,2,4,5-tetrasakis (N, N-diethyldithiocarbamylmethyl) benzene synthesized by i) above was dissolved in 20 mL of toluene, and 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide was dissolved. (Hereafter, it may be described as 3-N, N-DMAPAAm.) 19.0 g was added and mixed, and the total amount was adjusted to 50 mL with toluene. After purging with high-purity nitrogen gas for 5 minutes with vigorous stirring in a quartz cell, ultraviolet light was irradiated with a 200 W high-pressure mercury lamp for 35 minutes. The irradiation intensity was adjusted to 1 mW / cm ² (250 nm) using an illuminometer (UVR-1, TOPCON, Tokyo, Japan). The polymerization solution is concentrated with an evaporator, purified by reprecipitation of the polymer with diethyl ether, dissolved in a small amount of water, filtered through a 0.2 μm filter, and lyophilized to obtain a 4-branched star homopolymer 1,2. , 4,5-tetrakis [(N, N-diethyldithiocarbamyl) poly (3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide) -methyl] benzene (pDMAPAAm) was obtained (40% polymerization rate). ). The molecular weight was determined to be 50,000 by GPC.

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ_３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ_２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ_２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。 The measurement result of ¹ H NMR (in D ₂ O) is as follows: δ1.5-1.8 ppm (br, 2H, —CH ₂ CH ₂ CH ₂ —), δ 2.1-2.2 ppm (br, 6H, N— _{CH 3), δ2.2-2.4ppm (br,} 2H, CH 2 -N), δ3.0-3.4ppm (br, 2H, NH-CH 2), δ7.4-7.8ppm (br, 1H, -NH-).

iii)カチオン性ホモポリマーへのＮ−イソプロピルアクリルアミドのブロック共重合によるポリマー材料（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭ）の合成
下記反応式に従い、次のようにして、テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭと記すことがある。）の合成を行った。 iii) Synthesis of polymer material (4-branched pDMAPAAm-b-pNIPAM) by block copolymerization of N-isopropylacrylamide with cationic homopolymer According to the following reaction formula, tetrakis [(N, N-diethyl) Synthesis of dithiocarbamyl) -poly (N-isopropylacrylamide) -block-poly (3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide) -methyl] benzene (hereinafter sometimes referred to as pDMAPAAm-b-pNIPAM). went.

即ち、上記ii）で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを１リットルフラスコへ移し、約８００ｍＬのジエイチルエーテルを投入して再沈殿させ、デカンテーションによりジエチルエーテルを除去した。ここへ約５０ｍＬのトルエンを加えポリマー成分を溶解し、再度ジエイチルエーテルを投入してポリマー成分を再沈殿した。この操作を３回繰り返した。ポリマー成分を約２０ｍＬのメタノールへ溶解し、ここへＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）０．５ｇを混合して全量をメタノールで６０ｍＬに調整した。ii）と同様の条件で光照射重合を行って、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍとポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ｐＮＩＰＡＭ）とのブロックポリマーよりなるポリマー材料ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭを得た。分子量はＧＰＣにより５５，０００と測定された。   That is, the 4-branched pDMAPAAm homopolymer synthesized in the above ii) was transferred to a 1 liter flask, re-precipitated by adding about 800 mL of diethyl ether, and diethyl ether was removed by decantation. About 50 mL of toluene was added thereto to dissolve the polymer component, and diethyl ether was added again to reprecipitate the polymer component. This operation was repeated three times. The polymer component was dissolved in about 20 mL of methanol, and 0.5 g of N-isopropylacrylamide (NIPAM) was mixed therein to adjust the total amount to 60 mL with methanol. Polymerization material pDMAPAAm-b-pNIPAM consisting of a block polymer of 4-branched pDMAPAAm and poly N-isopropylacrylamide (pNIPAM) after light irradiation polymerization under the same conditions as in ii) and purification in methanol / diethyl ether system Got. The molecular weight was determined to be 55,000 by GPC.

以上により、目的とする分岐スター型遺伝子導入剤が得られた。   As a result, the intended branched star gene introduction agent was obtained.

