JP2009507085A - 濃縮された液体酵素添加剤の安定化 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、濃縮された液体酵素添加剤の沈殿を防ぐための安定化に関する。本発明はさらに、前記液体酵素添加剤の製造方法に関する。
貯蔵安定性の問題は、酵素含有液体において良く知られている。特に酵素含有液体洗剤においては、特に洗剤がプロテアーゼを含む場合、時間にわたって安定した酵素活性を確保することが主要問題である。
従来技術は、例えばプロテアーゼを添加することにより、貯蔵安定性の改良を広範囲に対処して来た。
従って、本発明の目的は、酵素、及び調製の間、及び貯蔵に基づいて、沈殿物を形成しない、ホウ素酸又はその誘導体を含んで成る液体酵素添加剤を供給することである。本発明のさらなる目的は、沈殿物の最少形成を伴って、前記液体酵素添加剤を製造するための方法を提供することである。液体酵素添加剤への界面活性剤の添加が、貯蔵の間に形成される沈殿物の量を有意に低めることが驚くべきことに見出された。
本発明は、第2の観点においては、
i)液体酵素調製物を供給し;
ii)i)の液体を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し;
iii)前記液体酵素添加に、界面活性剤を、段階ii)の前又は後、添加するか、又はホウ素酸又はその誘導体と一緒に添加する段階を含んで成る、濃縮された液体酵素添加剤の製造方法を提供する。
本発明はさらに、前記濃縮された液体酵素添加剤の使用に関する。
定義:
HLB値:
HLB(親水性−親油性バランス)値は、1〜20の指数である。
界面活性剤として作用する化学物質。この用語は、乳化剤、分散剤、油−湿潤剤、水−湿潤剤、発泡剤及び脱泡剤として機能する多数の材料を包含する。乳化剤又は分散剤又は他のものとして作用する界面活性剤挙動性の型は、分子(又は分子の混合物)上の構造基に依存する。
本発明においては、pHは、RadlometerからのpH計測器PHM93、及びRoss(商標)セミ−ミクロ組合わせpH電極(Orion 8103SC)を用いて測定された。使用される前、pH電極は、Radlometer Analyticalからの標準緩衝液(pH4.005オーダー番号:S11M002;pH7.000オーダー番号:S11M004及びpH10.012オーダー番号:S11M007)を用いて検量された。pH、室温(23℃)で測定された。
酵素濃縮物は、液体の除去及び/又は所望しない材料の除去のために暴露された酵素発酵ブイヨンである。
濃縮された液体酵素添加剤:
濃縮された液体酵素添加剤は、最終製品、例えば洗剤の製造において原料又はプレミックスとして使用されるべき製品である。濃縮された液体酵素添加剤は、次において、液体酵素塩化剤又は濃縮された液体酵素添加剤として言及される。
液体洗剤におけるプロテアーゼ安定剤としてのホウ素酸及びその誘導体の使用は、問題を引起すことが示されている。前記プロテアーゼ安定剤を含んで成る液体酵素添加剤を調製する場合、及び前記液体酵素添加剤の貯蔵に基づいて、沈殿物が形成され得ることが見出された。洗剤製造は、それらの製品に添加されるべき液体が透明な液体であることを必要とする。不透明な液体の使用は、最終使用者に、汚染された洗剤の認識を心理学的に与える。従って、所望には、液体洗剤は透明であり、そして従って原料がそこに含まれる。さらに、沈殿物のない液体をポンプで送ることは容易である。前記液体酵素添加剤の製造における問題は、沈殿物が貯蔵に基づいて形成されることである。本発明者は、液体酵素添加物への界面活性剤の添加が沈殿物形成を妨げることを、驚くべきことは見出した。
本発明の液体酵素添加剤は、酵素、ホウ素酸又は誘導体、及び界面活性剤を含んで成る。
本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤は、5.5〜10のpHを有する。本発明のより特定の態様においては、pHは7.5〜10である。
本発明のより特定の態様においては、液体酵素添加剤はさらに、液体酵素添加剤のpHを7.5〜10に調節するためのアルカリ性物質を含んで成る。
本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤は、キレート化剤を含まない。本発明のより好ましい態様においては、液体酵素添加剤は、エタノールアミンを含まない。本発明のさらにより好ましい態様においては、液体酵素添加剤は、ホスホネートを含まない。本発明の最も好ましい態様においては、液体酵素添加剤は、香料を含まない。
