KR20200106885A

KR20200106885A - Pd-l1에 대항하는 단일-도메인 항체 및 이의 변이체들

Info

Publication number: KR20200106885A
Application number: KR1020207016959A
Authority: KR
Inventors: 야펭 장; 슈 위; 슈아이 양; 츄안-츄 쵸우
Original assignee: 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디.
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2020-09-15
Also published as: SG11202004144VA; EP3710480A1; CA3081375A1; US11673954B2; IL274438A; US20210221891A1; EP3710480A4; CN111433224B; JP7410024B2; TW201923083A; WO2019096121A1; AU2018366650A1; CN111433224A; JP2021503455A

Abstract

본 출원은 PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체 (sdAb) 모이어티를 포함하는 구조체들을 제공한다. 또한 이들 구조체를 만들고, 이용하는 방법도 제공된다.

Description

PD-L1에 대항하는 단일-도메인 항체 및 이의 변이체들

발명의 분야

본 발명은 PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체 (sdAb) 모이어티를 포함하는 구조체들, 그리고 이를 만드는 방법 및 이용하는 방법들에 관한 것이다.

발명의 배경

예정된 세포 사멸 수용체 1 (PD-1)라고도 불리는 활성화된 T 및 B 세포 상에 주로 발현하는 면역 억제성 수용체는 CD28 및 세포독성 T-림프구 연합된 단백질-4 (CTLA-4)와 관련된 면역글로블린 수퍼패밀리의 구성원이다. PD-1 및 유사 패밀리 구성원은 그의 리간드에 결합하는 세포 외 Ig 가변-유형 (V-유형) 도메인 및 신호전달 분자에 결합하는 세포질 꼬리를 함유하는 유형 I 막경유 당단백질이다. PD-1의 세포질 꼬리는 2개의 티로신-기반의 신호전달 모티프, ITIM (면역수용체 티로신-기반의 억제 모티프) 및 ITSM (면역수용체 티로신-기반의 전환 모티프)를 함유한다.

PD-1은 예정된 사멸 리간드 1 (PD-L1)로도 불리는 예정된 세포 사멸 리간드 1 및/또는 예정된 사멸 리간드 2 (PD-L2)로도 불리는 예정된 사멸 리간드 2에 결합할 때, T-세포 반응을 감쇠시킨다. 이들 리간드중 어느 것이던 간에 PD-1에 결합함으로써 항원 수용체 신호전달은 음성적으로 조절된다. PD-1에 PD-L1의 결합 차단은 종양-특이적 CD8+ T-세포 면역성을 강화시키고, 당해 면역계에 의한 종양-세포의 소거를 지원한다.

그 결과, 치료요법적 PD-1 및 PD-1과의 상호작용을 통하여 신호를 발생시키는 다른 분자들을 표적화하는 것, 이를 테면, 예정된 사멸 리간드 1 (PD-L1) 및 예정된 사멸 리간드 2 (PD-L2)가 강력한 관심분야다. PD-L1 신호 전달의 억제는 암 (가령, 종양 면역) 및 급성 및 만성 (가령, 지속적인) 감염 둘 다를 포함하는 감염의 치료를 위한 T 세포 면역성을 향상시키는 수단으로서 제안되어 왔다. 그러나, 이 경로에서 표적을 향한 최적의 치료제가 아직 상용화되지 않았기 때문에, 충족되지 않은 의학적 요구가 상당히 존재한다. 항-PD-L1 항체 요법은 다수의 암, 이를 테면, 흑색종에서 가능성을 보여주었다.

단일-쇄 항체 (sdAbs)는 단일 단량체성 항체 가변 도메인을 갖기 때문에 통상적인 4-쇄 항체와 상이하다. 예를 들면, 낙타와 상어는 단일-도메인 항체 명명된 오로지-중쇄 항체 (HCAbs)를 만들고, 즉, 자연적으로 경쇄는 결여된다. 카멜리드(camelid) HCAb의 각 암(arm)에서 항원-결합 단편은 단일 중쇄 가변 도메인 (V_HH)을 갖고, 이는 경쇄의 도움없이, 항원에 대한 높은 친화력을 나타낼 수 있다. 카멜리드 V_HH는 분자량이 약 15 kD인 가장 작은 기능성 항원 결합 단편으로 알려져 있다.

본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고문헌에 편입된다.

본 발명은 PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체 (sdAb) 모이어티를 포함하는 구조체들, 그리고 이를 만드는 방법 및 이용하는 방법들에 대한 것이다.

본 출원의 한 측면은 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체를 제공하는데, 이때 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3을 포함한다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 다음중 임의의 하나를 포함한다:

(1) 서열 번호: 51의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(2) 서열 번호: 52의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 152의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 252의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(3) 서열 번호: 53의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 153의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 253의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(4) 서열 번호: 54의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 154의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 254의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(5) 서열 번호: 55의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 155의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 255의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(6) 서열 번호: 56의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 156의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 256의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(7) 서열 번호: 57의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 157의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 257의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(8) 서열 번호: 58의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 158의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 258의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(9) 서열 번호: 59의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 159의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 259의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(10) 서열 번호: 60의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 160의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 260의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(11) 서열 번호: 61의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 161의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 261의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(12) 서열 번호: 62의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 162의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 262의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(13) 서열 번호: 63의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 163의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 263의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(14) 서열 번호: 64의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 164의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 264의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(15) 서열 번호: 65의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 165의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 265의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(16) 서열 번호: 66의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 166의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 266의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(17) 서열 번호: 67의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 167의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 267의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(18) 서열 번호: 68의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 168의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 268의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(19) 서열 번호: 69의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 169의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 269의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(20) 서열 번호: 70의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 170의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 270의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(21) 서열 번호: 71의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 171의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 271의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(22) 서열 번호: 72의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 172의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 272의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(23) 서열 번호: 73의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 173의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 273의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(24) 서열 번호: 74의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 174의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 274의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(25) 서열 번호: 75의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 175의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 275의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(26) 서열 번호: 76의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 176의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 276의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(27) 서열 번호: 77의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 177의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 277의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(28) 서열 번호: 78의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 178의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 278의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(29) 서열 번호: 79의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 179의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 279의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(30) 서열 번호: 80의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 180의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 280의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(31) 서열 번호: 81의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 181의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 281의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(32) 서열 번호: 82의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 182의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 282의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(33) 서열 번호: 83의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 183의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 283의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(34) 서열 번호: 84의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 184의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 284의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(35) 서열 번호: 85의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 185의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 285의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(36) 서열 번호: 86의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 186의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 286의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(37) 서열 번호: 87의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 187의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 287의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(38) 서열 번호: 88의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 188의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 288의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(39) 서열 번호: 89의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 189의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 289의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(40) 서열 번호: 90의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 190의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 290의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(41) 서열 번호: 91의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 191의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 291의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(42) 서열 번호: 92의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 192의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 292의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(43) 서열 번호: 93의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 193의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 293의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(44) 서열 번호: 94의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 194의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 294의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(45) 서열 번호: 95의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 195의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 295의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(46) 서열 번호: 96의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 196의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 296의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(47) 서열 번호: 97의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 197의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 297의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(48) 서열 번호: 98의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 198의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 298의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(49) 서열 번호: 99의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 199의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 299의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

(50) 서열 번호: 100의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 200의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 300의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3;

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 다음의 아미노산 잔기들중 하나 또는 그 이상을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 V_HH 도메인을 포함한다: a-1) F, Y, L, I, 및 V, 바람직하게는 F, V 또는 Y로 구성된 군에서 선택된 위치 37의 아미노산 잔기; a-2) A, G, E, D, G, Q, R, S, 및 L, 바람직하게는 G, E, 또는 Q로 구성된 군에서 선택된 위치 44의 아미노산 잔기; a-3) L, R 및 C, 바람직하게는 이를 테면, L 또는 R로 구성된 군에서 선택된 위치 45의 아미노산 잔기; a-4) G, W, R 및 S, 바람직하게는 W 또는 R로 구성된 군에서 선택된, 더욱 바람직하게는 W인 위치 103의 아미노산 잔기; 그리고 a-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며, 이때 상기 위치들은 Kabat 번호매김에 따른다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 다음의 아미노산 잔기들중 하나 또는 그 이상을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 V_HH 도메인을 포함한다: b-1) F, Y, L, I, 및 V, 바람직하게는 F, V 또는 Y로 구성된 군에서 선택된 위치 37의 아미노산 잔기; b-2) G, E 및 Q로 구성된 군에서 선택된 위치 44의 아미노산 잔기; b-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 R 또는 L이며; b-4) G, W, R 및 S로 구성된 군에서 선택된, 바람직하게는 W인 위치 103의 아미노산 잔기, 그리고 b-5) Q 및 L로 구성된 군에서 선택된, 바람직하게는 Q인 위치 108의 아미노산 잔기, 이때 상기 위치들은 Kabat 번호매김에 따른다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산, 또는 서열 번호: 288-328중 임의의 하나에 대해 최소한 약 80% (이를 테면, 최소한 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%중 임의의) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인, 또는 V_HH 도메인에서 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인을 포함한다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티와 PD-L1 간에 결합 친화력 (K_D,해리 상수)은 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화, 또는 온전하게(fully) 인간화된다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 오로지-중쇄 항체 (HCAb)이다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 인간 IgG1 Fc에 융합된다. 일부 구체예들에서, HCAb는 단량체성 또는 이량체성이다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, HCAb는 서열 번호: 401-440중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 제 2 항원을 특이적으로 인지하는 제 2 항체 모이어티를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항체 모이어티는 전장의 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), sdAb, 또는 항체 모방체이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 단일특이성이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 다중특이성이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항체 모이어티는 sdAb이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항원은 PD-L1이다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 PD-L1을 특이적으로 인지하는 3개 또는 그 이상의 sdAbs이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항원은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 상기 제 2 항체 모이어티에 대해 아미노 (N)-말단 및/또는 카르복실(C)-말단에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티 및 상기 제 2 항체 모이어티는 임의선택적으로 펩티드 링커 (이를 테면, 서열 번호: 443, 444, 또는 445)에 의해 연결된다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나에 따른 일부 구체예에서, 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 제 2 항원을 특이적으로 인지하는 제 2 항체 모이어티를 더 포함하며, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 전장(full- length)의 항체이다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 아미노(N) 말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 카르복시(C)-말단에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 카르복시(C) 말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 아미노 (N)-말단에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 전장 항체는 특이적으로 TIGIT를 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 전장 항체는 특이적으로 TIM-3을 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 전장 항체는 특이적으로 LAG-3을 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티 및 상기 제 2 항체 모이어티는 임의선택적으로 펩티드 링커 (서열 번호: 443-445)에 의해 연결된다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체중 임의의 하나와 경쟁적으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제 2 단리된 항-PD-L1 구조체가 추가로 제시된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 단리된 항-PD-L1 구조체는 서열 번호:51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3을 포함한다.

상기 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물, 및 약제학적 수용가능한 담체가 더 제공된다.

본 출원의 또다른 측면은 PD-L1-관련된 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 기술된 약제학적 조성물중 임의의 하나의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1 관련된 질환은 암이다. 일부 구체예들에서, 암은 고형 종양, 이를 테면, 결장 암이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 추가의 암 요법, 예컨대 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 이들의 조합을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1 관련된 질환은 병원성 감염이다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 전신으로, 이를 테면, 정맥내로　(i.v.)투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 국소적으로, 이를 테면, 종양내로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 개체는 인간이다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체중 임의의 하나를 인코드하는 단리된 핵산이 추가로 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 핵산은 서열 번호: 351-400중 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 인코드한다.

상기에서 기술된 단리된 핵산중 임의의 하나를 포함하는 벡터가 더 제공된다.

상기에서 기술된 단리된 핵산 또는 벡터중 임의의 하나를 포함하는 단리된 숙주 세포가 더 제공된다.

상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들, 단리된 핵산, 벡터, 또는 단리된 숙주 세포중 임의의 하나를 포함하는 키트가 더 제공된다.

본 출원의 또다른 측면은 상기에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나를 생산하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 인코드된 항-PD-L1 구조체를 발현시키는데 효과적인 조건하에서 상기에서 기술된 단리된 핵산 또는 벡터중 임의의 하나를 포함하는 숙주 세포를 배양하거나, 또는 상기에서 기술된 단리된 숙주 세포를 배양하고; 그리고 전술한 숙주 세포로부터 발현된 항-PD-L1 구조체를 획득하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기에서 기술된 단리된 핵산 또는 벡터중 임의의 하나를 포함하는 숙주 세포를 만드는 것을 더 포함한다.

전술한 요약뿐만 아니라 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽는다면 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명하기 위해, 현재 바람직한 구체예들이 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 정확한 배열 및 기구들에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 도면에서:
도 1은 재조합체 PD-L1 ECD 단백질로 제 4 및 제 6차 면역화 후, 프레-면역 혈청 및 면역 혈청의 면역 반응 평가를 도시한다.
도 2는 재조합체 PD-L1 ECD 단백질로 제 6차 면역화 (말단 출혈) 후, 중쇄 항체 (IgG2 및 IgG3) 의 면역 반응 평가를 도시한다; 전-면역 혈청으로부터 분획화된 중쇄 항체는 음성 대조군으로 이용되었다.
도 3a-3n은 선택된 sdAbs의 친화력 결정을 나타낸다 (AS06617 (도 3a); AS06618 (도 3b); AS06628 (도 3b); AS06682 (도 3d); AS06686 (도 3e); AS06703 (도 3f); AS06730 (도 3g); AS06750 (도 3h); AS06775 (도 3i); AS06778 (도 3j); AS06791 (도 3k); AS11947 (도 3l); AS11948 (도 3m); 그리고 AS12003 (도 3n)): 상기 PD-L1는 칩 상에 고정되었고, 항-PD-L1 sdAb는 0.11, 0.33, 1, 3, 및 9 nM의 농도에서 피분석물(analyte)로서 흘려보냈다.
도 4a-4n은 선택된 sdAbs의 친화력 결정을 나타낸다 (AS06617 (도 4a); AS06618 (도 4b); AS06628 (도 4b); AS06682 (도 4d); AS06686 (도 4e); AS06703 (도 4f); AS06730 (도 4g); AS06750 (도 4h); AS06775 (도 4i); AS06778 (도 4j); AS06791 (도 4k); AS11947 (도 4l); AS11948 (도 4m); 그리고 AS12003 (도 4n)): 상기 PD-L1는 칩 상에 고정되었고, 항-PD-L1 HCAb는 0.11, 0.33, 1, 3, 및 9 nM의 농도에서 피분석물(analyte)로서 흘려보냈다.
도 5a 및 5b는 PD-L1 안정적으로 발현시키는 세포 계통을 이용한 선택된 항-PD-L1 HCAbs 기반 FACS의 상대적 결합 분석을 도시한다: Tecentriq®는 항-PD-L1 항체 양성 대조군으로 이용되었다.
도 6a 및 6b는 PD-L1 발현시키는 안정적인 세포 계통 및 바이오틴-라벨된 hPD-1/Fc 단백질을 이용하여 선택된 항-PD-L1 HCAbs의 FACS-기반의 리간드 경쟁 분석을 도시한다: Tecentriq®는 항-PD-L1 항체 양성 대조군으로 이용되었다.
도 7a-7o는 PD-L1-기반의 차단(blockade) 분석에 의해 정제된 sdAbs의 기능성 활성 평가를 도시한다:(AS06617 (도 7a); AS06618 (도 7b); AS06628 (도 7c); AS06682 (도 7d); AS06686 (도 7e); AS06703 (도 7f); AS06730 (도 7g); AS06750 (도 7h); AS06775 (도 7i); AS06778 (도 7j); AS06791 (도 7k); AS11947 (도 7l); AS11948 (도 7m); AS12003 (도 7n); 그리고 Tecentriq (도 7o)) Tecentriq®는 항-PD-L1 항체 양성 대조군으로 이용되었다.
도 8a-8o는 PD-L1-기반의 차단 분석에 의해 정제된 sdAbs의 기능성 활성 평가를 도시한다:(AS06617 (도 8a); AS06618 (도 8b); AS06628 (도 8c); AS06682 (도 8d); AS06686 (도 8e); AS06703 (도 8f); AS06730 (도 8g); AS06750 (도 8h); AS06775 (도 8i); AS06778 (도 8j); AS06791 (도 8k); AS11947 (도 8l); AS11948 (도 8m); AS12003 (도 8n); 그리고 Tecentriq (도 8o)) Tecentriq®는 항-PD-L1 항체 양성 대조군으로 삼았다.
도 9a-9e는 3개의 WT 항-PD-L1 sdAbs 및 인간화 이후 상위 1-9개 클론의 sdAb 서열 배열을 도시하고, 인간 수용체에 비교하여 프레임워크 영역에서 아미노산 차이 (WT sdAb와 최고 수준의 상동성을 공유의는 최적의 인간 생식계열 서열)는 진회색으로 음영처리된다:
도 9a는 AS06730 (서열 번호: 360), 인간화 이후의 상위 9개 클론 (서열 번호: 376-384)의 sdAb 서열 정렬 및 콘센수스 서열의 배열을 도시한다;
도 9b는 AS06750 (서열 번호: 361), 인간화 이후의 상위 5개 클론 (서열 번호: 385-389)의 sdAb 서열 정렬 및 콘센수스 서열의 배열을 도시한다; 그리고
도 9c는 AS11948 (서열 번호: 372), 인간화 이후의 상위 9개 클론 (서열 번호: 390-398)의 sdAb 서열 정렬 및 콘센수스 서열의 배열을 도시한다;
도 9d는 AS06617 (서열 번호: 351), 인간화 이후의 상위 1개 클론 (서열 번호: 399)의 sdAb 서열 정렬 및 콘센수스 서열의 배열을 도시한다;
도 9e는 AS06775 (서열 번호: 365), 인간화 이후의 상위 1개 클론 (서열 번호: 400)의 sdAb 서열 정렬 및 콘센수스 서열의 배열을 도시한다.
도 10a-10t는 부모계 HCAbs와 함께 선택된 인간화된 HCAbs의 친화력 측정을 도시한다:
도 10a-10c (AS06730 (도 10a); AS06730S (도 10b); AS06730SVH3a (도 10c)): 친화력 측정은 0.11, 0.33, 1, 3 및 9 nM의 농도에서 피분석물로서 칩 상에 고정된 PD-L1His 및 항-PD-L1 HCAb를 사용하여 수행되었다;
도 10d-10f (AS06730SVH12 (도 10d); AS06730SVH12M8 (도 10e); AS06730SVH12M9 (도 10f)): 친화력 측정은 항-인간 IgG 및 피분석물로써 0.33, 1, 3, 9 및 27 nM 농도의 PD-L1 His를 이용하여 칩 상에 포획된 HCAbs를 이용하여 수행되었다;
도 10g-10j (AS06750 (도 10g); AS06750VH2 (도 10h); AS06750VH11 (도 10i); AS06750VH4 (도 10j)), 친화력 측정은 0.11, 0.33, 1, 3 및 9 nM의 농도에서 피분석물로서 칩 상에 고정된 PD-L1 His 및 항-PD-L1 HCAb를 사용하여 수행되었다;
도 10k-10l (AS11948 (도 10k); AS11948S (도 10l)): 친화력 측정은 0.11, 0.33, 1, 3 및 9 nM의 농도에서 피분석물로서 칩 상에 고정된 PD-L1 His 및 항-PD-L1 HCAb를 사용하여 수행되었다;
도 10m-10o (AS11948SV12 (도 10m); AS11948SV12M8 (도 10n); AS11948V12M9 (도 10o)): 친화력 측정은 항-인간 IgG 및 피분석물로써 0.33, 1, 3, 9 및 27 nM 농도의 PD-L1 His를 이용하여 칩 상에 포획된 HCAbs를 이용하여 수행되었다;
도 10p-10q (AS06617 (도 10p); AS06617VH11 (도 10q)): 친화력 측정은 0.11, 0.33, 1, 3 및 9 nM의 농도에서 피분석물로서 칩 상에 고정된 PD-L1 His 및 항-PD-L1 HCAb를 사용하여 수행되었다;
도 10r-10t (AS06775 (도 10r); AS06775VH11 (도 10s); AS06775VH4 (도 10t)): 친화력 측정은 0.11, 0.33, 1, 3 및 9 nM의 농도에서 피분석물로서 칩 상에 고정된 PD-L1 His 및 항-PD-L1 His를 사용하여 수행되었다;
도 11a-11q (AS06730 (도 11a); AS06730S (도 11b); AS06730SVH3a (도 11c); AS06730SVH12 (도 11d); AS06750 (도 11e); AS06750VH2 (도 11f); AS06750VH11 (도 11g); AS06750VH4 (도 11h); AS11948 (도 11i); AS11948S (도 11j); AS11948SVH12 (도 11k); AS11948SVH12M8 (도 11l); AS06617 (도 11m); AS06617VH11 (도 11n); AS06775 (도 11o); AS06775VH11 (도 11p); AS06775VH4 (도 11q))는 PD-L1-기반의 차단 분석에 의해 부모계 HCAbs와 함께, 정제된 상위 인간화된 HCAbs의 기능성 활성 평가를 도시한다.
도 12는 6가지 인간화된 HCAbs (AS06730QVH1, AS06750VH11, AS11948SVH12, AS06617VH11, AS06617VH11, AS11948QVH1 및 AS06775VH11)의 생체내 효능 연구를 도시한다.

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발명의 상세한 설명

본 발명은 PD-L1-관련된 질환, 이를 테면, 암을 치료하기 위한 새로운 전략으로써, 단일-도메인 항체 (sdAb) PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체 (sdAb)(이후 “항-PD-L1 sdAb”로도 지칭됨) 및 이의 항체 변이체들을 제공하는데, 여기에는 상기 항-PD-L1 sdAb, 이를 테면, 오로지-중쇄 항체 (HCAb), 또는 전장의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 융합된 항-PD-L1 sdAb를 포함하는 더 큰 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

단일-쇄 항체 (sdAbs)는 단일 단량체성 항체 가변 도메인, 이를 테면, 중쇄 가변 도메인 (V_HH)을 보유함으로써 통상적인 4-쇄 항체와 상이하며, 이는 경쇄의 도움없이, 항원에 높은 친화도를 나타낼 수 있다. 카멜리드 V_HH는 분자량이 약 15 kD인 가장 작은 기능성 항원 결합 단편으로 알려져 있다.

따라서, 본 출원의 한 측면은 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티를 포함하는 단리된(isolated) 항-PD-L1 구조체를 제공한다. 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 예를 들면, 항-PD-L1 sdAb (가령, 자연 또는 인간화된), 본원에서 기술된 다중 항-PD-L1 sdAbs, 인간 IgG1 Fc에 융합된 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb를 포함하는 폴리펩티드 또는 전장의 항체에 융합된 항-PD-L1 sdAb, 이를 테면, 항-PD-1 항체, 또는 항-PD-L1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 HCAb일 수 있다. 상기 항-PD-L1 구조체는 단일특이성 또는 다중특이성, 단가(monovalent) 또는 다가(multivalent)일 수 있다.

조성물 (이를 테면, 약제학적 조성물), 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 구조체를 포함하는 키트 및 제작 물품, 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 상기 구조체를 제작하는 방법, 및 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 상기 구조체를 이용하여, PD-L1 관련된 질환 (이를 테면, 암)을 치료하는 방법들이 또한 제공된다.

I.정의

용어 "예정된 세포 사멸 1 리간드 1", "PD-L1", "B7 동족체(homolog) 1 (B7-H1)", "PD-L1 항원", "PDCD1 리간드 1" 및 "CD274" (가령, Chemnitz (2004) J Immunol 173:945-954 참고)는 호환되며, PD-L1　와 최소한 한개의 공통 에피토프를 갖는 인간　PD-L1의 변이체, 변이체, 아이소폼(isoforms), 종 동족체, 및 유사체를 포함한다(가령, Butte (2008)　Mol Immunol. 　45:3567-3572 참고). 따라서, 본 발명의 상기 항-PD-L1 구조체는 특정 경우들에서 인간이외의 종에서 유래된 PD-L1　과, 또는 인간　PD-L1　와 구조적으로 관련된 다른 단백질(가령, 인간　PD-L1　동족체들)과 특정 경우에 교차-반응할 수 있다. 다른 경우들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 전적으로 인간　PD-L1　에 특이적일 수 있고, 종 또는 다른 유형의　　교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다.

용어 “인간　PD-L1”이란 인간 서열　PD-L1, 이를 테면, Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7의 인간　PD-L1　의 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 인간　PD-L1　서열은 　Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7의 인간　PD-L1　와는 상이할 수 있는데, 예를 들면, 보존된 돌연변이 또는 비-보존된 영역에서의 돌연변이를 가지는 것이 상이하며, 　PD-L1　은 Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7의 인간　PD-L1　와 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다. 예를 들면, 인간　PD-L1　의 생물학적 기능은 본 명세서의 항-PD-L1 구조체에 특이적으로 결합되는 PD-L1의 세포외 도메인 안에 에피토프를 갖고, 또는 인간　PD-L1　의 생물학적 기능은 T 세포 활성의 조정이다.

용어 “에피토프”는　항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산이나 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑(groupings)으로 구성되며, 일반적으로 특이적인 3 차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특이적 전하 특성을 가지고 있다. 형태학적 및 비형태학적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 결합하나, 후자에 결합하지 않는 것이 상실된다는 점에서 구별된다.

본원에서 이용된 용어 “예정된 세포 사멸 1 (PD-1)”란 면역글로블린 수퍼패밀리에 속하고, T 세포와 프로-B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 수용체를 지칭하는 의도이다. 인간 B7-1 (CD80)의 아미노산 서열은 Genbank 수탁 번호 NP_005009에 공개된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “치료(treatment)”또는 “치료하는 (treating)"이란 임상 결과를 포함하여 유익하거나 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유익한 또는 바람직한 임상 결과는 다음중 하나 또는 그 이상을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 당해 질환으로 인한 하나 또는 그 이상의 증상의 완화, 당해 질환 정도의 감소, 당해 질환을 안정화 (가령, 당해 질환의 악화 방지 또는 지연), 당해 질환의 확산(가령, 전이) 방지 또는 지연, 당해 질환의 재발 방지 또는 지연, 당해 질환 진행을 지연 또는 늦춤, 당해 질환 상태의 개선, (부분적 또는 전적으로) 당해 질환의 차도를 제공, 당해 질환을 치료하는데 요구되는 하나 또는 그 이상의 약물의 투여량(dose)의 감소, 당해 질환 진행의 지연, 삶의 질 증가, 및/또는 생존 연장. “치료”에는 암의 병리학적 결과 감소가 또한 포괄된다. 본 발명의 방법은 치료의 이들 하나 또는 그 이상의 임의의 측면들을 고려한다.

