JP2009036970A - カバーガラス、スライドガラス、プレパラート、観察方法、及び顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】顕微鏡装置によって取得された二次元画像同士の位置関係を良好に調整できるプレパラートを提供する。
【解決手段】プレパラートは、異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマークを備えている。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡装置によって画像を取得するためのカバーガラス、スライドガラス、プレパラート、顕微鏡装置を用いる観察方法、及び顕微鏡装置に関する。

顕微鏡装置は、対物レンズ等を含む光学系を備えており、カバーガラスとスライドガラスとを有するプレパラートは、光学系を介して観察される。例えばプレパラートの試料の三次元画像を構築するために、光学系の光軸方向に関して光学系の焦点位置とプレパラートとの位置関係を変化させつつ、プレパラートの二次元画像を複数回取得し、それら取得した二次元画像を合成することによって、三次元画像を構築することが行われている。下記特許文献１には、顕微鏡装置を用いてプレパラートの三次元画像を構築する技術の一例が開示されている。
特開２００６−３０８７０９号公報

二次元画像同士を合成する際、それら二次元画像同士の位置関係が所望状態にないと、三次元画像を良好に構築することができなくなる可能性がある。また、二次元画像を合成することによって、動画を構築する場合においても、それら二次元画像同士の位置関係が所望状態にないと、動画を良好に構築することができなくなる可能性がある。そのため、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる技術の案出が望まれる。

本発明は、顕微鏡装置によって取得された二次元画像同士の位置関係を良好に調整できるカバーガラスを提供することを目的とする。また本発明は、顕微鏡装置によって取得された二次元画像同士の位置関係を良好に調整できるスライドガラスを提供することを目的とする。また本発明は、顕微鏡装置によって取得された二次元画像同士の位置関係を良好に調整できるプレパラートを提供することを目的とする。また本発明は、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる顕微鏡装置を用いた観察方法を提供することを目的とする。また本発明は、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記の課題を解決するため、本発明を例示する各態様として実施の形態に示す各図に対応付けした以下の構成を採用している。但し、各要素に付した括弧付き符号はその要素の例示に過ぎず、各要素を限定するものではない。

本発明を例示する第１の態様に従えば、二次元の画像を取得する顕微鏡装置（２１）に使用されるカバーガラスであって、異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマーク（１０）を備えたカバーガラス（３）が提供される。

本発明を例示する第１の態様によれば、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる。

本発明を例示する第２の態様に従えば、二次元の画像を取得する顕微鏡装置（２１）に使用されるスライドガラスであって、異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマーク（１０）を備えたスライドガラス（２）が提供される。

本発明を例示する第２の態様によれば、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる。

本発明を例示する第３の態様に従えば、顕微鏡装置によって二次元の画像が取得されるプレパラートであって、異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマーク（１０）を備えたプレパラート（１）が提供される。

本発明を例示する第３の態様によれば、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる。

本発明を例示する第４の態様に従えば、プレパラートを顕微鏡装置（２１）を用いて観察する観察方法であって、上記態様のプレパラート（１）を観察する観察方法が提供される。

本発明を例示する第４の態様によれば、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる。

本発明を例示する第５の態様に従えば、マーク（１０）が形成されたプレパラート（１）を顕微鏡装置（２１）を用いて観察する観察方法であって、顕微鏡装置（２１）を用いて、マーク（１０）を含むプレパラート（１）の二次元の画像を異なるタイミングで少なくとも２回取得することと、取得されたプレパラート（１）の第１の画像と第２の画像との位置関係をマーク（１０）を用いて調整することと、を含む観察方法が提供される。

本発明を例示する第５の態様によれば、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる。

本発明を例示する第６の態様に従えば、マーク（１０）が形成されたプレパラート（１）を観察する顕微鏡装置であって、マーク（１０）を含むプレパラート（１）の二次元の画像を異なるタイミングで少なくとも２回取得する撮像装置（２９）と、取得されたプレパラート（１）の第１の画像と第２の画像との位置関係をマーク（１０）を用いて調整し、第１の画像と第２の画像とを合成する画像処理装置（２２）と、を備えた顕微鏡装置（２０）が提供される。

