JP2010001292A - Vegfおよびbmp1に相同なポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血管内皮性増殖因子(VEGF)と骨形態形成タンパク質1に関連する新規のポリペプチドである血管内皮性増殖因子−E(VEGF−E)のアンタゴニストを第二薬剤と組み合わせて投与する。第二薬剤は、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、血管新生抑制剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗VEGF抗体、FGFアンタゴニスト、PDGFアンタゴニスト、又はErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4又はVEGFレセプターに結合する抗体である。また、さらに第三の治療剤として、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、血管新生抑制剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗VEGF抗体、FGFアンタゴニスト、PDGFアンタゴニスト、又はErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4又はVEGFレセプターに結合する抗体を投与する。
【選択図】なし
Description
ヘパリン結合内皮細胞増殖因子である、VEGFは、数年前にウシ下垂体濾胞細胞又は濾胞星状(folliculo-stellate)細胞の培養培地から同定精製された。Ferrara et al., Biophys Res. Comm., 161: 851 (1989) を参照のこと。ヒトVEGF(hVEGF)cDNAでトランスフェクションされた細胞で馴化した培養培地は毛細管内皮細胞の増殖を促進したが、コントロール細胞の培養培地はこれを促進しなかった。Leung et al., Science, 246: 1306 (1989)。VEGFは、濾胞細胞または濾胞星状細胞(FC)において生産され、形態学的によく特徴付けられている顆粒細胞の集団である、天然に存在する化合物である。FCは分泌細胞間に細胞質プロセスを伝える星状細胞である。
このように、VEGFは、過剰な組織成長の不存在下、血管上皮細胞に対する選択的な作用が重要であるような症状、例えば、糖尿病性の潰瘍および、皮下傷害のような外傷から生じる血管損傷の処置に有用である。VEGFは血管(動脈および静脈)内皮細胞増殖因子であり、損傷を受けた細胞を回復させ(血管形成と称される過程)、新しい血管の形成を刺激する(血管新生と称される過程)。
腫瘍の増殖の場合、血管新生は過形成から新形成への移行と、増殖する充実性腫瘍への栄養の提供に関し、極めて重要であると思われる。Folkman et al., Nature, 339: 58 (1989)。血管新生は、腫瘍細胞に、正常細胞と比べて有利な増殖と増殖自律性を獲得させる。しかるべく、乳ガンおよび他のいくつかの腫瘍において、腫瘍セクションにおける微小血管の密度と患者の生存の相関が観察された。Weidner et al., N Engl J Med, 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992)。
もう1つの態様では、本発明は、VEGF−Eポリペプチドの発現に適当な条件下で上記宿主細胞を培養し、この細胞培養物からVEGF−Eポリペプチドを回収することを含む、VEGF−Eポリペプチドの製造方法を提供する。さらに、この方法によって製造されるポリペプチドを提供する。
もう1つの態様では、本発明は配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
本発明のもう1つの側面では、VEGF−Eポリペプチドを担体と組み合わせて含む組成物を提供する。好ましい側面では、この組成物は治療有効量のポリペプチドを含み、ここに担体は製薬的に許容される担体である。また、この組成物がさらに、心臓血管、内皮または血管新生薬剤を含むのが好ましい。
さらなる態様では、本発明は心臓血管障害または内皮障害の処置用の組成物を製造する方法であって、治療有効量のVEGF−Eポリペプチドを担体と混合することを含む方法を提供する。
もう1つの態様では、本発明は以下のものを含む医薬品を提供する:
(a)上記組成物;
(b)該組成物を含む容器;
(c)心臓血管障害または内皮障害の処置における該VEGF−Eポリペプチドの使用に言及する、該容器に貼られたラベル、または該医薬品に含まれるパッケージ内の印刷物。
(a)宿主由来のサンプルからVEGF−Eをコードする核酸配列を単離し;ならびに、
(b)VEGF−Eをコードする核酸配列中の突然変異を決定する。
さらなる態様では、本発明は、哺乳類の心臓血管障害および内皮障害の診断方法であって、
(a)哺乳類から得られた組織細胞の試験サンプル中、および、
(b)同細胞型の既知の正常組織細胞のコントロールサンプル中において、VEGF−Eポリペプチドをコードする遺伝子のを発現レベルを検出することを含む方法を提供し、ここでは、試験サンプル中の発現レベルがコントロールより高いか、あるいはより低い場合には、該試験組織細胞のソースである哺乳類が心臓血管または内皮の機能不全を有していることが示される。
(a)ポリペプチドが細胞の増殖を刺激する条件で、細胞と候補化合物を接触させ;
(b)細胞増殖が該化合物によって阻害される程度を測定することを含む方法を提供する。
さらに、上記方法によって同定されたVEGF−Eポリペプチドに対するアゴニストを提供する。
また、VEGF−Eポリペプチドの発現または活性を阻害する化合物を同定する方法であって、
(a)化合物がポリペプチドと相互作用するのに十分な条件および時間で、候補化合物をポリペプチドと接触させ;ならびに、
(b)化合物がポリペプチドと相互作用する程度を測定することを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明はVEGF−Eポリペプチドの発現または活性を阻害する化合物を提供する。
もう1つの態様では、本発明は哺乳類の血管新生障害の処置方法であって、VEGF−Eポリペプチドに対する有効量のアンタゴニストを該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。好ましい態様では、血管新生障害は癌または加齢性黄斑変性である。もう1つの好ましい態様では、該哺乳類はヒトである。さらなる好ましい側面では、有効量の血管新生薬剤を該アンタゴニストと組み合わせて投与する。
さらなる側面では、本発明は、哺乳類(好ましくはヒトである)の、VEGF−Eポリペプチドによって誘導される血管新生の阻害方法であって、該哺乳類に治療有効量の抗体を投与することを含む方法を提供する。また該哺乳類は、好ましくは腫瘍または網膜障害を有する。別の好ましい側面では、該哺乳類は癌を有し、該抗体を化学療法薬、生長阻害剤または細胞毒性物質と組み合わせて投与する。
さらに別の好ましい側面では、本発明は、哺乳類の心臓血管障害、内皮障害または血管新生障害の診断方法であって、(a)抗体を、該哺乳類から得られた組織細胞の試験サンプルと接触させ、(b)抗VEGF−E抗体と、試験サンプル中のVEGF−Eポリペプチドの複合体形成を検出することを含む方法を供給する。
さらなる態様では、本発明は以下のものを含む製品を提供する:
容器;
容器のラベル;および、
容器内に含有される抗VEGF−E抗体を含む組成物
(容器のラベルは、該組成物を治療的または診断的方法において用いることができることを示す)。
I.定義
本明細書中で用いる「血管内皮細胞増殖因子−E」または「VEGF−E」とは、図2のヒトアミノ酸配列、VEGFおよび骨形成タンパク質1と相同性を有しかつVEGFの生物学的活性に必要とされることが示されたすべてのVEGFシステイン残基が完全に保存されている配列を含む、本明細書中に記載の哺乳類の増殖因子を表す。VEGF−Eの発現には、ヒト胎児骨、胸腺、胃腸管、ならびに胎児精巣、肺およびリンパ節、および以下の実施例に示される他の組織における発現が含まれる。天然のVEGF−Eの生物学的活性は、臍静脈内皮細胞の選択的増殖および/または生存を促進し、多能性線維芽細胞の増殖を誘導し、ヒト内皮セルラインにおいて即時型遺伝子c−fosを誘導し、心臓細胞の筋細胞肥大を引き起こし、副腎皮質毛細管内皮細胞のVEGF刺激性増殖を阻害するか、あるいは、対応する天然VEGF−Eの少なくとも1つのエピトープに対して作成された抗体と免疫学的に交差反応性である免疫エピトープを有する、その任意のアナログまたは変異体と共有される。本明細書中のヒトVEGF−Eはラットおよびマウス細胞に対して活性であり、このことから種間で保存されていることが示される。さらに本明細書中のVEGF−Eは成長板領域で発現され、胎児筋細胞を取り囲むことが示された。
本明細書中で用いる用語「VEGF−Eポリペプチド」および「VEGF−E」には、天然配列VEGF−EポリペプチドおよびVEGF−Eポリペプチド変異体(本明細書中でさらに定義されているもの)が含まれる。VEGF−Eポリペプチドは、ヒト組織型または他のソースのような種々のソースから単離することができ、また、組換え法あるいは合成法によって製造することができる。
通常、VEGF−Eポリペプチド変異体は、図2のアミノ酸配列と、少なくとも約80%アミノ酸配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも約90%アミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約95%アミノ酸配列同一性を有する。
「鬱血性心不全」または「CHF」は、進行性の病理状態であり、ここでは心臓が徐々に、末梢組織に酸素化血をデリバリーするのに適当な心臓出力(心臓によって送り出される、時間あたり血液量)を供給できなくなる。CHFが進行するにつれて、構造的および血流力学的損傷が生じる。これらの損傷はさまざまに現れるが、1つの特徴的徴候は心室肥大である。CHFは多数の種々の心臓障害の一般的な最終結果である。
これらすべてに対する処置および、心臓肥大を伴ってもよいし、伴わなくてもよい他の心臓血管障害および内皮障害に対する処置は本発明に包含される。
処置を目的とする「哺乳類」とは、ヒト、およびイヌ、ウマ、ネコ、乳牛、ヒツジ、ブタなどのような家畜(domestic and farm animals)、および動物園の、競技用、もしくはペット動物を含む、哺乳類として分類されるあらゆる動物を表す。好ましくは哺乳類はヒトである。
1つまたはそれ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時に投与することおよび任意の順序で連続投与することが含まれる。
A.完全長VEGF−Eポリペプチド
本発明は、本明細書中、VEGF−Eと称されるポリペプチドをコードする、新規に同定単離されたヌクレオチド配列を提供する。具体的には、以下の実施例にさらに詳細に開示されているように、VEGF−EポリペプチドをコードするcDNAを同定単離した。BLAST配列アラインメントコンピュータープログラムを用い、VEGF−EポリペプチドがVEGFおよびBMP1と一定の配列同一性を有していることがわかった。
本明細書中に記載の、完全長の天然配列VEGF−Eポリペプチドに加えて、VEGF−E変異体を調製することが可能であると考えられる。VEGF−E変異体は、VEGF−EをコードするDNAに適当なヌクレオチド変更を導入するか、あるいは所望のVEGF−Eポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者であれば、アミノ酸変更がVEGF−Eポリペプチドの翻訳後プロセッシング、例えばグリコシル化部位の数または位置もしくは膜アンカー性質を変化させ得ることを理解するであろう。
例えば、米国特許第5364934号に記載の保存的および非保存的突然変異に関するいずれかの技術およびガイドラインを用いて、天然の完全長配列VEGF−Eまたは、本明細書中に記載のVEGF−Eポリペプチドの種々のドメインに変異を施すことができる。変異は、VEGF−Eポリペプチドをコードする1つまたはそれ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であって、天然配列のVEGF−Eと比べて、VEGF−Eポリペプチドのアミノ酸配列に変化を生じさせるものであり得る。場合により、この変異は、VEGF−Eポリペプチドの1つまたはそれ以上のドメインにおいて、少なくとも1つのアミノ酸が他のいずれかのアミノ酸で置換されていることによるものである。所望の活性に不都合な影響を与えることなく、いずれのアミノ酸残基を挿入、置換または欠失させることができるかの決定に関する指針は、VEGF−Eポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子と比較し、高度に相同な領域内に施されるアミノ酸配列変化の数を最小にすることに見出すことができる。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の構造および/または化学的性質を有する別のアミノ酸と取り替えること、例えばロイシンをセリンで置換すること、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、アミノ酸1〜5個の範囲内であることもある。可能な変異は、該配列にアミノ酸の挿入、欠失または置換を計画的に施し、得られた変異体を、以下の実施例に記載のインビトロアッセイにおける活性に関して試験することによって決定することができる。
また、走査性アミノ酸(scanning amino acid)分析を用いて、1つまたはそれ以上のアミノ酸を、連続する配列に沿って同定することができる。好ましい走査性アミノ酸は比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが含まれる。アラニンはβ−炭素を超える側鎖がなく、変異体の主鎖のコンフォメーションを変更する可能性が低いため、この群内の一般に好ましい走査性アミノ酸である。また、アラニンは最も一般的なアミノ酸であるため、一般に好ましい。さらに、アラニンはしばしば、埋め込まれた位置および暴露された位置の両方に見られる(Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976))。アラニン置換によって適量の変異が生じない場合には、イソテリックアミノ酸(isoteric amino acid)を用いることができる。
VEGF−Eポリペプチドの共有結合による修飾は本発明の範囲内に含まれる。1つのタイプの共有結合による修飾には、VEGF−Eポリペプチドの標的アミノ酸残基を、VEGF−Eポリペプチドの選択的側鎖またはN末端またはC末端残基と反応可能な有機誘導体化物質と反応させることが含まれる。二官能性物質での誘導体化は、例えば、抗VEGF−E抗体の精製方法での使用のために、VEGF−Eを水不溶性の支持基質または表面に架橋するのに有用であり、また逆も然りである。一般に用いられる架橋剤には、例えば1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸とのエステル、3,3’−ジチオビス−(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−N−マレイミド−1,8−オクタンのような二官能性マレイミドおよび、メチル−3−((p−アジドフェニル)−ジチオ)プロピオイミデートのような物質が含まれる。
他の修飾には、グルタミニルおよびアスパラギニル残基をそれぞれ対応するグルタミルおよびアルパルチル残基に脱アミド化し、プロリンおよびリシンをヒドロキシル化し、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基をリン酸化し、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基をメチル化し(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))、N末端アミンをアセチル化し、ならびに任意のC末端カルボキシル基をアミド化することが含まれる。
VEGF−Eポリペプチドのアミノ酸配列を変更することによって、これにグリコシル化部位を加えることができる。この変更は、例えば(O結合グリコシル化に関しては)天然配列のVEGF−Eポリペプチドに1つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を加えるか、あるいは天然配列のVEGF−Eポリペプチドを1つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基で置換することによって行ってもよい。場合により、DNAレベルでの変化、特にVEGF−EポリペプチドをコードするDNAをあらかじめ選択された塩基の位置で突然変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることによってVEGF−Eアミノ酸配列を変化させてもよい。
VEGF−Eポリペプチド上に存在する炭水化物部分は、化学的または酵素的に、あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異性置換によって除去することができる。化学的脱グリコシル化技術は当分野に既知であり、例えば Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) および Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981) に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分は、Thokakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987) に記載のように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いて酵素的に開裂させることができる。
