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VERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
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Die Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung Seriennummer 60/674,051, die am 22. April 2005 eingereicht worden ist.
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TECHNISCHES GEBIET
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Die Erfindung betrifft im Allgemeinen die Chromatographie und insbesondere Instrumente und Verfahren für auf Chromatographie basierende Trennungen von Targets und Nebenproduktmaterialien.
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HINTERGRUNDINFORMATION
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Bei zahlreichen wissenschaftlichen oder industriellen Anwendungen werden Verbindungen für ein Testen, eine Analyse, oder die Erzeugung größerer Volumen aufbereitet bzw. aufgereinigt (purified). Die Aufbereitung bzw. Aufreinigung (purification) einer Verbindung beinhaltet das Trennen einer gewünschten Verbindung aus einem Gemisch, das zusätzliche Verbindungen und/oder Verunreinigungen enthält.
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Bei der Chromatographie handelt es sich um ein Verfahren zum Fraktionieren eines Gemisches, um Verbindungen des Gemisches zu trennen. Manchmal wird die Chromatographie für die Aufbereitung bzw. Aufreinigung verwendet. Bei der Flüssigkeitschromatographie beispielsweise wird eine Probe, die eine Anzahl von zu trennenden Verbindungen enthält, in einen Fluidstrom (d. h. ein Lösungsmittel) injiziert und durch eine chromatographische Säule hindurchgeleitet. Die Säule trennt das Gemisch in seine Komponentenbestandteile aufgrund der unterschiedlichen Retention der Komponentenbestandteile in der Säule. Konzentrationspeaks, die mit den getrennten Verbindungen im Zusammenhang stehen, treten typischerweise nacheinander bzw. in einer Sequenz aus der Säule aus.
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Die chromatographischen Peaks werden oftmals hinsichtlich ihrer Retentionszeit charakterisiert, wobei es sich um den Zeitpunkt relativ zu dem Zeitpunkt der Injektion handelt, zu dem das Zentrum des Bandes sich am Detektor vorbeibewegt. Bei zahlreichen Anwendungen wird die Retentionszeit eines Peaks dazu verwendet, um die Identität des eluierenden Analyten auf der Grundlage von ähnlichen Analysen abzuleiten, bei denen Standardmittel oder Kalibrierungsmittel verwendet werden. Das Vorhandensein der getrennten Substanzen wird oftmals durch die Verwendung eines Refraktometers oder eines Absorptionsmeters unter Einsatz von UV-Licht nachgewiesen.
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Ein typisches Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (high performance liquid chromatography system; HPLC system) umfasst eine Pumpe zum Fördern eines Fluids (eine ”mobile Phase”) mit einer geregelten Flussrate und Zusammensetzung, eine Injektionseinrichtung bzw. einen Injektor, um eine Probenlösung in die fließende mobile Phase einzubringen, ein röhrenförmiges Säulengehäuse, das ein Packungsmaterial oder ein Sorbens (eine ”stationäre Phase”) enthält, sowie einen UV-Detektor, um das Vorhandensein einer Probe und die Menge der Probenverbindungen in der mobilen Phase zu registrieren. Das Vorhandensein einer bestimmten Verbindung in der mobilen Phase, die aus der Säule austritt, wird sodann durch das Messen von Veränderungen von physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Eluenten detektiert. Antwortpeaks, die dem Vorhandensein von jeder der Verbindungen der Probe entsprechen, können beobachtet werden und aufgezeichnet werden, indem das Detektorsignal als Funktion der Zeit aufgezeichnet wird.
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Für eine Targetaufbereitung ist es oftmals wünschenswert, die Targetverbindung mit einem optimalen Reinheitsgrad wiederzugewinnen und die größtmögliche Menge einer Probe bei jedem Lauf zu separieren, um Laborkosten, Laufzeitkosten und andere Kosten zu verringern. Typische Chromatographiesysteme weisen jedoch Probenladungs- bzw. Probenchargenbeschränkungen auf. In einigen Fällen führt eine Verwendung von überladenen Proben (overloaded samples) zu größeren Verarbeitungsvolumina. Das Überladen bringt jedoch typischerweise eine größere Komplexität bei der Extraktion einer Targetverbindung durch die Verwendung eines Verdrängungsmaterials (displacer material) oder einer segmentierten Säule mit sich. Überdies weist das extrahierte Target oftmals einen Reinheitsgrad auf, der geringer als der erwünschte ist.
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Die internationale Patentanmeldung
WO 01/00642 A1 beschreibt ein Verfahren zum Reinigen eines Oligonukleotids oder mehrerer Nukleotide. Das Verfahren umfasst das Laden des Oligonukleotids auf die stationäre Phase einer Anionenaustausch-Säule und das Verdrängen des Oligonukleotids von der stationären Phase durch ein anionisches Verdrängungsmittel mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000. Das anionische Verdrängungsmittel wist eine höhere Affinität zu der stationären Phase auf als das Oligonukleotid. Das Molekulargewicht des Verdrängungsmittels beträgt weniger als etwa 5.000, wobei bevorzugt ist, dass das Molekulargewicht des Verdrängungsmittels weniger als 2.500 ist. Eine bevorzugte Zusammensetzung für das Verdrängungsmittel ist eine substituierte oder nicht-substituierte aromatische Verbindung, die mindestens einen anionischen Substituenten aufweist. Alternativ ist die Zusammensetzung für das Verdrängungsmittel eine substituierte oder nicht-substituierte aliphatische Verbindung, die mindestens einen anionischen Substituenten aufweist, wobei bevorzugte anionische Substituenten Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat-, Phosphonat- und Carboxylatgruppen sind. Weiter bevorzugte anionische Substituenten sind Sulfonatgruppen, und eine bevorzugte aromatische Verbindung ist eine substituierte oder nicht-substituierte, aromatische Verbindung, die mindestens einen anionischen Substituenten aufweist.
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Das
US Patent Nummer 6 576 134 B1 beschreibt ein Verfahren zur probenverdrängungschromatographischen Trennung. Das Verfahren umfasst das Aufgeben einer Mehrkomponentenprobe an einem Ende eines Chromatographiebettes, das ein stationäres Phasenmaterial mit einer Affinität für Komponenten der Probe aufweist. Ferner umfasst das Verfahren das Bewirken, dass die Komponenten der Probe entlang des Chromatographiebettes verteilt werden, und zwar indem eine nicht-eluierende mobile Lösungsphase über das Bett geleitet wird, sowie das Rückgewinnen einer gewünschten Komponente der Probe aus mindestens einem Abschnitt des Chromatographiebettes. Die Probenkomponenten werden auf das Chromatographiebett in einer nicht-homogenen Weise appliziert, derart dass die Konzentration mindestens einer Komponente mit relativ geringer Affinität für das stationäre Phasenmaterial während eines früheren Abschnitts der Probenaufgabe erhöht wird, und/oder die Konzentration mindestens einer Komponente mit relativ hoher Affinität für das stationäre Phasenmaterial während eines späteren Abschnitts der Probenaufgabe erhöht wird.
