JP2008537153A - 生体高分子の質量分析管理された精製のための装置および方法 - Google Patents

Abstract

試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出するための方法は、過負荷量の試料をクロマトグラフ導管１１０内に注入するステップと、時間で変化する組成を有する溶媒を導管１１０を通り流すステップとを含む。試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出するための装置は、クロマトグラフモジュールと、クロマトグラフモジュールからの溶出液の一部分を受け取るためにクロマトグラフモジュールと流体連通する質量分析モジュールと、クロマトグラフモジュールおよび質量分析モジュールと連絡する制御ユニットとを含む。

Description

本出願は、２００５年４月２２日出願の米国特許仮出願第６０／６７４，０５１号の優先権および利益を主張する。

本発明は、一般にクロマトグラフに関し、より詳しくは、目的材料および副生材料のクロマトグラフベースの分離のための機器および方法に関する。

多くの科学的または工業的用途で、化合物は試験、分析または大量生産のために精製される。化合物の精製には、その他の化合物および／または不純物を含有する混合物から所望の化合物を分離することが含まれる。

クロマトグラフは、混合物の化合物を分離するために混合物を分別する方法であり、時には精製のために使用される。例えば液体クロマトグラフでは、分離すべき多数の化合物を含有する試料が流体流（すなわち、溶媒）内に注入され、クロマトグラフカラムを通り導かれる。このカラムが、カラム内の成分種の異なる保持力に応答して、混合物をその成分種に分離する。この分離された化合物と関連する濃度ピーク値が、カラムから通常順々に現れる。

クロマトグラフピーク値は、しばしばそれらの保持時間、すなわち、注入の時間に対するバンドの中央値が検出器を通過する時間に関連して特徴づけられる。多くの用途では、ピーク値の保持時間は、標準値または較正値を組み込んだ関連する分析に基づいて溶出する検体の同定を推定するために使用される。分離された種の存在は、紫外（ＵＶ）線を利用する屈折計または吸光光度計の使用を介してしばしば識別される。

典型的な高速液体クロマトグラフ（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＨＰＬＣ）システムは、制御される流量および組成で流体（「移動相」）を供給するためのポンプ、試料溶液を流れている移動相内に導入するためのインジェクタ、充填材料または吸着剤（「固定相」）を格納する円筒柱状容器、および移動相内の試料化合物の存在および量を記録するためのＵＶ検出器とを含む。カラムを出る移動相内の特定の化合物の存在は、次いで溶出液の物理的または化学的特性の変化を測定することによって検出される。試料の化合物各々の存在に対応する反応ピーク値は、検出器の信号を時間に対し追跡することによって観測し記録することができる。

目的物精製のためには、労力、稼動時間、および他のコストを減少させるために、目的化合物を可能な限り高純度で回収し、各稼動で試料の最大可能量を分離することがしばしば望ましい。しかしながら、通常のクロマトグラフシステムは、試料負荷制限を有する。ある場合には、過負荷試料の使用は、増大する処理容積をもたらす。しかしながら、過負荷は通常、置換剤材料（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ ｍａｔｅｒｉａｌ）またはセグメント化されたカラムの使用によって目的化合物の抽出の複雑性を増加させる。さらに、抽出された目的物はしばしば所望に満たない純度を有する。

本発明は部分的に、置換分離と組み合わせたグラジェントモード（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｏｄｅ）溶出の使用、すなわち過負荷試料状態と組み合わせた時間で変化する溶媒組成の使用によって、クロマトグラフ試料からより多くの化合物をより効率的に分離できることを実現することから生じている。いくつかの有利な実施形態も、試料置換すなわち分離置換剤材料を全く試料化合物に加えないことを利用する。その他の実施形態も、溶出化合物の良好な分離を可能にするために、溶出する試料化合物間の境界の正確な観測を可能にするための質量分析計または他の適切な検出器を利用する。本発明のいくつかの実施形態では、クロマトグラフカラムを一回通過後に、比較的高純度を有する目的化合物の効率的な収集を可能にする抽出窓を装備する。

したがって、いくつかの実施形態では、自己置換列（ｓｅｌｆ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｒａｉｎ）内の化合物間の境界は、流れている溶媒組成が組成グラジェントを有するにもかかわらず、実質的に明瞭なままである。これらの実施形態のうちのいくつかでは、溶媒は分離された化合物をカラムを通させる置換剤として作用する。したがって、いくつかの従来技術方法と対照的に、例えば分離置換剤材料、または分離可能なカラム区画、または複数カラムは、分離された目的化合物を抽出するために利用する必要はない。

これらの実施形態のうちの多くでは、ＵＶ検出は過負荷試料状態下で化合物境界を十分に区別するためには不十分な解像度を通常有するであろう。しかしながら、これらの実施形態は、置換列内の化合物間の境界の正確な識別のために、質量分析計などの適切な分析技術を利用する。

所望の試料化合物に対する質量スペクトルピークの開始の観測は、一例の実施形態では、目的化合物の収集を応答して開始するために使用される。同様に、所望の化合物が最早溶出していないことを示す質量スペクトルピークの終わりの検出に応答して、収集は任意選択で中止される。

