JP2009537139A - 置換されたテトラサイクリン化合物を用いて、遺伝子または遺伝子産物の発現を制御する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2006年5月15日に出願された米国仮特許出願第60/800,662号への優先権を主張する。上述の出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
遺伝子の発現レベルまたはその合成の時期を変化させる能力は、例えば遺伝子機能の解析から遺伝子治療にいたるまでの多くの応用例に大いなる有用性を発揮する。このアプローチのためには、外部刺激により制御される誘導発現系がきわめて望ましい。こうした系は遺伝子発現の「オン/オフ」状態を提供し、定められたレベルに遺伝子発現を制限することを可能にもする。
本発明は、少なくとも部分的には、新規の置換されたテトラサイクリン化合物が、テトラサイクリンによって制御される遺伝子転写の調節に用いるのに優れた特性を向上させるという知見に基づく。本発明は、細胞内の遺伝子または遺伝子産物の発現を制御するために原核生物のTetリプレッサー/オペレーター/インデューサー系の構成要素を利用する制御系において使用される化合物、およびこうした化合物を使用した遺伝子または遺伝子産物の発現の制御方法に関する。本発明の系による遺伝子または遺伝子産物の発現制御は、一般に少なくとも二つの構成要素を必要とする。テトラサイクリンに応答する制御配列に作動可能に連結された標的となる核酸配列と、テトラサイクリンの存在または不在のいずれかにおいて前記制御配列と結合して、前記遺伝子または遺伝子産物の転写を活性化するか阻害するタンパク質である。
本発明は、少なくとも部分的には、細胞または生体内の遺伝子または遺伝子産物の発現をきわめてコントロールされた方法で制御するのに使用することができるテトラサイクリン応答性発現系を調節する置換されたテトラサイクリン化合物の使用に関する。前記化合物を使用することのできる例示的な系は当該技術分野で既知である。一実施形態において、本発明の系による発現の制御には、少なくとも2つの構成要素が必要である。制御配列に作動可能に連結された遺伝子と、誘導物質の存在または不在のいずれかにおいて前記制御配列と結合して、前記遺伝子の転写を活性化するか阻害するタンパク質である。本発明は、真核細胞における遺伝子発現を調節するため、原核生物のTetリプレッサー/オペレーター/インデューサー系の構成要素を利用する。
用語「テトラサイクリン」は無置換型および置換されたテトラサイクリン化合物を含む。
一実施形態において、本発明の方法に使用する置換されたテトラサイクリン化合物は、式(I)
の化合物およびその薬学的に許容される塩であり、ただし、式Iの置換されたテトラサイクリン化合物は、ドキシサイクリンではない。
スキーム1に示すように、9位置換テトラサイクリン化合物の5位エステル類は、9位置換テトラサイクリン化合物(3A)を強酸(HF、メタンスルホン酸およびトリフルオロメタンスルホン酸など)に溶解し、しかるべきカルボン酸を添加して相当するエステル類(3B)を得ることによって生成することができる。
テトラサイクリンが制御する遺伝子発現系において、遺伝子の転写は転写レギュレーターによって調節される。すなわち、アクチベータータンパク質(または逆転写アクチベータータンパク質)によって活性化されるか、転写サイレンサータンパク質によって抑制される。本発明の転写アクチベーターおよびサイレンサーは、融合タンパク質であるか、非共有結合タンパク質である。このため、本発明の特定の方法は、融合タンパク質および融合タンパク質または非共有結合タンパク質をコードする核酸(DNAなど)に関わる。
一実施形態において、本発明の特定の方法に関わる転写アクチベーター融合タンパク質は、部分的には、本発明の置換されたテトラサイクリン化合物が不在の場合にtetオペレーター配列に結合する第一のポリペプチドから構成される。
転写アクチベーター融合タンパク質の第一のポリペプチドは、機能できる状態で、真核細胞の転写を直接的または間接的に活性化する第二のポリペプチドに結合する。第一および第二のポリペプチドを機能できる状態で結合するには、典型的には、第一および第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をインフレームで互いにライゲートして、融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を作製する。ただし、各ポリペプチドの機能を保存できる他の手段によっても(化学的架橋など)、第一および第二のポリペプチドを機能できる状態で結合することはできる。転写アクチベーターの第二のポリペプチドはそれ自体で転写活性化の活性を有する(すなわち、第二のポリペプチドは直接的に転写を活性化する)。第二のポリペプチドは、融合タンパク質と相互作用する転写活性化タンパク質を動員する間接的な機序によっても転写を活性化することができる。
一実施形態において、転写サイレンサー融合タンパク質の第一のポリペプチドは、機能できる状態で、真核細胞の転写を直接的または間接的に阻害する第二のポリペプチドに結合する。本明細書に記載し、当該技術分野で既知の通り、融合タンパク質の第一および第二のポリペプチドを機能できる状態で結合するには、典型的には、第一および第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をインフレームで互いにライゲートして、融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を作製する。ただし、各ポリペプチドの機能を保存できる他の手段によっても(化学的架橋など)、第一および第二のポリペプチドを機能できる状態で結合することはできる。融合タンパク質は、典型的には融合タンパク質のアミノ末端に第一のポリペプチドを有し、融合タンパク質のカルボキシ末端に第二のポリペプチドを有するとして本明細書に記載されるが、逆方向(すなわち、第二のポリペプチドがアミノ末端に位置し、第一のポリペプチドがカルボキシ末端に位置する)も本発明に含まれることは当業者には理解され得ることである。
