JP2009536524A

JP2009536524A - 薄切りにした腫瘍組織におけるｍＲＮＡ発現を定量することによって固形腫瘍の薬剤感受性を検査する方法

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Publication number: JP2009536524A
Application number: JP2009509816A
Authority: JP
Inventors: マサトミツハシ; 和彦小原
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd; Showa Denko Materials Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 2006-05-08
Filing date: 2007-05-08
Publication date: 2009-10-15
Also published as: US20090298071A1; WO2007133551A3; CN101437549A; EP2015783A2; WO2007133551A2; EP2015783A4

Abstract

治療剤に対する新生物組織の感受性を評価する方法、特にこのような方法において薄切りにした生腫瘍組織から得られた細胞におけるアポトーシス促進性のマーカーｍＲＮＡを定量する方法を開示する。この方法は、個々の腫瘍又は腫瘍型に対する特定のアポトーシスマーカーｍＲＮＡを確認すること、並びにｉｎｖｉｔｒｏで個々の腫瘍由来の薄切りにした生癌組織を候補化学療法剤の投薬法に曝した後、この組織でマーカーｍＲＮＡのレベルを評価することを含めることができる。

Description

本開示は、治療剤に対する新生物組織の感受性を評価する方法に関し、特にこのような方法において薄切りにした生腫瘍組織から得られた細胞におけるアポトーシス促進性のマーカーｍＲＮＡの発現の定量に関する。

患者向けの「テーラード（tailored：テーラーメイド）」、「オーダーメイド（personalized）」、又は「個別化（individualized）」医療は、各患者に好適な個別化した治療を特定するのに、近年兆しが見えてきた新しい概念である（参照により本明細書中に援用されるJain KK, Curr Opin Mol Ther 4, 548（2002）を参照されたい）。この医療は、化学療法剤は深刻な副作用を誘導することが知られているため、癌患者にとって特に重要である。しかし、現在の薬剤選択は、多数例の患者集団を用いる二重盲式臨床試験によって得られた統計的に有意な結果に依存してなされる。診断が下されると、患者は、薬剤感受性における個人差を考慮されずに、統計的に実証された標準的な治療を受ける。このような薬剤応答性を予測するのに様々な試みが為されてきたが、１）癌細胞が、ｉｎｖｉｔｒｏで手術によって取り出した組織又は生検標本から単離されると、癌細胞の特性が均一ではなくなることがあることと、２）培養条件は一般的に、通常の生理学的環境を模倣していないことという、主として２つの大きな理由から、現時点では利用可能な普遍的方法論は存在しない。ゲノムＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）の解析は、特定薬剤に感受性がある、又は感受性がない患者を特定する幾つかの手掛かりを与えるが（参照により本明細書中に援用されるA. Di Paolo, R. Danesi, M. Del Tacca, Pharmacol. Res. 49, 331（2004）を参照されたい）、このような情報は全ての薬剤で普遍的に適用可能というわけではない。さらに、特定薬剤に対する応答性に影響するＳＮＰが同定されたとしても、２番目又は３番目の未だに同定されていないＳＮＰが、薬剤に対する応答性の変化を補うのか、その変化を妨げるのか、又は悪化させるのかは依然として知られていない。

一実施形態において、治療剤が固形腫瘍に対して効果がありそうか否かを決定する方法を開示し、この方法は、固形腫瘍から、厚さが２０μｍ〜５００μｍである実質的に均質な切片を含む第１のサンプル及び第２のサンプルを得ること、ｉｎｖｉｔｒｏで第１のサンプルを治療剤とインキュベートすること、ｉｎｖｉｔｒｏで第２のサンプルを対照の刺激とインキュベートすること、インキュベーション後、第１のサンプル及び第２のサンプルにおける腫瘍細胞のアポトーシスに関連するｍＲＮＡの量を測定すること、及び第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量とを比較し、この量が約５０％超異なる場合、この治療は効果がありそうであると決定することを含む。さらなる態様では、実質的に均質な切片の厚さは、約５０μｍ〜２００μｍの範囲内である。さらなる態様では、第１のサンプル及び第２のサンプルのそれぞれが、少なくとも３つの均質な切片を含む。さらなる態様では、対照の刺激がＰＢＳ及びＤＭＳＯから成る群から選択される。さらなる態様では、第１のサンプル及び第２のサンプルをＣＯ₂インキュベータでインキュベートする。さらなる態様では、第１のサンプル及び第２のサンプルを３時間〜５時間インキュベートする。さらなる態様では、第１のサンプル及び第２のサンプルを約４時間インキュベートする。さらなる態様では、第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量が、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量より大きい場合、治療は効果がありそうであると決定する。さらなる態様では、第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量とを比較することが、第１のサンプルにおけるｍＲ
ＮＡの量と第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、この比が１．５以上である場合、治療は効果がありそうであると決定する。さらなる態様では、この比が２．０以上である場合、治療は効果がありそうであると決定する。さらなる態様では、治療剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シタラビン、シスプラチン、エトポシド、及びミトキサントロンから成る群から選択される薬剤を含む。

