JP2008532476A - 複合結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Tie1及びTie2は膜貫通ドメインを包含するレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Tie1及びTie2は内皮細胞上に存在する。本開示は内皮細胞の活性及び新脈管形成を阻害するものを包含するTie1、Tie2及びAngに結合する抗体のような薬剤を説明する。薬剤は新脈管形成関連障害を治療するために使用できる。一局面において、本発明は、被験体におけるTie複合体形成またはTie複合体成分間の相互作用を調節する方法を特徴とする。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国出願番号11/049,536(2005年2月2日出願)の一部継続出願であり、この11/049,536は、米国出願番号10/916,840(2004年8月12日出願)の一部継続出願であり、これは米国出願番号60/494,713号(2003年8月12日出願)に対して優先権を主張する。本出願はまた、PCT/US2004/026116(2004年8月12日出願)の一部継続出願であり、これは米国出願番号60/494,713(2003年8月12日出願)に対して優先権を主張する。上記出願の各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
本出願は、米国出願番号11/049,536(2005年2月2日出願)の一部継続出願であり、この11/049,536は、米国出願番号10/916,840(2004年8月12日出願)の一部継続出願であり、これは米国出願番号60/494,713号(2003年8月12日出願)に対して優先権を主張する。本出願はまた、PCT/US2004/026116(2004年8月12日出願)の一部継続出願であり、これは米国出願番号60/494,713(2003年8月12日出願)に対して優先権を主張する。上記出願の各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
(背景)
血管により供給される酸素および栄養素は、組織の発達と機能にとって極めて重要である。実際、心臓血管系は胚で発達する最初の器官系である。器官形成中および組織または腫瘍の発達中、成長細胞の循環系への近接は、血管および器官実質の調和した成長によって確保される。血管の発達または血管形成を調節することにより病気を予防または治療することが可能であり得る。
血管により供給される酸素および栄養素は、組織の発達と機能にとって極めて重要である。実際、心臓血管系は胚で発達する最初の器官系である。器官形成中および組織または腫瘍の発達中、成長細胞の循環系への近接は、血管および器官実質の調和した成長によって確保される。血管の発達または血管形成を調節することにより病気を予防または治療することが可能であり得る。
血管は、内皮細胞の内層および周皮細胞または平滑筋細胞の外層からなる。最初の管状構造物は内皮細胞により形成され、続いてこの内皮細胞は、周皮細胞および平滑筋細胞を補充して形成された管状構造物を外筒で覆う。中胚葉に由来する内皮前駆細胞の分散した個体群からの血管のde novo形成を脈管形成と呼ぶ。この初生のネットワークは、発芽、***および再造形等の連続的な形態形成のイベントを受けて、大きい血管から分岐した小さな血管までの階層血管ネットワークを発生させる。これらの連続的な形態形成のイベントをまとめて血管形成と呼ぶ。以前の研究は、血管の脈管形成と血管形成の発達を媒介する多くの内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼ(RTK)およびそれらの同起源のリガンドを同定した。血管内皮成長因子(VEGF)ファミリーのメンバーおよびそれらのリセプターは初期の胚の脈管叢組織の形成中に機能する一方で、アンギオポイエチン(Ang)およびそれらのレセプターTie2、ならびにエフリンおよびそれらのEphレセプターがその後の再造形プロセスに関与する。血管形成およびリンパ管形成応答に関与するレセプターの検討については、例えば、非特許文献1を参照されたい。
Tie1およびTie2は、内皮細胞および造血細胞でほとんど排他的に発現されるRTKである。これらの2つのレセプターは、胚形成の間の脈管構造の正常な発達に必要とされる。これら2つのTieレセプターは、他のRTKファミリーメンバーとは異なり細胞外EGFホモロジードメインを含むので、RTKサブファミリーを形成する。例えば、非特許文献2および特許文献1を参照のこと。マウスにおけるTie1遺伝子の標的された破壊は、広範な出血および欠損微小血管完全性によって特徴付けられる致死性の表現型を生じる。例えば、非特許文献3を参照のこと。Tie2ヌル胚は、内皮細胞周囲を支持する細胞の不適切な漸増に起因する、脈管再構築および成熟の欠損を有する。脈管形成(Ang、例えば、Ang1、Ang2、Ang3およびAng4)は、Tie2と相互作用するタンパク質である。
国際公開第93/14124号パンフレット
Jones et al.Nat.Rev.Molec.Cell Biol (2001)2:257
Partanen,Mol.Cell Biol.12,(1992),1698
Puriら,EMBO J.14,(1995),5884
(要旨)
一局面において、本発明は、被験体におけるTie複合体形成またはTie複合体成分間の相互作用を調節する方法を特徴とする。その方法はTie1に結合する薬剤を被験体に投与することを包含する。例えば薬剤はTie1自己会合(例えばホモ2量体化)を促進し、または、以下のもの、すなわちTie1、Tie2およびアンジオポエチン(Ang;例えばAng1、Ang2、Ang3またはAng4)の少なくとも2つの間の会合に拮抗する。一実施形態において、薬剤の結合はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合はTie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。
一局面において、本発明は、被験体におけるTie複合体形成またはTie複合体成分間の相互作用を調節する方法を特徴とする。その方法はTie1に結合する薬剤を被験体に投与することを包含する。例えば薬剤はTie1自己会合(例えばホモ2量体化)を促進し、または、以下のもの、すなわちTie1、Tie2およびアンジオポエチン(Ang;例えばAng1、Ang2、Ang3またはAng4)の少なくとも2つの間の会合に拮抗する。一実施形態において、薬剤の結合はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合はTie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。
一実施形態において、薬剤はTie1に結合する。一実施形態において、薬剤はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤は、Tie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、薬剤はTie1の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりTie1をTie1と会合させ、そしてTie1のTie2および/またはAngとの会合を防止する。薬剤はTie1への結合のために少なくとも2つの結合価を有する。一実施形態において、薬剤はTie1のリン酸化、例えばTie1の自己リン酸化を増大させる。この増大はTie1の自己会合に依存することができるが必須ではない。
一実施形態において、薬剤は、ヒトTie1の細胞外ドメインに結合するタンパク質、例えば抗体を包含する。例えば、抗体は以下のもの、即ち、ヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換えのもののうち1つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はTie1の第1のIg様C2型ドメイン(Ig1)または第2のIg様C2型ドメイン(Ig2)に結合することができる。一実施形態において、抗体はTie1のEGF様ドメイン(例えば第1、第2または第3のEGF様ドメイン)に結合する。一実施形態において、抗体はTie1のフィブロネクチンIII型リピートに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号2のアミノ酸残基24〜124、74〜174、124〜224、174〜274、224〜324、274〜374、324〜424、374〜474、424〜524、474〜574、524〜624、574〜674、624〜724、674〜759または724〜759に結合する。
一実施形態において、薬剤はTie1エクトドメインに結合するタンパク質を包含し、そして、重鎖(HC)免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖(LC)免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含する。タンパク質は更に以下、即ち、(1)可変ドメイン配列の少なくとも1つがE3またはE3b抗体のCDR少なくとも1つ(例えばE3またはE3b抗体のCDR1、2または3つ)を含み;(2)可変ドメイン配列の少なくとも1つがE3またはE3b抗体の対応する可変ドメインのCDRに合計で少なくとも85%同一であるCDR配列を含み、(3)可変ドメインの少なくとも1つがE3またはE3b抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも85%同一であり、そして(4)タンパク質はTie1への結合に関してE3またはE3bと競合するか、または、Tie1上のE3またはE3bにより結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するという特性の1つ以上を包含する。Tie1への結合に関してE3と競合する抗原結合部位を含む抗体の例は、M0044B08、M0056G08、M0045B03、M0053F04、M0055E10、M0060H01、M0054H10、M0058F03および関連する抗体を包含する。
一実施形態において、薬剤はE3またはE3b抗体のHCおよび/またはLC可変ドメイン、または、E3またはE3b抗体のHCおよび/またはLC可変ドメインと少なくとも70、80、85、90、95、98、99%同一の配列を包含する。一実施形態において、HC可変ドメイン配列のアミノ酸配列はE3またはE3bクローン由来のCDR1、CDR2およびCDR3を包含し、そしてLC可変ドメイン配列はE3またはE3bクローン由来のCDR1、CDR2およびCDR3を包含する。一実施形態において、薬剤はE3またはE3b抗体を含む。LC可変ドメイン配列は配列番号116を包含することができる。HC可変ドメイン配列は配列番号114を包含することができる。一実施形態において、HCおよびLCフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態においては、薬剤は配列番号723および配列番号724を包含する。
一実施形態において、薬剤はTie2に結合する。一実施形態において、薬剤はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合は、Tie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、薬剤はTie2の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりTie2をTie2と会合させ、そしてTie2のTie1および/またはAngとの会合を防止する。一実施形態において、薬剤は、ヒトTie2の細胞外ドメインに結合するタンパク質、例えば抗体を包含する。例えば、抗体は以下のもの、即ち、ヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換えのもののうち1つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はTie2の第1のIg様C2型ドメイン(Ig1)または第2のIg様C2型ドメイン(Ig2)に結合することができる。一実施形態において、抗体はTie2のEGF様ドメイン(例えば第1、第2または第3のEGF様ドメイン)に結合する。一実施形態において、抗体はTie2のフィブロネクチンIII型リピートに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号162のアミノ酸残基19〜119、69〜169、119〜229、169〜269、229〜329、269〜369、329〜429、369〜469、429〜529、469〜569、529〜629、569〜669、629〜729、669〜745または729〜745に結合する。
一実施形態において、薬剤はAng(例えばAng1、Ang2、Ang3またはAng4)に結合する。一実施形態において、薬剤はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合は、Tie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。一実施形態において、薬剤はAngに結合する抗体のようなタンパク質を包含する。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の1つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はAng1のN末端ドメイン(例えばAng1のN末端50アミノ酸)に結合する。一実施形態において、抗体はAng1のコイルドコイルドメインに結合する。一実施形態において、抗体はAng1のフィブリノーゲン様ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号163のアミノ酸残基1〜100、50〜150、100〜200、150〜250、200〜300、250〜350、300〜400、350〜450、400〜497または450〜497に結合する。
一実施形態において、薬剤は重鎖(HC)免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖(LC)免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含するタンパク質を含む。一実施形態において、HCおよびLCフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態において。薬剤はまたFcドメインも包含する。一実施形態において、薬剤はヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の定常ドメインを包含する。一実施形態において、重鎖の定常ドメインはアロタイプ、(a,z)アロタイプまたは何れかの他のアロタイプである。
一実施形態において、薬剤は血管発生または新脈管形成を低減するために有効な量において投与される。一実施形態において、被験体は新脈管形成関連障害を有する。一実施形態において、被験体は例えば新生物障害、転移癌、新脈管構造依存性の癌または腫瘍、炎症性障害、関節リウマチまたは乾癬を有する。一実施形態において、タンパク質は全身投与される。
別の実施形態においては、タンパク質は以下の活動、即ち、新芽形成、分離、血管リモデリング、脈管形成および細管形成の1つ以上を低減するために有効な量で投与される。方法は本明細書に記載する他の特徴を包含する。
一局面において、本発明は被験体における内皮細胞活性を低減または阻害する方法を包含し、その方法は、被験体において内皮細胞活性を低減または阻害するために有効な量のTie複合体形成を低減または阻害する薬剤を投与することを包含する。方法は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
一局面において、本発明はTie1のリン酸化を促進する薬剤を投与することによる内皮細胞活性を低減する方法を包含する。一実施形態において、リン酸化は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。
別の局面において、本発明は内皮細胞活性を低減する方法を包含し、方法はシグナリング経路を活性化する薬剤を投与することによる。一実施形態においてシグナリング経路は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。例えば薬剤はTie1自己リン酸化を増大させる。方法は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
一局面において、本発明は被験体におけるTie複合体形成を調節するための抗体を包含し、ここで抗体は以下のもの、即ち、Tie1、Tie2およびアンジオポエチン(Ang)の少なくとも2つの間の会合に拮抗する。一実施形態において、抗体はTie複合体成分に、または、Tie1、Tie2およびAngの1つ以上に結合する。一実施形態において、抗体はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態において、抗体は、Tie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。
一実施形態において、抗体はTie1に結合する。一実施形態において、抗体はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Tie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、抗体はTie1の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりTie1をTie1と会合させ、そしてTie1のTie2および/またはAngとの会合を防止する。別の実施形態において、抗体はTie1のリン酸化を増大および/またはTie1のTie2またはAngとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はヒトTie1の細胞外ドメインに結合する抗体を包含する。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の1つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はTie1の第1のIg様C2型ドメイン(Ig1)または第2のIg様C2型ドメイン(Ig2)に結合することができる。一実施形態において、抗体はTie1のEGF様ドメイン(例えば第1、第2または第3のEGF様ドメイン)に結合する。一実施形態において、抗体はTie1のフィブロネクチンIII型リピート領域に結合する。一実施形態において、抗体は配列番号2のアミノ酸残基24〜124、74〜174、124〜224、174〜274、224〜324、274〜374、324〜424、374〜474、424〜524、474〜574、524〜624、574〜674、624〜724、674〜759または724〜759に結合する。
一実施形態において、抗体はTie1エクトドメインに結合し、そして重鎖(HC)免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖(LC)免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含し、タンパク質は更に以下、即ち、(1)可変ドメイン配列の少なくとも1つがE3またはE3b抗体のCDR少なくとも1つを含み;(2)可変ドメイン配列の少なくとも1つがE3またはE3b抗体の対応する可変ドメインのCDRに合計で少なくとも85%同一であるCDR配列を含み、(3)可変ドメインの少なくとも1つがE3またはE3b抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも85%同一であり、そして(4)タンパク質はTie1への結合に関してE3またはE3bと競合するか、または、Tie1上のE3またはE3bにより結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するという特性の1つ以上を包含する。例えば、抗体は少なくとも2価であり、例えばTie1に結合する抗原結合部位少なくとも2つを有する。一実施形態において、抗体はE3、E3b(例えばDX−2220)またはDX−2240を含む。