본원에 이용된 용어 “효과량(effective amount)”이란 명시된 장애, 상태 또는 질환의 치료, 이를 테면, 하나 또는 그 이상의 증상을 개선, 완화, 경감 및 / 또는 지연시키는데 충분한 제제 또는 제제들의 조합된 양을 지칭한다. 암과 관련하여, 유효량이란 종양이 종양을 수축 및/또는 종양의 성장 속도를 감소시키기 위해 (예를 들어, 종양 성장을 억제하기 위해), 또는 다른 원치않는 세포 증식을 예방 또는 지연시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 구체예들에서, 효과량은 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구체예들에서, 효과량은 재발을 예방하거나 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 효과량은 하나 또는 그 이상의 투여로 투여될 수 있다. 당해 약물 또는 조성물의 효과량은 (i) 암 세포의 수를 감소시키고; (ii) 종양 크기를 줄이고; (iii) 주변 장기로의 암 세포 침윤이 어느 정도 억제, 지연, 늦추거나, 또는 바람직하게는 중단시키고; (iv) 종양 전이를 억제하고(즉, 어느 정도 지연, 바람직하게는 중단); (v) 종양 성장을 억제시키고; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 방지 또는 지연시키고; 및/또는 (vii) 암과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 없애줄 수 있다.

용어 “항체” 또는 “항체 모이어티”란 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 전장 항체 및 이의 항원-결합 단편들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나, 이에 국한되지 않은 다양한 항체 구조를 포괄하는 광범위한 의미로 이용된다.

기본 4-쇄 항체 단위는 2 개의 동일한 경쇄 (L)와 2 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 이종사량체(heterotetrameric)의 당단백질이다. IgM 항체는 5 개의 기본 이종사량체 단위와 J 쇄라고 불리는 추가 폴리펩티드로 구성되며, 10 개의 항원-결합 부위를 포함하고, IgA 항체는 J 쇄와 조합하여, 다가 결합체(assemblages)를 형성할 수 있는 2-5개의 기본 4-쇄 단위를 포함한다. IgGs의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 결합된 디술파이드(disulfide) 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 두 개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라 하나 또는 그 이상의 디술파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디술파이드 브릿지를 갖는다. 각 H 쇄는 N-말단, 가변 도메인 (V_H), 이어서 α 및 γ 쇄 각각에 대해 3 개의 불변 도메인 (C_H) 그리고μ 및 ε 아이소타입에 대해 4 개의 C_H 도메인을 갖는다. 각 L 쇄는 N-말단, 가변 도메인 (V_L) 그리고 이어서 이의 다른 단부에 불변 도메인을 갖는다. V_L은 V_H와 함께 정렬되고, C_L은 중쇄의 첫번째 불변 도메인 (C_H1)과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다. V_H와 V_L의 쌍형성(pairing)은 함께 하나의 항원-결합 부위를 형성한다. 항체의 상이한 클라스의 구조 및 성질은 가령, Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6을 참고한다. 임의의 척추동물 종으로부터의 L 쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 및 람다라고 불리는 2 개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다. 이들 중쇄 (C_H)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로블린은 상이한 클래스(classes) 또는 동형(isotypes)로 할당될 수 있다. 면역글로블린에는 5 가지 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는다. γ 및 α 클래스는 C_H 서열 및 기능에서 상대적으로 작은 차이에 근거하여 추가로 서브클래스로 분류되는데, 가령, 인간은 다음의 서브클래스를 발현시킨다: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.

용어 “오로지-중쇄 항체(heavy chain-only antibody)”또는 “HCAb”는 중쇄를 포함하나, 4-쇄 항체에서 항상 볼 수 있는 경쇄가 결여된 기능성 항체를 지칭한다. 카멜리드 동물 (이를 테면, 카멜, 라마, 또는 알파카)은 HCAbs를 만드는 것으로 알려져 있다.

용어 “단일-도메인 항체” 또는 “sdAb”는 3개의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 갖는 단일 항원-결합 폴리펩티드를 지칭한다. sdAb 단독은 대응하는 CDR-함유 폴리펩티드와 쌍형성 없이, 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우들에서, 단일-도메인 항체는 카멜리드 HCAbs로부터 공작되며, 이들의 중쇄 가변 도메인은 본원에서 “V_HHs”(중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인)로 지칭된다. 일부 V_HHs는 나노바디(nanobodies)로 또한 공지될 수 있다. 카멜리드 sdAb는 공지된 가장 작은 항원-결합 항체 단편중 하나다 (가령, Hamers-Casterman 외, Nature 363:446-8 (1993); Greenberg 외, Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh 외, Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)참고). 기본 V_HH는 N-말단에서 C-말단으로 다음의 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 이때 FR1 내지 FR4는 차례로 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, 이때 CDR1 내지 CDR3은 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭한다.

“단리된(isolated)”항체 (또는 구조체)는 이들의 생성 환경 (가령, 자연 또는 재조합체) 구성요소로부터 확인된, 분리된 및/또는 회수된 것이다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 이의 생산 환경으로부터 다른 모든 성분과 회합되지 않는다. 생산 환경, 이를 테면, 재조합 형질감염된 세포로부터 발생된 오염 성분들은 항체의 연구, 진단 또는 치료요법적 용도를 전형적으로 간섭하는 물질이며, 그리고 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성(proteinaceous) 용질을 함유할 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 다음에 의해 정제된다: (1) 예를 들면, Lowry 방법에 의해 측정할 때 항체 중량의 95%, 그리고 일부 구체예들에서, 중량의 99% 이상; (2) 스피닝 컵 서열분석장치(sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻는데 충분한 정도로 정제되거나; 또는 (3) Coomassie 블루 또는, 바람직하게는 실버 착색을 이용하여, 비-환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 상동성으로 정제될 것이다. 단리된 항체 (또는 구조체)는 항체 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에, 재조합 세포 내에서 원위치(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드, 항체, 또는 구조체는 최소한 하나의 정제 단계에 의해 준비된다.

항체의 “가변 영역” 또는 “가변 도메인”이란 당해 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 차례로 “V_H” 및 “V_L”로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 상기 항체의 대부분의 가변 부분 (동일 클래스의 다른 항체와 비교하여)이고, 상기 항원 결합 부위를 함유한다. 카멜리드 종의 오로지-중쇄 항체는 단일 중쇄 가변 영역을 갖는데, 이는 “V_HH”로 명명된다. 따라서, V_HH는 V_H의 특별한 유형이다.

용어 “가변(variable)”이란 가변 도메인의 특정 세그먼트(segments)가 항체 간에 순열이 광범위하게 다르다는 사실을 의미한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 나타낸다. 그러나, 가변성(variability)은 가변 도메인의 전체 폭에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신, 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 영역 (CDRs) 또는 초가변 영역 (HVRs)이라고 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 더 보존된 부분들은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불린다. 고유의(native) 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 베타-시트 형태를 채택한 4 개의 FR 영역, 이에 연결된 3 개의 CDRs, 이때, 이들은 루프 연결되며, 그리고 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 CDRs는 FR 영역에 의해 서로 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDRs와 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat 외, Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) 참고). 상기 불변 도메인은 항체가 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 작동체(effector) 기능, 이를 테면, 항체-의존적 세포 독성에서 항체에 참여와 같은 기능을 나타낸다.

본 발명에서 이용된 용어 “단클론 항체(monoclonal antibody)”는 실질적으로 동질성 항체의 집단으로부터 수득한 항체, 가령, 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 자연 발생적 돌연변이 및/또는 소량으로 존재할 수 있는 해독-후 변형(가령, 이성체화, 아미드화) 경우를 제외하고 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원 부위로 지향되는 매우 특이적이다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대항하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론 항체 조제물과 대조적으로, 각 단클론 항체는 상기 항원 상의 단일 결정인자를 지향한다. 이들의 특이성에 추가하여, 단클론 항체는 이들이 다른 면역 글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리 도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 이용되는 단클론 항체는 다음을 포함하는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다: 예를 들면, 하이브리도마 방법 (가령, Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo 외., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow 외., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nded. 1988); Hammerling 외, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합체 DNA 방법(가령, U.S. 특허 번호 4,816,567 참고), 파아지-디스플레이 기술 (가령, Clackson 외, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks 외, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992 참고); Sidhu 외, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee 외, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 그리고 Lee 외, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)을 포함하는 다양한 기술, 그리고 인간 면역글로블린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로블린 좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 방법 (가령, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits 외, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann 외, Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 그리고 5,661,016; Marks 외, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg 외, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild 외, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 그리고 Lonberg 및 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) 참고.

용어 “전장(full-length) 항체”, “무손상(intact) 항체”, 또는 “전체(whole) 항체”는 호환되며, 항체 단편과는 대조적으로, 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭한다. 특이적으로, 전장 4-쇄 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것들이다. 전장 오로지-중쇄 항체는 중쇄 (이를 테면, V_HH)와 Fc 영역을 포함한다. 불변 도메인은 고유의 서열 불변 도메인 (가령, 인간 고유의 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체들일 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 무손상 항체는 하나 또는 그 이상의 작동체 기능을 가질 수 있다.

“항체 단편”은 무손상 항체의 일부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab′, F(ab′)₂ 및 Fv 단편들; 디아바디(diabodies); 선형(linear) 항체 (U.S. 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata 외, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); 단일-쇄 항체 분자; 단일-도메인 항체 (이를 테면, V_HH), 및 항체 단편들에서 형성된 다중특이성 항체을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 항체의 파파인 절단으로 2개의 동일한 항원-결합 단편들, 소위 “Fab”단편들, 그리고 잔류 “Fc”단편들을 만드는데, 이는 쉽게 결정화하는 능력을 반영한다. 상기 Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인 (V_H)과 함께 전체 L 쇄, 그리고 하나의 중쇄의 제 1 불변 도메인(C_H1)으로 구성된다. 각 Fab 단편은 항원 결합에 있어서 단가(monovalent), 즉, 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리로 상이한 항원-결합 활성을 갖는 2개의 디술파이드 연계된 Fab 단편들에 대충 대응하고, 여전히 항원을 교차-연계할 수 있는 단일의 큰 F(ab')₂단편이 생성된다. Fab′단편들은 이 항체 힌지 영역의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 함유하는 C_H1 도메인의 카르복시-말단에서 몇 개의 추가 잔기를 보유함으로써, Fab 단편들과는 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리(free) 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂항체 단편들은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.

Fc 단편은 디술파이드에 의해 함께 유지된 양쪽 H 사슬의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 작동체 기능은 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체들(FcR)에 의해 또한 인지되는 Fc 영역의 서열에 의해 결정된다.

용어 “불변 도메인(constant domain)”이란 면역글로불린의 다른 부분, 항원-결합 부위를 포함하는 가변 도메인에 비해 보다 더 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자 부분을 의미한다. 상기 불변 도메인은 중쇄의 C_H1, C_H2 및 C_H3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로블린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (“κ”) 및 람다(“λ”)라고 불리는 2 개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다.

“Fv”는 완벽한 항원-인지 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 단단하게, 비-공유적 연합된 하나의 중쇄-및 하나의 경쇄-가변 영역 도메인으로 된 이량체로 구성된다. 이들 2개의 도메인 폴딩으로부터 6개의 초가변 루프 (H 및 L 쇄로부터 각각 3개 루프)가 발생되며, 이들은 항원 결합에 대한 아미노산 잔기를 제공하고, 당해 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (항원에 대해 특이적인 단지 3개의 CDRs만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다는 더 낮은 치화력을 갖지만, 여전히 항원을 인지하고, 결합하는 능력을 갖는다.

또한 “sFv”또는 “scFv”으로도 약칭되는 “단일-쇄 Fv”는 단일 폴리펩티드 쇄에 연결된 V_H 및 V_L항체 도메인을 포함하는 항체 단편들이다. 바람직하게는, 상기 sFv 폴리펩티드는 V_H 도메인과 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하고, 이는 상기 sFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 만들게 한다. sFv에 관한 리뷰는 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참고한다.

본원에서 기술된 항체의 “기능성 단편들”은 무손상 항체의 일부분, 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역, 또는 변형된 FcR 결합 능력을 유지하거나, 또는 갖는 항체의 Fc 영역을 포함한다. 항체 단편들의 예로는 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.

용어 “디아바디(diabodies)”란 V_H 와 V_L도메인 사이에 짧은 링커(약 5-10개 잔기)를 이용하여 sFv 단편들 (앞 단락 참고)를 구축함으로써 만들어지는 작은 항체 단편들을 지칭하며, V 도메인에서 쇄-내(intra-chain) 쌍형성이 아니라 쇄-간(inter-chain) 쌍형성이 이루어지고, 이로 인하여 이가(bivalent) 단편, 즉, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편이 초래된다. 이중특이적 디아바디는 2개의 “교차(crossover)”sFv 단편의 이종이량체이며, 이때 2개 항체의 V_H 및 V_L도메인은 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재한다. 디아바디는 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)에 더 상세하게 기술된다.

상기 본 명세서에서 제공된 항체는 “키메라” 항체(면역글로블린)를 특별히 포함하는데, 이때 중쇄 및/또는 경쇄의 부분은 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면, 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 부류 또는 아류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나, 또는 유사하며, 한편, 이 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또다른 항체 부류 또는 아류에 속하는 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 있는 대응하는 서열과 동일하거나 또는 유사하다(U.S. 특허 번호. 4,816,567; 그리고 Morrison 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). “인간화된 항체”는 “키메라 항체”의 부분집합(subset)으로 이용된다.

비-인간 (가령, 라마 또는 카멜리드) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로블린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 항체다. 일부 구체예들에서, 인간화된 항체는 인간 면역글로블린 (수령 항체)이며, 이때 수형 CDR(이후에 정의됨)의 잔기는 비-인간 종 (공여 항체) 이를 테면, 마우스, 렛(rat), 토끼, 카멜, 라마, 알파카, 또는 원하는 특이성, 친화력, 및/또는 수용력(capacity)을 갖는 비-인간 영장류의 CDR의 잔기로 대체된다. 일부 경우에서, 인간 면역글로블린의 프레임워크 ("FR") 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 수행능, 이를 테면, 결합 친화력을 더 개선하기 위하여 만들어질 수 있다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 이때 초가변 루프의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 면역글로블린 서열에 대응하며, FR의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 면역글로블린의 서열에 대응하고, FR 영역은 항체 수행능, 이를 테면, 결합 친화력, 이성체화(isomerization), 면역원성, 등등을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 개별 FR 잔기 치환을 포함할 수도 있다. FR에서 이들 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄에서 6개를 넘지 않고, L 쇄에서 3개를 넘지 않는다. 상기 인간화된 항체는 임의선택적으로 면역글로블린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로블린의 것을 포함할 것이다. 더욱 상세한 내용은 가령, Jones 외., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 외., Nature 332:323-329 (1988); 그리고 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참고한다. 또한, 예를 들면, Vaswani 및 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 그리고 U.S. 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참고한다.

“인간 항체”란 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산-서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 아미노산 서열을 보유하는 항체다. 인간 항체의 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특이적으로 배제한다. 인간 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리를 포함한, 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 만들어질 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks 외, J. Mol. Biol., 222:581 (1991). 인간 단클론 항체를 제조하는데 Cole 외, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner 외, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에 기술된 방법 또한 이용가능하다. van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001) 또한 참고. 인간 항체는 항원 시험감염(challenge)에 반응하여, 이러한 항체를 생산하도록 변형되었으나, 이의 내생적 좌는 불능화된, 예를 들면, 면역화된 제노마우스(xenomice),와 같은 유전자 삽입 동물에 상기 항원을 투여하여 만들어질 수 있다(가령, U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584의 XENOMOUSE™ 기술에 대하여, 참고). 예를 들면, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 만들어진 인간 항체는 Li 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)를 또한 참고.

용어 “초가변 영역(hypervariable region)", “HVR" 또는 “HV"은 서열에서 초가변적이고, 및/또는 구조적으로 특정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 단일-도메인 항체는 3개의 HVRs (또는 CDRs): HVR1 (또는 CDR1), HVR2 (또는 CDR2), 및 HVR3 (또는 CDR3)을 포함한다. HVR3 (또는 CDR3)은 3개의 HVRs중 가장 다양성을 나타내고, 항체에 대한 정밀성을 부여하는 데 독특한 역할을 하는 것으로 간주된다. 가령, Hamers-Casterman 외, Nature 363:446-448 (1993); Sheriff 외, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996) 참고.

용어 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”은 Kabat 시스템에 의해 정의된 초가변 영역을 지칭하는데 이용된다. Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) 참고.

많은 HVR 묘사가 사용되고 있으며, 본 명세서에 포함되어있다. Kabat 상보성 결정 영역 (CDRs)은 서열 가변성에 근거하여, 가장 흔히 이용된다 (Kabat 외, equences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia는 대신, 구조 루프(structural loops)의 위치를 나타낸다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVRs은 Kabat HVRs와 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어가 이용된다. "접촉" HVRs은 이용 가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 이들 각 HVRs의 잔기는 하기 표 1에 표시된다.

HVRs는 다음과 같이 "연장된 HVRs"을 포함할 수 있다: V_L에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2), 및 89-97 또는 89-96 (L3), 그리고 V_H에서 26-35(H1), 50-65 또는 49-65 (H2), 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기들은 상기 정의 각각에 대해 Kabat 외, supra에 따라 번호매김된다.

단일-도메인 항체 (이를 테면, V_HH)의 아미노산 잔기는 Riechmann and Muyldermans, J Immunol Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195 문헌에서 카멜리드의 V_HH 도메인에 적용될 때, Kabat 외 ("equences of Proteins of Immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md, Publication No 91)에 의해 제공된 VH 도메인을 위한 전반적인 번호매김에 따라 번호매김된다. 이 번호매김에 따라, V_HH의 FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고, V_HH의 CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함하고, V_HH의 FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고, V_HH의 CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하고, V_HH의 FR3 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고, V_HH의 CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하고, 그리고 V_HH의 FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다. 이 점에 있어서, (V_H 도메인 및 V_HH 도메인에 대하여 당분야에서 공지된 바와 같이) CDRs의 각각의 총 아미노산 서는 가변적일 것이고, Kabat 번호매김에 의해 나타낸 아미노산 잔기의 총수에 대응하지 않을 수 있음(즉, Kabat 번호매김에 따른 하나 또는 그 이상의 위치는 실제 서열에 점유되지 않을 수 있고, 또는 실제 서열은 Kabat 번호매김에 의해 허용되는 수 이상의 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다)을 주지해야 한다.

표현 “Kabat와 같은 가변-도메인 잔기-번호매김” 또는 “Kabat와 같은 아미노-산-위치 번호매김” 및 이의 변이들은 Kabat 외, supra에서 항체 모음(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 이용된 번호매김 시스템을 지칭한다. 이 번호매김 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR에 상응하는 몇 개의 또는 추가 아미노산, 또는 이보다 짧은 삽입체를 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입 (Kabat에 따라, 잔기 52a)과 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (가령, Kabat에 따라, 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 번호매김은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 번호가 매겨진 서열의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.

본원에서 언급되지 않는 한, 면역글로블린 중쇄에서 잔기의 번호매김은 Kabat 외, supra와 같이 EU 색인 번호매김이다. “Kabat에서와 같은 EU 색인”이란 상기 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호매김을 지칭한다.

“프레임워크” 또는 “FR”잔기는 본원에서 정의된 바와 같이, HVR 잔기이외의 가변-도메인 잔기들이다.

“인간 콘센수스(consensus) 프레임워크” 또는 “수용체 인간 프레임워크”는 인간 면역글로블린 V_L 또는 V_H 프레임워크 서열의 선별에서 가장 흔히 발생되는 아미노산 잔기에 해당되는 프레임워크다. 일반적으로, 인간 면역글로블린 V_L 또는 V_H 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군(subgroup)이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에서와 같은 하위군이다. 실시예는 V_L경우를 포함하는데, 이때 상기 하위군는 Kabat 외, supra에서와 같이, 하위군 카파 I, 카파 II, 카파 III 또는 카파 IV일 수 있다. 추가적으로, VH의 경우, 상기 하위군은 Kabat 외 에서와 같은 하위군 I, 하위군 II, 또는 하위군 III일 수 있다. 대안으로, 인간 콘센수스 프레임워크는 상기로부터 유래될 수 있고, 이때 특정 잔기, 이를 테면, 인간 프레임워크 잔기는 다양한 인간 프레임워크 서열 집합과 정렬됨으로써, 공여 프레임워크에 대한 이의 상동성에 근거하여 선택된다. 인간 면역글로블린 프레임워크 또는 인간 콘센수스 프레임워크로부터 "유래된(derived from)" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 기존 아미노산 변화의 수는 10 또는 그 미만, 9 또는 그 미만, 8 또는 그 미만, 7 또는 그 미만, 6 또는 그 미만, 5 또는 그 미만, 4 또는 그 미만, 3 또는 그 미만, 또는 2 또는 그 미만이다.

“친화력-발달된(matured)”항체란 이의 하나 또는 그 이상의 CDRs에서 하나 또는 그 이상의 변경(alterations)을 갖는 항체로써, 이로 인하여 이러한 변경(들)을 보유하지 않은 부모계 항체와 비교하였을 때, 항원에 대한 당해 항체의 친화력의 개선을 초래한다. 일부 구체예들에서, 친화력-발달된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화력을 갖는다. 친화력-발달된 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 예를 들면, Marks 외, Immunol. 10:779-783 (1992)는 V_H-및 V_L -도메인 셔플링(shuffling)에 의해 친화력 발달(maturation)을 설명한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 예를 들면: Barbas 외 Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier 외 Gene 169:147-155 (1995); Yelton 외 J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson 외, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 그리고 Hawkins 외, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)에서 설명된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “특이적으로 결합한다", “특이적으로 인지한다", 또는 “~에 특이적인(specific for)”이란 측정가능한, 그리고 재생가능한 상호작용, 이를 테면, 표적과 항원 결합 단백질 (이를 테면, sdAb) 사이의 결합을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함한 이질적(heterogeneous) 집단 존재 하에 표적의 존재를 확정한다. 예를 들면, 표적 (에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 (이를 테면, sdAb)은 다른 표적에 결합하는 것과 비교하여 더 큰 친화력, 항원항체결합력(avidity), 더욱 더욱 즉각적으로, 및/또는 더 오랜 기간 동안 당해 표적에 결합하는 항원 결합 단백질 (이를 테면, sdAb)이다. 일부 구체예들에서, 무관한 표적에 항원 결합 단백질 (이를 테면, sdAb)의 결합 정도는 가령, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, 표적에 당해 항원 결합 단백질 (이를 테면, sdAb)의 결합에 대해 약 10% 미만이다. 일부 구체예들에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 (이를 테면, sdAb)은 ≤10^-5 M, ≤10^-6 M, ≤10^-7 M, ≤10^-8 M, ≤10^-9 M, ≤10^-10 M, ≤10^-11 M, 또는 ≤10^-12 M의 해리 상수 (K_d)를 갖는다. 일부 구체예들에서, 항원 결합 단백질은 상이한 종의 단백질중에서 보존된 단백질 상에 있는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 특이적 결합은 독점적(exclusive) 결합을 포함할 수 있지만, 이것을 요구하지는 않는다.

용어 “특이성(specificity)”이란 항원의 특정 에피토프에 대하여 항원 결합 단백질 (이를 테면, sdAb)의 선택적 인지를 지칭한다. 자연 항체는 예를 들면, 단일특이성이다. 용어 “다중특이성(multispecific)”이란, 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 단백질이 다중에피토프성(polyepitopic) 특이성 (즉, 하나의 생물학적 분자 상의 2, 3, 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 능력이 있거나, 2, 3, 또는 그 이상의 상이한 생물학적 분자 상에 있는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 능력)을 갖는다는 것을 말한다. “이중특이성(bispecific)”이란 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 단백질은 상이한 2개의 항원-결합 특이성을 갖는다는 것을 나타낸다. 다른 언급이 없는 한, 열거된 이중특이성 항체에 결합된 항원의 순서는 임의적이다. 즉, 예를 들면, 용어 "항-PD-L1/PD-1", "항-PD-1/PD-L1", "PD-L1×PD-1", "PD-1×PD-L1", "PD-1-PD-L1", 및 "PD-L1-PD-1"은 호환되며, PD-L1 및 PD-1 모두에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 지칭한다. 용어 "단일특이성"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 단백질 (이를 테면, sdAb)은 하나 또는 그 이상의 결합 부위를 갖고, 이들 각각은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 말한다.

용어 “가(valent)”란 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 단백질에서 명시된 수의 결합 부위가 존재함을 나타낸다. 예를 들면, 자연 항체 또는 전장의 항체는 2개의 결합 부위를 갖고, 이가(bivalent)이다. 이와 같이, 용어 “3가(trivalent)”,“4가(tetravalent)”,“5가(pentavalent)”및 “6가(hexavalent)”는 항원 결합 단백질에 차례로 2개 결합 부위, 3개 결합 부위, 4개 결합 부위, 5개 결합 부위, 및 6개 결합 부위가 존재함을 나타낸다.

“항체 작동체 기능(antibody effector functions)”이란 생물학적 활성이 항체의 Fc 영역 (고유한 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인되며, 항체의 아이소타입에 의해 가변적이다. 항체 작동체 기능의 실시예로는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식작용; 세포 표면 수용체들 (예로써, B 세포 수용체)의 하향 조절; 그리고 B 세포 활성화. “감소된 또는 최소화된” 항체 작동체 기능이란 야생형 또는 변형안된 항체로부터 최소한 50% (대안으로 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 감소된 것을 의미한다. 항체 작동체 기능의 측정은 당업자에 의해 용이하게 결정 및 측정 가능하다. 바람직한 구체예에서, 보체(complement) 결합의 항체 작동체 기능, 보체 의존적 세포독성 및 항체 의존적 세포독성이 영향을 받는다. 일부 구체예들에서, 작동체 기능은 당화(glycosylation)를 제거하는 불변 영역에서의 돌연변이, 예를 들어 "작동체-없는 돌연변이"를 통해 제거된다. 한 측면에서, 작동체-없는 돌연변이는 C_H2 영역에서 N297A 또는 DANA 돌연변이 (D265A+N297A)이다. Shields 외, J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001). 대안으로, 감소된 또는 제거된 작동체 기능을 초래하는 추가적인 돌연변이는 다음을 포함한다: K322A 및 L234A/L235A (LALA). 대안으로, 작동체 기능은 생산 기술, 이를 테면, 당화하지 않는 또는 이때 작동체 기능을 촉진시킴에 있어서 효과가 없거나, 또는 효과가 덜한 변경된 당화 패턴을 야기하는숙주 세포(가령, 대장균(E. coli.))에서 발현을 통하여 감소 또는 제거될 수 있고, 한다 (가령, Shinkawa 외, J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003).

“항체-의존성 세포-매개된 세포독성” 또는 “ADCC”는 특정 세포 독성 세포 (가령, 자연 킬러(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs)에 결합된 분비된 Ig는 이들 세포 독성 작동체가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하도록 하고, 결국 세포독소로 이 표적 세포를 죽이게 하는, 세포독성 형태를 지칭한다. 상기 항체는 이 세포독성 세포를 "암(arm)"로 하고, 이러한 기전에 의해 표적 세포의 사멸에 절대적으로 요구된다. ADCC를 중개하는 일차 세포, NK 세포는 오직 FcγRIII만을 발현시키고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 Fc 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92(1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, U.S. 특허 번호. 5,500,362 또는 5,821,337에서 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 검증을 수행할 수 있다. 이러한 분석을 위한 유용한 작동체 세포는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들면, 동물 모델에서 생체에서 평가될 수 있는데, 가령, Clynes 외. PNAS USA 95:652-656 (1998)에서 설명된다.

