CN109964163B - 使用扫掠共焦对准平面激发进行三维成像以及定制图像分离器 - Google Patents

使用扫掠共焦对准平面激发进行三维成像以及定制图像分离器 Download PDF

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Abstract

在第一发明中，一种SCAPE***将来自倾斜的中间图像平面(170)的光引导到设置在第三物镜(180)后面的无限空间。位于无限空间中的第一分束器(52)沿不同方向引导来自中间图像平面的具有不同波长的光。第一和第二光检测器阵列(90)分别捕获第一波长图像和第二波长图像，并且光学部件(54，56，58，82)分别将具有第一波长和第二波长的光朝向第一光检测器和第二光检测器引导。在第二发明中，SCAPE***用于在扰动(例如，振动、变形、推动、拉动、拉伸或挤压)样品的情况下捕获多个图像，以便可视化扰动对样品的影响。

Description

使用扫掠共焦对准平面激发进行三维成像以及定制图像分 离器
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年9月16日提交的美国临时申请62/395,812和于2016年9月20日提交的美国临时申请62/397,275的优先权，这两个申请的全部内容通过引用并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的NS094296、NS076628、NS063226和NS053684资助款的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及显微镜术。
背景技术
已经将其内容通过引用并入本文的WO 2015/109323和US 2016/0327779中研制并描述了三维成像***，其被称为扫掠共焦对准平面激发(SCAPE)显微镜术。通过扫描激发光和去扫描图像光，SCAPE***在光检测器上以高速形成三维显微图像，使得在每个瞬间都能检测到样品的多个深度。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种第一成像装置。该第一成像装置包括具有近端和远端的第一组光学部件，其中，第一组光学部件包括第一物镜，第一物镜设置在第一组光学部件的远端。第一成像装置还包括具有近端和远端的第二组光学部件，其中，第二组光学部件包括第二物镜，第二物镜设置在第二组光学部件的远端。第一成像装置还包括扫描元件，扫描元件相对于第一组光学部件的近端设置在近侧，并且相对于第二组光学部件的近端设置在近侧。扫描元件被布置成引导片状激发光(a sheet of excitation light)，使得片状激发光将沿近端到远端方向穿过第一组光学部件并且投射到样品中，所述样品在第一组光学部件的远端之外定位在远侧，其中片状激发光以倾斜角度投射到样品中，并且其中片状激发光在基于扫描元件的取向而变化的位置处投射到样品中。第一组光学部件将来自样品的检测光沿远端到近端方向引导回到扫描元件。扫描元件还被布置为引导检测光，使得检测光将沿近端到远端方向穿过第二组光学部件，并且在第二组光学部件的远端之外但在远侧的位置处形成中间图像平面。第一成像装置还包括第三物镜，第三物镜被布置为将来自中间图像平面的光引导到无限空间，其中，中间图像平面设置在第三物镜的前面，而无限空间设置在第三物镜的后面。第一成像装置还包括第一分束器，第一分束器定位在无限空间中。第一分束器被布置为沿第一方向引导来自中间图像平面的具有第一波长的光并且沿第二方向引导来自中间图像平面的具有第二波长的光，其中第二方向与第一方向不同，并且其中第一波长比第二波长长。第一成像装置还包括第一光检测器阵列，第一光检测器阵列被布置为捕获第一波长图像；以及第二光检测器阵列，第二光检测器阵列被布置为捕获第二波长图像。第一成像装置还包括第三组光学部件，第三组光学部件被布置为将离开第一分束器的具有第一波长的光朝向第一光检测器阵列引导，并且将离开第一分束器的具有第二波长的光朝向第二光检测器阵列引导。
在第一成像装置的一些实施例中，第一光检测器阵列和第二光检测器阵列在不同的光检测器芯片上实现。在第一成像装置的一些实施例中，第一光检测器阵列和第二光检测器阵列在单个光检测器芯片的分离区域上实现。
在第一成像装置的一些实施例中，第三组光学部件包括：第二分束器；第一转向镜，第一转向镜被布置为将离开第一分束器的具有第一波长的光引导到第二分束器中；第二转向镜，第二转向镜被布置为将离开第一分束器的具有第二波长的光引导到第二分束器中；以及至少一个透镜，至少一个透镜设置在(a)第二分束器和(b)第一和第二光检测器阵列之间。在这些实施例中，第二分束器被布置为将来自第一转向镜和第二转向镜的光朝向至少一个透镜引导。
在这些实施例的一些实施例中，第一分束器包括长通二向色元件，长通二向色元件使第一波长的光通过而不转移其路径，并且沿第二方向重新定向第二波长的光。第二分束器包括长通二向色元件，长通二向色元件使第一波长的光通过而不转移其路径，并且将来自第二转向镜的第二波长的光朝向至少一个透镜重新定向。可选地，第一分束器和第二分束器中的每个分束器在相应的可移动模块中实现。该装置还包括：(i)第一光学块；(ii)用于将第一分束器移出第一光学路径并且将第一光学块移动到第一光学路径中的机构；(iii)第二光学块；以及(iv)用于将第二分束器移出第二光学路径并且将第二光学块移动到第二光学路径中的机构。
在这些实施例的一些实施例中，第一分束器包括长通二向色元件，长通二向色元件使第一波长的光通过而不转移其路径，并且沿第二方向重新定向第二波长的光；第二分束器包括短通二向色元件，短通二向色元件使第二波长的光通过而不转移其路径，并且将来自第一转向镜的第一波长的光朝向至少一个透镜重新定向。可选地，第一分束器和第二分束器中的每个分束器均在相应的可移动模块中实现。该装置还包括：(i)第一光学块；(ii)用于将第一分束器移出第一光学路径并且将第一光学块移动到第一光学路径中的机构；(iii)包括镜的第二光学块；以及(iv)用于将第二分束器移出第二光学路径并且将第二光学块移动到第二光学路径中的机构。
在这些实施例的一些实施例中，第一转向镜和第二转向镜中的至少一个转向镜的取向能够调整。可选地，第一转向镜和第二转向镜中的至少一个转向镜的位置能够调整。可选地，第一光检测器阵列和第二光检测器阵列在单个光检测器芯片的分离区域上实现。
在这些实施例的一些实施例中，离开第二分束器的光偏离由(a)第一组光学部件的光轴和(b)第二组光学部件的光轴所限定的平面小于30°。在这些实施例的一些实施例中，离开第二分束器的光偏离由(a)第一组光学部件的光轴和(b)第二组光学部件的光轴所限定的平面小于15°。在这些实施例的一些实施例中，离开第二分束器的光与由(a)第一组光学部件的光轴和(b)第二组光学部件的光轴所限定的平面的垂直度为±30°。在这些实施例的一些实施例中，离开第二分束器的光与由(a)第一组光学部件的光轴和(b)第二组光学部件的光轴所限定的平面的垂直度为±15°。
在这些实施例的一些实施例中，第一分束器和第二分束器中的每个分束器均在相应的可移除的磁性安装模块中实现。
在第一成像装置的一些实施例中，第一分束器在可移除的磁性安装模块中实现。
第一成像装置的一些实施例还包括片状光发生器，片状光发生器将来自光源的光扩展成片状激发光；以及辅助分束器，辅助分束器设置在第二组光学部件的近端和扫描元件之间。在这些实施例中，辅助分束器被布置为将来自片状光发生器的片状激发光朝向扫描元件引导，并且辅助分束器被布置将来自扫描元件的检测光引导到第二组光学部件的近端中。在这些实施例的一些实施例中，片状光发生器包括光源和以下中的至少一项：(a)柱面透镜，柱面透镜被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光；(b)非球面镜，非球面镜被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光；(c)空间光调制器，空间光调制器被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光；(d)第二扫描元件，第二扫描元件被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光；以及(e)振荡检流计镜，振荡检流计镜被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光。