本発明のVEGF−Eポリペプチドをまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合させたVEGF−Eポリペプチドを含むキメラ分子を形成させるように修飾してもよい。1つの態様では、このようなキメラ分子は、VEGF−Eポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合可能なエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合物を含む。このエピトープタグは一般に、VEGF−Eポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。このようなエピトープタグを付された形態のVEGF−Eポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出可能である。また、エピトープタグを提供すると、抗タグ抗体または、このエピトープタグと結合する他のタイプのアフィニティー基質を用いるアフィニティー精製により、VEGF−Eポリペプチドを容易に精製することが可能になる。別の態様では、キメラ分子は、VEGF−Eポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との融合物を含み得る。二価形態のキメラ分子用には、該融合はIgG分子のFc領域に対するものであり得る。
以下の記載は主に、少なくとも、丸で囲まれた出発コドンで始まり、終止コドンの直前で終わる、図1に記載のコード化核酸を含むベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養することによってVEGF−Eを生産することに関する。もちろん、当分野に周知の別の方法を用いて、VEGF−Eポリペプチドを調製してもよいと思われる。例えば、固相技術を用いる直接ペプチド合成によってVEGF−E配列またはその一部を生産してもよい(Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) を参照のこと)。インビトロタンパク質合成は、手動の技術を用いるか、あるいは自動操作により行うことができる。自動化合成は、例えば Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA)を用い、製造元の使用説明にしたがって行うことができる。VEGF−Eポリペプチドの種々の部分を別々に化学合成し、化学的または酵素的方法を用いて結合させ、完全長VEGF−Eポリペプチドを生産してもよい。
VEGF−EポリペプチドをコードするDNAは、VEGF−E mRNAを有し、それを検出可能なレベルで発現していると信じられている組織から調製されたcDNAライブラリーから得ることができる。したがって、ヒトVEGF−EをコードするDNAは、実施例に記載のような、ヒト組織から調製されたcDNAライブラリーから簡単に得ることができる。また、VEGF−Eをコードする遺伝子を、ゲノムライブラリーから得るか、あるいはオリゴヌクレオチド合成によって得てもよい。
ライブラリーは、関心ある遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するように設計されたプローブ(例えばVEGF−Eポリペプチドに対する抗体または少なくとも約17〜80塩基のオリゴヌクレオチド)を用いてスクリーニングできる。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) に記載のような標準的手法を用い、選択されたプローブでcDNAまたはゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことができる。VEGF−Eをコードする遺伝子を単離する別の方法は、PCR方法論を用いるものである(Sambrook et al., 上記; Dieffenbach et al., PCR Primer:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995))。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列を、寄託され、GenBankのような公的なデータベースまたは他の私的配列データベースにおいて入手可能な他の既知の配列と比較、アラインメントすることができる。分子の規定の領域内または完全長配列にわたる(アミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルでの)配列同一性は、ALIGN、DNAstarおよびINHERITのようなコンピューターソフトウェアプログラムを用いる配列アラインメントにより決定できる。
まず、本明細書中に開示される、演繹されたアミノ酸配列を用いて選択的cDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし、必要であれば、Sambrook et al., 1989(上記)に記載の慣用のプライマー伸張手法を用いて、cDNAに逆転写されなかったかもしれないmRNAの前駆体およびプロセッシング中間体を検出することによって、タンパク質コード化配列を有する核酸を得ることができる。
本明細書中に記載の、VEGF−Eポリペプチド生産用の発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞をトランスフェクションあるいは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅用に適当なように修飾された慣用の栄養培地中で培養する。当業者であれば、過度に実験することなしに、培地、温度、pHなどのような培養条件を選択することができる。一般に、細胞培養物の生産性を最大にするための原理、プロトコルおよび実施技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) および Sambrook et al., 1989(上記)中に見出すことができる。
トランスフェクション法、例えばCaPO4およびエレクトロポレーションは当業者に既知である。用いる宿主細胞に応じ、該細胞に適当な標準的技術を用いて形質転換を行う。Sambrook et al., 1989(上記)に記載の塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、またはエレクトロポレーションは一般に、実質的な細胞壁障壁を含む原核生物または他の細胞に対して用いられる。細胞壁のない哺乳類細胞に関しては、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) のリン酸カルシウム沈殿法を用いることができる。哺乳類細胞宿主系形質転換体の一般的側面は米国特許第4399216号に記載されている。酵母内への形質導入は一般に、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) および Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979) の方法にしたがって行う。しかし、DNAを細胞内へ導入する他の方法、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞とのバクテリアプロトプラスト融合またはポリカチオン、例えばポリブレンまたはポリオルニチンによる方法を用いてもよい。哺乳類細胞を形質転換する種々の技術に関しては、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)およびMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988) を参照のこと。
原核生物に加えて、真核微生物、例えば繊維状真菌または酵母は、VEGF−Eをコードするベクターの適当なクローニング宿主または発現宿主である。サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は一般に用いられる低級真核宿主微生物である。
所望のVEGF−Eポリペプチドをコードする核酸(例えばcDNAまたはゲノムDNA)を、クローニング(DNAの増幅)用または発現用の複製可能なベクターに挿入することができる。種々のベクターが公に利用可能である。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。種々の手法により、適当な核酸配列をベクターに挿入することができる。一般には、当分野に既知の技術を用い、DNAを適当な制限エンドヌクレアーゼ部位(群)に挿入する。ベクター成分には一般に、1つまたはそれ以上のシグナル配列、複製起点、1つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーターおよび転写終結配列が含まれるがこれらに限定されない。1つまたはそれ以上のこれらの成分を含む適当なベクターの構築には、当業者に既知の標準的ライゲーション技術を用いる。
所望のVEGF−Eポリペプチドを、直接組換え生産するだけでなく、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的開裂部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え生産してもよい。一般には、シグナル配列はベクターの成分であり得、あるいはベクターに挿入されたVEGF−EをコードするDNAの一部であり得る。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は例えば、酵母インベルターゼリーダー、(サッカロミセスおよびクルイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダー(後者は米国特許第5010182号に記載されている)を含む)α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダー、C.アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP 362179)または1990年11月15日公開のWO 90/13646に記載のシグナルであってよい。哺乳類細胞の発現では、哺乳類のシグナル配列、例えば同種または関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダーを用いて、タンパク質を分泌させることができる。
発現ベクターおよびクローニングベクターは一般に、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、(b)栄養要求性欠損を補完するか、あるいは(c)複合培地からは利用可能でない重要な栄養素、例えば、バチルス(Bacilli)用のD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、mRNA合成のための、VEGF−Eをコードしている核酸配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。種々の潜在的宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核宿主とともに用いるのに適当なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系(Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36776)およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーター(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))が含まれる。バクテリア系で使用するためのプロモーターはまた、VEGF−EポリペプチドをコードするDNAと作動可能に連結されたシャイン−ダルガルノ(S.D.)配列を含む。
生育条件によって制御される転写に関してさらなる利点を有する誘導可能なプロモーターである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロナーゼ2、イソシトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、金属結合性タンパク質、グリセルアルデヒド−3−ホスフェイトデヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトース利用を行う酵素に関するプロモーター領域である。酵母内での発現において使用するのに適当なベクターおよびプロモーターはEP 73657にさらに記載されている。哺乳類宿主細胞におけるベクターからのVEGF−Eの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス(fowlpox virus、1989年7月5日公開のUK 2211504)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス2)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、シミアンウイルス40(SV40)のようなウイルスのゲノム由来のプロモーター、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター由来、および熱ショックプロモーター由来のプロモーターによって制御される(ただし、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合することを条件とする)。
真核宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの核形成細胞(nucleated cells))内で使用する発現ベクターはまた、転写終結に必要な配列およびmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は一般に、真核生物またはウイルスDNA群またはcDNA群の5’側および、時に3’側非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、VEGF−EをコードするmRNAの非翻訳部分に、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養物中でのVEGF−Eポリペプチドの合成に適用するのに適当な、さらに他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117060; および EP 117058 に記載されている。
遺伝子増幅および/または発現は、本明細書中で提供される配列に基づく、適当なラベル化プローブを用い、例えば慣用のサザンブロッティング、ノザンブロッティングによりmRNAの転写を定量して(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980))、あるいはドットブロッティング(DNA分析)またはインシトゥーハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接測定することができる。別法では、二本鎖DNA、二本鎖RNAおよびDNA−RNAのハイブリッド二本鎖またはDNA−タンパク質の二本鎖(DNA-protein duplexes)を含む、特異的な二本鎖を認識できる抗体を用いてもよい。次いでこの抗体をラベルし、二本鎖を表面に結合させ、表面上の二本鎖形成時に、二本鎖に結合した抗体の存在が検出可能であるようなアッセイを行ってもよい。
別法では、免疫学的方法、例えば細胞または組織セクションの免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイを用い、直接、遺伝子産物の発現を定量することによって遺伝子発現を測定することができる。免疫組織化学的染色および/またはサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、任意の哺乳類内で調製することができる。簡単には、天然配列のVEGF−Eポリペプチド、または本明細書中に提供されるDNA配列に基づく合成ポリペプチド、またはVEGF−EをコードするDNAおよび特定の抗体エピトープをコードするDNAと融合された外因性配列に対する抗体を調製することができる。
各形態のVEGF−Eは培養培地または宿主細胞溶解物から回収することができる。VEGF−Eポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結解凍サイクル、超音波破砕、機械的破砕または細胞溶解剤のような種々の物理的または化学的手段によって粉砕することができる。VEGF−Eを、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドから精製するのが望ましいこともある。以下の手法は適当な精製手法の例である:イオン交換カラムでのフラクション化;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカゲルクロマトグラフィーまたはカチオン交換樹脂、例えばDEAEクロマトグラフィー;等電点電気泳動(chromatofocusing);SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばSephadex G−75を用いるゲルろ過;汚染物、例えばIgGを除去するためのプロテインAセファロースカラム;およびエピトープタグを付された形態のVEGF−Eポリペプチドを結合させるための金属キレートカラム。当分野に既知であり、例えば Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification:Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) に記載されている種々のタンパク質精製方法を用いることができる。精製過程(群)は、例えば用いられる生成方法の性質および生成される特定のVEGF−Eポリペプチドに依存して選択される。
