JP2008536473A - ユニバーサル抗体のライブラリー - Google Patents
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- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Abstract
Description
本願は、その全内容を本明細書に参照により組み込んでいる、2004年7月6日に出願した米国仮特許出願第60/585931号に対する優先権を請求している。本明細書全体で引用するすべての特許、特許出願および参考文献の内容は、その全体を参照によりここに組み込んでいる。
本明細書で使用する場合、「抗体結合領域」との用語は、抗原(複数も)を結合できる、免疫グロブリンまたは抗体の可変領域の1個または複数の部分を指す。抗体結合領域は、通常、例えば抗体軽鎖(VL)(またはその可変領域)、抗体重鎖(VH)(またはその可変領域)、重鎖Fd領域、またはFab、F(ab’)2、単一ドメイン、1本鎖抗体(scFv)などの抗体複合重軽鎖(またはその可変領域)、あるいは完全長抗体、例えばIgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgE、またはIgM抗体である。
概説
抗体は強力な診断・治療手段である。標的に対して容易にスクリーニングできる候補結合性分子を含んだ抗体ライブラリーは、望ましい。包括的なユニバーサル抗体ライブラリーの十分な展望は、これまでのところ幻想であった。合成ライブラリーには、ノイズや、自然には出現しない過剰な多様性が伴う。純粋なヒトライブラリーには、ある種の抗原クラスに対して偏りがあり、その多様性は捕捉技術次第に過ぎない。本発明は、包括的であり、例えばハイスループット法を用いて容易にスクリーニングすることにより、新規な治療薬を得ることのできるユニバーサル抗体ライブラリーを提供する。
本発明のユニバーサル抗体ライブラリー(UAL)を構築する第1ステップは、所定のある種の規準を満たす配列の選択である。例えば、非冗長再編成抗体配列を含んだ電子データベースのKabatデータベースから、特に特定の抗原クラスに対して極めて高頻度に発現される配列を探すことができる。該抗原クラスは、例えばタンパク質、ペプチド抗原を含むが、低分子、多糖類およびポリヌクレオチドも含むことができる。このような抗体のフレームワーク配列のクラスタリング分析を行った後、生殖細胞系配列(V BASEデータベース)との比較(BLAST探索アルゴリズムを用いて)により、所与の抗原クラス、例えばタンパク質性の抗原または標的を認識する機能抗体を生成するために後に再編成する、最も使用頻度の高い生殖細胞系ファミリーが決定される。
本発明の規準に基づく候補フレームワークの選択によって、導入すべきCDRサイズおよび初期アミノ酸配列多様性が左右される。抗体配列の1)ある抗原クラスに対する出現頻度および2)生殖細胞系頻度を特定すると、該配列をその正準クラスに従って配列できる。正準クラスは、Clothiaにより記載された約束事項(後述の、材料および方法を参照されたい)を用いて決定する。抗体配列の所与のセットについては、該抗体配列の大多数はある一定の正準クラスに入り得る。次いで、該正準クラスにより、CDR内に収容できるアミノ酸残基の個数が決まる。例えば、該正準クラスが1−3であれば、CDR1はアミノ酸6個のループを有し、CDR2はアミノ酸13個のループを有することになろう。重鎖可変配列に関しては、Jセグメントの配列分担は、ほんの6配列のサブセット由来の最適合配列だけを通常検討しさえすればよい程度に、かなり良好に保存されている。Kabat、V BASEの各データベースに関するCDRアミノ酸の頻度分析により、2種の区分、例えば1)保存すべき位置、および2)多様性生成に適する位置に属するCDRアミノ酸残基位置の特定が可能となる。
本発明のユニバーサル抗体ライブラリーおよびその構築は、生成すべき抗体多様性に関する配列・構造情報の便宜を得て、改良抗体を生成する可能性が高まるように行う。画定領域、例えばCDRに導入すべきアミノ酸多様性を選択する指針とするために、モデリング情報も使用できる。更にまた、本発明の抗体について得られた実際の結果も、繰り返し作製し、スクリーニングすべきそれ以後の抗体の選択(または排除)、例えば親和性成熟の指針とすることができる。
一実施形態では、本発明のユニバーサル抗体ライブラリー(UAL)は、ポリペプチドの画定領域をコードし、所定のアミノ酸に対してコドンを1個だけ有する個々のオリゴヌクレオチドを合成することによって、スクリーニングのために生成される。これは、オリゴヌクレオチド内の各コドン位置に、野生型ポリペプチドの合成に必要なコドン、所定のアミノ酸用コドンのいずれかを導入することによって実現され、LTM(look−through変異誘発)と称する(例えば、米国特許出願第60/483282号を参照されたい)。
前記技術または他の適切な技術のいずれかによって生成するポリヌクレオチドのライブラリーは、発現させ、スクリーニングすることにより、所望の構造および/または活性を有する抗体を特定することができる。該抗体の発現は、無細胞抽出物(および、例えばリボソームディスプレイ)、ファージディスプレイ、原核細胞、または真核細胞(例えば、酵母)を用いて実行できる。
本発明の実施は、別途指示のない限り、化学、分子生物学、組み換えDNA技術、PCR技術、免疫学(特に、例えば抗体技術)、発現系(例えば、無細胞発現、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびProfusion(商標))、ならびに必要な任意の細胞培養に関する従来技法は、当分野の技術に含まれ、文献中で説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);DNA Cloning,Vols.1 and 2,(D.N.Glover,Ed.1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,Ed.1984);PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,Beaucage,Ed.John Wiley & Sons(1999)(Editor);Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure,Neidle,Ed.,Oxford Univ Press(1999);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis et al.,Academic Press(1990);PCR Essential Techniques:Essential Techniques,Burke,Ed.,John Wiley & Son Ltd(1996);The PCR Technique:RT−PCR,Siebert,Ed.,Eaton Pub.Co.(1998);Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996);Antibody Engineering:A Practical Approach (Practical Approach Series,169),McCafferty,Ed.,Irl Pr(1996);Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow et al.,C.S.H.L.Press,Pub.