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Das
DE Patent Nummer 694 16 103 T2 beschreibt ein Verfahren zur Aufreinigung eines bestimmten Hemoglobins aus einer Rohlösung, die zusätzlich Protein-Verunreinigungen enthält. Gemäß dieses Verfahrens wird die Rohlösung in einem ersten chromatographischen Schritt auf eine Chromatographiesäule aufgetragen und einer Chromatographie unterzogen, und zwar entweder unter Anionenaustausch-Bedingungen, oder unter Kationenaustausch-Bedingungen. In dem ersten chromatographischen Schritt wird die Rohlösung so weit aufgetragen, bis die Säule mit der Hemoglobin-Spezies und Komponenten mit höherer Affinität vollständig beladen ist, wobei eine Überbeladung der Säule erfolgt und die Hemoglobin-Spezies anschließend von der Säule entfernt wird. Der so Hemoglobin-Spezies enthaltende Ausfluss aus dem ersten Schritt wird in einem zweiten Schritt auf eine Chromatographiesäule aufgetragen und einer Chromatographie unter den für den ersten Schritt nicht gewählten Anionenaustausch-Bedingungen oder Kationenaustausch-Bedingungen unterzogen. Der Ausfluss wird in dem zweiten chromatographischen Schritt so weit aufgetragen, bis die Säule mit der Hemoglobin-Spezies und Komponenten höherer Affinität unter den Bedingungen des zweiten Schritts vollständig beladen ist, um eine Überbeladung der Säule zu bewirken und infolgedessen eine Entfernung der Hemoglobin-Spezies von der Säule zu bewirken.
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Die internationale Patentanmeldung
WO 2004/076681 A2 beschreibt einen automatisierten Mechanismus zum raschen Analysieren unerwarteter Metaboliten in einem Metaboliten-Analyse-System. Ein erster Durchlauf wird mit einer Kontrollprobe durchgeführt und sodann wird die Kontrollprobe analysiert, um eine Ausschlussliste von unerwünschten Probenkomponenten zu erzeugen. Anschließend wird ein Durchlauf mit einer einzelnen Analytenprobe durchgeführt und unter Verwendung eines speziellen Programms wird die Ausschlussliste verwendet, die die unerwünschten Metaboliten enthält, um dynamisch Daten in Bezug auf Komponenten herauszufiltern, die sowohl in der Kontrollprobe als auch in der Analytenprobe vorhanden sind. Die übrigen Komponenten in der Analytenprobe werden auf unerwartete Metaboliten hin untersucht.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfindung basiert zum Teil auf der Erkenntnis, dass eine oder mehrere Verbindungen wirksamer von einer chromatographischen Probe mittels der Verwendung einer Gradientenmodus-Elution in Kombination mit einer Verdrängungstrennung bzw. Verschiebungstrennung (displacement separation) getrennt bzw. separiert werden können, d. h. die Verwendung einer Lösungsmittelzusammensetzung, die im Laufe der Zeit variiert, in Kombination mit Bedingungen einer überladenen Probe. Einige vorteilhafte Ausführungsformen verwenden außerdem eine Probenverdrängung (sample displacement), d. h. kein separates Verdrängungsmaterial wird den Probenverbindungen hinzugefügt. Weitere Ausführungsformen verwenden außerdem ein Massenspektrometer oder einen anderen geeigneten Detektor, um eine gute Auflösung der eluierenden Verbindungen zu liefern, um eine genaue Beobachtung von Grenzen zwischen den eluierenden Probenverbindungen zu ermöglichen. Einige Ausführungsformen der Erfindung stellen Extraktionsfenster bereit, die ein wirksames Sammeln von Targetverbindungen mit einem verhältnismäßig hohen Reinheitsgrad nach einem einzelnen Durchgang durch eine Chromatographiesäule erlauben.
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Somit verbleiben in einigen Ausführungsformen die Grenzen zwischen Verbindungen in einer Selbstverdrängungsfolge (self-displacement train) im Wesentlichen unterscheidbar, und zwar obwohl die Zusammensetzung des fließenden Lösungsmittels einen Zusammensetzungsgradienten aufweist. In einigen dieser Ausführungsformen wirkt das Lösungsmittel als ein Verdrängungsmittel (displacer), um die getrennten Verbindungen durch eine Säule zu treiben. Somit ist es im Gegensatz zu einigen bekannten Verfahren beispielsweise nicht notwendig, dass ein separates Verdrängungsmaterial oder trennbare Säulenabschnitte oder mehrere Säulen verwendet werden, um eine separierte Targetverbindung zu extrahieren.
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Bei vielen dieser Ausführungsformen würde eine UV-Detektion typischerweise eine unzureichende Auflösung haben, um Verbindungsgrenzen bei überladenen Probenbedingungen (overloaded sample conditions) hinreichend zu unterscheiden. Diese Ausführungsformen verwenden jedoch eine geeignete Analysetechnik, wie beispielsweise Massenspektrometrie, um eine Grenze zwischen Verbindungen in einer Verdrängungsfolge akkurat zu identifizieren.
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Der beobachtete Beginn eines Peaks im Massenspektrum für eine gewünschte Probenverbindung wird in einer beispielhaften Ausführungsform dazu verwendet, um in Reaktion darauf das Sammeln der Targetverbindung zu beginnen. Gleichermaßen wird das Sammeln optionalerweise in Reaktion auf die Detektion des Endes des Peaks im Massenspektrum beendet, der anzeigt, dass die gewünschte Verbindung nicht länger eluiert wird.
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Demgemäß stellt eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren wenigstens einer Targetverbindung aus einer Probe bereit, die eine Vielzahl von Verbindungen enthält. Das Verfahren umfasst das Injizieren einer überladenen Menge der Probe in eine chromatographische Säule und das Leiten bzw. Fließen eines Lösungsmittels mit einer zeitabhängigen Zusammensetzung durch die Säule. In Reaktion auf die Injektion der Probe wird eine Verdrängungsfolge (displacement train) ausgebildet, in der die wenigstens eine Targetverbindung im Wesentlichen von einer benachbarten Verbindung der Vielzahl von Verbindungen getrennt ist. In Reaktion auf das Fließen des Lösungsmittels wird ein Eluent, einschließlich der wenigstens einen Targetverbindung, aus einer Ausgangsöffnung der Säule eluiert, während die wenigstens eine Targetverbindung im Wesentlichen getrennt von der benachbarten Verbindung verbleibt.
