JP2009521474A

JP2009521474A - ＥｐｈＡ２ＢｉＴＥ分子およびその使用

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Publication number: JP2009521474A
Application number: JP2008547600A
Authority: JP
Inventors: マイケル・エス・キンチ; シャノン・ロフ; ペーター・クーファー; エリザベス・ブルックハイマー; ベルント・シュレレート; スコット・エイ・ハモンド; ラルフ・ルッタービューゼ; ピーター・エイ・キーナー; パトリック・ベウレレ; ペトラ・ルッタービューゼ
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2009-06-04
Also published as: EP1981532A2; ZA200805261B; WO2007073499A2; CN101426521A; KR20080090441A; WO2007073499A3; US20080044413A1; IL192279A0; MX2008008046A; EP1981532A4; AU2006327175A1; RU2008129827A; CA2633713A1

Abstract

本発明は、Ｔ細胞抗原ＣＤ３に免疫特異的に結合する第１の結合ドメインと、ＥｐｈＡ２受容体に免疫特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体に関する。そのような二重特異性単鎖抗体は、用語「ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ」に包含される。本発明はさらに、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害の治療、予防、および／または管理のために設計された方法および組成物に関する。そのような障害には、非限定的に、癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染が挙げられる。本発明はさらに、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチドを含むベクター、それを用いて形質転換された宿主細胞、および前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの産生へのその使用に関する。本発明は、前述のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、ポリヌクレオチド、またはベクターのうち任意のものを単独で、または１つまたは複数の予防剤もしくは治療剤と組み合わせて含む、医薬組成物などの組成物も提供する。前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥについてのスクリーニング方法、ならびに前述の組成物および診断試薬のうち任意のものを備えるキットも開示する。

Description

本出願は、２００５年１２月２１日に出願された米国仮出願第６０／７５３，３６８号の利益を主張し、その仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

１．発明の分野
本発明は、Ｔ細胞抗原ＣＤ３に免疫特異的に結合する第１の結合ドメインと、ＥｐｈＡ２受容体に免疫特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体に関する。そのような二重特異性単鎖抗体は、用語「ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ」に包含される。本発明はさらに、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害の治療、予防、および／または管理のために設計された方法および組成物に関する。そのような障害には、非限定的に、癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染が挙げられる。本発明はさらに、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチドを含むベクター、それを用いて形質転換された宿主細胞、および前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの産生へのその使用に関する。本発明は、前述のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、ポリヌクレオチド、またはベクターのうち任意のものを単独で、または１つまたは複数の予防剤または治療剤と組み合わせて含む、医薬組成物などの組成物も提供する。前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥについてのスクリーニング方法、ならびに前述の組成物および診断用試薬のうち任意のものを備えるキットも開示する。

２．発明の背景
２．１ＥｐｈＡ２
ＥｐｈＡ２は、成体の上皮に発現している１３０ｋＤａの受容体型チロシンキナーゼであり、ＥｐｈＡ２は、上皮では低レベルで見い出され、細胞間接着部位に濃縮されている（Zantek et al., 1999, Cell Growth & Differentiation 10(9):629-38; Lindberg et al., Mol. & Cell. Biol. 10:6316, 1990）。この細胞内局在化は、ＥｐｈＡ２と、隣接細胞の細胞膜にアンカーされているそのリガンド（エフリンＡ１〜Ａ５として知られている）との相互作用による接触阻止に役割を果たすと考えられている（Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90:403-04；Cheng et al., 2002, Cytokine & Growth Factor Rev. 13:75-85）。ＥｐｈＡ２とそのリガンドとの結合は、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化および続いて起こるその分解を招く（Walker-Daniels et al., 2002, Mol. Cancer. Res. 1(1):79-87；Carles-Kinch et al., 2002, Cancer Res. 62(10):2840-47）。このシグナル伝達カスケードは、細胞外マトリックス接着分子への付着の負の調節を行う下流の事象もまた開始することによって、細胞の成長および遊走を調節する（Zantek et al., 1999, Cell Growth & Differentiation 10(9):629-38；Miao et al., 2000, Nat. Cell Biol. 2(2):62-69; Zelinski et al., 2001, Cancer Res. 61(5):2301-06）。

ＥｐｈＡ２は、黒色腫、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、食道癌、子宮頚癌、肺癌、卵巣癌、および膀胱癌を含めたいくつかの異なる種類の腫瘍に過剰発現していることが示された（Carles-Kinch et al., 2002, Cancer Res. 62(10):2840-47）。最高レベルのＥｐｈＡ２発現は大部分の侵襲性細胞に見られ、これは、疾患の進行に果たすＥｐｈＡ２の役割を示唆している。高レベルのＥｐｈＡ２は、非小細胞肺癌、食道癌、子宮頚癌、および卵巣癌に関する生存率不良とも相関していた（Kinch et al., 2003, Clin. Cancer Res. 9(2):613-18；Miyazaki et al., 2003, Int. J. Cancer 103(5) 657-63；Wu et al., 2004, Gynecol. Oncol. 94(2):312-19；Thaker et al., 2004, Clin. Cancer Res. 10(15):5145-50）。追加的に、前臨床モデルでは、ＥｐｈＡ２の外因性発現が非腫瘍形成性細胞系をｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで腫瘍形成性にするのに十分であることが実証された（Zelinski et al., 2001, Cancer Res. 61(5):2301-06）。

２．２ＢｉＴＥ（登録商標）分子
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、すなわちＢｉＴＥ（登録商標）は、縦列配置された単鎖抗体に基づく二重特異性抗体の一形態である［Wolf et al., 2005, Drug Discovery Today（印刷中）に総説されている］。ＢｉＴＥ（登録商標）は、約５５ｋＤａのポリペプチド１本鎖を形成し、単量体と二量体との混合物としてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により分泌される。ＢｉＴＥ（登録商標）は、一方のアームでＴ細胞上のＴ細胞受容体のシグナル伝達複合体のタンパク質構成要素であるヒトＣＤ３のイプシロン（ε）サブユニットに結合する。ＢｉＴＥ（登録商標）は、もう一方のアームで標的細胞上の抗原を判別する。ＢｉＴＥ（登録商標）が標的細胞表面でＴ細胞に提示された場合にのみ、Ｔ細胞の活性化が見られる。

ＢｉＴＥ（登録商標）は、Ｔ細胞および標的細胞を一時的に繋ぐ。ＢｉＴＥ（登録商標）によるＴ細胞活性化は、ＣＤ６９、ＣＤ２５、および様々な細胞接着分子のアップレギュレーション、サイトカインのｄｅｎｏｖｏ発現および放出（例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０）、グランザイムおよびパーフォリンの発現のアップレギュレーション、ならびに細胞増殖を伴う。ＢｉＴＥ（登録商標）により対象を変更された（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）標的細胞の溶解は、Ｔ細胞受容体の特異性、ＭＨＣクラスＩおよびβ２ミクログロブリンの存在、ならびに任意の共刺激性刺激に依存しない。定型的なＴ細胞シグナルおよび認識分子に対するこの非依存性は、ＢｉＴＥ（登録商標）を介した定型的な細胞溶解シナプスおよび最大限の膜近接の誘導により説明することができる。ＢｉＴＥ（登録商標）に誘導されたシナプスからＣＤ４５などの負の調節タンパク質をはずすと、共刺激の必要性を緩和することができる。

以前に刺激されていない末梢ポリクローナルＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いると、ＢｉＴＥ（登録商標）は対象を変更されたｉｎｖｉｔｒｏ溶解を示す。ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞では活性は見られない。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＢｉＴＥ（登録商標）で刺激された場合に、グランザイムＢおよびパーフォリンの発現をアップレギュレーションすることにより、ＣＤ８が仲介する標的細胞の溶解の原因となることができる。ｉｎｖｉｔｒｏでは対象を変更された溶解が低ピコモル濃度で見られ、これは、Ｔ細胞の誘因となるために非常に少数のＢｉＴＥ分子が標的細胞に結合する必要があることを示唆している。ＳＣＩＤマウスモデルでは、μｇ以下の用量のＢｉＴＥ（登録商標）が、腫瘍の増殖を完全に防止すること（Dreier et al., 2003, J Immunol. 170:4397-4402）および最大２００ｍｍ^３の固形腫瘍を根絶することが示された（Schlereth et al., 2005, Cancer Res. 2005 65(7):2882-89）。

したがって、ＢｉＴＥ（登録商標）は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染）の治療、予防、および／または管理のための、ＥｐｈＡ２に対する選択的かつ効果的な抗体療法を開発する無類の機会を与える。

３．発明の概要
本発明は、ＥｐｈＡ２およびＴ細胞抗原ＣＤ３と免疫特異的に結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［すなわちＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ（特に、二重特異性単鎖抗体であるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ）］ならびにＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を治療、予防、および／または管理するためにそれを使用する方法を提供する。そのような障害には、例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染が挙げられる。一態様では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２を異常発現する細胞の除去に、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２特異性抗体よりも効率的である。特定の態様では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞（特に、ＥｐｈＡ２を発現している悪性癌細胞）の除去に、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２抗体よりも効率的である。別の態様では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２を発現している非癌性過剰増殖細胞の除去に、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２抗体よりも効率的である。なお別の態様では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２を発現している感染細胞（特に、呼吸器合胞体ウイルス「ＲＳＶ」に感染した細胞）の除去に、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２抗体よりも効率的である。別の態様では、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２特異性抗体よりも低い投与量のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を治療、予防、および／または管理するために必要である。

本発明のＥｐｈＡ２特異的二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（以下、「ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ」、「ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子」、または「ＥｐｈＡ２二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」と記す）は、Ｔ細胞抗原ＣＤ３に免疫特異的に結合する第１の結合ドメインと、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む。一実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３に免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３の任意のサブユニット（例えばγ、δ、ζ、またはηサブユニット）の１つまたは複数に免疫特異的に結合する。好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３のイプシロン（ε）サブユニットに免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３のイプシロン（ε）サブユニットがＣＤ３のδサブユニットと複合体化している場合に、前記εサブユニットに免疫特異的に結合する。別の実施形態では、ＣＤ３に結合する結合ドメインは脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅ）されている。別の特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する。好ましい実施形態では、癌の治療、予防、および／または管理に使用されるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第２の結合ドメインは、非癌細胞ではなく癌細胞上に選択的に露出および／または増加している、ＥｐｈＡ２のエピトープに免疫特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第２の結合ドメインは、非過剰増殖細胞ではなく、非癌性過剰増殖細胞上に選択的に露出および／または増加している、ＥｐｈＡ２のエピトープに免疫特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第２の結合ドメインは、非感染細胞ではなく、感染細胞上に選択的に露出および／または増加している、ＥｐｈＡ２のエピトープに免疫特異的に結合する。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、（１）Ｔ細胞抗原ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む第１の結合ドメイン、ならびに（２）ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む第２の結合ドメインを含む。特定の実施形態では、第１の結合ドメインのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、Ｔ細胞抗原ＣＤ３への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。この実施形態に加えて、そのようなリンカーは、例えば配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ_２Ｓ）_２ＧＧＡＤ（配列番号５７）を含むことがある。別の特定の実施形態では、第２の結合ドメインのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ＥｐｈＡ２への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。この実施形態に加えて、そのようなリンカーは、例えば配列（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号５９）を含むことがある。別の特定の実施形態では、第１および第２の結合ドメインは、Ｔ細胞抗原ＣＤ３およびＥｐｈＡ２への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。この実施形態に加えて、そのようなリンカーは、例えば配列Ｇ_４Ｓ（配列番号５８）を含むことがある。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）（配列番号６５）である。

直前の節での実施形態によると、結合は共有結合である。特定の実施形態では、本発明のリンカーはセリンおよびグリシン残基を含む。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのリンカー、例えばＣＤ３に結合する第１の結合ドメインのＶＨドメインとＶＬドメインとの間のリンカー、ＥｐｈＡ２に結合する第２の結合ドメインのＶＨドメインとＶＬドメインとの間のリンカー、およびＣＤ３に結合する第１の結合ドメインとＥｐｈＡ２に結合する第２の結合ドメインとの間のリンカーは、それぞれＣＤ３抗原およびＥｐｈＡ２抗原への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な任意の長さでありうる。ある実施形態では、本発明のリンカーは、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０残基、少なくとも２５残基、少なくとも３０残基以上の長さを含む。他の実施形態では、本発明のリンカーは、２〜４残基の間、２〜４残基の間、２〜６残基の間、２〜８残基の間、２〜１０残基の間、２〜１２残基の間、２〜１４残基の間、２〜１６残基の間、２〜１８残基の間、２〜２０残基の間、２〜２２残基の間、２〜２４残基の間、２〜２６残基の間、２〜２８残基の間、または２〜３０残基の間の長さを含む。ある実施形態では、第１の結合ドメインは、第２の結合ドメインの５’側である。他の実施形態では、第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインの５’側である。ある実施形態では、第１および第２の結合ドメインは単鎖抗体である。特定の実施形態では、第１および第２の結合ドメインは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。

特定の実施形態では、本発明は、（ａ）ＣＤ３のε鎖と免疫特異的に結合する抗体にそれぞれ由来する第１の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインであって、前記第１の重鎖可変ドメインおよび前記第１の軽鎖可変ドメインがフォールディングしてＣＤ３のεサブユニットと結合する第１の結合ドメインを形成するような十分な長さの第１のリンカー［例えばＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ_２Ｓ）_２ＧＧＡＤ（配列番号５７）］により、前記第１の重鎖可変ドメインが前記第１の軽鎖可変ドメインに共有結合している第１の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインと、（ｂ）細胞表面に露出したＥｐｈＡ２のエピトープと免疫特異的に結合する抗体に由来する第２の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインであって、前記第２の重鎖可変ドメインおよび前記第２の軽鎖可変ドメインがフォールディングしてＥｐｈＡ２の前記エピトープと結合する第２の結合ドメインを形成するような十分な長さの第２のリンカー（例えば（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号５９））により、前記第２重鎖可変ドメインが前記第２の軽鎖可変ドメインに共有結合している第２の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体であって、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが相互に独立してフォールディングするような長さの第３のリンカー（例えばＧ_４Ｓ（配列番号５８））により、前記第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは共有結合している二重特異性単鎖抗体を提供する。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、５’から３’方向の以下の配置のうち任意のものを含む：（１）ＶＨ_ＣＤ３−ＶＬ_ＣＤ３−ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＬ−_{ＥｐｈＡ２}；（２）ＶＬ_ＣＤ３−ＶＨ_ＣＤ３−ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＬ _{ＥｐｈＡ２}；（３）ＶＬ_ＣＤ３−ＶＨ_ＣＤ３−ＶＬ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＨ− _{ＥｐｈＡ２}；（４）ＶＨ_ＣＤ３−ＶＬ_ＣＤ３−ＶＬ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}；（５）ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＬ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＨ_ＣＤ３−ＶＬ_ＣＤ３；（６）ＶＬ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＨ_ＣＤ３−ＶＬ_ＣＤ３；（７）ＶＬ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＬ_ＣＤ３−ＶＨ_ＣＤ３；または（８）ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＬ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＬ_ＣＤ３−ＶＨ−_ＣＤ３。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の全体図については、例えば図１４Ａを参照のこと。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第１の結合ドメインは、ＥｐｈＡ２と結合する第２の結合ドメインよりも低い親和性でＣＤ３のεサブユニットに結合する。一実施形態では、ＣＤ３のεサブユニットに結合する第１の結合ドメインの解離定数（Ｋ_Ｄ）は、０．１×１０^−１２Ｍから０．５×１０^−１２Ｍ、０．１×１０^−１２Ｍから１×１０^−１２Ｍ、０．１×１０^−１１Ｍから０．５×１０^−１１Ｍ、０．１×１０^−１１Ｍから１×１０^−１１Ｍ、０．１×１０^−１０Ｍから０．５×１０^−１０Ｍ、０．１×１０^−１０Ｍから１×１０^−１０Ｍ、０．１×１０^−９Ｍから０．５×１０^−９Ｍ、０．１×１０^−９Ｍから１×１０^−９Ｍ、０．１×１０^−８Ｍから０．５×１０^−８Ｍ、０．１×１０^−８Ｍから１×１０^−８Ｍ、０．１×１０^−７Ｍから０．５×１０^−７Ｍ、０．１×１０^−７Ｍから１×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから２×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから３×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから４×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから５×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから６×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから７×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから８×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから９×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから１０×１０^−７Ｍ、０．１×１０^−６Ｍから０．５×１０^−６Ｍ、０．１×１０^−６Ｍから１×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから２×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから３×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから４×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから５×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから６×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから７×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから８×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから９×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから１０×１０^−６Ｍ、０．１×１０^−５Ｍから０．５×１０^−５Ｍ、０．１×１０^−５Ｍから１×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから２×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから３×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから４×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから５×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから６×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから７×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから８×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから９×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから１０×１０^−５Ｍの間である。特定の実施形態では、ＣＤ３のεサブユニットに結合する第１のドメインの解離定数は、４×１０^−７Ｍである。別の特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２に結合する第２のドメインの解離定数は、０．１×１０^−１２Ｍから０．５×１０^−１２Ｍ、０．１×１０^−１２Ｍから１×１０^−１２Ｍ、０．１×１０^−１１Ｍから０．５×１０^−１１Ｍ、０．１×１０^−１１Ｍから１×１０^−１１Ｍ、０．１×１０^−１０Ｍから０．５×１０^−１０Ｍ、０．１×１０^−１０Ｍから１×１０^−１０Ｍ、０．１×１０^−９Ｍから０．５×１０^−９Ｍ、０．１×１０^−９Ｍから１×１０^−９Ｍ、０．１×１０^−８Ｍから０．５×１０^−８Ｍ、０．１×１０^−８Ｍから１×１０^−８Ｍ、０．１×１０^−７Ｍから０．５×１０^−７Ｍ、０．１×１０^−７Ｍから１×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから２×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから３×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから４×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから５×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから６×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから７×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから８×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから９×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍから１０×１０^−７Ｍ、０．１×１０^−６Ｍから０．５×１０^−６Ｍ、０．１×１０^−６Ｍから１×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから２×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから３×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから４×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから５×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから６×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから７×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから８×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから９×１０^−６Ｍ、１×１０^−６Ｍから１０×１０^−６Ｍ、０．１×１０^−５Ｍから０．５×１０^−５Ｍ、０．１×１０^−５Ｍから１×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから２×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから３×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから４×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから５×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから６×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから７×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから８×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから９×１０^−５Ｍ、１×１０^−５Ｍから１０×１０^−５Ｍの間である。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２に結合する第２ドメインの解離定数は１．１３×１０^−７Ｍである。別の特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、４×１０^−７ＭのＫ_ＤでＣＤ３のεサブユニットに結合する第１の結合ドメインと、１．１３×１０^−７ＭのＫ_ＤでＥｐｈＡ２に結合する第２の結合ドメインとを含む。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥｐｈＡ２結合ドメインは、高い親和定数および低い解離定数を有する。代替の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥｐｈＡ２結合ドメインは、低い親和定数および高い解離定数を有する。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥｐｈＡ２結合ドメインは、高い親和定数および高い解離定数を有する。別の特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＣＤ３結合ドメインは、ＥｐｈＡ２と結合する第２の結合ドメインよりも低い親和性でＣＤ３のεサブユニットに結合する。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、最初にＥｐｈＡ２に結合し、次にＣＤ３に結合する。別の特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、当技術分野で公知の標準的な細胞傷害性アッセイにより測定するとき、または下記の第６．２．６および第６．３節に記載するように、ＥｐｈＡ２を発現する標的細胞の溶解を引き起こす。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、下記の第６．０節に記載するようなフローサイトメトリーに基づくアッセイにより測定するとき、ＥｐｈＡ２を発現する正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団でのＥｐｈＡ２の発現レベルに比べて、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍、もしくは少なくとも１０倍だけ、標的細胞（例えばＥｐｈＡ２を発現する癌細胞、非癌性過剰増殖細胞、または感染細胞）の溶解を仲介する。なお別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、下記の第６．０節に記載するような免疫沈降／ウェスタンブロットアッセイにより測定するとき、ＥｐｈＡ２に結合した場合に、ＥｐｈＡ２を活性化（例えばリン酸化）しない。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥに結合した場合に、ＥｐｈＡ２受容体の集団の２０％未満、１５％未満、または５％未満が活性化（例えばリン酸化）する。

本発明はさらに、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを含む組成物を提供する。特に、本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥと、１つまたは複数の薬学的担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのうち任意のものを含む水性製剤、凍結乾燥製剤、ゲル、および外科用インプラントを提供する。本発明は、１つまたは複数の容器に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥと、そのようなＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを使用するための説明書とを備えるキットもまた提供する。

本発明は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する癌を治療、予防、および／または管理するための組成物および方法を提供し、その方法は、それを必要とする対象に本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与することを含む。特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２の異常発現に関連する癌を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、その方法は、それを必要とする対象に、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの予防または治療有効量を投与することを含む。

一実施形態では、治療、予防、および／または管理される癌は上皮細胞起源である。なお別の実施形態では、治療、予防、および／または管理される対象の癌の癌細胞は、前記対象の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団に比べて、ＥｐｈＡ２を過剰発現している。好ましい実施形態では、癌細胞により発現される一部のＥｐｈＡ２は、細胞間接触の減少、細胞内局在化の変化、またはリガンドに対するＥｐｈＡ２の量の増加のいずれかの結果として、リガンドに結合していない。好ましい実施形態では、治療、予防、および／または管理される癌は悪性である。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、１つまたは複数の他の癌療法と組み合わせて投与することができる。特に本発明は、癌を治療、予防、および／または管理方法を提供し、その方法は、それを必要とする対象に１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの治療または予防有効量を、１つまたは複数の他の療法の治療または予防有効量の投与と組み合わせて投与することを含む。他の療法の非限定的な例には、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法、放射線療法、および外科療法が挙げられる。

ＥｐｈＡ２の発現増加は、ある種の細胞内病原体、特にＲＳＶによる感染に関連することが見い出された（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００５年１０月２７日に出願された「感染を治療および予防するためのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１のモジュレーターの使用」という名称の米国出願第１１／２５９，２６６号を参照のこと）。したがって本発明は、非限定的に、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、および原虫感染を含めた病原体感染［そのような病原体の例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００５年１０月２７日に出願された「感染を治療および予防するためのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１のモジュレーターの使用」という名称の米国出願第１１／２５９，２６６号（の特に段落［００６］、［００４６］、［００４７］、および［００５７］）に開示されている］の治療、予防、および／または管理のために設計された組成物および方法もまた提供する。特に本発明は、感染細胞（例えば感染したＥｐｈＡ２発現細胞）でＥｐｈＡ２の発現がアップレギュレーションされている感染を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量および所望によりＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法の有効量を投与することを含む。特定の実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される病原体感染は、細胞内病原体感染である。別の特定の実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される病原体感染は、ＲＳＶ感染である。

本発明の別の態様では、ＥｐｈＡ２の発現増加が、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、「ＥｐｈＡ２および過剰増殖性細胞障害」という名称の米国特許出願公開第２００５−００５９５９２Ａ１号に開示されている障害などのある種の非癌性過剰増殖性細胞障害に関連することが見い出された。したがって、本発明は、過剰増殖性細胞障害［そのような障害の非限定的な例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、「ＥｐｈＡ２および過剰増殖性細胞障害」という名称の米国特許出願公開第２００５−００５９５９２号（そして特に、段落［００３５］）に開示されている］の治療、予防、および／または管理のために設計された組成物および方法もまた提供する。特に本発明は、過剰増殖性細胞障害を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、ＥｐｈＡ２の発現は、そのような障害に冒された細胞においてアップレギュレーションされており、前記方法は、それを必要とする対象に、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量と、所望によりＥｐｈＡ２以外の療法の有効量とを投与することを含む。特定の実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される過剰増殖性細胞障害は、喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症、石綿沈着症、ＩＰＦ、ＤＩＰ、ＵＩＰ、腎線維症、肝線維症、他の線維症、気管支反応性亢進、乾癬、脂漏性皮膚炎、嚢胞性線維症、または再狭窄、過剰増殖性血管疾患、ベーチェット症候群、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、もしくは過剰増殖性線維芽細胞障害などの過剰増殖性内皮細胞障害である。

本発明の方法および組成物は、未治療の癌患者に有用なばかりでなく、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、および／または外科療法を非限定的に含めた現行の標準的癌療法および実験的癌療法に部分的または完全に抗療性の癌患者の治療に、ならびにそのような治療の有効性を高めるためにもまた有用である。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与を含む療法以外の療法に抗療性もしくは非応答性であること、またはそうありうることが示された癌の治療、予防、および／または管理のための治療法および予防法を提供する。特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ療法（すなわちＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法）に抗療性または非応答性の患者に、その患者を非抗療性または応答性にするために投与される。ある実施形態では、その患者が以前に抗療性または非応答性であった療法を次に投与して、治療効果を得ることができる。

本発明の方法および組成物は、非癌性過剰増殖性細胞障害を有する未治療の患者に有用なばかりでなく、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、および／または外科療法を非限定的に含めた、非癌性過剰増殖性細胞傷害に対する現行の標準的療法および実験的療法に部分的または完全に抗療性のそのような癌患者の治療に、ならびにそのような治療の有効性を高めるためにもまた有用である。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与を含む療法以外の療法に抗療性もしくは非応答性であること、またはそうありうることが示された非癌性過剰増殖性細胞障害の治療、予防、および／または管理のための治療法および予防法を提供する。特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ療法（すなわちＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法）に抗療性または非応答性の患者に、その患者を非抗療性または応答性にするために投与される。ある実施形態では、その患者が以前に抗療性または非応答性であった療法を次に投与して、治療効果を得ることができる。

別の実施形態では、本発明の方法および組成物は、病原体（例えばウイルス、細菌、真菌、または原虫病原体）に感染した未治療の患者に有用なばかりでなく、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、および／または他の抗微生物剤を非限定的に含めた、感染に対する現行の標準的療法および実験的療法に部分的または完全に抗療性の患者の治療にもまた有用である。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与を含む療法以外の療法に抗療性もしくは非応答性であること、またはそうありうることが示された感染の治療、予防、および／または管理のための治療法および予防法を提供する。特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ療法（すなわちＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法）に抗療性または非応答性の患者に、その患者を非抗療性または応答性にするために投与される。ある実施形態では、その患者が以前に抗療性または非応答性であった療法を次に投与して、治療効果を得ることができる。

加えて本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのためのスクリーニング法を提供する。特に、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーアッセイ、および下の第６節に記載するアッセイなどの日常的な免疫学的技法を使用して、ＥｐｈＡ２、特にＥｐｈＡ２の細胞外ドメインおよびＴ細胞抗原ＣＤ３への結合についてスクリーニングすることができる。一実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを同定するために、候補ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２陽性標的細胞（例えば、ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞、非癌性過剰増殖性細胞、または感染細胞）の対象を変更された溶解を開始する能力についてスクリーニングすることができる。別の実施形態では、候補ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有する能力について（例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植モデルにおいて）スクリーニングすることができる。

本発明は、ＥｐｈＡ２特異的ＢｉＴＥを同定するために本明細書に記載する方法を使用して、ＡおよびＢ型の他のＥｐｈ受容体、すなわち他のＥｐｈ受容体−ＢｉＴＥに結合する二重特異性単鎖抗体構築物をスクリーニングする方法もまた提供する。他のＥｐｈ受容体特異的ＢｉＴＥ分子を同定するための標的として使用することができるＥｐｈ受容体ファミリーのメンバーのリストについては、Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90(3):403-4；およびCheng et al., 2002, Cytokine & Growth Factor Rev. 13:75-85を参照のこと。これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

別の実施形態では、非癌細胞ではない癌細胞、非癌性過剰増殖性細胞、または非感染細胞ではない感染細胞に露出したＥｐｈＡ２エピトープと選好的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを同定するために、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、リガンド、例えばエフリンＡ１に結合しておらず、細胞間接触部に局在化していないＥｐｈＡ２と選好的に結合する能力についてもまたスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害に冒された組織を同定するための方法を提供し、その方法は、エピトープ排除アッセイ（例えば下記の第６．２．４節、第６．３．８節、および第６．７．２節）に本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを使用することを含む。この実施形態によると、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、異常なＥｐｈＡ２発現および／または活性に関連する障害に冒された組織の細胞（例えばＥｐｈＡ２を発現している癌、非癌細胞、過剰増殖性細胞、または感染細胞）上でのみ可触性であるか、または露出しており、同じ組織型の正常組織の細胞上では可触性でもなく、露出してもいないＥｐｈＡ２エピトープに結合する。細胞上の抗体の結合／局在化を判定するための、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、所望の結合特性について候補ＢｉＴＥをスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、核磁気共鳴（ＮＭＲ）顕微鏡検査、免疫蛍光顕微鏡検査、フローサイトメトリーアッセイ、または表面プラズモン共鳴アッセイなどの、当技術分野で公知の標準アッセイを使用して、特定のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの結合特性を判定する。この実施形態では、ＥｐｈＡ２がそのリガンドに結合しており、細胞間接触部に局在化している場合に、ＥｐｈＡ２にあまり結合しないが、細胞上の遊離ＥｐｈＡ２に十分に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが本発明に包含される。別の特定の実施形態では、細胞アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥがＥｐｈＡ２との結合をリガンド（例えば、細胞にアンカーされたリガンドまたは精製リガンド）と競合する能力について、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを選択する。

３．１定義
ＥｐｈＡ２の発現に関連して本明細書に使用する用語「異常」は、ある実施形態では、細胞、例えば対象の癌細胞、非癌性過剰増殖性細胞、または感染細胞上で増加しているＥｐｈＡ２の発現を、前記対象の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団におけるＥｐｈＡ２の発現レベルに比べて表す。ＥｐｈＡ２の発現増加は、ＥｐｈＡ２の異常発現に関連する障害を有する対象の細胞におけるＥｐｈＡ２の発現増加を、前記対象の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団におけるＥｐｈＡ２の発現レベルに比べて表す。特定の実施形態では、当技術分野で公知の標準アッセイにより、または下記の第６．０節に記載するように（例えばフローサイトメトリーアッセイで）測定するとき、ＥｐｈＡ２の異常発現に関連する障害を有する対象の細胞におけるＥｐｈＡ２の発現レベルは、前記対象の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団におけるＥｐｈＡ２の発現レベルに比べて少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍、もしくは少なくとも１０倍だけ増加している。特定の実施形態では、癌細胞、非癌性過剰増殖性細胞、または感染細胞上のＥｐｈＡ２の発現は、当技術分野で公知の標準アッセイにより、または下記の第６．０節に記載するように（例えばフローサイトメトリーアッセイで）測定するとき、前記対象の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団におけるＥｐｈＡ２の発現レベルに比べて少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍、もしくは少なくとも１０倍だけ増加している。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２の発現に関連する用語「異常」は、ＥｐｈＡ２のあるエピトープが、対象由来の癌細胞、非癌性過剰増殖性細胞、または感染細胞上に選択的に露出しており、前記対象の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団の上には露出していないＥｐｈＡ２の発現を表す。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２の発現に関連する用語「異常」は、例えば免疫蛍光染色などの当技術分野で公知の標準アッセイにより、または下記の第６．０節に記載する方法により測定するとき、ＥｐｈＡ２の細胞内位置（例えば細胞間接触部位以外の部位での）が細胞において変化しているＥｐｈＡ２の発現を表す。

本明細書に使用する用語「薬剤」は、所望の生物学的効果を有する分子を表す。薬剤には、非限定的に、タンパク質性分子［例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および抗体（例えば二重特異性単鎖抗体）］、ワクチン、小分子（１０００ダルトン未満）、無機または有機化合物、および核酸分子［非限定的に、２本鎖もしくは１本鎖ＤＮＡ、または２本鎖もしくは１本鎖ＲＮＡ（例えばアンチセンス、ＲＮＡｉなど）、アプタマー、および三重らせん核酸分子を含む］が挙げられる。薬剤は、任意の公知の生物［非限定的に、動物（例えば哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物））、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスを含む］に、または合成分子のライブラリーに由来することがあるし、あるいはそれから得ることができる。

タンパク質性薬剤（例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または抗体）に関連して本明細書に使用する用語「アナログ」は、第２のタンパク質性薬剤と類似または同一の機能を有するが、第２のタンパク質性薬剤と類似または同一のアミノ酸配列または構造を必ずしも含まないタンパク質性薬剤を表す。類似のアミノ酸配列を有するタンパク質性薬剤は、以下のうち少なくとも１つを満たすタンパク質性薬剤を表す。（ａ）第２のタンパク質性薬剤のアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質性薬剤、（ｂ）少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、または少なくとも１５０アミノ酸残基の第２のタンパク質性薬剤をコードしているヌクレオチド配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性薬剤、および（ｃ）第２タンパク質性薬剤をコードしているヌクレオチド配列に少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性薬剤。第２のタンパク質性薬剤に類似した構造を有するタンパク質性薬剤は、第２のタンパク質性薬剤に類似した二次、三次、または四次構造を有するタンパク質性薬剤を表す。タンパク質性薬剤の構造は、非限定的に、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、および結晶学的電子顕微鏡検査を含めた、当業者に公知の方法により決定することができる。好ましくは、本発明のタンパク質性薬剤は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ活性を有する。

２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一率を決定するために、最適比較の目的で配列を整列させる（例えば第２のアミノ酸または核酸配列との最適のアライメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列での位置が第２の配列での対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有されているならば、それらの分子はその位置で同一である。２つの配列の間の同一率は、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一率（％）＝同一の重複する位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。

２つの配列の間の同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用してもまた実現することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877のように改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264-2268）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（1990, J. Mol. Biol. 215: 403）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを、例えばスコア＝１００、ワード長＝１２に設定して行って、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを、例えばスコア−５０、ワード長＝３に設定して行って、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るために、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されているようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係（Ｉｄ）を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムの初期設定パラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴのもの）を使用することができる（例えばＮＣＢＩのウェブサイトを参照のこと）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（1988, CABIOS 4: 11-17）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合には、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。

２つの配列の間の同一率は、上記の技法に類似した技法を用いて、ギャップを許容するかまたは許容せずに決定することができる。同一率を計算するにあたり、典型的には完全合致のみを計数する。

非タンパク質性アナログに関して本明細書に使用する用語「アナログ」は、第１の有機または無機分子と類似または同一の機能を保有し、第１の有機または無機分子と構造的に類似した、第２の有機または無機分子を表す。

本明細書に使用する用語「抗体」は、抗原結合部位を含む分子、例えば免疫グロブリン分子、および抗原結合部位を含む、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を表す。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子でありうる。抗体には、非限定的に、合成抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、組換え産生された抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ（例えば単一特異性および二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のうち任意のもののエピトープ結合性断片が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、（１）Ｔ細胞抗原ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む第１の結合ドメインと、（２）ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体である。別の特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、それぞれ単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第１の結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび／または可変軽鎖ドメインは、ＣＤ３に免疫特異的に結合する任意の型の抗体から得ることができるが、またはそれに由来しうる。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第２の結合ドメインの可変重鎖ドメインおよび／または可変軽鎖ドメインは、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する任意の型の抗体から得ることができるか、またはそれに由来しうる。抗体の型の非限定的な例には、合成抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、組換え産生された抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ（例えば単一特異性および二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記の任意のエピトープ結合性断片が挙げられる。

本明細書に使用する用語「結合ドメイン」は、エピトープに免疫特異的に結合することができる三次元構造を含むドメインを表す。したがって一実施形態では、前記ドメインは、抗体鎖のＶＨおよび／またはＶＬドメイン、好ましくは少なくともＶＨドメインを含むことがある。別の実施形態では、結合ドメインは、ＥｐｈＡ２抗原およびＣＤ３抗原をそれぞれ判別する抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことがある。これに関して、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥに存在する結合ドメインのドメインは、抗体に由来しうるだけではなく、天然表面受容体またはリガンドなどの他のＥｐｈＡ２結合タンパク質またはＣＤ３結合タンパク質にも由来しうることに留意される。

本明細書に使用する用語「脱免疫化」、「脱免疫」または文法的に関係するその変形は、本来の野生型構築物をヒトにおいて非免疫原性または低免疫原性にすることによる、前記野生型構築物と比較した第１および／または第２の結合ドメインの改変を示す。脱免疫化アプローチは、当技術分野において十分に公知であり、例えば国際公開ＷＯ００／３４３１７（特に１〜１４頁）、ＷＯ９８／５２９７６（特に１８〜３８頁の実施例１〜６）、ＷＯ０２／０７９４１５（特に２〜８頁および１５〜４３頁の実施例１〜１０）、およびＷＯ９２／１０７５５（特に６〜９頁）に開示されている。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを発生する傾向の低減を示す構築物にもまた関する。本発明によると、用語「Ｔ細胞エピトープを発生する傾向の低減」は、特異的Ｔ細胞活性化に至るＴ細胞エピトープの除去に関する。さらに、「Ｔ細胞エピトープを発生する傾向の低減」は、Ｔ細胞エピトープの形成に寄与するアミノ酸の置換、すなわちＴ細胞エピトープの形成に不可欠なアミノ酸の置換を表す。言い換えると、「Ｔ細胞エピトープを発生する傾向の低減」は、免疫原性の低減または抗原依存性Ｔ細胞増殖を誘導する能力の低減に関する。Ｔ細胞エピトープという用語は、細胞内でペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の分解時に放出され、続いてＴ細胞の活性化をトリガーするために主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子により提示されうる短いペプチド配列に関する（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開ＷＯ０２／０６６５１４を参照のこと）。ＭＨＣクラスＩＩにより提示されるペプチドに関して、Ｔ細胞のそのような活性化は、次にＢ細胞を直接刺激することにより抗体応答を生じ、前記抗体を産生することができる。「Ｔ細胞エピトープを発生する傾向の低減」および／または「脱免疫」は、当技術分野で公知の技法により測定することができる。好ましくは、タンパク質の脱免疫化は、Ｔ細胞増殖アッセイによりｉｎｖｉｔｒｏ検査することができる。このアッセイでは、世界中のＨＬＡ−ＤＲアレルの＞８０％に相当するドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が野生型または脱免疫化ペプチドのいずれかに応答した増殖についてスクリーニングされる。理想的には細胞増殖は、野生型ペプチドを抗原提示細胞に負荷した場合にのみ検出される。あるいは、脱免疫化は、すべてのハプロタイプに相当するＨＬＡ−ＤＲ四量体を発現させることにより検査することができる。これらの四量体は、ペプチドの結合について検査することができるし、増殖アッセイにおいて抗原提示細胞のためにペプチド代用物を負荷することもできる。脱免疫化ペプチドがＨＬＡ−ＤＲハプロタイプ上に提示されるかどうかを判定するために、ＰＢＭＣ上の例えば蛍光標識ペプチドの結合を測定することができる。さらに、脱免疫化は、脱免疫化分子に対する抗体が、患者に投与後に形成したかどうかを判定することによって確認することができる。好ましくは、Ｔ細胞エピトープを誘導する傾向の低減を生じるために、抗体由来分子はフレームワーク領域で脱免疫化され、大部分のＣＤＲ領域は改変されない結果、ＣＤＲ領域の結合親和性は影響されない。１つのＴ細胞エピトープの除去でさえも免疫原性の減少を招く。特定の実施形態では、関心対象の抗原（例えばＣＤ３）に結合する結合ドメインの免疫原性は、上記または当技術分野で公知の標準アッセイ（例えばＴ細胞増殖アッセイ）により測定するとき、非免疫処置対照ポリペプチドもしくはタンパク質またはその断片に比べて、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％だけ減少している。要約すると、上に論じたアプローチは、本明細書に記載する治療用二重特異性単鎖抗体（例えばＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ）が、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染）を有する患者に投与された場合に、その抗体の免疫原性を低減することを助ける。例えば、ＣＤ３のεサブユニットに結合する第１の結合ドメインが脱免疫化される。好ましくは、このＣＤ３結合ドメインの可変領域の配置はＶＨ−ＶＬである。

タンパク質性薬剤（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および抗体）に関連して本明細書に使用する用語「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失、および／または付加の導入により変化したアミノ酸配列を含むタンパク質性薬剤を表す。本明細書に使用される用語「誘導体」は、改変された、すなわちタンパク質性薬剤への任意の種類の分子の共有結合により改変されたタンパク質性薬剤もまた表す。限定の目的ではなく、例として、タンパク質性薬剤の誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質などへの結合により産生させることができる。タンパク質性薬剤の誘導体は、非限定的に、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた当業者に公知の技法を使用した化学的改変により産生させることもできる。さらに、タンパク質性薬剤の誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有することがある。タンパク質性薬剤の誘導体は、それが由来するタンパク質性薬剤と同一の機能を保有する。

非タンパク質性誘導体に関連して本明細書に使用する用語「誘導体」は、第１の有機または無機分子の構造に基づき形成した第２の有機または無機分子を表す。有機分子の誘導体には、非限定的に、例えばヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシル、ニトリル、またはアミン基の付加または欠失により改変された分子が挙げられる。有機分子は、例えばエステル化、アルキル化、および／またはリン酸化していることもまたある。

本明細書に使用する用語「有効量」は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／もしくは活性に関連する障害またはその症状の重症度および／または持続期間を低減および／または改善するため、前記障害の進行を予防するため、前記障害の退縮を起こすため、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する前記障害に関連する１つまたは複数の症状の再発、発生、または発症を予防するため、あるいは別の療法（例えば別の予防または治療剤）の予防または治療効果を強化または向上するために十分な療法（例えば予防または治療剤）の量を表す。

本明細書に使用する用語「高齢のヒト」、「高齢者」、またはその変形は、６５歳以上、好ましくは７０歳以上のヒトを表す。

本明細書に使用する用語「内因性リガンド」または「天然リガンド」は、通常はｉｎｖｉｖｏで特定の受容体と結合する分子を表す。例えば、エフリンＡ１はＥｐｈＡ２の内因性リガンドである。

本明細書に使用する用語「ＥｐｈＡ２ポリペプチド」は、ＥｐｈＡ２、そのアナログ、誘導体、もしくは断片、またはＥｐｈＡ２を含む融合タンパク質、そのアナログ、誘導体、もしくは断片を表す。ＥｐｈＡ２ポリペプチドは任意の種由来であってもよい。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドはヒトポリペプチドである。ある実施形態では、用語「ＥｐｈＡ２ポリペプチド」は、成熟してプロセシングされた形態のＥｐｈＡ２を表す。他の実施形態では、用語「ＥｐｈＡ２ポリペプチド」は、未熟形態のＥｐｈＡ２を表す。この実施形態によると、本発明の抗体は、成熟したプロセシングされた形態のＥｐｈＡ２に対応する、未熟形態のＥｐｈＡ２の部分に免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、用語「ＥｐｈＡ２ポリペプチド」は、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインまたはその断片を表す。ある実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、細胞に関連してＥｐｈＡ２の細胞外ドメイン（すなわち細胞表面に露出したＥｐｈＡ２のエピトープ）に結合する。

ＥｐｈＡ２ポリペプチドのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、文献または公共データベースに見い出すことができるし、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、当業者に公知のクローニングおよび配列決定技法を用いて決定することができる。例えば、ヒトＥｐｈＡ２のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（例えば受託番号ＢＣ０３７１６６、Ｍ５９３７１、およびＭ３６３９５参照）に見い出すことができる。ヒトＥｐｈＡ２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（例えば受託番号ＡＡＨ３７１６６およびＡＡＡ５３３７５参照）に見い出すことができる。ＥｐｈＡ２のアミノ酸配列の追加の非限定的な例は、以下の表に挙げる。

本明細書に使用する用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有する、ポリペプチドまたはタンパク質の部位または断片を表す。特定の実施形態では、用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有する、ＥｐｈＡ２ポリペプチドの断片またはＣＤ３ポリペプチドの断片を表す。免疫原性活性を有するエピトープは、動物に抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の部位または断片である。特定の実施形態では、免疫原性活性を有するエピトープは、動物に抗体応答を誘発するＥｐｈＡ２ポリペプチドの断片またはＣＤ３ポリペプチドの断片である。抗原活性を有するエピトープは、当業者に十分に公知の任意の方法、例えばＲＩＡまたはＥＬＩＳＡアッセイなどのイムノアッセイによって決定するとき、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の部位または断片である。特定の実施形態では、抗原性活性を有するエピトープは、当技術分野で十分に公知の任意の方法、例えばイムノアッセイによって決定するとき、抗体が免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２ポリペプチドの断片またはＣＤ３ポリペプチドの断片である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。