VEGF−Eは二量体に集合するため、ヘテロ二量体およびホモ二量体を提供することは本発明の範囲内である。1つまたはそれ以上のサブユニットが変異体である場合、アミノ酸配列の変化は各サブユニット鎖に関して同じこともあり、異なっていることもあり得る。ヘテロ二量体は、両サブユニットをコードするDNAで宿主細胞を同時形質転換し、必要であれば、所望のヘテロ二量体を精製することによるか、あるいはサブユニットを別々に合成し、(例えば、尿素、グアニジン塩酸などのカオトロピック物質で処理することによって)サブユニットを解離させ、解離したサブユニットを混合し、次いでカオトロピック物質を透析して除くことによってサブユニットを再び会合させることによって容易に生産される。
1.心臓血管、内皮および血管新生活性に関するアッセイ
種々のアッセイを用いて、本明細書中のポリペプチドを心臓血管、内皮および血管新生活性に関して試験することができる。このようなアッセイには、以下の実施例に提供されるものが含まれる。
米国特許第5773414号に開示される、エンドセリンアンタゴニスト活性に関して試験するアッセイには、レセプターアッセイにおけるヨウ素化エンドセリン−1結合を阻害する能力に関してポリペプチドを試験する、ラット心室結合アッセイ、ウサギ腎動脈血管平滑筋細胞を用い、無傷の細胞の放射性ラベル化エンドセリン−1結合に関して試験する、エンドセリンレセプター結合アッセイ、第二のメッセンジャーの細胞内レベルを測定することによってラット−1細胞における機能活性を測定する、リン酸イノシトール蓄積アッセイ、培養血管平滑筋内において、添加化合物がエンドセリン刺激性アラキドン酸放出を減少させる能力を測定する、アラキドン酸放出アッセイ、雄性ニュージーランドウサギ由来の内皮細胞を用いるインビトロ(単離血管)試験、ならびに雄性Sprague−Dawley ラットを用いるインビボ試験が含まれる。組織生成活性に関するアッセイには、WO 95/16035(骨、軟骨、腱);WO 95/05846(神経、ニューロン)およびWO 91/07491(皮膚、内皮)に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。
エンドセリンB1(ETB1)レセプターポリペプチドと結合し、シグナル変換活性を調節する、VEGF−Eポリペプチドに関連する試験分子に関してスクリーニングするアッセイは、例えば米国特許第5773223号に記載されるように、エンドセリンB1レセプターポリペプチドをコードするDNAで形質転換された宿主細胞を提供し、この細胞を試験候補物質に暴露し、エンドセリンB1レセプターシグナル変換活性を測定することを含む。
インビボアッセイの別の例は、圧力過負荷心臓肥大アッセイである。インビボ試験に関しては、試験動物の腹部大動脈を締め付けることによって圧力過負荷心臓肥大を誘導するのが一般的である。典型的なプロトコルでは、ラット(例えば雄性WistarまたはSprague−Dawley)を麻酔下で処置し、各ラットの腹部大動脈を横隔膜直下で締め付ける。Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33: 985-94 (1955)。外科的切開によってこの動脈を暴露させ、短い太針を管に隣接して設置する。針の周りを絹糸で縛ってこの動脈を締め付け、針をすぐに除去して、動脈の管腔を針の直径にまで小さくする。このアプローチは、例えば Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992) および O'Rourke and Reibel, P.S.E.M.B., 200: 95-100 (1992) に記載されている。
癌に関し、種々の周知の動物モデルを用いて、本明細書中で同定された遺伝子の、腫瘍の発達および病因に関する役割をさらに理解し、天然VEGF−Eポリペプチドの抗体および他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む、候補治療薬の効力を試験することができる。このようなモデルのインビボ性質から、ヒト患者における応答を具体的に予測することができる。腫瘍および癌(例えば乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌など)の動物モデルには、組換えされていない動物および組換え(トランスジェニック)動物の両方が含まれる。組換えされていない動物モデルには、例えば齧歯動物、例えばマウスモデルが含まれる。このようなモデルは、標準的技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植またはオルトピン(orthopin)移植を利用し、腫瘍細胞を同系マウスに導入する(例えば大腸癌細胞を結腸組織内に移植する)ことによって調製することができる。例えば、1997年9月18日公開のPCT公報第WO 97/33551号を参照のこと。
該動物に導入される細胞は、上に列記される腫瘍セルラインおよび、例えばB104−1−1セルライン(neu原腫瘍遺伝子でトランスフェクションされた安定NIH−3T3セルライン);rasトランスフェクション NIH−3T3細胞;Caco−2(ATCC HTB−37);または適度によく分化したグレードIIヒト結腸腺癌セルライン、HT−29(ATCC HTB−38)のような既知の腫瘍/癌セルラインまたは別の腫瘍および癌から誘導可能である。腫瘍または癌細胞のサンプルは、液体窒素中での凍結および保存を含む標準的条件を用い、手術を受けている患者から得ることができる。Karmali et al., Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983)。
乳癌の動物モデルは、本質的には Drebin et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9129-9133 (1986) に記載のように、例えばラット神経芽腫細胞(ここからneu腫瘍遺伝子が最初に単離された)またはneuトランスフェクション NIH−3T3細胞をヌードマウスに移植することによって製造できる。
同様に、大腸癌の動物モデルは、動物、例えばヌードマウスに大腸癌細胞を継代し、これらの動物に腫瘍を出現させることによって製造できる。ヌードマウスにおけるヒト大腸癌の正所性移植モデルは、例えば Wang, et al., Cancer Research, 54: 4726-4728 (1994) および Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995) に記載されている。このモデルは、AntiCancer,Inc.(SanDiego,California)から市販されている、いわゆる”METAMOUSE”(登録商標)に基づくものである。
例えばMeth A、CMS4、CMS5、CMS21およびWEHI−164は化学的に誘導された、BALB/c雌性マウスの繊維肉腫であり(DeLeo et al., J. Exp. Med., 146: 720 (1977))、これは、種々の物質の抗腫瘍活性を研究するための、高度に制御可能なモデル系を提供する。Palladino et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987)。簡単には、細胞培養物中、インビトロで腫瘍細胞を増殖させる。動物への注射前に、このセルラインを洗浄し、バッファー中に、約10×106〜10×107細胞/mLの細胞密度で懸濁する。次いでこの動物に、細胞懸濁液10〜100μLを皮下感染させ、1〜3週間で腫瘍を出現させる。
移植された腫瘍を有する動物モデルにおける、試験化合物の効力を評価する1つの方法は、処置前後の腫瘍のサイズを測定することである。伝統的に、移植された腫瘍のサイズはノギスを用いて二次元または三次元で測定されてきた。二次元に限定された測定では、腫瘍のサイズが正確に反映されない;したがって、通常は、数式を用いてこれを対応する容量に変換する。しかし、腫瘍サイズの測定は非常に不正確である。薬物候補の治療的効果は、処置誘導性の増殖遅延および特定の増殖遅延によってより首尾よく記載することができる。腫瘍増殖の記載における別の重要な変数は腫瘍容量倍増時間である。腫瘍増殖の計算および記載用のコンピュータープログラム、例えば Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p.301 によって報告されているプログラムもまた、利用可能である。しかし、処置後の壊死および炎症応答は、少なくとも最初は、実際に腫瘍サイズの増加を生じさせ得ることに注意したい。したがって、これらの変化については、形態計測法およびフローサイトメトリー分析を組み合わせて、慎重にモニターする必要がある。
当分野に既知の他のインビトロおよびインビボ心臓血管、内皮および血管新生試験もまた、本発明において適当である。
本明細書中の心臓血管、内皮および血管新生アッセイの結果は、さらなる研究、例えば種々のヒト組織においてmRNA発現を測定することによって確認することができる。
上に記載のように、種々の組織における遺伝子増幅および/または遺伝子発現は、本明細書中に提供される配列に基づく適当なラベル化プローブを用い、慣用のサザンブロッティング、ノザンブロッティングによりmRNAの転写を定量し(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980))、あるいはドットブロッティング(DNA分析)またはインシトゥーハイブリダイゼーションによって測定することができる。別法として、抗体を用いて、DNA二重鎖、RNA二重鎖およびDNA−RNAハイブリッド二重鎖またはDNA−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識することができる。
また、種々の組織における遺伝子発現を免疫学的方法、例えば組織セクションの免疫組織化学的染色、および細胞培養物または体液のアッセイにより、遺伝子産物の発現を直接定量することによって測定してもよい。免疫組織化学的染色および/またはサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、任意の哺乳類において調製することができる。簡単には、天然配列VEGF−Eポリペプチドまたは、本明細書中に提供されるDNA配列に基づく合成ペプチドまたは、VEGF−EをコードするDNAおよび特異的抗体エピトープをコードするDNAと融合された外因性配列に対して、抗体を調製することができる。抗体を作成する一般的技術および、インシトゥーハイブリダイゼーションに関する特別なプロトコルは、本明細書中、以下に提供する。
心臓血管、内皮および血管新生(angiogenic)研究の結果は、抗体結合実験によってさらに確認することができ、ここでは、抗VEGF−E抗体が、内皮細胞または、心臓血管、内皮および血管新生アッセイにおいて使用される他の細胞に対するVEGF−Eポリペプチドの作用を阻害する能力について試験される。抗体の例には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体およびヘテロ共役抗体(heteroconjugate antibodies)が含まれ、その製造方法は、本明細書中以下に記載される。
抗体結合実験は、任意の既知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈澱アッセイにおいて行うことができる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987), pp.147-158。
サンドイッチアッセイには、それぞれが、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープと結合することができる、2つの抗体の使用が含まれる。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル被検体を、固形支持体に固定化した第一の抗体に結合させ、その後、第二の抗体がこの被検体に結合し、これにより不溶性の三者複合体が形成される。例えば米国特許第4376110号を参照のこと。第二の抗体自体を検出可能な部分でラベルしておく(直接サンドイッチアッセイ)か、あるいは検出可能な部分でラベルされている抗免疫グロブリン抗体を用いて測定(間接サンドイッチアッセイ)してもよい。例えば、サンドイッチアッセイの1つのタイプは、ELISAアッセイであり、ここでは検出可能部分が酵素である。
免疫組織化学では、組織サンプルは、例えば、新鮮なものか、あるいは凍結されたものか、あるいはパラフィン中に包埋され、保存剤、例えばホルマリンで固定されているものであってよい。
細胞に基づくアッセイおよび、心臓血管、内皮および血管新生障害、例えば腫瘍に関する動物モデルを用いて、本明細書中における、心臓血管、内皮および血管新生アッセイの発見を確認し、さらに本明細書中で同定された遺伝子と望ましくない心臓血管、内皮および血管新生細胞増殖の発達および病因との関係を理解することができる。望ましくない心臓血管、内皮および血管新生細胞増殖、例えば腫瘍細胞の発達および病理学に関する、本明細書中で同定された遺伝子産物の役割は、本明細書中で、VEGF−Eポリペプチドによって刺激されるか、あるいは阻害されるものとして同定された細胞またはセルラインを用いて試験することができる。このような細胞には、例えば、以下の実施例に記載のものが含まれる。
別のアプローチでは、特定の心臓血管、内皮および血管新生障害に関与することが知られている細胞型の細胞を、本明細書中に記載のcDNAでトランスフェクションし、これらのcDNAが過剰の増殖を誘導するか、あるいは増殖を阻害する能力を分析する。心臓血管、内皮および血管新生障害が癌である場合、適当な腫瘍細胞には、例えば、B104−1−1セルライン(neu原腫瘍遺伝子でトランスフェクションされた安定NIH−3T3セルライン)およびrasトランスフェクションNIH−3T3細胞のような安定腫瘍セルラインが含まれ、これを所望の遺伝子でトランスフェクションし、腫瘍形成性増殖に関してモニターできる。次いで、このようなトランスフェクションされたセルラインを用い、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または抗体組成物が、形質転換された細胞の増殖に対して細胞増殖抑制活性または細胞傷害性(細胞毒性)活性を行使するか、あるいは抗体依存性の細胞傷害性(ADCC)を媒介することによって、腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する能力を試験することができる。さらに、本明細書中で同定された遺伝子のコード化配列でトランスフェクションされた細胞を用いて、心臓血管、内皮および血管新生障害、例えば癌の処置用の薬物候補を同定することができる。
さらには、安定セルラインのほうが好ましいけれども、(上に記載されるような)トランスジェニック動物において腫瘍から誘導される最初の培養物を、本明細書中の細胞に基づくアッセイに用いることができる。トランスジェニック動物由来の継代セルラインを誘導する技術は当分野に周知である。例えば Small et al., Mol. Cell. Biol. 5: 642-648 (1985) を参照のこと。
本発明にしたがい、本明細書中のVEGF−Eポリペプチドおよびポリペプチド性アゴニストおよびアンタゴニストをインビボで発現させて用いることができ、このことはしばしば遺伝子治療と称される。
核酸(場合により、ベクターを含む)を患者の細胞に導入するためには、2つの主用なアプローチ:インビボおよびエクスビボがある。インビボデリバリー用には、核酸を、通常は患者の、VEGF−Eポリペプチドを必要としている部位、すなわち、既知であれば、VEGF−Eポリペプチドの合成部位およびVEGF−Eポリペプチドの生物学的活性が必要とされる部位(例えば傷害部位)に直接注入する。エクスビボ処置用には、患者の細胞を取り出し、これらの単離された細胞に核酸を導入し、この修飾された細胞を直接患者に投与するか、あるいは、例えば多孔性膜内に包んで患者に移植する(例えば米国特許第4892538号および第5283187号を参照のこと)。
生存能力のある細胞に核酸を導入するための種々の利用可能な技術が存在する。この技術は、核酸を意図される宿主のインビトロ培養細胞に移すのか、あるいはインビボ細胞に移すのかに依存して変化する。核酸をインビトロ哺乳類細胞に移すのに適当な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法の使用などが含まれる。形質導入には、複製欠損性組換えウイルス(好ましくはレトロウイルス)粒子を細胞レセプターと結合させ、次いで粒子内に含まれる核酸を細胞に導入することが含まれる。遺伝子のエクスビボデリバリー用に一般に用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