D. 転写アクチベーターまたはインヒビター融合タンパク質の任意の第三のポリペプチド
TetRまたは変異型TetRおよび転写活性化または抑制ドメインに加えて、本発明の方法の融合タンパク質は、融合タンパク質の細胞核への輸送を促進する、作動可能に連結された第三のポリペプチドを含有することができる。タンパク質内に含まれた場合に、細胞核へのそのタンパク質の輸送を促進するべく機能するアミノ酸配列は当該技術分野で既知であり、核局在シグナル(NLS)と呼ばれる。核局在シグナルは典型的には、一定範囲の塩基性アミノ酸から構成される。異種タンパク質(本発明の融合タンパク質など)に結合した場合、核局在シグナルはそのタンパク質の細胞核への輸送を促進する。核局在シグナルは異種タンパク質と結合して、そのタンパク質の表面に位置するが、そのタンパク質の機能に干渉することはない。望ましくは、NLSはタンパク質の片方の末端(N末端など)に結合するのがよい。本発明の方法の融合タンパク質に含めることのできる非制限的な例のNLSのアミノ酸配列は、米国特許5,789,156号に記載がある。望ましくは、標準的な組換えDNA法により、核局在シグナルをコードする核酸をインフレームで、融合タンパク質をコードする核酸にスプライシングするのがよい(例えば5’末端で)。
III. テトラサイクリン制御系により制御される標的転写ユニット
一実施形態において、本発明の方法は、標的ヌクレオチド配列の転写を制御するための融合タンパク質の調節に関わる。この標的ヌクレオチド配列を、TREに機能できる状態で結合させることができる。したがって、本発明の別の態様は、TREに作動可能に連結された転写対象のヌクレオチド配列を含む標的核酸(DNA分子など)に関する。こうした核酸分子も本明細書ではtet制御転写ユニット(または単に転写ユニット)と呼ぶ。
一実施形態において、本発明の転写レギュレーターは、テトラサイクリン系化合物の非存在下での基底レベルの転写活性の低下、テトラサイクリン系化合物の存在下での誘導転写活性の上昇またはテトラサイクリンおよびテトラサイクリン類似体による特異な誘導といった新規の表現型を有する。
1.PCR変異導入法。エラーを起こしやすいTaqポリメラーゼを開発して、転写制御タンパク質の変異型対立遺伝子を作製し、それを酵母内で直接アッセイして結合能をみる。
2.化学的変異導入法。転写制御タンパク質をコードする発現カセットを変異原に暴露し、変異型配列のタンパク質産物を酵母内で直接アッセイして結合能をみる。
3.転写制御タンパク質遺伝子の部分をコードするオリゴヌクレオチドをドープ合成する。
4.In vivoの変異導入法。転写制御タンパク質のコード領域に、大腸菌の突然変異誘発株XL1−Red(mutD5 mutS mutT)(Stratagene、米国ウィスコンシン州メナサ)を通過させることによってランダムな変異を導入する。転写制御タンパク質の機能ドメインに対して変異型ペプチド配列を置換することによって、機能の達成に必要とされる特異的な配列を決定することができる。
A. 発現ベクター
本発明の核酸分子は、上述のような転写レギュレーター融合タンパク質および/またはTREに作動可能に連結された標的核酸配列をコードすることができ、当該技術分野で既知の方法を用いて、宿主細胞での融合タンパク質の発現に好適な形態で、1個以上の組換え発現ベクターに組み込むことができる。
テトラサイクリン化合物を用いて、細胞または生体内の転写を制御することができる。一実施形態において、この細胞は真核細胞である。また別の実施形態において、この細胞は哺乳動物細胞である。本発明の方法は幅広い応用が可能であり、非哺乳動物の真核細胞および非真核細胞も含む。いくつかの例には、細菌、昆虫(Sp.Frugiperdaなど)、酵母(Fleer,R.(1992)Current Opinion in Biotechnology3(5):486−496に概括されているようなS.cerevisiae,S.pombe、P.pastoris,K.lactis,H.polymorphaなど)、真菌および植物細胞が含まれる。酵母S.cerivisaeで発現させるベクターの例には、pYepSec1(Baldari et al.(1987)Embo J.6:229−234)、pMFa(Kujan and Herskowitz,(1982)Cell30:933−943)、pJRY88(Schultz et al.(1987)Gene54:113−123)およびpYES2(米国カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen Corporation)が含まれる。融合タンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞で発現させることができる(例えば、O’Reilly et al.(1992)Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual, Stockton Pressに記載のように)。培養昆虫細胞(SF9細胞など)でタンパク質を発現させるのに利用できるバキュロウイルスベクターとしては、pAcシリーズ(Smith et al.(1983)Mol.CellBiol.3:2156−2165)およびpVLシリーズ(Lucklow,V.A., and Summers,M.D.(1989)Virology170:31−39)が挙げられる。
融合タンパク質をコードする核酸分子を、従来の形質転換またはトランスフェクション法によって、原核または真核細胞に導入することができる。用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来の核酸(DNAなど)を宿主細胞に導入する当該技術分野で認識された種々の手法を指し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAE−デキストランを介するトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに好適な方法については、Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)および他の研究室マニュアルに記載がある。