タンパク質性薬剤に関連して本明細書に使用する用語「断片」は、別のポリペプチドまたはタンパク質の、少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを表す。特定の実施形態では、タンパク質性薬剤に関連した用語「断片」は、別のポリペプチドまたはタンパク質の１０から１５個、１０から２０個、１０から３０個、１０から４０個、１０から５０個、１０から６０個、１０から７０個、１０から８０個、１０から１００個、１０から１２５個、１０から１５０個、１０から１７５個、１０から２００個、１０から２５０個、または１０から３００個の連続したアミノ酸残基の範囲のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを表す。

特定の実施形態では、断片は、ＥｐｈＡ２の断片またはＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する抗体である。別の特定の実施形態では、断片は、ＣＤ３またはＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体の断片である。一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドの断片は、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。別の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質の断片は、そのポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの機能を保持する。好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体の断片は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する能力を保持する。別の好ましい実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体の断片は、ＣＤ３ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する能力を保持する。好ましくは、抗体断片はエピトープ結合性断片である。

本明細書に使用する用語「融合タンパク質」は、第１のポリペプチドもしくはタンパク質、またはその断片、アナログ、もしくは誘導体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチドまたはタンパク質（すなわち、第１のポリペプチドもしくはタンパク質、またはその断片、アナログ、もしくは誘導体とは異なるか、あるいは通常は第１のポリペプチドもしくはタンパク質、またはその断片、アナログ、もしくは誘導体の一部ではない、第２のポリペプチドもしくはタンパク質、またはその断片、アナログ、もしくは誘導体）のアミノ酸配列とを含む、ポリペプチドまたはタンパク質を表す。一実施形態では、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと融合した予防または治療剤を含む。本実施形態によると、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、異なる種類の予防剤または治療剤であっても、そうでなくてもよい。例えば、免疫調節活性を有する２つの異なるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを一緒に融合させて、融合タンパク質を形成させることができる。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと融合する前の本来のポリペプチドまたはタンパク質の活性に比べて、活性を保持しているか、または活性が向上している。特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｔ細胞抗原ＣＤ３に結合する第１の結合ドメインと、関心対象の抗原（例えばＥｐｈＡ２）に結合する第２の結合ドメインとを含む。この実施形態によると、融合タンパク質はＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥである。

本明細書に使用する用語「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、非ヒト（例えばマウス）抗体、好ましくはキメラ抗体の形態を表す。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域または相補性決定（ＣＤＲ）残基を所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種由来の抗体（ドナー抗体）からの超可変領域残基またはＣＤＲ残基で置き換えた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、例えば、ヒト化抗体の親和性を向上させるために、ヒト免疫グロブリンの１つもしくは複数のフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、構造モデリングに基づいて対応する非ヒト残基または他の残基で置き換える。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見い出されない残基を含むことがある。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうち実質的にすべてを含むものである。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも断片もまた含むものである。ヒト化方法およびフレームワークシャフリング（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）に関するさらなる詳細については、Dall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525；Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-329；Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596；ならびにＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、および米国特許出願第２００５−００４８６１７Ａ１号を参照のこと。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書に使用する用語「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、相互に少なくとも３０％（好ましくは、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一であるヌクレオチド配列が、典型的には相互にハイブリダイズしたまま保たれる、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明している。そのようなストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見い出すことができる。

一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５から１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）濃度で、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド超）について少なくとも約６０℃の条件であろう。ストリンジェントな条件は、不安定化剤、例えば、ホルムアミドを添加することによってもまた実現することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。

１つの非限定的な例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で、約４５℃でのハイブリダイゼーションに続く、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で、約６８℃での１回または複数回の洗浄である。好ましい非限定的な例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣで、約４５℃でのハイブリダイゼーションに続く、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、５０〜６５℃での１回または複数回の洗浄（すなわち、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃での１回または複数回の洗浄）である。本発明の核酸には、これらの条件で、ＡまたはＴヌクレオチドのみからなるヌクレオチド配列だけにハイブリダイズする核酸分子は含まれないことが了解されている。

本明細書に使用する用語「超可変領域」は、抗原の結合を担っている、抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」［すなわち軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)］由来のアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」［すなわち軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917］由来の残基を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義する超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。

本明細書に使用する用語「免疫調節剤」は、対象の免疫系を調節する薬剤を表す。特に、免疫調節剤は、対象の免疫系が１つまたは複数の外来抗原に反応する能力を変化させる薬剤である。特定の実施形態では、免疫調節剤は、対象の免疫応答の一側面をシフトさせる薬剤である。本発明の好ましい実施形態では、免疫調節剤は、対象の免疫反応を阻害または低減する薬剤（すなわち免疫抑制剤）である。

抗ＥｐｈＡ２抗体、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、およびＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの結合ドメインに関連して本明細書に使用する用語「ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する」および類似の用語は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに特異的に結合し、非ＥｐｈＡ２ポリペプチドに特異的には結合しない、抗体（例えば二重特異性単鎖抗体であるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ）およびＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの結合ドメイン（例えば二重特異性単鎖抗体であるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのｓｃＦｖ）を含めたタンパク質性薬剤を表す。好ましくは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの抗体および結合ドメインは、他の無関係な抗原とは交差反応しない。特定の実施形態では、本発明の抗ＥｐｈＡ２抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイなどの当技術分野に公知の標準アッセイにより測定するとき、他の無関係な抗原とほとんどまたは全く交差反応性を有さずにＥｐｈＡ２ポリペプチドに結合する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの抗体および結合ドメインは、関係する抗原（例えばＡおよび／またはＢファミリーのＥｐｈ受容体由来の他の種類のＥｐｈ受容体）と交差反応性でありうる。ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または結合ドメインは、例えば結合親和性を検出するための当技術分野で公知のイムノアッセイまたは他のアッセイにより判定するとき、低親和性で他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に結合しうる。ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体または結合ドメインは、関係する抗原と交差反応性でありうる。好ましくは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはその断片は、例えば当業者に公知のイムノアッセイまたは他の技法により同定することができる。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの実験技法を用いて判定するとき、抗体またはその断片が任意の交差反応性抗原よりも高い親和性でＥｐｈＡ２ポリペプチドに結合する場合に、その抗体またはその断片は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに特異的に結合する。例えば、抗体の特異性に関する考察については、Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology, 2^nd ed., Raven Press, New Yorkの３３２〜３３６頁を参照のこと。別の実施形態では、融合タンパク質であるＥｐｈＡ２ポリペプチドに結合する抗体は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドであるその融合タンパク質の断片に免疫特異的に結合する。好ましくは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥという抗体およびその結合ドメインは、ＥｐｈＡ２活性を調節するだけであり、他の活性にあまり影響しない。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの抗体および結合ドメインは、好ましくは低いＫ_ｏｆｆ速度（例えば３×１０^−２ｓ^−１未満のＫ_ｏｆｆ）を有しうる単鎖抗体（例えば１つのＶＨドメインおよび１つのＶＬドメインを含むｓｃＦｖ）である。

本明細書に使用する用語「ＣＤ３に免疫特異的に結合する」および類似の用語は、ＣＤ３またはそのサブユニットに特異的に結合し、他の抗原に特異的には結合しないタンパク質性薬剤を表す。好ましくは、ＣＤ３に免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの抗体および結合ドメインは、無関係の抗原と交差反応しない。

療法の投与に関連して本明細書に使用する用語「組み合わせて」は、１回を超える療法の使用を表す。用語「組み合わせて」の使用は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を有する対象に療法を投与する順序を限定しない。第１の療法は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を有した、有する、またはそれに感受性の対象に、第２の療法を投与する前（例えば１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）に、それに付随して、もしくはそれと同時に、またはそれに続いて（例えば１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後に）投与することができる。任意の追加の療法は、他の追加の療法と任意の順序で投与することができる。ある実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、１つまたは複数の療法（例えばＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を治療、予防、および／または管理するために現在投与されている非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、例えば鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、免疫調節剤など）と組み合わせて投与することができる。

ＥｐｈＡ２の発現に関して本明細書に使用する用語「増加した」または「過剰発現する」または「過剰発現」は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する抗体を使用した、非限定的に、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー、または免疫組織化学を含めた、当技術分野で公知の任意の方法により測定するとき、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を有する対象の細胞におけるＥｐｈＡ２の発現の増加を、前記対象の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団におけるＥｐｈＡ２の発現レベルに比べて表す。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を有する対象の細胞におけるＥｐｈＡ２の発現レベルは、前記対象の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団におけるＥｐｈＡ２の発現レベルに比べて少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍、もしくは少なくとも１０倍だけ増加している。

本明細書に使用する用語「ヒト乳児」または「乳児」またはその変形は、月齢２４カ月未満、好ましくは１２カ月未満、６カ月未満、３カ月未満、２カ月未満、または月齢１カ月未満のヒトを表す。

本明細書に使用する用語「早産で生まれたヒト乳児」、「早期産児」、もしくは「早産児」、またはその変形は、在胎齢４０週未満、好ましくは在胎齢３５週未満で生まれ、月齢６カ月未満、好ましくは月齢３カ月未満、さらに好ましくは月齢２カ月未満、最も好ましくは月齢１カ月未満のヒトを表す。

タンパク性薬剤または核酸以外の有機または無機分子（小分子にせよ大分子にせよ）に関して本明細書に使用する用語「単離された」は、異なる有機または無機分子を実質的に有さない有機または無機分子を表す。好ましくは、有機または無機分子は、第２の異なる有機または無機分子を６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％有さない。好ましい実施形態では、有機および／または無機分子は単離されている。

タンパク性薬剤（例えばペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、または抗体）に関連して本明細書に使用する用語「単離された」は、それが由来する細胞もしくは組織源からの細胞性物質もしくは混入タンパク質を実質的に有さないか、または化学合成した場合には化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に有さないタンパク性薬剤を表す。語「細胞性物質を実質的に有さない」には、タンパク性薬剤を単離または組換え産生する元の細胞の細胞構成要素から、そのタンパク性薬剤が分離されている、そのタンパク性薬剤の調製物が含まれる。したがって、細胞性物質を実質的に有さないタンパク性薬剤には、約３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満（乾燥重量）の異種タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または抗体（「混入タンパク質」とも呼ぶ）を有する、タンパク性薬剤の調製物が含まれる。タンパク性薬剤を組換え産生する場合は、それが培地を実質的に有さないこともまた好ましく、すなわち、培地がタンパク性薬剤調製物の体積の約２０％未満、１０％未満、または５％未満に相当する。タンパク性薬剤を化学合成によって産生する場合は、そのタンパク質性薬剤は、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に有さないことが好ましく、すなわち、タンパク性薬剤の合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、そのようなタンパク性薬剤の調製物は、約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満（乾燥重量）の、関心対象のタンパク性薬剤以外の化学物質前駆体または化合物を有する。特定の実施形態では、本明細書に開示するタンパク性薬剤は単離されている。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子は単離されている。

核酸分子に関連して本明細書に使用する用語「単離された」は、天然起源の核酸分子に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を表す。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、好ましくは、組換え技法により産生された場合には他の細胞性物質または培地を実質的に有さないし、化学合成された場合には、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に有さない。特定の実施形態では、核酸分子は単離されている。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子をコードしている核酸分子は単離されている。

本明細書に使用する用語「低耐容性」は、患者が療法による副作用を患うことによって、副作用の有害作用および／または害が治療の利益を上回るために、患者が療法から利益を得られず、かつ／または療法を継続しないであろう状態を表す。

本明細書に使用する用語「管理する」、「管理すること」、および「管理」は、対象が療法から得る、障害の治癒をもたらさない有益効果を表す。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）を「管理」して、その障害の進行または悪化を防止する（すなわち疾患の進行を抑える）ために、患者は、１つまたは複数の療法を投与される。

本明細書に使用する用語「病態を引き起こす細胞表現型」は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害の病態を引き起こすかまたはその一因となる、前記障害に冒された細胞が行う機能を表す。病態を引き起こす細胞表現型には、非限定的に、細胞／細胞相互作用の減少、細胞外マトリックスの沈着の増加、遊走の増加、癌細胞、過剰増殖性細胞、または感染性病原体／因子（例えば細菌、ウイルス、真菌、または原虫）に感染した細胞（例えば上皮細胞）の細胞生存および／または増殖の増加が挙げられる。これらの病態を引き起こす細胞表現型の１つまたは複数は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）を患う患者に症状を引き起こすか、またはその一因となる。

本明細書に使用する語句「薬学的に許容される」は、動物、より詳細にはヒトでの使用について連邦政府もしくは州政府の規制当局に認可されているか、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは他の一般に認定されている薬局方に記載されていることを意味する。

対象への療法の投与に関連して本明細書に使用する用語「増強する」は、その一般的または許可された用量での療法の有効性の向上を表す。

対象に投与される療法に関連して本明細書に使用する用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」は、療法（例えば予防または治療剤）の投与、または療法の組合せ（例えば予防または治療剤の組合せ）の投与に起因する、対象におけるＥｐｈＡ２の異常発現および／もしくは活性に関連する障害またはその症状の発生、発症、拡大、または再発の低減または阻止を表す。特定の実施形態では、対象に投与する療法に関連した用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害の再発までの時間の増加または拡大もしくは進行の減少を表す。

本明細書に使用する用語「予防剤」は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその症状の発生、再発、拡大、または発症を予防することができる任意の薬剤を表す。ある実施形態では、用語「予防剤」はＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを表す。ある他の実施形態では、用語「予防剤」は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の薬剤を表す。好ましくは、予防剤は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状の発症、発生、再発、進行、および／または拡大を予防または妨害するために有用なことが公知であるか、またはそのために使用されてきたか、もしくは現在使用されている薬剤である。

本明細書に使用する「予防有効量」は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその症状の発生、再発、拡大、または発症の予防を招くのに十分な療法（例えば予防剤）の量を表す。予防有効量は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその症状の発生、再発、拡大、または発症を予防するのに十分な療法（例えば予防剤）の量を、例えばそのような障害を以前に患った者、または免疫無防備状態であるか、もしくは免疫抑制されている者、またはそのような障害の遺伝的素因を有する者において表す。予防有効量は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその症状の予防に予防的利益を提供する療法（例えば予防剤）の量もまた表す。さらに、療法（例えば本発明の予防剤）に関する予防有効量は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）の予防に予防的利益を提供する療法（予防剤）を、単独で、または１つもしくは複数の他の療法（例えばＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を予防するために現在投与される非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ療法、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、または免疫調節剤）と組み合わせたときの量を意味する。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの量に関連して使用する場合には、この用語は、全体的な予防を改善する量、または別の療法（例えば予防剤）の予防的有効性を強化もしくは相乗する量を包含することができる。

本明細書に使用する「プロトコール」には、投薬スケジュールおよび投薬レジメンが含まれる。

本明細書に使用する用語「抗療性」は、１つまたは複数の療法（例えば現在利用可能な療法）に応答しない、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）を表す。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）が療法に抗療性であることは、前記障害に関連する症状の少なくとも一部の重大な部分がその療法により除去も減少もしないことを意味する。そのような障害が抗療性であるかどうかの判定は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）のための療法の有効性をアッセイするための、当技術分野において公知の任意の方法により、ｉｎｖｉｖｏおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。

本明細書に使用する語句「副作用」は、療法（例えば予防または治療剤）の望まれない有害な作用を包含する。有害作用は常に望まれないが、望まれない作用は必ずしも有害ではない。療法（例えば予防または治療剤）の有害作用は、有害または不快または危険でありうる。副作用の例には、非限定的に、嘔気、嘔吐、摂食障害、腹部痙攣、発熱、疼痛、体重減少、脱水、脱毛症、呼吸困難、不眠症、眩暈、粘膜炎、神経および筋肉作用、疲労、口渇、および食欲不振、投与部位における発疹または腫脹、発熱、悪寒および疲労などのインフルエンザ様症状、消化管の問題ならびにアレルギー反応が挙げられる。患者が経験する追加の望まれない作用は多数であり、当技術分野で公知である。その多くは、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)に記載されている。

本明細書に使用する用語「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片であって、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在するものを表す。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することが可能となる。ｓｃＦｖを産生するための方法は、当技術分野において十分に公知である。ｓｃＦｖを産生するための方法の総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥはｓｃＦｖからなる。

本明細書に使用する用語「対象」および「患者」は、相互交換可能に使用される。本明細書に使用するとき、対象は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類［例えばサル（例えばアカゲザル、カニクイザル、またはチンパンジー）およびヒト］などの哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を有する哺乳動物であり、好ましくはヒトである。そのような障害には、非限定的に、癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染が含まれる。別の実施形態では、対象は、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を発生するリスクのある哺乳動物（例えば、免疫無防備状態であるか、もしくは免疫抑制されている哺乳動物、または遺伝的素因のある哺乳動物）、好ましくはヒトである。別の実施形態では、対象は、免疫無防備状態の哺乳動物でも免疫抑制された哺乳動物でもなく、好ましくはヒトである。別の実施形態では、対象は、リンパ球数が約５００細胞／ｍｍ^３未満でない哺乳動物、好ましくはヒトである。

本明細書に使用する用語「相乗的な」は、任意の２つ以上の単独の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の相加効果よりも有効な、療法（例えば予防または治療剤）の組合せを表す。一態様では、治療の組合せ（例えば予防または治療剤の組合せ）の相乗効果により、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）を有する対象に、１つもしくは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）をより低い投与量で使用すること、および／または前記療法をより低い頻度で投与することが可能となる。いくつかの実施形態では、療法（例えば予防または治療剤）をより低い投与量で利用できること、および／または前記療法をより低い頻度で投与できることにより、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性（例えば過剰発現）に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）の予防または治療における前記療法の有効性を低減せずに、対象に前記療法を投与することに関連する毒性を低減する。別の態様では、相乗効果は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）の治療、予防、および／または管理における療法（例えば予防または治療剤）の有効性の向上を招くことができる。別の態様では、療法（例えば予防または治療剤）の組合せの相乗効果により、任意の単一療法の使用に関連する有害作用または望まれない副作用を回避または低減することができる。

本明細書に使用する用語「治療剤」は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）または１つもしくは複数のその症状の治療および／または管理に使用することができる任意の薬剤を表す。ある実施形態では、用語「治療剤」は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子を表す。ある他の実施形態では、用語「治療剤」は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子以外の薬剤を表す。好ましくは、治療剤は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状の治療、予防、および／または管理に有用であることが公知であるか、または使用されてきたか、または現在使用されている薬剤である。

癌に関連して本明細書に使用する「治療有効量」は、癌の治療および／または管理に治療上の利益を提供する療法の量を単独で、または他の療法と組み合わせて表す。一態様では、治療有効量は、原発性、局所、または転移性癌組織を破壊、改変、防除、または除去するために十分な療法の量を表す。別の態様では、治療有効量は、癌の症状を低減するために十分な療法の量を表す。別の態様では、治療有効量は、癌の拡大を遅延または最小化するために十分な療法の量を表す。特定の実施形態では、療法の治療有効量は、癌細胞の成長もしくは増殖を阻害するため、既存の癌細胞を死滅させる（例えば癌の退縮を引き起こす）ため、および／または他の組織もしくは領域への癌細胞の拡大を予防する（例えば転移を予防する）ために十分な療法の量である。別の特定の実施形態では、療法の治療有効量は、当技術分野で公知の、または下の第６．４．１節に記載する標準法により測定するとき、腫瘍の成長を少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％だけ阻害するために十分な療法の量である。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの量とともに用いるとき、この用語は、療法全体を向上させるか、望まれない作用を低減もしくは回避するか、または別の療法の治療有効性を高めるか、もしくはそれと相乗する量を包含することができる。一実施形態では、当技術分野で公知のアッセイまたは本明細書に記載するアッセイにおいて、療法の治療有効量は、対照（例えばリン酸緩衝食塩水などの陰性対照）に比べて少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％だけ、望まれない作用を低減もしくは回避するか、または別の療法の治療有効性を高めるか、もしくはそれと相乗する。

非癌性過剰増殖性細胞障害に関連して本明細書に使用する「治療有効量」は、前記障害の治療および／または管理に治療上の利益を提供する療法の量を単独で、または他の療法と組み合わせて表す。一態様では、治療有効量は、非癌性過剰増殖性細胞障害に冒されている細胞を破壊、改変、防除、または除去するために十分な療法の量を表す。別の態様では、治療有効量は、非癌性過剰増殖性細胞障害の症状を低減するために十分な療法の量を表す。別の態様では、治療有効量は、非癌性過剰増殖性細胞障害の拡大を遅延または最小化するために十分な療法の量を表す。特定の実施形態では、療法の治療有効量は、非癌性過剰増殖性細胞障害の成長または増殖を阻害するため、既存の非癌性過剰増殖性細胞を死滅させる（障害の退縮を引き起こす）ために十分な療法の量である。別の特定の実施形態では、療法の治療有効量は、当技術分野で公知の標準法により測定するとき、非癌性過剰増殖性細胞の成長を少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％だけ阻害するために十分な療法の量である。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの量とともに使用するとき、この用語は、療法全体を向上させるか、望まれない作用を低減もしくは回避するか、または別の療法の治療有効性を高めるか、もしくはそれと相乗する量を包含することができる。一実施形態では、当技術分野で公知のアッセイまたは本明細書に記載するアッセイにおいて、療法の治療有効量は、対照（例えばリン酸緩衝食塩水などの陰性対照）に比べて少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％だけ、望まれない作用を低減もしくは回避するか、または別の療法の治療有効性を高めるか、もしくはそれと相乗する。

感染に関連して本明細書に使用する「治療有効量」は、感染の重症度を低減するため、感染の持続期間を低減するため、感染の１つまたは複数の症状を改善するため、感染の進行を防止するため、感染の退行を引き起こすため、または別の療法の治療効果を高めるか、もしくは向上させるために十分な療法（例えば治療剤）の量を表す。ある実施形態では、治療有効量は、病原体の複製を減少もしくは阻害するため、病原体による細胞の感染を阻害もしくは減少させるため、病原体タンパク質の産生を阻害もしくは減少させるため、病原体の放出を阻害もしくは減少させるため、他の組織もしくは対象への病原体の拡大を阻害もしくは減少させるため、または感染に関連する１つもしくは複数の症状を改善するために十分な治療剤の量を表す。一実施形態では、当技術分野で公知のアッセイまたは本明細書に記載するアッセイにおいて、治療剤の治療有効量は、対照（例えばリン酸緩衝食塩水などの陰性対照）に比べて少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％だけ病原体の複製または拡大を低減する。病原体、例えばウイルスの複製を測定するために使用することができるアッセイには、例えばH.M. Temin and H. Rubin. 1958. Characteristics of an assay for Rous sarcoma virus and Rous sarcoma cells in tissue culture. Virology 17: 669-688；およびJ.W. Hartley and W.P. Rowe. 1966. Production of altered cell foci in tissue culture by defective Moloney sarcoma virus particles. Proc. Natl. Acad. Sci. 55: 780-786に記載されているような感染性アッセイおよび形質転換アッセイが挙げられるが、それに限定されるわけではない。これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書に使用する用語「療法」は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）の治療、予防、および／または管理に使用することができる任意のプロトコール、方法、および／または薬剤を表す。ある実施形態では、用語「療法」は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状の治療、予防、および／または管理に有用な、医療関係者などの当業者に公知の生物学的療法、支持療法、および／または他の療法を表す。

対象への療法の投与に関連して本明細書に使用する用語「治療する」、「治療」、および「治療すること」は、１つまたは複数の療法の投与（非限定的に、１つまたは複数の予防もしくは治療剤の投与を含む）に起因する、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／もしくは活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）の進行、重症度、および／もしくは持続期間の低減もしくは改善、ならびに／またはその１つもしくは複数の症状の改善を表す。特定の実施形態では、対象への療法の投与に関連した用語「治療する」、「治療」、および「治療すること」は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌）の進行、重症度、および／または持続期間の低減または改善を表し、その低減または改善は、対照（例えばリン酸緩衝食塩水などの陰性対照）に比べて少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％だけの癌細胞の低減を表す。他の実施形態では、対象への療法の投与に関連した用語「治療する」、「治療」、および「治療すること」は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌）の進行、重症度、および／または持続期間の低減または改善を表し、その低減または改善は、癌を有する対象の癌細胞数の無変化、入院期間の低減、死亡率の低減、または生存期間の増加を表す。

５．本発明の詳細な説明
下に詳述するように、本発明は、Ｔ細胞抗原ＣＤ３に免疫特異的に結合する第１の結合ドメインと、ＥｐｈＡ２受容体に免疫特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体に関する。そのような二重特異性単鎖抗体は、用語「ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ」に包含される。本発明はさらに、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害の治療、予防、および／または管理のために設計された方法および組成物に関する。そのような障害には、非限定的に、癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染が挙げられる。本発明はさらに、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチドを含むベクター、それを用いて形質転換された宿主細胞、および前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ産生へのその使用に関する。本発明は、前述のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、ポリヌクレオチド、またはベクターのうち任意のものを単独で、または１つまたは複数の予防剤、または治療剤と組み合わせて含む、医薬組成物などの組成物も提供する。前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥについてのスクリーニング方法ならびに前述の組成物および診断試薬のうち任意のものを備えるキットも開示する。

５．１ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ
本発明は、ＥｐｈＡ２およびＴ細胞抗原ＣＤ３と免疫特異的に結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［すなわちＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ（特に、二重特異性単鎖抗体であるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ）］ならびにＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を治療、予防、および／または管理するためにそれを使用する方法を提供する。そのような障害には、例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染が挙げられる。一態様では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２を異常発現する細胞の除去に、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２特異性抗体よりも効率的である。特定の態様では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞（特に、ＥｐｈＡ２を発現している悪性癌細胞）の除去に、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２抗体よりも効率的である。別の態様では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２を発現している非癌性過剰増殖性細胞の除去に、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２抗体よりも効率的である。なお別の態様では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２を発現している感染細胞（特に、呼吸器合胞体ウイルス「ＲＳＶ」に感染した細胞）の除去に、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２抗体よりも効率的である。別の態様では、当技術分野で公知のＥｐｈＡ２特異性抗体よりも低い投与量のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害を治療、予防、および／または管理するために必要である。

本発明のＥｐｈＡ２特異的ＢｉＴＥ（以下、「ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ」または「ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子」）は、Ｔ細胞抗原ＣＤ３に免疫特異的に結合する第１の結合ドメインと、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む。一実施形態では、第１の結合ドメインはＣＤ３に免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３の任意のサブユニット（例えばγ、δ、ζ、またはηサブユニット）の１つまたは複数に免疫特異的に結合する。好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３のイプシロン（ε）サブユニットに免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３のイプシロン（ε）サブユニットがＣＤ３のδサブユニットと複合体化している場合に、前記εサブユニットに免疫特異的に結合する。別の実施形態では、ＣＤ３に結合する結合ドメインは脱免疫化されている。別の特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する。好ましい実施形態では、癌の治療、予防、および／または管理に使用されるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第２の結合ドメインは、非癌細胞ではなく癌細胞上に選択的に露出および／または増加している、ＥｐｈＡ２のエピトープに免疫特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第２の結合ドメインは、正常細胞ではなく、非癌性過剰増殖細胞上に選択的に露出および／または増加している、ＥｐｈＡ２のエピトープに免疫特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第２の結合ドメインは、非感染細胞ではなく、感染細胞上に選択的に露出および／または増加している、ＥｐｈＡ２のエピトープに免疫特異的に結合する。

本発明は、第１の結合ドメインが、Ｔ細胞抗原ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、第２の結合ドメインが、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供する。特定の実施形態では、第１の結合ドメインのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、Ｔ細胞抗原ＣＤ３への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。この実施形態に加えて、そのようなリンカーは、例えば配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ_２Ｓ）_２ＧＧＡＤ（配列番号５７）を含むことがある。別の特定の実施形態では、第２の結合ドメインのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ＥｐｈＡ２への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。この実施形態に加えて、そのようなリンカーは、例えば配列（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号５９）を含むことがある。別の特定の実施形態では、第１および第２の結合ドメインは、Ｔ細胞抗原ＣＤ３およびＥｐｈＡ２への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。この実施形態に加えて、そのようなリンカーは、例えば配列Ｇ_４Ｓ（配列番号５８）を含むことがある。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、（配列番号６５）のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、単一ドメイン抗体を含む。

前節の実施形態によると、結合は共有結合である。特定の実施形態では、本発明のリンカーは、セリンおよびグリシン残基を含む。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのリンカー、例えばＣＤ３に結合する第１の結合ドメインのＶＨドメインとＶＬドメインの間のリンカー、ＥｐｈＡ２に結合する第２の結合ドメインのＶＨドメインとＶＬドメインの間のリンカー、およびＣＤ３に結合する第１の結合ドメインとＥｐｈＡ２に結合する第２の結合ドメインの間のリンカーは、それぞれＣＤ３およびＥｐｈＡ２抗原への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な任意の長さでありうる。ある実施形態では、本発明のリンカーは、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０残基、少なくとも２５残基、少なくとも３０残基、またはそれを超える長さを含む。他の実施形態では、本発明のリンカーは、２〜４残基の間、２〜４残基の間、２〜６残基の間、２〜８残基の間、２〜１０残基の間、２〜１２残基の間、２〜１４残基の間、２〜１６残基の間、２〜１８残基の間、２〜２０残基の間、２〜２２残基の間、２〜２４残基の間、２〜２６残基の間、２〜２８残基、または２〜３０残基の間の長さを含む。ある実施形態では、第１の結合ドメインは、第２の結合ドメインの５’側である。他の実施形態では、第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインの５’側である。ある実施形態では、第１および第２の結合ドメインは単鎖抗体である。特定の実施形態では、第１および第２の結合ドメインは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。

別の特定の実施形態では、本発明は、（ａ）ＣＤ３のε鎖と免疫特異的に結合する抗体にそれぞれ由来する第１の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインであって、前記第１の重鎖可変ドメインおよび前記第１の軽鎖可変ドメインがフォールディングしてＣＤ３のεサブユニットと結合する第１の結合ドメインを形成するような十分な長さの第１のリンカー［例えばＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ_２Ｓ）_２ＧＧＡＤ（配列番号５７）］により、前記第１の重鎖可変ドメインが前記第１の軽鎖可変ドメインに共有結合している第１の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインと、（ｂ）細胞表面に露出したＥｐｈＡ２のエピトープと免疫特異的に結合する抗体に由来する第２の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインであって、前記第２の重鎖可変ドメインおよび前記第２の軽鎖可変ドメインがフォールディングしてＥｐｈＡ２の前記エピトープと結合する第２の結合ドメインを形成するような十分な長さの第２のリンカー（例えば（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号５９））により、前記第２重鎖可変ドメインが前記第２の軽鎖可変ドメインに共有結合している第２の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体であって、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが相互に独立してフォールディングするような長さの第３のリンカー（例えばＧ_４Ｓ（配列番号５８））により、前記第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは共有結合している二重特異性単鎖抗体を提供する。

十分に公知のように、ある状況で完全な抗原認識結合ドメインを含む抗体断片は、非共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の二量体からなることがある。未変性抗体に見い出されるものに対応するこの立体配置では、各可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を規定する。集団的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を付与する。ＣＤＲに隣接するフレームワーク（ＦＲ）は、ヒトおよびマウスのように多様な種の未変性免疫グロブリンにおいて本質的に保存されている三次構造を有する。これらのＦＲは、ＣＤＲを適切な方向に保持するように働く。定常ドメインは結合機能には必要ないが、ＶＨ−ＶＬ相互作用を安定化することを援助することができる。単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つだけ含む半分のＦｖ）は、抗原を認識して、高いコンフォメーション安定性でそれと結合する能力を有する（例えばDumoulin et al., 2002, Protein Science 11:500-515を参照のこと）。したがって、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの結合ドメインの前記ドメインは、同一または異なる免疫グロブリンのいずれかのＶＨ−ＶＬドメインの対を含むことがある。ポリペプチド鎖内のＶＨドメインおよびＶＬドメインの順序は、本発明に決定的ではなく、本発明は、可変ドメインのすべての可能な配置を包含する。しかし、抗原結合ドメインが正しくフォールディングし、抗原を認識してそれと結合できるように、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが配置されることが重要である。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２結合ドメインのドメインは、同一または異なる免疫グロブリンに由来しうる。

したがって、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、各抗体の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメイン［例えばＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬドメインならびに関心対象の別の抗原（例えばＥｐｈＡ２）に免疫特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬドメイン］の任意の配置を含むことがあり、各ドメインはＢｉＴＥ分子のＮ末端またはＣ末端部分に位置することがある。例えば、限定する目的ではなく、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子は、以下の表に概要する以下の配置を含むことがある。

上に論じた前記結合ドメインは、柔軟なリンカーにより、好ましくは前記ドメイン同士の間に置かれたポリペプチドリンカーにより好ましくは連結しており、本発明のポリペプチドが水溶液中に置かれたときに結合に適したコンフォメーションをとる場合に、前記ポリペプチドリンカーは、前記結合ドメインを含む前記ドメインの一方のＣ末端と、前記結合ドメインを含む前記ドメインの他方のＮ末端との間の距離に及ぶために十分な長さの、複数で親水性のペプチド結合したアミノ酸を含む。好ましくは、前記ポリペプチドリンカーは、複数のグリシン、アラニン、および／またはセリン残基を含む。前記ポリペプチドリンカーが、アミノ酸配列の複数の連続コピーを含むことがさらに好ましい。通常は、ポリペプチドリンカーは１〜１５個のアミノ酸を含むが、アミノ酸が１５個を超えるポリペプチドリンカーも同様に役立つことがある。ある実施形態では、本発明のリンカーは、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０残基、少なくとも２５残基、少なくとも３０残基、またはそれを超える長さを含む。他の実施形態では、本発明のリンカーは、２〜４残基の間、２〜４残基の間、２〜６残基の間、２〜８残基の間、２〜１０残基の間、２〜１２残基の間、２〜１４残基の間、２〜１６残基の間、２〜１８残基の間、２〜２０残基の間、２〜２２残基の間、２〜２４残基の間、２〜２６残基の間、２〜２８残基の間、または２〜３０残基の間の長さを含む。本発明の方法により使用することができるリンカーの例は、図３に見い出される（配列番号５７〜５９）。

本発明の実施形態では、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する抗体またはリガンドは、ＢｉＴＥ分子の部分を含む。例えば、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する抗体のＶＨおよび／またはＶＬ（好ましくはｓｃＦＶ）は、上記分子の部分のような抗ＣＤ３結合部分に融合することによって、ＥｐｈＡ２を標的とする二重特異性単鎖抗体を生み出すことができる。抗体ＥｐｈＡ２のＶＨおよび／またはＶＬドメインに加えて、ＥｐｈＡ２と結合する他の分子、例えば受容体またはリガンド（例えばエフリン）がＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを含むことがある。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＣＤ３と免疫特異的に結合する第１の結合ドメインと、ＥｐｈＡ２と免疫特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む二重特異性単鎖抗体である。特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬドメインの脱免疫化バージョンを含む。またこの実施形態によると、第２の結合ドメインはＥＡ２のＶＨおよびＶＬドメインを含む。好ましくは、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの可変領域の配置は、以下、すなわちＣＤ３結合ドメインのＶＨ−ＶＬおよびＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ結合ドメインのＶＨ−ＶＬである。またこの実施形態によると、特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、ＥＡ２、ＥＡ３、ＥＡ４、ＥＡ５、３Ｆ２、４Ｈ５、２Ａ４、２Ｅ７、１２Ｅ２、Ｅｐｈ０９９Ｂ−１０２．１４７、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２０８．２６１、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２１０．２４８、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２３３．１５２、Ｅｐｈ１０１．５３０．２４１、２３３、またはＧ５のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ（特に二重特異性単鎖抗体であるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ）が由来する抗体を産生する方法は、当技術分野において十分に公知であり、例えばＵＳ２００４−００９１４８６Ａ１（２００４年５月１３日）、ＵＳ２００４−００２８６８５Ａ１（２００４年２月１２日）、およびＷＯ９９／５４４０（および本明細書に開示されている参照）に見い出すことができる。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。親和性を最適化したＥｐｈＡ２アゴニスト抗体変異体２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２に関する情報については、２００５年１２月２１日に出願された「親和性を最適化したＥｐｈＡ２アゴニスト抗体およびそれを使用する方法」という名称の米国仮出願第６０／７５１，９６４号もまた参照のこと。この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

５．１．１ＥｐｈＡ２抗体
上に論じるように、本発明は、ＥｐｈＡ２抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれ特異的な少なくとも２つの結合ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［すなわちＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ（特に、二重特異性単鎖抗体であるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ）］を包含する。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、Ｔ細胞抗原ＣＤ３に結合する第１の結合ドメインと、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはその断片に結合する第２の結合ドメインとを含む。

特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。本明細書に使用する用語「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片を表し、これらのドメインは１本鎖ポリペプチドに存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、さらにＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、そのリンカーは、ｓｃＦｖが抗原の結合のために所望の構造を形成できるようにする。ｓｃＦｖを産生するための方法は当技術分野において十分に公知である。ｓｃＦｖを産生するための方法の総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。一実施形態では、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの結合ドメインは、本明細書に開示するＥｐｈＡ２抗体などの任意の抗体から産生されたｓｃＦｖに由来する。

特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを発生させるために使用されるＥｐｈＡ２抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちＥｐｈＡ２抗原に免疫特異的に結合する抗原結合ドメイン、例えば抗ＥｐｈＡ２抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む分子が含まれる。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥｐｈＡ２結合ドメインが由来するＥｐｈＡ２抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、またはサブクラスでありうる。

他の特定の実施形態では、本発明に包含されるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを発生させるために使用されるＥｐｈＡ２抗体は、ＥＡ２（図１参照）、ＥＡ３、ＥＡ４、ＥＡ５（図２参照）、３Ｆ２（図３０参照）、４Ｈ５（図３２参照）、２Ａ４（図３３）、２Ｅ７（図３４）、１２Ｅ２（図３５）、Ｅｐｈ０９９Ｂ−１０２．１４７、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２０８．２６１、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２１０．２４８、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２３３．１５２、Ｅｐｈ１０１．５３０．２４１、２３３（図２９）、およびＧ５（図４２）である。また、例えば米国特許出願公開第２００４−００９１４８６Ａ１号（２００４年５月１３日）、第２００４−００２８６８５Ａ１号（２００４年２月１２日）、第２００５−００５９５９２Ａ１号（２００５年３月１７日）、第２００５−００４８６１７Ａ１号、２００５年６月２４日に出願された米国特許出願第１１／１６５，０２３号、および２００５年８月１５日に出願された第１１／２０３，２５１号もまた参照のこと。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明の抗体ＥＡ２産生ハイブリドーマ（ＥＡ２．３１株）および抗体ＥＡ５産生ハイブリドーマ（ＥＡ５．１２株）は、２００２年５月２２日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１０８）に寄託され、それぞれ受託番号ＰＴＡ−４３８０およびＰＴＡ−４３８１を割り付けられた。これらの株は、参照により組み込まれている。Ｅｐｈ０９９Ｂ−１０２．１４７、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２０８．２６１、およびＥｐｈ０９９Ｂ−２１０．２４８は、２００２年８月７日にＡＴＣＣに寄託され、受託番号（それぞれＰＴＡ−４５７２、ＰＴＡ−４５７３、およびＰＴＡ−４５７４）を割り付けられた。Ｅｐｈ０９９Ｂ−２３３．１５２は２００３年５月１２日にＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＰＴＡ−５１９４を割り付けられ、Ｅｐｈ１０１．５３０．２４１は、２００２年９月２６日にＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＰＴＡ−４７２４を割り付けられた。前述の寄託物のすべては、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定により行われ、それぞれの抗体に対応する受託番号および日付は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

特定の実施形態では、本発明の方法を用いてＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを生み出すために使用される抗体は、ヒトまたはヒト化バージョンの前述のＥｐｈＡ２抗体である。そのようなヒト化ＥｐｈＡ２抗体および産生方法は、例えば米国特許出願公開第２００５−００４８６１７Ａ１号およびDall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60に開示されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。別の特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを発生するために使用されるＥｐｈＡ２抗体はＥＡ２である。なお別の特定の実施形態では、本発明の方法を用いてＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを生み出すために使用される抗体は、前述の抗体の親和性を最適化したヒト化バージョンである。この実施形態によると、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインは、２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２に由来する。親和性を最適化したＥｐｈＡ２アゴニスト抗体変異体２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２に関する情報については、２００５年１２月２１日に出願された「親和性を最適化したアゴニスト抗体およびそれを使用する方法」という名称の米国仮出願第６０／７５１，９６４号もまた参照のこと。この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

いくつかのＥｐｈＡ２抗体の配列は、図１、２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３７、もしくは３９、または上に引用するＥｐｈＡ２抗体の配列を開示している刊行物に開示されている。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが発生する元になるＥｐｈＡ２抗体を調製するための方法は、例えば米国特許出願公開第２００４−００９１４８６Ａ１号（２００４年５月１３日）、第２００４−００２８６８５Ａ１号（２００４年２月１２日）、第２００５−００５９５９２Ａ１号（２００５年３月１７日）、第２００５−００４８６１７Ａ１号、２００５年６月２４日に出願された米国特許出願第１１／１６５，０２３号、および２００５年８月１５日に出願された第１１／２０３，２５１号に開示されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に由来するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記抗体は、例えば図１、２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３７もしくは３９、または上に引用するＥｐｈＡ２抗体を開示している刊行物に明白にされたＶＨＣＤＲのうち任意の１つのアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲを含むことがある。特に、本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、例えば図１、２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３７もしくは３９、または上に引用するＥｐｈＡ２抗体の配列を開示している刊行物に挙げられた任意のＶＨＣＤＲのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超えるＶＨＣＤＲを含む（あるいはそれからなる）。

本発明は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に由来するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記抗体は、例えば図１、２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３７もしくは３９、または上に引用するＥｐｈＡ２抗体を開示している刊行物に明白にされたＶＬＣＤＲのうち任意の１つのアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲを含むことがある。特に、本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、例えば図１、２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３７もしくは３９、または上に引用するＥｐｈＡ２抗体の配列を開示している刊行物に挙げられた任意のＶＬＣＤＲのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超えるＶＨＣＤＲを含む（あるいはそれからなる）。

本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＶＨＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ３およびＶＨＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨ１ＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３を、あるいは例えば図１、２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３７もしくは３９、または上に引用するＥｐｈＡ２抗体の配列を開示している刊行物に開示されているＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲのうちその任意の組合せを含む（あるいはそれからなる）。

他の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、上に言及する、例えば図１、２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３７もしくは３９、または上に引用するＥｐｈＡ２抗体の配列を開示している刊行物に開示されている前述の任意のＥｐｈＡ２抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む（あるいはそれからなる）。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２抗体に由来する。例えば図３３、３４、３５、および３７を参照のこと。

特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に由来し、前記抗体は、少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、もしくは少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１、または約１０^５から１０^８Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、約１．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から１×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、約２×１０^５から１×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、もしくは約４．５×１０^５から１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲の会合速度定数またはｋ_ｏｎ速度［抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ］を有する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、または少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎを有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的する抗体に由来し、前記抗体は、１０^−３ｓ^−１未満、５×１０^−３ｓ^−１未満、１０^−４ｓ^−１未満、２×１０^−４ｓ^−１未満、５×１０^−４ｓ^−１未満、１０^−５ｓ^−１未満、５×１０^−５ｓ^−１未満、１０^−６ｓ^−１未満、５×１０^−６ｓ^−１未満、１０^−７ｓ^−１未満、５×１０^−７ｓ^−１未満、１０^−８ｓ^−１未満、５×１０^−８ｓ^−１未満、１０^−９ｓ^−１未満、５×１０^−９ｓ^−１未満、もしくは１０^−１０ｓ^−１未満、または約１０^−３から１０^−１０ｓ^−１の範囲、約１０^−４から１０^−８ｓ^−１の範囲、もしくは約１０^−５から１０^−８ｓ^−１の範囲のｋ_ｏｆｆ速度［抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ］を有する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、１０^−２ｓ^−１、５×１０^−３ｓ^−１未満、または１０^４ｓ^−１未満のｋ_ｏｆｆを有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的する抗体に由来し、前記抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、少なくとも１０^２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^２Ｍ^−１、少なくとも１０^３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^３Ｍ^−１、少なくとも１０^４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^４Ｍ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１２Ｍ^−１、少なくとも１０^１３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１３Ｍ^−１、少なくとも１０^１４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１４Ｍ^−１、少なくとも１０^１５Ｍ^−１、もしくは少なくとも５×１０^１５Ｍ^−１、または約１０^２から５×１０^５Ｍ^−１の範囲、約１０^４から１×１０^１０Ｍ^−１の範囲、もしくは約１０^５から１×１０^８Ｍ^−１の範囲の親和定数すなわちＫａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）を有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的する抗体に由来し、前記抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、１０^−５Ｍ未満、５×１０^−５Ｍ未満、１０^−６Ｍ未満、５×１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、５×１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、５×１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、５×１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満、５×１０^−１１Ｍ未満、１０^−１２Ｍ未満、５×１０^−１２Ｍ未満、１０^−１３Ｍ未満、５×１０^−１３Ｍ未満、１０^−１４Ｍ未満、５×１０^−１４Ｍ未満、１０^−１５Ｍ未満、もしくは５×１０^−１５Ｍ未満、または約１０^−２Ｍから５×１０^−５Ｍの範囲、約１０^−６から１０^−１５Ｍの範囲、もしくは約１０^−８から１０^−１４Ｍの範囲の解離定数すなわちＫ_ｄ（Ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）を有する。

