JP2008544285A

JP2008544285A - リン酸化タンパク質のイムノアッセイ

Info

Publication number: JP2008544285A
Application number: JP2008518464A
Authority: JP
Inventors: ジャバドホスラビ，; ゴパールブイ．サブジャニ，
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2008-12-04
Also published as: US20060292642A1; EP1907837A1; WO2007002483A1

Abstract

ペプチド、タンパク質、またはそれらの様々な関連形態のリン酸化アイソフォーム（リン形態、リンアイソフォーム）のイムノアッセイについて記載する。１つの実施形態では、サンドイッチタイプの「２部位」イムノアッセイは２つの異なる相違する認識抗体パートナーを含んでおり、このとき１つの抗体はタンパク質もしくはペプチドに対して特異的であり、もう１つの抗体は、公知の、もしくは見いだされたリン酸化アミノ酸残基に対して特異的である。１つのアッセイの実施形態は、特異的抗タンパク質抗体を用いてタンパク質もしくはペプチドを捕捉する第１工程と、標識もしくはレポーター分子に結合した公知のリン酸化残基に対する抗体を用いてタンパク質の結合したリン酸化アイソフォームを検出する第２工程とを含んでいる。

Description

（発明の背景）
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、細胞の増殖および成長にとって必須である広範囲の成長ホルモン依存性および非依存性の有糸***誘発作用および代謝作用を媒介する１ファミリーのペプチドに属する（非特許文献１〜４）。大多数のペプチドホルモンとは相違して、循環中および他の生理液中のＩＧＦは、特異的に結合して細胞レベルでＩＧＦ生物活性を調節する１群の高親和性インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）と関連付けられている。別個の分子サイズ、ホルモン制御、組織発現および機能を備える、構造的には相同である６つのＩＧＦＢＰが同定されている（非特許文献４〜６）。

胎盤タンパク質１２（非特許文献７）および妊娠関連性子宮内膜α_１−グロブリン（非特許文献８）と同義であるＩＧＦＢＰ−１は、肝細胞、卵巣果粒膜細胞、および脱落子宮内膜を含む様々な細胞タイプによって発現かつ分泌される２５ｋＤａ（キロダルトン）のタンパク質である（非特許文献９〜１１）。ＩＧＦＢＰ−１は血清中に存在し、羊水中で優勢なＩＧＦ結合タンパク質であり、そして胎児および母体循環中の主要ＩＧＦ結合タンパク質である（非特許文献９、非特許文献１２〜１３）。ヒトおよび動物モデルの両方において、胎児成長制限と関連するＩＧＦＢＰ−１のレベル上昇が見いだされている（非特許文献９、非特許文献１３〜１６および参考文献１７）。

ＩＧＦＢＰ−１は、報告によればＩＧＦ作用の阻害ならびに増強の両方を行うことができる（非特許文献４、非特許文献６）。ＩＧＦＢＰ−１のこれらの二重官能性は、一部にはアミノ酸残基の翻訳後リン酸化によって説明されている。セリンアミノ酸残基の翻訳後リン酸化は、ＩＧＦに対するＩＧＦＢＰ−１の親和性を４〜８倍変化させ（非特許文献４、非特許文献１８）、それによりＩＧＦバイオアベイラビリティを調節する能力に影響を及ぼす。リン酸化度だけが相違する、５つまでのＧＦＢＰ−１変種が同定されている。ＨｅｐＧ２、脱落膜細胞、および肝細胞などの様々な細胞タイプは主としてＩＧＦＢＰ−１のリン酸化形を分泌することが見いだされており、他方羊水および胎児血清は実質的な量の非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１変種を含有している（非特許文献４、非特許文献１８〜１９）。正常成人血清中ではＩＧＦＢＰ−１の主要なリン酸化形が見いだされるが、ＩＧＦＢＰ−１のリン酸化プロファイルは妊娠に応答して重大な変化に曝される（非特許文献２０）。

可逆性リン酸化などのアミノ酸残基の翻訳後修飾は、タンパク質の活性化および非活性化の必須かつほぼ普遍的な機序であり、ほぼ全部の細胞シグナリング経路および最終的に全生物学的機能を調節することに責任を負っている（非特許文献２１）。様々なリン酸化タンパク質（「リンタンパク質」もしくは「リン形態」）の同定およびリン酸化残基の局在化における有意な進歩は、質量分析法を含む様々な方法によって達成されてきた（非特許文献２２）。したがって、ＩＧＦＢＰの調節されたリン酸化／脱リン酸化もまた、それによってＩＧＦのバイオアベイラビリティを調節できる重要な代替機序であると認識されてきた（非特許文献４、非特許文献２３）。正常妊娠（非特許文献２０）に加えて、ＩＧＦＢＰ−１の試験はこれまでに、Ｌａｒｏｎｅ症候群（非特許文献２０、非特許文献２４）を有する被験者ならびに子癇前症（非特許文献２５）、出生後成長制限（非特許文献１５）、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンの生合成の調節（非特許文献２５）に関連して、ならびに心血管疾患の発生および２型糖尿病の血管性合併症（非特許文献２６）に関連する有意な変化を同定してきた。より近年の研究の対象は、セリンリン酸化されていることも知られているＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−５などのＩＧＦＢＰファミリーの他のメンバーの試験に拡大されてきた（非特許文献４、非特許文献２３）。ＩＧＦＢＰ−１に類似して、入手できる証拠は、それらの様々な結合特性およびＩＧＦ依存性および／またはＩＧＦ非依存性機能を調節する際にＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−５のリン酸化を変化させるための重大な役割を支持すると思われる（非特許文献４、非特許文献２７〜２９）。ＩＧＦＢＰ−５は、骨代謝および骨粗鬆症に関連してより広範囲に試験されてきた（非特許文献４、非特許文献６、非特許文献２９、非特許文献１７（参考文献４５））。

リン酸化によるタンパク質の活性化および／または非活性化の機序についての試験は、リン酸化の作用がタンパク質の三元構造内で重要な立体構造変化を誘導することによって媒介されることを示唆している（非特許文献３０）。抗原／抗体相互作用の免疫学的基礎もまた立体構造エピトープの認識に大きく依存しているので（非特許文献３１）、免疫応答性における潜在的変化に関連して変化したリン酸化の作用についての調査は極めて重要である（非特許文献２１、非特許文献３０）。タンパク質に対する広い特異性を備える伝統的イムノアッセイはそのような調査に寄与してきたが、様々なタンパク質のリン形態を特異的に決定するための単純なイムノアッセイの利用可能性は、それらの調節機序、病態生理学的役割、および臨床的重要性の理解を促進するであろう。

ＩＧＦ研究の分野では、ＩＧＦＢＰ−１についてはタンパク質リン酸化と免疫応答性との有意な関係が最初に報告され、様々な抗体によるＩＧＦＢＰ−１リン形態の弁別的認識の結果として、健常成人血清中のＩＧＦＢＰ−１の測定濃度において１０倍までの差が観察された（非特許文献２０、非特許文献３２）。抗体によるＩＧＦＢＰ−１リン形態の変動する認識は、間違った推定値、または測定されたＩＧＦＢＰ−１レベルの不適切な解釈を生じさせる可能性がある。変化したリン酸化に応答したＩＧＦＢＰ−５の免疫応答性における有意な変化もまた観察されている。後者は、組換えヒトＩＧＦＢＰ−５もしくは合成ＩＧＦＢＰ−５ペプチドに対して立てられた１パネルの４つのポリクローナルおよび１２のモノクローナル抗体についての系統的な評価を含んでいた。競合的（ＥＩＡ）および非競合的（ＥＬＩＳＡ）フォーマット両方でのＩＧＦＢＰ−５免疫応答性は、Ｍｇ^２＋、ＥＤＴＡ、およびＩＧＦＢＰ−５分子のリン酸化状態によって有意に影響を受けることが見いだされた（非特許文献３３、非特許文献３４）。

従来型イムノアッセイによるリン酸化タンパク質の試験は、変化したリン酸化が及ぼす検出可能な免疫応答性のレベルへの作用によって影響を受けることがある。ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−５について記載したように、変化したリン酸化は検出可能な血清レベルにおける変化を生じさせることがある。これは、生体液において観察されるＩＧＦＢＰ−１リン酸化アイソフォームの可変性発現を考察する際に特に重要である（非特許文献４、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献３２）。報告されたＩＧＦＢＰ−１正常範囲の妥当性は、単一ＩＧＦＢＰ−１変種を明らかに発現する非妊娠成人集団中においてさえ、問題にされてきた（非特許文献２０）。さらに、ＩＧＦＢＰ−１抗体は、妊娠中には相当に類似の濃度が測定されるのに、非妊娠被験者では有意に相違する血清濃度（平均値における１１倍の差まで）を検出すると報告されている（非特許文献２０）。そこで抗体免疫応答性がタンパク質のリン酸化によって影響を受けないＩＧＦＢＰのためのイムノアッセイが開発されてきた（非特許文献３２、および特許文献１）。そのようなイムノアッセイは、リン酸化度とは無関係にサンプル中のＩＧＦＢＰの総濃度の検出を可能にする。しかし、そのようなイムノアッセイは、タンパク質リン酸化のレベルを測定できない、またはタンパク質リン酸化レベルにおける変化を検出できない。

