CN107557384B - 一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用，所述遗传体系是SIP1家族基因诱导植株矮化的遗传转化体系；所述体系的构建包括（1）番茄RNA的提取；（2）SlGT‑33基因的RNA反转录；（3）SlGT‑33基因的克隆及沉默表达载体的构建。所述体系的应用是用于诱导番茄植株矮化。本发明诱导植物矮化的遗传转化体系可用来培育番茄矮化植株，得到的番茄植株具有可高密度种植、充分利用空间和土地，增强光合效率，提高产量，低耗水率，抗倒伏等优点。

Description

一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用

技术领域

本发明涉及一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用，特别是一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用该其培育番茄矮化植株的方法。

背景技术

番茄(学名：Solanum lycopersicum Mill.var)属于一年生或多年生草本植物，株高1-2米；羽状复叶或深裂；茎易倒伏；聚伞花序；浆果。番茄起源于南美洲的安第斯山地带，在秘鲁、厄瓜多尔等地仍有大部分野生种分布。番茄在长日照和短日照情况下均能生长、结实，适生温度范围较广，对土壤条件要求不严格，如今，番茄已作为世界范围栽种的主要蔬菜作物。植物矮化是一种重要的农艺性状，因其可高密度种植、充分利用空间和土地，增强光合效率，提高产量、低耗水率、抗倒伏等优势，对选育高产品种来说是一个重要的研究方向。诱导矮化的因素较多，包括栽培措施、生长环境、引种、生物调节剂、病毒及化学诱变等，而诱变过程中产生的安全性问题、诱变的长效性、透彻的机理分析等问题依然有局限性。番茄的矮化研究已从上个世纪的中叶便已开始，目前，植物矮化的探索逐步从生物调节剂分析向遗传基因的研究过渡，特别是发现了多种矮小型番茄突变品种，如Micro-Tom、TomThumb、Dwarf stone等。转基因技术是获得遗传稳定矮化品种的重要渠道。许多与矮化的相关基因被鉴定：赤霉素的合成、信号转导、代谢调控等途径中的蛋白编码基因突变后均可导致植株矮化，这与甾醇类激素、生长素、多胺等生物活性物质代谢合成途径中的基因变化相似。

植物界中已发现的转录因子有60多种，如bHLH、MADS-box、MYB、WD40、WRKY、AP2/ERF、YABBY、HB-box和NAC等。Kato等发现，NAC家族转录因子ANAC036基因主要在拟南芥的叶片中表达，超表达ANAC036基因产生了半矮化的植株；水稻中，超表达CYTOKININ-RESPONSIVE GATA TRANSCRIPTION FACTOR1(Cga1)基因诱导植物叶片的叶绿素合成，并导致植物半矮化；油菜素类固醇信号途径中的HLH转录因子INCREASED LEAF INCLINATION1BINDING bHLH1(IBH1)基因的超表达导致植株的严重矮化；等。可见，在植物的生长发育调控中，转录因子发挥了至关重要的作用。然而，到目前为止，Trihelix转录因子家族的相关基因在培育矮化植株方面的贡献还未见报道。

GT-1亚家族基因的功能研究进展：GT-1是首先被发现的Trihelix转录因子。GT元件首先在豌豆光响应基因rbs-3A启动子区发现并进行了分离，该启动子区为Box II。继而，其他非光响应基因的启动子中也含有GT元件，如相似启动子序列(GT-2box和GT-3box)存在于水稻的phyA启动子中，它可在暗环境中激活相关基因的表达。GT-2亚家族基因的功能研究进展：GT-2的命名是源于它含有两个与GT-1同源的DNA结合域。该亚家族基因的功能较为强大，其主要功能与植物的抗逆性、花器官的发育有关。据报道，SH4亚家族基因的功能与离层的发育相关。GTγ亚家族基因的功能与植物的逆境胁迫相关。

SIP1亚家族基因的功能研究发现：Kitakura等报道烟草NtSIP1作为Trihelix转录因子家族另一个亚家族基因被发现，它促进了6b蛋白与下游基因启动子的结合，实现了植物的细胞增殖。ASIL1(Arabidopsis 6b-interacting protein 1-like1)与拟南芥2S3启动子区互作。asil1突变体积累了2S白蛋白和脂肪酸类油脂，这与种子中的脂类非常相似。Gao等研究表明ASIL1识别GT元件，与2S的RY重复非常接近。Kuromori等指出，SIP1亚家族中存在一个融合基因，即3’末端融合了天冬氨酸/谷氨酸盐/尿苷激酶的编码序列。在拟南芥和水稻中，这些基因在父母本中存在。虽然这种融合基因的功能还未确定，但它们诱导植株矮化，并形成浅绿和畸形的叶子。Geraldo等研究结果显示，只包含了coiled-coil结构的蛋白FRIGIDA(FRI)上调了开花抑制子FLOWERING LOCUS C(FLC)的基因表达，导致植物必须接受春化处理和度过冬天的习惯。突变帽子结合蛋白cap-binding complex(CBC)的小亚基抑制FRI的活性。CBC可与FRI在体内和体外直接互作，这种FRI与5’帽子结构的密切关系可以被RNA连接酶介导的迅速cDNA扩增来证实。缺失CBC20削弱了FLC的表达，提高了FLC剪切mRNA的含量。FRI可恢复这种缺失影响，并恢复部分FLC的表达以及剪切能力。虽然该基因与Trihelix家族并无直接联系，但coiled-coil结构使得它被分到了SIP1亚家族。然而，到目前为止，Trihelix转录因子家族SIP1亚家族基因诱导植物矮化的研究也未见报道。

因此，现有技术中，培育番茄矮化植株还未见报道，使得现有番茄植株存在不能高密度种植，不能充分利用空间和土地，光合效率低，产量低，水率高，不抗倒伏等问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建。本发明诱导植物矮化的遗传转化体系可用来培育番茄矮化植株，得到的番茄植株具有可高密度种植、充分利用空间和土地，增强光合效率，提高产量，低耗水率，抗倒伏等优点。