液体酵素添加剤は、液体洗剤に添加されるべき濃縮された製品である。従って、液体酵素添加剤に使用される酵素の量は非常に高い。本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤に存在する酵素の量は、少なくとも1.5g/Lである。本発明のより態様においては、酵素の量は少なくとも5g/Lである。本発明のさらなる特定の態様においては、存在する酵素の量は少なくとも10g/Lである。本発明の最も特定の態様においては、存在する酵素の量は、少なくとも20g/L、例えば25g/L以上である。特定の態様においては、酵素の量は、200g/Lを越えない。本発明のより特定の態様においては、酵素の量は、150g/Lを越えない。本発明の最も特定の態様においては、液体酵素添加剤に存在する酵素の量は100g/L以下である。
リパーゼ:適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。
市販のリパーゼの例は、LipexTM, LipoprimeTM, LipopanTM, LipolaseTM, LipolaseTM Ultra, LipozymeTM, PalataseTM, ResinaseTM, NovozymTM 435 及び LecitaseTM (すべた Novozymes A/Sから入手できる)を包含する。
適切なアミラーゼ(α及び/又はβ)は、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。アミラーゼは、例えばGB1,296,839号に詳細に記載される、B. リケニホルミス(B. licheniformis)の特定株から得られたα−アミラーゼを包含する。市販のアミラーゼは、DuramylTM, TermamylTM, FungamylTM 及び BANTM (Novo Nordisk A/Sから入手できる) 及び RapidaseTM及びMaxamyl PTM (Genencorから入手できる)である。
適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、アメリカ特許第4,435,307号に開示されており、これは、ヒューミコラ・インソレンス(Humicola insolens)から生成された菌類セルラーゼを開示する。特に適切なセルラーゼは、色彩保護利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許出願第0495257号に記載されるセルラーゼである。
液体組成物への使用のための適切ないずれかのオキシドレダクターゼ、例えばペルオキシダーゼ又はオキシダーゼが本明細書において使用され得る。本明細書における適切なペルオキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なペルオキシダーゼの例は、コプリナス(Coprinus)の株、例えばC. シネリウス(C. cinerius)又はC. マクロリザス(C. macrorhizus)、バチルスの株、例えばB. プミラス(B. pumilus)由来のそれら、例えば特にWO91/05858号に従ってのペルオキシダーゼである。
b)アルデヒド又はケトン残基を転移するトランスフェラーゼ(EC 2. 2);アシルトランスフェラーゼ(EC 2. 3);
c)グリコシルトランスフェラーゼ(EC 2. 4);
d)アルキル又はメチル基以外のアリールを転移するトランスフェラーゼ(EC 2. 5);及び
e)窒素基を転移するトランスフェラーゼ(EC 2. 6)。
適切なトランスグルタミナーゼのさらなる例は、WO96/06931号(Novo Nordisk A/S)に記載される。
他の市販の酵素は、MannawayTM、PectawayTM、StainzymeTM 及び RenozymeTMを包含する。
液体酵素添加剤における沈殿を回避するための適切な界面活性剤は、いずれの界面活性剤でもあり得る。本発明の界面活性剤は、アニオン性、非イオン性、カチオン性又は両性(両性イオン)であり得る。
添加される界面活性剤の量は、合計液体添加剤の0.1〜10%w/w, より特定には0.25〜8%w/w, 例えばさらにより特定には、0.5〜5%w/wである。
本発明の特定の態様においては、界面活性剤の量は、合計の液体酵素添加剤の1%w/w以下である。本発明の特定の態様においては、界面活性剤の量は、合計の液体酵素添加剤の0.7%w/w以下である。
R2O (CnH2nO)t (グリコシル)x
[式中、R2は、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物(ここで、アルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含む)から成る群から選択され;nは、2又は3、好ましくは2であり;tは0〜約10、好ましくは0であり;そしてxは約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約3、最も好ましくは約1.3〜約2.7である]を有する。
