CN102803498B

CN102803498B - 生物质水解工艺

Info

Publication number: CN102803498B
Application number: CN201080058472.2A
Authority: CN
Inventors: W.韩; 李冬敏; M.刘
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Cofco Corp; Novo Nordisk AS
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Cofco Corp; Novo Nordisk AS
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2030-12-21
Also published as: CN102803498A

Abstract

本发明涉及包含纤维素水解酶的分次剂量的生物质工艺。

Description

生物质水解工艺

技术领域

本发明涉及工艺，所述工艺包含在含木素纤维素材料的水解中使用纤维素水解酶的分次投入(split dosing)。

发明背景

由于化石燃料的有限储备和关于温室气体排放的担心，存在关于使用可再生能源，例如发酵产物，例如生物乙醇的越来越多的关注。来自生物质即含木素纤维素材料的乙醇生产是本领域已知的，并且可以包括含木素纤维素材料的预处理、酶促水解和发酵成乙醇。在水解中使用的酶的成本已视为此类工艺的收益性的限制。因此，需要提供改善的并且更有效的工艺用于将含木素纤维素材料酶促水解成适合于发酵的底物。

本申请的发明人目前已令人惊讶地发现通过将纤维素水解酶分成至少2个剂量并且在不同阶段加入所述剂量，可以显著改善高干固体生物质浆料的水解。

发明概述

本发明涉及这样的工艺，其包括酶促水解高干固体浓度的含木素纤维素材料，和任选地将水解产物发酵成发酵产物，优选乙醇，其中纤维素水解酶在该工艺中的两个或更多个阶段加入。

相应地，在第一个方面，本发明涉及用于自含木素纤维素材料产生水解产物的工艺，其包括如下步骤，(a)预处理含木素纤维素材料；(b)形成包含水、预处理的含木素纤维素材料和纤维素水解酶的浆料，(c)且温育所述浆料，(d)加入更多水解酶，和(e)温育所述浆料，以产生水解产物，其中所述浆料具有至少25％的干固体浓度。

发明详述

含木素纤维素材料

术语“含木素纤维素材料”在本文中用于指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。含木素纤维素材料通常称为“生物质”。

木素纤维素的结构不是酶促水解能够直接接近的。因此，木素纤维素必须在压力、湿度和温度的适当条件下例如通过酸水解进行预处理，以便破裂木质素密封且破坏纤维素的晶状结构。这引起半纤维素级分的增溶和糖化。纤维素级分随后可以水解，例如通过纤维素酶酶促水解，以将碳水化合物聚合物转化成单糖和寡糖，其可以发酵成所需发酵产物，例如乙醇。任选地，将发酵产物回收，例如通过蒸馏进行回收。

任何含木素纤维素材料都根据本发明加以考虑。含木素纤维素材料可以是含有木素纤维素的任何材料。在一个优选实施方案中，含木素纤维素材料含有至少30重量％、优选至少50重量％、更优选至少70重量％、甚至更优选至少90重量％木素纤维素。应当理解含木素纤维素材料还可以包含其他组成成分，例如纤维素材料，包括纤维素和半纤维素，并且还可以包含其他组成成分，例如蛋白质性质材料、淀粉、糖例如可发酵糖和/或不可发酵糖。

含木素纤维素材料一般例如在植物的茎、叶、皮、壳(hull，husk)和穗轴或树的叶、枝和木材中发现。含木素纤维素材料可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废物、废纸以及浆和造纸厂残余物。在本文中应当理解含木素纤维素材料可以是在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。

含木素纤维素材料可以包含玉米秸秆，硬木材例如白杨木(poplar)和桦木(birch)，软木材例如松材，柳枝稷(switch grass)，谷类稻草(cereal straw)和/或壳(husk)例如来自稻、小麦、大麦、黑麦等的稻草，市政固体废物(MSW)，工业有机废物，办公室用纸，木屑(wood chip)，甘蔗渣，纸或浆加工废物或其混合物。

在一个优选实施方案中，含木素纤维素材料是玉米秸秆。在另一个优选方面，含木素纤维素材料是玉米纤维。

预处理

含木素纤维素材料可以以任何合适方式进行预处理。预处理可以在水解和/或发酵前进行。预处理的目的是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，并且这种方式改善了水解速率。预处理方法例如湿氧化和碱预处理靶向木质素，而稀酸和自水解靶向半纤维素。蒸汽***是靶向纤维素的预处理的例子。