在一些实施例中，第一成像装置还包括片状光发生器，片状光发生器将来自光源的光扩展成片状激发光。在这些实施例中，第二组光学部件被布置为将来自片状光发生器的片状激发光沿远侧到近侧方向朝向扫描元件引导。在这些实施例的一些实施例中，片状光发生器包括光源和以下中的至少一项：(a)柱面透镜，柱面透镜被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光；(b)非球面镜，非球面镜被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光；(c)空间光调制器，空间光调制器被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光；(d)第二扫描元件，第二扫描元件被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光；以及(e)振荡检流计镜，振荡检流计镜被布置为将来自光源的光扩展成片状激发光。
在第一成像装置的一些实施例中，中间图像平面是静止的。在第一成像装置的一些实施例中，第一波长对应于红光，并且第二波长对应于绿光。
本发明的另一方面涉及一种第二成像装置。该第二成像装置包括光学***，所述光学***：(a)将片状激发光以倾斜角度投射到样品中，其中，片状激发光在样品内的位置基于扫描元件的取向而变化，并且(b)在中间图像平面处由源自片状激发光的位置处的检测光形成图像，其中，无论扫描元件的取向如何，中间图像平面都保持静止。第二成像装置还包括第三物镜，第三物镜被布置为将来自中间图像平面的光引导到无限空间，其中，中间图像平面设置在第三物镜的前面，而无限空间设置在第三物镜的后面。第二成像装置还包括第一分束器，第一分束器位于无限空间中，其中，第一分束器被布置为沿第一方向引导来自中间图像平面的具有第一波长的光，并且沿第二方向引导来自中间图像平面的具有第二波长的光，其中第二方向不同于第一方向，并且其中第一波长比第二波长长。第二成像装置还包括第一光检测器阵列，第一光检测器阵列被布置为捕获第一波长图像；第二光检测器阵列，第二光检测器阵列被布置为捕获第二波长图像；第三组光学部件，第三组光学部件被布置为将离开第一分束器的具有第一波长的光朝向第一光检测器阵列引导，并且将离开第一分束器的具有第二波长的光朝向第二光检测器阵列引导。
在第二成像装置的一些实施例中，第一光检测器阵列和第二光检测器阵列在不同的光检测器芯片上实现。在第二成像装置的一些实施例中，第一光检测器阵列和第二光检测器阵列在单个光检测器芯片的分离区域上实现。
在第二成像装置的一些实施例中，第三组光学部件包括：第二分束器；第一转向镜，第一转向镜被布置为将离开第一分束器的具有第一波长的光引导到第二分束器中；第二转向镜，第二转向镜被布置为将离开第一分束器的具有第二波长的光引导到第二分束器中；以及至少一个透镜，至少一个透镜设置在(a)第二分束器和(b)第一和第二光检测器阵列之间。在这些实施例中，第二分束器被布置为将来自第一转向镜和第二转向镜的光朝向至少一个透镜引导。
在这些实施例的一些实施例中，第一分束器包括长通二向色元件，长通二向色元件使第一波长的光通过而不转移其路径，并且沿第二方向重新定向第二波长的光。在这些实施例中，第二分束器包括长通二向色元件，长通二向色元件使第一波长的光通过而不转移其路径，并且将来自第二转向镜的第二波长的光朝向至少一个透镜重新定向。可选地，在这些实施例中，第一分束器和第二分束器中的每个分束器在相应的可移动模块中实现。该装置还包括：(i)第一光学块；(ii)用于将第一分束器移出第一光学路径并且将第一光学块移动到第一光学路径中的机构；(iii)第二光学块；以及(iv)用于将第二分束器移出第二光学路径并且将第二光学块移动到第二光学路径中的机构。
在这些实施例的一些实施例中，第一分束器包括长通二向色元件，长通二向色元件使第一波长的光通过而不转移其路径，并且沿第二方向重新定向第二波长的光；第二分束器包括短通二向色元件，短通二向色元件使第二波长的光通过而不转移其路径，并且将来自第一转向镜的第一波长的光朝向至少一个透镜重新定向。可选地，在这些实施例中，第一分束器和第二分束器中的每个分束器均在相应的可移动模块中实现。该装置还包括：(i)第一光学块；(ii)用于将第一分束器移出第一光学路径并且将第一光学块移动到第一光学路径中的机构；(iii)包括镜的第二光学块；以及(iv)用于将第二分束器移出第二光学路径并且将第二光学块移动到第二光学路径中的机构。
在这些实施例的一些实施例中，第一转向镜和第二转向镜中的至少一个转向镜的取向能够调整。可选地，在这些实施例中，第一转向镜和第二转向镜中的至少一个转向镜的位置能够调整。可选地，在这些实施例中，第一光检测器阵列和第二光检测器阵列在单个光检测器芯片的分离区域上实现。
在这些实施例的一些实施例中，离开第二分束器的光偏离由(a)激发光的光轴和(b)检测光的光轴所限定的平面小于30°。在这些实施例的一些实施例中，离开第二分束器的光偏离由(a)激发光的光轴和(b)检测光的光轴所限定的平面小于15°。在这些实施例的一些实施例中，离开第二分束器的光与由(a)激发光的光轴和(b)检测光的光轴所限定的平面的垂直度为±30°。在这些实施例的一些实施例中，离开第二分束器的光与由(a)激发光的光轴和(b)检测光的光轴所限定的平面的垂直度为±15°。
在这些实施例的一些实施例中，第一分束器和第二分束器中的每个分束器均在相应的可移除的磁性安装模块中实现。
在第二成像装置的一些实施例中，第一分束器在可移除的磁性安装的模块中实现。
本发明的另一方面涉及一种第三成像装置。该第三成像装置包括具有近端和远端的第一组光学部件，其中，第一组光学部件包括第一物镜，第一物镜设置在第一组光学部件的远端。第三成像装置还包括具有近端和远端的第二组光学部件，其中，第二组光学部件包括第二物镜，第二物镜设置在第二组光学部件的远端。第三成像装置还包括扫描元件，扫描元件相对于第一组光学部件的近端设置在近侧，并且相对于第二组光学部件的近端设置在近侧。扫描元件被布置为引导片状激发光，使得片状激发光将沿近端到远端方向穿过第一组光学部件并且投射到样品中，所述样品在第一组光学部件的远端之外定位在远侧，其中，片状激发光以倾斜角度投射到样品中，并且其中片状激发光在基于扫描元件的取向而变化的位置处投射到样品中。第一组光学部件将来自样品的检测光沿远端到近端方向引导回到扫描元件。扫描元件还被布置为引导检测光，使得检测光将沿近端到远端方向穿过第二组光学部件，并且在第二组光学部件的远端之外在远侧的位置处形成中间图像平面。第三成像装置还包括致动器，致动器被配置为在片状激发光在分别对应于扫描元件的多个不同取向的多个位置处投射到样品中的情况下，扰动样品；以及光检测器阵列，光检测器阵列被布置为捕获中间图像平面的多个图像，这多个图像分别对应于扫描元件的多个不同取向。
在第三成像装置的一些实施例中，致动器包括振动器。在第三成像装置的一些实施例中，致动器包括音频换能器和超声频率换能器中的至少一个。在第三成像装置的一些实施例中，致动器被配置为变形、推动、拉动、拉伸或挤压样品。
本发明的另一方面涉及一种第四成像装置。第四成像装置包括光学***，所述光学***：(a)将片状激发光以倾斜角度投射到样品中，其中，片状激发光在样品内的位置基于扫描元件的取向而变化；并且(b)在中间图像平面处由源自片状激发光的位置处的检测光形成图像，其中，无论扫描元件的取向如何，中间图像平面都保持静止。第四成像装置还包括致动器，致动器被配置为在片状激发光在分别对应于扫描元件的多个不同取向的多个位置处投射到样品中的情况下，扰动样品。第四成像装置还包括光检测器阵列，光检测器阵列被布置为捕获中间图像平面的多个图像，这多个图像图像分别对应于扫描元件的多个不同取向。
在第四成像装置的一些实施例中，致动器包括振动器。在第四成像装置的一些实施例中，致动器包括音频换能器和超声频率换能器中的至少一个。在第四成像装置的一些实施例中，致动器被配置为变形、推动、拉动、拉伸或挤压样品。
本发明的另一方面涉及一种对样品成像的第一方法。第一方法包括：将片状激发光以倾斜角度投射到样品中，其中，片状激发光在样品内的位置基于扫描元件的取向而变化；在中间图像平面处由源自片状激发光的位置处的检测光形成图像，其中，无论扫描元件的取向如何，中间图像平面都保持静止；在片状激发光在分别对应于扫描元件的多个不同取向的多个位置处投射到样品中的情况下，扰动样品；以及捕获中间图像平面的多个图像，该多个图像分别对应于扫描元件的多个不同取向。
