JP2009294200A - タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法 - Google Patents
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Abstract
タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能の低下を改善する成分が、傷害されたタイトジャンクションにおいてどの様にその機能の回復をせしめるかを視覚的に鑑別できる鑑別法を提供する。
【解決手段】
皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルと、タイトジャンクション機能トレーサーとを用い、トレーサーの分布の変化より、タイトジャンクションにおいてどの様にその機能の回復をせしめるかを視覚的に鑑別する。
【選択図】なし
Description
(1)皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデル。
(2)前記皮膚乃至は皮膚三次元モデルが、培養ヒト皮膚三次元モデルであることを特徴とする、(1)に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
(3)前記タイトジャンクションの傷害処理が、中鎖飽和直鎖脂肪酸処理であることを特徴とする、(1)又は(2)に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
(4)皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用であることを特徴とする、(1)〜(3)何れか1項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
(5)標識されていても良いビオチンと、標識されていても良いアビジンからなるタイトジャンクション機能トレーサーキットであって、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする、タイトジャンクション機能トレーサー。
(6)(1)〜(4)何れか1項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルのタイトジャンクション機能を鑑別すべきものであることを特徴とする、(5)に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキット。
(7)(1)〜(4)何れか1項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを標識されていても良いビオチンで処理する工程と、標識されていても良いビオチンで処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルから顕微鏡用切片を切り出す工程と、標識されていても良いアビジンで処理する工程を有する使用態様で使用されることを特徴とする、(6)に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキット。
(8)(1)〜(4)何れか1項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを被験体で処理し、しかる後に、タイトジャンクション機能の標識処理を行い、しかる後に標識の存在状況よりタイトジャンクション機能を鑑別することを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
(9)タイトジャンクション機能の標識処理が、(5)〜(7)何れか1項に記載のタイトジャンクション機能トレーサーによるものであることを特徴とするタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
(10)(5)〜(8)何れか1項に記載のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法において、コントロールに対して有意にタイトジャンクション機能回復を示すことを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤。
(11)ε,γ−グルタミルリジン及び/又はパルマリア抽出物であることを特徴とする、(10)に記載のタイトジャンクション機能回復剤。
本発明の タイトジャンクション傷害皮膚モデルは、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用のものであって、 皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなることを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト乃至はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な(癌化していない)ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して使用することもできる。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EFT-400」(正常培養ヒト三次元皮膚モデル)などが好適に例示できる。特に表皮成分のみで構成される「EPI-200」や、USA MaTek社から販売されている「EpiDerm」などがさらに好適に例示できる。かかる皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルは、真皮側乃至は表皮基底層側から傷害手段を講じてタイトジャンクション部分を傷害する。傷害手段としては、例えば、紫外線や化学物質などが好ましく例示でき、紫外線であれば、波長280〜320nmの紫外線を7.5〜200mJ/cm2、さらに好ましくは50〜160mJ/cm2の単位あたりのエネルギー量で照射すれば良く、化学的な処置であれば、カプリン酸、カプリル酸などの中鎖長(炭素数8〜12)の脂肪族飽和直鎖脂肪酸またはその一価金属塩の0.1〜10mM、さらに好ましくは0.5〜2mMの溶液を真皮側乃至は表皮基底層側から、5〜24時間、さらに好ましくは10〜15時間作用させれば良い。