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Eine zweite Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Extrahieren wenigstens einer Targetverbindung aus einer Probe bereit. Das Verfahren umfasst das Injizieren einer überladenen Menge der Probe in eine chromatographische Säule, wodurch bewirkt wird, dass ein Eluent, einschließlich der wenigstens einen Targetverbindung, aus einer Ausgangsöffnung der Säule eluiert wird, das Gewinnen massenspektroskopischer Daten, die eine Grenze zwischen der wenigstens einen Targetverbindung und der benachbarten Verbindung identifizieren, sowie das Sammeln der wenigstens einen Targetverbindung in Reaktion auf die identifizierte Grenze. Die massenspektroskopischen Daten werden aus einem Teil des Eluenten gewonnen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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In den Zeichnungen bezeichnen die gleichen Bezugsziffern im Allgemeinen die gleichen Teile in den unterschiedlichen Ansichten. Ferner sind die Zeichnungen nicht notwendigerweise maßstabsgerecht, sondern im Allgemeinen werden die Prinzipien der Erfindung betont.
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1a zeigt ein schematisches Diagramm einer chromatographischen Säule, die eine überladene Probe enthält, die sich durch die Säule in Reaktion auf ein fließendes Lösungsmittel mit einem Gradienten bewegt, und zwar gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
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1b zeigt ein Diagramm eines Rechtecksignalkonzentrationsprofils von getrennten Verbindungen und ein Lösungsmittelgradientenprofil, das mit 1a im Zusammenhang steht.
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1c zeigt einen Graph der Lösungsmittelzusammensetzung gegenüber der Zeit, der mit dem Lösungsmittelgradientenprofil von 1b im Zusammenhang steht.
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2a zeigt einen Graph von vier UV-Chromatogrammen, die aus Trennungen einer Oligonukleotidprobe gewonnen worden sind und vier unterschiedlichen Probenladungen entsprechen, und zwar gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
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2b zeigt einen Graph eines UV-Chromatogramms und massenspektrometrischer Ionenchromatogramme für drei Verbindungen einer 100 μg-Probe, die mit 2a im Zusammenhang steht.
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Die 3a, 3b und 3c zeigen Graphen von UV-Adsorptionschromatogrammen und massenspektrometrischen Ionenchromatogrammen, die von Trennungen synthetischer Peptide erhalten worden sind und Probenladungen von 2 μg, 200 μg und 1000 μg aufweisen.
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4 zeigt ein Blockdiagramm einer Ausführungsform eines Aufbereitungssystems, das nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
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5 zeigt einen Graph eines UV-Chromatogramms und massenspektrometrischer Ionenchromatogramme, die mit einer 20 mg-Ladung eines synthetischen Peptids gewonnen worden sind und mit den 3a, 3b und 3c im Zusammenhang stehen.
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BESCHREIBUNG
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Die Nachsilbe ”mer” kennzeichnet in dieser Beschreibung ein Element einer Klasse, das sich mit anderen Elementen verbinden kann, um eine Polymerkette auszubilden, wie beispielsweise ein Dimer, ein Trimer, ein Dekamer, ein 30mer usw. Beispielsweise können Elemente der Klasse von Nukleotiden, wenn diese miteinander verbunden werden, ein Oligonukleotid ausbilden, und Elemente der Klasse von Peptiden können sich miteinander verbinden, um Polypeptide oder Proteine auszubilden.
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Der Begriff ”chromatographisches System” bezeichnet in dieser Beschreibung Ausrüstungsgegenstände zum Durchführen chemischer Trennungen. In diesen Systemen werden typischerweise Fluide unter Druck bewegt. Einige Ausführungsformen der Erfindung enthalten Chromatographiesystemmodule, die über Interface- bzw. Schnittstellen in fluider Kommunikation mit Massenspektrometern angeordnet sind. Diese Schnittstellen erzeugen manchmal getrennte Materialien in einer ionischen Form und bewahren diese auf und entlassen üblicherweise einen Fluidstrom, der die Ionen enthält, in eine Atmosphäre, wo der Strom vaporisiert bzw. verdampft wird und die Ionen in einer Öffnung des Massenspektrometers aufgenommen werden. Die Öffnung trennt typischerweise Niedrigdruckkammern des Massenspektrometers von einer Schnittstelle bei Atmosphärendruck.
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Der Begriff ”Ladekapazität” bezeichnet in dieser Beschreibung einen Schwellenwert des maximalen Volumens und/oder der maximalen Masse einer Probe, die in eine Säule geladen werden kann, ohne eine beträchtliche Peakverbreiterung und/oder die Ausbildung einer Verdrängungsfolge (displacement train) von getrennten Verbindungen und/oder den Verlust von UV-Detektorauflösung zu bewirken. Eine 'Verdrängungsfolge” (displacement train) bezeichnet in dieser Beschreibung die Gruppe von physikalisch getrennten, jedoch nur wenig beabstandeten oder überlappenden Verbindungen, die in Reaktion auf ein Überladen einer Probe in eine Säule ausgebildet werden; jede Verbindung in der Folge weist typischerweise eine gewisse Breite auf, die deren Menge in der Probe entspricht. Die Begriffe ”Selbstverdrängung” (self displacement) und ”Probenverdrängung” (sample displacement) bezeichnen in dieser Beschreibung die Verwendung einer überladenen Probe (overloaded sample), um eine Verdrängungsfolge ohne die Verwendung eines Verdrängungsmaterials zusätzlich zu der Probe und dem Lösungsmittel zu erzeugen, sowie um die Probenverbindung durch eine Säule zu treiben. Wie dies nachstehend beschrieben wird, liefern zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung eine verhältnismäßig gute Trennung von Verbindungen und eine massenspektrometrische Auflösung der Verbindungsgrenzen der Verdrängungsfolge.
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Der Begriff ”isokratischer Chromatographiemodus” bezeichnet in dieser Beschreibung die Verwendung einer Lösungsmittelzusammensetzung, die über die Zeit im Wesentlichen konstant bleibt. Während des isokratischen Chromatographiemodus werden Analyten in einigen Proben eluiert, während eine mobile Phase mit einer gleich bleibenden Konzentration durch eine Säule fließt.
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Der Begriff ”Gradientenmodus” der Chromatographie bezeichnet in dieser Beschreibung das Fließen einer Lösungsmittelzusammensetzung, die sich im Verlauf der Zeit ändert, und zwar typischerweise in Reaktion auf ein von einem Benutzer definiertes Profil. Ein Lösungsmittel weist eine Zusammensetzung auf, die beispielsweise ein Gemisch von zwei Lösungen ist, die hierin als die mobile Phase A und die mobile Phase B bezeichnet werden.
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Die Konzentrationen von Lösungen können, wie dies dem Fachmann wohlbekannt ist, als molare Lösungen ausgedrückt werden. Eine 1 M-Lösung ist beispielsweise eine Lösung von 1 M pro Liter. Gleichermaßen ist eine 1 mM eine Lösung von 1 mM pro Liter.
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Unter Bezugnahme auf die 1a, 1b und 1c wird ein Verfahren zum Extrahieren wenigstens einer Targetverbindung aus einer Probe, die eine Vielzahl von Verbindungen enthält, gemäß einer Ausführungsform der Erfindung beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Überladens (overloading) und die Verwendung eines fließenden Lösungsmittels mit einer variierenden Zusammensetzung, um eine Elution der getrennten Probe zu bewirken.