在第一方法的一些实施例中，扰动包括振动。在第一方法的一些实施例中，扰动包括以音频或超声频率扰动。在第一方法的一些实施例中，扰动包括推动、拉动、拉伸或挤压样品中的至少一种。
本发明的另一方面涉及一种第五成像装置。该第五成像装置包括：光源；至少一个光学部件，至少一个光学部件从光源生成片状光；分束器，分束器设置在片状光的路径中；扫描镜，扫描镜设置在片状光的路径中；第一望远镜，第一望远镜具有近端和远端、以及设置在第一望远镜的远端的第一物镜；以及第二望远镜，第二望远镜具有近端和远端、以及设置在第二望远镜的远端的第二物镜。分束器将片状光朝向扫描镜引导，并且扫描镜将片状光引导到第一望远镜的近端中。第一望远镜沿近端到远端方向引导片状光通过第一物镜而进入样品中，接受通过第一物镜来自样品的返回光，并且沿远端到近端方向引导返回光回到扫描镜。扫描镜引导返回光通过分束器并且进入第二望远镜的近端，并且第二望远镜沿近端到远端方向引导片状光通过第二物镜，以形成倾斜的中间图像平面。第五成像装置还包括：相机，相机被光学定位成在倾斜的中间图像平面处捕获图像；以及致动器，致动器被配置为扰动样品。
在第五成像装置的一些实施例中，致动器包括振动器。在第五成像装置的一些实施例中，致动器包括音频换能器和超声频率换能器中的至少一个。在第五成像装置的一些实施例中，致动器被配置为变形、推动、拉动、拉伸或挤压样品。
本发明的另一方面涉及一种扫描显微镜的第二方法。该扫描显微镜的第二方法包括：提供三维体积的宽视场照明；通过多个位置扫描光重新定向器，其中，光重新定向器适于扫描来自体积内的多个不同深度的光并且将光传送到光检测器；存储对应于从针对所述光重新定向器的、用于多个聚焦和离焦样品的所述多个位置中的每个位置的聚焦和离焦平面接收的光的信号；以及通过对所存储的信号进行去卷积，重构样品中的多个平面中的每个平面的光。
在第二扫描显微镜方法的一些实施例中，平面中的每个平面与用于聚焦平面中的至少一些平面的主物镜的光轴形成对角线。
附图说明
图1是在样品扰动期间捕获图像的SCAPE***的框图。
图2是在样品扰动期间捕获图像的另一SCAPE***的框图。
图3是具有使光损失最小化的图像分离器的SCAPE***的框图。
图4是具有使光损失最小化的图像分离器的另一SCAPE***的框图。
图5描绘了图3和图4的实施例的沿垂直于参考平面的方向重新定向光的另选图像分离器。
图6A和图6B描绘了转向镜分别以不同取向倾斜的图3和图4的图像分离器的详细视图。
图7A和图7B描绘了图6A和图6B的图像分离器的变型的详细视图，其中添加了位置移位器以改善共同对准。
图8A和图8B描绘了图7A和图7B的图像分离器的详细视图，其中入射光束的位置偏移。
图9描绘了改进的图像分离器配置，其相对于图3和图4的图像分离器改变出射光的方向。
图10描绘了另选图像分离器，其中短通二向色分束器用作第二分束器。
图11A描绘了与图6A的实施例类似的可重新配置实施例。
图11B描绘了在两个图像分离器被换下并且用实心玻璃光学立方体替换之后以“旁路模式”操作的图11A的实施例。
图12描绘了在两个图像分离器被换下并且用另选光学元件替换之后以“旁路模式”操作的图10的实施例。
以下参考附图对各种实施例进行详细描述，其中相同的附图标记表示相同的元件。
具体实施方式
在全部内容通过引用并入本文的WO 2015/109323和US 2016/0327779中公开了实现使用扫描共焦对准平面激发(SCAPE)进行成像的多种实施例。
第1部分：使用SCAPE进行弹性成像
在许多情况下，癌变组织的机械特性不同于正常组织的机械特性。另外，不同的组织类型/层等通常具有不同的机械特性。表征组织是正常还是发生癌变或表征组织以确定它们是什么类型的组织(例如，软骨、主动脉、子宫颈、心脏等)可能具有重要的临床效用，因为机械改变可能先于更严重的病理学改变或可用于检测治疗效果。
机械扰动组织(例如，通过变形、推动、拉动、拉伸、挤压、振动、施加超声等)使组织的各部分移动。如果对该运动进行成像(特别以3D)，则可以量化或测量组织的机械特性。这已经在大组织上通过使用MRI和超声以及使用光学相干断层扫描(OCT)得以实现，该光学相干断层扫描揭示了如新鲜组织病理学之类的事物的微观机械对比。但是在该情况下，所有那些成像模态都有缺陷。更具体地，使用MRI的帧速率非常低，使用超声的分辨率和图像质量非常低；并且使用OCT的穿透深度很低。
图1是使用SCAPE的***的框图，该***通过在样品145的扰动期间以非常高的帧速率捕获分辨率良好的图像来克服这些缺点。
在***的SCAPE部分中，来自光源(例如，激光器100或LED)的光通过一个或多个引导镜115朝向分束器120(例如，二向色分束器)引导，并且通过一个或多个柱面透镜110从笔形光束扩展成片(sheet)。在另选实施例(未示出)中，代替使用柱面透镜110，将来自光源(例如，激光器100)的笔形光束(pencil-shaped beam)转换成扇形片(fan-shaped sheet)，Powell透镜或SLM可以用于执行该功能。在另选实施例中，引导镜115中的一个引导镜可以用检流计替换，该检流计被取向为扫描笔形光束，以便产生虚拟片状光。注意，如本文中所使用的，术语“片状光(sheet of light)”包括这些虚拟片状光以及真实片状光(例如，使用一个或多个柱面透镜和/或Powell透镜等形成的片状光)。
片状光(更准确地说，如本领域技术人员所理解的，片的前体，因为该片最终由第一物镜140形成)被分束器120朝向扫描元件125反射。在一些实施例中，该扫描元件125包括快速移动的检流计镜。在另选实施例中，扫描元件125可以使用快速移动的棱镜或包括MEMS光导、SLM等的多种另选设计中的任一种来实现，这些另选设计对于相关领域的技术人员而言是显而易见的，或者在上述并入本文的参考文献中变得显而易见。
在通过扫描元件125重新引导之后，片状光通过第一组光学部件(例如，透镜131、132和第一物镜140)沿近端到远端的方向继续沿着激发臂向下。然后，片状光以倾斜角度进入组织样品145，以沿着Z轴穿透组织样品，而产生片状光142。当扫描元件125移动时(例如，由于检流计镜125的运动)，它使得片状光142在样品内的位置平移。因此，片状激发光在样品内的位置依据扫描元件125的取向而变化。
激发光可以激发样品145中的荧光，或者激发光可以仅照亮样品，并且对所照亮的区域进行成像。图像光从样品到检测器的路径首先沿远端到近端方向穿过第一组光学部件131-140，并且返回到扫描元件125。从扫描元件125，图像光穿过二向色分束器120，并且进入检测臂。检测臂包括第二组光学部件(例如，透镜151、155和第二物镜160)。图像光沿近端到远端方向穿过这些部件151-160，并且形成中间图像平面170。因为片状光以倾斜角度进入样品，所以对应于由片状光142照亮的样品的部分的中间图像平面将相对于透镜151、155的光轴倾斜。SCAPE的这种配置的其中一个优点是无论片状光142在样品内的位置的改变如何，中间图像平面170的位置保持静止。
在一些实施例中，激发臂中的第一组光学部件131-140与检测臂中的第二组光学部件151-160匹配。在激发路径和检测路径中使用相同的扫描元件125。这种配置是有利的，因为它消除了使用另选方法难以消除的某些光学畸变。例如，如果检测臂中的第二组光学部件151-160的放大率大于激发臂中的第一组光学部件131-140的放大率，则倾斜的中间图像平面170处出现的图像可能会失真。然而，在一些情形下，这种失真可能是可接受的或甚至是期望的(例如，当放大率的差值用于减小倾斜的中间图像平面的角度时)。
为了捕获倾斜的中间图像平面170处出现的图像，可以使用多种方法。在图1的实施例中，使用放大镜来旋转和扩展图像并且将其引导到光检测器阵列(例如，相机190)。该放大镜包括第三物镜180和附加光学部件(例如，透镜182和可选的长通滤光片181)。光检测器阵列(例如，相机190)捕获倾斜的中间图像平面170的图像。
基于SCAPE的***在穿透合理深度的情况下可以有利地以高帧速率获取高质量的3D图像帧。