一実施形態において、抗体はE3またはE3b由来の可変ドメイン1つ以上、または、そのような可変ドメインに少なくとも70、80、85、90、95、98、99%同一の可変ドメイン配列を包含する。一実施形態において、HC可変ドメイン配列のアミノ酸配列はE3またはE3bクローン由来のCDR1、CDR2およびCDR3配列を包含し、そしてLC可変ドメイン配列はE3またはE3bクローン由来のCDR1、CDR2およびCDR3配列を包含する。一実施形態において、LC可変ドメイン配列は配列番号116を包含する。一実施形態において、HC可変ドメイン配列は配列番号114を包含する。一実施形態において、HCおよびLCフレームワーク領域はヒト型である。
一実施形態において、抗体はTie2に結合する。一実施形態において、抗体はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Tie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、抗体はTie2の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりTie2をTie2と会合させ、そしてTie2のTie1またはAngとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はTie1のリン酸化を増大させる。一実施形態において、抗体はTie1のTie2またはAngとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はヒトTie2の細胞外ドメインに結合する抗体を包含する。抗体はこれ等の特性の1つ以上を有してよく、例えば抗体はTie1のリン酸化を促進し、Tie1のTie2またはAngとの会合を防止してよい。
例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の1つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はTie2の第1のIg様C2型ドメイン(Ig1)または第2のIg様C2型ドメイン(Ig2)に結合することができる。一実施形態において、抗体はTie2のEGF様ドメイン(例えば第1、第2または第3のEGF様ドメイン)に結合する。一実施形態において、抗体はTie2のフィブロネクチンIII型リピート領域に結合する。一実施形態において、抗体は配列番号162のアミノ酸残基19〜119、69〜169、119〜229、169〜269、229〜329、269〜369、329〜429、369〜469、429〜529、469〜569、529〜629、569〜669、629〜729、669〜745または729〜745に結合する。
一実施形態において、抗体はAngに結合する。一実施形態において、抗体はTie1、Tie2およびAngのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Tie1とTie2の間、Tie1とAngの間、または、Tie2とAngの間の会合に拮抗することができる。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の1つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はAng1のN末端ドメイン(例えばAng1のN末端50アミノ酸)に結合する。一実施形態において、抗体はAng1のコイルドコイルドメインに結合する。一実施形態において、抗体はAng1のフィブリノーゲン様ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号163のアミノ酸残基1〜100、50〜150、100〜200、150〜250、200〜300、250〜350、300〜400、350〜450、400〜497または450〜497に結合する。
一実施形態において、抗体は重鎖(HC)免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖(LC)免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含する。
一実施形態において、HCおよびLCフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態において、抗体はまたFcドメインを包含する。一実施形態において、抗体はIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の定常ドメインを包含する。
一実施形態において、抗体は血管発生または新脈管形成を低減するために有効な量において投与される。一実施形態において、抗体は全身投与される。一実施形態において、抗体は以下の活動、即ち、新芽形成、分離、血管リモデリング、脈管形成および細管形成の1つ以上を低減するために有効な量で投与される。
一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体の可変ドメイン1つ以上を包含する単離されたタンパク質を包含する。
一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体の可変ドメインを包含するポリペプチドをコードするコーディング配列を包含する核酸を包含する。
一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体を包含する薬学的組成物を包含する。組成物および抗体は本明細書記載の他の特徴を包含できる。
一局面において、本発明は新脈管形成関連障害の治療のための本明細書記載の抗体を包含する。抗体および治療は本明細書記載の他の特徴を包含できる。
一局面において、本発明は新脈管形成関連障害を治療するための医薬の製造のための本明細書記載の抗体を包含する。医薬および抗体は本明細書記載の他の特徴を包含できる。
一局面において、本発明は第2の治療、例えば抗癌療法と組み合わせて第1の薬剤を投与することを包含する第1の治療を提供する方法を包含する。第1の薬剤はTie複合体形成を低減するか、またはTie1ホモ二量体化を増大させる薬剤である。例えば第1の薬剤はTie1結合タンパク質である。一実施形態において、第2の療法は放射線療法または手術を包含する。一実施形態において、第2の療法は第2の薬剤を投与することを包含する。例えば、第2の薬剤はTie複合体形成を拮抗または低減するか、またはTie1ホモ二量体化を増大させる。一実施形態において、第2の薬剤はVEGF経路を介したシグナリングに拮抗する薬剤、例えばVEGF拮抗剤抗体、例えばベバシズマブ;VEGFレセプターチロシンキナーゼ阻害剤またはVEGF経路シグナリングに拮抗する他の薬剤である。後述する「複合療法」も参照できる。
別の局面において、本発明はTie複合体形成を低減する薬剤および抗癌剤を包含する組成物を包含する。例えば、抗癌剤はTie複合体形成に拮抗する第2の薬剤またはVEGF経路に拮抗する第2の薬剤であることができる。
一局面において、本発明はTie1リン酸化を促進することにより内皮細胞活性を低減する抗体を特徴とする。例えば抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。
一つの局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、Tie1外部ドメインに結合するタンパク質(例えば、単離されたタンパク質)により特徴付けられる。この結合タンパク質は、Tie1外部ドメインに結合する。例えば、このタンパク質は、10−8M、5・10−9M、10−9M、10−10M、10−11Mまたは10−12M未満の親和性KDで結合する。
一実施形態において、重鎖および/または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のCDRは、ヒト、霊長類、非げっ歯類(例えば、非マウスまたは非ラット)または合成のものである。一実施形態において、重鎖および/または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域は、ヒト、霊長類または非げっ歯類(例えば、非マウスまたは非ラット)のものである。
一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を含む:
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR1:
(AGSR)−Y−(GVK)−M−(GSVF)(配列番号117)
(AGSIMRH)−Y−(GVMK)−M−(GSVMFH)(配列番号118)または
(AGSIMRNH)−Y−(AGTVMKPQ)−M−(AGSTVMYWFKH)(配列番号119);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR2:
X−I−Y−P−S−G−G−X−T−X−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号120)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WQ)−T−(GY)(配列番号121)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WNQ)−T−(GY)(配列番号160)
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WQ)−T−(GY)−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号122)
(GSVW)−I−(SY)−P−S−G−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)(配列番号123)または
X−I−Y−P−S−G−G−(WPS)−T−(YVH)−Y−A−D(配列番号722)(式中、Xは任意のアミノ酸である);
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR3:
V−(4または5残基)−F−D−(I/Y)(配列番号124)、
G−Y−G−P−I−A−P−G−L−D−Y(配列番号125)、
(GV)−N−Y−Y−(GYD)−S−(SD)−G−Y−G−P−I−A−P−G−L−D−Y(配列番号126)、
(GVD)−(AGLN)−(LYR)−(GSTLYH)−(GYD)−(AGSYFP)−(SFD)−(AGYD)−(IY)−(GFD)−(YDP)−(IP)−A−P−G−L−D−Y(配列番号127)、
A−P−R−G−Y−S−Y−G−Y−Y−Y(配列番号727)、
VNYYDSSGYGPIAPGLDY(配列番号128)または
G−X−X−G−(AY)−F−D−(Y1)(配列番号705)(式中、Xは任意のアミノ酸である)。
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR1:
(AGSR)−Y−(GVK)−M−(GSVF)(配列番号117)
(AGSIMRH)−Y−(GVMK)−M−(GSVMFH)(配列番号118)または
(AGSIMRNH)−Y−(AGTVMKPQ)−M−(AGSTVMYWFKH)(配列番号119);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR2:
X−I−Y−P−S−G−G−X−T−X−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号120)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WQ)−T−(GY)(配列番号121)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WNQ)−T−(GY)(配列番号160)
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WQ)−T−(GY)−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号122)
(GSVW)−I−(SY)−P−S−G−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)(配列番号123)または
X−I−Y−P−S−G−G−(WPS)−T−(YVH)−Y−A−D(配列番号722)(式中、Xは任意のアミノ酸である);
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR3:
V−(4または5残基)−F−D−(I/Y)(配列番号124)、
G−Y−G−P−I−A−P−G−L−D−Y(配列番号125)、
(GV)−N−Y−Y−(GYD)−S−(SD)−G−Y−G−P−I−A−P−G−L−D−Y(配列番号126)、
(GVD)−(AGLN)−(LYR)−(GSTLYH)−(GYD)−(AGSYFP)−(SFD)−(AGYD)−(IY)−(GFD)−(YDP)−(IP)−A−P−G−L−D−Y(配列番号127)、
A−P−R−G−Y−S−Y−G−Y−Y−Y(配列番号727)、
VNYYDSSGYGPIAPGLDY(配列番号128)または
G−X−X−G−(AY)−F−D−(Y1)(配列番号705)(式中、Xは任意のアミノ酸である)。
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を含む:
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR1:
R−A−S−Q−S−(IV)−S−(SR)−X1−Y−L−(AN)(配列番号129)、
R−A−S−Q−S−(IV)−S−S−(YS)−L−(ALN)(配列番号706)、
T−G−T−(SN)−S−D−V−G−(GS)−Y(配列番号707)、
(SCQ)−(GS)−(DS)−(NS)−(IL)−(GR)−S−(YKN)−(YS)−(VA)(配列番号708)、
R−A−S−Q−S−V−S−S−Z−L(配列番号130)、
R−A−S−Q−S−(IV)−S−(SR)(SY)−(LY)−(ALN)(配列番号131)または
R−A−S−(REQ)−(GSTRN)−(IV)−(GSTIRN)−(STIRH)−X1−(SYWNH)−(LV)−(ASN)(配列番号132)(式中、X1はセリンであるか、または不在であり得る);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CSR2:
X−A−S−X−R−A−T(配列番号133)(式中、Xは任意のアミノ酸であり得る)、
(AGD)−A−S−(STN)−R−A−T(配列番号134)、
(DG)−(AV)−S−N−(RL)−(AP)−(ST)(配列番号709)、
(AGD)−A−S−(STN)−(LR)−(AEQ)−(ST)(配列番号135)または
(AGTKDEH)−A−S−(STN)−(LR)−(AVEQ)−(ST)(配列番号136);および
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR3:
Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LWRH)−(TIY)(配列番号161)、
Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LWR)−(TIY)−T(配列番号137)、
(LQ)−Q−(SYFR)−(GSYN)−(SKN)−(STYW)−(RP)−(LWR)−(TIY)−T(配列番号138)、
Q−Q−X−S−(SN)−(WS)−P−X−T−F(配列番号710)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
Y−(TG)−(SG)−S−(PGS)−(TN)−X−(VT)(配列番号711)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
Q−Q−(YR)−(GS)−S−(SW)−P−R−X1−T(配列番号139)(式中、X1は任意のアミノ酸であるか、または不在であり得る)、
Q−Q−F−N−S−Y−P−H(配列番号728)、
(LQ)−(LQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(STRKN)−(STYWF)−(RP)−(ILMWRH)−(TIY)−(TI)(配列番号140)または
(LQ)−(LRQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(ASTRKN)−(STYWF)−(SVRP)−(STILMWRH)−(TIY)−(STI)(配列番号141)。
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR1:
R−A−S−Q−S−(IV)−S−(SR)−X1−Y−L−(AN)(配列番号129)、
R−A−S−Q−S−(IV)−S−S−(YS)−L−(ALN)(配列番号706)、
T−G−T−(SN)−S−D−V−G−(GS)−Y(配列番号707)、
(SCQ)−(GS)−(DS)−(NS)−(IL)−(GR)−S−(YKN)−(YS)−(VA)(配列番号708)、
R−A−S−Q−S−V−S−S−Z−L(配列番号130)、
R−A−S−Q−S−(IV)−S−(SR)(SY)−(LY)−(ALN)(配列番号131)または
R−A−S−(REQ)−(GSTRN)−(IV)−(GSTIRN)−(STIRH)−X1−(SYWNH)−(LV)−(ASN)(配列番号132)(式中、X1はセリンであるか、または不在であり得る);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CSR2:
X−A−S−X−R−A−T(配列番号133)(式中、Xは任意のアミノ酸であり得る)、
(AGD)−A−S−(STN)−R−A−T(配列番号134)、
(DG)−(AV)−S−N−(RL)−(AP)−(ST)(配列番号709)、
(AGD)−A−S−(STN)−(LR)−(AEQ)−(ST)(配列番号135)または
(AGTKDEH)−A−S−(STN)−(LR)−(AVEQ)−(ST)(配列番号136);および
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR3:
Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LWRH)−(TIY)(配列番号161)、
Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LWR)−(TIY)−T(配列番号137)、
(LQ)−Q−(SYFR)−(GSYN)−(SKN)−(STYW)−(RP)−(LWR)−(TIY)−T(配列番号138)、
Q−Q−X−S−(SN)−(WS)−P−X−T−F(配列番号710)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
Y−(TG)−(SG)−S−(PGS)−(TN)−X−(VT)(配列番号711)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
Q−Q−(YR)−(GS)−S−(SW)−P−R−X1−T(配列番号139)(式中、X1は任意のアミノ酸であるか、または不在であり得る)、
Q−Q−F−N−S−Y−P−H(配列番号728)、