本発明の1個以上の融合タンパク質をコードする核酸分子を、非ヒト動物の受精卵母細胞に輸送して、1種類以上の細胞で本発明の融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物は、トランスジーンを含有する細胞を有し、そのトランスジーンが出生前、例えば胚の段階でその動物または動物の祖先に導入された動物である。トランスジーンは、ある細胞のゲノムからトランスジェニック動物が発達し、それが成熟した動物のゲノムに留まることによって、そのトランスジェニック動物の1種類以上の細胞または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を司るある細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。一実施形態において、この非ヒト動物はマウスであるが、本発明はそれに限定はされない。他の実施形態において、トランスジェニック動物はヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシまたはその他の家畜である。こうしたトランスジェニック動物は、タンパク質の大規模生産に有用である(いわゆる「遺伝子農業」)。
また、本発明の方法は、本発明の融合タンパク質を発現し、置換されたテトラサイクリン化合物を投与することのできる、相同組換え非ヒト生物に関わる。用語「相同組換え生物」は、動物の細胞(例えば動物の胚細胞など)に導入した遺伝子およびDNA分子間の相同組換えによって修飾された遺伝子を含有する、動物、植物などの生物を含む。一実施形態において、ヒトでない動物はマウスであるが、本発明はそれに限定されない。融合タンパク質をコードする核酸をゲノムの特定の部位に導入して、すなわち核酸を内在遺伝子と相同組換えさせて動物をつくることができる。
標的ヌクレオチド配列の発現は、上述のような転写レギュレータータンパク質によって制御される。このため、融合タンパク質および標的核酸分子はいずれも宿主細胞または生体中に存在する。多数の異なる方法で、同じ宿主細胞または生体中に転写レギュレーター融合タンパク質および標的転写ユニットを存在させることができる。例えば、発現系の1個の核酸(転写レギュレーター融合タンパク質をコードするなど)を宿主細胞に導入した後に、他の核酸分子を同じ宿主細胞に導入することができる。2個の異なる選択マーカーを用いて選択することができる。第一の核酸の取り込みはG418によって選択でき、第二の核酸の取り込みはヒグロマイシンによって選択できる。あるいは、細胞の単一の集合に、その系の両方の構成要素に対応する核酸をトランスフェクトすることができる。
−転写を調節する融合タンパク質をコードする第一の核酸。この融合タンパク質は、真核細胞で転写を活性化する第二のポリペプチドに、作動可能に連結された置換されたテトラサイクリン化合物の存在または非存在下でtetオペレーター配列に結合する第一のポリペプチドを含む。
−少なくとも1個のtetオペレーター配列に作動可能に連結された、転写対象のヌクレオチド配列を含む第二の核酸。
単一の転写されたヌクレオチド配列の発現を制御する系を提供することに加えて、本発明の方法はさらに、同一のtetオペレーター配列に作動可能に連結された2個のヌクレオチド配列の発現を協調的に制御することを可能にする。したがって、本発明の方法は、二個の遺伝子の協調的な制御のための新規のtet制御転写ユニットにも関する。この転写ユニットでは、同一のtetオペレーター配列が、共通のtetオペレーター配列から逆方向で転写された2個の作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を制御する。したがって、1個のヌクレオチド配列がtetオペレーター配列の片側(例えば、DNAのトップ鎖の5’末端)に機能できる状態で結合し、もう1個のヌクレオチド配列がtetオペレーター配列の反対側(例えばDNAのトップ鎖の3’末端)に機能できる状態で結合する。また、転写対象の各ヌクレオチド配列が、転写対象のヌクレオチド配列とtetオペレーター配列の間に位置する作動可能に連結されたミニマルプロモーター配列を含むことは理解される必要がある。
本発明の方法はさらに、転写対象となる2個以上のヌクレオチド配列の独立または対立した制御を可能にする。したがって、2個以上の遺伝子の独立した制御のためのtet制御転写ユニットを使用することができる。転写対象となる2個のヌクレオチド配列の発現を独立して制御するためには、1個のヌクレオチド配列をあるクラスのtetオペレーター配列に機能できる状態で結合させることができ、もう1個のヌクレオチド配列を別のクラスのtetオペレーター配列に機能できる状態で結合させる。
−少なくとも1個の第一のクラスのtetオペレーター配列に機能できる状態で結合し、転写対象の第一のヌクレオチド配列の導入のための第一のクローニング部位および
−少なくとも1個の第二のクラスのtetオペレーター配列に機能できる状態で結合し、転写対象の第二のヌクレオチド配列の導入のための第二のクローニング部位を含むことができる。
さらに、上述の2つの系で記述された系を統合して、2対の配列を協調させて制御しながらも、1対がもう1対とは独立して制御されるようにすることによって、4個のヌクレオチド配列の発現を制御することも可能である。したがって、以下を含む2個の標的転写ユニットを設計することができる。
−5’から3’の方向で、転写対象の第一のヌクレオチド配列、第一のクラスのtetオペレーター配列、転写対象の第二のヌクレオチド配列を含む第一の核酸。
−5’から3’の方向で、転写対象の第三のヌクレオチド配列、第二のクラスのtetオペレーター配列、転写対象の第四のヌクレオチド配列を含む第二の核酸。