(1999);Current Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubel et al.,John Wiley & Sons(1992);Large−Scale Mammalian Cell Culture Technology,Lubiniecki,A.,Ed.,Marcel Dekker,Pub.,(1990).Phage Display :A Laboratory Manual,C.Barbas(Ed.),CSHL Press,(2001);Antibody Phage Display,P O’Brien(Ed.),Humana Press(2001);Border et al.,Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries,Nature Biotechnology,15(6):553−7(1997);Border et al.,Yeast surface display for directed evolution of protein expression,affinity,and stability,Methods Enzymol.,328:430−44(2000);米国特許第6348315号にてPluckthun 他が記載したリボソームディスプレイと、米国特許第6258558号、第6261804号および第6214553号にてSzostak他が記載したProfusion(商標);ならびにUS20040058403A1に記載の細菌ペリプラズム発現を参照されたい。
Winter G.The repertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VH segments with different hypervariable loops.J Mol Biol.1992 Oct 5;227(3):776−98;Li W,Jaroszewski L,Godzik A.Clustering of highly homologous sequences to reduce the size of large protein databases.Bioinformatics.2001 Mar;17(3):282−3;[VBDB]www.mrc−cpe.cam.ac.uk/vbase−ok.php?menu=901;[KBTDB]www.kabatdatabase.com;[BLST]www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/[CDHIT]bioinformatics.ljcrf.edu/cd−hi/;[EMBOSS]www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/;[PHYLIP]evolution.genetics.washington.edu/phylip.html;and [FASTA]fasta.bioch.virginia.edu。
バイオインフォマティクス主導のユニバーサル抗体ライブラリー配列の特定方法
この実施例では、バイオインフォマティクスと本発明の判定規準とを用いて、ユニバーサル抗体ライブラリーの配列を特定および選択する。
ユニバーサル抗体ライブラリーのためのCDR多様性を設計する方法
この実施例では、ユニバーサル抗体ライブラリーのCDR多様性を最適化する方法を示す。
バイオインフォマティクスを用いた、抗体CDRの位置可変性プロファイル(VP)を作成する方法
別の手法では、in vivoで発現されているCDRの位置可変性プロファイル(VP)を決定することによって、ユニバーサル抗体ライブラリー(UAL)を設計した。位置可変性プロファイルは、自然に発現される抗体のアラインメントされた配列のデータセットにおける特定の位置に存在する様々なアミノ酸およびそれらそれぞれの出現率のカタログ登録を表す。
ユニバーサル抗体ライブラリーを遺伝子操作する方法
この実施例では、遺伝子工学技法を用いてユニバーサル抗体ライブラリーを作製し、組み立てるステップを記述する。
ユニバーサル抗体ライブラリーの発現および提示方法
この実施例では、標的に対してスクリーニングするためのユニバーサル抗体ライブラリーを発現および提示する方法を記述する。
ユニバーサル抗体ライブラリーから得た候補のハイスループット親和性成熟を行う方法
この実施例では、ユニバーサル抗体ライブラリーから候補抗体を特定して、親和性成熟を用いてそれを改善するステップを記載する。
ヒト疾患を治療するための治療薬抗体候補を特定するためにユニバーサル抗体ライブラリーをスクリーニングする方法
この実施例では、治療薬候補を特定するために、本発明のユニバーサル抗体ライブラリーをスクリーニングする方法を記述する。
遺伝子配列のフィルターおよびクラスター分析を用いたユニバーサル抗体ライブラリー配列のバイオインフォマティクス主導的特定法
この実施例では、データベース分析を用いて、ユニバーサル抗体ライブラリー配列を特定する方法を記述する。
CDR分析を使用したユニバーサル抗体ライブラリーのためのCDR多様性を設計するための方法
この実施例では、ユニバーサル抗体ライブラリーのためのCDRを設計するための方法を記載する。
1つまたは2つのアミノ酸が他方に対して明らかに優勢である場合、位置を固定として分類する。通常、パラメータ調整に優れたパーサは、こうした位置で、異常なアミノ酸をフィルターによって除外することが可能である。優勢な1つ(複数)のアミノ酸をCDR配列における野生型として使用する。2つのアミノ酸が優勢である場合、混合したコドンを合成して両方のアミノ酸が得られることを意味する「縮重」野生型を使用する。可変性の高い位置(WTM位置)を特定するための選ばれたパラメータは非常に精度が高い。こうした位置で、明らかに優勢のアミノ酸は存在しないが、多くは中頻度から低頻度で異なる。ここで、多様性は、最も頻度の高いアミノ酸が野生型である変異誘発、例えば、LTMまたはWTMを使用して表すことができる。
重鎖および軽鎖の両方のCDR3は、長さおよび配列がどちらも最も可変性の高い領域であり、抗体結合部位の構造多様性の大部分が得られる。したがって、完全なデータセットおよびタンパク質特異的鎖の両方に関する長さ分析を各鎖型について実行した。2つのデータセットの長さ分布は有意差が認められ、タンパク質抗原が、わずかに長いCDR3を好むことが示された。VH CDR3は非常に広い分布を有し、したがって9から18の長さ(使用したものの約75%)を選択した(図10参照)。Vκ CDR3は、非常に狭い分布を有し、使用されたほとんどの長さは8および9である(図20参照)。Vλ CDR3は、わずかに広い分布を有し、この場合、長さ8、9、10および11(図24参照)をライブラリー用に選択した。
WTMおよび拡張WTMを使用してCDR多様性を導入するためのオリゴヌクレオチドの設計
表12に記載の配列を使用してオリゴ構築を実行することができる。表12で影付きの、Xで表した配列に示す適切な位置でウォークスルーおよび拡張ウォークスルー(CDRH3のための)を実行した。Xはウォークスルーアミノ酸を指し、―(ダッシュ)の次の1つ(複数)のアミノ酸はベースアミノ酸を指し、必要とされる任意の副産物は/(スラッシュ)の後に示す。記載した多数のアミノ酸を有する白の位置は、これらのアミノ酸と最小数の副産物との同じ割合の混合物を示す。この混合物は、可変性プロファイルに存在するこうしたアミノ酸の優勢の混合物を反映する。
分割プール設計変異誘発/オリゴヌクレオチド合成
