JP2009538269A - グリシル−2−メチルプロリルグルタミン酸塩の経口製剤 - Google Patents
グリシル−2−メチルプロリルグルタミン酸塩の経口製剤 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】図16A
Description
本発明は、グリシル−2−メチルプロリルグルタミン酸塩(G−2MePE)の経口利用可能な製剤に関する。とりわけ、本発明は、神経保護剤であるG−2MePEのマイクロエマルジョン、液晶およびカプセル剤と、これらの製造方法と、これらを含有する医薬組成物と、神経障害を治療する上でのこれらの使用とに関する。
投与量または時間に関して用いる場合の「約」という用語は、特定の変数とその周囲の範囲、すなわち、この変数の値の通常の測定誤差内またはこの変数の値の約20%内にある範囲とを指す。
神経細胞の変性および神経細胞の死を含む神経障害は、治療が困難であると考えられてきた。最近まで、神経細胞の変性を覆す、または、神経変性をうまく治療する方法は存在しなかった。このような疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびこれ以外の周知の慢性疾患などの慢性疾患を含む。さらに、神経変性を伴う急性疾患には、外傷性脳損傷またはTBI(貫通弾道のような脳損傷またはPBBI、および鈍器でなぐられてできた傷を含む)、脳卒中、心筋梗塞(MI)、心臓動脈バイパス移植手術(CABG)、低酸素症/虚血(HI)およびこれ以外の周知の疾患を含む。
本発明の製剤は、神経変性またはその兆候をもたらしうる状態の発現の前または後に投与可能である。例えば、低酸素症/虚血は、冠状動脈バイパス移植手術(CABG)中におこりうることが知られている。したがって、体外酸素吸入システムをつける前に、患者に、本発明の化合物で予め治療されうる。実施形態によっては、手術の4時間前、または、外傷性神経損傷もしくはこれ以外の神経損傷に至りうる出来事の前に、本発明の化合物を投与することが望ましい場合もありうる。実施形態によっては、脳卒中、TBI、CABGまたはこれ以外の神経障害ゆえに神経変性またはその兆候を起こし、回復しつつある患者に本発明の製剤を、亜急性に投与することができる。さらに別の実施形態では、このような製剤を、認知障害に苦しむ患者に投与することができる。さらに別の実施形態では、このような製剤を、神経損傷に関連して機能障害に苦しむ患者に投与することができる。
薬物デリバリーにおいて、経口デリバリーは、最も安全で、最も便利で、かつ経済的な方法である。今日の経口デリバリーされる製品の治療上の利点は、有効成分に関して、予測可能性が極めて高く、デリバリーの管理が極めてよくできることに集中し、その結果、治療効能を高め、副作用を減らすことができる。この点と、投与の頻度を減らすこととを組み合わせることにより、患者の薬剤服用遵守力を改善し、したがって、治療の結果も改善する。経口薬物デリバリーは、通常、感染の危険性を減らすことができるが、これは、この投与方法での投与中は、体内の自然の防衛機構が破られないからである。
油中水滴エマルジョンが、長鎖カルボン酸、または、これのエステルもしくはアルコールからなる油相と、界面活性剤または表面活性剤と、主に水およびG−2MePEを含有する水相とを含有する実施形態もある。
長鎖カルボン酸は、C16〜C22の範囲のものであり、3つまでの不飽和結合(分岐も)を有するものである。飽和直鎖酸の例として、n−ドデカン酸、n−テトラデカン酸、n−ヘクサドデカン酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、モンタン酸およびメリシン酸が挙げられる。不飽和モノオレフィン直鎖モノカルボン酸も有用である。この例は、オレイン酸、ガドレイン酸およびエルカ酸である。不飽和(ポリオレフィン)直鎖モノカルボン酸も有用である。この例は、リノール酸、リシノール酸、リノレン酸、アラキドン酸およびベヘノール酸である。有用な分岐鎖酸には、例えば、ジアセチル酒石酸が含まれる。
表面活性剤または界面活性剤は、親水性/疎水性(水/油)界面に蓄積することができ、かつ、この界面での界面張力を低くすることができる長鎖分子である。この結果、これらは、エマルジョンを安定化することができる。本発明のいくつかの実施形態では、界面活性剤は、以下を有してもよい。すなわち、ツイーン(Tween)80(登録商標)(ポリオキシエチレンソルベート)界面活性剤群、スパン(Span)80(登録商標)(ソルビタン長鎖カルボン酸エステル)界面活性剤群、プルロニック(Pluronic)(登録商標)(エチレンまたはプロピレンオキシド・ブロックコポリマー)界面活性剤群、ラブラゾル(Labrasol)(登録商標)、ラブラフィル(Labrafil)(登録商標)およびラブラファック(Labrafac)(登録商標)(各々、ポリ加グリコール分解されたグリセリド)界面活性剤群、オレイン酸、ステアリン酸、ラウリン酸もしくはこれ以外の長鎖カルボン酸のソルビタンエステル、ポロクサマー(ポリエチレン−ポリプロピレングリコール・ブロックコポリマーもしくはプルロニック(Pluronic)(登録商標))、これ以外のソルビタンもしくはショ糖の長鎖カルボン酸エステル、モノグリセリドまたはジグリセリド、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリドのPEG誘導体およびこれらの混合物、または、上述の2つ以上の混合物を有してもよい。