様々なタンパク質のリン形態の検出は当該の分子のゲル電気泳動法分離後のウエスタンおよび／またはリガンド免疫ブロットによって可能にされてきたが（非特許文献１８、非特許文献２０）、これらの方法は、１ラン当たりにアッセイできるサンプル数、集中的作業、高額の費用、ならびに分析の定性的もしくはせいぜい半定量的性質に関する制限を含んでいる。

タンパク質リン酸化の重要性がその後ずっと増していることを前提にすると、依然として極めて多数のサンプルの定量を可能にする単純な方法に対する切迫した必要が存在する（非特許文献２１、非特許文献２２）。ＩＧＦＢＰのリン酸化レベルにおける変化は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびリガンドおよび／または免疫ブロッティングアプローチ（非特許文献４、非特許文献１８〜２０）などの伝統的アプローチによって証明されているが、利用できる方法はせいぜい半定量的であり、大規模の手動もしくは自動用途には適合しない。
米国特許第５，７４７，２７３号明細書ＲｏｔｗｅｉｎＰ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎ− 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１ｉｎｎｏｒｍａｌｐｌａｓｍａｉｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｔｈａｔｉｎａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄａｎｄｃｈａｎｇｅｓｄｕｒｉｎｇｐｒｅｇｎａｎｃｙ．ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ１９９４；７９：１７３５−１７４１ＧｒａｖｅｓＪＤ，ＫｒｅｂｓＥＧ．Ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．ＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ１９９９；８２：１１１−１２１ＧａｒｃｉａＢＡ，ＳｈａｂａｎｏｗｉｔｚＪ，ＨｕｎｔＤＦ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｂｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２００５；３５：２５６−２６４ＫｅｌｌｙＫＭ，ＯｈＹ，ＧａｒｇｏｓｋｙＳＥ，ＧｕｃｅｖＺ，ＭａｔｓｕｍｏｔｏＴ，ＨａｗＶ，ＮｇＬ，ＳｉｍｐｓｏｎＤＭ，ＲｏｓｅｎｆｅｌｄＲＧ．Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＩＧＦＢＰｓ）ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｄｙｎａｍｉｃｓ．ＩｎｔＪＢｉｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ１９９６；２８：６１９−６３７ＷｅｓｔｗｏｏｄＭ，ＧｉｂｓｏｎＪＭ，ＷｉｌｌｉａｍｓＡＣ，ＣｌａｙｔｏｎＰＥ，ＨａｍｂｅｒｇＯ，ＦｌｙｖｂｊｅｒｇＡ，ＷｈｉｔｅＡ．ＨｏｒｍｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＩＧＦＢＰ−ＩｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎＳｔａｔｕｓ．ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ１９９５；８０：３５２０−３５２７ＢａｎｋｏｗｓｋｉＥ，ＳｏｂｏｌｅｗｓｋｉＫ，ＰａｌｋａＪ，ＪａｗｏｓｋｉＳ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−Ｉ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＩＧＦＢＰ−Ｉ）ｐｈｏｓｐｈｏｉｓｏｆｏｒｍｉｎｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉｃＷａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｏｌｌａｇｅｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＣｌｉｎＣｈｅｍＬａｂＭｅｄ２００４；４２：１７５−１８１ＨｅａｌｄＡＨ，ＳｉｄｄａｌｓＫＷ，ＦｒａｓｅｒＷ，ＴａｙｌｏｒＷ，ＫａｕｓｈａｌＫ，ＭｏｒｒｉｓＪ，ＹｏｕｎｇＲＪ，ＷｈｉｔｅＡ，ＧｉｂｓｏｎＪＭ．Ｌｏｗｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｌｅｖｅｌｓｏｆｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＩＧＦＢＰ−Ｉ）ａｒｅｃｌｏｓｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｍａｒｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅａｎｄｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｉｎｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２００２；１８：２６２９− ２６３６ＳｃｈｅｄｌｉｃｈＬＪ，ＮｉｌｓｅｎＴ，ＪｏｈｎＡＰ，ＪａｎｓＤＡ，ＢａｘｔｅｒＲＣ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−３ｂｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｒｅｄｕｃｅｓｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｎｕｃｌｅａｒａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ２００３；１４４：１９８４−１９９３ＭｉｓｈｒａＳ，ＭｕｒｐｈｙＬＪ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−３ｂｙｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｎｈａｎｃｅｓＩＧＦ−Ｉｂｉｎｄｉｎｇ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ２００３；４４：４０４２−４０５０ＨｏｕＪ，ＣｌｅｍｍｏｎｓＤＲ，ＳｍｅｅｋｅｎｓＳ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｔｈａｔｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｃｌｅａｖｅｓｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−５．ＪＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ２００５；９４：４７０−４８４ＬｉｎＫ，ＲａｔｈＶＬ，ＤａｉＳＣ，ＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋＲＪ，ＨｗａｎｇＰＫ．ＡｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｗｉｔｃｈａｔｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｌｌｏｓｔｅｒｉｃｓｉｔｅｉｎＧＰ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９６；２７３：１５３９−１５４２ＲｏｔｔＩ．Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｎｔｉｇｅｎｉｎ "ｅｓｓｅｎｔｉａｌｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ" Ｂｌａｃｋｗｅｌｌｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＢｏｓｔｏｎＭＡ，１９９４；８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ：８１−１０２ＫｈｏｓｒａｖｉＭＪ，ＤｉａｍａｎｄｉＡ，ＭｉｓｔｒｙＪ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｏｆｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−Ｉ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ１９９７；４３：５２３−５３２ＫｈｏｓｒａｖｉＭＪ，ＤｉａｍａｎｄｉＡ，ＭｉｓｔｒｙＪ，ＢａｎｄｌａＭ，ＫｒｉｓｈｎａＲＧ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｄｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ，ＥＩＡ）ｏｆｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−５．ＴｈｅＥｎｄｏｃｒｉｎｅＳｏｃｉｅｔｙ８１＜ｓｔ＞ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ，Ｐ２−５６３，１９９９ＫｈｏｓｒａｖｉＭＪ，ＤｉａｍａｎｄｉＡ，ＭｉｓｔｒｙＪ，ＢａｎｄｉａＭ，ＫｒｉｓｈｎａＲＧ．ＡｌｔｅｒｅｄＩＧＦＢＰ−５Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｃｈａｎｇｅｓｉｎｉｔｓｓｔａｔｅｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，Ｍｇ２＋ａｎｄｐＨ：ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ（Ｍｇ２＋）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＩＧＦＢＰ−５ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．５ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＩＧＦｓ．Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９

当技術分野においては、依然として、リン酸化タンパク質変種の測定を許容して手動および／または完全自動作業による大規模サインプル分析を提供する、比較的に単純かつ信頼できる定量的イムノアッセイ方法ならびに組成物に対する必要が存在する。

（発明の要旨）
本明細書では、タンパク質またはペプチドのリン酸化アイソフォームについてのイムノアッセイに関する方法および組成物を開示する。より詳細には、本明細書に記載したイムノアッセイは、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）のリン酸化アイソフォームに関する。

本明細書に記載した方法および組成物の様々な実施形態は、従来型イムノアッセイフォーマットの長所および単純性を用いて、ＩＧＦＢＰなどのタンパク質のリン酸化アイソフォームを定量する能力を提供する。抗ＩＧＦＢＰ捕捉抗体を抗リン酸化残基抗体と結び付けることは、本明細書でＩＧＦＢＰについて例示するようなリン酸化タンパク質のイムノアッセイにとっての新規なアプローチを表す。

本明細書に記載したイムノアッセイ組成物の１つの実施形態は、第１抗体および第２抗体を含んでいる。第１抗体はリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質には結合するが、リン酸化アミノ酸残基には結合しない。第２抗体は、リン酸化アミノ酸残基に結合する。

サンプル中にリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を測定するためのイムノアッセイキットを含む追加の実施形態もまた本明細書に記載されている。１つの実施形態では、そのようなキットは第１抗体および第２抗体を含んでおり、このとき第１抗体はリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質に結合し、第２抗体はリン酸化アミノ酸残基に結合する。この実施形態によると、本キットは、第１抗体と結合した固体支持体および第２抗体と結合した標識をさらに含有している。

また別の態様では、本明細書においてサンプル中にリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を測定するためのイムノアッセイ方法が記載されている。１つの実施形態では、１つの方法は、リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質に第１抗体を結合させ、それにより結合した第１抗体を作製する工程を含んでいる。第２抗体は、リン酸化アミノ酸残基に結合させられ、それにより結合した第２抗体が作製される。結合した第２抗体の量が測定され；そしてサンプル中のタンパク質の濃度が結合した第２抗体の量に基づいて計算される。