(LQ)−(LQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(STRKN)−(STYWF)−(RP)−(ILMWRH)−(TIY)−(TI)(配列番号140)または
(LQ)−(LRQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(ASTRKN)−(STYWF)−(SVRP)−(STILMWRH)−(TIY)−(STI)(配列番号141)。
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を有する:
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR1:
S−X−(ND)−(IV)−(AG)−X1−X2−X3(配列番号142)または
T−(GR)−(ST)−S−X5−(ND)−(IV)−(AG)−X1−X2−X3−Y−X4−S(配列番号143)(式中、X1は任意のアミノ酸(例えば、GまたR)であり、X2は任意のアミノ酸(例えば、YまたはN)であり、X3は任意のアミノ酸(例えば、F、NまたはK)であり、X4は任意のアミノ酸(例えば、脂肪族、例えば
VまたはA)である);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR2:
(DE)−V−N−N−R−P−S(配列番号144)、
(DE)−(VD)−(STDN)−(YRDN)−R−P−S(配列番号145);
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR3:
(SQ)−S−(SY)−(ASID)−(GSR)−(ST)−(STRN)−(STYR)−(ATLY)−(SVWQ)(配列番号146)。
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR1:
S−X−(ND)−(IV)−(AG)−X1−X2−X3(配列番号142)または
T−(GR)−(ST)−S−X5−(ND)−(IV)−(AG)−X1−X2−X3−Y−X4−S(配列番号143)(式中、X1は任意のアミノ酸(例えば、GまたR)であり、X2は任意のアミノ酸(例えば、YまたはN)であり、X3は任意のアミノ酸(例えば、F、NまたはK)であり、X4は任意のアミノ酸(例えば、脂肪族、例えば
VまたはA)である);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR2:
(DE)−V−N−N−R−P−S(配列番号144)、
(DE)−(VD)−(STDN)−(YRDN)−R−P−S(配列番号145);
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR3:
(SQ)−S−(SY)−(ASID)−(GSR)−(ST)−(STRN)−(STYR)−(ATLY)−(SVWQ)(配列番号146)。
一実施形態において、HC CDR2は以下のとおりのアミノ酸配列を含む:
(GSVW)−I−(SY)−P−SG−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)−Y−(AT)−D−S−V−K−G(配列番号147)または(GSV)−I−(SY)−P−SG−G−(WQ)−T−(GY)−Y−(AT)−D−S−V−K−G(配列番号148)。
(GSVW)−I−(SY)−P−SG−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)−Y−(AT)−D−S−V−K−G(配列番号147)または(GSV)−I−(SY)−P−SG−G−(WQ)−T−(GY)−Y−(AT)−D−S−V−K−G(配列番号148)。
一実施形態において、タンパク質は、p−F3、E3またはE3bの対応するCDR配列に関連するHC CDR1およびHC CDR2配列を含む。例えば、タンパク質は、配列MYGM(配列番号149)をHC CDR1に対応する位置に含む。この配列の後に小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリンまたはセリンが続き得る。別の実施例において、タンパク質は、配列VISPSGGX1TX2YADSAVKG(配列番号150)をHC CDR2に対応する位置に含む。例えば、X1は親水性アミノ酸、例えばグルタミンまたはアスパラギンであり得る。例えば、X2は小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリンまたはセリンであり得る。
一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は以下の特徴、即ち、Kabat31位におけるアミノ酸残基がA、H、K、N、Q、R、SまたはT、例えばH、N、RまたはSであり;Kabat32位におけるアミノ酸残基がYであり;Kabat33位におけるアミノ酸残基がG、K、P、RまたはV、例えばKまたはVであり;Kabat34位におけるアミノ酸残基がMであり;Kabat35位におけるアミノ酸残基がA、G、H、I、L、M、SまたはV、例えばGHMまたはVであり;Kabat50位におけるアミノ酸残基がG、R、SまたはV、例えばSまたはVであり;Kabat51位におけるアミノ酸残基がIであり;Kabat52位におけるアミノ酸残基がSまたはY、例えばYであり;Kabat52a位におけるアミノ酸残基がPまたはS、例えばPであり;Kabat53位におけるアミノ酸残基がSであり;Kabat54位におけるアミノ酸残基がGであり;Kabat55位におけるアミノ酸残基がGであり;Kabat56位におけるアミノ酸残基がA、F、H、I、Q、WまたはY、例えばA、WまたはYであり;Kabat57位におけるアミノ酸残基がTであり;Kabat58位におけるアミノ酸残基がR、S、TまたはY、例えばYであること;の1つ以上を有することができる。一実施形態において、CDR3の長さは8〜18アミノ酸、例えば8〜12、8〜10、または15〜17アミノ酸である。
一実施形態において、HC可変ドメイン配列の二つまたは三つのCDRは、本明細書中に記載される抗体のHC可変ドメインにも適合するモチーフに適合する。同様に、一実施形態において、LC可変ドメイン配列の二つまたは三つのCDRは、本明細書中に記載される抗体のLC可変ドメインにも適合するモチーフに適合する。さらに別の実施形態において、CDRに適合したモチーフは、本明細書中に記載される抗体で対となるHCおよびLCに基づく。
一実施形態において、H1およびH2の超可変ループは、本明細書中に記載される抗体と同じ標準構造を有する。一実施形態において、L1とL2の超可変ループは本明細書中に記載の抗体と同じ標準構造を有する。
一実施形態において、HC CDR1アミノ酸配列は少なくとも5個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも3個、4個または5個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のHCのCDR1配列と同一である。一実施形態において、HC CDR2アミノ酸配列は、少なくとも15個、16個または17個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも10個、12個、14個、15個、16個または17個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のHCのCDR2配列と同一である。一実施形態において、HC CDR2アミノ酸配列は、少なくとも17個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも14個、15個、16個または17個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のHCのCDR2配列と同一である。一実施形態において、HC CDR3アミノ酸配列は、少なくとも7個または8個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも5個、6個、7個または8個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のHCのCDR3配列と同一である。
一実施形態において、HC可変ドメイン配列の二つまたは三つのCDRは本明細書中に記載されるモチーフに適合して、該モチーフは本明細書中に記載されるクローン、例えばE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のHC可変ドメインに適合するモチーフの組となる。例えば、このタンパク質は、配列番号118および配列番号160、例えばE3 HC可変ドメインに適合するモチーフを含み得る。
一実施形態において、LC CDR1アミノ酸配列は、少なくとも10個、11個または12個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも7個、8個、9個、10個または11個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のLCのCDR1配列と同一である。一実施形態において、LC CDR2アミノ酸配列は、少なくとも6個または7個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも5個、6個または7個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のLCのCDR2配列と同一である。一実施形態において、LC CDR3アミノ酸配列は、少なくとも8個、9個または10個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも7個、8個、9個または10個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のLCのCDR3配列と同一である。
一実施形態において、LC可変ドメイン配列の二つまたは三つのCDRは、本明細書中に記載されるモチーフに適合して、該モチーフが、本明細書中に記載されるクローン、例えばE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のLC可変ドメインに適合するモチーフの組となる。例えば、このタンパク質は、配列番号132、配列番号136および配列番号161、例えばE3 LC可変ドメインに適合するモチーフを含み得る。
一実施形態において、HC可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンE3、E3b、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のHC可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または100%同一である。
一実施形態において、LC可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のLC可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または100%同一である。
一実施形態において、HCおよびLC可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、E3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、および本明細書中の任意の他の抗体からなる群から選択されるクローンのHCおよびLC可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または100%同一である。
一実施形態において、HCおよび/またはLC可変ドメインの一つ以上のフレームワーク領域(例えば、FR1、FR2、FR3および/またはFR4)のアミノ酸配列は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4、または本明細書中に記載の別の抗体のHCおよびLC可変ドメインの対応するフレームワーク領域と、少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または100%同一である。
一実施形態において、HCおよびLC可変ドメイン配列のアミノ酸配列はE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3,s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10またはs−H4または本明細書に記載した他の抗体の可変ドメインをコードする核酸にハイブリダイズ(例えば高ストリンジェンシー下)する核酸によりコードされる配列を含む。
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。
タンパク質は、Tie1を発現する細胞、例えば内皮細胞に結合し得る。一実施形態において、タンパク質は、血小板(例えば、静止および/または活性化血小板)に実質的に結合しない(例えば、検出可能に結合しない)。
一実施形態において、タンパク質はインビトロのHUVECによる管形成を阻害する。例えば、E3抗体はインビトロのHUVECによる管形成を阻害する(例えば実施例18に記載の条件下)。一実施形態において、タンパク質はインビボMATRIGEL(登録商標)プラグ試験において新脈管形成を阻害する。例えばE3抗体は例示的な試験(例えば実施例21に記載する例示的な試験を参照)において新脈管形成を阻害できる。
一実施形態において、タンパク質は、組織切片中のメラノーマ関連構造物(例えば、メラノーマ組織)のみならず、周囲構造物の抗原を認識する。一実施形態において、タンパク質は、組織切片中の正常な皮膚の血管を染色しない。
一実施形態において、タンパク質はTie1に特異的に結合し、例えば、該タンパク質は別のヒトタンパク質(例えば、Ig様ドメイン、EGF様ドメインまたはフィブロネクチンタイプIIIリピートを有するTie1以外の天然タンパク質であるTie2、またはヒト血清アルブミン)に比較して、少なくとも10倍、50倍、100倍、103倍または104倍、優先的にTie1に結合する。一実施形態において、タンパク質は、本明細書中に記載されるTie1ドメインに結合する。
別の局面において、本発明は、Tie1の活性を調節するタンパク質(例えば、単離タンパク質)、例えばTie1レセプターにより特徴付けられる。例えば、このタンパク質は天然のものではない。一実施形態において、タンパク質は、HCおよびLC免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、重鎖および/または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のCDRは、ヒト、霊長類、非げっ歯類(例えば、非マウスまたは非ラット)または合成のものである。一実施形態において、重鎖および/または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域は、ヒト、霊長類または非げっ歯類(例えば、非マウスまたは非ラット)のものである。別の実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリン可変ドメインを実質的に含まず、例えばタンパク質は、独立してTie1と相互作用するペプチド、または免疫グロブリン可変ドメインを含まないポリペプチドを含む。
一実施形態において、タンパク質はTie1タンパク質の活性、例えば実施例2に記載したTie1/EpoRキメラBaF32おける活性を活性化する。この試験において活性化を示すタンパク質は他の条件、例えばインビボにおいて拮抗剤として挙動できる。
一実施形態において、タンパク質は、E3、E3bもしくは他の抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメイン、E3、E3bもしくは本明細書中に記載の他の抗体の各CDRと、CDR領域において少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%、同一であるHCおよび/またはLC免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、タンパク質はTie1への結合に関してE3、E3bもしくは本明細書中に記載の他の抗体と競合するか、あるいはE3、E3bもしくは本明細書中に記載の他の抗体により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープ、またはE3、E3bもしくは本明細書中に記載の他の抗体により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つもしくは三つの残基を有するエピトープに結合する。
一実施形態において、活性化タンパク質は、Tie1細胞外ドメインおよびEpoR細胞内ドメイン等のキメラレセプターを発現するIL−3依存性細胞が、IL−3の不在において生存することを可能とする。
一実施形態において、タンパク質は、Tie1の二量体化を引き起こし得る。一実施形態において、タンパク質は、Tie1のRTKドメインの自己リン酸化を引き起こし得る。
一実施形態において、タンパク質は、E3もしくはE3b抗体と共働して、(例えば、Tie1/EpoRキメラBaF3細胞アッセイにおいて)Tieの活性を活性化する。一実施形態において、タンパク質は、G2もしくはC7抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメイン、またはCDR領域において少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%、同一であるドメインを含む。一実施形態において、タンパク質は、Tie1への結合に関してG2もしくはC7と競合するか、あるいはG2もしくはC7により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープ、またはG2もしくはC7により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つもしくは三つの残基を有するエピトープに結合する。
別の実施形態において、タンパク質は、Tie1タンパク質の活性を中和する。例えば、このタンパク質は、E3またはE3b抗体の能力を少なくとも部分的に阻害して、Tieタンパク質に作用し得る。一実施形態において、タンパク質は、Tie1細胞外ドメインおよびEpoR細胞内ドメイン等のキメラレセプターを発現するIL−3依存性細胞がIL−3の不在において生存することを可能とするE3またはE3b抗体の能力を少なくとも部分的に阻害し得る。
一実施形態において、タンパク質のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメイン配列は、B2またはD11の各免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%、同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Tie1結合タンパク質は、B2、D11、A2、A10、P−B1、P−B3およびP−C6からなる群から選択される抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメイン、あるいはCDR領域において各抗体のCDR領域と、少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%、同一である免疫グロブリンドメインを含む。例えば、このタンパク質は、10−8M、5・10−9M、10−9M、10−10M、10−11Mまたは10−12M未満の親和力KDで結合する。
一実施形態において、タンパク質は、天然のTie1結合タンパク質の能力がTieタンパク質と相互作用することを少なくとも部分的に阻害し得る。
タンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、例えば、蛍光励起細胞分離により検出されるように、Tie1外部ドメインに結合するが、血小板には実質的に結合しない抗体(例えば、単離された抗体)により特徴付けられる。例えば、抗体は、活性化血小板および/または静止血小板には実質的に結合しない。一実施形態において、抗体は内皮細胞に結合する。一実施形態において、タンパク質はモノクローナル抗体である。この抗体は、他の特性を有する他のTie1結合抗体を含まない(例えば、血小板と結合するTie1結合抗体を含まない)調製物中に提供し得る。この抗体は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、非刺激状態の内因性Tie1タンパク質と比較して、E3またはE3b抗体により安定化した立体配座のTie1タンパク質に優先的に結合するタンパク質(例えば、単離されたタンパク質)により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンHCおよびLCドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、Tie1に独立して結合するペプチド(例えば、30、28、25、22、20、18、16または14アミノ酸未満の長さのペプチド)を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、単量体Tie1タンパク質に比較して、二量体立体配座のTie1タンパク質に優先的に結合するタンパク質(例えば、単離されたタンパク質)により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンHCおよびLCドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してTie1に結合するペプチド(例えば、30、28、25、22、20、18、16または14アミノ酸未満の長さのペプチド)を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、AngまたはTie1との相互作用に偏する立体配座のTie2タンパク質に優先的に結合するタンパク質(例えば、単離されたタンパク質)により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンHCおよびLCドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してTie2に結合するペプチド(例えば、30、28、25、22、20、18、16または14アミノ酸未満の長さのペプチド)を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。本発明はまた、これらの特性のうちの1つ以上を有する核酸アプタマーにより特徴付けられる。
別の実施形態において、本発明はAngタンパク質に優先的に結合し、そしてTie1およびTie2との相互作用を調節(例えば阻害)するタンパク質(例えば単離されたタンパク質)を特徴とする。一実施形態において、タンパク質は免疫グロブリンHCおよびLCドメインを包含する。別の実施形態において、タンパク質はAngに独立して結合するペプチド(例えば30、28、25、22、20、18、16または14アミノ酸より短い長さのもの)を包含する。例えばペプチドはジスルフィド結合1、2または3つを含むことができる。タンパク質は本明細書に記載した他の特徴を包含できる。本発明は又これ等の特性の1つ以上を有する核酸アプタマーを包含する。
別の局面において、本発明は、2×10−7M未満のKDでTie1外部ドメインのエピトープに結合するタンパク質(例えば、単離されたタンパク質)により特徴付けられる。このエピトープは、E3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4もしくは本明細書中に記載される別の抗体が結合したエピトープ、または少なくとも一つ、二つもしくは三つの共通する残基を含むエピトープとオーバーラップするか、またはその一部であるか、またはそれを含む。例えば、このタンパク質は、10−8M、5・10−9M、10−9M、10−10M、10−11Mまたは10−12M未満の親和力KDで結合する。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンHCおよびLCドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してTie1に結合するペプチド(例えば、30、28、25、22、20、18、16または14アミノ酸未満の長さのペプチド)を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。本発明はまた、これらの特性のうちの1つ以上を有する核酸アプタマーにより特徴付けられる。
別の局面において、本発明は、E3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体のTie1外部ドメインへの結合を競合的に阻害するタンパク質(例えば、単離されたタンパク質)により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンHCおよびLCドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してTie1に結合するペプチド(例えば、30、28、25、22、20、18、16または14アミノ酸未満の長さのペプチド)を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつTie1外部ドメインの活性を中和するタンパク質(例えば、単離されたタンパク質)により特徴付けられる。一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のCDR1は:Q−S−X−S−S(配列番号151)またはR−A−S−Q−S−X−S−S−Y−L−A(配列番号152)(式中、Xは任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて脂肪族、例えばイソロイシンもしくはバリンである)を含む。
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のCDR2は:A−S−X1−R−X2−T(配列番号153)またはD−A−S−X1−R−X2−T(配列番号154)(式中、X1は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて親水性アミノ酸、例えばセリンもしくはアスパラギンであり、X2は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて脂肪族もしくは小さい脂肪族、例えばアラニンもしくはバリンである)を含む。一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のCDR3は;Q−R−S−X2−W−P−R(配列番号155)またはX1−Q−R−S−X2−W−P−R−T(配列番号156)(式中、X1は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてロイシンもしくはグルタミンであり、X2は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてリジンもしくはセリンである)を含む。一実施形態において、タンパク質は、Tie1への結合に関してB2および/またはD11抗体と競合するか、あるいはB2および/またはD11のTie1への結合を競合的に阻害する。
一実施形態において、タンパク質は、E3またはE3b抗体により刺激されるTie1活性を中和する。一実施形態において、タンパク質は、Tie1の二量体化を阻害する。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質であって、該タンパク質がTie1外部ドメインに結合し、かつヒトまたは非マウス定常ドメイン(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4定常ドメイン)を含む単離された単一特異性タンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、Tie1外部ドメインに結合する単離されたヒト抗体により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、Tie1外部ドメインに結合し、かつ起源が非ヒトであって5個、4個、3個もしくは2個未満のペプチド(長さが6〜9アミノ酸のペプチド)または潜在的なヒトT細胞エピトープである5個、4個、3個または2個未満のペプチドを含む単離された抗体(例えば、単離された抗体)により特徴付けられる。一実施形態において、抗体は、起源が非ヒトであるか、または潜在的なヒトT細胞エピトープであるペプチド(長さが6〜9アミノ酸のもの)は含まない。
一実施形態において、抗体は、脱免疫化(deimmunization)を含む方法により得られる。例えば、この抗体は、脱免疫化される(例えば、完全に脱免疫化される)。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、Tie1外部ドメインに結合し、かつ改変Fcドメイン(例えば、改変ヒトFcドメイン)を含む単離された抗体により特徴付けられる。例えば、抗体は、例えばFc機能を変える改変を含み得る。例えば、ヒトIgG1定常領域を、一つ以上の残基、例えば米国特許第5,648,260号中の番号によると、例えば残基234と237のうちの一つ以上において変異させ得る。他の例示的な改変は、米国特許第5,648,260号に記載される改変を含む。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、10−7M、10−8M、5・10−9M、10−9M、10−10M、10−11Mまたは10−12M未満の親和力KDでTie1レセプターに結合する単離されたタンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質であって、該タンパク質がTie1外部ドメインに結合し、かつ例えば、非霊長類CDR(例えば、非マウスまたは非ウサギCDR)または合成CDRである少なくとも一つ以上のCDRを含む、単離されたタンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明はTie1に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンHC可変ドメインを包含するポリペプチドをコードするコーディング配列を包含する単離された核酸を特徴とする。核酸またはポリペプチドは本明細書に記載した他の特徴1つ以上を包含できる。核酸は改変されたコドン1つ以上を包含できる。一実施形態において、核酸は配列番号725および/または726を包含する。また、特徴となるのは、配列番号725および/または726を包含する哺乳類発現ベクターである。
一実施形態において核酸は更に免疫グロブリンHC可変ドメイン、例えば本明細書に記載したHCドメインを包含するポリペプチドをコードする第2のコーディング配列を包含する。一実施形態において、核酸は更にコーディング配列に作動可能に連結したプロモーターを包含する。
別の局面において、本発明はTie1に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンHCまたはLC可変ドメインを集合的に包含するポリペプチド鎖1つ以上をコードするコーディング配列1つ以上を包含する核酸を特徴とする。一実施形態において、可変ドメイン少なくとも1つをコードする核酸セグメントは例えばストリンジェントな条件下(例えば高ストリンジェンシー条件下)で本明細書に記載した核酸にハイブリダイズし、例えば可変ドメインをコードする領域にハイブリダイズし、そして、そのような領域に長さの少なくとも80、85、90、95または98%である。核酸は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
別の局面において、本発明は抗原結合タンパク質のHC可変ドメインを包含するポリペプチドをコードする第1の核酸配列および抗原結合タンパク質のLC可変ドメインを包含するポリペプチドをコードする第2の核酸配列を含有する宿主細胞を特徴とし、ここで抗原結合タンパク質は2×10−7M未満のKDでTie1に結合する。一実施形態において、HCまたはLC可変ドメインはヒトCDR少なくとも1つを包含する。抗原結合タンパク質は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
別の局面において、本発明はHC可変領域を包含するポリペプチドをコードする第1の核酸およびLC可変領域を包含するポリペプチドをコードする第2の核酸を含有する宿主細胞を特徴とし、ここでHCおよびLCの可変領域は各々、E3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3,s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10およびs−H4よりなる群から選択されるクローンのHCおよびLC可変ドメインの対応するアミノ酸配列に少なくとも70、80、85、90、92、95、97、98、99または100%同一のものを包含する。抗原結合タンパク質は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
別の局面において、本発明はTie1と相互作用する本明細書に記載したタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを包含する薬学的組成物を特徴とする。
別の局面において、本発明はTie1と相互作用する本明細書に記載したタンパク質を包含する治療用組成物を特徴とし、ここで組成物は滅菌され、被験体への投与のために適している。
別の局面において、本発明はTie1細胞外ドメインを包含するキメラレセプターおよびシグナルを発生できる非相同の細胞内配列を発現するシグナル依存性またはシグナル応答性の細胞を準備すること;細胞に候補化合物を接触させること;およびシグナルに依存している細胞の特性を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、細胞内配列はEpoRタンパク質の細胞内配列の少なくとも領域を包含する。方法は例えば候補化合物または複数の化合物の活性を評価するために使用できる。
別の局面において、本発明はTie1細胞外ドメインおよびEpoR細胞内ドメインを包含するキメラレセプターを発現するIL−3依存細胞を提供すること;IL−3の濃度が細胞の生存性を持続させるために十分ではない条件下で細胞に候補化合物を接触させること;および細胞の特性を評価することを包含する方法を特徴とする。方法は例えば候補化合物または複数の化合物の活性を評価するために使用できる。一実施形態において、特性は生存性である。一実施形態において評価することはMTT試験を包含する。一実施形態において、方法は更に被験体に候補化合物を投与することを包含する。例えば、候補化合物は、タンパク質、例えば免疫グロブリン可変ドメインを包含するタンパク質を包含する。
別の局面において、本発明はTie1活性を調節する化合物を発見する方法を特徴とする。方法は、化合物候補複数を準備すること;および本明細書に記載した方法を用いて複数の化合物の各々を評価することを包含する。
別の局面において、本発明はTie1細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する培養細胞を特徴とする。一実施形態において、細胞内配列はEpoR細胞内ドメインの領域を包含する。一実施形態において、細胞は生存性のためにはIL−3またはTie1を必要とする。例えば、細胞はキメラ膜貫通タンパク質の非存在下ではIL−3依存性であるが、E3またはE3b抗体の存在下およびIL−3の非存在下では生存性である。
別の局面において、本発明は単離された哺乳類細胞(例えばTie1細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する細胞)およびTie1結合タンパク質を包含する調製品を特徴とし、ここでTie1結合タンパク質は細胞の生存正の維持のために必要である。
別の局面において、本発明はTie1結合タンパク質およびTie1細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する培養細胞を包含するキットを特徴とする。
別の局面において、本発明は候補化合物を評価する方法を特徴とする。方法は(i)(a)Tie1細胞外ドメインおよびキナーゼドメインの領域を包含する不溶性タンパク質および(b)ATPを含有する細胞または膜の画分;(ii)キナーゼドメインの活性を改変するリガンド;および(iii)候補化合物を包含する調製品を準備すること;および不溶性タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する。
別の局面において、本発明は候補化合物を評価する方法を特徴とする。方法は(i)Tie1タンパク質またはTie1細胞外ドメインの領域を少なくとも包含する膜貫通タンパク質およびATPを包含する細胞または膜画分、(ii)Tie1または膜貫通タンパク質の自己リン酸化を促進するリガンド;および(iii)候補化合物を包含する調製品を準備すること;およびTie1タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する。
一実施形態において、リガンドは抗体である。一実施形態において、リガンドはE3またはE3b抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメインまたはCDR領域に少なくとも90%同一であるドメインを包含する。一実施形態において、方法は更に被験体に候補化合物を投与することを包含する。
別の局面において、本発明は(i)Tie1細胞外ドメインの領域少なくとも1つを包含する膜貫通タンパク質およびATPを包含する細胞または膜画分;および(ii)Tie1または膜貫通タンパク質の自己リン酸化を促進するリガンドを包含する調製品を準備すること;および膜貫通タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する方法を特徴とする。
別の局面において、本発明は(i)Tie1の自己リン酸化をアゴナイズすることができ、および/または(ii)Tie1細胞外ドメインおよびEpoR細胞内ドメインを包含するキメラレセプターを発現するIL−3依存性細胞をIL−3の濃度が細胞の生存性を持続させるために十分ではない条件下で生存性に維持することができるリガンドに哺乳類細胞を接触させること;および哺乳類細胞を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、細胞は内因性のTie1タンパク質を発現する。一実施形態において、細胞は内皮細胞である。一実施形態において、方法は更にリガンド以外の被験化合物に哺乳類細胞を接触させることを包含する。例えばリガンドは抗体である。例えば、リガンドはE3またはE3b抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメインまたはCDR領域に少なくとも90%同一であるドメインを包含する。
