JP2006519616A - チロシンホスファターゼ−prl−1、膵臓癌のマーカーおよび治療標的 - Google Patents
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Abstract
遺伝子発現プロファイリングを用いて、本発明はチロシンホスファターゼIVAメンバー1(PRL-1)を膵臓癌の診断マーカーおよび治療標的として同定する。したがって、本発明は、PRL-1に関連する癌を予測および検出する方法、ならびにPRL-1阻害剤を評価する方法を提供する。本発明は、被検者の膵臓癌を治療または予防する方法も提供する。
Description
1. 発明の分野
本発明は一般には分子生物学および癌治療の分野に関する。特に、膵臓癌の診断マーカーおよび薬物標的に関する。なお、本出願は、同時係属中の2003年7月10日提出の米国特許仮出願第60/486,231号、2003年3月20日提出の米国特許仮出願第60/453,380号、および2003年3月3日提出の米国特許仮出願第60/451,488号の恩典を主張し、これらの全開示は特に参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は一般には分子生物学および癌治療の分野に関する。特に、膵臓癌の診断マーカーおよび薬物標的に関する。なお、本出願は、同時係属中の2003年7月10日提出の米国特許仮出願第60/486,231号、2003年3月20日提出の米国特許仮出願第60/453,380号、および2003年3月3日提出の米国特許仮出願第60/451,488号の恩典を主張し、これらの全開示は特に参照として本明細書に組み込まれる。
2. 関連技術の説明
膵臓癌は、米国の成人の癌による死因の4番目のものである。2000年だけで、米国において推定28,300例の膵臓癌が新しく診断され、28,200名近くの患者が死亡したと推定されている。膵臓癌と診断された患者の90%近くは診断後1年以内に死亡する。この疾患の致死率の高さ故に、発生率に影響する因子、および膵臓腫瘍進行に関与する分子事象についての研究が推進されてきた。分子レベルでは、正常な組織の成長および発生に寄与する特定遺伝子の欠陥の蓄積が癌の進行の原因と考えられている。したがって、膵臓癌の発生においてよく見られる遺伝的障害の影響を理解することは、必ずやこの破壊的疾患を診断、治療、および予防するための新しく、より効果的な方法につながると思われる。
膵臓癌は、米国の成人の癌による死因の4番目のものである。2000年だけで、米国において推定28,300例の膵臓癌が新しく診断され、28,200名近くの患者が死亡したと推定されている。膵臓癌と診断された患者の90%近くは診断後1年以内に死亡する。この疾患の致死率の高さ故に、発生率に影響する因子、および膵臓腫瘍進行に関与する分子事象についての研究が推進されてきた。分子レベルでは、正常な組織の成長および発生に寄与する特定遺伝子の欠陥の蓄積が癌の進行の原因と考えられている。したがって、膵臓癌の発生においてよく見られる遺伝的障害の影響を理解することは、必ずやこの破壊的疾患を診断、治療、および予防するための新しく、より効果的な方法につながると思われる。
cDNAマイクロアレイ技術の出現により、薬物開発の可能性がある新しい標的の同定および確認、ならびに下流遺伝子の発現における変化を監視することによる薬剤の二次効果の解析が可能となった。cDNA発現マイクロアレイ解析は、癌細胞と正常細胞における何千もの遺伝子の発現を調べることにより、薬物開発の可能性がある標的の迅速な同定を可能にする。正常細胞から腫瘍細胞への遺伝子発現パターンの変化は、癌細胞ではどの経路が変化しているかを、包括的尺度で調べるためのバックグラウンドを提供する。
膵臓癌に関与するいくつかの遺伝子が同定されているが、これらの発見はこの疾患の治療および予防を進めるにあたり、有益ではないことが判明している。したがって、膵臓癌の分野では、さらなる疾患マーカーおよび治療標的がいまだに必要とされている。
発明の概要
本発明は、疾患の分子レベルの基礎を研究することにより、膵臓癌の有効な治療法の技術分野における欠陥に取り組む。膵臓癌細胞と正常な膵臓の細胞との、発現プロファイリングによる比較において、チロシンホスファターゼIVAメンバー1(PRL-1)がこの疾患治療における診断マーカーおよび治療標的として同定された。したがって、本発明は、被検者における膵臓癌の発生を診断または予測する方法であって、(a)被検者から膵臓の細胞試料を採取する段階と;(b)細胞におけるPRL-1活性または発現を評価する段階を含み、同じタイプの正常細胞と比較した場合の細胞におけるPRL-1の活性または発現増大が、被検者が膵臓癌を有している、または膵臓癌発生のリスクが高いことを示す方法を提供する。
本発明は、疾患の分子レベルの基礎を研究することにより、膵臓癌の有効な治療法の技術分野における欠陥に取り組む。膵臓癌細胞と正常な膵臓の細胞との、発現プロファイリングによる比較において、チロシンホスファターゼIVAメンバー1(PRL-1)がこの疾患治療における診断マーカーおよび治療標的として同定された。したがって、本発明は、被検者における膵臓癌の発生を診断または予測する方法であって、(a)被検者から膵臓の細胞試料を採取する段階と;(b)細胞におけるPRL-1活性または発現を評価する段階を含み、同じタイプの正常細胞と比較した場合の細胞におけるPRL-1の活性または発現増大が、被検者が膵臓癌を有している、または膵臓癌発生のリスクが高いことを示す方法を提供する。
本発明に含まれる膵臓細胞試料は、前癌膵臓細胞試料、転移膵臓細胞試料、または悪性膵臓細胞試料であってもよい。悪性膵臓細胞試料は、導管腺癌細胞試料、管内乳頭状新生物細胞試料、乳頭状嚢状新生物細胞試料、粘液性嚢胞腺癌細胞試料、粘液性嚢胞腺腫細胞試料、腺房腺癌細胞試料、未分類大細胞癌試料、小細胞癌試料、または膵臓芽腫細胞試料をさらに含むこともできる。
他の態様において、細胞は膵臓腫瘍細胞である。
特定の態様において、本発明は、細胞または組織試料などの試料におけるPRL-1発現または活性を、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCR、ウェスタンブロッティング、または定量的免疫組織化学試験により評価する段階を含む。
いくつかの態様において、被検者は以前に癌の診断を受けているか、または被検者は以前に癌の診断を受けたことがなく、試験の時点で癌がないと思われる。もう一つの態様において、本発明は、試験後に被検者に予防的癌治療、または癌治療を投与する段階を含む。他の態様において、癌治療は化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法、ホルモン療法または手術であってもよい。
さらにもう一つの態様において、本発明は、膵臓癌治療の有効性を予測する方法であって、(a)癌治療を被検者に投与する段階と;(b)被検者から膵臓の腫瘍細胞試料を採取する段階と;(c)試料の腫瘍細胞におけるPRL-1活性または発現を評価する段階を含み、治療前の同じタイプの腫瘍細胞と比較した場合の腫瘍細胞におけるPRL-1の活性または発現低下が、治療が有効であることを示す方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、PRL-1タンパク質レベルを測定する段階、またはPRL-1転写物レベルを測定する段階を含む、PRL-1発現を評価する段階を含む。他の態様において、本発明は、複数の時点でPRL-1活性または発現を評価する段階をさらに含む。
さらにもう一つの態様において、本発明は、抗癌活性の候補化合物をスクリーニングする方法であって、(a)膵臓癌細胞を提供する段階と;(b)細胞を候補化合物と接触させる段階と;(c)PRL-1発現または活性に対する候補化合物の効果を評価する段階を含み、候補化合物で治療していない類似の細胞におけるPRL-1発現または活性の量と比較した場合のPRL-1発現または活性の量の低下が、候補化合物が抗癌活性を有することを示す方法を含む。
本発明の候補化合物は、タンパク質、核酸、または有機医薬品であってもよい。
本発明のいくつかの態様において、腫瘍細胞は、前癌膵臓細胞、転移膵臓細胞、または悪性膵臓細胞からなる群より選択することができる。悪性膵臓細胞は、導管腺癌細胞、管内乳頭状新生物細胞、乳頭状嚢状新生物細胞、粘液性嚢胞腺癌細胞、粘液性嚢胞腺腫細胞、腺房腺癌細胞、未分類大細胞癌、小細胞癌、または膵臓芽腫細胞をさらに含むこともできる。
さらなる態様において、癌の治療法は、それを必要としている被検者にPRL-1活性または発現を阻害する組成物を投与する段階を含む。
さらなる態様において、候補化合物はタンパク質、核酸、または有機医薬品であってもよい。さらなる態様において、タンパク質はPRL-1に免疫学的に結合する抗体である。さらなる態様において、核酸はPRL-1アンチセンス核酸、PRL-1 RNAi核酸、またはPRL-1に免疫学的に結合する一本鎖抗体をコードする抗体であってもよい。
いくつかの態様において、本発明は、化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法、ホルモン療法または手術などの第二の癌治療を投与する段階をさらに含む。
さらなる態様において、本発明の組成物を二回以上投与してもよい。
さらなる態様において、本発明は、被検者における膵臓癌の発生を診断または予測する方法であって、被検者を細胞におけるPRL-1活性または発現について全身スキャニングにかける段階を含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、抗癌治療を監視する方法であって、抗癌治療提供後、または提供中に、被検者の膵臓癌細胞におけるPRL-1の発現または機能を評価する段階を含む方法を提供する。
本明細書に記載のいかなる方法または組成物も、本明細書に記載のいかなる他の方法または組成物に関して実行可能であることが企図される。
特許請求の範囲および/または本明細書において「含む」なる用語と共に用いられる「a」または「an」なる用語は「一つ」を意味しうるが、「一つ以上」、「少なくとも一つ」、および「一つまたは複数」の意味とも一致する。
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかになると思われる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の態様を示してはいるが、この詳細な説明から、当業者には本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変が明らかになると思われるため、これらは例示のために示すにすぎないことが理解されるべきである。
例示的態様の説明
A. 本発明
前述のとおり、最も致死的な癌の一つは膵臓癌で、最初の診断後1年以上生存する患者は非常に少ない。この疾患が大きく注目されているにもかかわらず、患者の予後は悪いままである。したがって、膵臓癌に対して集中的研究が行われなければならない。
A. 本発明
前述のとおり、最も致死的な癌の一つは膵臓癌で、最初の診断後1年以上生存する患者は非常に少ない。この疾患が大きく注目されているにもかかわらず、患者の予後は悪いままである。したがって、膵臓癌に対して集中的研究が行われなければならない。
この研究の一つの局面は、膵臓癌の分子レベルの基礎に関する研究である。発明者らは、膵臓癌細胞の発現特性を調べようと努力し、これを正常細胞と比較した。そうする中で発明者らは、発現が癌細胞では対応する非癌細胞よりも多い、または少ない、調節不全遺伝子群を同定した。
これらの遺伝子の一つであるPRL-1は、調べたほとんどの膵臓癌細胞で高度に過剰発現された。膵臓癌細胞株におけるPRL-1遺伝子の過剰発現を、ノーザンブロッティングおよびRT-PCRを用いて確認した。PRL-1が癌治療の実現可能な分子標的であることをさらに確かめるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて膵臓癌細胞におけるPRL-1の発現を阻害した。処理細胞はアポトーシスの著しい増大と、S期の細胞の蓄積低下を示した。これらの結果から、PRL-1は膵臓癌の診断マーカー、およびこの疾患を治療する際の治療標的として確認された。
したがって、本発明は、様々な技術を用いてPRL-1タンパク質の活性もしくは発現または転写物レベルを評価する方法であって、ゴールは膵臓由来の癌の同定である方法を提供する。本発明は、PRL-1阻害剤候補のスクリーニング法も提供する。最後に、本発明は、癌、特に膵臓癌を治療する方法であって、PRL-1活性または発現を阻害する組成物を、単剤として、または他の治療薬との組み合わせで提供することによる方法を提供する。本発明の詳細は、下記に提供されることになる。
B. チロシンリン酸化およびPRL-1
細胞タンパク質のリン酸化、特にチロシンリン酸化は、細胞増殖および分化を含む、いくつかの細胞プロセスの調節において中心的役割を果たしている(Tonks, 1993; Pawson et al., 1994)。チロシンホスファターゼ(PTPアーゼ)はプロテインホスファターゼ遺伝子ファミリーに属している。このホスファターゼファミリーは、タンパク質チロシン残基からリン酸エステル基を高選択的に除去するホスファターゼからなる。一つのリン酸化チロシン残基は基質として役立つが、同じタンパク質の別のホスホチロシン残基は役に立たないこともある。これらのホスファターゼは、膜貫通受容体様および非膜貫通型を含む、広範なサイズおよび構造で存在する。しかし、これらはすべて、触媒ドメインを定義し、C末端の近くに(I/V)HCXAGXXR(S/T)Gコンセンサスアミノ酸配列を含む、240残基の領域内で相同性を有する。活性部位システイン残基の突然変異は、この活性を消失させる。
細胞タンパク質のリン酸化、特にチロシンリン酸化は、細胞増殖および分化を含む、いくつかの細胞プロセスの調節において中心的役割を果たしている(Tonks, 1993; Pawson et al., 1994)。チロシンホスファターゼ(PTPアーゼ)はプロテインホスファターゼ遺伝子ファミリーに属している。このホスファターゼファミリーは、タンパク質チロシン残基からリン酸エステル基を高選択的に除去するホスファターゼからなる。一つのリン酸化チロシン残基は基質として役立つが、同じタンパク質の別のホスホチロシン残基は役に立たないこともある。これらのホスファターゼは、膜貫通受容体様および非膜貫通型を含む、広範なサイズおよび構造で存在する。しかし、これらはすべて、触媒ドメインを定義し、C末端の近くに(I/V)HCXAGXXR(S/T)Gコンセンサスアミノ酸配列を含む、240残基の領域内で相同性を有する。活性部位システイン残基の突然変異は、この活性を消失させる。
このプロテインホスファターゼのファミリーの一員は、チロシンホスファターゼIVAメンバー1(PRL-1)で、非膜貫通プロテインホスファターゼである。PRL-1は、細胞増殖を制御する独特の核チロシンホスファターゼである。PRL-1は20kDaのサイズで、このファミリーの他のチロシンホスファターゼとは異なる。PRL-1は活性部位以外の他のPTPアーゼとの相同性をほとんど有していない。しかし、PRL-1は二つの他のチロシンホスファターゼ、PRL-2およびPRL-3とは密接に関連している。これらのPRLホスファターゼはC末端でのタンパク質プレニル化のコンセンサスモチーフを含む(Zengetal., 1998)。
PRL-1は当初、肝臓再生に関与する最初期遺伝子として同定された(Diamond et al., 1996)。この遺伝子はマイトジェンで刺激された線維芽細胞で発現されることも判明した。PRL-1を過剰発現する、安定にトランスフェクションされた細胞は、変化した細胞増殖および形態、ならびに形質転換した表現型を示す。PRL-1の発現は、不明なままの基質のタンパク質チロシンリン酸化および脱リン酸化を調節する能力により、細胞増殖および分化に関連する。上皮細胞におけるPRL-1の過剰発現は、ヌードマウスで腫瘍形成を引き起こすことが判明している(Cates et al., 1996)。PRL-1機能は細胞周期依存性の様式で調節されることも示唆されている。PRL-1は、おそらくは紡錘体動力学を調節することにより、有糸***を通じての進行調節にも関わっているとされている(Wang et al., 2002)。PRL-1はいくつかの腫瘍細胞株において発現されることが示されている(Wang et al.,2002)。したがって、当分野の技術により、PRL-1は様々な組織において多様な役割を有することが示唆される。
最低限でも、PRL-1は正常な細胞増殖制御において重要であると思われ、いくつかの癌細胞の腫瘍形成性に寄与している可能性がある(Diamond et al, 1994)。可能性がある治療標的としてのホスファターゼ、特にチロシンホスファターゼの出現は、PTP1Bを標的とする最近の試験から起こってきた。ノックアウト、アンチセンス、および薬物開発試験により、PTP1Bのダウンレギュレーションは糖尿病および肥満治療のための良好なアプローチでありうることが示されている(Elcheby et al., 1999)。癌では、いくつかのPTP(例えば、PTP-a、PTP-E、Sap1、GLEPPI、PTP1B)が癌原遺伝子Srcファミリーキナーゼを脱リン酸化および活性化するとの仮説が立てられている。PRL-3およびCdc25Bは、様々な腫瘍型において特にアップレギュレートされていることが判明している、他のPTPである。
C. 予後および診断法
細胞、組織試料または生物における遺伝子産物の活性または発現を評価するために、当業者には公知の様々な方法が利用可能である。本発明は、診断法およびPRL-1活性または発現を評価する方法であって、PRL-1タンパク質または転写物レベルを測定する段階を含む方法を含む。PRL-1酵素活性、またはタンパク質発現レベルを評価する方法も用いることができる。これらの方法は、癌発生のリスクが高い可能性がある被検者、および膵臓癌をすでに有している被検者の両方を同定するために提供される。加えて、これらの同じ方法を、癌治療の有効性を評価するために適用することもできる。
細胞、組織試料または生物における遺伝子産物の活性または発現を評価するために、当業者には公知の様々な方法が利用可能である。本発明は、診断法およびPRL-1活性または発現を評価する方法であって、PRL-1タンパク質または転写物レベルを測定する段階を含む方法を含む。PRL-1酵素活性、またはタンパク質発現レベルを評価する方法も用いることができる。これらの方法は、癌発生のリスクが高い可能性がある被検者、および膵臓癌をすでに有している被検者の両方を同定するために提供される。加えて、これらの同じ方法を、癌治療の有効性を評価するために適用することもできる。
ポリペプチドの発現のレベルを評価するためのアッセイも、当業者には公知である。これは、PRL-1 mRNAレベル、mRNA安定性またはターンオーバー、ならびにタンパク質発現レベルをアッセイすることにより達成することもできる。PRL-1のいかなる翻訳後プロセッシング、ならびにこれが局在している、または適当に調節されているかどうかを評価しうることもさらに企図される。いくつかの場合に、PRL-1に特異的に結合する抗体を用いることもできる。PRL-1活性についてのアッセイを用いることもできる。
1. ノーザンブロッティング技術
本発明は、癌または腫瘍細胞におけるPRL-1の発現を評価する際にノーザンブロッティングを用いる。ノーザンブロッティングに関与する技術は、分子生物学においてよく用いられ、当業者には公知である。これらの技術は分子プロトコルに関する多くの標準的な書籍に見いだすことができる(例えば、Sambrook et al., 2001)。この技術、すなわち標識プローブとのハイブリダイゼーションにより、RNAの検出が可能になる。
本発明は、癌または腫瘍細胞におけるPRL-1の発現を評価する際にノーザンブロッティングを用いる。ノーザンブロッティングに関与する技術は、分子生物学においてよく用いられ、当業者には公知である。これらの技術は分子プロトコルに関する多くの標準的な書籍に見いだすことができる(例えば、Sambrook et al., 2001)。この技術、すなわち標識プローブとのハイブリダイゼーションにより、RNAの検出が可能になる。
簡単に言うと、RNAをゲル電気泳動により分離する。次いで、ゲルを、ニトロセルロースなどの膜と接触させて、核酸を転写および非共有結合させる。続いて、膜を、例えば、標的増幅産物とハイブリダイズ可能な発色団結合プローブと共にインキュベートする。検出は、膜のX線フィルムへの曝露、またはイオン放出検出装置によって行う。
米国特許第5,279,721号は、参照として本明細書に組み込まれ、自動電気泳動および核酸転写の装置および方法を開示している。この装置は、ゲルを外部から操作をせずに、電気泳動およびブロッティングができ、本発明の方法を実施するために申し分なく適している。
2. 定量的RT-PCR
本発明は、癌または腫瘍細胞におけるPRL-1の発現または活性を評価する際に定量的RT-PCRも用いる。RNAのcDNAへの逆転写(RT)と、その後の相対的定量的登録商標PCR(RT-PCR)を用いて、細胞から単離した、PRL-1転写物などの特定のmRNA種の相対濃度を調べることができる。特定のmRNA種の濃度が変動することを調べることにより、特定のmRNA種をコードする遺伝子が特異的に発現されることが示される。
本発明は、癌または腫瘍細胞におけるPRL-1の発現または活性を評価する際に定量的RT-PCRも用いる。RNAのcDNAへの逆転写(RT)と、その後の相対的定量的登録商標PCR(RT-PCR)を用いて、細胞から単離した、PRL-1転写物などの特定のmRNA種の相対濃度を調べることができる。特定のmRNA種の濃度が変動することを調べることにより、特定のmRNA種をコードする遺伝子が特異的に発現されることが示される。
登録商標PCRにおいて、増幅される標的DNAの分子の数は、いずれかの試薬が限界となるまで、反応サイクルごとにほぼ2倍に増加する。その後、増幅の速度は、増幅される標的がサイクル間で増加しなくなるまで徐々に低減する。X軸にサイクル数、Y軸に増幅される標的DNAの濃度の対数をプロットすると、プロットした点をつなぐことにより特徴的な形状の曲線が得られる。最初のサイクルに始まり、曲線の傾きは正で一定である。これを曲線の直線部分と言う。いずれかの試薬が限界となった後、曲線の傾きは小さくなり始め、最後にはゼロとなる。この時点で、増幅された標的DNAの濃度は特定の固定値に漸近する。これを曲線のプラトー部分と言う。
登録商標PCRの直線部分における標的DNAの濃度は、登録商標PCRを始める前の標的の開始濃度に直接比例する。同じ回数のサイクルを完了し、それらの直線範囲にある登録商標PCR反応における標的DNAの登録商標PCR産物の濃度を求めることにより、元のDNA混合物中の特定の標的配列の相対濃度を求めることが可能である。DNA混合物が異なる細胞から単離されたRNAから合成されたcDNAである場合、標的配列が由来する特定のmRNAの相対存在量をそれぞれの組織または細胞について求めることができる。登録商標PCR産物の濃度と相対mRNA存在量との間の直接比例関係は、登録商標PCR反応の直線範囲部分でのみあてはまる。
曲線のプラトー部分における標的DNAの最終濃度は反応混合物中の試薬の利用可能性によって決まり、標的DNAの元の濃度とは無関係である。したがって、収集したRNA群についてmRNA種の相対存在量をRT-PCRで求めることができる以前に満たさなければならない第一の条件は、登録商標PCR反応がその曲線の直線部分にあるときに、増幅した登録商標PCR産物の濃度をサンプリングしなければならないことである。
特定のmRNA種の相対存在量を首尾よく求めるためのRT-PCR試験のために満たさなければならない第二の条件は、増幅可能なcDNAの相対濃度をいくつかの独立の基準に対して正規化しなければならないことである。RT-PCR試験のゴールは、特定のmRNA種の存在量を、試料中のすべてのmRNA種の平均存在量に対して求めることである。そのような試験において、β-アクチン、アスパラギンシンテターゼ、およびリポコルチンIIのmRNAを、他のmRNAの相対存在量を比較するための外部および内部標準として用いてもよい。
競合登録商標PCRのためのほとんどのプロトコルは、標的とほぼ同じ量の内部登録商標PCR内部標準を用いる。これらの戦略は、登録商標PCR増幅の産物を直線相においてサンプリングする場合に有効である。反応がプラトー相に近づいている時に産物をサンプリングすると、量の少ない産物が相対的に多く示されることになる。差次的発現のためにRNA試料を調べる場合などの、多くの異なるRNA試料に対して行う相対存在量の比較は、RNAの相対存在量の差が実際よりも小さく見えるようにひずむことになる。これは、内部標準が標的よりもはるかに多い場合には、たいした問題ではない。内部標準が標的よりも多量にある場合、RNA試料間で直接の一次比較を行うことができる。
前述の議論は、臨床由来材料のRT-PCRアッセイについての理論的考察である。臨床試料に内在する問題は、その量にばらつきがあり(正規化に問題が生じる)、質にもばらつきがある(信頼できる内部対照、好ましくは標的よりもサイズが大きい対照の同時増幅が必要となる)ことである。