R-O-(CH2CH2O)nH
[式中、Rは、8〜22個の炭素原子を有する、枝分かれ鎖又は直鎖のアルカンであり、そしてnは3に等しいか、又は3以上であり、より好ましい態様においては、nは5に等しいか又は5以上である。nは9, 7, 8, 15及び80に制限されない。特定の態様においては、平均鎖長は、C12〜C18、より好ましい態様においては、平均鎖長はC13〜C16であり、より特定の態様においては、平均鎖長はC13〜C15である]、
さらなる例は、“Surface Active Agents and Detergents”(Vol. I and II by Schwartz, Perry and Berch)に記載される。種々のそのような界面活性剤はまた、一般的に、アメリカ特許第3,929,678号(第23頁左欄、第58行〜第29頁左欄、第23行;引用により本明細書に組み込まれる)にも開示される。
[式中、R2は、アルキル又はアルキル鎖に約8〜約18個の炭素原子を有するアルキルベンジル基であり;個々のR3は、-CH2CH2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2CH2(CH2OH)-, -CH2CH2CH2-及びそれらの混合物から成る群から選択され;個々のR4は、C1-C4アルキル、C1-C4ヒドロキシアルキル、2つのR4基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、及び-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(ここで、R6は、約1000以下の分子量を有するいずれかのヘキソース又はヘキソースポリマー、及びyが0でない場合、水素である)から成る群から選択され;R5は、R4と同じであるか、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の合計数、又はR2+R5がが約18よりも大きくなく;個々のyは0〜約10であり、そしてy値の合計0〜約15であり;そしてXがいずれかの適合できるアニオンである]を有するそれらの海面活性剤。
R1R2R3R4N+X-(i)
[式、C6-C16アルキルであり、個々のR2, R3, 及びR4は独立して、C1-C4アルキル、C1-C4ヒドロキシアルキル、ベンジル及び-(C2H40)XH(ここで、Xは2〜5の値である)であり、Xはアニオンである]で表される本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くとも1つのR2, R3又はR4がベンジルであるべきである。
R2R3及びR4のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンXは、ハロゲン化合物、メトスルフェ−ト、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。
本明細書において有用な他のカチオン性界面活性剤は、アメリカ特許第4,228,044号及びヨーロッパ特許第000224号に記載される。
本発明の酵素安定剤は、ホウ素酸及び/又はその誘導体のいずれかである。
本発明の特定の態様においては、前記安定剤は、フェニルホウ素酸及び/又はその誘導体である。
本発明は、ホウ素酸又はその誘導体を含んで成る液体酵素添加剤を包含する。特定の態様においては、本発明は、フェニルホウ素酸又はその誘導体を含んで成る液体酵素添加剤を包含する。
液体酵素添加剤に存在する安定剤の量は、液体酵素添加剤に存在する酵素の量に依存する。添加される安定剤の量は特に、合計液体添加剤の0.1〜20%(w/w)、より特定には0.5〜8%(w/w)、例えばさらにより特定には、1〜5%(w/w)である。
本発明の好ましい態様は、酵素、及び上記に開示される式のフェニルホウ素酸誘導体酵素安定剤を含んで成る液体組成物を提供し、前記式中、RはC1-C6アルキル、特にCH3, CH3CH2又はCH3CH2CH2であり、又はRは水素である。本発明の特定の態様においては、酵素の安定剤は、4−ホルミル−フェニル−ホウ素酸(4−FPBA)である。
チオフェン-2 ホウ素酸、 チオフェン-3 ホウ素酸、 アセトアミドフェニル ホウ素酸、 ベンゾフラン-2 ホウ素酸、 ナフタレン-1 ホウ素酸、 ナフタレン-2 ホウ素酸、 2-FPBA、 3-FBPA、 4- FPBA、 1-チアントレン ホウ素酸、 4-ジベンゾフラン ホウ素酸、 5-メチルチオフェン-2 ホウ素酸、 チオナフタレン ホウ素酸、 フラン-2 ホウ素酸、 フラン-3 ホウ素酸、 4、4 ジフェニル- 二ホウ素酸、 6-ヒドロキシ-2-ナフタレン、 4-(メチルチオ) フェニル ホウ素酸、 4 (トリメチル シリル)フェニル ホウ素酸、 3-ブロモチオフェン ホウ素酸、 4-メチルチオフェン ホウ素酸、 2- ナフチル ホウ素酸、 5-ブロモチオフェン ホウ素酸、 5-クロロチオフェン ホウ素酸、 ジメチル- チオフェン ホウ素酸、 2-ブロモフェニル ホウ素酸、