本発明を例示する第６の態様によれば、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる。

本発明によれば、二次元画像同士を合成する際、二次元画像同士の位置関係を良好に調整できる。したがって、プレパラートの画像情報を良好に取得することができる。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら例示的に説明するが、本発明はこれに限定されない。以下の説明においては、ＸＹＺ直交座標系を設定し、このＸＹＺ直交座標系を参照しつつ各部材の位置関係について説明する。そして、水平面内の所定方向をＸ軸方向、水平面内においてＸ軸方向と直交する方向をＹ軸方向、Ｘ軸方向及びＹ軸方向のそれぞれに直交する方向（すなわち鉛直方向）をＺ軸方向とする。また、Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸まわりの回転（傾斜）方向をそれぞれ、θＸ、θＹ、及びθＺ方向とする。

＜第１実施形態＞
第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係るプレパラート１の一例を示す斜視図である。プレパラート１は、顕微鏡装置で観察するための試料Ｓを含む。図１において、プレパラート１は、試料Ｓが載せられたスライドガラス２と、スライドガラス２上の試料Ｓを覆うカバーガラス３とを含む。

スライドガラス２は、プレート状の部材であり、表面４及び裏面５を有する。カバーガラス３は、プレート状の部材であり、表面６及び裏面７を有する。本実施形態においては、試料Ｓは、スライドガラス２の表面４に載せられており、スライドガラス２の表面４とカバーガラス３の裏面７とが対向するように配置されている。すなわち、試料Ｓは、スライドガラス２の表面４とカバーガラス３の裏面７との間に配置されている。

以下の説明において、スライドガラス２の表面４及びカバーガラス３の表面６を合わせて適宜、プレパラート１の表面８、と称する。本実施形態においては、プレパラート１の表面８が、ＸＹ平面と平行である場合を例にして説明する。また、本実施形態においては、カバーガラス３がスライドガラス２の＋Ｚ側（上側）に配置されている場合を例にして説明する。また、本実施形態においては、スライドガラス２の表面４及びカバーガラス３の表面６を含むプレパラート１の表面８は、＋Ｚ側を向いている。

プレパラート１は、所定間隔で配置された複数のマーク１０を有する。マーク１０は、プレパラート１の表面８と平行なＸＹ平面内において、所定間隔でプレパラート１上に複数配置されている。本実施形態においては、マーク１０は、カバーガラス３の表面６に配置されている。

本実施形態においては、顕微鏡装置によって、プレパラート１の二次元画像が取得される。本実施形態において、二次元画像は、ＸＹ平面と平行な画像である。また、本実施形態においては、顕微鏡装置は、異なるタイミングで、少なくとも２回、プレパラート１の画像情報を取得する。プレパラート１に形成されているマーク１０は、異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマークである。具体的には、マーク１０は、ＸＹ平面内における第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマークである。本実施形態においては、マーク１０を用いて、Ｘ軸、Ｙ軸、及びθＺ方向に関する第１の画像と第２の画像との位置関係が調整される。

本実施形態においては、マーク１０は、プレパラート１の表面８と平行なＸＹ平面内において、４ヵ所に配置されている。本実施形態においては、マーク１０のそれぞれは、ＸＹ平面内において十字状である。なお、マーク１０の形状は、例えば三角形、四角形等の多角形でもよい。あるいは、マーク１０が、バーコードパターンのようなラインアンドスペースパターンでもよい。

また、本実施形態においては、マーク１０は、試料Ｓの周囲に配置されている。プレパラート１の表面８と平行なＸＹ平面内において、試料Ｓとマーク１０とが重ならないように配置されている。

本実施形態のマーク１０は、所定波長領域の光（励起光）が照射されたときに、蛍光を発する蛍光物質で形成されている。蛍光物質とは、所定波長領域の光（励起光）を吸収し、それにより励起された状態（励起状態）から元の状態（基底状態）に戻る際に光（蛍光）としてエネルギーを放出する特性を有する物質である。一般に、蛍光物質が発する蛍光の波長は、励起光の波長よりも長い。

なお、蛍光物質としては、例えば、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）と呼ばれる蛍光タンパク質等、従来のものを用いることができる。