前述の問題はいずれも、内部標準が標的cDNA断片よりも大きい増幅可能なcDNA断片であり、内部標準をコードするmRNAの存在量が標的をコードするmRNAよりもおおよそ5〜100倍高い、内部標準を用いた相対定量PCRとしてRT-PCRを実施すれば克服される。このアッセイは、それぞれのmRNA種の絶対存在量ではなく、相対存在量を測定する。
外部標準による通常の相対定量RT-PCRを用いる、他の試験も利用可能である。これらのアッセイは登録商標PCR産物をその増幅曲線の直線部分でサンプリングする。サンプリングに最適な登録商標PCRサイクルの回数は、それぞれの標的cDNA断片について経験的に決定しなければならない。加えて、様々な組織試料から単離した各RNA群の逆転写酵素産物は、増幅可能なcDNAの等しい濃度で注意深く正規化しなければならない。このアッセイは絶対的なmRNA存在量を測定するため、これは非常に重要である。絶対mRNA存在量は、正規化試料でのみ差次的遺伝子発現の尺度として用いることができる。増幅曲線の直線範囲の経験的決定およびcDNA調製物の正規化は単調で時間がかかる工程であるが、得られるRT-PCRアッセイは内部標準による相対定量RT-PCRから得られるものよりも優れていることもある。
この理由の一つは、内部標準/競合物がないので、増幅曲線の直線範囲においてすべての試薬を単一のPCR産物に変換することができ、アッセイの感度が上がることである。もう一つの理由は、登録商標PCR産物が一つだけであれば、電気泳動ゲル上の生成物の表示または他の表示法が複雑にならず、ハックグラウンドが低く、解釈が容易になることである。
3. 免疫組織化学
本発明は、癌または腫瘍細胞におけるPRL-1の発現を評価する際に定量的免疫組織化学も用いる。
本発明は、癌または腫瘍細胞におけるPRL-1の発現を評価する際に定量的免疫組織化学も用いる。
簡単に言うと、凍結した「粉砕」腫瘍50ngを小さいプラスティックカプセル内のリン酸緩衝化食塩水(PBS)中、室温で再水和し;粒子を遠心分離によってペレット化し;これを粘稠包埋媒質(OCT)に再懸濁し;カプセルを反転させて遠心分離により再度ペレット化し;-70℃のイソペンタン中で急速凍結し;プラスティックカプセルを切断して組織の凍結円筒を取り出し;組織円筒をクリオスタットミクロトームチャックに保定し;平均約500の目立って完全な腫瘍細胞を含む25〜50の連続切片を切断することにより、凍結切片を調製することができる。
試料50mgをプラスティック遠沈管内で再水和し;ペレット化し;10%ホルマリンに再懸濁して、4時間固定し;洗浄/ペレット化し;温2.5%寒天に再懸濁し;ペレット化し;氷水中で冷却して寒天を硬化させ;組織/寒天ブロックをチューブから取り出し;ブロックをパラフィンに浸潤して包埋し;50の連続永久切片に切断することを含む、同様の方法により、永久切片を調製することもできる。
4. ウェスタンブロッティング
本発明は、膵臓癌細胞などの細胞におけるPRL-1活性または発現を評価するためにウェスタンブロッティング(イムノブロッティング)解析も使用する。この技術は当業者には公知で、米国特許第4,452,901号(参照として本明細書に組み込まれる)およびSambrook et al. (2001)を参照されたい。簡単に言うと、この技術は一般には細胞または組織試料などの試料中のタンパク質をSDS-PAGEゲル電気泳動により分離する段階を含む。SDS-PAGEにおいて、タンパク質を分子量に基づいて分離し、次いで適当な固体支持体(ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルターなど)に転写し、続いて固体支持体上のタンパク質をタンパク質に特異的に結合する抗体と共にインキュベートする。例えば、本発明において、抗PRL-1抗体は固体支持体上のPRL-1タンパク質に特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識することもでき、または抗PRL-1に特異的に結合する標識抗体(例えば、標識したヒツジ、ヤギ、またはマウス抗体)を用いて後で検出することもできる。
本発明は、膵臓癌細胞などの細胞におけるPRL-1活性または発現を評価するためにウェスタンブロッティング(イムノブロッティング)解析も使用する。この技術は当業者には公知で、米国特許第4,452,901号(参照として本明細書に組み込まれる)およびSambrook et al. (2001)を参照されたい。簡単に言うと、この技術は一般には細胞または組織試料などの試料中のタンパク質をSDS-PAGEゲル電気泳動により分離する段階を含む。SDS-PAGEにおいて、タンパク質を分子量に基づいて分離し、次いで適当な固体支持体(ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルターなど)に転写し、続いて固体支持体上のタンパク質をタンパク質に特異的に結合する抗体と共にインキュベートする。例えば、本発明において、抗PRL-1抗体は固体支持体上のPRL-1タンパク質に特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識することもでき、または抗PRL-1に特異的に結合する標識抗体(例えば、標識したヒツジ、ヤギ、またはマウス抗体)を用いて後で検出することもできる。
5. ELISA
本発明は、癌または腫瘍細胞におけるPRL-1の活性または発現を評価する際に酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)などのイムノアッセイも使用する。ELISAは一般にコーティングする段階と、インキュベートおよび結合する段階と、洗浄して非特異的に結合している種を除去する段階と、結合した免疫複合体を検出する段階とを含む。この技術は当技術分野において公知で、例えば、米国特許第4,367,110号およびHarlow and Lane, 1988を参照されたい。
本発明は、癌または腫瘍細胞におけるPRL-1の活性または発現を評価する際に酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)などのイムノアッセイも使用する。ELISAは一般にコーティングする段階と、インキュベートおよび結合する段階と、洗浄して非特異的に結合している種を除去する段階と、結合した免疫複合体を検出する段階とを含む。この技術は当技術分野において公知で、例えば、米国特許第4,367,110号およびHarlow and Lane, 1988を参照されたい。
ELISAアッセイにおいて、PRL-1タンパク質試料を選択した表面、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなどのタンパク質親和性を示す表面に固定化してもよい。洗浄して不完全に吸着した材料を除去した後、アッセイプレートウェルを、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼインまたは粉乳の溶液などの試験抗血清に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的タンパク質と結合させる、またはこれでコーティングすることが望ましい。これにより、固定化表面の非特異的吸着部位をブロックし、したがって表面上への抗血清の非特異的結合によるバックグラウンドを低下させることができる。
抗原性材料をウェルに結合させ、バックグラウンドを低下させるために非反応性材料でコーティングし、結合していない材料を除去するために洗浄した後、固定化表面を試験する抗血清または臨床もしくは生体抽出物と、免疫複合体(抗原/抗体)形成の助けとなる様式で接触させる。そのような条件は、好ましくは、抗血清をBSA、ウシガンマグロブリン(BGG)およびリン酸緩衝化食塩水(PBS)/トゥイーンなどの希釈剤で希釈する段階を含む。これらの添加物質も、非特異的バックグラウンドの低下を助ける傾向にある。次いで、層状抗血清を2から4時間以上インキュベートし、好ましくは約25℃から37℃の温度(または4℃で終夜)で効果的に結合させる。インキュベーションの後、抗血清に接触させた表面を洗浄して、非免疫複合材料を除去する。好ましい洗浄法は、PBS/トゥイーンなどの溶液、またはホウ酸緩衝液での洗浄を含む。
試験試料と結合抗原との間の特異的免疫複合体形成と、その後の洗浄に続き、免疫複合体形成の出現およびその量を、試料を一次抗体に特異性を有する二次抗体にさらすことにより評価することができる。検出手段を提供するために、二次抗体は、好ましくは、適当な色素産生基質とインキュベートした後に発色する結合酵素を有する。したがって、例えば、抗血清結合表面をオーリアーゼ(aurease)またはペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgGと、免疫複合体形成に有利な条件下で一定時間接触させ、インキュベートする(例えば、PBS-トゥイーンなどのPBS含有溶液中、室温で2時間インキュベートする)ことが望ましいと思われる。
酵素タグ二次抗体とインキュベートし、洗浄して結合していない材料を除去した後、尿素およびブロモクレゾールパープルなどの色素産生基質、または酵素標識としてペルオキシダーゼの場合には2,2'-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)およびH2O2とのインキュベーションにより標識の量を定量する。次いで、発色の程度を、例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて測定することにより、定量を行う。イムノアッセイのための標識の使用は、米国特許第5,310,687号、第5,238,808号および第5,221,605号に記載されている。
本発明において企図されうる他の免疫検出法には、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイが含まれる。これらの方法は当業者には公知で、Doolittle et al. (1999);Gulbis et al. (1993);De Jager et al. (1993);およびNakamura et al. (1987)に記載されており、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み込まれる。
6. 組織マイクロアレイ免疫組織化学
組織マイクロアレイ免疫組織化学は、1回に1切片の通常の技術に比べて、複数の組織切片を同時に検査することができる、最近開発された技術である。この技術は、腫瘍標本の高処理量分子プロファイリングのために用いられる(Kononen et al., 1998)。特に、本発明は、異なる腺腫組織試料を含む膵臓腫瘍組織マイクロアレイを用い、これらはそれぞれ同じパラフィン包埋切片の異なる部位からの2つの1.5mmの代表的ディスクを有する。これらの膵臓組織マイクロアレイを用いて、cDNAマイクロアレイに現れた他の遺伝子の過剰発現を検証することができる。
組織マイクロアレイ免疫組織化学は、1回に1切片の通常の技術に比べて、複数の組織切片を同時に検査することができる、最近開発された技術である。この技術は、腫瘍標本の高処理量分子プロファイリングのために用いられる(Kononen et al., 1998)。特に、本発明は、異なる腺腫組織試料を含む膵臓腫瘍組織マイクロアレイを用い、これらはそれぞれ同じパラフィン包埋切片の異なる部位からの2つの1.5mmの代表的ディスクを有する。これらの膵臓組織マイクロアレイを用いて、cDNAマイクロアレイに現れた他の遺伝子の過剰発現を検証することができる。
7. 循環癌細胞の定量
濃縮技術の出現に伴い、循環癌細胞の検出を、原発腫瘍治療後の癌再発の早期検出、転移の早期診断や、様々な腫瘍に対する治療戦略の選択および監視のために用いることができる(Martin et al. 1998;Wang et al., 2000;Hu et al., 2003)。循環膵臓癌細胞の検出において、本発明の抗PRL抗体を癌細胞濃縮技術と共に用いることができる。一つの適当な細胞濃縮法は、Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA)によって配布されている磁気活性化細胞分離システムである。この免疫磁気法は磁気標識した抗サイトケラチン8抗体を用いて、循環癌細胞を他の循環細胞型から分離する(Martin et al., 1998;Hu et al., 2003参照)。膵臓癌細胞はサイトケラチン8を発現する(Rafie et al., 1992;Ditzel et al., 1997;Luttges et al., 1998)。例えば、血液試料(20〜40ml)を採取し、抗凝血物質で処理し、さらなる処理まで23hr保存した後、400gで35分間遠心沈降し、白血球を多く含む間期細胞を回収し、0.5%BSAおよび0.1%サポニンを含むPBSで透過化処理し、次いで37%ホルムアルデヒドで固定する。PBS、0.5%BSA、0.5%サポニンおよび0.05%NaN3で2回洗浄した後、細胞を600μlのPBS、0.5%BSA、0.5%サポニンおよび0.05%NaN3に再懸濁し、200μlのFcRブロッキング試薬(Miltenyi Biotech)を加え、200μlのCytokeratin Microbeads(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)の添加と、細胞の室温で45min.のインキュベーションにより癌細胞を直接磁気標識する。磁気標識した細胞を30μmのフィルターを通し、磁場内に置いたMACS MS濃縮カラム(Miltenyi Biotec)に充填する。陰性細胞をPBS、0.5%BSA、および0.05%NaN3で洗浄し、次いでカラムを磁場から取り出した後、同じ緩衝液およびカラムに付属のプランジャーを用いて標識細胞を除去する。この画分の膵臓癌細胞を、適当な標識抗PRL-1抗体を用いて免疫組織化学またはフローサイトメトリーにより検出することができる。または、磁気的抗PRL-1抗体を用いて循環膵臓癌細胞を濃縮してもよい。
濃縮技術の出現に伴い、循環癌細胞の検出を、原発腫瘍治療後の癌再発の早期検出、転移の早期診断や、様々な腫瘍に対する治療戦略の選択および監視のために用いることができる(Martin et al. 1998;Wang et al., 2000;Hu et al., 2003)。循環膵臓癌細胞の検出において、本発明の抗PRL抗体を癌細胞濃縮技術と共に用いることができる。一つの適当な細胞濃縮法は、Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA)によって配布されている磁気活性化細胞分離システムである。この免疫磁気法は磁気標識した抗サイトケラチン8抗体を用いて、循環癌細胞を他の循環細胞型から分離する(Martin et al., 1998;Hu et al., 2003参照)。膵臓癌細胞はサイトケラチン8を発現する(Rafie et al., 1992;Ditzel et al., 1997;Luttges et al., 1998)。例えば、血液試料(20〜40ml)を採取し、抗凝血物質で処理し、さらなる処理まで23hr保存した後、400gで35分間遠心沈降し、白血球を多く含む間期細胞を回収し、0.5%BSAおよび0.1%サポニンを含むPBSで透過化処理し、次いで37%ホルムアルデヒドで固定する。PBS、0.5%BSA、0.5%サポニンおよび0.05%NaN3で2回洗浄した後、細胞を600μlのPBS、0.5%BSA、0.5%サポニンおよび0.05%NaN3に再懸濁し、200μlのFcRブロッキング試薬(Miltenyi Biotech)を加え、200μlのCytokeratin Microbeads(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)の添加と、細胞の室温で45min.のインキュベーションにより癌細胞を直接磁気標識する。磁気標識した細胞を30μmのフィルターを通し、磁場内に置いたMACS MS濃縮カラム(Miltenyi Biotec)に充填する。陰性細胞をPBS、0.5%BSA、および0.05%NaN3で洗浄し、次いでカラムを磁場から取り出した後、同じ緩衝液およびカラムに付属のプランジャーを用いて標識細胞を除去する。この画分の膵臓癌細胞を、適当な標識抗PRL-1抗体を用いて免疫組織化学またはフローサイトメトリーにより検出することができる。または、磁気的抗PRL-1抗体を用いて循環膵臓癌細胞を濃縮してもよい。
別の濃縮技術はCirculating Cancer Cell Test(Cell Works Inc., Baltimore, MD;Wang et al., 2000参照)である。この方法はほとんどのRBCおよびWBCを除去するための二重勾配沈降、ならびにサイトスピン装置を用いて癌細胞をスライド上に広げる前にWBCをさらに除去するための磁気細胞選別を用いる。次いで、スライド上に固定した細胞を適当な抗PRL-1抗体で染色し、陽性細胞を分光顕微鏡システムで、最初は低倍率で蛍光ディジタル画像を複数の励起/発光波長を用いた0.2μmの分解能で捕捉し、次いでさらなる解析のために高分解能で、自動的に走査する。システムは、適当な画像収集と、強度およびブロブ解析に基づき癌細胞およびマーカーを同定するための解析に必要とされる露出、焦点および他のパラメーターの自動調節を有する。
8. 全身撮像法
本発明は、癌を有している、または癌発生のリスクが高い可能性がある被検者を同定するための全身撮像技術をさらに用いることができる。そのような診断法は、ポジトロン放出断層撮影(PET)走査法、電子ビーム断層撮影(EBT)走査法、およびMRI走査法を用いることができる。これらの方法に不可欠であるのは、PRL-1と定量的に共存する、抗体などの標識した標的物質の使用である。
本発明は、癌を有している、または癌発生のリスクが高い可能性がある被検者を同定するための全身撮像技術をさらに用いることができる。そのような診断法は、ポジトロン放出断層撮影(PET)走査法、電子ビーム断層撮影(EBT)走査法、およびMRI走査法を用いることができる。これらの方法に不可欠であるのは、PRL-1と定量的に共存する、抗体などの標識した標的物質の使用である。
D. PRL-1活性または発現のスクリーニング法
1. PRL-1阻害剤のスクリーニング
本発明は、PRL-1活性または発現の阻害剤を同定するための方法をさらに含む。PRL-1は、膵臓癌細胞などの癌細胞においてその発現または活性を阻害、低減またはダウンレギュレートする化合物をスクリーニングする際の標的として用いることができる。これらのアッセイは、大きい候補物質ライブラリの無作為スクリーニングを含んでいてもよい。または、アッセイを用いて、PRL-1の機能を阻害させていると考えられる構造上の特質に注目して選択した特定の化合物群に焦点を合わせることもできる。機能とは、癌細胞におけるPRL-1発現の阻害、アポトーシスの増大、またはPRL-1酵素の基質からホスファターゼを切断する能力の阻害についてアッセイすることができることを意味する。
1. PRL-1阻害剤のスクリーニング
本発明は、PRL-1活性または発現の阻害剤を同定するための方法をさらに含む。PRL-1は、膵臓癌細胞などの癌細胞においてその発現または活性を阻害、低減またはダウンレギュレートする化合物をスクリーニングする際の標的として用いることができる。これらのアッセイは、大きい候補物質ライブラリの無作為スクリーニングを含んでいてもよい。または、アッセイを用いて、PRL-1の機能を阻害させていると考えられる構造上の特質に注目して選択した特定の化合物群に焦点を合わせることもできる。機能とは、癌細胞におけるPRL-1発現の阻害、アポトーシスの増大、またはPRL-1酵素の基質からホスファターゼを切断する能力の阻害についてアッセイすることができることを意味する。
PRL-1阻害剤を同定するために、一般には候補物質存在下および非存在下でPRL-1活性または発現を評価することになり、ここで阻害剤とはPRL-1活性または発現をダウンレギュレート、低下、阻害または低減する任意の物質と定義される。例えば、方法は一般には:
a)細胞を提供する段階と;
b)細胞を候補化合物と接触させる段階と;
c)候補化合物のPRL-1発現または活性に対する効果を評価する段階とを含み、候補化合物で治療していない類似の細胞におけるPRL-1発現または活性の量と比較した場合のPRL-1発現または活性の量の低下が、候補化合物が抗癌活性を有することを示すと考えられる。
a)細胞を提供する段階と;
b)細胞を候補化合物と接触させる段階と;
c)候補化合物のPRL-1発現または活性に対する効果を評価する段階とを含み、候補化合物で治療していない類似の細胞におけるPRL-1発現または活性の量と比較した場合のPRL-1発現または活性の量の低下が、候補化合物が抗癌活性を有することを示すと考えられる。
アッセイは無細胞系、単離細胞、またはトランスジェニック動物を含む生物で行うことができる。当然のことながら、本発明のスクリーニング法はすべて、有効な候補が見つからないこともあるという事実にもかかわらず、それ自体で有用であることが理解されると思われる。本発明は、候補の発見法だけでなく、そのような候補のスクリーニング法も提供する。
a. 阻害剤
本明細書において用いられる「候補物質」または「候補化合物」なる用語は、PRL-1の発現または活性を阻害する可能性があるいかなる分子も意味する。PRL-1阻害剤は、全体に見てPRL-1活性の阻害に影響をおよぼす化合物で、これはPRL-1発現、転座もしくは輸送、機能、発現、翻訳後修飾、配置を阻害することにより、またはより直接的に、PRL-1と結合するなど、その活性を妨げることにより、達成することができる。本明細書の方法および組成物において記載されるいかなる化合物または分子も、PRL-1活性または発現の阻害剤でありうる。
本明細書において用いられる「候補物質」または「候補化合物」なる用語は、PRL-1の発現または活性を阻害する可能性があるいかなる分子も意味する。PRL-1阻害剤は、全体に見てPRL-1活性の阻害に影響をおよぼす化合物で、これはPRL-1発現、転座もしくは輸送、機能、発現、翻訳後修飾、配置を阻害することにより、またはより直接的に、PRL-1と結合するなど、その活性を妨げることにより、達成することができる。本明細書の方法および組成物において記載されるいかなる化合物または分子も、PRL-1活性または発現の阻害剤でありうる。
候補物質は、タンパク質もしくはその断片、小分子、または核酸分子であってもよい。最も有用な薬学的化合物は、PRL-1もしくは他のチロシンホスファターゼに構造的に関係している、またはPRL-1に結合する化合物であることが判明すると考えられる。改善された化合物の開発を助けるために先導化合物を用いることは、「合理的薬物設計」として知られ、公知の阻害剤との比較だけでなく、標的分子の構造に関しての予測も含む。
本発明の候補化合物または阻害剤は、膵臓癌細胞などの癌細胞におけるPRL-1の発現または活性を阻害、低減またはダウンレギュレートするよう機能すると考えられる。そのような候補化合物は、チロシンホスファターゼの阻害剤もしくは調節物質である;ホスホチロシンを含むタンパク質もしくはペプチドからリン酸エステルを除去する能力を有する;または膵臓癌細胞などの癌もしくは腫瘍細胞の細胞増殖の制御に関与している可能性がある。これらの候補化合物は、アンチセンス分子、リボザイム、干渉RNA、抗体(一本鎖抗体を含む)、または有機医薬品でありうるが、これらに限定されることはない。
b. 合理的薬物設計
本発明は、膵臓癌などの癌を治療するために用いることができる、PRL-1活性または発現を阻害する薬物の開発法も提供する。一つのそのような方法は、分子モデリングおよびコンピューターシミュレーションを用いた、有効性確認されたチロシンホスファターゼ標的の三次元構造の予測を含む。次いで、得られた構造をドッキング試験で用いて、酵素の活性部位に好ましい結合エネルギーで結合する小分子阻害剤の可能性がある化合物を同定することができる。次いで、同定された阻害剤を生化学アッセイで試験して、膵臓癌治療のためのPRL-1薬物標的をさらに同定することができる。
本発明は、膵臓癌などの癌を治療するために用いることができる、PRL-1活性または発現を阻害する薬物の開発法も提供する。一つのそのような方法は、分子モデリングおよびコンピューターシミュレーションを用いた、有効性確認されたチロシンホスファターゼ標的の三次元構造の予測を含む。次いで、得られた構造をドッキング試験で用いて、酵素の活性部位に好ましい結合エネルギーで結合する小分子阻害剤の可能性がある化合物を同定することができる。次いで、同定された阻害剤を生化学アッセイで試験して、膵臓癌治療のためのPRL-1薬物標的をさらに同定することができる。
したがって、合理的薬物設計を用いて、PRL-1のリン酸化基質の構造類縁体を調製する。そのような類縁体を作製することにより、変化に対する感受性が異なる、または様々な他の分子の機能に影響をおよぼしうる、天然分子よりも活性または安定性が高い薬物を形成することが可能である。一つのアプローチにおいて、本発明のPRL-1標的またはその断片の三次元構造を生成する。これは、X線結晶学、コンピューターモデリングまたは両方のアプローチの組み合わせによって達成することができる。
