JP2009521224A - 組み換え法によって生物活性ビタミンk依存性タンパク質を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2005年12月21日に提出された米国仮特許出願第60/752,642号(参照により本明細書中に援用される)に対する優先権を主張する。
又は政府援助プログラムにほとんどの場合依存している。平均して、米国において血友病治療には、日常的に要望に応じたケアに必要な市販製品のために毎年1人の患者当たり約50000ドルかかると推測される。しかし、米国血友病財団の医学科学諮問委員会によって、患者が、成人の血友病患者の場合、毎年250000ドルをはるかに超える年間コストがかかり得る予防的治療を受けることを勧められている限り、このコストはますます高くなる可能性がある。約100万ドルという生命保険の上限額が一般的に米国のほとんどの政策に結び付いていると考えると、血友病患者がケアのために購入することができる市販製品の量は厳しく制約され、このことが少なくとも成人期の生活の質に影響し、最悪の場合生死にかかわる出血の危険性が増大する。
る第IX因子が依然としてプロペプチド領域を含有し、非機能的であることが見出された(Bond, M., Jankowski, M., Patel, H., Karnik, S., Strand, A., Xu, B.,他(1998)著「組み換え第IX因子の生化学的特徴(Biochemical characterization of recombinant factor IX)」. Semin. Hematol. 35 [2 Suppl.2], 11-17)。
。さらに好ましくは、少なくとも80%のビタミンK依存性タンパク質が生物活性である。
(a)哺乳動物細胞を、プロモータと作用可能に連結するビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程、
(b)高レベルのビタミンK依存性タンパク質産物を発現する細胞を選択する工程、
(c)選択された細胞を、プロモータと作用可能に連結する1つ又は複数のプロセシング因子でトランスフェクトする工程、
(d)工程(b)を繰り返す工程、
(e)任意で、工程(a)及び/又は工程(c)の後に工程(b)を繰り返す工程、
(f)選択された細胞をクローン化する工程、
(g)クローン化した細胞を増幅する工程、並びに
(h)少なくとも15mg/Lの量の組み換え生物活性ビタミンK依存性タンパク質でクローン化した細胞から産物を回収する工程、
を含む、組み換え生物活性ビタミンK依存性タンパク質産物を製造する方法に関する。
るまで、開始(ポリクローナル)培養物を段階希釈する。
ski, M., Patel, H., Karnik, S., Strand, A., Xu, B.,他(1998)著「組み換え第IX因子の生化学的特徴(Biochemical characterization of recombinant factor IX)」 Semin. Hematol. 35 [2 Suppl.2], 11- 17)。
シド還元酵素(VKOR)の酵素活性を有する。幾つかの好ましい実施形態では、このような酵素の別の1つがビタミンK依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ(VKGC)の酵素活性を有する。幾つかの好ましい実施形態では、このような酵素の別の1つが対になったアミノ酸切断酵素、すなわちPACE又はフリンの酵素活性を有する。
ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照によって本明細書に援用される。
幾つかの実施形態において、γ−カルボキシル化は、米国特許出願第2003/0220247号(参照により本明細書中に援用される)に記載されるように、天然のプロペプチド配列をγ−カルボキシラーゼに対して低親和性であるプロペプチド配列で置き換えることによって増大される。有用なプロペプチド配列としては、異種ビタミンK依存性タンパク質に対する代替形態の野生型配列若しくはプロペプチド配列、又はその組合せが挙げられる。ビタミンK依存性タンパク質のプロペプチド配列はタンパク質のγ−カルボキシル化を導く酵素に対する認識因子である。ビタミンK依存性タンパク質が高い割合のγ−カルボキシル化部分を含まない場合、ビタミンK依存性タンパク質は完全に機能的ではない。したがって、これらのタンパク質の組み換え型が生じる際にその完全なγ−カルボキシル化を確実にするように機構が整備されることが重要である。