特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、もしくは少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１、または約１０^５から１０^８Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、約１．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から１×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、約２×１０^５から１×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、もしくは約４．５×１０^５から１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲の会合速度定数またはｋ_ｏｎ速度［抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ］を有する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、または少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎを有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、１０^−３ｓ^−１未満、５×１０^−３ｓ^−１未満、１０^−４ｓ^−１未満、２×１０^−４ｓ^−１未満、５×１０^−４ｓ^−１未満、１０^−５ｓ^−１未満、５×１０^−５ｓ^−１未満、１０^−６ｓ^−１未満、５×１０^−６ｓ^−１未満、１０^−７ｓ^−１未満、５×１０^−７ｓ^−１未満、１０^−８ｓ^−１未満、５×１０^−８ｓ^−１未満、１０^−９ｓ^−１未満、５×１０^−９ｓ^−１未満、もしくは１０^−１０ｓ^−１未満、または約１０^−３から１０^−１０ｓ^−１の範囲、約１０^−４から１０^−８ｓ^−１の範囲、もしくは約１０^−５から１０^−８ｓ^−１の範囲のｋ_ｏｆｆ速度［抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ］を有する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、１０^−２ｓ^−１、５×１０^−３ｓ^−１未満、または１０^−４ｓ^−１未満のｋ_ｏｆｆを有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、少なくとも１０^２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^２Ｍ^−１、少なくとも１０^３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^３Ｍ^−１、少なくとも１０^４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^４Ｍ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１２Ｍ^−１、少なくとも１０^１３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１３Ｍ^−１、少なくとも１０^１４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１４Ｍ^−１、少なくとも１０^１５Ｍ^−１、もしくは少なくとも５×１０^１５Ｍ^−１、または約１０^２から５×１０^５Ｍ^−１の範囲、約１０^４から１×１０^１０Ｍ^−１の範囲、もしくは約１０^５から１×１０^８Ｍ^−１の範囲の親和定数すなわちＫａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）を有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、１０^−５Ｍ未満、５×１０^−５Ｍ未満、１０^−６Ｍ未満、５×１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、５×１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、５×１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、５×１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満、５×１０^−１１Ｍ未満、１０^−１２Ｍ未満、５×１０^−１２Ｍ未満、１０^−１３Ｍ未満、５×１０^−１３Ｍ未満、１０^−１４Ｍ未満、５×１０^−１４Ｍ未満、１０^−１５Ｍ未満、もしくは５×１０^−１５Ｍ未満、または約１０^−２Ｍから５×１０^−５Ｍの範囲、約１０^−６から１０^−１５Ｍの範囲、もしくは約１０^−８から１０^−１４Ｍの範囲の解離定数すなわちＫ_ｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）を有する。

５．１．２ＣＤ３抗体
本発明の特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＣＤ３Ｔ細胞抗原と免疫特異的に結合する結合ドメインを含む。前記ＣＤ３Ｔ細胞抗原は任意の種（例えばヒト）由来でありうる。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＣＤ３の１つまたは複数のサブユニット（例えばγ、δ、ζ、またはηサブユニット）に免疫特異的に結合する結合ドメインを含む。好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３のイプシロン（ε）サブユニットに免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、ＣＤ３のイプシロン（ε）サブユニットがＣＤ３のδサブユニットと複合体化している場合に、第１の結合ドメインは、前記εサブユニットに免疫特異的に結合する。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＣＤ３結合ドメインは脱免疫化されている。脱免疫化アプローチは、当技術分野で十分に公知であり、例えば国際公開ＷＯ００／３４３１７（特に１〜１４頁）、ＷＯ９８／５２９７６（特に１８〜３８頁の実施例１〜６）、ＷＯ０２／０７９４１５（特に２〜８頁および１５〜４３頁の実施例１〜１０）、およびＷＯ９２／１０７５５（特に６〜９頁）に開示されている。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

特定の実施形態では、ＣＤ３に免疫特異的に結合する結合ドメインは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。本明細書に使用する用語「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片を表し、これらのドメインは、１本鎖ポリペプチドに存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、さらにＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、そのリンカーは、ｓｃＦｖが抗原の結合のために所望の構造を形成できるようにする。ｓｃＦｖを産生するための方法は当技術分野において十分に公知である。ｓｃＦｖを産生するための方法の総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。一実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、下に開示するＥｐｈＡ２抗体のうち任意のものから産生したｓｃＦｖに由来する。

特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを発生させるために使用されるＣＤ３抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちＣＤ３抗原に免疫特異的に結合する抗原結合ドメイン、例えば抗ＣＤ３抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む分子が挙げられる。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＣＤ３結合ドメインが由来するＣＤ３抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、またはサブクラスでありうる。そのようなＣＤ３抗体は、任意の種（例えばラット、マウス、ヒトなど）由来であってもよい。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＣＤ３結合ドメインは、国際公開ＷＯ９９／５４４４０（３頁および図８）に記載されるように産生させることができる。これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。前記結合ドメインが由来する抗ＣＤ３抗体は、例えばKipriyanov, 1998, Int. J. Cancer 77:763-772 (p. 763-765); Dreier et al., 2002, Int. J. Cancer 100:690-697 (p. 691)にも記載されており、その文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明は、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に由来するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記抗体は、例えば上に引用するＣＤ３抗体または結合性断片を開示している刊行物に開示されているＶＨＣＤＲのうち任意の１つのアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲを含むことがある。特に、本発明は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、例えば上に引用するＣＤ３抗体または結合性断片を開示している刊行物に開示されている任意のＶＨＣＤＲのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超えるＶＨＣＤＲを含む（あるいはそれからなる）。

本発明は、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に由来するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記抗体は、例えば上に引用するＣＤ３抗体または結合性断片を開示している刊行物に開示されているＶＬＣＤＲのうち任意の１つのアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲを含むことがある。特に、本発明は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、例えば上に引用するＣＤ３抗体または結合性断片を開示している刊行物に開示されている任意のＶＬＣＤＲのアミノ酸配列を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超えるＶＬＣＤＲを含む（あるいはそれからなる）。

本発明は、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＶＨＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ３およびＶＨＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨ１ＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ１；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ２；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３；ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３；または上記のＣＤ３抗体のＶＨＣＤＲおよびＶＬＣＤＲのうちその任意の組合せを含む（あるいはそれからなる）。

他の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体に由来するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記抗体は、上記ＣＤ３抗体の１つのＶＨドメインおよび１つのＶＬドメインを含むことがある。

特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体に由来し、前記抗体は、少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、もしくは少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１、または約１０^５から１０^８Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、約１．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から１×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、約２×１０^５から１×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、もしくは約４．５×１０^５から１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲の会合速度定数すなわちｋ_ｏｎ速度［抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ］を有する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、または少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎを有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に由来し、前記抗体は、１０^−３ｓ^−１未満、５×１０^−３ｓ^−１未満、１０^−４ｓ^−１未満、２×１０^−４ｓ^−１未満、５×１０^−４ｓ^−１未満、１０^−５ｓ^−１未満、５×１０^−５ｓ^−１未満、１０^−６ｓ^−１未満、５×１０^−６ｓ^−１未満、１０^−７ｓ^−１未満、５×１０^−７ｓ^−１未満、１０^−８ｓ^−１未満、５×１０^−８ｓ^−１未満、１０^−９ｓ^−１未満、５×１０^−９ｓ^−１、もしくは１０^−１０ｓ^−１未満、または約１０^−３から１０^−１０ｓ^−１の範囲、約１０^−４から１０^−８ｓ^−１の範囲、もしくは約１０^−５から１０^−８ｓ^−１の範囲のｋ_ｏｆｆ速度［抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ］を有する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、１０^−２ｓ^−１、５×１０^−３ｓ^−１未満、または１０^−４ｓ^−１未満のｋ_ｏｆｆを有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に由来し、前記抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、少なくとも１０^２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^２Ｍ^−１、少なくとも１０^３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^３Ｍ^−１、少なくとも１０^４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^４Ｍ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１２Ｍ^−１、少なくとも１０^１３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１３Ｍ^−１、少なくとも１０^１４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１４Ｍ^−１、少なくとも１０^１５Ｍ^−１、もしくは少なくとも５×１０^１５Ｍ^−１、または約１０^２から５×１０^５Ｍ^−１の範囲、約１０^４から１×１０^１０Ｍ^−１の範囲、もしくは約１０^５から１×１０^８Ｍ^−１の範囲の親和定数すなわちＫ_ａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）を有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、その結合ドメインは、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に由来し、前記抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、１０^−５Ｍ未満、５×１０^−５Ｍ未満、１０^−６Ｍ未満、５×１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、５×１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、５×１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、５×１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満、５×１０^−１１Ｍ未満、１０^−１２Ｍ未満、５×１０^−１２Ｍ未満、１０^−１３Ｍ未満、５×１０^−１３Ｍ未満、１０^−１４Ｍ未満、５×１０^−１４Ｍ未満、１０^−１５Ｍ、もしくは５×１０^−１５Ｍ未満、または約１０^−２Ｍから５×１０^−５Ｍの範囲、約１０^−６から１０^−１５Ｍの範囲、もしくは約１０^−８から１０^−１４Ｍの範囲の解離定数すなわちＫ_ｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）を有する。

特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１．５×１０^５Ｍ^−１ｓ⁻１、少なくとも２×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、もしくは少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１、または約１０^５から１０^８Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、約１．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から１×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、約２×１０^５から１×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の範囲、もしくは約４．５×１０^５から１０^７Ｍ^−１ｓ^−１の範囲の会合速度定数すなわちｋ_ｏｎ速度［抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ］を有する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、または少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎを有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、１０^−３ｓ^−１未満、５×１０^−３ｓ^−１未満、１０^−４ｓ^−１未満、２×１０^−４ｓ^−１未満、５×１０^−４ｓ^−１未満、１０^−５ｓ^−１未満、５×１０^−５ｓ^−１未満、１０^−６ｓ^−１未満、５×１０^−６ｓ^−１未満、１０^−７ｓ^−１未満、５×１０^−７ｓ^−１未満、１０^−８ｓ^−１未満、５×１０^−８ｓ^−１未満、１０^−９ｓ^−１未満、５×１０^−９ｓ^−１、もしくは１０^−１０ｓ^−１未満、または約１０^−３から１０^−１０ｓ^−１の範囲、約１０^−４から１０^−８ｓ^−１の範囲、もしくは約１０^−５から１０^−８ｓ^−１の範囲のｋ_ｏｆｆ速度［抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ］を有する。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、１０^−２ｓ^−１、５×１０^−３ｓ^−１未満、または１０^−４ｓ^−１未満のｋ_ｏｆｆを有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、少なくとも１０^２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^２Ｍ^−１、少なくとも１０^３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^３Ｍ^−１、少なくとも１０^４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^４Ｍ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１２Ｍ^−１、少なくとも１０^１３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１３Ｍ^−１、少なくとも１０^１４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１４Ｍ^−１、少なくとも１０^１５Ｍ^−１、もしくは少なくとも５×１０^１５Ｍ^−１、または約１０^２から５×１０^５Ｍ^−１の範囲、約１０^４から１×１０^１０Ｍ^−１の範囲、もしくは約１０^５から１×１０^８Ｍ^−１の範囲の親和定数すなわちＫ_ａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）を有する。

別の特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３ポリペプチドに免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを提供し、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定すると、１０^−５Ｍ未満、５×１０^−５Ｍ未満、１０^−６Ｍ未満、５×１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、５×１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、５×１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、５×１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満、５×１０^−１１Ｍ未満、１０^−１２Ｍ未満、５×１０^−１２Ｍ未満、１０^−１３Ｍ未満、５×１０^−１３Ｍ未満、１０^−１４Ｍ未満、５×１０^−１４Ｍ未満、１０^−１５Ｍ未満、もしくは５×１０^−１５Ｍ未満、または約１０^−２Ｍから５×１０^−５Ｍの範囲、約１０^−６から１０^−１５Ｍの範囲、もしくは約１０^−８から１０^−１４Ｍの範囲の解離定数すなわちＫ_ｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）を有する。

５．１．３ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコンジュゲート
本発明は、さらに、少なくとも１つのさらなるドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー［すなわちＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ（特に二重特異性単鎖抗体であるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ］に関し、前記ドメインは、共有または非共有結合により結合している。追加のドメインは、所定の特異性または機能でありうる。したがって、本発明は、融合タンパク質を発生させるための、異種ポリペプチドに（またはその断片、好ましくは少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、もしくは少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチドに）組換え融合または化学コンジュゲート（共有コンジュゲーションおよび非共有コンジュゲーションの両方を含む）した、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの使用に関する。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して起こってもよい。例えば、抗体を使用して、その抗体を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合またはコンジュゲートすることにより、特定の細胞型の異種ポリペプチドをｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏのいずれかで標的化することができる。例えば国際公開ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99；米国特許第５，４７４，９８１号；Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432;およびFell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452を参照のこと。これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明には、さらに、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ断片に融合またはコンジュゲートした異種ポリペプチドを含む組成物が含まれる。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、またはその断片に融合またはコンジュゲートすることができる。抗体断片にポリペプチドを融合またはコンジュゲートさせるための方法は、当技術分野で公知である。例えば米国特許第５，３３６，６０３号、第５，６２２，９２９号、第５，３５９，０４６号、第５，３４９，０５３号、第５，４４７，８５１号、および第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；国際公開ＷＯ９６／０４３８８およびＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539；Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；ならびにVil et al., 1992, PNAS 89:11337- 11341を参照のこと（前記参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。

例えば前述の任意のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの、追加の融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と呼ぶ）の技法により発生させることができる。ＤＮＡシャフリングは、本発明の抗体（例えば高い親和性および低い解離速度を有する抗体）の活性を変化させるために採用することができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号；第５，８３０，７２１号；第５，８３４，２５２号；および第５，８３７，４５８号、ならびにPatten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76；Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265；およびLorenzo and Blasco, 1998, BioTechniques 24:308（これらの特許および刊行物のそれぞれは、これによりその全体が参照により組み込まれている）を参照のこと。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはコードされているＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、誤りがちのＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法に供してから組換えを行うことにより変化させることができる。抗体または抗体断片をコードしているポリヌクレオチドの１つまたは複数の断片であって、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する断片は、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などを用いて組み換えることができる。

さらに、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはその断片は、精製を容易にするためにペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ＥｔｏｎＡｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）に用意されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その中の多くが市販されている。例えばGentz et al., 1989, PNAS 86:821に記載されているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を導く。精製に有用な他のペプチドタグには、非限定的に、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ(Wilson et al., 1984, Cell 37:767)および「ｆｌａｇ」タグが挙げられる。

他の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはその断片もしくは変異体は、診断薬または検出可能な薬剤にコンジュゲートしている。そのようなＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、特定の療法の有効性を判定することなどの臨床検査の手順の一部として癌の発生または進行をモニターまたは予測するために有用なことがある。追加的に、そのような抗体は、ＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞に関連する前癌状態［例えば高悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、乳腺線維腺腫、線維嚢胞症、または複合母斑］の発生または進行をモニターまたは予測するために有用なことがある。一実施形態では、露出したＥｐｈＡ２エピトープ抗体は、診断薬または検出可能な薬剤にコンジュゲートしている。さらに特定の実施形態では、抗体はＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥである。

そのような診断および検出は、非限定的に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；非限定的に、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子団；非限定的に、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどの蛍光物質；非限定的に、ルミノールなどの発光物質；非限定的に、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；非限定的に、ビスマス（^２１３Ｂｉ）、炭素（^１４Ｃ）、クロム（^５１Ｃｒ）、コバルト（^５７Ｃｏ）、フッ素（^１８Ｆ）、ガドリニウム（^１５３Ｇｄ、^１５９Ｇｄ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、ゲルマニウム（^６８Ｇｅ）、ホルミウム（^１６６Ｈｏ）、インジウム（^１１５Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ）、ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ）、ランタン（^１４０Ｌａ）、ルテチウム（^１７７Ｌｕ）、マンガン（^５４Ｍｎ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、リン（^３２Ｐ）、プラシオジム（^１４２Ｐｒ）、プロメチウム（^１４９Ｐｍ）、レニウム（^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ）、ロジウム（^１０５Ｒｈ）、ルテニウム（^９７Ｒｕ）、サマリウム（^１５３Ｓｍ）、スカンジウム（^４７Ｓｃ）、セレニウム（^７５Ｓｅ）、ストロンチウム（^８５Ｓｒ）、イオウ（^３５Ｓ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、スズ（^１１３Ｓｎ、^１１７Ｓｎ）、トリチウム（^３Ｈ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（^１６９Ｙｂ、^１７５Ｙｂ）、イットリウム（^９０Ｙ）、亜鉛（^６５Ｚｎ）などの放射性物質；様々な陽電子放射型断層撮影を用いた陽電子放射型金属および非放射型常磁性金属イオンを非限定的に含めた検出可能な物質に抗体を結合させることにより実現することができる。

一実施形態では、患部組織（例えば腫瘍）へのＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの局在化は、組織中のラベル形態のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを検出することにより判定することができる。特定の実施形態では、標識化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、（ａ）有効量の標識化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを対象に投与する工程、および（ｂ）ＥｐｈＡ２が発現している部位に標識化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを対象において濃縮させるために十分な時間間隔の後で、対象におけるラベル化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを検出する工程を含む方法により、対象からｉｎｖｉｖｏで検出される。この実施形態によると、標識化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、当技術分野における任意の適切な方法により、対象に例えば非経口または腹腔内投与することができる。さらに、この実施形態によると、有効量のラベル化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、対象におけるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの検出を許す量である。この量は、特定の対象、使用する標識、および採用する検出法により変動するものである。例えば、対象の大きさおよび使用する画像化システムが、画像化手段を使用した対象におけるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを検出するために必要なラベル化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの量を決定するものであることが当技術分野で了解されている。ヒト対象のための放射性標識ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの場合では、投与するラベル化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの量は、放射能、例えば約５から２０ミリキュリーの^９９Ｔｃによって測定する。ラベル化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをＥｐｈＡ２が発現している対象の部位に濃縮させるのに十分な、ラベル化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ投与後の時間間隔は、いくつかの要因、例えば使用する標識の種類、投与形態、および画像化される対象の身体部分に応じて変動するものである。詳細な実施形態では、十分な時間間隔は、６から４８時間、６から２４時間、または６から１２時間である。別の実施形態では、時間間隔は５から２０日または５から１０日である。

ラベル化ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの存在は、当技術分野で公知の画像化手段を用いて対象から検出することができる。一般に、採用する画像化手段は、使用する標識の種類に依存する。当業者は、特定の標識を検出するために適切な手段を判定することができるものである。使用することができる方法および装置には、非限定的に、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽電子放射型断層撮影（ＰＥＴ）などの全身走査、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられる。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、放射性同位体で標識され、放射線応答性外科器械を使用して患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、蛍光化合物で標識され、蛍光応答性走査器械を使用して患者から検出される。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、陽電子放射型金属で標識され、陽電子放射型断層撮影を使用して患者から検出される。なお別の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、常磁性標識で標識され、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を使用して患者から検出される。

本発明は、さらに治療剤にコンジュゲートしたＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはその断片の使用を包含する。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、例えば細胞***抑制剤もしくは細胞破壊剤である細胞毒治療剤、または放射性金属イオン、例えばα放射体などの非高分子性治療部分にコンジュゲートさせることができる。細胞毒または細胞傷害剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。例には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、およびシクロホスファミド、ならびにそのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤には、非限定的に、代謝拮抗物質（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン［例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、およびドキソルビシン］、抗生物質［例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ）］、ならびに抗有糸***剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。

さらに、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、所与の生体応答を改変する治療剤または薬物部分にコンジュゲートさせることができる。治療剤または薬物部分は、古典的化学治療剤に限定されると解釈してはならない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質には、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭＩ（国際公開ＷＯ９７／３３８９９参照）、ＡＩＭＩＩ（国際公開ＷＯ９７／３４９１１参照）、Ｆａｓリガンド（Takahashi et al., 1994、J. Iminunol., 6:1567）、およびＶＥＧＩ（国際公開ＷＯ９９／２３１０５参照）、血栓剤もしくは抗血管新生剤、例えばアンギオスタチンもしくはエンドスタチンなどのタンパク質；または例えばリンホカイン［例えばインターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、および顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）］、もしくは成長因子［例えば成長ホルモン（「ＧＨ」）］などの生体応答調節薬を挙げることができる。

さらに、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、放射性金属イオンをコンジュゲートするために有用な放射性物質または大環状キレート剤などの治療部分にコンジュゲートさせることができる（放射性物質の例については上を参照のこと）。ある実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合することができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当技術分野で一般に公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90;Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553;およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50に記載されている。これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

特定の実施形態では、コンジュゲートしたＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非癌細胞ではなく癌細胞上に、または非感染細胞ではなく感染細胞上に露出したＥｐｈＡ２エピトープと好ましくは結合する１つのドメイン（すなわち露出したＥｐｈＡ２エピトープの抗体）と、ＣＤ３と好ましくは結合する第２ドメインとを含む。

抗体に治療部分をコンジュゲートするための技法は十分に公知である。部分は、アルデヒド／シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸に不安定な結合、シス−アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素分解可能な結合（一般にGarnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216参照）を非限定的に含めた当技術分野で公知の任意の方法により抗体にコンジュゲートすることができる。抗体に治療部分をコンジュゲートするための追加の技法は十分に公知である。例えばArnon et al., ”Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., ”Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, ”Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；”Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。ポリペプチド部分に抗体を融合またはコンジュゲートするための方法は、当技術分野で公知である。例えば米国特許第５，３３６，６０３号、第５，６２２，９２９号、第５，３５９，０４６号、第５，３４９，０５３号、第５，４４７，８５１号、および第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；国際公開ＷＯ９６／０４３８８およびＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539；Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；ならびにVil et al., 1992, PNAS 89:11337-11341を参照のこと。部分への抗体の融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して起こってもよい。そのようなリンカー分子は当技術分野で一般に公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553；Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50；Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216に記載されている。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に結合させてもよい。そのような固体支持体には、非限定的に、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられる。

５．２本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に開示するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチドの配列を提供する。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしている本発明のポリヌクレオチドは、第１の結合ドメインをコードしている第１のヌクレオチド配列と、第２の結合ドメインをコードしている第２のヌクレオチド配列と、第１および第２の結合ドメインを結合させるリンカー配列をコードしているヌクレオチド配列とを含む。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥポリヌクレオチド構築物の全体図については例えば図３を参照のこと。本発明は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチド配列もまた提供し、そのポリヌクレオチド配列では、第１および／または第２の結合ドメインをコードしているヌクレオチド配列は、当技術分野で公知か、もしくは本明細書に記載する抗ＥｐｈＡ２抗体（例えば、ＥＡ２、４Ｈ５、２Ａ４、２Ｅ７、または１２Ｅ２）および／または当技術分野で公知か、もしくは本明細書に記載する抗ＣＤ３抗体の１つまたは複数の可変ドメインのヌクレオチド配列にハイブリダイズする。

一実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドから産生するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２の発現を調節し、かつ／または当技術分野で十分に公知であるか、もしくは本明細書に記載するアッセイでのＴ細胞による、ＥｐｈＡ２を過剰発現している細胞の、対象を変更された溶解を誘導する。別の実施形態では、本発明の方法に使用されるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥには、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの断片をコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドから産生されたポリペプチドが含まれる。ハイブリダイゼーションのための条件には、非限定的に、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションに続く、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、約５０〜６５℃での１回もしくは複数回の洗浄などのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、６×ＳＳＣ中で、約４５℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションに続く、０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で、約６０℃での１回もしくは複数回の洗浄などの高度にストリンジェントな条件、または当業者に公知の他の任意のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件［例えばAusubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NYの６．３．１〜６．３．６頁および２．１０．３頁参照］が挙げられるが、それに限定されるわけではない。

本発明の方法に使用するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのヌクレオチド配列が決定すれば、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のために当技術分野で十分に公知の方法、例えば組換えＤＮＡ技法、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えばSambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技法を参照。これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）を用いて操作して、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発生させ、例えばアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を生み出すことができる。

特定の実施形態では、そのようなポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する。可能な置換に含まれるのは、１つまたは複数のアミノ酸配列が、類似の化学的もしくは構造的性質を有する、異なるアミノ酸であって、かつ／またはそのペプチドの生物学的機能を有意に変化させないアミノ酸に置き換わることによって改変された保存的置換である。

アミノ酸置換を招く、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発などの当業者に公知の標準的な技法は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているヌクレオチド配列に突然変異を導入するために用いることができる。好ましくは、誘導体は、本来の分子に対して２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、誘導体は、１つまたは複数の予測される可欠アミノ酸残基に加えられた保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられた置換である。類似の電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖をもつアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。あるいは、突然変異は、飽和突然変異誘発などにより、コード配列のすべてまたは部分に沿ってランダムに導入することができ、結果として生じた突然変異体は、生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後で、コードされているＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、発現ベクターに挿入し、発現させ（例えば異種宿主細胞中）、タンパク質の活性は、下記のように決定することができる。

本発明は、第１および／または第２の結合ドメインのフレームワーク領域または可変領域に突然変異（例えば１つまたは複数のアミノ酸置換）を有する、本明細書に記載する任意のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのアミノ酸配列を含む二重特異性単鎖抗体の使用もまた包含する。好ましくは、これらの突然変異は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２および／またはＣＤ３に対するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのアビディティーおよび／または親和性を維持または強化する。当業者に公知の標準的な技法（例えばイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ）は、ポリペプチドであるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥと、その結合パートナーとの間の結合度をアッセイするために用いることができる。

５．３ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを産生させる方法
５．３．１ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの組換え発現
本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、当技術分野で公知の、または本明細書に開示する任意の方法、特に化学合成、または好ましくは上記の組換え発現技法により産生することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ９９／５４４４０参照）。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを産生させるための方法の詳細な実施例については下記第６節もまた参照のこと。

例えばＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害または感染）の遺伝子療法または診断において、本発明のポリヌクレオチドは、単独で、またはベクターの部分として使用して、細胞に本発明のポリペプチド（例えばＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ）を発現させることができる。本発明の任意のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドまたはベクターは、細胞に導入され、その細胞は、今度は関心対象のポリペプチド（例えばＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ）を産生する。ｅｘ−ｖｉｖｏまたはｉｎ−ｖｉｖｏ技法により細胞に治療用遺伝子を導入することに基づく遺伝子療法は、遺伝子伝達の最も重要な応用の１つである。

したがって、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの組換え発現は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターの構築を必要とする。例えば図３を参照のこと。本明細書に記載するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法により入手および配列決定することができる。例えば、本発明の方法に使用するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができ（例えばKutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242に記載される通り）、その組み立ては、簡潔にはポリペプチドをコードしている配列の断片を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次にＰＣＲによる連結したオリゴヌクレオチドの増幅を伴う。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチドが得られたならば、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子の産生のためのベクターは、組換えＤＮＡ技法により当技術分野で十分に公知の技法を用いて産生させることができる。したがって、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製するための方法が、本明細書に記載する。当業者に十分に公知の方法は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのコード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法には、例えばｉｎｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインまたはその断片、あるいは重鎖または軽鎖ＣＤＲをコードしているヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結したものを含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードしているヌクレオチド配列を含むことがあり（例えば国際公開ＷＯ８６／０５８０７およびＷＯ８９／０１０３６；ならびに米国特許第５，１２２，４６４号参照）、その抗体の可変ドメインは、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖および軽鎖両方の全体を発現させるためにそのようなベクターにクローニングすることができる。

発現ベクターは、従来技法により宿主細胞に移動され、次に、トランスフェクトされた細胞は従来技法により培養され、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを産生する。したがって、本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはその断片（例えばＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第１および／または第２の結合ドメイン）をコードしているポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結したものを含有する宿主細胞を含む。

多様な宿主発現ベクター系は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはその断片（例えばＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第１および／または第２の結合ドメイン）を発現させるために利用することができる（例えば米国特許第５，８０７，７１５号参照）。そのような宿主発現系は媒体に相当し、その媒体によって、関心対象のコード配列を産生し、その後精製することができるが、この系は、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトした場合に本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子をｉｎｓｉｔｕで発現することができる細胞にも相当する。これらには、非限定的に、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えばイー・コリおよびビー・スブチリス）などの微生物；ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコード配列を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えばサッカロミセスおよびピキア）；ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター［例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）］に感染しているか、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を内部に有する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）が挙げられる。好ましくは、エシェリキア・コリなどの細菌細胞、さらに好ましくは真核細胞が、組換えＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期（ｍａｊｏｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと一緒になったチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、抗体に関する有効な発現系である（Foecking et al., 1986, Gene 45:101およびCockett et al., 1990, BioTechnology 8:2）。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターにより調節される。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、例えば米国特許第６，０４０，４９８号、１９９９年２月１８日に公開された国際出願（ＷＯ９９／０７２１０）、および２００２年２月７日に公開された国際出願（ＷＯ０２／１０４１４）に開示されているＬＥＸＳｙｓｔｅｍ（商標）などのトランスジェニック植物発現系で発現させることができる。本発明のポリヌクレオチドに利用することができる別のトランスジェニック植物発現系は、米国特許第５，２０２，４２２号；第５，６３９，９４７号；第５，９５９，１７７号；および第６，４１７，４２９号に記載されているＰｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）技法である。

細菌系では、発現されるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子またはその断片に意図された使用に応じて、いくつかの発現ベクターを好都合に選択することができる。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子の医薬組成物の発生のために、例えば大量のそのようなタンパク質を産生しようとする場合には、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが理想的でありうる。そのようなベクターには、ベクターのｌａｃＺコード領域を有するフレーム内にＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコード配列を個別に連結することにより、融合タンパク質を産生することができるイー・コリ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられるが、それに限定されるわけではない。ｐＧＥＸベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用することができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスであるグルタチオン−アガロースビーズに吸着および結合させ、続いて遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン切断部位または第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されており、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物はＧＳＴ部分から放出することができる。本発明のポリヌクレオチドを発現させるために使用することができる別の微生物系は、Squires et al., BioProcess Int'l p. 54 Dec 2004およびSquires et al., Specialty Chemicals July/August 2004に記載されているような、シュードモナス・フルオレセンスの新規な株に基づくＰｆｅｎｅｘＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙである。

昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞中で成長する。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコード配列は、ウイルスの可欠領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。

哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、関心対象のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三連リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅｌｅａｄｅｒ）配列に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの可欠領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、生存可能で、感染した宿主にＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子を発現することができる組換えウイルスを生じるものである（例えばLogan & Shenk, 1984, PNAS 8 1:355-359参照）。特異的開始シグナルもまた、挿入されたＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥコード配列の効率的な翻訳に必要なことがある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入部全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の多様な起源でありうる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含により高まることがある（例えばBittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544参照）。

加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の方法で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。そのようなタンパク質産物の改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能に重要でありうる。タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のために、異なる宿主細胞が特徴的で特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系は、発現される外来タンパク質の正しい改変およびプロセシングを確実にするために選択することができる。このために、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機械を保有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞には、非限定的に、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ、ＮＳ１、およびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（内因的に免疫グロブリン鎖を全く産生しないマウス骨髄腫細胞系）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ならびにＨｓＳ７８ＢｓＴ細胞が挙げられる。

組換えタンパク質を長期間高収率で産生するために、安定な発現が好ましい。例えば、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子を安定に発現する細胞系を操作することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーにより制御されるＤＮＡを用いて形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、強化培地中で１〜２日間成長させ、次に、選択培地に転換することができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、プラスミドを細胞の染色体に安定に組み込んでその細胞を成長させ、フォーカスを形成させ、今度はそのフォーカスをクローニングして細胞系に拡大することができる。この方法は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子を発現する細胞系を操作するために好都合に使用することができる。そのような操作された細胞系は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子と直接または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価に特に有用でありうる。

ｔｋ−、ｇｓ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞にそれぞれ採用することができる、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11:223）、グルタミンシンターゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17）遺伝子を非限定的に含めたいくつかの選択系を使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性も、以下の遺伝子、すなわちメトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al., 1980, PNAS 77:357；O’Hare et al., 1981, PNAS 78:1527）；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg, 1981, PNAS 78:2072）；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ（Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573; Mulligan, 1993, Science 260:926；およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191; May, 1993, TIB TECH 11:155-）；およびヒグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerre et al., 1984, Gene 30:147）についての選択の基盤として使用することができる。組換えＤＮＡ技法の、当技術分野で一般に公知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用することができ、そのような方法は、例えばAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；およびChapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)；Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ分子の発現レベルは、ベクターの増幅により増大することがある［総説については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)参照］。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを発現しているベクター系のマーカーが増幅可能な場合には、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベル増大は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるものである。増幅される領域がＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ遺伝子と関連することから、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの産生もまた増加するものである（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。

宿主細胞は、第１のベクターが、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第１の結合ドメインまたは抗体（例えば抗ＥｐｈＡ２抗体または抗ＣＤ３抗体）の可変重鎖ドメインをコードしており、第２のベクターが、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第２の結合ドメインまたは抗体（例えば抗ＥｐｈＡ２抗体または抗ＣＤ３抗体）の可変軽鎖ドメインをコードしている、本発明の２つの発現ベクターを用いて共トランスフェクトされていることがある。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第１および第２の結合ドメインは、当技術分野で公知の技法を使用して精製することができ、これら２つのドメインは、当技術分野で公知の方法により化学的に結合させることができる。

宿主細胞は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしている、本発明の発現ベクターを用いてトランスフェクトすることができる。そのベクターは、抗体（例えば抗ＥｐｈＡ２抗体または抗ＣＤ３抗体）の可変ドメインおよび軽鎖ドメインの両方またはＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの第１および第２の結合ドメインの両方をコードし、それを発現することができる単一のベクターを含むことがある（Proudfoot, 1986, Nature 322:52およびKohler, 1980, PNAS 77:2197）。可変ドメインまたは結合ドメインについてのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことがある。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはその結合ドメインが組換え発現によりいったん産生したならば、それは、免疫グロブリン分子の精製のために当技術分野で公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特にプロテインＡクロマトグラフィー後の特異的抗原についてのアフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差により、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準技法により、精製することができる。さらに、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはその断片は、本明細書に記載するか、または当技術分野で別の方法で公知の異種ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易にすることができる。

特定の実施形態では、組換え産生された本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、ＣＤ３Ｔ細胞抗原への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。別の特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＥｐｈＡ２への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。別の特定の実施形態では、第１および第２の結合ドメインは、ＣＤ３およびＥｐｈＡ２への結合を可能にするようにこれらのドメインをフォールディングできるのに十分な長さのリンカーによって一緒に結合している。ある実施形態では、第１および第２の結合ドメインはｓｃＦｖである。他の実施形態では、ＣＤ３に結合する結合ドメインは脱免疫化されている。

５．４予防／治療法
本発明は、対象におけるＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）を治療、予防、および／または管理するために設計された医薬組成物ならびに予防、および治療レジメンに関し、その予防レジメンおよび治療レジメンは、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与することを含む。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、および感染）を治療、予防、および／または管理するために対象に投与される。ある実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、１つまたは複数の他の療法と組み合わせて投与される。ある実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、哺乳動物、好ましくはヒトに、１つまたは複数の他の療法と同時に投与される。好ましくは、そのような療法は、そのような障害の治療に有用である。用語「同時に」は、厳密に同じ時間に療法を投与することに限定されず、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥおよび他の療法が、順にある時間間隔内で対象に投与されることにより、本発明の抗体が他の療法と一緒に作用して、それらが別の方法で投与されたときよりも増大した利益を与えることができることを意味する。例えば、各療法は、同時に、または異なる時点で任意の順序で連続的に投与することができるが、同時に投与しないならば、これらの療法は、所望の治療または予防効果をもたらすように十分に近接した時間で投与すべきである。各療法は、別々に、任意の適切な形態および任意の適切な経路で投与することができる。他の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、外科手術前、外科手術と同時、または外科手術後に投与される。好ましくは、外科手術は局所腫瘍を完全に除去するか、または大きな腫瘍の大きさを減少させる。外科手術は、予防策として、または疼痛を軽減するためにもまた行うことができる。

様々な実施形態では、これらの療法は、１時間未満の間隔で、約１時間の間隔で、約１時間から約２時間の間隔で、約２時間から約３時間の間隔で、約３時間から約４時間の間隔で、約４時間から約５時間の間隔で、約５時間から約６時間の間隔で、約６時間から約７時間の間隔で、約７時間から約８時間の間隔で、約８時間から約９時間の間隔で、約９時間から約１０時間の間隔で、約１０時間から約１１時間の間隔で、約１１時間から約１２時間の間隔で、２４時間を超えない間隔で、または４８時間を超えない間隔で投与される。好ましい実施形態では、２つ以上の構成要素が、患者の１回の来院の間に投与される。

本明細書に提供される投与量および投与回数は、治療有効および予防有効という用語に包含される。さらに投与量および回数は、典型的には投与される特定の療法、癌の重症度および種類、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に応じて、各患者に特異的な要因に従って変動するものである。適切なレジメンは、そのような要因を考慮することおよび例えば文献に報告され、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)に推奨されている投与量に従うことによって、当業者が選択することができる。

５．４．１患者集団
５．４．１．１癌患者
本発明は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの治療または予防有効量を対象に投与することによって、癌を治療、予防、および／または管理するための方法を提供する。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、１つまたは複数の他の療法と組み合わせて投与することができる。対象は動物であり、好ましくは非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えばカニクイザルなどのサルおよびヒト）などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。

本発明に包含される方法により治療することができる癌の特定の例には、ＥｐｈＡ２を過剰発現する癌が挙げられるが、それに限定されるわけではない。さらなる実施形態では、癌は上皮起源である。そのような癌の例は、肺、結腸、前立腺、***、および皮膚の癌である。追加的な癌は、限定としてではなく例示として下記第５．４．１．２節に挙げる。特定の実施形態では、本発明の方法は、原発性腫瘍からの転移を治療、予防、および／または管理するために用いることができる。

本発明の方法および組成物は、癌を患っているか、または癌を患っていると予想される対象／患者、例えば特定の種類の癌に対する遺伝的素因を有するか、発癌物質に曝露されてきたか、もしくは特定の癌から寛解中である対象／患者に本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与することを含む。本明細書に使用する「癌」は、原発性または転移性癌を表す。そのような患者は、以前に癌を治療されていることもあるし、治療されていないこともある。本発明の方法および組成物は、任意の順位の療法、例えば、第１選択、第２選択、第３選択などの療法として使用することができる。他の癌療法を受けている患者の治療もまた本発明に含まれ、本発明の方法および組成物は、これらの他の癌療法の任意の副作用または不耐性が起きる前に使用することができる。本発明は、抗療性の患者における症状を治療、予防、および／または管理するために、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与するための方法もまた包含する。ある実施形態では、癌が療法に抗療性であるということは、癌細胞の少なくとも一部の重大な部分が死滅しないか、またはその細胞***が停止しないことを意味する。癌細胞が抗療性であるかどうかの判定は、当技術分野で許容されている「抗療性の」意味をそのような状況で使用して、癌細胞に及ぼす療法の有効性をアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法により、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。様々な実施形態では、癌細胞数が有意に減少しなかったか、または増加した場合に、癌は抗療性である。本発明は、癌を有する素因のある患者での癌の発症または再発を予防するために１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与するための方法もまた包含する。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、またはＥｐｈＡ２の発現を減少させる他の治療薬は、あるホルモン療法剤、放射線療法剤、および化学療法剤に対する癌細胞の耐性または感受性の減少を反転させることによって、これらの薬剤の１つまたは複数に対して癌細胞を感受性にするために投与され、その薬剤は、次に転移を防止するためなどの、癌を治療または管理するために投与する（または投与を継続する）ことができる。

代替の実施形態では、本発明は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを、他の任意の療法と組み合わせて、または他の治療に抗療性であることが証明されたが、これらの治療をもはや受けていない患者に投与することにより、患者の癌を治療するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法により治療される患者は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、または生物学的療法／免疫療法ですでに治療されている患者である。これらの患者の中には、抗療性の患者および既存の癌療法を用いた治療にかかわらず癌を有する患者がいる。他の実施形態では、患者は、すでに治療されており、疾患の活動を有さず、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが、癌の再発を防止するために投与される。

好ましい実施形態では、既存の治療は化学療法である。特定の実施形態では、既存の治療には、非限定的に、メトトレキセート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルなどを含めた化学療法の投与が含まれる。これらの患者の中には、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法で治療された患者がいる。これらの患者の中には、癌の治療のために外科手術を受けた患者もまたいる。

あるいは、本発明は、放射線療法を受けているか、または受けた患者を治療するための方法もまた包含する。これらの中には、化学療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法で治療されているか、または以前治療された患者がいる。これらの患者の中には、癌の治療のために外科手術を受けた患者もまたいる。

他の実施形態では、本発明は、ホルモン療法および／または生物学的療法／免疫療法で治療を受けているかまたは受けた患者を治療するための方法を包含する。これらの中には、化学療法および／または放射線療法で治療されているか治療された患者がいる。これらの患者の中には、癌の治療のために外科手術を受けた患者もまたいる。

追加的に、本発明は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法が、治療される対象に過度に毒性である、すなわち許容もしくは耐容されない副作用を招くことが証明されたか、または証明されるおそれのある場合に、その療法の代替としての癌の治療法もまた提供する。本発明の方法を用いて治療される対象は、どの治療が許容または耐容されないと見出されたかに応じて、所望により外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、または生物学的療法などの他の癌治療で治療することができる。

他の実施形態では、本発明は、癌の治療のための他の任意の癌療法を行わずに、そのような治療に抗療性であることが証明された患者に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与することを提供する。特定の実施形態では、他の癌療法に抗療性である患者は、癌療法の不在下で本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与される。

他の実施形態では、ＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞に関連する前癌状態を有する患者は、その障害を治療し、それが悪性癌に進行する見込みを減少させるために、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与することができる。特定の実施形態では、前癌状態は、高悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、乳腺線維腺腫、線維嚢胞症、または複合母斑である。