液体酵素添加剤に添加される場合、7以上にpHを提供するいずれかの化合物が、酵素含有混合物のpHを調節するために使用され得る。適切な化合物は、塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアルカリ緩衝塩であり得る。
適切な緩衝塩は、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、ピロリン酸四カリウム、トリポリリン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムであり得る。他の適切な塩又はアルカリ性pHを提供できる化合物が使用され得る。
本発明はさらに、液体酵素添加剤の調製に関する。液体酵素添加剤は、酵素、ホウ素酸又はその誘導体、及び界面活性剤を含んで成る。それらの化合物は、ランダムな順序で又はすべて同時に混合され得る。
i)液体酵素調製物を供給し;
ii)i)の液体酵素調製物を、界面活性剤及びホウ素酸又はその誘導体と共に混合する段階を含んで成る。
i)液体酵素調製物を供給し;
ii)i)の液体酵素調製物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し;そして
iii)界面活性剤を、ホウ素酸又はその誘導体の添加の前又は後、液体酵素添加剤に一緒に添加する段階を含んで成る。
本発明のより特定の態様においては、界面活性剤は、ホウ素酸又はその誘導体が添加される前、液体酵素調製物と共に混合される。
i)液体酵素調製物を供給し;
ii)i)の液体酵素調製物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し;そして
iii)界面活性剤を、ホウ素酸又はその誘導体の添加の前又は後、液体酵素添加剤に添加する段階を含んで成る。
本発明の特定の態様においては、界面活性剤は、発酵ブイヨンに添加される。本発明のより特定の態様においては、界面活性剤は、細胞を有さない発酵ブイヨンに添加される。本発明の最も好ましい態様においては、界面活性剤濃縮物に添加される。
本発明の特定の態様においては、酵素添加剤のpHは、4.5〜11である。本発明のより特定の態様においては、酵素添加剤のpHは、5.5〜10である。
本発明者は、pHの調節、及び調節が起こる時間が、液体酵素添加剤における沈殿物の形成に対して効果を有することを見出した。
pHは好ましくは、酵素含有液体及びホウ素酸又はその誘導体の混合の前、調節され、それにより、沈殿物の形成が回避される。調節はまた、酵素及びホウ素酸又はその誘導体の混合の後、行われ、それにより形成される沈殿物が溶解される。
i)液体酵素調製物を供給し;
ii)i)の液体酵素調製物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し;ホウ素酸又は誘導体の添加の前又は後、液体のpHを7.5〜10に調節する段階を含んで成る。
i)液体酵素調製物を供給し;
ii)i)の液体酵素調製物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し;ホウ素酸又は誘導体の添加の前又は後、液体のpHを7.5〜10に調節し;そしてホウ素酸又はその誘導体の添加の前又は後、液体に界面活性剤を添加する段階を含んで成る。
pHは、いずれかの適切なアルカリ性物質により調節され得る。特定の態様においては、pHはNaOHにより調節される。
i)1又は複数の酵素を含んで成る液体酵素調製物を供給し;
ii)i)の液体酵素調製物を、界面活性剤と共に混合し;
iii)ii)の液体酵素調製物のpHを、7.5〜10に調節し;
iv)ii)の液体組成物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合するか;
又は
i)1又は複数の酵素を含んで成る液体酵素調製物を供給し;
ii) i)の液体酵素調製物のpHを、7.5〜10に調節し;
iii)ii) の液体酵素調製物を、界面活性剤と共に混合し;
iv)ii)の液体組成物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合する段階を含んで成る。
i)1又は複数の酵素を含んで成る液体酵素調製物を供給し;
ii)i)の液体酵素調製物を、界面活性剤と共に混合し;
iii)ii)の液体酵素調製物のpHを、7.5〜10に調節し;