さらに追加の実施形態は、タンパク質サンプルのリン酸化レベルを測定するためのイムノアッセイ方法である。本方法は、第１抗体をタンパク質サンプルと接触させる工程を含み、このときタンパク質サンプルはリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質を含み、そして第１抗体はタンパク質に結合し、それにより結合した第１抗体が作製される。本方法は、第１抗体をリン酸化アミノ酸残基に結合させ、それにより結合した第２抗体が作製される工程をさらに含んでいる。結合した第２抗体の量が測定され、そしてサンプル中のリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度が結合した第２抗体の量に基づいて計算される。タンパク質サンプル中の全タンパク質の濃度が計算される。リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度は、次にサンプル中の全タンパク質の濃度に比較して決定される。

本発明のその他のまた別の態様、特徴、および長所は、本発明の現在好ましい実施形態の以下の説明から明白である。これらの実施形態は、開示するために提供される。

上記に言及した本発明の機能、長所および目的、ならびに今後明白になるであろうその他のことが達成され、詳細に理解できるように、上記に手短に要約した本発明の様々な実施形態についてのより詳細な説明は、添付の図面に例示されている所定の実施形態を参照することによって得ることができる。これらの図面は、本明細書の一部を形成する。しかし添付の図面は本発明の好ましい実施形態を例示するものであり、それらの範囲を限定すると見なすべきではないことに留意されたい。

（発明の詳細な説明）
（Ｉ．発明の組成物）
本明細書に記載したイムノアッセイ組成物は、第１抗体および第２抗体を含んでいる。第１抗体はリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質には結合するが、リン酸化アミノ酸残基には結合しない。第２抗体は、リン酸化アミノ酸残基に結合する。１つの実施形態では、本組成物は、そのリン酸化アミノ酸残基で第２抗体へ結合している「標的」タンパク質に結合した第１抗体によって提供される中間体である。以下で詳細に記載するように、第１抗体は任意で固体支持体に結合している。また別の実施形態では、第２抗体は任意で標識に結合している。また別の実施形態では、第１抗体は第１エピトープで標的タンパク質に結合している；および第１抗体の第１エピトープへの結合は第２抗体のリン酸化残基への結合を妨害しない。また別の実施形態では、第１エピトープは、リン酸化残基を含有するかリン酸化残基である第２エピトープとは相違する。本発明の組成物のまた別の実施形態は、本組成物を作り上げる個別成分の生成物もしくは収集物である。

そこで、そのような組成物のまた別の実施形態は、サンプル中にリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を測定するためのイムノアッセイキットである。１つの実施形態では、そのようなキットは第１抗体および第２抗体を含んでいるが、このとき第１抗体はリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質には結合するがリン酸化残基には結合せず、そして第２抗体はリン酸化アミノ酸残基に結合する。この実施形態によると、本キットは第１抗体と結合した固体支持体および第２抗体と結合した標識をさらに含有している。固体支持体の適切な実施例を以下で同定する。本キット内に使用するための標識の適切な実施例も、同様に以下で同定する。本キットは、本明細書に記載したアッセイ法を実施するための任意の追加の成分も含有している。そのような任意の成分は、容器、ミキサー、アッセイ遂行の説明書、標識、支持体、および抗体を支持体もしくは標識へ結合させるために必要な試薬から独立して選択される。

これらの組成物、生成物ならびに抗体、標的タンパク質、支持体、標識を含むキットの成分および任意のキット成分の説明については、以下により詳細に提供する。

（ＩＩ．本発明の方法）
本発明の方法の１つの実施形態は、サンプル中にリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を測定するためのイムノアッセイ方法であって、リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質に第１抗体を結合させ、それにより結合した第２抗体を作製する工程と；結合した第２抗体の量を測定する工程と；および結合した第２抗体の量に基づいてサンプル中のタンパク質の濃度を計算する工程と、を含む方法である。

１つの実施形態では、１工程アッセイ（サンプル＋検出抗体の同時インキュベーション）が有用である。また別の実施形態では、２工程アッセイ（サンプルおよび検出抗体の逐次的インキュベーション）が有用である。２工程アッセイは、他のリン酸化分子が例えば抗ホスホセリンもしくはホスホチロシンなどの抗リン酸化成分への結合について競合する可能性がある場合には好ましい。

免疫測定、「２部位」もしくは「サンドウィッチ」イムノアッセイと呼ばれるイムノアッセイの実施形態では、分析物は分析物上の相違するエピトープに結合する２つの抗体に結合する、またはそれらの間に挟まれる。そのようなイムノアッセイの代表的な実施例には、酵素イムノアッセイもしくは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＩＡもしくはＥＬＩＳＡ）、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）、蛍光イムノアッセイ、ラテラルフローアッセイ、拡散イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、および磁気選別アッセイ（ＭＳＡ）が含まれる。１つのそのようなアッセイでは、「捕捉」抗体と説明される第１抗体は、タンパク質連結もしくはタンパク質結合表面、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、またはポリマービーズなどの固体支持体に結合させられる。ポリマービーズの１つの例は、ラテックス粒子である。そのような実施形態では、捕捉抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて固体支持体上に結合させられる、もしくはその上に被覆される。または、捕捉抗体は、固体支持体に結合させられる、もしくはその上に被覆される追加の抗体によって認識されるリガンドと連結させられる。捕捉抗体の追加の抗体へのリガンドを介しての結合は、次に捕捉抗体を固体支持体上に間接的に固定する。そのようなリガンドの例は、フルオレセインである。

「検出」抗体であると記載される第２抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて標識と連結もしくはコンジュゲートさせられる。このために適切な標識の例には、化学発光剤、比色剤、エネルギー転移剤、酵素、酵素反応の基質、蛍光剤および放射性同位元素が含まれる。１つの実施形態では、標識は、第２抗体と連結したビオチンなどの第１タンパク質、および酵素と連結しているストレプトアビジンなどの第２タンパク質を含んでいる。第２タンパク質は、第１タンパク質に結合する。酵素は、基質が提供されると検出可能なシグナルを生成するので、測定されたシグナルの量は、分析物に結合している第２抗体の量に対応する。酵素の例には、制限なく、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ラクタマーゼ、ウレアーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼが含まれる。適切な基質には、制限なく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）、およびＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）が含まれる。

イムノアッセイ法の追加の実施形態は、タンパク質サンプルのリン酸化レベルを測定するために設計されている。そのような方法は、第１抗体をタンパク質サンプルと接触させる工程を含み、このときタンパク質サンプルはリン酸化アミノ酸残基を有する標的タンパク質を含む。第１抗体は、タンパク質に結合し、それにより結合した第１抗体が作製される。第２抗体は、サンプルと接触させられ、そして標的タンパク質のリン酸化アミノ酸残基に結合し、それにより結合した第２抗体が作製される。結合した第２抗体の量が測定される。サンプル中のリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度は、結合した第２抗体の量に基づいて計算される。タンパク質サンプル中の全標的タンパク質の濃度が決定され、サンプル中の全タンパク質の濃度に比較してリン酸化アミノ酸残基を有する標的タンパク質の濃度が決定される。そのようなイムノアッセイ法の１つの実施形態では、リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度をサンプル中の全標的タンパク質の濃度に関連付ける工程は、リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度対サンプル中の全タンパク質の濃度の比率を計算する工程を含んでいる。

上述の組成物および方法の様々な実施形態は、リン酸化アミノ酸残基を有する任意のタンパク質のリン酸化変種もしくはリン形態を測定するために使用される。本明細書に記載の実施形態では、リン酸化タンパク質に結合する第１抗体はタンパク質中の第１エピトープに結合し、第２抗体はリン酸化アミノ酸残基を含有するタンパク質中の第２エピトープに結合する。１つの実施形態では、第２抗体に結合させられたエピトープは、リン酸化アミノ酸残基および任意でそれに隣接している他のアミノ酸残基を含んでいる。また別の実施形態では、第２抗体に結合させられたエピトープは、単一リン酸化アミノ酸残基である。それに第２抗体が結合しているリン酸化アミノ酸残基は、制限なく、ホスホセリン、ホスホチロシン、およびホスホトレオニンを含むタンパク質内でリン酸化しているいずれかのアミノ酸残基である。第１エピトープは第２エピトープとは相違しているので、第１抗体のタンパク質への結合は第２抗体のリン酸化アミノ酸残基への結合を妨害しない。

本明細書に記載した組成物および方法は、手動および自動両方のイムノアッセイプラットフォームに適用できるタンパク質リン形態を特異的に定量するためのイムノアッセイアプローチを提供する。タンパク質のリン酸化変種を特異的に定量するための新規なＥＬＩＳＡの開発および性能特性について記載する。本明細書に記載したアッセイの特徴は、複数のリン酸化アイソフォームを備える標的タンパク質としてＩＧＦＢＰを用いることによって証明されている。そこで、以下の実施例に記載した組成物および方法は、前記ＩＧＦＢＰの表面上で発現するリン酸化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体と組み合わせて抗ＩＧＦＢＰ抗体を含んでいる。アッセイの特異性は、抗ホスホチロシン抗体などの非関連性リン酸化残基に特異的に結合する抗体との応答性がないことを示すことによって、そして所定のＩＧＦＢＰに対する捕捉された分子の特異性によってさらに証明される。