ヒトの結腸癌から取ったCaco−2細胞株
化合物の経口デリバリーの適性を検査するために、インビトロでのモデルを設けた。最初の目的は、消化管からの神経保護ペプチドの吸収を改善するために、酵素障壁および物理的な障壁に打ち勝つことにあった。
Caco−2細胞の存在下でのGPEおよびG−2MePEの安定性
目的
本研究の目的は、Caco−2培養物中でペプチダーゼの存在下での、GPEおよびG−2MePEの酵素安定性を調査することである。
Caco−2結腸癌細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手し、10%ウシ胎仔血清およびペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep)を加えた、高グルコースDMEM中で、37℃、5%のCO2中で培養、維持した。細胞は、約5〜7日継代培養した。50〜100μg/mlのGPEおよび50〜100μg/mlのG−2MePEそれぞれを、Caco−2単層と共に、T75フラスコ中のハンクス平衡塩類溶液(HBSS)緩衝液(pH 7.4)中、37℃で培養し、空気中の5%のCO2にさらした。標本を、0、15、30、45、60、120、150、180、210、240、360および1440分で採取した。
Caco−2細胞の存在下で、GPEの分解からは4つの代謝産物が特定された。G−2MePEは、GPEよりも、Caco−2細胞の酵素による酵素分解に対して、より耐性があった(図1)。G−2MePE類似体には、代謝産物が見つからず、Caco−2細胞の存在下での、G−2MePE類似体の安定性が確認された。
腸上皮細胞に接触した際に、G−2MePEは酵素的に安定であるとの結論に達した。
異なるpHにおける、Caco−2細胞存在下でのG−2MePE酵素安定性
目的
本研究の目的は、Caco−2細胞によるG−2MePEの分解におけるpHの効果を決めることである。
異なるpH状態のCaco−2細胞の密集培養物の尖端側に、100μg/mlのG−2MePEを加えた。標本を、0、15、30、45、60、90、120、150、180、210および240分後に採取した。標本を、15分間、20,000gで遠心分離機にかけた。50μlの上澄みをHPLCのカラムに投入した。G−2MePEおよび代謝産物の分析は、アクア(Aqua) 5u、250×4.6mm、C18カラム(フェノメネックス(Phenomenex)、ニュージーランド、オークランド在)を、ウォーターズ(Waters) 2695アライアンス(Alliance)分離モデル、および、ウォーターズ(Waters)2996PDA検出器に接続し、210nmでの吸収を測定して行った。異なるpHにおけるG−2MePEのペプチド分解作用および半減期を決めた。
G−2MePEのペプチド分解作用の最高値は、pH6.5において見られた。G−2MePEのペプチド分解作用の最低値は、pH5.5未満の酸性条件において見られた(図2)。中程度のG−2MePEの分解は、塩基性条件(pH7〜9.5)にも見られた。
G−2MePEは、pH≦5.5において安定している。したがって、G−2MePEは、胃の比較的酸性である環境(例えば、pH<3.0)では保護されうるが、十二指腸、回腸または結腸のより中性環境においては、おそらくは、保護の程度はより低いであろう。
阻害剤の存在下でのGPEの酵素分解
目的
本研究の目的は、Caco−2細胞ペプチダーゼまたはプロテアーゼが、GPEを分解できるか否かを決定することである。この論拠は、GPEがCaco−2細胞により酵素的に分解されうるならば、G−2MePEも酵素分解の対象になるであろうということであった。このような分解を阻害することにより、G−2MePEの生物利用効率を改善することができる。
酵素阻害剤であるSDA(胆汁塩)およびEDTAの存在下または非存在下で、GPEを、Caco−2細胞の密集培養物で、4時間培養した。標本を、異なる時点で採取した。無傷のGPEを、HPLCで分析し、標本のタンパク質含有量をローリー検定により推定した。阻害百分率を用いて、GPEの分解の阻害における胆汁塩およびEDTAの効果を評価した。
図3に、培養Caco−2細胞の存在下での、GPEのペプチド分解に対する胆汁塩(SDA)およびEDTAの効果について示す。GPEの分解は、SDA(≧5mM)およびEDTA(≧20mM)において、有意に阻害された。Caco−2の存在下でGPEのペプチド分解を妨げる効果の序列は、SDA(20mM)>SDA(10mM)>EDTA(20mM)>SDA(5mM)>SDA(2mM)であった。GPEのペプチド分解の阻害は、用いたSDAの投与量に比例した。
このインビトロでの研究により、アミノペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼを含むペプチダーゼが、Caco−2細胞によるGPEの分解に関与できることが示された。SDA(5〜20mM)およびEDTA(20mM)は、このような分解を防ぐように、有意に阻害することが示された(図3)。したがって、ペプチダーゼ阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤は、G−2MePEの生物利用効率を改善することができる。
GPEおよびG−2MePEの細胞毒性
目的