根据本发明，预处理步骤(a)可以是使用本领域众所周知的技术的常规预处理步骤。在一个优选实施方案中，预处理在含水浆料中进行。含木素纤维素材料可以在预处理过程中以10-80重量％之间、优选20-70重量％之间、尤其是30-60重量％之间例如约50重量％的量存在。

预处理在水解和/或发酵之前进行。

术语“化学处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理的例子包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳处理。进一步地，湿氧化和pH控制的水热解也是考虑的化学预处理。

在一个优选实施方案中，化学预处理是酸处理，更优选地连续稀酸和/或弱酸处理，例如用硫酸或另一种有机酸和/或无机酸处理，所述酸例如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。还可以使用其他酸。弱酸处理意指处理pH处于1-5的范围中，优选pH 1-3。在一个特定实施方案中，酸浓度是在0.1-2.0重量％酸(优选硫酸)的范围中。酸可以与含木素纤维素材料接触，并且混合物可以在160-220℃，例如165-195℃范围的温度保持范围在例如1-60分钟例如2-30分钟或3-12分钟的时期。可以应用强酸例如硫酸的添加以去除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。

还考虑了其他技术。纤维素溶剂处理已显示将约90％纤维素转化成葡萄糖。还已显示当木素纤维素结构被破坏时，酶促水解可以得到极大增强。碱H₂O₂、臭氧、有机溶剂(organosolv)(使用在含水的醇中的(Al)₂SO₄、FeCl₃、路易斯酸)、甘油、二噁烷、苯酚或乙二醇属于已知的破坏纤维素结构且促进水解的溶剂(Mosier等人Bioresource Technology 96(2005)，第673-686页)。

用碱例如NaOH、Na₂CO₃和/或氨等的碱性化学预处理也根据本发明加以考虑。使用氨的预处理方法在例如WO2006110891、WO200611899、WO200611900、WO2006110901(其在此引入作为参考)中描述。

湿氧化技术涉及氧化剂的使用，例如：基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的例子包括用DMSO(二甲亚砜)等处理。化学预处理一般进行1-60分钟，例如5-30分钟，但取决于待预处理的材料可以进行更短或更长的时期。

合适预处理方法的其他例子由下述描述：Schell等人(2003)Appl.Biochemand Biotechn.第105-108卷，第69-85页，Mosier等人Bioresource Technology96(2005)673-686，Ahring等人在WO2006032282和WO200160752中，Foody等人在WO2006034590中，和Ballesteros等人在美国公开号20020164730中，所述参考文献在此全部引入作为参考。

术语“机械预处理”指促进自含木素纤维素材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的任何机械(或物理)处理。例如，机械预处理包括多个类型的研磨、照射、汽蒸/蒸汽***、湿氧化和其他水热处理。

机械预处理包括粉碎(大小的机械减少)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨。机械预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽***)。在本发明的一个实施方案中，高压意指在300-600psi范围中、优选400-500psi例如约450psi的压力。在本发明的一个实施方案中，高温意指在约100-300℃范围中、优选约140-235℃的温度。在一个优选实施方案中，机械预处理是分批工艺，蒸***水解仪***(steam gun hydrolyzer system)，其使用如上定义的高压和高温。Sunds Hydrolyzer(可从Sunds Defibrator AB(瑞典)获得)可以用于此。

在一个优选实施方案中，进行化学和机械两种预处理。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高的温度和/或压力处理。需要时，化学和机械预处理可以连续或同时进行。

相应地，在一个优选实施方案中，对含木素纤维素材料实施化学和机械两种预处理，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

在一个优选实施方案中，机械预处理在蒸汽***预处理前进行。

在一个优选实施方案中，预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽***步骤进行。在另一个优选实施方案中，预处理作为氨纤维***步骤(或AFEX预处理步骤)进行。

如在本发明中使用的术语“生物学预处理”指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素自含木素纤维素材料分离和/或释放的生物学预处理。生物学预处理技术可以涉及应用木质素溶解微生物(参见例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.，编辑，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，于EnzymaticConversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.，编辑，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society， Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.，编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；以及Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