본원에서 용어 “Fc 영역” 은 고유의-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 비롯한, 면역글로블린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 이용된다. 면역글로블린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간씩 변화될 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 중쇄의 아미노산 잔기 Cys226, 또는 Pro230으로부터 이의 카르복실-말단까지 이어지는 것으로 특정된다. Fc 영역의 C-말단 리신(EU 번호매김 시스템에 따라 잔기 447)은 예를 들면, 상기 항체의 생산 또는 정제 과정 동안, 또는 상기 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산의 재조합적 작제에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체 조성물은 모든 K447 잔기가 제거 된 항체 집단, 제거될 K447 잔기가 없는 항체 집단 및 K447 잔기가 있거나 또는 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 본원에서 기술된 항체에서 사용하기에 적합한 고유의-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.

“Fc 수용체” 또는 “FcR”는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 고유의 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 선호되는 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고, 대립유전자 변이체 및 이들 수용체의 대체 스플라이스된 형태를 비롯한 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스 수용체들을 포함하고, FcγRII 수용체들은 FcγRIIA (“활성화 수용체”) 및 FcγRIIB (“억제 수용체”)를 포함하는데, 이들은 이들의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인 안에 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인 안에 면역수용체 티로신-기반의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (M.

, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참고. FcRs는 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel 외, Immunomethods 4: 25-34 (1994); 그리고 de Haas 외, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995) 등에서 검토된다. 미래에 확인되어야 할 것을 포함하는 다른 FcRs는 본원에서 "FcR"이라는 용어에 의해 포함된다.

용어 “Fc 수용체” 또는 “FcR”어에는 모체 IgG를 태아로 옮기는 신생아 수용체인 FcRn도 포함된다. Guyer 외, J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim 외, J. Immunol. 24: 249 (1994). FcRn에 결합을 측정하는 방법들은 공지되어 있다(가령, Ghetie 및 Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie 외, Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton 외, J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton 외) 참고. 생체내 FcRn-에 대한 결합 및 인간 FcRn 고-친화력 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는, 가령, 인간 FcRn를 발현시키는 이식유전자를 가진(transgenic) 마우스 또는 형질감염된 인간 세포 계통, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석될 수 있다. WO 2004/42072 (Presta)는 FcRs에 결합을 개선 또는 감소시키는 항체 변이체를 기술한다. 또한, 가령, Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참고.

“보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity)”또는 “CDC”란 보체 존재하에서 표적 세포의 용해를 말한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 그들의 동족(cognate) 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스)에 대한 보체 시스템의 제 1 성분 (C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석 (가령, Gazzano-Santoro 등 외, 1996, J. Immunol. Methods 202:163)이 실행될 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가된 또는 감소된 C1q 결합 역량을 갖는 항체 변이체들은 U.S. 특허 번호 6,194,551B1 및 WO99/51642에서 기술된다. 이들 특허 공보의 내용은 본원에 구체적으로 참고자료에 편입된다. Idusogie 외 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) 또한 참고.

“결합 친화력”이란 일반적으로 분자의 단일 결합 부위 (예를 들면, 항체)와 이의 결합 짝 (예를 들면, 항체) 사이에 비-공유 상호작용의 총 강도를 말한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “결합 친화력”이란 결합 쌍의 구성요소들간에 1:1 상호작용을 반영한 고유한 결합 친화력을 지칭한다. 결합 친화력은 K _d , K _off , K _on , 또는 K _a 로 표시될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “K _off ”는 상기 항체/항원 복합체로부터 항체(또는 항원-결합 도메인) 해리용 분리(off rate) 상수를 지칭하는데, 이는 s^-1 당 단위로 표현되는 역학적 선택 설정으로 측정된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “K _on ”는 상기 항체/항원 복합체로부터 항체(또는 항원-결합 도메인) 연합용 결합(on rate) 상수를 지칭하는데, 이는 M^-1s^-1 당 단위로 표현된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 평형 해리 상수 “K_D” 또는 “K_d”는 특정　항체-항원 상호작용의 해리 상후를 지칭하며, 평형에서 항체 분자 용액 안에 존재하는 항체-결합 도메인 모두의 절반을 차지하는데 요구되는 항원의 농도로 설명되며, M 단위로 표현되는 K _off /K _on 와 같다. K_d 　측정은 용액 안에 모든 결합제가 존재하는 것으로 전제한다. 상기　항체　가 세포 벽, 가령, 효모 발현 시스템내 세포벽에 묶여있는 경우, 대응하는 평형 속도 상수는 EC50으로 나타내며, 이는 K _d 의 양호한 근사치이다. 친화력 상수, K _a 는 해리 상수, K _d 의 역이며, M^-1단위로 표현된다.

해리 상수(K_D 또는 K_d)는 항체의 항원에 대한 친화력을 나타내는 지표로 이용된다. 예를 들면, BiacoreX(Amersham Biosciences사), 이와 함께 제공된 사용자 매뉴얼 및 실험 작동 방법에 따라 처방전 없이 구입할 수 있는 측정 키트 또는 이와 유사한 키트를 사용하여, 다양한 마커제(marker agents)로 표시된 항체를 사용하여 Scatchard 방법으로 용이한 분석이 가능하다. 이들 방법을 이용하여 이끌어낼 수 있는　K_D　값은 M 단위(Mols)로 표시된다. 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들면, ≤10^-5 M, ≤10^-6 M, ≤10^-7 M, ≤10^-8 M, ≤10^-9 M, ≤10^-10 M, ≤10^-11 M, 또는 ≤10^-12 M의 해리 상수 (K_d)를 가질 수 있다.

상기 항체 또는 항원-결합 도메인의 결합 특이성은 당분야에 공지된 방법에 의해 실험적으로 측정될 수 있다. 이러한 방법들은 Western 블랏, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-, EIA-, BIAcore-테스트 및 펩티드 스캔(scans)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

최대 억제성 농도-절반(IC₅₀)은 특이적 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제함에 있어서 물질(이를 테면, 항체)의 효과 척도이다. 주어진 생물학적 과정 (가령, PD-L1과 B7-1 사이의 결합, 또는 과정의 구성 요소, 즉, 효소, 세포, 세포 수용체 또는 미생물)을 절반으로 억제하는데 필요한 특정 약물 또는 기타 물질 (항체와 같은 억제제)이 얼마나 필요한 지를 나타낸다. 이 값은 일반적으로 몰 농도로 표시된다. IC₅₀은 작용제 약물 또는 다른 물질 (이를 테면, 항체)의 EC₅₀과 필적될 수 있다. EC₅₀은 생체내 최대 효과의 50%를 얻는데 요구되는 혈장 농도를 또한 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, “IC₅₀”은 시험관내에서 상기 항원 생물활성 (이를 테면, PD-L1 생물활성)의 50%를 중화시키는데 요구되는 항체 (이를 테면, 항-PD-L1 sdAb)의 효과적인 농도를 지시하는데 이용된다. IC₅₀ 또는 EC₅₀은 생물분석, 이를 테면, FACS 분석에 의한 리간드 결합 억제 (경쟁 결합 분석), 세포 기반 사이토킨 방출 분석, 또는 증폭된 발광성 근접성 동질성 분석 (AlphaLISA)에 의해 측정될 수 있다.

펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대하여 “아미노산 서열 동일성 백분율(%)”및 "상동성(homology)"은 참고 서열 및 후보 서열들을 배열하고, 필요에 따라 최대 백분율의 서열 동일성을 획득하기 위하여 갭을 도입한 후, 특정 펩티드, 또는 폴리펩티드 서열에 있는 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에 있는 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 임의의 보존 치환은 서열 동일성 부분으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 성취될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.

본원에서 기술하는 구조체, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 그것이 생성된 환경에서 통상적으로 관련된 최소한 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인되고, 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 상기 단리된 핵산은 이의 생산 환경과 연합된 모든 다른 성분들과 연합되지 않는다. 본원에서 기술된 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 이들이 자연계에서 발견되는 형태 또는 설정이 아닌 형태로 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 세포에서 자연적으로 존재하는 본원에서 기술되는 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 핵산과는 구별된다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.

용어 “벡터"란 본원에서 사용된 바와 같이, 이에 연결된 또다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 포함된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 “발현 벡터”라고 지칭된다.

용어 “형질감염된(transfected)”또는 “형질변형된(transformed)”또는 “형질도입된(transduced)”이란 본원에서 사용된 바와 같이, 외인성 핵산이 숙주 세포 안으로 전달되거나 또는 도입되는 과정을 지칭한다. “형질감염된” 또는 “형질변형된” 또는 “형질도입된” 세포는 외인성(exogenous) 핵산이 형질감염된, 형질변형된 또는 형질도입된 것을 말한다. 세포는 원발성 대상 세포 및 그의 자손을 포함한다.

용어 “숙주 세포", “숙주 세포 계통", 및 “숙주 세포 배양물”은 호환되며, 외인성 핵산이 도입된 세포 및, 이러한 세포의 후손을 포함하는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체(transformants)" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 여기에는 원발성 형질변형된 세포 및 계대 횟수에 관계없이, 이로부터 유래된 자손이 포함된다. 자손은 핵산 함량에서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 또는 선택되어, 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손도 본원에서는 포함된다.

"어쥬번트 설정"은 개인이 암 병력을 가졌으며, 수술 (예를 들어, 수술 절제), 방사선 요법 및 화학 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 요법에 일반적으로 (그러나 반드시 그런 것은 아님) 반응하는 임상적 설정을 지칭한다. 그러나, 암의 병력으로 인해 이들 개체는 질병의 발병 위험이 있는 것으로 간주된다. “어쥬번트 설정(adjuvant setting)”에서 치료 또는 투여는 치료의 후속 방식을 지칭한다. 위험 정도 (가령, 보조제 환경의 개인이 "높은 위험" 또는 "낮은 위험"으로 간주될 때)는 몇 가지 요인, 가장 일반적으로 처음 치료할 때의 질병 정도에 따라 달라진다.

"네오어쥬번트 설정(neoadjuvant setting)"이란 1 차/확정정(definitive) 요법 전에 방법이 수행되는 임상 설정을 지칭한다.

용어 약제학적 조성물의 "약제학적 제형(pharmaceutical formulation)"이란 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 이러한 제형이 투여되는 대상에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다. 이러한 제형은 무균성이다. "무균" 제형이란 무균이거나, 모든 살아있는 미생물 및 그들의 포자가 없다.

본 명세서에 기술된 본 발명의 구체예는 구체예들로 "~로 구성되는 (consisting)" 및/또는 "본질적으로 ~로 구성되는 (consisting essentially of)"것을 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 값 또는 파라미터의 "약(about)"에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 변형을 포함(및 설명)한다. 예를 들면, “약 X”에 대한 설명은 “X”의 설명을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 값 또는 파라미터가 "아닌(not)"이란 일반적으로 값 또는 파라미터를 "제외한 것(other than)"을 의미하고 설명한다. 예를 들면, 상기 방법은 유형 X의 암 치료에 사용되지 않는다라는 것은 당해 방법은 유형 X를 제외한 암 치료를 이용한다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수(“a”, "an" 및 “the”)형은 다른 명시적인 언급이 없는 한, 복수 개념을 포함한다는 것으로 주지되어야 한다.

II.항-PD-L1 구조체

항-PD-L1 단일-도메인 항체 모이어티

본원에서 기술된 단리된 항-PD-L1 구조체는 PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체 (sdAb) 모이어티 (또는 “항-PD-L1 sdAb”)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 항-PD-L1 sdAb이다.

단일-도메인 항체

예시적인 sdAbs는 오로지-중쇄 항체의 중쇄 가변 도메인 (가령, 카멜리데(Camelidae)의 V_HH (중쇄 항체의 중쇄 가변 도메인) 또는 연골 물고기의 V_NAR (상어 새로운 항원 수용체(New Antigen Receptor)의 가변 도메인)), 자연적으로 경쇄가 없는 결합 분자, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유도된 단일 도메인 (이를 테면, V_H 또는 V_L), 인간화된 오로지-중쇄 항체, 인간 중쇄 세그먼트를 발현시키는 이식유전자를 가진 마우스 또는 렛에 의해 만들어진 인간 단일-중쇄 항체, 그리고 항체로부터 유래된 것이 아닌 공작된 도메인 및 단일 도메인 스캐폴드(scaffolds)를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. sdAbs는 마우스, 렛, 인간, 카멜, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본원에서 고려되는 단일-도메인 항체는 카멜리데(Camelidae) 및 상어 이외의 종으로부터의 자연적으로 발생되는 단일-도메인 항체 분자를 포함한다.

일부 구체예들에서, sdAb는 경쇄가 없는 중쇄 항체 (본원에서는 “오로지-중쇄 항체”, 또는 “HCAb”로도 지칭됨)로 공지된 자연적으로 발생되는 단일-도메인 항원 결합으로부터 유래된다. 이러한 단일 도메인 분자는 예를 들면, WO 94/04678 및 Hamers-Casterman, C. 외 (1993) Nature 363:446-448에 기술된다. 명확성을 이유로, 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 4 개의 쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해, V_HH로 본원에 공지되어 있다. 이러한 V_HH 분자는 카멜리데(Camelidae) 종, 예를 들면, 카멜, 라마, 비큐나(vicuna), 단봉낙타, 알파카 및 과나코(guanaco)에서 만들어진 항체로부터 유래될 수 있다. 카멜리데(Camelidae) 이외의 다른 종은 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자를 생산할 수 있으며, 이러한 V_HHs는 본 출원의 범위 내에 있다.

일부 구체예들에서, sdAb는 연골 어류에서 발견되는 면역글로블린의 가변 영역으로부터 유래된다. 예를 들면, sdAb는 상어 혈청에서 발견되는 신규 항원 수용체 (NAR)로 알려진 면역글로블린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자 ("IgNARs")를 만드는 방법은 WO 03/014161 및 Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909에 기술된다.

일부 구체예들에서, sdAb는 재조합, CDR-접합된, 인간화된, 카멜화된, 탈-면역화된 및/또는 시험관내 생산된다 (가령, 파아지 디스플레이에 의해 선택된). 일부 구체예들에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역 안에 특이적 아미노산 잔기의 “카멜화(camelization)”에 의해 변경될 수 있다. 카멜화란 통상적인 4-쇄 항체의 (자연적으로 발생되는) VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 중쇄 항체의 V_HH 도메인 안에 대응하는 위치(들)에서 발생된 아미노산 잔기중 하나 또는 그 이상으로 대체 또는 치환됨을 지칭한다. 이는 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어, 본 명세서의 추가 설명에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 “카멜화(camelizing)”치환은 본원에서 정의된 바와 같이, VH-VL 계면을 형성하는 및/또는 이에 존재하는 아미노산 위치들, 및/또는 소위 카멜리데(Camelidae) 특징(hallmark) 잔기에 바람직하게는 삽입된다(예를 들면, WO 94/04678, Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994; Davies and Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531-537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol. 259: 957-969, 1996; 그리고 Riechmann and Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999 참고).

일부 구체예들에서, sdAb는 인간 중쇄 세그먼트를 발현시키는 이식유전자를 가진 마우스 또는 렛에 의해 만들어진 인간 sdAb이다. 가령, US20090307787A1, U.S. 특허 번호 8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, 및 WO2004049794 참고. 일부 구체예들에서, sdAb는 친화력 발달된 것이다.

일부 구체예들에서, 특정 항원 또는 표적에 대항하는 자연적으로 발생되는 V_HH 도메인은 카멜리드 V_HH서열의 (나이브(

) 또는 면역(immune)) 라이브러리로부터 획득될 수 있다. 이러한 방법은 자체로 공지된 하나 또는 그 이상의 스크리닝 기술을 이용하여, 전술한 항원 또는 표적, 또는 이의 최소한 하나의 부분적, 항원성 결정인자 또는 에피토프를 이용하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 것과 관련될 수 있거나, 또는 관련되지 않을 수 있다. 이러한 라이브러니 및 기술은 예를 들면, WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에서 기술된다. 대안으로, (나이브 또는 면역) V_HH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반-합성 라이브러리가 이용될 수 있는데, 예를 들면, WO 00/43507에서 기술된 것과 같은 이를 테면, 무작위 돌연변이유발 및/또는 CDR 셔플링과 같은 기술에 의해 (나이브 또는 면역) V_HH 라이브러리로부터 획득된 이를 테면, V_HH라이브러리가 이용될 수 있다.

일부 구체예들에서, sdAbs는 통상적인 4-쇄 항체로부터 생성된다. 예를 들면, EP 0 368 684, Ward 외 (Nature 1989 Oct. 12; 341 (6242): 544-6), Holt 외, Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; WO 06/030220; 그리고 WO 06/003388 참고.

sdAbs의 독특한 성질 때문에, 단일 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 도메인 (즉, 더 큰 단백질 또는 폴리펩티드의 일부분으로써)으로써 V_HH　도메인의 사용은 통상적인 V_H　및 V_L, scFv 및 통상적인 항체 단편들 (이를 테면, Fab 또는 (Fab')2)을 사용하는 것과 비교하여 다수의 유의적인 장점을 제공한다: 1) 고-친화력으로 항원에 결합하기 위하여 오직 단일 도메인만 요구되고, 따라서 제 2 도메인을 가져야 하거나, 또는 이들 두 도메인이 정확한 공간적 형태 및 배열에 있어야 할 필요는 없다 (가령, 폴딩 동안 중쇄와 경쇄의 페어링이 필요하지 않고, 또는 이를 테면, scFv에 대하여 특별히 기획된 링커를 필요로 하지 않고); 2) V_HH 도메인 및 기타 sdAbs는 단일 유전자로부터 발현될 수 있고, 해독-후 폴딩 또는 변형을 요구하지 않고; 3) V_HH 도메인 및 다른 sdAbs는 용이하게 다가(multivalent) 및/또는 다중특이성 포멧 (이를 테면, 본 출원에서 기술된 것들)으로 공작될 수 있고; 4) (Ward 외, Nature.1989　Oct 12;341(6242):544-6)에서 기술된 마우스-유래된 “dAbs”와 같이), V_HH 도메인 및 다른 sdAbs는 매우 가용성이 크고, 응집되는 경향이 없고; 5) V_HH 도메인 및 다른 sdAbs는 열, pH, 프로테아제, 그리고 다른 변성제 및 조건에 대항하여 상당히 안정적이고; 6) V_HH 도메인 및 다른 sdAbs는 이를 테면, 미생물 발효를 이용하여 용이하고, 상대적으로 저렴하게 준비하고(심지어 대규무 생산의 경우에도), 포유동물 발현 시스템 (예를 들면, 통상적인 항체 단편들의 생산에 요구되는)을 사용할 필요가 없고; 7) V_HH 도메인 및 다른 sdAbs는 통상적인 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편들과 비교하였을 때 상대적으로 작고 (대략적으로 15 kDa, 또는 통상적인 IgG보다 10배 더 작고), 따라서 이를 테면, 충실성 종양 및 다른 조밀한 조직에 대하여 (더) 높은 조직 침투 능력을 갖고; 그리고 8) V_HH 도메인 및 다른 sdAbs는 소위 "구멍-결합 성질" (통상적인 V_H도메인과 비교하여 이들의 연장된 CDR3 루프로 인하여)을 갖고, 따라서 통상적인 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편들이 접근할 수 었는 표적 및 에피토프에 접근할 수 있고, 예를 들면, V_HH 도메인 및 다른 sdAbs는 효소를 억제할 수 있는 것으로 나타났다 (예를 들면, WO1997049805; Transue 외, Proteins.　1998 Sep 1;32(4):515-22; Lauwereys 외., EMBO J.　1998 Jul 1;17(13):3512-20).

PD-L1

관련된 B7 패밀리 구성원에 대한 구조적 유사성으로, PD-L1 단백질은 세포외 IgV 및 IgC 도메인 및 짧은, 세포질 영역을 함유한다. PD-L1은 CD28과 유사하게 세포내 도메인을 갖는데, 이는 내재된(intrinsic) 촉매 활성이 없고, PI3K, PP2A 및 SHP-2에 결합할 수 있는 YVKM 모티프, 그리고 SH3 함유 단백질에 결합할 수 있는 프롤린-풍부한 모티프를 함유한다.

인간　PD-L1의 아미노산 서열은 Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7에서 개시된다. 아미노산 1-18의 영역은 리더(leader) 펩티드이며; 아미노산 19-238은 세포외 도메인이며; 아미노산 239-259는 막경유 도메인이고; 그리고 아미노산 260-290은 세포질 도메인이다.

특정 인간　PD-L1　서열은 인간　PD-L1의 아미노산 서열(Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7)에 최소한 90% 동일할 것이며, 다른 종(가령, 뮤린) PD-L1　아미노산 서열과 비교하였을 때, 인간의 아미노산 서열로 확인되는 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 구체예들에서, 인간　PD-L1은 PD-L1　의 아미노산 서열(Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7)에 대하여 최소한 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 일부 구체예들에서, 인간　PD-L1　서열은 Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7의 PD-L1과 많아야 10개 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 일부 구체예들에서, 인간　PD-L1　서열은 Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7의 PD-L1과 많아야 5, 4, 3, 2, 또는 1개 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. 동일성 백분율은 본 명세서에 기술 된 바와 같이 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7의 PD-L1에 대하여 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 PD-L1 폴리펩티드를 특이적으로 인지한다. PD-L1 sdAb 모이어티는 서열 번호: 441의 아미노산 서열을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드를 특이적으로 인지한다.

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb　모이어티는 인간이외의 종의 PD-L1, 또는 인간　PD-L1에 구조적으로 관련된 다른 단백질(가령, 인간　PD-L1　동족체들)과 가교 반응할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb　모이어티는 인간　PD-L1에 대하여 전적으로 특이적이며, 　종 또는 다른 유형의　교차-반응성을 나타내지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb　모이어티는 인간 PD-L1의 가용성 아이소폼을 특이적으로 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb　모이어티는 인간 PD-L1의 막-결합된 아이소폼 (서열 번호: 441)을 특이적으로 인지한다.

일부 구체예들에서, 본원에서 기술하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 PD-L1의 세포외 도메인(ECD)을 특이적으로 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 상기 PD-L1 세포외 도메인 (ECD)의 N-말단 부분을 특이적으로 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 상기 PD-L1 세포외 도메인 (ECD)의 C-말단 부분을 특이적으로 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 상기 PD-L1 세포외 도메인 (ECD)의 중간 부분을 특이적으로 인지한다. 일부 구체예들에서, 항-PD-L1 sdAb 모이어티에 의해 특이적으로 인지되는 PD-L1의 세포외 도메인은 Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7의 PD-L1의 세포외 도메인에 대한 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일부 구체예들에서, 항-PD-L1 sdAb 모이어티에 의해 특이적으로 인지되는 PD-L1의 세포외 도메인은 Genbank 수탁 번호 Q9NZQ7의 PD-L1의 세포외 도메인에 대한 아미노산 서열에 대하여 100% 동일하다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 서열 번호: 442의 아미노산 서열을 포함하는 PD-L1 폴리펩티드를 특이적으로 인지한다.

항체 친화력

일부 구체예들에서, 항-PD-L1 sdAb 모이어티 및 PD-L1 사이의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-6 M, 약 10^-6 M 내지 약 10^-7 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-8 M, 약 10^-8 M 내지 약 10^-9 M, 약 10^-9 M 내지 약 10^-10 M, 약 10^-10 M 내지 약 10^-11 M, 약 10^-11 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-6 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-9 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-10 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-5 M 내지 약 10^-11 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-11 M, 약 10^-8 M 내지 약 10^-11 M, 약 10^-9 M 내지 약 10^-11 M, 약 10^-5 M 내지 약 10^-10 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-10 M, 약 10^-8 M 내지 약 10^-10 M, 약 10^-5 M 내지 약 10^-9 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-9 M, 약 10^-5 M 내지 약 10^-8 M, 또는 약 10^-6 M 내지 약 10^-8 M이다.

일부 구체예들에서, 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 사이의 결합 K_on은 약 10² M^-1s^-1 내지 약 10⁴ M^-1s^-1, 약 10⁴ M^-1s^-1 내지 약 10⁶ M^-1s^-1, 약 10⁶ M^-1s^-1 내지 약 10⁷ M^-1s^-1, 약 10² M^-1s^-1 내지 약 10⁷ M^-1s^-1, 약 10³ M^-1s^-1 내지 약 10⁷ M^-1s^-1, 약 10⁴ M^-1s^-1 내지 약 10⁷ M^-1s^-1, 약 10⁵ M^-1s^-1 내지 약 10⁷ M^-1s^-1, 약 10³ M^-1s^-1 내지 약 10⁶ M^-1s^-1, 또는 약 10⁴ M^-1s^-1 내지 약 10⁶ M^-1s^-1이다.

일부 구체예들에서, 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 사이의 결합 K_off은 약 1 s^-1 내지 약 10^-2 s^-1, 약 10^-2 s^-1 내지 약 10^-4 s^-1, 약 10^-4 s^-1 내지 약 10^-5 s^-1, 약 10^-5 s^-1 내지 약 10^-6 s^-1, 약 1 s^-1 내지 약 10^-6 s^-1, 약 10^-2 s^-1 내지 약 10^-6 s^-1, 약 10^-3 s^-1 내지 약 10^-6 s^-1, 약 10^-4 s^-1 내지 약 10^-6 s^-1, 약 10^-2 s^-1 내지 약 10^-5 s^-1, 또는 약 10^-3 s^-1 내지 약 10^-5 s^-1이다.

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티의 IC₅₀는 증폭된 발광성 근접성 동질성 분석 (AlphaLISA)에서 10nM 이만으로, 0.12 nM PD-1 및 0.2 nM　PD-L1이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티의 IC₅₀는 FACS 분석 (경쟁 결합 분석), 또는 세포 기반 사이토킨 방출 분석에 의하면, 리간드 결합 억제에서 500nM 미만이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티의 IC₅₀는 1 nM, 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 10 nM 내지 약 50 nM, 약 50 nM 내지 약 100 nM, 약 100 nM 내지 약 200 nM, 약 200 nM 내지 약 300 nM, 약 300 nM 내지 약 400 nM, 또는 약 400 nM 내지 약 500 nM 미만이다.

키메라 또는 인간화된 항체

일부 구체예들에서, 본원에서 제공된 상기 항-PD-L1 항체는 키메라 항체다. 특정 키메라 항체들은 가령, U.S. 특허 번호 4,816,567; 그리고 Morrison 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에 기술된다. 한 실시예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예로써, 카멜리드 종, 이를 테면, 라마로부터 유도된 가변적 영역)과 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 실시예에서, 키메라 항체는 “클래스 전환된(class switched)”항체로써, 부모 항체의 것과는 다른 클래스 또는 하위클래스로 변화된 것이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다.