適当な遺伝子治療およびレトロウイルス粒子および構造タンパク質の作成方法は、例えば米国特許第5681746号に見出すことができる。
本発明はまた、VEGF−Eポリペプチドをコードする遺伝子の、診断薬としての使用に関する。VEGF−Eポリペプチドにおける突然変異は腫瘍を生じさせることがあるため、突然変異型のVEGF−Eポリペプチドを検出することにより、心臓血管、内皮および血管新生疾患を診断するか、あるいは心臓血管、内皮および血管新生疾患、例えば腫瘍に対する罹患しやすさを診断することができる。
ヒトVEGF−Eポリペプチドをコードする遺伝子に突然変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断用の核酸は、患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織バイオプシーおよび解剖物質から得ることができる。ゲノムDNAを直接、検出用に用いるか、あるいは、分析前に、PCR(Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986))を用いてこれを酵素的に増幅してもよい。また、RNAまたはcDNAを同じ目的で用いてもよい。例として、VEGF−Eポリペプチドをコードする核酸と相補的なPCRプライマーを用いて、VEGF−Eポリペプチドの突然変異を同定し、分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常遺伝子型との比較において増幅産物のサイズ変化により検出可能である。点突然変異は、増幅されたDNAを、放射性ラベルされた、VEGF−EポリペプチドをコードするRNAまたは放射性ラベルされた、VEGF−EポリペプチドをコードするアンチセンスDNA配列とハイブリダイゼーションさせることによって同定可能である。完全に合致する配列は、RNAアーゼA消化または融解温度の差異によってミスマッチ二重鎖とはっきり区別することができる。
また特定の位置における配列の変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRNAアーゼおよびS1保護または化学的開裂法、例えば Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985) によっても示され得る。
したがって、ハイブリダイゼーション、RNAアーゼ保護、化学的開裂、直接DNA配列決定または制限酵素の使用、例えば制限断片長多型(RFLP)およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって、DNA配列を詳細に検出することができる。
より一般的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加え、インシトゥー分析によっても突然変異を検出できる。
VEGF−Eポリペプチド発現は、腫瘍形成に基づく血管疾患または新血管新生に関連し得る。VEGF−Eポリペプチドがシグナル配列を有し、mRNAが内皮細胞において高度に、また平滑筋細胞においてはより少ない程度に発現されていることは、VEGF−Eポリペプチドが血清中に存在していることを示す。したがって、VEGF−Eポリペプチドのレベル変化は腫瘍形成に伴う血管疾患または新血管新生の指標であり得るため、抗VEGF−Eポリペプチド抗体を用いて該疾患を診断することができる。
競合アッセイを用いてもよく、ここでは、VEGF−Eポリペプチドに特異的な抗体を固形支持体に結合させ、ラベルしたVEGF−Eポリペプチドと宿主由来のサンプルを固形支持体に通した結果、固形支持体に結合し、検出されたラベル量がサンプル中のVEGF−Eポリペプチド量と相関し得る。
天然VEGFに対して作成した抗体と免疫学的に交差反応性である、VEGF−Eアミノ酸変異体配列および誘導体は、VEGF−Eに関する免疫アッセイにおいて、標準物質としてか、あるいは、ラベル化されている場合は競合試薬として有用である。
完全長ヌクレオチド配列、配列番号1またはその一部をcDNAライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして用い、完全長VEGF−E遺伝子を単離するか、あるいは、図1に開示されるVEGF−E配列(配列番号1)と望ましい配列同一性を有する、さらに他の遺伝子(例えば、天然に存在するVEGF−Eの変異体または他の種由来のVEGF−Eをコードするもの)を単離することができる。プローブの長さは約17〜約50塩基であってよい。ハイブリダイゼーションプローブは、図1に示される配列番号1のヌクレオチド配列からか、あるいは、プロモーター、エンハンサー因子および天然配列VEGF−Eコード化DNAのイントロンを含むゲノム配列から誘導することができる。例示的に、スクリーニング方法には、既知のDNA配列を用いてVEGF−E遺伝子のコード領域を単離し、約40塩基の選択されたプローブを合成することが含まれる。ハイブリダイゼーションプローブは、放射性ヌクレオチド、例えば32Pまたは35S、または酵素的ラベル、例えばアビジン/ビオチンカップリング系によりプローブとカップリングしたアルカリホスファターゼを含む、種々のラベルでラベル化することができる。本発明のVEGF−E遺伝子と相補的な配列を有するラベル化プローブを用いて、ヒトcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーをスクリーニングし、該ライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイゼーションするかを決定することができる。ハイブリダイゼーション技術については、以下の実施例にさらに詳細に記載する。
また、このプローブをPCR技術において用い、密接に関係するVEGF−E配列の同定に関して配列のプールを作成することができる。
また、VEGF−Eポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて、VEGF−Eポリペプチドをコードする遺伝子のマッピング用および遺伝的障害を有する個体の遺伝的分析用のハイブリダイゼーションプローブを構築することができる。既知の技術、例えばインシトゥーハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析およびライブラリーを用いるハイブリダイゼーションスクリーニングを用いて、本明細書中に提供されるヌクレオチド配列を染色体および染色体の特定領域にマッピングすることができる。
染色体同定では、配列は特異的に標的化され、個々のヒト染色体上の特定位置とハイブリダイゼーション可能である。さらに、染色体上の特定部位を同定する必要が存在している。染色***置をマーキングするのに利用可能な、実際の配列データに基づく染色体マーキング物質(反復多型)は、現時点ではほとんどない。本発明にしたがってDNAを染色体にマッピングすることは、疾患と関連する遺伝子とその配列を相関させる重要な第一段階である。簡単には、cDNA由来のPCRプライマー(好ましくは15〜25bp)を調製することによって配列を染色体にマッピングできる。3’非翻訳領域に対するコンピューター分析を用い、増幅工程を面倒にするような、ゲノムDNA中の1つ以上のエキソンをまたぐことのない、プライマーを迅速に選択する。次いでこれらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニング用に用いる。このプライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドだけが増幅断片を生産する。
有糸***中期の拡大した染色体に対するcDNAクローンの蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション(FISH)を用いて、正確な染色***置を一回の工程で提供することができる。この技術は500または600塩基程の短いcDNAとともに用いることができるが、2000bpより大きなクローンのほうが、簡単な検出のための十分なシグナル強度を伴って、唯一の染色***置に結合する可能性がより高い。FISHは、VEGF−Eポリペプチドをコードする遺伝子の元となるクローンの使用を必要とし、クローンは長いほどよい。例えば2000bpで良好、4000bpでより良好であり、時間当たりの妥当なパーセンテージの良好な結果を得るために4000以上はおそらく必要ない。この技術の総括に関しては、Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988) を参照のこと。
次に、病気に冒された個体とそうでない個体間のcDNAまたはゲノム配列における差異を測定することが必要である。病気に冒された個体のいくつかあるいはすべてにおいてはある突然変異が観察されるが、いかなる正常個体においても観察されない場合、この突然変異は疾患の原因物質である可能性が高い。
物理的マピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の分解能では、疾患に関連する染色体領域を正確に起源とするcDNAは50〜500の潜在的原因遺伝子のうちの1つであり得る(これは1メガ塩基のマッピング分解能および20kb当たりに1遺伝子を仮定している)。
天然VEGF−E、または、VEGF−Eの受容体の生物学的活性を模倣するリード化合物を見つけるために、スクリーニング分析を設計することができる。このようなスクリーニング分析には、ハイスループットスクリーニングで化学ライブラリーを分析でき、それにより小分子の薬剤候補を同定するのに特に適合された分析を含むであろう。意図された小分子には合成有機化合物、または、無機化合物が含まれる。分析は、蛋白質−蛋白質結合分析、生化学的スクリーニング分析、免疫分析、および、細胞を基礎とした分析を含む、当分野においてよく特性付られた種々の形式で行われ得る。
よって、本発明は、VEGF−Eポリペプチドを模倣する(アゴニスト)、または、VEGF−Eポリペプチドの効果を妨げる(アンタゴニスト)化合物を同定する、化合物のスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト薬剤候補のスクリーニング分析は、本明細書中で同定される遺伝子によりコードされるVEGF−Eポリペプチドに結合、若しくは、それと複合体形成する化合物、または、そうでなければコードされるポリペプチドの他の細胞性蛋白質との相互作用を妨げる化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニング分析には、ハイスループットスクリーニングにより化学ライブラリーを分析できる分析を含み、それは特に小分子の薬剤候補を同定するのに適当である。
アンタゴニストについての全ての分析は、薬剤候補と、本明細書中に同定される核酸によりコードされるVEGF−Eポリペプチドとを、これらの2成分の相互作用が可能な条件下、および時間、接触させること必要とする点で共通する。
結合分析では相互作用は結合であり、形成された複合体は反応混合物中で単離、または、検出され得る。特定の態様では、本明細書中で同定される遺伝子によりコードされたVEGF−Eポリペプチド、または、薬剤候補は、例えば、マイクロタイタープレート等の固相上に、共有、若しくは非共有結合により固定される。非共有結合は一般に、固体表面をVEGF−Eポリペプチドの溶液で被覆し、乾燥することによって達成される。代わりに、固定化されるべきVEGF−Eポリペプチドに特異的な、例えばモノクローナル抗体である固定化抗体を、それを固体表面に固定化するのに用い得る。検出可能な標識により標識化されていてもよい非固定化成分を、例えば、固定化された成分を含むコートされた表面である固定化された成分に添加することにより分析を行う。反応が終了したら、例えば洗浄により未反応の成分を除去し、固体表面に固定化された複合体を検出する。当初は固定化されていない成分が検出可能な標識を有する場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体形成が起こったことを示す。当初は固定化されていない成分が標識を有さない場合には、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識化された抗体を用いて複合体形成は検出され得る。
VEGF−Eポリペプチドが、共マイトジェンConAの存在下で内皮細胞増殖を刺激する能力を有するのであれば、スクリーニング方法の1例は、この能力を利用する。特に、増殖分析では、ヒト臍帯血管の内皮細胞を得、96ウェル平底培養プレート(Costar,Camgridge,MA)中で培養し、細胞増殖を促進するのに適当な反応混合物を補う。その混合物は、Con−A(Calbiochem, La Jolla, CA)を含む。Con−A、および、スクリーニングされる化合物を添加し、37℃で培養した後、培養物に3−H−チミジンを適用し、グラスファイバーフィルター(phD;Cambridge Technology,Watertown,MA)上に採収する。3連の培養物の平均3−(H)チミジン結合(cpm)は、液体シンチレーションカウンター(Beckman Instruments,Irvine,CA)を用いて決定される。有意の3−(H)チミジン結合は、内皮細胞増殖の活性化を示す。
アンタゴニストとなり得るもののより具体的な例には、VEGF−Eポリペプチド、(ポリ)ペプチド−免疫グロブリン融合体、並びに、これらに限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および、抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、および、このような抗体若しくは断片のキメラまたはヒト化形体、ヒト抗体、および、抗体断片を含む、抗体が特に含まれる。或いは、アンタゴニストとなり得るものは、例えば、受容体を認識するが何の効果も与えず、それによりVEGF−Eポリペプチドの活性を競合的に阻害するVEGF−Eポリペプチドの変異形体である、密接に関連した蛋白質であり得る。
リボザイムは、RNAの特異的開裂を触媒することができる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリダイゼーションに続く、内ヌクレオチド結合分解性開裂により機能する。標的RNAとなり得るもの内部の特異的リボザイム開裂部位は、公知の技術により同定され得る。詳細については、例えば、Rossi(Current Biology, 4:469-471(1994))、および、PCT公開第WO97/33551号(1997年9月18日公開)参照。
これらの小分子は、上述のスクリーニング分析のいずれか1つ、若しくは、それ以上により、および/または、当業者に公知のその他のいずれかのスクリーニング技術により同定され得る。
本明細書中に記載の心血管、血管新生、および、内皮分析において活性を有するか、および/または、その遺伝子産物が心血管系に局在することが見つけられているVEGF−Eポリペプチド、または、そのアゴニスト若しくはアンタゴニストは、真性糖尿病等の血管に作用する循環器系疾患を含む種々の心血管、内皮、および、血管新生系疾患において治療上の有用性を有する可能性がある。本発明のVEGF−E分子は細胞の生存、増殖、および/または、分化に関連した多数の治療上の有用性を有する。このような有用性には、VEGF−Eの立証されたヒト臍帯血管内皮細胞の生存増幅能力を考慮して、臍帯血管内皮細胞の処置が含まれる。血管が外傷を受けた場合、または、例えば、それが弱っているか、病気にかかっているか、人工的なマトリックスを基礎とするか、または、人工的な環境中にある場合等の臍帯血管の生存を増幅する人工的な手段が採用されるような状況で、処置が必要とされ得る。VEGF−Eの選択的マイトジェン特性により改善され得る、その他の物理的状態もまた本発明に含まれる。線維芽細胞の増殖、および、筋細胞中の肥大を誘導する、立証されたVEGF−Eの能力に基づき、線維芽細胞および筋細胞の処置も有用性に含まれる。特に、VEGF−Eは創傷治療、組織成長、並びに、筋肉産出、および再生に用い得る。
その治療上の有用性は、動脈、毛細血管、静脈、および/または、リンパ管の疾病を含み得る。以下の処置例には、筋肉衰弱疾病の処置、骨粗鬆症の処置、移殖の周囲の細胞の成長を刺激して、それにより意図された部位へのその付着を容易にする移殖定着における補助、可能であれば、組織または血清におけるIGF安定性の増加、および、IGF受容体への結合の増加(IGFは、イン・ヴィトロでヒト骨髄赤芽球および顆粒球始原細胞の成長を増幅することが示されているので)が含まれる。
いずれかの特定の適応症に、その分子のアンタゴニストではなく分子自体、または、そのアゴニストを、使用すべきかの判断は主に、この分子が心血管新生、内皮細胞の生成、若しくは、血管新生を促進するか、または、これらの症状を阻害するかに依存する。例えば、分子が血管新生を促進するのであれば、そのアンタゴニストは、血管新生を制限または防止するのが望まれる疾患を処置するのに有用であろう。このような疾患の例には、血管腫(haemangioma)、腫瘍血管新生、糖尿病性網膜症、早熟児網膜症、若しくは黄斑変性に伴う網膜、脈絡膜若しくは角膜における新血管新生、および、増殖性ガラス体網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化、卵巣過剰刺激、乾癬、新血管新生を伴う子宮内膜症、気球血管新生による再狭窄(restenosis)、例えば、手術後に形成されるケロイド、心筋梗塞後の繊維症、若しくは、肺繊維症に伴う繊維症病変に見られる瘢痕組織過剰生成が含まれる。
しかしながら、もし分子が血管新生を阻害するのであれば、それを直接、上記症状の処置に使用することが期待される。