本发明的技术方案：一种诱导植株矮化的遗传转化体系，所述遗传体系是SIP1家族基因诱导植株矮化的遗传转化体系。

一种前述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法，包括(1)SlGT-33基因的RNA的提取；(2)SlGT-33基因的RNA反转录；(3)SlGT-33基因的克隆；(4)沉默载体的构建。

前述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法中，所述的番茄RNA的提取；是番茄组织放入液氮中速冻10～20s后放入研钵，研磨后，取98-102mg粉末放入1.5mL离心管中，加入0.8-1.2mL RNAiso Plus提取试剂，震荡混匀，室温静置4-6min后，混合液在3-5℃下13100rpm离心4-6min，吸取上清液880-920μL放入到新1.5mL的离心管中，并加入三氯甲烷245-265μL，混匀后，常温静置4-6min；混合液3-5℃下12500-13500rpm离心13-17min，吸取最上层澄清液体180-220μL于新的1.5mL的离心管中，加入180-220μL浓度为99-100％的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置4-6min，将混合液3-5℃下13000-13200rpm离心8-12min，倒掉上清液，并加入1mL70乙醇，3-5℃下13000-13200rpm离心50-70s，倒掉上清液，吸干残留液体，常温静置干燥；待干燥后加入灭菌的无离子水20～30μl溶解，即得。

前述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法中，所述的SlGT-33基因的RNA反转录；是在无菌的环境下，于灭菌的离心管中加入如下反应体系的试剂：番茄RNA0.8-1.2μL、引物1.8-2.2μL、无离子水10-12μL，将加好试剂的离心管放到PCR仪上，74-76℃孵育4-6min；孵育结束后迅速放到冰上冷却4-6min，并加入4-6倍的buffer缓冲液(5×ReactionBuffer)4μL、dNTP2μL、莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶0.8-1.2μL和无离子水8-10μL后，放在PCR上40-44℃温育50-70min，再升高到70-74℃孵育8-12min，取出，零下20℃保存；所述的引物是1.8-2.2mmoL/L的oligodT。

前述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法中，所述的SlGT-33基因的克隆；是利用引物SlGT-33-F和SlGT-33-R扩增番茄基因SlGT-33，反应体系试剂如下：2×PrimeSTAR Mix，12.5μL；SlGT-33-F，1.0μL；SlGT-33-R，1.0μL；cDNA模板1.0μL；无菌水9.5μL；加好后，在PCR仪上放置后进行扩增，扩增的条件如下：变性98℃，2min；复性58℃，30s，片段固定72℃，10min，得到PCR的扩增产物；

所述的沉默载体的构建；是PCR的扩增产物连接到pMD18-T载体上，测序，获得克隆片段的编码序列，在5'加入了酶切位点，合成引物SlGT-33-F和SlGT-33-R，分别以正向和反向的方式连接到中间载体pHANNIBAL上，然后连接到终载体pBIN19上，获得含有SlGT-33基因的沉默表达终载体；所述的SlGT-33-F是：5'CTTCCTGTTCACGACCCTTC 3'；所述的SlGT-33-R：5'CTCTCAATTTTGGACCCCC 3'。

一种前所述的诱导植株矮化的遗传转化体系应用，用于诱导番茄植株矮化。

前所述的诱导植株矮化的遗传转化体系应用中，所述的用于诱导番茄植株矮化；是SlGT-33基因转移到农杆菌和农杆菌侵染番茄子叶。

前所述的诱导植株矮化的遗传转化体系应用中，所述的SlGT-33基因转移到农杆菌；将农杆菌LBA4404菌种，在含量为50mg/L利福平和500mg/L的链霉素的YEB的固体培养基上划线，在25-30℃下培养2-3天；大肠杆菌HB101/pRK2013(Helper)菌种在含有5050mg/L的卡那霉素的培养基上划线，密封在35-39℃的培养箱中培养16-18h，取含有SlGT-33基因的沉默表达终载体单克隆于不含抗生素的YEB培养基的培养皿中，形成0.4-0.6cm长的菌斑，然后以同样的方式取Helper菌株以及农杆菌与终载体的混合在一起，混匀后，在25-30℃下培养2-3天；用接种环将共培养的菌斑在含有50mg/L的利福平、500mg/L的链霉素和50mg/L的卡那霉素的培养基上划线，在25-30℃下培养2-3天；取单克隆，做菌落PCR，提取质粒PCR，摇菌增殖；保菌，提取质粒。

前所述的诱导植株矮化的遗传转化体系应用中，所述的农杆菌侵染番茄子叶；是无菌的环境下，将AC⁺⁺的种子分别利用20～40ml质量浓度0.8-1.2％的次氯酸钠、20～40ml75％乙醇和20～40ml饱和磷酸钠进行消毒处理；处理完毕后加入无菌水，在25-30℃的摇床上110rpm摇动培养；待生长整齐后，将发芽的种子在无菌的环境下播种到没有抗生素的MS培养基上培养，直至长出0.8-1.2cm的子叶，子叶在无菌环境条件切成2-3小片，放入含量为0.2μg/mL 2,4-D和10μg/mL激动素的液体MS培养基中浸泡1h后，取出，放在灭菌的滤纸上吸干残留液体，放置在含量为1μg/mL IAA和1.75μg/mL玉米素的固体MS培养基上，光照培养箱中用报纸包裹培养1天后，加入农杆菌中浸泡15分钟，然后用灭菌的滤纸吸干残留液，重新放到MS固体培养基上，培养箱中培养2天；将共培养的子叶斜***到含量为500μg/mL羧卞青霉素、75μg/mL卡那霉素、1.75μg/mL玉米素和1.0μg/mL IAA的MS培养基上，培养箱中培养，每18-22天的时间更换一次培养基，直至形成愈伤组织，继续培养至愈伤组织会长出幼苗，切取幼苗到含量为50μg/mL卡那霉素及250μg/mL羧卞青霉素的MS培养基中诱导生根；生根后的幼苗可以进一步切取两株，重新发芽和生根，产生更多的转基因植株。