興味深い抗原結合領域/抗原接触を特定するために、チロシンおよびグリシンを所望のあらゆる残基位置に導入することができる。アンバー終止コドンなど望ましくない副産物を産生することなく、こうした残基をあらゆる位置に導入するために、代替のオリゴヌクレオチド合成操作を利用することができるが、ここで、コドンのプールを別々に合成し、次いで組み合わせ、次回の合成のために分割する(E A Peters,P J Schatz,S S JohnsonおよびW J Dower,J Bacteriol.1994 July;176(14):4296〜4305)。このプロセスでは2つのプールを使用し、第1のプールは、YおよびSをコードしているコドンTMCを利用し、第2のプールは、H、S、R、NおよびDをコードしているコドンVRCを利用する。したがって、こうしたプールは、チロシンによる疎水性への寄与、および第2のプールによる多数の極性寄与を可能にする。この分割プール設計では、CDRH3多様性表(図12)においてXで示すすべての多様性位置はこうしたコドンの分割プールを含み得る。この実施例は、以下で示すVH3 CDR長さ9に利用したコドンセットを示す。
当分野の技術者であれば、通常の実験を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態との多くの均等物を認識し、または確認できるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
Claims (106)
- a)次の規準:
i)各フレームワーク領域は、所定の抗原クラスに対する発現抗体において規定した閾値頻度以上で生殖細胞系配列を含むこと
に従って選択された、1個または複数のフレームワーク領域、および場合により
b)1個または複数のCDR領域
を含む、抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドのライブラリー。 - 抗体結合領域が、抗体、抗体軽鎖(VL)、抗体重鎖(VH)および1本鎖抗体(scFv)からなる群から選択される、請求項1に記載のライブラリー。
- 1個または複数のCDR領域を含む、請求項1に記載のライブラリー。
- 1個または複数の前記CDR領域が、次の規準:
i)前記CDR領域は、a)の選択フレームワーク領域(複数も)の正準クラスにより決定される長さを備えること、および
ii)前記CDR領域は、前記CDR領域内の各位置または位置のサブセットに、相当する天然CDR領域(複数も)中の相当位置に見出される、ある閾値頻度以上で出現するアミノ酸のセットから選択されるアミノ酸残基を含むこと、
によって選択され、a)のフレームワーク領域およびb)のCDR領域が共同で抗体結合領域を形成する、
請求項3に記載のライブラリー。 - 1個または複数の前記CDR領域が、次の規準:
i)前記CDR領域は、a)の選択フレームワーク領域(複数も)の正準クラスにより決定される長さを備えること、および
ii)前記CDR領域は、前記CDR領域内の各位置に、
生殖細胞系CDR、発現CDR領域の両方に出現する保存アミノ酸、
生殖細胞系では保存されているが、発現CDR領域では可変性である半保存アミノ酸、および
生殖細胞系で可変性であり、発現CDR領域で可変性である非保存アミノ酸
からなる群から選択されるアミノ酸残基によって表わされる、アミノ酸残基を含むこと、
によって選択され、a)のフレームワーク領域およびb)のCDR領域が共同で抗体結合領域を形成する、
請求項3に記載のライブラリー。 - 前記フレームワーク領域が、軽鎖フレームワーク領域および重鎖フレームワーク領域からなる群から選択される、請求項1に記載のライブラリー。
- 前記軽鎖フレームワーク領域が、VκI−L1、VκI−L5、VκIII−A27、VκIII−L6、VκIII−L20、Vλ1−1b、Vλ1−1c、Vλ2−2a2、およびVλ3−31、Vλ3−3rからなる群から選択される、ヒト軽鎖フレームワーククローンに由来する請求項6に記載のライブラリー。
- 前記重鎖フレームワーク領域が、1−e、3−07、3−11、3−21、3−23、3−30.5、3−33、3−48および3−74からなる群から選択される、ヒト重鎖フレームワーククローンに由来する請求項6に記載のライブラリー。
- 重鎖フレームワークが、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6からなる群から選択されるJセグメント配列を含む、請求項6に記載のライブラリー。
- フレームワーク領域が、約10%から約100%の閾値出現頻度を有する、請求項1に記載のライブラリー。
- 前記所定の抗原クラスが、タンパク質、ペプチド、低分子、多糖類およびポリヌクレオチドからなる群から選択される抗原のクラスである、請求項1に記載のライブラリー。
- CDR領域が、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3からなる群から選択される、請求項1に記載のライブラリー。
- 所与の正準構造に関連して選択されたCDRの画定により決定されるCDR−H1の長さが、長さ5、6、7および8からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- CDR−H1領域が、Kabatに基づくCDRの画定に従うと長さが5である、請求項13に記載のライブラリー。
- CDR−H1がアミノ酸配列SYX1MX2を含み、式中X1の配列はA、Y、G、D、S、I、P、R、H、NまたはGであり、X2はA、Y、G、D、S、I、P、R、H、N、WまたはGである、請求項14に記載のライブラリー。
- CDR−H1領域が、接触決定に基づくCDRの画定に従うと長さが6である、請求項13に記載のライブラリー。
- VH1 CDR−H1がアミノ酸配列T/SSYX1I/MX2を含み、式中X1はA、Y、G、D、S、I、P、R、H、NまたはGであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、HまたはNである、請求項16に記載のライブラリー。
- VH3 CDR−H1がアミノ酸配列SX1YX2MX3を含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、WまたはGであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、Nである、請求項16に記載のライブラリー。
- 所与の正準構造に関連して選択されたCDRの画定により決定されるCDR−H2の長さが、長さ17、12および13からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- CDR−H2領域が、Kabatに基づくCDR画定に従うと長さ17である、請求項19に記載のライブラリー。
- CDR−H2がアミノ酸配列X1IX2X3X4GGX4X6YYADSVKGを含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはWであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、HまたはNであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、HまたはNであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはGであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、HまたはNであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTである、請求項20に記載のライブラリー。
- CDR−H2領域が、接触決定に基づくCDR画定に従うと長さ13である、請求項19に記載のライブラリー。