さらなる態様において、腫瘍細胞のアポトーシスに関連するｍＲＮＡが、第３のサンプル及び第４のサンプルを固形腫瘍から得ること、ｉｎｖｉｔｒｏで第３のサンプルをアポトーシス促進性の刺激に曝すこと、細胞サンプルにおいてアポトーシス変化が生じるのに十分な時間、第３のサンプル及び第４のサンプルをインキュベートすること、第３のサンプル及び第４のサンプルにおいて、ｐ２１、ＧＡＤＤ、Ａｐａｆ−１、ＳＵＭＯ、Ｂｆｌ−１、ＢＣＬ−Ｗ、ＢＣＬ−２、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、Ｈｒｋ、Ｂｉｍ、ＢＩＮＰ３、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ−ＸＳ、Ｂｏｋ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＬＲＰ、及びＭＲＰから成る群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの量を測定すること、及び第３のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と第４のサンプルにおけるｍＲＮＡの量との比を求めること（１．５以上の比を示すｍＲＮＡがアポトーシスのマーカーｍＲＮＡとして同定される）を含む方法によって同定される。さらなる態様では、第３のサンプル及び第４のサンプルは、固形腫瘍の実質的に均質な切片を含む。さらなる態様では、アポトーシス促進性の刺激は放射である。さらなる態様では、アポトーシス変化が生じるのに十分な時間は２時間〜４時間である。さらなる態様では、アポトーシス変化が生じるのに十分な時間は約３時間である。さらなる態様では、２．０以上の比を示すｍＲＮＡがアポトーシスのマーカーｍＲＮＡとして同定される。

さらなる態様において、第１のサンプル及び第２のサンプルが、病変の実質的に均質な部分を固形腫瘍から取り出す工程、この部分とほぼ同じ硬さであり、この部分内の細胞の生存率を低減させない材料にこの部分を埋め込む工程、埋め込んだ部分の温度を約４℃にする工程、及び埋め込んだ部分を切片にする工程を含む方法によって得られる。さらなる態様では、均質な部分は略立方体である。さらなる態様では、立方体状の均質な部分は約１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。さらなる態様では、この材料は、この細胞に到達可能な栄養物及び酸素を含む。さらなる態様では、この材料はゲルである。さらなる態様では、このゲルは液体を刺激することによって製造される。さらなる態様では、この刺激は、化学薬剤、紫外線及び電気から成る群から選択される。さらなる態様では、埋め込む工程は、液体に実質的に均質な部分を含浸させること、及び刺激の適用によってこの液体をゲルに変えることを含む。

ｉｎｖｉｔｒｏ環境に置いた癌細胞の変化に関連する問題を克服するために、本方法では、ｉｎｖｉｔｒｏで薄切りにした生癌組織を候補化学療法剤の投薬法に曝す。生きている動物脳標本から薄片を調製することが可能な組織切片作製機が、数十年間、神経科学分野で利用されてきた（参照により本明細書中に援用されるMayahara H, Fujimoto K, Noda T, Tamura I, Ogawa K. Acta Histochem Cytochem. 14, 211（1981）を参照されたい）。しかし、これまでこれらは、薬剤感受性アッセイにおける使用のために、ヒト固形腫瘍からサンプルを調製するのには用いられてこなかった。細胞間接触を破壊することなく癌標本を分析することができるので、生薄片はこのようなアッセイに理想的な材料である。切断面の両側の細胞は破壊されるが、薄片の中では無傷の細胞層が維持される。このような薄片を適切な培養培地で懸濁すると、薬剤がこれらの無傷細胞に浸透する。複数の同一切片を癌塊の均質な病変から調製することができ、その後ｉｎｖｉｔｒｏで様々な薬剤レジメンをスクリーニングするのに用いてもよい。癌組織が脳組織よりもはるかに硬く、また不規則であるために、複数の同質の薄片（厚さ３０μｍ〜１００μｍ）を、新鮮な非固定癌塊から切り出すことができるか否かは、今まで明らかになっていない。その上
、生理学的条件下でこのように取り出した切片をどのようにしてｉｎｖｉｔｒｏ処理中に保持するかも、今まで知られていない。

＜切片にした組織における細胞生存率の分析＞
硬さが固形腫瘍塊に似ているブタの舌を、切片にした組織の物理的性質を評価するのに利用した。約１０ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ（高さ）片のこの肉塊をレーザブレードで切断し、組織切片作成機（ＤＳＫ−１０００、堂阪イーエム株式会社、日本国京都府）上に置いた。氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Invitrogen）にサンプルを入れた。このサンプルの１２個の切片は、機器の取扱説明書に従って、４つずつ、厚さをそれぞれ、３０μｍ、５０μｍ、及び１００μｍにして調製した。４つのサンプル間の差異を評価するために、それぞれの切片の乾燥重量を測定した。図１では、薄切りにした試料の重量が示されている。４重のデータは、平均±標準誤差（ｓ．ｄ．）で示されている。図１で示されるように、３０μｍ、５０μｍ及び１００μｍ切片に対応する３つのデータ点は、５％〜１２％の変動係数（ＣＶ）で直線状であった。