本明細書中で用いられるように、「PACE」という用語は対になった塩基性アミノ酸変換(又は切断)酵素の頭文字である。元々はヒト肝細胞株から単離されたPACEはサブチリシン様エンドペプチダーゼ、すなわちポリペプチドの塩基性残基、例えば−Lys−Arg−、−Arg−Arg、又は−Lys−Lys−での切断に対して特異性を示すプロペプチド切断酵素である。PACEはカルシウムイオンによって刺激され、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)によって阻害される。PACE(又はフリン)をコードするDNA配列が、米国特許第5,460,950号(参照により本明細書中に援用される)の図1(配列番号1)で表される。PACEと、成熟タンパク質の産生にプロセシングが必要な前駆タンパク質との同時発現によって、成熟タンパク質が高レベルで発現される。さらに、PACEと、生物活性にγ−カルボキシル化が必要なタンパク質との同時発現によって、真核生物、好ましくは哺乳動物の細胞において高収率の機能的な生物活性成熟タンパク質が発現される。
ビタミンKが補因子である反応中に、ビタミンKがビタミンKエポキシドに変換されるので、ビタミンK依存性エポキシド還元酵素(VKOR)はビタミンK依存性タンパク質に重要である。ヒトの食事におけるビタミンKの量は制限される。したがって、ビタミン
Kエポキシドは、枯渇を防ぐためにVKORによってビタミンKに戻し変換させる必要がある。結果として、VKORによる同時トランスフェクションによって、ビタミンK依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ(VKCG)等のビタミンK依存性酵素を適切に機能させるのに十分なビタミンKが与えられる。ビタミンK依存性VKCGの適切な機能は、ビタミンK依存性凝固因子のglaドメインの適切なγ−カルボキシル化に不可欠である。
ビタミンK依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ(VKGC)は、ビタミンK依存性タンパク質の翻訳後修飾に関与するER酵素である。VKGCによって、CO2がグルタミン酸に取り込まれ、プロペプチドの約40残基内のビタミン依存性タンパク質内の複数の残基を修飾する。3つのカルボキシル化の喪失によって、ビタミンK依存性凝固因子等のビタミンK依存性タンパク質の活性が顕著に低減される。ヒトのビタミンK依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼに対するcDNA配列は、米国特許第5,268,275号(参照により本明細書中に援用される)に記載される。この配列は、米国特許第5,268,275号の配列番号15で与えられる。
遺伝子操作によるクローン遺伝子、組み換えDNA、ベクター、形質転換宿主細胞、タンパク質、及びタンパク質断片の産生は既知である。たとえば、Bell他への米国特許第4,761,371号の第6欄3行目〜第9欄65行目、Clark他への米国特許第4,877,729号の第4欄38行目〜第7欄6行目、Schillingへの米国特許第4,912,038号の第3欄26行目〜第14欄12行目、及びWallnerへの米国特許第4,879,224号の第6欄8行目〜第8欄59行目を参照されたい。
本発明の実施形態は、より高収率の生物活性ビタミンK依存性タンパク質が達成されるように、ビタミンK依存性タンパク質をプロセシングするのに必要な酵素及び補因子を細胞に与えることに関する。適切なレベルの完全に機能的なビタミンK依存性タンパク質が組み換え細胞によって産生される場合、所望の産物から不要の部分修飾、又は非修飾のビタミンK依存性タンパク質を取り除くように設計された長期にわたる精製工程が避けられる。このことによって製造コストが抑えられ、患者にとって望ましくない副作用を有し得る不活性材料が排除される。
択及び利用することができる。
好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母又はより高等な真核生物の細胞、例えば哺乳動物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多細胞生物由来の細胞は、組み換えビタミンK依存性タンパク質の合成に特に好適な宿主であり、哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞培養下でのこのような細胞の増殖は決められた手順になっている(Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973))。有用な宿主細胞株の例はVERO細胞及びHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、並びにWI138、HEK293、BHK、COS−7、CV、及びMDCK細胞株である。このような細胞に対する発現ベクターには通常、(必要であれば)複製起点、リボソーム結合部位と共に、発現するビタミンK依存性タンパク質をコードするDNAの上流に位置し、操作可能に結び付くプロモータ、RNAスプライシング部位(イントロン含有ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列が含まれる。好ましい実施形態では、米国特許第5,888,809号(参照により本明細書中に援用される)の発現系を用いて、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で発現が行われる。