別の局面において、本発明はTie1の活性を調節できる薬剤に哺乳類細部またはその画分を接触させること;および哺乳類細胞またはその画分を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は細胞生存時に細胞に接触させ、そして評価は細胞の画分を単離することを包含する。一実施形態において、薬剤はタンパク質、例えば抗体またはペプチドである。一実施形態において、薬剤はE3またはE3b抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメインまたはE3またはE3b抗体のCDR領域に少なくとも90%同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はB2またはD11抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメインまたはB2またはD11抗体のCDR領域に少なくとも90%同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はA2、A10、P−B1、P−B3またはP−C6抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメインまたはA2、A10、P−B1、P−B3またはP−C6抗体のCDR領域に少なくとも70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はG2またはC7抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメインまたはG2またはC7抗体のCDR領域に少なくとも90%同一であるドメインを包含する。薬剤は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
別の局面において、本発明は被験化合物を評価する方法を特徴とする。方法は被験化合物存在下のTie1の活性を調節する薬剤とTie1細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質との間の相互作用を評価することを包含する。一実施形態において、薬剤、被験化合物は、8000、7000、6000、5000または3000ダルトン未満の分子量を有する小型有機化合物である。例えば評価は、被験化合物の存在下、薬剤にTie1細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質を包含する細胞を接触させることを包含する。別の例においては、評価はTie1細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質、薬剤および被験化合物を包含する無細胞調製品を形成することを包含する。
別の局面において、本発明は(i)Tie1細胞外ドメインを包含するタンパク質、および(ii)Tie1の活性を調節(例えばアゴナイズまたは拮抗)できるTie1結合タンパク質を包含する人工タンパク質複合体を特徴とする。一実施形態において、リガンドは抗体(例えば本明細書に記載した抗体)である。例えば、リガンドはE3、E3b、B2、D11、A2、A10、P−B1、P−B3、P−C6、G2およびC7よりなる群から選択される抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメインまたは対応する抗体のCDR領域にCDR領域において少なくとも90%同一である免疫グロブリンドメインを包含する。一実施形態において、複合体は哺乳類細胞の膜画分中、および/または、被験体中に存在する。
別の局面において、本発明はTie1、Tie2またはAngと相互作用するタンパク質(例えば本明細書に記載したタンパク質)を包含する組成物を、被験体における新脈管形成を低減するため、または、他の態様において被験体における障害を治療または防止するために有効な量で被験体に投与することを包含する方法を特徴とする。例えばタンパク質は10−8M、5・10−9M、10−9M、10−10M、10−11Mまたは10−12M未満の親和性KDでTie1、Tie2またはAngに結合する。
一実施形態において、タンパク質はTie1結合タンパク質である。タンパク質は少なくとも2つの結合価を有し、その各々がTie1に結合する。例えば結合価の少なくとも1、2または全てがTie1への結合に関してE3と競合する結合部位であることができる。一実施形態において、タンパク質はTie1への結合に関してE3と競合するか、またはTie1上のE3により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合する。
一実施形態において、タンパク質は重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。タンパク質は更に、以下の特性、即ち、(1)E3抗体のCDR少なくとも1つを含む可変ドメイン配列少なくとも1つ;(2)E3抗体の対応する可変ドメインのCDRに合計で少なくとも85%同一であるCDR配列を含む可変ドメイン配列少なくとも1つ;(3)可変ドメインの少なくとも1つがE3抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも85%同一であること;および(4)タンパク質がTie1への結合に関してE3と競合するか、または、Tie1上のE3により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合すること、の1つ以上を包含する。
一実施形態において、重鎖および/または軽鎖の可変ドメイン配列のCDRの1つ以上はヒト、霊長類、非げっ歯類(例えば非マウスまたは非ラット)または合成の型である。一実施形態において、重鎖および/または軽鎖の可変ドメイン配列のフレームワーク領域の1つ以上はヒト、霊長類または非げっ歯類(例えば非マウスまたは非ラット)型である。
一実施形態において、重鎖は、以下の特性のうちの一つ以上を有する。
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR1:
(AGSR)−Y−(GVK)−M−(GSVF)(配列番号117)、
(AGSIMRH)−Y−(GVMK)−M−(GSVMFH)(配列番号118)または
(AGSIMRNH)−Y−(AGTVMKPQ)−M−(AGSTVMYWFKH)(配列番号119);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR2:
X−I−Y−P−S−G−G−X−T−X−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号120)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WQ)−T−(GY)(配列番号121)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WQ)−T−(GY)−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号122)、
(GSVW)−I−(SY)−P−S−G−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)(配列番号123);または
X−I−Y−P−S−G−G−(WPS)−T−(YVH)−Y−A−D(配列番号704)(式中、Xは任意のアミノ酸である);
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR3:
V−(4または5残基)−F−D−(I/Y)(配列番号124)、
G−Y−G−P−I−A−P−G−L−D−Y(配列番号125)、
(GV)−N−Y−Y−(GYD)−S−(SD)−G−Y−G−P−I−A−P−G−L−D−Y(配列番号126)、
(GVD)−(AGLN)−(LYR)−(GSTLYH)−(GYD)−(AGSYFP)−(SFD)−(AGYD)−(IY)−(GFD)−(YDP)−(IP)−A−P−G−L−D−Y(配列番号127)、
VNYYDSSGYGPIAPGLDY(配列番号128)または
G−X−X−G−(AY)−F−D−(YI)(配列番号705)(式中、Xは任意のアミノ酸である)。
(AGSR)−Y−(GVK)−M−(GSVF)(配列番号117)、
(AGSIMRH)−Y−(GVMK)−M−(GSVMFH)(配列番号118)または
(AGSIMRNH)−Y−(AGTVMKPQ)−M−(AGSTVMYWFKH)(配列番号119);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR2:
X−I−Y−P−S−G−G−X−T−X−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号120)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WQ)−T−(GY)(配列番号121)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WQ)−T−(GY)−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号122)、
(GSVW)−I−(SY)−P−S−G−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)(配列番号123);または
X−I−Y−P−S−G−G−(WPS)−T−(YVH)−Y−A−D(配列番号704)(式中、Xは任意のアミノ酸である);
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むHC CDR3:
V−(4または5残基)−F−D−(I/Y)(配列番号124)、
G−Y−G−P−I−A−P−G−L−D−Y(配列番号125)、
(GV)−N−Y−Y−(GYD)−S−(SD)−G−Y−G−P−I−A−P−G−L−D−Y(配列番号126)、
(GVD)−(AGLN)−(LYR)−(GSTLYH)−(GYD)−(AGSYFP)−(SFD)−(AGYD)−(IY)−(GFD)−(YDP)−(IP)−A−P−G−L−D−Y(配列番号127)、
VNYYDSSGYGPIAPGLDY(配列番号128)または
G−X−X−G−(AY)−F−D−(YI)(配列番号705)(式中、Xは任意のアミノ酸である)。
一実施形態において、軽鎖は、以下の特性のうちの一つ以上を含む:
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1:
R−A−S−Q−S−(IV)−S−(SR)−X1−Y−L−(AN)(配列番号129)、
R−A−S−Q−S−(IV)−S−S−(YS)−L−(ALN)(配列番号706)、
T−G−T−(SN)−S−D−V−G−(GS)−Y(配列番号707)、
(SGQ)−(GS)−(DS)−(NS)−(IL)−(GR)−S−(YKN)−(YS)−(VA)(配列番号708)、
R−A−S−Q−S−V−S−S−X−L(配列番号130)、
R−A−S−Q−S−(IV)−S−(SR)−(SY)−(LY)−(ALN)(配列番号131)または
R−A−S−(REQ)−(GSTRN)−(IV)−(GSTIRN)−(STIRH)−X1−(SYWNH)−(LV)−(ASN)(配列番号132)(式中、X1はセリンであるか、または不在であり得る);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR2:
X−A−S−X−R−A−T(配列番号133)(式中、Xは任意のアミノ酸であり得る)、
(AGD)−A−S−(STN)−R−A−T(配列番号134)、
(DG)−(AV)−S−N−(RL)−(AP)−(ST)(配列番号709)、
(AGD)−A−S−(STN)−(LR)−(AEQ)−(ST)(配列番号135)または
(AGTKDEH)−A−S−(STN)−(LR)−(AVEQ)−(ST)(配列番号136);および
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR3:
Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LWR)−(TIY)−T(配列番号137)、
(LQ)−Q−(SYFR)−(GSYN)−(SKN)−(STYW)−(RP)−(LWR)−(TIY)−T(配列番号138)、
Q−Q−X−S−(SN)−(WS)−P−X−T−F(配列番号710)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
Y−(TG)−(SG)−S−(PGS)−(TN)−X−(VT)(配列番号711)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
Q−Q−(YR)−(GS)−S−(SW)−P−R−X1−T(配列番号139)(式中、X1は任意のアミノ酸であるか、または存在しない)、
(LQ)−(LQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(STRKN)−(STYWF)−(RP)−(ILMWRH)−(TIY)−(TI)(配列番号140)または
(LQ)−(LRQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(ASTRKN)−(STYWF)−(SVRP)−(STILMWRH)−(TIY)−(STI)(配列番号141)。
i)以下のとおりのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1:
R−A−S−Q−S−(IV)−S−(SR)−X1−Y−L−(AN)(配列番号129)、
R−A−S−Q−S−(IV)−S−S−(YS)−L−(ALN)(配列番号706)、
T−G−T−(SN)−S−D−V−G−(GS)−Y(配列番号707)、
(SGQ)−(GS)−(DS)−(NS)−(IL)−(GR)−S−(YKN)−(YS)−(VA)(配列番号708)、
R−A−S−Q−S−V−S−S−X−L(配列番号130)、
R−A−S−Q−S−(IV)−S−(SR)−(SY)−(LY)−(ALN)(配列番号131)または
R−A−S−(REQ)−(GSTRN)−(IV)−(GSTIRN)−(STIRH)−X1−(SYWNH)−(LV)−(ASN)(配列番号132)(式中、X1はセリンであるか、または不在であり得る);
ii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR2:
X−A−S−X−R−A−T(配列番号133)(式中、Xは任意のアミノ酸であり得る)、
(AGD)−A−S−(STN)−R−A−T(配列番号134)、
(DG)−(AV)−S−N−(RL)−(AP)−(ST)(配列番号709)、
(AGD)−A−S−(STN)−(LR)−(AEQ)−(ST)(配列番号135)または
(AGTKDEH)−A−S−(STN)−(LR)−(AVEQ)−(ST)(配列番号136);および
iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR3:
Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LWR)−(TIY)−T(配列番号137)、
(LQ)−Q−(SYFR)−(GSYN)−(SKN)−(STYW)−(RP)−(LWR)−(TIY)−T(配列番号138)、
Q−Q−X−S−(SN)−(WS)−P−X−T−F(配列番号710)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
Y−(TG)−(SG)−S−(PGS)−(TN)−X−(VT)(配列番号711)(式中、Xは任意のアミノ酸である)、
Q−Q−(YR)−(GS)−S−(SW)−P−R−X1−T(配列番号139)(式中、X1は任意のアミノ酸であるか、または存在しない)、
(LQ)−(LQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(STRKN)−(STYWF)−(RP)−(ILMWRH)−(TIY)−(TI)(配列番号140)または
(LQ)−(LRQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(ASTRKN)−(STYWF)−(SVRP)−(STILMWRH)−(TIY)−(STI)(配列番号141)。
一実施形態において、重鎖は以下の特性:
i)下記:
(AGSIMRH)−Y−(GVMK)−M−(GSVMFH)(配列番号118)または、
(AGSIMRNH)−Y−(AGTVMKPQ)−M−(AGSTVMYWFKH)(配列番号119)
のアミノ酸配列を包含するHC CDR1;
ii)下記:
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(NWQ)−T−(GY)(配列番号160)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(NWQ)−T−(GY)−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号122)、または、
(GSVW)−I−(SY)−P−S−G−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)(配列番号123)、
のアミノ酸配列を包含するHC CDR2;
iii)下記:
APRGYSYGYYY(配列番号712)
のアミノ酸配列を包含するHC CDR3;
の1つ以上を包含する。
i)下記:
(AGSIMRH)−Y−(GVMK)−M−(GSVMFH)(配列番号118)または、
(AGSIMRNH)−Y−(AGTVMKPQ)−M−(AGSTVMYWFKH)(配列番号119)
のアミノ酸配列を包含するHC CDR1;
ii)下記:
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(NWQ)−T−(GY)(配列番号160)、
(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(NWQ)−T−(GY)−Y−A−D−S−V−K−G(配列番号122)、または、
(GSVW)−I−(SY)−P−S−G−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)(配列番号123)、
のアミノ酸配列を包含するHC CDR2;
iii)下記:
APRGYSYGYYY(配列番号712)
のアミノ酸配列を包含するHC CDR3;
の1つ以上を包含する。
一実施形態において、軽鎖は以下の特性:i)以下:R−A−S−(REQ)−(GSTRN)−(IV)−(GSTIRN)−(STIRH)−X1−(SYWNH)−(LV)−(ASN)(配列番号132)、ただしX1はセリンまたは非存在であるもののアミノ酸配列を包含するLCCDR1;ii)以下:(TAGD)−A−S−(STN)−(LR)−(AEQ)−(ST)(配列番号713)または(AGTKDEH)−A−S−(STN)−(LR)−(AVEQ)−(ST)(配列番号136)のアミノ酸配列を包含するLCCDR2;およびiii)以下:Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LHWR)−(TIY)(配列番号714)、(LQ)−Q−(SYFR)−(GSYN)−(SKN)−(STYW)−(RP)−(LHWR)−(TIY)(配列番号715)、または、(LQ)−(LQ)−(SYFRD)−(GSYN)−(STRKN)−(STYWF)−(RP)−(ILMWRH)−(TIY)(配列番号716)のアミノ酸配列を包含するLCCDR3;の1つ以上を包含する。
一実施形態において、軽鎖は以下の特性のうちの一つ以上を含む:i)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR1:S−X−(ND)−(IV)−(AG)−X1−X2−X3(配列場号142)またはT−(GR)−(ST)−S−X5−(ND)−(IV)−(AG)−X1−X2−X3−Y−X4−S(配列番号143)(式中、X1は任意のアミノ酸(例えば、GまたはR)であり、X2は任意のアミノ酸(例えば、YまたはN)であり、X3は任意のアミノ酸(例えば、F、NまたはK)であり、X4は任意のアミノ酸(例えば、脂肪族、例えば、VまたはA)である);iii)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR2:(DE)−V−N−N−R−P−S(配列番号144);(DE)−(VD)−(STDN)−(YRDN)−R−P−S(配列番号145);v)以下のとおりのアミノ酸配列を含むLC CDR3:(SQ)−S−(SY)−(ASID)−(GSR)−(ST)−(STRN)−(STYR)−(ATLY)−(SVWQ)(配列番号146)。