したがって、本発明の一実施形態は、複数の化合物を含む試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出するための方法を特徴とする。この方法は、過負荷量の試料をクロマトグラフ導管内に注入するステップと、時間で変化する組成を有する溶媒を導管を通り流すステップを含む。試料注入に応答して、置換列が形成され、少なくとも１つの目的化合物が複数の化合物のうちの隣接する化合物から実質的に分離される。溶媒を流すことに応答して、少なくとも１つの目的化合物が隣接する化合物から実質的に分離されたままである間に、少なくとも１つの目的化合物を含む溶出液が導管の出口オリフィスから溶出する。

本発明の第２の実施形態は、試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出するための方法を特徴とする。この方法は、過負荷量の試料をクロマトグラフ導管内に注入するステップと、少なくとも１つの目的化合物を含む溶出液を導管の出口オリフィスから溶出させるステップと、少なくとも１つの目的化合物と隣接する化合物との間の境界を識別する質量分析データを取得するステップと、識別された境界に応答して少なくとも１つの目的化合物を収集するステップとを含む。質量分析データは、溶出液の一部分から取得される。

本発明の別の実施形態は、試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出するための装置を特徴とする。この装置は、クロマトグラフモジュール、このクロマトグラフモジュールから溶出する溶出液の一部分を受け取るようにクロマトグラフモジュールと流体連通する質量分析モジュール、ならびにクロマトグラフモジュールおよび質量分析モジュールと連絡する制御ユニットを含む。制御ユニットは、少なくとも１つのプロセッサならびに複数の指示を記憶するための少なくとも１つの記憶装置とを含み、少なくとも１つのプロセッサによって実施されるとき、過負荷量の試料をクロマトグラフモジュールのクロマトグラフ導管内に注入するステップと、少なくとも１つの目的化合物を含む材料の溶出を起こさせるために、時間で変化する組成を有する溶媒を導管を通して流すステップと、溶出材料の一部分と関連する質量分析データに応答して、少なくとも１つの目的化合物を収集するステップの実行を行わせる。

図面では、同様な参照記号は一般に、異なる図の最初から最後まで同じ部品を示す。同様に、図面は必ずしも縮尺どおりではなく、代わりに全体的に本発明の原理を図示することに強調が置かれている。

本明細書で使用される接尾辞「マー（ｍｅｒ）」は、ダイマー（２量体）、トリマー（３量体）、デカマー（１０量体）、３０マー（３０量体）等などの重合体鎖を形成するために他のメンバーと連結することができるクラスのメンバーを示す。例えば、ヌクレオチドのクラスのメンバーは、互いに接合されるときオリゴヌクレオチドを形成することができ、ペプチドのクラスのメンバーは、互いに結合しポリペプチドまたは蛋白を形成することができる。

本明細書での語句「クロマトグラフシステム」は、化学的分離を実施するための機器を呼ぶ。これらのシステムは、通常流体を圧力下で移動させる。本発明のいくつかの実施形態では、インターフェイスを介して質量分析計と流体連通して配置されるクロマトグラフシステムモジュールを含む。これらのインターフェイスは時にはイオン形態の分離された材料を作り出しまたは維持し、通常このイオンを含有する流体の流れを大気内に置き、そこでこの流れは蒸発させられ、イオンは質量分析計のオリフィス内に受けられる。オリフィスは通常、質量分析計の低圧チャンバを大気圧のインターフェイスから分離する。

本明細書での語句「負荷能力」は、かなりのピーク広がり（ｐｅａｋ ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ）および／または分離された化合物の置換列の形成および／またはＵＶ検出器の解像度の損失を引き起こすことなく、カラム内に負荷することができる試料の最大容量および／または最大質量に対する閾値を呼ぶ。本明細書での「置換列」は、カラム内に試料を過負荷することに応答して形成される物理的に分離されているが近接して間隔のあいた、またはオーバーラップする化合物の群を呼ぶ。この列内の各化合物は、試料内のその量に対応するいくらかの幅を通常有する。本明細書での「自己置換」および「試料置換」は、試料化合物をカラムを通らせるために、試料および溶媒に加えて置換剤材料を使用することなしに置換列を作り出す過負荷試料の使用を呼ぶ。以下で説明するように、本発明の様々な実施形態は、化合物の比較的良好な分離および置換列化合物境界の質量分析解像度を提供する。

本明細書での語句「クロマトグラフのアイソクラテックモード（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｍｏｄｅ）」は、時間の関数として実質的に一定のままである溶媒組成の使用を呼ぶ。アイソクラテックモードクロマトグラフ中、固定された濃度の移動相がカラムを通り流れる間に、いくつかの試料内の検体が溶出する。

本明細書での語句「クロマトグラフのグラジェントモード」は通常、使用者の定義したプロファイルに応答して時間の関数として変化する、流れている溶媒組成を呼ぶ。溶媒は、本明細書で移動相Ａおよび移動相Ｂと呼ばれる例えば２つの溶液の混合物である組成を有する。

当業者によって理解されるように、溶液濃度はモル溶液として表現することができる。「１Ｍ」溶液は、例えば１モル／リットル溶液である。同様に、「１ｍＭ」溶液は１ミリモル／リットル溶液である。

次に図１ａ、図１ｂ、および図１ｃを参照すると、本発明の一実施形態による、複数の化合物を含む試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出する方法が記載されている。この方法は、過負荷の使用および分離された試料の溶出を起こさせるために変化する組成を有する溶媒流の使用を含む。