当***的SCAPE部分获取图像时(例如，如上所述)，致动器200扰动样品145。可以使用多种致动器200以实现该目的，其包括例如实现机械扰动的致动器，诸如，螺线管、音频换能器、超声换能器、机械搅拌器或蜂鸣器等。在另选实施例中，可以使用实现非机械扰动的致动器，并且SCAPE***可以用于在非机械扰动之前、期间和之后获取图像。非机械扰动的示例包括但不限于温度改变、暴露于光或辐射中等。虽然图1描绘了设置在物镜140的一侧的致动器200，但是可以使用另选配置。例如，多个致动器可以放置在物镜140的相对两侧上，或者可以在物镜140周围提供环形致动器。当然，致动器200的定位将取决于正在由致动器引起的扰动的性质。
在致动器200对组织样品145施加扰动的情况下使用SCAPE获取的图像可以用于量化组织中的特征的位移和/或运动速度，并且提供机械特性(例如，杨氏模量、剪切模量、应变、以及刚度)的测量。SCAPE还可以用于获取微观/细胞等级的更多的尚未被探索(在诸如原子力显微镜(AFM)之类的模态的情况下)出的特征。
可以通过内在荧光或反射对比度或通过引入荧光标记物、珠子、染料和其他物质来提供图像对比度。斑点变化的成像可以为表征诸如流动(例如，与血流分析的OCT扩展有关)之类的机械和动态过程提供更多机会。
可以以多种方式执行空间变形的分析，空间变形的分析还涉及使用SCAPE用于成像粒子流动并且使用速度测量学用于跟踪表示流动和物理变形的组织(和其他物质)的动态3D改变。
有利地，SCAPE在任何给定瞬间获取具有深度方向的完整像素平面(对于具有真实片状光的实施例)或具有深度方向的完整像素线(对于具有虚拟片状光的实施例)。与其中在任何给定瞬间仅可以对单个深度进行成像的对比技术相比，这提供了显著的速度优势。该速度优势对于体内成像特别有用，因为被成像的主体正在移动(例如，在心脏的情况下)或者至少易于移动。并且，在对样品145施加扰动的情况下，该速度优势对样品成像极其有用，使得可以实时可视化扰动的影响。
除了以下情况之外，图2类似于图1的实施例：代替经由图1的分束器120(其设置在第二组光学部件151-160的近端和扫描元件125之间)将片状激发光引入***；省略该分束器；并且经由第二物镜160通过注入片而将片状激发光引入***中，使得它沿远端到近端方向穿过第二组光学部件151-160。
图2中描绘的用于实现该目的的一种方法使用光源200(例如，激光器或LED)来生成笔形光束，并且光束成形光学器件205(例如，柱面透镜110、或Powell透镜或SLM)将该笔形光束扩展成片状激发光。用于形成上文结合图1所讨论的片状激发光的任何另选方法也可以用于该图2的实施例。然后，将片状激发光引入第四物镜220。片状激发光穿过第四物镜220，并且进入第二组光学部件151-160的远端。然后，片状激发光沿远端到近端方向穿过第二组光学部件151-160，直到它到达扫描元件125为止。图2的实施例的随后的操作类似于上文所描述的图1的实施例的操作。
第2部分：使用新型图像分离器进行SCAPE
在某些情形下，同时捕获同一主体的不同颜色的图像可能是有利的。例如，可以将两种不同的荧光团(例如，mCherry和GCaMP)引入单个样品中，同时激发以分别显示肌肉结构和钙动态。
同时捕获同一主体的不同颜色图像的一种方式是使用具有位于CCD上方的适当滤光片(例如，Bayer滤光片)的图像传感器(例如，CCD)。但是，这种解决方案不适用于显微镜术，因为滤光片丢弃了超过一半的入射光，这对信噪比和NA有很大的负面影响。
同时捕获同一主体的不同颜色图像的另一种方式是使用市售的图像分离器(例如，由Andor销售的Optosplit II)。参见图1和图2，将任何这些市售的图像分离器添加到SCAPE***需要将图像分离器定位在透镜182和相机190之间(由于这些图像分离器的光学设计，其将图像平面映射到相机上)。但是，当发明人分析了不同的市售的图像分离器之后，发现每个图像分离器都会使图像失真并且会丢弃大部分光。
因为SCAPE***中的中间图像平面170相对于第二组光学部件151-160的光轴倾斜，所以使用与倾斜的中间图像平面170对准的第三物镜180的SCAPE***本身会丢失大部分光。(这是因为在检测臂中离开第二物镜160的大部分光不会进入第三物镜180，所以这些光就丢失了。)鉴于这些固有损失，最小化光的任何进一步损失(例如，在数值孔径和信噪比的情况下)是有利的。
图3的实施例描绘了一种用于将图像分离器50添加到SCAPE***的新方法，该图像分离器50与SCAPE兼容并且能够最小化大于或超过前一段落中描述的固有损失的附加损失。更具体地，图3的实施例将图像分离器50添加到SCAPE***，该图像分离器50与SCAPE***协同操作以减少失真量并且减少丢失的光量。该实施例用于对多色对比度进行成像，以及用于改善对准的自由度。在图3的实施例中，图像分离器50包括下文所讨论的部件52-58。
发明人已经认识到，离开第三物镜透镜180的光不需要形成为图像，也不需要在被分色之前重新映射。相反，光可以在到达相机之前进行分色。结构，使不同颜色的光将到达相机传感器上的不同区域，或甚至到达单独的传感器(即，每种颜色对应一个传感器)。这大大简化了图像分离器的设计，从而其可以用可获得的零件以较低的成本生成该图像分离器。
图3的实施例的部件100-180和图1和图2的实施例的对应部件100-180的操作方式相同。但是值得注意的是，图3的实施例不包括位于第三物镜180后面的透镜182。相反，图像分离器50的初始光学元件(例如，第一分束器52)直接位于第三物镜180后面，即，位于在第三物镜180后面的准直空间(也就是该物镜180的“无限空间”)中。
在图3的实施例中，离开第三物镜180的背面的光进入分束器52，而非首先穿过聚焦元件(例如，透镜)。在该实施例中，第一分束器52是长通二向色分束器。入射光被第一分束器52分离，使得较长波长(以实线示出)直接穿过第一分束器52朝向第一转向镜54，而较短波长(以虚线示出)朝向第二转向镜56重新定向(例如，反射)。然后，第一转向镜54朝向第二分束器58重新定向较长波长，并且第二转向镜56朝向第二分束器58重新定向较短波长。在该实施例中，第二分束器58也是长通二向色分束器。
来自第一转向镜54的较长波长(以实线示出)直接穿过第二分束器58朝向透镜82；并且，来自第二转向镜56的较短波长(以虚线示出)由第二分束器58朝向同一透镜82重新定向(例如，反射)。然后，两个波长的光将继续到达相机90。
除了以下情况之外，图4描绘了与图3的实施例类似的另选实施例：代替经由图3的分束器120将片状激发光引入***中，省略了该分束器120；并且，经由第二物镜160通过注射片将片状激发光引入***中，如上文结合图2所描述的。
注意，如图3和图4所示，当对跟随第三物镜180的光学部件52-58、82和90进行布置时，光学部件52-58中的反射在光到达相机90之前在光路中引入左转向。另外，离开图像分离器50的光停留在由(a)第一组光学部件131-140的光轴和(b)第二组光学部件151-160的光轴所限定的平面中。该平面在本文中称为“参考平面”。注意，在一些情况下，离开图像分离器50的光可以在参考平面上方或下方转向，如下文所讨论的。在一些实施例中，这些偏离(deviation)小于30°。在一些实施例中，这些偏离小于15°。
在一些另选实施例中，跟随第三物镜180的所有光学部件52-58、82和90都可以在倾斜的中间图像平面170和转向镜54之间围绕光轴旋转90°，使得在光(其将设置在页面和读者之间)到达相机90之前，图像分离器50中的反射将光向上重新定向到页面之外(即，朝向读者，沿垂直于参考平面的方向)。在图5中描绘了该配置。(注意，为了清楚起见，在图5中省略了元件52和54，因为这些元件完全被元件56和58遮挡)。还要注意，如下文所讨论的，可以通过转向引入与参考平面的真实垂直度的偏差。在一些实施例中，离开第二分束器的光与参考平面的垂直度为±30°。在一些实施例中，离开第二分束器的光与参考平面的垂直度为±15°。
在其他另选实施例(未示出)中，跟随第三物镜180的所有光学部件52-58、82和90可以在倾斜的中间图像平面170和转向镜54之间围绕光轴沿相反方向旋转90°，使得在光(其将设置在页面后面)到达相机90之前，图像分离器50中的反射将光向下重新定向到页面中(即，远离读者，沿垂直于参考平面的方向)。再者，这里，如下文所讨论的，可以通过转向引入与参考平面的真实垂直度的类似偏差。