前述的诱导植株矮化的遗传转化体系应用中，所述的农杆菌侵染番茄子叶；是无菌的环境下，将AC⁺⁺的种子分别利用30ml质量浓度1.0％的次氯酸钠、30ml75％乙醇和30ml饱和磷酸钠进行消毒处理；处理完毕后加入无菌水，在25-30℃的摇床上110rpm摇动培养；待生长整齐后，将发芽的种子在无菌的环境下播种到没有抗生素的MS培养基上培养，直至长出0.8-1.2cm的子叶，子叶在无菌环境条件切成2-3小片，放入含量为0.2μg/mL 2,4-D和10μg/mL激动素的液体MS培养基中浸泡1h后，取出，放在灭菌的滤纸上吸干残留液体，放置在含量为1.0μg/mL IAA和1.75μg/mL玉米素的固体MS培养基上，光照培养箱中用报纸包裹培养1天后，加入农杆菌中浸泡15分钟，然后用灭菌的滤纸吸干残留液，重新放到MS固体培养基上，培养箱中培养2天；将共培养的子叶斜***到含量为500μg/mL羧卞青霉素、75μg/mL卡那霉素1.75μg/mL玉米素和1.0μg/mL IAA的MS培养基上，培养箱中培养，每20天的时间更换一次培养基，直至形成愈伤组织，继续培养至愈伤组织会长出幼苗，切取幼苗到含量为50μg/mL卡那霉素及250μg/mL羧卞青霉素的MS培养基中诱导生根；生根后的幼苗可以进一步切取两株，重新发芽和生根，产生更多的转基因植株。

申请人对本发明进行了大量的试验研究，部分试验如下：

1、生物信息学分析

利用茄科专用数据库Sol Genomics Network(SGN,http://solgenomics.net/)检索SIP1亚家族的基因信息，然后利用蛋白专用数据库Pfamdatabase(http://pfam.sanger.ac.uk/)来检验结果的准确性。利用Multiline网站(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)进行序列比对，找出内含子或外显子，利用DNAMAN做氨基酸序列的比对，并分析来自于不同物种的GT-2亚家族氨基酸序列的一致性；利用软件MEGA5.1构建生物进化树。

2、构建基因沉默表达载体，并进行遗传转化

总RNA的提取：常用的方法为RNAiso Plus提取试剂进行手工提取，具体的操作过程简述如下：番茄组织取材后，迅速放入液氮中速冻；将所选材料放入研钵后，液氮研磨需仔细，选取100mg粉末放入1.5mL离心管(含糖类或醌类物质较多的材料选取的量小于100mg大于50mg)，加入1mL RNAiso Plus提取试剂，剧烈震荡混匀，室温静置5min；将混合液4℃下13100rpm离心5min；吸取上清液900μL放入到新1.5mL的离心管中，并加入新开封的三氯甲烷255μL，混匀时上下颠倒，常温静置5min；混合液4℃下13100rpm离心15min，吸取最上层澄清液体200μL于新的1.5mL的离心管中，加入体积相等的异丙醇原液，上下颠倒混匀，室温静置5min；将混合液4℃下13100rpm离心10min；倒掉上清液，并加入1mL75％乙醇，小心清洗掉蛋白质残留，4℃下13100rpm离心1min；倒掉上清液，残留液体需吸干，常温静置干燥；待干燥后加入灭菌的无离子水，充分溶解；琼脂糖凝胶电泳检验总RNA纯度和浓度。

RNA反转录：在无菌的环境下，0.2mL的离心管中加入如下反应体系的试剂：RNA 1μL、引物(2毫摩尔/升的oligodT)2μL、无离子水11μL；将加好的离心管放到PCR仪上，75℃孵育5min；孵育结束后迅速放到冰上冷却5min，并分别加入混合试剂16μL，该混合试剂的配制方法：5倍的buffer缓冲液4μL、dNTP 2μL、反转录酶M-mLV 1μL和无离子水9μL；将所有的体系混合后放在PCR上42℃温育1小时，再升高到72℃孵育10min，最后取出，放入零下20℃长久保存。

基因克隆：具体操作如下：利用引物SlGT-33-F和SlGT-33-R扩增全长番茄基因SlAW034575，反应体系试剂如下：2×PrimeSTAR Mix，12.5μL；SlGT-33-F，1.0μL；SlGT-33-R，1.0μL；cDNA模板1.0μL；无菌水9.5μL。加好后，在PCR仪上放置后进行扩增，扩增的条件如下：变性98℃，2min；复性58℃，30s，片段固定72℃，10min。得到PCR的扩增产物后，可利用琼脂糖凝胶电泳来推测PCR产物浓度和片段大小。

沉默载体的构建：经过生物信息学分析比对，找到SlGT-33-like基因大小为455bp的特异序列，合成引物，

SlGT-33-F：5'CTTCCTGTTCACGACCCTTC 3'

SlGT-33e-R：5'CTCTCAATTTTGGACCCCC 3'；

经过高保真PCR扩增后连接到pMD18-T载体上测序。结果见图1，测序后比对结果显示虽然有两个碱基突变，但符合试验要求。

SlGT-33-EcoRI-XbaI-F：5'CGGAATTCTCTAGACTTCCTGTTCACGACCCTTC3'