５．４．１．２癌
本発明の方法および組成物により治療、予防、および／または管理することができる癌および関係する障害には、非限定的に、急性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病などの急性骨髄性白血病、ならびに骨髄異形成症候群などの白血病；非限定的に、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病などの慢性白血病；真性赤血球増加症；非限定的に、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫；非限定的に、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症；良性単クローン性ガンマグロブリン血症；Ｈ鎖病；非限定的に、骨肉腫（ｂｏｎｅｓａｒｃｏｍａ、ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜性肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（血管腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などの骨および結合組織肉腫；非限定的に、神経膠腫、星状膠細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍；非限定的に、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、***の髄様癌、***の粘液癌、***の管状腺癌、***の乳頭状癌、パジェット病、および炎症性乳癌などの乳癌；非限定的に、クロム親和性細胞腫および副腎皮質癌などの副腎癌；非限定的に、乳頭状または濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌、および未分化甲状腺癌などの甲状腺癌；非限定的に、膵島細胞腺腫、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは膵島細胞腫などの膵癌；非限定的に、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症および尿崩症などの下垂体癌；非限定的に、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫などの眼球黒色腫ならびに網膜芽細胞腫などの眼癌；扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫などの膣癌；扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病などの外陰癌；非限定的に、扁平上皮癌および腺癌などの子宮頚癌；非限定的に、子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮癌；非限定的に、卵巣上皮癌、境界性腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質腫瘍などの卵巣癌；非限定的に、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅癌および燕麦細胞（小細胞）癌などの食道癌；非限定的に、腺癌、腫瘤形成型（ポリープ状）、潰瘍形成型、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫などの胃癌；結腸癌；直腸癌；非限定的に、肝細胞癌および肝芽腫などの肝臓癌；腺癌のなどの胆嚢癌；非限定的に、乳頭状、結節型、およびびまん性などの胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌、および小細胞肺癌などの肺癌；非限定的に、胚腫瘍、精上皮腫、未分化型、古典的（典型的）、***細胞性、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）などの精巣癌；非限定的に、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫などの前立腺癌；腎臓癌；非限定的に、扁平上皮癌などの口腔癌；基底癌；非限定的に、腺癌、粘表皮癌、および腺様嚢胞癌などの唾液腺癌；非限定的に、扁平上皮癌および疣贅癌などの咽頭癌；非限定的に、基底細胞癌、扁平上皮癌、および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端黒子型黒色腫などの皮膚癌；非限定的に、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盤および／または尿管）などの腎癌；ウィルムス腫瘍；非限定的に、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌が挙げられるが、それに限定されるわけではない。加えて、癌には、混合肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、および乳頭状腺癌も挙げられる（そのような障害の総説については、Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., PhiladelphiaおよびMurphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照のこと）。

したがって、本発明の方法および組成物は、以下のもの、すなわち膀胱、***、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、頚部、甲状腺、および皮膚のものを含む癌腫；扁平上皮癌を含む；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含めたリンパ系列の造血腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄性白血病を含めた骨髄系列の造血腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含めた間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫、および神経膠腫を含めた他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含めた中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含めた間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞状癌、および奇形癌を含めた他の腫瘍を含む（がそれに限定されるわけではない）様々な癌または他の異常増殖性疾患の治療、予防、および／または管理にもまた有用である。アポトーシスの異常によって引き起こされた癌もまた本発明の方法および組成物により治療されることもまた考えている。そのような癌には、濾胞状リンパ腫、ｐ５３突然変異を有する癌、***、前立腺、および卵巣のホルモン依存腫瘍、ならびに家族性腺腫性ポリポージスなどの前癌性病変、ならびに骨髄異形成症候群を挙げることができるが、それに限定されるわけではない。特定の実施形態では、悪性もしくは異常増殖性変化（化生および異形成など）、または過剰増殖性細胞障害は、皮膚、肺、結腸、***、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣、または子宮において治療または予防される。他の特定の実施形態では、肉腫、黒色腫、または白血病が治療または予防される。

特定の実施形態では、本発明の方法および組成物により治療、予防、および／または管理される癌は上皮起源である。他の実施形態では、癌は悪性であり、ＥｐｈＡ２を過剰発現する。特定の実施形態では、癌は、ＥｐｈＡ２を異常発現する細胞を含む。他の実施形態では、治療される障害は、ＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞に関連する前癌状態である。特定の実施形態では、前癌状態は高悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、乳腺線維腺腫、線維嚢胞症、または複合母斑である。

特定の実施形態では、本発明の方法および組成物は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、および前立腺癌、ならびに黒色腫などの皮膚癌の治療、予防、および／または管理のために使用される。

５．４．１．３乳癌の治療
特定の実施形態では、乳癌を有する患者は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与される。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非限定的に、ドキソルビシン、エピルビシン、ドキソルビシンおよびシクロホスファミドの合剤（ＡＣ）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、および５−フルオロウラシルの合剤（ＣＡＦ）、シクロホスファミド、エピルビシン、および５−フルオロウラシルの合剤（ＣＥＦ）、ハーセプチン、タモキシフェン、タモキシフェンおよび細胞傷害性化学療法の組合せ、タキサン（ドセタキセルおよびパクリタキセルなど）を含めた乳癌療法に有用な１つまたは複数の他の薬剤の有効量と組み合わせて投与することができる。さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、リンパ節転移陽性の局所乳癌のアジュバント治療のために、タキサンならびに標準的なドキソルビシンおよびシクロホスファミドとともに投与することができる。

特定の実施形態では、***の前癌性線維腺腫または線維嚢胞症を有する患者は、その障害を治療し、それが悪性乳癌に進行する見込みを減少させるために、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与される。

５．４．１．４結腸癌の治療
特定の実施形態では、結腸癌を有する患者は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与される。別の実施形態では、本発明の抗体は、非限定的に、５−ＦＵおよびロイコボリンの合剤、５−ＦＵおよびレバミソールの合剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、またはイリノテカン、５−ＦＵ、およびロイコボリンの合剤（ＩＦＬ）を含めた結腸癌療法に有用な１つまたは複数の他の薬剤の有効量と組み合わせて投与することができる。

５．４．１．５前立腺癌の治療
特定の実施形態では、前立腺癌を有する患者は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与される。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非限定的に、外部ビーム放射線療法、放射性同位体（すなわち、Ｉ^１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内移植、ロイプロイドまたは他のＬＨＲＨアゴニスト、非ステロイド系抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド）、ステロイド系抗アンドロゲン（酢酸シプロテロン）、ロイプロイドおよびフルタミドの合剤、ＤＥＳ、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、結合型エストロゲン（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）、ＤＥＳ二リン酸などのエストロゲン、ストロンチウム８９などの放射性同位体、外部ビーム放射線療法とストロンチウム８９の組合せ、アミノグルテチミド、ヒドロコルチゾン、フルタミド退薬、プロゲステロン、およびケトコナゾールなどの第２選択のホルモン療法、低用量プレドニゾン、またはドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン／ドセタキセル、エストラムスチン／エトポシド、エストラムスチン／ビンブラスチン、およびエストラムスチン／パクリタキセルを含めた、症状の主観的な改善およびＰＳＡレベルの低減を生じることが報告されている他の化学療法レジメンを含めた、前立腺癌療法に有用な１つまたは複数の他の薬剤の有効量と組み合わせて投与することができる。

特定の実施形態では、前癌性高悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を有する患者は、その障害を治療し、それが悪性前立腺癌に進行する見込みを減少させるために、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与される。

５．４．１．６黒色腫の治療
特定の実施形態では、黒色腫を有する患者は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与される。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非限定的に、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）などのニトロソ尿素、ビンカアルカロイド、白金化合物、およびタキサンを含めた中程度の単剤活性をもつ薬剤、ダートマスレジメン（シスプラチン、ＢＣＮＵ、およびＤＴＩＣ）、インターフェロンα（ＩＦＮ−Ａ）、ならびにインターロイキン２（ＩＬ−２）を含めた、黒色腫癌療法に有用な１種または複数の他の薬剤の有効量と組み合わせて投与することができる。特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、多発性脳転移、骨転移、および脊髄圧迫を有する患者に、メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ）とともに、かつ腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の存在下または不在下で患肢分離温熱潅流（ｉｓｏｌａｔｅｄｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃｌｉｍｂｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）（ＩＬＰ）と組み合わせて投与して、放射線療法による症状軽減および腫瘍のある程度の収縮を果たすことができる。

特定の実施形態では、前癌性複合母斑を有する患者は、その障害を治療し、それが悪性黒色腫に進行する見込みを減少させるために、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与される。

５．４．１．７卵巣癌の治療
特定の実施形態では、卵巣癌を有する患者は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与される。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非限定的に、Ｐ^３２療法などの腹腔内放射線療法、全腹部および骨盤放射線療法、シスプラチン、パクリタキセル（タキソール）またはドセタキセル（タキソテール）およびシスプラチンまたはカルボプラチンの合剤、シクロホスファミドおよびシスプラチンの合剤、シクロホスファミドおよびカルボプラチンの合剤、５−ＦＵおよびロイコボリンの合剤、エトポシド、ドキソルビシンリポソーム製剤、ゲムシタビンまたはトポテカンを含めた卵巣癌療法に有用な１つまたは複数の他の薬剤の有効量と組み合わせて投与することができる。白金抗療性疾患を有する患者のために、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量をタキソール投与と組み合わせて投与することが考えられている。白金抗療性の疾患を有する患者におけるイホスファミド、シスプラチンに基づく併用レジメンの失敗後のサルベージ化学療法としてのヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、および腫瘍に検出可能なレベルの細胞質エストロゲン受容体を有する患者におけるタモキシフェンの投与を含めた、抗療性卵巣癌を有する患者の治療が含まれる。

５．４．１．８肺癌の治療
特定の実施形態では、小細胞肺癌を有する患者は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与される。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非限定的に、胸部放射線療法、シスプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびエトポシドを単独でまたは組み合わせて、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン／エトポシド、およびシスプラチンの合剤（ＣＡＶ／ＥＰ）、気管支内レーザー療法による局所緩和、気管支内ステント、および／または近接照射療法を含めた肺癌療法に有用な１つまたは複数の他の薬剤の有効量と組み合わせて投与することができる。

他の特定の実施形態では、非小肺細胞癌を有する患者は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、非限定的に、姑息的放射線療法、シスプラチン、ビンブラスチン、およびマイトマイシンの合剤、シスプラチンおよびビノレルビンの合剤、パクリタキセル、ドセタキセルもしくはゲムシタビン、カルボプラチンおよびパクリタキセルの合剤、気管支内病変の組織内放射線療法、または定位放射線外科手術を含めた肺癌療法に有用な１つまたは複数の他の薬剤の有効量と組み合わせて投与される。

５．４．２他の予防／治療剤
いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与による療法は、非限定的に、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法などの１つまたは複数の療法の投与と組み合わせる。予防または治療剤には、非限定的に、ペプチド、ポリペプチド、翻訳後に改変されたタンパク質を含むタンパク質、抗体などを含めたタンパク質性分子；あるいは小分子（１０００ダルトン未満）、無機もしくは有機化合物；あるいは非限定的に、２本鎖もしくは１本鎖ＤＮＡ、または２本鎖もしくは１本鎖ＲＮＡ、および三重らせん核酸分子を含めた核酸分子が含まれるが、それに限定されるわけではない。予防または治療剤は、任意の公知の生物（非限定的に、動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスを含む）、または合成分子のライブラリーに由来することがある。そのような療法は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与の前、投与と同時、または投与後に投与することができる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、非限定的に、ＡＢＬ、ＡＣＫ、ＡＦＫ、ＡＫＴ（例えばＡＫＴ−１、ＡＫＴ−２、およびＡＫＴ−３）、ＡＬＫ、ＡＭＰ−ＰＫ、ＡＴＭ、Ａｕｒｏｒａ１、Ａｕｒｏｒａ２、ｂＡＲＫ１、ｂＡｒｋ２、ＢＬＫ、ＢＭＸ、ＢＴＫ、ＣＡＫ、ＣａＭキナーゼ、ＣＤＣ２、ＣＤＫ、ＣＫ、ＣＯＴ、ＣＴＤ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＥＧＦ−Ｒ、ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４、ＥＲＫ（例えばＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＥＲＫ３、ＥＲＫ４、ＥＲＫ５、ＥＲＫ６、ＥＲＫ７）、ＥＲＴ−ＰＫ、ＦＡＫ、ＦＧＲ（例えばＦＧＦ１Ｒ、ＦＧＦ２Ｒ）、ＦＬＴ（例えばＦＬＴ−１、ＦＬＴ−２、ＦＬＴ−３、ＦＬＴ−４）、ＦＲＫ、ＦＹＮ、ＧＳＫ（例えばＧＳＫ１、ＧＳＫ２、ＧＳＫ３−α、ＧＳＫ３−β、ＧＳＫ４、ＧＳＫ５）、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）、ＨＣＫ、ＨＥＲ２、ＨＫＩＩ、ＪＡＫ（例えばＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＡＫ４）、ＪＮＫ（例えばＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３）、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＫＫ−１、ＩＫＫ−２、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＫ、ＩＴＫ、ＬＣＫ、ＬＯＫ、ＬＹＮ、ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫＡＰＫ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＥＫ、ＭＥＴ、ＭＦＰＫ、ＭＨＣＫ、ＭＬＣＫ、ＭＬＫ３、ＮＥＵ、ＮＩＫ、ＰＤＧＦ受容体α、ＰＤＧＦ受容体β、ＰＨＫ、ＰＩ−３キナーゼ、ＰＫＡ、ＰＫＢ、ＰＫＣ、ＰＫＧ、ＰＲＫ１、ＰＹＫ２、ｐ３８キナーゼ、ｐ１３５ｔｙｋ２、ｐ３４ｃｄｃ２、ｐ４２ｃｄｃ２、ｐ４２ｍａｐｋ、ｐ４４ｍｐｋ、ＲＡＦ、ＲＥＴ、ＲＩＰ、ＲＩＰ−２、ＲＫ、ＲＯＮ、ＲＳキナーゼ、ＳＲＣ、ＳＹＫ、Ｓ６Ｋ、ＴＡＫ１、ＴＥＣ、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＴＲＫＡ、ＴＸＫ、ＴＹＫ２、ＵＬ１３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＹＥＳ、ＹＲＫ、ＺＡＰ−７０、およびこれらのキナーゼのすべてのサブタイプ（例えば、Hardie and Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, Calif.参照）などのキナーゼの阻害剤である１つまたは複数の予防／治療剤の投与と組み合わせた、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与を包含する。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、Ｅｐｈ受容体キナーゼ（例えばＥｐｈＡ２）の阻害剤である１つまたは複数の予防／治療剤の投与と組み合わせて投与される。最も好ましい実施形態では、本発明のものは、ＥｐｈＡ２の阻害剤である１つまたは複数の予防／治療剤の投与と組み合わせて投与される。

別の特定の実施形態では、本発明の方法は、非限定的に、アンギオスタチン（プラスミノーゲン断片）；抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ；Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ；ＡＢＴ−６２７；Ｂａｙ１２−９５６６；ベネフィン；ベバシズマブ；ＢＭＳ−２７５２９１；軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）；ＣＡＩ；ＣＤ５９補体断片；ＣＥＰ−７０５５；Ｃｏｌ３；コンブレタスタチンＡ−４；エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）；フィブロネクチン断片；Ｇｒｏ−β；ハロフギノン；ヘパリナーゼ；ヘパリン六糖断片；ＨＭＶ８３３；ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）；ＩＭ−８６２；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）；インターロイキン１２；クリングル５（プラスミノーゲン断片）；マリマスタット；メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）；２−メトキシエストラジオール；ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ２７０２３Ａ）；ＭｏＡｂＩＭＣ−１Ｃ１１；ネオバスタット；ＮＭ−３；パンゼム；ＰＩ−８８；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；血小板因子４（ＰＦ４）；プリノマスタット；プロラクチン１６ｋＤ断片；プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）；ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５９４；レチノイド；ソリマスタット；スクアラミン；ＳＳ３３０４；ＳＵ５４１６；ＳＵ６６６８；ＳＵ１１２４８；テトラヒドロコルチゾール−Ｓ；テトラチオモリブデート；サリドマイド；トロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）；ＴＮＰ−４７０；形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）；バスクロスタチン（Ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）；バソスタチン（Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ）（カルレチクリン断片）；ＺＤ６１２６；ＺＤ６４７４；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）；およびビスホスホネートなどの血管新生阻害剤である、１つまたは複数の予防／治療剤の投与と組み合わせた、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与を包含する。

別の特定の実施形態では、本発明の方法は、非限定的に、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アムボマイシン（ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン（ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カーベタイマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン（ｃａｒｕｂｉｃｉｎ）、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン（ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン（ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）、エダトレキセート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）、エンロプラチン、エンプロメート（ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン（ｅｔｏｐｒｉｎｅ）、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキン２（組換えインターロイキン２すなわちｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−Ｉａ、インターフェロンγ−Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン（ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）、ミトクロミン、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、ミトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）、マイトマイシン、ミトスペル（ｍｉｔｏｓｐｅｒ）、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ニトロソ尿素、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン（ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）、ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン（ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ）、リン酸トリシリビン、トリメトレキセート、グルクロン酸トリメトレキセート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン（ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ）、硫酸ビングリシネート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、硫酸ビンロイロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシンなどの抗癌剤である１つまたは複数の予防／治療剤の投与と組み合わせた、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与を包含する。他の抗癌薬には、非限定的に、２０−エピ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、５−エチニルウラシル、アビラテロン（ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール（ａｄｅｃｙｐｅｎｏｌ）、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミフォスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホライド、血管新生阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス（ａｎｔａｒｅｌｉｘ）、抗背側化形態形成タンパク質１、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、抗新生物薬、グリシン酸アフィジコリン、アポトーシス遺伝子調節剤、アポトーシス調節剤、アプリン酸、ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン（ａｘｉｎａｓｔａｔｉｎ）１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール（ｂａｌａｎｏｌ）、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、β−ラクタム誘導体、β−アレチン（ａｌｅｔｈｉｎｅ）、β−クラミシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ）、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフレート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシイミン、カルシポトリオール、
カルフォスチンＣ、カンプトセシン誘導体、カナリアポックスＩＬ−２、カペシタビン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔＭ３、ＣＡＲＮ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリクス、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、ｃｉｓ−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェンアナログ、クロトリマゾール、コリスマイシン（ｃｏｌｌｉｓｍｙｃｉｎ）Ａ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチンアナログ、コナゲニン、クラムベシジン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタンスラキノン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）、シクロプラタム、サイペマイシン（ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ）、シタラビンオクホスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジコン、ジデムニンＢ、ジドックス（ｄｉｄｏｘ）、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール、ジオキサマイシン（ｄｉｏｘａｍｙｃｉｎ）、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフール、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチンアナログ、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルビシン、ホルフェニメクス、フォルメスタン、フォストリエシン、フォテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゲラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）、イルモホシン、イロマスタット（ｉｌｏｍａｓｔａｔ）、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫刺激ペプチド、インスリン様成長因子１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール、イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）、イルソグラジン、イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）、イソホモハリコンドリン（ｉｓｏｈｏｍｏｈａｌｉｃｏｎｄｒｉｎ）Ｂ、イタセトロン、ジャスプラキノライド、カハラリド（ｋａｈａｌａｌｉｄｅ）Ｆ、三酢酸ラメラリン−Ｎ、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン（ｌｅｐｔｏｌｓｔａｔｉｎ）、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾール、直鎖ポリアミンアナログ、親油性二糖類ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）、溶解ペプチド、メイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン（ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ２本鎖ＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシンアナログ、メトナフィド、ミトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）線維芽細胞成長因子−サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロフィン、モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発腫瘍抑制因子１に基づく療法、マスタード抗癌剤、ミカペルオキシドＢ、ミコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ−アセチルジナリン、Ｎ−置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ネリドロン酸、中性エンドペプチターゼ、ニルタミド、ニサマイシン（ｎｉｓａｍｙｃｉｎ）、一酸化窒素調節剤、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）、Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン（ｏｋｉｃｅｎｏｎｅ）、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導因子、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキザウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセルアナログ、パクリタキセル誘導体、パラウアミン（ｐａｌａｕａｍｉｎｅ）、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ポリ硫酸ペントサンナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）、パーフルブロン、パーホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、酢酸フェニル、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ、プラセチンＢ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金トリアミン錯体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡ系免疫調節剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤（微細藻）、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、エチドロン酸レニウムＲｅ１８６、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチンアミド、ログレチミド、ロヒツカイン（ｒｏｈｉｔｕｋｉｎｅ）、ロムルチド、ロキニメクス、ルビギノン（ｒｕｂｉｇｉｎｏｎｅ）Ｂ１、ルボキシル（ｒｕｂｏｘｙｌ）、サフィンゴール、サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ１模倣体、セムスチン、老化由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達調節剤、単鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ボロカプテート（ｂｏｒｏｃａｐｔａｔｅ）ナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルホス酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞***阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン（ｓｕｌｆｉｎｏｓｉｎｅ）、超活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）、スラミン、スワンソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タキソール、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロマイド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン（ｔｈａｌｉｂｌａｓｔｉｎｅ）、サリドマイド、チオコラリン（ｔｈｉｏｃｏｒａｌｉｎｅ）、チオグアニン、トロンボポエチン、トロンボポエチン模倣体、チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）、チモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン（ｔｉｎｅｔｈｙｌｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）、チラパザミン、二塩化チタノセン、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキセート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクター系、赤血球遺伝子療法、ベラレソール、ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）、ボロゾール、ザノテロン（ｚａｎｏｔｅｒｏｎｅ）、ゼニプラチン、ジラスコルブ、およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。好ましい追加の抗癌薬は、５−フルオロウラシルおよびロイコボリンである。

さらに特定の実施形態では、本発明は、非限定的に表１に開示するような、好ましくは上記の乳癌、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、および肺癌の治療のための抗癌剤などの１つまたは複数の療法の投与と組み合わせた、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与もまた含む。

本発明は、癌細胞を破壊するためのＸ線、ガンマ線、および他の線源の使用を含む放射線療法と組み合わせた、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与もまた包含する。好ましい実施形態では、放射線治療は、体外ビーム放射または放射能が遠隔線源から向けられる遠隔療法として適用される。他の好ましい実施形態では、放射線治療は、放射線源が体内の癌細胞または腫瘍塊近くに置かれる内部療法または近接照射療法として適用される。

癌療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨用途は、当技術分野で公知であり、the Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)などの文献に記載されている。

５．４．２．１過剰増殖性細胞障害を有する患者
本発明は、過剰増殖性細胞障害またはその症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、その方法は、対象に本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを単独で、またはＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法と組み合わせて投与することを含む。対象は、動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えばカニクイザルなどのサルまたはヒト）などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。

特定の実施形態では、過剰増殖性細胞障害は癌ではない。本発明の方法により治療、予防、および／または管理される過剰増殖性細胞障害の非限定的な例は、例えば「ＥｐｈＡ２および過剰増殖性細胞障害」という名称の米国特許出願公開第２００５−００５９５９２号に開示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。したがって、本発明は、過剰増殖性細胞障害の治療、予防、および／または管理のために設計された組成物および方法もまた提供する（そのような障害の非限定的な例は、例えば「ＥｐｈＡ２および過剰増殖性細胞障害」という名称の米国特許出願公開第２００５−００５９５９２号に開示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。

特に本発明は、過剰増殖性細胞障害に冒された細胞において、ＥｐｈＡ２の発現がアップレギュレーションされている場合に、その障害を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量と、所望によりＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法の有効量とを投与することを含む。好ましい実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される過剰増殖性細胞障害は、喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症、石綿沈着症、ＩＰＦ、ＤＩＰ、ＵＩＰ、腎線維症、肝線維症、他の線維症、気管支反応性亢進、乾癬、脂漏性皮膚炎、嚢胞性線維症、または再狭窄、過剰増殖性血管疾患、ベーチェット症候群、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、もしくは過剰増殖性線維芽細胞障害などの過剰増殖性内皮細胞障害である。

５．４．２．２炎症および／または自己免疫障害を有する患者
本発明は、炎症もしくは自己免疫障害またはその症状を治療、管理、および／または予防するための方法を提供し、その方法は、対象に本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを単独で、またはＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法と組み合わせて投与することを含む。対象は、好ましくは霊長類［例えばサル（例えばアカゲザル、カニクイザル、またはチンパンジー）またはヒト］などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。

特に、本発明は、炎症または自己免疫障害に冒された細胞において、ＥｐｈＡ２の発現がアップレギュレーションされている場合に、その障害を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量と、所望によりＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法の有効量とを投与することを含む。特定の実施形態では、治療される炎症または自己免疫障害は、例えば国際公開ＷＯ００／７８８１５、２００２年９月１２日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０２／０７０００７Ａ１、２００３年９月１８日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを他の薬剤と組み合わせて使用する癌の予防または治療」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５９５７Ａ１、２００２年１１月１４日の「インテグリンα_ｖβ３アンタゴニストを他の予防または治療剤と組み合わせて投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の米国特許出願公開第２００２／０１６８３６０Ａ１号、および２００３年９月１８日の「インテグリンαｖβ３アンタゴニストをＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤またはビスホスホネートと組み合わせて投与することにより障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５７４１Ａ２に開示されている障害であり、これらはそれぞれ、これによりその全体が参照により組み込まれている。

これらの実施形態によると、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ００／７８８１５、２００２年９月１２日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０２／０７０００７Ａ１、２００３年９月１８日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを他の薬剤と組み合わせて使用する癌の予防または治療」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５９５７Ａ１、２００２年１１月１４日の「インテグリンα_ｖβ３アンタゴニストを他の予防または治療剤と組み合わせて投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の米国特許出願公開第２００２／０１６８３６０Ａ１号、および２００３年９月１８日の「インテグリンαｖβ３アンタゴニストをＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤またはビスホスホネートと組み合わせて投与することにより障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５７４１Ａ２、これらはそれぞれ、これによりその全体が参照により組み込まれている）の有効量と組み合わせて投与される。別の特定の実施形態では、本発明は、炎症もしくは自己免疫障害またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、シプリズマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、その全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開ＷＯ０２／０６９９０４）の有効量と組み合わせて投与することを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、炎症もしくは自己免疫障害またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、下記第５．４．２．４節に開示する抗炎症剤の有効量と組み合わせて投与することを含む。

５．４．２．３感染を有する患者
本発明は、感染（特に細胞内感染）またはその症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、その方法は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを単独で、またはＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法と組み合わせて投与することを含む。対象は、好ましくは非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えばカニクイザルなどのサルまたはヒト）などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。

本発明の方法は、感染を患っているか、または感染を患うと予想される患者（例えば感染の遺伝的素因を有する患者または感染を以前に患ったことのある患者）に本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与することを含む。そのような患者は、例えば非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ療法を用いて、感染について以前に治療されていてもよいし、現在治療されていてもよい。さらなる実施形態では、本発明の方法は、免疫無防備状態であるか、または免疫抑制されている患者に本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与することを含む。ある実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、免疫無防備状態であるか、または免疫抑制されている患者に投与されない。本発明によると、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非限定的に、第１選択、第２選択、第３選択、および第４選択の療法を含めた任意の順位の療法として用いることができる。さらに、本発明によると、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ療法の任意の有害作用または不耐性が起きる前に使用することができる。本発明は、感染の開始または再発を予防するために、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与するための方法を包含する。

一実施形態では、本発明は、現行の療法の代替として、感染の治療、予防、および／または管理の方法もまた提供する。特定の実施形態では、現行の療法は、患者に過度に毒性である（すなわち許容もしくは耐容されない副作用を招く）ことが証明されたか、または証明されるおそれがある。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、現行の療法に比べて副作用を減少させる。別の実施形態では、患者は、現行の療法に抗療性であることが証明されている。そのような実施形態では、本発明は、他の抗感染療法が全く伴わずに、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与することを提供する。ある実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、それを必要とする患者に、感染を治療するための別の療法の代わりに投与することができる。一実施形態では、本発明は、活動性感染を治療、予防、および／または管理する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、潜伏感染を治療、予防、および／または管理する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、急性感染の再発を予防する方法を提供する。なお別の実施形態では、本発明は、慢性感染を治療、予防、および／または管理する方法を提供する。

本発明は、非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ療法に抗療性であるか、または抗療性になった患者における感染の症状を治療、予防、および／または管理するために、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを投与するための方法もまた包含する。感染が抗療性であるかどうかの判定は、感染に冒された細胞、特に上皮細胞に対する、または非ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ療法に抗療性であるか、もしくは抗療性になった患者における療法の有効性をアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法により、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。

５．４．２．３．１ウイルス感染
ＥｐｈＡ２の発現増加は、ある細胞内病原体、特にＲＳＶによる感染に関連することが見い出された（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００５年１０月２７日に出願された「感染の治療および予防のためのＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１の調節剤の使用」という名称の米国特許出願第１１／２５９，２６６号参照）。したがって、本発明は、非限定的に、例えばＲＳＶ感染などのウイルス感染を含めた病原体感染の治療、予防、および／または管理のために設計された組成物および方法もまた提供する。本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥおよび前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを含む組成物は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために対象に投与することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理するウイルス感染は細胞内ウイルス感染である。本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥおよび前記抗体を含む組成物は、ウイルス感染の素因があるか、またはウイルス感染を有する対象に、ウイルス感染の治療、予防、および／または管理に有用な、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の他の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）と組み合わせて投与することができる。そのような療法の非限定的な例には、下記第５．４．２．５節に記載する薬剤が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明は、ウイルス感染または１つもしくは複数のその症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つもしくは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量と、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の有効量とを投与することを含む。

ある実施形態では、本発明の１つもしくは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状の治療、予防、および／または管理に現在使用されているか、使用されてきたか、または有用であることが公知の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の有効量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与される。ウイルス感染のための療法には、非限定的に、アシクロビル、アマンタジン、オセルタミビル、リバビリン、パリビズマブ、およびザナミビルなどの抗ウイルス剤が挙げられる。ある実施形態では、本発明の１つもしくは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、それを必要とする対象に、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、１つまたは複数の支援策と組み合わせて投与される。支援策の非限定的な例には、超音波ネブライザーによる空気の加湿、エアロゾル化ラセミ体エピネフリン、経口デキサメタゾン、静脈用液剤、挿管、解熱剤［例えばイブプロフェン、アセトメタフィン（ａｃｅｔｏｍｅｔａｐｈｉｎ）］、ならびに抗生物質および／または抗真菌療法（すなわち二次細菌感染を予防または治療するためのもの）が挙げられる。

任意の種類のウイルス感染、またはウイルス感染に起因もしくは関連する任意の種類の状態は、本発明の方法により治療、予防、および／または管理することができ、前記方法は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または別の療法（例えば本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の予防または治療剤）の有効量と組み合わせて投与することを含む。ウイルス感染を引き起こすウイルスの例には、非限定的に、レトロウイルス［例えばヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩおよびＩＩ型ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、例えばＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）］、ヘルペスウイルス［例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩおよびＩＩ型、ＥＢウイルス、ＨＨＶ６〜ＨＨＶ８、およびサイトメガロウイルス］、アレナウイルス（例えばラッサ熱ウイルス）、パラミキソウイルス（例えばモルビリウイルス属ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ムンプス、ｈＭＰＶ、およびニューモウイルス）、アデノウイルス、ブニヤウイルス（例えばハンタウイルス）、コロナウイルス（ｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、フィロウイルス（例えばエボラウイルス）、フラビウイルス［例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱病ウイルス、および日本脳炎ウイルス］、ヘパドナウイルス［例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）］、オルソミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｏｖｉｒｕｓ）（例えばインフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣ、ならびにＰＩＶ）、パポバウイルス（例えばパピローマウイルス）、ピコルナウイルス（例えばライノウイルス、エンテロウイルス、およびＡ型肝炎ウイルス）、ポックスウイルス、レオウイルス（例えばロタウイルス）、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、およびラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）が挙げられる。ウイルス感染に対する生物学的応答には、非限定的に、ＩｇＥ抗体レベル上昇、Ｔ細胞の増殖および／または浸潤の増加、Ｂ細胞の増殖および／または浸潤の増加、上皮過形成、ならびにムチン産生が挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、かぜ、ウイルス性咽頭炎、ウイルス性喉頭炎、ウイルス性クループ、ウイルス性気管支炎、インフルエンザ、パラインフルエンザウイルス（「ＰＩＶ」）疾患（例えばクループ、細気管支炎、気管支炎、肺炎）、呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）疾患、メタニューマウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍａｖｉｒｕｓ）疾患、およびアデノウイルス疾患（例えば発熱呼吸器疾患、クループ、気管支炎、肺炎）に関連するか、またはそれを引き起こすウイルス感染を治療、予防、および／または管理する方法もまた提供し、前記方法は、本発明の１つもしくは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または別の療法の有効量と組み合わせて投与することを含む。

特定の実施形態では、インフルエンザウイルス感染、ＰＩＶ感染、ｈＭＰＶ感染、アデノウイルス感染、および／もしくはＲＳＶ感染、またはその１つもしくは複数の症状が、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される。特定の実施形態では、本発明は、ＲＳＶ感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または非限定的に、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ザナミビル、リバビラン、ＲＳＶ−ＩＶＩＧ（すなわち静脈内免疫グロブリン輸液）（ＲＥＳＰＩＧＡＭ（商標））、およびパリビズマブ、ならびに２００１年１１月２８日に出願された、ともに「予防および治療用抗ＲＳＶ抗体を投与／投薬する方法」という名称の米国特許出願第０９／９９６，２８８号および第０９／９９６，２６５号に開示されている抗体などの１つもしくは複数の抗ウイルス剤の有効量と組み合わせて投与することを含む。ある実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理されるウイルス感染は、ＲＳＶ感染ではない。

特定の実施形態では、本発明は、ＰＩＶ感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または非限定的に、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ズナミビル、リバビラン、およびパリビズマブなどの１つまたは複数の抗ウイルス剤の有効量と組み合わせて投与することを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、ｈＭＰＶ感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数の抗体の有効量を単独で、または非限定的に、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ズナミビル、リバビラン、およびパリビズマブなどの１つまたは複数の抗ウイルス剤の有効量と組み合わせて投与することを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザを治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または非限定的に、ザナミビル［ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標）］、オセルタミビル［ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標）］、リマンタジン、およびアマンタジン［ＳＹＭＡＤＩＮＥ（登録商標）、ＳＹＭＭＥＴＲＥＬ（登録商標）］などの抗ウイルス剤の有効量と組み合わせて投与することを含む。

本発明は、ウイルス呼吸器感染を患っているか、または患ったことのある対象における喘息の発生を予防するための方法を提供し、前記方法は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または別の療法の有効量と組み合わせて投与することを含む。特定の実施形態では、対象は、高齢者（すなわち６５歳以上の対象）、早産で生まれた乳児、乳児、または小児である。別の特定の実施形態では、対象はＲＳＶ感染を患ったか、または患っている。特定の実施形態では、感染はウイルス性呼吸器感染ではない。さらなる実施形態では、感染はＲＳＶ感染ではない。

特定の実施形態では、本発明は、初回ウイルス感染に対する１つまたは複数の二次応答を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または他の療法（例えば他の予防または治療剤）の有効量と組み合わせて投与することからなる。初回ウイルス感染、特に初回ウイルス性呼吸器感染に対する二次応答の例には、非限定的に、粘膜刺激に対する喘息様応答、全気道抵抗上昇、二次ウイルス、細菌、真菌、および原虫感染に対する感受性増加、ならびに非限定的に、肺炎、クループ、および熱性気管支炎などの状態の発生が挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、急性ウイルス感染を治療、予防、および／または管理するための方法を提供する、さらなる実施形態では、本発明は、ウイルス潜伏感染を治療、予防、および／または管理するための方法を提供する。なおさらなる実施形態では、本発明は、ＨＩＶ感染またはＨＢＶ感染を治療、予防、および／または管理するための方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ００／７８８１５、２００２年９月１２日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０２／０７０００７Ａ１、２００３年９月１８日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを他の薬剤と組み合わせて使用する癌の予防または治療」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５９５７Ａ１、２００２年１１月１４日の「インテグリンα_ｖβ３アンタゴニストを他の予防または治療剤と組み合わせて投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の米国特許出願公開第２００２／０１６８３６０Ａ１号、および２００３年９月１８日の「インテグリンαｖβ３アンタゴニストをＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤またはビスホスホネートと組み合わせて投与することにより障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５７４１Ａ２、これらはそれぞれ、これによりその全体が参照により組み込まれている）の有効量と組み合わせて投与することを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、シプリズマブ（ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、その全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開ＷＯ０２／０６９９０４）の有効量と組み合わせて投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００５０００２９３４号（２００５年１月６日）に開示されている抗体のような１つまたは複数の抗ＩＬ−９抗体の有効量と組み合わせて投与することを含む。なお別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、以下、すなわちＶＩＡＸＩＮ（登録商標）、抗ＩＬ−９抗体、および／またはシプリズマブのうち２つ以上の有効量と組み合わせて投与することを含む。

一実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、１つまたは複数の抗ＩｇＥ抗体の有効量と組み合わせて対象に投与される。特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数の抗体の有効量は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、抗ＩｇＥ抗体ＴＮＸ９０１の有効量と組み合わせて対象に投与される。特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数の抗体の有効量は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、抗ＩｇＥ抗体ｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５であるオマリズマブの有効量と組み合わせて対象に投与される。別の実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、抗ＩｇＥ抗体ＨＭＫ−１２の有効量と組み合わせて対象に投与される。特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、抗ＩｇＥ抗体６ＨＤ５の有効量と組み合わせて対象に投与される。別の実施形態では、本発明の１つまたは複数の抗体の有効量は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、抗ＩｇＥ抗体ＭＡｂＨｕ−９０１の有効量と組み合わせて対象に投与される。

本発明は、ウイルス感染を患うと予想されるか、そのような感染のリスクが増大している患者、例えば免疫系が抑制された患者［例えば臓器移植のレシピエント、ＡＩＤＳ患者、化学療法を受けている患者、高齢者、早産で生まれた乳児、乳児、小児、閉塞状態の食道癌を有する患者、気管気管支ろうを有する患者、神経系疾患（例えば脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、およびミオパシーによって起こるもの）を有する患者、およびすでにウイルス感染を患っている患者］におけるウイルス感染の発生を予防するための方法を包含する。患者は、ウイルス感染について以前に治療されていてもよいし、治療されていなくてもよい。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、本発明の組成物または組合せ療法は、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための、非限定的に、第１選択、第２選択、第３選択、第４選択、または第５選択の療法を含めた、任意の順位の療法として使用することができる。本発明は、ＥｐｈＡ２発現の増加に関連する他の疾患または障害のための療法を受けている患者におけるウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた含む。本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法に対する任意の有害作用または不耐性が発生する前に、患者におけるウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を包含する。本発明は、抗療性の患者におけるウイルス感染またはその症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。ある実施形態では、ウイルス感染を有する患者は、その感染が有意に根絶されず、かつ／またはその症状が有意に緩和されなかった場合に、療法に抗療性である。患者が抗療性であるかどうかの判定は、当技術分野で許容されている「抗療性の」意味をそのような状況で使用して、感染の治療の有効性をアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法により、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。様々な実施形態では、ウイルスの複製が減少しなかったか、または増加した場合に、ウイルス感染を有する患者は抗療性である。本発明は、ウイルス感染を発生するリスクのある患者におけるそのような感染の発症または再発を予防する方法もまた包含する。本発明は、従来療法の有害反応に感受性の患者におけるウイルス感染またはその症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。本発明は、抗ウイルス療法が利用できないウイルス感染を治療、予防、および／または管理するための方法をさらに包含する。

本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法に抗療性であることが証明されたが、これらの治療をもはや受けていない患者におけるウイルス感染またはその症状を治療、予防、および／または管理するための方法を包含する。ある実施形態では、本発明の方法により管理または治療される患者は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または他の生物学的療法／免疫療法ですでに治療されている患者である。これらの患者の中には、抗療性の患者、従来療法には若齢すぎる患者、および既存の療法を用いた管理または治療にかかわらずウイルス感染が再発している患者がいる。

本発明は、他の従来療法の代替として、ウイルス感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を包含する。特定の実施形態では、本発明の方法により管理または治療される患者は、他の療法に抗療性であるか、またはそのような療法による有害反応に感受性である。患者は、免疫系が抑制された者（例えば術後の患者、化学療法の患者、および免疫不全疾患を有する患者）、腎臓または肝臓機能が不全の患者、高齢者、小児、乳児、早産で生まれた乳児、精神神経障害を有する者あるいは向精神薬を服用している者、痙攣の病歴を有する者、あるいはウイルス感染またはその１つもしくは複数のその症状を治療、予防、および／または管理するために使用される従来薬剤と負の相互作用をするおそれのある薬物の適用を受けている者でありうる。

ウイルス感染療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)などの文献に記載されている。

５．４．２．３．２細菌感染
本発明は、細菌感染、特に、細胞内細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与することを含む。好ましくは、細胞内細菌に感染した細胞は、ＥｐｈＡ２の発現が増加している。別の実施形態では、本発明は、細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量と、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の有効量とを投与することを含む。好ましい実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される細菌感染は、細胞内細菌感染である。

任意の種類の細胞内細菌感染または細菌感染に起因もしくは関連する状態（例えば呼吸器感染）は、本発明の方法により治療、予防、および／または管理することができる。感染を引き起こす細胞内細菌の例は、非限定的に、ミコバクテリウム・ツベルクロシス、ミコバクテリウム・レプレ、サルモネラ・エンテリカ・セロバー・チフィ、ブルセラ種、レジオネラ種、リステリア・モノサイトゲネス、フランシセラ・ツラレンシス、リケッチア・リケッチ、リケッチア・プロワツェキー、チケッチア・チフィ、リケッチア・ツツガムシ、クラミジア・トラコマティス、クラミジア・シッタシ、およびクラミジア・ニューモニエが挙げられる。ある実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される細胞内細菌感染は、呼吸器細菌感染ではない。他の実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される細胞内細菌感染は、サルモネラ種感染ではない。なお他の実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される細胞内細菌感染は、サルモネラ・ダブリン感染ではない。

特定の実施形態では、本発明は、細胞内細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、細胞内細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量と、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば予防または治療剤）の有効量とを投与することを含む。

ある実施形態では、本発明は、細菌感染または１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを、細菌感染を治療、予防、および／または管理するために使用される、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の有効量と組み合わせて投与することを含む。細菌感染、特に細菌感染のための療法には、非限定的に、抗細菌剤［例えばアミノグリコシド（例えばゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチリマイシン（ｎｅｔｉｌｉｍｉｃｉｎ））、アズトレオナム、セファロスポリン（例えばセファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファゾリン）、クリンダマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えばペニシリンＶ、結晶ペニシリンＧ、プロカインペニシリンＧ）、スペクチノマイシン、およびテトラサイクリン（例えばクロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン）］、ならびに補助換気および機械換気などの支援療法が挙げられる。ある実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、それを必要とする対象に、細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、１つまたは複数の支援策と組み合わせて投与される。支援策の非限定的な例には、超音波ネブライザーによる空気の加湿、エアロゾル化ラセミ体エピネフリン、経口デキサメタゾン、静脈用液剤、挿管、解熱剤（例えばイブプロフェン、アセトメタフィン）、ならびにさらに好ましくは抗生物質または抗ウイルス療法（すなわち二次再感染を予防または治療するためのもの）が挙げられる。

本発明は、非限定的に、ＩｇＥ抗体レベル上昇、マスト細胞の増殖、脱顆粒、および／または浸潤、Ｂ細胞の増殖および／または浸潤の増加、ならびにＴ細胞の増殖および／または浸潤の増加などの、細菌感染に対する生物学的応答を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つもしくは複数の療法（例えば予防または治療剤）の有効量と組み合わせて投与することを含む。本発明は、非限定的に、肺炎、再発誤嚥性肺炎、レジオネラ症、百日咳、髄膜炎、または結核などの細菌感染により引き起こされるか、またはそれに関連する呼吸器状態を治療、予防、および／または管理する方法もまた提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または別の療法の有効量と組み合わせて投与することを含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ミコバクテリアまたはその１つもしくは複数の症状により引き起こされる細菌感染を治療、予防、および／または管理するために利用され、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つもしくは複数の他の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の有効量と組み合わせて投与することを含む。

特定の実施形態では、本発明は、初回細菌感染、好ましくは初回細菌感染に対する１つまたは複数の二次的状態または応答を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または他の療法（例えば他の予防または治療剤）の有効量と組み合わせて投与することを含む。初回細菌感染、特に細菌感染に対する二次的状態または応答の例には、非限定的に、粘膜刺激に対する喘息様応答、全体耐性の上昇、二次ウイルス、細菌、真菌、および原虫感染に対する感受性増加、ならびに非限定的に、肺炎、クループ、熱性気管支炎などの状態の発生が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用され、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ００／７８８１５、２００２年９月１２日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０２／０７０００７Ａ１、２００３年９月１８日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを他の薬剤と組み合わせて使用する癌の予防または治療」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５９５７Ａ１、２００２年１１月１４日の「インテグリンα_ｖβ３アンタゴニストを他の予防または治療剤と組み合わせて投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の米国特許出願公開第２００２／０１６８３６０Ａ１号、および２００３年９月１８日の「インテグリンαｖβ３アンタゴニストをＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤またはビスホスホネートと組み合わせて投与することにより障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５７４１Ａ２、これらはそれぞれ、これによりその全体が参照により組み込まれている）の有効量と組み合わせて投与することを含む。