［遺伝子導入剤と核酸との複合体］
ＤＮＡとして、ホタルルシフェラーゼをコードするｐＧＬ３コントロールベクター（プロメガ社)を濃度０．０３３μｇ／μＬで調製した。
その９０μＬに１μｇ／μＬ濃度の上記遺伝子導入剤の生理食塩水溶液を６０μＬタッピングして混合した。粒子径を測定すると８０〜１２０ｎｍ、平均１１０ｎｍのイオン複合体が形成され、２０〜２３℃の温度下では約４８時間後にも安定に分散していた。これを３７℃の環境に置くと、昇温後の数時間は粒子径は９０〜１４０ｎｍ、平均１３０ｎｍで大きな変化はなかったが、２４時間後には４００ｎｍ程度まで増大し、微粒子同士の凝集が起こっていることが確認された。実際の遺伝子導入操作が数時間内で行われることを考慮すれば、３７℃昇温後の数時間だけ核酸複合体の粒子径が維持できれば問題ないと考えられる。
次に、水溶液をすべて３７℃に温調する以外はすべて前記と同様の手法で粒子径を測定した。３６０〜４００ｎｍのイオン複合体が形成されており、経時性に粒子径を増大し、沈降することが確認された。これは疎水性ブロックを包囲するようにミセルライクな微粒子が形成されるために粒子径が大きくなったものと推測される。
なお、上記の粒子径の測定には動的光散乱装置（ＨＯＲＩＢＡ社、ＬＢ−５００）を用いた。 [Composite of gene introduction agent and nucleic acid]
As DNA, a pGL3 control vector (Promega) encoding firefly luciferase was prepared at a concentration of 0.033 μg / μL.
60 μL of the physiological saline solution of the gene introduction agent having a concentration of 1 μg / μL was tapped and mixed with 90 μL. When the particle size was measured, an ionic complex of 80 to 120 nm and an average of 110 nm was formed, and was stably dispersed even after about 48 hours at a temperature of 20 to 23 ° C. When placed in an environment of 37 ° C., the particle size was 90 to 140 nm for several hours after the temperature rise, and the average was 130 nm, but there was no significant change, but after 24 hours, the particle size increased to about 400 nm, causing aggregation of fine particles. It was confirmed that Considering that the actual gene transfer operation is performed within several hours, it is considered that there is no problem if the particle diameter of the nucleic acid complex can be maintained for several hours after the temperature is raised at 37 ° C.
Next, the particle diameter was measured by the same method as described above except that the temperature of all aqueous solutions was adjusted to 37 ° C. An ion complex of 360 to 400 nm was formed, and it was confirmed that the particle diameter increased with time and settled. This is presumed that the particle diameter was increased because micelle-like fine particles were formed so as to surround the hydrophobic block.
In addition, the dynamic light-scattering apparatus (HORIBA company, LB-500) was used for the measurement of said particle diameter.

［遺伝子導入実験］
細胞として血管内皮細胞を使用した。
遺伝子導入剤の溶液の調製は２０〜２５℃の環境下で行った。ＤＮＡは濃度０．０３３μｇ／μＬのＴＥバッファー溶液とし、その９０μＬに１μｇ／μＬ濃度の上記遺伝子導入剤の生理食塩水溶液を６０μＬタッピングして混合した後に１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭを混合して室温で３０分間インキュベートして遺伝子導入剤溶液とした。２４穴培養フ゜レートへＣＯＳ−１細胞を６×１０^４個播種し、培養２４時間後にトランスフェクションを行った。
トランスフェクションは培養細胞から培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に遺伝子導入剤溶液を２００μＬづつ加えて３時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄後に完全培地を加えて４８時間培養して行った。
このトランスフェクション後の４８時間の培養後に遺伝子導入活性の評価をルシフェラーゼアッセイで行った結果を図１に示す。ホタルルシフェラーゼ活性はプロメガ社のアッセイキットを使用し、補正はタンパク濃度で行った。タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。 [Gene transfer experiment]
Vascular endothelial cells were used as the cells.
The solution of the gene introduction agent was prepared in an environment of 20 to 25 ° C. The DNA is prepared as a TE buffer solution with a concentration of 0.033 μg / μL, and 90 μL of the above-described gene transfer agent physiological saline solution with a concentration of 1 μg / μL is mixed with 60 μL, and then mixed with 150 μL of OPTI-MEM at room temperature. Incubated for a minute to obtain a gene transfer agent solution. 6 × 10 ⁴ COS-1 cells were seeded in a 24-well culture plate, and transfection was performed after 24 hours of culture.
Transfection was performed by removing the medium from the cultured cells, washing with PBS twice, adding 200 μL of the gene transfer agent solution, incubating for 3 hours, washing with PBS, adding complete medium, and culturing for 48 hours.
FIG. 1 shows the results of evaluating the gene transfer activity by luciferase assay after culturing for 48 hours after the transfection. For firefly luciferase activity, Promega's assay kit was used, and correction was performed at the protein concentration. Protein quantification was performed with Bradford reagent from BioRad.