本発明の別の態様は、本発明の誘導制御系の構成要素を含むキットに関する。こうしたキットを用いて、所定の遺伝子(転写対象の所定のヌクレオチド配列など)の発現を制御し、それを標的転写ユニットにクローン化することができる。このキットは、転写アクチベーター融合タンパク質または転写サイレンサー融合タンパク質またはその両方をコードする核酸を含むことができる。あるいは、安定に組み込まれた転写アクチベーターおよび/またはインヒビター融合タンパク質をコードする核酸を有して、その転写アクチベーターおよび/またはインヒビター融合タンパク質がその真核細胞内で発現するようにした真核細胞をキット内で提供することができる。
A. 転写アクチベーター融合タンパク質による遺伝子発現の促進
本発明の転写アクチベーター融合タンパク質およびtetオペレーター配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列をコードする核酸(すなわち、転写対象の所定の遺伝子)を有する宿主細胞においては、本発明の置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下では、tetオペレーター配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列の高レベルの転写は起こらない。ヌクレオチド配列の基底転写のレベルは、宿主細胞および配列の組み込み部位によって左右されるが、本発明の置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下では一般には低いか検出されないレベルである。宿主細胞内での転写を誘導するために、宿主細胞を本発明の置換されたテトラサイクリン化合物と接触させる。置換されたテトラサイクリン化合物は、その細胞を含む被験体に投与することができる。
また、本発明の方法は、転写サイレンサー融合タンパク質を用いた遺伝子発現の阻害にも関する。これらの方法を用いて、所定のtetO結合遺伝子の基底、恒常的または組織特異的な転写をダウンレギュレートすることができる。例えば、tetO配列に作動可能に連結された所定の遺伝子および追加的な正の制御エレメント(恒常的または組織特異的なエンハンサー配列など)は、宿主細胞中のその正の制御エレメントの強度によって主として決定されるレベルで、宿主細胞中に転写される。さらに、tetO配列に作動可能に連結された所定の遺伝子およびミニマルプロモーター配列のみが、宿主細胞または組織および/またはその配列の組み込み部位に応じた転写の種々の基底レベルを示すことができる。こうした標的配列を含み、本発明のインヒビター融合タンパク質を発現する宿主細胞では、標的配列の転写は、その宿主細胞と接触する置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を変化させることによって、制御された方法でダウンレギュレートすることができる。例えば、インヒビター融合タンパク質が置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下でtetOに結合する場合、宿主細胞と接触する置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を低下させて、標的核酸配列の発現を抑制する。望ましくは、宿主細胞は置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で培養して、標的核酸配列の発現を抑制したままにする。同様に、置換されたテトラサイクリン化合物を宿主生物に投与せず、標的核酸配列の発現を抑制したままにする。あるいは、インヒビター融合タンパク質が置換されたテトラサイクリン化合物の存在下でtetOに結合する場合、宿主細胞に接触した置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を上昇させて、標的核酸配列の発現を抑制する。例えば、置換されたテトラサイクリン化合物を宿主細胞の培地に添加するか、置換されたテトラサイクリン化合物を宿主生物に投与して、標的核酸配列の発現を抑制する。
転写アクチベーターまたはインヒビター融合タンパク質のいずれかを単独で用いて遺伝子発現を制御するのに加えて、この2種類の融合タンパク質を組み合わせて用いて、宿主細胞中の1個以上の標的核酸配列の発現の正および負の制御を可能にすることができる。このため、(i)置換されたテトラサイクリン化合物の存在下ではなく非存在下で、または(ii)置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下ではなく存在下でtetOに結合する転写サイレンサータンパク質を、(i)置換されたテトラサイクリン化合物の存在下ではなく非存在下で、または(ii)置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下ではなく存在下でtetOに結合する転写アクチベータータンパク質と組み合わせて用いることができる。無置換されたテトラサイクリン(野生型TetR−アクチベーター融合タンパク質など)の存在下ではなく非存在下でtetOに結合する転写アクチベータータンパク質のさらなる詳細は、米国特許出願第08/076,726号、米国特許出願第08/076,327号および米国特許出願第08/260,452号に記載がある。置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下ではなく存在下でtetOに結合する転写アクチベーター融合タンパク質(変異型TetR−アクチベーター融合タンパク質など)は当該技術分野で既知である。
本発明は、遺伝子発現をオンおよびオフにするか、多面発現性または細胞毒性を引き起こすことなく、迅速、効率的かつ制御された方法で遺伝子発現のレベルを制御するのが望ましいような、当該技術分野で認識される種々の状況に幅広く応用することができる。このため、本発明の方法の系は、真核細胞、植物および動物における細胞発達および分化の研究に幅広く応用することができる。例えば、癌遺伝子の発現を制御された方法で制御して、その機能を研究することができる。また、その系を利用して、CREまたはFLPなどの部位特異的リコンビナーゼの発現を制御し、それによって発達の特定の段階において、制御された条件下でトランスジェニック生物の遺伝子型を不可逆的に改変することができる。例えば、特定のトランスジェニック植物の選択を可能にするような、トランスジェニック植物のゲノムに挿入した薬物耐性マーカーを、置換されたテトラサイクリン化合物が制御する部位特異的リコンビナーゼを介して不可逆的に除去することができた。本発明の方法の制御系のこのほかの応用例には以下が含まれる。