図１ａは、グラジェントモードの溶媒流に応答してカラム１１０を通り移動する過負荷試料１２０を含むクロマトグラフカラム１１０の概略図である。このカラムは吸着剤を格納し、かつ溶出液がカラムから出る出口オリフィス１１１を含む。図示のように、過負荷試料は分離され、カラム１２０内で自己置換列を形成している。この置換列１２０は、目的化合物１２１および例えば副生品化合物である非目的化合物１２２、１２３、１２４を含む。

図１ｂは、カラム１１０に沿った位置の関数として、試料の分離された化合物の方形波ゾーン濃度プロファイル、ならびに溶媒の濃度グラジェントプロファイルを定性的に示す、図１ｂと関連する図である。この図は、試料のより弱く保持される化合物がより強く保持される化合物によってクロマトグラフ吸着剤から置換されている、試料自己置換を示す。

本明細書での記載を考慮すると、当業者は図示されたグラジェントプロファイルは単に定性的であることを理解するであろう。例えば、このプロファイルは、アイソクラテック溶媒流の最初の期間後直線的である（一定の割合で増加する）グラジェントを定性的に示す。しかしながら処理中の時間内の特定の時点のところで、このアイソクラテック溶媒組成は導管１１０を通して存在することができ、あるいは例えば、溶媒組成は、導管１１０を通る流量および置換列１２０の通過の継続時間に応じて、導管１１０を通してほとんど一定であることができる。

図１ｃは、図１ｂの溶媒グラジェントプロファイルと関連する溶媒組成対時間のグラフである。図示のように、この実施形態での組成は最初はアイソクラテックであり、例えば、試料を導管１２０内に注入するのに使用され、かつ例えば、置換列１２０の形成中アイソクラテックである。その後この溶媒組成は、直線的なグラジェントを有する。一般にこの記述を通して、溶媒組成は２つ以上の溶媒組成のうちの１つの溶媒組成のパーセントで表現される。多くの溶媒の実施形態は、Ａ相組成およびＢ相組成を含む。本明細書で説明されるそのような実施形態に対して、溶媒組成はＢ相組成で表現される。

図１ａ、図１ｂ、および図１ｃは、本発明の一実施形態による、複数の化合物１２１、１２２、１２３、１２４を含む試料から図１ａに示す化合物１２１などの、少なくとも１つの目的化合物を抽出する方法を示す。この方法は、試料の過負荷量をクロマトグラフ導管１１０内に注入するステップと、それに応答して、少なくとも１つの目的化合物１２１が複数の化合物１２２、１２３、１２４の隣接する化合物１２２、１２３から実質的に分離される置換列１２０を形成するステップとを含む。この方法は、導管１１０を通して時間で変化する組成を有する溶媒を流すステップと、それに応答して、少なくとも１つの目的化合物１２１を含む溶出液が導管１１０の出口オリフィス１１１から溶出するステップも含む。この少なくとも１つの目的化合物１２１は、隣接する化合物１２２、１２３から実質的に分離されたままである。

この方法は、例えば、逆相ＨＰＬＣおよび／またはイオン交換ＨＰＬＣを含む、任意の適切なクロマトグラフ技術を使用する。導管は、例えば所望の生産速度を支持するように選択されたサイズのクロマトグラフカラムである。次に表１を参照すると、適切なカラム寸法および質量負荷が示されている。表１は、いくつかのカラム内径（ＩＤ）に対する適切で例示的な質量負荷および溶媒流量のリストである。

これらの例示的な値は、本発明の用途を特定のサイズのカラムの使用および／または特定の流量の溶媒に限定するためのものではない。示されるように本方法は、いくつかの従来型の溶出クロマトグラフ精製方法と比較して、試料容積でほとんど２０倍またはそれ以上の増加を可能にする。

溶媒グラジェントは、任意の適切な溶媒グラジェントから選択することができる。例えば、例示的な一実施形態では、このグラジェントは直線であり浅い。この例では、グラジェントは、どの時点においても溶媒組成が導管の長さに沿ってほとんど一定であるように徐々に傾斜する。さらに、いくつかの実施形態では、試料をカラム内に注入し分離された化合物の置換列を形成させるために、アイソクラテック溶媒が最初に使用される。次いで時間で変化する溶媒組成がこの置換列をカラムを通り移動させ、カラム出口から溶出させるために使用される。

いくつかの適切な溶媒およびグラジェントプロファイルが以下でより詳細に説明される。説明される溶媒は、本発明の用途をどのような特定のグラジェントプロファイルに限定するためのものではない。本発明の他の実施形態は、非直線グラジェントおよび／またはより急速に、またはより急速でなく変化する溶媒濃度グラジェントを使用する。いくつかの実施形態では、グラジェントのサイズは、隣り合うゾーン間のオーバーラップを所望の量のオーバーラップより大きくなるのを回避するように選択される。

上記で説明した方法のいくつかの代替実施形態では、カラムは粒状吸着剤材料を含む。この吸着剤材料は、シリカまたはシリカとアルキル化合物などの共重合体の混合物などの知られた材料を含む、任意の適切な吸着剤材料から選択される。この吸着剤は例えば、グラジェント状態の下での溶媒溶出中良く分離されたままである良く分離された化合物を有する置換列の発達を支持するために選択される。

吸着剤粒子サイズおよび／またはサイズ分布は適切に選ばれる。例えば、いくつかの実施では、粒子径は、波列内の良く分離された化合物の維持を支持するのに十分に小さいように選ばれる。いくつかの実施では、適切な粒子径は、約５μｍまたはそれより小さい。