VEGF−Eポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、器官(例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、若しくは、内皮を含む)、筋肉(平滑筋、骨格筋、若しくは、心筋)、並びに、血管(血管内皮を含む)組織等の他の組織の生成、若しくは、再生、または、このような組織を含む細胞の成長を促進する活性を示し得る。所望の効果の一部は、正常な組織の再生を可能にする繊維症瘢痕の防止、または、モジュレーションであり得る。
VEGF−Eポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、歯周病の処置、および、その他の歯治療方法で用いられ得る。このような薬剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供するか、骨形成細胞の成長を刺激するか、または、骨形成の原細胞の分化を誘導し得る。血管は骨の再編成、および、成長に重要な役割を果たすので、本発明のVEGF−Eポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、骨および/若しくは軟骨修復の刺激、または、炎症、若しくは、炎症過程により仲介される組織破壊の過程(コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性等)の阻害等を介した、骨粗鬆症、または、骨関節症の処置において有用で有り得る。
VEGF−Eポリペプチド、または、そのアンタゴニストはまた、肥大型心筋症と診断された患者における、実質的に発達する心房細動の治療において有用であり得る。
上述の記載を考慮し、本明細書中に記載の内皮細胞の機能、増殖、および/若しくは形体を変化させるか、または、それらに影響するVEGF−Eポリペプチド、または、そのアゴニスト、若しくはアンタゴニストは、上述の多くの、若しくは全ての疾患の病因、または、病原で重要な役割を果たすかも知れず、このためこれらの過程を増大、若しくは阻害する治療ターゲットとして、または、これらの疾患における血管関連薬剤ターゲティングにおいて機能し得る。
本発明の分子、並びに、そのアゴニスト、およびアンタゴニストは、上述のような種々の疾患および疾病に対する予防、および、治療薬剤として医薬的に有用である。
本発明のVEGF−Eは、医薬的に有用な組成物の調製において公知の方法に従って製剤され得、本発明のVEGF−Eは、医薬的に許容される担体ビヒクルと混合物として一緒にされる。適当な担体ビヒクル、および、例えば、ヒト血清アルブミン等の他のヒト蛋白質を含み得るその製剤は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第16版(1980年)(Mack Publishing Co., Osloら編)に記載される。本発明のVEGF−Eは、心血管疾患、若しくは心血管病を患う患者に非経口で、または、その血流への有効な形体での運搬を保証する他の方法により投与され得る。
治療用に投与されるVEGF−Eは無菌でなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜(例えば、0.2ミクロン膜)で濾過することにより容易に行われる。通常、VEGF−Eは、熱的および酸化的変性に対して非常に安定であれば、凍結乾燥形体、または、水溶液として貯蔵される。VEGF−E製剤のpHは、場合によってはより高い、または、より低いpH値が適当であるが、典型的には約6〜8である。前述の或る種の賦形剤、担体、または、安定剤の使用により、VEGF−Eの塩が形成されるであろうことが理解されるであろう。
緩衝液は、例えば、所望のpHに応じて、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、または、リン酸塩緩衝液であり得る。本発明の1つの型の液体製剤のpHは、約4〜8の範囲に、好ましくは、およそ生理的なpHに緩衝化される。
保存剤のフェノール、ベンジルアルコール、および、ベンゼトニウムのハロゲン化物、例えば、塩化物が採用され得る公知の抗菌剤である。
VEGF−Eポリペプチドはまた、除放性製剤の形体で投与され得る。除放性製剤の適当な例には、蛋白質を含む固体の親水性ポリマーからなる半透性マトリックスを含む。マトリックスは、例えばフィルム、マイクロカプセル等の付形された物品の形体である。除放性マトリックスの例には、ポリエステル、Langer et al.,(J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981))に記載されるようなヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、ポリアクチド(polyactide)(米国特許第3773919号、EP58481号)、L−グルタミン酸、および、γエチル−L−グルタミン酸の共重合体(Sidman et al., Biopolymers,22:547-556(1983))、非分解性エチレン−酢酸ビニル(Langer et al.,前述)、Lupron Depot(登録商標)(乳酸−グリコール酸共重合体、および、酢酸ロイプロリド(leuprolide)から成る注射可能なマイクロスフェア)等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、並びに、ポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP133988号)が含まれる。
上述のガイドラインについて、一般的な有効量は約0.001〜約1.0mg/kg、より好ましくは約0.01〜1mg/kg、最も好ましくは約0.01〜0.1mg/kgの範囲内である。
組織再生に用いられるVEGF−Eポリペプチドを含む医薬組成物の用量レジメは、担当医により、例えば、所望の形成される組織重量、損傷の部位、損傷された組織の状態、創傷の大きさ、損傷を受けた組織の型(例えば、骨)、患者の年齢、性別、および、食餌、いずれかの感染症の重篤度、投与の時間、並びに、その他の臨床的要因等のポリペプチドの活性を変える種々の要因を考慮して決定される。再構成に用いられるマトリックスの型、および、医薬組成物内のその他の蛋白質の含有により用量は異なる。例えば、IGF−I等のその他の公知の成長因子の最終組成物への添加もまた、用量に影響するであろう。経過は、組織/骨成長、および/または修復の周期的な評価、例えば、X線、組織形態学的測定、および、テトラサイクリン標識によりモニターされ得る。
ペプチド、または、小型の分子がアンタゴニスト、または、アゴニストとして用いられた場合、それは好ましくは経口、または非経口で、液体、または固体形体で、哺乳動物に投与される。
塩を形成し、ここで有用な分子の薬理学的に許容される塩の例には、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩)、アンモニウム塩、有機塩基塩(例えば、ピリジン塩、トリエチルアミン塩)、無機酸塩(例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩)、および、有機酸の塩(例えば、酢酸塩、シュウ酸塩、p−トルエンスルホン酸塩)が含まれる。
マトリックス材料の選択は生体適合性、生分解性、物理的特性、整形的様相、および界面特性に基づく。組成物の特定の適用は、それに適当な製剤を明確にするであろう。組成物のマトリックスとなり得るものは生分解性で、化学的に明らかな、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、および、ポリ無水物であり得る。その他の材料となり得るものは、骨、または、皮膚コラーゲン等の生分解性で、生物学的に明確なものである。さらなるマトリックスは、純粋な蛋白質、または、細胞外マトリックス成分から成る。他のマトリックスとなり得るものは、燒結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩、または、他のセラミックス等の非生物分解性で化学的に明確なものである。マトリックスは、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンとリン酸三カルシウム等、上述の型の材料のいずれかの組合わせから成ってもよい。生体セラミックは、カルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩中のように組成が変えられていてもよく、孔の大きさ、粒子径、粒子形、および、生分解性を変えるために加工されているもよい。
分離剤の1つの好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および、カルボキシメチルセルロースを含むアルカリセルロース(ヒドロキシアルカリセルロースを含む)であり、好ましいのは、カルボキシメチルセルロース(CMC)のカチオン塩である。その他の好ましい分離剤には、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ(エチレン グリコール)、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、および、ポリ(ビニルアルコール)が含まれる。ここで有用な分離剤の量は総製剤重量に基づいて、0.5〜20重量%、好ましくは1〜10重量%であり、これはポリマーマトリックスからのポリペプチド(または、そのアンタゴニスト)の脱着を防止し、そして、組成物の適当な使い易さを提供するのに必要な量であり、マトリックスに原細胞が浸潤するのを妨げるほど多くはなく、それにより原細胞の骨形成活性をポリペプチド(または、そのアンタゴニスト)が補助する機会を提供する量である。
一般に、疾患が許せば、VEGF−Eを部位特異的運搬用に製剤し、投与すべきである。これは、創傷および潰瘍の場合に重宝である。
好ましくは、多糖類はエーテル化されたセルロース誘導体、より好ましくは、例えば、メチルセルロース、および、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、および、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のヒドロキシアルキルセルロース誘導体等の明確で、精製され、そしてUSPに載ったものである。ここで、最も好ましいのはメチルセルロースである。
多糖類、および、ポリエチレングリコールに関しての「水溶性」という用語は、コロイド溶液および分散液を含むことを意味する。一般に、セルロース誘導体の溶解性は、エーテル基の置換の度合いにより決定され、本発明で有用な安定化誘導体は、セルロース鎖中の各無水グルコース単位当りこのようなエーテル基を十分量有するべきである。一般に、各無水グルコース単位当り少なくとも0.35個のエーテル基によるエーテル置換の程度が十分である。さらに、セルロース誘導体は、例えば、Li、Na、KまたはCs塩等のアルカリ金属塩の形体であり得る。
ゲル中でメチルセルロースが用いられる場合、それは、ゲルの好ましくは約2〜5%、より好ましくは約3%を構成し、VEGF−Eは、ゲル1ml当り約300〜1000mgの量で存在する。
VEGF−Eポリペプチド、または、そのアゴニスト若しくはアンタゴニストの、問題となる疾患を予防、若しくは処置する効力は、その活性な薬剤を、連続して、または、その目的に有効な他の剤と組合わせた一つの組成物として、若しくは、別々の組成物として投与することにより改善され得る。よって、VEGF−E治療をVEGF−Eを含むいずれかの成長因子の細胞増殖、生存、分化および修復を増進する活性を増幅するため、他の新規、若しくは慣用の治療(例えば、VEGF、aFGF、bFGF、PDGF、IGF、NGF、蛋白同化ステロイド、EGF、または、TGF−α)と組合わせることは本発明の範囲内に含まれる。このような共同治療の薬剤自体が組成物中に含まれることは、本発明において必要ではないが、このような薬剤が蛋白質性である場合には都合がよい。このような混合物は、VEGF−Eを単独で用いる場合と同様の方法で、同様の目的のために適切には投与される。
他の適応症について、VEGF−Eポリペプチド、または、そのアンタゴニストは、問題となる骨、および/または、軟骨の欠陥、創傷、若しくは、組織の処置に有用な他の薬剤と組み合わせ得る。これらの薬剤には、EGF、PDGF、TGF−α、若しくは、TGF−β、IGF、FGF、および、CTGF等の種々の成長因子が含まれる。
VEGF−Eポリペプチド、または、そのアンタゴニストと組合わせて投与される治療薬の有効量は医師、または、獣医の裁量に任される。投薬投与、および、調整は、処置されるべき症状の最大の処置を達成するように行われる。例えば、高血圧を処置するためのこれらの量では、理想的には利尿剤、または、ジギタリスの使用、および、高血圧、若しくは低血圧、腎傷害等の症状が考慮される。用量はさらに、使用される治療薬の型、処置される特定の患者等の要因に依存する。典型的には、VEGF−Eポリペプチドなしで投与される治療薬において使用されるのと同じ用量が採用される。VEGF−Eの二次成長因子に対する有用なモル比は典型的には、1:0.1〜10であり、等モル量が好ましい。
上述の疾患の診断または処置に有用なVEGF−Eポリペプチド、若しくは、そのアンタゴニストを含むキット等の製品は、少なくとも1つの容器、および、1枚のラベルを含む。適当な容器には、例えば、瓶、ガラス瓶、シリンジ、および、試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の多様な材料より形成され得る。容器には、症状を診断または処置するのに有効な組成物が保持され、無菌の出入口(例えば、容器は、皮下注射針が貫通し得る栓を有する、静脈注射用の溶液バックまたはガラス瓶であり得る)を有し得る。組成物中の活性剤はVEGF−Eポリペプチド、または、そのアゴニスト、若しくは、アンタゴニストである。容器上のラベル、または、それに関連するラベルは、組成物が選ばれた症状を診断、または、処置するのに用いられることを示す。製品はさらに、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液、および、デキトロース溶液等の医薬的に許容される緩衝液を含む第2の容器を含んでもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および、使用のための指示が記されたパッケージ内の印刷物を含む、商業および使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。製品はまた、上述のように別の活性剤を含む第2または第3の容器を含んでもよい。
本発明によりさらに、抗−VEGF−Eポリペプチド抗体が提供される。抗体の例には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、および、異結合抗体を含む。
本発明の抗−VEGF−E抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者には周知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤、および、望ましければアジュバンドの1若しくは複数回の注射により、哺乳動物中で生じさせ得る。典型的には、免疫化剤、および/または、アジュバントは、哺乳動物に複数の皮下、または、腹膜内注射により注入される。免疫化剤には、VEGF−Eポリペプチド、または、その融合蛋白質が含まれ得る。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが知られている蛋白質に結合することは有用であり得る。このような免疫原性の蛋白質の例には、これらに限定されるわけではないが、スカシガイのヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および、ダイズトリプシン阻害剤が含まれる。採用され得るアジュバントの例には、フロイントの完全アジュバント、および、MPL−TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコレート)が含まれる。免疫化方法は、過度の実験をすることなく当業者により選択され得る。
代わりに、抗−VEGF−E抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein(Nature,256:495(1975))に記載される方法等のハイブリドーマ法により調製され得る。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または、他の適当な宿主動物が、免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を産生できる、または、産生する能力を有するリンパ球を誘導する免疫化剤で典型的には免疫化される。或いは、リンパ球はイン・ヴィトロで免疫化され得る。
免疫化剤には、典型的にはVEGF−Eポリペプチド、または、その融合蛋白質が含まれる。一般的に、ヒト起源のものが望ましければ末梢血リンパ球(PBL(peripheral blood lymphocytes))、または、非ヒト哺乳動物起源のものが望ましければ脾臓細胞、若しくは、リンパ節細胞のどちらかが用いられる。その後リンパ球は、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いて、不死化セルラインと、ハイブリドーマ細胞を形成するよう融合される(Goding,「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」(Academic Press,(1986))第59−103頁)。不死化セルラインは通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ、および、ヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラット、または、マウスミエローマセルラインが採用される。ハイブリドーマ細胞は、融合されていない不死化細胞の成長、または、生存を阻害する、1若しくはそれ以上の物質を好ましくは含む適当な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、HGPRT−欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、および、チミジンを含む(HAT培地)。