本発明の方法は、遺伝性または後天性疾患のいずれかに対する治療で、遺伝子治療のアプローチに用いることができる。遺伝子治療の一般的なアプローチは、核酸を細胞に導入して、その導入された遺伝子材料によってコードされる1個以上の遺伝子産物がその細胞で産生されて機能的活性を回復するか強めるようにするものである。遺伝子治療のアプローチに関する再検討については、Anderson,W.F.(1992)Science256:808−813;Miller,A.D.(1992)Nature357:455−460;Friedmann,T.(1989)Science244:1275−1281;およびCournoyer,D.,et al.(1990)Curr.Opin.Biotech.1:196−208を参照されたい。ただし、現在の遺伝子治療のベクターは典型的には、内在性の転写因子に応答する恒常的な制御エレメントを用いる。これらのベクター系は、対象における遺伝子発現レベルを調節することはできない。これとは異なり、本発明の方法の誘導制御系はこの能力を提供することができる。
所定のタンパク質の大規模な産生は、1)細胞内での転写レギュレーターの発現に好適な形態をとった本発明の転写レギュレーター融合タンパク質をコードする核酸および2)tetオペレーター配列に作動可能に連結された所定のタンパク質をコードする遺伝子を含有するべく修飾されたin vitroの培養細胞を用いて達成することができる。例えば、哺乳動物、酵母または真菌細胞を修飾して、本明細書に記載のようなこれらの核酸構成要素を含むようにすることができる。この修飾細胞をその後、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で標準的な発酵法によって培養して、遺伝子の発現を誘導し、所定のタンパク質を産生することができる。したがって、本発明の方法を用いて、所定のタンパク質の単離のための生成プロセスを操作することができる。そのプロセスでは、本発明の方法の転写レギュレーター融合タンパク質をコードする核酸と少なくとも1個のtetオペレーター配列に作動可能に連結された所定のタンパク質をコードする核酸の両方を導入した宿主細胞(酵母または真菌など)を、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で培地にて製造規模で増殖させ、所定のタンパク質をコードするヌクレオチド配列(tetオペレーター配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列など)の転写を促進し、その所定のタンパク質を回収した宿主細胞または培地から単離する。標準的なタンパク質精製法を用いて、所定のタンパク質を培地または回収した細胞から単離することができる。
また、本発明の方法は、トランスジェニック家畜などの動物で所定のタンパク質の大規模な精製を促進することができる。トランスジェニック技術の進歩により、ウシ、ヤギ、ブタおよびヒツジなどのトランスジェニック家畜を生成することが可能になった(Wall,R.J.et al.(1992)J.Cell.Biochem.49:113−120およびClark,A.J.et al.(1987)Trends in Biotechnology 5:20−24)。したがって、ゲノム中に本発明の方法の誘導制御系の構成要素を有するトランスジェニック家畜を構築することができ、そこでは所定のタンパク質をコードする遺伝子は機能できる状態で少なくとも1個のtetオペレーター配列に結合する。遺伝子発現およびそれ故にタンパク質の生成は、トランスジェニック動物に置換されたテトラサイクリン化合物を投与することによって誘導される。転写レギュレーターの発現を特定の細胞に制限するしかるべき組織特異的制御エレメントに、転写レギュレーター融合タンパク質をコードする核酸を結合させることによって、特定の組織にタンパク質を生成させることができる。例えば、乳清プロモーター(米国特許第4,873,316号および欧州特許申請第264,166号)などの乳腺特異的制御エレメントを転写レギュレータートランスジーンに結合させて、転写レギュレーターの発現を乳腺組織に限定することができる。このため、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で、所定のタンパク質はトランスジェニックアニマルの乳腺組織で産生されることになる。このタンパク質をトランスジェニック動物の乳に分泌させるべく設計し、必要であればその後そのタンパク質を乳から単離することができる。
本発明の方法を侵襲的またはより望ましくは非侵襲的な造影法と組み合わせて、細胞、細胞系および/または生物における遺伝子発現の制御をモニターすることができる。例えば、レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ、GFP、CATなど)と所定のヌクレオチド配列の両方を、ニ方向tetオペレーター(Ptetbi−1)の制御下におき、レポーター遺伝子および所定のヌクレオチド配列の発現を置換されたテトラサイクリン化合物制御転写アクチベーター(tTAまたはrtTA)に応答するようにすることができる。こうした遺伝子構築物の使用により、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の発現および/または活性がtetオペレーター結合ヌクレオチド配列の間接的な非侵襲的マーカーとして働くように、トランスジェニック動物および細胞系を導くことができる。生物において非侵襲的な造影を実行するためのこうした方法の使用については、Hasan,MT et al.Genesis29(3):116−22に記載がある。