SlGT-33-KpnI-HindIII-R：5'GGGGTACCAAGCTTCTCTCAATTTTGGACCCCC3'；

再重新的合成引物5'加入了酶切位点，以正向和反向的方式连接到中间载体pHANNIBAL上，然后连接到终载体pBIN19上。获得的终载体结构如图2：

双元质粒的农杆菌结合转移：将含有SlGT-33沉默片段的片段转移到农杆菌中，需要大肠杆菌HB101/pRK2013(Helper)的辅助作用，具体步骤如下：将贮存的农杆菌LBA4404菌种，在50毫克/升的利福平、500毫克/升的链霉素的YEB的固体培养基上划线，在28℃下培养到单克隆的大小为0.5-1毫米(2-3天)；大肠杆菌HB101/pRK2013(Helper)菌种慢慢融化，在含有50毫克/升的卡那霉素的培养基上划线，密封在37℃的培养箱中培养16-18小时，直到长出含有明显的单克隆；挑取SlGT-33沉默终载体单克隆于不含抗生素的YEB培养基的培养皿中，形成大约0.5厘米大小的菌斑，然后以同样的方式挑取heper菌株以及农杆菌与终载体的混合在一起，要慢慢混合，混合的越均匀越好，在28℃下培养到菌斑大量繁殖时期(2-3天)；用接种环将共培养的菌斑在含有50毫克/升的利福平、500毫克/升的链霉素和50毫克/升的卡那霉素的培养基上划线，在28℃下培养到单克隆的大小为0.5-1毫米(2-3天)；挑取单克隆，做菌落PCR，提取质粒PCR，所用的引物为检验终载体或中间载体的引物，选择阳性进行摇菌增殖；保菌，提取质粒。

子叶的农杆菌侵染:具体步骤如下：

无菌的环境下，将AC⁺⁺的种子利用次氯酸钠、75％乙醇和饱和磷酸钠进行消毒处理；处理完毕的种子加入无菌水，在28℃的摇床上黑暗下110rpm，摇动培养；待生长整齐后，将发芽的种子在无菌的环境下播种到没有抗生素的MS培养基上培养，直至长出1厘米左右的子叶大小后准备侵染过程；达到1厘米左右的子叶在无菌环境条件下两头分别各切一刀，放入含有激素的液体MS培养基(0.2μg/mL 2,4-D和10μg/mL KT)中浸泡1小时，放在灭菌的滤纸上吸干残留液体，放置在固体MS培养基(1μg/mL IAA和1.75μg/mL ZT)上，光照培养箱中用报纸包裹培养1天；将预培养了一天的子叶加入的悬浮的农杆菌中浸泡15min，然后用灭菌的滤纸吸干残留液，重新放到MS固体培养基上，培养箱中培养2天；将共培养的子叶斜***到500μg/mL Carb+75μg/mL Kan+1.75μg/mL ZT+1.0μg/mL IAA的MS培养基上，培养箱中培养；每20天左右的时间更换一次抗性培养基，直至形成愈伤组织；过一段时间后，愈伤组织会长出幼苗，切取幼苗到生根培养基中(MS+50μg/mL Kan及250μg/mL Carb)诱导生根；生根后的幼苗可以进一步切取两株，重新发芽和生根，产生更多的转基因植株，用于后续的试验。

3、对转基因植株进行鉴定

转基因植株的鉴定以终载体上可以编码卡那霉素的基因为依据进行。PCR扩增载体卡那霉素基因的序列作为转基因成功的标志，因为AC⁺⁺中没有编码卡那霉素的基因序列。具体步骤如下：选取由番茄转基因愈伤组织发育而来的植株和AC⁺⁺叶片作为试验材料，分别提取DNA；以提取的DNA为模板，以常规r-Taq酶体系为标准进行检测。

普通PCR程序：94℃，5min；[94℃，30秒，56℃，30秒，72℃，60秒]，共35个循环；最后72℃，10min，4℃保存；取合适量的PCR产物，选用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，120V，20-25min。

转基因效率的鉴定：利用荧光定量PCR技术，采用设计的定量引物来检测沉默基因在的效率。

4、获得番茄转基因植株

鉴定为转基因的植株观察表型，并收集T0代种子，播种后收获子一代种子，播种后收获子二代种子，再通过转基因鉴定后，阳性植株便为番茄转基因植株。

实验结果

1、SlGT-33基因的分子克隆和同源比对分析

SlGT-33基因(基因ID：Solyc12g043090)的全长片段，测序后发现，其总长度为1125个碱基，无内含子，编码了374个氨基酸。

SlGT-33基因核苷酸序列：

ATGGATGACATTGAGGATAATGGGAGATATCCTTCCAACCCTTATGGCATGAACCAGGGTTATGAGTCATCCAATCGCCAGAAGCTTCCTGTTCACGACCCTTCTTATTCAAGGCATGTCGACAATCAGTATGTGGAGGAGGCGGATGATGATGAAGAAGTTGATGGCGAAGAAGAAGAAGATGATGATGGCGAAGAAAATGGTGTTCAGCGGATAGGGAAAGATGTGTTTGATGACGATGATGATGATGATGATGAGTATGGTGATTTGCAGAGGCATCAAAAGAAGAGGAAGTTAAAGAGCTTGTTATCAAGTTATGAGTTTGCACCTCGAGTACCACCACCATCTACTACAGCTGCAACTGCTCCTAAGCCTTCATTTGGTGGTAGGAATCCACTTTCAGATTGGTCTGAAAATGAGACATTTATTTTGCTTGATGCATGGGGCACTAGGTTTGTTCGACATGGGAGGAAGAGTCTTCGATCAGAGGAATGGCAAGAAGTTGCAGACAGAGTGTCACGGGGGTCCAAAATTGAGAGGACAGACACCCAATGTCGTAACCGTTTGGATACTTTGAAAAAGAAATACAAAAAGGAGAAGATGAAGTTTGCAGAGACTGGAAGTAGCACTAGCAAGTGGGTGTACTTCAAAAAGATGGACATGTTACTAACATCAACTCCCCAGAAAGCTGGTGTTTCATGTGGAATGGACTCTGGAGAGTATGTTTTCATGAGCCCAAAAGCTTATCTGAATCGTGCTAATGGCTTGGATGAGATGAGGGACAGTCCTGCTAACTCAGAATCTGCTGATGGTGAGGAGGATGGTTCAGAGGATCTTCCACCAAAAAGATCAAGAAATGTACAACCAGGAGGGAACGGGAATGGGAATGGACATTCTTTCAAATTAATAGCAGATTCTATCCATAAATTTAGTGAGATATATGTGAAGATTGAGAATAGCAAGAGACAGCAAATGATGGAACTGGAGAAAATGAGGATGGACTTCCACCGAGAATTGGAACTCCAAAAGAGGCAAATTATGGAGAGAGCTCAGGCAGAAATTGCAAGAATACGTCAAGGAAGTGATGAAGAGAACGACATGTCTGCTGAAAATGTTAGTGGATGA。