さらに、いくつかの実施形態では、多孔質変形種のシリカまたはシリカ混合物などの多孔質吸着剤材料が有利に使用される。例えば大きな分子を含有する試料に対する適切な孔のサイズは、例えば約１０ｎｍから約３０ｎｍである。いくつかの分離に対して特定の多孔質材料が、所望の化合物拡散挙動をもたらすように選ばれる。例えばいくつかの実施形態では、多孔質吸着剤が比較的大きな目的分子に対し、より小さな分子に対する拡散係数より１０から１０^２倍小さな拡散係数を可能にするように選択される。または例えばより小さな孔サイズが、置換列内の隣接する化合物間の改善された分離を可能にするために選択される。

代替の一実施形態では、この方法は、溶出液、例えば溶出液の迂回された部分から分光データを収集するステップを含む。この分光データは、少なくとも１つの目的化合物と隣接する化合物間の境界を識別する。この分光データは、目的化合物の収集を助けるために目的化合物の開始境界および終止境界を識別するために任意選択で使用される。

この分光データは、過負荷された試料状態の下で適切な解像度を可能にする技術を使用して収集するのが好ましい。適切な技術の１つは、質量分析、例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）である。したがって任意選択で、溶出液の小さな部分が質量分析計に迂回させられる。いくつかの実施形態では、質量分析データによって支持される収集窓の識別に応答して、１つまたは複数の目的化合物が溶出液の残りから収集される。本発明のいくつかの実施形態では、収集された目的化合物は、一回のクロマトグラフ処理ステップの後で約９８％またはそれより良い純度を有する。

様々な実施形態も、目的化合物の極めて良好な収率をもたらす。そのような実施形態は収集窓の正確な選択を可能にし、その結果、精製された化合物の効率的な収集を支持する。例えば目的化合物は、試料から約８０％またはそれより良い、または９０％またはそれより良い収率で抽出され得る。したがっていくつかの実施形態は、クロマトグラフモジュールの一回の処理運転後で極めて優れた収率と高い純度の両方を可能にする。

本発明のいくつかの実施形態は、合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドなどの目的生体高分子の精製を自動化するために利用される。精製される目的材料の所望の量に応じて、過負荷条件の下で様々なカラムサイズが使用される。

以下に、本発明のいくつかの実施形態による、目的化合物精製のいくつかの例示的な実施例が説明される。これらの実施例は、本発明の用途を限定するためのものではない。代替の実施は、分離技術の分野の技術者には明らかであろう。以下の例示的な実施例は、以下に説明する試料、材料、および機器によって取得された。

試料−合成２５量体のホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチド（マサチューセッツ州ケンブリッジのＨｙｂｒｉｄｏｎ，Ｉｎｃ．から入手可能）および合成ペプチド（マサチューセッツ州ボストンのＣｅｌｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓおよびカリフォルニア州ダブリンのＳｙｎＰｅｐから入手可能）。

溶媒−オリゴヌクレオチドに対して、ｐＨ８．３に調整された１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）および８．６ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を含む溶媒移動相Ａ、ならびに１００％メタノール（ＭｅＯＨ）を含む溶媒移動相Ｂ。ペプチドに対して、水中に０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む溶媒移動相Ａ、ならびにアセトニトリル（ＡＣＮ）内に０．０８％ＴＦＡを含む溶媒移動相Ｂ。

クロマトグラフ分離−２９９６光ダイオードアレー（ＰＤＡ）検出器を装備するＣＡＰＬＣ分離モジュールを有するＨＰＬＣ（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）によってキャピラリ分離が実施された。分析用の分離は、２９９６ＰＤＡ検出器を装備するＡＬＬＩＡＮＣＥバイオ分離システム（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）で行われた。

質量分析−ＣＡＰＬＣシステムから溶出するオリゴヌクレオチドの分析に対して、分光分析がＭＩＣＲＯＭＡＳＳ ＬＣＴ（商標）質量分析計（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）で行われ、ＡＬＬＩＡＮＣＥバイオ分離システムから溶出するペプチドの分析に対してＭＩＣＲＯＭＡＳＳ ＺＱ（商標）シングル四重極質量分析計（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）で行われた。

カラム：それぞれ１．０ｍｍ×５０ｍｍの内径および長さ寸法を有するＸＴＥＲＲＡ Ｃ１８カラム、および２．５μｍの吸着剤粒子サイズが、いくつかのオリゴヌクレオチドの分離のために使用された。２．１ｍｍ×１５０ｍｍの内径および長さ寸法を有するＡＴＬＡＮＴＩＳ ｄＣ１８カラム、および５μｍの吸着剤粒子サイズが、いくつかのペプチドの分離のために使用された。４．６ｍｍ×１００ｍｍの内径および長さ寸法を有するＡＴＬＡＮＴＩＳ ｄＣ１８カラム、および５μｍの吸着剤粒子サイズが、いくつかのペプチドの予備精製のために使用された。（全てのカラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）。

図２ａは、４つの異なる試料負荷（１μｇ、１０μｇ、２５μｇ、および１００μｇ）に対応する、２５量体ＰＳオリゴヌクレオチドの分離から取得された４つのＵＶクロマトグラム（２６０ｎｍ波長吸収、時間および強度の座標系は任意単位）を示す。この分離は、イオン対逆相ＨＰＬＣによって取得された。溶媒グラジェント条件は、以下のとおりであった。移動相Ｂの１分間の間の０から１３％の直線グラジェントに続く、移動相Ｂの２８分間の１３から２０％の直線グラジェント。カラム内径は１ｍｍ、温度は６０℃、溶媒流量は２３．６μＬ／分であった。