本発明の方法の転写アクチベーターおよびインヒビタータンパク質を単独でまたは組み合わせて用いて、動物において特定の遺伝子の発現を促進または抑制し、ヒトの疾患の病態生理を模倣し、ヒト疾患の動物モデルを作製することができる。例えば、宿主動物で、疾患に関与すると考えられている所定の遺伝子を、1個以上のtetオペレーター配列の転写制御下におくことができる(本明細書に記載の相同組換えなどによって)。こうした動物を、転写アクチベーター融合タンパク質および/またはインヒビター融合タンパク質の1個以上のトランスジーンを有する第二の動物と交配させて、置換されたテトラサイクリン化合物が制御する融合タンパク質遺伝子とtet制御標的配列の両方を有する子孫動物を作製することができる。置換されたテトラサイクリン化合物を使用して、こうした子孫動物における所定の遺伝子の発現を調節することができる。例えば、転写サイレンサー融合タンパク質を用いて所定の遺伝子の発現を抑制的に調節し、遺伝子発現と疾患との因果関係を調べることができる。本明細書に記載のtet制御系により所定の遺伝子の発現レベルおよび遺伝子発現のダウンおよびアップレギュレートの時期の両方を制御することができるため、こうしたアプローチは相同組換えによる遺伝子「ノックアウト」に対して有益である。
本発明の方法で使用する転写サイレンサー系は、遺伝子発現を「オフ」にし続け(すなわち、発現させ)、それによってほかの方法では産生することのできない安定な細胞系を産生することができる。例えば、その細胞に対する細胞毒性を有する遺伝子をもつ安定な細胞系は、その毒性遺伝子の発現における「漏出」のために作製することが困難であるか不可能であることがある。こうした毒性遺伝子の遺伝子発現を本発明の転写サイレンサー融合タンパク質を用いて抑制することによって、毒性遺伝子を有する安定な細胞系を作製することができる。その後、こうした安定な細胞系を用いて、こうした毒性遺伝子をクローン化することができる(例えば、置換されたテトラサイクリン化合物を用いて制御された条件下で毒性遺伝子の発現を誘導する)。本発明の転写サイレンサー系を応用することのできる遺伝子の発現クローニングの一般的な方法は当該技術分野で既知である(例えば、Edwards,C.P. and Aruffo,A.(1993)Curr.Opin.Biotech.4:558−563を参照)。さらに、転写サイレンサー系を応用して、胚性幹細胞(ES細胞)などの他の細胞内で遺伝子の基底発現を抑制し、安定な細胞系を作製することもできる。ES細胞に導入した特定の遺伝子が残留的に発現することにより、安定にトランスフェクトしたクローンが単離できなくなることがある。本明細書に記載の転写サイレンサー系を用いてこうした遺伝子の転写抑制を行うことは、この問題を克服するのに有用である。
本発明の方法の特定の置換されたテトラサイクリン化合物は、本発明の方法に記載の誘導制御系を調節する望ましい物質としてのドキシサイクリンなどの使用によって改良される。ドキシサイクリンは、血液脳関門の通過が限定され、そのために、脳内で誘導制御系を調節するためには、対象の末梢血中のドキシサイクリンをきわめて高レベルまで上昇させる必要がある(本明細書に参照として組み込まれているMansuy and Bujard Curr.Op.Neurobiol.10:593−96を参照)。本明細書に記載の特定の置換されたテトラサイクリン化合物を用いた本発明の方法を実行することにより、対象の脳および脊髄において、記載の誘導制御系の機能を向上させることができる。
また別の実施形態においては、本発明は、当該技術分野で既知の方法を用いた標的遺伝子の発現に干渉する核酸分子(二重鎖RNA分子など)の誘導および/または組織特異的発現のための組換えベクターに関する。特定の実施形態において、本発明は、組み込まれたか内在性の遺伝子の特定の細胞における誘導性ノックダウンを司るTet(テトラサイクリン)応答性RNAポリメラーゼII(PolII)プロモーター(TetONまたはTetOFFなど)の使用に関する。また、本発明は、標的遺伝子の発現に干渉するテトラサイクリンが制御する可逆的および/または組織特異的な核酸分子(二重鎖RNA分子)を発現するトランスジェニック動物(マウスなど)の作製方法にも関する。
本明細書に記載の方法は、記載の誘導制御系の使用の強化を可能にする。本発明の方法の置換されたテトラサイクリン化合物は、ドキシサイクリンで用いる場合の1/10の低濃度で置換されたテトラサイクリン化合物がトリガーとなる応答を誘導することを可能にする。特定の実施形態において、本発明の方法はドキシサイクリンの1/100の低濃度のエフェクターで遺伝子をin vivoで誘導することも可能にする。
置換されたテトラサイクリン化合物によるルシフェラーゼ活性の誘導
HR5−C11細胞における置換されたテトラサイクリン化合物のルシフェラーゼ発現の誘導能を試験した。細胞系HR5−CL11細胞はルシフェラーゼ遺伝子およびrtTA遺伝子を有するが、tTA遺伝子を有さない。HR5−C11細胞を約3×104細胞/35mm皿の密度で播種した(生育密度約80%)。細胞が完全に付着した後、テトラサイクリン誘導体を濃度0、30〜3000ng/mLで細胞に投与した。3日間の培養の後、ルシフェラーゼ活性を測定した。
置換されたテトラサイクリン化合物を用いたrtTAが媒介する遺伝子活性化
2種類のルシフェラーゼ陽性細胞系34RおよびMT2が、新しい転写アクチベーターrtTA2−34RおよびrtTA2−MT2をそれぞれ産生した。これらの変異型は、テトラサイクリン化合物の存在下できわめて低レベルの残留DNA結合を示すことを特徴とする。rtTA2−MT2系では、9−t−ブチルドキシサイクリンがRtTAが媒介する遺伝子活性化を100倍上昇させた。9−t−ブチルドキシサイクリンは濃度30〜100ng/mLでこの系を活性化した。9−t−ブチルドキシサイクリンは、in vitroでドキシサイクリンの1/10の濃度で全てのrtTAを誘導したことが見出された。この系は、濃度10ng/mLの9−t−ブチルドキシサイクリンで完全に誘導された。また、5−フェニルカルバメートドキシサイクリンも、ドキシサイクリンに比してrtTA2s−M2を2倍活性化することが見出された。
X1/5細胞および置換されたテトラサイクリン化合物を用いた用量反応試験