该基因编码的氨基酸可形成Trihelix结构域、第四螺旋和一个保守中央结构域，如图3所示。

2、转基因株系的鉴定

3、沉默株系的幼苗矮化

AC⁺⁺和转基因植株在温室内培养了70天后，沉默植株的高度显著小于AC⁺⁺,只有对照的50％左右(如图5)。沉默植株的平均节间长度也显著小于对照，只有AC⁺⁺植株的25-30％。此外，沉默植株的复叶结构不变，但是复叶的整体尺寸明显变小。因此，抑制SlGT-33基因的表达诱导了植物明显矮化。

4、沉默株系的花序提早形成

伴随着幼苗的逐渐长大，沉默株系的花序形成时间早于AC⁺⁺。图6显示，当沉默植株生长到7-8片真叶时，AC⁺⁺植株只有4-5片真叶；当沉默植株生长到11-12片真叶时，AC⁺⁺植株只着生了7-8片真叶。通常7-8片真叶是番茄形成第一胎花序的时期，11-12片真叶是番茄形成第二胎花序的时期。因此，沉默SlGT-33促进了植株提早形成花序。此外，沉默植株的生长受到抑制后，然而其侧芽的萌发速度明显快于对照。以上研究说明，SlGT-33基因可促进植株矮化。

有益效果：本发明得到的番茄植株具有可高密度种植、充分利用空间和土地，增强光合效率，提高产量，低耗水率，抗倒伏等优点。

附图说明

图1是经过高保真PCR扩增后连接到pMD18-T载体上测序结果图；

图2是终载体结构图；

图3是氨基酸多重序列比对SIP1(SlGT-33)转录因子分析图；

图4是沉默效率鉴定；

图5是室外沉默株系与AC⁺⁺幼苗的表型；

图6是是室外沉默株系与AC⁺⁺幼苗的表型。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1。

一种诱导植株矮化的遗传转化体系，其构建方法为：

(1)番茄RNA的提取；番茄组织放入液氮中速冻15s后放入研钵，研磨后，取100mg粉末放入1.5mL离心管中，加入1.0mL RNAiso Plus提取试剂，震荡混匀，室温静置5min后，混合液在3-5℃下13100rpm离心5min，吸取上清液900μL放入到新1.5mL的离心管中，并加入三氯甲烷255μL，混匀后，常温静置5min；混合液3-5℃下13000rpm离心15min，吸取最上层澄清液体200μL于新的1.5mL的离心管中，加入200μL浓度为99％的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置5min，将混合液3-5℃下13000rpm离心10min，倒掉上清液，并加入1mL75％乙醇，3-5℃下13000rpm离心60s，倒掉上清液，吸干残留液体，常温静置干燥；待干燥后加入灭菌的无离子水25μl溶解，即得；

(2)SlGT-33基因的RNA反转录：在无菌的环境下，于灭菌的离心管中加入如下反应体系的试剂：番茄RNA1.0μL、引物2.0μL、无离子水11μL，将加好试剂的离心管放到PCR仪上，74-76℃孵育5min；孵育结束后迅速放到冰上冷却5min，并加入5倍的buffer缓冲液(5×Reaction Buffer)4μL、dNTP 2μL、莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶1.0μL和无离子水9μL后，放在PCR上40-44℃温育60min，再升高到70-74℃孵育10min，取出，零下20℃保存；所述的引物是2.0mmoL/L的oligodT；

(3)SlGT-33基因的克隆：利用引物SlGT-33-F和SlGT-33-R(基因ID:SlAW034575，见茄科基因组网站https://solgenomics.net/)扩增全长番茄基因SlAW034575，反应体系试剂如下：2×PrimeSTAR Mix，12.5μL；SlGT-33-F，1.0μL；SlGT-33-R，1.0μL；cDNA模板1.0μL；无菌水9.5μL；加好后，在PCR仪上放置后进行扩增，扩增的条件如下：变性98℃，2min；复性58℃，30s，片段固定72℃，10min，得到PCR的扩增产物；

所述的沉默载体的构建；PCR的扩增产物连接到pMD18-T载体上，测序，获得克隆片段的编码序列，在5'加入了酶切位点，合成引物SlGT-33-F和SlGT-33-R，分别以正向和反向的方式连接到中间载体pHANNIBAL上，然后连接到终载体pBIN19上，获得含有SlGT-33基因的沉默表达终载体；所述的SlGT-33-F是：5'CTTCCTGTTCACGACCCTTC 3'所述的SlGT-33-R：5'CTCTCAATTTTGGACCCCC 3'。

用于诱导诱导番茄植株矮化，具体操作方法为：

(1)SlGT-33基因转移到农杆菌；将农杆菌LBA4404菌种，在含量为50mg/L利福平和500mg/L的链霉素的YEB的固体培养基上划线，在25-30℃下培养2-3天；大肠杆菌HB101/pRK2013(Helper)菌种在含有5050mg/L的卡那霉素的培养基上划线，密封在35-39℃的培养箱中培养16-18h，取含有SlGT-33基因的沉默表达终载体单克隆于不含抗生素的YEB培养基的培养皿中，形成0.4-0.6cm长的菌斑，然后以同样的方式取Helper菌株以及农杆菌与终载体的混合在一起，混匀后，在25-30℃下培养3天；用接种环将共培养的菌斑在含有50mg/L的利福平、500mg/L的链霉素和50mg/L的卡那霉素的培养基上划线，在25-30℃下培养2-3天；取单克隆，做菌落PCR，提取质粒PCR，摇菌增殖；保菌，提取质粒；