別の特定の実施形態では、本発明の方法は、細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用され、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、シプリズマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ０２／０６９９０４）の有効量と組み合わせて投与することを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用され、前記方法は、それを必要とする対象に、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、１つまたは複数の抗ＩＬ−９抗体［例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００５０００２９３４号（２００５年１月６日）に記載されている抗ＩＬ−９抗体の１つ］の有効量と組み合わせて投与することを含む。なお別の実施形態では、本発明は、細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、以下、すなわちＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）、シプリズマブ、および／または抗ＩＬ−９抗体のうち２つ以上の有効量と組み合わせて投与することを含む。

本発明は、細菌感染を患っていると予想されるか、またはそのような感染のリスクが増大している患者、例えば免疫系が抑制された患者［例えば臓器移植のレシピエント、ＡＩＤＳ患者、化学療法を受けている患者、高齢者、早産で生まれた乳児、乳児、小児、閉塞状態の食道癌を有する患者、気管気管支ろうを有する患者、神経系疾患（例えば脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、およびミオパシーによって起こるもの）を有する患者、およびすでに感染を患っている患者］における細菌感染の発生を予防するための方法を包含する。患者は、感染について以前に治療されていてもよいし、治療されていなくてもよい。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたは本発明の組合せ療法は、非限定的に、第１、第２、第３、第４、または第５選択を含めた任意の順位の療法として、細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用することができる。本発明には、他の疾患または障害のための療法を受けている患者における細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた含まれる。本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法に対する任意の有害作用または不耐性が発生する前に、患者における細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を包含する。本発明は、抗療性の患者における細菌感染またはその症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。ある実施形態では、細菌感染を有する患者は、その感染が有意に根絶されず、かつ／またはその症状が有意に緩和されなかった場合に、療法に抗療性である。患者が抗療性であるかどうかの判定は、当技術分野で許容されている「抗療性の」意味をそのような状況で使用して、感染の治療の有効性をアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法により、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。様々な実施形態では、細菌の複製が減少しなかったか、または増加した場合には、細菌感染を有する患者は抗療性である。本発明は、細菌感染を発生するリスクのある患者におけるそのような感染の発症または再発を予防する方法もまた包含する。本発明は、従来療法の有害反応に感受性の患者における細菌感染またはその症状を治療、管理、および／または予防する方法もまた包含する。本発明は、抗細菌療法が利用できない細菌感染を治療、予防、および／または管理するための方法をさらに包含する。

本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法に抗療性であることが証明されたが、これらの療法をもはや受けていない患者における細菌感染またはその症状を治療、予防、および／または管理するための方法を包含する。ある実施形態では、本発明の方法により管理または治療される患者は、抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、または他の生物学的療法／免疫療法ですでに治療されている患者である。これらの患者の中には、抗療性の患者、従来療法には若齢すぎる患者、および既存の療法を用いた管理または治療にかかわらず細菌感染が再発している患者がいる。

本発明は、他の従来療法の代替として、細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を包含する。特定の実施形態では、本発明の方法により管理または治療される患者は、他の療法に抗療性であるか、そのような療法による有害反応に感受性である。患者は、免疫系が抑制された者（例えば術後の患者、化学療法の患者、および免疫不全疾患を有する患者）、腎臓または肝臓機能が不全の患者、高齢者、小児、乳児、早産で生まれた乳児、精神神経障害を有する者、あるいは向精神薬を服用している者、痙攣の病歴を有する者、あるいは細菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用される従来薬剤と負の相互作用をするおそれのある薬物の適用を受けている者でありうる。

細菌感染療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)などの文献に記載されている。

５．４．２．３．３真菌感染
本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、本発明の方法により対象に投与することができる。好ましい実施形態では、真菌に感染した細胞は、ＥｐｈＡ２の発現が増加している。本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状の治療、予防、および／または管理に有用な、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）と組み合わせて、真菌感染および／またはその１つもしくは複数の症状を治療、管理、および／または改善するために、対象に投与することもまたできる。好ましい実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される真菌感染は、細胞内真菌感染である。

任意の種類の真菌感染または真菌感染に起因もしくは関連する状態は、本発明の方法により治療、予防、および／または管理することができる。真菌感染を引き起こす真菌の例は、非限定的に、アブシディア種（例えばアブシディア・コリンビフェラおよびアブシディア・ラモサ）、アスペルギルス種（例えばアスペルギルス・フラブス、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニズランス、アスペルギルス・ニゲル、およびアスペルギルス・テレウス）、バシディオボルス・ラナルム、ブラストミセス・デルマティディス、カンジダ種（例えばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ケル（Ｃａｎｄｉｄａｋｅｒｒ）、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・シュードトロピカリス、カンジダ・キレルモンディイ（Ｃａｎｄｉｄａｑｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ルゴサ、カンジダ・ステラトイデア、およびカンジダ・トロピカリス）、コクシジオイデス・イミチス、コニジオボラス種、クリプトコッカス・ネオフォルムス、クニンガメラ種、皮膚糸状菌、ヒストプラスマ・カプスラーツム、ミクロスポルム・ギプセウム、ムコール・プシルス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、シュードアレシェリア・ボイディー、リノスポリジウム・セーベリ、ニューモシスティス・カリニ、リゾプス種（例えばリゾプス・アリズス、リゾプス・オリゼ、およびリゾプス・ミクロスポルス）、サッカロミセス種、スポロトリクス・シェンキー、接合菌類、ならびに接合菌綱、子嚢菌綱、担子菌綱、不完全菌綱、および卵菌綱などの綱が挙げられる。特定の実施形態では、真菌感染は、呼吸器真菌感染ではない。

特定の実施形態では、本発明は、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量と、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の有効量とを投与することを含む。

ある実施形態では、１つまたは複数の抗体の有効量は、それを必要とする対象に、真菌感染、好ましくは真菌感染の治療、予防、および／もしくは管理に現在使用されているか、使用されてきたか、または有用であることが公知の、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の有効量と組み合わせて投与される。真菌感染のための療法には、非限定的に、例えばミコナゾール、ケトコナゾール［ＮＩＺＯＲＡＬ（登録商標）］、カスポファンギンアセテート［ＣＡＮＣＩＤＡＳ（登録商標）］、イミダゾール、トリアゾール［例えばフルコナゾール（ＤＩＦＬＵＣＡＮ（登録商標））］、およびイトラコナゾール［ＳＰＯＲＡＮＯＸ（登録商標）］などのアゾール薬、ポリエン（例えばナイスタチン、アムホテリシンＢコロイド状分散液（「ＡＢＣＤ」）［ＡＭＰＨＯＴＥＣ（登録商標）］、アムホテリシンＢリポソーム製剤［ＡＭＢＩＳＯＮＥ（登録商標）］）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ピリミジン［例えばフルシトシン（ＡＮＣＯＢＯＮ（登録商標））］ならびにボリコナゾール［ＶＦＥＮＤ（登録商標）］などの抗真菌剤が挙げられる。ある実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、それを必要とする対象に、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために１つまたは複数の支援策と組み合わせて投与される。支援策の非限定的な例には、超音波ネブライザーによる空気の加湿、エアロゾル化ラセミ体エピネフリン、経口デサメタゾン（ｄｅｓａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、静脈用液剤、挿管、解熱剤（例えばイブプロフェンおよびアセトメタフィン）、および抗ウイルスまたは抗細菌療法（すなわち二次ウイルス感染または細菌感染を予防または治療するためのもの）が挙げられる。

本発明は、非限定的に、ＩｇＥ抗体レベル上昇、神経成長因子（ＮＧＦ）レベル上昇、マスト細胞の増殖、脱顆粒、および／または浸潤、Ｂ細胞の増殖および／または浸潤の増加、ならびにＴ細胞の増殖および／または浸潤の増加などの、真菌感染に対する生物学的応答を治療、予防、および／または管理するための方法もまた提供し、前記方法は、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または１つもしくは複数の他の療法と組み合わせて投与することを含む。

特定の実施形態では、本発明は、初回真菌感染、好ましくは初回真菌感染に対する１つまたは複数の二次的状態または応答を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の他の療法（例えば他の予防または治療剤）の有効量と組み合わせて投与することからなる。初回真菌感染、特に初回真菌感染に対する二次的状態または応答の例には、粘膜刺激に対する喘息様応答、全体耐性の上昇、二次ウイルス、真菌、および真菌感染に対する感受性増加、ならびに非限定的に、肺炎、クループ、熱性気管支炎などの状態の発生が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明は、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ００／７８８１５、２００２年９月１２日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０２／０７０００７Ａ１、２００３年９月１８日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを他の薬剤と組み合わせて使用する癌の予防または治療」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５９５７Ａ１、２００２年１１月１４日の「インテグリンα_ｖβ３アンタゴニストを他の予防または治療剤と組み合わせて投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の米国特許出願公開第２００２／０１６８３６０Ａ１号、および２００３年９月１８日の「インテグリンαｖβ３アンタゴニストをＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤またはビスホスホネートと組み合わせて投与することにより障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５７４１Ａ２、これらのそれぞれは、これによりその全体が参照により組み込まれている）の有効量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。

別の実施形態では、本発明は、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、シプリズマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ０２／０６９９０４）の有効量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、１つまたは複数の抗ＩＬ−９抗体［例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００５０００２９３４号（２００５年１月６日）に記載されている抗ＩＬ−９抗体の１つまたは複数］の有効量と組み合わせて投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、以下、すなわちＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）、シプリズマブ、および／または抗ＩＬ−９抗体のうち２つ以上の有効量と組み合わせて投与することを含む。

本発明は、真菌感染を患っているか、またはそのような感染のリスクが増大していると予想される患者における真菌感染の発生を予防するための方法を包含する。そのような対象には、非限定的に、免疫系が抑制された患者［例えば臓器移植のレシピエントの患者、ＡＩＤＳ患者、化学療法を受けている患者、高齢者、早産で生まれた乳児、乳児、小児、閉塞状態の食道癌を有する患者、気管気管支ろうを有する患者、神経系疾患（例えば脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、およびミオパシーによって起こるもの）を有する患者、およびすでに状態、特に感染を患っている患者］が挙げられる。特定の実施形態では、患者は、気管支肺異形成、先天性心疾患、嚢胞性線維症、および／または後天性もしくは先天性免疫不全を患っている。別の特定の実施形態では、患者は、早産で生まれた乳児、乳児、小児、高齢者、またはグループホーム、養護ホームもしくは他のいくつかの種類の施設に入っているヒトである。本発明は、療法が利用できない状態に対する従来の抗真菌療法に対する有害反応に感受性の患者における、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたは本発明の組合せ療法は、非限定的に、第１、第２、第３、第４、または第５選択の療法を含めた任意の順位の療法として、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用することができる。本発明には、他の疾患または障害のための療法を受けている患者における真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた含まれる。本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法に対する任意の有害作用または不耐性が発生する前に、患者における真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を包含する。本発明は、抗療性の患者における真菌感染またはその症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。ある実施形態では、真菌感染を有する患者は、その感染が有意に根絶されず、かつ／またはその症状が有意に緩和されなかった場合に、療法に抗療性である。患者が抗療性であるかどうかの判定は、当技術分野で許容されている「抗療性の」意味をそのような状況で使用して、感染の治療の有効性をアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法により、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。様々な実施形態では、真菌の複製が減少しなかったか、または増加した場合には、真菌感染を有する患者は抗療性である。本発明は、真菌感染を発生するリスクのある患者におけるそのような感染の発症または再発を予防する方法もまた包含する。本発明は、従来療法の有害反応に感受性の患者における真菌感染またはその症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。本発明は、抗真菌療法が利用できない真菌感染を治療、予防、および／または管理するための方法をさらに包含する。

本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法に抗療性であることが証明されたが、これらの療法をもはや受けていない患者における真菌感染またはその症状を治療、予防、および／または管理するための方法を包含する。ある実施形態では、本発明の方法により管理または治療される患者は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または他の生物学的療法／免疫療法ですでに治療されている患者である。これらの患者の中には、抗療性の患者、従来療法には若齢すぎる患者、および既存の療法を用いた管理または治療にかかわらず真菌感染が再発している患者がいる。

本発明は、他の従来療法の代替として、真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の方法により管理または治療される患者は、他の療法に抗療性であるか、またはそのような療法による有害反応に感受性である。患者は、免疫系が抑制された者（例えば術後の患者、化学療法の患者、および免疫不全疾患を有する患者）、腎臓または肝臓機能が不全の患者、高齢者、小児、乳児、早産で生まれた乳児、精神神経障害を有する者、あるいは向精神薬を服用している者、痙攣の病歴を有する者、あるいは真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用される従来薬剤と負の相互作用をするおそれのある薬物の適用を受けている者でありうる。

真菌感染療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)などの文献に記載されている。

５．４．２．３．４原虫感染
本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために、本発明の方法により対象に投与することができる。好ましい実施形態では、原虫に感染した細胞は、ＥｐｈＡ２の発現が増加している。本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状の治療、予防、および／または管理に有用な、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の他の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）と組み合わせて、原虫感染および／またはその１つもしくは複数の症状を治療、管理、および／または改善するために、対象に投与することもまたできる。好ましい実施形態では、本発明の方法により治療、予防、および／または管理される原虫感染は、細胞内原虫感染である。

任意の種類の原虫感染または原虫感染に起因もしくは関連する状態は、本発明の方法により治療、予防、および／または管理することができる。感染を引き起こす原虫の例には、非限定的に、リーシュマニア、トリパノソーマ、ジアルジア、トリコモナス、エントアメーバ、二核アメーバ、ネグレリアおよびアカントアメーバ、バベシア、プラスモディウム、イソスポラ、サルコシスティス、トキソプラズマ、エンテロシトゾーン、バランチジウム、ならびにニューモシスティスが挙げられる。

特定の実施形態では、本発明は、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量と、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは複数の予防もしくは治療剤）の有効量とを投与することを含む。

ある実施形態では、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、原虫感染の治療、予防、および／または管理に現在使用されているか、使用されてきたか、または有用であることが公知の、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の１つまたは複数の療法（例えば１つまたは予防もしくは治療剤）の有効量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与される。ある実施形態では、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量は、それを必要とする対象に、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために１つまたは複数の支援策と組み合わせて投与される。支援策の非限定的な例には、超音波ネブライザーによる空気の加湿、エアロゾル化ラセミ体エピネフリン、経口デサメタゾン、静脈用液剤、挿管、解熱剤（例えばイブプロフェンおよびアセトメタフィン）、および抗ウイルスまたは抗細菌療法（すなわち二次ウイルスまたは細菌感染を予防または治療するためのもの）が挙げられる。

本発明は、非限定的に、ＩｇＥ抗体レベル上昇、神経成長因子（ＮＧＦ）レベル上昇、マスト細胞の増殖、脱顆粒、および／または浸潤、Ｂ細胞の増殖および／または浸潤の増加、ならびにＴ細胞の増殖および／または浸潤の増加などの、原虫感染に対する生物学的応答を治療、予防、および／または管理するための方法もまた提供し、前記方法は、１つもしくは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または１つもしくは複数の他の療法と組み合わせて投与することを含む。

特定の実施形態では、本発明は、初回感染、好ましくは初回原虫感染に対する１つまたは複数の二次的状態または応答を治療、予防、および／または管理するための方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を単独で、または本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の他の療法（例えば他の予防または治療剤）の有効量と組み合わせて投与することからなる。

特定の実施形態では、本発明は、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ００／７８８１５、２００２年９月１２日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０２／０７０００７Ａ１、２００３年９月１８日の「インテグリンαＶβ３アンタゴニストを他の薬剤と組み合わせて使用する癌の予防または治療」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５９５７Ａ１、２００２年１１月１４日の「インテグリンα_ｖβ３アンタゴニストを他の予防または治療剤と組み合わせて投与することにより炎症または自己免疫障害を予防または治療する方法」という名称の米国特許出願公開第２００２／０１６８３６０Ａ１号、および２００３年９月１８日の「インテグリンαｖβ３アンタゴニストをＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤またはビスホスホネートと組み合わせて投与することにより障害を予防または治療する方法」という名称の国際公開ＷＯ０３／０７５７４１Ａ２、これらのそれぞれは、これによりその全体が参照により組み込まれている）の有効量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。

別の実施形態では、本発明は、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、シプリズマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ０２／０６９９０４）の有効量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、１つまたは複数の抗ＩＬ−９抗体［例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００５０００２９３４号（２００５年１月６日）に記載されている抗ＩＬ−９抗体］の有効量と組み合わせて投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を、以下、すなわちＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）、シプリズマブ、および／または抗ＩＬ−９抗体のうち２つ以上の有効量と組み合わせて投与することを含む。

本発明は、原虫感染を患っているか、またはそのような感染のリスクが増大していると予想される患者における原虫感染の発生を予防するための方法を包含する。そのような対象には、非限定的に、免疫系が抑制された患者［例えば臓器移植のレシピエントの患者、ＡＩＤＳ患者、化学療法を受けている患者、癌を有する患者、気管気管支ろうを有する患者、神経系疾患（例えば脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、およびミオパシーによって起こるもの）を有する患者、およびすでに状態、特に感染を患っている患者］が挙げられる。特定の実施形態では、患者は、気管支肺異形成、先天性心疾患、嚢胞性線維症、および／または後天性もしくは先天性免疫不全を患っている。別の特定の実施形態では、患者は、早産で生まれた乳児、乳児、小児、高齢者、またはグループホーム、養護ホームもしくは他のいくつかの種類の施設に入っているヒトである。本発明は、療法が利用できない状態に対する従来の抗原虫療法に対する有害反応に感受性の患者における原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。

本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたは本発明の組合せ療法は、非限定的に、第１、第２、第３、第４、または第５選択の療法を含めた任意の順位の療法として、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用することができる。本発明には、他の疾患または障害のための療法を受けている患者における原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた含まれる。本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法に対する任意の有害作用または不耐性が発生する前に、患者における原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を包含する。本発明は、抗療性の患者における原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。ある実施形態では、原虫感染を有する患者は、その感染が有意に根絶されず、かつ／またはその症状が有意に緩和されなかった場合に、療法に抗療性である。患者が抗療性であるかどうかの判定は、当技術分野で許容されている「抗療性の」意味をそのような状況で使用して、感染の治療の有効性をアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法により、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。様々な実施形態では、原虫の複製が減少しなかったか、または増加した場合には、原虫感染を有する患者は抗療性である。本発明は、原虫感染を発生するリスクのある患者におけるそのような感染の発症または再発を予防する方法もまた包含する。本発明は、従来療法の有害反応に感受性の患者における原虫感染またはその症状を治療、予防、および／または管理する方法もまた包含する。本発明は、抗原虫療法が利用できない原虫感染を治療、予防、および／または管理するための方法をさらに包含する。

本発明は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法に抗療性であることが証明されたが、これらの療法をもはや受けていない患者における原虫感染またはその症状を治療、予防、および／または管理するための方法を包含する。ある実施形態では、本発明の方法により管理または治療される患者は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗原虫剤、または他の生物学的療法／免疫療法ですでに治療されている患者である。これらの患者の中には、抗療性の患者、従来療法には若齢すぎる患者、および既存の療法を用いた管理または治療にかかわらず原虫感染が再発している患者がいる。

本発明は、他の従来療法の代替として、原虫感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の方法により管理または治療される患者は、他の療法に抗療性であるか、またはそのような療法による有害反応に感受性である。患者は、免疫系が抑制された者（例えば術後の患者、化学療法の患者、および免疫不全疾患を有する患者）、腎臓または肝臓機能が不全の患者、高齢者、小児、乳児、早産で生まれた乳児、精神神経障害を有する者、あるいは向精神薬を服用している者、痙攣の病歴を有する者、または真菌感染またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用される従来薬剤と負の相互作用をするおそれのある薬物の適用を受けている者でありうる。

原虫感染療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)などの文献に記載されている。

５．４．２．４．抗炎症療法
抗炎症障害に対する療法に有用な、当業者に十分に公知の薬剤などの任意の抗炎症剤は、本発明の組成物および方法に使用することができる。抗炎症剤の非限定的な例には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド系抗炎症薬、抗コリン作動薬［例えば硫酸アトロピン、アトロピン硝酸メチル、および臭化イプラトロピウム（ＡＴＲＯＶＥＮＴ（商標））］、β２アゴニスト［例えばアルブテロール（ＶＥＮＴＯＬＩＮ（商標）およびＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標））、ビトルテロール（ＴＯＲＮＡＬＡＴＥ（商標））、レバルブテロール（ＸＯＰＯＮＥＸ（商標））、メタプロテレノール（ＡＬＵＰＥＮＴ（商標））、ピルブテロール（ＭＡＸＡＩＲ（商標））、テルブタリン（ＢＲＥＴＨＡＩＲＥ（商標）およびＢＲＥＴＨＩＮＥ（商標））、アルブテロール（ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標）、ＲＥＰＥＴＡＢＳ（商標）、およびＶＯＬＭＡＸ（商標））、ホルモテロール（ＦＯＲＡＤＩＬＡＥＲＯＬＩＺＥＲ（商標））、およびサルメテロール（ＳＥＲＥＶＥＮＴ（商標）およびＳＥＲＥＶＥＮＴＤＩＳＫＵＳ（商標））］、およびメチルキサンチン［例えばテオフィリン（ＵＮＩＰＨＹＬ（商標）、ＴＨＥＯ−ＤＵＲ（商標）、ＳＬＯ−ＢＩＤ（商標）、およびＴＥＨＯ−４２（商標））］が挙げられる。ＮＳＡＩＤの例には、非限定的に、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ［ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標）］、ジクロフェナク［ＶＯＬＴＡＲＥＮ（商標）］、エトドラク［ＬＯＤＩＮＥ（商標）］、フェノプロフェン［ＮＡＬＦＯＮ（商標）］、インドメタシン［ＩＮＤＯＣＩＮ（商標）］、ケトララック（ｋｅｔｏｒａｌａｃ）［ＴＯＲＡＤＯＬ（商標）］、オキサプロジン［ＤＡＹＰＲＯ（商標）］、ナブメトン［ＲＥＬＩＦＥＮ（商標）］、スリンダク［ＣＬＩＮＯＲＩＬ（商標）］、トルメンチン（ｔｏｌｍｅｎｔｉｎ）［ＴＯＬＥＣＴＩＮ（商標）］、ロフェコキシブ［ＶＩＯＸＸ（商標）］、ナプロキセン［ＡＬＥＶＥ（商標）、ＮＡＰＲＯＳＹＮ（商標）］、ケトプロフェン［ＡＣＴＲＯＮ（商標）］、およびナブメトン［ＲＥＬＡＦＥＮ（商標）］が挙げられる。そのようなＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えばＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２）を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬の例には、非限定的に、グルココルチコイド、デキサメタゾン［ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標）］、コルチコステロイド［例えばメチルプレドニゾロンＭＥＤＲＯＬ（商標）］］、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＰＲＥＤＮＩＳＯＮＥ（商標）およびＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標））、プレドニゾロン［ＰＲＥＬＯＮＥ（商標）およびＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（商標）］、トリアムシノロン、アザルフィジン、およびエイコサノイド（例えばプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエン）阻害剤［例えばモンテルカスト（ＳＩＮＧＵＬＡＩＲ（商標））、ザフィルルカスト（ＡＣＣＯＬＡＴＥ（商標））、プランルカスト（ＯＮＯＮ（商標））、またはジロートン（ＺＹＦＬＯ（商標））］が挙げられる。

抗炎症療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)などの文献に記載されている。

５．４．２．５．抗ウイルス療法
当業者に十分に公知の任意の抗ウイルス剤は、本発明の組成物および方法に使用することができる。抗ウイルス剤の非限定的な例には、ウイルスのその受容体への付着、細胞へのウイルスのインターナリゼーション、ウイルスの複製、または細胞からのウイルスの放出を阻害および／または低減するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、および小分子が挙げられる。特に、抗ウイルス剤には、非限定的に、ヌクレオシドアナログ（例えばジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリバビリン）、フォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、αインターフェロンおよび他のインターフェロン、ならびにＡＺＴが挙げられる。

特定の実施形態では、抗ウイルス剤は、ウイルス抗原に免疫特異的な免疫調節剤である。本明細書に使用する用語「ウイルス抗原」には、非限定的に、免疫応答を誘発することのできる任意のウイルスペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質［例えばＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｎｅｆ、ＲＳＶＦ糖タンパク質、ＲＳＶＧ糖タンパク質、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、ＨＴＬＶｔａｘ、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（例えばｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、およびｇＥ）およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原］が含まれる。ウイルス感染の治療のために本発明に有用な抗体には、例えば非限定的に、アデノウイルス科（例えばマストアデノウイルスおよび鳥アデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、単純ヘルペスウイルス５、および単純ヘルペスウイルス６）、レヴィウイルス科（例えばレヴィウイルス、腸内細菌ファージＭＳ２、アロレヴィウイルス）、ポックスウイルス科（例えばコルドポックスウイルス亜科、パラポックスウイルス、鳥ポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、およびエントモポックスウイルス亜科）、パポバウイルス科（例えばポリオーマウイルスおよびパピローマウイルス）、パラミキソウイルス科［例えばパラミキソウイルス、パラインフルエンザウイルス１、モルビリウイルス（ｍｏｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）（例えば麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（例えばムンプスウイルス）、ニューモウイルス亜科（ｐｎｅｕｍｏｎｏｖｉｒｉｎａｅ）（例えばニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス）、およびメタニューモウイルス（例えば鳥ニューモウイルスおよびヒトメタニューモウイルス）］、ピコルナウイルス科［例えばエンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス（例えばヒトＡ型肝炎ウイルス）、カルジオウイルス、およびアフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）］、レオウイルス科（例えばオルソレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、サイポウイルス、フィジウイルス、フィトレオウイルス、およびオリザウイルス）、レトロウイルス科［例えば哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス、鳥Ｃ型レトロウイルス、Ｄ型レトロウイルス群、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、レンチウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス１およびヒト免疫不全ウイルス２）、スプーマウイルス］、フラビウイルス科（例えばＣ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えばＢ型肝炎ウイルス）、トガウイルス科［例えばアルファウイルス（例えばシンドビスウイルス）およびルビウイルス（例えば風疹ウイルス）］、ラブドウイルス科［例えばベシキュロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、シトラブドウイルス、およびヌクレオラブドウイルス（ｎｅｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）］、アレナウイルス科［例えばアレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピイウイルス（Ｉｐｐｙｖｉｒｕｓ）、およびラッサウイルス］、およびコロナウイルス科（例えばコロナウイルスおよびトロウイルス）などの病原性ウイルスの抗原に対する抗体が挙げられるが、それに限定されるわけではない。

ウイルス感染の治療に有用な、入手できる抗体の特定の例には、非限定的に、ＨＩＶ感染の治療に有用なＣＤ４融合抗体であるＰＲＯ５４２（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）、Ｂ型肝炎ウイルスの治療に有用なヒト抗体であるＯｓｔａｖｉｒ（ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｓｉｇｎＬａｂｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の治療に有用なヒト化ＩｇＧ１抗体であるＰｒｏｔｏｖｉｒ（ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｓｉｇｎＬａｂｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）、ならびにＲＳＶの治療に有用なヒト化抗体であるパリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、国際公開ＷＯ０２／４３６６０）が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用する抗ウイルス剤は、ウイルス感染を阻害もしくは低減するか、感染を引き起こすウイルスの複製を阻害もしくは低減するか、または他の細胞もしくは対象に感染を引き起こすウイルスの拡大を阻害もしくは低減する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用する抗ウイルス剤は、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ、もしくはＰＩＶによる感染を阻害もしくは低減するか、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ、もしくはＰＩＶの複製を阻害もしくは低減するか、または他の細胞もしくは対象へのＲＳＶ、ｈＭＰＶ、もしくはＰＩＶの拡大を阻害もしくは低減する。そのような薬剤ならびにＲＳＶ、ｈＭＰＶ、および／またはＰＩＶ感染の治療方法の例には、非限定的に、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリバビリンなどのヌクレオシドアナログ、ならびにフォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、およびαインターフェロンが挙げられる。２００２年７月２５日に出願された「抗ＲＳＶ、抗ＨＭＰＶ、および抗ＰＩＶ抗体を使用してＲＳＶ、ｈＭＰＶ、およびＰＩＶを治療および予防する方法」という名称の米国仮特許出願第６０／３９８，４７５号および２００３年２月２１日に出願された米国特許出願第１０／３７１，１２２号を参照のこと。これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

特定の実施形態では、ウイルス感染はＲＳＶであり、抗ウイルス抗原は、ＲＳＶの抗原に免疫特異的に結合する抗体である。ある実施形態では、抗ＲＳＶ抗原抗体は、Ａ群ＲＳＶのＲＳＶ抗原に免疫特異的に結合する。他の実施形態では、抗ＲＳＶ抗原抗体は、Ｂ群ＲＳＶのＲＳＶ抗原に免疫特異的に結合する。他の実施形態では、抗体は、一方の群のＲＳＶの抗原に結合し、もう一方の群の類似の抗原と交差反応する。特定の実施形態では、抗ＲＳＶ抗原抗体は、ＲＳＶ核タンパク質、ＲＳＶリンタンパク質、ＲＳＶマトリックスタンパク質、ＲＳＶ小疎水性タンパク質、ＲＳＶＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＳＶＦタンパク質、および／またはＲＳＶＧタンパク質に免疫特異的に結合する。追加的な特定の実施形態では、抗ＲＳＶ抗原抗体はＲＳＶ核タンパク質、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、ＲＳＶリンタンパク質、ＲＳＶマトリックスタンパク質、ＲＳＶ付着糖タンパク質、ＲＳＶ融合糖タンパク質、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、ＲＳＶマトリックスタンパク質、ＲＳＶ小疎水性タンパク質、ＲＳＶＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＳＶＦタンパク質、ＲＳＶＬタンパク質、ＲＳＶＰタンパク質、および／またはＲＳＶＧタンパク質のアレル変異体に結合する。

ＲＳＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体は、当技術分野で公知であることを認識すべきである。例えばパリビズマブ［ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）］は、小児患者におけるＲＳＶ感染の予防に現在使用されているヒト化モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、本発明の方法を用いて使用される抗体は、パリビズマブ、またはその抗体の結合性断片（例えば、パリミズマブの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは可変ドメインを含む断片）である。パリビズマブのアミノ酸配列は、例えばJohnson et al., 1997, J. Infection 176:1215-1224ならびに米国特許第５，８２４，３０７号およびＹｏｕｎｇらによる「予防および治療のために抗ＲＳＶ抗体を投与／投薬する方法」という名称の国際出願公報ＷＯ０２／４３６６０に開示されており、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

ＦｃＲｎ受容体に対してパリビズマブのＦｃドメインよりも高い親和性を有するＦｃドメインを含むＲＳＶ抗原に免疫特異的に結合する１つもしくは複数の抗体またはその抗原結合性断片もまた、本発明により使用することができる。そのような抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００１年１２月１２日に出願された米国特許出願第１０／０２０，３５４号に記載されている。さらに、抗ＲＳＶ抗原抗体Ａ４Ｂ４、Ｐ１２ｆ２Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａｌｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲＨ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、またはＡ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒのうち１つまたは複数は、本発明により使用することができる。これらの抗体は、Ｙｏｕｎｇらによる「予防および治療のために抗ＲＳＶ抗体を投与／投薬する方法」という名称の国際出願公開ＷＯ０２／４３６６０および「抗ＲＳＶ、抗ＨＭＰＶ、および抗ＰＩＶ抗体を使用してＲＳＶ、ＨＭＰＶ、およびＰＩＶを治療および予防する方法」という名称の２００２年７月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／３９８，４７５号に開示されており、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

ある実施形態では、抗ＲＳＶ抗原抗体は、すべて「予防および治療のために抗ＲＳＶ抗体を投与／投薬する方法」という名称の、Ｙｏｕｎｇらによる２０００年１１月２８日に出願された米国特許出願第０９／７２４，５３１号、２００１年１１月２８日に出願された第０９／９９６，２８８号、２００３年５月１５日に公開された米国特許出願公開第２００３／００９１５８４Ａ１号の抗ＲＳＶ抗原抗体であるか、またはその方法から調製される。これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明の方法に使用することができる安定化された抗体製剤の方法および組成物は、２００２年６月１４日に出願された米国仮出願第６０／３８８，９２１号および２００２年６月１４日に出願された第６０／３８８，９２０号に開示されており、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

抗ウイルス療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)などの文献に記載されている。呼吸器ウイルス感染に関する追加情報は、Cecil Textbook of Medicine (18th ed., 1988)から得ることができる。

５．４．２．６．抗細菌療法
細菌感染の治療、予防、および／または管理のための抗細菌剤および当業者に十分に公知の療法は、本発明の組成物および方法に使用することができる。抗細菌剤の非限定的な例には、細菌感染を阻害もしくは低減するか、細菌の複製を阻害もしくは低減するか、または他の対象への細菌の拡大を阻害もしくは低減するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、および小分子が挙げられる。特に、抗細菌剤の例には、非限定的に、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アズトレオナム、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、リファンピシン、ポリミキシン、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ケトコナゾール、イソニアジド、メトロニダゾール、およびペンタミジンが挙げられる。

好ましい実施形態では、抗細菌剤は、細菌感染を阻害もしくは低減するか、感染を引き起こす細菌の複製を阻害もしくは低減するか、または他の対象への感染を引き起こす細菌の拡大を阻害もしくは低減する薬剤である。細菌感染がマイコプラズマ感染（例えば咽頭炎、気管気管支炎、および肺炎）の場合には、抗細菌剤は、好ましくは、テトラサイクリン、エリスロマイシン、またはスペクチノマイシンである。細菌感染が結核の場合には、抗細菌剤は、好ましくはリファンピシン、イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、およびストレプトマイシンである。

抗細菌療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)などの文献に記載されている。呼吸器感染および抗細菌療法に関する追加情報は、Cecil Textbook of Medicine (18th ed., 1988)から得ることができる。

５．４．２．７．抗真菌療法
真菌感染またはその１つもしくは複数の症状（例えば真菌呼吸器感染）の治療、予防、および／または管理のための、当業者に十分に公知の抗真菌剤および療法は、本発明の組成物および方法に使用することができる。抗真菌剤の非限定的な例には、真菌感染を阻害および／もしくは低減するか、真菌の複製を阻害および／もしくは低減するか、または他の対象への真菌の拡大を阻害および／もしくは低減するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、および小分子が挙げられる。抗真菌剤の特定の例には、非限定的に、アゾール薬［例えばミコナゾール、ケトコナゾール［ＮＩＺＯＲＡＬ（登録商標）］、酢酸カスポファンギン［ＣＡＮＣＩＤＡＳ（登録商標）］、イミダゾール、トリアゾール［例えばフルコナゾール（ＤＩＦＬＵＣＡＮ（登録商標））およびイトラコナゾール（ＳＰＯＲＡＮＯＸ（登録商標））］、ポリエン［例えばナイスタチン、アムホテリシンＢ（ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（登録商標））、アムホテリシンＢ脂質複合体（「ＡＢＬＣ」）（ＡＢＥＬＣＥＴ（登録商標））、アムホテリシンＢコロイド状分散液（「ＡＢＣＤ」）（ＡＭＰＨＯＴＥＣ（登録商標））、アムホテリシンＢリポソーム製剤（ＡＭＢＩＳＯＮＥ（登録商標））］、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ピリミジン［例えばフルシトシン（ＡＮＣＯＢＯＮ（登録商標））］、およびボリコナゾール［ＶＦＥＮＤ（登録商標）］が挙げられる。例えば、特定の抗真菌剤およびその推奨される投与量のリストについては下記表３を参照のこと。

ある実施形態では、抗真菌剤は、真菌感染を阻害もしくは低減するか、感染を引き起こす真菌の複製を阻害もしくは低減するか、または他の対象への感染を引き起こす真菌の拡大を阻害もしくは低減する薬剤である。真菌感染がブラストミセス・デルマティディスの場合には、抗真菌剤は、好ましくはイトラコナゾール、アムホテリシンＢ、フルコナゾール、またはケトコナゾールである。真菌感染が肺アスペルギルス腫の場合には、抗真菌剤は、好ましくはアムホテリシンＢ、アムホテリシンＢリポソーム製剤、イトラコナゾール、またはフルコナゾールである。真菌感染がヒストプラスマ症の場合には、抗真菌剤は、好ましくはアムホテリシンＢ、イトラコナゾール、フルコナゾール、またはケトコナゾールである。真菌感染がコクシジオイデス症の場合には、抗真菌剤は、好ましくはフルコナゾールまたはアムホテリシンＢである。真菌感染がクリプトコッカス症の場合には、抗真菌剤は、好ましくはアムホテリシンＢ、フルコナゾール、またはこの２つの薬剤の組合せである。感染がクロモミコシス症の場合には、抗真菌剤は、好ましくはイトラコナゾール、フルコナゾール、またはフルシトシンである。真菌感染がムコール症の場合には、抗真菌剤は、好ましくはアムホテリシンＢまたはアムホテリシンＢリポソーム製剤である。肺または呼吸器真菌感染がシュードアレシェリア症の場合には、抗真菌剤は、好ましくはイトラコナゾールまたはミコナゾールである。

抗真菌療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Dodds et al., 2000 Pharmacotherapy 20(11) 1335-1355、the Physicians’ Desk Reference (61^st ed., 2007)、およびMerk Manual of Diagnosis and Therapy (17th ed., 1999)などの文献に記載されている。

５．４．２．８．抗原虫療法
原虫感染またはその１つもしくは複数の症状（例えば原虫感染に関連する呼吸器感染）の治療、予防、および／または管理のための、当業者に十分に公知の抗原虫剤および療法は、本発明の組成物および方法に使用することができる。抗原虫剤の非限定的な例には、原虫感染を阻害および／もしくは低減するか、原虫の複製を阻害および／もしくは低減するか、または他の対象への原虫の拡大を阻害および／もしくは低減するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、および小分子が挙げられる。抗原虫剤の特定の例には、非限定的に、クロロキンリン酸塩［Ａｒａｌｅｎ（商標）］；キニン硫酸塩および以下、すなわちドキシサイクリン、テトラサイクリン、またはクリンダマイシンのうちの１つの合剤；アトバコン−プログアニル合剤［Ｍａｌａｒｏｎｅ（商標）］；メフロキン［Ｌａｒｉａｍ（商標）］；メトロニダゾール（フラジール）；チニダゾール（Ｔｉｎｄａｍａｘ）；５−ニトロイミダゾール（オルニダゾール）、および米国特許第６，４４０，９３６号に記載されている薬剤が挙げられる。

ある実施形態では、抗原虫剤は、原虫感染を阻害もしくは低減するか、感染を引き起こす原虫の複製を阻害もしくは低減するか、または他の対象への感染を引き起こす原虫の拡大を阻害もしくは低減する薬剤である。原虫感染がトリコモナス症の場合には、抗原虫剤は、好ましくはメトロニダゾール（フラジール）、チニダゾール（Ｔｉｎｄａｍａｘ）、または５−ニトロイミダゾール（オルニダゾール）である。原虫感染がマラリアである場合には、抗原虫剤は、好ましくはクロロキンリン酸塩［Ａｒａｌｅｎ（商標）］；キニン硫酸塩および以下、すなわちドキシサイクリン、テトラサイクリン、またはクリンダマイシンのうちの１つの合剤；グルコン酸キニジンおよび以下、すなわちドキシサイクリン、テトラサイクリン、またはクリンダマイシンの１つの合剤；Ｆａｎｓｉｄａｒ（商標）；Ｍａｌａｒｏｎｅ（商標）（アトバコン２５０ｍｇおよびプログアニル１００ｍｇの合剤）；またはメフロキン［Ｌａｒｉｕｍ（商標）］である。

抗原虫療法、ならびにその投与量、投与経路、および推奨される用途は、当技術分野で公知であり、Dodds et al., 2000 Pharmacotherapy 20(11) 1335-1355、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)、Merk Manual of Diagnosis and Therapy (17th ed., 1999)、および疾病予防管理センター（ＣＤＣ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ）（アトランタ、ジョージア州）が供給する刊行物などの文献に記載されている。

５．５ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの生物学的活性
当技術分野で公知で、下記第６節に詳細に記載する様々なｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイは、本発明の方法により産生したＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの生物学的活性を判定するために使用することができる。そのようなｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイは、例えば標的細胞の特異性および前記細胞の効率的な溶解などの所望の生物学的活性を有するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのスクリーニングおよび同定を可能にする。特に本発明は、様々なイムノアッセイを用いて標的細胞の特異性（例えばＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥがＥｐｈＡ２を発現する細胞に免疫特異的に結合する能力）を判定する方法を提供する。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの結合特性は、例えば表面プラズモン共鳴を用いて、本発明の方法により産生したＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの親和定数（Ｋ_Ｄ、Ｋ_ｏｎ、およびＫ_ｏｆｆ）を同定してもまた判定することができる。本発明は、様々な細胞傷害アッセイを用いて、特定の生物学的活性、例えば標的細胞（例えばＥｐｈＡ２を過剰発現する腫瘍細胞）と結合してｉｎｖｉｔｒｏ溶解を仲介する能力などを有するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥについてスクリーニングするために使用することができるアッセイをさらに提供する。そのようなアッセイは、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの毒性および有効性を判定するため［例えばＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥで処理された細胞集団の５０％に致死的な用量（ＬＤ_５０）を決定するため］に使用することができる。動物モデルを用いて、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥがｉｎｖｉｖｏで腫瘍細胞死を仲介する能力を判定するために使用することができるアッセイもまた提供される。

５．５．１標的細胞の特異性を判定するためのアッセイ
当業者に公知の様々なアッセイを用いて、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥがＥｐｈＡ２発現細胞およびＣＤ３発現細胞（例えばＥｐｈＡ２を過剰発現している細胞またはＥｐｈＡ２のあるエピトープが選択的に露出している細胞）に免疫特異的に結合する能力を判定することができる。そのようなアッセイには、例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫蛍光、およびフローサイトメトリーアッセイが挙げられる。例えば、下記第６．２．３節に記載するように、フローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、様々なＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の二重特異性細胞結合を判定することができる。Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌細胞）などのＥｐｈＡ２陽性細胞系は、標的細胞として使用することができ、ＣＤ３陽性ＨＰ−Ｂａｌｌ細胞（ヒトＴ細胞系）は、エフェクター細胞として使用することができる。これらの細胞を、一緒に混合し、関心対象のＥｐｈＡ２とともにインキュベートすることができる。フローサイトメトリーを使用して、各ＥｐｈＡ２陽性標的細胞への結合強度を判定することができる。

エピトープ排除分析は、免疫蛍光染色を使用して行い、本発明の方法により産生されたＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが、それらが得られた親抗体と同様にエピトープ排除を維持しているかどうかを判定することができる。下記第６．２．４節を参照のこと。

５．５．２表面プラズモン共鳴アッセイ
表面プラズモン共鳴アッセイを行って、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの結合特性を判定することができる。本発明の方法により産生するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの親和性定数および解離定数、ならびに会合速度および解離速度（ｋ_ａ、ｋ_Ｄ、ｋ_ｏｎ、およびｋ_ｏｆｆ）は、このアッセイを用いて同定することができる。例えば下記第６．８．３節を参照のこと。例えば、表面プラズモン共鳴アッセイは、カルボキシメチル（ＣＭ）デキストランマトリックスおよびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を有するセンサーチップＣＭ５（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を使用して行うことができる。ＣＤ３εγは、アミンカップリング化学反応を用いてＣＭデキストランマトリックスに共有結合させる。参照表面は、ＣＤ３εγカップリング工程の省略により生み出す。ＥｐｈＡ２−Ｆｃは、Ｆｃ部分であるＥｐｈＡ２Ｆｃとヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）との間の高親和性相互作用により捕捉する。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）は、アミンカップリング化学反応を使用してＣＭデキストランマトリックスに共有結合させる。次に、２つの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異的表面を生み出す。これらの表面の１つは、参照表面として使用し、もう一方の表面は、ＥｐｈＡ２−Ｆｃ特異的表面を生み出すために使用する。次に、異なる濃度のｂｓｃＥｐｈＡ２×ＣＤ３を、ＨＢＳ−ＥＰ［０．０１ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％サーファクタントＰ２０］中で系列希釈することにより調製する。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、Ｄ３εγ特異的表面またはＥｐｈＡ２特異的表面と、それに対応する参照表面とを通る連続流動的にインジェクトする。結合したＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの解離は、ＨＢＳ−ＥＰの存在下でモニターする。残りの結合物質は、１０ｍＭ四ホウ酸二ナトリウム（ｐＨ８．５）、１ＭＮａＣｌ（ＣＤ３εγ特異的表面に対して）、または１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）（ＥｐｈＡ２−Ｆｃ特異的表面に対して）用いて除去した。