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1a zeigt eine schematische Darstellung einer chromatographischen Säule 110, die eine überladene Probe (overloaded sample) 120 enthält, die sich in Reaktion auf ein Lösungsmittel, das im Gradientenmodus fließt, durch die Säule 110 bewegt. Die Säule enthält ein Sorbens und beinhaltet eine Ausgangsöffnung 111, aus der Eluent aus der Säule austritt. Wie dargestellt, hat sich die überladene Probe getrennt und eine Selbstverdrängungsfolge (self displacement train) in der Säule 110 ausgebildet. Die Verdrängungsfolge 120 beinhaltet eine Targetverbindung 121 und Nicht-Targetverbindungen 122, 123, 124, bei denen es sich beispielsweise um Nebenproduktverbindungen handelt.
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1b zeigt ein Diagramm, das mit 1a im Zusammenhang steht und qualitativ ein Rechtecksignalzonenkonzentrationsprofil der getrennten Verbindungen der Probe sowie ein Konzentrationsgradientenprofil des Lösungsmittels als eine Funktion der Position entlang der Säule 110 illustriert. Das Diagramm zeigt die Selbstverdrängung der Probe (sample self displacement), bei der die schwächer zurückgehaltenen Verbindungen der Probe von dem chromatographischen Sorbens durch stärker zurückgehaltene Verbindungen verdrängt worden sind.
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Im Lichte der vorliegenden Beschreibung wird der Fachmann erkennen, dass das dargestellte Gradientenprofil lediglich qualitativ ist. Beispielsweise illustriert das Profil qualitativ einen Gradienten, der linear ist (mit einer konstanten Rate ansteigt), und zwar nach einer anfänglichen Periode eines isokratischen Lösungsmittelflusses. Bei einem bestimmten Zeitpunkt während der Verarbeitung kann jedoch die isokratische Lösungsmittelzusammensetzung entlang der gesamten Säule 110 bestehen, oder die Lösungsmittelzusammensetzung kann beispielsweise nahezu konstant entlang der Säule 110 sein, und zwar je nach der Flussrate und der Durchlaufdauer der Verdrängungsfolge 120 durch die Säule 110.
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1c zeigt einen Graph der Lösungsmittelzusammensetzung gegenüber der Zeit, der mit dem Lösungsmittelgradientenprofil von 1b im Zusammenhang steht. Wie dargestellt, ist die Zusammensetzung in dieser Ausführungsform anfangs isokratisch, die beispielsweise dazu verwendet wird, um die Probe in die Säule 120 zu injizieren, und die beispielsweise während der Ausbildung der Verdrängungsfolge 120 verwendet wird. Anschließend weist die Lösungsmittelzusammensetzung einen linearen Gradienten auf. Im Allgemeinen wird die Lösungsmittelzusammensetzung in dieser Beschreibung mittels eines Prozentsatzes einer Lösungsmittelkomponente von zwei oder mehr Lösungsmittelkomponenten ausgedrückt. Zahlreiche Lösungsmittelausführungsformen enthalten eine A-Phasenkomponente und eine B-Phasenkomponente. Für derartige hierin beschriebene Ausführungsformen wird die Lösungsmittelzusammensetzung mittels der B-Phasenkomponente ausgedrückt.
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Die 1a, 1b und 1c illustrieren ein Verfahren zum Extrahieren wenigstens einer Targetverbindung, wie beispielsweise der in 1a dargestellten Verbindung 121, aus einer Probe, die eine Vielzahl von Verbindungen 121, 122, 123, 124 enthält, und zwar gemäß einer Ausführungsform der Erfindung. Das Verfahren beinhaltet das Injizieren einer überladenen Menge der Probe in eine chromatographische Säule 110 und in Reaktion das Ausbilden einer Verdrängungsfolge 120, in der die wenigstens eine Targetverbindung 121 im Wesentlichen von einer benachbarten Verbindung 122, 123 der Vielzahl von Verbindungen 122, 123, 124 getrennt ist. Das Verfahren umfasst außerdem das Fließen eines Lösungsmittels mit einer zeitabhängigen Zusammensetzung durch die Säule 110, wobei in Reaktion darauf ein Eluent, der die wenigstens eine Targetverbindung 121 enthält, aus einer Ausgangsöffnung 111 der Säule 110 eluiert wird. Die wenigstens eine Targetverbindung 121 verbleibt im Wesentlichen von den benachbarten Verbindungen 122, 123 getrennt.
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Bei dem Verfahren wird jedwede geeignete chromatographische Technik eingesetzt, einschließlich beispielsweise Umkehrphasen-HPLC (reverse-phase HPLC) und/oder Ionenaustausch-HPLC (ion-exchange HPLC). Eine Säule ist beispielsweise eine chromatographische Säule mit einer Größe, die ausgewählt ist, eine gewünschte Produktionsrate zu ermöglichen. In Tabelle 1 sind Beispiele für geeignete Säulenabmessungen und Massenladungen dargestellt. Tabelle 1 zeigt eine Auflistung einiger geeigneter beispielhafter Massenladungen und Lösungsmittelflussraten für mehrere Säuleninnendurchmesser (column IDs). Tabelle 1
Säulen-ID (mm) | Massenladung (Überladung) | Lösungsmittelflussrate (ml/Min.) |
4,6 | 20 mg | 1 |
10,0 | 100 mg | 5 |
19,0 | 340 mg | 17 |
30,0 | 0,85 g | 43 |
50,0 | 2,4 g | 118 |
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Diese beispielhaften Werte sind nicht dazu gedacht, die Anwendung der Erfindung auf den Einsatz von Säulen einer bestimmten Größe und/oder auf Lösungsmittel mit einer bestimmten Flussrate zu beschränken. Wie dargestellt, liefert das Verfahren eine Steigerung von bis zu dem 20-fachen Probenvolumen oder mehr im Vergleich zu einigen bekannten Elutionschromatographieaufbereitungsverfahren.
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Der Lösungsmittelgradient wird aus einer Vielzahl geeigneter Lösungsmittelgradienten ausgewählt. Beispielsweise ist der Gradient in einer beispielhaften Ausführungsform linear und flach. In diesem Beispiel weist der Gradient eine graduelle Rampe auf, so dass zu jedem Zeitpunkt die Lösungsmittelzusammensetzung entlang der Länge der Säule nahezu konstant ist. Überdies wird in einigen Ausführungsformen anfänglich ein isokratisches Lösungsmittel verwendet, um die Probe in eine Säule zu injizieren und die Verdrängungsfolge getrennter Verbindungen auszubilden. Eine zeitabhängige Lösungsmittelzusammensetzung wird dann dazu verwendet, um zu bewirken, dass sich die Verdrängungsfolge durch die Säule bewegt und aus einem Säulenausgang eluiert wird.