X1/5細胞の用量反応分析を用いて、tTAおよびrtTA転写活性化に対する置換されたテトラサイクリン化合物の能力を試験した。細胞系X1/5細胞は、テトラサイクリン誘導プロモーターによって制御される染色体に組み込まれたtTA遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子のコピーを有する。細胞が完全に付着した後、テトラサイクリン誘導体を濃度0、30〜3000ng/mLで細胞に投与した。3日間の培養の後、ルシフェラーゼ活性を測定した。
置換されたテトラサイクリン化合物によるin vivoにおけるrtTA2s−M2遺伝子の活性化
rTA M2CaMK−1/LC1のバイトランスジェニックマウスを用いて9−t−ブチルドキシサイクリンを試験した。マウスは前脳特異的α−CamKIIプロモーターの制御下でrtTA2s−M2遺伝子を発現した。また、LC1マウスはニ方向プロモーターの制御下にルシフェラーゼおよびcre遺伝子を有した。飲用水に5%スクロースまたは0.2および2mg/mLの9−t−ブチルドキシサイクリンを溶解し、マウスに7日間ドキシサイクリン(2mg/mL)を投与した。マウスにアベルチンで麻酔をかけ、ルシフェラーゼ(IP)を注射し、バイオルミネセンスチャンバーに置き、5分後に測定を行った。結果、0.2mg/mLの9−t−ブチルドキシサイクリンが2mg/mLのドキシサイクリンよりも良好な活性化をもたらした。図4はマウスにおけるルシフェラーゼ発現の画像である。
当業者は、通常の実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等事項を認識するか、確認することができる。こうした均等事項は下記の特許請求の範囲に包含されることを意図するものである。
Claims (41)
- (i)テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、(ii)細胞内で転写を制御する第二のポリペプチドに作動可能に連結された置換されたテトラサイクリン化合物の存在下あるいは非存在下で該TREに結合する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質とを含む細胞において、tetオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための方法であって、該細胞内の標的ヌクレオチド配列の発現が制御されるように、該細胞内で置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、該置換されたテトラサイクリン化合物は、式(I):
R5はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
R7は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、
R9は水素またはアルキルである)
の化合物およびその薬学的に許容される塩であり、ただし、式Iの置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、
方法。 - 前記標的ヌクレオチド配列がタンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記第一のポリペプチドが前記置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で前記TREに結合する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第一のポリペプチドが前記置換されたテトラサイクリン化合物の存在下ではなく非存在下で前記TREに結合する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記融合タンパク質の前記第一のポリペプチドが変異型Tetリプレッサーである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異型TetリプレッサーがクラスBリプレッサーである、請求項5に記載の方法。
- 前記変異型Tetリプレッサーが、71位、95位、101位および102位のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸位置でアミノ酸置換が行われているTn10由来のTetリプレッサーである、請求項6に記載の方法。
- 前記変異型Tetリプレッサーが、71位、95位、101位および102位からなる群から選択される少なくとも2つのアミノ酸位置でアミノ酸置換が行われているTn10由来のTetリプレッサーである、請求項6に記載の方法。
- 前記融合タンパク質の前記第二のポリペプチドが、単純ヘルペスウイルス粒子タンパク質16の転写活性化ドメインを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、細胞の染色体中にランダムに組み込まれる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、細胞の染色体中の所定の位置に組み込まれる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子がex vivoの細胞に導入され、さらに前記細胞を対象に投与することを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記tetオペレーター連結核酸が、少なくとも1つのtetオペレーター配列に作動可能に連結された細胞の内在性の核酸である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記tetオペレーター連結核酸分子が、細胞内に導入された外在性の核酸分子である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がさらに第二の標的核酸分子を含有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記テトラサイクリン化合物が抗菌活性を有さない、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- R7およびR9が水素である、請求項1に記載の方法。