アポトーシス変化を確認するために、通常は標本を３７℃で一晩以上インキュベートする。しかし、インキュベーション時間が長いと、あまり生理学的ではない条件が生じ、幾つかの人工産物を誘導する可能性がある。これまでに同定された初期アポトーシスマーカーを用いて、アポトーシス促進性のｍＲＭＡ発現の増加を、２時間〜４時間という短いインキュベーション後に確認できることを見出した（参照により本明細書中に援用されるMitsuhashi M, Tomozawa S, Endo K, Shinagawa A. Clin Chem. 52, 634（2006）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３７９２５号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２４２７号を参照されたい）。これは、ｍＲＮＡ発現が、タンパク質合成及びそれによる生物学的変化よりも前の事象であるからである。

一実施例において、１００μｍ切片は、手術によって取り出した胃癌標本のうちの２つの例から成功裏に調製した。これらのサンプルにおけるｍＲＮＡ定量結果は、図２〜図４で示されている。３７℃で３時間インキュベートして、又はインキュベートしないで、手術によって取り出した胃癌標本から、本発明者らの何人かがこれまでに公開した方法に従って、ｐ２１ｍＲＮＡを定量した（参照により本明細書中に援用されるMitsuhashi M, Tomozawa S, Endo K, Shinagawa A. Clin Chem. 52, 634 （2006）を参照されたい）。簡潔に述べると、組織切片作成機を用いて切片を得て、任意でインキュベートした。ｐ２１
ｍＲＮＡ定量のために切片を準備したら、それに溶解緩衝液を添加した。溶解緩衝液は、例えば０．５％のＮ−ラウロイルサルコシン、４×ＳＳＣ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０、及び１．７９１Ｍのチオシアニン酸グアニジンを含み、それに１％の２−メルカプトエタノール（Bio
Rad, Hercules, CA, USA）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Pierce, Rockford,
IL, USA）、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ***ＤＮＡ（5 Prime Eppendorf/Brinkmann, Westbury, NY, USA）、０．１ｍｇ／ｍｌの大腸菌ｔＲＮＡ（Sigma）、特異的なリバースプライマーをそれぞれ１０ｍＭ有するカクテル、及び標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドを添加したものだった。それから、溶解緩衝液を激しく混合する（１０回〜２０回、上下にピペッティングする）ことによって組織切片を溶解させた。得られた溶解溶液をピペットでオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（GenePlate, RNAture）に移した。４℃で一晩保存した後、プレーン溶解緩衝液１００μｌで３回、その後洗浄緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回、４℃でマイクロプレートを洗浄した。１×ＲＴ緩衝液、各１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、及び８０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）（プライマーなし）を含有する緩衝液３０μｌを添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによって、それぞれのウェルで直接ｃＤＮＡを合成した。特異的なプライマーでプライミングしたｃＤＮＡが溶液中に存在し、残留したオリゴ（ｄＴ）でプライミングしたｃＤＮＡがマイクロ
プレートに固定された。ＴａｑＭａｎＰＣＲを行うため、得られたｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、それにＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（ABI）５μｌ、オリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに３μＭ〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６０℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（ABI）で行った。ＳＹＢＲグリーンＰＣＲも利用することができ、これに関しては、ｃＤＮＡを水中で３倍〜４倍希釈することができ、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにマスターミックス（BioRad, Hercules, CA）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間、及び６０℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（ABI）で行った。それぞれの遺伝子は個々のウェルで増幅した。Ｃｔ値は、解析用ソフトウェア（ＳＤＳ、ABI）によって決定した。

一実施例において、迅速に固まる不活性ゲルは、切片にする前に組織塊を埋め込むのにも利用できる。例えば、化学薬剤、紫外線又は電気で処理することによって４℃で迅速に硬化させることができる液体ゲルを含有する、小さい使い捨てのプラスチックカセットを用いてもよい。例えば各辺が１ｍｍの大きさである立方体状のサンプルとして組織を得たら、それをカセットに入れた後に、液体ゲルを固まらせる。一実施例では、組織細胞を損傷させないように、このゲルは生物学的に不活性なものでもよい。また、ある実施例では、組織の硬さと同程度の硬さのゲルを用いてもよい。それから、細胞の損傷を防ぐため、４℃で切断を行うのが好ましい。さらなる実施例では、ゲルによって、埋め込まれた組織に栄養物及び酸素が供給される。