일부 구체예들에서, 키메라 항체는 인간화된 항체다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간에 대한 면역원성이 감소되도록 인간화되지만, 부모계 비-인간 항체의 특이성 및 친화력은 유지된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 가변적 도메인을 포함하는데, 이때 HVRs, 가령, CDRs, (또는 이의 부분들)는 비-인간 항체로부터 유도되고, FRs (또는 이의 부분들)은 인간 항체 서열로부터 유도된다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 불변 영역의 최소한 일부분을 또한 포함할 것이다. 일부 구체예들에 있어서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예로써, HVR 잔기가 유도된 항체)의 대응 잔기로 대체되어, 예로써, 항체 특이성 또는 친화력이 복원 또는 개선된다.

인간화된 항체 및 이를 만드는 방법은 가령, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토하고, 추가로, 가령, Riechmann 외, Nature 332:323-329 (1988); Queen 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 번호. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 외, Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 접합 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (“재포장(resurfacing)”설명); Dall'Acqua 외, Methods 36:43-60 (2005) (“FR 셔플링” 설명); 그리고 Osbourn 외, Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka 외, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 “유도된(guided) 선별” 설명)에서도 기술된다.

인간화에 이용되는 인간 틀-구조 영역은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: "베스트-핏(best-fit)" 방법을 이용하여 선택된 틀-구조 영역 (가령, J. Immunol. 151:2296 (1993) 참고); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위집단의 인간 항체의 콘센수스 서열로부터 유도된 틀-구조 영역 (가령, Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 그리고 Presta 외, J. Immunol. , 151:2623 (1993) 참고); 인간 성숙 (체세포적으로 성숙된) 틀-구조 영역 또는 인간 생식계 틀-구조 영역 (가령, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참고); 그리고 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유도된 틀-구조 영역 (가령, Baca 외, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 외, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참고).

일부 구체예들에서, sdAbs는 변형되는데, 이를 테면, 항원에 대한 도메인의 고유의 친화력 감소없이 인간화되고, 한편 이질성 종에 대한 이의 면역원성은 감소된다. 예를 들면, 라마 항체의 항체 가변 도메인 (V_HH)의 아미노산 잔기들이 결정될 수 있고, 카멜리드 아미노산, 예를 들면, 프레임워크 영역 안의 하나 또는 그 이상은 당해 폴리펩티드가 이의 전형적인 성질의 상실 없이, 인간 콘센수스 서열에서 발견되는 것과 같이, 이들의 인간 대응부에 의해 대체되며, 즉 상기 인간화는 생성 폴리펩티드의 항원 결합 수용력에 유의적으로 영향을 주지 않는다. 카멜리드 단일-도메인 항체의 인간화는 단일 폴리펩티드 쇄 안에 제한된 양의 아미노산의 도입 및 돌연변이유발을 요구한다. 즉, 두 쇄, 중쇄 및 경쇄에서 아미노산 도입 및 이들 두 쇄의 어셈블리의 보존을 요구하는 scFv, Fab', (Fab')2 및 IgG의 인간화와 대조적이다.

V_HH 도메인을 포함하는 단일-도메인 항체는 인간-유사 서열을 갖도록 인간화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 이용된 V_HH 도메인의 FR 영역은 인간 VH 프레임워크 영역에 대하여 최소한 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 아미노산 서열 상동성중 임의의 하나를 포함한다. 인간화된 V_HH 도메인의 하나의 예시적인 클래스는 V_HHs가 위치 45에서 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민으로 구성된 군에서 선택된 아미노산을 휴대하고, 이를 테면, 예를 들면, Kabat 번호매김에 따라 L45 및 위치 103에 트립토판을 휴대하는 것을 특징으로 한다. 이와 같이, 이 클래스에 속하는 폴리펩티드는 인간 VH 프레임워크 영역에 대하여 높은 아미노산 서열 상동성을 보이며, 전술한 폴리펩티드는 원치 않는 면역 반응의 예상 없이, 그리고 추가 인간화의 부담없이, 인간에게 직접적으로 투여될 것이다.

인간화된 카멜리드 단일-도메인 항체의 또다른 예시적인 클래스는 WO 03/035694에 기술되며, 원래 인간의 통상적인 항체 또는 다른 종에서 전형적으로 발견되는 소수성 FR2 잔기를 함유하지만, 이중-쇄 항체의 V_H에 존재하는 보존된 트립토판 잔기를 대체하는 위치 103에서 하전된 아르기닌 잔기에 의해 이들의 친수성 상실을 보상한다. 이와 같이, 이들 두 클래스에 속하는 펩티드는 인간 V_H 프레임워크 영역에 대하여 높은 아미노산 서열 상동성을 보이며, 전술한 펩티드는 원치 않는 면역 반응의 예상 없이, 그리고 추가 인간화의 부담없이, 인간에게 직접적으로 투여될 것이다.

인간 항체

일부 구체예들에서, 본원에서 제공된 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 인간 항체다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 기술된다. 온전하게 인간 단일-도메인 항체를 생산할 수 있는 이식유전자를 가진 마우스 또는 렛은 당분야에 공지되어 있다. 가령, US20090307787A1, U.S. 특허 번호. 8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, 및 WO2004049794 참고.

예를 들면, 인간 항체는 항원 공격에 대하여 손상되지 않은 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 손상되지 않은 항체를 만들도록 변형된 이식유전자를 가진 동물에게 면역원을 투여하여 만들 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로 내인성 면역 글로불린 좌를 대체하거나, 또는 염색체 외적으로 존재하거나 무작위로 동물의 염색체에 통합된 인간 면역 글로불린 좌 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 이식유전자를 가진 마우스에서 내인성 면역 글로불린 유전자 좌는 일반적으로 불활성화되었다. 이식유전자를 가진 동물로부터 인간 항체를 획득하는 방법에 대한 검토는 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)을 참고한다. 가령, U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584는 XENOMOUSE^TM 기술을 기재하고; U.S. 특허 번호 5,770,429는 HuMab® 기술을 기재하고; U.S. 특허 번호 7,041,870는 K-M MOUSE®기술을 기재하고, U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900은 VelociMouse® 기술을 기술한다). 그러한 동물에 의해 생성된 손상되지 않은 항체로부터 인간 가변 영역은 예컨데, 상이한 인간 불변 영역과 결합시킴으로써 추가로 변형 될 수 있다.

인간 항체는 하이브리도마-기반 방법에 의해 또한 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종(heteromyeloma) 세포주들이 기술되어 왔다. (가령, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 그리고 Boerner 외, J. Immunol, 147: 86 (1991) 참고). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체는 Li 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 또한 기술된다. 추가 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포 계통에서 단클론 인간 IgM 항체를 생산하는 것을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마 설명)에 기술된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 또한 기술된다.

인간 항체는 인간-유래 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 그 다음 원하는 인간 불변 도메인에 복합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하는 기술은 하기에서 기술하고 있다.

특정 항원 또는 표적을 지향하는 V_HH 서열을 획득하는 한 가지 기술은 중쇄 항체를 발현시킬 수 있는 이식유전자를 가진 포유를 적절하게 면역화시키고 (즉, 전술한 항원 또는 표적을 지향하는 면역 반응 및/또는 중쇄 항체를 생성시키기 위하여), 전술한 V_HH 서열을 함유하는 (인코딩하는 핵산 서열) 전술한 이식유전자를 가진 포유류에서 적절한 생물학적 샘플 (이를 테면, 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 B-세포의 샘플)을 구하고, 그 다음 전술한 샘플에서 출발하여 전술한 항원 또는 표적을 지향하는 V_HH 서열을, 그 자체로 알려진 적절한 기술 (이를 테면, 본원에서 기술하는 방법중 임의의 것, 또는 하이브리도마 기술)을 사용하여 만드는 것과 관련된다. 예를 들면, 이와 같은 목적을 위하여, WO 02/085945, WO 04/049794 및 WO 06/008548 및 Janssens 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Oct. 10; 103(41):15130-5에서 기술된 상기 중쇄 항체-발현시키는 마우스 그리고 추가 방법 및 기술이 이용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 중쇄 항체를 발현시키는 마우스는 임의의 적합한 (단일) 가변 도메인, 이를 테면, 자연 원천 (가령, 인간 (단일) 가변 도메인, 카멜리드 (단일) 가변 도메인 또는 상어 (단일) 가변 도메인)으로부터의 (단일) 가변 도메인, 뿐만 아니라 예를 들면, 합성 또는 반-합성 (단일) 가변 도메인을 갖는 중쇄 항체를 발현시킬 수 있다.

라이브러리-유래된 항체

본 출원의 항체는 원하는 활성 또는 작용을 가진 항체에 대하여 복합 라이브러리 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 예를 들면, 파아지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 원하는 결합 특성을 가진 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 가령, Hoogenboom 외 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되며, 그리고 가령, McCafferty 외, Nature 348:552-554; Clackson 외, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 외, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 외, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee 외, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 그리고 Lee 외, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에서 추가 기술된다. 단일-도메인 항체 라이브러리를 작제하는 방법들은 예를 들면, U.S. 특허 번호 7371849에서 기술되며, 이를 참고한다.

특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레파토리는 중합효소 쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클론되고, 그 다음 파아지 라이브러리에 무작위로 재복합되고, 그 다음 Winter 외. Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이, 항원-결합 파아지에 대하여 스크리닝될 수 있다. 파아지는 전형적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편의 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 원천으로부터 라이브러리는 하이브리도마의 구축 요구없이 면역원에 대한 고-친화력 항체를 제공한다. 대안으로, 나이브 레퍼토리가 클론되어 (가령, 인간으로부터) Griffiths 외. EMBO J, 12: 725-734 (1993)에서 설명된 바와 같이 임의의 면역화없이 광범위의 비-자가 및 자가 항원에 대한 항체의 단일 원천을 제공할 수 있다. 끝으로, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에서 기술된 바와 같이, 순수 라이브러리는 줄기 세포로부터 재배치되지 않은 V-유전자 단편을 클로닝하고, 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고, 시험 관내에서 재배열을 수행하기 위하여 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여, 합성에 의해 만들어 질 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 설명하는 특허 공개는 예를 들면: US 특허 번호 5,750,373, 및 US 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360를 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편들은 본원의 인간 항체 또는 인간 항체 단편들로 간주된다.

생물학적 활성

본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티의 생물학적 활성은 최대 억제성 농도-절반(IC₅₀)을 측정함으로써 결정될 수 있는데, 이것은 특이적 생물학적 또는 생화학적 기능(이를 테면, PD-L1과 이의 수용체 PD-1 사이의 결합 억제)을 억제함에 있어서 물질(이를 테면, 항체)의 효과 척도이다. 예를 들면, IC₅₀ 은 시험관내에서 PD-L1 생물활성의 50%를 중화시키는데 요구되는 항-PD-L1 sdAb의 효과적인 농도를 지시하는데 이용된다. IC₅₀은 작용제 약물 또는 다른 물질 (이를 테면, 항체)의 EC₅₀과 필적될 수 있다. EC₅₀은 생체내 최대 효과의 50%를 얻는데 요구되는 혈장 농도를 또한 나타낸다. IC₅₀ 또는 EC₅₀은 당분야에 공지된 분석, 예를 들면, 생분 분석, 이를 테면, FACS 분석에 의한 리간드 결합 억제 (경쟁 결합 분석), 세포 기반 사이토킨 방출 분석, 또는 증폭된 발광성 근접성 동질성 분석 (AlphaLISA)에 의해 측정될 수 있다.

예를 들면, 리간드 결합의 차단은 유동 세포분석 (또한 실시예 1 참고)을 이용하여 연구될 수 있다. 인간 PD-L1을 발현시키는 CHO 세포는 흡착 배양 플라스크로부터 해리될 수 있고, 테스트용 다양한 농도의 항-PD-L1 sdAb 및 일정한 농도의 라벨된-PD-1 단백질 (이를 테면, 바이오틴-라벨된 hPD-1/Fc 단백질)과 혼합될 수 있다. 항-PD-L1 항체 양성 대조군, 이를 테면, Tecentriq®이 이용될 수 있다. 상기 혼합물을 실온에서 30 분 동안 평형화시키고, FACS 완충제 (1% BSA를 함유하는 PBS)로 3 회 세척하였다. 그 다음, 일정한 농도의 라벨된 PD-1 단백질 (이를 테면, PE/Cy5 스트렙타아비딘 제 2 항체)를 특이적으로 인지하는 항체가 추가되고, 실온에서 15분 동안 항온처리된다. 세포는 FACS 완충제로 세척되고, 유동 세포분석에 의해 분석된다. IC₅₀을 계산하기 위해 비-선형 회귀를 사용하여 Prism (GraphPad Software, San Diego, CA)으로 데이터를 분석할 수 있다. 경쟁 분석의 결과는 라벨 PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용을 억제하는데 항-PD-L1 sdAbs의 능력을 입증할 것이다

항-PD-L1 sdAb 모이어티의 생물학적 활성은 사이토킨 방출에 대한 PD-L1-기반의 차단 분석 (또한 실시예 1 참고)에 의해 또한 테스트될 수 있다. PD-1 신호전달은 전형적으로 세포 증식보다 시토카인 생성에 더 영향을 주는데, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 생성에 유의적으로 효과가 있다. PD-1 매개된 억제 신호는 TCR 신호전달의 강도에 또한 의존적인데, 또한 낮은 수준의 TCR 자극에서 더 큰 억제가 있다. 이러한 감소는 CD28을 통한 공동자극 (Freeman 외, J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)) 또는 IL-2의 존재 (Carter 외, Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002))에 의해 극복될 수 있다. 추가적으로, 몇몇 연구는 PD-1과 독립적인 PD-L1 또는 PD-L2에 대한 수용체를 보여준다. B7.1은 PD-L1의 결합 짝으로 이미 확인되었다 (Butte 외, Immunity 27: 111-22 (2007)). 화학적 가교 연구는 PD-L1 및 B7.1이 그들의 IgV-유사 도메인을 통해 상호 작용할 수 있음을 시사한다. B7.1:PD-L1 상호작용은 T 세포에게 억제성 신호를 유도할 수 있다. 그 결과, PD-1, B7.1 또는 이 둘 모두와의 상호작용으로부터 PD-L1의 차단하고, 이로 인하여 PD-L1이T-세포 및 다른 항원 제공 세포로의 음성적 공동-자극 신호를 보내는 것을 방해하는 것을 포함하는 PD-L1을 통한 신호전달의 길항작용은 감염에 대한 반응 (가령, 급성 및 만성)에서 면역성 및 종양 면역성을 강화시킬 것이다. 또한, 본 발명의 항-PD-L1 항체는 PD-1:PD-L1 신호전달의 다른 성분들의 길항제, 예를 들면, 항-PD-1 및 항-PD-L2 항체의 길항체와 조합될 수 있다. 따라서, 항-PD-L1 항체에 의한 PD-L1 경로의 차단은 T 세포 증식, IFN-γ 방출, 또는 IL-2 분비를 모니터하는 다양한 생물분석을 이용하여 연구될 수 있다.

예를 들면, PD-1 작동체 세포 (인간 PD-1 단백질 및 NFAT 루시페라제로 안정적으로 형질감염된 Jurkat 세포) 및 CHO-K1/인간 CD274 (인간 CD80을 안정적으로 발현시키는 CHO-K1)는 웰 안에서 혼합된다. 항-PD-L1 sdAbs는 상이한 농도로 각 웰에 추가된다. 배경 대조군으로 항체를 이용할 수 없다. 음성 대조군 (이를 테면, 인간 IgG1) 및 양성 대조군 (이를 테면, Tecentriq®을 이용할 수 있다. 37℃/5% CO₂ 배양기에서 24-시간 항온처리 후, IL-2 분비 측정 (Cisbio)을 위하여 각 테스트 웰로부터 배지를 취한다. 각 테스트 항체의 EC₅₀값이 측정되고, 이는 Jurkat 세포 상에서 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용 차단, 그리고 따라서 T-세포 IL-2 생산 억제에 있어서 테스트 항-PD-L1 sdAb의 능력을 반영한다.

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 상기 PD-L1　리간드에 의해 형질도입된 신호를 차단 또는 길항한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 PD-L1이 PD-1과의 상호작용을 억제하기 위하여, PD-L1 상에 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 조건하에 PD-L1이 이의 수용체 PD-1에 결합하는 것을 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9% 중 최소한 임의의 하나로 감소시킬 수 있고, 이때 PD-L1　리간드 결합 부위에 항체 복합 부위 비율은 1:1 이상이며, 항체의 농도는 10^-8　M이상이다.

일부 구체예들에서, 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 아미노산 치환은 CDR1 및/또는 CDR2에 있다.

따라서, 일부 구체예들에서, 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

일부 구체예들에서, 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

본원에 언급된 CDRs의 서열은 표 15에 제공된다.

CDRs는 다수의 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 생성하기 위하여, 여러 쌍의 조합으로 조합될 수 있다.

상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 하나 또는 그 이상의 FR 서열에서 하나 또는 그 이상의 “특징 잔기”를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 다음중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인을 포함할 수 있다: a-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I, 및 V로 구성된 군에서 선택되고(이를 테면, Y 또는 이를 테면, F); a-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, G, Q, R, S, 및 L로 구성된 군에서 선택되고 (이를 테면, G, E, 또는 Q); a-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 L, R 및 C로 구성된 군에서 선택되고 (이를 테면, L 또는 R); a-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 G, W, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고 (이를 테면, W 또는 R, 또는 이를 테면, W); 그리고 a-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이고; 또는 b-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I, 및 V로 구성된 군에서 선택되고 (이를 테면, Y 또는 이를 테면, F); b-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 E 및 Q로 구성된 군에서 선택되고; b-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 R; b-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 G, W, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고 (이를 테면, W); 그리고 b-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 구성된 군에서 선택되고 (이를 테면, Q); 이때 상기 아미노산 위치는 Kabat 번호매김에 따른다. Kabat 번호매김에 따른 아미노산 위치 37, 44, 45, 103 및 108에서 "특정 잔기"는 자연 V_HH 서열의 항-PD-L1 sdAb 모이어티에 적용되며, 인간화동안 치환될 수 있다. 예를 들면, Kabat 번호매김에 따른 아미노산 위치 108의 Q는 임의선택적으로 인간화되어 L이 될 수 있다. 다른 인간화된 치환은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 잠재적으로 유용한 인간화 치환은 자연적으로 발생되는V_HH의 FR 서열을 하나 또는 그 이상의 밀접하게 관련된 인간 V_H의 대응하는 FR 서열과 비교하고, 그 다음 당분야에 공지된 방법(본원에서 또한 기술됨)을 이용하여 전술한 V_HH안으로 이러한 잠재적으로 유용한 인간화 치환중 하나 또는 그 이상을 도입함으로써 결정될 수 있다. 생성된 인간화된 V_HH서열은 이들의 PD-L1 결합 친화력, 안정성, 용이한 발현 및 발현 수준, 및/또는 다른 원하는 성질에 대하여 테스트될 수 있다. 가능한 잔기 치환은 항체 V_H 도메인으로부터 유래될 수 있고, 이때 VH/VL 계면은 하나 또는 그 이상의 고도로 하전된 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 부분적으로 또는 온전하게 인간화된 것일 수 있다. 바람직하게는, 생성된 인간화된 항-PD-L1 sdAb는 본원에서 기술된 K_d, K_on, K_off로 PD-L1에 결합한다.

일부 구체예들에서, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:351-400중 임의의 하나에 대하여 최소한 약 80% (이를 테면, 최소한 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%중 임의의) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 제공한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 V_HH 도메인에서 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 제공한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 CDRs, 이를 테면, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 CDR1, 및/또는 CDR2, 및/또는 CDR3에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 FRs, 이를 테면, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 FR1, 및/또는 FR2, 및/또는 FR3, 및/또는 FR4에 있다.

일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티중 임의의 하나와 경쟁적으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티 (이후 “경쟁성 항-PD-L1 sdAb 모이어티” 또는 “경쟁성 항-PD-L1 sdAb”)를 제공한다. 일부 구체예들에서, 경쟁적 결합은 ELISA 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 경쟁적으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 제공한다. 또다른 예로써, 일부 구체예들에서, 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 경쟁적으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 제공한다. 일부 구체예들에서,일부 구체예들에서, 상기 경쟁성 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다. 일부 구체예들에서, 상기 경쟁성 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 구조체

항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 구조체는 임의의 가능한 포멧일 수 있다.

일부 구체예들에서, 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 구조체는 추가 폴리펩티드 서열, 이를 테면, 면역글로블린의 하나 또는 그 이상의 항체 모이어티, 또는 Fc 단편을 더 포함할 수 있다. 이러한 추가 폴리펩티드 서열는 sdAb의 (생물학적) 성질을 변화시키거나 또는 변화시키지 않을 수 있거나, 그렇지 않으면 영향을 줄 수 있고, 본원에서 기술된 sdAb에게 기능을 더 할 수 있거나, 또는 더 하지 않을 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 추가 폴리펩티드 서열은 하나 또는 그 이상의 원하는 성질 또는 기능성을 본 발명의 sdAb에 부여한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 본원에서 기술된 하나 또는 그 이상의 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.

일부 구체예들에서, 상기 추가 폴리펩티드 서열은 제 2 항원을 특이적으로 인지하는 제 2 항체 모이어티 (이를 테면, sdAb, scFv, 전장 항체)일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항원은 PD-L1이 아니다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항체 모이어티는 PD-L1상에 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb와 동일한 에피토프를 특이적으로 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항체 모이어티는 PD-L1상에 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb와 상이한 에피토프를 특이적으로 인지한다.

일부 구체예들에서, 상기 추가 폴리펩티드 서열은 항체 구조체 반감기, 용해도 또는 흡수를 증가시킬 수 있고, 면역원성 또는 독성을 감소시킬 수 있고, 바람직하지 않은 부작용을 제거 또는 약화시킬 수 있으며, 및/또는 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 자체와 비교하였을 때, 본 발명의 항-PD-L1 구조체에 다른 유리한 성질을 부여하거나 및/또는 원하지 않는 성질을 감소시킨다. 이러한 추가 폴리펩티드 서열의 일부 비-제한적인 예는 혈청 단백질, 이를 테면, 인간 혈청 알부민 (예를 들면, WO 00/27435 참고) 또는 합텐 분자 (예를 들면, 순환 항체에 의해 인지되는 합텐, 예를 들면, WO 98/22141 참고)이다. 면역글로블린의 단편들 (이를 테면, V_H도메인)을 혈청 알부민 또는 이의 단편들에 연계시키면 항체 반감기가 증가될 수 있음을 보여주었다(가령, WO 00/27435 및 WO 01/077137 참고). 따라서, 일부 구체예들에서, 본 발명의 항-PD-L1 구조체는 적합한 링커 (이를 테면, 펩티드 링커)를 통하여 혈청 알부민 (또는 적합한 이의 단편)에 연계된 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 혈청 알부민 도메인 III을 최소한 포함하는 혈청 알부민의 단편에 연계될 수 있다 (PCT/EP2007/002817 참고).

오로지-중쇄 항체 (HCAb)

일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 임의선택적으로 링커 서열을 통하여 하나 또는 그 이상의 (바람직하게는 인간) C_H2 및/또는 C_H3 도메인에 연계되어 이의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다.

따라서 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 면역글로블린, 이를 테면, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 Fc 단편에 융합된 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 HCAb (이후 “항-PD-L1 HCAb”로 지칭됨)이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 HCAb는 IgG, 이를 테면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4중 임의의 하나의 Fc 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 인간 Fc이다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 인간 IgG1 Fc이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 HCAb는 단량체성이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 HCAb는 이량체성이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 상기 Fc 단편은 펩티드 링커에 의해 임의선택적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 돌연변이된 인간 IgG1 힌지 (서열 번호: 445)이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 443 (GGGGSGGGS)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 444 (GGGGSGGGGSGGGGS)의 아미노산 서열을 포함한다.

따라서 일부 구체예들에서, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 HCAb이 제공되는데, 이때 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3을 포함하고, 이때 sdAb 모이어티는 면역글로블린의 Fc 단편에 융합된다. 일부 구체예들에서, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 HCAb를 제공하며, 이때 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하며, 이때 sdAb 모이어티는 면역글로블린의 Fc 단편에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 아미노산 치환은 CDR1 및/또는 CDR2에 있다. 일부 구체예들에서, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 HCAb를 제공하며, 이때 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하며, 이때 sdAb 모이어티는 면역글로블린의 Fc 단편에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 다음중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인을 포함한다: a-1) 위치 44의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, G, Q, R, S, 및 L로 구성된 군에서 선택되며 (이를 테면, G, E, 또는 Q); a-2) 위치 45의 아미노산 잔기는 L, R 및 C로 구성된 군에서 선택되며 (이를 테면, L 또는 R); a-3) 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 구성된 군에서 선택되며(이를 테면, W 또는 R, 또는 이를 테면, W); 그리고 a-4) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며; b-1) 위치 44의 아미노산 잔기는 E 및 Q로 구성된 군에서 선택되며; b-2) 위치 45의 아미노산 잔기는 R; b-3) 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 구성된 군에서 선택되며 (이를 테면, W); 그리고 b-4) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 구성된 군에서 선택되며 (이를 테면, Q); 이때 상기 아미노산 위치는 Kabat 번호매김에 따르며, 이때 위치 108이 Q일 때, 위치 108은 임의선택적으로 L로 인간화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 인간 IgG1 Fc이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 HCAb는 단량체성이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 HCAb는 이량체성이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 상기 Fc 단편은 펩티드 링커에 의해 임의선택적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 443, 서열 번호: 444, 또는 서열 번호: 445의 아미노산 서열이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

일부 구체예들에서, 서열 번호: 401-440중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 HCAb가 제공된다.

일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-PD-L1 HCAb중 임의의 하나와 경쟁적으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 HCAb (이하 “경쟁성 항-PD-L1 HCAb”로 지칭됨)를 또한 제공한다. 경쟁적 결합은 ELISA 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 서열 번호: 401-440중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 HCAb와 경쟁적으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 HCAb를 제공한다. 또다른 예로써, 일부 구체예들에서, 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-PD-L1 HCAb와 경쟁적으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 HCAb를 제공한다. 일부 구체예들에서,일부 구체예들에서, 상기 경쟁성 항-PD-L1 HCAb와 PD-L1 간의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다. 일부 구체예들에서, 상기 경쟁성 항-PD-L1 HCAb는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

다가 및/또는 다중특이성 항체

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 하나 또는 그 이상의 다른 항체 모이어티 (이를 테면, 또다른 항원을 특이적으로 인지하는 항체 모이어티)에 융합된 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함한다. 하나 또는 그 이상의 다른 항체 모이어티는 항체 또는 항체 단편 포멧, 이를 테면, 다중특이성 sdAb (이를 테면, 이중특이적 sdAb), 전장의 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 또는 sdAb중 임의의 하나일 수 있다. 특정 항체 단편들에 관한 검토는 Hudson 외 Nat. Med. 9:129-134 (2003)을 참고. scFv 단편들에 관한 검토는 가령,

, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994) 참고; WO 93/16185; 그리고 U.S. 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458 또한 참고. 셀비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고, 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편들에 대한 논의는 U.S. 특허 번호 5,869,046을 참고한다. 다중특이성 항체의 검토는 Weidle 외, Cancer Genomics Proteomics, 10(1):1-18, 2013; Geering and Fussenegger, Trends Biotechnol., 33(2):65-79, 2015; Stamova 외, Antibodies, 1(2):172-198, 2012를 참고한다. 디아바디는 이가(bivalent) 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편들이다. 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 참고. 트리아바디(Triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies) 또한 Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다. 항체 단편은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이에는 손상되지 않은 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 재조합 숙주 세포(가령, 대장균(E. coli) 또는 파아지)에 의한 생산된 항체를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 다른 항체 모이어티는 항체의 연상(reminiscent) 항원-결합 도메인을 포함하는 작은 공작된 단백질인, 항체 모방체다(Geering and Fussenegger, Trends Biotechnol., 33(2):65-79, 2015). 이들 분자는 기존 간 스캐폴드 단백질로부터 유래되며, 단일 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 기술된 항-PD-L1 구조체 안에 포함될 수 있는 예시적인 항체 모방체는 다음과 같을 수 있지만, 이에 국한되지 않는다: 기획된(designed) 안키린 반복 단백질 (DARPin; N-및 C-말단 Cap 도메인의 측면 3-5개의 온전하게 합성 안키린 반복을 포함), 항원항체결합력 다량체 (아비머(avimer); 다중 A 도메인을 포함하는 고-친화력 단백질, 각 도메인은 표적에 대해 낮은 친화력을 갖는다), 또는 안티칼린 (리포칼린의 스캐폴드 기반, 4개의 접근가능한 루프가 있고, 각 서열은 무작위화될 수 있다).