５．５．３細胞傷害アッセイ
下記第６．３．１節に説明するように、対象を変更された細胞のフローサイトメトリーに基づく細胞傷害アッセイは、エフェクター細胞ドナーを用いてＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ細胞傷害活性を判定するために行うことができる。例えばＣＤ３＋Ｔ細胞富化ヒト末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）は、健康なドナーから単離することができる。標的細胞、例えばＥｐｈＡ２を発現している細胞は、（ＤｉＯＣ１８（３）すなわち「ＤｉＯ」）などの蛍光膜色素で標識する。細胞を、関心対象のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥと共インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の添加後にフローサイトメトリーにより分析する。次に、標的細胞の溶解は、ＰＩにより陽性染色されたＤｉＯ陽性細胞の率として計算することができる。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する細胞（例えばＥｐｈＡ２を発現している癌細胞、非癌性過剰増殖性細胞、または感染細胞）の溶解を仲介する。この実施形態によると、そのような細胞は、同じ細胞系または対象由来の正常細胞、正常で健康な対象の細胞、および／または正常で健康な細胞の集団のレベルに比べて、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍、もしくは少なくとも１０倍だけ減少している。別の特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、正常組織由来の細胞または健康な対象もしくは対照の組織由来の正常細胞の溶解を仲介しない。

本発明により使用される療法の生物学的活性（例えば抗癌、抗過剰増殖、または抗感染活性）は、ＳＣＩＤマウスモデルもしくはマウスＥｐｈＡ２がヒトＥｐｈＡ２に置き換えられたトランスジェニックマウス、ヒト移植片を有するヌードマウス、下記第６節に記載する動物モデル、または当技術分野で公知であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれているRelevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger)；Contributions to Oncology (1999, Karger)；The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd)；およびAnticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher)に記載されている任意の動物モデル（ハムスター、ウサギなどを含む）などの、癌の研究のための様々な実験的動物モデルを使用することにより判定することもまたできる。

特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの細胞障害作用は、ＳＷ４８０ヒト結腸癌細胞系などの腫瘍異種移植片を使用した非糖尿病／重症複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスモデルなどのマウスモデルを用いてｉｎｖｉｖｏで検査することもまたできる。ＳＷ４８細胞はＥｐｈＡ２を発現していることから、ＳＷ４８細胞系は、ヒト異種移植モデルの樹立のために選択することができる。簡潔には、動物に標的細胞（例えばＳＷ４８０細胞）およびエフェクター細胞（健康なドナー由来のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞）の混合物、またはエフェクター細胞なしに標的細胞単独を注射することができる。腫瘍の成長動態は、２つの処置群の間で測定することができる。例えば下記第６．４．１節を参照のこと。

したがって、本発明の予防および／または治療用プロトコールの毒性および有効性は、細胞培養または実験動物において、例えばＬＤ_５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％に治療有効性の用量）を判定するための標準的な薬学的手順により判定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０という比として表現することができる。大きな治療指数を示す予防および／または治療剤が好ましい。有毒副作用を示す予防および／または治療剤を使用することができるが、未感染細胞への潜在的な損傷を最小にすることによって副作用を低減するように、患部組織の部位にそのような薬剤を標的化するデリバリーシステムを設計するために注意を払わねばならない。本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの生物学的活性を判定する方法の特定の例は、下記第６節の実施例にもまた提供される。

細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための予防および／または治療剤の一連の投与量を設定する際に使用することができる。そのような薬剤の投与量は、ほとんどまたは全く毒性を有さずにＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内に好ましくは入る。投与量は、採用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動しうる。本発明の方法で用いるどの薬剤についても、治療有効な用量は、細胞培養物アッセイから初めは推定することができる。用量は、細胞培養物で判定されたＩＣ_５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルで設定することができる。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

療法に使用するための化合物は、ヒトで試験する前に、非限定的に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターを含めた適切な動物モデル系、例えば上記の動物モデルで試験することができる。次に、化合物は、適切な臨床試験に使用することができる。

さらに、当業者に公知の任意のアッセイを使用して、ＥｐｈＡ２の異常発現および／または活性に関連する障害（例えば癌、非過剰増殖性細胞障害、または感染）の治療または予防のために、本明細書に開示する組合せ療法の予防および／または治療有用性を評価することができる。

５．６組成物
本発明は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用な原薬組成物（例えば不純な、または未滅菌の組成物）および単位投与形態の調製物に使用することができる医薬組成物（すなわち、対象または患者への投与に適した組成物）もまた含む。そのような組成物は、本明細書に開示する予防もしくは治療有効量の予防および／もしくは治療剤またはそれらの薬剤の組合せと、薬学的に許容される担体とを含む。好ましくは、本発明の組成物は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの予防または治療有効量と、薬学的に許容される担体とを含む。さらなる実施形態では、本発明の組成物は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥではない追加の療法をさらに含む。

特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局に認可されているか、または動物、より詳細にはヒトへの使用について米国薬局方、もしくは他の一般に認定されている薬局方に記載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬が一緒に投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを表す。そのような薬学的担体は、水、および石油、動物、合成、または植物起源の油など、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油を含めた油などの無菌液体でありうる。医薬組成物が静脈内投与される場合には、水が好ましい担体である。食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液もまた液体担体として、特に注射用溶液に採用することができる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望ならば、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤もまた含むことがある。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの剤形を採ることがある。

一般に、本発明の組成物の成分は、別々に供給されるか、または一緒に混合されるかのいずれかで、活性薬剤の量を表示しているアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の単位投与形態、例えば凍結乾燥粉末または無水濃縮物となる。組成物を点滴により投与する場合には、組成物は無菌医薬品等級の水または食塩水が入った輸液ボトルを用いて調剤することができる。組成物を注射により投与する場合には、注射用無菌水または食塩水のアンプルを用意することにより、投与前に成分を混合することができる。

本発明の組成物は、中性形態または塩形態として処方することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来の陰イオンと形成した塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来の陽イオンと形成した塩が挙げられる。

様々なデリバリーシステム、例えばマイクロ粒子、マイクロカプセル、抗体または抗体断片を発現することができる組換え細胞（例えばWu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照）、レトロウイルス、または他のベクターの部分としての核酸の構築物などが公知であり、それを用いて、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたは本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの組合せおよびＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）を治療、予防、および／または管理するために有用な予防剤または治療剤を投与することができる。本発明の予防または治療剤を投与する方法には、非限定的に、非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば鼻腔内、吸入、および経口経路）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の予防または治療剤は、筋肉内、静脈内、または皮下投与される。予防または治療剤は、任意の好都合な経路、例えば点滴またはボーラス注射により、上皮または粘膜ライニング（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収により投与することができ、他の生物学的活性薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身または局所でありうる。

特定の実施形態では、治療が必要な領域に本発明の予防または治療剤を局所投与することが望ましいことがあり、これは、例えば非限定的に、局所点滴、注射、またはインプラントにより達成することができる。前記インプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜または繊維などの膜を含めた多孔質、無孔質、またはゼラチン状材料製である。

なお別の実施形態では、予防または治療剤は、放出制御または徐放システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、放出制御または徐放を達成することができる（Langer、上記；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたはその断片の放出制御または徐放を達成することができる［例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照のこと、Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105もまた参照のこと］；米国特許第５，６７９，３７７号、第５，９１６，５９７号、第５，９１２，０１５号、第５，９８９，４６３号、第５，１２８，３２６号、国際公開ＷＯ９９／１５１５４およびＷＯ９９／２０２５３も参照］。徐放製剤に使用されるポリマーの例には、非限定的に、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸エステル、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリメタクリル酸エステル、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。好ましい実施形態では、徐放製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出性の不純物を有さず、保存に安定性で、無菌で、生分解性である。なお別の実施形態では、放出制御または徐放システムは、予防または治療標的の近くに置くことにより、全身用量の一部だけを要するようにすることができる［例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照］。

放出制御システムは、Ｌａｎｇｅｒ（1990, Science 249:1527-1533）による総説に論じられている。当業者に公知の任意の技法は、本発明の１つまたは複数の治療剤を含む徐放製剤を産生するために使用することができる。例えば米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開ＷＯ９１／０５５４８およびＷＯ９６／２０６９８；Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179 189；Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372 397；Cleek et al., 1997, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853 854；およびLam et al., 1997, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759 760を参照のこと。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

５．６．１製剤
本発明により使用するための医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して従来方法で処方することができる。

したがって、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物は、（口もしくは鼻のいずれかを通した）吸入もしくは吹入による投与、または経口、非経口、もしくは粘膜（口腔、膣、直腸、舌下など）投与のために処方することができる。好ましい実施形態では、局所または全身非経口投与が使用される。

経口投与のために、医薬組成物は、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロール）、増量剤（例えばラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えばバレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤とともに、従来手段により調製された、例えば錠剤またはカプセル剤の剤形を採ることがある。錠剤は、当技術分野で十分に公知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与用の液体調製物は、例えば液剤、シロップ剤、または懸濁剤の剤形を採ることがあるし、使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提示することがある。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）、非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分別植物油）、および保存料（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤とともに、従来手段により調製することができる。調製物は、必要に応じて緩衝塩、着香料、着色料、および甘味料もまた含むことがある。

経口投与用調製物は、活性化合物の放出制御を行うために適切に処方することができる。

口腔内投与のために、組成物は、従来方法で処方された錠剤または口中錠の剤形を採ることがある。

吸入による投与のために、本発明により使用するための予防または治療剤は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合には、投与ユニットは、定量を送達するためにバルブを用意することにより決定することができる。吸入器または吹入器に使用するための、化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤を含む、例えばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジを製剤することができる。

予防または治療剤は、注射、例えばボーラス注射または連続点滴による非経口投与のために処方することができる。注射用製剤は、保存料を添加して単位投与形態で、例えばアンプルまたは多回容器に入れて提示することができる。組成物は、懸濁剤、液剤、または油性または水性ビヒクル中の乳剤のような剤形を採ることがあり、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤用薬剤を含むことがある。あるいは、活性成分は、適切なビヒクル、使用前に例えば無菌無発熱物質の水で構成するために粉末形態であってもよい。

予防または治療剤は、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤用基剤を含む坐剤または保留浣腸などの直腸組成物の形にもまた処方することができる。

先に記載した製剤に加えて、予防または治療剤は、デポー調製物として処方することもまたできる。そのような長期作用型製剤は、埋め込み（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば予防または治療剤は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例えば許容される油中の乳剤）もしくはイオン交換樹脂とともに、またはやや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩として処方することができる。

本発明は、予防または治療剤が、量を表示しているアンプルまたはサシェなどの密閉容器にパッケージされていることもまた提供する。一実施形態では、予防または治療剤は、密閉容器中の乾燥無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、対象に投与するために適切な濃度まで、例えば水または食塩水で再構成することができる。

本発明の好ましい実施形態では、様々な化学療法剤、生物学的／免疫療法剤、およびホルモン療法剤の製剤および投与は、当技術分野で公知であり、多くの場合で、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)に記載されている。例えば、本発明のある特定の実施形態では、本発明の治療剤は、表２に提供されるように処方および供給することができる。

本発明の他の実施形態では、放射性同位体などの放射線療法剤は、カプセル内の液体として、またはドリンクとして経口的に与えることができる。放射性同位体は、静脈注射用に処方することもまたできる。熟練の腫瘍学者は、好ましい製剤および投与経路を決定することができる。

ある実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、静脈内注射について１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、および２５ｍｇ／ｍｌ、繰り返し皮下投与および筋肉内注射について５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、および８０ｍｇ／ｍｌで処方される。

組成物は、所望であれば、活性成分を含む１つまたは複数の単位投与形態を含みうるパックまたはディスペンサー装置の中に提示することができる。パックは、例えばブリスターパックのように金属箔またはプラスチックフィルムを備えていることがある。パックまたはディスペンサー装置は、投与説明書を添付していることがある。

５．６．２投与量および投与回数
回数および投与量は、各患者に特異的な要因により、投与される特定の療法（例えば特定の治療または予防剤）、障害、疾患、または状態の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に応じてもまた変動するものである。例えば、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状の治療、予防、および／または管理に有効な本発明の予防もしくは治療剤、または組成物の投与量は、例えば本明細書に開示するか、または当業者に公知の動物モデルなどの動物モデルに組成物を投与することにより決定することができる。加えて、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、所望により、最適な投与量範囲の同定を助けるために採用することができる。適切なレジメンは、そのような要因を考慮することにより、および以下により、当業者が選択することができる。例えば投与量は、文献に報告されており、Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007)に推奨されている。

小分子の例示的な用量には、対象または試料の重量１ｋｇあたりの小分子のｍｇまたはμｇ量（例えば１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇから約５０μｇ／ｋｇ）が含まれる。

本発明に包含される抗体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および融合タンパク質について、患者に投与される投与量は、典型的には０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）から１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される投与量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）から２０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１から２ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１から１ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．７５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．２５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１から０．１５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１から０．１０ｍｇ／ｋｇの間、０．００１から０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０１から０．２５ｍｇ／ｋｇの間、または０．０１から０．１０ｍｇ／ｋｇの間である。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答が原因の、他の種由来の抗体に比べて、ヒト体内で長い半減期を有する。したがって、ヒト抗体のより低い投与量およびより少ない投与回数が多くの場合で可能である。さらに、例えば脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）などの改変によって抗体の取り込みおよび組織透過を高めることにより、本発明の抗体またはその断片の投与量および投与回数を減らすことができる。

患者に投与された、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの例示的な投与量は、典型的には０．０１μｇから１００ｍｇである。特に好ましい投与量は、０．１μｇから１０ｍｇ、さらに好ましくは１μｇから１００μｇであり、最も好ましくは３μｇから１０μｇである。

特定の実施形態では、患者におけるＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために投与されたＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ（例えば本発明の抗体、組成物、または組合せ療法）の投与量は、１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）以下、５０ｍｇ／ｋｇ以下、２５ｍｇ／ｋｇ以下、１０ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、５００μｇ／ｋｇ以下、４００μｇ／ｋｇ以下、３００μｇ／ｋｇ以下、２００μｇ／ｋｇ以下、１５０μｇ／ｋｇ以下、好ましくは１２５μｇ／ｋｇ以下、１００μｇ／ｋｇ以下、９５μｇ／ｋｇ以下、９０μｇ／ｋｇ以下、８５μｇ／ｋｇ以下、８０μｇ／ｋｇ以下、７５μｇ／ｋｇ以下、７０μｇ／ｋｇ以下、６５μｇ／ｋｇ以下、６０μｇ／ｋｇ以下、５５μｇ／ｋｇ以下、５０μｇ／ｋｇ以下、４５μｇ／ｋｇ以下、４０μｇ／ｋｇ以下、３５μｇ／ｋｇ以下、３０μｇ／ｋｇ以下、２５μｇ／ｋｇ以下、２０μｇ／ｋｇ以下、１５μｇ／ｋｇ以下、１０μｇ／ｋｇ以下、５μｇ／ｋｇ以下、２．５μｇ／ｋｇ以下、２μｇ／ｋｇ以下、１．５μｇ／ｋｇ以下、１μｇ／ｋｇ以下、０．５μｇ／ｋｇ以下、または０．５μｇ／ｋｇ以下である。別の実施形態では、患者におけるＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために投与された、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥまたは組合せ療法の投与量は、０．１ｍｇから２０ｍｇ、０．１ｍｇから１５ｍｇ、０．１ｍｇから１２ｍｇ、０．１ｍｇから１０ｍｇ、０．１ｍｇから８ｍｇ、０．１ｍｇから７ｍｇ、０．１ｍｇから５ｍｇ、０．１から２．５ｍｇ、０．２５ｍｇから２０ｍｇ、０．２５から１５ｍｇ、０．２５から１２ｍｇ、０．２５から１０ｍｇ、０．２５から８ｍｇ、０．２５ｍｇから７ｍｇ、０．２５ｍｇから５ｍｇ、０．５ｍｇから２．５ｍｇ、１ｍｇから２０ｍｇ、１ｍｇから１５ｍｇ、１ｍｇから１２ｍｇ、１ｍｇから１０ｍｇ、１ｍｇから８ｍｇ、１ｍｇから７ｍｇ、１ｍｇから５ｍｇ、または１ｍｇから２．５ｍｇの単位用量である。

他の実施形態では、対象は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を１回または複数回投与され、有効量の薬用量は、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清中力価を達成する。なお他の実施形態では、対象は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量を１回投与され、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの抗体の血清中力価を達成し、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量の後続用量が投与され、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清中力価が維持される。これらの実施形態によると、対象に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回、またはそれを超える後続用量を投与することができる。

特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つもしくは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、組合せ療法、または組成物の少なくとも１０μｇ、好ましくは少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも１０５μｇ、少なくとも１１０μｇ、少なくとも１１５μｇ、少なくとも１２０μｇ、少なくとも１５０μｇ、少なくとも３００μｇ、少なくとも４００μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも１００ｍｇの用量を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明の１つもしくは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、組合せ療法、または組成物の少なくとも１０μｇ、好ましくは少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも１０５μｇ、少なくとも１１０μｇ、少なくとも１１５μｇ、または少なくとも１２０μｇの用量を、連続点滴として、３日に１回、好ましくは４日に１回、５日に１回、６日に１回、７日に１回、８日に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、または１カ月に１回投与することを含む。

本発明は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、（ａ）それを必要とする対象に、本発明の１つもしくは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、組合せ療法、または組成物の予防または治療有効量を１回または複数回投与すること、および（ｂ）前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをある回数投与後に前記対象における前記投与されたＥｐｈＡ２の血漿レベル／濃度をモニターすることを含む。さらに、前記ある用量回数は、本発明の１つもしくは複数のＥｐｈＡ２、組成物、または組合せ療法の予防または治療有効量の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回である。別の実施形態では、用量は連続ｉ．ｖ．点滴として投与される。

特定の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、（ａ）それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの少なくとも１０μｇ（好ましくは少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇ）を１回投与すること、および（ｂ）前記対象に投与されたＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの血漿レベルが０．１μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．２５μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．７５μｇ／ｍｌ未満、または１μｇ／ｍｌ未満の場合には、前記対象に１回または複数回の後続用量を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理する方法を提供し、前記方法は、（ａ）それを必要とする対象に、本発明の１つまたは複数の抗体の少なくとも１０μｇ（好ましくは少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇ）を１回または複数回投与すること、（ｂ）ある用量回数の投与を行った後に、投与された本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの前記対象における血漿レベルをモニターすること、および（ｃ）前記対象における投与されたＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの血漿レベルが０．１μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．２５μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．７５μｇ／ｍｌ未満、または１μｇ／ｍｌ未満である場合には、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの後続用量を投与することを含む。一実施形態では、前記ある回数の投与は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの有効量の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２回の投与であるか、または連続ｉ．ｖ．点滴として投与することができる。

ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために用いられてきたか、あるいは現在用いられている、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法（例えば予防または治療剤）は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するための本発明の方法による１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥと組み合わせて投与することができる。好ましくは、本発明の組合せ療法に使用される予防または治療剤の薬用量は、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために使用されてきたか、あるいは現在使用されている薬用量よりも低い。ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）またはその１つもしくは複数の症状を治療、予防、および／または管理するために現在使用されている薬剤の推奨薬用量は、Hardman et al., eds., 2001, Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed., Mc-Graw-Hill, New York；Physicians' Desk Reference (61^st ed., 2007), Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJを非限定的に含めた、当技術分野の任意の参考文献から得ることができ、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

様々な実施形態では、療法（例えば予防または治療剤）は、５分未満の間隔で、３０分未満の間隔で、１時間間隔で、約１時間間隔で、約１から約２時間の間隔で、約２時間から約３時間の間隔で、約３時間から約４時間の間隔で、約４時間から約５時間の間隔で、約５時間から約６時間の間隔で、約６時間から約７時間の間隔で、約７時間から約８時間の間隔で、約８時間から約９時間の間隔で、約９時間から約１０時間の間隔で、約１０時間から約１１時間の間隔で、約１１時間から約１２時間の間隔で、約１２時間から１８時間の間隔で、１８時間から２４時間の間隔で、２４時間から３６時間の間隔で、３６時間から４８時間の間隔で、４８時間から５２時間の間隔で、５２時間から６０時間の間隔で、６０時間から７２時間の間隔で、７２時間から８４時間の間隔で、８４時間から９６時間の間隔で、または９６時間から１２０時間の間隔で、連続点滴として投与される。好ましい実施形態では、２つ以上の療法が、患者の１回の来院時に投与される。

ある実施形態では、本発明の１つまたは複数の抗体および１つまたは複数の他の療法（例えば予防または治療剤）は、周期的に投与される。周期的療法は、１つの療法に対する抵抗性の発生を低減し、１つの療法の副作用を回避もしくは低減し、および／または療法の有効性を向上させるために、第１の療法（例えば第１の予防または治療剤）をある期間投与し、続いて第２の療法（例えば第２の予防または治療剤）をある期間投与し、所望により、続いて第３の療法（例えば第３の予防または治療剤）をある期間投与することなど、およびこの連続投与、すなわちサイクルを繰り返すことを伴う。

ある実施形態では、本発明の同一のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの投与は繰り返すことができ、その投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、または少なくとも６カ月だけ間隔が空いていることがある。他の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ以外の療法（例えば予防または治療剤）の投与は繰り返すことができ、その投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、または少なくとも６カ月だけ間隔が空いていることがある。

５．７キット
本発明は、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ、前記ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥをコードしているポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを発現しているベクターを充填した１つまたは複数の容器を備える医薬パックまたはキットを提供する。追加的に、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）の治療に有用な１つまたは複数の他の予防もしくは治療剤もまた、医薬パックまたはキットに含ませることができる。本発明は、本発明の医薬組成物の１つまたは複数の成分を充填した１つまたは複数の容器を備える医薬パックまたはキットもまた提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制している政府機関に規定された様式の注意書きをそのような容器に所望により添付することができ、その注意書きは、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売を当機関が認可したことを反映している。

本発明は、上記方法に使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キットは、１つまたは複数の容器の中に、本発明の１つまたは複数のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥおよび使用説明書を備える。別の実施形態では、キットは、ＥｐｈＡ２の異常発現（例えば過剰発現）および／または活性に関連する障害（例えば癌、非癌性過剰増殖性細胞障害、または感染）の治療に有用な１つまたは複数の他の予防もしくは治療剤を１つまたは複数の容器に備える。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）である。ある実施形態では、他の予防または治療剤は化学療法剤である。他の実施形態では、予防または治療剤は、生物学的またはホルモン療法である。なお他の実施形態では、予防または治療剤は、抗ウイルス、抗真菌、抗原虫、抗細菌、または抗自己免疫剤である。

本発明は、上に論じる任意の診断用組成物を備えるキットをさらに提供する。

以下の非限定的実施例は、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの産生およびその特性解析を示す。

６．１ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの産生
６．１．１２種類の親モノクローナル抗体からの８種類のＥｐｈＡ２特異的ＢｉＴＥの構築
米国特許出願公開第２００４−００９１４８６Ａ１号および２００６年１０月６日付の米国特許出願第１１／５４４，３２２号が述べる通り、ＥＡ２およびＥＡ５と称する２種類のマウス抗ＥｐｈＡ２抗体の可変領域コード配列を含むプラスミドを、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築に用いた。それぞれ、図１および２も参照のこと。抗ＣＤ３単鎖抗体の一種で、ｄｉＬ２Ｋと称する、ヒトＣＤ３ε特異的マウスｍＡｂＬ２Ｋの脱免疫化派生物を、ＥｐｈＡ２単鎖抗体との融合に用いた（全体が参照により本明細書に組み込まれているDreier et al., 2002, Int. J. Cancer 100:690-697を参照のこと。）。８種類のＢｉＴＥ構築物のためのｃＤＮＡは、ＰＣＲに基づく融合法により産生した。ＢｉＴＥ構築物には、抗ＥｐｈＡ２および抗ＣＤ３単鎖抗体に対し、以下の可変（ＶＨおよびＶＬ）ドメイン配置および位置取りを与えた：

作製したＢｉＴＥ構築物

ＢｉＴＥｃＤＮＡの構造を図３に示す。発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ内でクローン化する挿入物は、各々、翻訳効率の上昇および分泌シグナル配列（マウスＩｇ重鎖リーダー配列）のために、５’末端をコザック部位とするリーダー配列を含んだ。該リーダー配列には、上記で一覧した４種類のＩｇ可変領域が後続した。抗ＥｐｈＡ２のＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ接合部のリンカーペプチドは、１５アミノ酸長（モチーフＧ_４Ｓの３回反復［配列番号５９］）を有する。ＥｐｈＡ２をＣＤ３結合特異性と連結するリンカーペプチドは、モチーフＧ_４Ｓの１回反復（配列番号５８）を含む。第４ドメインに直接隣接するのは、Ｃ末端ヘキサヒスチジン（Ｈ６）配列（配列番号６６）で、検出および精製用である。表示の制限酵素部位を用いて、ＢｉＴＥ構築物を発現ベクター内でクローン化させた。

６．１．１．１ＣＨＯ細胞におけるＢｉＴＥ発現のためのベクター
ｐＥＦ−ＤＨＦＲベクターは、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼを選択マーカーとして含む５．８ｋｂのベクターで、ヒトＥＦ１αプロモーターの制御下で発現させる該遺伝子とともにバイシストロニックの転写単位を形成する。該真核細胞用発現ベクターは、発現ベクターｐＭＴ２ＰＣの派生物である。

ＥＦ１αプロモーター部位には、リボゾーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＤＨＦＲ遺伝子、およびポリアデニル化シグナルからなる多重クローニング部位が後続する。該ベクターに存在する付加的制御配列は、細菌由来の複製起点（ＯＲＩ）およびアンピシリン耐性のための遺伝子（ｂｌａ）である。以下の表に、ｃＤＮＡ発現ベクターの各構成要素をまとめる。

ベクターを図４に図示する。

６．１．１．２宿主ＣＨＯ細胞系
チャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞系ＣＨＯ／ｄｈｆｒ⁻のＣＲＬ９０９６は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州、マナサス、「ＡＴＣＣ」）から購入し、英国Ｑ−Ｏｎｅ社が特性解析した。ＣＨＯ／ｄｈｆｒ⁻細胞系はジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損するので、成長培地にはサプリメントとして、ヒポキサンチンおよびチミジンを添加する必要がある。

６．１．１．３ＣＨＯ細胞におけるＢｉＴＥ発現
ＥｐｈＡ２に基づくＢｉＴＥ構築物をコードする８種類の発現ベクターをＣＨＯ／ｄｈｆｒ⁻細胞にトランスフェクションした後、各細胞プールを、ヌクレオシドを含まないＨｙＱＰＦＣＨＯ大豆液体培地（４．０ｍＭＬ−グルタミンおよびプルロニックＦ−６８を添加：ＨｙＣｌｏｎｅ社製、型番ＳＨ３０３５９．０２）中で培養し、ＤＨＦＲ陽性トランスフェクタントを選択した。次いで、トランスフェクションした細胞プールに対し、ヌクレオシドなしの培地へのサプリメントとしてＤＨＦＲ阻害剤のメトトレキサート（ＭＴＸ）を２０ｎＭの濃度で用いる、単回の遺伝子増幅工程を実施した。

６．１．１．４培養上清からのＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの精製
クロマトグラフィーには、Ａｅｋｔａ（登録商標）ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）およびＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアを用いた。製造元が提供するプロトコールに従い、ＺｎＣｌ_２を添加したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）カラム（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（「ＩＭＡＣ」）を実施した。カラムは、緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ７．５］、０．４ＭＮａＣｌ）で平衡化し、細胞培養液上清（５００ｍｌ）を、流速３ｍｌ／分でカラム（１０ｍｌ）に投入した。緩衝液Ａでカラムを洗浄し、非結合試料を除去した。結合タンパク質は、以下に従う緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ７．５］、０．４ＭＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール）の２段階勾配を用いて溶出した：
段階１：６カラム容量中に１０％緩衝液Ｂ、
段階２：６カラム容量中に１００％緩衝液Ｂ。

段階２からの溶出タンパク質画分を、さらなる精製のためにプールした。

ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ２００ＨｉＰｒｅｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）上でゲルろ過クロマトグラフィーを実施した（図５）。溶出タンパク質試料（流速１ｍｌ／分）を検出するため、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを実施した（図６）。精製前に、カラムを分子量測定用に較正した（Ｓｉｇｍａ社製、ＭＷＧＦ−２００、分子量マーカーキット）。タンパク質アッセイ用染料（Ｐｉｅｒｃｅ社製、ＭｉｃｒｏＢＣＡ）および標準タンパク質としてＩｇＧ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて、タンパク質濃度を測定した。

６．１．２毒性試験のためのマカク属ＣＤ３反応性代理ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ
６．１．２．１カニクイザル反応性抗ＣＤ３親抗体のフローサイトメトリーによる結合分析
ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物をカニクイザルにおける毒性について調べるための出発点として、カニクイザル由来の末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を用い、いずれもＦＩＴＣと抱合させた２種類のカニクイザル反応性抗ＣＤ３親抗体であるｃＣＤ３−１およびｃＣＤ３−２に対するＣＤ３の結合を検出した。各試料につき２００，０００個の細胞を、氷上で３０分間、各抗体とともにインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。陰性対照として、非関与抗体を用いた（黒線）。ヒストグラムオーバーレイでは、ＣＤ３結合をグレーの線で表す。細胞は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ハイデルベルク、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上のフローサイトメトリーにより分析した。いずれの抗体も、カニクイザルＰＢＭＣのＴ細胞画分への著明な結合を示す。図７を参照のこと。

６．１．２．２置換標的特異性を有する代理分子
抗ＣＤ３親抗体であるｃＣＤ３−１およびｃＣＤ３−２の可変ドメインを用いて、置換標的特異性を有するＢｉＴＥ分子を構築した。ＰＣＲに基づく融合法により、ドメイン配置の異なる単鎖抗体を産生した。以下のＢｉＴＥ構築物は、置換標的特異性によるこれら特異性を組み合わせることにより産生した：

代理構築物のクローニングおよびトランスフェクションは、前出の手順で行った。

６．１．２．３ｍＡｂＥＡ２およびＥＡ５のアカゲザルＥｐｈＡ２との交差反応性の証拠
アカゲザルＣＭＭＴ１１０／ＣＬ系由来のアカゲザルＥｐｈＡ２（ヒトＥｐｈＡ２と９７．７％の相同性）の配列決定、およびカニクイザル脾臓細胞（ヒトＥｐｈＡ２と＞９９％の相同性）の部分配列決定は、ヒトＥｐｈＡ２特異的モノクローナル抗体ＥＡ２およびＥＡ５が、非ヒト霊長類ＥｐｈＡ２分子と交差反応を生じる可能性があることを示唆した。実際、ＥＡ２およびＥＡ５抗体は、ＣＭＭＴ１１０／ＣＬ細胞上におけるＥｐｈＡ２のリン酸化を活性化させ（図８）、フローサイトメトリーによる測定の通り、ＣＭＭＴ１１０／ＣＬ細胞表面のアカゲザルＥｐｈＡ２に弱いながらも結合した（アイソタイプ対照との対比で、１．２〜１．８倍のＭＦＩ変化）。

６．１．２．４マカク属ＣＤ３反応性ＥＡ２およびＥＡ５ＢｉＴＥの構築
抗ＥｐｈＡ２抗体ＥＡ２およびＥＡ５ならびにマカク属ＣＤ３特異的単鎖抗体ｃＣＤ３−１およびｃＣＤ３−２の可変鎖コード配列を含むプラスミドを、ＰＣＲに基づく融合法により構築した。以下の１２種類のＢｉＴＥ分子を作製した：

６．１．２．５マカク属ＣＤ３と反応する各種抗ＥｐｈＡ２代理ＢｉＴＥ構築物のフローサイトメトリーによる結合分析
各試料につき２００，０００個の細胞（Ｔ細胞またはＥｐｈＡ２^＋腫瘍細胞）を、氷上で３０分間、各種抗ＥｐｈＡ２代理ＢｉＴＥ構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の５０μｌ純細胞培養液上清とともにインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、マウスＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（２％ＦＣＳを添加した５０μｌＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈：Ｑｉａｇｅｎ社製、注文番号３４６６０）を含むＣ末端ヒスチジンタグにより結合構築物を検出した後、洗浄工程に続き、２％ＦＣＳを添加した５０μｌＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリスリン抱合マウスＦｃガンマ特異抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製、注文番号１１５−１１６−０７１）とともにインキュベートした（グレー線）。陰性対照として、非トランスフェクション細胞の細胞培養液上清を用いた（黒線）。細胞は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ハイデルベルク、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上のフローサイトメトリーにより分析した。図９に示す通り、これらマカク属ＣＤ３抗体ｃＣＤ３−１に基づく代理ＢｉＴＥ構築物のみが、ＣＤ３およびＥｐｈＡ２に対して強力な結合を示した。ｃＣＤ３−２に基づく構築物は、強力なＣＤ３結合を示すのみであり、ＥｐｈＡ２結合は、ほぼ完全に抑制されることがわかった。

６．２ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの特性解析
６．２．１抗ＥｐｈＡ２親抗体のフローサイトメトリーによる結合分析
フローサイトメトリー分析を実施して、抗ＥｐｈＡ２親モノクローナル抗体Ｂ２３３、ＥＡ２およびＥＡ５の結合強度を推定した（図１０）。Ｂ２３３モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨドメイン配列については、図３を参照のこと。ＥｐｈＡ２発現Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞系）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌）を用いた。２００，０００個の細胞を、氷上で３０分間、１０μｇ／ｍｌの各抗体とともにインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。一次抗体の結合を、２％ＦＣＳを添加した５０μｌＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリスリン抱合マウスＦｃガンマ特異抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製、注文番号１１５−１１６−０７１）により検出した。陰性対照として、同じアイソタイプによる非関与抗体を用いた（細線）。細胞は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ハイデルベルク、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上のフローサイトメトリーにより分析した。

ｍＡＢＢ２３３は、ＥＡ２およびＥＡ５に次いで強力な結合シグナルを示した。３種類の抗体の結合能を、ヒストグラムオーバーレイに示す。

６．２．２抗ＥｐｈＡ２親抗体ＥＡ２およびＥＡ５の組織交差反応性（ＴＣＲ）
免疫組織化学法を用いてヒトＥｐｈＡ２反応性モノクローナル抗体ＥＡ２およびＥＡ５により凍結ヒト組織切片を染色し、該抗体が正常組織に特異的に結合するかどうかを判定した。略述すると、非結合二次結合部位を適切な種類のガンマグロブリンでブロックした、一次および二次抗体のプレ複合体を産生した。凍結切片を、１０％ホルマリンによりスライドに接着させ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した１倍濃度トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ですすいだ。グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）、β−Ｄ（＋）−グルコース（Ｓｉｇｍａ社製）、およびアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製）を含む溶液により、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。アビジン／ビオチンベクターキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ社製）により、アビジン／ビオチン反応部位をブロックした。次いで、スライドを、ウシ血清アルブミン、カゼイン、および正常ヤギ血清を含むタンパク質ブロッキング溶液とともにインキュベートした。プレ複合化抗体とともに組織切片をインキュベートした後、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣＥｌｉｔｅキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ社製）で染色し、１倍濃度ＴＢＳですすぎ、ＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ社製）で処理し、ヘマトキシリンで対比染色した。組織切片は、乾燥させ、カバースリップをかけ、画像化した。

図１１に示すように、ＥＡ５は、心臓組織（図１１Ｂ）、複数器官の血管および間質の平滑筋要素（細胞質）、結腸上皮（細胞質）、および子宮筋層内の介在板を染色させた。アイソタイプ対照モノクローナル抗体１Ａ７と異なり、ＥＡ２がヒト組織切片（図１１Ｃ）を染色することはなく、以下の表にまとめる通りであった。

６．２．３ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の二重特異性細胞結合
ＥｐｈＡ２陽性Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞系）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌）のほか、ＣＤ３陽性ＨＰ−ＢＡＬＬ（ヒトＴ細胞系）を用いた。２００，０００個の細胞を、氷上で３０分間、４種類のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の精製済みＢｉＴＥ単量体１０μｇ／ｍｌとともにインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、マウスＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（２％ＦＣＳを添加した５０μｌＰＢＳで１：２０に希釈：Ｑｉａｇｅｎ社製、注文番号３４６６０）を含むＣ末端ヘキサヒスチジンタグにより結合構築物を検出した後、洗浄工程に続き、２％ＦＣＳを添加した５０μｌＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリスリン抱合マウスＦｃガンマ特異抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製、注文番号１１５−１１６−０７１）とともにインキュベートした（グレー線）。陰性対照として、トランスフェクタントからの培養液上清でなく、非トランスフェクトＣＨＯ細胞からの新鮮な細胞培養培地を用いた（黒線）。細胞は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ハイデルベルク、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上のフローサイトメトリーにより分析した。図１２を参照のこと。

以下の表に、全８種類を産生しフローサイトメトリーにより分析した、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の相対値による結合強度をまとめる。

全８種類のＥＡ２−ＢｉＴＥ構築物が、抗ＣＤ３ＳＣＡ部分により、ＨＰＢａｌｌ細胞上で発現するＣＤ３に対してある程度の強い結合を示したことは、抗ＣＤ３部分の適正な発現およびフォールディングを示唆する。ｍＡｂＥＡ２由来のＢｉＴＥ全４種類が、ＥｐｈＡ２陽性の乳癌および肺癌細胞系への結合を示したのに対し、ｍＡｂＥＡ５由来のＢｉＴＥは１種類のみが、ＥｐｈＡ２特異的結合活性を保持した。こうして、モノクローナル抗体ＥＡ２は、ｍＡｂＥＡ５よりも好適なＢｉＴＥ構築物であると考えられる。

６．２．４ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥによるエピトープ排除
免疫蛍光染色試験に、ＥｐｈＡ２陽性非形質転換***上皮細胞系ＭＣＦ１０Ａおよび乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用いて、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物（１０μｇ／ｍｌで使用）が、親モノクローナル抗体のＥＡ２およびＥＡ５と同様に、エピトープ排除を保持しているかどうかを解明した。分析結果を、以下の表にまとめる。ＢｉＴＥＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）−脱免疫化抗ＣＤ３が、最も強力なエピトープ排除を示した。

６．２．５単量体ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの生産性
５種類の活性ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの生産性を、ローラーボトルによる小規模産生の単量体収量から計算した。最大生産性１．１ｍｇ／ｌの精製済み単量体を得た（以下の表を参照のこと）。

ＢｉＴＥ構築物の脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）をトランスフェクトした増幅済みＣＨＯ細胞（２０ｎＭＭＴＸ）のプールによる、培地規模生産（２×１０Ｌ培養槽）の生産性は、細胞培養液上清中に１．１ｍｇ／Ｌの精製済みＢｉＴＥであった。

６．２．６５種類のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の対象変更溶解能
クロム５１放出に基づく細胞傷害アッセイを実施して、ヒトＴ細胞存在下の各種ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物による、対象変更した標的細胞溶解を解明した。略述すると、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法により、エフェクターＴ細胞源としてのＰＢＭＣを得た。ＣＤ１６誘導磁性ビーズによりＰＢＭＣからＮＫ細胞を枯渇させて、Ｔ細胞に依存しない細胞溶解を回避した。ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ５４９にクロム５１を添加し、標的細胞として用いた。各種ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を、広範な濃度範囲にわたり滴定した。アッセイの実施時間は１８時間であり、エフェクター対標的比率（Ｅ：Ｔ）は、１０：１であった。図１３を参照のこと。

以下の表に、２つの独立した試験において測定した通り、ＥｐｈＡ２陽性標的細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ５４９それぞれの、対象変更細胞溶解最大値の５０％に必要なＢｉＴＥ濃度（すなわちＥＣ５０）をまとめる。以下の表に、２つの独立した試験において測定した通り、ＥｐｈＡ２陽性標的細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ５４９それぞれの、対象変更細胞溶解最大値の５０％に必要なＢｉＴＥ濃度（すなわちＥＣ５０）をまとめる。

ＢｉＴＥ構築物の脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）は、乳癌および肺癌細胞系の対象変更溶解において、一貫して高度な能力を示した。

６．２．７さらなる特性解析のためのＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の選定
脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）が、対象変更溶解において最も強力なＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物（２種類の標的細胞系について、６〜２５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値）であることがわかり、二重特異性結合活性を示す全５種類のＢｉＴＥ構築物のうちで２番目に高い単量体生産性（０．８〜１．１ｍｇ／ｌ）を示したので、これをさらなる特性解析用に選定した。脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２ＢｉＴＥ構築物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については、図１４を参照のこと。

６．３ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ「脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）」のさらなる特性解析
６．３．１生産バッチおよびエフェクター細胞ドナーによる細胞傷害活性の変化
ＰＢＭＣ（ＣＤ１６陽性細胞の枯渇後）および刺激済みＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いて、２種類のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）生産ロットの細胞傷害活性を比較した。ＥｐｈＡ２陽性細胞系Ａ５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、標的細胞として用いた。Ｅ：Ｔ比率は１０：１、インキュベーション時間は１８時間であった。図１５を参照のこと。

以下の表に、ＰＢＭＣまたは刺激済みＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかをエフェクター細胞として用いる、異なる生産バッチからのＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥによる上述の用量反応分析から得た、対象変更した標的細胞溶解の最大溶解値の５０％（すなわちＥＣ５０）をまとめる。

７例のヒトＰＢＭＣドナー（ＮＫ細胞枯渇）により、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）について、対象変更した標的細胞溶解のＥＤ５０値の変化を調べた。

ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）は、ＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣによる場合よりも、刺激済みＣＤ８＋Ｔ細胞による場合の方が、より高度な細胞傷害性を示した。２種類のバッチ間の生物学的活性の変化は、１．４〜３．２倍の範囲内にあった。一方、効力の変化は、ヒトＰＢＭＣドナーについてより著明であり、１．９〜２３．９ｎｇ／ｍｌの間のＥＤ５０値が観察された。こうして、ドナー特異的なＴ細胞の有効性が、ＢｉＴＥ活性変化の主要な源泉であると考えられる。

フローサイトメトリーに基づく対象変更細胞傷害アッセイも実施して、エフェクター細胞ドナーによるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ細胞傷害活性の変化を測定した。ＣＤ３＋Ｔ細胞富化ＰＢＭＣをエフェクター細胞、ＥｐｈＡ２＋ＳＷ４８０結腸癌細胞を標的細胞として用いた。略述すると、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法により、健康なドナーからＣＤ３＋Ｔ細胞富化ヒトＰＢＭＣを分離した（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ）。標的細胞は、３，３’ −ジオクタデシロキサカルボシアニン［ＤｉＯＣ１８（３）または「ＤｉＯ」（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製）］の緑色蛍光膜染料により、３７℃で５分間標識した。エフェクターおよび標的細胞の混合物を、５：１の比率で混合し、９６ウェルの丸底プレートに移した。培地のみ、または各ＢｉＴＥ構築物の段階希釈液を該当するウェルに添加し、３７℃で１８または４２時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるよう添加した後にフローサイトメトリーにより分析した。標的細胞溶解は、ＰＩが陽性に染色するＤｉＯ陽性細胞の百分率として計算した。すべてのインキュベーションは、デュプリケートで行った。ＥＣ５０値の計算は、４パラメータ非線形近似モデルを用いて行った。

図１６に示す通り、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、異なる被験者からのＴ細胞の対象を変更し、ＥｐｈＡ２＋腫瘍細胞殺滅を媒介した。フローサイトメトリーに基づく細胞傷害アッセイでは、４９例のヒトドナーから単離したＳＷ４８０標的細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞を用いた。大半のヒトドナーに対し、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、きわめて低濃度で腫瘍細胞殺滅を媒介した。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥＣ５０は、全被験Ｔ細胞ドナーについて１〜１１０ｎｇ／ｍｌであり、中央値（水平バー）は２４ｎｇ／ｍｌであった。こうして、大半のヒトＴ細胞ドナーに対して、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、低ｎｇ／ｍｌ濃度の範囲で殺滅活性の観察される、きわめて強力な分子である。