本研究の目的は、GPEおよび/またはG−2MePEが、細胞の成長を阻害しうるか否かを決めることである。この論拠は、もしG−2MePEが腸の細胞成長を阻害するのであれば、このような成長の阻害は、許容可能なG−2MePEの投与量を限定しうるからである。スルホローダミンB(SRB)を用い、Caco−2細胞の成長を阻害するのに必要な50%阻害濃度(IC50)を決めた。Caco−2細胞単層を通過する輸送研究のために安全な投与量を決定したいと考えた。
スルホローダミンB(SRB)は、培養細胞の細胞タンパク質の定量化に用いる際に有用なタンパク質染料であると判明している。この染料は、細胞内タンパク質の塩基性アミノ酸に結合すると考えられている。したがって、結合染料の比色分析測定をすることにより、推定細胞数を得ることができる。この検定方法は、単純で再現性があり、この終点測定では、時間は問題とはならず、テトラゾリウム誘導体を用いた検定に対して、有意な利点がある。
Caco−2細胞成長に関するG−2MePE(24〜120時間)のIC50は1〜4.6mMであると見出した。GPEは15mMの濃度でさえも、Caco−2細胞の成長を35%しか阻害せず、したがってCaco−2細胞成長のIC50は≧15mMであった(表1)。
G−2MePEのIC50は、インビトロで神経保護を行うと知られているG−2MePEの濃度よりも高い。したがって、インビトロで有効であると見出されたのと等価の濃度で、インビボでG−2MePEを使用することは、腸上皮細胞に対して毒性を有さないであろうと結論づけた。
フルオレセインのCaco−2細胞透過性
目的
本研究の目的は、通常の親水性材料がCaco−2上皮細胞の密集培養物を通過することにより引き起こされる、みかけの透過係数(Papp)および経上皮電気抵抗(TEER)を決めることである。
Caco−2細胞培養の完全性は、密集培養物を通るTERRおよび14Cマンニトールまたはフルオレセインの漏れを測定することにより評価した。密集細胞培養物を有するインサートおよび300Ω/cm2の電気抵抗が、本研究には適切であると考えられた。フルオレセインまたは0.5μCi/50μl14Cマンニトールが、頂端細胞に加えられ、1〜4時間培養された。容認可能な漏れは、0.5〜1%未満であると考えられた。優良な完全性を持つ6つのインサートが選択されて、輸送緩衝液で洗浄された。全ての頂端細胞および全ての基底外側ウェルの培地は除去された。細胞培養物は、37℃の暖かい輸送緩衝液で洗浄された。
カプリン酸ナトリウム(10mMまたは20mM)、タウロコール酸ナトリウム(30mM)、EDTA(40mM)およびSDA(1mM)は、それぞれ、3時間の輸送実験中で、Caco−2上皮細胞のフルオレセインに対する透過性を有意に高め(P<0.05)、TEERを低減した(図4および図5)。しかし、カプリン酸ナトリウム(20mM)の効果は、同じ濃度のタウロコール酸塩の効果よりも大きかった(図4)。
タウロコール酸ナトリウム(≧20mM)、カプリン酸ナトリウム(≧10mM)、EDTA(40mM)またはSDA(1mM)を用いて、細胞間経路および細胞間隙経路に影響を与えることにより、Caco−2上皮細胞膜を通過する親水性化合物(フルオレセイン)の透過性を改善することができた。
Caco−2細胞のG−2MePEの取り込み
目的
本研究の目的は、Caco−2細胞によるG−2MePEの取り込みを評価し、腸細胞を通過するペプチドの能動活性を探索し、Caco−2細胞によるG−2MePEの取り込みに関して、培養培地のpH、時間、温度および基材の濃度の効果を決めることである。
Caco−2培養物(5mlのDMEM培地中に5×105個の細胞)を、60mmのプラスチック培養ディッシュで成長させた。2〜3日毎に、新鮮な培地に取り替えた。取り込み検定研究のために、細胞を37℃で12〜14日間培養した。取り込み検定研究は、細胞が密集状態になった後、すなわち、12〜14日間培養した後に開始した。各ディッシュを、HEPES(pH7.4)で洗浄した。G−2MePEを、各60mmの培養ディッシュに加え、37℃で培養した。G−2MePEを加えた後、5秒、15秒、30秒、45秒、1分、2分、5分、10分、15分、30分および120分の時点で標本を採取した。セルスクレーパーで細胞を擦り取った後、抽出溶液中にいれ、20分間、20,000gで遠心分離機にかけた。上澄みをHPLCで分析し、G−2MePEとその代謝産物を識別した。ペレットは、NaOHで希釈され、ローリー検定によりタンパク質含有量を決めた。
この研究は、G−2MePEが、Caco−2細胞により取り込まれたことを示す(すなわち、1.3%、図6)。G−2MePEの取り込みは、時間に依存し、投与量に依存した。
Caco−2細胞を通過するG−2MePEの透過性、透過促進剤の効果
目的
本研究の目的は、透過促進剤が、Caco−2細胞膜を通過するG−2MePEの輸送を増加させることができるか否かを決めることである。
細胞培養の完全性は、実施例6で記載したように確認された。様々な透過促進剤の存在下または非存在下で、Caco−2細胞を含むトランスウェルのドナー側に、G−2MePEが、3回または6回繰り返して加えられた(図4)。1.5mlの輸送緩衝液が、レセプター側に加えられた。その後、トランスウェルは、培養のために放置された。標本(各0.4ml)は、レセプター側で、異なる時点(15、30、45、60、90、120、150、180、210、240および360分)で採取された。各標本の採取後、0.4mlの新鮮な緩衝液を、トランスウェルの側に加え、そこから標本を取った。続いて、0.1mlのドナー溶液を採取して、無傷のG−2MePEの濃度を測定した。各サンプリングの後、0.1mlの同じ濃度のG−2MePEで置き換えられた。