다중특이적 항체를 만드는 기술은 상이한 특이성을 가진 2개의 면역글로블린 중쇄-경쇄의 재조합 공동-발현을 포함하나, 이에 국한되지 않는다(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker 외, EMBO J. 10: 3655 (1991)), 및 “노브-인-홀(knob-in-hole)”공작 (가령, U.S. 특허 번호 5,731,168). 다중-특이적 항체는 항체 Fc-이형이량체 분자를 만드는 정전기적 스티어링 효과를 조작(WO　2009/089004A1); 2개 또는 그 이상의 항체 또는 단편들의 가교(가령, US 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan 외, Science, 229: 81 (1985) 참고); 이중-특이적 항체를 만들기 위하여 류신 지퍼 이용 (가령, Kostelny 외, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 참고); 이중특이적 항체 단편들을 만들기 위하여 "디아바디" 기술이용 (가령, Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 그리고 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 이용 (가령, Gruber 외, J. Immunol., 152:5368 (1994)); 그리고 가령, Tutt 외 J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 기술된 바와 같이 삼중특이적 항체를 준비; 그리고 텐덤 단일-도메인 항체를 포함하는 폴리펩티드의 창조 (가령, U.S. 특허 출원 번호 20110028695; 그리고 Conrath 외 J. Biol. Chem., 2001; 276(10):7346-50 참고)에 의해 또한 만들어질 수 있다. "Octopus 항체"를 포함하는 3개 또는 그 이상의 기능성 항원 결합 부위를 가진 조작된 항체 또한 본 명세서에 포함된다(가령, US 2006/0025576A1 참고).

펩티드 링커

일부 구체예들에서, 항-PD-L1 구조체 안에 2개 또는 그 이상의 항체 모이어티는 임의선택적으로 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 항-PD-L1 구조체에 이용된 펩티드 링커(들)의 길이, 연성도 및/또는 다른 성질들은 하나 또는 그 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화력, 특이성 또는 항원항체결합력을 포함하나, 이에 국한되지 않는 성질에 어느 정도 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 2개의 인접 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 하기 위해, 더 긴 펩티드 링커가 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 연성(flexible) 잔기 (이를 테면, 글리신 및 세린)를 포함하여, 인접 도메인은 서로에 대하여 상대적으로 움직임이 자유롭다. 예를 들면, 글리신-세린 더블릿(doublet)이 적합한 펩티드 링커일 수 있다.

상기 펩티드 링커는 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 그 이상의 아미노산 길이중 임의의 것이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 많아야 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 또는 이보다 적은 아미노산 길이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커의 길이는 약 1개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 25개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 30개 아미노산 길이, 약 30개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 50개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 1개 아미노산 내지 약 100개 아미노산중 임의의 것일수 있다.

상기 펩티드 링커는 자연적으로 발생되는 서열, 또는 비-자연적으로 발생되는 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 오로지-중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열이 링커로 이용될 수 있다. 예를 들면, WO1996/34103 참고. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 돌연변이된 인간 IgG1 힌지 (서열 번호: 445)이다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 연성 링커다. 예시적인 연성 링커는 글리신 중합체 (G)_n, 글리신-세린 중합체 (예를 들면, (GS)_n, (GSGGS)_n, (GGGS)_n, 및 (GGGGS)_n포함, 이때 n은 최소한 1의 정수임) 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당분야에 공지된 다른 연성 링커를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 GGGGSGGGS (서열 번호: 443)의 상기 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 444 (GGGGSGGGGSGGGGS)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 445 (EPKSSDKTHTSPPSP)의 상기 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 항-PD-L1 sdAb 모이어티 및 하나 또는 그 이상의 다른 항체 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 구조체는 단일특이성이다. 일부 구체예들에서, 항-PD-L1 sdAb 모이어티 및 하나 또는 그 이상의 다른 항체 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 구조체는 다중특이성 (이를 테면, 이중특이적)이다. 다중특이성 분자는 최소한 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 분자다 (가령, 이중특이적 항체는 2개의 항원 또는 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는다). 2 이상의 결합가(valencies) 및/또는 특이성을 갖는 다중특이성 분자가 또한 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체가 준비될 수 있다. Tutt 외 J. Immunol. 147: 60 (1991). 당업자는 본원에 기재된 개별 다중특이적 분자의 적절한 특징을 선택하여, 서로 복합하여 본 발명의 다중-특이적-항-PD-L1 분자를 형성할 수 있음을 이해해야 한다.

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 다가(multivalent)이지만 단일특이성으로, 즉, 상기 항-PD-L1 구조체는 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티와, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 동일한 PD-L1 에피토프를 특이적으로 인지하는 최소한 제 2 항체 모이어티를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 동일한 PD-L1 에피토프를 특이적으로 인지하는 하나 또는 그 이상의 항체 모이어티는 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 동일한 CDRs 및/또는 동일한 V_HH 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항-PD-L1 구조체는 2개 또는 그 이상의 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함할 수 있고, 이때 상기 2개 또는 그 이상의 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 동일하다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 펩티드 링커(들)에 의해 임의선택적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 443-445중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 다가(multivalent) 및 다중특이성으로써, 즉, 상기 항-PD-L1 구조체는 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티, 그리고 PD-L1이외의 제 2 항원, 또는 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티가 인지하는 것과 상이한 PD-L1 에피토프를 특이적으로 인지하는 제 2 항체 모이어티를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항체 모이어티는 sdAb이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 항체 모이어티는 특이적으로 인간 혈청 알부민 (HSA)을 인지한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 상기 제 2 항체 모이어티의 N 말단 또는 C 말단에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 삼가(trivalent) 및 이중특이적이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 본원에서 기술된 2개의 항-PD-L1 sdAbs, 그리고 제 2 항체 모이어티 (이를 테면, 항-HSA sdAb)를 포함하는데, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 상기 2개의 항-PD-L1 sdAbs 사이에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 모이어티는 펩티드 링커(들)에 의해 임의선택적으로 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 443-445중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

PD-L1을 특이적으로 인지하는 2개 또는 그 이상의 sdAb 모이어티를 포함하는 단일특이성 또는 다중특이성 항-PD-L1 구조체는 본원에서 기술된 단일 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 비교하였을 때, 증가된 항원항체결합력을 가질 수 있다.

전장 항체에 융합된 sdAb를 포함하는 이중특이적 항체

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 제 2 항체 모이어티에 융합된 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하고, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 전장의 항체 (이를 테면, 항-TIGIT 전장 항체)이다. PD-L1 및 TIGIT에 대항하여 이중-특이성을 포함하는 구조체는 이하에서 “항-PD-L1/TIGIT 항체”, “항-PD-L1/TIGIT 구조체”, 또는 “PD-L1×TIGIT 항체”로 지칭된다.

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 제 2 항체 모이어티에 융합된 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하고, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 전장의 항체 (이를 테면, 항-TIM-3 전장 항체)이다. PD-L1 및 TIM-3에 대항하여 이중-특이성을 포함하는 구조체는 이하에서 “항-PD-L1/TIM-3 항체”, “항-PD-L1/TIM-3 구조체”, 또는 “PD-L1×TIM-3 항체”로 지칭된다.

일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체는 제 2 항체 모이어티에 융합된 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하고, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 전장의 항체 (이를 테면, 항-LAG-3 전장 항체)이다. PD-L1 및 LAG-3에 대항하여 이중-특이성을 포함하는 구조체는 이하에서 “항-PD-L1/LAG-3 항체”, “항-PD-L1/LAG-3 구조체”, 또는 “PD-L1×LAG-3 항체”로 지칭된다.

PD-L1과 유사하게, TIGIT, TIM-3 및 LAG-3은 억제성 면역 체크포인트(checkpoint) 분자다.

일부 구체예들에서, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티 및 항-TIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 및 항-LAG-3 항체로 구성된 군에서 선택된 전장 항체를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체가 제공되며 이때 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 N-말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 C-말단에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 C-말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 N-말단에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티 및 상기 전장 항체는 임의선택적으로 펩티드 링커에 의해 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 443-445의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

일부 구체예들에서, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티, 그리고 항-TIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 및 항-LAG-3 항체로 구성된 군에서 선택된 전장 항체를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체를 제공하는데 이때 sdAb는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나에 대하여 최소한 약 80% (이를 테면, 최소한 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%중 임의의) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티, 그리고 항-TIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 및 항-LAG-3 항체로 구성된 군에서 선택된 전장 항체를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체가 제공되는데, 이때 sdAb는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인, 또는 V_HH 도메인 안에 최대 약 3개 (이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의) 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 CDRs, 이를 테면, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 CDR1, 및/또는 CDR2, 및/또는 CDR3에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 또는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 FRs, 이를 테면, 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 FR1, 및/또는 FR2, 및/또는 FR3, 및/또는 FR4에 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 351-400의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인를 포함하는 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 CDRs 및 FRs 모두에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티, 그리고 항-TIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 및 항-LAG-3 항체로 구성된 군에서 선택된 전장-항체를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체가 제공되는데, 이때 sdAb는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 N-말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 C-말단에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 C-말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 N-말단에 융합된다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티 및 상기 전장 항체는 임의선택적으로 펩티드 링커에 의해 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 443-445의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_d는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M (이를 테면, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M)이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

일부 구체예들에서, 본원에서 기술되는 항-PD-L1/TIGIT 구조체들, 항-PD-L1/TIM-3 구조체들 또는 항-PD-L1/LAG-3 구조체들중 임의의 하나와 경쟁적으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 구조체 (이하에서 “경쟁성 항-PD-L1 구조체”로 지칭됨)를 또한 제공한다.

항-PD-L1 항체 변이체

일부 구체예들에서, 본원에서 제시되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 항체를 인코드하는 핵산 서열에 적절한 변형을 도입시키거나, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 이 항체의 아미노산 서열 안에 잔기의 결손 및/또는 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 만일 최종 구조체가 바람직한 특징, 가령, 항원-결합을 보유한다면, 최종 구조체에 결손, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 있을 수 있다.

a) 치환, 삽입, 결손 및 변이체

일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVRs 및 FRs를 포함한다. 보존적 치환은 표 2에서 “선호되는 치환”이란 칸 아래에 나타낸다. 더욱 실질적인 변화는 표 2의 “예시적인 치환" 칸에 제공되며, 아미노산 측쇄 클래스를 참고하여 하기에서 추가 기술된다. 아미노산 치환은 관심대상 항체 안으로 도입될 수 있고, 원하는 활성, 가령, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대하여 산물을 스크리닝할 수 있다.

표 2. 아미노산 치환

원래 잔기	예시적인 치환	선호되는 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu (L)	노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신	Leu

아미노산은 일반적인 측쇄-성질에 따라 그룹화될 수 있다:(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 방향성에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환들은 한 클래스의 멤버를 또다른 클래스로 교환을 수반할 것이다.

치환 변이체의 한 가지 유형은 부모계 항체 (가령, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기의 치환이 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선택된 생성 변이체(들)은 부모계 항체와 비교하여 특정 생물학적 성질 (가령, 증가된 친화력, 감소된 면역원성)의 변형(가령, 개선)을 가질 수 있거나 및/또는 부모계 항체의 특정 생물학적 성질이 실질적으로 유지될 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화력 발달된 항체이며, 이는 가령, 이를 테면, 본원에서 기술된 바와 같은 파아지 디스플레이-기반의 친화력 발달 기술에 의해 통상적으로 만들어질 수 있다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 상기 변이체 항체가 파아지 상에 디스플레이되고, 특정 생물학적 활성 (가령, 결합 친화력)에 대해 스크리닝된다.

예를 들면, 항체 친화력을 개선시키기 위하여 변경 (가령, 치환)은 HVRs에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR에서 "핫스팟(hotspots)", 가령, 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코드되는 잔기에서 만들어질 수 있고(가령, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) 참고), 및/또는 SDRs (a-CDRs), 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화력에 대하여 테스트된다. 제 2 라이브러리를 작제하고, 이를 재선택하는 친화력 발달이 가령, Hoogenboom 외, Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기술되어 있다. 친화력 성숙의 일부 구체예들에 있어서, 다양성은 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자들에 도입된다(가령, 오류-발생(error-prone) PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지향된 돌연변이생성). 그 다음 제 2 라이브러리가 만들어진다. 이어서, 이 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화력을 갖는 임의의 항체 변이체를 동정한다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 포함하는데, 이때 몇 개의 HVR 잔기 (가령, 1회에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 가령, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 동정될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 대개 표적이 된다.

일부 구체예들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결손은 이러한 변경으로 이 항체가 항원에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 HVRs에 발생될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (가령, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 HVRs에 만들어 질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟(hotspots)" 또는 CDRs 밖에 있을 수 있다. 상기에서 제시된 변이체 V_HH의 일부 구체예들에 있어서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산 치환을 함유한다.

돌연변이유발의 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 동정하는데 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에서 설명된 바와 같이, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기 집단 (가령, 하전된 잔기, 이를 테면Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)은 동정되고, 그리고 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 판단하기 위하여 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가령, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 추가 치환이 상기 아미노산 위치에 도입되어, 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정(crystal) 구조는 항체와 항원 간의 접촉 접을 동정한다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로 표적화되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 보유하는지를 판단하기 위하여 이 변이체들이 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 한 개 잔기에서 수백 또는 그 이상의 잔기가 함유된 폴리펩티드 범위, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된 아미노-및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 이 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 이 항체의 N-또는 C-말단을 효소 (가령, ADEPT를 위한) 또는 이 항체의 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 융합을 포함한다.

b) 당화 변이체

일부 구체예들에서, 본 명세서에서 제공된 항-PD-L1 구조체는 이 구조체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체의 당화 부위의 추가 또는 결손은 하나 또는 그 이상의 당화 부위가 만들어지거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편의적으로 실행될 수 있다.

상기 항-PD-L1 구조체가 Fc 영역을 포함할 때, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포들에 의해 만들어지는 고유 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 일반적으로 부착된 분기화된, 바이안테너리 올리고사카라이드를 전형적으로 포함한다. 가령, Wright 외 TIBTECH 15:26-32 (1997) 참고. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예로써, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 상기 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기(stem)"에 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원의 항-PD-L1 구조체의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 성질들을 가진 항체 변이체들을 만들기 위하여 만들어질 수 있다.

일부 구체예들에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 이러한 항체의 퓨코스 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40% 일 수 있다. 예를 들면 WO　2008/077546에서 기술되어 있는 MALDI-TOF 질량 분광분석에 의해 측정하였을 때, 퓨코스의 양은 Asn 297에 부착된 모든 당구조(가령, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)의 합과 비교하여 Asn297에서 슈가 쇄 안에 평균 퓨코스 양을 산출함으로써, 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 번호매김)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하며; 그러나, Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류 약 ± 3의 아미노산, 가령, 위치 294와 300에 또한 위치할 수 있다. 이러한 퓨코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 보유할 수 있다. 가령, US 특허 공개 번호. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) 참고. “탈퓨코실화된” 또는 “퓨코스-결핍” 항체 변이체에 관련된 공개 예로는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki 외 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 외 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈퓨코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 퓨코실화 결핍 Lec13 CHO 세포들 (Ripka 외 Arch. Biochem. Biophy. 249:533-545 (1986); US 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 그리고 WO 2004/056312 A1, Adams 외, 특히 실시예11), 그리고 녹아웃 세포주, 이를 테면, 알파-1,6-퓨코실전이효소 유전자 FUT8가 결여된 세포 계통, 녹아웃 CHO 세포들 (가령, Yamane-Ohnuki 외 Biotechnol. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 그리고 WO2003/085107 참고)를 포함한다.

항-PD-L1 구조체 변이체는 양분된(bisected) 올리고사카라이드를 더 보유하고, 가령, 항체의 Fc 영역의 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체들은 가령, WO 2003/011878 (Jean-Mairet 외); US 특허 번호 6,602,684 (Umana 외); 그리고 US 2005/0123546 (Umana 외)에서 기술된다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에서 최소한 1 개의 갈락토스 잔기를 가진, 항체 변이체들이 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체들은 개선된 CDC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체들은 가령, WO 1997/30087 (Patel 외); WO 1998/58964 (Raju, S.); 그리고 WO 1999/22764 (Raju, S.)에서 기술된다.

c) Fc 영역 변이체

일부 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본 발명의 항-PD-L1 구조체의 Fc 영역 안으로 도입되고, 이로 인하여 Fc 영역 변이체가 만들어질 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (가령, 치환)이 포함된 인간 Fc 영역 서열 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

일부 구체예들에서, 본 출원의 개시 내용은 전체 작동체 기능이 아닌 일부만을 보유하는 항-PD-L1 구조체 변이체를 고려하는데, 이들 항-PD-L1 구조체 변이체는 항체의 반감기도 중요하지만, 특정 작동체 기능(가령, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 또는 유해한 용도에 바람직한 후보물질이 될 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 FcγR 결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 중개하는 일차 세포, NK 세포는 오직 FcγRIII만을 발현시키고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위한 시험관내 분석의 비-제한적인 예는 U.S. 특허 번호 5,500,362 (가령, Hellstrom, I. 외 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참고) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참고)에 기술된다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법이 이용될 수 있다(가령, 유동 세포 분석을 위한 ACTI™비-방사능활성 세포독성 분석(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; 그리고 CytoTox 96^®비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI). 이러한 분석에 유용한 작동체 세포들은 주변 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들면, 동물 모델에서 생체에서 평가될 수 있는데, 가령, Clynes 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 설명된다. 이 항체가 C1q에 결합 할 수 없으므로, CDC 활성이 결핍된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 시행될 수 있다. 가령, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참고. 보체 활성화 평가를 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다(예를 들면, Gazzano-Santoro 외, J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외, Blood 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참고). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정은 당분야에 공지된 방법에 의해 또한 실행될 수 있다(가령, Petkova, S.B. 외, Int'l. Immunol 18(12):1759-1769 (2006) 참고).

감소된 작동체 기능을 가진 항체는 하나 또는 그 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329에 치환을 갖는 것들을 포함한다 (U.S. 특허 번호 6,737,056) 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체가 포함된, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중 2개 또는 그 이상이 치환된 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).

FcRs에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체가 기술된다. (가령, U.S. 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참고).

일부 구체예들에서, 항-PD-L1 구조체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 가령, Fc 영역 (잔기의 EU 번호매김)위치 298, 333, 및/또는 334에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.

일부 구체예들에서, 가령, US 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 외 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 기술된 바와 같이, 상기 Fc 영역에 만들어진 변경으로 C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 변경(즉, 개선되거나 또는 감소되거나)이 초래된다.

일부 구체예들에서, 반감기가 증가되거나 및/또는 신생 Fc 수용체 (FcRn)에 결합이 개선되는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-PD-L1 구조체 (가령, HCAb) 변이체가 제공된다. 증가된 반감기 및 모계 IgGs를 태아에게 전달을 담당하는 신생 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합을 갖는 항체(Guyer 외, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994))는 US2005/0014934A1 (Hinton 외)에 기술된다.　이들 항체는 Fc 영역이 FcRn에 결합하는 것을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기중 하나 또는 그 이상에서 치환을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 가령, 가령, Fc 영역 잔기 434의 치환(US 특허 번호 7,371,826).

Fc 영역 변이체의 또다른 예와 관련하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 번호 5,648,260; U.S. 특허 번호 5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참고.

본원에서 기술된 Fc 변이체중 임의의 것 또는 이의 조합을 포함하는 항-PD-L1 구조체들 (이를 테면, 전장의 항체에 융합된 HCAb 또는 항-PD-L1 sdAb)이 고려된다.

d) 시스테인 공작된 항체 변이체

일부 구체예들에서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기으로 대체된, 시스테인 공된 항-PD-L1 구조체들, 가령, "thioMAbs"를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응활성 티올기는 이 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 이를 테면 하기에서 설명되는 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 다음의 잔기들중 임의의 하나 또는 그 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 중쇄의 A118 (EU 번호매김); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 번호매김). 시스테인 공작된 항-PD-L1 구조체들은 가령, U.S. 특허 번호 7,521,541에서 설명된 바와 같이 만들어질 수 있다.

e) 항체 유도체

일부 구체예들에서, 본원에서 제공된 항-PD-L1 구조체는 당업계에 공지되어 있고, 쉽게 입수할 수 있는 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 부분은 물 가용성 중합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 예로는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다:폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥소레인, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프로일프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공동-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (가령, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인하여 제작에서 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 항체 유도체가 규정된 상태 등에 치료에 사용될 것인지 여부에 관계없이, 개선되는 항체의 특정 특성 또는 기능을 포함하는, 고려사항에 근거하여 결정될 수 있다.

일부 구체예들에서, 방사능에 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항-PD-L1 구조체의 접합체 및 비단백질성 모이어티가 제공된다. 일부 구체예들에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브 (Kam 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))이다. 방사선은 임의의 파장일 수 있으며, 통상적인 세포에 해를 끼치 지 않지만, 그러나 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 가열하는 파장을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

일부 구체예들에서, 본원에서 제공되는 항-PD-L1 구조체(이를 테면, 항-PD-L1 sdAb, 항-PD-L1 HCAb, 항-PD-L1/항CTLA-4 HCAb, 항-PD-L1/TIGIT 이중특이적 항체, 항-PD-L1/TIM-3 이중특이적 항체 또는 항-PD-L1/LAG-3 이중특이적 항체)는 하나 또는 그 이상의 생물학적으로 활성 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편들을 함유하도록 추가 변형될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, “생물활성” 또는 “생물학적으로　활성”란 특이적 기능을 수행하기 위하여 신체내 생물학적 활성을 보인다는 것을 의미한다. 예를 들면, 특정 생물분자 이를 테면, 단백질, DNA, 등과의 조합과 그리고 그런 생물 분자의 활성의 촉진 또는 억제를 의미할 수 있다. 일부 구체예들에서, 생물활성 단백질 또는 이의 단편들은 면역 자극/면역 조절, 막 수송 또는 효소 활성을 갖는다.

일부 구체예들에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 구조체와 융합될 수 있는 생물활성 단백질 또는 이의 단편들은 리간드, 예를 들어, 림포카인 및 특정 세포 수용체와 상호 작용하는 세포 인자이다. 림포카인은 항원 또는 렉틴이 T 세포 성장을 자극할 때, T 세포에 의해 분비되는 저-분자량 단백질이다. 림포카인의 예로는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 인터페론-α, 인터페론-γ, 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-3 (IL-3), 종양 괴사 인자(TNF), 콜로니 자극 인자 (가령, CSF-1, G-CSF 또는 GM-CSF), 케모탁신, 대식세포 이동 억제성 인자　(MIF), 대식세포-활성화 인자 (MAF), NK 세포 활성화 인자, T 세포 대체 인자, 백혈구-억제성 인자 (LIF), 림포탁신, 파골세포-활성화 인자 (OAF), 가용성 면역 반응 억제제 (SIRS), 성장-자극 인자, 단핵구 성장 인자, 등. 본 발명의 항-PD-L1 융합　단백질에 편입될 수 있는 세포 인자로는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터페론 (IFNs), 및 신경 성장 인자 (NGF),등.

III.약제학적 조성물

본원에서 기술된 바와 같이, PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb를 포함하는 항-PD-L1 구조체들중 임의의 하나 (이를 테면, 항-PD-L1 sdAb, 항-PD-L1 HCAb, 항-PD-L1/항CTLA-4 HCAb, 항-PD-L1/TIGIT 이중특이적 항체, 항-PD-L1/TIM-3 이중특이적 항체 또는 항-PD-L1/LAG-3 이중특이적 항체), 그리고 임의선택적으로 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 출원에 의해 추가 제공된다. 약제학적 조성물은 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 원하는 순도를 갖는 본원에서 기술된 항-PD-L1 구조체를 선택적 약제학적으로수용가능한 담체들, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 안정적인 것이 바람직하고, 이때 본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb를 포함하는 항-PD-L1 구조체는 기본적으로 보관시에 이의 물리적 그리고 화학적 안정성과 온전함을 유지한다. 단백질 안정성을 측정하는 다양한 분석 기술이 당분야에서 이용가능하고, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 검토된다. 선택된 온도에서 선택된 시간 동안 안정성을 측정할 수 있다. 신속한 스크리닝을 위해, 제형은 2 주 내지 1 개월 동안 40℃에서 유지될 수 있으며, 이때 안정성이 측정된다. 제형이 2-8℃에서 저장되는 경우, 일반적으로 제형은 30℃ 또는 40℃에서 최소한 1 개월 동안 안정해야 하고 및/또는 2-8℃에서 최소한 2 년 동안 안정해야 한다. 제형이 30℃에서 저장되는 경우, 제형은 일반적으로 30℃에서 최소한 2 년 동안 안정해야 하고 및/또는 최소한 6 개월 동안 40℃에서 안정해야 한다. 예를 들면, 저장 동안 응집 정도는 단백질 안정성의 지표로서 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 구조체의 안정적 제형은 제형내 항-PD-L1 구조체의 약 10% 미만 (바람직하게는 약 5% 미만)은 응집물로서 존재하는 것을 포함할 수 있다.

수용가능한 담체들, 부형제, 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수령자에게 비독성이며, 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨을 포함한 항산화제; 보존제, 등장화제 (가령, 염화나트륨), 안정제, 금속 착물 (가령, Zn-단백질 착물); 킬레이트제, 예컨대 EDTA 및/또는 비-이온성 계면 활성제를 포함한다.