その後、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、VEGF−Eポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について評価し得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、放射免疫分析(RIA)、または、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)等の免疫沈降、または、イン・ヴィトロ結合分析により決定される。このような技術、および、分析は公知である。例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson et al., Pollardのスカッチャード分析により決定され得る(Anal.Biochem.,107:220(1980))。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインA−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または、アフィニティークロマトグラフィー等の慣用の免疫グロブリン精製方法により培養培地、または、腹水液から精製され得る。
抗体は一価抗体であり得る。一価抗体を調製する方法は当分野において周知である。例えば、一つの方法には免疫グロブリンの軽鎖、および改変された重鎖の組換え発現が含まれる。重鎖の架橋を妨げるように、一般に、重鎖はFc領域のいずれかの部分が切断されている。代わりとしては、架橋を妨げるように関連するシステイン残基は別のアミノ酸残基で置換されるか、または、欠失されている。
イン・ヴィトロの方法もまた一価抗体を調製するのに適当である。その断片、特にFab断片を製造するための抗体の消化は、当分野においての公知のルーチンな技術により行われ得る。
本発明の抗−VEGF−E抗体は、さらにヒト化抗体、または、ヒト抗体を含み得る。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形体は、最小限の非ヒト免疫グロブリン由来の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または、その断片(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、または、その他の抗体の抗原結合配列等)である。ヒト化抗体には、受容体の相補性決定領域(CDR)が、所望の特異性、親和性、および、能力を有するマウス、ラット、若しくはウサギ等の非ヒト種のCDRからの残基(供与抗体)により置換されたヒト免疫グロブリン(受容抗体)が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体はまた、受容抗体、または導入されたCDR、若しくは、フレームワーク配列中のどちらにも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全部、若しくは、実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンに対応し、FR領域の全部、若しくは、実質的に全部がヒト免疫グロブリン定常配列のもにである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンである免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも1部を含むであろう(Jones et al., Nature,321:522-525(1986);Riechmann et al., Nature,332:323-329(1988);および、Presta et al., Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J.Mol.Biol., 227:381(1991);Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581(1991))を含む、種々の公知の技術を用いて製造され得る。Cole et al.および、Boerner et al.の技術もまたヒトモノクローナル抗体の調製に使用し得る(Cole et al., 「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」, Alan R. Liss, 第77頁(1985)、および、Boerner et al., J.Immunol.,147(1):86-95(1991))。
両(二)特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体であり、好ましくはヒト又は擬人化モノクローナル抗体である。本発明の場合には、結合特異性のうち一つは、VEGF−Eポリペプチドに対するものであり、他は任意の他の抗原に対するものであるが、好ましくは細胞表面タンパク又は受容体又は受容体サブユニットに対するものである。
両特異性抗体の作成法は当該技術分野で既知である。伝統的には、両特異性抗体の組換え生産は2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖ペアーの共−発現(co-expression)に基いている。ここで、2個の重鎖は異なる特異性を有する(Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の種類がランダムなので、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子のタンパク混合物を生産する可能性があり、そのうち、唯一つが正しい両特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィー工程で達成される。同様の方法はWO93/08829(1993年5月13日公開)およびTraunecker et al., (EMBO J. 10: 3655-3659 (1991))に開示されている。
異種複合抗体も本発明の範囲内である。異種複合抗体は2つの共有結合で結合した抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞を標的化するため(USP 4676980)、HIV感染の治療(WO91/00360; WO92/200373; EP 03039)のために、提案されている。抗体は合成タンパクの化学、例えば架橋剤を含めて、において既知の方法を用い、インビトロで調製できると考えられる。例えば、抗毒素は、ジスルフィド−交換反応を用いるかチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適当な試薬にはイミノチオラートおよびメチル−4−メルカプトブチルイミダート、並びに米国特許4676980号に記載の試薬が含まれる。
本発明の抗体をエフェクター機能、例えば癌の治療における抗体の有効性、に関して改良することが望ましいであろう。例えば、システイン残基(単数又は複数)をFc領域に挿入することによりこの領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させうる。このようにして生成されたホモ二量体抗体では内部移行(インターナリゼーション)能力が改良されおよび/又は補体を介する細胞死滅化および抗体依存性の細胞性細胞毒性(ADCC)が増大されうる。Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992) 参照。高められた抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Wolff et al., (Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))が記載したように、異種両機能性クロスリンカーを用いても調製することができる。別法として、二重Fc領域を有し、それにより高められた補体溶解性とADCC能を有しうる抗体を設計(工作)することができる。Stevenson et al., (Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989))参照。
本発明はまた以下の物質と結合(共役)した抗体からなる免疫複合体に関する;化学療法剤、毒素(例、酵素的に活性な、細菌、真菌、植物、動物起源の毒素若しくはそのフラグメント)、又は放射性同位体(即ち、放射性複合体)。そのような免疫複合体の製造に有用な化学療法剤は上記したとおりである。使用し得る酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントにはジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルディ(Aleurites fordii)タンパク、ディアンシン(dianthin)タンパク、フィトラーカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク(PAPI、PAPIIおよび PAP−S)、ノモルディカ・カランティア(nomordica charantia)インヒビター、クルシン(crucin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン類(tricothecene)が含まれる。放射性複合抗体を得るために、様々な放射性核種を使用することができる。例として212Bi、131In、90Yおよび186Reが挙げられる。
他の実施態様では、腫瘍の予備的なターゲッティングに用いるために、抗体を「受容体」(例、ストレプトアビジン)と結合させる。この場合、抗体―受容体複合体を患者に投与したのち、清掃剤(clearing agent)を用いて循環中から非結合複合体を除去し、次いで細胞毒性物質(例、放射性ヌクレオチド)と結合した「リガンド(例、アビジン)」を投与する。
本明細書に開示した抗体は免疫リポソームとしても製剤化することができる。抗体含有リポソームは当該技術分野で既知の方法により調製することができる(Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 米国特許4485045号および 4544545号)。循環時間を増加したリポソームは米国特許5013556号に記載されている。
特に有用なリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含有する脂質組成物を用い、逆相蒸発法で生成させることができる。リポソームは、規定の孔径のフィルターを通して押し出し成形し、所望の直径のリポソームを得る。Martin et al.が記載した方法(Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982))で、互換反応により本発明の抗体のFab´フラグメントをリポソームに結合させることができる。場合により化学療法剤(ドキソルビシンなど)をリポソームに含有させる。Gabizon et al.のJ. National Cancer Inst., 81: 1484 (1989)参照。
本発明の抗VEGF−E抗体は様々な用途を有する。例えば、抗VEGF−E抗体は、VEGF−Eポリペプチドの診断アッセイ、例えば、特異的な細胞、組織又は血清中での発現の検出に用いることができる。当該技術分野で既知の様々な診断検定法が使用可能であり、例えば、異種又は同種相で実施される競合的結合アッセイ、直接又は間接的なサンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどがある(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158)。診断アッセイで用いる抗体を検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は直接又は間接的に、検出可能なシグナルを生産しうるはずである。例えば、検出可能な部分は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光性又は化学発光性化合物、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。例えば、文献(Hunter et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); およびNygren, J. Histochem. And Cytochem., 30: 407 (1982)等)に記載された方法を含む、当該技術分野で既知の、抗体を検出可能な部分に結合させるための方法を適宜用いることができる。
抗VEGF−E抗体はまた、組換え細胞培養又は天然起源からのVEGF−Eポリペプチドのアフィニティー精製にも有用である。この方法では、当該技術分野で周知の方法により、VEGF−Eに対する抗体を、SephadexTMレジンやろ紙などの適当な支持体に固定化する。次いで、固定化抗体を精製すべきVEGF−Eポリペプチドを含有する試料と接触させたのち、支持体に結合した、試料中のVEGF−Eポリペプチドを除く全物質を除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、支持体を抗体からVEGF−Eポリペプチドを放出させる他の適当な溶媒で洗浄する。
本発明で同定したVEGF−Eポリペプチドと結合する抗体、並びに後述のスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、様々な上記および下記の疾患(障害)の治療に医薬組成物の形で投与することができる。
VEGF−Eポリペプチドが細胞内にあって、全抗体をインヒビターとして用いる場合、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、抗体又は抗体フラグメントを細胞内にを到達させるために、リポフェクチンやリポソームも使用できる。抗体フラグメントを用いる場合、標的タンパクの結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基いて、標的タンパクとの結合能力を維持しているペプチド分子をデザインすることができる。そのようなペプチドは化学的に合成するか、および/又は組換えDNA技術で製造することができる。例えば、Marasco et al.のProc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) 参照。本発明の処方はまた、治療すべき特定の兆候(適応)に対して必要ならば1以上の、好ましくは相互に不利な影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性物質を含有していても良い。別法として、あるいは、付加的に、組成物は、その機能を高める物質、例えば、細胞毒性物質、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害物質など、を含有していてもよい。意図する目的に有効な量のそのような分子を一緒に適切に含有させる。
インビボ投与のために用いられる製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通してろ過することにより、容易に達成される。
VEGF−Eポリペプチドに対する抗体は前記のごとく、様々な心血管、内皮、および血管形成障害の治療に用いることができる。
抗体は、ボーラス静脈内投与、又はある期間の連続注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、包膜内、経口、局所などの投与経路又は吸入経路などの既知の方法で哺乳類、好ましくはヒトに投与される。抗体は静脈内投与が好ましい。
他の治療レジメも上記の本発明の抗体と一緒に投与することができる。例えば、抗体が癌の治療のためのものであれば、そのような抗体で治療される患者は放射線治療をも受けるであろう。別法として、あるいは付加的に患者に化学療法剤を投与することができる。そのような化学療法剤の調製および投与スケジュールは、業者の指示に従うか、熟練した医師によって経験的に決定される。そのような化学療法剤の調製および投与スケジュールは専門書(Chemotherapy Service, M.C.Perry編(Williams & Wilkins: Baltimore, M.D., 1992))にも記載されている。化学療法剤は、抗体の投与に先立って、或いは後に、又は同時に投与することができる。抗体は、タモキシフェン又はEVISTATMのような抗−エストロゲン物質、又はオナプリストン(EP 616812参照)のような抗プロゲステロン物質と、それらの分子に関して既知の用量で併用することができる。