（ＩＩＩ．本発明の組成物および方法の成分）
（Ａ．標的タンパク質およびサンプル）
本発明の実施形態を用いて測定されるリン酸化変種を備える標的タンパク質の例は、ＩＧＦＢＰである。ＩＧＦＢＰ変種の例は、リン酸化セリンアミノ酸残基を含有するＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−５である。リン酸化変種もしくはアイソフォームを有し、本明細書に記載した方法による分析のために適合するその他のタンパク質は、特に様々な酵素、増殖因子および転写因子を含む、当技術分野において公知のタンパク質から容易に選択できる。

所定の標的タンパク質は、三元タンパク質複合体（３６）中に存在しているので、それ自体が抗リン酸化「部位特異的」抗体に結合するためには接近しにくい。そのような標的タンパク質もまた、本明細書に記載した組成物および方法を用いて測定することができる。しかし、そのような標的は、例えば三元構造内の変化を誘導するような、抗体による結合を許容するためのタンパク質構造内の変化を許容する追加の方法工程にかけられる。そのような変化には、制限なく、第１および／または第２抗体による結合のためのエピトープの暴露を許容するための従来型処理が含まれる。

様々な実施形態では、その中のリン酸化タンパク質の濃度が測定されるサンプルは、その中でタンパク質が自然に発生する生体液である。リン酸化タンパク質を含有する有用な生体液の例には、ヒト血清サンプルなどの血清サンプルが含まれる。ヒト血清サンプルの例には、非妊娠血清、妊娠初期、妊娠中期もしくは妊娠後期からの妊娠血清が含まれる。さらにまた別の適切な生物学的サンプルは、羊水である。本明細書に記載したアッセイのために適合するリン酸化タンパク質を含有するさらにまた別の生体液は、制限なく、特に全血、血漿、尿、唾液、涙、脳脊髄液を含む公知の液体から選択されてよい。その他のサンプルは、タンパク質のリン酸化アイソフォームを含有する非天然型もしくは合成の液体もしくは溶液を含むことができる。

（Ｂ．抗体）
本明細書に記載した組成物および方法の様々な実施形態において有用な抗体には、市販で入手できる抗体および抗体フラグメント、ならびに指定された標的タンパク質上の適切なエピトープに結合するように生成された任意の新規な抗体が含まれる。本明細書に例示した様々な実施形態において使用した抗体は、実際はモノクローナルもしくはポリクローナルである。組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、例えばＦａｂもしくはＦｖフラグメントならびにファージ提示ライブラリーをスクリーニングすることによって選択されるフラグメントなどの抗体フラグメントなどの他の抗体および抗体フラグメントもまた、本明細書に記載した組成物および方法において有用である。

モノクローナルならびにポリクローナル抗体を調製する方法は、現在では明瞭に確立されている（ＨａｒｌｏｗＥ．ｅｔａｌ．，１９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）。１つの実施形態では、抗体は、組換えヒトＩＧＦＢＰ、それらの合成フラグメントまたはヒト血清から精製できるようなＩＧＦＢＰ／ＩＧＦタンパク質複合体に対して立てられる。ポリクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバおよびウマなどを含むがそれらに限定されない様々な種において、標準免疫および出血方法を用いて立てられる。高力価を備える動物出血は、硫酸アンモニウムを用いる沈降法などのルーチンの選択的塩析方法および標準方法にしたがってプロテインＡ−セファロースおよびレプチン−セファロースカラム上での連続的親和性クロマトグラフィによって分離される特異的免疫グロブリン分画によって分別される。精製されたポリクローナルならびにモノクローナル抗体は、次に特異性および関連分子との交差反応性の欠如について特性付けられる。そのような特性解析は、例えば、抗体結合について未標識の潜在的交差反応物質のレベル上昇に伴って競合する放射性同位体もしくはビオチンなどのトレーサーを用いて標識されたＩＧＦＢＰなどのタンパク質を用いる標準方法によって実施される。一部の実施形態では、高特異性抗体分画を入手するため、またはポリクローナルプールからより高い親和性抗体分画を選択するためにはいっそうの精製が必要とされる。モノクローナル抗体の場合には、特に免疫のために組換え分子もしくはペプチド抗原が使用される場合は、免疫原に対してだけではなく天然循環分子に対しても良好な結合特性および特異性を備える抗体を選択するために注意が払われる。交差反応性試験は、還元および非還元条件下で、例えば明瞭に確立されたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタン免疫ブロット法などの他の標準方法によってさらに評価される。検出されたタンパク質の分子量プロファイルを大まかに規定するためには、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって分画化された血清サンプル中で検出されたタンパク質免疫応答性の評価もまた使用される（３２，３７）。

モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎのオリジナルの技術（ＫｏｈｌｅｒＧ．，ＭｉｌｓｔｅｉｎＣ．Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５，１９７５）に基づく、明瞭に確立された標準実験室方法（“ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｂｙＰ．Ｔｉｊｓｓｅｎ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ：Ｒ．Ｈ．ＢｕｒｄｏｎａｎｄＰ．Ｈ．ｖａｎＫｉｎｐｐｅｎｂｅｒｇ；ＥｌｓｅｖｉｅｒＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＤｉｖｉｓｉｏｎ，１９８５のＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載））にしたがって調製する。この技術は、免疫した動物から脾細胞を除去して骨髄腫細胞との融合またはエプスタインーバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス形質転換によって抗体産生細胞を不死化すること、そして次に所望の抗体を発現するクローンについてスクリーニングすることによって実施するが、当技術分野において公知の他の技術もまた使用される。抗体は、さらにまた特異的ＤＮＡを用いた免疫を含むがそれには限定されない当業者に公知の他のアプローチによって生成される。

本明細書に記載したイムノアッセイにおいて使用するためには、抗体は標準抗体精製スキームを用いて精製される。様々な実施形態では、モノクローナルおよびポリクローナル抗体のどちらもプロテインＡカラム上での親和性クロマトグラフィによって精製される。または、抗体は、標準方法を用いて固定された抗原タンパク質を含有するゲルカラム上での親和性クロマトグラフィによって精製される。

本発明の一部の実施形態では、検出抗体の選択は、例えばＩＧＦＢＰなどの特定標的タンパク質のリン酸化部位に関して報告された知識に基づく。１つの実施形態では、ＩＧＦＢＰは多くの場合にセリンリン酸化されているので（４，２３）、そのような抗体と所定の抗ＩＧＦＢＰ捕捉抗体との強力なペアワイズ結合を同定することが重視される。そのような情報を入手できない場合は、当業者であれば様々なリン酸化成分（ホスホセリン、ホスホチロシン、ホスホトレオニン）に対する特異性を備える抗体を使用できる。

本明細書に記載した組成物および方法において使用するために適切な抗体を選択するためのまた別の検討課題は、捕捉抗体および検出抗体が所定のタンパク質分子へ同時に結合する能力である。ＩＧＦＢＰを含む１つの実施形態では、捕捉抗体（エピトープ）の抗ＩＧＦＢＰ結合部位は検出抗体が結合するリン酸化部位とは相違しているので、捕捉および検出抗体の同時結合ならびにタンパク質のリン酸化アイソフォームの検出が可能になる。エピトープおよび結果として生じる不良な結合応答が有意に重複する場合には、捕捉抗体として相違する抗ＩＧＦＢＰ抗体を選択することは当業者の技能の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、抗体結合部位は例えばタンパク質が主として１つまたは複数の他のタンパク質との複合体でサンプル中に存在する、そして捕捉もしくは抗リン酸化「部位特異的」抗体への結合のために接近しにくい場合には、タンパク質の表面上では完全には利用できない。そのような状況では、部分タンパク質変性もしくはバッファー修飾などの当技術分野において公知の技術を使用して抗体結合部位が露出させられる。

当技術分野において公知のように、捕捉抗体は、必要とされる分析的および／または固相分離要件に依存して、標準的な非共有もしくは共有結合方法を用いて様々な固相支持体と結合させられる、またはそれらに連結させられる。固体支持体は、試験管、ビーズ、微粒子、濾紙、膜、ガラスフィルター、磁性粒子、ガラスもしくはシリコンチップまたは当業者には公知の他の材料およびアプローチの形状にある。微粒子、特別には抗体（磁性粒子捕捉抗体）が直接的にコーティングされている磁化可能粒子、または汎用結合剤（例、アビジンもしくは抗種抗体）で標識されている粒子の使用は、アッセイインキュベーション時間を有意に短縮するために有用である。これらは当技術分野において公知の他の代替アプローチと一緒に、必要な感受性を制限せずに数分間以内のアッセイ完了を可能にする。磁化可能粒子もしくは類似のアプローチの使用は、広範囲で利用できる免疫分析装置に関するテクノロジーの便宜的な自動化を可能にする。