iv)ii)の液体組成物を、フェニルホウ素酸又はその誘導体と共に混合するか;
又は
i)1又は複数の酵素を含んで成る液体酵素調製物を供給し;
ii) i)の液体酵素調製物のpHを、7.5〜10に調節し;
iii)ii) の液体酵素調製物を、界面活性剤と共に混合し;
iv)ii)の液体組成物を、フェニルホウ素酸又はその誘導体と共に混合する段階を含んで成る。
本発明の液体酵素添加剤を含んで成る組成物:
本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤は、液体洗剤、例えば洗濯洗剤における原料として使用される。
本発明はさらに、液体洗剤組成物への液体酵素添加剤の使用にも向けられる。
本発明はさらに次の例により記載されるが、但しそれらは本発明の範囲を制限するものではない。
プロテアーゼを、4−FPBA及び界面活性剤と共に配合した。プロテアーゼは、約40g/Lの酵素タンパク質及び55%の1.2−プロパンジオールを含む濃縮Savinase溶液(pH5.5)であった。この例においては試験される界面活性剤は、表に見られる。
肉眼での観察の結果は、表3に見られる:
プロテアーゼを、4−FPBA及び界面活性剤と共に配合した。例1に使用される同じ3種の界面活性剤を研究した。プロテアーゼは、44g/Lの酵素及び30%の1,2−プロパンジオールを含む濃縮されたAlcalase(商標)の溶液(pH5.2)であった。
肉眼での観察の結果は、表4に見られる:
この実験は、例1及び2に概略されるようにして行われた。但し、界面活性剤の濃度が変更された。結果は表5に示される。
プロテアーゼ(例1におけるのと同じ)を、次の方法を用いて、4−FPBAと共に配合した:
1)界面活性剤を、液体プロテアーゼサンプルに添加し、2%w/wの最終濃度にした(表1を参照のこと)。
2)混合の後、pHを10MのNaOHにより8.7に調節した。
4)次に、サンプルを2種のバイアルに移し、密封の後、それらを、それぞれ5℃及び40℃で4週間インキュベートした。
5)貯蔵の後、サンプルの物理的安定性を、肉眼での観察により決定した。
参照として、サンプルを段階1−5に従って調製し、但し界面活性剤の添加は伴わなかった。
4−FPBA溶液:
10MのNaOHによりpH9.6に調節された、1,2−プロパンジオール中、30%4−FPBA。
10g/Lの酵素タンパク質及び55%の1,2−プロパンジオールを含む濃縮されたサビナーゼ溶液(pH5.5)。
界面活性剤C(例1からの)。
界面活性剤D:R-O-(CH2OH2O)nH, すなわちRが13〜15個の炭素原子の平均鎖長を有するアルカンであり、そしてn=3である2種の界面活性剤の混合物。
界面活性剤E:界面活性剤Dと同じ、但しn=7。
界面活性剤G:界面活性剤Fと同じ、但しn=15。
界面活性剤H:R-O-(CH2OH2O)nH, すなわちRが13個の炭素原子の平均鎖長を有するアルカンであり、そしてn=3及び8である2種の界面活性剤の混合物。
試験結果が表6に示される。
酸素タンパク質の決定:
酵素溶液の酸素タンパク質の濃度を、多くの方法により決定することができる。酸素の比活性が知られている場合、酵素タンパク質濃度は、選択された条件組で酵素活性(単位/g材料)をまず決定し、そして比活性(単位/mg酵素タンパク質)により割り算することにより決定され得る。酵素の比活性は、当業界において知られている手段により酵素を均質性にまず精製することにより決定される。次に、酵素活性が、酵素タンパク質濃縮物における酵素活性を測定するために使用されるのと同じ条件組で精製されたサンプルにおいて決定される。
DMC−基質:90mMの四硼酸ナトリウム中、0.4%のN, N−ジメチルカゼイン、120mMのリン酸ナトリウム、0.2%Brij35、pH8.0に調節される。
希釈緩衝液:0.15MのKCl、0.05Mの硼酸、0.16Mの亜硫酸ナトリウム、0.2%Brij35、pH9.0に調節される。
合計タンパク質決定:
参照文献:M. Matsushita, T. Irino, T. Komoda and Y. Sakagishi "Determination of proteins by a reverse biuret method combined with the copper-bathocuproine chelate reaction", Clinica Chimica Acta, 216 (1993), p 103-111。
Claims (27)
ii)i)の液体酵素調製物を、界面活性剤及びホウ素酸又はその誘導体と共に混合する段階を含んで成る請求項1記載の液体酵素添加剤の製造方法。
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