一つの態様では、併用治療で腫瘍の血管形成を攻撃する。例えば、腫瘍患者に、腫瘍又はその転移巣(あれば)の壊死を観察することにより、決定された治療有効量の抗VEGF−Eポリペプチドと他の抗体(例、抗−VEGF)を投与する。この治療法はさらに有利な効果が観察されなくなるまで、又は臨床検査で腫瘍又はあらゆる転移病巣の痕跡が示されなくなるまで継続する。次いで、TNFを単独又は補助剤、又は熱又は照射と一緒に与える。補助剤には、α−、β−若しくはγ−インターフェロン、抗HER2抗体、ヘレグリン、抗ヘレグリン抗体、D因子、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)又は腫瘍内での微小血管凝集を促進する他の物質、例えば抗プロテインC抗体、抗プロテインS抗体又はC4b結合タンパク(WO91/01753(1991年2月21日公開)参照)が含まれる。
心血管、内皮、および脈管形成障害の予防又は治療のための本発明抗体の適当な用量は上で明らかにしたように、治療すべき障害(疾患)のタイプ、疾患の重篤度、および経過、抗体を予防又は治療のいずれの目的で投与するか、治療歴、患者の病歴および抗体に対する反応、および担当医師の判断に依存する。抗体は一回で、又は一連の治療を通して患者に適宜投与される。
抗体と標識を備えた容器を含む製造品も提供される。活性物質として抗VEGF−E抗体を含有するそのような製品は上に記載されている。
抗体を使用すべき指示が癌である場合、細胞表面タンパク、例えば、ある種の腫瘍内で過剰発現している成長レセプター、は薬物候補又は腫瘍(例、癌)治療の優れた標的であるが、同タンパクはまたVEGF−Eポリペプチドと一緒に腫瘍の診断および予防にも付加的な用途を有する。例えば、VEGF−Eポリペプチドに対する抗体は腫瘍診断薬又は予防薬として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体を、VEGF−Eポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子の発現を定量的又は定性的に検出するために用いることができる。抗体は検出可能な標識を有し(例、蛍光性ラベル)、結合を光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光分析法、又は当該技術分野で既知の他の方法で観察し得ることが好ましい。そのような結合アッセイは基本的に上記のようにして実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインシトゥー検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡検査で行うことができる。この目的には、患者から組織学的標本を取り、標識した抗体を、好ましくは抗体を生物学的標本に重層することにより、適用する。この方法によって、検査した組織内でのマーカー遺伝子産物の分布を決定することもできる。当業者には明らかであろうが、インシトゥー検出には広範な組織学的な方法を容易に用いることができる。
本明細書中で参照した全ての特許および文献は、その全体を本明細書に引用して組み込まれる。
VEGFとの相同性により、the Incyte Pharmaceuticals データベースから同定された、発現配列タグ(expressed sequence tag、EST)に基づくプローブを用いて、ヒト神経膠腫セルラインG61由来のcDNAライブラリーをスクリーニングした。具体的には、Incyte Clone ”INC1302516”を用いて以下の4つのプローブを製造した:
(配列番号3)5’−ACTTCTCAGTGTCCATAAGGG;
(配列番号4)5’−GAACTAAAGAGAACCGATACCATTTTCTGGCCAGGTTGTC;
(配列番号5)5’−CACCACAGCGTTTAACCAGG; および
(配列番号6)5’−ACAACAGGCACAGTTCCCAC。
9個のポジティブを同定し、特徴付けした。3個のクローンは完全コード化領域を含み、配列が同一であった。また、胎児肺ライブラリーから部分的クローンを同定した。これは、コード化されるアミノ酸を変化させない1個のヌクレオチド変化を除いて、神経膠腫由来配列と同一であった。
哺乳類タンパク質の発現のため、完全なオープンリーディングフレーム(ORF)をCMVに基づく発現ベクターにクローン化した。エピトープタグ(FLAG(登録商標)、Kodak)およびヒスチジンタグ(His8)をこのORFと終止コドンの間に挿入した。VEGF−E−His8およびVEGF−E−FLAGを、SuperFect(登録商標)(Qiagen)によってヒト胎児腎臓293細胞にトランスフェクションし、(35S)メチオニンおよび(35C)システインで3時間パルスラベルした。15倍濃縮された、血清を含まない条件培地20μLを、ドデシル硫酸ナトリウムサンプルバッファー中、ポリアクリルアミドゲル(Novex)上で電気泳動(SDS−PAGE)すると、両方のエピトープタグを付されたタンパク質はいっしょに移動した。VEGF−E−IgG発現プラスミドは、このORFをヒトFc(IgG)配列の前にクローニングすることによって構築した。
このVEGF−E−IgGプラスミドを、Baculogold Baculovirus(登録商標)DNA(Pharmingen)とともに、Lipofectin(登録商標)(GibcoBRL)を用いて、10%ウシ胎児血清を補った Hink’s(登録商標)TNM−FH培地(JRH Biosciences)中で培養された105Sf9細胞中に同時トランスフェクションした。細胞を28℃で5日間インキュベーションした。上清を回収した後、これを感染多重度(MOI)約10でSf9細胞に感染させることによって最初のウイルス増幅用に用いた。細胞を3日間インキュベーションした後、上清を回収し、上清1mLを Protein−A Sepharose(登録商標)CL−4Bビーズ(Pharmacia)30μLに結合させた後、SDS−PAGE分析して組換えプラスミドの発現を測定した。最初の増幅上清を用い、ESF−921培地(Expression Systems LLC)中で培養されたSf9細胞の攪拌培養物500mLを感染多重度約0.1で感染させた。回収された上清を滅菌ろ過したことを除いて、上記のように細胞を処理した。特異的タンパク質を Protein−A Sepharose 4 Fast Flow(登録商標)(Pharmacia)カラムと結合させて精製した。
複数の成人および胎児組織および腫瘍セルラインからのヒトポリ(A)+RNAのブロットは、Clontech(Palo Alto, CA)から得られたものである。完全コード化領域を含む32P−ラベル化プローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSC、0.1% SDS中、63℃で洗浄した。
VEGF−E mRNAは、胎児肺、腎臓、脳および肝臓、ならびに成人心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓において検出可能であった。またVEGF−E mRNAは、A549肺腺癌(lung adenocarcinoma)およびHeLa頸部腺癌(cervical adenocarcinoma)セルラインにおいても見られた。
インシトゥーハイブリダイゼーションは、細胞または組織調製物内の核酸配列の検出および局在部位決定(localization)に関する強力で用途の広い技術である。これは、例えば遺伝子発現部位を同定し、転写の組織分布を分析し、ウイルス感染を同定し、その局在部位を決定し、特定のmRNA合成の変化を追跡し、染色体マッピングを援助するのに有用であり得る。
Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994) のプロトコルの最適化バージョンにしたがい、PCR作成33Pラベル化リボプローブを用いてインシトゥーハイブリダイゼーションを行った。簡単には、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されたヒト組織をセクション化し、パラフィン除去し、プロテイナーゼK(20g/mL)中、37℃で15分間タンパク質除去し、さらに、Lu and Gillett,(上記)に記載のように、インシトゥーハイブリダイゼーション用にプロセッシングする。(以下に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて)980bpのPCR産物から(33−P)UTPラベル化アンチセンスリボプローブを製造し、55℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。このスライドグラスを KODAK NTB2(登録商標)核追跡エマルジョン(nuclear track emulsion)中に浸し、4週間暴露した。
33P−UTP(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)6.0μL(125mCi)を急速減圧乾燥した。乾燥33P−UTPを含むそれぞれの試験管に以下の成分を加えた:
5×転写バッファー 2.0μL
DTT(100mM) 1.0μL
NTP mix(2.5mM:10mM GTP,CTPおよびATP各10μL+H2O 10μL) 2.0μL
UTP(50μM) 1.0μL
RNAsin 1.0μL
DNA鋳型 1.0μL(1μg)
H2O 1.0μL
RNAポリメラーゼ(通常、PCR産物に関してT3=AS、T7=S) 1.0μL。
このプローブをTBE/尿素ゲル上で電気泳動した。トータル1〜3μLのプローブまたは5μLのRNA Mrk IIIをローディングバッファー(loading buffer)3μLに加えた。95℃の熱ブロック(heat block)上で3分間加熱した後すぐに、このゲルを氷上に置いた。ゲルのウェルを洗い流し、サンプルを載せ、180〜250ボルトで45分間、電気泳動した。このゲルをプラスチックラップ(SARAN(登録商標)ブランド)で覆い、XARフィルムに暴露し、−70℃フリーザー内で1時間〜一晩補力スクリニング(intensifying screen)した。
A.凍結セクションの前処理
スライドグラスをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレーに載せ、室温で5分間解凍した。このトレーを55℃のインキュベーター内に5分間置き、曇り(condensation)を減少させた。このスライドグラスを、換気フード内、氷上の4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、室温下の0.5×SSC(20×SSC 25mL+s.c.H2O 975mL)中で5分間洗浄した。0.5μg/mL プロテイナーゼK(前もってあたためておいたRNAseを含まないRNAseバッファー250mL中の10mg/mL ストック 12.5μL)中、37℃で10分間、タンパク質除去を行った後、セクションを0.5×SSC中、室温で10分間洗浄した。このセクションを、70%、95%および100%エタノール中で、それぞれ2分間脱水した。
このスライドグラスをパラフィン除去し、s.c.H2O中に置き、室温で各5分間、2×SSCで2回すすいだ。セクションを、ヒト胎児組織用には、20μg/mL プロテイナーゼK中(RNAseを含まないRNAseバッファー250mL中の10mg/mL 500μL;37℃、15分間)、あるいはホルマリン組織用には、8×プロテイナーゼK(RNAseバッファー250mL中の100μL、37℃、30分間)中でタンパク質除去した。次いで、上記のように0.5×SSC中ですすぎ、脱水した。
このスライドグラスを、Boxバッファー(4×SSC、50%ホルムアミド)で満たされたプラスチックボックスに移した。ろ紙を浸した。この組織を、ハイブリダイゼーションバッファー(硫酸デキストラン3.75g+s.c.H2O 6mL)50μLで覆い、ボルテックスし、キャップを緩めて電子レンジで2分間加熱した。氷上で冷却した後、ホルムアミド 18.75mL、20×SSC 3.75mLおよびs.c.H2O 9mLを加え、この組織を十分にボルテックスし、42℃で1〜4時間インキュベートした。
スライドグラス当たり1.0×106cpmプローブおよびtRNA(50mg/mL ストック)1.0μLを95℃で3分間加熱した。このスライドグラスを氷上で冷却し、スライドグラス当たりハイブリダイゼーションバッファー48μLを加えた。ボルテックスした後、スライドグラス上のプレハイブリダイゼーション物50μLに33P mix 50μLを加えた。このスライドグラスを55℃で一晩インキュベートした。
室温で2×10分間、2×SSC、EDTAで洗浄し(20×SSC 400mL+0.25M EDTA 16mL、Vf=4L)、次いで37℃で30分間RNAseA処理した(RNAseバッファー 250mL中の10mg/mL 500μL=20μg/mL)。このスライドグラスを、室温で2×10分間、2×SSC、EDTAで洗浄した。ストリンジェンシーな洗浄条件は以下のものであった:55℃で2時間、0.1× SSC、EDTA(20×SSC 20mL+EDTA 16mL、Vf=4L)。
本明細書中に開示される、DNA29101配列に対してインシトゥー分析を行った。これらの分析用のリボプローブを製造するために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは以下のものであった。
P1: 5’−GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGC GGA ATC CAA CCT GAG TAG (配列番号7)
P2: 5’−CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCG GCT ATC CTC CTG TGC TC (配列番号8)。
インシトゥー分析から得られた結果は次のようであった。
ヒト胎児下肢では、軟骨原基の縁(edge)(すなわち外縁の周り)にある発達中の下肢骨、発達中の腱、血管の平滑筋および、発達中の骨格筋の筋細胞および筋管を含む細胞内でVEGF−Eの発現が見られた。発現は、骨端成長板でも観察された。ヒト胎児リンパ節では、発達中のリンパ節の辺縁洞(marginal sinus)にVEGF−Eの発現が見られた。ヒト胎児胸腺では、胸腺皮質の莢膜下領域(subcapsular region)、可能性としては、この領域に見られる莢膜下上皮細胞、または増殖中のダブルネガティブな胸腺細胞で発現が見られた。ヒト胎児脾臓は発現に関してネガティブであった。
気管では、ヒト胎児組織の平滑筋でVEGF−Eの発現が観察された。ヒト胎児脳(大脳皮質)では、皮質性ニューロン(cortical neurons)に集中してVEGF−Eの発現が見られた。ヒト胎児脊髄はネガティブであった。ヒト胎児小腸では、平滑筋でVEGF−Eの発現が見られた。さらに、ヒト胎児甲状腺では、甲状腺上皮全般にわたってVEGF−Eの発現が見られた。ヒト胎児副腎(adrenal gland)はネガティブであった。肝臓では、ヒト胎児管板細胞(ductal plate cells)でVEGF−Eの発現が観察され、ならびに、ヒト胎児胃では壁平滑筋で、ヒト胎児皮膚では扁平上皮の基底層で発現が見られた。さらに、ヒト胎児胎盤では栄養膜絨毛内の間質細胞でVEGF−Eの発現が見られ、ヒト胎児索状組織(cord)では、動脈壁および静脈壁で発現が見られた。
さらに以下の部位では、VEGF−Eの高度な発現が観察された:
チンパンジー(chimp)卵巣−成熟した濾胞の顆粒膜細胞、包膜細胞(thecal cells)での低い強度のシグナルが観察された。
チンパンジー副甲状腺(parathyroid)−主細胞での高度な発現。
ヒト胎児精巣−発達中の尿細管を取り囲む間質細胞での中程度の発現。
ヒト胎児肺−発達中の気管支の軟骨細胞での高度な発現および、分岐する気管上皮での低レベルの発現。
腎細胞癌、胃癌および大腸癌に対しては特異的な発現が観察されなかった。
胎盤、臍帯(umbilical cord)、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁(body wall)、骨盤および下肢。
上記実験で試験された成人組織には以下のものが含まれる:
肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、大腸、大腸癌および軟骨肉腫ならびに、アセトミノフェン(acetominophen)誘導性の肝臓傷害および肝硬変を有する組織。
まとめると、この発現パターンによって、VEGF−Eが細胞の分化および/または増殖に関与し得ることが示される。発達中の骨格筋での発現パターンにより、このタンパク質が筋芽細胞の分化および/または増殖に関与し得ることが示される。
新生児 Harlan Sprague Dawley ラット心室(妊娠23日)由来の筋細胞を、96ウェルプレートに75000細胞/mLで2回(in duplicate)配置した。細胞を、2000、200、20または2ng/mL VEGF−E−IgGで48h処理した。筋細胞をクリスタルバイオレットで染色して形態を明視化し、3〜7の尺度で評価した(3は未刺激のものであり、7は完全膨張(full−blown)肥大のものである)。
2000ng/mLおよび200ng/mLのVEGF−Eは評価5の肥大を生じさせた。
マウス胎児線維芽細胞C3HlOT1/2細胞(ATCC)を、50:50 Ham’s F−12:10%ウシ(calf)胎児血清(FCS)を含む低グルコースDMEM培地中で培養した。細胞を24ウェルプレートに1000、2000および4000細胞/ウェルで2回(in duplicate)配置した。48時間後、2%FCSを含む培地に細胞を移し、200、800または2000ng/mL VEGF−Eと、あるいは増殖因子を加えずに、72時間インキュベーションした。
200ng/mL VEGF−Eの存在下では、3つの細胞濃度すべてで、その不存在下と比べて約1.5倍多い数の細胞が測定された。
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC、Cell Systems)を Complete Media(Cell Systems)中で維持し、48ウェルプレート中、20000細胞/ウェルで血清を含まない培地(0.1%BSAを含む Basic Media、Cell Systems)に3回(in triplicate)配置した。細胞を、200または400ng/mL VEGF−E−IgG、100ng/mL VEGF−E、20ng/mL 塩基性FGFと、あるいは何も添加せずに5日間インキュベーションした。
VEGF−Eを加えると、増殖因子を添加しなかった場合と比べて生存率が2〜3倍高くなった。VEGFおよび塩基性FGFはポジティブコントロールとして加えられたものである。
このアッセイは Davis and Camarillo, Experimental Cell Research, 224:39-51 (1996) に記載のアッセイにしたがうか、あるいはそれを以下のように修飾して用いた:
プロトコル:HUVEC細胞(最初からの継代数8以下)を、6×105細胞/mLの密度で最終濃度2.6mg/mLのタイプIラット尾コラーゲンと混合し、96ウェルプレートにウェルあたり50μLを配置する。このゲルを37℃で1hr固化させ、次いで1%FBSおよびVEGF−Eサンプルを(それぞれ1%、0.1%および0.01%希釈で)補ったウェルあたり50μLのM199培養培地を1μM 6−FAM−FITC色素とともに加え、空胞(vacuoles)をその形成時に染色する。細胞を37℃/5%CO2で48hrインキュベーションし、室温で10分間、3.7%ホルマリンで固定し、PBSで5回洗浄し、次いで4℃で一晩、Rh−Phalloidinで染色した後、4μM DAPIで核を染色する。
このアッセイでは、外因性増殖因子(PMAを含まないVEGF、bFGF)の存在下において、三次元基質(3-dimensional matrix)中で細胞の生存を促進する因子を同定する。
ポジティブな結果は1であるか、あるいは1以下である。0=アポトーシスなし、1=20%以下の細胞がアポトーシス、2=50%以下の細胞がアポトーシス、3=50%以上の細胞がアポトーシス。この系におけるアポトーシスの刺激剤はアポトーシス因子であると予想され、阻害剤はアポトーシスを防止または減少させることが予想される。
このアッセイでは、bFGFおよびVEGF(40ng/mL)の存在下における内皮空胞形成および管腔(lumen)形成を刺激する因子を同定する。
ポジティブな結果は2であるか、あるいは2以上である。1=20%以下の細胞内に空胞が存在、2=20〜50%の細胞内に空胞が存在、3=50%以上の細胞内に空胞が存在。このアッセイは、ピノサイトーシス、イオンポンプ作用、透過性および接合部(junction)形成の刺激に関与する因子を同定するように設計されている。
このアッセイは、三次元基質内における内皮管形成を刺激する因子を同定するためのものである。このアッセイは、外因性増殖因子(VEGF、bFGF)の存在下、内皮細胞を刺激して、三次元基質内で管様構造に分化させる因子を同定する。
ポジティブな結果は2であるか、あるいは2以上である。1=細胞はすべて丸型、2=細胞は伸長、3=細胞はいくつか連結して管を形成中、4=細胞は複雑な管状ネットワークを形成中。このアッセイは、トラッキング、走化性または内皮細胞形変化の刺激に関与し得る因子を同定するであろう。
図4Aおよび4Bはそれぞれ、HUVEC管形成に対するVEGF−E−IgG 1%希釈物の作用およびバッファーコントロール(10mM HEPES/0.14M NaCl/4%マンニトール、pH6.8)1%希釈物の作用を示す。図5Aおよび5Bはそれぞれ、HUVEC管形成に対するVEGF−E−ポリ−his 1%希釈物の作用およびVEGF−E−IgG用バッファーコントロール1%希釈物の作用を示す。
この結果により、VEGF−E−IgGおよびVEGF−E−ポリ−hisサンプルを用いると、バッファーコントロールの場合より複雑な管形成が生じることをはっきりと示される。
皮膚での発現を生じさせるケラチンプロモーター(Xie et al., Nature, 391: 90-92 (1998))の制御下にVEGF−EをコードするcDNAを含むマイクロインジェクションに適当なベクターを用い、C57Bl/6/SJL F2マウス胚(DNAX)をマイクロインジェクションして、トランスジェニックマウスを作成した。
トランスジェニックイヌは生誕時にはしわがあって、光沢を示し(shiny)、毛が生えるのが遅かった。マウスは齢2週間までにその表現型を喪失した。ヒストパシックな(histopathic)変化は検出できなかった。
雌性ニュージーランド白色ウサギ内で、ヒトVEGF−Eに対するポリクローナル抗血清を作成した。このタンパク質を最初のインジェクション用に Freund’s 完全アジュバントと、以後すべての追加免疫(boost)用には、Freund’s 不完全アジュバントとホモジナイゼーションした。最初の免疫化および最初の追加免疫に関しては、Bennett et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-23067 (1991); および Sigel, Sinha and VanderLaan, "Production of Antibodies by Inoculation into Lymph Nodes" in Methods in Enzymology, vol. 93 (New York: Academic Press, 1983) にしたがって、体重1kgあたり3.3μgを膝窩リンパ節に直接インジェクションした。以後すべての追加免疫に関しては、体重1kgあたり3.3μgを皮下および筋肉内部位にインジェクションした。インジェクションは3週間毎に行い、各インジェクション後、2週間を経過した時点で採血した。このように得られたポリクローナル抗血清は、免疫沈澱実験によって示されるようにVEGF−Eと結合する抗体を含んでいた。
(最初の培養物由来、最大12〜14継代)ウシ副腎皮質毛細管内皮細胞(ACE細胞)を96ウェルプレートに100μLあたり500細胞/ウェルで配置した。アッセイ培地には、低グルコースDMEM、10%ウシ(calf)血清、2mM グルタミンおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン(fungizone)が含まれていた。コントロールウェルには以下のものが含まれていた:(1)ACE細胞を添加せず;(2)ACE細胞のみ;(3)ACE細胞+5ng/mL FGF;(4)ACE細胞+3ng/mL VEGF;(5)ACE細胞+3ng/mL VEGF+1ng/mL TGF−ベータ;および(6)ACE細胞+3ng/mL VEGF+5ng/mL LIF。次いで試験サンプル、ポリ−hisタグを付されたVEGF−Eポリペプチド(上記実施例に記載されているもの;100μL容量)を(それぞれ1%、0.1%および0.01%希釈で)ウェルに加えた。この細胞培養物を37℃/5%CO2で6〜7日間インキュベーションした。インキュベーション後、ウェル中の培地を吸引し、細胞をPBSで1×洗浄した。次いで酸ホスファターゼ反応混合物(100μL;0.1M 酢酸ナトリウム、pH5.5、0.1%トリトンX−100、10mM p−ニトロフェニルホスフェイト)を各ウェル加えた。37℃で2時間インキュベーションした後、1N NaOH 10μLを加えて、この反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて、405nmでの光学密度(OD)を測定した。
VEGF−Eの活性を、(OD405nmでの酸ホスファターゼ活性によって測定される、)刺激しない細胞と比較した、VEGF(3ng/mL)刺激性増殖の阻害パーセントとして計算した。TGF−ベータは、活性リファレンスとして用いた−TGF−ベータは1ng/mLでVEGF刺激性ACE細胞増殖の70〜90%を遮断する。観察された阻害が>30%であった場合、このアッセイの結果は「ポジティブ」であると判断される。
最初のアッセイ実行では、VEGF−Eは、1%、0.1%および0.01%希釈物で、それぞれ52%、90%および96%阻害を示した。2回目のアッセイ実行では、VEGF−Eは、1%、0.1%および0.01%希釈物で、それぞれ57%、93%および91%阻害を示した。
以下の物質は the American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia USA (ATCC) に寄託された:
材料 ATCC寄託番号 寄託日
DNA29101−1272 209653 1998年3月5日
この寄託は、the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder (ブダペスト条約) の規定下で行われたものである。これは寄託物の生存培養物を、その寄託の日から30年間維持することを保証する。この寄託物は、ブダペスト条約の条件下、ATCCによって利用可能にされ、Genentech, Inc. とATCC間の同意に付され、これにより、いずれが先になるとしても、当米国特許の発行時か、あるいはいずれかの米国または外国特許出願の公開時に、公に対する、寄託物の後代培養物の、恒久的で非制限的な利用可能性が保証され、the U.S. Commissioner of Patents and Trademarks(米国特許および商標庁の長官)によって決定された、35 USC §122およびそれにしたがう長官の規則(the Commissioner's rules)(37 CFR §1.14、特に886 OG 638を含む)により権利を有する者に対する後代の利用可能性が保証される。
本出願の代理人は、この寄託時の物質の培養物が、適当な条件下で培養された場合に、死ぬか、あるいは失われるか、あるいは破壊されたならば、この物質を、通知時において迅速に、別の同物質で置き換えることに同意した。この寄託物質の利用可能性は、いずれかの政府の、その特許法にしたがう権限下に認められた権利に違反して、本発明を実施するためのライセンスとして考えられるべきではない。
2. 図1のヌクレオチド259〜1293の配列(配列番号1)またはその相補鎖を含む、請求項1に記載の核酸。
3. ストリンジェンシーな条件下で、請求項1に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
4. 請求項1に記載の核酸を含むベクター。
5. 請求項1に記載の核酸を含む宿主細胞。
6. チャイニーズハムスター卵巣細胞、昆虫細胞、大腸菌細胞または酵母細胞である、請求項5に記載の宿主細胞。
7. バキュロウイルス感染昆虫細胞である、請求項6に記載の宿主細胞。
8. 請求項5に記載の宿主細胞をVEGF−Eポリペプチドの発現に適当な条件下で培養し、細胞培養物からVEGF−Eポリペプチドを回収することを含む、血管内皮細胞増殖因子−E(VEGF−E)ポリペプチドの製造方法。
9. 請求項8に記載の方法によって製造されたポリペプチド。
10.図2のアミノ酸残基1〜345(配列番号2)を含むVEGF−Eポリペプチド。
11.(a)図2のアミノ酸残基1〜345(配列番号2)を含むポリペプチドおよび(b)生物学的に活性な(a)のポリペプチド断片からなる群から選択されるVEGF−Eポリペプチド。
12.ATCC寄託番号第209653号のヌクレオチド配列挿入物によってコードされるVEGF−Eポリペプチド。
13.異種アミノ酸配列と融合された請求項10に記載のポリペプチドを含むキメラポリペプチド。
14.異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列または免疫グロブリンのFc領域である、請求項13に記載のキメラポリペプチド。
15.担体とともに請求項10に記載のポリペプチドを含む組成物。
16.担体が製薬的に許容される担体であり、治療有効量の該ポリペプチドを含む、請求項15に記載の組成物。
17.(a)請求項15に記載の組成物;
(b)該組成物を含む容器;および、
(c)心臓血管障害または内皮障害の処置におけるVEGF−Eポリペプチドの使用に言及する、該容器に貼られたラベルまたは医薬品に含まれるパッケージ内の印刷物を含む医薬品。
18.哺乳類の心臓血管障害または内皮障害の処置方法であって、請求項15に記載の組成物の有効量を該哺乳類に投与することを含む方法。
19.障害が心臓肥大、外傷または骨関連障害である、請求項18に記載の方法。
20.心臓肥大が高レベルのPGF2αの存在を特徴とする、請求項19に記載の方法。
21.心臓肥大が心筋梗塞によって誘導されたものである、請求項19に記載の方法。
22.心筋梗塞後、48時間以内にVEGF−Eポリペプチドの投与を開始する、請求項21に記載の方法。
23.(a)宿主由来のサンプルからVEGF−Eをコードする核酸配列を単離し;
(b)VEGF−Eをコードする核酸配列中の突然変異を測定することを含む、血管内皮細胞増殖因子−E(VEGF−E)をコードする核酸配列の突然変異に関係する疾患または疾患に対する罹患しやすさの診断方法。
24.(a)哺乳類から得られた組織細胞の試験サンプル中、および(b)同細胞タイプの既知の正常組織細胞のコントロールサンプル中の、血管内皮細胞増殖因子−E(VEGF−E)ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出し、試験サンプル中の発現レベルがコントロールより高いか、あるいは低ければ、該試験組織細胞の供給元の哺乳類が心臓血管機能不全または内皮機能不全を有していることが示されることを含む、哺乳類の心臓血管障害および内皮障害の診断方法。
25.血管内皮細胞増殖因子−E(VEGF−E)ポリペプチドに対するアゴニストの同定方法であって、
(a)該ポリペプチドが細胞の増殖を刺激可能な条件下で細胞と候補化合物を接触させ;
(b)この化合物によって細胞の増殖が阻害された程度を測定することを含む方法。
26.請求項25の方法によって同定されたVEGF−Eポリペプチドに対するアゴニスト。
27.血管内皮細胞増殖因子−E(VEGF−E)ポリペプチドの発現または活性を阻害する化合物の同定方法であって、
(a)化合物が該ポリペプチドと相互作用するのに十分な条件および時間で、候補化合物を該ポリペプチドと接触させ;
(b)この化合物が該ポリペプチドと相互作用する程度を測定することを含む方法。
28.請求項27に記載の方法によって同定された化合物。
29.血管内皮細胞増殖因子−E(VEGF−E)ポリペプチドと結合する、単離された抗体。
30.モノクローナル抗体である、請求項29に記載の抗体。
31.VEGF−Eポリペプチドを含有する可能性がある細胞を、請求項29に記載の抗体に暴露し、この細胞と抗体の結合を測定することを含む、血管内皮細胞増殖因子−E(VEGF−E)ポリペプチドの存在を測定する方法。
32.(a)請求項29に記載の抗体を哺乳類から得られた組織細胞の試験サンプルと接触させ、(b)試験サンプル中の抗VEGF−E抗体とVEGF−Eポリペプチド間の複合体形成を検出することを含む、哺乳類の心臓血管障害、内皮障害または血管新生障害の診断方法。
33.容器;
容器のラベル;および、
容器内に含まれる、請求項29に記載の抗体を含む組成物を含む製品(容器のラベルは、治療的または診断的方法における該抗体の使用に関する説明を示す)。
Claims (14)
- 哺乳動物の癌細胞の増殖を阻害又は予防する方法であって、
有効量のVEGF−Eアンタゴニストを、有効量の第二薬剤と組み合わせて哺乳動物に投与し、
このとき組み合わせた投与により癌細胞の増殖が阻害又は予防される、方法。 - 癌細胞の増殖が腫瘍増殖と関係している、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物には、腫瘍についての治療が行われている腫瘍保持患者であり、該患者は該治療から更なる有益な効果を得ていない患者が含まれる、請求項3に記載の方法。
- 第二薬剤が、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、血管新生抑制剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗VEGF抗体、FGFアンタゴニスト、PDGFアンタゴニスト、又はErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4又はVEGFレセプターに結合する抗体である、請求項1に記載の方法。
- 第二薬剤が血管新生抑制剤である、請求項1に記載の方法。
- 血管新生抑制剤が抗VEGF抗体である、請求項6に記載の方法。
- VEGF−Eアンタゴニストには抗VEGF−E抗体が含まれる、請求項1に記載の方法。
- 抗体がヒト化抗体である、請求項7又は8に記載の方法。
- 第三の治療剤を投与することがさらに含まれる、請求項1に記載の方法。
- 第三の治療剤が、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、血管新生抑制剤、放射線療法に用いられる薬剤、抗VEGF抗体、FGFアンタゴニスト、PDGFアンタゴニスト、又はErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4又はVEGFレセプターに結合する抗体である、請求項9に記載の方法。
- 第三薬剤が血管新生抑制剤である、請求項10に記載の方法。
- 血管新生抑制剤が抗VEGF抗体である、請求項12に記載の方法。
- 抗体がヒト化抗体である、請求項13に記載の方法。
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