６．３．２標的細胞結合の特異性：可溶ＥｐｈＡ２融合タンパク質を脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）と結合で競合させる
競合アッセイにおいて、ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の標的結合特異性を調べた。この目的のため、２００，０００個のＥｐｈＡ２陽性Ａ５４９細胞を、氷上で３０分間、５０μｇ／ｍｌの可溶ＥｐｈＡ２Ｆｃ融合体タンパク質の存在または非存在下における、５μｇ／ｍｌのＥＡ２に基づくＢｉＴＥ構築物とともにインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、マウスＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（２％ＦＣＳを添加した５０μｌＰＢＳで１：２０に希釈：Ｑｉａｇｅｎ社製、注文番号３４６６０）を用いるＣ末端ヒスチジンタグにより結合構築物を検出した後、洗浄工程に続き、２％ＦＣＳを添加した５０μｌＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリスリン抱合マウスＦｃガンマ特異抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製、注文番号１１５−１１６−０７１）とともにインキュベートした（グレー線）。陰性対照として、二次抗体のみを用いた（黒線）。細胞は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置（ハイデルベルク、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上のフローサイトメトリーにより分析した。

図１７に示す通り、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）を、重量が１０倍上回る可溶ＥｐｈＡ２Ｆｃ融合タンパク質と共インキュベートすると、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＡ５４９ヒト肺癌細胞への結合が完全に遮断された。これは、ＥｐｈＡ２標的の認識が、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの腫瘍細胞への結合を特異的に媒介することを示す。

６．３．３ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の標的細胞特異性：抗原陽性細胞の殺滅
元のＩｇＧからＢｉＴＥフォーマットへの変換後における標的特異性の保持を確認するため、抗原陽性および陰性標的細胞による細胞傷害アッセイを実施した。この目的のため、マウス黒色腫細胞系のＢ１６Ｆ１０細胞にＥｐｈＡ２をトランスフェクトして、非トランスフェクト細胞と比較した。１０：１のＥ：Ｔ比率および１８時間のアッセイ時間で、刺激済みヒトＣＤ８Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いる標準的なクロム放出アッセイを、各濃度のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物により実施した。図１８を参照のこと。

脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２−ＢｉＴＥが、ＥｐｈＡ２＋ＳＷ４８０ヒト結腸癌細胞の溶解を媒介する一方、ＥｐｈＡ２陰性ＳＫ−ＭＥＬ２８黒色腫細胞の溶解を媒介しないことは、標的細胞溶解の特異性をさらに裏付けた。図１９を参照のこと。ＥｐｈＡ２およびＣＤ３の双方に対する親抗体特異性が、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの媒介する溶解を遮断した。こうして、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２−ＢｉＴＥの細胞傷害活性は、標的細胞上におけるＥｐｈＡ２の発現に厳密に依存し、ＥｐｈＡ２陰性細胞は、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２−ＢｉＴＥの媒介する溶解に対して完全に耐性である。

６．３．４ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが媒介する腎細胞癌および前立腺癌細胞殺滅
ＣＤ３＋Ｔ細胞富化ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞、ＥｐｈＡ２＋ＡＣＨＮおよびＣａｋｉ２腎細胞癌細胞系ならびにＰＣ３およびＤＵ１４５前立腺癌細胞系を標的細胞として用いて、フローサイトメトリーに基づく対象変更細胞傷害アッセイを実施した。略述すると、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法により、健康なドナーからＣＤ３＋Ｔ細胞富化ヒトＰＢＭＣを分離した（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ）。標的細胞は、３，３’ −ジオクタデシロキサカルボシアニン［ＤｉＯＣ１８（３）または「ＤｉＯ」（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製）］の緑色蛍光膜染料により、３７℃で５分間標識した。エフェクターおよび標的細胞の混合物を、５：１の比率で混合し、９６ウェルの丸底プレートに移した。培地のみ、または各ＢｉＴＥ構築物の段階希釈液を該当するウェルに添加し、３７℃で４２時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるよう添加した後にフローサイトメトリーにより分析した。標的細胞溶解は、ＰＩが陽性に染色するＤｉＯ陽性細胞の百分率として計算した。すべてのインキュベーションは、デュプリケートで行った。ＥＣ５０値の計算は、４パラメータ非線形近似モデルを用いて行った。

図２０に示す通り、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、腎細胞癌および前立腺癌細胞のいずれに対しても、対象変更したＴ細胞溶解を媒介した。

６．３．５標的細胞上におけるＥｐｈＡ２量に対するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ殺滅の効果
上述の手順で細胞傷害アッセイを実施した。細胞傷害アッセイの終了と同時に、培養液を氷上に置き非処理で放置するか、または１０μｇ／ｍｌの非結合アイソタイプ対照マウスモノクローナル抗体１Ａ７もしくは抗ヒトＥｐｈＡ２マウスモノクローナル抗体Ｂ２３３で処理した（全体が参照により本明細書例に組み込まれているDall'Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60）。ＡＰＣ抱合抗ペンタヒスチジン抗体が、非処理細胞上に残存するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥに結合した。ＡＰＣ抱合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体が、アイソタイプまたはＢ２３３の標的細胞結合量を解明した。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ投入量と対比したアイソタイプ対照、ＥｐｈＡ２、およびＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの幾何平均による蛍光強度を、グラフで表した。図２１を参照のこと。

６．３．６細胞傷害性の時間、対標的エフェクター比率、および受容体結合部位に対する依存性
脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の動態および効力を探索するため、対象変更腫瘍細胞溶解の複数のパラメータを評価した。標的細胞殺滅の経時分析は、抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）存在下において、１８時間後に非刺激ＣＤ３＋Ｔ細胞による限定的溶解が生じ、４２時間後までに最大殺滅（＞８０％の溶解）が生じることを示した（図２２Ａ）。大半の試験で、対象変更したＴ細胞溶解の規模は、標的細胞の８０％を超えた。効力の別の尺度として、対標的細胞エフェクター比率を検討した。１：１〜２０：１のＥ：Ｔ比率で同様に高い溶解活性を示す一方、１：２および１：５のＥ：Ｔ比率でも、溶解百分率は低下するものの、依然としてＳＷ４８０腫瘍細胞の対象変更溶解を生じた（図２２Ｂ）。推定ＥＣ５０値が、インキュベーション時間（図２２Ａ、１〜９ｎｇ／ｍｌ）またはＥ：Ｔ比率（図２２Ｂ、２〜７ｎｇ／ｍｌ）の変化にもかかわらずおおむね一定であったことは、注目に値する。

表面上で異なる密度のＥｐｈＡ２を発現する腫瘍細胞標的を評価し、抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）活性に必要な表面標的密度の閾値が存在するかどうかを解明した。細胞あたり２，４００個のＥｐｈＡ２分子しか発現しなかったＭ１４細胞（図２２Ｄ）を含む、すべてのＥｐｈＡ２発現細胞系（図２２Ｃ）について、効率的な対象変更Ｔ細胞溶解が観察された。抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）が媒介する溶解の規模は、表面標的密度によらず、標的細胞間で同等であった（図２２Ｄ）。一方、標的細胞上におけるＥｐｈＡ２の表面密度は、対象変更溶解の効率に影響を与えた。腫瘍細胞上におけるＥｐｈＡ２結合部位数が増加するのに応じて、抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の効力も増大する傾向が観察された（図２２Ｃ）。まとめると、以上の結果は、抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）が、強力かつ特異的に非刺激ヒトＴ細胞の対象を変更して、腫瘍上に存在する結合可能部位が低密度の場合でも、ＥｐｈＡ２発現腫瘍細胞を溶解させうることを示唆した。

６．３．７ヒト血漿中におけるＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の安定性
ＥｐｈＡ２特異ＢｉＴＥの血漿安定性を、異なるインキュベーション条件下で調べた後、標準的な５１クロム放出アッセイにおいて、細胞傷害活性のＥＤ５０を測定した。ヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコート済み注射器により、健康なドナー５例の血液から採取した。遠心分離により細胞成分を除去し、上部血漿層の採取後にプールした。脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）ＢｉＴＥを、血漿の存在または非存在下において、３７℃または４℃のいずれかとともにインキュベートした。対照として、細胞傷害アッセイ直前に、それぞれ血漿またはＲＰＭＩ−１６４０培地中でＢｉＴＥを希釈した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１を標的細胞、ＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率は、１０：１であった。アッセイ時間は１８時間であった。図２３を参照のこと。

脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）は、ヒト血漿中３７℃で２４時間のインキュベーション後に、著明な細胞傷害活性の喪失が検出できなかったので、安定であることが示された。

６．３．８脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）による非形質転換細胞上における標的エピトープ排除
ビデオ顕微鏡検査を用いて、ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）および非エピトープ排除対照ＢｉＴＥの存在下における、非形質転換ＭＣＦ１０Ａ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の攻撃を可視化した（図２４を参照のこと）。標的細胞を播種して２４時間の接着細胞成長後に、４８ウェルプレート内でのビデオ録画を開始した。録画の直前、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢｉＴＥの混合物を、培養ウェルに添加した。おおむね１分あたり１画像の割合で２０時間にわたりビデオ顕微鏡検査を記録した。１８時間後、ウェルにヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）を添加した。スライド画像をＡＶＩビデオ動画に変換し、透過光および蛍光光写真を撮影した。

１８時間のアッセイ時間中のビデオ顕微鏡分析は、ＥｐｈＡ２特異ＢｉＴＥによるエピトープ排除を裏付けた。汎腫瘍陽性対照ＢｉＴＥが、無傷細胞単層全体にわたって非形質転換ＭＣＦ１０Ａ細胞を攻撃するのに対し（図２４Ｃ）、ＥｐｈＡ２特異ＢｉＴＥは、隣接細胞全体のエピトープ排除が不可能であるコンフルエント細胞層境界部においてのみＴ細胞活性を示した（図２４Ａ）。無傷単層領域のＴ細胞活性は、Ｔ細胞が単層上部に均等に分布するのみであるＢｉＴＥ非存在下（図２４Ｂ）で見られるのと同様、きわめて脆弱であった。ＥｐｈＡ２のエピトープ排除を支援しないＡ５４９癌細胞単層は、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）存在下のＴ細胞が完全に破壊した。該アッセイ終了時にヨウ化プロピジウムを添加したところ、Ｔ細胞によるクラスター中において死滅した癌細胞を可視化することができた。このように強く染色された細胞クラスターが、ＢｉＴＥを含まない対照ウェル以外の各ウェルにおいて、アッセイ終了時に見られた。

６．３．９脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）のＥｐｈＡ２標的に対する結合定数
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００システムを用いる表面プラズモン共鳴により、ＢｉＴＥ／ＥｐｈＡ２複合体の形成および解離をモニターした。この目的のため、ＣＭ５カルボキシメチル化デキストランマトリックスによるセンサーチップ上に、ＥｐｈＡ２Ｆｃ融合タンパク質を固定化した。ｐＨスカウティング（酢酸ナトリウム［ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５］、四ホウ酸二ナトリウム［ｐＨ８．５］）により、最適の固定化条件を求めた。最適ｐＨ値は、ｐＨ４．０であった。フローセル２へ１０００ＲＵ、フローセル３へ５，０００ＲＵ、およびフローセル４へ４００ＲＵの固定化後、エタノラミンにより過剰反応群を脱活性化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で異なる濃度に希釈した解析対象物の脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）を注入することにより、抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの固定化ＥｐｈＡ２への親和性を測定した。表面を再生するため、ＲＥＧＥＮ緩衝液（５０ｍＭＮａＯＨ、２０ｍＭＭＥＳ、１ｍＭＮａＣｌ［ｐＨ６．４］）を用いた。図２５を参照のこと。

６．４ＥｐｈＡ２特異ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）のｉｎｖｉｖｏにおける有効性
脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）は、ヒトＣＤ３および霊長類ＥｐｈＡ２に特異性であるため、マウスＣＤ３またはＥｐｈＡ２には結合しない。このため、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の抗腫瘍活性は、ヒト結腸癌異種移植モデルによる免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてのみ検討可能であった。

６．４．１ＮＯＤ／ＳＣＩＤＳＷ４８０異種移植モデル
ＳＷ４８０細胞がＥｐｈＡ２を発現し、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）がｉｎｖｉｔｒｏにおけるＳＷ４８０細胞の対象変更溶解を示したので、ヒト異種移植モデルの確立のために、ヒト結腸癌細胞系ＳＷ４８０を選定した。

５×１０^６個のＳＷ４８０細胞を、健康なドナーからの２．５×１０^６個のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞と混合し、最終容量０．２ｍｌＰＢＳ中のＥ：Ｔ比率が１：２となるようにした。次いで、Ｔ細胞エフェクター／ＳＷ４８０細胞混合液を、各ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右脇腹に皮下注射した。皮下成長するＳＷ４８０腫瘍を、直交する２方向の寸法において測径器により週３回測定し、以下の表式により腫瘍体積を計算した：腫瘍体積＝［（幅^２×長さ）／２］

６．４．２試験デザイン
各群６例ずつのマウスに、ＰＢＳ対照ビヒクル、非関与対照ＢｉＴＥ、または脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）を、以下の表に従うＣＤ３＋Ｔ細胞およびＳＷ４８０腫瘍細胞の皮下接種１時間後より、５日間連続で静脈内投与した。

ＩおよびＪ群のマウスには、ＳＷ４８０腫瘍細胞接種の５分後、尾静脈注射により２．５×１０^６個のＣＤ３＋エフェクター細胞を追加投与し、末梢Ｔ細胞の存在を刺激した。

６．４．３ｉｎｖｉｖｏにおける脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の抗腫瘍活性
６．４．３．１ＳＷ４８０モデルの特異性および再現性
エフェクター細胞なしのＳＷ４８０細胞のみの接種後、ＰＢＳ（Ａ群）または脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）（Ｂ群）を投与したところ、接種４日後に最初の触知可能な腫瘍が生じ、３０日目には腫瘍塊の肥大（＞１ｃｍ^３）ゆえに、マウスを安楽死させなければならなかった。ＰＢＳおよび脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）投与群間に腫瘍成長動態の差が見られなかったことは、エフェクター細胞の非存在下で、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが、抗腫瘍効果を及ぼさなかったことを示す。図２６を参照のこと。

ＳＷ４８０腫瘍およびヒトＴ細胞混合物の接種後に、ＰＢＳ対照ビヒクル（Ｃ群）、または、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）とＣＤ３結合アームを共有するが異なる標的アームも有する非関与対照ＢｉＴＥ（Ｄ群）を投与しても腫瘍成長に影響を及ぼさなかったことは、ＢｉＴＥ抗ＣＤ３アーム自体も、Ｔ細胞のみも、抗腫瘍活性を有さなかったことを示す。こうして、非関与対照ＢｉＴＥの投与は、ビヒクルＰＢＳと同じ効果を示した。図２６を参照のこと。

最後に、腫瘍細胞接種５分前における追加のＣＤ３＋Ｔ細胞静脈内注射により末梢Ｔ細胞の存在を模倣しても、腫瘍成長には影響を及ぼさなかった（Ｉ群）。図２６を参照のこと。

以下で調べたすべての対照条件間に、腫瘍成長の著明な差は見られなかった。このことも、選択した腫瘍細胞接種量によるＳＷ４８０ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルの、高度な頑健性および再現性を示す。図２６を参照のこと。

６．４．３．２脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）による腫瘍成長の用量依存的阻害
脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）投与は、ＣＤ３＋エフェクターＴ細胞存在下において、ＳＷ４８０腫瘍成長の用量依存的な阻害を誘発した。

１μｇ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２の投与が腫瘍成長に対して何らの影響も及ぼさなかったのに対し、他のすべての被験用量（５日間にわたり、毎日５、２０、および１００μｇ）が、腫瘍成長を著明に阻害した。５日間連日の５μｇ投与により、３〜９日目には腫瘍体積が著明に減少し、１８、２０、および２７日目には非関与対照ＢｉＴＥ群と比べても著明に減少した。２０μｇ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）投与マウスの腫瘍体積は、分析したすべての時点における非関与対照ＢｉＴＥ投与マウスと比べ、著明に減少した。最後に、５×１００μｇ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）投与は、分析したすべての時点において高度に著明な差を生じ、ＢｉＴＥ投与後の２週間にわたり、腫瘍成長を一切示さなかった。非関与対照ＢｉＴＥ投与は、ビヒクルＰＢＳ投与と同様の効果を示した。図２７を参照のこと。

６．４．３．３脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の抗腫瘍効果に対する末梢Ｔ細胞の無作用
末梢にヒトＴ細胞が存在しない異種移植モデルの状況とは対照的に、末梢中の分子を捕獲することで脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の腫瘍特異的標的化を低下させると考えられる循環Ｔ細胞は、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２の有効性に影響を与えうる。この仮説を再現するため、２群のマウスにヒトＴ細胞を追加で静脈内注射し、末梢ヒトＴ細胞集団を供給した。

追加ヒトＴ細胞の静脈内投与は、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の有効性に何らの影響も与えなかった。Ｆ群（２０μｇ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）投与／注射）およびＪ群（２０μｇ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）投与／追加のＴ細胞２．５×１０^６個の静脈内注射後の注射）におけるＳＷ４８０腫瘍の成長は、ほぼ同様であった。いずれの群においても、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）投与は、ＰＢＳ投与マウスまたは循環Ｔ細胞を追加したＰＢＳ投与マウスと比べ、高度に著明な腫瘍成長の阻害を誘発した。図２８を参照のこと。

６．５ヒト化抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの産生および特性解析
以下の知見は、抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの構築に用いるヒト化抗ＥｐｈＡ２抗体の産生および特性解析について詳述する。ヒト化した抗体から構築した候補ＢｉＴＥは、ヒト化カニクイザルＥｐｈＡ２に結合することができたが、正常ヒト心臓組織には結合しなかった。

２種類のマウス抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体Ｂ２３３（図２９参照）およびＥＡ２（図１）をヒト化して、３Ｆ２（Ｂ２３３由来、図３０）および４Ｈ５（ＥＡ２由来）を産生した。以下に、および全体が参照により本明細書に組み込まれているDall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60に詳述する手順で親和性最適化を実施した。

６．５．１ＥｐｈＡ２抗体の親和性最適化
６．５．１．１４Ｈ５の親和性最適化
以下の知見は、ヒト化抗ヒトＥｐｈＡ２ｍＡｂ４Ｈ５の親和性最適化による３種類の親和性最適化変異体２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２の生産について詳述する。親和性最適化変異体、特に２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２の生産に関する詳細については、「親和性を最適化したＥｐｈＡ２アゴニスト抗体およびその使用法」（本文献の全体を参照により本明細書に組み入れる）と題する２００５年１２月２１日付の米国特許仮出願第６０／７５１，９６４号を参照のこと。

６．５．１．１．１試薬
すべての試薬は、分析グレードのものとした。制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素、ならびにＴ４リガーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社（マサチューセッツ州、ビバリー）から購入した。特注のオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州、カールスバード）が合成した。ヒトＥｐｈＡ２−Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質と融合させたヒトＥｐｈＡ２外部ドメインからなる）をヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞内で発現させ、標準的なプロトコールを用いるプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。製造元の取扱説明書（イリノイ州、ロックフォード、Ｐｉｅｒｃｅ社製）に従いＥＺ−ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎＫｉｔを用いて、ヒトＥｐｈＡ２−Ｆｃのビオチニル化を実行した。

６．５．１．１．２フレームワークシャフリング法によるマウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体ＥＡ２のヒト化
それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれている、Dall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60および米国特許出願公開第２００５／０００４８６１７Ａ１号が述べるフレームワークシャフリング法を用いて、マウス親ｍＡｂＥＡ２のヒト化を実施した。基本を述べると、ＥＡ２ＶＬおよびＥＡ２ＶＨ両領域のＣＤＲ領域を、ヒトフレームワーク生殖細胞系列配列のライブラリー上にコンビナトリアル手法で移植し、ＥｐｈＡ２結合性を保持するモザイク状のヒト化変異体を作製した。このようなヒト化クローンの１つである４Ｈ５は、キメラＦａｂＥＡ２と比べ、親和性が約２０倍上昇した。このクローンを親和性成熟のテンプレートとして選択した後、以下の手順で最適化した結果、変異体２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２を得た。

６．５．１．２４Ｈ５ｓｃＦｖの親和性最適化
６．５．１．２．１ｓｃＦｖテンプレートの構築
Ｍ１３発現ベクターに導入したｓｃＦｖ断片として、ヒト化ｍＡｂ４Ｈ５の可変領域をクローン化させた（全体が参照により本明細書に組み込まれているDall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-6）。［（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ］_３リンカーにより、４Ｈ５軽鎖可変領域を４Ｈ５重鎖可変領域の３’末端に接合した後、Ｃ末端にＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを接合した（図３１）。ＰＣＲ法および以下のプライマーを用いて構築物を産生し、個別の反応により可変領域を増幅した：

Ｍｅｄｉ−ＶＨ８：TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC CAG GTG CAG CTG TTG SAG TCT G（ＶＨを増幅する５’プライマー、Ｓ＝Ｃ／Ｇ）（配列番号１２０）

Ｍｅｄｉ−ＪＨ１：GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC（ＶＨを増幅する３’プライマー）（配列番号１２１）

Ｍｅｄｉ−ＶＫ１：GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC（ＶＬ用の５’プライマー、Ｗ＝Ａ／Ｔ）（配列番号１２２）

Ｍｅｄｉ−ＪＫ４：TGG AAT TCG GCC CCC GAG GCC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC（ＶＬ用の３’プライマー）（配列番号１２３）、以上において、下線を付した配列が［（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ］_３リンカーに対応し、太字のイタリック体（Ｍｅｄｉ−ＶＨ８の下線部）がＳｆｉＩ制限部位を示す。オーバーラッピングＰＣＲ法を用いて、ｓｃＦｖ断片を構築した後、これをＳｆｉＩで制限し、ベクターＭＤ１０２内でクローン化させた。マウス親ＥＡ２可変領域を同じ手順でクローン化させ、ｓｃＦｖ対照として用いた。次いで、全体が参照により本明細書に組み込まれているWu and An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234が述べる手順で、４Ｈ５ｓｃＦｖ構築物をＣＪ２３６内で発現させ、ウリジン＋ｓｓＤＮＡを産生した。この４Ｈ５ｓｃＦｖＵ＋ｓｓＤＮＡを、後続の突然変異誘発による親和性最適化反応のためのテンプレートとして用いた。４Ｈ５ｓｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図３２に示す。

６．５．１．２．２各ＣＤＲ領域の最小限の無作為化によるｓｃＦｖの親和性最適化
アミノ酸あたり２種類ずつの個別ライブラリーを用いて、全６種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の各アミノ酸を、個別かつ無作為に変異させた（全体が参照により本明細書に組み込まれているWu and An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234）。各ＣＤＲアミノ酸位置に８アミノ酸（ＮＳＳ）または１２アミノ酸（ＮＷＳ）をコードする各個の縮重プライマーを、単回のハイブリダイゼーションによる突然変異誘発反応に用い（それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれているWu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212、およびDall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60）た後、対応するＣＤＲライブラリーの産生用に組み合わせた。略述すると、各縮重プライマーをリン酸化した後、１時間にわたり温度を９５℃から５５℃に低下させるアニーリング反応において、ウリジニル化４Ｈ５ｓｃＦｖによる１本鎖Ｕ＋ＤＮＡテンプレート（Wu and An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234が述べる手順で調製）とともに１０：１の比率で用いた。アニール化反応にＴ４リガーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼを添加して、３７℃で１．５時間半、該反応をインキュベートした。各ＣＤＲの各アミノ酸につき合成産物をプールする一方で、ＮＳＳおよびＮＷＳライブラリーは分離し、個別にスクリーニングした。典型的な手順は、１μｌのプール済みＣＤＲライブラリーによる合成ＤＮＡを、次いでWu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212が述べる手順によりＸＬ１−Ｂｌｕｅ中で電気穿孔し、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌ローン上のプラーク形成またはｓｃＦｖ断片の生産を促した。

６．５．１．３ライブラリーのスクリーニング
６．５．１．３．１一次スクリーニング
一次スクリーニングは、シングルポイントＥＬＩＳＡ法（ＳＰＥ）からなり、基本的にWu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212、およびDall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60が述べる手順で、９６ウェル深底プレート中に１ｍｌ細菌培養液を培養し個々の組換えＭ１３クローンを感染させ、ここから調製する可溶性の分泌ｓｃＦｖタンパク質を含む上清を用いて実施した。略述すると、このキャプチャーＥＬＩＳＡ法では、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅの各ウェルを約３０ｎｇのマウス抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）でコートし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより３７℃で２時間ブロックし、試料（可溶性の分泌ｓｃＦｖ）とともに室温で２時間インキュベートした。次いで、１５０〜６００ｎｇ／ウェルのビオチニル化ヒトＥｐｈＡ２−Ｆｃを添加し、室温で約２時間放置した。これに続き、ニュートラビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体（イリノイ州、Ｐｉｅｒｃｅ社製）により、室温で４０分間インキュベートした。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質でＨＲＰ活性を検出し、０．２ＭＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍでプレートを測定した。

６．５．１．３．２一次スクリーニングの結果
典型的な手順では、ＯＤ４５０ｎｍシグナルを親４Ｈ５ｓｃＦｖよりも約２倍強く示すクローンを１５ｍｌ規模で再成長させ、デュプリケートウェル中の同じＥＬＩＳＡ法により再アッセイし、肯定的な結果を確認した。次いで、複製されるクローンを配列決定し、活性ＥＬＩＳＡ法（下記参照）により分析し、ヒトＥｐｈＡ２への結合の増大倍数を推定した。

６．５．１．３．３二次スクリーニング
すでに同定した単回変異による親和性最適化変異体の特徴をさらに明らかにするため、１５ｍｌ細菌培養液から発現した分泌ｓｃＦｖ断片を用いる二次スクリーニング（Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212参照）を実施した。より正確には、以下の２種類のＥＬＩＳＡ法を用いた：（ｉ）活性ＥＬＩＳＡ法では、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅの各ウェルを約０．５ｕｇのヒトＥｐｈＡ２−Ｆｃでコートし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより３７℃で２時間ブロックする。次いで、２倍に段階希釈した試料を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、ヤギ抗ヒトカッパ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体とともにインキュベートした。ＴＭＢ基質でＨＲＰ活性を検出し、０．２ＭＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍでプレートを測定した。（ｉｉ）抗ｓｃＦｖ定量化ＥＬＩＳＡ法は、基本的にWu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212が述べる手順で実施した。略述すると、９６ウェルＮｉＮＴＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ社製）の各ウェルを、２倍段階希釈試料または標準液（５０〜０．７８ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。次いで、マウス抗ＦＬＡＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体とともにインキュベートした。ＴＭＢ基質でＨＲＰ活性を検出し、０．２ＭＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍでプレートを測定した。

６．５．１．３．４二次スクリーニングの結果
上記の二部構成による二次スクリーニングは、ｓｃＦｖ４Ｈ５および親和性最適化変異体をｓｃＦｖ濃度で規格化することにより、ヒトＥｐｈＡ２への結合の点から相互に比較することを可能とした。単回変異によるすべての親和性最適化変異体ｓｃＦｖクローンが、親ｓｃＦｖ４Ｈ５と比べ、ヒトＥｐｈＡ２への良好な結合を示した（データは示さない）。

６．５．１．４ＣＤＲ親和性最適化クローンからのコンビナトリアル変異体の構築および特性解析
結合のさらに改善したコンビナトリアル変異体を設計するため、活性／定量化ＥＬＩＳＡ法により親４Ｈ５ｓｃＦｖと比べると、結合の改善したすべての単回アミノ酸変異を組み合わせて、小型で集約的なコンビナトリアルライブラリーを作製した。略述すると、同定されたすべてのアミノ酸変異のほか、同じ位置に親アミノ酸もコードする縮重プライマーを設計した。すべてのプライマーを包含するアニーリング反応および後続の合成（前出）により、前述の手順でコンビナトリアルライブラリーを構築し、スクリーニングした。

６．５．１．４．１ＥｐｈＡ２上における一次スクリーニングの結果
典型的な手順では、ＯＤ４５０ｎｍシグナルを親ｓｃＦｖ４Ｈ５よりも強く示すクローンを１５ｍｌ規模で再成長させ、デュプリケートウェル中のＥＬＩＳＡ法（前出）により再アッセイし、肯定的な結果を確認した。次いで、１６種類のコンビナトリアル変異体を選択および配列決定し、１１種類の固有なＣＤＲアミノ酸変異の組合せを同定した後、一次配列レベルの１〜３アミノ酸により各変異体を互いに識別した。

６．５．１．４．２ＥｐｈＡ２上における二次スクリーニングの結果
上述した１１種類の固有コンビナトリアル変異体を、前述の二次スクリーニングにより分析し、コンビナトリアル変異体の結合親和性の改善を推定した。すべての変異体が、４Ｈ５ｓｃＦｖと比べ、ヒトＥｐｈＡ２への親和性を著明に改善した。３種類の親和性最適化コンビナトリアル変異体２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図３３、３４、および３５に示す。３種類の親和性最適化コンビナトリアル変異体２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２のデータを、図３６に示す。図３７は、ヒト化４Ｈ５ｓｃＦｖをともなう親和性最適化変異体２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２のアミノ酸配列アライメントを示す。

６．５．１．４．３結合分析
２Ａ４、２Ｅ７、および１２Ｅ２のほか、親ＥＡ２およびヒト化４Ｈ５ｓｃＦｖは、１Ｌ培養液容量中のイー・コリ内で発現を誘発した。可溶性の分泌ｓｃＦｖ断片を含む上清を遠心して細胞残屑を除去した後、抗ＦＬＡＧカラム（Ｓｉｇｍａ社製）を通過させ、変異体タンパク質を精製および分離した。ＢＩＡｃｏｒｅ３０００測定器（スウェーデン、アップサラ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ社製）を用いる表面プラズモン共鳴により、精製済み親和性最適化変異体を分析した。ＥＡ２のヒト化親和性最適化変異体は、親抗ＥｐｈＡ２ｓｃＦｖＥＡ２と比べ、１１０〜１５０倍の親和性改善を示した。親和性測定結果については、後出６．６節中の表を参照のこと。

６．５．２マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体Ｂ２３３の親和性最適化
全体が参照により本明細書に組み込まれているDall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60が詳細に述べるフレームワークシャフリング法を用いて、親ｍＡｂＢ２３３分子のヒト化を達成した。基本を述べると、Ｂ２３３ＶＬおよびＢ２３３ＶＨの両領域のＣＤＲ領域を、ヒトフレームワーク生殖細胞系列配列のライブラリー上にコンビナトリアル手法で移植し、ＥｐｈＡ２結合性を保持するモザイク状のヒト化変異体を作製した。このようなヒト化クローンの１つである２Ｇ６は、キメラｍＡｂＢ２３３と比べ、親和性が約１０倍低下した。このクローンを親和性成熟のテンプレートとして選択した後、後述の手順で最適化した結果、変異体３Ｆ２を得た。

６．５．２．１コンビナトリアル変異体の構築および特性解析
ヒトＥｐｈＡ２への結合がさらに改善したコンビナトリアル変異体を設計するため、親Ｂ２３３と比べると、結合の改善したすべての単回アミノ酸変異を組み合わせて、小型で集約的なコンビナトリアルライブラリーを作製した。略述すると、同定されたすべてのアミノ酸変異のほか、同じ位置に親アミノ酸もコードする縮重プライマー（図３８参照）を設計した。基本的に全体が参照により本明細書に組み込まれているDall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60、およびWu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212が述べる手順で、すべてのプライマーを包含するアニーリング反応の後、合成を実施した。こうしてコンビナトリアルライブラリーを構築した後、スクリーニングした。

６．５．２．１．１ライブラリーのスクリーニング
６．５．２．１．１．１一次スクリーニング
一次スクリーニングは、シングルポイントＥＬＩＳＡ法（ＳＰＥ）からなり、基本的にDall’Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60、およびWu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212が述べる手順で、９６ウェル深底プレート中に１ｍｌ細菌培養液を培養し個々の組換えＭ１３クローンを感染させ、ここから調製するペリプラズムＦａｂ抽出物を用いて実施した。略述すると、このキャプチャーＥＬＩＳＡ法では、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅの各ウェルを約２０ｎｇのヤギ抗ヒトＦａｂ抗体でコートし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより３７℃で２時間ブロックし、試料（ペリプラズム抽出Ｆａｂ）により室温で２時間インキュベートした。次いで、３００ｎｇ／ウェルのビオチニル化ヒトＥｐｈＡ２−Ｆｃを添加し、室温で約２時間放置した。これに続き、ニュートラビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体（イリノイ州、Ｐｉｅｒｃｅ社製）により、室温で４０分間インキュベートした。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質でＨＲＰ活性を検出し、０．２ＭＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍでプレートを測定した。

６．５．２．１．１．２一次スクリーニングの結果
典型的には、ＯＤ４５０ｎｍシグナルを親２Ｇ６よりも２倍以上強く示すクローンを１５ｍｌ規模で再成長させ、デュプリケートウェル中の同じＥＬＩＳＡ法により再アッセイし、肯定的な結果を確認した。次いで、複製されるクローンを配列決定し、活性ＥＬＩＳＡ法（下記参照）により分析し、ヒトＥｐｈＡ２への結合の増大倍数を推定した。

６．５．２．１．１．３二次スクリーニング
すでに同定したコンビナトリアル親和性最適化変異体（前出参照）の特徴をさらに明らかにするため、１５ｍｌ細菌培養液から調製したペリプラズム抽出物中で発現したＦａｂ断片を用いる二次スクリーニング（Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212）を実施した。より正確には、以下の２種類のＥＬＩＳＡ法を用いた：（ｉ）活性ＥＬＩＳＡ法では、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅの各ウェルを約１μｇのヒトＥｐｈＡ２−Ｆｃでコートし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより３７℃で２時間ブロックした。次いで、２倍に段階希釈した試料を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、ヤギ抗ヒトカッパ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体とともにインキュベートした。ＴＭＢ基質でＨＲＰ活性を検出し、０．２ＭＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍでプレートを測定した。（ｉｉ）抗ヒトＦａｂ定量化ＥＬＩＳＡ法は、基本的に（Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212）が述べる手順で実施した。略述すると、９６ウェルＢｉｏｃｏａｔプレート（カリフォルニア州、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の各ウェルを、２倍段階希釈試料または標準液（ヒトＩｇＧＦａｂ、１００〜１．５６ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。次いで、ヤギ抗ヒトカッパ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体とともにインキュベートした。ＴＭＢ基質でＨＲＰ活性を検出し、０．２ＭＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。４５０ｎｍでプレートを測定した。

６．５．２．１．１．４二次スクリーニングの結果
前節の二部構成のＥＬＩＳＡ法による二次スクリーニングは、Ｆａｂ２Ｇ６および親和性最適化コンビナトリアル変異体を、ヒトＥｐｈＡ２への結合の点から相互に比較することを可能とした。これら親和性最適化コンビナトリアル変異体Ｆａｂの１つを、より広範な分析用に選択した（以下、３Ｆ２と称する変異体）。マウスＢ２３３、ヒト化２Ｇ６、および親和性最適化３Ｆ２の各ｍＡｂの可変領域のアミノ酸配列を、図３９に整列させた。

６．５．２．２ヒトＩｇＧ１フォーマットにおけるｍＡｂＢ２３３の各種ヒト化親和性最適化変種のクローン化、発現、および精製
ヒト化フレームワークシャフルクローン２Ｇ６および親和性最適化変異体３Ｆ２の可変領域を、対応するＶ領域をコードするＭ１３ファージベクターから、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法により増幅した。次いで、これらを、ヒトサイトメガロウイルス主要即時初期（ｈＣＭＶｉｅ）エンハンサー、プロモーター、および５’非翻訳領域をコードする哺乳類発現ベクター中で、個別にクローン化させた（全体が参照により本明細書に組み込まれているBoshart et al., 1985, Cell 41:521-530）。この系は、ヒトκ鎖とともにヒトγ１鎖を分泌した（全体が参照により本明細書に組み込まれているJohnson et al., 1997, Infect. Dis. 176:1215-1224）。異なる構築物をＨＥＫ２９３細胞中で一過性発現させ、トランスフェクションの７２および１４４時間後に回収した。製造元の取扱説明書に従い、１ｍｌＨｉＴｒａｐプロテインＡまたはプロテインＧカラム（ニュージャージー州、ピスケイタウェイ、ＡＰＢｉｏｔｅｃｈ社製）に直接接触させた条件培地から、分泌可溶性ヒトＩｇＧ１を精製した。精製済みヒトＩｇＧ１（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる判定では、＞９５％の同質性が通例）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により透析、瞬時凍結し、−７０℃で保管した。

６．５．２．２．１Ｂｉａｃｏｒｅ分析
基本的にW.F. Dall’Acqua et al., 2005, Methods 36 (2005)43-60が述べる手順で、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００測定器（スウェーデン、アップサラ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ社製）を用いる表面プラズモン共鳴検出法により、可溶性Ｂ２３３、２Ｇ６、および３Ｆ２の各ＩｇＧと固定化ＥｐｈＡ２−Ｆｃとの相互作用をモニターした。後出の６．６．２節をも参照のこと。以下の表にキメラＢ２３３、ヒト化２Ｇ６、および親和性最適化３Ｆ２の親和性測定値を示した。

６．６ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの親和性測定
以下に、表面プラズモン共鳴により測定した、本発明によるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの親和定数を記す。

６．６．１抗ヒトＣＤ３
固定化可溶性ＣＤ３εγ表面を用いる表面プラズモン共鳴による測定値を示す。ＢｉＴＥ分子のＣＤ３εγへの二相性会合が、結合率および親和定数の正確な計算を妨げる。
脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）４００〜５００ｎＭ（推定値）

６．６．２抗ヒトＥｐｈＡ２
以下に、固定化ＥｐｈＡ２−Ｆｃ表面を用いる表面プラズモン共鳴による測定値を示す：
脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）（ＭＴ）４５ｎＭ
脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）（ＭｅｄＩ）１１３ｎＭ

６．６．３ｓｃＦＶの親和性測定値（Ｋ_Ｄ）
以下の表は、抗ヒトＥｐｈＡ２ｓｃＦｖの結合動態の概要を示す。表面プラズモン共鳴結合により、単量体抗ヒトＥｐｈＡ２ｓｃＦｖのＥｐｈＡ２への会合度を測定した。親和性最適化は、４Ｈ５と比べ、ヒトＥｐｈＡ２への親和性（Ｋ_Ｄ）が２０〜３０倍上昇する３種類のｓｃＦｖを生産した。

６．７ヒト化抗ヒトＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの特性解析
６．７．１フローサイトメトリーによるヒト化抗ＥｐｈＡ２親抗体のヒトおよびカニクイザルＥｐｈＡ２に対する結合分析
ＳＷ４８０結腸癌またはカニクイザルＥｐｈＡ２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の準コンフルエント単層を、トリプシン化し、洗浄し、カウントし、９６ウェル丸底プレートに接種し、１０μｇ／ｍｌの陰性対照抗体（Ｒ３４７）、抗ヒトＥｐｈＡ２マウス抗体ＥＡ２（Coffman 2003）、またはヒト化抗体３Ｆ２および４Ｈ５により染色した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧＨ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に細胞を再懸濁させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いるフローサイトメトリーにより分析した。図４０に示すように、ＥＡ２、３Ｆ２、および４Ｈ５各々が、ヒトおよびカニクイザルＥｐｈＡ２に結合した。

６．７．２ヒト化抗ＥｐｈＡ２親抗体のエピトープ排除特性
ＭＣＦ−１０ＡまたはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞単層を、カバーガラススリップ上、３７℃で２４時間以上培養した後、染色した。４％パラホルムアルデヒドで細胞単層を固定（２５℃で２分間）した後の、一次抗体（クローンＧ５［陰性対照］、ＥＡ５、ＥＡ２、３Ｆ２、または４Ｈ５）による３０分間のインキュベーションに続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）で染色した。細胞を固定し、免疫蛍光顕微鏡検査により分析した。図４１に示すように、３Ｆ２および４Ｈ５は、非形質転換および形質転換いずれの***表皮細胞にも結合した。こうして、３Ｆ２および４Ｈ５は、悪性細胞上で接触可能なＥｐｈＡ２エピトープに対するＥＡ２固有の結合能を共有しなかったが、非形質転換上皮細胞の正常構造により選択的に除外された。Ｇ５抗体のＶＬおよびＶＨドメインのアミノ酸配列を、図４２に示す。

６．７．３組織交差反応性分析
ヒト化抗ＥｐｈＡ２抗体のヒト心臓組織への組織交差反応性評価は、３Ｆ２および４Ｈ５が、最高１０μｇ／ｍｌの濃度における正常ヒト心臓組織に結合しないことを明らかにした。

コンビナトリアル変異体ｓｃＦｖの２Ａ４、１２Ｅ２、および２Ｅ７についても、組織交差反応性を評価した。コンビナトリアル変異体ｓｃＦｖ（２Ａ４、１２Ｅ２、および２Ｅ７）のいずれもが、最高５０μｇ／ｍｌの濃度におけるヒト心臓組織（ドナー２例）を染色しなかった（データは示さない）。

６．７．４３Ｆ２抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の特性解析
３Ｆ２に基づき生産したＢｉＴＥ構築物を以下の表に示し、さらに細胞傷害アッセイにより特性を明らかにした。

クロム５１放出に基づく細胞傷害アッセイを実施して、刺激済みヒトＣＤ８＋Ｔ細胞存在下の各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物による対象変更した標的細胞溶解を解明した。ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１にクロム５１を添加し、標的細胞として用いた。各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を、広範な濃度範囲にわたり滴定した。アッセイの実施時間は１８時間であり、エフェクター対標的比率は、１０：１であった。異なる生産バッチによる最大溶解の５０％に必要なＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ濃度（すなわちＥＣ_５０）を、４パラメータ非線形近似モデルを用いて推定した。図４３を参照のこと。

ＣＤ３＋Ｔ細胞富化ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞としておよびＥｐｈＡ２＋ＳＷ４８０結腸癌細胞を用い、前出で記した手順により、フローサイトメトリーに基づく対象変更細胞傷害アッセイを実施した。図４４を参照のこと。

４種類の単鎖３Ｆ２に基づく抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物（上表）のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害測定（図４３および４４）は、３Ｆ２ＢｉＴＥの効力（すなわちＥＣ_５０）が、マウスＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを上回らないことを示唆した。以上の結果は、ヒト化抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが、ヒトＴ細胞の対象を変更して、ＥｐｈＡ２＋腫瘍細胞を溶解させることを確定した。

６．７．５４Ｈ５抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の特性解析
４Ｈ５に基づき生産した抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を以下の表に示し、さらに特性を明らかにした。

６．７．５．１４Ｈ５に基づく抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥｐｈＡ２＋およびＣＤ３＋発現細胞に対する標的細胞結合特異性
前述のフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、４Ｈ５に基づく各種ＢｉＴＥ構築物の標的結合特異性を検証した。ＥｐｈＡ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＣＤ３＋ＨＰＢａｌｌヒトＴ細胞を、標的細胞として用いた。脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）ＢｉＴＥを、陽性対照として用いた。図４５に示す通り、４Ｈ５に基づく各ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物は、ＥｐｈＡ２およびＣＤ３をともに発現する細胞に結合した。

６．７．５．２ヒト化親和性成熟４Ｈ５に基づくＢｉＴＥ構築物１２Ｅ２、２Ｅ７、および２Ａ４の標的細胞結合特異性
前述のフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、４Ｈ５に基づく各種ＢｉＴＥ構築物の標的結合特異性を検証した。ＥｐｈＡ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＣＤ３＋ＨＰＢａｌｌヒトＴ細胞を、標的細胞として用いた。図４６に示す通り、４Ｈ５に基づく各ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物は、ＥｐｈＡ２およびＣＤ３をともに発現する細胞に結合した。

前述のフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いたところ、図４７に示すように、親和性成熟４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の精製済み単量体は、ＥｐｈＡ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＣＤ３＋ＨＰＢａｌｌヒトＴ細胞の標的細胞に５μｇ／ｍｌの濃度で結合した。