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Einige geeignete Lösungsmittel und Gradientenprofile werden nachstehend detaillierter beschrieben. Die beschriebenen Lösungsmittel sind nicht dazu gedacht, die Anwendung der Erfindung auf irgendwelche bestimmten Gradientenprofile zu beschränken. Andere Ausführungsformen der Erfindung verwenden nicht lineare Gradienten und/oder Lösungsmittelkonzentrationsgradienten, die rascher oder weniger rasch variieren. In einigen Ausführungsformen wird die Größe eines Gradienten ausgewählt, um zu verhindern, dass ein Überlappen zwischen benachbarten Zonen bewirkt wird, das größer als ein erwünschtes Ausmaß des Überlappens ist.
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In einigen alternativen Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen Verfahrens enthält eine Säule ein partikelförmiges Sorbensmaterial. Das Sorbensmaterial kann aus einer Vielzahl geeigneter Sorbensmaterialien ausgewählt werden, einschließlich bekannter Materialien wie beispielsweise Silica oder ein Gemisch aus Silica und einem Copolymer, wie beispielsweise einer Alkylverbindung. Das Sorbens wird beispielsweise derart ausgewählt, um die Ausbildung einer Verdrängungsfolge mit gut getrennten Verbindungen zu unterstützen, die unter Gradientenbedingungen während der Lösungsmittelelution gut getrennt verbleiben.
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Eine Sorbenspartikelgröße und/oder Größenverteilung wird geeigneterweise gewählt. In einigen Ausführungsformen wird beispielsweise ein Partikeldurchmesser derart gewählt, dass dieser klein genug ist, um die Beibehaltung von gut getrennten Verbindungen in einer Wellenfolge zu unterstützen. In einigen Ausgestaltungen beträgt ein geeigneter Partikeldurchmesser ungefähr 5 μm oder weniger.
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Überdies werden bei einigen Ausführungsformen vorteilhafterweise poröse Sorbensmaterialien bzw. ein poröses Sorbensmaterial eingesetzt, wie beispielsweise poröse Versionen von Silica oder Silicagemischen. Eine geeignete Porengröße für Proben, die große Moleküle enthalten, beträgt beispielsweise ungefähr 10 nm bis ungefähr 30 nm. Für einige Trennungen wird ein partikuläres poröses Material bzw. werden partikuläre poröse Materialien gewählt, um ein erwünschtes Verbindungsdiffusionsverhalten zu liefern. Beispielsweise wird in einigen Ausführungsformen das poröse Sorbens derart ausgewählt, dass dieses einen Diffusionskoeffizienten für ein verhältnismäßig großes Targetmolekül liefert, der 10- bis 102-mal kleiner als ein Diffusionskoeffizient für kleinere Moleküle ist. Oder beispielsweise wird eine kleinere Porengröße ausgewählt, um eine verbesserte Trennung zwischen benachbarten Verbindungen in einer Verdrängungsfolge zu liefern.
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Das Verfahren umfasst in einer alternativen Ausführungsform das Sammeln von spektroskopischen Daten mittels des Eluenten, beispielsweise mittels eines abgezweigten Teils des Eluenten. Die spektroskopischen Daten identifizieren eine Grenze zwischen der wenigstens einen Targetverbindung und der benachbarten Verbindung. Die spektroskopischen Daten werden optional dazu verwendet, um eine Startgrenze und eine Endgrenze einer Targetverbindung zu identifizieren, um das Sammeln der Targetverbindung zu unterstützen.
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Die spektroskopischen Daten werden vorzugsweise mittels einer Technik gesammelt, die eine geeignete Auflösung unter überladenen Probenbedingungen bereitstellen. Eine geeignete Technik ist die Massenspektrometrie, beispielsweise die Elektrospray-Ionisierungsmassenspektrometrie (elecrospray ionization mass spectrometry; ESI-MS). Somit wird optional ein kleiner Teil des Eluenten zu einem Massenspektrometer abgezweigt. In einigen Ausführungsformen werden eine oder mehrere Targetverbindungen von dem Rest des Eluenten in Reaktion auf die Identifizierung von Sammelfenstern gesammelt, wie diese durch massenspektrometrische Daten geliefert werden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung weist eine gesammelte Targetverbindung einen Reinheitsgrad von ungefähr 98% oder mehr nach einem einzelnen chromatographischen Verarbeitungsschritt auf.
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Zahlreiche Ausführungsformen liefern außerdem exzellente Ausbeuten der Targetverbindungen. Derartige Ausführungsformen stellen eine akkurate Auswahl von Sammelfenstern bereit, um somit ein effizientes Sammeln einer aufbereiteten bzw. aufgereinigten Verbindung zu unterstützen. Beispielsweise kann eine Targetverbindung aus einer Probe mit einer Ausbeute von ungefähr 80% oder besser oder 90% oder besser extrahiert werden. Somit liefern einige Ausführungsformen sowohl eine exzellente Ausbeute als auch einen hohen Reinheitsgrad nach einem einzelnen Verarbeitungslauf eines chromatographischen Moduls.
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Einige Ausführungsformen der Erfindung werden dazu verwendet, um die Aufbereitung von Targetbiopolymeren zu automatisieren, wie beispielsweise synthetische Peptide und Oligonukleotide. Zahlreiche Säulengrößen werden unter überladenen Bedingungen in Reaktion auf eine gewünschte Menge des aufgereinigten Targetmaterials verwendet.
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Nachstehend werden einige illustrative Beispiele für eine Targetverbindungsaufbereitung gemäß einigen Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Diese Beispiele sind nicht dazu gedacht, die Anwendung der Erfindung zu beschränken. Alternative Ausgestaltungen sind für den Fachmann ohne Weiteres erkennbar. Die nachstehenden illustrativen Beispiele sind mit den nachstehend beschriebenen Proben, Materialien und Instrumenten erhalten worden.
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Proben – Synthetisches 25mer-Phosphorothioat-Oligonukleotide (erhältlich von der Firma Hybridon, Inc., Cambridge, Massachusetts) und synthetische Peptide (erhältlich von der Firma Cell Essentials, Boston, Massachusetts und von der Firma Syn-Pep, Dublin, Kalifornien).
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Lösungsmittel – Für Oligonukleotide enthielt eine mobile Phase A eines Lösungsmittels 100 mM Hexafluorisopropanol (HFIP) und 8,6 mM Triethylamin (TEA), und zwar bei einem pH-Wert von 8,3, und eine mobile Phase B eines Lösungsmittels enthielt 100% Methanol (MeOH). Für Peptide enthielt eine mobile Phase A eines Lösungsmittels 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser und eine mobile Phase B eines Lösungsmittels enthielt 0,08% TFA in Acetonitril (ACN).
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Chromatographische Trennungen – Kapillartrennungen wurden mittels HPLC mit einem CAPLC®-Trennmodul durchgeführt, das mit einem 2996 Fotodiodenarraydetektor (PDA) ausgestattet gewesen ist (erhältlich von der Firma Waters Corporation, Milford, Massachusetts). Analytische Trennungen sind mittels eines ALLIANCE®-Bioseparations-System durchgeführt wurden, das mit einem 2996 PDA-Detektor ausgestattet gewesen ist (erhältlich von der Firma Waters Corporation, Milford, Massachusetts).