预处理的含木素纤维素材料的洗涤

当预处理含木素纤维素材料时，可产生对酶抑制性的降解产物。洗涤预处理的含木素纤维素材料以去除酶的抑制剂可以改善酶促水解。

抑制剂是木素纤维素降解产物，包括木质素降解产物、纤维素降解产物和半纤维素降解产物。木质素降解产物可以在实质上是酚类的。半纤维素降解产物包括来自糖(例如己糖和/或戊糖)的呋喃，所述糖包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、***糖和木糖，包括寡糖。认为对酶抑制性的化合物包括在PCS液中存在的木寡糖(XOOs)或XOO和可溶性木质素的复合物。根据本发明，通过用洗涤溶液洗涤从预处理的含木素纤维素材料中去除对酶抑制性的可溶性化合物。洗涤溶液优选是水性洗涤溶液。洗涤溶液可以是基本上纯的水溶液，或具有显著量的添加剂例如去污剂和/或有机溶剂的水，以改善对酶抑制性的化合物的提取和/或可溶性。

水解

在发酵前和/或与发酵同时，将预处理且洗涤的含木素纤维素材料酶促水解，以将纤维素和半纤维素分解成糖和/或寡糖。

在一个优选实施方案中，水解可以作为分批补料工艺进行，其中将预处理的含木素纤维素材料(底物)逐步补料给例如含酶的水解溶液。预处理的含木素纤维素材料可以在一个或多个不同批次中，作为一个或多个不同的连续流或作为一个或多个不同批次和一个或多个不同的连续流的组合供应给含酶水解溶液。水解自始至终的干固体浓度是至少20％、更优选至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％或甚至至少30％。

根据本发明，使用至少酶内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)水解预处理的含木素纤维素材料。

可以在水解过程中应用的另外的酶在下文“酶”部分中描述，并且包括木聚糖酶、***呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切***糖酶、内切或外切半乳聚糖酶、及其两种或更多种的混合物。

用于水解的一种或多种酶能够将洗涤的预处理的含木素纤维素材料直接或间接转化成可发酵糖，其可以发酵成所需发酵产物，例如乙醇。

根据本发明，将酶的量分成至少两个剂量，其中第一个在水解步骤起始时应用，而一个或多个剩余剂量随后在水解过程中应用。

在一个优选实施方案中，将酶的量分成大致相等大小的两个剂量，前一半在水解步骤起始时应用，而在应用剩余剂量前，将浆料温育约12-48小时，优选约18-36小时，更优选约20-30小时。水解继续另外的48-72小时。

同样考虑了其中将酶的量分成大致相等和/或不同大小的几个剂量且在水解过程中以大致有规律和/或无规律的间隔应用的实施方案。酶甚至可以在水解或至少水解的前一半过程中作为连续添加的稀释酶制备物应用。

水解即工艺步骤(c)+(e)的完整持续时间优选在72-120小时之间。

不受理论束缚，认为来自使用分次酶剂量的积极效果是因为一般而言酶在水解步骤过程中是灭活的，所述酶尤其是纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II以及程度较低的内切葡聚糖酶。这是为何在其中作用于酶的剪切力更强的高干固体浓度下观察到积极效果的原因。通过使用分次酶投入且延迟一个或多个剂量向温育中加入，在水解的随后阶段中的剩余酶活性得到增加。

酶促处理在可以通过本领域技术人员容易地测定的条件下在合适的水环境中进行。优选地，水解在25℃-70℃之间、优选在40℃-60℃之间、尤其是约50℃的温度进行。该工艺优选在3-8范围中的pH、优选pH 4-6、尤其是约pH 5进行。

在一个实施方案中，可以将水解产物发酵以产生发酵产物。

考虑水解和发酵可以同时(SHHF工艺)或连续(SHF工艺)进行。

发酵

根据本发明，通过能够将可发酵糖例如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或间接发酵成所需发酵产物的至少一种发酵生物发酵预处理的(且水解的)含木素纤维素材料。

发酵优选进行8-96小时之间、优选12-72、更优选24-48小时。在一个实施方案中，发酵在20-40℃之间、优选26-34℃、特别是约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH是pH 3-6、优选约pH 4-5。

优选用于乙醇发酵的是属于物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母，优选针对高水平乙醇即高达例如约10、12或15体积％乙醇或更多，例如20体积％乙醇有抗性的菌株。

根据本发明考虑的是同时水解和发酵(SHF)。在一个实施方案中，不存在用于水解的单独保留阶段，意指一种或多种水解酶和发酵生物一起加入。当发酵与水解同时进行时，温度优选在26℃-35℃之间、更优选在30℃-34℃之间、例如约32℃。根据本发明可以应用包括在不同温度的至少两个保留阶段的温度程序。