組織が埋め込まれたゲルは、切断テーブル上に固定され、冷培養培地に入れられる。切断手順は培地溶液中で行う。したがって、それぞれの組織切片が作製されると、それらは培養培地中に浮遊する。それぞれの切片は、ピンセットを用いて摘み、組織培養プレート（４８ウェルプレート又は２４ウェルプレート）に入れてもよい。スクリーニングする薬剤を培養プレートに添加する。薬剤インキュベーション後、溶液を吸引し、溶解緩衝液を添加する（例えば上記の溶解緩衝液を利用してもよい）。３７℃で１０分間、組織切片を溶解緩衝液でインキュベートする。それから、溶解緩衝液を激しく混合する（１０回〜２０回、上下にピペッティングする）ことによって、組織切片を溶解させる。得られた溶解溶液をピペットでＧｅｎｅＰｌａｔｅに移す。

さらなる実施例において、培養培地流を利用する切断器を用いてもよい。それによって、それぞれの切片が、９６ウェルフィルタプレートの個々のウェルで回収される。それから、フィルタプレートを切断器から取り出し、ホルダ（一時的に底のフィルタプレートの穴を塞ぐ）上に置く。それから、それぞれのウェルに培養培地及び薬剤を添加し、１時間〜４時間インキュベートする。穴が塞がれているので、溶液はそれぞれのウェルに残る。フィルタプレート材料は、組織を損傷せず、薬剤を吸着しない程度に不活性であることが好ましい。フィルタプレートをホルダから取り出し、回収プレート上に置き、５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）１５０μｌを加える。４℃、１２０×ｇで１分間の遠心分離の後、細胞サンプル５０μｌをそれぞれのウェルに加え、すぐに４℃、１２０×ｇで２分間遠心分離した後に、４℃、２０００×ｇで、５分間遠心分離しながら、ＰＢＳ３００μｌでそれぞれのウェルを１回洗浄する。それから、上記のストック溶解緩衝液６０μｌをフィルタプレートに加えた後、３７℃で１０分間インキュベートする。それから、フィルタプレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）上に置き、４℃で５分間、２０００×ｇで遠心分離する。４℃で一晩保存した後、４℃でマイクロプレートをプレーン溶解緩衝液１００μｌで３回、その後洗浄緩衝液（０．５ＭのＮａＣ
ｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回洗浄する。１×ＲＴ緩衝液、各１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、及び８０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）（プライマーなし）を含有する緩衝液３０μｌを添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによって、それぞれのウェルでｃＤＮＡを直接合成する。特異的なプライマーでプライミングしたｃＤＮＡが溶液中に存在し、オリゴ（ｄＴ）でプライミングしたｃＤＮＡはマイクロプレートに固定されたままである。ＴａｑＭａｎＰＣＲを行うため、得られたｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（ABI）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに３μＭ〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（ABI）で行う。ＳＹＢＲグリーンＰＣＲも利用することができ、これに関しては、ｃＤＮＡを水中で３倍〜４倍希釈することができ、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにマスターミックス（BioRad, Hercules, CA）５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（ABI）で行う。それぞれの遺伝子を別々のウェルで増幅させた。Ｃｔ値は、解析用ソフトウェア（ＳＤＳ, ABI）によって決定する。

ｍＲＮＡの測定に利用されるプローブ及びプライマーの配列は、以下の表１に示される。

図２で示されるように、ｐ２１ｍＲＮＡは、胃癌の小片（１０ｍｍ×５ｍｍ×１００μｍ）から定量された。４重のデータは、平均±ｓ．ｄ．で示された。ｐ２１は、サイクリン−ＣＤＫ２と、サイクリン−ＣＤＫ４との複合体の活性を阻害するサイクリン依存性のキナーゼ阻害剤であり、Ｇ１期の細胞周期の進行の調節因子として作用する。ある特定の腫瘍組織、例えば***腫瘍、神経膠腫、及び卵巣癌において、ｐ２１は、アポトーシスに寄与することも示されている。

ｐ２１ｍＲＮＡのＣＶ（３９％〜４６％）は図１のＣＶよりも大きかったが、このようなＣＶは、３時間のインキュベーション中のｐ２１誘導についての統計的に有意な（ｐ＝０．０２）結論を導くのに適していた。このことによって、ｐ２１ｍＲＮＡが何れの刺激なくｉｎｖｉｔｒｏでのインキュベーション中に増加したという従来の示唆（Mitsuhashi M, Tomozawa S, Endo K, Shinagawa A. Clin Chem. 52, 634（2006）を参照されたい）が確認され、また胃腫瘍から取り出されたサンプルが生きており、機能的であることが示唆される。

腫瘍細胞においてアポトーシスに関連する他のｍＲＮＡも測定した。細胞がアポトーシスを受けることが認められる場合、幾つかのアポトーシス促進性のタンパク質が活性化することが知られている。これらには、いわゆるＢｃｌ−２／ＢＡＸファミリー遺伝子が含
まれ、特にＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫｋ、Ｂｃｌ−ＸＳ等が挙げられる。切断型のＢＡＸ、例えばいわゆるＢＨ３−ｏｎｌｙメンバーもアポトーシス促進性であることが知られており、この群は、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＢＩＭ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ（アポトーシスのｐ５３上方調節因子）等から成る。