생리학적으로 수용가능한 담체의 예로는 완충액, 이를 테면, 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산; 아스코르브산, 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (이를 테면, 옥타데실디메틸벤질 암모니움 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로로이드, 벤제토니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 이를 테면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르씨놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만의 아미노산 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 이를 테면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 폴리머 이를 테면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 이를 테면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린이 포함된 기타 탄수화물; 킬레이트 물질들, 이를 테면 EDTA; 슈가, 이를 테면, 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 솔비톨; 염-형성 카운터-이온, 이를 테면, 나트륨, 금속 착물(가령, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 이를 테면, TWEEN™ 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

완충제는 특히 안정성이 pH에 의존하는 경우, 치료 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하는 데 사용된다. 완충제는 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 출원에서 사용하기에 적합한 완충제는 유기 및 무기 산 및 이의 염 모두를 포함한다. 예를 들면, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트. 추가적으로, 완충제는 히스티딘 및 트리메틸아민 염, 예컨대, Tris를 포함할 수 있다.

보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가되며, 전형적으로 0.2% -1.0% (w/v)의 범위로 존재한다. 방부제의 첨가는 예를 들어, 다중-사용 (다중-투여량) 제형의 생산을 용이하게 할 수 있다. 본 출원에서 사용하기에 적합한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 할로겐화물 (가령, 클로라이드, 브롬화물, 요오드화물), 벤제토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.

조성물 중에 액체의 등장성을 조정하거나 유지하기 위해 때때로 "안정화제"로 알려진 등장화제가 존재한다. 단백질 및 항체와 같은 큰 하전된 생체 분자와 함께 사용될 때, 이들은 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호 작용할 수 있기 때문에 종종 "안정화제"로 지칭되며, 이로써 분자-간 및 분자-내 상호 작용의 가능성을 감소시킨다. 등장화제는 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여, 0.1 중량% 내지 25 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 5 중량%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 선호되는 등장화제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 또는 그 이상의 고차 알코올, 예컨대 글리세린, 에리스리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.

추가 부형제에는 다음 중 하나 또는 그 이상을 제공할 수 있는 제제가 포함된다: (1) 증량제(bulking agents), (2) 용해도 증강제, (3) 안정제 및 (4) 용기 벽에 변성 또는 부착을 방지하는 제제. 이러한 부형제는 다음을 포함한다: 다가 당 알코올 (상기 열거됨); 아미노산 이를 테면, 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알코올 이를 테면, 슈크로스, 락토오스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클로 톨 (가령, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 이를 테면, 우레아, 글루타티온, 티오크산, 티오글리콜산 나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오 황산나트륨; 저-분자량 단백질, 이를 테면, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로블린; 친수성 중합체 이를 테면, 폴리비닐피롤리돈; 단당류 (가령, 자일로스, 만노스, 과당, 포도당; 이당류 (가령, 락토스, 말토오스, 슈크로스); 라피노스와 같은 삼당류; 그리고 다당류 이를 테면, 덱스트린 또는 덱스트란.

비-이온성 계면활성제 또는 세제 ("습윤제"라고도 함)는 치료제를 가용화하고, 교반-유도된 응집으로부터 치료용 단백질을 보호하기 위해 존재하고, 이는 또한 활성 치료요법적 단백질 또는 항체의 변성을 유발하지 않으면서 제형이 전단 표면 응력에 노출되게 한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재한다.

적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80, 등), 폴리옥사머 (184, 188, 등), PLURONIC®폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80, 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 슈크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온 성 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포숙시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세제에는 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드가 포함된다.

상기 약제학적 조성물이 생체 내 투여에 사용되려면, 멸균되어야 한다. 상기 약제학적 조성물은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 멸균성이 부여될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 있는 정맥 내 용액 주머니 또는 바이알을 갖는 용기 안에 배치된다.

투여 경로는 공지된 및 허용된 방법, 예를 들어 단일 또는 다중 볼루스(bolus) 또는 적절한 방식으로 장기간에 걸친 주입에 따르는데, 가령, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥-내, 병변내 또는 동맥내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입 또는 서방성 방출 또는 연장-방출 수단에 의한 주사 또는 주입에 의한다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 국소적으로, 이를 테면, 종양내로 투여된다.

서방성-조제물(sustained-release preparations)을 준비할 수 있다. 서방성-조제물의 적합한 예는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투성 매트릭스를 포함하며, 이때 상기 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로 캡슐의 형태이다. 서방성-매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (U.S. 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및. 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 이를 테면, LUPRON DEPOT^TM (젖산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 그리고 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

본원의 상기 약제학적 조성물 또한 치료되는 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 악영향을 미치지 않는 보완 활성을 갖는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 상기 조성물은 세포독성제, 화학치료요법제, 사이토킨, 면역억제제, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 목적하는 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합하여 존재한다.

활성 성분들은 예를 들면, 액적형성(coacervation) 기술 또는 계면(interfacial) 중합화, 예를 들면, 콜로이드성 약물 운반계(예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 미소유화액, 나노-입자, 그리고 나노캡슐) 또는 거대유화액에서 차례로 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐에 의해 준비된 미소캡슐 안에 포집될 수도 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition에 기술된다.

일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 단일-사용 바이알, 이를 테면, 단일-사용 밀봉된 바이알 안에 담겨있다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 다중-사용 바이알 안에 담겨있다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 용기 안에 다량으로(in bulk) 담겨있다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 저온보존된다(cryopreserved).

IV. PD-L1 관련된 질환의 치료 방법

본원에서 기술된 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb를 포함하는 항-PD-L1 구조체(이를 테면, 항-PD-L1 sdAb, 항-PD-L1 HCAb, 항-PD-L1/항CTLA-4 HCAb, 항-PD-L1/TIGIT 이중특이적 항체, 항-PD-L1/TIM-3 이중특이적 항체 또는 항-PD-L1/LAG-3 이중특이적 항체), 및 이의 조성물 (이를 테면, 약제학적 조성물)은 진단, 분자 분석 및 치료와 같은 다양한 응용 분야에 유용하다.

본 발명의 한 측면은 PD-L1 관련된 질환 또는 상태의 치료를 요하는 개체에서 이를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본원에서 기술된 항-PD-L1 구조체를 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1 관련된 질환은 암이다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1 관련된 질환은 병원성 감염, 이를 테면, 바이러스 감염이다.

본 발명은 부분적으로, 단독으로, 또는 또다른 요법의 임의의 조합으로, 및 최소한 일부 측면에서 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 투여될 수 있는 단백질 구조체들 (이를 테면, 항-PD-L1 sdAb, 항-PD-L1 HCAb, 항-PD-L1/항CTLA-4 HCAb, 항-PD-L1/TIGIT 이중특이적 항체, 항-PD-L1/TIM-3 이중특이적 항체 또는 항-PD-L1/LAG-3 이중특이적 항체), 핵산 분자 및/또는 이를 인코딩하는 벡터, 핵산 분자 및/또는 이를 인코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 고려한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 구조체를 투여하기 전, 이들 구조체는 당분야에 공지된 적합한 약제학적 담체들 및 부형제와 복합될 수 있다. 본 명세서에 따라 준비된 조성물은 암의 치료 또는 악화의 지연을 위해 이용될 수 있다.

일부 구체예들에서, 암을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 당해 개체에게 PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체 (sdAb) 모이어티를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체 (이를 테면, 항-PD-L1 sdAb, 항-PD-L1 HCAb, 항-PD-L1/항CTLA-4 HCAb, 항-PD-L1/TIGIT 이중특이적 항체, 항-PD-L1/TIM-3 이중특이적 항체 또는 항-PD-L1/LAG-3 이중특이적 항체)를 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 암은 고형 종양(이를 테면, 결장 암)이다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 전신으로 (이를 테면, 정맥내로) 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 국소적으로 (이를 테면, 종양내로) 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 추가의 암 요법(이를 테면, 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 이들의 조합)을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 개체는 인간이다. 일부 구체예들에서, 암을 치료하는 방법은 다음 생물학적 활성중 하나 또는 그 이상을 갖는다: (1) 암 세포를 죽이고 (방관자(bystander) 사멸 포함); (2) 암 세포의 증식을 억제하고; (3) 종양에서 면역 반응을 유도하고; (4) 종양 크기를 감소시키고; (5) 암을 가진 개체에서 하나 또는 그 이상의 증상을 완화시키고; (6) 종양 전이를 억제하고; (7) 생존을 연장시키고; (8) 암 진행까지 시간을 연장시키고; 그리고 (9) 암 재발을 예방, 억제, 또는 가능성을 감소시킴. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 암 세포 사멸 방법은 최소한 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상중 임의의 하나의 종양 세포 사멸율을 얻을 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 암 세포 사멸 방법은 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상중 임의의 하나의 방관적 종양 세포(종양세포붕괴성 VV에 의해 감염되지 않음) 사멸율을 얻을 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 종양 크기를 감소시키는 방법은 종양 크기의 최소한 약 10% (예를 들면, 최소한 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%중 임의의) 감소시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 종양 전이를 억제시키는 방법은 전이를 최소한 약 10% (예를 들면, 최소한 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%중 임의의) 억제시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 개체 (이를 테면, 인간)의 생존을 연장시키는 방법은 개체의 생존을 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 또는 24 개월중 임의로 연장시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 암 진행까지의 시간을 연장시키는 방법은 암 진행까지의 시간을 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 주 중 임의로 연장시킬 수 있다.

본원에 기재된 방법은 고형 암 및 액체 암 둘 모두를 비롯한, 다양한 암을 치료하는데 적합하다. 상기 방법은 초기 단계 암, 비-전이성 암, 원발성 암, 진행된 암, 국소적으로 진행된 암, 전이성 암, 또는 완화 암(cancer in remission)을 포함하는, 모든 단계의 암에 적용된다. 본원에 기술된 방법들은 제1 요법, 제 2 요법, 제 3 요법, 또는 당분야에 공지된 다른 유형의 암 치료법, 이를 테면, 화학요법, 수술, 호르몬 요법, 방사능, 유전자 요법, 면역요법 (이를 테면, T-세포 요법), 골수 이식, 줄기 세포 이식, 표적화 요법, 저온요법, 초음파 요법, 광역학 요법, 고주파 절제 또는 이와 유사한 것들과 어쥬번트 설정 또는 네오어쥬번트 설정 (즉, 상기 방법은 원발성/확정적 요법 이전에 시행될 수 있음)에서 복합 요법으로 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 이미 치료를 받았던 개체를 치료하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 암은 기존 요법에 대해 난치성이었다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 이미 치료를 받지 않았던 개체를 치료하는데 이용된다.

일부 구체예들에서, 상기 방법은 비정상 PD-L1 발현, 활성 및/또는 신호전달을 하는 암의 치료에 적합한데, 비-제한적 예로써, 흑색종, 전립선암, 폐암, 결장암, 위암, 난소암, 유방암, 및 교아세포종을 포함한다.

따라서 일부 구체예들에서, 면역요법-반응성 고형 종양 (이를 테면, 암종 또는 선암, 이를 테면, 비정상 PD-L1 발현, 활성 및/또는 신호전달)을 갖는 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개체에게 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체 (이를 테면, 항-PD-L1 sdAb, 항-PD-L1 HCAb, 항-PD-L1/항CTLA-4 HCAb, 항-PD-L1/TIGIT 이중특이적 항체, 항-PD-L1/TIM-3 이중특이적 항체 또는 항-PD-L1/LAG-3 이중특이적 항체)를 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 암은 고형 종양(이를 테면, 결장 암)이다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 전신으로 (이를 테면, 정맥내로) 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 국소적으로 (이를 테면, 종양내로) 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 추가의 암 요법(이를 테면, 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 이들의 조합)을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 개체는 인간이다. 일부 구체예들에서, 암을 치료하는 방법은 다음 생물학적 활성중 하나 또는 그 이상을 갖는다: (1) 암 세포를 죽이고 (방관자 사멸 포함); (2) 암 세포의 증식을 억제하고; (3) 종양에서 면역 반응을 유도하고; (4) 종양 크기를 감소시키고; (5) 암을 가진 개체에서 하나 또는 그 이상의 증상을 완화시키고; (6) 종양 전이를 억제하고; (7) 생존을 연장시키고; (8) 암 진행까지 시간을 연장시키고; 그리고 (9) 암 재발을 예방, 억제, 또는 가능성을 감소시킴. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 암 세포 사멸 방법은 최소한 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상중 임의의 하나의 종양 세포 사멸율을 얻을 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 암 세포 사멸 방법은 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상중 임의의 하나의 방관적 종양 세포(종양세포붕괴성 VV에 의해 감염되지 않음) 사멸율을 얻을 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 종양 크기를 감소시키는 방법은 종양 크기의 최소한 약 10% (예를 들면, 최소한 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%중 임의의) 감소시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 종양 전이를 억제시키는 방법 은 전이를 최소한 약 10% (예를 들면, 최소한 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%중 임의의) 억제시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 개체 (이를 테면, 인간)의 생존을 연장시키는 방법은 개체의 생존을 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 또는 24 개월중 임의로 연장시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 약제학적 조성물에 의해 중개되는 암 진행까지의 시간을 연장시키는 방법은 암 진행까지의 시간을 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 주 중 임의로 연장시킬 수 있다.

일부 구체예들에서, 상기 방법은 비정상 PD-1 또는 PD-L1/PD-L2 발현, 활성 및/또는 신호전달을 갖는 암을 치료하는데 적합하며, 비-제한적 실시예, 혈액성 암 및/또는 충실성 종양을 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 성장이 억제될 수 있는 일부 암은 면역요법에 전형적으로 반응성인 암을 포함한다. 치료를 위한 다른 암의 비-제한적 예로는 흑색종 (가령, 전이성 악성 흑색종), 신장　암　(가령, 투명 세포(clear cell) 암종), 전립선　암　(가령, 호르몬 난치성 전립선 선암), 유방　암, 결장　암　및 폐 암　(가령, 비-소 세포 폐　암)을 포함한다. 추가적으로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 성장을 억제할 수 있는 난치성(refractory) 또는 재발성 악성 종양을 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예는 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안내(intraocular) 악성 흑색종, 자궁암, 난소 암, 직장암, 항문 부위 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부의 암종, Hodgkin 질환, 비-Hodgkin 림프종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비 계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함한 만성 또는 급성 백혈병, 소아의 고형 종양, 림프구 림프종, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신장 골반의 암종, 중추 신경계의 신생물 (CNS), 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 축 종양, 뇌간 신경 교종, 뇌하수체 선종, Kaposi 육종, 표피 암, 편평 상피 세포 암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도된 암을 포함하는 환경적으로 유발된 암 및 상기 암의 조합을 포함한다. 본 발명은 전이성 암, 특히 PD-L1을 발혀시키는 전이성 암 치료에 또한 유용하다(Iwai 외 (2005)　Int. Immunol.　17:133-144).

따라서, 일부 구체예들에서, 면역요법-반응성 고형 종양 (이를 테면, 암종 또는 선암, 이를 테면, 비정상 PD-L1 발현, 활성 및/또는 신호전달, 및/또는 비정상 TIGIT, TIM-3 및 LAG-3 발현, 활성 및/또는 신호전달을 갖는 암)을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 상기 개체에게 TIGIT, TIM-3 또는 LAG-3 전장 항체에 융합된 PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체 (sdAb) 모이어티를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체를 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 면역요법-반응성 고형 종양 (이를 테면, 암종 또는 선암, 이를 테면, 비정상 PD-L1 발현, 활성 및/또는 신호전달, 및/또는 비정상 TIGIT, TIM-3, LAG-3 발현, 활성 및/또는 신호전달을 갖는 암)을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 TIGIT, TIM-3 또는 LAG-3 전장 항체에 융합된 PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체 (sdAb) 모이어티를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체를 포함하는 약제학적 조성물의 효과량을 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예들에서, 본원에 기술된 방법은 결장 직장암, 예컨대 선암종, 위장 암양종(carcinoid) 종양, 위장관 간질(stromal) 종양, 평활근육종(Leiomyosarcoma), 흑색종 또는 편평 세포 암종의 치료에 적합하다.

본 출원의 약제학적 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구상된 특정 용도에 따라 가변적일 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 치료를 위한 유효량을 결정하기 위한 신뢰할만한 지침을 제공한다. 유효 투여량의 종간(interspecies) 스케일링은 Mordenti, J. 및 Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics", In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 외, Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46에 의한 원칙에 따라 수행될 수 있다.

본원에서 기술된 항-PD-L1 sdAb 모이어티를 포함하는 항-PD-L1 구조체의 생체내 투여가 이용될 때, 정상적인 투여량은 투여 경로에 따라, 일일 포유류 체중 기준으로 약 10 ng/kg에서 최대 약 100 mg/kg 또는 그 이상, 바람직하게는 약 1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 이를 테면, 약 1-3 mg/kg/일, 약 2-4 mg/kg/일, 약 3-5 mg/kg/일, 약 4-6 mg/kg/일, 약 5-7 mg/kg/일, 약 6-8 mg/kg/일, 약 6-6.5 mg/kg/일, 약 6.5-7 mg/kg/일, 약 7-9 mg/kg/일, 또는 약 8-10 mg/kg/일로 가변적일 수 있다. 상이한 제형은 상이한 치료 및 상이한 장애에 효과적일 것이며, 특정 기관 또는 조직을 치료하기 위한 투여는 또다른 기관 또는 조직에 대한 방식과는 또다른 방식으로 전달을 필요로 할 수 있다는 점은 이 본 출원의 범주 내에 있다. 더욱이, 투여량은 하나 또는 그 이상의 별개 투여, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 상태에 따라 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 원하는 질환 증상의 억제가 발생할 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 다른 투여 섭생이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 기존의 기술과 분석에 의해 쉽게 모니터링된다.

일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 단일 횟수 (가령, 볼루스 주사)로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 다중 횟수 (이를 테면, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 횟수)로 투여된다. 다수의 투여인 경우, 동일한 또는 상이한 경로에 의해 수행될 수 있고, 동일한 부위 또는 대체 부위에서 투여가 있을 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 주당 2 회, 주당 3 회, 주당 4 회, 주당 5 회, 매일, 휴식없이 매일, 주당 1 회, 휴식없이 매주, 2 주에 1 회, 3 주에 1 회, 1 개월에 1회, 2 개월에 1회, 3 개월에 1회, 4 개월에 1회, 5 개월에 1회, 6 개월에 1회, 7 개월에 1회, 8 개월에 1회, 9 개월에 1회, 10 개월에 1회, 11 개월에 1회, 또는 1 년에 1회 투여될 수 있다. 투여 간격은 약 24 시간 내지 48 시간, 2 일 내지 3 일, 3 일 내지 5 일, 5 일 내지 1 주, 1 주 내지 2 주, 2 주 내지 1 개월, 1 개월 내지 2 개월, 2 개월에서 3 개월, 3 개월에서 6 개월 또는 6 개월에서 1 년 중 임의의 하나일 수 있다. 간격도 또한 불규칙 할 수 있다 (가령, 종양 진행에 따라).　일부 구체예들에서, 투약 일정에는 휴식이 없다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 4 일마다 4 회 투여된다. 특정 환자에 대한 최적 투여량 및 치료 요법은 환자에게서 질병의 징후를 모니터링하고, 그에 따라 치료를 조정함으로써 의약 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

재구성된 및 액상 제형를 포함하지만, 이에 국한되지 않는 본 출원의 약제학적 조성물은 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 볼루스로서 정맥내 투여, 일정 시간에 걸쳐 연속 주입, 근육내, 복강내, 뇌내 척수액, 피하, 정맥내 (i.v.), 관절-내, 활액내, 척수강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로로, 본원에 기재된 항-PD-L1 구조체로 치료를 요하는 개체, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 본원에 기재된 동결 건조된 항-PD-L1 구조체를 희석제에 용해시키고, 이 희석제 안에 당해 단백질이 분산되도록 함으로써 재구성된 제형이 만들어질 수 있다. 본 출원에 사용하기에 적합한 예시적인 약제학적으로 허용되는 (인간에 투여하기에 안전하고, 무독성) 예시적인 희석제는 멸균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충된 용액 (가령, 인산염-완충된 염수), 멸균 염수 용액, Ringer 용액 또는 포도당 용액 또는 염 및/또는 완충제의 수용액을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 피하(즉, 피부 아래) 투여에 의해 상기 개체에게 투여된다. 이러한 목적을 위하여, 상기 약제학적 조성물은 주사기를 이용하여 주사될 수 있다. 그러나, 상기 약제학적 조성물의 투여를 위한 다른 장치, 예컨대, 주사 장치; 인젝터 펜; 자동-주사기 장치, 무침(needleless) 장치; 및 피하 패치 전달 시스템이 이용가능하다.

일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 상기 개체의 정맥내로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 개체에게 주입, 이를 테면, 정맥내 주입에 의해 투여된다. 면역요법을 위한 주입 기술은 당분야에 공지되어 있다(가령, Rosenberg 외, New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)).

V. 제조 방법

본원에서 기술되는 항-PD-L1 구조체 (이를 테면, 항-PD-L1 단일-도메인 항체)는 당분야의 임의의 공지된 방법, 또는 본원에서 기술된 임의의 방법들을 이용하여 만들어질 수 있다. 실시예 1-2 또한 참고.

단일-도메인 항체를 준비하는 방법들은 기술되어 있다. 예를 들면, Els Pardon 외, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674 참고. 단일-도메인 항체 (이를 테면, V_HHs)는 당분야에 공지된 방법들, 이를 테면, 카멜리드(Camelid) 종 (이를 테면, 카멜 또는 라마)을 면역주사하고, 그리고 이로부터 하이브리도마를 수득하거나, 또는 당분야에 공지된 분자 생물학 기술을 이용하여 단일-도메인 항체의 라이브러리를 클로닝하고, 선택안된 라이브러리의 개별 클론으로 ELISA에 의해, 또는 파아지 라이브러리를 이용여여 후속 선별함으로써, 수득될 수 있다.

단일-도메인 항체의 재조합체 생산을 위하여, 단일-도메인 항체가 인코딩된 핵산을 단리하고, 추가 클로닝(DNA 증폭)을 위하여 또는 발현을 위하여 복제가능한 벡터 안으로 삽입한다. 단일-도메인 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 과정 (가령, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)을 이용하여 용이하게 단리되고, 그리고 서열화될 수 있다. 많은 벡터들이 이용가능하다. 벡터의 선택은 이용될 숙주 세포에 따라 일부 달라진다. 일반적으로, 선호되는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 (일반적으로 포유동물) 기원의 세포다.

구체예들

본 발명은 다음의 비-제한적 구체예들을 또한 제공한다.

구체예 1은 PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체(sdAb) 모이어티를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3을 포함한다.

구체예 2는 구체예 1의 상기 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함한다.

구체예 3은 구체예 1-2중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 다음중 임의의 하나를 포함한다:

(1) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(2) 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 152의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 252의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(3) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 153의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(4) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 154의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 254의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(5) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 155의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 255의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(6) 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 156의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 256의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(7) 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 157의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 257의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(8) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 158의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 258의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(9) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 259의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(10) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 160의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 260의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(11) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 261의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(12) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 262의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(13) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 263의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(14) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 264의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(15) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 165의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 265의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(16) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 166의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(17) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 167의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(18) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 168의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(19) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(20) 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 170의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 270의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(21) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 171의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(22) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 172의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 272의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(23) 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 173의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 273의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(24) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 174의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 274의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(25) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 175의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 275의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(26) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 176의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 276의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(27) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 177의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 277의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(28) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 278의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(29) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 279의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(30) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 180의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 280의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(31) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 181의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 281의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(32) 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 182의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 282의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(33) 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 183의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 283의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(34) 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 184의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 284의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(35) 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 185의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 285의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(36) 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 186의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 286의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(37) 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 187의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 287의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(38) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 188의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 288의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(39) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 189의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 289의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(40) 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 190의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 290의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체; 그리고

(41) 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 191의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 291의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(42) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 192의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 292의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(43) 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 193의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 293의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(44) 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 194의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 294의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(45) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 295의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(46) 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 296의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(47) 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 297의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(48) 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 198의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 298의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(49) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 199의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 299의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

(50) 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 300의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;

구체예 4는 구체예 1-3중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 다음의 아미노산 서열을 갖는 V_HH 도메인을 포함한다:

a-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I, 및 V, 바람직하게는 Y 및 V으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 더욱 바람직하게는 F이며;

a-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, G, Q, R, S, 및 L, 바람직하게는 Q 및 G로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 더욱 바람직하게는 E이며;

a-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 L, R, 및 C로 구성된 군에서 선택되며;

a-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R, G, 및 S로 구성된 군에서 선택되며; 그리고

a-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며,

이때 상기 각 아미노산 위치은 Kabat 번호매김에 따른다.

구체예 5는 구체예 4의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 다음의 아미노산 서열을 갖는 V_HH 도메인을 포함한다:

a-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 G, E 및 Q로 구성된 군에서 선택되며;

a-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 L 및 R로 구성된 군에서 선택되며;

a-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W, G, 및 R로 구성된 군에서 선택되며; 그리고

a-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이다.

구체예 6은 구체예 5의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 다음의 아미노산 서열을 갖는 V_HH 도메인을 포함한다:

a-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, 및 V로 구성된 군에서 선택되며;

a-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W 또는 G이며; 그리고

a-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며, 이는 임의선택적으로 L로 인간화된다.

구체예 7은 구체예 1-3중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 다음의 아미노산 서열을 갖는 V_HH 도메인을 포함한다:

b-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I, 및 V, 바람직하게는 Y 및 V으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 더욱 바람직하게는 F이며;

b-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 E, Q 및 G로 구성된 군에서 선택되며;

b-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 R이며;

b-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R, 및 S로 구성된 군에서 선택되며; 그리고

b-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 구성된 군에서 선택되며;

이때 상기 각 아미노산 위치은 Kabat 번호매김에 따른다.

구체예 8은 구체예 7의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 다음의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함한다:

b-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I 및 V로 구성된 군에서 선택되며;

b-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 E, G 및 Q로 구성된 군에서 선택되며;

b-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 R이며;

b-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W 또는 G이며; 그리고

b-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며, 이는 임의선택적으로 L로 인간화된다.

구체예 9는 구체예 1-8중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나에 대하여 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함한다.

구체예 10은 구체예 9중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인, 또는 V_HH 도메인에서 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.

구체예 11은 구체예 1-10중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_D는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M이다.

구체예 12은 구체예 1-11중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된다.

구체예 13은 구체예 1-12중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 오로지-중쇄 항체 (HCAb)다.

구체예 14는 구체예 13의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 인간 IgG1 Fc에 융합된다.

구체예 15는 구체예 13 또는 14의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 HCAb는 단량체성 또는 이량체성이다.

구체예 16은 구체예 13-15중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

구체예 17은 구체예 13-15중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 HCAb는 서열 번호: 401-440중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

구체예 18은 구체예 1-13중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 제 2 항원을 특이적으로 인지하는 제 2 항체 모이어티를 더 포함한다.

구체예 19는 구체예 18의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 전장의 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), sdAb, 또는 항체 모방체이다.

구체예 20은 구체예 18 또는 19중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 항-PD-L1 구조체는 단일특이성 또는 다중특이성이다.

구체예 21은 구체예 18-20중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 sdAb이다.

구체예 22는 구체예 18-21중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 제 2 항원은 PD-L1이다.

구체예 23은 구체예 22중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 PD-L1을 특이적으로 인지하는 3개 또는 그 이상의 sdAbs이다.