＜比較例１＞
上記実施例１の合成プロセスii）を踏襲し、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを合成し、２リットルフラスコ内でジエチルエーテル再沈殿を７回繰り返し、その沈殿物の全量を２０ｍＬのメタノールへ溶解した。ここへスチレン１．０ｇを加え、メタノールで全量を５０ｍＬへ調整した。光照射重合の手法は上記合成プロセスiii）と同様に行い、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−Ｓｔブロックポリマーを合成した。分子量はＧＰＣにより５５，０００と測定された。これより親水性のカチオン性ポリマー鎖へ疎水性のスチレンブロックが導入されたことが確認された。
この４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂＳｔブロックポリマーとＤＮＡのイオン複合体の粒子径を実施例１と同様に測定した。温度環境は２０℃〜２５℃で行い、疎水性ブロックが導入されたことによる影響を確認した。３５０〜４５０ｎｍのイオン複合体が形成されており、数時間は安定に分散したが経時性に粒子径は増大し凝集現象が起こっていることが示唆された。
ベクターとして、この４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−Ｓｔブロックポリマーを使用したこと以外は実施例１に準拠して遺伝子導入実験を行った。その結果を図１に示す。 <Comparative Example 1>
Following the synthesis process ii) of Example 1 above, a 4-branched pDMAPAAm homopolymer was synthesized, and diethyl ether reprecipitation was repeated 7 times in a 2 liter flask, and the total amount of the precipitate was dissolved in 20 mL of methanol. Styrene 1.0g was added here and the whole quantity was adjusted to 50 mL with methanol. Photoirradiation polymerization was carried out in the same manner as in the above synthesis process iii), and a 4-branched pDMAPAAm-b-St block polymer was synthesized. The molecular weight was determined to be 55,000 by GPC. From this, it was confirmed that a hydrophobic styrene block was introduced into the hydrophilic cationic polymer chain.
The particle size of the ion complex of the 4-branched pDMAPAAm-bSt block polymer and DNA was measured in the same manner as in Example 1. The temperature environment was 20 ° C. to 25 ° C., and the influence due to the introduction of the hydrophobic block was confirmed. It was suggested that an ion complex of 350 to 450 nm was formed and was stably dispersed for several hours, but the particle diameter increased with time and the aggregation phenomenon occurred.
A gene transfer experiment was conducted according to Example 1 except that this 4-branched pDMAPAAm-b-St block polymer was used as a vector. The result is shown in FIG.

＜比較例２＞
ベクターに実施例１の合成プロセスii）で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを使用したこと以外は実施例１に準拠して遺伝子導入実験を行った。その結果を図１に示す。 <Comparative example 2>
A gene transfer experiment was conducted according to Example 1 except that the 4-branched pDMAPAAm homopolymer synthesized in the synthesis process ii) of Example 1 was used as the vector. The result is shown in FIG.