模拟和实际测试表明，在离开图像分离器50的光垂直于参考平面或者大致垂直于参考平面的那些实施例中，某些类型的像差被最小化。并且，减小这些像差可以更容易叠加由相机90获得的短波长图像和由相机90获得的长波图像。
当图3至图5的实施例中的转向镜54和56对准时，从第二长通二向色分束器58发出的两个波长的光将在相机90的图像传感器处对准。然而，当转向镜54、56倾斜时，不同波长的光会有方向差异，使得每个波长的光将聚焦在相机90的图像传感器上的两个不同的位置91、92上。这在图6A和图6B中图示，该图6A和图6B描绘了第三物镜180和相机90(在图3和图4的实施例中)之间设置的部件的详细视图，其中转向镜54、56分别以不同取向倾斜。
在一些实施例中，两个转向镜54、56中的每个转向镜都具有两个转向自由度。如果通过围绕垂直于图6B中的页面的轴线(如曲线箭头A1、A2所示)旋转转向镜54、56来调整转向镜54、56，则长波长和短波长的光将分别聚焦在相机90的图像传感器上的两个不同的位置91、92上，如图6B所描绘的。但是，如果通过围绕相对于图6B中所描绘的页面垂直的轴线(如曲线箭头B1、B2所示)旋转转向镜54、56来调整转向镜54、56，则转向镜54、56将长波长和短波长的光分别转向到图6B所描绘的页面前面和后面的两个不同位置(未示出)。
图6A/图6B配置的一个潜在复杂性是改变转向镜54、56的角度以移动不同波长的图像(相对于相机90的图像传感器)来改变射入末级镜筒透镜的光的位置，并且这种位置改变会引入像差。解决该问题的一种方法是使用附加的图像中继光学器件将每个镜成像到镜筒透镜上。
另一种选择是将位置移位器引入***中以使得能够进行更好的共同对准，如图7A/7B和图8A/7B所描绘的。注意，图像位移是光束角度而非镜头上的位置的函数。如图所示，可以通过在各个位置(例如，图7A中所描绘的位置和图7B中所描绘的位置)之间移动转向镜62(即，在方向A上沿与该取向相对地调整该镜的位置)来改变每个不同波长的光将聚焦的位置，直到不同波长91、92的焦点一起移动为止，如图7B中所描绘的。
也可以通过移动光进入第一分束器52的点来改变相机90内的、每个不同波长的光将聚焦的位置。例如，比较图7A中所描绘的光的路径(光到达第一分束器52的中心)与图8A中所描绘的光的路径(光到达时相对于中心发生偏移)的焦点91、92。提供这种附加自由度可以使***更具耐用性，以对与第二物镜透镜的部分NA相对应的光进行重新成像。
上文结合图5至图8所描述的图像分离器设计都引入了光束中的90°左转向(如从沿着光束行进的光子的角度观察，如图5至图8所示)。这种90°转向对于实现整个装置的更紧凑的布局是有利的。
在另选实施例中，如图9所示，如果对第一和第二分束器52、58以及第一和第二转向镜54、56的位置进行重新配置，则该设计将在光束中引入90°右转向，而非图3至图8的实施例中出现的90°左转向。
上文结合图3至图9所描述的实施例假设分束器52、58两者均是长通分束器。但是，在另选实施例中，通过对相关几何形状进行适当修改，短通分束器可以用作第一和/或第二分束器，这对于相关领域的技术人员而言是显而易见的。
图10描绘了一个这样的示例，其中，短通二向色分束器70用作第二分束器。除了离开第二分束器70的光束将沿与进入第一分束器52的光束相同的方向(与向右转90°或向左转90°相对)行进之外，该实施例的操作将类似于上文所描述的图3至图9的实施例的操作。当然，该图10的实施例中的相机将必须相对于图3至图9的实施例中的相机重新定位。
可选地，上文结合图3至图9所描述的任何实施例可以通过将各种光学部件彼此交换(例如，通过将它们安装在转台上或利用对准磁铁)的机构来重新配置。例如，如果长通分束器52、58(图11A中所示)被换出并且用实心玻璃光学立方体替换，则所有波长的光都将行进通过同一光路，而形成图11B所示的“旁路模式”。因为在该旁路模式下所有分束器都被换出，所以光不会发生光谱分离，并且继续行进到相机。但是，在任一模式下，转向镜54、56都引入了用于将图像定位在相机上的新自由度，这用于确保最大读出速度所需的中心定位，而不会发生错位。
值得注意的是，可以调整这些转向镜54、56的取向以利用在特定相机(例如，AndorZyla相机)的相机芯片的中心处相机读取速度最快的事实。在这些实施例中，优选的是针对待成像深度的范围不同的样品，使用转向镜54、56将图像重新定位在相机上。例如，为了在厚样品中获得300行，可以将样品保持在片状光的最窄部分处，在这种情况下，可以在相机芯片上从中间-150位置到中间+150位置定位图像。在另一示例中，在执行50行获取时，图像应当位于相机芯片的中间-25部分到中间+25部分中。在后面的情况下，图像在相机上向上平移125行。
图12示出了可以通过交换图10的实施例的各种光学部件来实现的另一种旁路配置。更具体地，如果第一和第二分束器52、70(均在图10中示出)被换出并且分别用玻璃块72和镜76替换，则离开最终部件76的光将沿与图10中的方向相同的方向向下行进，但是在到达相机之前，不会对光进行光谱分离。
注意，上文结合图3至图12所描述的实施例假设相机90具有单个图像传感器芯片，在这种情况下，每个波长的光将聚焦在该单个图像传感器上的两个不同位置上。但是，在另选实施例中，可以使用两个单独的图像传感器芯片以及附加的光学元件(未示出)以将基于波长分离的光引导到相应的图像传感器芯片上。
第3部分：使用宽视场照明成像的SCAPE
SCAPE显微镜可以与宽场照明一起使用，以通过使用扫描样品的去扫描部件(镜、SLM或其他设备)在多个平面中收集聚焦图像来获取图像堆栈。根据用于去卷积显微镜术的已知技术，去卷积显微镜术方法可以用于使用聚焦和离焦光来开发整个三维样品的计算模型。因此，使用SCAPE，在聚焦平面扫过样品时通过反射成像或者通过泛光照明样品以及图像获取，实现类似于去卷积显微镜术的方法。这产生的图像相当于传统的去卷积显微镜术。
从平面外结构获取信号，并且基于所有平面区域的全部信号集合通过计算重构平面外区域的贡献。SCAPE允许在不平移样品的情况下进行去卷积，并且可以快速获取并存储完整堆栈样品平面，并且完整堆栈样品平面生成从一个或多个扫描的完整数据集合计算的3D静态或3D图像序列。此外，结合荧光(或拉曼、二次谐波生成或其他)对比成像，SCAPE可以提供关于样品结构的补充信息，并且准许衰减校正。在一些实施例中，还可以同时扫描激发光束以生成荧光，并且荧光激发输出的波长可以通过波长分离到不同的成像检测器或单个成像检测器的各个区域。
第4部分：SCAPE的选项和益处
光动力学：
SCAPE的3D快速成像的能力能快速对如随时间变化的光漂白或磷光衰变之类的事物进行动态成像，该速度快至足以表征整个体积中的特性。这种测量可以可选地局限于单个部位。这些测量可以应用于诸如FRAP(光漂白后的荧光恢复)之类的技术和化学结合和构象改变的测量。
减少光损伤的选通照明(Strobed Illumination)：
依据相机获取策略的类型，相机可能数次没有曝光(既用于SCAPE，也用于诸如SPIM之类的标准片状光成像几何形状)。在这些时段期间照亮样品将增加光损伤/光毒性(其可能是活体标本成像的关注点)。可调制激光器(以及快速快门***/普克尔盒(pockelcell))的可用性提供了仅在相机芯片曝光时同步所有激光器照明的机会，从而使光损伤最小化。
非荧光成像：
SCAPE还可以有利地与非荧光对比成像相结合。近红外成像反射可以提供反散射信息，并且深入组织中的吸收对比度可以提供结构和动态信息。使用图像分离器可以实现同时反射和透射成像。这种组合可以用于增加组织的结构成像的价值以及提高诸如钙敏感荧光团之类的功能对比度。
非相干光成像：
传统SCAPE和片状光方法使用激光器照明。这可以使对准变得更容易，但是却受以下因素限制：可用波长限制、成本高以及稳定性限制，并且会在照明中产生斑点，这些斑点产生了噪声和异质性。这还会使反射对比度成像更加困难。
发明人已经认识到，片状光基本上不需要相干光，并且可以使用非相干光，诸如发光二极管(LED)光源。这提供了范围更广泛的通用波长、调制和照明策略、以及不产生斑点的能力。特别是对于上述反射/泛光照明方法，去除斑点大有益处。挑战在于能够将非相干光(诸如来自LED)适当地成形和调节成形状良好的片状光。一种方法是使用传统的光学器件基于LED照明生成形状良好的片状光。另一种方法是使用空间光调制器(SLM)或数字微镜阵列(DMA)。还有一种方法是将传统光学器件与SLM/DMA相结合。