リン酸化成分を検出するために使用される検出抗体は、レポーター分子と直接的に結合させられる、または二次検出系によって間接的に検出される。後者は、標識された抗種抗体および他の形態の免疫学的もしくは非免疫学的架橋およびシグナル増幅検出系（例、ビオチン−ストレプトアビジンテクノロジー）による抗体認識を含む、当技術分野において公知のいくつかの相違する原理に基づいている。シグナル増幅アプローチは、アッセイ感受性ならびに低レベル再現性および性能を有意に増加させるために使用される。直接的もしくは間接的抗体結合のために使用される標識は、任意の検出可能なレポーター分子である。適切な標識の例は、蛍光体、発光標識、金属錯体および放射性標識などの免疫学的および非免疫学的検出系の分野において広く使用されている標識、ならびに酵素などの他の適切な試薬によって検出できる成分、またはルミノゲン性基質を備える酵素などの直接的もしくは間接的標識の様々な組み合わせである。

（Ｃ．バッファー）
標準イムノアッセイマトリックスは、担体タンパク質（例、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、９ｇ／ＬのＮａＣｌ、５ｇ／ＬのＢＳＡ、０．１ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ３００）を含有するバッファーをベースとする溶液または正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、正常ウマ血清（ＮＥＳ）、またはウシ新生児血清（ＮＢＣＳ）を含むがそれらに限定されないヒトもしくは動物血清である。その他の当技術分野において公知の標準マトリックス調製物もまた有用である。当業者であれば、様々な実施形態のために広いｐＨ範囲が可能であるＴｒｉｓ、ホウ酸塩、リン酸塩もしくは炭酸塩をベースとするバッファーなどのバッファーを容易に選択できる。

（ＩＶ．本発明の方法および組成物の実施形態）
本明細書では、イムノアッセイアプローチを用いてＩＧＦＢＰのリン酸化形を測定するための組成物および方法の様々な実施形態を記載する。本イムノアッセイは、ＩＧＦＢＰが抗ＩＧＦＢＰ抗体によって捕捉され、サンプル中の前記ＩＧＦＢＰの対応するリン形態および／またはリン酸化のレベルにおける変化が分子上で発現するリン酸化残基に対する抗体を用いて測定される。

本発明の様々な実施形態では、任意のサンプルおよび抗体の量ならびにインキュベーション時間を変化させることは当業者の技能の範囲内に含まれる。これらの方法および組成物は、従来型イムノアッセイにおいて使用される一般的修飾、および当業者に公知の任意の修飾を含んでいる。様々な実施形態では、アッセイ設計は、アッセイの特定用途ならびに速度、感受性、正確さおよび便宜性の必要に依存して、同種もしくは異種である。

様々な実施形態は、当該の病態生理学的状態における変化に応答したタンパク質リン酸化の状態における変化の正確な追跡を可能にする。タンパク質リン酸化のレベルにおける変化の特異的定量および監視は、例えば、ＩＧＦＢＰ−１（３２）もしくはＩＧＦＢＰ−３（３７）についての現在利用可能なイムノアッセイよりむしろ全タンパク質免疫応答性を測定することに関してより多くの情報を与える。「比率」決定を用いるなどの、リン酸化タンパク質アイソフォームの濃度をタンパク質の全濃度に関連付けることは、タンパク質のリン酸化レベルにおける変化が全免疫応答性レベルにおける変化より大きい病態生理学的状態を評価する場合に有用である。それらを使用するためのそのようなイムノアッセイおよび方法の利用可能性は、一般にはリン酸化タンパク質、特別にはＩＧＦＢＰの病態生理学的役割および潜在的診断的価値についての調査を促進する。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために提供するが、決して本発明を限定することは意図していない。

（実施例１：リン酸化ＩＧＦＢＰのイムノアッセイ）
サンプルの調製
非妊娠女性（ｎ＝２９、年齢１７〜４８歳、メジアン値）、ならびに妊娠初期（ｎ＝３８）および妊娠中期（ｎ＝２９）由来の血清サンプルは、ＬｅｎｅｔｉｘＭｅｄｉｃａｌＳｃｒｅｅｎｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社（ニューヨーク州ニューヨーク）から入手した。これらの標本は、ルーチンもしくは研究用試験サンプルの残りであった。収集後、血液サンプルは凝固させられ、その後に分離させられた。臨床試験後、残りは−２０℃で保存され、３カ月以内に本試験のために使用された。妊娠中期（妊娠第１５〜１８週）からの羊水（ｎ＝２０）は、カナダ国オンタリオ州トロントにある臨床検査室から入手した。サンプルはルーチンの臨床試験サンプルの残りであり、使用前には４カ月未満にわたり−７０℃で保存された。

試薬
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、ＳｃｒｉｐｐｓＬａｂｓ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）マイクロウエルペルオキシダーゼ基質系は、ＮｅｏｇｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ケンタッキー州レキシントン）からであった。スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）および２−イミノチオランはＰｉｅｒｃｅ社（イリノイ州ロックフォード）から購入した。酵素イムノアッセイ等級のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社（インディアナ州インディアナポリス）から入手した。その他すべての化学試薬は最高品質であり、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州セントルイス）またはＡｍｒｅｓｃｏ社（オハイオ州ソロン）から入手した。微量滴定ストリップおよびフレームは、ＧｒｅｉｎｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ドイツ国）の製品であった。

組換えヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩはＧｒｏＰｅｐ社（オーストラリア国アデレード）から、そして組換え非グリコシル化ヒトＩＧＦＢＰ−３はＣｅｌｔｒｉｘＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（カリフォルニア州サンタクララ）から入手した。組換えヒトＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６は、ＡｕｓｔｒａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（カナダ国サンロマン）から購入した。以前に記載された方法（３５）によってヒト羊水から精製されたヒトＩＧＦＢＰ−１は、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（テキサス州ウェブスター）から入手した。調製物は、純粋組換えヒトＩＧＦＢＰ−１に対してキャリブレーションした。マウス骨髄腫細胞系中で発現させた組換えヒトＩＧＦＢＰ−５は、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。

抗体
様々なリン酸化アミノ酸残基に対するマウスモノクローナル抗体は、市販の供給源から購入した。抗ホスホセリン抗体は、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サンホセ）から入手した。抗ホスホチロシンは、Ｕｐｓｔａｔｅｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州レークプラシッド）から入手した。５種の相違するＩＧＦＢＰ−１マウスモノクローナル抗体および親和性精製ヤギポリクローナル抗ＩＧＦＢＰ−１抗体は、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（テキサス州ウェブスター）から入手した。これらの抗体のＩＧＦＢＰ−１に対する特異性は、以前に記載されている（参考文献３２、米国特許第５，７４７，２７３号）。これらの抗体の中では、ＩＧＦＢＰ−１リン酸化の状態もしくはＩＧＦ−ＩへのＩＧＦＢＰ−１結合によって影響を受けなかった抗ＩＧＦＢＰ−１モノクローナル抗体は、以前に全ＩＧＦＢＰ−１についてのイムノアッセイを設計する際に使用された（参考文献３２、米国特許第５，７４７，２７３号）。これらの特性のために、同一抗体を候補抗体であると同定し、リン酸化ＩＧＦＢＰ−１変種の特異的測定のための本ＥＬＩＳＡを開発するために評価した。組換えヒトＩＧＦＢＰ−５もしくはＩＧＦＢＰ−５の合成ペプチドに対して立てられた１パネルの抗ＩＧＦＢＰ−５モノクローナル（ｎ＝１２）およびポリクローナル（ｎ＝４）抗体もまたＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（テキサス州ウェブスター）から入手した。

以前に報告されたように、無傷ＩＧＦＢＰ−５に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、ペアワイズＥＬＩＳＡの組み合わせまたは非競合的酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）フォーマットで評価した場合に最高の結合シグナルおよび特異性を生じさせた（３３，３４）。この特性およびポリクローナルコーティングがＩＧＦＢＰ−５へのＩＧＦ−Ｉ結合によってあまり影響を受けなかったという所見があるために、これらの両方の抗体をより詳細に評価した。評価した抗ＩＧＦＢＰ−３抗体は、以前にＩＧＦＢＰ−５のＮ末端領域に結合することが証明されたモノクローナル抗体であり、三元ＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−Ｉ複合体を測定するためのＥＬＩＳＡ法を開発する際に役立った（参考文献２６、米国特許第６，２４８，５４６号）。ＩＧＦＢＰに対する全マウスモノクローナル抗体およびヤギポリクローナル抗体は、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（テキサス州ウェブスター）から入手した。許容できる特異性および結合特性を備えるこれらの抗体は、ＩＧＦＢＰ−１（３２）、ＩＧＦＢＰ−３（３７）、またはＩＧＦＢＰ−５（３３，３４）についての特異的イムノアッセイに組み込まれている。