EDTA(30mM)、カプリン酸ナトリウム(20mM)、タウロコール酸ナトリウム(20mMおよび30mM)、クエン酸(30mM)およびバシトラシン(3.5mM)は、それぞれ、G−2MePEに対するCaco−2上皮細胞の透過性を有意に高めた(図7)。TEERは、EDTA(30mM)、カプリン酸ナトリウム(20mM)、タウロコール酸ナトリウム(20mMおよび30mM)、クエン酸(30mM)を用いることにより、有意に低減した(データ不図示)。
タウロコール酸ナトリウム(≧20mM)、カプリン酸ナトリウム(≧10mM)、EDTA(40mM)またはSDA(1mM)を用いて、おそらくは細胞間経路および細胞間隙経路に影響を与えることにより、Caco−2上皮細胞膜を通過するG−2MePEの透過性を改善することができた(図7)。
インビトロでのGPEおよびG−2MePEのタンパク質結合
目的
本研究の目的は、GPEおよびG−2MePEに対する血清タンパク質結合が、インビボでのこれらの薬物の生物利用効率を変えうるか否かに関する。この論拠は、もしこれらの薬物が、血漿タンパク質により結合されるのであれば、遊離(結合されない)薬物を低減し、神経保護効能を低減することになりうる。
限外ろ過法を用いて、ウシ血清アルブミン(BSA)(シグマ(Sigma)社、アメリカ合衆国在)の存在下での遊離GPEおよびG−2MePEの画分測定する。異なる分量のGPEおよびG−2MePE(1g/L)を、アルブミン(88g/L)またはミリQ(MilliQ)水と共に混合し、各システムを3部(全体量は10ml)調製した。各システムの結合分画および未結合分画を、ウシ血清アルブミンから、限外ろ過ユニット(セントリザルト(Centrisart) I(登録商標),分子量10,000ダルトンを除去、ザルトリウス・バイオラボ(Sartorius Biolab))を用いて分離した。
GPEまたはG−2MePEの結合百分率=[1−Cu/ct]×100
ここで、Ctは、アルブミンでの培養前に限外ろ過ユニット中に存在する、全GPEまたはG−2MePEの濃度を示し、
ここで、Cuは、アルブミンでの培養後に限外ろ過ユニット中に存在する、全GPEまたはG−2MePEの濃度を示す。
図8の各システムの左側の棒は、アルブミンでの培養前のシステム1、2および3の各システム中にあるGPEの量(単位 mg)を示す。図8の各システムの中央の棒は、GPEでの培養前のシステム1、2および3の各システム中にあるアルブミンの量(単位 mg)を示す。図8の各システムの右側の棒は、アルブミンへのGPEの結合百分率を示す。
予想外であるが、G−2MePEはGPEよりもたんぱく質結合が低く、したがって、G−2MePEはインビボでの使用に適していると見出した。図8と図9とを比較すると認識できるように、薬物対タンパク質の割合が最高値である(1:88および1:44)であるときに、G−2MePEのアルブミンへの結合はより少なかった。これに対して、薬物対タンパク質の割合が同じ場合で(1:88および1:44)、より多いGPEが結合されたままの状態であった。この驚くべき現象のメカニズムの説明はつかないが、薬物と血漿タンパク質との結合は、薬物の薬物速度論的特性および薬理学的特性に、著しく影響を与えることができる。これは、分子量が小さいことにより、非結合の薬物は、血管壁をより容易に通り抜けることができ、タンパク質結合薬物は、分子量が大きいためこれができないという事実による。さらに、ヒトの血清アルブミン(HSA)やα−1−酸−グリコタンパク質(AGP)などの血漿タンパク質の本来的なキラリティにより、薬物と血漿タンパク質との結合は、立体選択的な性質も有する。さらに、多くの治療用分子は、タンパク質と結合している間は、それほど活性がない。
腸溶コーティング錠剤は、G−2MePEの安定性を改善する
目的
本研究の目的は、腸溶コーティング錠剤が、G−2MePEの生物利用効率を高めることができるか否かを決定することである。
錠剤調製
G−2MePE、クエン酸錠剤分解物質、ポリビニルピロリドン、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトースを含有する0.14〜0.2gの粉末の混合物を、錠剤空洞に充填し、直接錠剤に圧縮した。オイドラギット(EUDRAGIT)(登録商標)L100−55、ジブチルフタレート、タルクおよびイソプロパノールを含有するコーティング溶液を用いて、錠剤をコーティングした。コーティング工程は、特定のコーティング施設を用いて行った。コーティング材料は、錠剤重量の約1%であった。
崩壊試験は、ビーカーを11個と、30rpmで上下に動き、かつ、錠剤用のラックアセンブリを含む硬いバスケットを運ぶ電動式シャフトとを用いて行った。アセンブリは、各管からなる。崩壊アセンブリのそれぞれに、6つの錠剤を入れた。各アセンブリは、0.1Mの塩酸を含有するビーカー内でつるされ、120分間ディスクなしで作動された。次に、アセンブリを液体から取り出し、これを調べた。コーティングの破片以外、含有物が出たことを示す割れ目の兆候や、崩壊の兆候を示した錠剤はなかった。ビーカー中の0.1Mの塩酸をpH7のリン酸塩緩衝液に置き換えて、各管にディスクを付け加えた。さらに60分間30rpmで、装置を作動した。錠剤は、6つの錠剤全てが崩壊しなかった場合に、試験合格とした。
腸溶コーティング錠剤を製剤し、これらがBP崩壊試験に合格した。腸溶コーティング錠剤は、G−2MePEの経口投与にとって適切な製剤になることができるとの結論に至った。