次に、本実施形態に係る顕微鏡システム２０について説明する。図２は、本実施形態に係る顕微鏡システム２０の一例を示す図である。図２において、顕微鏡システム２０は、プレパラート１の試料Ｓを観察する顕微鏡装置２１と、顕微鏡装置２１の動作を制御する制御装置２２と、制御装置２２に接続された表示装置２３と、制御装置２２に接続された入力装置２４とを備えている。制御装置２２は、コンピュータシステムを含む。表示装置２３は、例えば液晶ディスプレイのようなフラットパネルディスプレイを含む。入力装置２４は、例えばキーボード、マウス等を含む。

顕微鏡装置２１は、光源装置２５と、対物レンズ２６等を含む光学システム２７と、プレパラート１を支持しながら移動可能なステージ２８と、プレパラート１から発生する光を受光する受光素子２９とを備えている。

本実施形態において、光源装置２５は、レーザ装置を含み、所定波長のレーザ光を射出する。本実施形態において、受光素子２９は、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ：フォトマルチプライヤ）を含む。なお、受光素子２９が、ＣＣＤ（charge coupled device）等の撮像素子を含んでいてもよい。

ステージ２８は、対物レンズ２６と対向する位置を含む所定領域内をプレパラート１を支持しながら移動可能である。プレパラート１は、そのプレパラート１の表面８が対物レンズ２６と対向するように、ステージ２８に支持される。本実施形態においては、ステージ２８は、プレパラート１を支持した状態で、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸、θＸ、θＹ、及びθＺ方向の６つの方向に移動可能である。

光学システム２７は、光源装置２５から射出された光を集光する第１集光光学系３１と、プレパラート１からの光を集光する第２集光光学系３２とを備えている。第１集光光学系３１は、光源装置２５から射出された光を、プレパラート１上に集光可能である。第２集光光学系３２は、プレパラート１からの光を、受光素子２９の近傍に配置されているプレート部材３３の開口３４に集光可能である。ここで、以下の説明において、開口３４を適宜、ピンホール３４、と称し、プレート部材３３を適宜、ピンホール部材３３、と称する。

本実施形態の顕微鏡装置２１は、プレパラート１を所定波長領域の励起光で照明して、プレパラート１から発生する蛍光を観察する蛍光顕微鏡を含む。本実施形態においては、プレパラート１の試料Ｓには、蛍光観察用の処理が予め施されており、プレパラート１の蛍光物質に励起光が照射されることによって、その蛍光物質から蛍光が発生する。

また、上述したように、本実施形態においては、マーク１０も蛍光物質で形成されており、マーク１０に励起光が照射されることによって、そのマーク１０から蛍光が発生する。

本実施形態において、第１集光光学系３１は、光源装置２５から射出された光を用いて、所定波長領域の励起光で、ステージ２８に支持されているプレパラート１を照明する。励起光が照射されることによって、プレパラート１から発生した光（蛍光）は、第２集光光学系３２によって、受光素子２９に導かれる。

第１集光光学系３１は、光源装置２５から射出された光を集光する第１集光レンズ３５と、第１集光レンズ３５で集光された光が入射する第１フィルタ３６と、第１フィルタ３６を透過した光を反射する分離光学素子３７と、分離光学素子３７で反射された光が入射する走査光学系３８と、走査光学系３８からの光が入射する対物レンズ２６とを含む。

第１集光光学系３１の第１集光レンズ３５は、光源装置２５から射出された光を集光する。第１集光レンズ３５で集光された光は、第１フィルタ３６に入射する。

第１フィルタ３６は、光源装置２５からの光のうち、一部の波長領域の光をカットして、蛍光物質の励起に必要な所定波長領域の光（励起光）を抽出する波長選択光学素子である。すなわち、第１フィルタ３６は、所定波長領域の光（励起光）のみを透過させ、他の波長領域の光を透過させないバンドパスフィルタを含む。第１集光レンズ３５で集光され、第１フィルタ３６を透過した所定波長領域の光（励起光）は、分離光学素子３７に入射する。

本実施形態において、分離光学素子３７は、ダイクロイックミラーを含む。ダイクロイックミラー（分離光学素子）３７は、励起光と蛍光とを分離可能である。本実施形態において、ダイクロイックミラー３７は、第１フィルタ３６を透過した所定波長領域の光（励起光）を反射し、所定波長領域以外の光（蛍光）を透過する。第１フィルタ３６を透過した所定波長領域の光（励起光）は、ダイクロイックミラー３７で反射する。