(2)农杆菌侵染番茄子叶：无菌的环境下，将AC⁺⁺的种子分别利用30ml质量浓度1.0％的次氯酸钠、30ml 75％乙醇和30ml饱和磷酸钠进行消毒处理；处理完毕后加入无菌水，在25-30℃的摇床上110rpm摇动培养；待生长整齐后，将发芽的种子在无菌的环境下播种到没有抗生素的MS培养基上培养，直至长出0.8-1.2cm的子叶，子叶在无菌环境条件切成2-3小片，放入含量为0.2μg/mL2,4-D和10μg/mL激动素的液体MS培养基中浸泡1h后，取出，放在灭菌的滤纸上吸干残留液体，放置在含量为1μg/mL IAA和1.75μg/mL玉米素的固体MS培养基上，光照培养箱中用报纸包裹培养1天后，加入农杆菌中浸泡15分钟，然后用灭菌的滤纸吸干残留液，重新放到MS固体培养基上，培养箱中培养2天；将共培养的子叶斜***到含量为500μg/mL羧卞青霉素、75μg/mL卡那霉素、1.75μg/mL玉米素和1.0μg/mL IAA的MS培养基上，培养箱中培养，每18-22天的时间更换一次培养基，直至形成愈伤组织，继续培养至愈伤组织会长出幼苗，切取幼苗到含量为50μg/mL Kan及250μg/mL Carb的MS培养基中诱导生根；生根后的幼苗可以进一步切取两株，重新发芽和生根，产生更多的转基因植株。

实施例2。

一种诱导植株矮化的遗传转化体系，其构建方法为：

(1)番茄RNA的提取；番茄组织放入液氮中速冻20s后放入研钵，研磨后，取102mg粉末放入1.5mL离心管中，加入1.2mL RNAiso Plus提取试剂，震荡混匀，室温静置6min后，混合液在3-5℃下13100rpm离心6min，吸取上清液920μL放入到新1.5mL的离心管中，并加入三氯甲烷265μL，混匀后，常温静置6min；混合液3-5℃下12500-13500rpm离心17min，吸取最上层澄清液体220μL于新的1.5mL的离心管中，加入220μL浓度为100％的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置6min，将混合液3-5℃下13200rpm离心12min，倒掉上清液，并加入1mL80％乙醇，3-5℃下13200rpm离心70s，倒掉上清液，吸干残留液体，常温静置干燥；待干燥后加入灭菌的无离子水30μl溶解，即得；

(2)SlGT-33基因的RNA反转录：在无菌的环境下，于灭菌的离心管中加入如下反应体系的试剂：番茄RNA1.2μL、引物2.2μL、无离子水12μL，将加好试剂的离心管放到PCR仪上，74-76℃孵育4-6min；孵育结束后迅速放到冰上冷却6min，并加入6倍的buffer缓冲液(5×Reaction Buffer)4μL、dNTP 2μL、莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶1.2μL和无离子水10μL后，放在PCR上40-44℃温育70min，再升高到70-74℃孵育8-12min，取出，零下20℃保存；所述的引物是1.8-2.2mmoL/L的oligodT；

(3)SlGT-33基因的克隆：利用引物SlGT-33-F和SlGT-33-R(基因ID:SlAW034575，见茄科基因组网站https://solgenomics.net/)扩增全长番茄基因SlAW034575，反应体系试剂如下：2×PrimeSTAR Mix，12.5μL；SlGT-33-F，1.0μL；SlGT-33-R，1.0μL；cDNA模板1.0μL；无菌水9.5μL；加好后，在PCR仪上放置后进行扩增，扩增的条件如下：变性98℃，2min；复性58℃，30s，片段固定72℃，10min，得到PCR的扩增产物；

(4)所述的沉默载体的构建；PCR的扩增产物连接到pMD18-T载体上，测序，获得克隆片段的编码序列，在5'加入了酶切位点，合成引物SlGT-33-F和SlGT-33-R，分别以正向和反向的方式连接到中间载体pHANNIBAL上，然后连接到终载体pBIN19上，获得含有SlGT-33基因的沉默表达终载体；所述的SlGT-33-F是：5'CTTCCTGTTCACGACCCTTC 3'所述的SlGT-33-R：5'CTCTCAATTTTGGACCCCC 3'。

用于诱导诱导番茄植株矮化，具体操作方法为：

(1)SlGT-33基因转移到农杆菌；将农杆菌LBA4404菌种，在含量为50mg/L利福平和500mg/L的链霉素的YEB的固体培养基上划线，在25-30℃下培养2天；大肠杆菌HB101/pRK2013(Helper)菌种在含有5050mg/L的卡那霉素的培养基上划线，密封在35-39℃的培养箱中培养18h，取含有SlGT-33基因的沉默表达终载体单克隆于不含抗生素的YEB培养基的培养皿中，形成0.4-0.6cm长的菌斑，然后以同样的方式取Helper菌株以及农杆菌与终载体的混合在一起，混匀后，在25-30℃下培养-3天；用接种环将共培养的菌斑在含有50mg/L的利福平、500mg/L的链霉素和50mg/L的卡那霉素的培养基上划线，在25-30℃下培养3天；取单克隆，做菌落PCR，提取质粒PCR，摇菌增殖；保菌，提取质粒；