標的化合物阻害剤の構造を確認するために抗体を用いることも可能である。原理的には、このアプローチは、その後の薬物設計の基礎となりうる薬物コアを提供する。機能的な、薬理活性を有する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生成することにより、タンパク質結晶学をまったく迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は元の抗原の類縁体であると予想される。したがって、抗イディオタイプを用いて、化学的または生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができる。次いで、選択したペプチドは薬物コアとして役立つと考えられる。抗イディオタイプは、抗原として抗体を用い、抗体を産生するために本明細書に記載した方法を用いて生成することができる。
一方、有用な化合物の同定を「力づくで強制する」努力において、有用な薬物の基本的基準に適合すると考えられる小分子ライブラリを、様々な商業的供給元から単純に得ることもできる。コンビナトリアル手法によって生成されたライブラリ(例えば、ペプチドライブラリ)を含む、そのようなライブラリのスクリーニングは、多数の関係がある(および無関係の)化合物を活性についてスクリーニングするための迅速かつ効率的な方法である。コンビナトリアルアプローチは、活性であるが、それ以外は望ましくない化合物から設計された第二、第三および第四世代の化合物を作製することにより、可能性がある薬物の迅速な進化にも役立つ。
候補化合物は、天然化合物の断片もしくは一部を含んでいてもよく、または単独では不活性な公知の化合物の活性な組み合わせとして見いだされることもある。動物、細菌、真菌、葉や樹皮を含む植物原料、および海洋試料などの天然の原料から単離された化合物を候補として、有用である可能性のある薬剤の有無についてアッセイすることが推奨される。スクリーニングする薬剤は化学的組成物または人工的化合物に由来する、またはそれらから合成されうることが理解されると思われる。したがって、本発明によって同定される候補物質は、公知の阻害剤または刺激物質から出発して、合理的薬物設計により設計することができる、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤またはいかなる他の化合物でありうることが理解される。
他の適当な化合物には、アンチセンス分子、リボザイム、および抗体(一本鎖抗体を含む)が含まれ、これらはそれぞれ標的分子に特異的である。そのような化合物を、本文書の他所で詳細に記載する。例えば、翻訳もしくは転写開始部位、またはスプライス部位に結合するアンチセンス分子は理想的な候補阻害剤であると思われる。
最初に同定された阻害化合物に加えて、発明者らは、阻害剤の構造の主要部分を模するために、他の立体的に類似の化合物を調製しうることも企図する。そのような化合物はペプチド阻害剤のペプチド様化合物を含むことができ、これらは最初の阻害剤と同じ様式で用いることができる。
本発明の阻害剤は、PRL-1またはこの遺伝子ファミリーの他の関連リン酸エステルの上流、下流またはこれに直接、その阻害または活性化効果を発揮するものであってもよい。本発明のスクリーニング法によって同定された阻害剤の型に関係なく、そのような化合物による阻害の効果は、候補物質を添加しない場合と比べてPRL-1活性または発現を調節することになる。
「薬物」なる用語は、被検者に投与したときに所望の治療効果を提供することができる、固体、液体、または気体相いずれかの化学的実体を指すことが意図される。「薬物」なる用語は、合成化合物、天然物や、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または脂質などの高分子実体、および神経伝達物質、リガンド、ホルモンまたは基本的化合物などの小さい実体を含むと解釈されるべきである。「薬物」なる用語は、未精製の混合物または精製・単離物のいずれであろうと、その化合物を指すことが意図される。
c. 生物学的等価性
本発明は、治療薬として用いることができ、PRL-1活性または発現を阻害することができる薬物の開発において、先導化合物の生物活性を改変するための生物学的等価性、イソステリズムの概念の適用も企図する。前述のとおり、所望の薬理活性を有する先導化合物は、望ましくない副作用、そのバイオアベイラビリティを制限する特性、またはその代謝および体内からの排出に有害な影響を持つ構造上の特徴を伴っていることがある。生物学的等価性は、当技術分野において先導化合物をより安全で臨床上より有効な物質へと合理的に改変するために用いられる一つのアプローチである(Patani and LaVoie, 1996)。生物学的等価体(bioisosteres)群が類似の生物活性を誘発する能力は、電気陰性度、立体的サイズ、および親油性などの共通の物理化学的性質によるとされてきた。ファルマコフォアおよび生物学的等価体の物理化学的性質の理解に基づく官能基の生物学的等価な置換により、新しい臨床薬の開発を成功させる可能性が増強されてきた。生物学的等価性の重大な要素は、生物学的等価体がアゴニストまたはアンタゴニストと同じ薬理学的標的に影響をおよぼし、それにより相互に関連する生物学的性質を有することである。
本発明は、治療薬として用いることができ、PRL-1活性または発現を阻害することができる薬物の開発において、先導化合物の生物活性を改変するための生物学的等価性、イソステリズムの概念の適用も企図する。前述のとおり、所望の薬理活性を有する先導化合物は、望ましくない副作用、そのバイオアベイラビリティを制限する特性、またはその代謝および体内からの排出に有害な影響を持つ構造上の特徴を伴っていることがある。生物学的等価性は、当技術分野において先導化合物をより安全で臨床上より有効な物質へと合理的に改変するために用いられる一つのアプローチである(Patani and LaVoie, 1996)。生物学的等価体(bioisosteres)群が類似の生物活性を誘発する能力は、電気陰性度、立体的サイズ、および親油性などの共通の物理化学的性質によるとされてきた。ファルマコフォアおよび生物学的等価体の物理化学的性質の理解に基づく官能基の生物学的等価な置換により、新しい臨床薬の開発を成功させる可能性が増強されてきた。生物学的等価性の重大な要素は、生物学的等価体がアゴニストまたはアンタゴニストと同じ薬理学的標的に影響をおよぼし、それにより相互に関連する生物学的性質を有することである。
生物学的等価体は古典的または非古典的のいずれかに分類される。古典的生物学的等価体は伝統的にいくつかの異なる範疇に分けられてきた:(a)一価の原子または基;(b)二価の原子または基;(c)三価の原子または基;(d)四置換原子;および(e)環状等価物。非古典的生物学的等価体は(a)環と非環状構造;および(b)交換可能な基に分類することができる。非古典的生物学的等価体は古典的等価体の立体的および電子的定義に従わない点で、古典的生物学的等価体と異なっている。非古典的生物学的等価体の顕著な特性は、それが置換基として用いられる元の置換基または部分と同じ数の原子を持たないことである。
本発明において、生物学的等価性の適用をPRL-1活性または発現を阻害することができる薬剤の開発において用いてきた。例えば、先導化合物、UA668394のファルマコフォアを生物学的等価性の概念を用いて開発し、下記に示す類縁体UA668394-1およびUA668394-2を開発することができる:
(式中、R1は水素、ハロゲン、チオール、トリフルオロメチル、またはヒドロキシルであり、R2は水素、ハロゲン、チオール、ヒドロキシルまたはトリフルオロメチルである)、
(式中、R3およびR5は独立にハロゲン、チオール、ヒドロキシまたはトリフルオロメチルであり、R4はヒドロキシル、ハロゲン、チオール、トリフルオロメチル、CH2OH、NHCONH2、NHSO2CH3、またはNHCNである)、
(式中、R3およびR5は独立にハロゲン、チオール、ヒドロキシルまたはトリフルオロメチルであり、R4はヒドロキシル、ハロゲン、チオール、トリフルオロメチル、CH2OH、NHCONH2、NHSO2CH3、またはNHCNである)。
(式中、R1は水素、ハロゲン、チオール、トリフルオロメチル、またはヒドロキシルであり、R2は水素、ハロゲン、チオール、ヒドロキシルまたはトリフルオロメチルである)、
(式中、R3およびR5は独立にハロゲン、チオール、ヒドロキシまたはトリフルオロメチルであり、R4はヒドロキシル、ハロゲン、チオール、トリフルオロメチル、CH2OH、NHCONH2、NHSO2CH3、またはNHCNである)、
(式中、R3およびR5は独立にハロゲン、チオール、ヒドロキシルまたはトリフルオロメチルであり、R4はヒドロキシル、ハロゲン、チオール、トリフルオロメチル、CH2OH、NHCONH2、NHSO2CH3、またはNHCNである)。
2. ホスファターゼアッセイ
a. チロシンホスファターゼアッセイ
ホスホチロシンを含むタンパク質またはペプチドからのリン酸エステルの除去を測定するアッセイも本発明で用いることができる。薬物標的をスクリーニングする一つの方法は、PRL-1媒介性チロシン脱リン酸化の阻害を測定することを含む。このアッセイは、モリブデン酸塩:マラカイトグリーン:リン酸複合体の吸光度を測定することにより、反応中に生じた遊離ホスファターゼの量を検出する。このアッセイはチロシンホスファターゼの活性を検出する。そのようなアッセイまたはシステムは、Promega (Madison, WI)またはApplied Biosystems (Foster City, CA)などの供給元から市販されている。
a. チロシンホスファターゼアッセイ
ホスホチロシンを含むタンパク質またはペプチドからのリン酸エステルの除去を測定するアッセイも本発明で用いることができる。薬物標的をスクリーニングする一つの方法は、PRL-1媒介性チロシン脱リン酸化の阻害を測定することを含む。このアッセイは、モリブデン酸塩:マラカイトグリーン:リン酸複合体の吸光度を測定することにより、反応中に生じた遊離ホスファターゼの量を検出する。このアッセイはチロシンホスファターゼの活性を検出する。そのようなアッセイまたはシステムは、Promega (Madison, WI)またはApplied Biosystems (Foster City, CA)などの供給元から市販されている。
b. DiFMUPアッセイ
本発明において用いるもう一つのアッセイは、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を含む高処理量スクリーニングのためのプロテインホスファターゼを測定する改善法である。DiFMUPは、酸性およびアルカリ性両方のホスファターゼ活性をアッセイすることができる。DiFMUPのDiF4MUへの加水分解産物はMUPの加水分解産物よりも低いpka(4.9対7.8)および高い蛍光量子収量(0.89対0.63)の両方を示す。その加水分解産物のpkaが低いことにより、DiFMUPは酸性ホスファターゼの感度の高い基質となり、これはMUPでは蛍光をアルカリ性pHで測定しなければならないため不可能である。さらに、量子収量が高いため、DiFMUPは酸性およびアルカリ性両方のホスファターゼ測定の感度を高める。フッ化フルオレセイン誘導体(すなわち、オレゴングリーン色素)と同様、フッ化により、吸光係数または励起/発光最大値に著しい影響を与えることなく、メチルウンベリフェロンフルオロフォアの光退色効果に対する感受性が低下する。DiFMUPは1.0pg/mlという少量のアルカリ性ホスファターゼの定量を可能にする。
本発明において用いるもう一つのアッセイは、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を含む高処理量スクリーニングのためのプロテインホスファターゼを測定する改善法である。DiFMUPは、酸性およびアルカリ性両方のホスファターゼ活性をアッセイすることができる。DiFMUPのDiF4MUへの加水分解産物はMUPの加水分解産物よりも低いpka(4.9対7.8)および高い蛍光量子収量(0.89対0.63)の両方を示す。その加水分解産物のpkaが低いことにより、DiFMUPは酸性ホスファターゼの感度の高い基質となり、これはMUPでは蛍光をアルカリ性pHで測定しなければならないため不可能である。さらに、量子収量が高いため、DiFMUPは酸性およびアルカリ性両方のホスファターゼ測定の感度を高める。フッ化フルオレセイン誘導体(すなわち、オレゴングリーン色素)と同様、フッ化により、吸光係数または励起/発光最大値に著しい影響を与えることなく、メチルウンベリフェロンフルオロフォアの光退色効果に対する感受性が低下する。DiFMUPは1.0pg/mlという少量のアルカリ性ホスファターゼの定量を可能にする。
例えば、本発明において、それから組換えHisタグPRl-1タンパク質を得、カラム(すなわち、ニッケルカラム)を用いて精製することができる、細菌発現システムを用いることができる(すなわち、pProExベクター)。目的の薬物化合物存在下、およびDiFMUP基質との組み合わせで、PRl-1酵素活性をインキュベートし(約1h)、脱リン酸基質を検出することができる。
3. インビトロアッセイ
実行が迅速、安価および容易なアッセイはインビトロアッセイである。そのようなアッセイは一般に単離分子を用い、速やかに多数で実行することができ、それにより短時間に得られる情報量が増加する。アッセイを実行するために、試験管、プレート、皿およびディップスティックまたはビーズなどの他の表面を含む様々な容器を用いることができる。
実行が迅速、安価および容易なアッセイはインビトロアッセイである。そのようなアッセイは一般に単離分子を用い、速やかに多数で実行することができ、それにより短時間に得られる情報量が増加する。アッセイを実行するために、試験管、プレート、皿およびディップスティックまたはビーズなどの他の表面を含む様々な容器を用いることができる。
無細胞アッセイの一例は結合アッセイである。機能を直接取り扱ってはいないが、化合物のPRL-1などの標的分子に特異的様式で結合する能力は関係する生物学的効果の強力な証拠であり、これをスクリーン上で追跡して評価することができる。例えば、分子のPRL-1への結合は、立体、アロステリックまたは電荷-電荷相互作用により、それ自体で阻害的である。PRL-1は、溶液中で遊離であっても、支持体に固定されていても、細胞内または細胞表面上で発現されてもよい。PRL-1または化合物のいずれかを標識し、それにより結合の測定を可能にすることもできる。物質の一つが標識された、競合的結合フォーマットを実施することができ、結合に対する効果を調べるために、遊離標識と結合標識の量を測定することができる。
化合物の高処理量スクリーニングのための技術が、WO84/03564に記載されている。多数の小さいペプチド試験化合物を、プラスティックピンまたは他の表面などの固体基質上で合成する。結合ポリペプチドを様々な方法で検出する。
4. インサイト(in cyto)アッセイ
本発明は、細胞内でPRL-1を阻害する能力についての化合物のスクリーニングも企図する。この目的のために特に操作された細胞を含む、様々な細胞株を、そのようなスクリーニングアッセイのために用いることができる。本発明は、高レベルのPRL-1活性を発現し、したがって測定のために容易な基準線を提供することができる、膵臓癌細胞の使用を特に企図する。アッセイに応じて、培養が必要とされることもある。細胞をいくつかの異なる生理学的アッセイのいずれかを用いて試験する。または、分子解析を行う、例えば、蛋白質発現、mRNA発現(全細胞またはポリA RNAのディファレンシャルディスプレイを含む)その他を、本明細書に記載しており、当業者には公知の方法により観察することもできる。
本発明は、細胞内でPRL-1を阻害する能力についての化合物のスクリーニングも企図する。この目的のために特に操作された細胞を含む、様々な細胞株を、そのようなスクリーニングアッセイのために用いることができる。本発明は、高レベルのPRL-1活性を発現し、したがって測定のために容易な基準線を提供することができる、膵臓癌細胞の使用を特に企図する。アッセイに応じて、培養が必要とされることもある。細胞をいくつかの異なる生理学的アッセイのいずれかを用いて試験する。または、分子解析を行う、例えば、蛋白質発現、mRNA発現(全細胞またはポリA RNAのディファレンシャルディスプレイを含む)その他を、本明細書に記載しており、当業者には公知の方法により観察することもできる。
5. インビボアッセイ
インビボアッセイは、PRL-1過剰発現などの特定の欠陥を有するように操作された、または候補物質が生物内の異なる細胞に到達して影響をおよぼす能力を評価するために用いることができるマーカーを有する、トランスジェニック動物を含む、様々な動物モデルの使用を含む。サイズ、取り扱いの容易さ、ならびに生理学的および遺伝的性質に対する情報ゆえに、マウスが、特にトランスジェニック動物については好ましい態様である。しかし、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、マーモット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマおよびサル(チンパンジー、テナガザルおよびヒヒを含む)を含む、他の動物も適当である。阻害剤のアッセイは、これらの種のいずれか由来の動物モデルを用いて行うことができる。
インビボアッセイは、PRL-1過剰発現などの特定の欠陥を有するように操作された、または候補物質が生物内の異なる細胞に到達して影響をおよぼす能力を評価するために用いることができるマーカーを有する、トランスジェニック動物を含む、様々な動物モデルの使用を含む。サイズ、取り扱いの容易さ、ならびに生理学的および遺伝的性質に対する情報ゆえに、マウスが、特にトランスジェニック動物については好ましい態様である。しかし、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、マーモット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマおよびサル(チンパンジー、テナガザルおよびヒヒを含む)を含む、他の動物も適当である。阻害剤のアッセイは、これらの種のいずれか由来の動物モデルを用いて行うことができる。
そのようなアッセイにおいて、一つまたは複数の候補物質を動物に投与し、候補物質で治療していない類似の動物と比べて、候補物質が一つまたは複数の特性を変える能力により阻害剤を同定する。特性はPRL-1発現もしくは機能に関して前述したもののいずれかであってもよく、または動物の状態を「治療する」という意味において、より広範であることもある。
これらの動物の試験化合物による治療は、適当な剤形の化合物の動物への投与を含むことになる。投与は、経口、鼻内、口腔内、または局所を含むが、これらに限定されることはない、臨床または非臨床目的で用いることができるいかなる経路にもよることになる。または、投与は気管内点滴、気管支点滴、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって行うこともできる。特に企図される経路は、全身静脈内注射、血液もしくはリンパ供給を介しての局所投与、または患部に直接である。
化合物のインビボでの有効性評価は、毒性の評価を含むと考えられ、用量反応試験は動物において、インビトロまたはインサイトアッセイよりも意味のある様式で実施することができる。
E. 癌治療
本発明は、癌を有する被検者へのPRL-1阻害剤の送達による、膵臓癌などの癌を治療する方法も含む。治療のために企図される癌の例には、白血病、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、前立腺癌、睾丸癌、胃癌、脳癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、およびPRL-1活性の活性を阻害または低減することにより治療可能ないかなる他の癌も含まれる。
本発明は、癌を有する被検者へのPRL-1阻害剤の送達による、膵臓癌などの癌を治療する方法も含む。治療のために企図される癌の例には、白血病、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、前立腺癌、睾丸癌、胃癌、脳癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、およびPRL-1活性の活性を阻害または低減することにより治療可能ないかなる他の癌も含まれる。
1. PRL-1阻害剤
a. アンチセンス
アンチセンス法は、核酸が「相補的」配列と対になる傾向があるという事実を利用している。相補的とは、ポリヌクレオチドが標準的ワトソン-クリックの相補則に従って塩基対形成できるものであることを意味する。すなわち、大きいプリンが小さいピリミジンと塩基対形成して、グアニンとシトシンの対(G:C)およびアデニンとDNAの場合にはチミン(A:T)、またはアデニンとRNAの場合にはウラシル(A:U)の組み合わせを形成することになる。ハイブリダイジング配列におけるイノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチンその他などの一般的でない塩基を含んでいても、対形成を妨害することはない。
a. アンチセンス
アンチセンス法は、核酸が「相補的」配列と対になる傾向があるという事実を利用している。相補的とは、ポリヌクレオチドが標準的ワトソン-クリックの相補則に従って塩基対形成できるものであることを意味する。すなわち、大きいプリンが小さいピリミジンと塩基対形成して、グアニンとシトシンの対(G:C)およびアデニンとDNAの場合にはチミン(A:T)、またはアデニンとRNAの場合にはウラシル(A:U)の組み合わせを形成することになる。ハイブリダイジング配列におけるイノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチンその他などの一般的でない塩基を含んでいても、対形成を妨害することはない。
ポリヌクレオチドで二本鎖(ds)DNAを標的指向することにより、三重らせんが形成されることになり;RNA標的指向により二重らせんが形成されることになる。アンチセンスポリヌクレオチドを標的細胞に導入すると、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、RNAプロセッシング、輸送、翻訳および/または安定性を妨害する。アンチセンスRNA作製物、またはそのようなアンチセンスRNAをコードするDNAを用いて、宿主細胞内の遺伝子転写もしくは翻訳、またはその両方を、インビトロまたはヒト被検者を含む宿主動物内などのインビボいずれかで阻害することができる。
アンチセンス作製物は、遺伝子のプロモーターおよび他の制御領域、エキソン、イントロンまたはエキソン-イントロンの境界に結合するよう設計することもできる。最も有効なアンチセンス作製物は、イントロン/エキソンスプライス部位に相補的な領域を含みうることが企図される。したがって、イントロン/エキソンスプライス部位の50〜200塩基以内の領域に相補性を有するアンチセンス作製物を用いてもよい。いくつかのエキソン配列は、その標的選択性に重大な影響をおよぼすことなく、作製物に含まれうることが観察されている。含まれるエキソン材料の量は、用いる特定のエキソンおよびイントロン配列に応じて変動することになる。単純に作製物をインビトロで試験して、正常な細胞機能が冒されているかどうか、または相補的配列を有する関連遺伝子の発現に影響があるかどうかを調べることにより、過剰のエキソンDNAが含まれるかどうかを容易に試験することができる。
前述のとおり、「相補的」または「アンチセンス」とは、その全長にわたって実質的に相補的であり、塩基ミスマッチをほとんど持たないポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、長さ15塩基の配列は、13または14の位置で相補的ヌクレオチドを有する場合に相補的ということができる。当然、完全に相補的な配列は、その全長を通して全く相補的であり、塩基ミスマッチがない配列である。相同性の程度が低い他の配列も企図される。例えば、限られた領域で相同性が高いが、非相同領域も含む、アンチセンス作製物(例えば、リボザイム)を設計することもできる。これらの分子は、相同性が50%未満であるが、適当な条件下で標的配列に結合すると考えられる。
ゲノムDNAの一部をcDNAまたは合成配列と結合させて、特定の作製物を精製することは有益であると思われる。例えば、最終作製物においてイントロンが望まれる場合、ゲノムクローンを用いる必要がある。cDNAまたは合成ポリヌクレオチドは、作製物の残りの部分のためにより好都合な制限部位を提供することができ、したがって、配列の残りに対して用いられる。
b. リボザイム