ダイクロイックミラー３７で反射した光は、走査光学系３８を介して、対物レンズ２６に入射する。対物レンズ２６は、ステージ２８に支持されているプレパラート１の表面８と対向可能である。本実施形態において、対物レンズ２６の光軸ＡＸは、Ｚ軸と平行である。

対物レンズ２６は、走査光学系３８からの光を集光して、プレパラート１に照射する。本実施形態においては、対物レンズ２６は、プレパラート１の＋Ｚ側（上方）に配置されている。ダイクロイックミラー３７からの励起光は、走査光学系３８及び対物レンズ２６を介して、プレパラート１の上方より、プレパラート１に照射される。

対物レンズ２６を含む第１集光光学系３１は、光源装置２５から射出された光を集光可能である。第１集光光学系３１は、光源装置２５から射出された光を用いて、集光点（スポット）Ｃ１を形成可能である。本実施形態において、第１集光光学系３１は、集光点Ｃ１をプレパラート１上に形成可能である。

第１集光光学系３１は、励起光によって、プレパラート１上に集光点Ｃ１を形成する。励起光が照射されることによって、第１集光光学系３１によって形成されたプレパラート１上の集光点Ｃ１から、蛍光が発生する。

第２集光光学系３２は、プレパラート１からの光（蛍光）を集光する対物レンズ２６と、対物レンズ２６を透過した光が入射する走査光学系３８と、走査光学系３８からの光を透過する分離光学素子３７と、分離光学素子３７を透過した光が入射する第２フィルタ３９と、第２フィルタ３９を透過した光を集光する第２集光レンズ４０とを含む。ピンホール部材３３のピンホール３４は、第２集光レンズ４０から射出される光が入射可能な位置に配置されている。ピンホール部材３３は、第２集光レンズ４０と受光素子２９との間に配置されている。第２集光レンズ４０から射出され、ピンホール部材３３のピンホール３４を通過した光は、受光素子２９に入射可能である。

プレパラート１から発生した蛍光は、対物レンズ２６及び走査光学系３８を介して、ダイクロイックミラー３７に入射する。ダイクロイックミラー３７に入射した蛍光は、ダイクロイックミラー３７を透過する。ダイクロイックミラー３７を透過した蛍光は、第２フィルタ３９に入射する。

第２フィルタ３９は、プレパラート１からの蛍光と、蛍光以外の波長の不要な光（散乱光等）とを分離して、蛍光のみを抽出する波長選択光学素子である。すなわち、第２フィルタ３９は、蛍光のみを透過させ、他の波長領域の光を透過させないバンドパスフィルタを含む。第２フィルタ３９を透過した蛍光は、第２集光レンズ４０に入射する。

第２集光レンズ４０を含む第２集光光学系３２は、プレパラート１から発生した光を集光可能である。第２集光光学系３２は、プレパラート１から発生した光を用いて、集光点（スポット）Ｃ２を形成可能である。本実施形態において、第２集光光学系３２は、集光点Ｃ２をピンホール部材３３のピンホール３４に形成可能である。

すなわち、本実施形態においては、第２集光光学系３２の集光点Ｃ２には、ピンホール部材３３のピンホール３４が配置されており、第２集光光学系３２は、蛍光によって、ピンホール３４に集光点Ｃ２を形成する。

ピンホール３４を通過した光は、受光素子２９に入射する。受光素子２９は、入射する光（蛍光）の強度に応じた信号を出力する。受光素子２９と制御装置２２とは、ケーブルを介して接続されており、受光素子２９から出力される信号は、ケーブルを介して、制御装置２２に出力される。

走査光学系３８は、例えばガルバノミラーを含む。ガルバノミラーは、駆動装置４１によって駆動される。ガルバノミラーが駆動されることによって、第１集光光学系３１によって形成されるプレパラート１上の集光点Ｃ１が、二次元方向（ＸＹ方向）に移動する。プレパラート１上の集光点Ｃ１から発生する光（蛍光）は、第２集光光学系３２を介して、受光素子２９に入射する。受光素子２９は、入射される光の強度に応じた信号を、制御装置２２に出力する。