図示のように、ＰＳオリゴヌクレオチドのクロマトグラフのピークのＵＶ検出は、特に１００μｇ負荷のところで、増加する質量負荷によって飽和になった。例えば１００μｇ負荷に対して、ＵＶクロマトグラムは試料化合物の置換波が形成されているが、分離された化合物間のどこに境界が存在するのか、あるいは境界が存在するか否かが、明瞭に示されていない。

次に図２ｂを参照すると、質量分析データは、化合物の良好な分離および目的化合物に対する適切な収集窓の両方の比較的明瞭な指示をもたらしている。図２ｂは、図２ａの１００μｇ負荷試料の３つの化合物（２５量体、２４量体、および２３量体）に対するエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルイオンクロマトグラムを示す（参考までに、図２ｂは図２ａからのＵＶクロマトグラムも含む）。このイオンクロマトグラムは、置換列がカラムから溶出するとき、数分間の時間にわたる一連の質量分析スキャンを収集することによって取得された。各スキャンは、１秒間３４０Ｄａから１５００Ｄａの質量対電荷比にわたりスキャンすることによって収集された。

図示のように、３つの化合物はわずかに異なる保持時間を有する。しかしながらこの化合物は、質量分析データによって観測できるように、過負荷試料および溶媒グラジェントの両方にもかかわらず、物理的に（かつ時間的に）良く分離されたままである。しかしながら上記で説明したように、この化合物は、ＵＶクロマトグラムでは分離が不十分である。したがって、主要な合成不純物例えば２４量体および２３量体のない収集が望ましいとき、質量分析データがＵＶ吸収データとは対照的に、例えば分離目的のための溶出する２５量体化合物の正確な識別に適している。

この実施例で示すように、いくつかの試料種類の密接に関連する化合物は、本質的に接近するＵＶ吸収ピークを有する。ある場合には、そのような試料化合物に対して、それらの関連するＵＶピークは、それらの密接な接近に起因して依然としてオーバーラップして現れる比較的はっきりした境界を有するであろう。しかしながら質量分析データは、それらの質量差に応答してこれらの化合物を容易に区別する。

したがって、いくつかの従来型の置換クロマトグラフ方法と対照的に、目的化合物はカラムから溶出させられ、別の置換剤材料の使用なしで置換列内で隣接する化合物からの良好な分離を保持する。

図３ａ、３ｂおよび３ｃは、それぞれ２μｇ、２００μｇ、および１０００μｇの試料負荷を有する合成ペプチド分離から取得されたＵＶ吸着クロマトグラム（２２０ｎｍ波長）および質量スペクトルイオンクロマトグラムを示す。この試料は、１８７３．２Ｄａの質量対電荷比（ｍ／ｚ）値（二重荷電＝９３７．１ｍ／ｚ）の目的ペプチドおよびｍ／ｚ＝７５８．１Ｄａのところに近接して溶出する合成不純物を有する、ＷＬＴＧＰＱＬＡＤＬＹＨＳＬＭＫのペプチド配列（ＮからＣ終端まで）を有していた。

分離は、内径２．１ｍｍを有するカラムを含む、上記で説明した分析分離機器によって行われた。溶媒グラジェントは以下のパラメータを有していた：移動相Ｂの３０分間に対し１８％から４２％までの直線グラジェント、および０．２ｍＬ／分の流量。温度は室温であった。質量スペクトルデータは、２．２秒のスキャン時間で３００Ｄａから２５００Ｄａまでのｍ／ｚ範囲をスキャンすることによって取得された。約３０分の溶出時間にわたり取られた一連のスペクトルは、時間にわたり溶出する目的物および不純物の濃度と関連する図示の強度対時間曲線をもたらした。

この実施例の２μｇ、２００μｇ、および１０００μｇの試料負荷は、それぞれ分析注入すなわち過負荷閾値より少ない状態、半予備注入すなわち閾値に近い状態、および過負荷状態と関連する。増加する負荷と関連する減少する保持時間および増加するピーク幅は、過負荷閾値に到達し超えたときの置換列の形成を示す。

図示のように、過負荷状態に対して、質量分析データは目的物および不純物がグラジェント溶出の下で良く分離されたままであることの明瞭な指示をもたらしている。上記で説明したこのデータは、本発明のいくつかの実施形態では、分離の目的物および／または他の化合物の収集を始動させるために応答的に使用される。例えば、図３ｃを再び参照すると、目的質量分析ピークの上昇する縁部は、ある場合に目的物の収集を始動させるために、かつ／または目的質量分析ピークの下降する縁部は目的物の収集を中止するために使用される。別法として、例えば、不純物ピークの観測された端部は、目的物の収集を始動させるために使用される。

上記で説明した方法で、目的物は一回のクロマトグラフ分離プロセスの後で、例えば約９５％から９８％または９９％またはそれ以上の純度を有して収集される。さらに本発明のいくつかの実施形態は、分光データに応答して、分離の１つまたは複数の目的化合物および／または他の化合物の自動化された収集を可能にする。

次に図４および図５を参照して、自動化された精製システムの実施例が説明される。所望の分離化合物の収集を始動させるための質量分析データの使用による自動化の利用を介して、多数の試料が効率的に処理される。例えば、質量分析計は、試料内の目的物の期待される分子量を検出し、その期待される分子量の検出に応答して精製された目的物の収集を指示するように構成される。