本発明は、PRL-1発現をダウンレギュレートまたは阻害するためのPRL-1特異的リボザイムの使用も企図する。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するRNA-タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有している(Kim and Cech, 1987; Forster and Symons, 1987)。例えば、多くのリボザイムは高度の特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうち一つだけを切断することが多い(Cech et. al., 1981; Michel and Westhof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 1992)。この特異性は、化学反応の前に基質が、特定の塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合するという条件によるとされている。
本発明は、PRL-1発現をダウンレギュレートまたは阻害するためのPRL-1特異的リボザイムの使用も企図する。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するRNA-タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有している(Kim and Cech, 1987; Forster and Symons, 1987)。例えば、多くのリボザイムは高度の特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうち一つだけを切断することが多い(Cech et. al., 1981; Michel and Westhof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 1992)。この特異性は、化学反応の前に基質が、特定の塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合するという条件によるとされている。
リボザイム触媒作用は当初、核酸を含む配列特異的切断/連結反応の一部として観察された(Joyce, 1989; Cech et. al., 1981)。例えば、米国特許第5,354,855号は、リボザイムが公知のリボヌクレアーゼよりも高く、DNA制限酵素に近づくほどの配列特異性でエンドヌクレアーゼとして作用しうることを報告している。したがって、遺伝子発現の配列特異的なリボザイムによる阻害(Scanlon et. al., 1991; Sarver et. al., 1990; Sioud et. al., 1992)は、本発明の治療への適用に特に適している。リボザイムはそれらが適用されたいくつかの細胞株で遺伝子変化を誘発したことが報告されており、変化した遺伝子には癌遺伝子H-ras、c-fosおよびHIVの遺伝子が含まれた。この研究のほとんどは、特定のリボザイムによって切断される特定の突然変異体コドンに基づく、標的mRNAの改変を含んでいた。本明細書に含まれる情報および当業者の知識に照らせば、所与の遺伝子を特異的に標的とする他のリボザイムの調製および使用は簡単であると思われる。
いくつかの異なるリボザイムモチーフがRNA切断活性と共に記載されている(Symons, 1992の総説)。PRl-1のダウンレギュレーションまたは阻害について同等に機能すると予想される例には、タバコ輪点ウイルス(Prody et. al., 1986)、アボカドサンブロッチウィロイド(Palukaitis et. al., 1979)、およびルーサン一時条斑ウイルス(Forster and Symons, 1987)を含むI群自己スプライシングイントロンからの配列が含まれる。これらおよび関連ウイルスからの配列は、予想される折りたたみ二次構造に基づき、ハンマーヘッドリボザイムと呼ばれる。
他の適当なリボザイムには、RNA切断活性を有するRNアーゼP(Yuanetal., 1992; Yuan and Altman, 1994)、ヘアピンリボザイム構造(Berzal-Herranz et al., 1992; Chowrira et al., 1993)および肝炎ウイルスに基づくリボザイム(Perrotta and Been, 1992)が含まれる。リボザイム指向RNA切断活性の一般的設計および最適化が詳細に論じられている(Haseloff and Gerlach, 1988; Symons, 1992; Chowrira, et al., 1994; and Thompson, et al., 1995)。
リボザイム設計における他の変数は、所与の標的RNA上の切断部位の選択である。リボザイムを、相補的塩基対相互作用により一部位にアニーリングすることによって、所与の配列に標的指向させる。この標的指向には、二つの相同性伸長が必要とされる。相同配列のこれらの伸長は前述の定義の触媒リボザイム構造に隣接する。相同配列の各伸長は7から15ヌクレオチドまで長さが変動しうる。相同配列を決定するための唯一の条件は、標的RNAにおいて、これらが切断部位である特定の配列によって分けられていることである。ハンマーヘッドリボザイムでは、切断部位は標的RNA上のジヌクレオチド配列、ウラシル(U)の後にアデニン、シトシンまたはウラシルのいずれかである(A、CまたはU; Perriman, et al., 1992; Thompson, et al., 1995)。このジヌクレオチドが任意の所与のRNA中に出現する頻度は、統計学的に16分の3である。したがって、1000塩基の所与の標的mRNAでは、統計学的に187のジヌクレオチド切断部位が可能である。
標的RNAを効率よく切断するためのリボザイムの設計および試験は、当業者には公知の方法である。リボザイムの設計および試験の科学的方法の例が、Chowrira et al. (1994)およびLieber and Strauss (1995)によって記載されており、それぞれ参照として本明細書に組み込まれる。PRL-1標的指向リボザイムにおいて使用するための操作可能かつ好ましい配列の同定は、単純に所与の配列の調製および試験の問題で、当業者には公知の日常的に行われている「スクリーニング」法である。
c. RNA干渉(RNAi)
RNA干渉(「RNA媒介干渉」またはRNAiとも言う)は、それにより遺伝子発現を低下または除去することができるメカニズムである。二本鎖RNA(dsRNA)は低下を媒介することが観察されており、これは多段階工程である。dsRNAは、細胞をウイルス感染およびトランスポゾン活性から防御するよう機能すると思われる、翻訳後遺伝子発現監視メカニズムを活性化する。(Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp et al., 2000; Tabara et al., 1999)。これらのメカニズムの活性化は、成熟した、dsRNAに相補的なmRNAを破壊の標的とする。RNAiは遺伝子機能の研究のために、大きい実験上の利点を提供する。これらの利点には、非常に高い特異性、細胞膜を通過しての移動の容易さ、および標的遺伝子のダウンレギュレーション延長が含まれる。(Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp, 1999; Sharp et al., 2000; Tabara et al., 1999)。さらに、dsRNAは、植物、原生動物、真菌、線虫、トリパノソーマ、ショウジョウバエ、および哺乳動物を含む、広範な系において遺伝子をサイレントにすることが示されている(Grishok et al., 2000; Sharp, 1999; Sharp et al., 2000; Elbashir et al., 2001)。RNAiが転写後にRNA転写物を分解の標的とするようはたらくことは一般に認められている。核および細胞質RNAの両方が標的となりうると思われる。(Bosher et al., 2000)。
RNA干渉(「RNA媒介干渉」またはRNAiとも言う)は、それにより遺伝子発現を低下または除去することができるメカニズムである。二本鎖RNA(dsRNA)は低下を媒介することが観察されており、これは多段階工程である。dsRNAは、細胞をウイルス感染およびトランスポゾン活性から防御するよう機能すると思われる、翻訳後遺伝子発現監視メカニズムを活性化する。(Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp et al., 2000; Tabara et al., 1999)。これらのメカニズムの活性化は、成熟した、dsRNAに相補的なmRNAを破壊の標的とする。RNAiは遺伝子機能の研究のために、大きい実験上の利点を提供する。これらの利点には、非常に高い特異性、細胞膜を通過しての移動の容易さ、および標的遺伝子のダウンレギュレーション延長が含まれる。(Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp, 1999; Sharp et al., 2000; Tabara et al., 1999)。さらに、dsRNAは、植物、原生動物、真菌、線虫、トリパノソーマ、ショウジョウバエ、および哺乳動物を含む、広範な系において遺伝子をサイレントにすることが示されている(Grishok et al., 2000; Sharp, 1999; Sharp et al., 2000; Elbashir et al., 2001)。RNAiが転写後にRNA転写物を分解の標的とするようはたらくことは一般に認められている。核および細胞質RNAの両方が標的となりうると思われる。(Bosher et al., 2000)。
siRNAは、目的遺伝子の発現を抑制する際に特異的かつ有効であるよう設計しなければならない。標的配列、すなわち、siRNAが分解機構を誘導することになる、一つまたは複数の目的遺伝子の選択法は、siRNAの誘導機能を干渉しうる配列を避ける一方で、一つまたは複数の遺伝子に特異的な配列を含むよう、指向される。典型的には、長さ約21から23ヌクレオチドのsiRNA標的配列が最も有効である。この長さは、前述のはるかに長いRNAのプロセッシングから生じる消化生成物の長さを示している。(Montgomery et al., 1998)。
siRNAの作製は主に、直接の化学合成;より長い二本鎖RNAのショウジョウバエ胚溶解産物への曝露によるプロセッシング;またはS2細胞由来のインビトロ系を通して行ってきた。細胞溶解産物またはインビトロプロセッシングの使用は、その後の溶解産物などからの短い、21〜23ヌクレオチドsiRNAの単離をさらに含むこともあり、工程が幾分厄介で高価なものになる。化学合成は、二つの一本鎖RNAオリゴマーを作製し、続いて二つの一本鎖オリゴマーをアニーリングして二本鎖RNAとすることにより進行させる。化学合成法は多様である。非限定例が米国特許第5,889,136号;第4,415,732号;第4,458,066号(これらは特に参照として本明細書に組み込まれる)、およびWincott et. al. (1995)に提供されている。
siRN配列の安定性を変える、またはそれらの有効性を改善するために、この配列へのいくつかのさらなる改変が示唆されている。ジヌクレオチドオーバーハングを有する合成相補的21量体RNA(すなわち、19の相補的ヌクレオチド+3'非相補的二量体)は最高レベルの抑制を提供しうることが示唆されている。これらのプロトコルは主に、ジヌクレオチドオーバーハングとして二つの(2'-デオキシ)チミジンの配列を用いる。これらのジヌクレオチドオーバーハングは、RNAに取り込まれた典型的ヌクレオチドと区別するために、dTdTと書くことが多い。文献には、dTオーバーハングの使用は主に、化学合成RNAのコストを下げる必要性が動機となっていることが示されている。dTdTオーバーハングはUUオーバーハングよりも安定でありうることも示唆されているが、入手可能なデータは、UUオーバーハングを有するsiRNAに比べてdTdTオーバーハングの改善がほんのわずか(<20%)であることを示している。
化学合成されたsiRNAは、細胞培養中に25〜100nMの濃度で含まれる場合に、最適にはたらくことが見いだされた。これは、Elbashir et. al.によって示され、約100nMの濃度で哺乳動物細胞における発現の有効な抑制が達成された。siRNAは哺乳動物細胞培養中、約100nMで最も有効であった。しかし、いくつかの場合に、低濃度の化学合成siRNAが用いられている(Caplen et. al., 2000; Elbashir et. al., 2001)。
WO 99/32619およびWO 01/68836は、siRNAにおいて用いるためのRNAは化学的またか酵素的に合成しうることを示唆している。これらのテキストはいずれも、参照としてその全体が本明細書に組み込まれる。これらの引用文献において企図される酵素的合成は、当業者には公知のとおり、発現作製物の使用および産生を介して、細胞RNAポリメラーゼまたはバクテリオファージRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)によるものである。例えば、米国特許第5,795,715号を参照されたい。企図される作製物は、標的遺伝子の一部と等しいヌクレオチド配列を含むRNAを産生する鋳型を提供する。これらの基準により提供される等しい配列の長さは、少なくとも25塩基であり、長さ400塩基以上であってもよい。この文献の重要な局面は、著者らが、インビボで長いdsRNAをsiRNAに変換する内因性ヌクレアーゼ複合体により、長いdsRNAを消化して21〜25量体の長さとすることを企図していることである。彼らは転写した21〜25量体dsRNAをインビトロで合成および使用するためのデータを記載または提示していない。RNA干渉において使用する際に、化学的または酵素的に合成されたdsRNAの予想される性質間に区別はない。
同様に、WO 00/44914(参照として本明細書に組み込まれる)は、RNAの一本鎖を酵素的に、または部分/全有機合成により生成しうることを示唆している。好ましくは、一本鎖RNAをDNA鋳型、好ましくはクローン化されたcDNA鋳型の登録商標PCR産物から酵素的に合成し、RNA生成物はcDNAの完全転写物で、何百ものヌクレオチドを含むこともある。WO 01/36646(参照として本明細書に組み込まれる)は、siRNAを合成する様式に制限を設けておらず、RNAを手動および/または自動の手順を用いてインビトロまたはインビボで合成することができるとしている。この文献は、インビトロ合成は化学的もしくは酵素的、例えば、内因性DNA(またはcDNA)鋳型の転写のためにクローン化されたRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)を用いる方法、または両方の混合であってもよいとしている。ここでも、RNA干渉において用いるための望ましい性質において、化学的または酵素的に合成されたsiRNAの間で区別はされていない。
米国特許第5,795,715号は、単一の反応混合物における二つの相補的DNA配列の同時転写を報告しており、二つの転写物はただちにハイブリダイズされる。用いる鋳型は、好ましくは、40から100塩基対の間のもので、それぞれの末端にプロモーター配列を有する。鋳型は、好ましくは、固体表面に結合されている。RNAポリメラーゼによる転写の後、得られたdsRNA断片を核酸標的配列を検出および/またはアッセイするために用いることができる。
2. 薬学的組成物と投与経路
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散した、PRL-1活性を阻害またはダウンレギュレートする一つまたは複数の阻害剤(および/または追加の物質)の有効量を被検者に投与する段階を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」なる句は、例えば、ヒトなどの動物に適宜投与した場合に、有害、アレルギー性または他の不都合な反応を生じることのない、分子実体および組成物を意味する。少なくとも一つのPRL-1阻害剤または追加の活性成分を含む薬学的組成物の製剤は、本開示に照らせば当業者には理解されると思われ、またRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990(参照として本明細書に組み込まれる)によって例示されるとおりである。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与のために、製剤はFDA Office of Biological Standardsによって要求される無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準に適合しているべきである。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散した、PRL-1活性を阻害またはダウンレギュレートする一つまたは複数の阻害剤(および/または追加の物質)の有効量を被検者に投与する段階を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」なる句は、例えば、ヒトなどの動物に適宜投与した場合に、有害、アレルギー性または他の不都合な反応を生じることのない、分子実体および組成物を意味する。少なくとも一つのPRL-1阻害剤または追加の活性成分を含む薬学的組成物の製剤は、本開示に照らせば当業者には理解されると思われ、またRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990(参照として本明細書に組み込まれる)によって例示されるとおりである。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与のために、製剤はFDA Office of Biological Standardsによって要求される無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準に適合しているべきである。
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」には、当業者には公知であるとおり、任意の、およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、着香料、色素、その他の材料およびその組み合わせが含まれる(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329(参照として本明細書に組み込まれる)参照)。いかなる通常の担体も活性成分と不適合である場合を除き、治療用または薬学的組成物におけるその使用が企図される。
本発明の薬学的組成物は、それが固体、液体またはエアロゾル剤形で投与されるかどうか、注射などの投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる型の担体を含んでいてもよい。本発明の薬学的組成物は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、腟内、直腸内、局所(topically)、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所(topically)、局所(locally)、吸入(例えば、エアロゾル吸入)、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸漬する局所灌流、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、脂質組成物(例えば、リポソーム)で、もしくは他の方法、または当業者には公知であると思われる前述の任意の組み合わせで投与することができる(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990(参照として本明細書に組み込まれる)参照)。
被検者に投与する本発明の組成物の実際の用量は、体重、状態の重症度、治療中の疾患のタイプ、過去または同時の治療的介入、患者の特発症および投与経路などの身体および生理学的因子によって決定することができる。投与回数および投与を行う期間は変動しうる。投与に責任のある医師は、いかなる事象においても、個々の被検者に対する組成物中の活性成分の濃度および適当な用量、ならびに投与期間を決定することになる。
特定の態様において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約0.1%の活性化合物を含むことができる。他の態様において、活性化合物はユニットの重量の約2%から約75%、または例えば約25%から約60%、およびそこで導き出せるいかなる範囲も含むことができる。他の非限定例において、用量は1回の投与につき約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重、約1000ミリグラム/kg/体重またはそれ以上、およびそこで導き出せるいかなる範囲も含むことができる。本明細書に記載の数値から導き出せる範囲の非限定例において、前述の数値に基づき、約5mg/kg/体重から約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重から約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を投与することができる。
いかなる場合でも、組成物は一つまたは複数の成分の酸化を遅延させるために様々な抗酸化剤を含むことができる。加えて、微生物作用の防止は、パラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されることはない、様々な抗菌および抗真菌剤などの保存剤によって行うことができる。
本発明のPRL-1阻害剤は、遊離塩基、中性または塩の形で組成物に製剤することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、あるいは例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸と形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第2鉄などの無機塩基;またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
組成物が液体剤形である態様において、担体は水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、脂質(例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム)およびその組み合わせを含むが、これらに限定されることはない、溶媒または分散媒でありうる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用;例えば、液体ポリオールもしくは脂質などの担体への分散による、要求される粒径の維持;例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用;またはそのような方法の組み合わせによって維持することができる。多くの場合に、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはその組み合わせなどの等張剤を含むことが好ましいと思われる。
本発明の特定の局面において、PRL-1阻害剤を、経口摂取などの経路による投与のために調製する。これらの態様において、固体組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤(例えば、ゼラチン硬または軟カプセル)、徐放性製剤、口腔内組成物、トローチ、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤、またはその組み合わせを含んでいてもよい。経口組成物は、食餌と共に直接取り込んでもよい。経口投与用の好ましい担体は、不活性希釈剤、同化可能な食用担体またはその組み合わせを含む。本発明の他の局面において、経口組成物はシロップ剤またはエリキシル剤として調製することもできる。シロップ剤またはエリキシル剤は、例えば、少なくとも一つの活性物質、甘味料、保存剤、着香料、色素、保存剤、またはその組み合わせを含んでいてもよい。
特定の好ましい態様において、経口組成物は一つまたは複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、およびその組み合わせを含んでいてもよい。特定の態様において、組成物は下記の一つまたは複数を含んでいてもよい:例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンもしくはその組み合わせなどの結合剤;例えば、リン酸2カルシウム、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸ナトリウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムもしくはその組み合わせなどの賦形剤;例えば、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸もしくはその組み合わせなどの崩壊剤;例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤;例えば、ショ糖、乳糖、サッカリンもしくはその組み合わせなどの甘味料;例えば、ペパーミント、冬緑油、桜香料、オレンジ香料などの着香料;または前述の組み合わせ。用量単位剤形がカプセルである場合、前述のタイプの材料に加え、液体担体などの担体を含んでいてもよい。様々な他の材料が、コーティングとして、またはそうではなく用量単位の物理的形状を改変するために含まれることもある。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤はシェラック、糖または両方でコーティングされていてもよい。