これらのｍＲＮＡは全て、１つ又は複数の腫瘍型におけるアポトーシス応答性に関連している。ＧＡＤＤ１５３（増殖停止及びＤＮＡ損傷誘導遺伝子）は、骨髄腫、肝癌及び結腸癌におけるアポトーシスを媒介することが示されている。Ａｐａｆ−１タンパク質は、ミトコンドリアによって放出されるシトクロムＣ及びｄＡＴＰと相互作用して、アポトソーム複合体を形成し、これはカスパーゼ９を活性化することができ、アポトーシスに至らしめる。Ａｐａｆ−１のサイレンシング又は下方調節は、黒色腫及び膠芽細胞腫に関与する。ＳＵＭＯ−１（小ユビキチン関連修飾因子）はユビキチンと構造的には関連するが、タンパク質は、ＳＵＭＯによって修飾される場合（スモ化）、ユビキチン媒介性分解から保護されると考えられる。さらに、ＳＵＭＯは、ゲノム安定性の監視に重要な経路を制御し、またＤＮＡ損傷に対する細胞応答の重要な決定因子であるＰＭＬ／ｐ５３腫瘍抑制ネットワークを調節する。Ｂｆｌ−１は、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーであり、ｐ５３媒介性アポトーシスを抑制して、細胞増殖活性及び形質転換活性を示す。Ｂｆｌ−１レベルの上昇が胃癌及び結腸癌、並びに乳癌で見られている。ＢＣＬ−Ｗは、Ｂｃｌ−２ファミリーの別のメンバーであり、抗アポトーシス効果を有する。ＢＣＬ−Ｗは、胃癌細胞の保護に関与する。Ｂｃｌ−２遺伝子は抗アポトーシス効果を有する。Ｂｃｌ−２は、カスパーゼ−９及びＡｐａｆ−１と複合体を形成し、この複合体はこれらのタンパク質がアポトソームを形成してアポトーシスに至るプロテアーゼカスケードが始まるのを防ぐ。Ｂｃｌ−２は、悪性Ｂ細胞及び慢性リンパ球性白血病に関与する。ＰＵＭＡ（ＢＢＣ３としても知られているアポトーシスのｐ５３上方調節修飾因子）は、転写誘導され、ミトコンドリアのアポトーシス経路を介してアポトーシスを誘導する。ＰＵＭＡは、ｐ５３によって転写活性化されて、またｐ５３の状態にかかわらず小胞体ストレス後に上方調節される。ＰＵＭＡは特に、黒色腫、結腸直腸癌、頭頸部癌及び膵臓癌に関与する。データは本明細書中では示されていないが、ＮＯＸＡｍＲＮＡも有用なマーカー遺伝子となり得る。ＮＯＸＡ（ＰＭＡＩＰ１又はＡＲＰとしても知られている）は、成人Ｔ細胞白血病で高度に発現することが見出され、細胞損傷に応じてアポトーシス促進機能を有し、カスパーゼ−９の活性化に関与ししてアポトーシスが引き起こす。Ｈｒｋは、Ｂｃｌ−２と相互作用するアポトーシスの活性化因子である。Ｈｒｋは、星細胞系腫瘍及び中枢神経系リンパ腫に関与する。Ｂｉｍは、ほとんどのＢｃｌ−２ホモログと短いＢＨ３モチーフを共有し、アポトーシスを誘発する。Ｂｉｍは、マントル細胞リンパ腫の発生に関与している。ＢＩＮＰ３は、悪性神経膠腫と結び付いたアポトーシス促進性のＢｃｌ−２ファミリータンパク質である。Ｂｉｋ（Ｂｃｌ−２相互作用キラー）タンパク質は、別のアポトーシス促進性のＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである。ＢｉｋはＢ細胞リンパ腫及び乳癌に関与し、上皮細胞及び肺細胞でも発現が見られている。Ｂｉｄ（ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト）は、骨肉種及び胃癌に関与するアポトーシス促進性のタンパク質である。Ｂａｄは、Ｂ細胞リンパ腫及び結腸癌に関連した別のＢｃｌ−２アポトーシス促進性のファミリーのメンバーである。Ｂｃｌ−ＸＳは、肝細胞癌、乳癌及び卵巣癌と結び付いたこのファミリーの別のアポトーシス促進性のメンバーである。Ｂｏｋ（Ｂｃｌ−２関連卵巣キラー）は、卵巣癌に関連した別のＢｃｌ−２アポトーシス促進性のファミリーのメンバーである。別のＢｃｌ−２ホモログであるＢａｋは、アポトーシスの強力なプロモータであり、胃癌及び結腸直腸癌に関与している。Ｂａｘ（Ｂｃｌ−２関連Ｘタンパク質）は、急性及び慢性のリンパ球性白血病、胃及び結腸直腸の癌、乳癌、並びに膵臓癌を含む多くの癌に関与するアポトーシス促進性のタンパク質である。ＬＲＰ（肺耐性タンパク質）の発現は、ヒトの線維肉腫、肝細胞癌及び急性骨髄性白血病で見られている。ＭＲＰ遺伝子は、肝細胞癌及び結腸直腸癌で発現されることが示されている。