- VH1 CDR−H2がWMGX1IX2PX3X4GX5T/ANのアミノ酸配列を含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはWであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、HまたはNであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはMであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、FまたはGであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTである、請求項22に記載のライブラリー。
- VH3 CDR−H2がWVS/AX1ISX2X3GX4X5X6Yのアミノ酸配列を含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、V、GまたはTであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、Q、WまたはFであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、HまたはNであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはTであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、TまたはKであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはFである、請求項22に記載のライブラリー。
- CDR−H3鎖長が、長さ9、10、11、12、13、14、15、16、17および18からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ9である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がARX1X2X3X4X5FDのアミノ酸配列を含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、E、LまたはVであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、LまたはQであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、T、LまたはQであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、WまたはLであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、TまたはVである、請求項26に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ10である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がアミノ酸配列ARX1X2X3X4X5X6FDを含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、E、L、VまたはMであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、V、KまたはQであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、E、L、V、QまたはWであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、V、WまたはQであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、E、WまたはLであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、LまたはFである、請求項28に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ11である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がアミノ酸配列ARX1X2X3X4X5X6X7FDを含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、K、G、EまたはLであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、T、G、F、LまたはVであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、VまたはTであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、TまたはWであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、TまたはLであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはWであり、X7はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、W、FまたはLである、請求項30に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ12である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がARX1X2X3X4X5X6X7X8FDのアミノ酸配列を含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、EまたはVであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、QまたはTであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、T、VまたはWであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、W、LまたはVであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、F、TまたはLであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、TまたはEであり、X7はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、WまたはFであり、X8はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、F、TまたはWである、請求項32に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ13である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がARX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDのアミノ酸配列を含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、E、V、LまたはKであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、QまたはKであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、V、KまたはMであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、LまたはVであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、W、LまたはQであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、L、EまたはTであり、X7はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、L、V、T、WまたはGであり、X8はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはFであり、X9はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、F、WまたはTである、請求項34に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ14である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10FDのアミノ酸配列を含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、EまたはVであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、T、QまたはKであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、V、TまたはEであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、F、TまたはQであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、TまたはLであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、LまたはVであり、X7はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、L、EまたはVであり、X8はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、F、EまたはLであり、X9はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、WまたはTであり、X10はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、F、WまたはLである、請求項36に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ15である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がアミノ酸配列ARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11FDを含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、E、VまたはTであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、W、L、TまたはVであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、E、T、F、LまたはWであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、E、C、TまたはFであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、WまたはLであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、TまたはEであり、X7はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、VまたはWであり、X8はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、L、F、V、MまたはWであり、X9はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、CまたはKであり、X10はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、WまたはQであり、X11はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、W、FまたはLである、請求項38に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ16である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がアミノ酸配列ARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12FDを含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、VまたはEであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、VまたはEであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、TまたはLであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、TまたはEであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、F、TまたはMであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、FまたはWであり、X7はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、V、LまたはEであり、X8はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、EまたはWであり、X9はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、FまたはWであり、X10はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、TまたはFであり、X11はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、WまたはTであり、X12はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、WまたはFである、請求項40に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ17である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がアミノ酸配列ARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13FDを含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、EまたはLであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、LまたはQであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、T、VまたはMであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、VまたはCであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、VまたはTであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、F、VまたはTであり、X7はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、W、T、VまたはFであり、X8はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、LまたはVであり、X9はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、F、LまたはCであり、X10はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、FまたはLであり、X11はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、L、VまたはCであり、X12はA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはGであり、X13はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはWである、請求項42に記載のライブラリー。
- CDR−H3領域が長さ18である、請求項25に記載のライブラリー。
- CDR−H3がアミノ酸配列ARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14FDを含み、式中X1はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、E、VまたはLであり、X2はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、LまたはKであり、X3はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、V、LまたはFであり、X4はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、VまたはTであり、X5はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、C、F、K、LまたはMであり、X6はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、V、F、T、WまたはCであり、X7はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、WまたはFであり、X8はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、W、VまたはFであり、X9はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、LまたはVであり、X10はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、C、LまたはFであり、X11はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、F、GまたはWであり、X12はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、T、LまたはFであり、X13はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはWであり、X14はA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、WまたはTである、請求項44に記載のライブラリー。
- 所与の正準構造に関連して選択されたCDRの画定により決定されるVL(κ)CDR−L1の長さが、長さ7および8からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- VK−I CDR−L1領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ7である、請求項46に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、アミノ酸配列SX1X2LA/NWYを含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、TまたはKであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはWである、請求項47に記載のライブラリー。
- VK−III CDR−L1領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ7である、請求項46に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、SSN/YLAWYのアミノ酸配列を含む、請求項49に記載のライブラリー。
- VK−III CDR−L1領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ8である、請求項46に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、アミノ酸配列SS/NX1YLAWYを含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTである、請求項51に記載のライブラリー。
- 所与の正準構造に関連して選択されたCDRの画定により決定されるVL(κ)CDR−L2の長さが、長さ10からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- VK−I CDR−L2領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ10である、請求項53に記載のライブラリー。
- CDR−L2が、LLIYX1ASX2LQ/Eのアミノ酸配列を含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、KまたはGであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTである、請求項54に記載のライブラリー。
- VK−III CDR−L2領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ10である、請求項53に記載のライブラリー。
- CDR−L2が、アミノ酸配列LLIYG/DASX1RAを含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTである、請求項56に記載のライブラリー。
- CDRの画定により決定されるVL(κ)CDR−L3鎖長が、長さ8および9からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- CDR−L3領域が、接触によるCDR画定に従って長さ8である、請求項58に記載のライブラリー。
