JP2009133654A - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】液体クロマトグラフィーを用いた糖化ヘモグロビンの測定方法であって、平均粒径が5μm〜20μmの範囲の充填剤が充填されており、内径が3.0mm〜5.0mm及び長さが10mm〜30mmの範囲にあるカラムを用い、ヘモグロビン画分の溶出に際しての溶離液の流速を1.6ml/分〜2.5ml/分の範囲とし、かつヘモグロビンA0を溶出する際の溶離液に非イオン性界面活性剤を含有させることを特徴とする、糖化ヘモグロビンの測定方法。
【選択図】なし
Description
攪拌機付き反応器に、3重量%ポリビニルアルコール(日本合成化学社製)水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学社製)300g、トリエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学社製)100g及び過酸化ベンゾイル1.0gの混合物を添加した。混合物を攪拌しながら調粒した後、窒素雰囲気下にて80℃の温度で1時間重合した。別途、イオン交換基を有する単量体として、2−メタクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(東亜合成化学社製)100gと、ポリエチレングリコールメタクリレート(日本油脂社製、エチレングリコール鎖n=4)100gをイオン交換水に溶解した。イオン交換水に上記単量体を溶解した該溶液を反応器に添加し、さらに攪拌しつつ窒素雰囲気下で80℃で2時間重合を行った。得られた重合体含有組成物を水及びアセトンで洗浄し、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。
充填剤B:平均粒子径3μm、CV値14%
充填剤C:平均粒子径25μm、CV値12%
(2)カラム
液体クロマトグラフィー用カラムとして、以下の5種類の寸法のカラムA〜カラムHを用意した。
カラムE:内径4.6mm、長さ9mm
カラムF:内径4.6mm、長さ35mm
カラムG:内径2.0mm、長さ20mm
カラムH:内径6.0mm、長さ20mm
(3)実験例1
上記充填剤A〜C及びカラムD〜Hを組み合わせて得られた下記の表1に示す各カラム装置1〜15について、A0以外のHb画分を溶出する液を送液ポンプ(島津製作所社製、LC−10AS)を用い、1.7ml/分の速度で送液した際のカラム内の圧力を測定した。結果を下記の表1に示す。カラム内の圧力が5MPa以下のものについては、圧力が高くなりすぎないため〇を付し、5MPaを越えるものについては×を付した。
実験例1において〇が付されたカラム装置について、以下の要領でHbA1cを測定し、クロマトグラムを比較した。もっとも、充填剤Cを充填したカラムは、HbA1cピークが溶出しなかったり、溶出しても大きくブロード化したため、HbA1c測定値を算出することができなかった。従って、充填剤AとカラムD,E,FまたはHを用いてクロマトグラフィーを行った。
グリコHbコントロールレベル1(国際試薬社製、参考数値5.8±0.5%)を200μLの注射用水で溶解した後、希釈液(0.1%トリトンX−100を含有するリン酸緩衝液(pH7.0))で100倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
測定試料中のヘモグロビンA1c量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンA1cと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンA1cの割合(ヘモグロビンA1c値(%))を求めた。
オートサンプラー ASU―420(積水化学工業社製)
検出器 SPD−6AV(島津製作所社製)
溶離液:第1液 リン酸緩衝液(pH5.3)
第2液 0.05%Tween20含250mMリン酸緩衝液(pH8.0)
※第1液は、それぞれのカラム(充填剤とカラムの組合せ)において、HbA1cが同一保持時間になるように濃度を調整。
流速:1.7mL/分
検出波長:415nm
試料注入量:10μL
2:ピーク2 HbF
3:ピーク3 不安定型HbA1c
4:ピーク4 安定型HbA1c
5:ピーク5 HbA0
2…ピーク2(HbF)
3…ピーク3(不安定型HbA1c)
4…ピーク4(安定型HbA1c)
5…ピーク5(HbA0)
Claims (2)
- 液体試料中の糖化ヘモグロビンを液体クロマトグラフィーにより測定する糖化ヘモグロビンの測定方法であって、
平均粒径が5μm〜20μmの範囲にある充填剤が収納されており、内径が3.0〜5.0mm、長さが10〜30mmの範囲にあるカラムに、液体の試料を通過させる工程と、
次に、前記カラムに、溶離液を溶出力を異ならせて1.6ml/分〜2.5ml/分の速度で通過させ、ヘモグロビンA0及び糖化ヘモグロビンを含む複数種のヘモグロビンを溶出する工程とを備え、前記ヘモグロビンA0を溶出する際の溶離液として非イオン性界面活性剤を含有する溶離液を用いることを特徴とする、糖化ヘモグロビンの測定方法。 - 前記液体の試料が溶血している血液試料である、請求項1に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
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