薬剤誘導性のアポトーシス進行中にそれぞれの種類の癌標本における転写レベルでｍＲＮＡが発現することは、未だにはっきりとは解明されていない。細胞の種類、薬剤の種類又は刺激の投与量若しくは程度に応じて、特定のｍＲＮＡをより優位に発現することができる。個別に変えることも可能である。したがって、一実施例では、これらのアポトーシス関連ｍＲＮＡを、いくつかの異なる薬剤を用いて、それぞれの癌（肺癌、肝臓癌、乳癌等）に関して、スクリーニングしてもよい。個々の腫瘍に対して、又は特定の癌の種類に対して特異的なｍＲＮＡマーカーが同定されれば、これらのマーカーのｍＲＮＡを薬剤のスクリーニングに用いてもよい。

図３で示されるように、ｐ２１だけでなく、ＰＵＭＡ、Ｈｒｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ及びＭＲＰのｍＲＮＡでも、３時間のインキュベーション中に有意に（ｐ＜０．０５）増加した。図３では、４重のデータは平均±ｓ．ｄ．で示される。影付きの棒グラフはｐ＜０．０５を示す。ｍＲＮＡ調製（参照により本明細書中に援用されるMitsuhashi et al., Clin Chem. 52, 634（2006）を参照されたい）中に溶解緩衝液に入れられた対照ＲＮＡ（ＲＮＡ３４）のレベルは全く有意な変化を示しておらず、このことはこのアッセイが適切に行われたことを示唆する。

＜腫瘍特異的なｍＲＮＡアポトーシスマーカーの同定＞
アポトーシス変化を確認するために、上記のように得られた胃癌片は、１５Ｇｙの放射によって刺激され、３７℃で３時間インキュベートした。これまでの研究に従って、１５Ｇｙの放射が選択された（Mitsuhashi, et al., Clin Chem. 52, 634（2006）を参照されたい）。それから、上記の方法を用いて、幾つかのアポトーシス関連ｍＲＮＡのレベルを評価した。

この結果が図４に示される。図４では、４重のデータが平均±ｓ．ｄ．で示される。影付きの棒グラフはｐ＜０．０５を示す。図４で示されるように、アポトーシス促進性のＢＨ３−ｏｎｌｙｍＲＮＡの１つであるＢｉｋが有意に誘導されたが、全血では見出されたアポトーシスマーカーｍＲＮＡ（ｐ２１及びＰＵＭＡ）は、この胃癌サンプルでは誘導されなかった。この場合、Ｂｉｋは、この腫瘍に対する薬剤プロトコルをスクリーニングする際に用いるのに適切なマーカーである。適切なマーカーｍＲＮＡは、それぞれの癌に対しても同様に決定することができる。様々な種類の固形腫瘍に関する多くの症例を通じてデータが展開されるので、臨床医が、腫瘍の組織学的な、遺伝学的な又は他の分類に基づき、薬剤スクリーニングプロトコルに利用するのに最も適切なｍＲＮＡマーカーを同定することを可能にする発現パターンが明らかになることが期待される。このようなマーカーｍＲＮＡが、個々の腫瘍に対して同定されるか、又は腫瘍の種類に基づいて選択されれば、生癌片をｉｎｖｉｔｒｏでｍＲＮＡ解析に用いてもよく、このことによって様々な癌標本に対する薬剤感受性アッセイが可能になる。

したがって、この方法の一実施例において、個々の腫瘍サンプルから採取された切片に、放射等のアポトーシス促進性の刺激を与えてもよく、刺激を受けた切片及び刺激を受けていない切片は、細胞サンプルにおいてアポトーシス変化が生じるのに十分な時間、インキュベートしてもよい。この時間は、例えば約３〜４時間としてもよい。この後、腫瘍組織におけるアポトーシスに関連した様々な潜在的なマーカーｍＲＮＡのレベルを、上記のように、刺激を受けたサンプル及び刺激を受けていないサンプルにおいて測定することができる。アポトーシス促進性又は抗アポトーシス性のｍＲＮＡを、このマーカーｍＲＮＡとしてもよい。一実施例では、刺激を受けたサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、刺激を受けていないサンプルにおけるｍＲＮＡの量との比が１．５以上を示すアポトーシス促進性のｍＲＮＡを、薬剤スクリーニングの際に用いるマーカーｍＲＮＡとして選択してもよい。さらなる実施例では、２．０以上の比を示すｍＲＮＡを選択してもよい。さらなる実施例では、刺激を受けていないサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、刺激を受けたサンプルに
おけるｍＲＮＡの量との比が１．５以上を示す抗アポトーシス性のｍＲＮＡを、薬剤スクリーニングの際に用いるマーカーとして選択してもよい。さらなる実施例では、２．０以上の比を示すｍＲＮＡを選択してもよい。