一実施形態において、HC CDR2は、以下のとおりのアミノ酸配列を含む:(GSVW)−I−(SY)−P−SG−G−(AGVMYWPQH)−T−(AGSTLVMYFKH)−Y−(AT)−D−S−V−K−G(配列番号147)または(GSV)−I−(SY)−P−SG−G−(WQ)−T−(GY)−Y−(AT)−D−S−V−K−G(配列番号148)。
一実施形態において、HC CDR1アミノ酸配列は、少なくとも5個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも3個、4個または5個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体のHCのCDR1配列と同一である。一実施形態において、HC CDR2アミノ酸配列は、少なくとも15個、16個または17個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも10個、12個、14個、15個、16個または17個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体のHCのCDR2配列と同一である。一実施形態において、HC CDR2アミノ酸配列は、少なくとも17個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも14個、15個、16個または17個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体のHCのCDR2配列と同一である。一実施形態において、HC CDR3アミノ酸配列は、少なくとも7個または8個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも5個、6個、7個または8個のアミノ酸は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体のHCのCDR3配列と同一である。
一実施形態において、LCCDR1アミノ酸配列は少なくとも10、11または12アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも7、8、9、10または11アミノ酸はクローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3,s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書に記載した他の抗体のLC CDR1配列と同一である。一実施形態において、LCCDR2アミノ酸配列は少なくとも6または7アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも5、6または7アミノ酸はクローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3,s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書に記載した他の抗体のLC CDR2配列と同一である。一実施形態において、LCCDR3アミノ酸配列は少なくとも8,9または10アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも7、8、9または10アミノ酸はクローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3,s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書に記載した他の抗体のLC CDR3配列と同一である。
一実施形態において、HC可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体のHC可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または100%同一である。
一実施形態において、LC可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体のLC可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または100%同一である。
一実施形態において、HCおよびLC可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、E3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10およびs−H4からなる群から選択されるクローンのHCおよびLC可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または100%同一である。
一実施形態において、HCおよび/またはLC可変ドメインの一つ以上のフレームワーク領域(例えば、FR1、FR2、FR3、および/またはFR4)のアミノ酸配列は、クローンE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体のHCおよびLC可変ドメインの対応するフレームワーク領域と、少なくとも70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%または100%同一である。
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列はヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。
タンパク質は、Tie1を発現する細胞、例えば内皮細胞に結合し得る。一実施形態において、タンパク質は、血小板に実質的に結合しない(例えば検出可能に結合しない)。
一実施形態において、タンパク質は、Tie1に特異的に結合し、例えば、別のヒトタンパク質(例えば、Ig様ドメイン、EGF様ドメインまたはフィブロネクチンタイプIIIリピートを有するTie1以外の天然タンパク質であるTie2、またはヒト血清アルブミン)と比較して、少なくとも10倍、50倍、100倍、103倍または104倍、優先的にTie1に結合する。一実施形態において、タンパク質は、本明細書中に記載のTie1ドメインに結合する。
一実施形態において、タンパク質は局所的に送達される。一実施形態において、タンパク質は全身に送達される。
一実施形態において、被験体は、血管形成の低減を必要とするか、またはそのように同定されている。例えば、この被験体は、血管形成関連疾患を有する。別の例において、被験体は、腫瘍性障害、例えば、転移性癌を有する。例えば、この被験体は、血管形成に依存する癌または腫瘍を有する。腫瘍は固形腫瘍、例えば直径が少なくとも1、2、3、5、8または10mmの腫瘍であることができる。一実施形態において、固形腫瘍は低酸素コアを有する。方法は更に代謝拮抗剤(例えば5−FUとロイコボリン)、イリノテカン(または他のトポイソメラーゼ阻害剤)、ドキソルビシン、ベバシズマブまたはこれ等の薬剤の全てを投与することを包含してよい。方法は拮抗剤投与前に、被験体を評価することおよび被験体における固形腫瘍を検出することを包含できる。
別の実施形態においては、被験体は炎症性障害、例えば関節リウマチ、乾癬、リウマチ様またはリウマチ性の炎症性疾患、または他の慢性炎症障害、例えば慢性喘息、動脈または移植後のアテローム性動脈硬化症および子宮内膜症を有する。治療できる他の障害は、脱調節された、または望ましくない新脈管形成、例えば眼の新生血管形成、例えば網膜症(糖尿病性網膜症および加齢関連黄斑変性を包含する)、血管芽腫、血管腫および動脈硬化を包含する。
一実施形態において、タンパク質を、以下の活性のうちの一つ以上を低減するのに有効な量で投与する:血管の出芽、***および再造形。一実施形態において、タンパク質を、脈管形成または細管形成を低減させるのに有効な量で投与する。
一実施形態において、該方法はさらに、投与前に、血管形成の低減を必要とする被験体として被験体を同定する工程を包含する。一実施形態において、この方法はさらに、タンパク質を連続的または別個の丸薬にて投与する工程を包含する。一実施形態において、この方法はさらに、投与期間中の被験体をモニタリングする工程を包含する。例えば、このモニタリングは、被験体の血管を(局所的または全体的に)画像化する工程を包含する。別の例において、このモニタリングは、被験体において、腫瘍の大きさまたは腫瘍の容量を評価する工程を包含する。
別の局面において、本発明は:本明細書中に記載のタンパク質(例えば、Tie1活性を低下させるタンパク質)を含む組成物を、被験体のTie1活性を低下させるのに有効な量で被験体に投与する工程を含む方法により特徴付けられる。この方法は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。
別の局面において、本発明は:本明細書中に記載のタンパク質(例えば、Tie1活性を調節し得るタンパク質)を含む組成物を、被験体の内皮細胞の活性を調節するのに有効な量で被験体に投与する工程を包含する方法により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、循環中に送達される。
一実施形態において、組成物は、内皮細胞を治療に対して増感させ、増感させた内皮細胞を阻害、死滅、剥離または抑止する治療を被験体に提供するのに有効である。
別の局面において、本発明は:(i)Tie1結合タンパク質とTie1タンパク質との相互作用が起こり得る条件下において、サンプル(および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル)を、Tie1に結合するタンパク質、例えば本明細書中に記載のタンパク質と接触させる工程;ならびに(ii)Tie1結合タンパク質とサンプル(および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル)との複合体の形成を検出する工程を含む方法により特徴付けられる。
別の局面において、本発明は:(i)Tie1結合タンパク質とTie1タンパク質との相互作用が起こり得る条件下において、Tie1結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)を、被験体(および必要に応じて、コントロール被験体)に投与する工程;ならびに(ii)Tie1結合タンパク質と被験体のTie1分子との複合体の形成を検出する工程、あるいは被験体中のTie1結合タンパク質の分布またはTie1結合タンパク質の少なくとも一つの位置を検出する工程を含む方法により特徴付けられる。一実施形態において、Tie1タンパク質は、Tie1の活性を調節しない。Tie1結合タンパク質は、本明細書中に記載のタンパク質であり得る。一実施形態において、リガンドは、活性化Tie1を検出する。
Tie1に結合する抗体は好ましくは単一特異性、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。例えば、この抗体は生細胞上のTie1、例えば内因性Tie1分子または異種核酸から発現するTie1分子を認識し得る。一実施形態において、Tie1結合タンパク質は、主要な内皮細胞と相互作用する。用語「単一特異性抗体」は、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語は、単一の分子種として、例えば同種の単離細胞の個体群から生成される抗体をいう「モノクローナル抗体」を含む。「モノクローナル抗体組成物」とは、抗体の単一分子種を含む組成物中の抗体またはそのフラグメントの調製物をいう。一実施形態において、モノクローナル抗体は、哺乳動物細胞により生成される。一種以上のモノクローナル抗体種を組み合わせ得る。
Tie1結合抗体は、全長(例えば、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(例えば、IgA1、IgA2)、IgDおよびIgE)であり得るか、または抗原結合フラグメント(例えば、Fab、F(ab’)2またはscFvフラグメント)のみを含み得る(例えば、Fcドメイン、またはCH2、CH3もしくはCH4配列を含まない)。この抗体は、二つの重鎖免疫グロブリンおよび二つの軽鎖免疫グロブリンを含み得るか、または単一鎖抗体であり得る。抗体は、必要に応じて、κ、λ、α、γ、δ、εまたはμ定常領域遺伝子から選択される定常領域を含み得る。Tie1結合抗体は、実質的にヒト抗体からの重鎖および軽鎖定常領域、例えば、ヒトIgG1定常領域またはその一部を含み得る。
一実施形態において、抗体(またはそのフラグメント)は、組換え抗体または改変抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化またはインビトロで生成される抗体である。用語「組換え」または「改変」ヒト抗体は、本明細書中で使用される場合、組換え手段により調製、発現、作成または単離されるすべての抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組換え体から単離させた抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入動物(例えば、マウス)から単離させた抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他DNA配列へのスプライシングをともなう任意の他の手段により調製、発現、作成もしくは単離された抗体を含むことが意図される。そのような組換え抗体は、ヒト化抗体、CDR移植抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、インビトロで生成される抗体を含み、必要に応じて、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含み得る。
一実施形態において、抗体は、Tie1に結合する公知のモノクローナル抗体(例えば、WO95/26364に記載される抗体、例えば3C4C7G6および10F11G6)が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。別の実施形態において、抗体は、Tie1に結合する公知のモノクローナル抗体、例えば、3C4C7G6および10F11G6と競合しない。さらに別の実施形態において、抗体は、本明細書中に記載されるリガンド、例えば、E3抗体と競合しない。
本明細書中に開示されるタンパク質(例えば、Tie1、Tie2またはAngに結合するタンパク質)のオーバーラップしているエピトープと結合するか、あるいはこれらのタンパク質の結合を競合的に阻害する抗体または他の因子(例えば、タンパク質または非タンパク質因子)もまた、本発明の範囲内にある。例えば、抗体または他の因子は、単一特異性抗体、例えば、E3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載される別の抗体のオーバーラップしているエピトープと結合するか、あるいはこの抗体のTie1への結合を競合的に阻害するか、またはその逆である(例えば、リガンドの結合を競合的に阻害する単一特異性抗体)。オーバーラップしているエピトープは、少なくとも一つの共通するアミノ酸を含み得る。互いの結合を競合的に阻害する因子は、オーバーラッピングするエピトープに必ずしも結合しない。例えば、それらは立体傷害により、またはTie1の立体配座を変えることにより結合を阻害し得る。
結合タンパク質の任意の組合せ、例えば、Tie1、Tie2またはAngの異なるドメインに結合する二つ以上の抗体(例えば、Tie1、Tie2またはAngの細胞外ドメイン上の二つの異なるエピトープに結合する抗体(例えば、二重特異性抗体))の組み合わせは、本発明の範囲内にある。
一実施形態において、Tie1結合抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも一つの軽鎖もしくは重鎖の免疫グロブリン(または好ましくは、少なくとも一つの軽鎖免疫グロブリンおよび少なくとも一つの重鎖免疫グロブリン)を含む。好ましくは、各免疫グロブリンは、抗Tie1軽鎖もしくは重鎖の可変領域のそれぞれから、すなわち、本明細書中に記載される抗体(例えばE3、E3b、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3、s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10、s−H4または本明細書中に記載の別の抗体)の可変領域から、CDRに実質的に同一である少なくとも一つ、二つ、好ましくは三つの相補性決定領域(CDR)を有する軽鎖または重鎖可変領域を含む。
一局面において、本発明はTie1リン酸化を増大させることにより内皮細胞活性を低減する薬剤(例えば抗体)を特徴とする。一実施形態において、抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。
一局面において、本発明はシグナリング経路を活性化することにより内皮細胞活性を低減する薬剤(例えば抗体)を特徴とする。一実施形態において、抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。この薬剤誘導作用はTie1の自己会合とは独立しているか、依存していることができる。
1つの局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質により特徴付けられ、このタンパク質は、Tie1と結合し、外部ドメインおよび重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、以下の特性の1つ以上を含む:i)
一実施形態において、タンパク質はまた、1つ以上の以下の特性を含む軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む:i)
一実施形態において、タンパク質は、クローンのHC可変ドメインのアミノ酸配列
一実施形態において、タンパク質は、クローンのLC可変ドメインのアミノ酸配列
本明細書中に記載の抗体または他の結合タンパク質(例えば、Tie1結合タンパク質、Tie2結合タンパク質またはAng結合タンパク質)を、被験体に投与し得、または非誘導体化形態もしくは非結合体化形態でインビトロに用い得る。他の実施形態において、結合タンパク質を、誘導体化、改変し得、あるいは別の機能性分子、例えば別のタンパク質(例えば、Fcドメインの1つ、HSAなど)、ポリマー(例えば、PEG)同位体、細胞または不溶性支持体に結合させ得る。例えば、結合タンパク質は、1つ以上の他の分子的実体、とりわけ例えば、抗体(例えば、タンパク質が二重特異性または多重特異性抗体を形成する抗体である場合)、毒素、放射性同位体、治療(例えば、細胞毒性または細胞静止)因子または部分に機能的に(例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合またはそれ以外によって)連結し得る。例えば、結合タンパク質は、放射性イオン(例えば、α−、γ−またはβ−エミッター)、例えばヨウ素(131Iまたは125I)、イットリウム(90Y)、ルテチウム(177Lu)、アクチニウム(225Ac)、レニウム(186Re)またはビスマス(212Biまたは213Bi)に連結し得る。
別の局面において、本発明は、Tie1に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメイン、例えば本明細書中に記載の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインを含むポリペプチドをコードするコード配列を含む核酸により特徴付けられる。例えば、核酸として、本明細書中に記載される特定の核酸配列、本明細書中に記載されるアミノ酸配列(例えば、特定の核酸配列)と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%、同一である核酸、または本明細書中に記載される核酸配列(例えば、特定の核酸配列、例えば