- CDR−L3が、アミノ酸配列QQYX1X2X3PX4を含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、TまたはLであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、T、QまたはGであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、T、L、WまたはFであり、X4がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、L、WまたはFである、請求項59に記載のライブラリー。
- CDR−L3領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ9である、請求項58に記載のライブラリー。
- CDR−L3が、アミノ酸配列QQYX1X2X3PPX4を含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはGであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、TまたはGであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、WまたはTであり、X4がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、W、LまたはTである、請求項61に記載のライブラリー。
- 所与の正準構造に関連して選択されたCDRの画定により決定されるV1(λ)CDR−L1鎖長が、長さ7、9および10からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- Vλ−1 CDR−L1領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ9である、請求項63に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、アミノ酸配列IGX1NX2VX3WYを含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、TまたはGであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、TまたはFであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、HまたはNである、請求項64に記載のライブラリー。
- Vλ−2 CDR−L1領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ10である、請求項63に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、VGX1YNYVSWYのアミノ酸配列を含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはGである、請求項66に記載のライブラリー。
- Vλ−3 CDR−L1領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ7である、請求項63に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、アミノ酸配列X1X2X3A/VX4WYを含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、KまたはTであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、K、QまたはEであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはFであり、X4がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはCである、請求項68に記載のライブラリー。
- 所与の正準構造に関連して選択されたCDRの画定により決定されるVL(λ)CDR−L2の長さが、長さ10からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- Vλ−1 CDR−L2領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ10である、請求項70に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、アミノ酸配列LLIYX1NN/SX2RPを含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはEであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、QまたはKである、請求項71に記載のライブラリー。
- Vλ−2 CDR−L2領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ10である、請求項70に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、アミノ酸配列LM/IIYE/DVX1X2RPを含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはKである、請求項73に記載のライブラリー。
- Vλ−3 CDR−L2領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ10である、請求項70に記載のライブラリー。
- CDR−L1が、アミノ酸配列LVI/VYX1DX2X3RPを含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、Q、E、KまたはGであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、KまたはEである、請求項75に記載のライブラリー。
- CDRの画定により決定されるVL(λ)CDR−L3鎖長が、長さ8、9、10および11からなる群から選択される、請求項12に記載のライブラリー。
- CDR−L3領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ8である、請求項77に記載のライブラリー。
- CDR−L3が、アミノ酸配列QS/AWDX1SX2X3を含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはGであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、T、LまたはGであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、V、W、QまたはLである、請求項78に記載のライブラリー。
- CDR−L3領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ9である、請求項77に記載のライブラリー。
- CDR−L3が、アミノ酸配列QS/AYD/AX1SX2X3X4を含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、GまたはTであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、LまたはTであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、TまたはLであり、X4がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、V、W、L、FまたはGである、請求項80に記載のライブラリー。