制御装置２２は、駆動装置４１を用いて走査光学系３８を駆動して、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１をプレパラート１に対してＸＹ方向に関して移動しつつ、そのプレパラート１から発生する光（蛍光）を受光素子２９で検出する。制御装置２２は、受光素子２９が出力する信号の変化に基づいて、ＸＹ平面内におけるプレパラート１の各点から発生した蛍光の強度分布を求め、その求めた結果に基づいて、プレパラート１の二次元画像を構築する。また、制御装置２２は、受光素子２９を用いて取得したプレパラート１の二次元画像を、表示装置２３を用いて表示する。表示装置２３は、受光素子２９を用いて取得したプレパラート１の二次元画像を拡大して表示することができる。

本実施形態においては、光源装置２５の射出部２５Ａは、点光源を形成し、その光源装置２５の射出部２５Ａとプレパラート１（集光点Ｃ１）とは、第１集光光学系３１に関して光学的に共役な位置関係にある。これにより、光源装置２５の射出部２５Ａから射出された光（励起光）は、プレパラート１上に集光される。

また、本実施形態においては、プレパラート１（集光点Ｃ１）とピンホール３４とは、第２集光光学系３２に関して光学的に共役な位置関係にある。これにより、プレパラート１の集光点Ｃ１から発生した光（蛍光）は、ピンホール３４に集光される。

このように、本実施形態の顕微鏡装置２１は、光源装置２５の射出部２５Ａとピンホール３４とが第１、第２集光光学系３１、３２に関して光学的に共役な位置関係にある共焦点顕微鏡（共焦点レーザ顕微鏡）を含む。これにより、光源装置２５の射出部２５Ａから射出された光は、ピンホール３４に集光される。

共焦点顕微鏡によれば、プレパラート１上の集光点Ｃ１から発生する光（蛍光）が受光素子２９に入射し、不要な散乱光等が受光素子２９に入射することが抑制される。これにより、プレパラート１からの蛍光（あるいは反射光）を良好に検出することができ、高いコントラストの画像を取得することができる。

次に、上述の構成を有する顕微鏡システム２０を用いて、プレパラート１の試料Ｓを観察する方法について説明する。本実施形態の観察方法は、図３のフローチャートに示すように、マーク１０を含むプレパラート１の二次元画像を第１のタイミングで取得する処理（ステップＳＡ１）と、マーク１０を含むプレパラート１の二次元画像を第２のタイミングで取得する処理（ステップＳＡ２）と、ステップＳＡ１で取得されたプレパラート１の二次元画像と、ステップＳＡ２で取得されたプレパラート１の二次元画像とを合成する処理（ステップＳＡ３）とを含む。

なお、図１を参照して説明したように、本実施形態においては、試料Ｓとマーク１０とが重ならないように、プレパラート１が作成される。また、プレパラート１の試料Ｓには、蛍光観察用の処理が予め施される。

ここで、以下の説明においては、ステップＳＡ１で取得されたプレパラート１の二次元画像を適宜、第１の画像、と称し、ステップＳＡ２で取得されたプレパラート１の二次元画像を適宜、第２の画像、と称する。

本実施形態においては、一例として、試料Ｓは、液体とその液体中を移動する微生物等の移動体Ｍとを含み、第１の画像と第２の画像とを合成することによって、移動体Ｍが動く様子を示す動画を構築する場合を例にして説明する。

まず、プレパラート１がステージ２８に支持される。プレパラート１がステージ２８に支持されると、制御装置２２は、第１の画像を取得するために、駆動装置４１を用いて走査光学系３８を駆動して、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１をプレパラート１に対してＸＹ方向に関して移動しつつ、そのプレパラート１から発生する光（蛍光）を受光素子２９で検出する。制御装置２２は、受光素子２９が出力する信号の変化に基づいて、ＸＹ平面内におけるプレパラート１の各点から発生した蛍光の強度分布を求め、その求めた結果に基づいて、プレパラート１の第１の画像を構築する（ステップＳＡ１）。制御装置２２は、取得した第１の画像を、所定の記憶装置に記憶する。