さらなる実施例において、腫瘍組織切片を得て刺激によってマーカーｍＲＮＡを同定するのではなく、腫瘍組織をコラゲナーゼ又はトリプシンで均質にしてもよく、単離細胞懸濁液を刺激した後に、ｍＲＮＡを測定する。

＜薬剤スクリーニングプロトコル＞
複数の薄切り切片（２００μｍ）が新鮮単離ラット脾臓から調製され、これらはＣＯ₂インキュベータで４時間、様々な薬剤とインキュベートした。脾臓は、均質で、容易に切片にすることができ、大きいサイズで得ることができるので、腫瘍組織の代わりに用いた。インキュベーション後、β−アクチン（３つの異なるプライマー組）、ＰＵＭＡ（１つのプライマー組）、及びｐ２１（３つの異なるプライマー組）のｍＲＮＡは、フィルタプレートを用いずに上記の方法によって定量した。このプライマーの配列は、以下の表２で示される。

簡潔に述べると、三つずつの切片は、ＣＯ₂インキュベータにおいて３７℃で４時間、それぞれ５０μＭのダウノルビシン及びドキソルビシン（「ＤＮＲ」）と、１ｍＭのＡｒａＣ及び５０μＭのシスプラチン（「ＡｒａＣ」）と、５００μＭのエトポシド及び５０μＭのミトキサントロン（「ＶＰ１６」）と、それぞれの対照（ＤＮＲ及びＡｒａＣではＰＢＳ、並びにＶＰ１６ではＤＭＳＯ）とに曝した。それから、β−アクチン（３つの異なるプライマー組）、ＰＵＭＡ（１つのプライマー組）、及びｐ２１（３つの異なるプラ
イマー組）のｍＲＮＡは、フィルタプレートを用いずに定量した。得られたｃＤＮＡを水で４倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにｉＴａｑＳＹＢＲマスターミックス（BioRad, Hercules, CA）５μｌと、オリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー）１μｌを加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルのＰＣＲをＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ（ABI）で行った。１×ＲＴ緩衝液を陰性対照として用い、プライマーダイマーがこれらのＰＣＲ条件下で生成しなかったことを確認した。さらに、溶解曲線をそれぞれの場合で解析し、ＰＣＲシグナルが単一のＰＣＲ産物に由来するものであることを確認した。Ｃｔ値は、解析用ソフトウェア（SDS,
ABI）によって決定した。ΔＣｔ値は、適切な対照サンプルのＣｔ値を差し引くことによって算出し、倍数増加は、それぞれのＰＣＲサイクルの有効性を１００％と仮定することによって、２^(-Δ^Ct)から算出した。

この結果は、図５で示される。図５では、データは平均±ｓ．ｄ．で示され、＊はｐ＜０．０３を示す。切片間に差異が存在するが、ｐ２１及びＰＵＭＡにおけるＤＮＲ誘導性の低減が統計的有意性によって確認された一方で、対照のハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）は変わらなかった。これに対して、ＶＰ−１６及びＡｒａＣのレジメンは、組織におけるｍＲＮＡ発現に対する統計的に有意な効果を示さなかった。このことによって、このシステムが特定の薬剤レジメンに対する組織の感受性を評価するのに効果的であることが示される。

したがって、一実施例において、薬剤に曝された腫瘍組織が、腫瘍組織におけるアポトーシスに関連したマーカーｍＲＮＡの発現レベルの変化を示す場合、このことが治療の潜在的な有効性の指標となる。特に、薬剤に曝された腫瘍片における、及び対照剤に曝された腫瘍片におけるマーカーｍＲＮＡのレベルが約５０％超異なる場合、治療は効果がありそうであると決定する。アポトーシス促進性又は抗アポトーシス性を、このマーカーｍＲＮＡとしてもよい。さらなる実施例では、薬剤に曝された切片におけるアポトーシス促進性のｍＲＮＡの量と、対照刺激に曝された切片におけるアポトーシス促進性のｍＲＮＡの量との比が１．５以上であることが、効果的な治療の指標となる。さらなる実施例では、２．０以上の比が効果的な治療の指標となる。さらなる実施例では、対照刺激に曝された切片における抗アポトーシス性のｍＲＮＡの量と、薬剤に曝された切片における抗アポトーシス性のｍＲＮＡの量との比が１．５以上であることが効果的な治療の指標となる。さらなる実施例では、２．０以上の比が効果的な治療の指標となる。