(2)农杆菌侵染番茄子叶：无菌的环境下，将AC⁺⁺的种子分别利用40ml质量浓度1.2％的次氯酸钠、40ml 75％乙醇和40ml饱和磷酸钠进行消毒处理；处理完毕后加入无菌水，在25-30℃的摇床上110rpm摇动培养；待生长整齐后，将发芽的种子在无菌的环境下播种到没有抗生素的MS培养基上培养，直至长出0.8-1.2cm的子叶，子叶在无菌环境条件切成2-3小片，放入含量为0.2μg/mL 2,4-D和10μg/mL激动素的液体MS培养基中浸泡1h后，取出，放在灭菌的滤纸上吸干残留液体，放置在含量为1μg/mL IAA和1.75μg/mL玉米素的固体MS培养基上，光照培养箱中用报纸包裹培养1天后，加入农杆菌中浸泡15分钟，然后用灭菌的滤纸吸干残留液，重新放到MS固体培养基上，培养箱中培养2天；将共培养的子叶斜***到含量为500μg/mL羧卞青霉素、75μg/mL卡那霉素、1.75μg/mL玉米素和1.0μg/mL IAA的MS培养基上，培养箱中培养，每-22天的时间更换一次培养基，直至形成愈伤组织，继续培养至愈伤组织会长出幼苗，切取幼苗到含量为50μg/mL Kan及250μg/mL Carb的MS培养基中诱导生根；生根后的幼苗可以进一步切取两株，重新发芽和生根，产生更多的转基因植株。

序列表

<110> 黔南民族师范学院

<120> 一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用

<130> 2017

<141> 2017-09-12

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1125

<212> DNA

<213> 茄科番茄属(Lycopersicon esculentum Mill)

<400> 1

atggatgaca ttgaggataa tgggagatat ccttccaacc cttatggcat gaaccagggt 60

tatgagtcat ccaatcgcca gaagcttcct gttcacgacc cttcttattc aaggcatgtc 120

gacaatcagt atgtggagga ggcggatgat gatgaagaag ttgatggcga agaagaagaa 180

gatgatgatg gcgaagaaaa tggtgttcag cggataggga aagatgtgtt tgatgacgat 240

gatgatgatg atgatgagta tggtgatttg cagaggcatc aaaagaagag gaagttaaag 300

agcttgttat caagttatga gtttgcacct cgagtaccac caccatctac tacagctgca 360

actgctccta agccttcatt tggtggtagg aatccacttt cagattggtc tgaaaatgag 420

acatttattt tgcttgatgc atggggcact aggtttgttc gacatgggag gaagagtctt 480

cgatcagagg aatggcaaga agttgcagac agagtgtcac gggggtccaa aattgagagg 540

acagacaccc aatgtcgtaa ccgtttggat actttgaaaa agaaatacaa aaaggagaag 600

atgaagtttg cagagactgg aagtagcact agcaagtggg tgtacttcaa aaagatggac 660

atgttactaa catcaactcc ccagaaagct ggtgtttcat gtggaatgga ctctggagag 720

tatgttttca tgagcccaaa agcttatctg aatcgtgcta atggcttgga tgagatgagg 780

gacagtcctg ctaactcaga atctgctgat ggtgaggagg atggttcaga ggatcttcca 840

ccaaaaagat caagaaatgt acaaccagga gggaacggga atgggaatgg acattctttc 900

aaattaatag cagattctat ccataaattt agtgagatat atgtgaagat tgagaatagc 960

aagagacagc aaatgatgga actggagaaa atgaggatgg acttccaccg agaattggaa 1020

ctccaaaaga ggcaaattat ggagagagct caggcagaaa ttgcaagaat acgtcaagga 1080

agtgatgaag agaacgacat gtctgctgaa aatgttagtg gatga 1125

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cttcctgttc acgacccttc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ctctcaattt tggaccccc 19

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cggaattctc tagacttcct gttcacgacc cttc 34

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggggtaccaa gcttctctca attttggacc ccc 33

Claims (7)

1.一种SlGT-33基因诱导番茄矮化的用途,其特征在于，将携带有SlGT-33基因沉默片段的沉默载体转移到农杆菌后,再用所述农杆菌侵染番茄子叶；其中, SlGT-33基因如序列1所示；诱导番茄矮化的过程包括：（1）番茄RNA的提取；（2）番茄总RNA反转录；（3）SlGT-33基因的克隆；（4）沉默载体的构建，构建中用到的引物为SlGT-33 -F：5'CTTCCTGTTCACGACCCTTC 3'；

SlGT-33-R：5' CTCTCAATTTTGGACCCCC 3'；

（5）将步骤（4）获得的沉默载体转移到农杆菌；（6）将步骤（5）获得的农杆菌侵染番茄子叶；（7）获得矮化的转基因番茄植株。

2.如权利要求1所述诱导番茄矮化的用途，其特征在于：所述的番茄RNA的提取，是番茄组织放入液氮中速冻10~20s后放入研钵，研磨后，取98-102mg粉末放入1.5mL离心管中，加入0.8-1.2mL RNAiso Plus提取试剂，震荡混匀，室温静置4-6min后，混合液在3-5℃下13100 rpm离心4-6min，吸取上清液880-920µL放入到新1.5mL的离心管中，并加入三氯甲烷245-265µL，混匀后，常温静置4-6min；混合液3-5℃下12500- 13500rpm离心13-17min，吸取最上层澄清液体180-220µL于新的1.5mL的离心管中，加入180-220µL浓度为99-100%的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置4-6min，将混合液3-5℃下13000-13200 rpm离心8-12 min，倒掉上清液，并加入1mL70乙醇，3-5℃下13000-13200rpm离心50-70s，倒掉上清液，吸干残留液体，常温静置干燥；待干燥后加入灭菌的无离子水20~30µl溶解，即得。