G−2MePE微小粒子
目的
本研究の目的は、微小粒子が、G−2MePEを胃内のペプシンなどの酵素分解から保護することができるか否かを決めることである。このために、インビトロで、様々なpHの溶液中で一連の実験を行った。
様々な量のG−2MePEまたはフルオレセインナトリウムを、オイドラギット(EUDRAGIT)(登録商標)FS30Dの30%分散液で溶かし、遠心分離機の管に移した。標本を含有する管を、−80℃で凍結し、標本を一晩乾燥させるために乾燥凍結機に移した。乾燥後、遠心分離管の重量を測定した。微小粒子の調製液各20mg(ポリマーと薬物の割合は、約20:1、10:1、1:5および1:2.5)を0.1M塩酸200mlまたは0.2Mのリン酸塩緩衝液(pH7)200mlを含有する溶液に加えた。様々な時点で標本を採取した。
微小粒子を調製し、インビトロで、酸性培地と中性培地とで試験を行った。腸溶コーティングポリマーであるオイドラギット(EUDRAGIT)(登録商標)を含む微小粒子は、胃の酸に対して耐性があり、腸管の至る所で放出された。親水性化合物のモデルであるフルオレセインナトリウムの微小粒子からの放出は、pH7において、pH1の培地中の放出よりも、約4倍速かった。この結果により、腸溶コーティングポリマーが、経口投与後にG−2MePEの治療効率を高めることができることが確認された。微小粒子は、持続放出が可能である物質の放出時間の制御も行った。(図10Aおよび図10B)。
G−2MePEマイクロエマルジョン
目的
本研究の目的は、G−2MePEを含有する油中水滴マイクロエマルジョンの製剤を行うことである。
オイル: カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(クロダモル(Crodamol) GTCC(登録商標))は、ケムカラー・インダストリーズ(NZ)社(Chemcolor Industries (NZ)Ltd)(ニュージーランド、オークランド在)から供給を受けた。C8/C10のモノ/ジグリセリドは、アビテック社(Abitec Corporation)(ウィスコンシン州、ジェーンズヴィル在)から供給を受けた。
成分の擬三次ダイアグラム(図11)を作り、異なる領域の境界を特定した。MEはマイクロエマルジョン、LCは液晶、coarseは、粗エマルジョンである。三角内の点線領域は、粗エマルジョンを提供する割合である。レンガ模様で示した領域は、液晶製剤を示し、チェック模様で示した領域は、マイクロエマルジョンを示す。
ポリマーナノカプセル(Nac)中のG−2MePE
目的
本研究の目的は、化合物を分解しないように保護し、腸上皮を通じた輸送を容易にする、G−2MePEのナノカプセル・デリバリーシステムを開発することである。
界面重合法を用いて、ポリマーナノカプセル(Nac)を調製した。まず、実施例12で記載した方法を用いて、マイクロエマルジョンを調製した。次に、マイクロエマルジョン2(MC2)10gを、以下の実施例14で記載する方法で調製した。ECA(エチル−2−シアノアクリレート)モノマー(シグマ社、ミズーリ州、セントルイス在)100mg、150mgまたは300mgを、300gのクロロホルムと共に、エッペンドルフチューブ中で混合し、ボルテックスした。約800rpmで4℃での磁性攪拌中に、このモノマー溶液をMC2に滴として加え、一晩放置し、ポリマー重合を生じさせた。
G−2MePEマイクロエマルジョン含有ポリマーナノカプセルは、小さい球面のカプセルで、概して径が100〜200nmの範囲の大きさのものである(図12Aおよび図12B)。ナノカプセルは、ペプチドの経口生物利用効率を高めるために使われてきたが、これはナノカプセルが、タンパク質分解からペプチドを保護することができるからである。さらに、ナノカプセルは、腸粘膜を通過し、したがって、腸管腔からのペプチドの吸収を容易にすることができる。ナノ粒子は、3つの異なる経路で、腸粘膜を通って移動することがわかっている。この3つの経路とは、GALTのパイエル板、細胞内経路および細胞間経路である。
マイクロエマルジョン、液晶および粗エマルジョンからのG−2MePEの放出
目的
本研究の目的は、本発明の異なる相システムからのG−2MePEの放出特性を決めることである。
薬物放出研究は、垂直型フランツ細胞(モデル VTC−200)を用いて行われた。実施例12に基づいて調製された3つの異なる相システムのそれぞれから、1つの製剤を選択した。マイクロエマルジョン1(MC1)は、リン酸塩緩衝液pH3中の、GTCC:MCM(3:1)を60%と、界面活性剤(ツイーン(Tween)80(登録商標):スパン(Span)80(登録商標))(3:2)を30%と、150mg/mlのG−2MePEを10%とからなる。マイクロエマルジョン2(MC2)は、リン酸塩緩衝液pH3中の、GTCC:MCM(3:1)を45%と、界面活性剤(ツイーン(Tween)80(登録商標):スパン(Span)80(登録商標))(3:2)を25%と、150mg/mlのG−2MePEを30%とからなる。液晶は、リン酸塩緩衝液pH3中の、GTCC:MCM(3:1)を15%と、界面活性剤(ツイーン(Tween)80(登録商標):スパン(Span)80(登録商標))(3:2)を70%と、150mg/mlのG−2MePEを15%とからなる。粗エマルジョンは、リン酸塩緩衝液pH3中の、GTCC:MCM(3:1)を16%と、界面活性剤(ツイーン(Tween)80(登録商標):スパン(Span)80(登録商標))(3:2)を14%と、150mg/mlのG−2MePEを70%とからなる。上述の様々な量の製剤のG−2MePE標本0.25gを三部、フランツ細胞に移し、薬物放出研究を行った。