試薬調製のプロトコール
抗体は、以前に報告されたプロトコール（３８〜４０）にしたがってマイクロウエルにコーティングした（２５０〜１，０００ｎｇ／１００μＬ／ウエル）。ビオチンもしくはＨＲＰへの抗体のコンジュゲート化は、以前に記載されたように実施した（３８〜４０）。標準物質は、任意単位で所望のＩＧＦＢＰ標準物質を生成するために組換えヒトＩＧＦＢＰもしくはヒト血清プールを様々な標準マトリックスバッファー内へ適切に希釈することによって調製した。血清プールには、対応する全ＩＧＦＢＰ免疫応答性についての従来型イムノアッセイによって測定されたプールの濃度に基づく質量単位で数値を指定した。例えば、リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡのキャリブレーションのためには、高リン酸化ＩＧＦＢＰ−１含量を備える１０種のサンプルを混合することによって作製した血清プールをＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製全ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡ（３２）によって全ＩＧＦＢＰ−１免疫応答性についてアッセイした。入手した数値は、血清プールに指定し、標準物質調製のために使用した。リン酸化ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−５のＥＬＩＳＡ両方のために使用した標準マトリックスは、商業的に調製されたウシ新生児血清であった。両方のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−５のＥＬＩＳＡのために、Ｔｒｉｓをベースにするアッセイバッファー（１Ｌにつき０．５ｇのＦＳＧ、０．５ｇのＢｒｉｊ３５および２ｍＬのプロクリン３００を含有する０．０２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．１））を選択した。

抗ＩＧＦＢＰ抗体は、標準抗体精製スキームを用いて精製した。モノクローナルおよびポリクローナル抗体はどちらも、標準方法を用いて、プロテインＡカラム上での親和性クロマトグラフィまたは固定化されたＩＧＦＢＰを含有するゲルカラム上での親和性クロマトグラフィによって精製した。

アッセイプロトコール
１つの実施形態では、１工程アッセイ（サンプル＋検出抗体の同時インキュベーション）を実施した；また別の実施形態では、２工程アッセイ（サンプル＋検出抗体の逐次的インキュベーション）を実施した。

市販で入手できる抗ホスホセリンもしくは抗ホスホチロシン（陰性コントロール）抗体とのペアワイズの組み合わせでのＩＧＦＢＰ抗体評価は、従来型方法を用いて実施した。合理的な応答を提供する条件を選択し、詳細に評価した。

リン酸化ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−５のＥＬＩＳＡは、抗ＩＧＦＢＰ抗体が事前にコーティングされたウエルへの標準物質、サンプル、もしくはコントロール（０．０２〜０．０５ｍＬ）およびアッセイバッファー（０．０５〜０．１０ｍＬ）を添加する工程、その後に連続的に攪拌しながら室温での１〜２時間にわたるインキュベーションの工程を含んでいた。次にウエルを５回洗浄し、上述したように０．１０ｍＬ／ウエルの抗ホスホセリン検出抗体と一緒に３０〜６０分間インキュベートした。追加の洗浄工程後、ウエルは０．１ｍＬ／ウエルのＴＭＢ／Ｈ_２Ｏ_２基質溶液とともにインキュベートし、上述したようにさらに１０分間インキュベートした。次に停止溶液（０．１ｍＬ）を加え、６２０ｎｍにバックグラウンド波長補正を設定した４５０ｎｍでの二重波長測定によって吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ吸光度測定は、ＬａｂｓｙｓｔｅｍｓＭｕｌｔｉｓｋａｎＭｕｌｔｉｓｏｆｔマイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、フィンランド国ヘルシンキ）を用いて実施した。コーティングおよびブロッキングバッファーの組成およびマイクロタイターウエルへの抗体コーティング方法ならびに洗浄および停止溶液は、以前に記載されたとおりであった（３２，３９）。

ＨＲＰへの検出抗体の結合は、以前に記載されたように実施した（３２，３９）。結合反応は、スルホ−ＳＭＣＣを用いた酵素の活性化およびそれに続く、２−イミノチオランによって活性化されていた検出抗体へのコンジュゲート化を含んでいた。ＨＲＰコンジュゲート化抗体のストック溶液は使用前に少なくとも１，０００倍に希釈した。

リン酸化ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−５の両方のアッセイのために、標準物質は高内因性リン酸化ＩＧＦＢＰ−１もしくはＩＧＦＢＰ−５含量を備える事前に選択した血清プールであった。ＩＧＦＢＰ−１プールは、様々な希釈率のＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製全ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡ（３２）プールによって全ＩＧＦＢＰ−１免疫応答性についてアッセイし、平均値を血清プールに指定し、次に０、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００ｎｇのリン酸化ＩＧＦＢＰ−１／ｍＬの標準値を生じさせるために標準マトリックス中に希釈した。類似のアプローチを用いてリン酸化ＩＧＦＢＰ−５のＥＬＩＳＡをキャリブレーションした。しかし、ＩＧＦＢＰ−５についての市販のアッセイは入手できないために、プールには１００単位／ｍＬの数値を指定し、次に標準マトリックス中でリン酸化ＩＧＦＢＰ−５を０、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００単位／ｍＬの濃度へ連続的に希釈した。標準物質は、４℃で少なくとも２日間は安定性であった。使用した品質コントロールサンプルは、様々なレベルのリン酸化ＩＧＦＢＰを含有する新鮮血清サンプルであった。コントロールサンプルの公称濃度は、全ＩＧＦＢＰのＥＬＩＳＡにおいてサンプルを分析することによって確定した（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。

リン酸化ＩＧＦＢＰのＥＬＩＳＡによるバリデーション方法
検出下限（感受性）は、ゼロキャリブレータ（ＮＢＣＳ）の１２回の測定の平均値＋２標準偏差（２ＳＤ）を内挿することによって決定した。アッセイ内変動係数（ＣＶ）は、１回のランでの様々な濃度の４つのサンプルの反復分析（ｎ＝１２）によって、アッセイ間ＣＶは９〜１２回の個別アッセイにおけるサンプルの２回の測定によって決定した。回収率は、２５μＬの高濃度のＩＧＦＢＰサンプルを２２５μＬの３種の低濃度ＩＧＦＢＰサンプルへ加え、添加した、および添加していないサンプルを分析することによって評価した。回収率は、添加されたＩＧＦＢＰの量を、内因性ＩＧＦＢＰ濃度を減じた後に測定した量と比較することによって決定した。直線性は、本アッセイのゼロキャリブレータ内で連続希釈した（２〜１６倍）の３種の血清サンプルを分析することによって試験した。

その他のアッセイ
全ＩＧＦＢＰ−１および非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１は、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製全および非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡイムノアッセイを用いて、以前に報告されたように（３２）アッセイした。

ＩＧＦＢＰの脱リン酸化
ＩＧＦＢＰ−１の脱リン酸化は、以前に記載した類似方法（３２）を用いるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）によるサンプル前処理によって達成した。手短には、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ_２を含有する１０μＬの１ｍｏｌ／Ｌジエタノールアミン（ＤＥＡ）（ｐＨ９．５）中に溶解させたＡＬＰを２００μＬのアリコートのサンプルに加え、混合し、室温で２時間インキュベートした。未処理コントロールアリコートに１０μＬのＤＥＡバッファーを加え、同様にインキュベートした。ＡＬＰ処理および未処理サンプルを次に分析した。

データ分析
ＥＬＩＳＡデータは、三次スプライン（平滑化）曲線当てはめを用いて、測定器が含まれているデータ整理ソフトウエアパッケージを用いて分析した。記述的データは、他に規定しない限り平均値、メジアン値、および標準偏差として表示されている。線形回帰分析は、最小二乗法によって実施し、相関係数はＰｅａｒｓｏｎ法によって決定した。プロッティングおよび統計分析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔおよびＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウエア（ＳｙｓｔａｔＳｏｆｔｗａｒｅ社、カナダ国ポイントリッチモンド９４８０４−２０２８）を用いて実施した。

リン酸化ＩＧＦＢＰのＥＬＩＳＡ
リン酸化アミノ酸残基（例、ホスホセリン、ホスホチロシン）を認識する抗体とのペアワイズの組み合わせでの明確に特性付けたＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−５モノクローナルおよびポリクローナル抗体のパネルについての評価は、それらの結合特性に関する情報を提供し、詳細には様々なＩＧＦＢＰのリン形態を特異的に検出できる抗体組み合わせを同定した。ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−５のリン形態は検出可能であった。ＩＧＦＢＰ−３のリン形態のイムノアッセイフォーマットによる検出は、発生したシグナルのさらなる増幅および／またはアッセイ前にＩＧＦＢＰ−３の循環構造を変化させるための追加の処理を必要とした。血中ＩＧＦＢＰ−３は、主として三元タンパク質複合体（３６）中に存在しており、抗リン酸化「部位特異的」抗体に結合するためには接近しにくい。

従来型イムノアッセイのように、ペアワイズ抗体選択は、ゼロ用量標準物質によって発生した非特異的結合シグナル（ＮＳＢ）に関連するそれらの相対結合応答（信号対雑音比）に基づいていた。ＩＧＦＢＰは、モノクローナル抗体によって捕捉し、その後に露出したホスホセリン残基を特異的に検出する抗体による捕捉されたリン酸化サブタイプの選択的検出を行った。

有用な分析性能特性は、５ｍｇ／Ｌ（１ウエルに付き５００ｎｇ／０．１ｍＬ）のコーティング抗体濃度、約０．１〜０．２５ｍｇ／Ｌ（１ウエルに付き１０〜２５ｎｇ／０．１ｍＬ）の検出抗体濃度、０．０２５〜０．０５ｍＬのサンプルサイズ、各々２時間および１時間の第１および第２工程の室温でのインキュベーション、および１０分間の基質展開工程を用いて入手した。

リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡおよびリン酸化ＩＧＦＢＰ−５のＥＬＩＳＡについての標準曲線の結果は、各々図１および２に示されている。代表的な例として、リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡの分析性能特性は従来型アプローチを用いてより詳細に評価した。関連する性能データは、表１に要約されている。

特異性
本明細書に記載のＩＧＦＢＰ抗体は、以前にＩＧＦＢＰファミリーの他のメンバーと最小の交差反応性を有する、または有していないことが証明された（３２〜３４，３７）。タンパク質リン形態の特異性を証明するために、本アッセイの抗ホスホチロシン抗体ならびに抗ホスホセリン検出抗体に対する本アッセイの結合反応を、アルカリホスファターゼによるサンプルの脱リン酸化の前後に評価した。外生的に添加されたアルカリホスファターゼによる血清中のＩＧＦＢＰの脱リン酸化は、以前に記載されたように実施した（３２〜３４）。予測されたように、そして図１に示したように、捕捉されたＩＧＦＢＰ−１リン形態への抗ホスホチロシン抗体の有意な結合は生じなかった。ポリクローナルまたは３種のモノクローナル抗体のうちの１つによって捕捉されたＩＧＦＢＰ−５を抗ホスホチロシン抗体に対して試験した場合にも類似の観察所見が得られた（図２および３）。どちらの場合にも、抗ホスホセリン検出抗体の予想された結合は、アルカリホスファターゼによるＩＧＦＢＰ−１もしくはＩＧＦＢＰ−５の脱リン酸化に応答してほぼ排除された（図１および４）。

（実施例２：生理学的調査）
生理液中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１
リン酸化ＩＧＦＢＰ−１は、非妊娠成人血清サンプル、妊娠初期血清および妊娠中期血清、ならびに羊水中で測定した。リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡは、様々なサンプルタイプにおいて有意に相違する濃度を測定し、最高レベルは妊娠中期サンプル中で、そして最低レベルは羊水中で検出できた（図５Ａ〜５Ｃを参照されたい）。

非妊娠サンプル
無作為に選択された非妊娠血清中で、リン酸化および全ＩＧＦＢＰ−１メジアンレベルは、本明細書に記載したイムノアッセイおよびＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製全ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡを各々用いて測定した。これら２つのレベルは高度に類似であり（ＡＮＯＶＡによってｐ＝０．２２５）（図５Ａ〜５Ｃおよび６）、そして個々の数値は高度に相関していた（図７Ａ〜７Ｃ）。全ＩＧＦＢＰ−１およびリン酸化ＩＧＦＢＰ−１変種間の高度に類似の濃度は、正常成人血清中のＩＧＦＢＰ−１が主としてリン酸化されているので（２０，３２）、予想外ではなかった。後者は、リン酸化もしくは全レベル（図５Ａ〜５Ｃ）に比較して非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１の有意に相違して（ｐ＝＜０．００１）はるかに低いレベルについてのＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡによる検出と一致していた。

妊娠サンプル
妊娠初期および妊娠中期の両方のサンプル中では、リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のメジアンレベルは、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製全ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡによって測定した対応する全ＩＧＦＢＰ−１レベル（ｐ＝＜０．００１）より有意に低いことが見いだされた（図６）。これは、妊娠初期（ｐ＝０．０９）および妊娠中期（ｐ＝０．１５２）サンプル中において各々検出されたＩＧＦＢＰ−１のリン酸化対非リン酸化レベルについての統計的に類似なメジアン値とは対照的であった。妊娠に関連するＩＧＦＢＰ−１リン酸化レベルにおける変化は、ＩＧＦＢＰ−１の妊娠初期および妊娠中期サンプル中のリン酸化対全（図７Ｂ〜７Ｃ）もしくはリン酸化対非リン酸化（図８Ｂ〜８Ｃ）レベルの比較において、個別サンプル間の変動性を証明した。

羊水
羊水は、主として非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１を含有している（２０）。したがって、リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡは羊水サンプル中で比較的低レベルのＩＧＦＢＰ−１免疫応答性を測定したが、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製全および非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１のＥＬＩＳＡは相当に類似で有意に高い濃度を検出した（図５Ａ〜５Ｃおよび６）。

本明細書に言及した任意の特許もしくは刊行物は、本発明が関係する分野の当業者の水準を示すものである。さらに、これらの特許および刊行物は、各個別の刊行物が特別かつ個別に参照して組み込まれると指示されているのと同程度まで本明細書に参照して組み込まれる。

当業者であれば、本発明の様々な実施形態は、目的を実施するため、そして本明細書に言及した目標および長所、ならびに本明細書に固有の目的、目標および長所を入手するために良好に適合する。本実施例は、本明細書に記載した方法、手順、処理、分子、および特定化合物とともに、現時点での好ましい実施形態の代表であり、典型であり、本発明の範囲の制限と見なされることは意図していない。添付の特許請求の範囲によって規定された本発明の精神の中に含まれるそれらの変化および他の使用は、当業者であれば思い当たるであろう。