他の投与様式に適したその他の製剤には坐剤が含まれる。坐剤は様々な重量および形状の固体剤形で、通常は直腸、膣、または尿道内へ挿入するために投薬する。挿入後、坐剤は腔内の液中で軟化、融解または溶解する。一般に、坐剤のための伝統的担体には、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはその組み合わせが含まれうる。特定の態様において、坐剤は、例えば、約0.5%から約10%、好ましくは約1%から約2%の範囲の活性成分を含む混合物から製剤することができる。
無菌注射溶液は、必要とされる量の活性化合物を適当な溶媒に、必要に応じて前述の様々な他の成分と共に取り込み、続いて滅菌ろ過することにより調製する。一般に、分散剤は様々な無菌活性成分を、基本的分散媒および/または他の成分を含む無菌媒体中に取り込むことにより調製する。無菌注射溶液、懸濁液または乳濁液調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、あらかじめ滅菌ろ過した活性成分プラス任意の他の所望の成分の液体媒質から、その粉末を生じる、真空乾燥または凍結乾燥法である。液体媒質は必要があれば適当に緩衝化し、希釈液は注射前にまず十分な食塩水またはグルコースで等張化すべきである。直接注射するための高濃縮組成物の調製も企図され、溶媒としてDMSOの使用により、高濃度の活性物質を狭い領域に送達する非常に速やかな浸透が得られる。
組成物は製造および保管条件下で安定で、細菌および真菌などの微生物の混入に対して保護されていなければならない。エンドトキシン混入は安全なレベル、例えば、蛋白質1mgあたり0.5ng未満で最小限に維持すべきである。
特定の態様において、注射用組成物の長期吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはその組み合わせなどの吸収遅延剤を組成物中で使用することにより達成することができる。
F. PRL-1阻害剤との併用療法
PRL-1阻害剤などの本発明の組成物による癌治療の有効性を高めるために、これらの組成物を他の癌治療薬と組み合わせることが望ましいと考えられる。例えば、癌の治療を、本発明の治療薬を他の抗癌療法と共に用いて実施してもよい。したがって、本発明において、プロアポトーシスもしくは細胞周期調節剤、またはチロシンホスファターゼ調節剤に加えて、PRL-1阻害剤を化学療法、放射線療法、免疫療法または他の生物学的介入と共に用いてもよい。
PRL-1阻害剤などの本発明の組成物による癌治療の有効性を高めるために、これらの組成物を他の癌治療薬と組み合わせることが望ましいと考えられる。例えば、癌の治療を、本発明の治療薬を他の抗癌療法と共に用いて実施してもよい。したがって、本発明において、プロアポトーシスもしくは細胞周期調節剤、またはチロシンホスファターゼ調節剤に加えて、PRL-1阻害剤を化学療法、放射線療法、免疫療法または他の生物学的介入と共に用いてもよい。
この方法は細胞をPRL-1阻害剤および治療薬に同時に、または阻害剤および治療薬の細胞、組織もしくは生物への別々の投与が所望の治療上の利益をもたらす場合には一定期間内に接触させる段階を含む。「接触」および「曝露」なる用語は、細胞、組織または生物に対して適用する場合は、本明細書においてPRL-1阻害剤および/または治療薬を標的細胞、組織もしくは生物に送達する、または標的細胞、組織もしくは生物の直接近位に設置する方法を述べるために用いる。細胞、組織または生物は、PRL-1阻害剤および一つもしくは複数の薬剤を両方含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤と接触(例えば、投与により)させてもよく、または一つの組成物がPRL-1阻害剤を含み、他方が一つもしくは複数の薬剤を含む、複数の別の組成物もしくは製剤と細胞を接触させることにより接触させてもよい。
1. 治療法
PRL-1阻害剤は、他の薬剤の前、同時、および/または後に、数分から数週間の範囲の間隔で投与してもよい。PRL-1阻害剤と他の薬剤とを細胞、組織または生物に別々に適用する態様において、一般には阻害剤と薬剤とが細胞、組織または生物に対して好都合な組み合わせ効果を発揮することができるように、それぞれの送達時の間で著しい期間が過ぎないようにする。例えば、そのような場合、細胞、組織または生物を二つ、三つ、四つまたはそれ以上の療法と、実質的に阻害剤と同時に(すなわち、約1分以内に)接触させうることが企図される。他の局面において、一つまたは複数の薬剤を実質的に同時、約1分、約5分、約10分、約20分、約30分、約45分、約60分、約2時間、もしくはそれ以上の時間、または約1日もしくはそれ以上の日数、または約4週間もしくはそれ以上の週数、または約3ヶ月もしくはそれ以上の月数、または約1もしくはそれ以上の年数、およびそこで導き出せるいかなる範囲内で、PRL-1阻害剤を投与する前および/または後に投与してもよい。
PRL-1阻害剤は、他の薬剤の前、同時、および/または後に、数分から数週間の範囲の間隔で投与してもよい。PRL-1阻害剤と他の薬剤とを細胞、組織または生物に別々に適用する態様において、一般には阻害剤と薬剤とが細胞、組織または生物に対して好都合な組み合わせ効果を発揮することができるように、それぞれの送達時の間で著しい期間が過ぎないようにする。例えば、そのような場合、細胞、組織または生物を二つ、三つ、四つまたはそれ以上の療法と、実質的に阻害剤と同時に(すなわち、約1分以内に)接触させうることが企図される。他の局面において、一つまたは複数の薬剤を実質的に同時、約1分、約5分、約10分、約20分、約30分、約45分、約60分、約2時間、もしくはそれ以上の時間、または約1日もしくはそれ以上の日数、または約4週間もしくはそれ以上の週数、または約3ヶ月もしくはそれ以上の月数、または約1もしくはそれ以上の年数、およびそこで導き出せるいかなる範囲内で、PRL-1阻害剤を投与する前および/または後に投与してもよい。
本発明において、PRL-1阻害剤と癌治療との様々な組み合わせを用いることができ、PRL-1阻害剤を「A」とし、化学療法剤もしくは放射線療法剤、または任意の他の癌治療薬などの第二の薬剤を「B」とする:
本発明のPRL-1阻害剤の患者への投与は、PRL-1阻害剤治療の毒性があれば、それを考慮に入れて、その特定の第二の療法を投与するための一般的プロトコルに従うことになる。治療周期は必要に応じて繰り返すことが予想される。本発明において用いる組成物は、被検者に一回または複数回投与してもよい。化学療法、放射線療法、ならびに外科的介入などの様々な癌治療を、前述の膵臓癌治療との組み合わせで適用しうることも企図される。
本発明のPRL-1阻害剤の患者への投与は、PRL-1阻害剤治療の毒性があれば、それを考慮に入れて、その特定の第二の療法を投与するための一般的プロトコルに従うことになる。治療周期は必要に応じて繰り返すことが予想される。本発明において用いる組成物は、被検者に一回または複数回投与してもよい。化学療法、放射線療法、ならびに外科的介入などの様々な癌治療を、前述の膵臓癌治療との組み合わせで適用しうることも企図される。
2. 抗癌療法
本発明と共に用いることが企図される「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させ、癌細胞でアポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖速度を低下させ、転移の発生率もしくは数を低下させ、腫瘍サイズを縮小し、腫瘍の増殖を阻害し、腫瘍もしくは癌細胞への血液供給を減らし、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を防止もしくは阻害し、または癌を有する被検者の寿命を延長することにより、被検者の癌に負の影響をおよぼすことができると思われる。抗癌剤には、生物学的薬剤(生物療法)、化学療法剤、および放射線療法剤が含まれる。化学療法と生物療法との組み合わせは生物化学療法として知られている。
本発明と共に用いることが企図される「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させ、癌細胞でアポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖速度を低下させ、転移の発生率もしくは数を低下させ、腫瘍サイズを縮小し、腫瘍の増殖を阻害し、腫瘍もしくは癌細胞への血液供給を減らし、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を防止もしくは阻害し、または癌を有する被検者の寿命を延長することにより、被検者の癌に負の影響をおよぼすことができると思われる。抗癌剤には、生物学的薬剤(生物療法)、化学療法剤、および放射線療法剤が含まれる。化学療法と生物療法との組み合わせは生物化学療法として知られている。
本発明において、PRL-1活性を阻害する組成物および抗癌剤を、細胞を死滅させる、またはその増殖を阻害するために有効な、組み合わせた量で提供することになる。この方法は、細胞をPRL-1阻害剤および薬剤または因子に同時に接触させる段階を含みうる。これは、細胞を、PRL-1阻害剤および他の薬剤の両方を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤と接触させることにより、または細胞を、一つの組成物がPRL-1阻害剤を含み、他方が第二の薬剤を含む、二つの別の組成物もしくは製剤と接触させることにより達成することができる。
a. 化学療法
本発明において、PRL-1阻害剤を化学療法剤との組み合わせで用いうることも企図される。そのような化学療法剤には、例えば、シスプラチン(SDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質転移酵素阻害剤、トランスプラチナム、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、テマゾロミド(DTICの水性型)、またはそのいかなる類縁体もしくは誘導体も含まれうる。膵臓癌を治療するために現在用いられている化学療法剤の一例は、ゲムシタビンである。他の試験は進行性膵臓癌の治療のために高用量の5-フルオロウラシル(5-FU)を用いている。
本発明において、PRL-1阻害剤を化学療法剤との組み合わせで用いうることも企図される。そのような化学療法剤には、例えば、シスプラチン(SDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質転移酵素阻害剤、トランスプラチナム、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、テマゾロミド(DTICの水性型)、またはそのいかなる類縁体もしくは誘導体も含まれうる。膵臓癌を治療するために現在用いられている化学療法剤の一例は、ゲムシタビンである。他の試験は進行性膵臓癌の治療のために高用量の5-フルオロウラシル(5-FU)を用いている。
PRL-1阻害剤は、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤などの他の化学療法剤との組み合わせで用いることもできる。そのような阻害剤には適当に、イマチニブまたはイマチニブメシレート(STI-571、登録商標Gleevec;Norvartis, Inc.,)、OSI-774(登録商標Tarceva;OSI Pharmaceuticals, Inc.,)、ZD-1839(登録商標Iressa);AstraZeneca, Inc.,)、SU-101(Sugen, Inc.,)およびCP-701(Cephalon, Inc.,)が含まれうる。
b. 放射線療法
癌を治療するために、本発明のPRL-1阻害剤と共に用いることができるもう一つの療法は放射線療法である。本発明において用いることができる放射線療法の因子は、γ線、X線、および/または放射性同位体の腫瘍細胞への直接送達などの、DNA損傷を引き起こし、広範に用いられてきた因子であることが企図される。マイクロ波およびUV照射などの、DNA損傷因子の他の形も企図される。これらの因子はすべて、DNA、DNA前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の構築および維持に対して広範な損傷を与えると考えられる。X線の用量範囲は、1日用量50から200レントゲンを長期間(3から4wk)から、1回用量2000から6000レントゲンまでの範囲である。放射性同位体の用量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、ならびに癌または腫瘍細胞による取り込みに依存する。
癌を治療するために、本発明のPRL-1阻害剤と共に用いることができるもう一つの療法は放射線療法である。本発明において用いることができる放射線療法の因子は、γ線、X線、および/または放射性同位体の腫瘍細胞への直接送達などの、DNA損傷を引き起こし、広範に用いられてきた因子であることが企図される。マイクロ波およびUV照射などの、DNA損傷因子の他の形も企図される。これらの因子はすべて、DNA、DNA前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の構築および維持に対して広範な損傷を与えると考えられる。X線の用量範囲は、1日用量50から200レントゲンを長期間(3から4wk)から、1回用量2000から6000レントゲンまでの範囲である。放射性同位体の用量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、ならびに癌または腫瘍細胞による取り込みに依存する。
c. 免疫療法
本発明は、PRL-1阻害剤と組み合わせての免疫療法の使用も企図する。免疫療法は一般に、免疫効果細胞および癌細胞を標的として破壊する分子の使用に頼っている。免疫効果器は、例えば、腫瘍細胞の表面上のマーカーに対して特異的な抗体でありうる。抗体は単独で治療の効果器として役立つこともあり、または殺細胞を実際に行うために他の細胞を動員することもある。抗体は薬物または毒素(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)に結合されていてもよく、単に標的指向物質としても役立つ。または、効果器は、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。様々な効果細胞には、細胞毒性T細胞およびNK細胞が含まれる。治療法の組み合わせ、すなわちPRL-1発現または活性の阻害または低下は、膵臓癌などの癌の治療において、治療上の利益を提供する。
本発明は、PRL-1阻害剤と組み合わせての免疫療法の使用も企図する。免疫療法は一般に、免疫効果細胞および癌細胞を標的として破壊する分子の使用に頼っている。免疫効果器は、例えば、腫瘍細胞の表面上のマーカーに対して特異的な抗体でありうる。抗体は単独で治療の効果器として役立つこともあり、または殺細胞を実際に行うために他の細胞を動員することもある。抗体は薬物または毒素(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)に結合されていてもよく、単に標的指向物質としても役立つ。または、効果器は、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。様々な効果細胞には、細胞毒性T細胞およびNK細胞が含まれる。治療法の組み合わせ、すなわちPRL-1発現または活性の阻害または低下は、膵臓癌などの癌の治療において、治療上の利益を提供する。
免疫療法は、併用療法の一部として用いることもできる。併用療法の一般的アプローチを本明細書において論じる。免疫療法の一つの局面において、腫瘍細胞は標的指向するのに適したマーカー、すなわち他の細胞の大多数には存在しないマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーがあり、これらのいずれかが本発明の状況における標的指向に適していると考えられる。膵臓癌でアップレギュレートされることが判明している一般的腫瘍マーカーには、癌胎児抗原、CA 27-29抗原、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、CA 125抗原、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)が含まれるが、これらに限定されることはない。
本発明のPRL-1阻害剤と共に用いることができる他の型の免疫療法は、受動的および能動的免疫療法である。
癌の受動的免疫療法のためにいくつかの異なるアプローチがある。これらは広く下記に分類することができる:抗体単独の注入;毒素または化学療法剤と組み合わせての抗体の注入;放射性同位体と組み合わせての抗体の注入;抗イディオタイプ抗体の注入;および最後に骨髄中の腫瘍細胞の除去。二つの異なる抗原に対する複数のモノクローナル抗体、または複数の抗原特異性を持つ抗体を投与することが好ましいと考えられる。治療プロトコルは、Bajorin et al. (1988)によって記載されているとおり、リンホカインまたは他の免疫増強剤の投与を含んでいてもよい。ヒトモノクローナル抗体の発生は、当業者には公知である(Harlow and Lane, 1988参照)。
能動的免疫療法において、抗原ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、あるいは自己もしくは同種腫瘍細胞組成物または「ワクチン」を、一般には別の細菌アジュバントと共に投与する(Ravindranath and Morton, 1991; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993)。
d. 遺伝子療法
本発明は、PRL-1阻害剤療法と組み合わせての遺伝子療法も企図する。ヒト癌の大多数がそうであるように、膵臓の腺腫において役割を果たす多くの遺伝子変化が同定されている。これらには、腫瘍抑制遺伝子p53、Rb、pl6、BRCA2およびDPC4における突然変異が含まれる。K-ras、HER-2/neu、NFkappaBおよびAKT2を含むいくつかの活性化癌遺伝子も、膵臓癌に寄与しているとして同定されている。もちろん、膵臓癌の発症および進行に寄与する多くの他の遺伝的欠陥があり、これらの突然変異体および欠陥の特定の結果を同定することは、この疾患をどのように治療するかについてのより良い理解につながることになる。遺伝子療法は、本発明の阻害剤の有効性をさらに改善するために、化学および放射線療法と組み合わせてもよい。例えば、単純ヘルペス-チミジンキナーゼ(HS-tK)遺伝子は、レトロウイルスベクターシステムにより脳腫瘍に送達した場合に、抗ウイルス薬ガンシクロビルに対する感受性をうまく誘導した(Culver et al., 1992)。
本発明は、PRL-1阻害剤療法と組み合わせての遺伝子療法も企図する。ヒト癌の大多数がそうであるように、膵臓の腺腫において役割を果たす多くの遺伝子変化が同定されている。これらには、腫瘍抑制遺伝子p53、Rb、pl6、BRCA2およびDPC4における突然変異が含まれる。K-ras、HER-2/neu、NFkappaBおよびAKT2を含むいくつかの活性化癌遺伝子も、膵臓癌に寄与しているとして同定されている。もちろん、膵臓癌の発症および進行に寄与する多くの他の遺伝的欠陥があり、これらの突然変異体および欠陥の特定の結果を同定することは、この疾患をどのように治療するかについてのより良い理解につながることになる。遺伝子療法は、本発明の阻害剤の有効性をさらに改善するために、化学および放射線療法と組み合わせてもよい。例えば、単純ヘルペス-チミジンキナーゼ(HS-tK)遺伝子は、レトロウイルスベクターシステムにより脳腫瘍に送達した場合に、抗ウイルス薬ガンシクロビルに対する感受性をうまく誘導した(Culver et al., 1992)。
腫瘍抑制遺伝子などの細胞増殖の阻害剤を、本発明のPRL-1阻害剤と共に用いてもよい。腫瘍抑制癌遺伝子は過剰な細胞増殖を阻害するよう機能する。これらの遺伝子の不活化はその阻害活性を破壊し、無秩序な増殖をきたす。膵臓癌などの癌を治療する際に、腫瘍抑制遺伝子p53、pl6、Rb、およびMMAC1/PTENを本発明のPRL-1阻害剤と共に用いてもよい。本発明のPRL-1阻害剤と共に用いることができる他の遺伝子には、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/pl6融合体、p21/p27融合体、抗血栓遺伝子(例えば、COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管形成に関与している遺伝子(例えば、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはそれらの受容体)およびMCCが含まれる。これらの遺伝子は本明細書に例として提供するもので、限定を意味するものではない。
アポトーシスまたはプログラム細胞死を調節する遺伝子も、膵臓癌を治療する際に、本発明のPRL-1阻害剤と共に用いることができる。アポトーシス、またはプログラム細胞死は、正常な胚発生にとって必須のプロセスであり、成人の組織におけるホメオスタシスを維持し、発癌を抑制する(Kerr et al., 1972)。タンパク質のBcl-2ファミリーは、当技術分野において、多くのシステムにおけるアポトーシスの重要な調節物質および効果器であることが示されている。このファミリーのいくつかのメンバー、例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiriは、細胞死を促進することが知られており、したがって本発明のPRL-1阻害剤と共に用いることができる。
e. ホルモン療法
ホルモン療法も本発明のPRL-1阻害剤と共に、または本明細書に記載のいかなる他の癌治療と組み合わせても用いることができる。ホルモンの使用は、腫瘍細胞の増殖において役割を果たしていると思われる特定のホルモンのレベルを低下させる、または効果を阻止するために用いることができる。この治療は、治療の選択肢として、または乳癌、前立腺癌、卵巣癌、もしくは子宮頸癌を含むが、これらに限定されることはない、癌の転移のリスクを下げるために、少なくとも一つの他の癌治療との組み合わせで用いることが多い。
ホルモン療法も本発明のPRL-1阻害剤と共に、または本明細書に記載のいかなる他の癌治療と組み合わせても用いることができる。ホルモンの使用は、腫瘍細胞の増殖において役割を果たしていると思われる特定のホルモンのレベルを低下させる、または効果を阻止するために用いることができる。この治療は、治療の選択肢として、または乳癌、前立腺癌、卵巣癌、もしくは子宮頸癌を含むが、これらに限定されることはない、癌の転移のリスクを下げるために、少なくとも一つの他の癌治療との組み合わせで用いることが多い。
f. 手術
本発明は、手術と共に用いてもよい。手術は、放射線療法および化学療法などの、本明細書に記載の他の癌治療のいずれかと組み合わせて用いることもできる。
本発明は、手術と共に用いてもよい。手術は、放射線療法および化学療法などの、本明細書に記載の他の癌治療のいずれかと組み合わせて用いることもできる。
手術は膵臓の全部または一部を摘出するために用いることができる。手術の程度は、腫瘍の位置およびサイズ、病期、ならびに患者の全身の健康に依存する。手術は様々な方法を用いることができる。膵臓癌を治療するために用いることができる手術法の一つのタイプはホイップル法である。この方法において、腫瘍が膵臓の頭部(最も幅が広い部分)にある場合、外科医は膵臓の頭部ならびに小腸、胆管、および胃の一部を摘出する。外科医は他の周辺組織も摘出することがある。もう一つの手術法は、腫瘍が膵臓の主要部および尾部のいずれかにある場合、これらの部位を摘出する、遠位膵切除術である。膵臓全部、小腸の一部、胃の一部、総胆管、胆嚢、脾臓、および周辺のリンパ節を摘出する、全膵切除術も実施することができる。
G. 実施例
下記の実施例は本発明の好ましい態様を示すために含まれる。当業者であれば、下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施においてうまく機能するよう、発明者らが見いだした技術であり、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると考えられることを理解すべきである。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の態様において多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果が得られることを理解すべきである。