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Massenspektrometrie – Spektrometrie wurde mittels eines MICROMASS®-LCTTM-Massenspektrometers durchgeführt (erhältlich von der Firma Waters Corporation, Milford, Massachusetts), und zwar für die Analyse von Oligonukleotiden, die aus einem CAPLC®-System eluiert werden, sowie mit einem MICROMASS® ZQTM-Einfachquadrupolmassenspektrometer (das von der Firma Waters Corporation, Milford, Massachusetts erhältlich ist) für die Analyse von Peptiden, die aus dem ALLIANCE®-Bioseparations-System eluiert werden.
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Säulen: XTERRA® C18-Säulen mit einem Innendurchmesser und Längenabmessungen von 1,0 mm × 50 mm und einer Sorbenspartikelgröße von 2,5 μm sind für einige Oligonukleotidtrennungen verwendet worden. ATLANTISTM dC18-Säulen mit einem Innendurchmesser und Längenabmessungen von 2,1 mm × 150 mm und einer Sorbenspartikelgröße von 5 μm sind für einige Peptidtrennungen verwendet worden. ATLANTISTM dC18-Säulen mit einem Innendurchmesser und Längenabmessungen von 4,6 mm × 100 mm und einer Sorbenspartikelgröße von 5 μm sind für einige präparative Peptidaufbereitungen verwendet worden (alle Säulen sind von der Firma Waters Corporation, Milford, Massachusetts erhältlich).
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2a zeigt vier UV-Chromatogramme (260 nm Wellenlängenabsorption; Koordinaten: Zeit und Intensität in beliebigen Einheiten), die anhand von Trennungen eines 25mer-PS-Oligonukleotids gewonnen worden sind und die vier unterschiedlichen Probenladungen entsprechen (1 μg, 10 μg, 25 μg und 100 μg). Die Trennungen sind mittels Ionenpaarumkehrphasen-HPLC (ion pair reversed phase HPLC) gewonnen worden. Die Lösungsmittelgradientenbedingungen waren folgendermaßen: ein linearer Gradient über einen Zeitraum von einer Minute von 0 bis 13% der mobilen Phase B, der von einem linearen Gradient über einen Zeitraum von 28 Minuten von 13 bis 20% der mobilen Phase B gefolgt worden ist. Der Säuleninnendurchmesser betrug 1 mm, die Temperatur betrug 60°C und die Lösungsmittelflussrate betrug 23,6 μl pro Minute.
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Wie dargestellt, hat sich die UV-Detektion der chromatographischen Peaks des PS-Oligonukleotids bei steigender Massenladung abgesättigt, was insbesondere bei einer Ladung von 100 μg sichtbar ist. Bei der Ladung von 100 μg beispielsweise zeigt das UV-Chromatogramm, dass eine Verdrängungswelle von Probenverbindungen ausgebildet worden ist, jedoch wird nicht klar angezeigt, wo dies der Fall ist oder ob Grenzen zwischen den getrennten Verbindungen bestehen.
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Wie sich dies nun 2b entnehmen lässt, liefern die massenspektrometrischen Daten ein verhältnismäßig klares Anzeichen sowohl für die gute Trennung von Verbindungen als auch ein geeignetes Sammelfenster für eine Targetverbindung. 2b zeigt massenspektrale Ionenchromatogramme für drei Verbindungen (25mer, 24mer und 23mer) der Probe mit einer Ladung von 100 μg von 2a, die mittels Elektrosprayionisierung (ESI) gewonnen worden sind (zum Vergleich enthält 2b außerdem das UV-Chromatogramm von 2a). Die Ionenchromatogramme sind erhalten worden, indem eine Reihe von massenspektrometrischen Scans bzw. Abtastungen über einen Zeitraum von mehreren Minuten gesammelt worden sind, während die Verdrängungsfolge aus der Säule eluiert worden ist. Jeder Scan ist gesammelt worden, indem über ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 340 Da bis 1500 Da in einer Sekunde gescannt worden ist.
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Wie dargestellt, weisen die drei Verbindungen ein wenig unterschiedliche Retentionszeiten auf. Die Verbindungen verbleiben jedoch physikalisch (und zeitlich) gut getrennt, trotz einer überladenen Probe und eines Lösungsmittelgradienten, wie sich dies den massenspektrometrischen Daten entnehmen lässt. Wie jedoch vorstehend beschrieben, sind die Verbindungen in dem UV-Chromatogramm nur schwach aufgelöst. Somit sind die massenspektrometrischen Daten im Gegensatz zu den UV-Absorptionsdaten beispielsweise für eine genaue Identifizierung der eluierenden 25mer-Verbindung für Trennzwecke geeignet, wenn ein Sammeln ohne größere Syntheseverunreinigungen, z. B. 24mer und 23mer, erwünscht wird. Wie dies durch dieses Beispiel gezeigt wird, weisen eng verwandte Verbindungen einiger Probentypen inhärent sich nahe beieinander befindende UV-Absorptionspeaks auf. Bei derartigen Probenverbindungen werden in einigen Fällen deren dazugehörige UV-Peaks verhältnismäßig scharfe Grenzen aufweisen, die aufgrund ihrer Nähe scheinbar immer noch überlappen. Die massenspektrometrischen Daten unterscheiden jedoch ohne Weiteres die Verbindungen hinsichtlich ihrer Massendifferenzen.
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Somit wird im Gegensatz zu einigen bekannten chromatographischen Verdrängungsverfahren bewirkt, dass eine Targetverbindung aus einer Säule eluiert und eine gute Trennung von benachbarten Verbindungen in der Verdrängungsfolge beibehält, und zwar ohne die Verwendung eines separaten Verdrängungsmaterials.
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Die 3a, 3b und 3c illustrieren UV-Absorptionschromatogramme (220 nm Wellenlänge) und massenspektrale Ionenchromatogramme, die mittels Trennungen synthetischer Peptide erhalten worden sind, die Probenladungen von 2 μg, 200 μg bzw. 1000 μg aufweisen. Die Probe weist eine Peptidsequenz (vom N- zum C-Terminus) WLTGPQLADLYHSLMK auf, und zwar mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) des Targetpeptids von 1873,2 Da (doppelt geladen = 937,1 m/z) und eine sich in der Nähe befindende eluierende Syntheseverunreinigung bei m/z = 758,1 Da.
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Die Trennung ist mit den vorstehend beschriebenen analytischen Trenninstrumenten durchgeführt worden, einschließlich einer Säule mit einem Innendurchmesser von 2,1 mm. Ein Lösungsmittelgradient hatte die folgenden Parameter: ein linearer Gradient über einen Zeitraum von 30 Minuten von 18% zu 42% der mobilen Phase B und eine Flussrate von 0,2 ml pro Minute. Die Temperatur entsprach der Umgebungstemperatur. Massenspektrale Daten sind erhalten worden, indem ein m/z-Bereich von 300 Da bis 2500 Da während einer Scanzeit von 2,2 Sekunden gescannt worden ist. Eine Abfolge von Spektren, die während einer Elutionszeitdauer von ungefähr 30 Minuten erhalten worden sind, lieferten die dargestellten Kurven der Intensität gegenüber der Zeit, die mit den Konzentrationen des Targets und der Verunreinigung in Zusammenhang steht, die im Verlauf der Zeit eluiert worden sind.