図４は、本発明の一実施形態による、精製システム４００の実施形態のブロック図である。このシステムは、クロマトグラフモジュール４１０、質量分析計モジュール４２０、制御ユニット４３０、溶出液流量制御ユニット４４０、希釈剤供給部４５０、および収集ユニット４６０とを含む。

溶出液流量制御ユニット４４０は、クロマトグラフ構成要素４１０から溶出液を受け取り、この溶出液の部分を収集モジュール４６０および質量分析計モジュール４２０に導く。溶出液流量制御ユニット４４０は、希釈液を質量分析計モジュール４２０に導かれる溶出液の部分と混合することができるように、希釈剤供給部とも流体連通している。

クロマトグラフモジュール４１０は、カラムベースの機器などの知られた機器を含む、任意の適切なクロマトグラフ機器を含む。適切なカラムには、クロマトグラフ技術の技術者に知られたカラムが含まれる。カラムは、例えば金属または絶縁材料から形成することができる。適切な材料には、鋼、溶融シリカ、または裏張りされた材料などの知られた材料が含まれる。カラムは、直列および／または並列の構成で配設された２つ以上のカラムを含むことができる。例えばこのカラムは、キャピラリカラムであり、複数のキャピラリチューブを含むことができる。

制御ユニット４３０は、データ通信分野で知られているものなどの有線および／または無線手段を介して、システム４００の他の構成要素とデータ通信する。この制御ユニット４３０は、例えば質量分析計モジュール４２０からプロセスデータを受け取り、制御信号を他の構成要素、例えば流量制御ユニット４４０に供給する。制御ユニット４３０は、精製システム４００による試料精製の自動化を支持するように構成される。様々な例示的な実施形態では、この制御ユニット４３０は、ソフトウエア、ファームウェア、および／または（例えば、特定用途向け集積回路などの）ハードウエアによって実施され、所望の場合、ユーザーインターフェイスを含む。制御ユニット４３０は記憶構成要素を含み、かつ／または記憶構成要素と通信する。

制御ユニット４３０の適切な組込み物には、例えば、マイクロプロセッサなどの１つまたは複数の集積回路が含まれる。いくつかの代替実施形態では、単一の集積回路またはマイクロプロセッサは、制御ユニット４３０およびシステム４００の他の電子部分を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサが、制御ユニット４３０の機能を可能にするソフトウエアを実施する。いくつかの実施形態では、このソフトウエアは汎用機器上で、および／または本明細書で説明した機能専用の専門のプロセッサで作動するように設計される。

システム４００のいくつかの実施では、この制御ユニット４３０は、制御ユニット４３０および／またはシステム４００の他の部分との相互作用を支持するためのユーザーインターフェイスを含む。例えば、このインターフェイスは、ユーザーから制御情報を受け取り、システム４００に関する情報をユーザーに供給するように構成される。このユーザーインターフェイスは、例えばシステム制御パラメータを設定するため、かつ／またはユーザーに診断またはトラブルシューティング情報を供給するために使用される。一実施形態では、このユーザーインターフェイスは、システム４００と作動環境現地にまたは作動環境から遠隔にのいずれかに位置するユーザーとの間のネットワーク化される通信を可能にする。いくつかの実施でのこのユーザーインターフェイスは、ソフトウエアを改変し最新のものにするために使用される。

流量制御ユニット４４０は、溶出液の全部または一部分を収集モジュール４６０および／または質量分析計モジュール４２０に導くように構成される。例えば、試料の置換列の溶出中、溶出液の少部分、例えば容積で約１％が流量制御ユニット４４０によって質量分析計モジュール４２０に導かれる。次いで、質量分析がこの迂回された溶出液に対し行われ、所望の目的化合物のｍ／ｚ値の検出に応答して、制御ユニット４３０が流量制御ユニット４４０に溶出液を収集モジュール４６０に導くように指示し、かつ／または収集モジュール４６０に溶出液の収集を開始するように指示する。

本発明の一実施形態では、この制御ユニットは、実行されるとき本明細書で説明した方法のうちの任意の１つを実施させる指示を記憶させるための記憶装置を含む。例えば一実施形態では、この指示は、システム４００にさらなる人間の介入なしに以下のステップを実施させる：試料の過負荷量を注入するステップ；時間で変化する組成を有する溶媒を流すステップ；および溶出液の一部分と関連する質量分析データに応答して、目的材料を収集するステップ。

本明細書で提供される例示的な実施形態の記載を考慮すると、分離分野の技術者には、目的化合物の収集の自動制御を行うための本発明の他の実施形態に制御ユニットの様々な他の構成および実施を使用することができることは明らかであろう。

本発明の他の実施形態によるいくつかの特定の、例示的な移動相および関連するグラジェントが本明細書で説明されているが、他の適切な移動相およびグラジェントが代替プロセスで使用される。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、移動相は質量分析とのそれらの適合性に対して選択される。いくつかの溶媒は直接的に適合性があり、質量分析に先立ち希釈を全く必要としない。その他は間接的に適合性があり、質量分析に先立っていくらかの希釈を必要とする。例えば、希釈なしでは、いくつかの溶媒は質量分析計の検出感度を減少させる。