図４（Ａ）は、取得された第１の画像の一例を示す模式図である。本実施形態において、第１の画像は、マーク１０を含む。すなわち、本実施形態においては、複数のマーク１０のそれぞれが含まれるように、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１とプレパラート１とを相対的に移動して、マーク１０及び試料Ｓのそれぞれを含むように、プレパラート１の第１の画像を取得する。

第１の画像を取得した後、制御装置２２は、第２の画像を取得するために、駆動装置４１を用いて走査光学系３８を駆動して、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１をプレパラート１に対してＸＹ方向に関して移動しつつ、そのプレパラート１から発生する光（蛍光）を受光素子２９で検出する。制御装置２２は、受光素子２９が出力する信号の変化に基づいて、ＸＹ平面内におけるプレパラート１の各点から発生した蛍光の強度分布を求め、その求めた結果に基づいて、プレパラート１の第２の画像を構築する（ステップＳＡ２）。制御装置２２は、取得した第２の画像を、所定の記憶装置に記憶する。

ステップＳＡ１における画像取得対象のプレパラート１と、ステップＳＡ２における画像取得対象のプレパラート１とは同じであり、制御装置２２は、ステップＳＡ２において、ステップＳＡ１と同様の処理を実行して、プレパラート１の第２の画像を取得する。

図４（Ｂ）は、取得された第２の画像の一例を示す模式図である。第１の画像と同様、第２の画像は、マーク１０を含む。制御装置２２は、複数のマーク１０のそれぞれが含まれるように、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１とプレパラート１とを相対的に移動して、マーク１０及び試料Ｓのそれぞれを含むように、プレパラート１の第２の画像を取得する。

第１の画像を取得する処理、及び第２の画像を取得する処理を実行した後、制御装置２２は、第１の画像と第２の画像とを合成する処理を実行する（ステップＳＡ３）。本実施形態においては、制御装置２２は、第１の画像と第２の画像とを重ね合わせる。

制御装置２２は、第１の画像と第２の画像とを重ね合わせる際、第１の画像と第２の画像との位置関係を、マーク１０を用いて調整する。本実施形態においては、第１の画像に含まれるマーク１０と、第２の画像に含まれるマーク１０とが一致するように、第１の画像と第２の画像とが位置合わせされる。これにより、図５に示すような、第１の画像と第２の画像とを合成したプレパラート１の合成画像が構築される。合成画像により、試料Ｓ中の移動体（微生物）Ｍが動く様子を把握することができる。

なお、ここでは、説明を簡単にするために、プレパラート１の画像を取得する処理が２回実行される場合を例にして説明したが、もちろん、プレパラート１の画像を取得する処理は、２回に限られず、３回以上の所定回数実行可能である。すなわち、顕微鏡装置２１は、異なるタイミングで複数回、プレパラート１の画像情報を取得可能である。異なるタイミングで取得された複数の画像を合成する際、制御装置２２は、各画像に含まれるマーク１０を用いて、各画像同士を合成する。

以上説明したように、本実施形態によれば、プレパラート１に、異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマーク（アライメントマーク）１０を設けたので、第１の画像と第２の画像とを合成する際、それら画像同士の位置関係を所望状態にすることができる。したがって、動画（例えば、時間経過とともに試料Ｓ中の移動体（微生物）Ｍが動く様子）等の合成画像を良好に構築することができる。

＜第２実施形態＞
次に、第２実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成部分については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。

上述の第１実施形態においては、異なるタイミングで取得した複数の画像を合成して、動画を構築する場合を例にして説明したが、第２実施形態の特徴的な部分は、異なるタイミングで取得した複数の画像を合成して、三次元画像を構築する点にある。本実施形態においては、プレパラート１の第１の画像と第２の画像とは、対物レンズ２６の光軸ＡＸと平行なＺ軸方向において異なる位置で取得された二次元画像である。