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Die Probenladungen von 2 μg, 200 μg und 1000 μg standen in diesem Beispiel jeweils mit einer analytischen Injektion, d. h. geringer als ein Überladungsschwellenwert, einer semipräparativen Injektion, d. h. in der Nähe des Schwellenwerts, sowie einem Überladungszustand im Zusammenhang. Die abnehmenden Retentionszeiten und die zunehmenden Peak-Breiten, die mit der zunehmenden Ladung im Zusammenhang stehen, zeigen die Ausbildung einer Verdrängungsfolge an, wenn ein Überladungsschwellenwert erreicht und überschritten wird.
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Wie dargestellt, liefern die massenspektrometrischen Daten für Überladungsbedingungen einen klaren Hinweis darauf, dass das Target und die Verunreinigung bei einer Gradientenelution gut getrennt verbleiben. Die Daten werden, wie vorstehend beschrieben, in einigen Ausführungsformen der Erfindung dazu verwendet, um das Sammeln des Targets und/oder anderer Verbindungen einer Trennung zu triggern. Wie sich dies wiederum 3c entnehmen lässt, wird beispielsweise die ansteigende Flanke des massenspektrometrischen Targetpeaks in einigen Fällen dazu verwendet, um das Sammeln des Targets zu triggern, und/oder die abfallende Flanke des massenspektrometrischen Targetpeaks wird dazu verwendet, um das Sammeln des Targets zu beenden. Alternativ wird beispielsweise das beobachtete Ende des Verunreinigungspeaks dazu verwendet, das Sammeln des Targets zu triggern.
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Auf die vorstehend beschriebene Art und Weise wird das Target mit einem Reinheitsgrad von beispielsweise ungefähr 95 bis 98% oder 99% oder besser nach einem einzelnen chromatographischen Trennprozess gesammelt. Überdies liefern einige Ausführungsformen der Erfindung in Reaktion auf spektroskopische Daten ein automatisches Sammeln von einer oder mehreren Targetverbindungen und/oder anderen Verbindungen einer Trennung.
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Unter Bezugnahme auf die 4 und 5 werden Beispiele für automatisierte Aufbereitungssysteme beschrieben. Mittels des Einsatzes einer Automatisierung und durch die Verwendung massenspektrometrischer Daten, um das Sammeln gewünschter Trennverbindungen zu triggern, wird eine große Anzahl von Proben effizient verarbeitet. Beispielsweise ist ein Massenspektrometer ausgestaltet, ein erwartetes Molekulargewicht eines Targets in einer Probe zu detektieren und das Sammeln des aufgereinigten Targets in Reaktion auf die Detektion dessen erwarteten Molekulargewichts zu steuern.
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4 zeigt ein Blockdiagramm ein Aufbereitungssystem 400, das nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Das System umfasst ein chromatographisches Modul 410, ein Massenspektrometermodul 420, eine Steuereinheit 430, eine Steuereinheit 440 für den Eluentenfluss, eine Verdünnungsmittelzufuhr 450 und eine Sammeleinheit 460. Die Steuereinheit 440 für den Eluentenfluss empfängt ein Eluent von der chromatographischen Komponente 410 und leitet Teile des Eluentens zu dem Sammelmodul 460 und zu dem Massenspektrometermodul 420. Die Steuereinheit 440 für den Eluentenfluss steht außerdem in fluider Kommunikation mit der Verdünnungsmittelzufuhr, um ein Vermischen eines Verdünnungsmittels mit dem Teil des Eluenten zu ermöglichen, der zu dem Massenspektrometermodul 420 geführt wird.
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Das chromatographische Modul 410 umfasst jedwede geeigneten chromatographischen Instrumente, einschließlich bekannter Instrumente, wie beispielsweise auf Säulen basierende Instrumente. Geeignete Säulen umfassen Säulen, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Chromatographie bekannt sind. Die Säule kann beispielsweise aus metallischen oder isolierenden Materialien ausgebildet sein. Geeignete Materialien umfassen bekannte Materialien, wie beispielsweise Stahl, Quarzglas oder ausgekleidete Materialien. Die Säule kann mehr als eine Säule umfassen, die in serieller und/oder paralleler Ausgestaltung angeordnet sind. Beispielsweise kann es sich bei der Säule um eine Kapillarsäule handeln oder diese kann mehrere Kapillarrohre enthalten.
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Die Steuereinheit 430 steht in Datenkommunikation mit anderen Komponenten des Systems 400 über verdrahtete und/oder drahtlose Mittel, wie diese auf dem Gebiet der Datenkommunikation bekannt sind. Die Steuereinheit 430 empfängt Prozessdaten beispielsweise von dem Massenspektrometermodul 420 und liefert Steuersignale an andere Komponenten, wie beispielsweise die Flusssteuereinheit 440. Die Steuereinheit 430 ist ausgestaltet, die Automatisierung der Probenaufbereitung durch das Aufbereitungssystem 400 zu unterstützen. Die Steuereinheit 430 ist in zahlreichen beispielhaften Ausführungsformen als Software, Firmenware und/oder Hardware (z. B. als ein Anwendungs spezifischer Schaltkreis; application specific integrated circuit) implementiert und umfasst, falls erwünscht, eine Benutzerschnittstelle. Die Steuereinheit 430 umfasst eine Speicherkomponente bzw. Speicherkomponenten und/oder steht in Kommunikation mit einer Speicherkomponente bzw. Speicherkomponenten.
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Geeignete Implementierungen der Steuereinheit 430 beinhalten beispielsweise einen oder mehrere integrierte Schaltkreise, wie beispielsweise Mikroprozessoren. Ein einzelner integrierter Schaltkreis oder Mikroprozessor umfasst in einigen alternativen Ausführungsformen die Steuereinheit 430 und andere elektronische Teile des Systems 400. In einigen Ausführungsformen implementieren ein oder mehrere Mikroprozessoren eine Software, die die Funktionen der Steuereinheit 430 ermöglicht. In einigen Ausführungsformen ist die Software ausgestaltet, auf Mehrzweckgeräten und/oder spezialisierten Prozessoren zu laufen, die für die hierin beschriebene Funktionalität bestimmt sind.