図１は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）により４５０ｎｍでの吸光度によって測定された血清サンプル中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１の濃度（μｇ／Ｌ）を示しているグラフである。事前に選択したヒト血清プールを３つの条件下でアッセイした。１群の未処理血清サンプルを連続希釈し、抗ホスホセリン検出抗体（●）を用いてアッセイした。また別の群の未処理血清サンプルを連続希釈し、抗ホスホチロシン検出抗体（○）を用いてアッセイした。第３群の血清サンプルはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いる処理によって脱リン酸化し、次に連続希釈し、そして抗ホスホセリン検出抗体（▼）を用いてアッセイした。表示した数値は、２回の測定の平均値である。実施例１を参照されたい。図２は、４５０ｎｍでの吸光度で、ＥＬＩＳＡによるリン酸化ＩＧＦＢＰ−５（単位／ｍＬ）の濃度を示しているグラフである。事前に選択したヒト血清プールを連続希釈し、抗ホスホセリン検出抗体（●）を用いてアッセイした。プールの連続希釈液は、さらに抗ホスホチロシン抗体（○）を用いてアッセイした。表示した数値は、２回の測定の平均値である。実施例１を参照されたい。図３は、４５０ｎｍでの吸光度で、ヒト血清サンプル（ｎ＝１６）中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−５を測定したＥＬＩＳＡの特異性を示している棒グラフである。抗ＩＧＦＢＰ−５ポリクローナル抗体＃１によって捕捉されたＩＧＦＢＰ−５は、抗ホスホセリン抗体（カラム１）または抗ホスホチロシン抗体（カラム２）のどちらかによって検出された。抗ＩＧＦＢＰ−５モノクローナル抗体＃４によって捕捉されたＩＧＦＢＰ−５は、抗ホスホセリン抗体（カラム４）または抗ホスホチロシン抗体（カラム５）のどちらかによって検出された。ＩＧＦＢＰ−５は、抗ＩＧＦＢＰ−５モノクローナル抗体＃３（カラム３）または抗ＩＧＦＢＰ−５ポリクローナル抗体＃６（カラム６）のどちらかによって捕捉され、抗ホスホセリン抗体によって検出された。測定されたＩＧＦＢＰ−５のメジアンレベルおよび９５％信頼区間がプロットされている。実施例１を参照されたい。図４は、ヒト血清サンプル（ｎ＝１６）中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−５のＥＬＩＳＡに対するＥＬＩＳＡの特異性を示している棒グラフである。カラム１は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）による脱リン酸化の前に、ポリクローナル捕捉抗体＃１および抗ホスホセリン検出抗体を用いてリン酸化ＩＧＦＢＰ−５についてアッセイされたサンプルを表している。カラム２は、ＡＬＰによる脱リン酸化後に、ポリクローナル捕捉抗体＃１および抗ホスホセリン検出抗体を用いてリン酸化ＩＧＦＢＰ−５についてアッセイされたサンプルを表している。カラム３は、ＡＬＰによる脱リン酸化の前に、ポリクローナル捕捉抗体＃３および抗ホスホセリン検出抗体を用いてリン酸化ＩＧＦＢＰ−５についてアッセイされたサンプルを表している。カラム４は、ＡＬＰによる脱リン酸化後に、ポリクローナル捕捉抗体＃３および抗ホスホセリン検出抗体を用いてリン酸化ＩＧＦＢＰ−５についてアッセイされたサンプルを表している。測定されたＩＧＦＢＰ−５のメジアンレベルおよび９５％信頼区間がプロットされている。実施例１を参照されたい。図５Ａ〜図５Ｃは、非妊娠ヒト血清（ｎ＝２９）（カラム１）、妊娠初期からのヒト血清（ｎ＝３８）（カラム２）、妊娠中期からのヒト血清（ｎ＝２９）（カラム３）およびヒト羊水（ｎ＝２０）（カラム４）中でＥＬＩＳＡによって測定された様々な形態のＩＧＦＢＰ−１の濃度（μｇ／Ｌ）を示した図である。測定されたＩＧＦＢＰ−１のメジアンレベルおよび９５％信頼区間が示されている。図５Ａは、上記に同定した４種の液体サンプル中のリン酸化および非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１を含む全ＩＧＦＢＰ−１の濃度を示している棒グラフである。図５Ａ〜図５Ｃは、非妊娠ヒト血清（ｎ＝２９）（カラム１）、妊娠初期からのヒト血清（ｎ＝３８）（カラム２）、妊娠中期からのヒト血清（ｎ＝２９）（カラム３）およびヒト羊水（ｎ＝２０）（カラム４）中でＥＬＩＳＡによって測定された様々な形態のＩＧＦＢＰ−１の濃度（μｇ／Ｌ）を示した図である。測定されたＩＧＦＢＰ−１のメジアンレベルおよび９５％信頼区間が示されている。図５Ｂは、同一サンプル中の非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１単独の濃度を示している棒グラフである。図５Ａ〜図５Ｃは、非妊娠ヒト血清（ｎ＝２９）（カラム１）、妊娠初期からのヒト血清（ｎ＝３８）（カラム２）、妊娠中期からのヒト血清（ｎ＝２９）（カラム３）およびヒト羊水（ｎ＝２０）（カラム４）中でＥＬＩＳＡによって測定された様々な形態のＩＧＦＢＰ−１の濃度（μｇ／Ｌ）を示した図である。測定されたＩＧＦＢＰ−１のメジアンレベルおよび９５％信頼区間が示されている。図５Ｃは、同一サンプル中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１単独の濃度を示している棒グラフである。実施例２を参照されたい。図６は、全測定ＩＧＦＢＰ−１に比較した全ＩＧＦＢＰ−１（黒色棒）、非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１変種単独（灰色棒）およびリン酸化ＩＧＦＢＰ−１変種単独（斜線棒）のメジアンレベルの比率を示している棒グラフである。ＩＧＦＢＰ−１濃度は、ヒト非妊娠血清サンプル（１〜３の棒）、妊娠初期血清サンプル（４〜６の棒）、妊娠中期血清サンプル（７〜９の棒）、および羊水サンプル（１０〜１２の棒）中においてＥＬＩＳＡによって測定した。実施例２を参照されたい。図７Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定したヒト非妊娠血清サンプル中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１対全ＩＧＦＢＰ−１免疫応答性の分析を示しているグラフである。（ＰＯ４）−ＩＧＦＢＰ−１（μｇ／Ｌ）はＹ軸上にプロットされている。全ＩＧＦＢＰ−１（μｇ／Ｌ）はＸ軸に沿ってプロットされている。プロットした数値は、２回の測定の平均値である。プロッティングおよび統計的分析パラメーターは、ｙ＝０．８８ｘ−２．２７；ｒ＝０．９９；Ｓｙ／ｘ＝４．５；およびｐ＝＜０．００１であった。実施例２を参照されたい。図７Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定したヒト妊娠初期血清サンプル中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１対全ＩＧＦＢＰ−１免疫応答性の図７Ａの分析に類似する比較分析を示しているグラフである。プロッティングおよび統計的分析パラメーターは、ｙ＝０．４１ｘ＋３．１９；ｒ＝０．４８；Ｓｙ／ｘ＝３２．５；およびｐ＝０．００２であった。実施例２を参照されたい。図７Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定したヒト妊娠中期血清サンプル中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１対全ＩＧＦＢＰ−１免疫応答性の図７Ａの分析に類似する比較分析を示しているグラフである。プロッティングおよび統計的分析パラメーターは、ｙ＝０．４９ｘ−１．０９；ｒ＝０．７４；Ｓｙ／ｘ＝２０；およびｐ＝＜０．００１であった。実施例２を参照されたい。図８Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定したヒト非妊娠血清サンプル中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１対非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１免疫応答性の分析を示しているグラフである。（ＰＯ４）−ＩＧＦＢＰ−１（μｇ／Ｌ）はＹ軸上にプロットされている。非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１（μｇ／Ｌ）はＸ軸に沿ってプロットされている。プロットした数値は、２回の測定の平均値である。プロッティングおよび統計的分析パラメーターは、ｙ＝９．０８ｘ＋４．７；ｒ＝０．９３；Ｓｙ／ｘ＝１２；およびｐ＝＜０．００１であった。実施例２を参照されたい。図８Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定したヒト妊娠初期血清サンプル中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１対非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１免疫応答性の図８Ａの分析に類似する比較分析を示しているグラフである。プロッティングおよび統計的分析パラメーターは、ｙ＝１．２９ｘ＋７．９；ｒ＝０．３８；Ｓｙ／ｘ＝３２；およびｐ＝０．０１８であった。実施例２を参照されたい。図８Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定したヒト妊娠中期血清サンプル中のリン酸化ＩＧＦＢＰ−１対非リン酸化ＩＧＦＢＰ−１免疫応答性の図８Ａの分析に類似する比較分析を示しているグラフである。プロッティングおよび統計的分析パラメーターは、ｙ＝０．７４ｘ＋１８．１５；ｒ＝０．４６；Ｓｙ／ｘ＝２７；およびｐ＝０．００３であった。実施例２を参照されたい。

Claims

第１抗体および第２抗体を含むイムノアッセイ組成物であって、該第１抗体はリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質に結合し、該第２抗体は該リン酸化アミノ酸残基に結合し、そして該第１抗体は該リン酸化アミノ酸残基には結合しない、イムノアッセイ組成物。
前記タンパク質はＩＧＦＢＰを含む、請求項１に記載の組成物。
前記ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−５からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
前記リン酸化アミノ酸残基は、ホスホセリン、ホスホチロシン、およびホスホトレオニンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記第１抗体と結合した固体支持体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
前記固体支持体は、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子およびポリマービーズからなる群から選択されるタンパク質結合表面を含む、請求項５に記載の組成物。
標識と結合した前記第２抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
前記標識は、化学発光剤、比色剤、エネルギー転移剤、酵素、酵素反応の基質、蛍光剤または放射性同位元素を含む、請求項７に記載の組成物。
前記酵素は、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ラクタマーゼ、ウレアーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
サンプル中のリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を測定するためのイムノアッセイ方法であって：
（ａ）リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質に第１抗体を結合させ、それにより、結合した第１抗体を作製する工程；
（ｂ）第２抗体を該リン酸化アミノ酸残基に結合させ、それにより、結合した第２抗体を作製する工程；
（ｃ）該結合した第２抗体の量を測定する工程；および
（ｄ）該結合した第２抗体の量に基づいて該サンプル中の該タンパク質の濃度を計算する工程、
を包含する、方法。
前記タンパク質はＩＧＦＢＰを含む、請求項１０に記載の方法。
前記ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−５からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
前記リン酸化アミノ酸残基は、ホスホセリン、ホスホチロシン、およびホスホトレオニンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
前記第１抗体と結合した固体支持体をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
前記固体支持体は、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、およびポリマービーズからなる群から選択されるタンパク質結合表面を含む、請求項１４に記載の方法。
標識と結合した前記第２抗体をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
前記標識は、化学発光剤、比色剤、エネルギー転移剤、酵素、酵素反応の基質、蛍光剤または放射性同位元素を含む、請求項１６に記載の方法。
前記酵素は、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ラクタマーゼ、ウレアーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
サンプル中のリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を測定するためのイムノアッセイキットであって、
（ａ）第１抗体および第２抗体であって、該第１抗体はリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質に結合し、該第２抗体はリン酸化アミノ酸残基に結合する、第１抗体および第２抗体；
（ｂ）該第１抗体と結合した固体支持体；ならびに
（ｃ）該第２抗体と結合した標識、
を備える、キット。
前記タンパク質はＩＧＦＢＰを含む、請求項１９に記載のキット。
前記ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−５からなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
前記リン酸化アミノ酸残基は、ホスホセリン、ホスホチロシン、およびホスホトレオニンからなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
タンパク質サンプルのリン酸化レベルを測定するためのイムノアッセイ方法であって：
（ａ）第１抗体をタンパク質サンプルと接触させる工程であって、該タンパク質サンプルはリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質を含み、該第１抗体は該タンパク質に結合し、それにより、結合した第１抗体を作製する工程；
（ｂ）第２抗体を該リン酸化アミノ酸残基に結合させ、それにより、結合した第２抗体を作製する工程；
（ｃ）結合した第２抗体の量を測定する工程；
（ｄ）該サンプル中のリン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を、該結合した第２抗体の量に基づいて計算する工程；
（ｅ）該タンパク質サンプル中の全タンパク質の濃度を測定する工程；および
（ｆ）リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を該サンプル中の全タンパク質の濃度に関連付ける工程、
を包含する、方法。
前記リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度を前記サンプル中の全タンパク質の濃度に関連付ける工程は、該リン酸化アミノ酸残基を有するタンパク質の濃度と該サンプル中の該全タンパク質の濃度との比率を計算する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
前記タンパク質サンプルは生体液を含む、請求項２３に記載の方法。
前記生体液は、非妊娠血清、妊娠血清、および羊水からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
前記妊娠血清は、妊娠初期血清、妊娠中期血清および妊娠後期血清からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。