下記の実施例は本発明の好ましい態様を示すために含まれる。当業者であれば、下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施においてうまく機能するよう、発明者らが見いだした技術であり、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると考えられることを理解すべきである。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の態様において多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果が得られることを理解すべきである。
実施例1
材料と方法
マイクロアレイ試料の調製とハイブリダイゼーション。本試験で用いたcDNAマイクロアレイスライドを、Arizona Cancer Center(Calaluce et al., 2001)のマイクロアレイ中心施設で作製した。簡単に言うと、各スライドは4つのブロックに分かれた5760個のスポットを有し、それぞれMesembryanthemum crystallinum由来の8つの同じアイスプラント遺伝子と、データ正規化のための標準として23の異なるハウスキーピング遺伝子とを含む。各スライドは5289の独特のヒトcDNA配列を有していた。ポリ(A)+ RNAを細胞ペレットから、FastTrack 2.0キット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を製造者の説明マニュアルどおりに用いて単離した。正常な膵臓ポリ(A)+ RNAを、Clontech Laboratories(Palo Alto, CA)から購入した全RNAから、Oligotex Direct mRNAキット(Qiagen, Inc., Valencia, CA)を用いて単離した。この「正常な膵臓」は、2人の18歳および40歳男性によって供与された2つの組織標本のプールで構成されていた。cDNAプローブの標識および精製は、MICROMAX direct cDNAマイクロアレイシステム(NEN Life Science Products, Boston, MA)を用いて実施した。それぞれの標識にポリ(A)+ RNA試料2から4μgを用いた。各膵臓細胞株のためのプローブをシアニン5(Cy5)で標識し、HeLa細胞のためのプローブをシアニン3(Cy3)で標識した。HeLa細胞対正常な膵臓のハイブリダイゼーションのために、正常な膵臓試料をCy3で標識し、HeLa細胞試料をCy5で標識した。
材料と方法
マイクロアレイ試料の調製とハイブリダイゼーション。本試験で用いたcDNAマイクロアレイスライドを、Arizona Cancer Center(Calaluce et al., 2001)のマイクロアレイ中心施設で作製した。簡単に言うと、各スライドは4つのブロックに分かれた5760個のスポットを有し、それぞれMesembryanthemum crystallinum由来の8つの同じアイスプラント遺伝子と、データ正規化のための標準として23の異なるハウスキーピング遺伝子とを含む。各スライドは5289の独特のヒトcDNA配列を有していた。ポリ(A)+ RNAを細胞ペレットから、FastTrack 2.0キット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を製造者の説明マニュアルどおりに用いて単離した。正常な膵臓ポリ(A)+ RNAを、Clontech Laboratories(Palo Alto, CA)から購入した全RNAから、Oligotex Direct mRNAキット(Qiagen, Inc., Valencia, CA)を用いて単離した。この「正常な膵臓」は、2人の18歳および40歳男性によって供与された2つの組織標本のプールで構成されていた。cDNAプローブの標識および精製は、MICROMAX direct cDNAマイクロアレイシステム(NEN Life Science Products, Boston, MA)を用いて実施した。それぞれの標識にポリ(A)+ RNA試料2から4μgを用いた。各膵臓細胞株のためのプローブをシアニン5(Cy5)で標識し、HeLa細胞のためのプローブをシアニン3(Cy3)で標識した。HeLa細胞対正常な膵臓のハイブリダイゼーションのために、正常な膵臓試料をCy3で標識し、HeLa細胞試料をCy5で標識した。
精製したcDNAプローブを乾燥し、ハイブリダイゼーション緩衝液15μl(MICROMAX direct cDNAマイクロアレイシステムキットに含まれる)に溶解した。次いで、プローブを95℃で2分間加熱して変性し、あらかじめ変性したマイクロアレイスライドのアレイ領域に載せた。マイクロアレイスライドを22×22cmスライドカバーグラスで覆い、HybChamber(GeneMachines, San Carlos, CA)中、62℃で終夜インキュベートした。二日目に、スライドを0.5×SSC、0.01%SDS中で5min;0.06×SSC、0.01%SDS中で5min;および0.06×SSC中で2min洗浄した。最後に、スライドを500×gで1min遠心分離して乾燥し、デュアルレーザー(赤色蛍光Cy5には635nm、緑色蛍光Cy3には532nm)マイクロアレイスキャナ(GenePix 4000; Axon Instruments, Foster City, CA)で走査した。
RT-PCR
膵臓癌細胞ペレットまたは凍結膵腫瘍組織から単離した全RNA2μgを逆転写酵素反応のために用い(全量20μl)、反応をOmniscript RTキット(Qiagen, Inc.)を製造者のプロトコルどおりに用いて実施した。次いで、PCRを、逆転写酵素反応混合物2μl、15mM Mg2+を含む10×登録商標PCR緩衝液5μl、10mMデオキシヌクレオチド三リン酸混合物1μl、特定の遺伝子に対する5μM登録商標PCRプライマー対2.5μl、β-アクチンプライマー対1μl、β-アクチンコンペティマー(Ambion, Inc., Austin, TX)1μl、H2O 37μl、および5ユニット/μl Taqポリメラーゼ(Promega Corp., Madison, WI)0.5μlを混合することにより実施した。増幅サイクル(94℃で30s;56℃で345s;および72℃で1min)を29回繰り返した。個々の遺伝子の登録商標PCRプライマーを、Primer3プログラム(Rozen and Skaletsky, 2000)を用いて、約600bpの長さのDNA断片を生成するよう設計した(mRNA自体が600bp未満である場合、登録商標PCR産物を最大長で生成した)。
膵臓癌細胞ペレットまたは凍結膵腫瘍組織から単離した全RNA2μgを逆転写酵素反応のために用い(全量20μl)、反応をOmniscript RTキット(Qiagen, Inc.)を製造者のプロトコルどおりに用いて実施した。次いで、PCRを、逆転写酵素反応混合物2μl、15mM Mg2+を含む10×登録商標PCR緩衝液5μl、10mMデオキシヌクレオチド三リン酸混合物1μl、特定の遺伝子に対する5μM登録商標PCRプライマー対2.5μl、β-アクチンプライマー対1μl、β-アクチンコンペティマー(Ambion, Inc., Austin, TX)1μl、H2O 37μl、および5ユニット/μl Taqポリメラーゼ(Promega Corp., Madison, WI)0.5μlを混合することにより実施した。増幅サイクル(94℃で30s;56℃で345s;および72℃で1min)を29回繰り返した。個々の遺伝子の登録商標PCRプライマーを、Primer3プログラム(Rozen and Skaletsky, 2000)を用いて、約600bpの長さのDNA断片を生成するよう設計した(mRNA自体が600bp未満である場合、登録商標PCR産物を最大長で生成した)。
ノーザンブロット
RNA電気泳動およびZeta-Probe GT膜(Bio-Rad, Hercules, CA)への転写を、以前に記載されたとおりに行った(Calaluce et al., 2001)。32P-標識プローブを、各遺伝子のアガロースゲル精製RT-PCR産物から、RadPrime DNA Labeling System(Invitrogen)を用いて作製した。プローブハイブリダイゼーションおよびストリッピング緩衝液および条件は、膜の製造者によって提供されたとおりであった。ハイブリダイズした膜をPhosphorlmager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に曝露し、シグナルをImageQuantソフトウェアを用いて定量した。
RNA電気泳動およびZeta-Probe GT膜(Bio-Rad, Hercules, CA)への転写を、以前に記載されたとおりに行った(Calaluce et al., 2001)。32P-標識プローブを、各遺伝子のアガロースゲル精製RT-PCR産物から、RadPrime DNA Labeling System(Invitrogen)を用いて作製した。プローブハイブリダイゼーションおよびストリッピング緩衝液および条件は、膜の製造者によって提供されたとおりであった。ハイブリダイズした膜をPhosphorlmager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に曝露し、シグナルをImageQuantソフトウェアを用いて定量した。
膵臓腫瘍組織アレイ作製および免疫組織化学
University of Arizona Health Sciences CenterおよびTucson Veterans Administration Medical Centerからの42のアーカイブに保存された膵臓腫瘍症例(このうち35例は証明された導管性腺腫である)を、パラフィンブロック中に包埋されたホルマリン固定組織試料から選択する。二つの直径1.5mmコア/症例を、組織アレイヤー(Beecher Instruments, Silver Spring, MD)を用い、以前に記載された方法(Kononen et al., 1998)に従って組織マイクロアレイに再度包埋する。パラフィン包埋膵臓組織アレイの連続切片を脱パラフィンし、c-Myc(クローン9E10.3; Neo-Markers, Fremont, CA)またはRad51(Oncogene, Boston, MA)に特異的な一次抗体と反応させる。抗体をインキュベートする前に、スライドを抗原回復のために処理する。すなわち、スライドを加圧調理器でクエン酸緩衝液(0.1M、pH6.0)中25minマイクロ波処理し、次いで放冷する。スライドを抗体と共に1hインキュベートする。ビオチン化抗マウス/抗ウサギ二次抗体と、続いてストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体(DAKO, Carpinteria, CA)を適用する。ジアミノベンジジン基質を用いて着色生成物を得る。染色反応を、新生物とバックグラウンドの間質両方について、散在性か限局性かを評価し、等級(0=陰性から4+=強く陽性まで)をつける。
University of Arizona Health Sciences CenterおよびTucson Veterans Administration Medical Centerからの42のアーカイブに保存された膵臓腫瘍症例(このうち35例は証明された導管性腺腫である)を、パラフィンブロック中に包埋されたホルマリン固定組織試料から選択する。二つの直径1.5mmコア/症例を、組織アレイヤー(Beecher Instruments, Silver Spring, MD)を用い、以前に記載された方法(Kononen et al., 1998)に従って組織マイクロアレイに再度包埋する。パラフィン包埋膵臓組織アレイの連続切片を脱パラフィンし、c-Myc(クローン9E10.3; Neo-Markers, Fremont, CA)またはRad51(Oncogene, Boston, MA)に特異的な一次抗体と反応させる。抗体をインキュベートする前に、スライドを抗原回復のために処理する。すなわち、スライドを加圧調理器でクエン酸緩衝液(0.1M、pH6.0)中25minマイクロ波処理し、次いで放冷する。スライドを抗体と共に1hインキュベートする。ビオチン化抗マウス/抗ウサギ二次抗体と、続いてストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体(DAKO, Carpinteria, CA)を適用する。ジアミノベンジジン基質を用いて着色生成物を得る。染色反応を、新生物とバックグラウンドの間質両方について、散在性か限局性かを評価し、等級(0=陰性から4+=強く陽性まで)をつける。
アンチセンス実験
アンチセンス実験を実施するために、三組の細胞(5×105)を6穴プレートで10%熱不活化FCSを補足した培地1ml中、65℃で30minインキュベートし、ヌクレアーゼ活性を破壊する。次いで、これらの細胞をアンチセンス、センス、または無作為にスクランブルしたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(ODN)の存在下、または非存在下で培養する(24h)。ODN配列を登録商標GenBankデータベースの配列に対して試験する。特定の標的の翻訳開始部位を含む配列に相補的な、二つの別のアンチセンスODNを用いる。アンチセンスが標的の発現を阻害する能力を、RT-PCRおよびウェスタンブロッティング用の抗体で検証する。標的の発現がダウンレギュレートされることが確認されれば、標的の阻害の表現型の結果を下記のアッセイを用いて評価することができる。
アンチセンス実験を実施するために、三組の細胞(5×105)を6穴プレートで10%熱不活化FCSを補足した培地1ml中、65℃で30minインキュベートし、ヌクレアーゼ活性を破壊する。次いで、これらの細胞をアンチセンス、センス、または無作為にスクランブルしたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(ODN)の存在下、または非存在下で培養する(24h)。ODN配列を登録商標GenBankデータベースの配列に対して試験する。特定の標的の翻訳開始部位を含む配列に相補的な、二つの別のアンチセンスODNを用いる。アンチセンスが標的の発現を阻害する能力を、RT-PCRおよびウェスタンブロッティング用の抗体で検証する。標的の発現がダウンレギュレートされることが確認されれば、標的の阻害の表現型の結果を下記のアッセイを用いて評価することができる。
細胞増殖アッセイ
これらの細胞株による細胞増殖アッセイを実施して、細胞増殖に対する標的阻害の効果を評価する。細胞を100mm培養皿に2.0〜5.0×105細胞で播種し、37℃で終夜付着させる。付着細胞を洗浄し、無血清RPMI 1640または10%FBSを含むRPMIと共に48時間インキュベートし、その後トリプシン処理して、血球計を用いて計数する。加えて、平行実験を実施し、細胞計数の代わりに、細胞株の増殖状態をDNA含量のフローサイトメトリー分析を用いて調べる。フロー分析のために、細胞を改変Krishan法(Krishan, 1975)を用いてヨウ化プロピジウムにより染色する。すべての試料をFACSCANフローサイトメーター(Becton Dickinson)で、488nm、6mWattのパワーで操作する15mWattアルゴンイオンレーザーを用いて分析する。光電子増倍管の電圧を、それぞれの対照試料で、G0/G1を1024チャンネル表示上のチャンネル240にくるよう調節する。ヒストグラムを細胞周期区画について、CELLQUEST(Becton Dickinson)解析ソフトウェアを用いて解析する。50K事象を有するヒストグラムを収集し、区画解析の統計学的妥当性を最大にする。このフロー分析の結果により、膵臓癌細胞株の細胞周期分布の試験が可能になる。
これらの細胞株による細胞増殖アッセイを実施して、細胞増殖に対する標的阻害の効果を評価する。細胞を100mm培養皿に2.0〜5.0×105細胞で播種し、37℃で終夜付着させる。付着細胞を洗浄し、無血清RPMI 1640または10%FBSを含むRPMIと共に48時間インキュベートし、その後トリプシン処理して、血球計を用いて計数する。加えて、平行実験を実施し、細胞計数の代わりに、細胞株の増殖状態をDNA含量のフローサイトメトリー分析を用いて調べる。フロー分析のために、細胞を改変Krishan法(Krishan, 1975)を用いてヨウ化プロピジウムにより染色する。すべての試料をFACSCANフローサイトメーター(Becton Dickinson)で、488nm、6mWattのパワーで操作する15mWattアルゴンイオンレーザーを用いて分析する。光電子増倍管の電圧を、それぞれの対照試料で、G0/G1を1024チャンネル表示上のチャンネル240にくるよう調節する。ヒストグラムを細胞周期区画について、CELLQUEST(Becton Dickinson)解析ソフトウェアを用いて解析する。50K事象を有するヒストグラムを収集し、区画解析の統計学的妥当性を最大にする。このフロー分析の結果により、膵臓癌細胞株の細胞周期分布の試験が可能になる。
増殖速度の代替分析は、BrdU取り込みまたはPCNAもしくはKi67免疫染色を含むいくつかの他の技術によって推定することができるが、フロー分析は細胞周期のG1およびG2/M期ならびにS期における細胞の割合を推定できるため、これが好ましい。細胞株の増殖状態を測定することにより、標的が膵臓癌細胞の増殖調節において役割を果たすかどうかについて、よりよく理解することができる。
アポトーシスアッセイ
標的阻害前後の自発的および血清欠乏誘導性アポトーシスの測定のために、細胞を100mm培養皿に2.0〜5.0×105細胞で播種し、37℃で終夜付着させる。付着細胞を洗浄し、無血清RPMI 1640培地または10%FBSを含むRPMI 1640培地と共に48時間インキュベートし、その時点でトリプシン処理により細胞を回収する。培地中に浮遊細胞があれば取っておき、アポトーシス解析のために回収細胞と共にプールする。アネキシンVによるアッセイを用いて、アポトーシスを定量する。アポトーシス開始後、細胞はホスファチジルセリン(PS)を原形質膜の内側から細胞表面に転位させる。細胞表面に転位すれば、PSはPSに強く天然の親和性を有するタンパク質、アネキシンVのGFPまたはFITC結合体(Clontech)を用いて検出することができる。この単純なアッセイは生細胞の一段階染色法で、10分を要する。結合アネキシンVとインキュベートした後、細胞をフローサイトメトリーで分析し、標識細胞のパーセンテージを求める。
標的阻害前後の自発的および血清欠乏誘導性アポトーシスの測定のために、細胞を100mm培養皿に2.0〜5.0×105細胞で播種し、37℃で終夜付着させる。付着細胞を洗浄し、無血清RPMI 1640培地または10%FBSを含むRPMI 1640培地と共に48時間インキュベートし、その時点でトリプシン処理により細胞を回収する。培地中に浮遊細胞があれば取っておき、アポトーシス解析のために回収細胞と共にプールする。アネキシンVによるアッセイを用いて、アポトーシスを定量する。アポトーシス開始後、細胞はホスファチジルセリン(PS)を原形質膜の内側から細胞表面に転位させる。細胞表面に転位すれば、PSはPSに強く天然の親和性を有するタンパク質、アネキシンVのGFPまたはFITC結合体(Clontech)を用いて検出することができる。この単純なアッセイは生細胞の一段階染色法で、10分を要する。結合アネキシンVとインキュベートした後、細胞をフローサイトメトリーで分析し、標識細胞のパーセンテージを求める。
足場依存性細胞増殖
足場依存性増殖を評価するために、標的阻害細胞を0.3%寒天を含む低血清(2%)培地に懸濁し、0.6%寒天床上に2×104細胞/60mm皿の密度で重層する。コロニー形成を1ヶ月まで監視する。標的阻害および非阻害細胞により形成されたコロニーの数を計数し、統計学的差を比較する。標的阻害が膵臓癌細胞株の足場依存性を変える能力は、標的が膵臓癌細胞株における腫瘍形成性の促進に関与しているかどうかの良い指標である。
足場依存性増殖を評価するために、標的阻害細胞を0.3%寒天を含む低血清(2%)培地に懸濁し、0.6%寒天床上に2×104細胞/60mm皿の密度で重層する。コロニー形成を1ヶ月まで監視する。標的阻害および非阻害細胞により形成されたコロニーの数を計数し、統計学的差を比較する。標的阻害が膵臓癌細胞株の足場依存性を変える能力は、標的が膵臓癌細胞株における腫瘍形成性の促進に関与しているかどうかの良い指標である。
細胞遊走
足場依存性細胞増殖に加えて、細胞遊走の抑制における標的阻害の役割を評価することができる。複数のシグナリング経路が、方向性を持った細胞遊走において役割を果たすと考えられる。細胞遊走を、膜を通過してコラーゲンアンダーコーティングへと方向性を持って遊走する細胞の数を定量することにより評価する。簡単に言うと、1×標的阻害および非阻害細胞を、I型コラーゲンアンダーコーティング膜を含む改変Boydenチャンバー(組織培養処理、直径6.5mm、厚さ10μm、孔径8μm、登録商標Transwell;Costar Corp)に充填する。37℃で様々な時間インキュベートすることにより、細胞を膜を通過して遊走させる。膜の上面の非遊走細胞を綿棒で除去し、膜の下面に付着した遊走細胞を0.1Mホウ酸塩、pH9.0、および2%エタノール中、0.1%クリスタルバイオレットにより、室温で20分間染色する。膜ごとの遊走細胞数を、倒立顕微鏡で40×対物レンズを用いて計数するか、または染料を10%酢酸で溶解し、600nmの吸光度を測定して、遊走を標準曲線から計数する。標的阻害細胞と非阻害細胞との間の遊走能の差を、パーセンテージを比較することにより評価する。遊走能の低下は、標的が細胞の侵襲性において役割を果たしていることを示す。
足場依存性細胞増殖に加えて、細胞遊走の抑制における標的阻害の役割を評価することができる。複数のシグナリング経路が、方向性を持った細胞遊走において役割を果たすと考えられる。細胞遊走を、膜を通過してコラーゲンアンダーコーティングへと方向性を持って遊走する細胞の数を定量することにより評価する。簡単に言うと、1×標的阻害および非阻害細胞を、I型コラーゲンアンダーコーティング膜を含む改変Boydenチャンバー(組織培養処理、直径6.5mm、厚さ10μm、孔径8μm、登録商標Transwell;Costar Corp)に充填する。37℃で様々な時間インキュベートすることにより、細胞を膜を通過して遊走させる。膜の上面の非遊走細胞を綿棒で除去し、膜の下面に付着した遊走細胞を0.1Mホウ酸塩、pH9.0、および2%エタノール中、0.1%クリスタルバイオレットにより、室温で20分間染色する。膜ごとの遊走細胞数を、倒立顕微鏡で40×対物レンズを用いて計数するか、または染料を10%酢酸で溶解し、600nmの吸光度を測定して、遊走を標準曲線から計数する。標的阻害細胞と非阻害細胞との間の遊走能の差を、パーセンテージを比較することにより評価する。遊走能の低下は、標的が細胞の侵襲性において役割を果たしていることを示す。
遺伝子発現パターンの解析
凍結膵臓癌標本から、凍結組織切片を作製し、元の病理学的報告とは無関係に検査することができる。全RNAを、標準的Triazol RNA単離プロトコル(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を用いて、75%を越える新生物細胞を含む組織ブロックから抽出する。RNAの量と品質を1%ホルムアミドアガロースゲル上での電気泳動によりチェックする。正常組織RNA試料はClontech(Palo Alto, CA)から入手可能である。RNAを逆転写により標識し、新しい10,000遺伝子チップへのアレイハイブリダイゼーションを前述のとおりに実施する。解析後、凍結組織からの遺伝子発現パターンを、細胞株からのものと比較し、顕著な差および新しい標的候補を探す。
凍結膵臓癌標本から、凍結組織切片を作製し、元の病理学的報告とは無関係に検査することができる。全RNAを、標準的Triazol RNA単離プロトコル(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を用いて、75%を越える新生物細胞を含む組織ブロックから抽出する。RNAの量と品質を1%ホルムアミドアガロースゲル上での電気泳動によりチェックする。正常組織RNA試料はClontech(Palo Alto, CA)から入手可能である。RNAを逆転写により標識し、新しい10,000遺伝子チップへのアレイハイブリダイゼーションを前述のとおりに実施する。解析後、凍結組織からの遺伝子発現パターンを、細胞株からのものと比較し、顕著な差および新しい標的候補を探す。
実施例2
マイクロアレイ解析