図６の模式図に示すように、制御装置２２は、ステージ２８のＺ軸方向の位置を調整して、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１（焦点面）と、Ｚ軸方向に関するプレパラート１（試料Ｓ）の第１高さ部分Ｈ１とを一致させる。そして、制御装置２２は、プレパラート１のＺ軸方向の位置を維持した状態で、第１の画像を取得するために、駆動装置４１を用いて走査光学系３８を駆動して、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１をプレパラート１に対してＸＹ方向に関して移動しつつ、そのプレパラート１から発生する光（蛍光）を受光素子２９で検出する。制御装置２２は、受光素子２９が出力する信号の変化に基づいて、ＸＹ平面内におけるプレパラート１の各点から発生した蛍光の強度分布を求め、その求めた結果に基づいて、プレパラート１の第１の画像を構築する。制御装置２２は、複数のマーク１０のそれぞれが含まれるように、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１とプレパラート１とをＸＹ方向に相対的に移動して、マーク１０及び試料Ｓのそれぞれを含むように、プレパラート１の第１の画像を取得する。制御装置２２は、取得した第１の画像を、所定の記憶装置に記憶する。

第１の画像を取得した後、制御装置２２は、ステージ２８のＺ軸方向の位置を変化させ、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１（焦点面）と、Ｚ軸方向に関するプレパラート１の第２高さ部分Ｈ２とを一致させる。そして、制御装置２２は、プレパラート１のＺ軸方向の位置を維持した状態で、第２の画像を取得するために、駆動装置４１を用いて走査光学系３８を駆動して、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１をプレパラート１に対してＸＹ方向に関して移動しつつ、そのプレパラート１から発生する光（蛍光）を受光素子２９で検出する。制御装置２２は、受光素子２９が出力する信号の変化に基づいて、ＸＹ平面内におけるプレパラート１の各点から発生した蛍光の強度分布を求め、その求めた結果に基づいて、プレパラート１の第２の画像を構築する。制御装置２２は、複数のマーク１０のそれぞれが含まれるように、第１集光光学系３１の集光点Ｃ１とプレパラート１とをＸＹ方向に相対的に移動して、マーク１０及び試料Ｓのそれぞれを含むように、プレパラート１の第２の画像を取得する。制御装置２２は、取得した第２の画像を、所定の記憶装置に記憶する。

第１の画像を取得する処理、及び第２の画像を取得する処理を実行した後、制御装置２２は、第１の画像と第２の画像とを合成する処理を実行する。制御装置２２は、第１の画像と第２の画像との位置関係を、マーク１０を用いて調整しつつ、第１の画像と第２の画像とを重ね合わせる。制御装置２２は、第１の画像に含まれるマーク１０と、第２の画像に含まれるマーク１０とが一致するように、第１の画像と第２の画像とを位置合わせする。これにより、第１の画像と第２の画像とを合成したプレパラート１の三次元画像が構築される。

なお、本実施形態においては、第１の画像及び第２の画像を取得するためにステージ２８（プレパラート１）をＺ軸方向に移動した場合でも、集光光学系の焦点深度内にマーク１０が配置されるように、集光光学系の光学特性が調整されており、第１の画像と第２の画像とを、マーク１０を用いて良好に位置合わせすることができる。

なお、本実施形態においては、説明を簡単にするために、プレパラート１の画像を取得する処理が２回実行される場合を例にして説明したが、もちろん、プレパラート１の画像を取得する処理は、２回に限られず、３回以上の所定回数実行可能である。合成する画像の数を多くすることによって、試料Ｓの三次元画像を良好に構築することができる。

なお、上述の第１、第２実施形態においては、マーク１０がカバーガラス３の表面６に形成されている場合を例にして説明したが、カバーガラス３の裏面７に形成されていてもよい。また、マーク１０は、スライドガラス２の表面４に形成されていてもよいし、スライドガラス２の裏面５に形成されていてもよい。なお、集光光学系の焦点深度が浅い場合等、Ｚ軸方向に関してマーク１０と試料Ｓとが近い位置に配置されているほうが望ましい場合には、マーク１０は、カバーガラス３の裏面７、あるいはスライドガラス２の表面４に配置されていることが望ましい。

また、上述の第１、第２実施形態においては、マーク１０が蛍光物質で形成されている場合を例にして説明したが、蛍光物質以外の材料（例えばクロム等）で形成されていてもよい。