本明細書中に記載の核酸は、さらに、コード配列に作動可能に連結させたプロモーターを含み得る。核酸は、第一および第二のコード配列を含み得、例えば、ここで第一のコード配列は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードし、第二のコード配列は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。
別の局面において、本発明は、重鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第一核酸および軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第二核酸を含む宿主細胞により特徴付けられる。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、結合してTie1結合タンパク質を形成し得る。これらの可変領域は、本明細書中に記載される一つ以上の特性(例えば本明細書中に記載される配列と、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性)を有し得る。本発明はまた、Tie1結合抗体を提供する方法を含む。この方法は、本明細書中に記載される宿主細胞を提供する工程;ならびに軽鎖および重鎖の可変領域の集合体が、Tie1と相互作用する抗原結合タンパク質を形成し得る条件下で、宿主細胞中に第一および第二の核酸を発現させる工程を含み得る。
別の局面において、本発明は、組成物、例えば、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤、および本明細書中に記載されるTie1結合タンパク質(例えば、抗体またはそのフラグメント)のうちの少なくとも一つを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、組成物(例えば、薬学的組成物)は、上記Tie1結合タンパク質の二つ以上からなる組合せを含む。
別の局面において、本発明は、単独での使用または他の治療様式(例えば、細胞静止剤または標識剤、例えば本明細書中に記載される細胞毒剤または標識剤)と組み合わせての使用のためのTie1結合抗体(またはそのフラグメント)、例えば本明細書中に記載されるTie1結合抗体(またはそのフラグメント)を、Tie1抗体の使用法またはTie1関連疾患、例えば内皮細胞関連疾患、例えば関節リウマチまたは転移性癌を治療、予防または検出するような薬剤の組合せについての説明書とともに含むキットにより特徴付けられる。
別の局面において、Tie1に結合する結合タンパク質は免疫グロブリンではないポリペプチドである。例えばポリペプチドは可変の長さ、例えば4〜100アミノ酸残基長、好ましくは5〜75、6〜50、または7〜40アミノ酸残基長、またはより好ましくは8〜30または10〜25アミノ酸残基長のものであることができる。一部の実施形態においては、ポリペプチドは非標準的な、または、合成のアミノ酸残基、例えばノルロイシン、セレノシステイン、ピロリジン等を包含する。一部の実施形態においては、ポリペプチドは交差結合基、例えばジスルフィド結合を形成するシステイン残基2つ、またはペプチドを環化するために使用できる化学的交差結合部分の何らかの別の型を包含する。他の好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、例えばポリペプチドの溶解度または循環半減期を増大させるために、ポリエチレングリコールまたは可溶性タンパク質への融合を用いるなどして修飾することができる。
標的結合タンパク質は別のタンパク質、例えばアミノまたはカルボキシ末端おいて標的に結合しないタンパク質と物理的に会合(例えば融合)することができる。例えば、標的結合タンパク質は血清中滞留を増大させるか、安定性を改変するタンパク質、例えばアルブミン、例えば血清アルブミン、例えばHSA(ヒト血清アルブミン)と会合(例えば融合)することができる。別の例においては、標的結合タンパク質は精製を容易にする部分、例えば精製タグ、例えばHis、PEG、または官能性の部分、例えばFcに物理的に会合(例えば融合)される。
別の局面において、本発明は、Tie1に特異的に結合するタンパク質を同定する方法により特徴付けられる。好ましい実施形態において、本発明は:Tie1抗原を提供する工程;ディスプレイライブラリ(例えば、ファージディスプレイライブラリーメンバー)を提供する工程;このライブラリーに存在するメンバーを同定する工程を包含し、このメンバーが、Tie1抗原に特異的に結合するタンパク質を発現する。用語「Tie1抗原」は、長さが少なくとも8アミノ酸であるTie1の任意の抗原フラグメントをいう。例えば、Tie1抗原として、Tie1外部ドメインフラグメント、例えば、折り畳まれたタンパク質ドメインを含むフラグメント(例えば、本明細書中に記載されるフラグメント)が挙げ得る。一部の実施形態において、Tie1抗原はヒト起源であり、例えばヒトTie1の細胞外ドメインまたはそのフラグメント(例えば、本明細書中に記載されるフラグメント)を含む。このTie1抗原は、必要に応じて別のポリペプチド(例えばFcドメイン)に融合させた組換えポリペプチドであり得、またはTie1をその表面に発現する細胞(例えば、内皮細胞)であり得る。他の好ましい実施形態において、Tie1抗原は、活性化立体配座を有し、例えばTie1抗原は、二量体立体配座または本明細書中に記載されるE3もしくはE3b抗体により安定化した立体配座である。
本明細書中に記載される方法は、例えば実質的に完全なゲノム(例えば改変遺伝子IIIを含む)を有するバクテリオファージに基づくライブラリーおよびファージミド核酸を含むバクテリオファージ粒子に基づくライブラリーに適用可能である。用語「バクテリオファージライブラリーメンバー」および「ファージ」は、両種のライブラリーのメンバーを包含する。用語「バクテリオファージ粒子」は、核酸をパッケージするバクテリオファージコートタンパク質から形成された粒子をいう。パッケージした核酸は、改変バクテリオファージゲノムまたはファージミドであり得、例えば、バクテリオファージの複製開始点を含むが基本的なファージ遺伝子を欠如し、「ヘルパーファージ」またはin transで供給されるファージ遺伝子の助けなくしてはE.coliで増殖し得ない核酸であり得る。
他の実施形態において、本発明は、Tie1に特異的に結合するタンパク質を同定する方法により特徴付けられる。該方法は、Tie1抗原(例えば、Tie1外部ドメインの領域)を提供する工程;非ヒト動物をTie1抗原により免疫する工程;ならびにTie1と相互作用する免疫グロブリンを産生する細胞を単離する工程を包含する。例えば、この方法は、動物(例えば、免疫マウス)の脾臓からハイブリドーマ細胞を作製する工程;ならびにTie1抗原に特異的に結合する抗体を発現する個々のハイブリドーマ細胞株を同定する工程を包含する。例えば、この
好ましい実施形態において、Tie1抗原はヒト起源であり、例えばヒトTie1の細胞外ドメインまたはその一部のフラグメント(例えば、Tie1のHA結合ドメイン)を含む。Tie1抗原は、別のポリペプチド(例えば、精製ハンドル(purification handle))に必要に応じて融合させた組換えポリペプチドであり得、またはTie1(例えば、内皮細胞)をその表面に発現する細胞であり得る。他の好ましい実施形態において、Tie1抗原は活性化立体配座を有し、例えば二量体化している。
好ましい実施形態において、Tie1抗原はヒト起源であり、例えばヒトTie1の細胞外ドメインまたはその一部のフラグメント(例えば、Tie1のHA結合ドメイン)を含む。Tie1抗原は、別のポリペプチド(例えば、精製ハンドル(purification handle))に必要に応じて融合させた組換えポリペプチドであり得、またはTie1(例えば、内皮細胞)をその表面に発現する細胞であり得る。他の好ましい実施形態において、Tie1抗原は活性化立体配座を有し、例えば二量体化している。
好ましい実施形態において、この方法は、さらに、同定されたファージまたはハイブリドーマから核酸分子を単離する工程を包含し、この核酸分子が、Tie1抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは抗体をコードする。この単離した核酸分子を、本明細書中に記載されるように、治療因子を生成するために使用し得る。
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載の方法により同定されるタンパク質をコードする核酸により特徴付けられる。好ましい実施形態において、核酸は、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン、または本明細書中に記載される免疫グロブリンフラグメントをコードする配列を含む。例えば、本発明は、本明細書中に記載されるようなTie1結合抗体分子の重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれコードする第一および第二の核酸により特徴付けられる。ともに機能する重鎖と軽鎖をコードする配列は、異なる核酸分子上または同じ核酸分子上に存在し得る。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される核酸を含む宿主細胞およびベクターにより特徴付けられる。
さらに別の局面において、本発明は、Tie1結合抗体、またはその抗原結合フラグメントを生成する方法により特徴付けられる。この方法は:重鎖可変領域(例えば、本明細書中に記載されるような重鎖可変領域)を含むポリペプチドをコードする第一核酸を含む宿主細胞を提供する工程;軽鎖可変領域(例えば、本明細書中に記載されるような軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第二核酸を提供する工程;ならびに上記軽鎖および重鎖の可変領域の集合体が、Tie1と相互作用する抗原結合タンパク質を形成し得る条件下で、上記第一および第二の核酸を宿主細胞中に発現させる工程を包含する。これら第一および第二の核酸は、連結または未連結であり得、例えば同じベクターまたは異なるベクター上にそれぞれ発現し得る。第一および第二の核酸は、同じ分子の成分であり得、または異なる分子(例えば、異なる染色体またはプラスミド)上に存在し得る。
宿主細胞は、真核細胞(例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞)、または原核細胞(例えば、大腸菌)であり得る。例えば哺乳動物細胞は、培養細胞または細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞として、リンパ球細胞株(例えば、NS0)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、COS細胞、HEK294、卵母細胞および形質転換動物の細胞(例えば、哺乳動物内皮細胞)が挙げられる。例えば、本明細書中に記載される抗体をコードする核酸は、形質転換動物において発現し得る。一実施形態において、核酸を組織特異的プロモーター(例えば、乳腺特異的プロモーター)の制御下に置き、抗体を形質転換動物中に生成する。例えば、抗体分子は、形質転換動物(例えば、遺伝子導入ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたは齧歯動物)の乳中で分泌される。単鎖抗体を生成するために、重鎖および軽鎖の可変ドメインの両方を含む単一ポリペプチドをコードするように核酸を構成する。
Tie1は、広範な癌に関連して過剰発現することがわかった。Tie結合タンパク質(例えば、抗体)を有する腫瘍脈管構造上のTie1の標的化を、腫瘍成長および転移が低減するように脈管構造を阻害、破壊、さもなければ中和するために使用し得る。これらのタンパク質は、例えば毒性ペイロードと結合し得、または直接的な機能的阻害を媒介し得る。ADCCの原因となり得るタンパク質(例えば、Fcドメインを有するタンパク質)もまた使用し得る。
別の局面において、本発明は、細胞(例えば内皮細胞)の活性、例えば、細胞(例えば内皮細胞(例えば、癌(例えば、腫瘍)周辺の内皮細胞)の増殖、付着、成長または生存等の細胞活性を阻害する方法により特徴付けられる。例示的な方法は、細胞を、細胞の付着、移動、成長または増殖を阻害するのに十分な量でTie1結合タンパク質と接触させる工程を包含する。Tie1結合タンパク質を投与する方法は、例えば障害(disorder)、例えば炎症性障害(例えば、関節リウマチ、狼瘡、再狭窄、乾癬、移植片対宿主反応または多発性硬化症)または癌障害(例えば、悪性または転移性疾患)を治療または予防するのに有効な量のTie1結合タンパク質を、被験体(例えば、実験動物またはヒト患者)に投与することにより、該疾患を治療または予防するために使用し得る。
Tie1結合タンパク質を、血管形成関連障害、特に血管形成依存性癌および腫瘍を処置または予防するために使用し得る。血管形成関連疾患としては、これらに限定されないが、固形腫瘍;腫瘍転移;良性腫瘍(例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫;関節リウマチ);乾癬;眼血管形成疾患、例えば、糖尿病性網膜症、早熟性網膜症、黄班変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症、ルベオーシス;Osler−Webber症候群;心筋血管形成;プラーク新血管形成;末梢血管拡張症;血友病関節;血管線維腫;および傷の肉芽形成が挙げられる。
「血管形成依存性癌および腫瘍」は、それらの成長(容積および/または質量の拡大)のために、血管の数および密度を増大して血液を供給することを必要とする癌腫瘍である。一実施形態において、Tie1結合タンパク質は、そのような癌および腫瘍の退縮を引き起こす。「退縮」とは腫瘍の質量および大きさの縮小、例えば少なくとも2%、5%、10%または25%の減少をいう。
更に又、Tie1およびTie2は造血細胞中で発現される(Kukk et al(1997)Br.J.Haematol.98:195;Iwama et al(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.195:301)。従って、別の実施形態において、Tie1結合タンパク質は造血状態、例えば造血系の癌を治療するために使用される。造血系の癌の例は、造血系起源の過形成/新生物の細胞、例えば骨髄様、リンパ様または赤血球様の系統から生じる細胞またはその前駆細胞から誘導された癌を包含する。例示される癌は急性前骨髄性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ芽球白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、前リンパ性白血病(PLL)、ヘアリー細胞白血病(HLL)およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM),非ホジキンリンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大顆粒リンパ球性白血病(LGF)、B細胞慢性リンパ球性白血病、脊髄形成異常症候群およびホジキン病を包含する。
別の特徴においては、本発明は細胞(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)、例えば内皮細胞、例えば癌、例えば腫瘍の近接部の内皮細胞を接触させる方法を特徴とする。方法はTie1と相互作用する薬剤(例えばタンパク質)、例えば本明細書に記載したタンパク質を準備すること、および検出可能なリガンド−細胞複合体少なくとも1つが形成されるのに十分な量のタンパク質に細胞を接触させることを包含することができる。タンパク質は例えば標識または細部毒性の実体、例えば免疫グロブリンFcドメインまたは細胞毒性剤を包含できる。
別の局面において、本発明は例えば被験体にアジュバント療法として本明細書に記載した薬剤を投与することを特徴とする。アジュバント療法は腫瘍の全てまたは部分を除去する手術を被験体が受けた後(例えば神経膠芽細胞腫または結腸直腸癌、乳癌または肺癌の手術の後)に被験体に投与される術後治療薬であることができる。例えば、薬剤はTie1複合体形成を阻害するか、Tie1ホモ二量体化を促進するか、または、Tie1リン酸化を増大させるタンパク質である。例えば薬剤はTie1に結合するタンパク質(例えば抗Tie1抗体)である。一実施形態において、薬剤は手術の6、12、24、48または100時間以内に投与する。薬剤は手術前並びに後に投与できる。
例示される薬剤は(a)E3抗体の重鎖可変ドメインに少なくとも85、90、95、98または99%同一である重鎖可変ドメイン配列およびE3抗体の軽鎖可変ドメインに少なくとも85、90、95、98または99%同一である軽鎖可変ドメイン配列;(b)Tie1への結合に関してE3と競合する抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列;または(c)E3抗体の重鎖可変ドメインのCDRの1、2または3つおよびE3抗体の軽鎖可変ドメインのCDRの1、2または3つ、を包含するTie1結合剤である。本明細書に記載する他のTie1結合剤、例えば、M0059A02、M0045A02*、M0054G05、M0053F05、M0053G05、M0061C06、M0045B01、M0046G12、M0046H11、M0053A02、M0053A05、M0046B06、M0044B10、M0044B08、M0056G08、M0045B03、M0053F04、M0055E10、M0060H01、M0054H10またはM0058F03の重鎖可変ドメインに少なくとも85、90、95、98、99%または100%同一である重鎖可変ドメイン配列、およびM0059A02、M0045A02*、M0054G05、M0053F05、M0053G05、M0061C06、M0045B01、M0046G12、M0046H11、M0053A02、M0053A05、M0046B06、M0044B10、M0044B08、M0056G08、M0045B03、M0053F04、M0055E10、M0060H01、M0054H10またはM0058F03の軽鎖可変ドメインに少なくとも85、90、95、98、99%または100%同一である軽鎖可変ドメイン配列を包含するTie1結合剤も使用できる。
別の局面において、本発明は、治療、例えば細胞の阻害、除去または殺傷、または、細胞の活性少なくとも1つの弱化の方法を特徴とする。方法はTie1結合タンパク質、例えば本明細書に記載したリガンドを準備すること、および、細胞の活性少なくとも1つを弱化、細胞を阻害、除去または殺傷するために十分な量のタンパク質に細胞を接触させることを包含する。接触はインビトロまたはインビボであってよい。例えば細胞は内皮細胞、例えば癌、例えば腫瘍の近接部にある内皮細胞であることができる。タンパク質は細胞毒性の実体を包含できる。Tie1結合タンパク質または本明細書に記載した他の薬剤を投与する方法は、例えば障害、例えば内皮細胞系の障害、血管障害、創傷治癒または癌性の障害(例えば悪性または転移性の障害)を治療または防止するために、そのような障害を治療または防止するために十分な量のTie1結合タンパク質を被験体(例えば実験動物またはヒト患者)に投与することにより、使用することができる。
Tie1結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子は、例えばインビトロまたはエクスビボで培養中の細胞に使用し得る。例えば、内皮細胞(例えば、癌生検材料中の内皮細胞)を、インビトロにおいて培地中で培養し得、Tie1結合タンパク質を培地に加えることにより、接触工程を実施し得る。この方法を、被験体に存在する細胞(例えば、癌性または転移性細胞)に対して、インビボ(例えば、治療または予防)プロトコルの一部として実施し得る。インビボ実施形態について、接触工程を被験体中で実施し、この工程は、タンパク質の細胞への結合および細胞の付着、移動、成長または増殖の阻害の両方を可能とするのに有効な条件下で、Tie1結合タンパク質を被験体に投与する工程を包含する。