また、オクルディンやクローディンの細胞外ドメインを認識する中和抗体を使用することもできる。これらの傷害処置の内、特に好ましいものは化学的傷害処置であり、なかでもカプリン酸ナトリウムによる処理が特に好ましい。これはタイトジャンクションに対して均質な損傷がなしうるからである。この様な均質な傷害は、後記の傷害タイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングにおいては、そのメカニズムを的確に鑑別する上で非常に重要な因子となる。処置後傷害手段は直ちに皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルより離脱させる。離脱は、紫外線照射であれば照射を終了することによりできるし、化学的傷害手段であれば、培地乃至はPBS(リン酸緩衝生理食塩水)などで洗浄することによりなしうる。斯くして得られたタイトジャンクション傷害皮膚モデルは、後記 タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法に用いられ、傷害されたタイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングに好適に使用される。
本発明のタイトジャンクション機能トレーサーキットは、 標識されていても良いビオチンと、標識されていても良いアビジンからなるタイトジャンクション機能トレーサーキットであって、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする。前記標識としては、例えば、フルオロセイン、ローダミン、フルオテトラメチルローダミン、ダンシルなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの発光標識、ガリウムなどの放射性標識、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなどの酵素標識などが例示でき、感度高く、視覚的にタイトジャンクション機能を鑑別するには、ビオチン乃至はアビジンのどちらかに蛍光標識を用いることが好ましい。タイトジャンクションの機能を鑑別するためには、本発明のキットでは、標識されていても良いビオチンを、真皮側乃至は表皮基底層側から作用させ、表皮顆粒層に向かって作用させる。この時、タイトジャンクションの機能が正常であれば標識されていても良いビオチンは表皮顆粒層で食い止められ、角層には移動しない。タイトジャンクションの機能が不全であれば、標識されていても良いビオチンは角層へと移動する。この様な皮膚組織中での、標識されていても良いビオチンの移動は標識されていても良いアビジンを作用させることにより、可視化できる。前記アビジンとしては、ビオチンとの不可逆的結合性を有するものであれば、何れも用いることが出来、例えば、ストレプトアビジン等が、その入手の容易性から好適に例示できる。かかるアビジンの標識としては、蛍光標識サクシニルビオチンなど、蛍光標識されていることが好ましい。本発明のキットについて、真皮側乃至は表皮基底層側より作用させる物質として標識されていても良いアビジンを選択し、組織中の標識されていても良いアビジンの可視化手段として標識されていても良いビオチンを用いることもできるが、タイトジャンクションの機能の正確な鑑別には、真皮側より作用させる物質として標識されていても良いビオチンを用い、該ビオチンの可視化手段として標識されていても良いアビジンを用いることがより好ましい。該ビオチンの好ましい市販品としては、EZ-LinkTM-スルフォ-NHS-LC-ビオチン(ピアス社製;PIERCE)などが好適に例示できる。また該アビジンの好ましい市販品としては、ストレプトアビジン-テキサスレッド(オンコジーン社製;ONCOGENE)などが好適に例示される。なお角層と表皮顆粒層の境界については、光学顕微鏡下で撮影した画像をもとに判断しても良いし、角層あるいは表皮顆粒層、好ましくはタイトジャンクションをトレーサーで使用するものと明らかに蛍光波長の異なる蛍光物質で標識することによって蛍光顕微鏡下で同時に判断しても良い。例えばタイトジャンクションに特異的に反応する抗体を用いることができるが、抗オクルディン抗体を用い、蛍光標識二次抗体による染色を併用した二重染色条件で本願の発明を実施することが好適に例示できる。
本発明のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法は、前記タイトジャンクション傷害皮膚モデルを検体で処理したものと、未処理のものとを、前記タイトジャンクション機能トレーサーキットで処理し、トレーサーの皮膚組織内における分布状況を調べ、表皮顆粒層から角層へのトレーサーの動きが、検体で処理することにより妨げられている蓋然性が、未処理のものに比して有意に高い場合には、前記検体の投与が皮膚のタイトジャンクションを回復させる効果を有し、該回復によって皮膚バリア機能が向上すると鑑別することを特徴とする。前記蓋然性は、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを、蛍光顕微鏡下観察することに容易に鑑別しうる。蓋然の差の有意性は、蛍光顕微鏡の観察像をコンピューターなどに取込み、アドビ社製の「フォトショップ」などの画像処理ソフトを用いて、二値化などの画像処理を行い、蛍光部位と非蛍光部位とを分けて、角層部に透過した蛍光部位の総面積比を求め、これを統計処理することにより明らかにできる。検体未処理と、処理とにおける、この値の差が大きいほど、検体のタイトジャンクション傷害回復作用、言い換えればバリア機能の回復作用が優れると鑑別できる。又、検体の濃度は実際に皮膚に投与した場合に外挿できるように設定し、ドーズを振って用量効果をみることも好ましい。本発明の鑑別法では、画像として、タイトジャンクションの傷害からの回復が鑑別できるので、蛍光部分の偏りや、時系列的変化などを追うことにより、タイトジャンクションの回復過程のメカニズムなども知ることができる。以上の作業を工程に分けて表現すると以下のようになる。