直接的に適合性のある溶媒の一例は、ＡＣＮ中の０．０８％ＴＦＡの移動相Ｂと組み合わされた、水中の０．１％ＴＦＡの移動相Ａである。この溶媒は、例えばペプチド試料を分離するために、本発明のいくつかの実施形態で使用される。

間接的に適合性のある溶媒の一例は、ＭｅＯＨの移動相Ｂと組み合わされた、ＨＦＩＰおよびＴＥＡを含む移動相Ａである。この場合溶出液の一部分は、質量分析に先立ち例えば１０倍に希釈されるのが有利である。この溶媒は、例えばオリゴヌクレオチド試料を分離するために、本発明のいくつかの実施形態で使用される。

希釈剤は、例えば質量分析計との改善される適合性をもたらすように選択される。知られた材料を含む任意の適切な材料を希釈剤として使用することができる。例えば、１つの希釈剤は約５０％ＡＣＮおよび約５０％の水を含む。より一般的には、いくつかの実施形態では、希釈剤は約２０％から約５０％の有機化合物および約５０％の水を含む。

次に図５を参照して、自動分析の一例が説明される。図５は、図３ａ、３ｂ、および３ｃと関連する合成ペプチドの２０ｍｇ負荷から取得されたＵＶ吸着クロマトグラム（２２０ｎｍ波長、強度の単位は任意）および質量スペクトルイオンクロマトグラムを図示する。目的ペプチドに対する１つおよび試料不純物に対する２つの、質量分析によって取得された３つのクロマトグラムが示されている（強度単位は任意）。

この分離は、内径４．６ｍｍを有するカラム内で行われた。溶媒グラジェントは、１分間１０％移動相Ｂのところの最初の保持を有し、その後、溶媒の移動相Ｂの組成が９０分無処理中に１０％から５０％に増加させられた直線グラジェントが続いた。溶媒流量は１．０ｍＬ／分であった。このカラムは、室温で保持された。目的ペプチドに対する分別物収集は、１８７４．０Ｄａの質量重量の選択されたイオン監視によって始動された。収集された部分の再注入は、最初に収集された部分は約９８％の純度を有することを示し、一方、元の試料内の目的物の純度は約８６％であった。

本明細書で説明されるものの変形形態、改変形態および他の実施は、特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者は気付くであろう。例えば本発明の様々な実施形態は、限定ではなく、薬剤、抗原性薬剤、親和性標識（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）、診断薬（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＲＮＡｉ、オリゴプローブ（ｏｌｉｇｏ−ｐｒｏｂｅ）、およびフェニル基試料などの小さな分子量の試料を含む様々な材料の精製に適している。したがって、本発明は、前述の例示的な説明ではなく、その代わりに特許請求の範囲の趣旨および範囲によって定義されるべきである。

本発明の一実施形態による、グラジェントを有する、流れる溶媒に応答してカラムを通り移動している過負荷試料を含有するクロマトグラフカラムの概略図である。 図１ａと関連する、分離された化合物の方形波濃度プロファイルおよび溶媒グラジェントプロファイルの図である。 図１ｂの溶媒グラジェントプロファイルと関連する、溶媒組成対時間のグラフである。 本発明の一実施形態による、４つの異なる試料負荷に対応するオリゴヌクレオチド試料の分離から取得された４つのＵＶクロマトグラムのグラフである。 図２ａと関連する１００μｇ試料の３つの化合物に対するＵＶクロマトグラムおよび質量スペクトルイオンクロマトグラムのグラフである。 ２μｇの試料負荷を有する合成ペプチド分離から取得されたＵＶ−吸着クロマトグラムおよび質量スペクトルイオンクロマトグラムのグラフである。 ２００μｇの試料負荷を有する合成ペプチド分離から取得されたＵＶ−吸着クロマトグラムおよび質量スペクトルイオンクロマトグラムのグラフである。 １０００μｇの試料負荷を有する合成ペプチド分離から取得されたＵＶ−吸着クロマトグラムおよび質量スペクトルイオンクロマトグラムのグラフである。 本発明の一実施形態による、精製システムの一実施形態のブロック図である。 図３ａ、３ｂ、および３ｃと関連する合成ペプチドの２０ｍｇ負荷から取得されたＵＶクロマトグラムおよびマススペクトルイオンクロマトグラムのグラフである。

Claims (37)