図１図２図３図４図５

Claims

治療剤が固形腫瘍に対して効果がありそうか否かを決定する方法であって、
前記固形腫瘍から、厚さが２０μｍ〜５００μｍである実質的に均質な切片を含む第１のサンプル及び第２のサンプルを得ること、
ｉｎｖｉｔｒｏで前記第１のサンプルを前記治療剤とインキュベートすること、
ｉｎｖｉｔｒｏで前記第２のサンプルを対照の刺激とインキュベートすること、
インキュベーション後、前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルにおける前記腫瘍細胞のアポトーシスに関連するｍＲＮＡの量を測定すること、及び
前記第１のサンプルにおけるｍＲＮＡの量と、前記第２のサンプルにおけるｍＲＮＡの量とを比較し、該量が約５０％超異なる場合、前記治療は効果がありそうであると決定すること、
を含む方法。
前記実質的に均質な切片の厚さが、約５０μｍ〜２００μｍの範囲内である、請求項１に記載の方法。
前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルのそれぞれが、少なくとも３つの均質な切片を含む、請求項１に記載の方法。
前記腫瘍細胞のアポトーシスに関連するｍＲＮＡが、
第３のサンプル及び第４のサンプルを前記固形腫瘍から得ること、
ｉｎｖｉｔｒｏで前記第３のサンプルをアポトーシス促進性の刺激に曝すこと、
前記細胞サンプルにおいてアポトーシス変化が生じるのに十分な時間、前記第３のサンプル及び前記第４のサンプルをインキュベートすること、
前記第３のサンプル及び前記第４のサンプルにおいて、ｐ２１、ＧＡＤＤ、Ａｐａｆ−１、ＳＵＭＯ、Ｂｆｌ−１、ＢＣＬ−Ｗ、ＢＣＬ−２、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、Ｈｒｋ、Ｂｉｍ、ＢＩＮＰ３、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ−ＸＳ、Ｂｏｋ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＬＲＰ、及びＭＲＰから成る群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの量を測定すること、及び
前記第３のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と前記第４のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との比を求めること（１．５以上の比を示すｍＲＮＡが前記アポトーシスのマーカーｍＲＮＡとして同定される）、
を含む方法によって同定される、請求項１に記載の方法。
前記第３のサンプル及び前記第４のサンプルが、前記固形腫瘍の実質的に均質な切片を含む、請求項４に記載の方法。
前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルが、
病変の実質的に均質な部分を前記固形腫瘍から取り出す工程、
前記部分とほぼ同じ硬さであり、該部分内の細胞の生存率を低減させない材料に該部分を埋め込む工程、
前記埋め込んだ部分の温度を約４℃にする工程、及び
前記埋め込んだ部分を切片にする工程、
を含む方法によって得られる、請求項１に記載の方法。
前記均質な部分が略立方体である、請求項６に記載の方法。
前記立方体状の均質な部分が約１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである、請求項７に記載の方法。
前記材料が、前記細胞に到達可能な栄養物及び酸素を含む、請求項６に記載の方法。
前記材料がゲルである、請求項６に記載の方法。
前記ゲルが、液体を刺激することによって製造されるものである、請求項１０に記載の方法。
前記刺激が、化学薬剤、紫外線及び電気から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
前記埋め込む工程が、
液体に前記実質的に均質な部分を含浸させること、及び
前記液体を刺激することによってゲルに変えること、
を含む、請求項６に記載の方法。
前記対照の刺激がＰＢＳ及びＤＭＳＯから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルをＣＯ₂インキュベータでインキュベートする、請求項１に記載の方法。
前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルを３時間〜５時間インキュベートする、請求項１に記載の方法。
前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルを約４時間インキュベートする、請求項１６に記載の方法。
前記第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量が、前記第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量より大きい場合、前記治療は効果がありそうであると決定する、請求項１に記載の方法。
前記第１のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、前記第２のサンプルにおける前記ｍＲＮＡの量とを比較することが、該第１のサンプルにおける該ｍＲＮＡの量と該第２のサンプルにおける該ｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、該比が１．５以上である場合、前記治療は効果がありそうであると決定する、請求項１に記載の方法。
前記比が２．０以上である場合、前記治療は効果がありそうであると決定する、請求項１９に記載の方法。
前記アポトーシス促進性の刺激が放射である、請求項４に記載の方法。
前記アポトーシス変化が生じるのに十分な時間が２時間〜４時間である、請求項４に記載の方法。
前記アポトーシス変化が生じるのに十分な時間が約３時間である、請求項４に記載の方法。
２．０以上の比を示すｍＲＮＡが前記アポトーシスのマーカーｍＲＮＡとして同定される、請求項４に記載の方法。
前記治療剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シタラビン、シスプラチン、エトポシド、及びミトキサントロンから成る群から選択される薬剤を含む、請求項１に記載の方法。