- R5がヒドロキシルである、請求項17に記載の方法。
- R5がアルキルカルボニルオキシである、請求項17に記載の方法。
- 前記アルキルカルボニルオキシがシクロブチルカルボニルオキシである、請求項19に記載の方法。
- 前記アルキルカルボニルオキシがシクロヘキシルカルボニルオキシである、請求項19に記載の方法。
- R5がヒドロキシルである、請求項1に記載の方法。
- R9が水素である、請求項22に記載の方法。
- R7がアルキルカルボニルアミノである、請求項23に記載の方法。
- 前記アルキルカルボニルアミノがメチルカルボニルアミノである、請求項24に記載の方法。
- R7が水素である、請求項22に記載の方法。
- R9がアルキルである、請求項26に記載の方法。
- 前記アルキルがシクロペンチルメチルである、請求項27に記載の方法。
- 前記アルキルがシクロブチルメチルである、請求項27に記載の方法。
- R9が水素である、請求項1に記載の方法。
- R5がアルキルカルボニルオキシである、請求項30に記載の方法。
- 前記アルキルカルボニルオキシがプロパニルカルボニルオキシである、請求項31に記載の方法。
- R7がアルキルカルボニルアミノである、請求項31に記載の方法。
- 前記アルキルカルボニルアミノがシクロペンチルアセチルアミノである、請求項33に記載の方法。
- R5がヒドロキシルであり、R7がメチルである、請求項1に記載の方法。
- R9がアルキルである、請求項35に記載の方法。
- 前記アルキルがt−ブチルである、請求項36に記載の方法。
- 前記置換されたテトラサイクリン化合物が、9−t−ブチルドキシサイクリン、9−1’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、5−シクロブタノエートドキシサイクリン、5−シクロヘキサノエートドキシサイクリン、5−プロピオニル−7−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリン、7−アセチルアミノドキシサイクリン、9−1’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、9−1’−メチルシクロブチルドキシサイクリン、9−t−ブチル−7−メチルドキシサイクリンおよび薬学的に許容されるその塩である、請求項1に記載の方法。
- (i)テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、(ii)置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下ではなく存在下で該TREに結合する変異型Tetリプレッサーとを含む細胞内において、tetオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための方法であって、該細胞内の標的ヌクレオチド配列の発現が制御されるように、該細胞内で置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、ここで、該変異型Tetリプレッサーは、該変異型Tetリプレッサーが、式(I):
R5はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
R7は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、
R9は水素またはアルキルである)
の置換されたテトラサイクリン化合物およびその薬学的に許容される塩の存在下で該TREに選択的に結合するように選択され、ただし、式Iの該置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、方法。 - (i)テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、(ii)置換されたテトラサイクリン化合物の存在下ではなく非存在下で該TREに結合する変異型Tetリプレッサーとを含む細胞内において、tetオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための方法であって、該細胞内の標的ヌクレオチド配列の発現が制御されるように、該細胞内で置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、ここで、該変異型Tetリプレッサーは、該変異型Tetリプレッサーが、式(I):
R5はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
R7は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、
R9は水素またはアルキルである)
の置換されたテトラサイクリン化合物およびその薬学的に許容される塩の非存在下でのみ該TREに選択的に結合するように選択され、ただし、式Iの該置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、方法。 - 前記置換されたテトラサイクリン化合物が、9−t−ブチルドキシサイクリン、9−1’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、5−シクロブタノエートドキシサイクリン、5−シクロヘキサノエートドキシサイクリン、5−プロピオニル−7−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリン、7−アセチルアミノドキシサイクリン、9−1’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、9−1’−メチルシクロブチルドキシサイクリン、9−t−ブチル−7−メチルドキシサイクリンおよび薬学的に許容されるその塩である、請求項39または40に記載の方法。
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