薬物放出曲線は、マイクロエマルジョンおよび液晶製剤が、持続的にG−2MePEを放出することを示したが、予想外に、粗エマルジョンは、G−2MePEをかなり迅速に放出した(図13)。MC2は、実施例17および実施例18に記載するインビボ研究用に選択した。
これらの研究から、これら3つの相システムはいずれも、G−2MePEを用いた治療に有益であるとの結論に達した。まず、マイクロエマルジョンおよび液晶は、比較的ゆっくりとしたG−2MePEの持続放出が望ましい状況下で用いることができる。次に、粗エマルジョンは、比較的迅速なG−2MePEの放出が望ましい時に用いることができる。最後に、マイクロエマルジョンと粗エマルジョンとの組み合わせ、または、液晶と粗エマルジョンとの組み合わせは、G−2MePEの迅速な放出と持続放出との両方が望まれるときに、用いられるのが望ましい。
経口投与されたG−2MePEの生物利用効率
目的
本研究の目的は、インビボでの様々なデリバリーシステムからのG−2MePEの放出を調べることである。
実験には、7〜9週齢の雄のウィスターラット(Wistar Rat)を用いた。この動物に、5%のハロタン/酸素混合物を用いて麻酔にかけ、実験を通して、3%のハロタン/酸素混合物下においた。首の正中線に沿って、10mmの切開を行った。先端が丸い鉗子を用いて、気管の右側に沿って筋肉を分離し、右側頸静脈を露出させた。ポリエチレンカテーテル(外形1.5mm、内径0.6mm)を頸静脈に挿入し、縫合により、適所に保った。このカテーテルにより、G−2MePEの薬物速度論的研究用に、選択した複数の時点で、標本(100μl)を採取することができた。カテーテルを、ヘパリン化された生理食塩水(40IU/ml)で充填し、血栓による閉塞を防いだ。サンプリングは、ラットが完全な全身麻酔下にある間に行い、ラットは、実験終了時に安楽死させた。
脳脊髄液(CSF)サンプリングされるラットに、5%のハロタン/酸素で麻酔をかけた。ラットの頭部を、固定フレームに載せた。切開は、頭頂を横切る形で行い、頭蓋底を露出させた。29ゲージの超細針と注射器とを用いて、大槽からCSFをサンプリングした。その後、これらの動物は、ペントバルビタールを過剰投与して(すなわち、180mg/kg)、心臓を介して、0.9%の生理食塩水を灌流し、安楽死させた。組織は、分析のために採取した。
様々な製剤でのG−2MePEを選別し、経口生物利用効率の効果を評価した。以下の製剤をテストした。
製剤1(G−2MePEを、35.3mMのタウロコール酸(TA)に溶解させ、10mg/kg n=6に投与)
製剤2(G−2MePEを、微小粒子(MP)に製剤し、35.3mMのタウロコール酸(TA)に分散させ、10mg/kg n=6に投与)
製剤3(G−2MePEを、MPに製剤し、5mMのバシトラシンを含有する35.3mMのタウロコール酸(TA)に分散させ、30mg/kg n=6に投与)
製剤4(G−2MePEを、マイクロエマルジョン(MC)として製剤し、30mg/kg n=6に投与)
製剤5(G−2MePEを、5mMのバシトラシンを含有するMCとして製剤し、30mg/kg n=6に投与)
製剤6(G−2MePEを、35.3mMのTAに溶解させ、MCを製剤し、次に、実施例13のように、このマイクロエマルジョンにECAを加え、30mg/kg n=6に投与)
製剤7(G−2MePEを、35.3mMのTAに溶解させ、まずMCを製剤し、次にECAモノマーを加え、5mMのバシトラシンを加え、30mg/kg n=6に投与)。対照群(n=6)もテストし、これには、生理食塩水に溶解したG−2MePEを、30mg/kgの投与量で投与した。
生理食塩水中のG−2MePEを投与した場合に比べて、製剤1〜7で投与した場合、G−2MePEの生物利用効率は有意に増加した(P>0.05)。7つの製剤中、マイクロエマルジョン中のG−2MePEおよび微小粒子中のG−2MePEが、最高の生物利用効率を示した(図14)。
水溶性の製剤1に比べて、製剤2〜7で、G−2MePEの生物利用効率は有意に増加した。G−2MePEの最高の生物利用効率は、マイクロエマルジョンおよび微小粒子を用いた際に見られた(図14)。したがって、G−2MePEのエマルジョンおよびカプセル形態が、有効な経口投与型の神経保護剤の製剤であることができるとの結論に達した。
エンドセリン−1誘発中大脳動脈閉塞症
目的
本研究の目的は、経口投与されたG−2MePEが、神経損傷状態を治療する上で有効でありえるか否かを決めることである。
エンドセリン−1誘発中大脳動脈閉塞症
本研究中で行われた全ての手術および実験手順は、オークランド大学動物倫理委員会によって認証されている。動物の苦痛を最小限に抑えるあらゆる努力がなされ、用いた動物の数を最小限に抑える努力がなされた。雄の成獣であるスプレーグ・ドーリー(Sprague Dawley)ラット(280〜350g)を用いた。