在预处理的含木素纤维素材料的洗涤过程中，溶解的糖可以在再循环的水性洗涤溶液中累积。溶解的糖将包含来自半纤维素降解的C5糖，例如木糖。这些糖可以用合适的发酵生物进行发酵，所述发酵生物能够将C5糖转化成所需发酵产物。这种C5发酵可以分开进行，或者可以将在再循环的水性洗涤溶液中累积的溶解的糖加入水解的含木素纤维素材料中，用于组合的C6和C5发酵。此类发酵优选用能够发酵C6糖(例如葡萄糖)和C5糖(例如木糖)两者的至少一种生物进行。可替代地，发酵可以用各自最佳化以利用C6或C5糖的至少两种单独的生物进行，或者在一个发酵步骤中在允许两种生物发酵的条件下，或者作为至少两个发酵步骤，各自在允许所述生物之一发酵的条件下。

本发明的工艺可以作为分批、分批补料或作为连续工艺进行。优选地，发酵步骤作为连续发酵进行。

回收

在发酵后，发酵产物可以与发酵肉汤分离。肉汤可以进行蒸馏以提取发酵产物，或发酵产物可以通过微滤或膜过滤技术从发酵肉汤中提取。可替代地，发酵产物可以通过汽提(stripping)进行回收。回收方法是本领域众所周知的。

发酵产物

本发明的工艺可以用于产生任何发酵产物。尤其考虑的发酵产物包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H₂和CO₂)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。

还考虑的产物包括可消费的醇工业产品，例如啤酒和葡萄酒。在一个优选实施方案中，发酵产物是醇，尤其是乙醇。根据本发明获得的发酵产物例如乙醇可以优选是燃料酒精/乙醇。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。

发酵生物

术语“发酵生物”指适合于产生所需发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物。根据本发明尤其合适的发酵生物能够将糖例如葡萄糖直接或间接发酵，即转化成所需发酵产物。还适合的是能够将C5糖例如木糖转化成所需发酵产物的发酵生物。发酵生物的例子包括真菌生物，尤其是酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株；毕赤酵母属(Pichia)菌株，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)，例如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属(Candida)菌株，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)或博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)菌株。其他考虑的酵母包括发酵单胞菌属(Zymomonas)；汉逊酵母属(Hansenula)，特别是异常汉逊酵母(H.anomala)；克鲁维酵母属(Klyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(S.pombe)菌株。

商购可得的酵母包括例如ETHANOL RED^TM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast，USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA获得)，GERT STRAND(可从瑞典Gert Strand AB获得)，和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。ANQI YEAST(可从Anqi yeast(CHIFENG)CO.，LTD，中国获得)。

酶

尽管在本发明的工艺的背景中未具体提及，但应当理解酶(以及其他化合物)以“有效量”使用。

纤维素酶：如本文使用的术语“纤维素酶”应理解为包含纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，例如纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。纤维素酶在水解步骤中应用。

为了有效，纤维素和半纤维素的消化需要协同作用的几个类型的酶。至少3个类别的酶对于将纤维素转化成可发酵糖是必需的：随机切开纤维素链的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；从纤维素链末端切割纤维二糖单位的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，和将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化成葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。在涉及纤维素生物降解的这3个类别的酶中，纤维二糖水解酶是用于降解天然结晶纤维素的关键酶。术语“纤维二糖水解酶I”在本文中定义为纤维素1，4-β-纤维二糖糖苷酶(也称为外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或1，4-β-纤维二糖水解酶)活性，如在酶类别EC 3.2.1.91中定义的，其通过从链的非还原端释放纤维二糖，催化纤维素和纤维四糖中的1，4-β-D-葡糖苷键水解。术语“纤维二糖水解酶II活性”的定义是相同的，除了纤维二糖水解酶II从链的还原端攻击外。

内切葡聚糖酶(EC编号3.2.1.4)催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷键、在混合的β-1，3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖和含有纤维质部分的其他植物材料中的β-1，4键的内水解。审定名称是内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖(glucano)水解酶，但在本说明书中使用缩写术语内切葡聚糖酶。

在一个优选实施方案中，纤维素酶活性可以衍生自真菌来源，例如木霉属(Trichoderma)菌株，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株；腐质霉属(Humicola)菌株，例如特异腐质霉(Humicola insolens)菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)菌株，优选Chrysosporium lucknowense菌株。