3.如权利要求1所述诱导番茄矮化的用途，其特征在于：所述的SlGT-33基因的RNA反转录，是在无菌的环境下，于灭菌的离心管中加入如下反应体系的试剂：番茄RNA0.8-1.2µL、引物1.8-2.2µL、无离子水10-12µL，将加好试剂的离心管放到PCR仪上，74-76℃孵育4-6min；孵育结束后迅速放到冰上冷却4-6min，并加入4-6倍的buffer缓冲液5×ReactionBuffer 4µL、dNTP 2µL、莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶0.8-1.2µL和无离子水8-10µL后，放在PCR上40-44℃温育50-70min，再升高到70-74℃孵育8-12min，取出，零下20℃保存；所述的引物是1.8-2.2mmoL/L的oligodT。

4.如权利要求1所述诱导番茄矮化的用途，其特征在于：所述的SlGT-33基因的克隆，是利用引物SlGT-33-F和SlGT-33-R扩增番茄基因SlGT-33，反应体系试剂如下：2×PrimeSTARMix，12.5µL；SlGT-33-F，1.0µL；SlGT-33-R，1.0µL；cDNA模板1.0µL；无菌水9.5µL；加好后，在PCR仪上放置后进行扩增，扩增的条件如下：变性98℃，2min；复性58℃，30s，片段固定72℃，10min，得到PCR的扩增产物；

所述的沉默载体的构建；是PCR的扩增产物连接到pMD18-T载体上，测序，获得克隆片段的编码序列，在5'加入了酶切位点，合成引物SlGT-33 -F和SlGT-33-R，分别以正向和反向的方式连接到中间载体pHANNIBAL上，然后连接到终载体pBIN19上，获得含有SlGT-33基因沉默片段的沉默表达终载体。

5.如权利要求1所述诱导番茄矮化的用途，其特征在于：将携带有SlGT-33基因沉默片段的所述沉默载体转移到农杆菌，具体是：将农杆菌LBA4404菌种，在含量为48-52mg/L利福平和490-510mg/L的链霉素的YEB的固体培养基上划线，在25-30℃下培养2-3天；大肠杆菌HB101/pRK2013 Helper 菌种在含有5000-5100mg/L的卡那霉素的培养基上划线，密封在35-39℃的培养箱中培养16-18h，取含有SlGT-33基因沉默片段的沉默表达终载体单克隆于不含抗生素的YEB培养基的培养皿中，形成0.4-0.6cm长的菌斑，然后以同样的方式取Helper菌株以及农杆菌与终载体的混合在一起，混匀后，在25-30℃下培养2-3天；用接种环将共培养的菌斑在含有48-52mg/L的利福平、490-510mg/L的链霉素和48-52mg/L的卡那霉素的培养基上划线，在25-30℃下培养2-3天；取单克隆，做菌落PCR，提取质粒PCR，摇菌增殖；保菌，提取质粒。

6.如权利要求1所述诱导番茄矮化的用途，其特征在于：所述的农杆菌侵染番茄子叶，具体是：无菌的环境下，将AC⁺⁺的种子分别利用20~40ml质量浓度0.8-1.2%的次氯酸钠、20~40ml 75%乙醇和20~40ml饱和磷酸钠进行消毒处理；处理完毕后加入无菌水，在25-30℃的摇床上110 rpm摇动培养；待生长整齐后，将发芽的种子在无菌的环境下播种到没有抗生素的MS培养基上培养，直至长出0.8-1.2cm的子叶，子叶在无菌环境条件切成2-3小片，放入含量为0.1-0.3μg/mL 2,4-D和8-12μg/mL 激动素的液体MS培养基中浸泡1h后，取出，放在灭菌的滤纸上吸干残留液体，放置在含量为0.8-1.2μg/mL IAA和1.65-1.85μg/mL 玉米素的固体MS培养基上，光照培养箱中用报纸包裹培养1天后，加入农杆菌中浸泡10-20分钟，然后用灭菌的滤纸吸干残留液，重新放到MS固体培养基上，培养箱中培养2-3天；将共培养的子叶斜***到含量为490-510μg/mL 羧卞青霉素、70-80μg/mL 卡那霉素1.65-1.85μg/mL 玉米素和0.8-1.2μg/mL IAA的MS培养基上，培养箱中培养，每18-22天的时间更换一次培养基，直至形成愈伤组织，继续培养至愈伤组织会长出幼苗，切取幼苗到含量为48-52μg/mL卡那霉素及240-260μg/mL羧卞青霉素的MS培养基中诱导生根；生根后的幼苗进一步切取两株，重新发芽和生根，产生更多的转基因植株。

7.如权利要求6所述诱导番茄矮化的用途，其特征在于：所述的农杆菌侵染番茄子叶，具体是：无菌的环境下，将AC⁺⁺的种子分别利用30ml质量浓度1.0%的次氯酸钠、30ml 75%乙醇和30ml饱和磷酸钠进行消毒处理；处理完毕后加入无菌水，在25-30℃的摇床上110 rpm摇动培养；待生长整齐后，将发芽的种子在无菌的环境下播种到没有抗生素的MS培养基上培养，直至长出0.8-1.2cm的子叶，子叶在无菌环境条件切成2-3小片，放入含量为0.2μg/mL2,4-D和10μg/mL 激动素的液体MS培养基中浸泡1h后，取出，放在灭菌的滤纸上吸干残留液体，放置在含量为1.0μg/mL IAA和1.75μg/mL 玉米素的固体MS培养基上，光照培养箱中用报纸包裹培养1天后，加入农杆菌中浸泡15分钟，然后用灭菌的滤纸吸干残留液，重新放到MS固体培养基上，培养箱中培养2天；将共培养的子叶斜***到含量为500μg/mL 羧卞青霉素、75μg/mL 卡那霉素1.75μg/mL 玉米素和1.0μg/mL IAA的MS培养基上，培养箱中培养，每20天的时间更换一次培养基，直至形成愈伤组织，继续培养至愈伤组织会长出幼苗，切取幼苗到含量为50μg/mL卡那霉素及250μg/mL羧卞青霉素的MS培养基中诱导生根；生根后的幼苗进一步切取两株，重新发芽和生根，产生更多的转基因植株。

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