薬物での治療後3日目に、これらの動物は、ペントバルビタールナトリウムを過剰投与して犠牲にし、神経細胞の生存を組織学的に評価するために、脳を採取した。ラットには、動脈を通じて0.9%の生理食塩水を灌流させ、続いて10%のホルマリンを灌流させた。脳を頭蓋骨から除去し、同じ固定液中で少なくとも24時間保存した。げっ歯類の脳マトリックス(RBM−3000C/RBM−4000C、ASIインストゥルメンツ、アメリカ合衆国在)を用いて、3つの2mmの冠状断面を切り取った。断面Aは、視神経交差の直前、断面Bは、視神経交差の直後で断面Aの直後、Cは、断面Bの直後の部分である。これらの断面を、10%のホルマリン中に、少なくとも24時間保持し、より高い%のアルコールおよびクロロホルム中で処理し、さらに切断するためにパラフィン中に埋め込んだ。冠状切片は、ライカ(Leica)(登録商標)マイクロトーム(ライカ インスツルメント(Leica Instruments)、ヌスロッホ、ドイツ在)上で、8μmの厚さに切断され、ポリサイン(Polysine)(登録商標)顕微鏡用被覆スライド(バイオラボ・サイエンティフィック(BioLab Scientific)、ニュージーランド在)に載せられ、顕微鏡検査の前にチオニン酸フクシンで染められた。
重量変化百分率は、以下の式を使って算出された。
w2−w1/w1×100%
ここで、w2は、エンドセリン注入後3日目の体重であり、w1は、エンドセリン注入の時点での体重である。
統計的分析は全て、グラフパッド・プリズム(GraphPad Prism)(登録商標)ソフトウェア(バージョン3.02、グラフパッド・ソフトウェア社(Graphpad Software Inc.)、アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サンディエゴ在)を用いて行われた。データは平均値±標準誤差を用いて示され、優位性は、p<0.05で定義された。
G−2MePEのマイクロエマルジョンを経口投与することによりMCAOを治療
材料および方法
エンドセリン−1誘発中大脳動脈閉塞症
実施例16で記載したMCAO誘発方法を用いた。24匹の動物にカニューレを挿入し、全動物が、2時間、その後4時間で、エンドセリン−1注入を受けた。12匹の動物が、G−2MePE含有マイクロエマルジョンで経口投与治療を受け、残りの12匹は、賦形剤で治療を受けた。
G−2MePE含有マイクロエマルジョンは、実施例12に記載の方法で調製された。
ラットには、MCAO後2時間および4時間の時点で、ミリQ水(n=12)またはG−2MePE含有マイクロエマルジョン(G−2MePEの分量は、マイクロエマルジョン1ml当り12mgに相当する)、全体でラット一匹当り80mg/kgが投与された。
組織学的測定および重量測定は、実施例16に記載の方法で行った。
図15Aに、G−2MePEのマイクロエマルジョン製剤が、梗塞サイズを減少させたことを示す。全投与量は、80mg/kgであった。賦形剤(n=12):G−2MePE(n=11)。対応のないt検定、p<0.0001。
この研究から、G−2MePEのマイクロエマルジョンは、経口投与後、ラットにおけるMCAOに対する有効な治療であることができるとの結論に至った。この実験システムは、ヒトにおける脳卒中で見られる効果を予測しているので、G−2MePEのマイクロエマルジョンは、脳卒中にかかったヒトを治療するためにも、経口で活性であることができるとの結論にも達した。
G−2MePEマイクロエマルジョンの経口での用量反応研究
目的
本研究の目的は、マイクロエマルジョン1mlあたり6mgのG−2MePEを含有するマイクロエマルジョンの、用量反応曲線を確立させることである。
エンドセリン−1誘発中大脳動脈閉塞症
上述の実施例16で記載したMCAO誘発方法を用いた。39匹の動物にカニューレを挿入し、全動物が、エンドセリン−1注入を受けた。MCAO後3日の生存期間の終了前に7匹が死に、または犠牲になった。
マイクロエマルジョンは、実施例12に記載の方法で調製された。
動物には、MCAO誘発後3時間の時点で治療を行った。動物は、6mgのG−2MePE含有マイクロエマルジョン、または、賦形剤としてのミリQ水で治療された。薬物は、体重にあわせた分量が与えられ、15、30または60mg/kgがデリバリーされた。
梗塞サイズの測定、体重測定および統計学的分析は、実施例16に記載の方法で行った。
経口投与G−2MePEは、投与量に依存して、脳の梗塞サイズを減少させた。G−2MePEの最高投与量では、阻害の程度は94.5%であった(図16A)。経口投与されたG−2MePEが、MCAOに関連づけられる体重減少を低減させたことも見出した(図16B)。
経口投与されたG−2MePE含有マイクロエマルジョン製剤は、ラットにおける脳卒中の有害効果を覆すのに有効であることができるとの結論に至った。これ以外の本発明のG−2MePE製剤も、MCAOの有害効果を覆すのに有効であることができるとの結論に至った。さらに、ここで研究したMCAOシステムは、ヒトにおいて見られる治療効果を予測しているので、本発明のG−2MePE含有製剤は、慢性および/または急性の神経障害にかかったヒトを治療するためにも、有効であることができるとの結論にも達した。この神経障害には、脳卒中またはこれ以外の脳損傷および疾患(低酸素症/虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病およびこれ以外の慢性的な神経変性疾患など)が含まれる。最後に、本発明のG−2MePE製剤は、急性の損傷(外傷性脳損傷、心筋梗塞、急性の低酸素症もしくは虚血、または、神経変性または細胞死により特徴づけられるこれ以外の障害を含む)に関連する神経変性効果を治療するのにも有用であることができるとの結論に至った。
G−2MePEの水溶性製剤の経口投与
目的
G−2MePE含有マイクロエマルジョンと、G−2MePE含有水溶性製剤との効能を比較する根拠を提供するために、上述に匹敵する研究を行った。しかし、マイクロエマルジョン製剤の代わりに、生理食塩水に溶解されたG−2MePEを用いた。