また、マーク１０が、カバーガラス３あるいはスライドガラス２に形成された凹部（刻印）等であってもよい。

なお、上述の第１、第２実施形態においては、マーク１０が４ヵ所に配置されている場合を例にして説明したが、少なくとも２ヵ所に配置されることによって、そのマークを用いて、Ｘ軸、Ｙ軸、及びθＺ方向に関して画像同士を良好に位置合わせすることができる。

なお、上述の各実施形態においては、顕微鏡装置２１が、共焦点レーザ顕微鏡である場合を例して説明したが、顕微鏡装置２１が二光子顕微鏡（多光子顕微鏡）であってもよい。

なお、上述の各実施形態においては、顕微鏡装置２１が、共焦点レーザ顕微鏡であり、走査光学系３８を用いて、プレパラートに対して集光点Ｃ１を移動する場合を例にして説明したが、顕微鏡装置２１が、光学顕微鏡であってもよい。その場合、対物レンズに対して、プレパラートを支持したステージをＸＹ方向に移動することによって、プレパラートの二次元画像を取得することができる。また、対物レンズの視野内に、プレパラート上の複数のマークが同時に配置可能である場合には、対物レンズに対してプレパラートを移動することなく、マーク及び試料を含むプレパラートの二次元画像を取得することができる。

第１実施形態に係るプレパラートを示す斜視図である。 第１実施形態に係る顕微鏡システムの一例を示す概略構成図である。 第１実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。 第１実施形態に係る観察方法の一例を説明するための模式図である。 第１実施形態に係る観察方法の一例を説明するための模式図である。 第２実施形態に係る顕微鏡システムの動作の一例を説明するための模式図である。

符号の説明

１…プレパラート、１０…マーク、２０…顕微鏡システム、２１…顕微鏡装置、２２…制御装置、２８…ステージ、２９…受光素子、３１…第１集光光学系、３２…第２集光光学系、４１…駆動装置、Ｃ１…集光点、Ｃ２…集光点、Ｓ…試料

Claims (11)

1. 二次元の画像を取得する顕微鏡装置に使用されるカバーガラスであって、
   異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマークを備えたカバーガラス。
2. 前記二次元平面内において、試料と前記マークとが重ならないように配置されている請求項１記載のカバーガラス。
3. 前記顕微鏡装置の集光光学系の集光点に対して前記二次元方向に関して相対的に移動されつつ、前記画像が取得される請求項１又は２記載のカバーガラス。
4. 二次元の画像を取得する顕微鏡装置に使用されるスライドガラスであって、
   異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマークを備えたスライドガラス。
5. 顕微鏡装置によって二次元の画像が取得されるプレパラートであって、
   異なるタイミングで取得される第１の画像と第２の画像との位置関係を調整するためのマークを備えたプレパラート。
6. 顕微鏡装置を用いた試料の観察方法であって、
   請求項１〜３のいずれか一項記載のカバーガラスを用いる観察方法。
7. 顕微鏡装置を用いた試料の観察方法であって、
   請求項４記載のスライドガラスを用いる観察方法。
8. プレパラートを顕微鏡装置を用いて観察する観察方法であって、
   請求項５記載のプレパラートを観察する観察方法。
9. マークが形成されたプレパラートを顕微鏡装置を用いて観察する観察方法であって、
   前記顕微鏡装置を用いて、前記マークを含む前記プレパラートの二次元の画像を異なるタイミングで少なくとも２回取得することと、
   前記取得された前記プレパラートの第１の画像と第２の画像との位置関係を前記マークを用いて調整することと、を含む観察方法。
10. マークが形成されたプレパラートを観察する顕微鏡装置であって、
    前記マークを含む前記プレパラートの二次元の画像を異なるタイミングで少なくとも２回取得する撮像装置と、
    前記取得された前記プレパラートの第１の画像と第２の画像との位置関係を前記マークを用いて調整し、前記第１の画像と前記第２の画像とを合成する画像処理装置と、を備えた顕微鏡装置。
11. 前記プレパラート上に集光点を形成可能な集光光学系と、
    前記集光光学系の集光点と前記プレパラートとを前記二次元方向に関して相対的に移動する移動装置を備え、
    前記集光点と前記プレパラートとを相対的に移動しつつ、前記画像を取得する請求項１０記載の顕微鏡装置。

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