在一个优选实施方案中，纤维素酶制备物包含具有纤维素分解增强活性(GH61A)的多肽，优选公开于WO2005074656中的多肽。纤维素酶制备物可以进一步包含β-葡糖苷酶，例如公开于US 60/832,511中的融合蛋白。在一个实施方案中，纤维素酶制备物还包含CBH II，优选土生梭孢壳(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II CEL6A。在一个实施方案中，纤维素酶制备物还包含衍生自里氏木霉的纤维素酶。在一个优选实施方案中，纤维素酶制备物是在实施例1中使用且公开于WO 2008/151079中的纤维素酶制备物，所述纤维素酶制备物包含衍生自里氏木霉的纤维素分解酶，公开于WO2005074656中具有纤维素分解增强活性(GH61A)的多肽，和公开于WO 2008/151079中的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶。

纤维素酶可以是商购可得的产品，例如 1.5L或CELLUZYME^TM或Cellic Ctec^TM(都来自Novozymes A/S、丹麦)或ACCELLERASE^TM 1000或ACCELLERASE^TM 1500(都来自Genencor Int.)。

纤维素酶可以以0.1-100FPU/克干固体(DS)、优选0.5-50FPU/克DS、尤其是1-20FPU/克DS的范围投入。

纤维素酶可以以0.1-10000mg酶蛋白(EP)/kg干固体(DS)、优选0.5-5000mgEP/kg DS、尤其是1-2500mg EP/kg DS的范围投入。

半纤维素酶：半纤维素可以通过半纤维素酶和/或酸水解进行分解，以释放其五和六碳糖组分。

可以使用适合于在水解半纤维素中使用的任何半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、***呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切***糖酶、内切或外切半乳聚糖酶、及它们中两种或更多种的混合物。优选地，用于在本发明中使用的半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，并且更优选地，半纤维素酶是这样的外切作用的半纤维素酶，其具有在低于pH 7、优选pH 3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适合于在本发明中使用的半纤维素酶组合物的例子包括VISCOZYME^TM和ULTRAFLO^TM(可从NovozymesA/S，丹麦获得)。

用于在本发明中使用的木聚糖酶(EC 3.2.1.8)优选是内切-1，4-β-木聚糖酶，并且优选属于糖苷水解酶家族10或11(GH10或GH11)。GH10或GH11在Cantarel等人(2008)于Nucl.Acids Res.2009 37：D233-D238中和在www.cazy.org上定义。

木聚糖酶可以是任何来源的，包括哺乳动物、植物或动物来源；然而，优选木聚糖酶是微生物来源的。特别地，木聚糖酶可以是可衍生自丝状真菌或酵母的那种。优选地，木聚糖酶衍生自丝状真菌例如曲霉属菌种(Aspergillus sp.)、芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)、腐质霉属菌种(Humicola sp.)、毁丝霉属菌种(Myceliophotora sp.)、Poitrasia属菌种、根毛霉属菌种(Rhizomucor sp.)或木霉属。木聚糖酶优选是GH10木聚糖酶。

最优选的是衍生自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)且作为木聚糖酶II公开于WO 1994/021785中的木聚糖酶。

在本发明的工艺中应用的用于处理使用过的洗涤溶液的木聚糖酶优选是固定的木聚糖酶。如果使用非固定的木聚糖酶，那么它以0.001-1.0g/kg DS底物的量、优选以0.005-0.5g/kg DS底物的量、且最优选0.05-0.10g/kg DS底物加入。

木聚糖酶还可以以0.001-1.0g/kg DS底物的量、优选以0.005-0.5g/kg DS底物的量、且最优选0.05-0.10g/kg DS底物在本发明的水解步骤中加入。

阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基自酯化的糖的水解，其通常为***木聚糖中的***糖。合适的阿魏酸酯酶可以得自丝状真菌(例如，木霉属、亚灰树花菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、镰孢属(Fusarium))或细菌(例如芽孢杆菌属)菌株，例如得自黑曲霉(Aspergillus niger)，例如由Faulds等人1994，Microbiology，140，第779-787页描述的FAEIII阿魏酸酯酶。

***呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)催化α-L-阿糖胞苷中的末端非还原α-L-***呋喃糖苷残基的水解。

半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)，***半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶，催化***半乳聚糖中的1，4-D-半乳糖苷键的内水解。