エンドセリン−1誘発中大脳動脈閉塞症
上述の実施例16で記載したMCAO誘発方法を用いた。
凍結乾燥させたG−2MePEを、10mg/mlの水で溶解した。エンドセリン−1後5時間の時点で、2mlのG−2MePE製剤、すなわち、60mg/kg(n=11)、または、2mlのミリQ水(賦形剤治療群、n=13)を、MCAO後3時間の時点で経口チューブで、各動物に投与した。
組織学的手順、体重測定および統計学的分析は、実施例16に記載の方法で行った。
G−2MePE水溶性溶液の梗塞サイズへの効果
G−2MePEの水溶性溶液(60mg/kg)の経口投与により、賦形剤治療群(n=13、*P<0.05)に比較して、梗塞領域が有意に減少した(図17A)。水溶性G−2MePEによる阻害は、賦形剤治療動物の約63%であった(図17A)。これに対して、G−2MePEのマイクロエマルジョン製剤による阻害は、水溶性製剤によるそれと比べて大きかった(図16A参照。すなわち、94%の阻害)。
G−2MePEの水溶性溶液(60mg/kg)の経口投与により、MCAOにかかった動物での体重減少が、約4分の3低減したが、この効果は統計学的には有意ではなかった(P<0.2)(図17B)。しかし、G−2MePEで治療した動物では、体重変化が、統計学的に0ではなかった。
この研究から、G−2MePEのエマルジョン製剤は、単なる水溶性溶液に比べて、薬物の生物利用効率を改善することができ、動物中の薬物濃度を持続し、その結果、これらの製剤は、ヒトおよびこれ以外の動物のインビボでの使用で有用であるとの結論に至った。
G−2MePEの静脈注射と経口投与との比較
目的
本研究の目的は、G−2MePEの水溶性溶液の静脈投与の効果と、マイクロエマルジョン製剤形態でG−2MePEを用いた上述の研究中で観察された効果(図16A)とを比較することである。
実施例16と同様に準備した動物を用い、エンドセリン−1誘発MCAOを起こした。この場合は、しかし、G−2MePEを、水溶性溶液として、1.2mg/kg、12mg/kgおよび120mg/kgの投与量で、静脈から、MCAO後4時間に渡って投与した。
この研究の結果を図18に示すが、この図は、エンドセリン−1誘発MCAO後に見られた平均的な梗塞範囲を示しているグラフである。静脈投与されたG−2MePEの水溶性溶液は、投与量に依存して、梗塞サイズを減少させ、最大の効果は、G−2MePEの全投与量が120mg/kgの場合に見られた。この水溶性G−2MePEの投与量による神経保護の程度は、賦形剤で治療した対照動物と比較して約74.4%であった。データは、一元配置分散分析法とダネットの事後解析テストを用いて(**p<0.01)、平均値±標準誤差を用いて示された。
Claims (13)
- 少なくとも1つの油を含む連続疎水性相、
少なくとも1つの界面活性剤、及び
グリシル−2−メチルプロリルグルタミン酸塩(G−2MePE)を含有する不連続で親水性の水相、
を含む油中水滴エマルジョンを含有する医薬組成物。 - 前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート(ツイーン(Tween)80(登録商標))、ソルビタンモノオレエート(スパン(Span)80(登録商標))およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- さらに、カプリン酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムからなる群から選択される透過促進剤をさらに有する、請求項1または2に記載の組成物。
- マイクロエマルジョンである請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 粗エマルジョンである請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 液晶である請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- さらに、微小粒子またはナノ粒子を有し、前記微小粒子またはナノ粒子は、コーティングにより周囲を取り囲まれたG−2MePEを有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- さらに、酵素阻害剤を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項4または請求項6に記載の1つまたは複数の組成物を、請求項5に記載の組成物と組み合わせて含有する製剤を有する医薬組成物。
- G−2MePEと、
結合剤と、
腸溶コーティングと
を有する錠剤。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物と、
追加的な神経保護剤と
を有する、神経障害を治療するための経口組成物。 - 神経障害を治療するための薬剤を製造するために、請求項1〜11のいずれか1項に記載のものの使用。
- 前記障害は、外傷性脳損傷、脳卒中、低酸素症/虚血、心臓動脈バイパス手術、心筋梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群から選択される、請求項12に記載の使用。
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