구체예 24는 구체예 22 또는 23중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 제 2 항체는 서열 번호:351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

구체예 25는 구체예 18-21중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 제 2 항원은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다.

구체예 26은 구체예 18-21중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 제 2 항원은 CTLA-4이며, 상기 제 2 항체는 항-CTLA-4 sdAb이다.

구체예 27은 구체예 18-26중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 상기 제 2 항체 모이어티에 대해 아미노 (N)-말단 및/또는 카르복시 (C)-말단이다.

구체예 28은 구체예 18-21중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 전장의 항체다.

구체예 29는 청구항 28의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 상기 아미노 (N)-말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 카르복시 (C)-말단에 융합된다.

구체예 30은 청구항 28의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 C-말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 N-말단에 융합된다.

구체예 31은 구체예 28-30중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 전장 항체는 TIGIT, TIM-3, 및 LAG-3으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 특이적으로 인지한다.

구체예 32는 구체예 28-30중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 sdAb 모이어티에 의해 특이적으로 인지되는PD-L1은 서열 번호:441 또는 서열 번호:442의 아미노산 서열을 포함한다.

구체예 33은 구체예 28-30중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티 및 상기 제 2 항체 모이어티는 임의선택적으로 펩티드 링커에 의해 연계된다.

구체예 34는 구체예 33의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 443-445의 아미노산 서열을 포함한다.

구체예 35는 구체예 1-34중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체와 PD-L1에 경쟁적으로 특이적 결합하는 제 2 단리된 항-PD-L1 구조체다.

구체예 36은 구체예 35의 단리된 항-PD-L1 구조체인데, 이때 상기 제 2 단리된 항-PD-L1 구조체는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.

구체예 37은 구체예 1-36중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체 및 약제학적 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

구체예 38은 PD-L1-관련된 질환을 갖는 치료를 요하는 개체를 치료하는 방법인데, 이 방법은 당해 개체에게 구체예 37의 약제학적 조성물 효과량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

구체예 39는 구체예 38의 방법인데, 이때 상기 PD-L1 관련된 질환은 암이다.

구체예 40은 구체예 39의 방법인데, 이때 상기 암은 고형 종양이다.

구체예 41은 구체예 39 또는 40의 방법인데, 이때 상기 암은 결장암이다.

구체예 42는 구체예 39-41중 임의의 하나의 방법인데, 상기 개체에게 추가 암 요법을 투여하는 것을 더 포함한다.

구체예 43은 구체예 42의 방법인데, 이때 상기 추가 암 요법은 수술, 방사능, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 또는 이의 조합이다.

구체예 44는 구체예 38의 방법인데, 이때 상기 PD-L1 관련된 질환은 병원성 감염이다.

구체예 45는 구체예 38-44중 임의의 하나의 방법인데, 이때 상기 약제학적 조성물은 전신으로 또는 국소적으로 투여된다.

구체예 46은 구체예 45의 방법인데, 이때 상기 약제학적 조성물은 정맥내로 투여된다.

구체예 47은 구체예 45의 방법인데, 이때 상기 약제학적 조성물은 종양내로 투여된다.

구체예 48은 구체예 38-47중 임의의 하나의 방법인데, 이때 상기 개체는 인간이다.

실시예

하기에서 실시예들은 본 발명의 순전히 예시적인 것으로 의도된 것이며 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 다음 실시예들 및 상세한 설명은 제한이 아닌 예시로서 제공된다.

실시예 1: 항-PD-L1 sdAbs 생성

면역화

모든 현재 동물 복지 규정 하에서, 재조합 PD-L1 ECD 단백질로 2 마리 라마를 면역화시켰다. 면역화를 위하여, 상기 항원은 CFA (일차 면역화) 또는 IFA (부스터 면역화)와 함께 에멀젼으로 제형화되었다. 상기 항원은 목에서 근육 내로 이중-스팟 주사에 의해 투여되었다. 각각의 동물은 100μg의 PD-L1 ECD를 함유하는 에멀젼의 2 회 주사를 맞고, 후속적으로 매주 간격으로 50μg의 항원을 함유하는 4 회의 주사를 맞았다. 면역화 동안 상이한 시점에서, 10 ml의 혈액 샘플을 동물로부터 수집하고, 혈청을 제조하였다. 고정화된 PD-L1 ECD 단백질을 사용한 ELISA-기반 실험에서 혈청 샘플을 사용하여 항원 특이적 체액성 면역 반응의 유도를 확인하였다(도 1 및 2). 마지막 면역화 후 5 일 시점, 300ml의 혈액 샘플을 수집하였다. 라마 중쇄 면역 글로불린 (HCAbs)의 유전자 공급원으로서 말초 혈액 림프구 (PBLs)를 Ficoll-Paque 구배 (Amersham Biosciences)를 사용하여 300 ml 혈액 샘플로부터 단리하여, 1x10⁹ PBLs을 생성하였다. 항체의 최대 다양성은 샘플링된 B-림프구의 수와 같을 것으로 예상되는데, 이는 PBLs 수의 약 10% (1×10⁸)에 해당된다. 라마에서 중쇄 항체의 분율은 B-림프구 수의 최대 20%이다. 따라서, 300 ml 혈액 샘플에서 HCAbs의 최대 다양성은 2x10⁷ 상이한 분자로 계산된다.

라이브러리 구축

PBLs 및 림프절로부터 추출된 RNA를 RT-PCR의 출발 물질로서 사용하여, sdAb 인코딩 유전자 단편을 증폭시켰다. 이들 단편을 사내(in-house) 파아지미드 벡터에 클로닝하였다. sdAb 코딩 서열을 갖는 프레임에서, 벡터는 C-말단 (His)6 태그를 코딩하였다. 상기 라이브러리 크기는 1×10⁹이상이다. 라이브러리 파아지를 표준 프로토콜에 따라 제조하고 추가 사용을 위해 4℃에서 필터 멸균 후 보관하였다.

선별 및 고-처리량 스크리닝(Selections and high-throughput screening)

세포 기반 패닝(panning) 뿐만 아니라 고형 패닝을 사용하여 상기 라이브러리로 선별하였다. 두 조건에 대해 오직 단일 선택 라운드만 수행되었다. 각각의 선별 결과는 풍도(enrichment) 인자 (대조군에 비해 용리액에 존재하는 파아지의 수 #), PD-L1 양성 클론 (ELISA)의 다양성 및 백분율에 대해 분석되었다. 이러한 매개 변수를 기반으로 추가 분석을 위해 최상의 선별이 선택되었다. 이를 위해, 각각의 선별로부터의 산출은 고-처리량 스크리닝을 위해 가용성 발현 벡터에 풀(pool)로서 재클로닝되었다. sdAb 코딩 서열을 갖는 프레임에서, 벡터는 C-말단 (His)6 태그를 코딩하였다. 콜로니를 찍어내고, 96 딥(deep) 웰 플레이트 (1 ml 용적)에서 성장시켰고, 상청액에서 sdAb 발현을 위하여 IPTG 및 0.1% Triton을 추가하여 유도하였다.

상청액을 분석하여 PD-L1 ECD 단백질 (ELISA를 통하여) 및 PD-L1 안정적인 세포 계통 (FACS를 통하여)에 결합하는 이들의 능력에 대하여 상청액을 분석하였다. 양성 결합제를 시퀀싱하고, 추가 특성화를 위해 고유 클론을 선별하였다.

고유 클론을 2XYT 배지에서 성장시키고, 상청액에서 sdAb 발현을 위해 IPTG에 의해 유도하였다. PD-L1-PD-1 상호 작용을 억제하는 능력에 대해 독특한 결합제의 상청액을 분석하였다. 이를 위해, 상청액을 PD-L1 ECD 단백질과 함께 항온처리한 다음, 복합체 평가를 위해 PD-1 안정 세포주에 복합체를 첨가하였다. PD-1 세포 계통에서 음성 신호를 갖는 sdAbs는 PD-L1 억제제로 간주된다.

BIAcore T200 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의한 해리(off-rate) 분석을 위해 모든 잠재적인 억제제를 선택하였다. 분리 상(dissociation phase)을 사용하여 각각의 개별 sdAb에 대한 k_off 값을 산출하였다.

sdAb 생산

에 의한 주변세포질(periplasmic) 추출물로부터 His6-테그된 sdAbs를 정제하였다. NTA 수지는 제조업체의 지침에 따라 처리되었다. 준비된 주변세포질 추출물을 회전자(rotator) 상에서 실온에서 30 분 동안 수지와 함께 항온처리하였다. 수지를 PBS로 세척하고, 컬럼으로 옮겼다. 채워진(packed) 수지를 15mM 이미다 졸로 세척하였다. sdAbs를 150 mM 이미다졸을 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 용리된 분획들(fractions)을 Hybond Membrane에서 스팟팅(spotting)하여 분석하고, Ponceau로 시각화했다. 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고(pooled), PBS에 대해 투석하였다. 투석된 단백질을 수집하고, 필터 멸균하고, 농도를 측정하고 -20℃에서 저장하였다.

순도를 결정하기 위해, 단백질 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에서 분석하였다. 10μl Laemmli 샘플 완충액을 10μl (2μg) 정제된 단백질에 첨가한 다음, 샘플을 95℃에서 10 분 동안 가열하고, 냉각시키고, 12% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 겔을 일반적인 절차에 따라 처리하고, Coomassie Brilliant Blue (CBB)로 염색하였다.

HCAb 생산

HCAb 구조체들은 sdAbs에 인간 Fc 영역을 융합함으로써 만들어졌다. HCAb 구조체의 멕시프레프(maxiprep)는 CHO-K1 세포 일시적 발현 및 정제를 위해 준비되었다. 발현된 HCAbs를 단백질 A 아가로스(agarose) 수지를 함유하는 컬럼에, 이어서 크기 배제 컬럼(size exclusion column)을 통한 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

순도를 결정하기 위해, 단백질 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에서 분석하였다. 10μl Laemmli 샘플 완충액을 10μl (2μg) 정제된 단백질에 첨가한 다음, 샘플을 95℃에서 10 분 동안 가열하고, 냉각시키고, 12% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 겔을 일반적인 절차에 따라 처리하고, Coomassie Brilliant Blue (CBB)로 염색하였다. 정제된 HCAbs의 순도는 >85%이다. 데이터는 표 20에 요약되어 있다.

sdAb 친화력 측정 및 HCAb 친화력 측정

각 sdAbs 및 HCAbs의 친화력 상수 (K _d )는 BIAcore T200 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정되었다. 간략하게 설명하자면, PD-L1 His는 100RU 보다 높지 않은 밀도로 CM5 센서 칩에 아민-결합되었다. 항-PD-L1 sdAbs 또는 항-PD-L1 HCAbs는 0.33 내지 27 nM 사이의 5가지 상이한 농도로 주사되었다. 모든 실험에서 유속은 30μl/분이었다. 연합 및 해리 상은 각각 5 분 및 10 분이었다. 칩은 글리신/HCl pH 1.5를 이용하여 재생되었다. 상이한 농도의 sdAbs 및 HCAbs에서 결합 곡선을 이용하여 운동 매개변수 k _on , k _off 및 K_D(도 3a-3n 및 도 4a-4n)를 산출하였다. 역학적 데이터는 표 3 및 표 4에 요약되어 있다.

표 3 PD-L1에 대한 sdAbs의 친화력 측정

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)
PD-L1/His	AS06617 sdAb	1.86E+06	4.64E-04	2.49E-10
	AS06618 sdAb	1.44E+06	2.45E-04	1.70E-10
	AS06628 sdAb	4.10E+06	2.15E-04	5.26E-11
	AS06682 sdAb	1.68E+06	3.42E-04	2.03E-10
	AS06686 sdAb	2.79E+06	9.65E-04	3.46E-10
	AS06703 sdAb	1.80E+06	6.96E-05	3.87E-11
	AS06730 sdAb	7.11E+06	1.39E-04	1.95E-11
	AS06750 sdAb	2.05E+06	2.23E-04	1.09E-10
	AS06775 sdAb	1.58E+06	2.47E-04	1.56E-10
	AS06778 sdAb	1.90E+06	4.42E-05	2.33E-11
	AS06791 sdAb	1.56E+06	2.39E-04	1.53E-10
	AS11947 sdAb	1.92E+06	1.18E-03	6.17E-10
	AS11948 sdAb	2.37E+06	3.94E-04	1.67E-10
	AS12003 sdAb	2.76E+06	1.55E-03	5.60E-10

표 4 PD-L1에 대한 HCAbS의 친화력 측정

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)
PD-L1/His	AS06617 HCAb	5.20E+05	5.51E-05	1.06E-10
	AS06618 HCAb	4.21E+05	1.41E-05	3.35E-11
	AS06628 HCAb	1.27E+06	1.98E-05	1.55E-11
	AS06730 HCAb	1.52E+06	2.44E-05	1.61E-11
	AS06682 HCAb	5.99E+05	3.34E-05	5.57E-11
	AS06686 HCAb	9.79E+05	1.53E-04	1.56E-10
	AS06703 HCAb	5.55E+05	<1.00E-05*	<1.80E-11*
	AS06750 HCAb	7.19E+05	2.81E-05	3.92E-11
	AS06775 HCAb	4.76E+05	3.29E-05	6.90E-11
	AS06778 HCAb	5.53E+05	<1.00E-05*	<1.81E-11*
	AS06791 HCAb	7.81E+05	5.33E-05	6.83E-11
	AS11947 HCAb	7.30E+05	2.26E-04	3.10E-10
	AS11948 HCAb	7.61E+05	8.25E-05	1.08E-10
	AS12003 HCAb	5.69E+05	2.47E-04	4.34E-10

*kd는 Biacore T200으로 측정할 수 있는 한계 범위 밖에 있다.

표적 결합 분석

PD-L1에 결합하는 정제된 항원 결합 단백질의 능력은 표면 플라스몬 공명법 (예를 들어, BIACORE®), 효소-연계된 면역흡착 분석법, 형광-보조 세포 분류법 (FACS), 또는 이들의 조합을 사용하여 결정된다. PD-L1 형질 감염된 세포에 대해 분석을 수행할 수 있다.

인간 PD-L1을 발현시키는 CHO-K1는 흡착 배양 플라스크로부터 해리되었고, 다양한 농도의 항체 및 일정한 농도의 항-PD-L1 sdAbs 또는 HCAbs와 혼합되었다(96-웰 플레이트에서). Tecentriq®는 항-PD-L1 항체 양성 대조군으로 이용되었다. 상기 항체 및 세포 항온처리물은 실온에서 30 분 동안 평형화시키고, FACS 완충제 (1% BSA를 함유하는 PBS)로 3 회 세척하였다. 이어서, FITC 접합된 항-인간 IgG 제2 항체를 첨가하고, 15 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 세포는 FACS 완충제로 다시 세척되었고, 유동 세포분석에 의해 분석된다. 비-선형 회귀 분석을 사용하여 Prism(GraphPad Software, San Diego, CA)으로 데이터를 분석하였고, EC₅₀ 값을 산출하였다 (도 5a 및 5b).

FACS 분석에 의한 리간드 결합 억제

유동 세포분석을 이용하여 리간드 결합 차단을 연구하였다. 항-PD-L1 HCAbs 평가를 위하여, 인간 PD-L1을 발현시키는 CHO-K1는 흡착 배양 플라스크로부터 해리되었고, 다양한 농도의 항체 및 일정한 농도의 바이오틴-라벨된 hPD-1/Fc 단백질와 혼합되었다(모두 96-웰 플레이트에서). Tecentriq®는 항-PD-L1 항체 양성 대조군으로 이용되었다. 상기 혼합물을 실온에서 30 분 동안 평형화시켰고, FACS 완충제 (1% BSA를 함유하는 PBS)로 3 회 세척하였다. PE/Cy5 스트렙타아비딘 제 2 항체를 첨가하였고, 15 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 세포는 FACS 완충제로 다시 세척되었고, 유동 세포분석에 의해 분석된다. 비-선형 회귀 분석을 사용하여 Prism(GraphPad Software, San Diego, CA)으로 데이터를 분석하였고, IC₅₀ 값을 산출하였다. 도 6a 및 6b에서 볼 수 있는 바와 같이, 경쟁 분석은 저농도(1-10μg/ml)에서 PD-L1-PD-1 상호 작용을 효율적으로 억제하는데 있어서 대부분의 항-PD-L1 HCAbs의 능력을 입증하였고, 대부분의 HCAbs의 IC₅₀은 Tecentriq®에 필적한다.

PD-L1-기반의 차단 분석

CHO-K1 안정적인 발현시키는 PD-L1 세포 및 Jurkat 작동체 세포를 이용하여 항-PD-L1 sdAbs 및 HCAbs 가치에 대한 PD-1 차단을 평가한다. PD-1을 발현시키는 작동체 세포와 PD-L1 세포가 혼합될 때, PD-1/PD-L1 수용체-리간드 상호 작용의 파괴 시, 유도되는 루시퍼라제 구조체를 상기 작동체 세포가 함유한다. 따라서, CHO-K1 안정적인 세포 상에서 항-PD-L1 sdAbs 및 HCAbs에 의한 PD-L1을 억제하는 효능은 루시페라제 리포터 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다. 상기 분석은 다음과 같이 실행된다.

1 일째, PD-L1 세포는 세포가 해동될 때까지 (약 3-4 분) 37℃ 수조에서 해동되고, 해동된 세포 0.5mL를 14.5mL 세포 회수 배지 (10% FBS/F-12)로 옮긴다. 당해 튜브를 1-2 회 부드럽게 뒤집어, 세포 현탁액을 잘 혼합시킨다. 이어서, 세포 현탁액을 멸균 시약 저장소로 옮기고, 웰당 25μL의 세포 현탁액으로 분석 플레이트에 분배한다. 블랭크 대조군으로써, 웰당 100μL의 분석 배지가 첨가된다. 블랭크 대조군으로써, 웰당 100μL의 세포 회수 배지를 웰에 첨가한다. 이어서, 플레이트를 뚜껑을 닫고, 37℃에서 CO₂ 배양에서 하룻밤동안 항온처리한다.

분석 당일, 새로운 분석 완충액 (RPMI 1640+1% FBS)을 제조하였다. 각각의 대조군 항-PD-L1 항체 (가령, Tecentriq®), sdAbs 또는 HCAbs에 대한 분석 완충액에서 8-점 연속 희석(eight-point serial dilution)이 수행된다. 시작 농도 및 희석 체계는 전체 용량-반응 곡선(full dose-response curves)을 달성하도록 최적화된다. PD-L1 세포를 함유하는 분석 플레이트는 CO₂ 배양기로부터 회수된다. 모든 웰에서 웰당 95μl의 배지를 빼낸다. 대조군 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단백질의 40μL의 연속 희석물을 PD-L1 세포를 함유하는 웰에 웰마다 첨가하였다. 각 플레이트의 블랭크 대조군웰에 웰당 80μL 분석 완충액을 첨가하였다.

다음으로, PD-1 작동체세포는 세포가 해동될 때까지 (약 3-4 분) 37℃ 수조에서 해동된다. 세포 현탁액을 바이알에서 위 아래로 피펫팅하여, 부드럽게 혼합하고, 0.5mL의 세포를 5.9mL 분석 완충액에 첨가한다. 당해 튜브를 1-2 회 부드럽게 뒤집어, 세포 현탁액을 잘 혼합시킨다. 이어서 세포 현탁액을 멸균 시약 저장소로 옮기고, 40μL의 세포 현탁액을 PD-1 세포 및 대조군 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단백질을 함유하는 각각의 웰에 분배하였다. 플레이트를 뚜껑을 덮고, CO₂ 배양기에서 37℃에서 6 시간 동안 항온처리한다.

루시페라제 분석 시스템은 하나의 완충액 병을 기질을 함유하는 병으로 옮김으로써 재구성된다. 시스템은 실온에서 보관되며, 당일 사용하기 위해 빛으로부터 보호된다. 6 시간의 유도 후, 분석 플레이트를 CO₂ 배양기에서 제거하고 주위 온도에서 5-10 분 동안 평형화시켰다. 시약 80μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 주위 온도에서 5-10 분 동안 항온처리한다. 발광은 GloMax®Discover System (WI, Madison, WI) 또는 글로우-타입(glow-type) 발광 판독 기능이 있는 플레이트 리더에서 측정된다.

발광은 상대적 광 단위(RLU)로 표시된다. 희석된 항체 또는 이중 특이적 항원 결합 단백질을 갖는 웰의 RLU 값은 항체 또는 이중 특이적 항원 결합 단백질 대조군의 RLU에 대해 표준화되어, 루시퍼라제 유도 배수(Fold of Luciferase Induction)를 제공한다. 데이터는 항체 또는 이중 특이적 항원 결합 단백질 농도의 Log₁₀대비(versus) RLU, 또는 항체 또는 이중 특이적 항원 결합 단백질의 Log₁₀ 농도 대비 유도 배수로 그래프화된다. 데이터는 각 이중 특이적 항원 결합 단백질의 곡선 및 EC₅₀에 피팅하고, 대조군 항-PD-1 항체는 곡선 피팅 소프트웨어, 이를 테면, GraphPad Prism를 이용하여 측정된다(도 7a-7o 및 도 8a-8o, 표 5 및 6).

표 5 sdAbs에 대한 PD-L1-기반 차단 분석의 EC₅₀

샘플	AS06617 sdAb	AS06618 sdAb	AS06628 sdAb	AS06682 sdAb	AS06686 sdAb
EC₅₀(M)	6.38E-08	4.45E-08	2.42E-08	4.20E-08	3.52E-07
샘플	AS06703 sdAb	AS06730 sdAb	AS06750 sdAb	AS06775 sdAb	AS06778 sdAb
EC₅₀(M)	1.50E-08	1.72E-08	3.36E-08	7.55E-08	2.01E-08
샘플	AS06791 sdAb	AS11947 sdAb	AS11948 sdAb	AS12003 sdAb	Tecentriq
EC₅₀(M)	3.65E-08	7.72E-08	2.52E-08	9.62E-08	5.92E-09

표 6 HCAbs에 대한 PD-L1-기반 차단 분석의 EC₅₀

샘플	AS06617 HCAb	AS06618 HCAb	AS06628 HCAb	AS06682 HCAb	AS06686 HCAb
EC₅₀(M)	6.20E-09	6.45E-09	5.88E-09	6.66E-09	7.37E-09
샘플	AS06703 HCAb	AS06730 HCAb	AS06750 HCAb	AS06775 HCAb	AS06778 HCAb
EC₅₀(M)	5.59E-09	6.791E-09	9.98E-09	5.8E-09	5.54E-09
샘플	AS06791 HCAb	AS11947 HCAb	AS11948 HCAb	AS12003 HCAb	Tecentriq
EC₅₀(M)	5.82E-09	7.55E-09	5.80E-09	9.34E-09	5.92E-09

실시예 2: 항-PD-L1 sdAb 인간화

인간화를 위하여 5가지 항-PD-L1 sdAbs (AS06730, AS06750, AS11948, AS06617 및 AS06675)가 선택되었다. 카멜리드 sdAb의 야생형 단백질 서열은 최대 수준의 상동성을 공유하는 5가지 최근접(closest) 인간 생식계열 서열과 함께 배열되었다. 최고의 인간 생식계열 서열이 인간 수용체로 선별되었다. 상동성 모델이 만들어졌다. 모델 분석 데이터에 따르면, 항원 결합 또는 항체 스캐폴드(scaffold) 형성에 잠재적으로 중요한 잔기들은 그대로 유지되고, 나머지는 인간 대응부로 전환되도록 선택되었다. 처음에 4 개의 서열 최적화 변이체의 패널이 생성되었다(단계 1). 이들 변이체는 다수의 매개변수 대해 분석되었고, 수득 된 결과는 제 2 세트의 sdAbs를 설계하는데 사용되었다(단계 2). 각 야생형 sdAb의 경우, 결합, 안정성 및 기능성 평가를 위하여 1-9개의 인간화된 sdAbs가 기획되었고, 이들의 서열 정렬은 도 9a-9e에 나타낸다.

인간화된 HCAb 생산

HCAb 구조체들은 sdAbs에 인간 Fc 영역을 융합함으로써 만들어졌다. HCAb 구조체의 멕시프레프(maxiprep)는 CHO-K1 세포 일시적 발현 및 정제를 위해 준비되었다. 발현된 HCAbs를 단백질 A 아가로스 수지를 함유하는 컬럼에, 이어서 크기 배제 컬럼을 통한 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

인간화된 HCAbs의 친화력 순위

PD-L1에 각 인간화된 HCAb의 결합 역학은 CM5 (Biacore) 센서 칩 상에 피복된 재조합체 인간 PD-L1 His 단백질 (R&D System)을 이용하여 측정된다. 각각의 항원 결합 단백질은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 항원-코팅된 칩 위로 유동된다. 대안으로, 각 항원 결합 단백질은 인간 PD-1-His 단백질이 그 위에 제공된 CM5 센서 칩 상에 포집된다. 추가적인 특성화를 위해, 부모계 HCAbs와 유사한 인간화 클론의 결합 친화력만이 선택되었다(표 7-11).