親和性成熟４Ｈ５に基づくｓｃＦｖの結合能を明らかにするため、ＭＣＦ−１０ＡまたはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞単層を、カバーガラススリップ上、３７℃で２４時間以上培養した後、染色した。４％パラホルムアルデヒドで細胞単層を固定（２５℃で２分間）した後の、一次抗体（２Ａ４、２Ｅ７、または１２Ｅ２）による３０分間のインキュベーションに続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）で染色した。細胞を固定し、免疫蛍光顕微鏡検査により分析した。２Ａ４および１２Ｅ２ｓｃＦｖは、非形質転換および形質転換いずれの***表皮細胞にも結合した。一方、２Ｅ７ｓｃＦｖは、悪性細胞上で接触可能なＥｐｈＡ２エピトープに対するＥＡ２固有の結合能を共有し、非形質転換上皮細胞の正常構造により、選択的に除外されなかった（データは示さない）。

６．７．５．３ヒト化４Ｈ５モノクローナル抗体に対する４種類のＥｐｈＡ２特異ＢｉＴＥの細胞傷害効力比較
クロム５１放出に基づく細胞傷害アッセイを実施して、刺激済みヒトＣＤ８＋Ｔ細胞存在下の各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物による対象変更した標的細胞溶解を解明した。図４８を参照のこと。ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１にクロム５１を添加し、標的細胞として用いた。各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を、広範な濃度範囲にわたり滴定した。アッセイの実施時間は１８時間であり、エフェクター対標的比率は、１０：１であった。異なる生産バッチによる最大溶解の５０％に必要なＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ濃度（すなわちＥＣ５０）を、４パラメータ非線形近似モデルを用いて推定した。

図４９は、３Ｆ２および４Ｈ５に基づく各種ＥｐｈＡ２構築物の標的細胞溶解効力を直接に比較する。前述の手順でクロム５１に基づく細胞傷害アッセイを実施した。

６．７．５．４親和性成熟４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの１２Ｅ４、２Ｅ４、および２Ａ４が誘発する細胞傷害活性
図５０および５１は、４Ｈ５に基づく各種ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物（１２Ｅ４、２Ｅ４、および２Ａ４）の標的細胞溶解効力を示す。ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞系Ａ５４９およびＳＷ４８０にクロム５１を添加し、標的細胞として用いた。刺激済みＣＤ８＋Ｔ細胞（図４０）および非刺激ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（図５１）をエフェクター細胞として用いた。各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を、広範な濃度範囲にわたり滴定した。アッセイの実施時間は１８時間（図５０）または４２時間（図５１）であり、エフェクター対標的比率は、１０：１（図５０）または５：１（図４１）であった。異なる生産バッチによる最大溶解の５０％に必要なＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ濃度（すなわちＥＣ５０）を、４パラメータ非線形近似モデルを用いて推定した。

６．７．５．５４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥによるＥｐｈＡ２の非活性化
図５２は、２Ａ４または２Ｅ７のいずれのＢｉＴＥ構築物も、ＥｐｈＡ２発現細胞におけるＥｐｈＡ２リン酸化を誘発しなかったことを示す。ＥｐｈＡ２＋ＳＷ４８０およびＡ５４９細胞を、２Ａ４−ＢｉＴＥまたは２Ｅ７−ＢｉＴＥ、ＥＡ５ＩｇＧ（陽性対照）、あるいはＲ３４７（陰性対照）により、表示濃度で１５分間処理した。次いで、抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体Ｄ７（バージニア州、シャーロットビル、Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を用いて細胞抽出物を免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を用いて精査した。既報（全体が参照により本明細書に組み込まれているCoffman K. et al., 2003, Cancer Res. 63:7907-12）に詳述した手順で試料抽出、免疫沈降、およびウェスタンブロット分析を実施した。すべての試験について、標準的なクーマシーアッセイ（イリノイ州、ロックフォード、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いてタンパク質濃度を測定し、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離（１０％）し、ＰＶＤＦ膜（カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に転写した。

６．７．６親和性成熟４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物のｉｎｖｉｖｏにおける有効性
２Ａ４−ＢｉＴＥおよび２Ｅ７−ＢｉＴＥ各構築物のｉｎｖｉｖｏにおける効力を、ヒト結腸癌異種移植モデルによる免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（前出の６．４節および後出の６．８．７節に記述）において評価した。ＳＷ４８０細胞はＥｐｈＡ２を発現するので、ヒト結腸癌細胞系ＳＷ４８０をヒト異種移植モデル確立のために選択した。

６．７．６．１試験デザイン
５×１０^６個のＳＷ４８０細胞を、同じドナーからの２．５×１０^６個のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞と混合し、最終容量０．２ｍｌＰＢＳ中のＥ：Ｔ比率が１：２となるようにした。Ｔ細胞エフェクター／ＳＷ４８０細胞混合液を、各ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右脇腹に皮下注射した。皮下成長するＳＷ４８０腫瘍を、直交する２方向の寸法において測径器により週３回測定し、以下の表式により腫瘍体積を計算した：腫瘍体積＝［（幅^２×長さ）／２］。ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＳＷ４８０腫瘍細胞皮下接種の１時間後から５日連続で、マウスに１、５、２０および１００μｇ／回の濃度の２Ａ４−ＢｉＴＥまたは２Ｅ７−ＢｉＴＥ、ＰＢＳ対照ビヒクル、あるいは陽性対照としての１００μｇ／回脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）を静脈内投与した。試験結果を図５３に示す。

６．８本実施例で実施したアッセイの詳細
６．８．１細胞系および培養液
ＣＨＯｄｈｆｒ⁻、ＳＷ４８０、ＭＣＦ−７、ＰＣ３、Ｍ１４、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＡＣＨＮ細胞はＡＴＣＣから入手し、同推奨に従い培養した。ＨｅｙＡ８は、アンダーソン癌センターのＡｎｉｌＳｏｏｄ（Ｍ．Ｄ．）博士から恵与された。

６．８．２免疫組織化学法および免疫蛍光顕微鏡検査
ヒトＥｐｈＡ２反応性モノクローナル抗体ＥＡ２により凍結ヒト組織切片を染色し、該抗体が正常組織に特異的に結合するかどうかを判定した。略述すると、一次および二次抗体の複合体を生産し、非結合二次結合部位をヒトガンマグロブリンでブロックした。凍結切片を１０％ホルマリン中でスライドに接着させ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１倍濃度トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ですすいだ。グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）、β−Ｄ（＋）−グルコース（Ｓｉｇｍａ社製）、およびアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製）を含む溶液により、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。アビジン／ビオチンベクターキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ社製）により、アビジン／ビオチン反応部位をブロックした。次いで、スライドを、ウシ血清アルブミン、カゼイン、および正常ヤギ血清を含むタンパク質ブロッキング溶液とともにインキュベートした。プレ複合化抗体で組織切片をインキュベートした後、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣＥｌｉｔｅキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ社製）で染色し、１倍濃度ＴＢＳですすぎ、ＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ社製）で処理し、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。組織切片は、乾燥させ、カバースリップをかけ、画像化した。

６．８．３表面プラズモン共鳴バイオセンサー分析
カルボキシメチル（ＣＭ）デキストランマトリックスおよびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー（スウェーデン、アップサラ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ社製）を含むＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（スウェーデン、アップサラ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ社製）を用いて、すべての試験を実施した。アミンカップリング化学反応を用いて、ＣＤ３εγをＣＭデキストランマトリックスに共有結合させた。ＣＤ３εγカップリング工程を省略することで、参照表面を作製した。ＥｐｈＡ２−ＦｃのＦｃ部分とヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（メリーランド州、ゲーサーズバーグ、ＫＰＬ社製）との間の高親和性相互反応を介して、ＥｐｈＡ２−Ｆｃを捕獲した。アミンカップリング化学反応を用いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＣＭデキストランマトリックスに共有結合させた。２種類の抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）特異的表面を作製した。これら表面の１つを参照表面として用いる一方、いま１つの表面を用いてＥｐｈＡ２−Ｆｃ特異的表面を作製した。ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、０．１５ＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中での段階希釈により、異なる濃度のｂｓｃＥｐｈＡ２×ＣＤ３を調製した。ＣＤ３εγ特異的またはＥｐｈＡ２特異的の各表面およびこれに対応する参照表面に沿った連続流動方式により、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを注入した。ＨＢＳ−ＥＰの存在下で、結合ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの解離をモニターした。１０ｍＭ四ホウ酸二ナトリウム（ｐＨ８．５）、１ＭＮａＣｌ（ＣＤ３εγ特異的表面用）または１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７、ＥｐｈＡ２−Ｆｃ特異的表面用）により、残存する結合物を除去した。

６．８．４細胞表面抗原密度
Ｑｉｆｉｋｉｔ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を用いて、細胞上のＥｐｈＡ２表面結合部位数を推定した。略述すると、細胞の準コンフルエント単層を、すばやくトリプシン化し、洗浄し、カウントし、９６ウェル丸底プレートに接種し、抗ヒトＥｐｈＡ２抗体Ｂ２３３（Coffman 2003）の２倍段階希釈液１００μｌで染色した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗マウスＩｇＧＨ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に細胞およびマウスＩｇＧを抱合した較正用ビーズを再懸濁させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いるフローサイトメトリーにより分析した。ビーズ検量線からの非線形回帰分析により、表面結合部位数を推定した。

７．等価物
当業者なら、常套的な実験を用いるだけで、本明細書で述べた本発明の特殊実施形態の多数の等価物を認知し、または確認することができるであろう。添付の特許請求の範囲は、こうした等価物を包含することを意図する。

各個の刊行物、特許または特許出願を、参照により、具体的かつ個別に本明細書に組み入れるよう指示した場合と同程度に、本明細書で言及したすべての刊行物、特許、および特許出願を、本明細書への参照により、本明細書に組み入れる。

抗ＥｐｈＡ２抗体ＥＡ２のＶＬおよびＶＨドメイン配列を示す図である。ＶＬドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を（Ａ）に示す。ＶＨドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号９および１０）を（Ｂ）に示す。ＣＤＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を太字で示し、下線を付した。ＥＡ２抗体については、すでに米国特許出願公開第２００５−０１５２８９９Ａ１号が述べており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。抗ＥｐｈＡ２抗体ＥＡ５のＶＬおよびＶＨドメイン配列を示す図である。ＶＬドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１７および１８）を（Ａ）に示す。ＶＨドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２５および２６）を（Ｂ）に示す。ＣＤＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を太字で示し、下線を付した。ＥＡ５抗体については、すでに米国特許出願公開第２００５−０１５２８９９Ａ１号が述べており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥｃＤＮＡの構造を示す図である（図３Ａ〜Ｂ）。発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ内でクローン化させる各挿入物には、翻訳効率の上昇および分泌シグナル配列（マウスＩｇ重鎖リーダー配列）のために、５’末端をコザック部位とするリーダー配列を含めた。該リーダー配列には、上記で一覧した４種類のＩｇ可変ドメインが後続する。抗ＥｐｈＡ２のＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ接合部のリンカーペプチドは、１５アミノ酸長（モチーフＧ４Ｓの３回反復）を有する。ＥｐｈＡ２結合特異性をＣＤ３結合特異性と結合するリンカーペプチドは、モチーフＧ４Ｓの１回反復を含む。第４ドメインに直接隣接するのは、Ｃ末端ヘキサヒスチジン（Ｈ６）配列で、検出および精製用である。表示の制限酵素部位を用いて、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を発現ベクター内でクローン化させた。ＣＨＯ細胞内でＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを発現させるために用いるｐＥＦ−ＤＨＦＲベクターの構造図である（図４Ａ〜Ｂ）。ｐＥＦ−ＤＨＦＲベクターは、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼを選択マーカーとして含む５．８ｋｂのベクターで、ヒトＥＦ１αプロモーターの制御下で発現させる該遺伝子とともにバイシストロニックの転写単位を形成する。該真核細胞用発現ベクターは、発現ベクターｐＭＴ２ＰＣの派生物である。ゲルろ過カラムからのタンパク質画分を含む、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）からの溶出プロファイルを示す図である（図５Ａ〜Ｂ）。ピーク１：会合体、ピーク２：二量体、ピーク３：単量体。精製済みＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓタグウェスタンブロットを示す図である（図６Ａ〜Ｂ）。単量体画分（レーン７）が、基本的に純ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥを含有した。会合体中にはＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが検出できなかった。カニクイザル反応性抗ＣＤ３親抗体のフローサイトメトリー結合分析を示す図である（図７Ａ〜Ｂ）。カニクイザル由来のＰＢＭＣを用い、いずれもＦＩＴＣと抱合させた該親抗体であるｃＣＤ３−１およびｃＣＤ３−２に対するＣＤ３の結合を検出した。細胞は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ハイデルベルク、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上のフローサイトメトリーにより分析した。本図で示す通り、いずれの抗体も、カニクイザルＰＢＭＣのＴ細胞画分に対する著明な結合を示す。ＥＡ２およびＥＡ５とアカゲザルＥｐｈＡ２との交差反応性の証拠を示す図である。ウェスタンブロットで示す通り、ＥＡ２およびＥＡ５抗体は、ＣＭＭＴ１１０／ＣＬ細胞におけるＥｐｈＡ２のリン酸化を活性化させた。マカク属ＣＤ３と反応する各種抗ＥｐｈＡ２代理ＢｉＴＥ構築物のフローサイトメトリー結合分析を示す図である。マカク属ＣＤ３抗体ｃＣＤ３−１に基づく代理ＢｉＴＥ構築物のみが、ＣＤ３およびＥｐｈＡ２に対して強力な結合を示した。ｃＣＤ３−２に基づく構築物は、強力なＣＤ３結合を示すのみであり、ＥｐｈＡ２結合は、ほぼ完全に抑制されることがわかった。こうして、ｃＣＤ３−１に基づく代理ＢｉＴＥ構築物が、カニクイザルＴ細胞による細胞傷害活性の生産、精製、および分析に進むことになる。抗ＥｐｈＡ２親抗体のフローサイトメトリー結合分析を示す図である。ＥｐｈＡ２発現Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞系）（Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌）（Ｂ）を用いた。細胞（２００，０００個）を、氷上で３０分間、１０μｇ／ｍｌの各抗体とともにインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。一次抗体の結合を、２％ＦＣＳを添加した５０μｌＰＢＳで１：１００に希釈したフィコエリスリン抱合マウスＦｃガンマ特異抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社製、注文番号１１５−１１６−０７１）により検出した。陰性対照として、同じアイソタイプによる非関与抗体を用いた（細線）。細胞は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ハイデルベルク、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上のフローサイトメトリーにより分析した。本図に示す通り、ｍＡｂＢ３２２が、最も強力な結合シグナルを示し、ＥＡ２およびＥＡ５がこれに続いた。３種類の抗体の結合能を、ヒストグラムオーバーレイに示す（左から４つ目のピーク＝Ｂ３２２抗体、左から３つ目のピーク＝ＥＡ２抗体、および左から２つ目のピーク＝ＥＡ５抗体、左端のピーク：対照）。正常細胞に対するＥＡ２およびＥＡ５の結合に関する免疫組織化学分析を示す図である。（Ａ）一次抗体なし。ＥＡ５は、心臓組織（Ｂ）、複数器官の血管および間質の平滑筋要素（細胞質）、結腸上皮（細胞質）、および子宮筋層内の介在板を染色させた。アイソタイプ対照モノクローナル抗体１Ａ７と異なり、ＥＡ２はヒト組織切片（Ｃ）を染色させなかった。フローサイトメトリーが解明する通り、異なる細胞系上におけるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの二重特異性結合を示す図である。ＥｐｈＡ２陽性Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞系）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌細胞系）のほか、ＣＤ３陽性ＨＰ−ＢＡＬＬ（ヒトＴ細胞系）を用いた。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（***）、および（Ｂ）Ａ５４９（肺）細胞における５種類のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥによる対象変更溶解の効力を示す図である。ＢｉＴＥ構築物の脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）が、乳癌および肺癌細胞系の対象変更溶解において、最も強力な効力を一貫して示した。脱免疫化抗ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）×ＥＡ２（ＶＨ−ＶＬ）ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの配列を示す図である（図１４Ａ〜Ｃ）。（Ａ）には、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第一の結合ドメインおよびＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する第２の結合ドメインを含むＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を図示する。合わせて、５’〜３’方向（左〜右）に、それぞれ、ＶＨ_ＣＤ３−ＶＬ_ＣＤ３、ＶＬ_ＣＤ３−ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}、およびＶＨ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＬ_{ＥｐｈＡ２}ドメイン間のリンカー配列をも示す。各リンカーのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号２７および２８、２９および３０、ならびに３１および３２で表される。（Ｂ）には、脱免疫化抗ＣＤ３（ＶＨ−ＶＬ）×ＥＡ２（ＶＨ−ＶＬ）ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの全長ヌクレオチド配列（配列番号６０）および同アミノ酸配列（配列番号６５）を示す。太字は、それぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩの酵素制限部位を表す。大文字イタリック体はリーダー配列、二重下線文字は停止コドンを表す。リンカーおよびヒスチジンタグ配列に下線を付した。ＰＢＭＣ（ＣＤ１６陽性細胞の枯渇後）および刺激済みＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として、２種類のＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）バッチの細胞傷害活性を比較した結果を示す図である。ＥｐｈＡ２陽性細胞系Ａ５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、標的細胞として用いた。Ｅ：Ｔ比率は１０：１、インキュベーション時間は１８時間であった。（Ａ）ＰＢＭＣを伴うＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの媒介するＡ５４９細胞溶解、（Ｂ）刺激済みＣＤ８＋Ｔ細胞を伴うＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの媒介するＡ５４９細胞溶解、（Ｃ）ＰＢＭＣを伴うＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの媒介するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞溶解、（Ｄ）刺激済みＣＤ８＋Ｔ細胞の媒介するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞溶解をそれぞれ示す図である。エフェクター細胞ドナーによるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ細胞傷害活性の変化を示す図である（図１６Ａ〜Ｂ）。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、異なる被験者からのＴ細胞の対象を変更し、ＥｐｈＡ２＋腫瘍細胞殺滅を媒介した。細胞傷害アッセイでは、４９例のヒトドナーから単離したＳＷ４８０標的細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞を用いた。大半のヒトドナーについて、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、きわめて低濃度で腫瘍細胞殺滅を媒介した。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥＣ５０は、全被験Ｔ細胞ドナーについて１〜１１０ｎｇ／ｍｌであり、中央値（水平バー）は２４ｎｇ／ｍｌであった。こうして、大半のヒトＴ細胞ドナーについて、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、低ｎｇ／ｍｌ濃度の範囲で殺滅活性の観察される、きわめて強力な分子である。標的細胞結合の特異性：可溶性ＥｐｈＡ２融合タンパク質が、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）に対する結合で競合することを示す図である（図１７Ａ〜Ｄ）。競合アッセイにおいて、ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の標的結合特異性を調べた。本図に示す通り、ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）を重量が１０倍上回る可溶ＥｐｈＡ２Ｆｃ融合タンパク質と共インキュベートすると、ＢｉＴＥのＡ５４９ヒト肺癌細胞への結合を完全に遮断した。これは、ＥｐｈＡ２標的の認識が、ＢｉＴＥの腫瘍細胞への結合を特異的に媒介することを示す。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の標的細胞特異性：抗原陽性細胞の殺滅を示す図である。脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２ＢｉＴＥの細胞傷害活性は、トランスフェクションしたＢ１６Ｆ１０標的細胞上でのＥｐｈＡ２発現に厳密に依存する。ＥｐｈＡ２陰性Ｂ１６Ｆ１０細胞は、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２が媒介する溶解に対して、完全に耐性である。ｉｎｖｉｔｒｏにおける脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の細胞傷害活性の特異性を示す図である。（Ａ）標的細胞溶解の特異性を示す図である。ＣＤ３＋Ｔ細胞富化ＰＢＭＣを、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）（四角）またはｂｓｃＣＤ１９×ＣＤ３（三角）の段階希釈液存在下において、３７℃で４２時間、ＥｐｈＡ２陽性ＳＷ４８０（黒印）またはＥｐｈＡ２陰性ＳＫ−ＭＥＬ−２８（白印）細胞とともにインキュベートした。（ＢおよびＣ）ＣＤ３およびＥｐｈＡ２に対する親抗体（ＤｉＬ２ＫおよびＥＡ２）が、ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞のｂｓｃＥｐｈＡ２×ＣＤ３溶解を阻害することを示す図である。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の段階希釈液のみ（白四角）、または１０μｇ（三角）もしくは１００μｇ（丸）の、パネルＢではＤｉＬ２ＫもしくはパネルＣではＥＡ２存在下において、３７℃で４２時間、ＳＷ４８０細胞を含む２００μｌの培養培地中とともにインキュベートした。結果は、溶解した標的細胞の百分率として示す。誤差バーは、デュプリケートによる測定の標準偏差（ＳＤ）を示す。注：溶解度は、各脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）曲線につき、１００％に接近している。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが媒介する腎細胞癌および前立腺癌細胞殺滅を示す図である。細胞傷害アッセイは、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが媒介するＡＣＨＮ（Ａ）、Ｃａｋｉ（Ｂ）、ＰＣ３（Ｃ）、およびＤＵ１４５（Ｄ）細胞に対する腫瘍細胞殺滅のＥＣ_５０値が、それぞれ、３、３０、６、および０．８ｎｇ／ｍｌであることを示した。ＣＤ１９に特異的な陰性対照ＢｉＴＥは、Ｔ細胞の対象を変更して標的細胞を溶解することがなかった。標的細胞上におけるＥｐｈＡ２量に対するＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ殺滅の効果を示す図である。（Ａ）細胞傷害アッセイは、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが媒介するＳＷ４８０細胞に対する腫瘍細胞殺滅のＥＣ_５０値が、６ｎｇ／ｍｌであることを示した。ＣＤ１９に特異的な陰性対照ＢｉＴＥは、Ｔ細胞の対象を変更して標的細胞を溶解することがなかった。（Ｂ）ｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞傷害アッセイの終了後、残りの生存ＳＷ４８０標的細胞を、ＥｐｈＡ２またはＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの存在について測定した。アイソタイプ対照、ＥｐｈＡ２発現（Ｂ２３３染色）またはＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ（ＢｉＴＥ）で染色した生存ＳＷ４８０細胞の幾何平均蛍光強度を、ＢｉＴＥ投入量との対比でプロットした。ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、Ｔ細胞の対象を変更して、まずＥｐｈＡ２発現量の大きな標的細胞を殺滅した。興味深いことに、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥが細胞に結合しても、すべての標的細胞が溶解するわけではなかった。こうして、ＥｐｈＡ２＋細胞のサブセットが耐性でありうるものの、ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥは、大半のＥｐｈＡ２＋標的細胞に対するＴ細胞殺滅を媒介する。脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）のｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞傷害性の特性解析を示す図である（図２２Ａ〜Ｄ）。（Ａ）対象変更溶解の動態を示す図である。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の段階希釈液の存在下において、ＳＷ４８０細胞とともに、３７℃で４（四角）、１８（三角）、２４（逆三角）、または４２（ダイアモンド）時間インキュベートした。誤差バーは、ＳＤを示す。ＥＣ５０値は、曲線から推定したものを列挙する。（Ｂ）エフェクター対標的比率の、対象変更溶解に対する影響を示す図である。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の段階希釈液の存在下において、ＳＷ４８０細胞と２０：１（黒四角）、１０：１（黒三角）、５：１（白逆三角）、１：１：（白ダイアモンド）、１：２：（グレー丸）、または１：５（グレー四角）の比率により、３７℃で４２時間インキュベートした。誤差バーは、ＳＤを示す。ＥＣ５０値は、曲線から推定したものを列挙する。（Ｃ）結合可能なＥｐｈＡ２受容体結合部位の、対象変更溶解の効力に対する影響を示す図である。各腫瘍細胞系（ＨｅｙＡ８、ＳＷ４８０、Ａ５４９ヒト癌細胞系ならびにＭ１４およびＡ３７５黒色腫細胞系）について、細胞あたりの推定ＥｐｈＡ２分子数を、４つの個別試験からの溶解標的細胞百分率による各ＥＣ５０値と対比してプロットした。Ｐ値および線形回帰曲線のｒ２をグラフ上に示す。（Ｄ）ＥｐｈＡ２表面密度の、対象変更溶解に対する影響を示す図である。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の段階希釈液の存在下において、細胞系ＨｅｙＡ８（黒四角、細胞あたり１０７，０００個のＥｐｈＡ２受容体）、Ｍ１４（グレー丸、細胞あたり２，４００個のＥｐｈＡ２受容体）、およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（白四角、検出限界未満のＥｐｈＡ２受容体）とともに、３７℃で４２時間インキュベートした。誤差バーは、ＳＤを示す。ＥＣ５０値は、曲線から推定したものを挙げる。ヒト血漿中におけるＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の安定性を示す図である。ＥｐｈＡ２特異ＢｉＴＥの血漿安定性を、異なるインキュベーション条件下で調べた後、標準的な５１クロム放出アッセイにおいて、細胞傷害活性のＥＤ５０を測定した。脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）による非形質転換細胞上における標的エピトープ排除を示す図である。ビデオ顕微鏡検査を用いて、ＢｉＴＥ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）および非エピトープ排除対照ＢｉＴＥの存在下における、非形質転換ＭＣＦ１０Ａ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の攻撃を可視化した。（Ａ）非形質転換ＭＣＦ１０Ａ細胞の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞および１００ｎｇ／ｍｌ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）との共インキュベート（１：１のＥ：Ｔ比率）を示す図である。（Ｂ）非形質転換ＭＣＦ１０Ａ細胞の、ＢｉＴＥなしのＣＤ８^＋Ｔ細胞との共インキュベート（１：１のＥ：Ｔ比率）を示す図である。（Ｃ）非形質転換ＭＣＦ１０Ａ細胞の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞および１００ｎｇ／ｍｌ汎腫瘍非エピトープ排除対照ＢｉＴＥとの共インキュベート（１：１のＥ：Ｔ比率）を示す図である。（Ｄ）肺癌細胞系Ａ５４９の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞および１００ｎｇ／ｍｌ脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）との共インキュベート（１：１のＥ：Ｔ比率）を示す図である。（Ｅ）（Ｄ）と同じ設定である。ヨウ化プロピジウム存在下における透過光顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真のオーバーレイにより、溶解した細胞（明るいグレー）を示す図である。表面プラズモン共鳴による、脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の標的親和性の測定を示す図である。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００システムを用いる表面プラズモン共鳴により、ＢｉＴＥ／ＥｐｈＡ２複合体の形成および解離をモニターした。Ｋ_Ｄは、４５ｎＭでの推定値である。ＳＷ４８０モデルにおける脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）のｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性のための、陰性対照試験群を示す図である。５×１０^６個のＳＷ４８０細胞のみ（「ＳＷ４８０のみ」および「脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）」）または２．５×１０^６個のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（「ＰＢＳ」、「非関与ＢｉＴＥ」、および「追加の静脈内Ｔ細胞、ＰＢＳ」）との混合物を、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。マウスの一群には、２．５×１０^６個のＣＤ３＋Ｔ細胞を静脈内注射した（「追加の静脈内Ｔ細胞、ＰＢＳ」）。マウスには、５日間にわたり毎日、ＢｉＴＥ（「脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２のみ」）、ＰＢＳ（「ＰＢＳ」、「追加の静脈内Ｔ細胞、ＰＢＳ」）、または非関与ＢｉＴＥを投与した。６匹／群の平均腫瘍体積を示す。５日間にわたる脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の連日投与が、ＣＤ３＋エフェクターＴ細胞存在下において、ＳＷ４８０腫瘍成長の用量依存的な阻害を誘発したことを示す図である。スチューデントのＴ検定により、＊＊高度に有意（ｐ≦０．０１）、＊有意（ｐ≦０．０５）。脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）の抗腫瘍効果に対する、末梢Ｔ細胞の無作用を示す図である。６匹／群の平均腫瘍体積を示す。＊＊高度に有意（ｐ≦０．０１）。抗ＥｐｈＡ２抗体２３３のＶＬおよびＶＨドメインのアミノ酸配列を示す図である。（Ａ）には、ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。（Ｂ）には、ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。ＣＤＲ配列は線で囲った。２３３抗体については、すでに米国特許出願公開第２００４−００２８６８５Ａ１が述べており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。抗ＥｐｈＡ２抗体３Ｆ２のＶＬおよびＶＨドメインのアミノ酸配列を示す図である。（Ａ）には、ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。（Ｂ）には、ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４５）を示す。ＣＤＲ配列は線で囲った。３Ｆ２抗体については、すでに２００５年８月１５日付の米国特許出願第１１／２０３，２５１Ａ１号が述べており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＭＤ１０２発現ベクターにおける４Ｈ５ｓｃＦｖ挿入部位の線状マップを示す図である。４Ｈ５ＶＬ−ＶＨｓｃＦｖヒト化クローンの配列を示す図である。（Ａ）には、ヌクレオチド配列（配列番号６７）を示す。（Ｂ）には、アミノ酸配列（配列番号６８）を示す。ＣＤＲ配列は線で囲う。４Ｈ５抗体については、すでに米国特許出願第２００５−００４８６１７Ａ１号が述べており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＶＨＶＬ２Ａ４ｓｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。（Ａ）には、ヌクレオチド配列（配列番号７５）を示す。（Ｂ）には、アミノ酸配列（配列番号７６）を示す。ＣＤＲ配列は線で囲う。ＶＨＶＬ２Ｅ７ｓｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。（Ａ）は、ヌクレオチド配列（配列番号８３）を示す。（Ｂ）は、アミノ酸配列（配列番号８４）を示す。ＶＨＶＬ１２Ｅ２ｓｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。（Ａ）は、ヌクレオチド配列（配列番号９１）を示す。（Ｂ）は、アミノ酸配列（配列番号９２）を示す。固定化ヒトＥｐｈＡ２上における、コンビナトリアル親和性最適化変異体ｓｃＦｖ上清のＥＬＩＳＡ滴定を示す図である。ヒト化４Ｈ５ｓｃＦｖを含む、親和性最適化変異体２Ａ２、２Ｅ７、および１２Ｅ２のアミノ酸配列アライメントを示す図である。Ｆａｂ２Ｇ６の親和性最適化で用いるコンビナトリアルプライマー（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ６、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、およびＨ１３）の配列（それぞれ、配列番号９９〜１１１）を示す図である。マウスＢ２３３、ヒト化２Ｇ６、および親和性最適化３Ｆ２の各ｍＡｂの可変領域アミノ酸配列アライメントを示す図である。抗ヒトＥｐｈＡ２抗体がカニクイザルＥｐｈＡ２に結合することを示す図である。精製済みマウスならびにヒト化の各抗ヒト抗体（それぞれ、ＥＡ２ならびに３Ｆ２および４Ｈ５）が、ＳＷ４８０結腸癌細胞上のヒトＥｐｈＡ２およびトランスフェクトしたＣＨＯ細胞上で発現したカニクイザルＥｐｈＡ２に結合した。結合した抗体は、抗マウスまたはヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８抗体を用いるフローサイトメトリーにより検出した。抗体を、非結合陰性対照抗体（Ｒ３４７）と比較した。ＥＡ２、３Ｆ２、および４Ｈ５が、ヒトおよびカニクイザルＥｐｈＡ２に結合した。ＥｐｈＡ２抗体サブセットによる選択的腫瘍細胞認識を示す図である。非形質転換および悪性の各哺乳類上皮細胞（それぞれ、ＭＣＦ−１０ＡおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）単層を、表示した抗体（Ｇ５、ＥＡ５、ＥＡ２、３Ｆ２、または４Ｈ５）により固定および標識した後、免疫蛍光顕微鏡検査を用いて可視化した。ＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞間接触部位から排除された抗体または排除されなかった抗体（それぞれ、「排除」または「非排除」）を示す。こうして、ＥＡ５およびＥＡ２エピトープは、非形質転換上皮細胞を典型的に示す正常構造により選択的に排除されるが、悪性形質転換後に結合可能となる。Ｇ５のＶＬおよびＶＨドメインのアミノ酸配列を示す図である。（Ａ）には、ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４９）を示す。（Ｂ）には、ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５３）を示す。Ｇ５抗体については、すでに２００５年６月２４日付の米国特許出願第１１／１６５，０２３号が述べており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ヒト化３Ｆ２モノクローナル抗体の２種類の生産工程から作製した、４種類のＥｐｈＡ２特異ＢｉＴＥの細胞傷害効力の比較を示す図である。ｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞傷害アッセイで、４種類の３Ｆ２に基づく抗ＥｐｈＡ２ＢｉＴＥ構築物による、ＥｐｈＡ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する、対象変更したＴ細胞溶解の媒介能を比較した。表は、２つの個別生産工程から精製した各構築物の効力（すなわち、ＥＣ５０）値を示す。ＢｉＴＥ構築物である脱免疫化抗ＣＤ３×３Ｆ２（ＶＨ／ＶＬ）が、一貫して最大の効力を示した。３Ｆ２に基づく４種類のＥｐｈＡ２特異的ＢｉＴＥについて、別個の細胞傷害効力の比較を示す図である。ｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞傷害アッセイで、３Ｆ２に基づく４種類の抗ＥｐｈＡ２ＢｉＴＥ構築物による、ＥｐｈＡ２＋ＳＷ４８０細胞に対する、対象変更したＴ細胞溶解の媒介能を比較した。ＢｉＴＥ構築物である脱免疫化抗ＣＤ３×３Ｆ２（ＶＨ／ＶＬ）が、一貫して最大の効力を示した。４Ｈ５に基づく抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥのＥｐｈＡ２＋およびＣＤ３＋発現細胞に対する標的細胞結合特異性を示す図である。前述のフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、４Ｈ５に基づく各種ＢｉＴＥ構築物の標的結合特異性を検証した。ＥｐｈＡ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＣＤ３＋ＨＰＢａｌｌヒトＴ細胞を、標的細胞として用いた。脱免疫化抗ＣＤ３×ＥＡ２（ＶＨ／ＶＬ）ＢｉＴＥを、陽性対照として用いた。本図に示す通り、４Ｈ５に基づく各ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物は、ＥｐｈＡ２およびＣＤ３をともに発現する細胞に結合した。ヒト化親和性成熟４Ｈ５に基づくＢｉＴＥ構築物１２Ｅ２、２Ｅ７、および２Ａ４の標的細胞結合特異性を示す図である。前述のフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、４Ｈ５に基づく各種ＢｉＴＥ構築物の標的結合特異性を検証した。ＥｐｈＡ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＣＤ３＋ＨＰＢａｌｌヒトＴ細胞を、標的細胞として用いた。本図に示す通り、４Ｈ５に基づく各ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物は、ＥｐｈＡ２およびＣＤ３をともに発現する細胞に結合した。精製済み単量体の標的細胞結合特異性を示す図である。前述のフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いたところ、本図に示すように、親和性成熟４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物の精製済み単量体は、ＥｐｈＡ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＣＤ３＋ＨＰＢａｌｌヒトＴ細胞の標的細胞に５μｇ／ｍｌの濃度で結合した。ヒト化４Ｈ５モノクローナル抗体に対する４種類のＥｐｈＡ２特異ＢｉＴＥの細胞傷害効力比較を示す図である。クロム５１放出に基づく細胞傷害アッセイを実施して、刺激済みヒトＣＤ８＋Ｔ細胞存在下の各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物による、対象変更した標的細胞溶解を解明した。ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１にクロム５１を添加し、標的細胞として用いた。各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を、広範な濃度範囲にわたり滴定した。アッセイの実施時間は１８時間であり、エフェクター対標的比率は、１０：１であった。異なる生産バッチによる最大溶解の５０％に必要なＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ濃度（すなわちＥＣ５０）を、４パラメータ非線形近似モデルを用いて推定した。クロム５１に基づく細胞傷害アッセイにより測定した通り、３Ｆ２および４Ｈ５に基づく各種ＥｐｈＡ２構築物（それぞれ、ＡおよびＢ）の標的細胞溶解効力を直接に比較する図である。親和性成熟４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥの１２Ｅ４、２Ｅ７、および２Ａ４が誘発する細胞傷害活性を示す図である。本図は、４Ｈ５に基づく各種ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物（１２Ｅ４、２Ｅ７、および２Ａ４）の標的細胞溶解効力を示す。ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞系Ａ５４９由来の細胞にクロム５１を添加し、標的細胞として用いた。刺激済みＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を、広範な濃度範囲にわたり滴定した。アッセイの実施時間は１８時間であり、エフェクター対標的比率は、１０：１であった。異なる生産バッチによる最大溶解の５０％に必要なＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ濃度（すなわちＥＣ５０）を、４パラメータ非線形近似モデルを用いて推定した。親和性成熟４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥである１２Ｅ４、２Ｅ７、および２Ａ４が誘発する細胞傷害活性を示す図である。本図は、４Ｈ５に基づく各種ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物（１２Ｅ４、２Ｅ７、および２Ａ４）の標的細胞溶解効力を示す。ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞系Ａ５４９およびＳＷ４８０由来の細胞にクロム５１を添加し、標的細胞として用いた。刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。各種抗ＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物を、広範な濃度範囲にわたり滴定した。アッセイの実施時間は１８時間であり、エフェクター対標的比率は、１０：１であった。異なる生産バッチによる最大溶解の５０％に必要なＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ濃度（すなわちＥＣ５０）を、４パラメータ非線形近似モデルを用いて推定した。ＥｐｈＡ２リン酸化が測定する通り、４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥによるＥｐｈＡ２の活性化が存在しないことを示す図である。本図は、２Ａ４または２Ｅ７の各ＢｉＴＥ構築物とともに、ＥｐｈＡ２発現細胞におけるＥｐｈＡ２リン酸化を誘発しなかったことを示す。親和性成熟４Ｈ５に基づくＥｐｈＡ２−ＢｉＴＥ構築物のｉｎｖｉｖｏにおける有効性を示す図である。２Ａ４−ＢｉＴＥおよび２Ｅ７−ＢｉＴＥ各構築物のｉｎｖｉｖｏにおける効力を、ヒト結腸癌異種移植モデルによる免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて評価した。ＳＷ４８０細胞はＥｐｈＡ２を発現するので、ヒト結腸癌細胞系ＳＷ４８０をヒト異種移植モデル確立のために選択した。試験結果を本図に示す。

Claims

（ａ）ＣＤ３に免疫特異的に結合する抗体にそれぞれ由来する第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）および第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）であって、前記第１のＶＨドメインおよび前記第１のＶＬドメインがフォールディングしてＣＤ３に結合する第１の結合ドメインを形成するような十分な長さの第１のリンカーにより、前記第１のＶＨドメインが前記第１のＶＬドメインに共有結合している第１のＶＨドメインおよび第１のＶＬドメインと、
（ｂ）細胞表面に露出したＥｐｈＡ２のエピトープと免疫特異的に結合する抗体に由来する第２のＶＨドメインおよび第２のＶＬドメインであって、前記第２のＶＨドメインおよび前記第２のＶＬドメインがフォールディングしてＥｐｈＡ２の前記エピトープと結合する第２の結合ドメインを形成するような十分な長さの第２のリンカーにより、前記第２のＶＨドメインが前記第２のＶＬドメインに共有結合している第２のＶＨドメインおよび第２のＶＬドメインと
を含む二重特異性単鎖抗体であって、
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが相互に独立してフォールディングするような長さの第３のリンカーにより、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが共有結合している二重特異性単鎖抗体。
ＣＤ３に免疫特異的に結合する前記第１の結合ドメインが、ＣＤ３のイプシロン（ε）サブユニットに結合する、請求項１に記載の二重特異性単鎖抗体。
ＣＤ３のεサブユニットに特異的な前記第１の結合ドメインが、前記第２の結合ドメインのＮ末端に位置する、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
ＣＤ３のεサブユニットに特異的な前記第１の結合ドメインが、前記第２の結合ドメインのＣ末端に位置する、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、ＶＨ_ＣＤ３−ＶＬ_ＣＤ３−ＶＨ_{ＥｐｈＡ２}−ＶＬ_{ＥｐｈＡ２}の順に配置されている、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
ＣＤ３のεサブユニットに免疫特異的に結合する前記第１の結合ドメインが脱免疫化されている、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
前記第２の結合ドメインの前記ＶＨおよび／またはＶＬドメインが、ＥＡ２、ＥＡ３、ＥＡ４、ＥＡ５、３Ｆ２、４Ｈ５、２Ａ４、２Ｅ７、１２Ｅ２、Ｅｐｈ０９９Ｂ−１０２．１４７、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２０８．２６１、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２１０．２４８、Ｅｐｈ０９９Ｂ−２３３．１５２、Ｅｐｈ１０１．５３０．２４１、２３３、またはＧ５のＶＨおよび／またはＶＬドメインである、請求項２に記載の二重特異性抗体。
前記第１、第２、および第３のリンカーの配列の長さが、少なくとも５残基、少なくとも１０残基、少なくとも１５残基、少なくとも２０残基、少なくとも２５残基、または少なくとも３０残基を含む、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
ＣＤ３のεサブユニットに結合する前記第１の結合ドメインの前記第１の重鎖可変ドメインと前記第１の軽鎖可変ドメインとの間の前記第１のリンカーが配列番号５７の配列を含む、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
ＥｐｈＡ２に結合する前記第２の結合ドメインの前記第２の重鎖可変ドメインと前記第２の軽鎖可変ドメインとの間の前記第２のリンカーが配列番号５９の配列を含む、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの間の前記第３のリンカーが配列番号５８の配列を含む、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
前記第１の結合ドメインの前記ＶＨおよび／またはＶＬドメインが、ヒト化された抗ＣＤ３抗体由来である、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
前記第２の結合ドメインの前記ＶＨおよび／またはＶＬドメインが、ヒト化された抗ＥｐｈＡ２抗体由来である、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
前記第２の結合ドメインがＥｐｈＡ２と結合するよりも低い親和性で、前記第１の結合ドメインがＣＤ３のεサブユニットと結合する、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
ＣＤ３のεサブユニットに結合する前記第１の結合ドメインの解離定数が４×１０^−７Ｍである、請求項１４に記載の二重特異性単鎖抗体。
ＥｐｈＡ２に結合する前記第２の結合ドメインの解離定数が１．１３×１０^−７Ｍである、請求項１４に記載の二重特異性単鎖抗体。
配列番号６５の配列を含む、請求項２に記載の二重特異性単鎖抗体。
請求項１から１７のいずれかに記載の二重特異性単鎖抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
癌の治療、予防、または管理を必要とする対象において、癌細胞がＥｐｈＡ２を発現している癌を治療、予防、または管理する方法であって、前記対象に、請求項１から１７のいずれかに記載の二重特異性単鎖抗体の治療有効量および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
前記二重特異性単鎖抗体が、細胞間接触部ではなく細胞上に発現している場合のＥｐｈＡ２と結合する、請求項１９に記載の方法。
前記癌が転移性癌である、請求項１９に記載の方法。
二重特異性単鎖抗体ではない追加の抗癌療法の投与を含む、請求項１９に記載の方法。
前記追加の癌療法が、化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、および外科手術からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
感染の治療、予防、または管理を必要とする対象において、感染を治療、予防、または管理する方法であって、前記対象に、請求項１から１７のいずれかに記載の二重特異性単鎖抗体の治療有効量および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
前記感染が細胞内病原体感染である、請求項２４に記載の方法。
前記感染が呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染である、請求項２４に記載の方法。
追加の療法の投与を含む、請求項２４に記載の方法。
前記追加の療法が、抗ウイルス療法、抗真菌療法、抗細菌療法、または抗原虫療法である、請求項２７に記載の方法。
非癌性過剰増殖性細胞障害を治療、予防、または管理する方法であって、前記対象に、請求項１から１７のいずれかに記載の二重特異性単鎖抗体の治療有効量および薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
前記非癌性過剰増殖性細胞障害が、喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症、石綿沈着症、ＩＰＦ、ＤＩＰ、ＵＩＰ、腎線維症、肝線維症、他の線維症、気管支反応性亢進、乾癬、脂漏性皮膚炎、嚢胞性線維症、または再狭窄、過剰増殖性血管疾患、ベーチェット症候群、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、もしくは過剰増殖性線維芽細胞障害などの過剰増殖性内皮細胞障害である、請求項２９に記載の方法。
追加の療法の投与を含む、請求項２９に記載の方法。
前記追加の療法が、抗ウイルス療法または免疫調節剤である、請求項３１に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項１９、２４、または２９に記載の方法。