通过引用并入本文的PCT/US 17/34945描述了用于构造改进的片状光照明的各种方法以及图案化激发点扩散函数的能力。将这些方法与非相干光源结合可能是有益的。
尽管空间光调制器的相位校正的某些特征可能对非相干光无效，但是空间光调制器或DMD可以容易地用于确保差准直的LED光形成更精确准直的光束。该设备还可以改变片状光的NA以及样品处片状光的侧向范围和强度分布，从而优化分辨率、光毒性和视野。
使用相干或非相干光，可以更改光束的侧向位置以更改进入物镜透镜的光束的位置，并且因此更改光束的角度，从而实现图像旋转对准的闭环数字优化。SLM/DMD还可以用于使激发光成形，以解决由于通过主物镜透镜侧形成片而导致的片形成的像差。
在一些实施例中，可以在中间倾斜图像平面处通过在第二物镜的输入处生成更理想的片状光来优化片状光。在这种情况下，主物镜和第二物镜的对称性会解决当形成如上文所描述的片时遇到的片形成像差的问题。尽管这种方法可以用于SCAPE，但是可以使用空间光调制器来预校正形成片状的光，以解决这些像差从而确保在样品处形成更高质量的片。适当快速的SLM甚至可以解决在片的SCAPE扫描期间片质量改变的问题。可以以闭环方式优化校正，以寻求入射光的校正，从而在SCAPE相机上产生最聚焦、最亮或以其他方式改善的图像。
可选特征：
在上述任何实施例中，可以调整片状光的数值孔径(NA)以及正在使用的相机上的行数以“放大”小样品或“缩小”大样品。可变物镜可以用于这些实施例。这些实施例中的一些实施例被配置为维持适度(高NA)放大率。
在上述任何实施例中，SLM可以用于准许在没有移动零件的情况下调整NA并且允许调整线宽和图案化照明。还可以通过使用SLM来校正片状光的像差校正。在一些实施例中，片状光的对准可以通过平移和调整片状光源处而非在检测侧上的倾斜来实现。
在一些实施例中，可以使用氟化乙烯丙烯(FEP)嵌段代替在倒置板读取器配置中保持水浸入。
在一些实施例中，可以提供“驻留(dwell)”模式用于使用图像旋转的***对大样品(例如，清除的组织)进行基于平移的扫描，这些样品类似于美国专利8,582,203中公开的那些样品。可以在有损图像旋转上进行类似于该专利中描述的所述方法的聚焦。
在一些实施例中，可以使用白光照明。在一些实施例中，可以使用光学投影断层摄影(OPT)。
在一些实施例中，可以为了速度而折衷分辨率。例如，细胞生物学微观应用可以容忍较低的速度以换取更高的分辨率(类似于共焦性能)；而神经科学应用可以容忍较低的分辨率以换取更高的速度。
在一些实施例中，SCAPE***可以用多种模式实现。例如，低功率模式使用低激光功率(例如，0.05mW)和长相机积分时间(例如，100ms)用于寻找样品目标。“高分辨率扫描”模式可以准许在样品上的许多位置处停止，并且还可以提供诸如在US 2016/0327779中的SCAPE高速扫描描述中描述的“快速扫描”模式。
SCAPE还可以使用两个相机而非图像分离器来实现。两个相机对于计算机而言可能是个累赘，并且需要相机之间的同步，这可能会使获取速度变慢，并且很有可能会带来相机差异的问题，例如，旋转、放大等。可以合并来自多个相机的图像。并排获取两个或更多个多光谱图像并将它们一起读出，不会造成速度损失。在一些实施例中，例如在移动目标(诸如正在爬行的果蝇幼虫)上的诸如细胞跟踪和gcamp比率成像中可以实现同时双色成像。
在任何前述实施例中，可以选择光源(激光器或其他)用于激发为增强对比度而引入的天然荧光团或荧光团。荧光造影剂的示例包括荧光素、磺酰罗丹明101(Sulforhodamine 101)、白藜芦醇(proflavin)、以及亚甲蓝(Methylene blue)。在各种实施例中，用于成像的光可以是来自由来自被标识的光源或反射光或散射光激发的光源的荧光中的一种或其组合。
可选地，对于本文中所描述的任何实施例，可以使用转向镜将图像重新定位到相机芯片的中间部分，如上文结合涉及Andor Zyla相机的示例所描述的。
避免使用传统显微镜底座：
在一些实施例中，避免使用传统显微镜底座。这提供了若干种优点，包括：(1)便于倒置配置和直立配置之间的切换，这在一些多用户***中可能很重要；(2)避免用户对使用转台的期望产生混淆；(3)避免可能对***其他部分施加人体工程学约束的目镜；(4)降低***的成本、尺寸、重量以及体积；以及(5)便于多种行为装备的结合并且能够在非传统样品上使用该***。示例包括使用标准化的机械或电子x-y-z平台进行样品定位，这也可以实现堆栈等的“共焦模式”获取。
期望为用户提供查找其样品的方式，并且DIC(微分干涉对比度)对于完整/体内样品而言是无用的。即使使用基于LED的照明，也还有其他可视化/查找样品的方式。SCAPE相机本身显示视野(尽管焦点偏斜)，但这已经足够了。在一些实施例中，用于样品可视化的另一相机可以定位在设置于物镜上方的转向镜的相对侧上(使得镜是二向色的并且使用红/NIR光来监测样品，即使在获取SCAPE数据期间也是如此)。样品可视化相机可以放置在中继透镜光路内的任何位置，以通过使用二向色分光器(或可以***的其他部件等)得到样品的合适的表观图(epi-view)。可选地，位于样品附近的iPad或廉价的屏幕/触摸屏可以允许控制仪器并且实时显示与目镜相当的图像。应当指出，对于荧光，数字预览比用人眼预览效果好得多，因为可以使用更低的亮度，从而避免光损伤。
在一些实施例中，关于光照明路径，可能期望提供将片状光与相机检测平面重新对准而不需要实际移动相机的能力。该功能可以使用机动设备(平台或基于实现方式的其他设备)自动化，可以使用在主物镜下具有珠子或类似样品的图像特征的闭环优化。如WO2015/109323和US 2016/0327779中所讨论的，可以采用SLM/DMD或类似物作为片状光的一部分。这可以带来附加好处，包括像差校正、调整片状光的NA的能力(同样，这能够允许“缩放”到同一样品内具有更高光学分辨率的区域，该区域还可以以较低分辨率成像，即在检测臂上使用或不使用可变放大率)。这会避免通过使用狭缝导致的衍射图案。除了使用高斯光束(Gaussian beam)还可以对片状光的构造进行优化，并且这不必使用贝塞尔光束(Besselbeam)。如果期望较小的视野(当在芯片上使用图像分离时，这可能也很重要)，则可能重要的是，能够将片的线长度调整到1mm左右，但也可以减少片，以避免过度的样品照明。该配置还可以给予可选地以闭环方式调整片角度和/或相对位置等的机会。这些可以通过其他光学部件实现，诸如并且包括可变孔径和移动镜。
使相机定位静止且不可移动很有吸引力。然而，这带来了与主物镜路径不对准的风险。尽管由于片状光对准的自由度而可以固定相机角度，但是在主光路或相机确实移位的情况下，依赖调整片状光发射(launch)的调整可能会使***迭代进入不期望的配置。例如，片状光可以游离到物镜透镜的边缘或中心，从而丢失光或改变片状光的特性、交叉角度和扫描图案。提供相对于主物镜光路调整相机的某些方式以及用于该对准的协议可能更可取。在一些实施例中，如通过引用并入本文的US 2016/0327779中所讨论的那样，可以对相机定位进行调整。
应当理解，上述模块、过程、***和部分可以以硬件、由软件编程的硬件、存储在非暂态计算机可读介质上的软件指令或上述的组合来实现。例如，可以使用被配置为执行存储在非暂态计算机可读介质上的编程指令序列的处理器来实现控制扫描和去扫描元件、采样和存储图像数据以及从图像数据构建三维模型的方法。例如，处理器可以包括但不限于个人计算机或工作站或其他这样的计算***，所述计算***包括处理器、微处理器、微控制器设备，或者由包括集成电路(诸如，专用集成电路(ASIC))的控制逻辑组成。可以根据诸如Java、C++、C#.net等之类的编程语言提供的源代码指令来编译指令。指令还可以包括根据例如Visual BasicTM语言、LabVIEW或其他结构化或对象取向的编程语言提供的代码和数据对象。编程指令序列和与其相关联的数据可以存储在非暂态计算机可读介质中，诸如计算机存储器或存储设备，其可以是任何合适的存储器装置，诸如但不限于只读存储器(ROM)、可编程只读存储器(PROM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、随机存取存储器(RAM)、闪存、磁盘驱动器等。
更进一步地，模块、过程、***和部分可以实现为单个处理器或分布式处理器。进一步地，应当理解，上述步骤可以在单个或分布式处理器(单核和/或多核)上执行。此外，在以上实施例的各个图中描述的过程、模块和子模块可以分布在多个计算机或***上，或者可以共同位于单个处理器或***中。下文提供了适合于实现本文中所描述的模块、部分、***、机构或过程的示例性结构实施例的另选方案。