膵臓癌細胞株からの遺伝子の遺伝子発現パターンを解析し、正常膵臓細胞における遺伝子発現と比較した。用いた戦略を図1に示す。膵臓癌細胞株における遺伝子発現を正常な膵臓と直接比較する代わりに、汎用標準RNA(Hela細胞RNA)を用いて、癌細胞株および正常な膵臓の両方にハイブリダイズした。次いで、図1に示すとおり、標準からの比率データを用いて、遺伝子発現比率を計算した。標準は対照RNA(正常な膵臓)が限られている場合に、複数のハイブリダイゼーションの比較ができるため、この解析では標準を用いた。
マイクロアレイ解析
膵臓癌細胞株からの遺伝子の遺伝子発現パターンを解析し、正常膵臓細胞における遺伝子発現と比較した。用いた戦略を図1に示す。膵臓癌細胞株における遺伝子発現を正常な膵臓と直接比較する代わりに、汎用標準RNA(Hela細胞RNA)を用いて、癌細胞株および正常な膵臓の両方にハイブリダイズした。次いで、図1に示すとおり、標準からの比率データを用いて、遺伝子発現比率を計算した。標準は対照RNA(正常な膵臓)が限られている場合に、複数のハイブリダイゼーションの比較ができるため、この解析では標準を用いた。
実施例3
BXPC-3膵臓癌細胞株からの発現生成物のハイブリダイゼーション
図2は、標準RNAにハイブリダイズした膵臓癌細胞株からの代表的アレイハイブリダイゼーションを示している。今日まで、いくつかの異なる膵臓癌細胞株からの遺伝子発現パターンが解析され、正常な膵臓の遺伝子発現パターンと比較されている。cDNAマイクロアレイ解析のためのプローブを、Cy5-dCTP(赤)存在下、各膵臓癌細胞からのポリA+ RNA 4μgから、およびCy3-dCTP(緑)存在下、Hela細胞からのポリA+ RNA 4μgからの、蛍光第一鎖cDNAを用いて作製した。次いで、二つの蛍光第一鎖cDNAを混合し、変性し、cDNAマイクロアレイスライド上の遺伝子に対する標的として用いた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階の後、定量的蛍光発光を、Gene Pix 4000A-マイクロアレイリーダー(Axon Instruments)を用いて収集し、Gene Pix 4000A関連ソフトウェアを用いて定量した。正常な膵臓RNA(Clontechから購入し、4人の異なる供与者からプールしたRNAからなる)を、Hela細胞RNAのCy5チャンネルおよび正常な膵臓のCy3チャンネルと同様に解析した。次いで、正常な膵臓に対する細胞株からの比率データを単純に倍増することにより、各細胞株を正常な膵臓と比較した。次いで、各遺伝子の遺伝子発現比率データを解析し、遺伝子発現において顕著な変化を示す遺伝子を95%信頼区間解析を用いて同定した。次いで、階層クラスター分析を用いて、類似の発現パターンを有する遺伝子をグループに分けた。この分析から、膵臓癌細胞株から438遺伝子を著しくダウンレギュレートされたとして同定し、68遺伝子は著しくアップレギュレートされた。68のアップレギュレートされた遺伝子を、薬物標的としての適性についてさらにスクリーニングした。公知および非公知両方の遺伝子を含む、これらの過剰発現遺伝子50のリストを表1に示す。cDNAマイクロアレイにより同定された標的として可能性があるものの例には、チロシンホスファターゼ1(PRL-1)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)およびその受容体(uPAR)、オーロラキナーゼ、CDC28プロテインキナーゼ2、CDC25Bならびに5'-ヌクレオチダーゼが含まれる。
BXPC-3膵臓癌細胞株からの発現生成物のハイブリダイゼーション
図2は、標準RNAにハイブリダイズした膵臓癌細胞株からの代表的アレイハイブリダイゼーションを示している。今日まで、いくつかの異なる膵臓癌細胞株からの遺伝子発現パターンが解析され、正常な膵臓の遺伝子発現パターンと比較されている。cDNAマイクロアレイ解析のためのプローブを、Cy5-dCTP(赤)存在下、各膵臓癌細胞からのポリA+ RNA 4μgから、およびCy3-dCTP(緑)存在下、Hela細胞からのポリA+ RNA 4μgからの、蛍光第一鎖cDNAを用いて作製した。次いで、二つの蛍光第一鎖cDNAを混合し、変性し、cDNAマイクロアレイスライド上の遺伝子に対する標的として用いた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階の後、定量的蛍光発光を、Gene Pix 4000A-マイクロアレイリーダー(Axon Instruments)を用いて収集し、Gene Pix 4000A関連ソフトウェアを用いて定量した。正常な膵臓RNA(Clontechから購入し、4人の異なる供与者からプールしたRNAからなる)を、Hela細胞RNAのCy5チャンネルおよび正常な膵臓のCy3チャンネルと同様に解析した。次いで、正常な膵臓に対する細胞株からの比率データを単純に倍増することにより、各細胞株を正常な膵臓と比較した。次いで、各遺伝子の遺伝子発現比率データを解析し、遺伝子発現において顕著な変化を示す遺伝子を95%信頼区間解析を用いて同定した。次いで、階層クラスター分析を用いて、類似の発現パターンを有する遺伝子をグループに分けた。この分析から、膵臓癌細胞株から438遺伝子を著しくダウンレギュレートされたとして同定し、68遺伝子は著しくアップレギュレートされた。68のアップレギュレートされた遺伝子を、薬物標的としての適性についてさらにスクリーニングした。公知および非公知両方の遺伝子を含む、これらの過剰発現遺伝子50のリストを表1に示す。cDNAマイクロアレイにより同定された標的として可能性があるものの例には、チロシンホスファターゼ1(PRL-1)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)およびその受容体(uPAR)、オーロラキナーゼ、CDC28プロテインキナーゼ2、CDC25Bならびに5'-ヌクレオチダーゼが含まれる。
実施例4
膵臓細胞株および腫瘍におけるPRL-1の過剰発現
膵臓癌細胞株におけるこれらの過剰発現遺伝子の発現パターンをさらに解析および確認するために、RT-PCRおよびノーザンブロッティングを用いて、各遺伝子を個々に調べた。図3Aは、膵臓癌細胞と正常な膵臓で過剰発現している遺伝子のいくつかのRT-PCR分析からの代表的データを示している。
膵臓細胞株および腫瘍におけるPRL-1の過剰発現
膵臓癌細胞株におけるこれらの過剰発現遺伝子の発現パターンをさらに解析および確認するために、RT-PCRおよびノーザンブロッティングを用いて、各遺伝子を個々に調べた。図3Aは、膵臓癌細胞と正常な膵臓で過剰発現している遺伝子のいくつかのRT-PCR分析からの代表的データを示している。
PRL-1は、最も一貫して顕著な過剰発現を示す遺伝子の一つであることが判明した(表2;図3B)。PRL-1は6つの細胞株で過剰発現し、その比率は3.3から9.5の範囲である。他の3つの細胞株は、そのマイクロアレイハイブリダイゼーションが品質管理を通過しなかったため、発現比率が記録されなかった。図3Cは、正常な膵臓と比べてのいくつかの患者腫瘍試料におけるPRL-1の過剰発現を示している。RT-PCRおよびノーザンブロッティングからの結果より、マイクロアレイ解析からの遺伝子過剰発現が確認され、両方のデータ群は異なる細胞株の発現レベルの差に関して良好な相関を示している。
実施例5
膵臓癌組織アレイ
膵臓癌細胞株における標的遺伝子の過剰発現の確認に加えて、膵臓癌患者から採取した腫瘍における特定の遺伝子産物発現の評価を可能にする組織アレイを作製した(図4参照)。アレイ化のための元の膵臓癌組織の採取を、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍および正常組織ブロックの形態学的代表領域から実施した。コア組織生検材料(直径0.6mm、高さ3〜4mm)を個々の「供与」ブロックから採り、組織マイクロアレイ化機器(Beecher Instruments)を用いて新しい「受容」パラフィンブロック(45×20mm)中にアレイ化した。平均で、一つの腫瘍組織マイクロアレイブロックから200切片を切り出すことができる。組織学的検証のためのHE-染色をブロックから切断した50番目の切片ごとに実施する(図4)。いったん作製すれば、組織マイクロアレイスライドを目的のタンパク質に対する抗体で免疫組織化学を用いて染色し、手動または高処理量ディジタル撮像システムを用いて評価した。この組織アレイシステムは、可能性のある標的遺伝子の発現を速やかに確認し、いくつかの患者腫瘍の発現頻度を解析するための能力を大幅に増強する。
膵臓癌組織アレイ
膵臓癌細胞株における標的遺伝子の過剰発現の確認に加えて、膵臓癌患者から採取した腫瘍における特定の遺伝子産物発現の評価を可能にする組織アレイを作製した(図4参照)。アレイ化のための元の膵臓癌組織の採取を、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍および正常組織ブロックの形態学的代表領域から実施した。コア組織生検材料(直径0.6mm、高さ3〜4mm)を個々の「供与」ブロックから採り、組織マイクロアレイ化機器(Beecher Instruments)を用いて新しい「受容」パラフィンブロック(45×20mm)中にアレイ化した。平均で、一つの腫瘍組織マイクロアレイブロックから200切片を切り出すことができる。組織学的検証のためのHE-染色をブロックから切断した50番目の切片ごとに実施する(図4)。いったん作製すれば、組織マイクロアレイスライドを目的のタンパク質に対する抗体で免疫組織化学を用いて染色し、手動または高処理量ディジタル撮像システムを用いて評価した。この組織アレイシステムは、可能性のある標的遺伝子の発現を速やかに確認し、いくつかの患者腫瘍の発現頻度を解析するための能力を大幅に増強する。
実施例6
膵臓癌細胞増殖の阻害に対するアンチセンスPRL-1の効果
膵臓癌細胞増殖に対するPRL-1阻害の効果を調べるために、アンチセンスオリゴヌクレオチド試験を行った。PRL-1 mRNAの異なる領域を標的とするために、4つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドの一つ、AS-Prl-1Cは、処理24時間以内にmRNAレベルを90%以上低下させ(図5A)、したがってその後の試験で用いるために選んだ。Mia PaCa-2細胞の200nM As-Prl-1Cまたは対応するスクランブルによる時間経過処理を行い、PRL-1 mRNAレベルの変化、細胞周期分布、およびアポトーシス群を調べた。PRL-1 mRNAレベルは、AS-Prl-1C処理の24時間後に最低レベル(対照の約5%)まで低下した(図5B)。Mia PaCa-2細胞のPRL-1アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、細胞周期G0/G1期における細胞増殖の停止を引き起こした。処理の24時間後、細胞の85%はG0/G1期にあり、細胞の3%はS期にあったが、これに対してスクランブルオリゴヌクレオチド処理試料では60%がG0/G1期、19%がS期にあった(図5C)。PRL-1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理は、Mia PaCa-2細胞でアポトーシスも誘導した。AS-Prl-1C処理の12時間後、アポトーシス細胞の数は、スクランブルオリゴヌクレオチド対照における5%未満に比べて、40%まで劇的に増加した(図5D)。これらの結果より、PRL-1は細胞周期調節において役割を果たし、PRL-1の阻害は腫瘍細胞でアポトーシスを誘導することが示された。
膵臓癌細胞増殖の阻害に対するアンチセンスPRL-1の効果
膵臓癌細胞増殖に対するPRL-1阻害の効果を調べるために、アンチセンスオリゴヌクレオチド試験を行った。PRL-1 mRNAの異なる領域を標的とするために、4つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドの一つ、AS-Prl-1Cは、処理24時間以内にmRNAレベルを90%以上低下させ(図5A)、したがってその後の試験で用いるために選んだ。Mia PaCa-2細胞の200nM As-Prl-1Cまたは対応するスクランブルによる時間経過処理を行い、PRL-1 mRNAレベルの変化、細胞周期分布、およびアポトーシス群を調べた。PRL-1 mRNAレベルは、AS-Prl-1C処理の24時間後に最低レベル(対照の約5%)まで低下した(図5B)。Mia PaCa-2細胞のPRL-1アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、細胞周期G0/G1期における細胞増殖の停止を引き起こした。処理の24時間後、細胞の85%はG0/G1期にあり、細胞の3%はS期にあったが、これに対してスクランブルオリゴヌクレオチド処理試料では60%がG0/G1期、19%がS期にあった(図5C)。PRL-1アンチセンスオリゴヌクレオチド処理は、Mia PaCa-2細胞でアポトーシスも誘導した。AS-Prl-1C処理の12時間後、アポトーシス細胞の数は、スクランブルオリゴヌクレオチド対照における5%未満に比べて、40%まで劇的に増加した(図5D)。これらの結果より、PRL-1は細胞周期調節において役割を果たし、PRL-1の阻害は腫瘍細胞でアポトーシスを誘導することが示された。
実施例7
膵臓癌細胞増殖の阻害に対するsiRNA複合体の効果
膵臓癌細胞においてPRL-1発現を抑制するために、短鎖干渉RNA(siRNA)も用いられている。本発明において、二本鎖siRNA複合体を、下記のガイドラインを用いて設計する:(1)二本鎖RNA複合体は21-ヌクレオチドセンスおよび21-ヌクレオチドアンチセンス鎖からなり、いずれも2-ヌクレオチド3'オーバーハング、すなわち、19ヌクレオチド相補領域を有する;(2)mRNAのコーディング領域において、G:C比が可能な限り50%に近い、好ましくは約60%から約40%の範囲内、または約70%から約30%の範囲内の21ヌクレオチド配列を選択する;(3)好ましくは、AUG開始コドンの約75ヌクレオチド以内、または停止コドンの約75ヌクレオチド以内の領域は避ける;(4)ポリG配列は過剰にスタッキングし、凝集するため、好ましくは、列に4つ以上のグアノシンは避ける;(5)AAで始まる配列により、ヌクレアーゼに抵抗性である可能性のあるdTdTオーバーハングを有するsiRNWAが得られるため、好ましくはそのような配列を選ぶ;(6)類似の配列による望ましくない遺伝子のサイレンシングを防ぐため、好ましくは、配列は他の遺伝子と相同ではない。陰性対照を含むこともでき、そのような陰性対照は試験siRNAと同じヌクレオチド配列であるが、いかなる他の遺伝子に対しても相同性がないよう、スクランブルすることが適当である。
膵臓癌細胞増殖の阻害に対するsiRNA複合体の効果
膵臓癌細胞においてPRL-1発現を抑制するために、短鎖干渉RNA(siRNA)も用いられている。本発明において、二本鎖siRNA複合体を、下記のガイドラインを用いて設計する:(1)二本鎖RNA複合体は21-ヌクレオチドセンスおよび21-ヌクレオチドアンチセンス鎖からなり、いずれも2-ヌクレオチド3'オーバーハング、すなわち、19ヌクレオチド相補領域を有する;(2)mRNAのコーディング領域において、G:C比が可能な限り50%に近い、好ましくは約60%から約40%の範囲内、または約70%から約30%の範囲内の21ヌクレオチド配列を選択する;(3)好ましくは、AUG開始コドンの約75ヌクレオチド以内、または停止コドンの約75ヌクレオチド以内の領域は避ける;(4)ポリG配列は過剰にスタッキングし、凝集するため、好ましくは、列に4つ以上のグアノシンは避ける;(5)AAで始まる配列により、ヌクレアーゼに抵抗性である可能性のあるdTdTオーバーハングを有するsiRNWAが得られるため、好ましくはそのような配列を選ぶ;(6)類似の配列による望ましくない遺伝子のサイレンシングを防ぐため、好ましくは、配列は他の遺伝子と相同ではない。陰性対照を含むこともでき、そのような陰性対照は試験siRNAと同じヌクレオチド配列であるが、いかなる他の遺伝子に対しても相同性がないよう、スクランブルすることが適当である。
PRL-1のコーディング領域由来(GenBank NM_003463[gi:17986281]由来)の、そのような21ヌクレオチド標的DNA配列、およびdTdTオーバーハング(dTは2'-デオキシチミジンである)を用いた19ヌクレオチドセンスおよびアンチセンス配列の例には、表3に記載のものが含まれるが、これらに限定されることはない:
前述のガイドラインは、適当なRNAオリゴヌクレオチドを設計する際の単なる補助であり、本発明の干渉RNAオリゴヌクレオチドおよび関連する使用法を限定するものではない。
ここまでは、PRL-1発現を未処理対照の約10%まで低下させることができる二つのsiRNA配列が同定されている(図6)。PRL-1 siRNA処理細胞の表現型を現在試験中であるが、siRNAの効果はPRL-1アンチセンスオリゴヌクレオチドで見られたものとほぼ同等であると予想される。
実施例8
酵素アッセイを用いたPRL-1阻害剤についての化合物ライブラリのスクリーニング
二つの異なるが、相補的アプローチが、PRL-1の新規小分子量阻害剤を同定するために適用されている。一つは、PRL-1のインビトロ酵素アッセイを用いた小分子ライブラリの高処理量スクリーンである。他方は、化学構造ライブラリの仮想スクリーニングおよび先導化合物の最適化に基づく、PRL-1ホモログモデルである。
酵素アッセイを用いたPRL-1阻害剤についての化合物ライブラリのスクリーニング
二つの異なるが、相補的アプローチが、PRL-1の新規小分子量阻害剤を同定するために適用されている。一つは、PRL-1のインビトロ酵素アッセイを用いた小分子ライブラリの高処理量スクリーンである。他方は、化学構造ライブラリの仮想スクリーニングおよび先導化合物の最適化に基づく、PRL-1ホモログモデルである。
インビトロホスファターゼアッセイのためのPRL-1タンパク質を生成するために、PRL-1遺伝子をHisタグを有する発現ベクター(登録商標pcDNA 3.1、Invitrogen)にクローン化し、タンパク質をTNT結合転写および翻訳キット(Promega)を用いてインビトロで発現させた。図7は、TNT混合物中のHisタグPRL-1タンパク質のウェスタンブロット検出を示している。このPRL-1タンパク質の分子量(22kDa)は文献で報告されている値とまったく同じである。組換えPRL-1タンパク質の脱リン酸活性を確認するために、チロシンホスファターゼアッセイシステム(Promega)を用いてインビトロホスファターゼアッセイを行った。図7Bに示すとおり、透析TNT生成物20μlは、ホスファターゼ活性を対照に比べて3倍上昇させた(吸光度0.2から0.8)。二つの公知のチロシンホスファターゼ阻害剤、オルトバナジン酸ナトリウムおよびEDTAは、PRL-1に対していくらかの阻害活性を示した(図7C)。
PRL-1阻害剤について様々な化合物ライブラリをスクリーニングするために、このアッセイを最適化して用いた。図8は、NCI多様性ライブラリおよび/またはUniversity of Arizona(UA) Natural Products Libraryから同定されたいくつかの陽性ヒットの抗PRL-1活性を示している。Nanosyn CombichemライブラリおよびNCIデータベースから化合物をスクリーニングするために、DiFMUPインビトロアッセイを用いて同定された化合物には、それぞれNS 19999、NS45609、NS45336、およびNCI668394が含まれる。
実施例9
化学構造ライブラリの分子モデリングおよび仮想スクリーニング
PRL-1の三次元構造はまだ解明されていない。しかし、様々な他のホスファターゼの構造が発表されている。PRL-1が脂質ホスファターゼPTENと触媒ドメインの約70%および全体の配列の21%の同一性を有する(図9)ことを考慮して、 PTEN結晶構造に基づき、相同性モデルを構築した(図10)。
化学構造ライブラリの分子モデリングおよび仮想スクリーニング
PRL-1の三次元構造はまだ解明されていない。しかし、様々な他のホスファターゼの構造が発表されている。PRL-1が脂質ホスファターゼPTENと触媒ドメインの約70%および全体の配列の21%の同一性を有する(図9)ことを考慮して、 PTEN結晶構造に基づき、相同性モデルを構築した(図10)。
このモデルに基づき、異なる供給源からの化合物構造を活性部位にドッキングさせた。これらの構造には、NCI化学データベース、チロシンホスファターゼ(PTP)の公知の先導薬物、および両特異性ホスファターゼCdc25Bの阻害剤が含まれる。分子スプレッドシートをSybyl内で構築した。当初、仮想ドッキングに入力するために三つの別々のデータベースを作製した。合わせたデータベースから、合計49の構造的に多様な化合物をさらなるスクリーニングのために得た。PRL-1の活性部位に最良のドッキングを有する三つの化合物のドッキングモデルを図11に示している(これらの化合物の構造は表5に示している)。
NCI29209は、高処理量スクリーニングおよび分子モデリング法からPRL-1阻害剤として同定された化合物の置換6-メトキシ-キノリン類である。NCI29209化合物はNCIデータベースから得、様々な癌についてNCIの細胞株パネルで試験した。この化合物は、PRL-1阻害剤としての一連の新規化合物の設計を最適化するための先導化合物として用いられている。表4は、構造に基づくアプローチを用いて設計した一連の新規PRL-1阻害剤も示している。これらの化合物は、酵素および細胞アッセイを用いて分析中である。
表5に示すとおり、Nanosyn Combichemライブラリ化合物NS12866:[3-(ベンゾ[1、2,5]-4-スルホニル-チアジアゾール、NS12882:2-アミノ-4-トリフルオロメタンスルホニル-安息香酸を、PRL-1の相同性モデルを用いてモデリングした。FlexXドッキングに基づき、これらの化合物の結合様式を探索し、構造に基づく設計戦略を用いて一連の新規化合物を設計している(表4)。表5は、様々なライブラリをスクリーニングすることにより同定されたPRL-1阻害剤のリスト、ならびにIC50値(いくつかの化合物では>100μMであることが判明した)も示している。前述のとおり、NCIデータベースおよびNanosyn Combichemライブラリをスクリーニングすることにより、いくつかの化合物が同定されたが、LeadQuest(Tripos Inc.)およびMayBridgeライブラリのスクリーニングからはヒットは得られなかった。
実施例10
PRL-1の脂質ホスファターゼ活性
分子モデリング試験により、PRL-1は脂質ホスファターゼPTENと類似の構造を有することが判明したため、PRL-1を脂質ホスファターゼ活性について試験した。結果は興味深いものである。図12に示すとおり、PRL-1はそのPTPアーゼ活性に比べて非常に強い脂質ホスファターゼ活性を示した。最も興味深いことには、PRL-1の脂質ホスファターゼ活性は4-リン酸エステルに特異的である。PRL-1は、ホスファチジルイノシトール3,4,5-3リン酸(PI 3,4,5-P3)、PI 3,4-P2、およびPI 4,5-P2を基質として用いた場合に遊離リン酸を生じた(図12)。この活性は、イノシトール3-ホスファターゼであるPTENと異なっている。3-ホスファターゼおよび5-ホスファターゼがインスリンシグナリング経路において主要な役割を果たすことはよく知られている。PRL-1のこの4-ホスファターゼ活性の重要性は今後調べなければならない。
PRL-1の脂質ホスファターゼ活性
分子モデリング試験により、PRL-1は脂質ホスファターゼPTENと類似の構造を有することが判明したため、PRL-1を脂質ホスファターゼ活性について試験した。結果は興味深いものである。図12に示すとおり、PRL-1はそのPTPアーゼ活性に比べて非常に強い脂質ホスファターゼ活性を示した。最も興味深いことには、PRL-1の脂質ホスファターゼ活性は4-リン酸エステルに特異的である。PRL-1は、ホスファチジルイノシトール3,4,5-3リン酸(PI 3,4,5-P3)、PI 3,4-P2、およびPI 4,5-P2を基質として用いた場合に遊離リン酸を生じた(図12)。この活性は、イノシトール3-ホスファターゼであるPTENと異なっている。3-ホスファターゼおよび5-ホスファターゼがインスリンシグナリング経路において主要な役割を果たすことはよく知られている。PRL-1のこの4-ホスファターゼ活性の重要性は今後調べなければならない。
実施例11
PRL-1ホスファターゼの阻害のための類縁体
UA668394は、過去に高処理量ライブラリスクリーニングを用いてPRL-1ホスファターゼ阻害剤(IC50=7μM)として同定された。UA668394は、MTS細胞増殖アッセイを用いて、膵臓癌細胞株MiaPaca-2の増殖をIC50=1.2μMで阻害することが判明した(図13A)。より高い抗膵臓癌活性を有するPRL-1のより強力な阻害剤を得るために、UA668394の一連の類縁体を用いた(表5)。
PRL-1ホスファターゼの阻害のための類縁体