［考察］
以上より、カチオン性ホモポリマーへの疎水性ブロックの固定的導入は核酸複合体の粒子径サイズ及びその安定性に影響し、若干の遺伝子導入活性の向上が確認されるが効率的でないこと考えられる。本発明では核酸複合体形成時には親水性であったブロックを細胞作用時に始めて疎水性ブロックへ相転移させることで核酸複合体の粒子径を高密度に凝縮し、安定化し、細胞作用時には細胞膜との疎水性相互作用を効率良く利用できることが確認された。 [Discussion]
From the above, it is considered that the fixed introduction of the hydrophobic block into the cationic homopolymer affects the particle size of the nucleic acid complex and its stability, and some improvement in gene introduction activity is confirmed, but it is not efficient. . In the present invention, the particle size of the nucleic acid complex is condensed and stabilized at a high density by phase transition to a hydrophobic block for the first time during the cell action to form a hydrophobic block when the nucleic acid complex is formed. It was confirmed that the hydrophobic interaction can be used efficiently.

実施例及び比較例の結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of an Example and a comparative example.

Claims (10)

芳香族環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤と核酸との微粒子状の複合体よりなる核酸複合体において、
該ポリマー材料は、少なくとも、カチオン性ポリマーブロックと、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である温度感応性ポリマーブロックとを有しており、
前記微粒子の表面に、核酸と、カチオン性ポリマーブロックと、温度感応性ポリマーブロックとが存在していることを特徴とする遺伝子導入剤。 In a nucleic acid complex comprising a fine particle complex of a gene introduction agent and a nucleic acid comprising a polymer material having a plurality of branched chains radially extending from an aromatic ring as a nucleus,
The polymer material is at least a cationic polymer block and a temperature that is hydrophilic at a temperature lower than a predetermined temperature (T) lower than a living body temperature and is hydrophobic at a temperature higher than the predetermined temperature (T). And a sensitive polymer block,
A gene introduction agent, wherein a nucleic acid, a cationic polymer block, and a temperature sensitive polymer block are present on the surface of the fine particles. 請求項１において、前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることを特徴とする核酸複合体。   2. The nucleic acid complex according to claim 1, wherein the polymer material is a block copolymer of a cationic monomer and N-isopropylacrylamide or a derivative thereof. 請求項１において、前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーと非イオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることを特徴とする核酸複合体。   2. The nucleic acid complex according to claim 1, wherein the polymer material is a block copolymer of a cationic monomer, a nonionic monomer, and N-isopropylacrylamide or a derivative thereof. 請求項３において、非イオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることを特徴とする核酸複合体。   4. The nucleic acid complex according to claim 3, wherein the molecular weight of the nonionic polymer block is 2,000 to 500,000. 請求項２ないし４のいずれか１項において、カチオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることを特徴とする核酸複合体。   The nucleic acid complex according to any one of claims 2 to 4, wherein the molecular weight of the cationic polymer block is 2,000 to 500,000. 請求項２ないし５のいずれか１項において、該ブロック共重合体の分子量が3,000〜600,000であることを特徴とする核酸複合体。   The nucleic acid complex according to any one of claims 2 to 5, wherein the molecular weight of the block copolymer is 3,000 to 600,000. 請求項１ないし６のいずれか１項において、前記所定温度（Ｔ）は、25〜35℃の間の温度であることを特徴とする核酸複合体。   The nucleic acid complex according to any one of claims 1 to 6, wherein the predetermined temperature (T) is a temperature of 25 to 35 ° C. 請求項２ないし７のいずれか1項において、前記ブロック共重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする核酸複合体。   8. The block copolymer according to claim 2, wherein the block copolymer is an iniferter having a compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl groups in the same molecule. A nucleic acid complex characterized by being a branched polymer obtained by light-irradiating living polymerized. 請求項８において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とする核酸複合体。   9. The compound according to claim 8, wherein the compound having three or more N, N-dialkyl-dithiocarbamylmethyl molecular groups in the same molecule has a benzene ring as a nucleus and three or more N, N- A nucleic acid complex comprising a dialkyl-dithiocarbamylmethyl molecular group bound thereto. 請求項８又は９において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする核酸複合体。   The group according to claim 8 or 9, wherein the vinyl monomer is 3-N, N-dimethylaminopropylacrylamide, 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylacrylamide, and methoxyethyl (meth) acrylate. A nucleic acid complex comprising at least one selected from the group consisting of:

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