上述模块、处理器或***可以实现为例如编程的通用计算机、用微代码编程的电子设备、硬连线模拟逻辑电路、存储在计算机可读介质或信号上的软件、光学计算设备、电子和/或光学设备的联网***、专用计算设备、集成电路设备、半导体芯片、以及存储在计算机可读介质或信号上的软件模块或对象。
该方法和***(或其子部件或模块)的实施例可以在通用计算机、专用计算机、编程微处理器或微控制器和***集成电路元件、ASIC或其他集成电路、数字信号处理器、硬连线电子或逻辑电路(诸如分立元件电路)、可编程逻辑电路(诸如可编程逻辑器件(PLD)、可编程逻辑阵列(PLA)、现场可编程门阵列(FPGA)、可编程阵列逻辑(PAL)器件等)上实现。一般而言，能够实现本文中所描述的功能或步骤的任何过程可以用于实现方法、***或计算机程序产品(存储在非暂态计算机可读介质上的软件程序)的实施例。
另外，所公开的方法、***和计算机程序产品的实施例可以使用例如提供可以在多种计算机平台上使用的便携式源代码的对象或对象取向的软件开发环境容易地完全或部分地以软件实现。可替代地，所公开的方法、***和计算机程序产品的实施例可以使用例如标准逻辑电路或超大规模集成(VLSI)设计部分地或完全地以硬件实现。依据***的速度和/或效率要求、特定功能、和/或所利用的特定软件或硬件***、微处理器或微计算机，可以使用其他硬件或软件来实现实施例。根据本文中所提供的功能描述并且利用控制***、光学器件、数字数据滤波、光学传感器***和/或计算机编程技术的一般基础知识，本领域普通技术人员可以使用任何已知的或新开发的***或结构、设备和/或软件以硬件和/或软件实现该方法、***和计算机程序产品的实施例。
而且，所公开的方法、***和计算机程序产品的实施例可以以在编程的通用计算机、专用计算机、微处理器等上执行的软件中实现。
因此，显而易见的是，根据本公开，提供了基于SCAPE的成像***。本公开实现了许多另选方案、修改和变型。在本发明的范围内，可以组合、重新布置、省略等所公开的实施例的特征，以产生附加实施例。此外，有时可以有利地使用某些特征，而无需对应地使用其他特征。因而，申请人意图涵盖在本发明的精神和范围内的所有这些另选方案、修改、等同物和变型。

Claims (38)

1.一种成像装置，包括：
具有近端和远端的第一组光学部件，其中，所述第一组光学部件包括第一物镜，所述第一物镜设置在所述第一组光学部件的所述远端；
具有近端和远端的第二组光学部件，其中，所述第二组光学部件包括第二物镜，所述第二物镜设置在所述第二组光学部件的所述远端；
扫描元件，所述扫描元件相对于所述第一组光学部件的所述近端设置在近侧，并且相对于所述第二组光学部件的所述近端设置在近侧，
其中，所述扫描元件被布置为引导片状激发光，使得所述片状激发光将沿近端到远端方向穿过所述第一组光学部件并且投射到样品中，所述样品在所述第一组光学部件的所述远端之外定位在远侧，其中所述片状激发光以倾斜角度投射到所述样品中，并且其中所述片状激发光在基于所述扫描元件的取向而变化的位置处投射到所述样品中，
其中，所述第一组光学部件将来自所述样品的检测光沿远端到近端方向引导回到所述扫描元件，以及
其中，所述扫描元件还被布置为引导所述检测光，使得所述检测光将沿近端到远端方向穿过所述第二组光学部件，并且在所述第二组光学部件的所述远端之外在远侧的位置处形成中间图像平面；
第三物镜，所述第三物镜被布置为将来自所述中间图像平面的光引导到无限空间，其中，所述中间图像平面设置在所述第三物镜的前面，而所述无限空间设置在所述第三物镜的后面；
第一分束器，所述第一分束器定位在所述无限空间中，其中，所述第一分束器被布置为沿第一方向引导来自所述中间图像平面的具有第一波长的光并且沿第二方向引导来自所述中间图像平面的具有第二波长的光，其中所述第二方向与所述第一方向不同，并且其中所述第一波长比所述第二波长长；
第一光检测器阵列，所述第一光检测器阵列被布置为捕获第一波长图像；
第二光检测器阵列，所述第二光检测器阵列被布置为捕获第二波长图像；以及
第三组光学部件，所述第三组光学部件被布置为将离开所述第一分束器的具有所述第一波长的所述光朝向所述第一光检测器阵列引导，并且将离开所述第一分束器的具有所述第二波长的所述光朝向所述第二光检测器阵列引导，
其中，所述第三组光学部件包括：
第二分束器；
第一转向镜，所述第一转向镜被布置为将离开所述第一分束器的具有所述第一波长的所述光引导到所述第二分束器中；
第二转向镜，所述第二转向镜被布置为将离开所述第一分束器的具有所述第二波长的所述光引导到所述第二分束器中；以及
至少一个透镜，所述至少一个设置在(a)所述第二分束器和(b)所述第一和第二光检测器阵列之间，
其中，所述第二分束器被布置为将来自所述第一转向镜和所述第二转向镜的光朝向所述至少一个透镜引导。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一光检测器阵列和所述第二光检测器阵列在不同的光检测器芯片上实现。
3.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一光检测器阵列和所述第二光检测器阵列在单个光检测器芯片的分离区域上实现。
4.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一分束器包括长通二向色元件，所述长通二向色元件使所述第一波长的光通过而不转移其路径，并且沿所述第二方向重新定向所述第二波长的光；以及
其中，所述第二分束器包括长通二向色元件，所述长通二向色元件使所述第一波长的光通过而不转移其路径，并且将来自所述第二转向镜的所述第二波长的光朝向所述至少一个透镜重新定向。
5.根据权利要求4所述的装置，其中，所述第一分束器和所述第二分束器中的每个分束器在相应的可移动模块中实现；并且
其中，所述装置还包括：(i)第一光学块；(ii)用于将所述第一分束器移出第一光学路径并且将所述第一光学块移动到所述第一光学路径中的机构；(iii)第二光学块；以及(iv)用于将所述第二分束器移出第二光学路径并且将所述第二光学块移动到所述第二光学路径中的机构。
6.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一分束器包括长通二向色元件，所述长通二向色元件使所述第一波长的光通过而不转移其路径，并且沿所述第二方向重新定向所述第二波长的光；以及
其中，所述第二分束器包括短通二向色元件，所述短通二向色元件使所述第二波长的光通过而不转移其路径，并且将来自所述第一转向镜的所述第一波长的光朝向所述至少一个透镜重新定向。
7.根据权利要求6所述的装置，其中，所述第一分束器和所述第二分束器中的每个分束器均在相应的可移动模块中实现；并且
其中，所述装置还包括：(i)第一光学块；(ii)用于将所述第一分束器移出第一光学路径并且将所述第一光学块移动到所述第一光学路径中的机构；(iii)包括镜的第二光学；以及(iv)用于将所述第二分束器移出第二光学路径并且将所述第二光学块移动到所述第二光学路径中的机构。
8.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一转向镜和所述第二转向镜中的至少一个转向镜的取向能够调整。
9.根据权利要求8所述的装置，其中，所述第一转向镜和所述第二转向镜中的至少一个转向镜的位置能够调整。
10.根据权利要求9所述的装置，其中，所述第一光检测器阵列和所述第二光检测器阵列在单个光检测器芯片的分离区域上实现。
11.根据权利要求1所述的装置，其中，离开所述第二分束器的光偏离由(a)所述第一组光学部件的光轴和(b)所述第二组光学部件的光轴所限定的平面小于30°。
12.根据权利要求1所述的装置，其中，离开所述第二分束器的光偏离由(a)所述第一组光学部件的光轴和(b)所述第二组光学部件的光轴所限定的平面小于15°。
13.根据权利要求1所述的装置，其中，离开所述第二分束器的光与由(a)所述第一组光学部件的光轴和(b)所述第二组光学部件的光轴所限定的平面的垂直度为±30°。
14.根据权利要求1所述的装置，其中，离开所述第二分束器的光与由(a)所述第一组光学部件的光轴和(b)所述第二组光学部件的光轴所限定的平面的垂直度为±15°。