(工程1)皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害手段により傷害し、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作製する工程
(工程2)タイトジャンクション傷害皮膚モデルを検体で処理する工程
(工程3)工程2の検体で処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルと、検体で処理しないタイトジャンクション傷害皮膚モデルをタイトジャンクション機能トレーサーキットの片方、好ましくは標識されたビオチンで処理する工程
(工程4)工程3のトレーサー処理した皮膚モデルより顕微鏡用の標本を作製する工程
(好ましくは工程5)工程4の標本を抗オクルディン抗体で処理し、蛍光標識二次抗体にて処理する工程
(工程6)工程4の標本をトレーサーキットのもう一方、好ましくは、蛍光標識アビジンで処理する工程
(工程7)工程4の標本を顕微鏡下、好ましくは蛍光顕微鏡下観察する工程
(好ましくは工程8)工程7の顕微鏡像をイメージ画像としてコンピューターに取込み、画像処理し、蛍光部と非蛍光部とに分け、角層部に透過した蛍光部の量を求める工程
(好ましくは工程9)工程8の蛍光部の量を、検体未処理の場合の工程8の蛍光部の量からの差を求め、タイトジャンクション機能の回復促進作用の有無を鑑別する工程
(工程2、3)処理検体として500μg/mlε,γ−グルタミルリジンと0.1%パルマリア抽出物の混合物を含む、1mMカプリン酸ナトリウムを含まない培地に交換して培養を続け、一定時間ごとに「EPI-200」を回収する1時間前にトレーサーとして「EZ-LinkTM-スルフォ-NHS-LC-ビオチン」を最終濃度0.1mg/mlになるように加えた。一方、未処理検体として500μg/mlε,γ−グルタミルリジンと0.1%パルマリア抽出物を含まない70%エタノール水溶液を添加し、同様に培養を続けた。
(工程4)工程1〜3で処理した「EPI-200」を回収し、「OCTコンパウンド」(サクラファインテック社製)に浸漬し、液体窒素中で凍結した。続いて凍結切片作製装置にて凍結切片標本を作製した。
(工程5)該標本をウサギ抗オクルディン抗体(インビトロジェン社製)と反応させ、その後FITC標識ロバ抗ウサギ抗体(ICN-ファーマシューティカル社製)及びストレプトアビジン-テキサスレッド(オンコジーン社製)と反応させた。
(工程6)工程5で得た標本を488、543nmの2波長で、蛍光顕微鏡下で観察した。
Claims (11)
- 皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデル。
- 前記皮膚乃至は皮膚三次元モデルが、培養ヒト皮膚三次元モデルであることを特徴とする、請求項1に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
- 前記タイトジャンクションの傷害処理が、中鎖飽和直鎖脂肪酸処理であることを特徴とする、請求項1又は2に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
- 皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用であることを特徴とする、請求項1〜3何れか1項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
- 標識されていても良いビオチンと、標識されていても良いアビジンからなるタイトジャンクション機能トレーサーキットであって、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする、タイトジャンクション機能トレーサー。
- 請求項1〜4何れか1項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルのタイトジャンクション機能を鑑別すべきものであることを特徴とする、請求項5に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキット。
- 請求項1〜4何れか1項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを標識されていても良いビオチンで処理する工程と、標識されていても良いビオチンで処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルから顕微鏡用切片を切り出す工程と、標識されていても良いアビジンで処理する工程を有する使用態様で使用されることを特徴とする、請求項6に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキット。
- 請求項1〜4何れか1項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを被験体で処理し、しかる後に、タイトジャンクション機能の標識処理を行い、しかる後に標識の存在状況よりタイトジャンクション機能を鑑別することを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
- タイトジャンクション機能の標識処理が、請求項5〜7何れか1項に記載のタイトジャンクション機能トレーサーによるものであることを特徴とするタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
- 請求項5〜8何れか1項に記載のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法において、コントロールに対して有意にタイトジャンクション機能回復を示すことを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤。
- ε,γ−グルタミルリジン及び/又はパルマリア抽出物であることを特徴とする、請求項10に記載のタイトジャンクション機能回復剤。
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