399,216号(参照により援用される)にさらに記載される。
Nature 281, 40、A. Levinson他, 欧州特許出願第117,060A号及び同第117,058A号に記載されるものが挙げられる。
コードし得る。本明細書中に開示されるタンパク質をコードするDNAでハイブリダイズ可能なビタミンK依存性タンパク質をコードするDNAも包含される。このような配列のハイブリダイゼーションは、低減したストリンジェント条件、又はストリンジェントな条件(例えば標準的なin situハイブリダイゼーションアッセイにおける本明細書中で開示されるビタミンK依存性タンパク質をコードするDNAに対する60℃又はさらに70℃での0.3MのNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム、0.1%のSDSの洗浄ストリンジェンシー(wash stringency)で表される条件)下であっても行うことができる。J. Sambrook他著「分子クローン化、研究所マニュアル)(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)(第2版)(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory))。
第IX因子の遺伝子によるCHO細胞の一次トランスフェクション
96ウェルプレートへの限界希釈によって、野生型の第IX因子の遺伝子をCHO細胞にトランスフェクトした。第IX因子の遺伝子はCHEF−1プロモータの制御下であった。細胞を14日間、5%の血清中で培養させた。細胞培養培地を回収し、第IX因子抗原の全量(μg/mL)を第IX因子のELISA法によって定量した。150個を超えるクローンを評価し、1つのクローン当たりに産生された第IX因子の全量を図1に示す。
VKGC遺伝子及びVKOR遺伝子による第IX因子産生CHO細胞のスーパートランスフェクション(Supertransfection)
第IX因子をトランスフェクトしたCHO細胞で産生した活性第IX因子の割合を増大させるために、一次トランスフェクタントをプールし、組織培養下に広げて、一般的に第IX因子の効果的なビタミンK依存性γ−カルボキシル化に重要であると考えられる酵素に対するcDNAを含有するベクターでスーパートランスフェクトした。第IX因子産生クローンを振盪フラスコにプールし、ビタミンK依存性γ−カルボキシラーゼ(VKGC)及びビタミンK依存性エポキシド還元酵素(VKOR)の両方に対するcDNAでスーパートランスフェクトした。個別にスーパートランスフェクトした細胞を5%血清の入った96ウェルプレートで限界希釈によって、14日間培養させた。1mL当たりに産生した第IX因子抗原の全量を第IX因子のELISAによって求めた。活性第IX因子の量を、基質として第IX因子欠損血漿、及び標準として血漿由来第IX因子を用いて、APTT凝固アッセイによって求めた。
大量の生物活性組み換え第IX因子の大規模産生
VKGC及びVKORによってスーパートランスフェクトした第IX因子産生CHO細胞が大量の生物活性第IX因子を産生することができることを実証するために、2つの独立して単離したクローンをバイオリアクターで培養し、材料を精製した後に第IX因子産物の量及び質を評価した。血清無含有培地の入ったバイオリアクターを用いて、クローン130(12L容のバイオリアクター)及びクローン44(10L容のバイオリアクター)を培養した。これらのクローンの両方がヒトの第IX因子、VKGC及びVKORを発現した。バイオリアクターを培地を変えずに12日間培養させた。組織培養液を細胞から分離し、第IX因子を標準セットのクロマトグラフィカラムによって精製して、90%を超える純度の第IX因子タンパク質を得た。
第IX因子、VKGC及びVKORを産生するクローンのVKORによる再トランスフェクション
トランスフェクトしたCHO細胞で生物活性組み換え第IX因子を産生することができるか否かを求めるために、VKGC及びVKORでスーパートランスフェクトした後に第IX因子を産生した2つのクローン、クローン130及びクローン44をVKORによって再びトランスフェクトさせた。クローン130及びクローン44の個別の単離物を限界希釈によってクローン化し、VKORに対するcDNAで再びトランスフェクトさせた。クローンは6ウェルプレートで培養させ、細胞が密集するまで9日間培養した。第IX因子のELISAによって全第IX因子抗原(μg/mL)を求め、第IX因子欠損血漿を用いたAPTT凝固アッセイによって活性(U/mL)を求めた。