15.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一分束器和所述第二分束器中的每个分束器均在相应的可移除的磁性安装模块中实现。
16.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一分束器在可移除的磁性安装模块中实现。
17.根据权利要求1所述的装置，还包括：
片状光发生器，所述片状光发生器将来自光源的光扩展成所述片状激发光；以及
辅助分束器，所述辅助分束器设置在所述第二组光学部件的所述近端和所述扫描元件之间，
其中，所述辅助分束器被布置为将来自所述片状光发生器的所述片状激发光朝向所述扫描元件引导，并且
其中，所述辅助分束器被布置为将来自所述扫描元件的所述检测光引导到所述第二组光学部件的所述近端中。
18.根据权利要求17所述的装置，其中，所述片状光发生器包括光源和以下中的至少一项：(a)柱面透镜，所述柱面透镜被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光；(b)非球面镜，所述非球面镜被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光；(c)空间光调制器，所述空间光调制器被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光；(d)第二扫描元件，所述第二扫描元件被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光；以及(e)振荡检流计镜，所述振荡检流计镜被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光。
19.根据权利要求1所述的装置，还包括片状光发生器，所述片状光发生器将来自光源的光扩展成所述片状激发光，
其中，所述第二组光学部件被布置为将来自所述片状光发生器的所述片状激发光沿远侧到近侧方向朝向所述扫描元件引导。
20.根据权利要求19所述的装置，其中，所述片状光发生器包括光源和以下中的至少一项：(a)柱面透镜，所述柱面透镜被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光；(b)非球面镜，所述非球面镜被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光；(c)空间光调制器，所述空间光调制器被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光；(d)第二扫描元件，所述第二扫描元件被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光；以及(e)振荡检流计镜，所述振荡检流计镜被布置为将来自所述光源的光扩展成所述片状激发光。
21.根据权利要求1所述的装置，其中，所述中间图像平面是静止的。
22.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一波长对应于红光，并且所述第二波长对应于绿光。
23.一种成像装置，包括：
光学***，所述光学***：(a)将片状激发光以倾斜角度投射到样品中，其中，所述片状激发光在所述样品内的位置基于扫描元件的取向而变化；并且(b)在中间图像平面处由源自所述片状激发光的所述位置处的检测光形成图像，其中，无论所述扫描元件的取向如何，所述中间图像平面都保持静止；
第三物镜，所述第三物镜被布置为将来自所述中间图像平面的光引导到无限空间，其中，所述中间图像平面设置在所述第三物镜的前面，而所述无限空间设置在所述第三物镜的后面；
第一分束器，所述第一分束器定位在所述无限空间中，其中，所述第一分束器被布置为沿第一方向引导来自所述中间图像平面的具有第一波长的光，并且沿第二方向引导来自所述中间图像平面的具有第二波长的光，其中所述第二方向与所述第一方向不同，并且其中所述第一波长比所述第二波长长；
第一光检测器阵列，所述第一光检测器阵列被布置为捕获第一波长图像；
第二光检测器阵列，所述第二光检测器阵列被布置为捕获第二波长图像；以及
第三组光学部件，所述第三组光学部件被布置为将离开所述第一分束器的具有所述第一波长的所述光朝向所述第一光检测器阵列引导，并且将离开所述第一分束器的具有所述第二波长的所述光朝向所述第二光检测器阵列引导，
其中，所述第三组光学部件包括：
第二分束器；
第一转向镜，所述第一转向镜被布置为将离开所述第一分束器的具有所述第一波长的所述光引导到所述第二分束器中；
第二转向镜，所述第二转向镜被布置为将离开所述第一分束器的具有所述第二波长的所述光引导到所述第二分束器中；以及
至少一个透镜，所述至少一个透镜设置在(a)所述第二分束器和(b)所述第一和第二光检测器阵列之间，
其中，所述第二分束器被布置为将来自所述第一转向镜和所述第二转向镜的光朝向所述至少一个透镜引导。
24.根据权利要求23所述的装置，其中，所述第一光检测器阵列和所述第二光检测器阵列在不同的光检测器芯片上实现。
25.根据权利要求23所述的装置，其中，所述第一光检测器阵列和所述第二光检测器阵列在单个光检测器芯片的分离区域上实现。
26.根据权利要求23所述的装置，其中，所述第一分束器包括长通二向色元件，所述长通二向色元件使所述第一波长的光通过而不转移其路径，并且沿所述第二方向重新定向所述第二波长的光；以及
其中，所述第二分束器包括长通二向色元件，所述长通二向色元件使所述第一波长的光通过而不转移其路径，并且将来自所述第二转向镜的所述第二波长的光朝向所述至少一个透镜重新定向。
27.根据权利要求26所述的装置，其中，所述第一分束器和所述第二分束器中的每个分束器在相应的可移动模块中实现；并且
其中，所述装置还包括：(i)第一光学块；(ii)用于将所述第一分束器移出第一光学路径并且将所述第一光学块移动到所述第一光学路径中的机构；(iii)第二光学块；以及(iv)用于将所述第二分束器移出第二光学路径并且将所述第二光学块移动到所述第二光学路径中的机构。
28.根据权利要求23所述的装置，其中，所述第一分束器包括长通二向色元件，所述长通二向色元件使所述第一波长的光通过而不转移其路径，并且沿所述第二方向重新定向所述第二波长的光；以及
其中，所述第二分束器包括短通二向色元件，所述短通二向色元件使所述第二波长的光通过而不转移其路径，并且将来自所述第一转向镜的所述第一波长的光朝向所述至少一个透镜重新定向。
29.根据权利要求28所述的装置，其中，所述第一分束器和所述第二分束器中的每个分束器均在相应的可移动模块中实现；并且
其中，所述装置还包括：(i)第一光学块；(ii)用于将所述第一分束器移出第一光学路径并且将所述第一光学块移动到所述第一光学路径中的机构；(iii)包括镜的第二光学块；以及(iv)用于将所述第二分束器移出第二光学路径并且将所述第二光学块移动到所述第二光学路径中的机构。
30.根据权利要求23所述的装置，其中，所述第一转向镜和所述第二转向镜中的至少一个转向镜的取向能够调整。
31.根据权利要求30所述的装置，其中，所述第一转向镜和所述第二转向镜中的至少一个转向镜的位置能够调整。
32.根据权利要求31所述的装置，其中，所述第一光检测器阵列和所述第二光检测器阵列在单个光检测器芯片的分离区域上实现。
33.根据权利要求23所述的装置，其中，离开所述第二分束器的光偏离由(a)所述激发光的光轴和(b)所述检测光的光轴所限定的平面小于30°。
34.根据权利要求23所述的装置，其中，离开所述第二分束器的光偏离由(a)所述激发光的光轴和(b)所述检测光的光轴所限定的平面小于15°。
35.根据权利要求23所述的装置，其中，离开所述第二分束器的光与由(a)所述激发光的光轴和(b)所述检测光的光轴所限定的平面的垂直度为±30°。
36.根据权利要求23所述的装置，其中，离开所述第二分束器的光与由(a)所述激发光的光轴和(b)所述检测光的光轴所限定的平面的垂直度为±15°。
37.根据权利要求23所述的装置，其中，所述第一分束器和所述第二分束器中的每个分束器均在相应的可移除的磁性安装模块中实现。
38.根据权利要求23所述的装置，其中，所述第一分束器在可移除的磁性安装模块中实现。
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