표 7 인간화된 sdAbs(AS06730)의 친화력 순위

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)
PD-L1/His	AS06730	2.34E+05	3.35E-04	1.43E-09
	AS06730S	2.29E+05	5.73E-04	2.51E-09
	AS06730A	6.96E+05	2.41E-02	3.46E-08
	AS06730Q	3.68E+11	1.18E+03	3.21E-09
	AS06730QVH1	2.58E+06	5.79E-03	2.24E-09
	AS06730QVH2	5.30E+05	2.19E-03	4.14E-09
	AS06730QVH3a	2.32E+06	2.12E-01	9.14E-08
	AS06730SVH12	3.0E+05	1.8E-03	6.1E-09
	AS06730SVH12M8	3.1E+05	6.5E-03	2.1E-08
	AS06730SVH12M9	3.2E+05	1.2E-02	3.7E-08

표 8 인간화된 sdAbs(AS06750)의 친화력 순위

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)
PD-L1/His	AS06750	1.49E+05	3.30E-04	2.21E-09
	AS06750VH2	2.12E+05	3.29E-04	1.55E-09
	AS06750VH3	2.02E+05	3.55E-04	1.75E-09
	AS06750VHa	1.89E+05	3.08E-04	1.63E-09
	AS06750VH1	7.08E+04	2.53E-03	3.57E-08
	AS06750VH11	1.40E+05	2.70E-04	1.90E-09

표 9 인간화된 sdAbs (AS11948)의 친화력 순위

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)
PD-L1/His	AS11948	2.97E+05	5.82E-04	1.96E-09
	AS11948Q	3.01E+05	4.65E-02	1.55E-07
	AS11948QVH1	3.32E+05	7.99E-04	2.41E-09
	AS11948QVH2	2.17E+06	1.95E-01	8.98E-08
	AS11948A	2.05E+06	1.96E-01	9.55E-08
	AS11948QVHa	6.41E+10	6.77E+02	1.06E-08
	AS11948S	2.26E+05	8.61E-04	3.80E-09
	AS11948SVH12	4.0E+05	1.5E-03	3.7E-09
	AS11948SVH12M8	4.3E+05	9.5E-03	2.2E-08
	AS11948SVH12M9	4.0E+05	6.3E-03	1.6E-08

표 10 인간화된 sdAbs (AS06617)의 친화력 순위

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)
PD-L1/His	AS06617	3.10E+05	4.30E-04	1.40E-09
PD-L1/His	AS06617VH11	4.30E+05	1.20E-03	2.70E-09

표 11 인간화된 sdAbs (AS06775)의 친화력 순위

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)
PD-L1/His	AS0775	2.10E+05	3.60E-04	1.70E-09
	AS06775VH11	3.20E+05	5.00E-04	1.60E-09
	AS06775VH4	2.46E+05	7.16E-04	2.92E-09

친화력 측정

AS06730S, AS06730SVH3a, AS06730SVH12, AS06730AVH12M8, AS06730SVH12M9, AS06750VH2, AS06750VH11, AS06750VH4, AS11948S, AS11948SVH12, AS11948SV12M8, AS11948SV12M9, AS06617VH11, AS06775VH11 및 AS06775VH4들이 친화력 측정을 위하여 선택되었다. 각 HCAbs의 친화력 상수 (K _d )는 BIAcore T200 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정되었다. 간략하게 설명하자면, 대부분 HCABs 친화력 측정을 위하여, PD-L1 His는 100RU 보다 높지 않은 밀도로 CM5 센서 칩에 아민-결합되었다. 항-PD-L1 HCAbs는 0.11 nM 내지 27 nM 사이의 5가지 상이한 농도로 주사되었다. 모든 실험에서 유속은 30μl/분이었다. 연합 및 해리 상은 각각 5 분 및 10 분이었다. 칩은 글리신/HCl pH 1.5를 이용하여 재생되었다. AS06730SVH12, AS06730SVH12M8, AS06730VH12M9, AS11948SV12, AS11948SV12M8 및 AS11948SV12M9 HCAbs 친화력 측정의 경우, 항-PD-L1 HCAbs는 CM5 센서 칩 상에서 100 RU 보다 높지 않은 밀도로 항-인간 IgG 항체에 의해 포집되었다. 항-PD-L1 His는 0.33 내지 27 nM 사이의 5가지 상이한 농도로 주사되었다. 모든 실험에서 유속은 30μl/분이었다. 연합 및 해리 상은 5 분이었다. 상이한 농도의 HCAbs에서 결합 곡선을 이용하여 운동 매개변수 k _on , k _off 및 K _d (도 10a-10t)가 산출되었다. 역학적 데이터는 표 12 및 표 13에 요약되어 있다.

표 12. 인간화된 HCAbs의 친화력 매개변수

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)
PD-L1 His	AS06730 HCAb	7.6E+04	1.7E-04	2.2E-09
	AS06730S HCAb	7.1E+04	3.5E-04	4.9E-09
	AS06730SVH3a HCAb	6.2E+04	3.7E-04	5.9E-09
	AS06750 HCAb	2.0E+05	3.6E-04	1.8E-09
	AS06750VH2 HCAb	2.0E+05	3.3E-04	1.7E-09
	AS06750VH11 HCAb	9.5E+04	3.0E-04	3.2E-09
	AS06750VH4 HCAb	1.4E+05	2.7E-04	1.9E-09
	AS11948 HCAb	3.5E+05	6.2E-04	1.8E-09
	AS11948S HCAb	2.9E+05	1.1E-03	3.8E-09
	AS06617 HCAb	4.8E+05	1.0E-03	2.1E-09
	AS06617VH11 HCAb	4.3E+05	1.2E-03	2.7E-09
	AS06775 HCAb	3.1E+05	4.3E-04	1.4E-09
	AS06775VH4 HCAb	2.1E+05	3.6E-04	1.7E-09
	AS06775VH11 HCAb	3.2E+05	5.0E-04	1.6E-09

표 13. 인간화된 HCAbs의 친화력 매개변수

리간드	피분석물	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)
AS06730SVH12 HCAb	PD-L1 His	3.0E+05	1.8E-03	6.1E-09
AS06730SVH12M8 HCAb		3.6E+05	6.5E-03	1.8E-08
AS06730SVH12M9 HCAb		4.0E+05	1.2E-02	3.0E-08
AS11948SVH12 HCAb		4.0E+05	1.5E-03	3.7E-09
AS11948SVH12M8 HCAb		4.3E+05	9.5E-03	2.2E-08
AS11948SVH12M9 HCAb		4.0E+05	6.3E-03	1.6E-08

PD-L1 기반 차단 분석

PD-L1 기반 차단 분석은 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 실행되었다. 도 11a-11q에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 선택된 인간화된 항-PD-L1 HCAbs는 PD-L1과 PD-1간의 결합 억제에 있어서 Tecentriq®에 필적한다. EC₅₀ 데이터는 표 14에 요약된다.

표 14 HCAbs에 대한 PD-L1-기반 차단 분석의 EC₅₀

샘플	AS0730 HCAb	AS06730S HCAb	AS06730SVH3a HCAb	AS06730SVH12 HCAb	AS06750 HCAb
EC₅₀(M)	2.15E-09	2.54E-09	1.58E-09	4.60E-09	3.60E-09
샘플	AS06750VH2 HCAb	AS06750VH11 HCAb	AS06750H4 HCAb	AS11948 HCAb	AS11948S HCAb
EC₅₀(M)	4.44E-09	3.61E-09	5.77E-09	5.00E-09	3.28E-09
샘플	AS11948VH12 HCAb	AS11948VH12M8 HCAb	AS06617 HCAb	AS06617VH11 HCAb	AS06775 HCAb
EC₅₀(M)	2.91E-09	7.86E-09	3.86E-09	4.28E-09	3.08E-09
샘플	AS06775VH11 HCAb	AS06775VH4 HCAb	Tecentriq
EC₅₀(M)	5.26E-09	3.43E-09	5.92E-09

인간화된 HCAbs의 생체내 활성

여기 제시된 연구에서, 뮤린 종양 모델에 대한 PD-L1 HCAb 차단의 효능을 조사하였다. 항-종양 CD8+ T 세포 반응을 복원함으로써 치료 효과를 발휘하기 위해, PD-L1 상호 작용의 억제가 제안되며, 따라서 전임상(preclinical) 효능 연구는 숙주의 면역계가 충분히 무손상된(fully intact) 동계(syngeneic) 뮤린 종양 모델에서 수행되었다. 인간 PD-1 이식유전자를 가진 마우스가 이용되었다. 이 연구에서, 마우스에 1 × 10⁶ 개의 인간 PD-L1 과발현 MC38 결장 암종 세포를 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 종양이 ~100 mm³의 평균 부피에 도달했을 때, 마우스를 처리 군으로 분류하였다 (n = 5) (연구 0일차로 정의됨). 본 연구에서 테스트된 6가지 인간화된 HCAbs의 목록은 다음과 같다: AS06730QVH1, AS06750VH11, AS11948SVH12, AS06617VH11, AS06617VH11, AS11948QVH1 및 AS06775VH11. 집단에 벤치마크 항체 MEDI4736 (10 mg/kg) 또는 인간화된 HCAbs (5.33 mg/kg)를 0일, 2일, 5일, 7일, 9일 및 12일차에 정맥내로 투여하였다. 대조군 집단은 10 ml/kg의 PBS로 처리하였다. 연구 기간 동안 매주 2 회 종양을 측정하였다. 모든 처리 그룹은 대조군과 비교할 때, 상당한 효능을 나타냈다 (P <0.050) (도 12). 이러한 관찰은 항-종양 CD8+T 세포 반응을 유도하기 위한 효과적인 전략으로서 항-PD-L1 요법을 뒷받침한다.

표 15: 단리된 sdAbs의 CDRs

sdAb	ID	CDR1	ID	CDR2	ID	CDR3
AS06617	51	GRTFISYAVG	151	GIRWNGIHTDYADSVKG	251	HRTIATIPEKYEYEY
AS06618	52	GRTFLSYAVG	152	GIRWSGGYTDYAEAVKG	252	HRTIATIPEKYEYEY
AS06624	53	GRTFLTYALG	153	GVSWSGSGTKYADSVKG	253	QISAIVPISAHEYEY
AS06628	54	GRTFITYAIG	154	AINWSGSMTSYADSVKG	254	HRGAIAPMTQSVYDY
AS06639	55	GRTFITYAIG	155	AINWSGSMTSYADSVKG	255	HRGAIAPMTQSVYDT
AS06682	56	GRTFLSYAVG	156	GIRWSGEHTDYAASVKG	256	HTTIATIPKKYEYEY
AS06686	57	GRTFLTYALG	157	GVSWSGSSTKYADSVKG	257	QISAIVPISAHEYQY
AS06703	58	GRTFITYAIG	158	AINWSGSMTSYADSVKG	258	HLGAIAPMSQSVYDY
AS06709	59	GRTFLSYAVG	159	GIRWSGGSTDYSDSVKG	259	HRTIATIPEKYEYEY
AS06730	60	GRTFITYAIG	160	AINWSGSMTSYADSVKG	260	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06750	61	GRTFLTYAVG	161	GIRWSGGYTDYADSVKG	261	HRTIATIPEKYEYEY
AS06752	62	GRTFLTYAVG	162	GIRWSGESTDYAESVKG	262	HRTIATIPEKYYYEY
AS06763	63	GRPVSSAVMG	163	RLTSSATSTFYAESVKG	263	DVPGTKIWSIQTPDRYNY
AS06766	64	GRTLTGLLIG	164	IISWTYGSTNYADSVKG	264	RDVAVAKYDS
AS06775	65	GRTFLTLAVG	165	GIRWSGSGTDYADSVKG	265	HTTIATIPEKYEYEY
AS06778	66	GRTFITYAMG	166	AISWSGSSTYSADSVKG	266	EVSARTGEHLPKLMGDY
AS06786	67	GRTFLTLAVG	167	GIRWSGSGTDYADSVKG	267	HTTIATIPEKYEYEY
AS06791	68	GRTFITYAIG	168	AINWSGSMTSYADSVKG	268	HRGAIAPMTQSVYDY
AS06808	69	GRTFSRYAMG	169	TSTGSGGLTSYANSVKG	269	NRYNSDSRYMSSYDW
AS06810	70	GRTFLSYAVG	170	GIRWSGLHTDYADSVKG	270	HRTIATIPEKYEYEY
AS11947	71	GRTFISYAVG	171	GIRWNGISTDYTDSVKG	271	HRTIATIPNKYEYDH
AS11948	72	GRTFVTYGMG	172	AINWSGSMTSYGDSVKG	272	ALGAVVYTTREPYTY
AS12003	73	GRTFLSYAVG	173	GIRWSGGSTDYADSVKG	273	HRTIATVPNKYEYDT
AL22863	74	VSSFSINDMG	174	TIAS-GGSTNYADSVKG	274	DFRDWTRRRYSY
AL23474	75	GRTFSNYTMA	175	VVSRGGGATDYADSVKG	275	GTDLSYYYSTKKWAY
AS06730S	76	GRTFITYAIG	176	AISWSGSMTSYADSVKG	276	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06730Q	77	GRTFITYAIG	177	AIQWSGSMTSYADSVKG	277	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06730QVH1	78	GRTFITYAIG	178	AIQWSGSMTSYADSVKG	278	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06730QVH2	79	GRTFITYAIG	179	AIQWSGSMTSYADSVKG	279	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06730QVH3a	80	GRTFITYAIG	180	AIQWSGSMTSYADSVKG	280	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06730SVH12	81	GRTFITYAIG	181	AISWSGSMTSYADSVKG	281	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06730SVH12M8	82	GRTFITYAIG	182	AISWSGSITSYADSVKG	282	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06730SVH12M9	83	GRTFITYAIG	183	AISWSGSLTSYADSVKG	283	HRGAIAPIAQSVYTN
AS06750VH1	84	GRTFLTYAVG	184	GIRWSGGYTDYADSVKG	284	HRTIATIPEKYEYEY
AS06750VH2	85	GRTFLTYAVG	185	GIRWSGGYTDYADSVKG	285	HRTIATIPEKYEYEY
AS06750VH3	86	GRTFLTYAVG	186	GIRWSGGYTDYADSVKG	286	HRTIATIPEKYEYEY
AS06750VHa	87	GRTFLTYAVG	187	GIRWSGGYTDYADSVKG	287	HRTIATIPEKYEYEY
AS06750VH11	88	GRTFLTYAVG	188	GIRWSGGYTDYADSVKG	288	HRTIATIPEKYEYEY
AS11948A	89	GRTFVTYGMG	189	AIAWSGSMTSYGDSVKG	289	ALGAVVYTTREPYTY
AS11948S	90	GRTFVTYGMG	190	AISWSGSMTSYGDSVKG	290	ALGAVVYTTREPYTY
AS11948Q	91	GRTFVTYGMG	191	AIQWSGSMTSYGDSVKG	291	ALGAVVYTTREPYTY
AS11948QVH1	92	GRTFVTYGMG	192	AIQWSGSMTSYGDSVKG	292	ALGAVVYTTREPYTY
AS11948QVH2	93	GRTFVTYGMG	193	AIQWSGSMTSYGDSVKG	293	ALGAVVYTTREPYTY
AS11948QVHa	94	GRTFVTYGMG	194	AIQWSGSMTSYGDSVKG	294	ALGAVVYTTREPYTY
AS11948SVH12	95	GRTFVTYGMG	195	AISWSGSMTSYGDSVKG	295	ALGAVVYTTREPYTY
AS11948SVH12M8	96	GRTFVTYGMG	196	AISWSGSITSYGDSVKG	296	ALGAVVYTTREPYTY
AS11948SVH12M9	97	GRTFVTYGMG	197	AISWSGSLTSYGDSVKG	297	ALGAVVYTTREPYTY
AS06617VH11	98	GRTFISYAVG	198	GIRWSGIHTDYADSVKG	298	HRTIATIPEKYEYEY
AS06775VH11	99	GRTFLTLAVG	199	GIRWSGSGTDYADSVKG	299	HTTIATIPEKYEYEY
AS06775VH4	100	GRTFLTYAVG	200	GIRWSGGYTDYADSVKG	300	HRTIATIPEKYEYEY

ID: 서열 번호

표 16: 프레임워크 영역 1 및 2

sdAb	ID	FR-1	ID	FR-2
AS06617	1	DVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAS	101	WFRQAPGSEREFVA
AS06618	2	EVQLVESGGRLVRAGDSLRLSCAAS	102	WFRQAPGTEREFVA
AS06624	3	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLACSAS	103	WFRQAPGKEREFVA
AS06628	4	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS	104	WFRQAPGKEREFVT
AS06639	5	AVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS	105	WFRQAPGKEREFVS
AS06682	6	AVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTAS	106	WFRQAPGTEREFVA
AS06686	7	AVQLVESGGGLVQAGDSLRLACAAS	107	WFRQAPGKEREFVA
AS06703	8	EVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCAAS	108	WFRQAPGKEREFVT
AS06709	9	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTAS	109	WFRQAPGTEREFVA
AS06730	10	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS	110	WFRQAPGKEREFVS
AS06750	11	AVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCTAS	111	WFRQAPGTEREFVA
AS06752	12	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAS	112	WFRQAPGTEREFVA
AS06763	13	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVS	113	WFRQAPGKEREFVG
AS06766	14	EVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCAVS	114	WFRQAPGKERELVA
AS06775	15	QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAS	115	WFRQAPGTEREFVA
AS06778	16	QVQLVESGGGLVQAGGSLKLSCAAS	116	WFRQAPGKERELVA
AS06786	17	QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAS	117	WFRQAPGTEREFVA
AS06791	18	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS	118	WFRQAPGKEREFVT
AS06808	19	QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVAS	119	WFRQAPGKEREFVS
AS06810	20	AVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAS	120	WFRQAPGTEREFVA
AS11947	21	DVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCSAS	121	WFRQAPGTEREFVA
AS11948	22	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCVAS	122	WFRQAPGKEREFVA
AS12003	23	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAS	123	WFRQAPGTEREFVA
AL22863	24	QVKLEESGGGLVQVGDSLRLSCAAS	124	WYRQAPGKQRELVA
AL23474	25	QVKLEESGGGLVQVGDSLRLSCAAS	125	WFRQFPGKEREFVA
AS06730S	26	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS	126	WFRQAPGKEREFVS
AS06730Q	27	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS	127	WFRQAPGKEREFVS
AS06730QVH1	28	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	128	WVRQAPGKGLEWVS
AS06730QVH2	29	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	129	WFRQAPGKGLEWVS
AS06730QVH3a	30	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	130	WFRQAPGKGLEFVS
AS06730SVH12	31	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	131	WFRQAPGKGREFVS
AS06730SVH12M8	32	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	132	WFRQAPGKGREFVS
AS06730SVH12M9	33	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	133	WFRQAPGKGREFVS
AS06750VH1	34	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	134	WVRQAPGKGLEWVS
AS06750VH2	35	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	135	WFRQAPGKGLEWVA
AS06750VH3	36	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	136	WFRQAPGKGLEFVA
AS06750VHa	37	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS	137	WFRQAPGKGLEFVA
AS06750VH11	38	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	138	WFRQAPGKGREFVS
AS11948A	39	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCVAS	139	WFRQAPGKEREFVA
AS11948S	40	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCVAS	140	WFRQAPGKEREFVA
AS11948Q	41	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCVAS	141	WFRQAPGKEREFVA
AS11948QVH1	42	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	142	WVRQAPGKGLEWVS
AS11948QVH2	43	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	143	WFRQAPGKGLEFVA
AS11948QVHa	44	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVAS	144	WFRQAPGKGREFVS
AS11948SVH12	45	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	145	WFRQAPGKGREFVS
AS11948SVH12M8	46	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	146	WFRQAPGKGREFVS
AS11948SVH12M9	47	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	147	WFRQAPGKGREFVS
AS06617VH11	48	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	148	WFRQAPGKGREFVS
AS06775VH11	49	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	149	WFRQAPGKGREFVS
AS06775VH4	50	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS	150	WFRQAPGKGLEFVS

ID: 서열 번호; FR: 프레임워크 영역

표 17: 프레임워크 영역 3 및 4

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ID: 서열 번호; FR: 프레임워크 영역

SEQUENCE LISTING <110> Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. <120> Single-domain antibodies and variants thereof against PD-L1 <160> 445 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 1 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Arg Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ser Ala Ser 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 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356 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AS11948SVH12 <400> 438 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Val Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Trp Ser Gly Ser Met Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Gly Ala Val Val Tyr Thr Thr Arg Glu Pro Tyr Thr 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser 115 120 125 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 130 135 140 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 145 150 155 160 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 165 170 175 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 180 185 190 Val His Asn Ala Lys Thr 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Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 444 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 445 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 445 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15

Claims

PD-L1을 특이적으로 인지하는 단일-도메인 항체(sdAb) 모이어티를 포함하는 단리된 항-PD-L1 구조체에 있어서, 상기 sdAb 모이어티는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 1에 있어서, 상기 sdAb 모이어티는 다음중 임의의 하나를 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체:
(1) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 151의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(2) 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 152의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 252의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(3) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 153의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(4) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 154의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 254의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(5) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 155의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 255의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(6) 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 156의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 256의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(7) 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 157의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 257의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(8) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 158의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 258의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(9) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 159의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 259의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(10) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 160의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 260의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(11) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 161의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 261의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(12) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 262의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(13) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 263의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(14) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 264의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(15) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 165의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 265의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(16) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 166의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(17) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 167의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(18) 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 168의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(19) 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 169의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(20) 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 170의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 270의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(21) 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 171의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 271의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(22) 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 172의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 272의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(23) 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 173의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 273의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(24) 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 174의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 274의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(25) 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 175의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 275의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(26) 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 176의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 276의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(27) 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 177의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 277의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(28) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 278의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(29) 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 279의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(30) 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 180의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 280의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(31) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 181의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 281의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(32) 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 182의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 282의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(33) 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 183의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 283의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(34) 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 184의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 284의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(35) 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 185의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 285의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(36) 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 186의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 286의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(37) 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 187의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 287의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(38) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 188의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 288의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(39) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 189의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 289의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(40) 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 190의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 290의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(41) 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 191의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 291의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(42) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 192의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 292의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(43) 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 193의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 293의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(44) 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 194의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 294의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(45) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 295의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(46) 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 296의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(47) 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 297의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(48) 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 198의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 298의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(49) 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 199의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 299의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체;
(50) 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 그리고 서열 번호: 300의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 CDR 영역에 최대 약 3개(이를 테면, 약 1, 2, 또는 3개중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체.
청구항 1-2중 임의의 한 항에 있어서, 상기 sdAb 모이어티는 다음중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체:
a-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I, 및 V; 바람직하게는 Y 및 V으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 더욱 바람직하게는 F이며;
a-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, G, Q, R, S, 및 L, 바람직하게는 Q 및 G로 구성된 군에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 E이며;
a-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 L, R, 및 C로 구성된 군에서 선택되며;
a-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R, G, 및 S로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
a-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며; 또는
b-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I, 및 V; 바람직하게는 Y 및 V으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 더욱 바람직하게는 F이며;
b-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 E, Q 및 G로 구성된 군에서 선택되며;
b-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 R이며;
b-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R, 및 S로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
b-5) 위치 108의 아미노산 잔기는Q 및 L로 구성된 군에서 선택되며;
이때 상기 아미노산 위치는 Kabat 번호매김에 따른다.
청구항 3에 있어서, 상기 sdAb 모이어티는 다음중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체:
a-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I, 및 V; 바람직하게는 Y 및 V으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 더욱 바람직하게는 F이며;
a-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 G, E 및 Q로 구성된 군에서 선택되며;
a-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 L 및 R로 구성된 군에서 선택되며;
a-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W, G, 및 R로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
a-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며; 또는
b-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, L, I 및 V로 구성된 군에서 선택되며;
b-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 E, G 및 Q로 구성된 군에서 선택되며;
b-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 R이며;
b-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W; 그리고 G이며;
b-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며;
이때 상기 아미노산 위치는 Kabat 번호매김에 따르며, 이때 위치 108의 Q는 임의선택적으로 L로 인간화된다.
청구항 4에 있어서, 상기 sdAb 모이어티는 다음중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체:
a-1) 위치 37의 아미노산 잔기는 F, Y, 및 V로 구성된 군에서 선택되며;
a-2) 위치 44의 아미노산 잔기는 G, E 및 Q로 구성된 군에서 선택되며;
a-3) 위치 45의 아미노산 잔기는 L 및 R로 구성된 군에서 선택되며;
a-4) 위치 103의 아미노산 잔기는 W; 그리고 G이며;
a-5) 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며; 또는
이때 상기 아미노산 위치는 Kabat 번호매김에 따르며, 이때 위치 108의 Q는 임의선택적으로 L로 인간화된다.
청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 상기 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나에 대하여 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 V_HH 도메인을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 6에 있어서, 상기 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 V_HH 도메인, 또는 V_HH 도메인에서 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 상기 sdAb 모이어티와 PD-L1 간의 결합 K_D는 약 10^-5 M 내지 약 10^-12 M, 약 10^-7 M 내지 약 10^-12 M, 또는 약 10^-8 M 내지 약 10^-12 M인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 1-8중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 카멜리드, 키메라, 인간, 부분적으로 인간화된, 또는 온전하게 인간화된, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 오로지-중쇄 항체 (HCAb)인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 90에 있어서, 이때 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 인간 IgG1 Fc에 융합된, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 90 또는 101에 있어서, 상기 HCAb는 단량체성 또는 이량체성인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 10-12중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 서열 번호: 351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 10-12중 임의의 한 항에 있어서, 상기 HCAb는 서열 번호: 401-440중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 제 2 항원을 특이적으로 인지하는 제 2 항체 모이어티를 더 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 15에 있어서, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 전장의 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), scFv-scFv, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), sdAb, 또는 항체 모방체인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 15 또는 16에 있어서, 이때 상기 항-PD-L1 구조체는 단일특이성 또는 다중특이성인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 15-17중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 sdAb인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 15-18중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 2 항원은 PD-L1인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 19에 있어서, 이때 상기 단리된 항-PD-L1 구조체는 PD-L1을 특이적으로 인지하는 3개 또는 그 이상의 sdAbs인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 19 또는 20에 있어서, 이때 상기 제 2 항체는 서열 번호:351-400중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 15-18중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 2 항원은 인간 혈청 알부민 (HSA)인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 15-18중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 2 항원은 CTLA-4이며, 상기 제 2 항체는 항-CTLA-4 sdAb인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 15-23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티는 상기 제 2 항체 모이어티에 대해 아미노 (N)-말단 및/또는 카르복시 (C)-말단인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 15-21중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 2 항체 모이어티는 전장(full-length)의 항체인, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 25에 있어서, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 상기 아미노 (N)-말단은 전장 항체의 중쇄중 최소한 하나의 카르복시 (C)-말단에 융합된, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 25에 있어서, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티의 C-말단은 전장-항체의 중쇄중 최소한 하나의 N-말단에 융합된, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 25-27중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 전장 항체는 TIGIT, TIM-3, 및 LAG-3으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 25-28중 임의의 한 항에 있어서, 이때 sdAb 모이어티에 의해 특이적으로 인지되는PD-L1은 서열 번호:441-442의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 25-28중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 PD-L1을 특이적으로 인지하는 sdAb 모이어티 및 상기 제 2 항체 모이어티는 임의선택적으로 펩티드 링커에 의해 연계되는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 280에 있어서, 이때 상기 펩티드 링커는 구이때 상기 펩티드 링커는 서열 번호: 443-445의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 1-31중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체와 PD-L1에 경쟁적으로 특이적 결합하는 제 2 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 32에 있어서, 상기 제 2 단리된 항-PD-L1 구조체는 서열 번호: 51-100중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체; 서열 번호: 151-200중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체; 그리고 서열 번호: 251-300중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 최대 약 3개 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 제 2 단리된 항-PD-L1 구조체.
청구항 1-33중 임의의 하나의 단리된 항-PD-L1 구조체 및 약제학적 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
PD-L1-관련된 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에 있어서, 청구항 34의 약제학적 조성물중 임의의 하나의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
청구항 35에 있어서, 이때 상기 PD-L1 관련된 질환은 암인, 방법.
청구항 36에 있어서, 이때 상기 암은 고형 종양인, 방법.
청구항 36 또는 37에 있어서, 이때 상기 암은 결장암인, 방법.
청구항 36-38중 임의의 한 항에 있어서, 상기 개체에게 추가 암 요법을 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
청구항 39에 있어서, 이때 상기 추가 암 요법은 수술, 방사능, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 또는 이의 조합인, 방법.
청구항 35에 있어서, 이때 상기 PD-L1 관련된 질환은 병원성 감염인, 방법.
청구항 35-41중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 약제학적 조성물은 전신으로 또는 국소적으로 투여되는, 방법.
청구항 42에 있어서, 이때 상기 약제학적 조성물은 정맥내로 투여되는, 방법.
청구항 42에 있어서, 이때 상기 약제학적 조성물은 종양내로 투여되는, 방법.
청구항 35-44중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 개체는 인간인, 방법.