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In einigen Implementierungen des Systems 400 umfasst die Steuereinheit 430 eine Benutzerschnittstelle, um die Wechselwirkung mit der Steuereinheit 430 und/oder anderen Teilen des Systems 400 zu unterstützen. Beispielsweise ist die Schnittstelle ausgestaltet, Steuerinformation von einem Benutzer anzunehmen und Information über das System 400 einem Benutzer zu liefern. Die Benutzerschnittstelle wird beispielsweise dazu verwendet, Systemsteuerparameter einzustellen und/oder dem Benutzer diagnostische Information und Information zum Beheben von Fehlern zu liefern. In einer Ausführungsform stellt die Benutzerschnittstelle eine Netzwerkkommunikation zwischen dem System 400 und Benutzern bereit, die entweder lokal hinsichtlich der Betriebsumgebung oder entfernt von der Betriebsumgebung lokalisiert sind. Die Benutzerschnittstelle wird in einigen Implementierungen dazu verwendet, um die Software zu modifizieren und zu aktualisieren.
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Die Flusssteuereinheit 440 ist ausgestaltet, den gesamten Eluenten oder einen Teil davon zu dem Sammelmodul 460 und/oder dem Massenspektrometermodul 420 zu leiten. Beispielsweise während der Elution einer Probenverdrängungsfolge wird ein kleiner Teil des Eluenten, beispielsweise ungefähr ein Volumenprozent, mittels der Flusssteuereinheit 440 zu dem Massenspektrometermodul 420 geleitet. Massenspektrometrie wird sodann mit dem abgezweigten Eluenten durchgeführt; in Reaktion auf die Detektion eines m/z-Werts einer erwünschten Targetverbindung, weist die Steuereinheit 430 die Flusssteuereinheit 440 an, den Eluenten zu dem Sammelmodul 460 zu leiten, und/oder weist das Sammelmodul 460 an, das Sammeln des Eluenten zu beginnen.
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Die Steuereinheit umfasst einen Speicher zum Speichern von Anweisungen, die, wenn diese ausgeführt werden, eine Implementierung eines der hierin beschriebenen Verfahren bewirken. Beispielsweise bewirken in einer Ausführungsform die Anweisungen, dass das System 400 die folgenden Schritte implementiert, und zwar ohne jede weitere Einwirkung eines Benutzers: Injizieren einer überladenen Menge einer Probe; Fließen eines Lösungsmittels mit einer zeitabhängigen Zusammensetzung; und Sammeln eines Targetmaterials in Reaktion auf massenspektrometrische Daten, die mit dem Teil des Eluenten im Zusammenhang stehen.
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Obgleich einige bestimmte beispielhafte mobile Phasen und dazugehörige Gradienten hierin beschrieben worden sind, werden andere geeignete mobile Phasen und Gradienten in alternativen Prozessen gemäß anderen Ausführungsformen der Erfindung verwendet. In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden mobile Phasen beispielsweise hinsichtlich ihrer Kompatibilität mit der Massenspektrometrie ausgewählt. Einige Lösungsmittel sind direkt kompatibel, so dass diese keine Verdünnung vor der Massenspektrometrie benötigen. Andere sind indirekt kompatibel, so dass diese einen gewissen Grad an Verdünnung vor der Massenspektrometrie erfordern. Beispielsweise reduzieren einige Lösungsmittel ohne eine Verdünnung die Detektionsempfindlichkeit eines Massenspektrometers.
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Ein Beispiel für ein direkt kompatibles Lösungsmittel ist eine mobile Phase A von 0,1% TFA in Wasser in Kombination mit einer mobilen Phase B von 0,08% TFA in ACN. Dieses Lösungsmittel wird in einigen Ausführungsformen der Erfindung verwendet, um beispielsweise Peptidproben zu trennen.
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Ein Beispiel für ein indirekt kompatibles Lösungsmittel ist eine mobile Phase A, die HFIP und TEA enthält, in Kombination mit einer mobilen Phase B von MeOH. Ein Teil des Eluenten wird in diesem Fall vorteilhafterweise verdünnt, und zwar beispielsweise um einen Faktor 10, vor der Massenspektrometrie. Dieses Lösungsmittel wird in einigen Ausführungsformen der Erfindung dazu verwendet, um beispielsweise Oligonukleotidproben zu trennen.
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Ein Verdünnungsmittel wird beispielsweise ausgewählt, um eine verbesserte Kompatibilität mit der Massenspektrometrie zu erreichen. Jedwedes geeignete Material, einschließlich bekannter Materialien, kann als ein Verdünnungsmittel verwendet werden. Beispielsweise umfasst ein Lösungsmittel ungefähr 50% ACN und ungefähr 50% Wasser. In einigen Ausführungsformen weist ein Lösungsmittel ungefähr 20% bis ungefähr 50% einer organischen Verbindung und ungefähr 50% Wasser auf.
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Unter Bezugnahme auf 5 wird nun ein Beispiel für eine automatisierte Analyse beschrieben. 5 zeigt ein UV-Absorptionschromatogramm (Wellenlänge 220 nm, beliebige Intensitätseinheiten) sowie massenspektrometrische Ionenchromatogramme, die mit einer Ladung von 20 mg des synthetischen Peptids gewonnen worden sind, das mit den 3a, 3b und 3c im Zusammenhang steht. Drei Chromatogramme, die mittels Massenspektrometrie erhalten worden sind, sind dargestellt (beliebige Intensitätseinheiten), und zwar eines für das Targetpeptid und zwei für Probenverunreinigungen.
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Die Trennung ist in einer Säule mit einem Innendurchmesser von 4,6 mm durchgeführt worden. Der Lösungsmittelgradient hatte eine anfängliche Haltezeit bei 10% mobiler Phase B über einen Zeitraum von einer Minute, dem ein linearer Gradient folgte, während dem die Zusammensetzung der mobilen Phase B des Lösungsmittels von 10% auf 50% während eines Zeitraums von 90 Minuten mit keiner Verarbeitung gesteigert worden ist. Die Lösungsmittelflussrate betrug 1,0 ml pro Minute. Die Säule wurde bei Umgebungstemperatur gehalten. Das Fraktionssammeln für das Targetpeptid ist durch das Verfolgen ausgewählter Ionen mit einem Massengewicht von 1874,0 Da getriggert worden. Das erneute Injizieren des gesammelten Teils hat angezeigt, dass der ursprünglich gesammelte Teil einen Reinheitsgrad von ungefähr 98% aufwies, während der Reinheitsgrad des Targets in der ursprünglichen Probe ungefähr 86% aufwies.
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Variationen, Modifizierungen und andere Implementierungen dessen, was hierin beschrieben wird, ergeben sich dem Fachmann, ohne vom Geist und vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, wie dieser beansprucht ist. Beispielsweise sind zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung dazu geeignet, eine Vielzahl von Materialien aufzubereiten bzw. aufzureinigen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Pharmazeutika, Antigene, Affinitätstags, diagnostische Mittel, RNAi, Oligosonden und kleinen Molekülproben, wie beispielsweise Phenylgruppenproben. Dementsprechend wird die Erfindung nicht durch die vorstehende beispielhafte Beschreibung, sondern stattdessen durch den Geist und den Schutzumfang der nachstehenden Ansprüche definiert.