1. クロマトグラフ導管内に過負荷量の試料を注入するステップであって、それに応答して、少なくとも１つの目的化合物が複数の化合物のうちの隣接する化合物から実質的に分離される置換列を形成させるステップと、
   導管を通して、時間で変化する組成を有する溶媒を流すステップであって、それに応答して、少なくとも１つの目的化合物が実質的に隣接する化合物から分離されたままである間に、少なくとも１つの目的化合物を含む溶出液を導管の出口オリフィスから溶出させるステップとを含む、複数の化合物を含む試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出する方法。
2. 溶出液の一部分から、少なくとも１つの目的化合物と隣接する化合物との間の境界を識別する分光データを取得するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 分光データを取得するステップが質量分析データを取得するステップを含む、請求項２に記載の方法。
4. 識別された境界に応答して少なくとも１つの目的化合物を収集するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
5. 収集された少なくとも１つの目的化合物が少なくとも約９８％の純度を有する、請求項４に記載の方法。
6. 収集された少なくとも１つの目的化合物が少なくとも約８０％の収率を有する、請求項４に記載の方法。
7. 収集された少なくとも１つの目的化合物が少なくとも約９５％の純度を有する、請求項６に記載の方法。
8. 取得するステップが、少なくとも１つの目的化合物と関連する収集窓を識別するステップを含み、かつ識別された収集窓に応答して少なくとも１つの目的化合物を収集するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
9. 溶媒を流すステップが、時間で変化する組成に少なくとも１つの第１の直線グラジェントを有するようにさせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
10. 溶媒を流すステップが、時間で変化する組成に直線グラジェントに続いて第２の直線グラジェントを有するようにさせるステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 溶媒を流すステップが、過負荷試料を注入する間、時間で変化する組成にアイソクラテックな部分を有するようにさせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
12. 溶出液の一部分を質量分析計に導くステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 溶出液の一部分が溶出液の約５％未満を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 過負荷量が、約１．０ｍｇ／ｍｍ^２より大きな導管断面積に対する質量比に関連する、請求項１に記載の方法。
15. 置換列が自己置換列である、請求項１に記載の方法。
16. クロマトグラフ導管が約５μｍ未満のサイズを有する吸着剤粒子を格納する、請求項１に記載の方法。
17. 吸着剤粒子が、約１０ｎｍから約３０ｎｍの範囲内の孔サイズを有する、請求項１に記載の方法。
18. 過負荷量が、少なくとも１つの目的化合物および隣接する化合物がＵＶ吸収分光分析によって十分に分離することができないように、置換列内の少なくとも１つの目的化合物にＵＶ検出器の感度を飽和させるのに少なくとも十分である、請求項１に記載の方法。
19. 溶媒が質量分析計と十分に適合性のある、請求項１に記載の方法。
20. 溶出液の一部分に対して質量分析を行うステップに先立ち、溶出液の一部分を希釈するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 溶媒が、水を含む第１の移動相、およびアセトニトリルを含む第２の移動相を含む、請求項１９に記載の方法。
22. 第１の移動相および第２の移動相の各々がトリフルオロ酢酸をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 溶媒を流すステップが、時間で変化する組成を移動相Ｂの約１５％と約５０％の間で変化させるステップを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 溶媒がヘキサフルオロイソプロパノールおよびトリエチルアミンを含む移動相Ａ、およびＭｅＯＨを含む移動相Ｂを含む、請求項１９に記載の方法。
25. 溶媒を流すステップが、時間で変化する組成を移動相Ｂの約０％と約２５％の間で変化させるステップを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 試料が合成生体高分子を含む、請求項１に記載の方法。
27. 試料がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
28. 試料がペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
29. 隣接する化合物が反応副生品を含む、請求項１に記載の方法。
30. 少なくとも１つの目的化合物が隣接する化合物より親水性である、請求項１に記載の方法。
31. 過負荷量の試料を注入した後で、クロマトグラフ導管内に置換剤材料を注入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
32. クロマトグラフ導管内に過負荷量の試料を注入するステップであって、それに応答して、少なくとも１つの目的化合物が複数の化合物のうちの隣接する化合物から実質的に分離される置換列を形成させるステップと、
    少なくとも１つの目的化合物が隣接する化合物から実質的に分離されたままである間に、少なくとも１つの目的化合物を含む溶出液を導管の出口オリフィスから溶出させるステップと、
    溶出液の一部分から、少なくとも１つの目的化合物と隣接する化合物との間の境界を識別する質量分析データを取得するステップと、
    識別された境界に応答して少なくとも１つの目的化合物を収集するステップとを含む、複数の化合物を含む試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出する方法。
33. 収集された少なくとも１つの目的化合物が少なくとも約９８％の純度を有する、請求項３２に記載の方法。
34. クロマトグラフモジュールと、
    少なくとも１つの目的材料を含む溶出液の一部分をクロマトグラフモジュールから受け取るようにクロマトグラフモジュールと流体連通する質量分析モジュールと、
    少なくとも１つのプロセッサおよび複数の指示を記憶するための少なくとも１つの記憶装置を備える、クロマトグラフモジュールおよび質量分析モジュールと連絡している制御ユニットであって、少なくとも１つのプロセッサによって実施されるとき、
    過負荷量の試料をクロマトグラフモジュールのクロマトグラフ導管内に注入するステップであって、それに応答して、少なくとも１つの目的化合物が複数の化合物のうちの隣接する化合物から実質的に分離される置換列を形成させるステップと、
    時間で変化する組成を有する溶媒を導管を通して流すステップであって、それに応答して、少なくとも１つの目的化合物を隣接する化合物から実質的に分離されたままである間に、少なくとも１つの目的化合物を含む溶出液を導管の出口オリフィスから溶出させるステップと、
    溶出液の一部分と関連する質量分析データに応答して、少なくとも１つの目的化合物を収集するステップとを実施させる制御ユニットとを備える、複数の化合物を含む試料から少なくとも１つの目的化合物を抽出する装置。
35. 溶出液の第２の部分を受け取るために、クロマトグラフモジュールと流体連通する収集ユニットをさらに含む、請求項３４に記載の装置。
36. 溶出液の一部分を質量分析モジュールに、かつ溶出液の第２の部分を収集モジュールに導くように、クロマトグラフモジュールと流体連通する流量制御ユニットをさらに備える、請求項３５に記載の装置。
37. 希釈剤を溶出液の一部分と混合させるために流量制御ユニットと流体連通する希釈剤供給部をさらに備える、請求項３６に記載の装置。

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