果胶酶(EC 3.2.1.15)催化果胶酸盐和其他聚半乳糖醛酸中的1，4-α-D-半乳糖醛酸(galactosiduronic)键的水解。

木糖葡聚糖酶催化木葡聚糖的水解。

半纤维素酶可以以有效水解半纤维素的量加入，例如以约0.001-0.5重量％干固体(DS)的量，更优选约0.05-0.5重量％DS。

材料与方法

酶：

纤维素酶制备物包含衍生自里氏木霉的纤维素分解酶，公开于WO2005074656中具有纤维素分解增强活性(GH61A)的多肽，和公开于WO2008/151079中的烟曲霉β-葡糖苷酶。所述纤维素酶制备物公开于WO2008/151079中。

实施例1

将玉米秸秆在205℃使用蒸汽***预处理5分钟。将所得到的PCS(预处理的玉米秸秆)使用自来水洗涤，以去除可溶性抑制剂。分批补料水解用经洗涤的PCS分别以15％、20％和30％TS(总固体)进行。经洗涤的PCS的所有分批补料以12.6％TS起始，并且需要PCS的1、3或4个额外载量以达到15％、20％或30％的指定最终TS。纤维素酶制备物在0小时以6mg EP/g纤维素的酶剂量加入，或分成相等两半，并且一半在0小时加入，而另一半在24小时加入。水解在50℃和pH 5.0进行96小时。

每24小时抽取全部浆料的样品，并且通过HPLC测定糖浓度。结果显示于表1中。葡萄糖当量转化计算为在PCS中的总葡萄糖潜力(potential)中产生的纤维二糖和葡萄糖的百分比。

实施例2

重复上述测试，以便获得约25％TS含量的数据，除反应器设置稍有不同外。在实施例1中，使用垂直反应器设置，而在本实施例中，使用水平反应器。一般而言，这将导致更低的糖得率。

Claims

1.一种用于从含木素纤维素材料产生水解产物的工艺，其包括如下步骤，

(a)预处理含木素纤维素材料；

(b)形成包含水、预处理的含木素纤维素材料和纤维素水解酶的浆料，

(c)温育步骤(b)中所形成的所述浆料，

(d)向步骤(c)的所述的温育的浆料加入更多水解酶而不加入发酵生物，和

(e)温育步骤(d)中所形成的所述浆料，以产生水解产物，

其中所述浆料具有至少25％的干固体浓度。

2.权利要求1的工艺，其中在步骤(d)前，将所述步骤(c)的浆料温育12-48小时。

3.权利要求2的工艺，其中将所述步骤(c)的浆料温育18-36小时。

4.权利要求3的工艺，其中将所述步骤(c)的浆料温育20-30小时。

5.权利要求1-4中任一项的工艺，其中所述步骤(c)+(e)的持续时间是72-120小时。

6.权利要求1-4中任一项的工艺，其中所述纤维素水解酶包含纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II和内切葡聚糖酶中的一种或多种。

7.权利要求1-4中任一项的工艺，其中将所述步骤(e)的水解产物发酵以产生发酵产物。

8.权利要求1-4中任一项的工艺，其进一步包括步骤(f)同时水解和发酵，该步骤(f)在步骤(e)之后。

9.权利要求1-4中任一项的工艺，其进一步包括包含回收所述发酵产物的步骤。

10.权利要求1-4中任一项的工艺，其中所述发酵产物是乙醇。

11.权利要求1-4中任一项的工艺，其中所述含木素纤维素材料源于选自下述的材料：玉米秸秆，硬木材，软木材，谷类稻草，柳枝稷，稻壳，市政固体废物，工业有机废物，办公室用纸或其混合物。

12.权利要求11的工艺，其中所述含木素纤维素材料源于选自下述的材料：白杨木和桦木。

13.权利要求11的工艺，其中所述含木素纤维素材料源于麦秸。

14.权利要求1-4中任一项的工艺，其中所述含木素纤维素材料源于玉米纤维。

15.权利要求1-4中任一项的工艺，其中所述步骤(a)中的预处理是使用有机酸和/或无机酸进行酸预处理。

16.权利要求15的工艺，其中所述步骤(a)中的预处理是使用硫酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和/或其混合物进行酸预处理。

17.权利要求1-4中任一项的工艺，其中将所述步骤(a)中的含木素纤维素材料用0.1-2.0重量％的酸进行酸预处理。

18.权利要求17的工艺，其中所述酸为硫酸。

19.权利要求1-4中任一项的工艺，其中将所述步骤(a)中的含木素纤维素材料在高温和/或高压下进行机械预处理。

20.权利要求中1-4任一项的工艺，其中将所述步骤(a)中的含木素纤维素材料通过蒸汽***、稀酸蒸汽***和/或湿氧化进行预处理。