翻訳後修飾酵素であるVKORで再びトランスフェクトした遺伝子操作細胞における生物活性第IX因子の大規模産生
この実験は、VKGC及びVKORによるトランスフェクション後に組み換え第IX因
子を産生し、VKORで再びトランスフェクトしたCHO細胞が生産規模で大量の第IX因子を産生することができることを実証するように設計された。VKORで再びトランスフェクトしたクローン130の個別の単離物を1.5L容の振盪フラスコで増殖させ(商業生産を表すため)、第IX因子抗原及び生物活性を求めた。上記の実施例4で記載されるクローン130の個別のサブクローン(第IX因子、VKGC及びVKORでトランスフェクトし、その後VKORで再びトランスフェクトしたCHOクローン)を6ウェルマイクロタイタープレートにおける限界希釈によって単離し、それから1.5L容の振盪フラスコに播種した。1.5L容の振盪フラスコ中の第IX因子の産生は、15L容以上のバイオリアクターの産生条件を反映することが知られている(データ図示せず)。細胞を血清無含有培地で18日間増殖させ、その時点のサンプルを採取し、第IX因子抗原に関しては第IX因子のELISAによって、及び生物活性に関しては第IX因子欠損血漿を用いたAPTT凝固アッセイによって評価した。
Claims (35)
- 哺乳動物細胞を、プロモータと作用可能に連結されたビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子と、少なくとも1つのプロモータと作用可能に連結されたプロセシング因子をコードする少なくとも1つの遺伝子とで、同時に又は逐次トランスフェクトする工程、及び
前記ビタミンK依存性タンパク質産物を回収する工程を含む、組み換え生物活性ビタミンK依存性タンパク質産物を製造する方法であって、前記細胞が、少なくとも約15mg/Lの量の生物活性ビタミンK依存性タンパク質産物を産生することを特徴とする方法。 - 前記ビタミンK依存性タンパク質産物が、第II因子、第VII因子、第IX因子、第X因子、プロテインC及びプロテインSから成る群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質が第IX因子である、請求項2に記載の方法。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質が第VII因子である、請求項2に記載の方法。
- 前記プロセシング因子が、1つ又は複数のプロモータと作用可能に連結された、対塩基性アミノ酸変換酵素(PACE)、ビタミンK依存性エポキシド還元酵素(VKOR)、ビタミンK依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ(VKGC)、及びそれらの組合せから成る群より選択される核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記プロセシング因子タンパク質がVKOR及びVKGCを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記遺伝子の少なくとも1つが過剰発現する、請求項5に記載の方法。
- 前記過剰発現した遺伝子が、チャイニーズハムスター伸長因子1−α(CHEF1)プロモータと作用可能に連結された、請求項7に記載の方法。
- 前記生物活性ビタミンK依存性タンパク質産物のglaドメイン内の少なくとも約75%のグルタミン酸残基がγ−カルボキシル化された、請求項1に記載の方法。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質の少なくとも25%が生物的に活性である、請求項1に記載の方法。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質の少なくとも50%が生物的に活性である、請求項10に記載の方法。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質の少なくとも80%が生物的に活性である、請求項11に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が、CHO細胞及びHEK293細胞から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記生物活性ビタミンK依存性タンパク質が、少なくとも約20mg/Lの量で産生される、請求項1に記載の方法。
- 前記生物活性ビタミンK依存性タンパク質が、少なくとも約30mg/Lの量で産生さ
れる、請求項14に記載の方法。 - 前記生物活性ビタミンK依存性タンパク質が、少なくとも約50mg/Lの量で産生される、請求項15に記載の方法。
- トランスフェクションが逐次であり、前記哺乳動物細胞をトランスフェクトすることが、