UA668394は、過去に高処理量ライブラリスクリーニングを用いてPRL-1ホスファターゼ阻害剤(IC50=7μM)として同定された。UA668394は、MTS細胞増殖アッセイを用いて、膵臓癌細胞株MiaPaca-2の増殖をIC50=1.2μMで阻害することが判明した(図13A)。より高い抗膵臓癌活性を有するPRL-1のより強力な阻害剤を得るために、UA668394の一連の類縁体を用いた(表5)。
UA668394の類縁体を同定し、合成した。膵臓癌細胞においてこれらの化合物が細胞増殖を阻害する能力を評価するために、さらなる試験を行った。膵臓癌細胞、Panc-1およびMia PaCa-2を、前述の通りUA668394-1およびUA66839-2類縁体で処理した。結果より、UA668394に比べて、UA668394-1類縁体は良好なPRL-1阻害剤であることが判明した。特に、UA668394-1(HT-8)はMiaPaCa-2およびPanc-1膵臓癌細胞に対してマイクロモルよりも低いIC50を有する(それぞれ0.5μMおよび0.7μM)(図13B)が、UA668394の同位体であるUA668394-2(HT-11)は、UA668394と非常に類似した活性を示した(MiaPaca-2細胞でIC50=2.2μM)(図13C)。フッ素または塩化物置換化合物(表5参照)は分子量を低くし、バイオアベイラビリティを高め、非特異的結合を減らすために設計したものである。すべての化合物を酵素阻害について無細胞PRL-1アッセイで評価する。
実施例12
組換えPRL-1タンパク質のNi-NTAカラムを用いた精製
インビトロPRL-1ホスファターゼアッセイのための活性PRL-1タンパク質を生成するために、InvitrogenのNi-NTA Purification System(Invitrogen)を用いて、細菌中で発現された組換えPRL-1タンパク質を精製した。
組換えPRL-1タンパク質のNi-NTAカラムを用いた精製
インビトロPRL-1ホスファターゼアッセイのための活性PRL-1タンパク質を生成するために、InvitrogenのNi-NTA Purification System(Invitrogen)を用いて、細菌中で発現された組換えPRL-1タンパク質を精製した。
発明者らはまず、PRL-1の完全長の開いた読み枠を細菌発現ベクターpProEx-HTa(Invitrogen)に、IPTG誘導性プロモーターの制御下でクローン化した。Ni-NTAシステムを用いたPRL-1の速やかな精製のために、6つのヒスチジンタグをPRL-1のC末端に付加した。発現ベクターを細菌株BL21に転写し、ウェスタンブロットを用いてPRL-1発現についてチェックした。大規模発現のために、細菌を500mlのLB培地中で対数期(OD600=0.5から0.9)まで培養し、IPTGを最終濃度1mMまで加えて4時間インキュベートすることにより、PRL-1を発現するよう誘導した。5,000rpmで5min遠心分離して細菌を回収し、Native Binding Buffer(50mM NaP04、0.5M NaCl、pH8.0、および10mMイミダゾール)中に培養液100ml中16mlで再懸濁した。次いで、1mg/mlのリゾチームを加えて超音波処理することにより、細菌細胞を溶解した。細胞溶解物を3,000gで15min遠心分離し、次いで上清をNi-NTA樹脂(Invitrogen)1.5mlをあらかじめ充填した10mlカラムに移した。カラムを60minゆっくり撹拌し、HisタグPRL-1を樹脂に結合させた。結合反応の後、カラムをNative Wash Buffer(50mM NaP04、0.5M NaCl、pH8.0、および20mMイミダゾール)で4回洗浄した。最後に、PRL-1タンパク質をNative Elution Buffer(50mM NaP04、0.5M NaCl、pH8.0、および250mMイミダゾール)10mlでカラムから溶出した。0.5mlの画分を集め、SDS-PAGEで分析した。PRL-1タンパク質を含む画分を合わせ、30%グリセロールを加えて4℃または-20℃で保存した。タンパク質の濃度を、分光光度計を用いてOD280の吸光度を測定することにより推定した。タンパク質の活性を酵素PRL-1アッセイにより評価した。
実施例13
siRNAによるPRL-1発現の阻害
PRL-1 mRNAに特異的なsiRNAオリゴヌクレオチドを用いて、PRL-1遺伝子の発現を抑制した。最大の抑制を得るために、PRL-1 mRNAの異なる領域を標的とする4つのsiRNAオリゴヌクレオチドの混合物を用いた。これらのsiRNAは、Dharmacon RNA Technologies(Lafayette, CO)により設計および合成した。それぞれのsiRNAオリゴヌクレオチド二本鎖を個々に変性し、アニーリングした後、等モルで混合してsiRNAオリゴヌクレオチドプールを生成した(SMARTPool, Dharmacon RNA Technologies)。20μMの保存溶液を調製し、-20℃で保存した。
siRNAによるPRL-1発現の阻害
PRL-1 mRNAに特異的なsiRNAオリゴヌクレオチドを用いて、PRL-1遺伝子の発現を抑制した。最大の抑制を得るために、PRL-1 mRNAの異なる領域を標的とする4つのsiRNAオリゴヌクレオチドの混合物を用いた。これらのsiRNAは、Dharmacon RNA Technologies(Lafayette, CO)により設計および合成した。それぞれのsiRNAオリゴヌクレオチド二本鎖を個々に変性し、アニーリングした後、等モルで混合してsiRNAオリゴヌクレオチドプールを生成した(SMARTPool, Dharmacon RNA Technologies)。20μMの保存溶液を調製し、-20℃で保存した。
一過性トランスフェクション法を用いて、SMARTPool siRNA混合物によるPRL-1発現の阻害を評価した。簡単に言うと、トランスフェクション当日に6穴プレートでMiaPaCa-2細胞を40〜50%コンフルエントまで培養し、Dulbeccoのリン酸緩衝化食塩水(PBS緩衝液、Cellgro, Herdon, VA)で洗浄した。用いたsiRNAオリゴヌクレオチド各100ナノモルに対し、培地1ml中にリポフェクチン試薬(Invitrogen)3μlを含むOPTI-MEMトランスフェクション培地(Introgen, Carlsbad, CA)を細胞培養プレートに加えた。次いで、siRNAオリゴヌクレオチドを最終濃度になるまで滴下した。細胞をトランスフェクション培地中で6時間インキュベートし、次いでPBSで1回洗浄した後、通常の増殖培地を加えた。細胞をトリプシン処理して回収した。siRNA処理細胞におけるPRL-1発現レベルを評価するために、全RNAを回収した細胞からSNAP RNA単離キット(Invitrogen)を用いて単離し、Omniscript RTキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてRT-PCRを実施した。内部標準とするために、各反応中でβ-アクチン転写物も増幅した。図14に示すとおり、トランスフェクション72時間後、siRNAオリゴヌクレオチドは試験した3つの濃度(図14のレーン6、7および8の50、100および200nM)すべてでPRL-1の発現を90%以上抑制した。
実施例14
PTENアッセイ
PRL-1阻害剤をさらに同定するために、University of Arizona (UA) Natural Products Libraryを実施例8および9で前述したものと同様の様式でスクリーニングした。5つのPRL-1阻害剤を追加で同定した(表6)。実施例10で述べたとおり、分子モデリング試験によりPRL-1はPTENと類似の構造を有することが判明したため、これらの化合物をPTEN活性について試験した。PTENはPI(3,4,5)P3からリン酸を切断するイノシトール3-ホスファターゼである。同定された化合物がPRL-1活性特異的で、PTEN活性は阻害しないことを確認するため、試験を実施した。したがって、PTENアッセイを基質としてマラカイトグリーンを用いて行った。マラカイトグリーンは遊離リン酸と複合体を形成することが知られている。プレートを、分光光度計を用いて630nmで測定した。図15に示すとおり、これらの化合物は、DMSO対照およびオルトバナジン酸ナトリウムNAVO4陽性対照と比べて、PTEN活性を示さなかった。
PTENアッセイ
PRL-1阻害剤をさらに同定するために、University of Arizona (UA) Natural Products Libraryを実施例8および9で前述したものと同様の様式でスクリーニングした。5つのPRL-1阻害剤を追加で同定した(表6)。実施例10で述べたとおり、分子モデリング試験によりPRL-1はPTENと類似の構造を有することが判明したため、これらの化合物をPTEN活性について試験した。PTENはPI(3,4,5)P3からリン酸を切断するイノシトール3-ホスファターゼである。同定された化合物がPRL-1活性特異的で、PTEN活性は阻害しないことを確認するため、試験を実施した。したがって、PTENアッセイを基質としてマラカイトグリーンを用いて行った。マラカイトグリーンは遊離リン酸と複合体を形成することが知られている。プレートを、分光光度計を用いて630nmで測定した。図15に示すとおり、これらの化合物は、DMSO対照およびオルトバナジン酸ナトリウムNAVO4陽性対照と比べて、PTEN活性を示さなかった。
次に、同定された化合物を、PRL-1活性を阻害する能力について試験した。UA64859、UA47548、UA63415化合物はそれぞれ76%、70%および62%PRL-1阻害活性を示した。一方、最も弱いPRL-1阻害はUA61880(50%阻害)およびUA58428(42%阻害)化合物で観察された。
実施例15
PRL-1阻害剤による細胞増殖
抗PRL-1活性陽性であると同定された化合物を、ヒト膵臓癌細胞において細胞増殖を阻害する能力について試験した。UA668394、UA19999およびUA45336(表5)の阻害活性を調べた。細胞増殖アッセイは、実施例1に示すとおり、膵臓癌細胞株Mia PaCa-2を用いて行った。簡単に言うと、2.0〜5.0×105細胞を100mm培養皿に播種し、37℃で終夜付着させた。付着細胞を洗浄し、無血清RPMI 1640または10%FBSを含むRPMIと共に48時間インキュベートし、目的化合物で処理して、細胞増殖に対するそれらの効果を評価した。例えば、細胞をUA668394、UA19999およびUA45336化合物で処理し、MTSアッセイを用いて細胞増殖の阻害を分析した。データは、UA668394化合物はUA19999またはUA45336化合物よりも細胞増殖阻害が優れていることを示している。特に、UA668394化合物で処理したMia PaCa-2細胞のIC50は1.2μMであることが判明したが、UA19999およびUA45336化合物では、IC50はそれぞれ120μMおよび95μMであった(図16A)。したがって、Mia PaCa-2膵臓癌細胞において、UA668394化合物は細胞増殖の全般的阻害において最良であることが判明した。
PRL-1阻害剤による細胞増殖
抗PRL-1活性陽性であると同定された化合物を、ヒト膵臓癌細胞において細胞増殖を阻害する能力について試験した。UA668394、UA19999およびUA45336(表5)の阻害活性を調べた。細胞増殖アッセイは、実施例1に示すとおり、膵臓癌細胞株Mia PaCa-2を用いて行った。簡単に言うと、2.0〜5.0×105細胞を100mm培養皿に播種し、37℃で終夜付着させた。付着細胞を洗浄し、無血清RPMI 1640または10%FBSを含むRPMIと共に48時間インキュベートし、目的化合物で処理して、細胞増殖に対するそれらの効果を評価した。例えば、細胞をUA668394、UA19999およびUA45336化合物で処理し、MTSアッセイを用いて細胞増殖の阻害を分析した。データは、UA668394化合物はUA19999またはUA45336化合物よりも細胞増殖阻害が優れていることを示している。特に、UA668394化合物で処理したMia PaCa-2細胞のIC50は1.2μMであることが判明したが、UA19999およびUA45336化合物では、IC50はそれぞれ120μMおよび95μMであった(図16A)。したがって、Mia PaCa-2膵臓癌細胞において、UA668394化合物は細胞増殖の全般的阻害において最良であることが判明した。
実施例16
MiaPacaヒト膵臓インビボ異種移植片モデル
ORL-1の抗腫瘍効果をMiaPacaヒト膵臓腫瘍モデルに対して評価する。MiaPaca腫瘍をヌードマウスの側腹部に皮下移植する。腫瘍があらかじめ決めた約100mm3のサイズに達したら、マウスを治療群に無作為に割り付ける。UA668394-1をIV注射により最大耐容量(MTD)、1/2 MTD、1/4 MTDで1日1回5日間投与する。平均腫瘍体積を1週間に3回測定する。腫瘍体積をキャリパー測定(mm)で楕円球のための式:L×W2/2=mm3(Lは長さ(mm)でWは幅(mm)である)を用いて求める。
この式を用い、単位密度(1mm3=1mg)を仮定して、腫瘍重量(mg)も計算する。対照群の腫瘍体積が2000mm3に達した時点で試験を停止する。各動物の腫瘍の評価サイズに達する時間を、中央の腫瘍の増殖における全般的遅延を計算するために用いる(T-C)。
MiaPacaヒト膵臓インビボ異種移植片モデル
ORL-1の抗腫瘍効果をMiaPacaヒト膵臓腫瘍モデルに対して評価する。MiaPaca腫瘍をヌードマウスの側腹部に皮下移植する。腫瘍があらかじめ決めた約100mm3のサイズに達したら、マウスを治療群に無作為に割り付ける。UA668394-1をIV注射により最大耐容量(MTD)、1/2 MTD、1/4 MTDで1日1回5日間投与する。平均腫瘍体積を1週間に3回測定する。腫瘍体積をキャリパー測定(mm)で楕円球のための式:L×W2/2=mm3(Lは長さ(mm)でWは幅(mm)である)を用いて求める。
この式を用い、単位密度(1mm3=1mg)を仮定して、腫瘍重量(mg)も計算する。対照群の腫瘍体積が2000mm3に達した時点で試験を停止する。各動物の腫瘍の評価サイズに達する時間を、中央の腫瘍の増殖における全般的遅延を計算するために用いる(T-C)。
本明細書に開示し、特許請求する、すべての組成物および/または方法および/または装置は、本開示に照らせば、過度の実験を行うことなく、製造および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および/または方法および/または装置ならびに方法の段階または一連の段階に変化を適用しうることが明らかであると思われる。特に、化学的および生理学的に関連する特定の物質を本明細書に記載の物質の代わりに用いることができる一方で、同じまたは類似の結果が得られることが明らかであると思われる。当業者には明らかである、そのような類似の代替物および改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると思われる。
下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、これらの図面の一つまたは複数を、本明細書に示す特定の態様の詳細な説明と併せて参照することにより、より良く理解することができる。
マイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングを示す図である。
5,760遺伝子チップを用いたBXPC-3膵臓癌細胞と標準HeLa細胞からの遺伝子発現のハイブリダイゼーションを示す図である。
図3A〜3Cは、マイクロアレイ解析から同定された遺伝子の過剰発現を示す図である。図3Aは、マイクロアレイ解析から同定された様々な遺伝子のRT-PCRを示す図である。図3Bは、PRL-1を過剰発現する膵臓細胞株のRT-PCRを示す図である。図3Cは、RL-1の過剰発現を示す膵臓腫瘍試料のRT-PCRを示す図である。
膵臓癌組織アレイを示す図である。薬物開発の可能性がある新しい標的の検証を助けるために、50の膵臓癌スポットおよび20の正常な膵臓スポットからなる膵臓癌組織アレイを作製した。
図5Aは、アンチセンス阻害剤AS-Prl-1CがPRL-1のmRNAレベルを低下させたことを示す図である。図5Bは、アンチセンスオリゴCがPRL-1を標的とすることを立証するリアルタイムPCRデータを示す図である。図5Cは、AS-Prl-1Cによる膵臓癌細胞(MiaPaCa-2)の治療により、細胞増殖の停止が起こることを示す図である。図5Dは、AS-Prl-1Cで治療した膵臓癌細胞(MiaPaCa-2)がアポトーシスの劇的な増加を引き起こすことを示す図である。
PRL-1発現を低下させるsiRNA配列の同定を示す図である。
図7Aは、TNT混合物中のHisタグPRL-1タンパク質のウェスタンブロット検出を示す図である。図7Bは、TNT産物がホスファターゼ活性を高めたことを示す図である。図7Cは、チロシンホスファターゼ阻害剤の阻害活性を示す図である。
阻害剤の抗PRL-1活性を示す図である。
クラスタルW整列により、PRL-1とヒトホスファターゼSHP2およびPTENとの間の配列同一性および類似性が認められることを示す図である。配列整列により、ホスファターゼドメインの活性部位に高い相同性と、活性部位以外では変動の増大が見られる。
PTENに基づくPRL-1の3Dモデルを示す図である。INSIGHT IIのモデリングソフトウェアを用いて、前述の構造整列に基づきRPL-1の相同性モデルを作製した。PRL-1相同性モデルは、高度に保存された疎水性コアであるが、活性部位の形状にいかなる大きなひずみもない、変化した特異性ポケットを示した。
RPL-1化合物のドッキングモデルを示す図である。
PRL-1の脂質ホスファターゼ活性を示す図である。
図13A〜13Cは、SRB染色アッセイを用いたPRL-1阻害剤による細胞増殖の阻害を示す図である。図13Aは、UA668394によるMiaPaCa-2細胞増殖の阻害を示す図である。SRB(スルホローダミンB)染色により、細胞を異なる用量のUA668394(0.2μMから200μM)に4日間曝露した。IC50推定値は1.2μMである。図13Bは、化合物UA66839-1類縁体による膵臓癌細胞Panc-1およびMiaPaCa-2の細胞増殖の阻害を示す図である。図13Cは、化合物UA668394-2類縁体による膵臓癌細胞Panc-1およびMiaPaCa-2の細胞増殖の阻害を示す図である。
SMARTPool siRNAによるPRL-1発現の阻害を示す図である。MiaPaCa-2細胞を、50nM(レーン1および6)、100nM(レーン2および7)、または200nM(レーン3および8)のいずれかのPRL-1 siRNAオリゴ混合物で一過性トランスフェクションを行い、トランスフェクション後48時間(レーン1、2および3)または72時間(レーン6、7および8)のいずれかで回収した。レーン4および9はそれぞれ48時間および72時間治療の対照である。レーン5および10はそれぞれ、未治療の48時間および72時間の時点での対照である。
PTENアッセイを示す図である。
UA668394化合物で治療したMiaPaCa-2細胞のIC50は1.2μMであったことを示す図である。UA19999およびUA45336化合物で治療した細胞のIC50はそれぞれ、120μMおよび95μMであった。
Claims (37)
- 被検者における膵臓癌の発生を診断または予測する方法であって:
(a)被検者から細胞を含む試料を採取する段階と;
(b)細胞試料の細胞におけるPRL-1活性または発現を評価する段階を含み、
同じタイプの正常細胞と比較した場合の細胞におけるPRL-1の活性または発現増大が、被検者が膵臓癌を有している、または膵臓癌発生のリスクが高いことを示す方法。 - 細胞が腫瘍細胞である、請求項1記載の方法。
- 評価する段階がPRL-1発現を評価する段階を含む、請求項1記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階がノーザンブロッティングを含む、請求項3記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階が定量的RT-PCRを含む、請求項3記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階がウェスタンブロッティングを含む、請求項3記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階が定量的免疫組織化学試験を含む、請求項3記載の方法。
- 評価する段階がPRL-1活性を評価する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 被検者が以前に癌の診断を受けている、請求項1記載の方法。
- 被検者が以前に癌の診断を受けたことがなく、試験の時点で癌がないと思われる、請求項1記載の方法。
- 試験後に被検者に予防的癌治療を投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 試験後に被検者に癌治療を投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 癌治療が化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法、ホルモン療法または手術である、請求項12記載の方法。
- 癌治療の有効性を予測する方法であって:
(a)癌治療を被検者に投与する段階と;
(b)被検者から腫瘍細胞を含む試料を採取する段階と;
(c)試料の腫瘍細胞におけるPRL-1活性または発現を評価する段階を含み、
治療前の同じタイプの腫瘍細胞と比較した場合の腫瘍細胞におけるPRL-1の活性または発現低下が、治療が有効であることを示す方法。 - PRL-1発現を評価する段階がPRL-1タンパク質レベルを測定する段階を含む、請求項14記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階がPRL-1転写物レベルを測定する段階を含む、請求項14記載の方法。
- 複数の時点でPRL-1活性または発現を評価する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 抗癌活性の候補化合物をスクリーニングする方法であって:
(a)細胞を提供する段階と;
(b)細胞を候補化合物と接触させる段階と;
(c)PRL-1発現または活性に対する候補化合物の効果を評価する段階を含み、
候補化合物で治療していない類似の細胞におけるPRL-1発現または活性の量と比較した場合のPRL-1発現または活性の量の低下が、候補化合物が抗癌活性を有することを示す方法。 - 候補化合物がタンパク質、核酸、または有機医薬品である、請求項18記載の方法。
- 細胞が腫瘍細胞である、請求項18記載の方法。
- 評価する段階がPRL-1発現を評価する段階を含む、請求項18記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階がノーザンブロッティングを含む、請求項21記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階が定量的RT-PCRを含む、請求項21記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階がウェスタンブロッティングを含む、請求項21記載の方法。
- PRL-1発現を評価する段階が定量的免疫組織化学試験を含む、請求項21記載の方法。
- 評価する段階がPRL-1活性を評価する段階を含む、請求項18記載の方法。
- 癌の治療法であって、それを必要としている被検者にPRL-1活性を阻害する組成物を投与する段階を含む方法。
- 化合物がPRL-1発現を阻害する、請求項27記載の方法。
- 候補化合物がタンパク質、核酸、または有機医薬品である、請求項27記載の方法。
- タンパク質がPRL-1に免疫学的に結合する抗体である、請求項29記載の方法。
- 核酸がPRL-1アンチセンス核酸、PRL-1 RNAi核酸、またはPRL-1に免疫学的に結合する一本鎖抗体をコードする抗体である、請求項29記載の方法。
- 癌が膵臓癌、白血病、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、前立腺癌、睾丸癌、胃癌、脳癌、膀胱癌、頭頸部癌、および黒色腫からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
- 被検者に第二の癌治療を投与する段階をさらに含む、請求項27記載の方法。
- 第二の癌治療が化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法、ホルモン療法または手術である、請求項33記載の方法。
- 組成物を二回以上投与する、請求項27記載の方法。
- 被検者における膵臓癌の発生を診断または予測する方法であって、被検者を細胞におけるPRL-1活性または発現について全身スキャニングにかける段階を含む方法。
- 抗癌治療を監視する方法であって、抗癌治療提供後、または提供中に、被検者の癌細胞におけるPRL-1の発現または機能を評価する段階を含む方法。
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