- CDR−L3領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ10である、請求項77に記載のライブラリー。
- CDR−L3が、アミノ酸配列QS/AWDX1SL/SX2X3X4を含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、TまたはGであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、G、LまたはVであり、X4がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、V、WまたはGである、請求項82に記載のライブラリー。
- CDR−L3領域が、接触によるCDR画定に従うと長さ11である、請求項77に記載のライブラリー。
- CDR−L3が、アミノ酸配列QS/AWDX1SL/SX2X3X4X5を含み、式中X1がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはGであり、X2がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはTであり、X3がA、D、S、I、P、R、Y、H、NまたはLであり、X4がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、V、LまたはFであり、X5がA、D、S、I、P、R、Y、H、N、V、WまたはGである、請求項84に記載のライブラリー。
- CDR領域が、約10%から約100%の閾値頻度で天然に出現するアミノ酸残基を含む、請求項1に記載のライブラリー。
- CDR領域は、CDR内の残基1個がLTM(look−through変異誘発)を用いて改変されている多様性を有する、請求項1に記載のライブラリー。
- CDR領域は、CDR内の複数の残基がWTM(walk−through変異誘発)を用いて改変されている多様性を有する、請求項1に記載のライブラリー。
- 抗体結合領域が、天然体細胞変異に相当する1個または複数のアミノ酸置換を更に含む、請求項1に記載のライブラリー。
- 発現ライブラリーである、請求項1に記載のライブラリー。
- 請求項90に記載のライブラリー、ここで発現ライブラリーが、リボソームディスプレイライブラリー、ポリソームディスプレイライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、細菌発現ライブラリー、および酵母ディスプレイライブラリーからなる群から選択される、ライブラリー。
- 少なくとも約104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012および1013からなる群から選択される抗体結合領域の多様性を含む、請求項1に記載のライブラリー。
- 1個または複数のフレームワーク領域および1個または複数のCDR領域をコードし、予め決定されたポリヌクレオチドを合成することによって生成する、請求項1に記載のライブラリーであって、前記領域をコードする該ポリヌクレオチドは十分な重複配列を更に含み、それによりポリヌクレオチド配列が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下で、完全な抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドに構築できるライブラリー。
- 画定したCDR領域をコードする前記ポリヌクレオチドが、WTM(walk−through変異誘発)、拡張WTM、LTM(look−through変異誘発)、およびそれらの組合せからなる群から選択される変異誘発法を用いて変異誘発されている、請求項93に記載のライブラリー。
- 次の規準:
i)各フレームワーク領域は、所定の抗原クラスに対する発現抗体において、ある閾値頻度以上で出現すること、および場合により、
ii)各フレームワーク領域は、生殖細胞系抗体配列において、ある閾値頻度以上で出現すること
に従って選択された、1個または複数のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、所定の多様性を有する1個または複数の画定されたCDR領域をコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、
を含む、請求項1に記載のライブラリーを生成する方法であって、前記領域をコードする該ポリヌクレオチドは十分な重複ポリヌクレオチド配列を更に含み、それによりポリヌクレオチド配列が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下で、完全な抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドに構築できる方法。 - 画定されたCDRの前記所定の多様性が、次の規準:
i)CDR領域の長さは、選択されたフレームワーク領域の生成した正準構造により決定されること、および
ii)CDR領域は、画定されたCDR領域内で天然に起こることが判明している閾値出現頻度で、アミノ酸残基の多様性を含むこと、
に従って設計される、請求項95に記載の方法。 - 前記所定の多様性が、WTM(walk−through変異誘発)、拡張WTM、LTM(look−through変異誘発)、およびそれらの組合せからなる群から選択される変異誘発を用いて導入される、請求項96に記載の方法。
- 請求項87に記載の発現ライブラリーを発現させることにより、抗体結合領域を産生するステップ、および
該抗体結合領域をスクリーニングすることにより、所望の結合親和性を有する抗体結合領域を選択するステップ
を含む、所望の結合親和性を有するポリペプチドを特定する方法。 - 請求項98に記載の方法、
ここで前記スクリーニングが、抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドと結び付いた状態で、該抗体結合領域を標的物質と接触させることを含む、方法。 - 選択した抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドを特定するステップを更に含む、請求項98に記載の方法。
- 請求項99に記載の方法、
ここで前記ポリヌクレオチドが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイからなる群から選択される発現ディスプレイを用いて、抗体結合領域と結び付けられる、方法。 - 請求項99または100に記載の方法により特定した抗体結合領域。
- 1つまたは複数のステップがコンピュータ支援される請求項95または98に記載の方法。
- 請求項103の方法の1つまたは複数のステップを実行するための指示を有する、電子装置での使用に適した媒体。
- 請求項104の方法の1つまたは複数のステップを実行するための装置。
- a)図または表のいずれかに示した配列を有する1個または複数のフレームワーク領域、および
b)図または表のいずれかに示した配列を有する1個または複数のCDR領域
を含み、
ここでa)のフレームワーク領域およびb)のCDR領域が、所定の抗原クラスに対する抗体結合領域を共同で形成する、
抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドのライブラリー。
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