高レベルの前記ビタミンK依存性タンパク質産物又は前記プロセシング因子を発現する細胞を選択すること、
前記選択された細胞をクローン化すること、及び
前記クローン化した細胞を増幅すること、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記プロセシング因子をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程が、前記ビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程の前に行なわれる、請求項17に記載の方法。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程が、前記プロセシング因子をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程の前に行なわれる、請求項17に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が、トランスフェクション前に、内因性レベルの1つ又は複数のプロセシング因子の発現に対して選択される、請求項17に記載の方法。
- プロモータと作用可能に連結されたビタミンK依存性タンパク質の遺伝子と、少なくとも1つのプロモータと作用可能に連結された少なくとも1つのプロセシング因子の遺伝子とを含む組み換え哺乳動物細胞であって、該細胞において、少なくとも1つのプロセシング因子の遺伝子によってコードされた前記タンパク質の発現が、少なくとも約15mg/Lの量の生物活性ビタミンK依存性タンパク質の製造を容易にする、組み換え哺乳動物細胞。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質が、第II因子、第VII因子、第IX因子、第X因子、プロテインC及びプロテインSから成る群より選択される、請求項21に記載の組み換え哺乳動物細胞。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質が第IX因子又は第VII因子である、請求項22に記載の組み換え哺乳動物細胞。
- 前記プロセシング因子が、前記細胞における発現のための、1つ又は複数のプロモータと作用可能に連結された、PACE、VKOR、VKGC及びそれらの組合せから成る群より選択されるプロセシング遺伝子産物を産生する遺伝子である、請求項21に記載の組み換え哺乳動物細胞。
- 前記プロセシング因子がVKOR及びVKGCを含む、請求項21に記載の組み換え哺乳動物細胞。
- 前記プロセシング遺伝子産物の少なくとも1つが、同じ系統のトランスフェクトしていない正常な細胞において見られるものよりも高いレベルで発現される、請求項24に記載の組み換え哺乳動物細胞。
- 前記過剰発現した遺伝子産物が、チャイニーズハムスター伸長因子1−α(CHEF1)プロモータと作用可能に連結された、請求項26に記載の組み換え哺乳動物細胞。
- CHO細胞又はHEK293細胞である、請求項21に記載の組み換え哺乳動物細胞。
- 請求項1に記載の方法によって産生される組み換え第IX因子タンパク質。
- 請求項29に記載の第IX因子タンパク質を含む薬学的組成物。
- 請求項29に記載の組み換え第IX因子タンパク質を含むキット。
- 血友病を治療する方法における、請求項30に記載の薬学的組成物の使用。
- 請求項21に記載の細胞を選択する方法であって、対応する血漿由来のビタミンK依存性タンパク質に存在する硫酸化レベルの少なくとも25%、及びリン酸化レベルの少なくとも25%含有するように翻訳後修飾されるアミノ酸から成るビタミンK依存性タンパク質を産生することができる天然の修飾酵素を含有する特異的組織培養細胞株の変異体を選択することを含む、請求項21に記載の細胞を選択する方法。
- 前記ビタミンK依存性タンパク質が第IX因子である、請求項33に記載の方法。
- (a)哺乳動物細胞を、プロモータと作用可能に連結されたビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程、
(b)高レベルの前記ビタミンK依存性タンパク質産物を発現する細胞を選択する工程、(c)前記選択された細胞を、プロモータと作用可能に連結された1つ又は複数のプロセシング因子でトランスフェクトする工程、
(d)工程(b)を繰り返す工程、
(e)任意で、工程(a)及び/又は工程(c)の後に工程(b)を繰り返す工程、
(f)前記選択された細胞をクローン化する工程、
(g)前記クローン化した細胞を増幅する工程、並びに
(h)少なくとも15mg/Lの組み換え生物活性ビタミンK依存性タンパク質の量で前記クローン化した細胞から前記産物を回収する工程、
を含む、組み換え生物活性ビタミンK依存性タンパク質産物を製造する方法。
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