Tie1結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子を、例えば、造血癌、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移病巣、特に、血液供給または血管形成を必要とする腫瘍等の癌性疾患を処置または予防するために使用し得る。固形腫瘍の例としては、例えば、種々の器官系(例えば、肺、胸、リンパ節、胃腸管(例えば、結腸)および尿生殖器管(例えば、腎臓、尿路上皮細胞)、咽頭を侵す)の肉腫、腺癌および癌腫等の悪性腫瘍、ならびに、例えば、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌腫、肝臓癌、肺の非小細胞癌腫、小腸癌および食道癌等の悪性腫瘍を含む腺癌が挙げられる。被験体は、哺乳動物、例えば霊長類、好ましくは高等霊長類、例えばヒト(例えば、本明細書中に記載される障害、例えば内皮細胞に基づく障害、例えば癌を有するかまたはその危険性のある患者)であり得る。
Tie1結合抗体またはそのフラグメント、例えば本明細書中に記載されるTie1結合抗体またはそのフラグメントを、被験体に対して、全身的に(例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、鼻腔内、経皮、または吸入により)、局所的に、または鼻、喉および気管支等の粘膜への適用により投与し得る。
これらの方法は、例えば:腫瘍サイズの減少;癌マーカー(例えば、癌特異抗原レベル)の減少;新しい病巣出現(例えば骨スキャンにおいて)の減少;新たな疾患関連症状の出現の減少;または軟組織塊の大きさの減少または安定化;あるいは臨床転帰の改善に関連する任意のパラメーターのうちの一つ以上の減少について、被験体をモニタリングする工程をさらに包含し得る。被験体は、以下の期間:処置開始前;処置中;または処置の一つ以上の要素を投与した後の一つ以上の期間中、モニタリングし得る。モニタリングは、同じTie1結合タンパク質によるさらなる処置の必要性、またはさらなる因子によるさらなる処置の必要性を評価するために使用し得る。一般的に、上記パラメーターの一つ以上の減少は、被験体の状態の改善を示す。モニタリングに関する情報は、例えば電子形態またはデジタル形態で記録され得る。
Tie1結合タンパク質は、非結合体化形態にて単独で使用することにより、Tie1発現細胞の付着、移動または溢出を阻害するか、またはTie1発現細胞を剥離または死滅させ得る。Tie1結合タンパク質が抗体である場合、剥離または死滅を、例えば、補体媒介細胞溶解および/またはエフェクター細胞媒介細胞死滅等の抗体依存性細胞死滅機構により媒介し得る。他の実施形態において、Tie1結合タンパク質は、Tie1発現細胞を死滅または剥離するのに効果的な物質、例えば、細胞毒性因子または細胞毒性部分に結合(例えば、直接的かまたは間接的な物理的会合、共有または非共有結合)し得る。例えば、Tie1結合タンパク質は、放射性イオン(例えば、α−、γ−またはβ−エミッター)、例えば、ヨウ素(131Iまたは125I)、イットリウム(90Y)、ルテチウム(177Lu)、アクチニウム(225Ac)またはビスマス(212Biまたは213Bi)に結合し得る。
本発明の方法および本明細書中に記載される組成物を、他の治療様式と組合せて使用し得る。一実施形態において、これらの方法は、Tie1結合タンパク質、例えば、Tie1結合抗体またはそのフラグメントを、疾患を処置または予防するのに有効な量で、細胞毒性因子と組み合せて、被験体に投与する工程を包含する。Tie1結合タンパク質および細胞毒性因子は、同時または逐次的に投与され得る。他の実施形態において、Tie1結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子は、外科的および/または放射線手法と組み合わせて使用される。
別の局面において、本発明は、サンプル中、インビトロ(例えば、生物学的サンプル、組織生検材料、例えば癌病巣)で、Tie1タンパク質またはTie1を発現する細胞(例えば内皮細胞)の存在を検出するための方法により特徴付けられる。この主題の方法を、本明細書中に記載される障害(例えば、癌障害)を評価、例えば診断または段階付けるために使用し得る。この方法は:(i)Tie1結合タンパク質とTie1タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、サンプル(および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル)を、本明細書中に記載されるTie1結合タンパク質と接触させる工程;ならびに(ii)Tie1結合タンパク質とサンプル(および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル)との複合体の形成を検出する工程を包含する。複合体の形成は、Tie1タンパク質(例えば、活性化Tie1タンパク質)の存在を示すものであり、本明細書中に記載される処置に対する適合性または必要性を示し得る。例えば、参照サンプル、例えばコントロールサンプルに比較して、サンプル中の複合体の形成の統計的に有意な変化は、このサンプル中のTie1(例えば、活性化Tie1)の存在を示している。
さらに別の局面において、本発明は、Tie1(例えば、活性化Tie1)の存在をインビボ(例えば、被験体中のインビボ画像化)で検出するための方法を提供する。この主題の発明を、本明細書中に記載される障害、例えば癌障害を評価、例えば診断、位置特定または段階付けるために使用し得る。この方法は:(i)Tie1結合タンパク質とTie1タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、Tie1結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)を、被験体(および必要に応じて、コントロール被験体)に投与する工程;ならびに(ii)このTie1結合タンパク質とTie1との複合体の形成を検出する工程を包含し、参照(例えば、コントロール被験体または被験体のベースライン)に比較して、被験体中の複合体形成の統計的に有意な変化が、Tie1の存在を示している。被験体内の特定の位置でのTie1の存在は、内皮細胞関連障害、例えば、血管形成関連障害(例えば、癌(例えば転移性癌))、または本明細書中に記載される他の血管形成関連障害を示すことができる。
腫瘍細胞はTie1を発現することができる。一局面において、本発明は被験体由来のサンプルを準備し、そして、サンプル中の細胞内のTie1発現を評価する方法を特徴とする。一実施形態において、Tie1発現水準の評価の結果を比較コントロール、例えば比較コントロール数値または比較コントロール特性と比較する。例えば、評価されたサンプル上のTie1発現は比較参照の数値と同様、低値または高値であってよい。比較コントロールの数値または性質はコントロールサンプル、統計値(例えば平均、メジアン等)または任意の数値を用いながら測定される。例えばコントロールサンプルは正常サンプル、例えば同じか異なる被験体に由来する腫瘍細胞を含まない使用であることができる。比較コントロールと相対比較した場合の変化(例えば増大)はサンプルが腫瘍細胞を包含すること、例えば被験体が腫瘍保有としての適応症であることを示している。
他の実施形態において、本明細書中に記載される障害(例えば、炎症または癌障害)を診断または段階付ける方法を提供する。この方法は:(i)この障害を有するか、またはその危険性のある被験体を同定する工程;(ii)この障害に侵された組織または細胞のサンプルを入手する工程;(iii)結合因子とTie1タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、このサンプルまたはコントロールサンプルを、Tie1結合タンパク質と接触させる工程(iv)ならびに複合体の形成を検出する工程を包含する。参照サンプル、例えばコントロールサンプルに対して、Tie1結合タンパク質との複合体の形成の統計的に有意な増加は、障害または障害の段階を示している。例えば、固形腫瘍に位置する腫瘍細胞上の活性化Tie1の発見は、腫瘍が転移性癌に進行していることを示し得る。
好ましくは、インビボおよびインビトロ診断法に使用されるTie1結合タンパク質を、結合または非結合の結合因子の検出を促進する検出可能な物質で、直接的または間接的に標識する。適切な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。一実施形態において、Tie1結合タンパク質は、放射性イオン、例えば、インジウム(111In)、ヨウ素(131Iまたは125I)、イットリウム(90Y)、アクチニウム(225Ac)、ビスマス(212Biまたは213Bi)、イオウ(35S)、炭素(14C)、トリチウム(3H)、ロジウム(188Rh)またはリン(32P)に結合する。別の実施形態において、このTie1結合タンパク質を、NMR造影剤で標識する。
一局面において、本発明は腫瘍の脈管構造を画像化する方法を特徴とし、方法はTie1、Tie2またはAngに結合するタンパク質、例えば本明細書に記載したタンパク質を準備すること、ただしここでタンパク質は画像化剤に物理的に会合しているものであること;例えば腫瘍を有する患者にタンパク質を投与すること;および、例えば腫瘍の脈管構造を検出するために患者を画像化することを包含する。
一局面において、本発明は血液骨新生物障害を有する患者を治療する方法を特徴とし、方法は血液骨新生物障害(例えば造血細胞の増殖性障害、例えば白血病)を有する患者にTie1、Tie2またはAngに結合するタンパク質、例えば本明細書に記載したタンパク質を投与することにより障害を治療することを包含する。
一局面において、本発明は被験体を診断および治療する方法を特徴とし、方法はTie1、Tie2またはAngに関連するパラメーターを評価すること;およびパラメーターが比較コントロールと相対比較して改変されている場合は本明細書に記載したタンパク質を患者に投与することにより被験体を治療することを包含する。一実施形態において、パラメーターは例えば被験体の組織中のタンパク質またはmRNAの水準を示す数値を包含する。一実施形態において、比較コントロールは比較コントロールの被験体、例えば年齢/性別がマッチした被験体、例えばコントロールまたは正常な被験体に関して求めた数値を包含する。
一局面において、本発明は被験体を治療する方法を特徴とし、方法は、比較コントロールと比較して上昇したTie1、Tie2またはAngの生体分子または活性を有する被験体に本明細書に記載したタンパク質を投与することを包含する。方法は例えば被験体が比較コントロールと比較して上昇したTie1、Tie2またはAngの生体分子または活性を有するかどうかを調べるために被験体を評価することを包含できる。一実施形態において、被験体は上昇したTie1タンパク質またはmRNA水準を有する。
本発明はまた、広範なアミノ酸配列および核酸配列、例えば、本明細書中に記載される配列または本明細書中に記載される配列に関連する配列を包含するポリペプチドおよび核酸を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に記載される各ポリペプチドをコードする核酸により特徴付けられる。この核酸は、同系コドン、または各々のポリペプチドを産生するように翻訳され得る任意の組のコドンを含み得る。そのようなポリペプチドは、多鎖タンパク質の個々のサブユニット、例えば、複数の異なるポリペプチド鎖を含む抗体を含む。この核酸はまた、発現されない核酸フラグメントまたはベクターであり得るが、免疫グロブリン可変領域(例えば、本明細書中に記載されるCDR等)の少なくとも一部またはその補体をコードする配列を含む。そのような核酸を、有用な構築物、細胞およびタンパク質を調製するために使用し得る。さらに、本発明は、本明細書中に記載される核酸を含む宿主細胞により特徴付けられる。この細胞は、本明細書中に記載されるタンパク質を、例えばその表面に発現し得る。本発明はまた、本明細書中に記載される核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、または本明細書中に記載される核酸にハイブリダイズするタンパク質を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質をいう。例えば、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書中ではVHと略す)および軽(L)鎖可変領域(本明細書中ではVLと略す)を含み得る。別の例において、抗体は、二つの重(H)鎖可変領域および二つの軽(L)鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合フラグメント(例えば、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2、Fdフラグメント、FvフラグメントおよびdAbフラグメント)ならびに完全抗体を包含する。
VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれるより保存的な領域が点在する「相補性決定領域」(「CDR」)と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割され得る。このフレームワーク領域およびCDRの範囲は、正確に定義されている(Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242およびChothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901−917を参照)。Kabatの定義を、本明細書中で使用する。VHおよびVLのそれぞれは、典型的には三つのCDRおよび四つのFRから成っており、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。
「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインをいう。免疫グロブリンドメインは、典型的には約7つのβストランドから構成される二つのβシート、および保存されたジスルフィド結合を含む(例えば、A.F.Williams and A.N. Barclay 1988 Ann.Rev Immunol.6:381−405を参照)。免疫グロブリン可変領域の超可変ループの標準構造は、Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227:799−817;Tomlinson et al.(1992)J.Mol.Biol.227:776−798);およびTomlinson et al.(1995) EMBO J.14(18):4628−38に記載されるように、その配列から推測され得る。
本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成し得るアミノ酸配列をいう。例えばこの配列は、天然の可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含み得る。例えばこの配列は、一つ、二つまたはそれ以上のNまたはC末端アミノ酸、内部アミノ酸を除外し得、一つ以上の挿入物または付加的な末端アミノ酸を含み得、あるいは他の改変物を含み得る。一実施形態において、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と会合して、標的結合構造物(または「抗原結合部位」)、例えばTie1と相互作用する(例えばTie1へ結合するか、またはTie1を阻害する)構造物を形成し得る。
抗体のVH鎖またはVL鎖は、重鎖または軽鎖定常領域の全てまたは一部をさらに含むことで、それぞれ免疫グロブリン重鎖または軽鎖を形成し得る。一実施形態において、抗体は二つの免疫グロブリン重鎖および二つの免疫グロブリン軽鎖からなる四量体であり、これらの免疫グロブリン重鎖または軽鎖は、例えばジスルフィド結合により相互に結びついている。重鎖定常領域は、CH1、CH2およびCH3の三つのドメインを含む。軽鎖定常領域は、CLドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の多様な細胞(例えば、エフェクター細胞)および典型的な補体系の第一成分(Clq)等の宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。用語「抗体」とは、IgA型、IgG型、IgE型、IgD型、IgM型(ならびにそれらのサブタイプ)のインタクトな免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンの軽鎖は、κまたはλ型であり得る。一実施形態において、抗体は、グリコシル化している。抗体は、抗体依存性細胞毒性および/または補体媒介細胞毒性に対して機能し得る。
抗体の一つ以上の領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、一つ以上の可変領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、一つ以上のCDRが、ヒトのもの(例えば、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2およびLC CDR3)であり得る。各軽鎖CDRは、ヒトものであり得る。HC CDR3は、ヒトものであり得る。一つ以上のフレームワーク領域が、ヒトのもの(例えば、HCまたはLCのFR1、FR2、FR3およびFR4)であり得る。一実施形態において、全てのフレームワーク領域はヒトのもの(例えば、ヒトの体細胞、例えば免疫グロブリンを産生する造血細胞、または非造血細胞に由来する)であり得る。一実施形態において、ヒト配列は、例えば生殖細胞系核酸によりコードされる生殖細胞系配列である。一つ以上の定常領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。別の実施形態において、フレームワーク領域(例えば、集団的にFR1、FR2およびFR3、または集団的にFR1、FR2、FR3およびFR4)または抗体全体の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%または98%がヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、FR1、FR2およびFR3は、集団的に、軽鎖または重鎖配列をコードする座のヒト生殖細胞系Vセグメントによりコードされるヒト配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%または99%同一であり得る。
抗体の全てまたは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによりコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α(IgA1およびIgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン軽鎖(約25Kdまたは214アミノ酸)は、NH2末端(約110アミノ酸)にて可変領域遺伝子によりコードされ、COOH末端にてκまたはλ定常領域遺伝子によりコードされている。全長免疫グロブリン重鎖(約50Kdまたは446アミノ酸)は、同様に可変領域遺伝子(約116アミノ酸)および他の上記の定常領域遺伝子のうちの一つ、例えばγ(約330アミノ酸をコードする)によりコードされている。軽鎖は、軽鎖可変ドメインを含む任意のポリペプチドをいう。重鎖は、重鎖可変ドメインを含む任意のポリペプチドをいう。
全長抗体(または単に「抗体部分」または「フラグメント」)の「抗原結合フラグメント」との用語は、本明細書中で使用される場合、目的の標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の一つ以上のフラグメントをいう。全長抗体の「抗原結合フラグメント」との用語に包含される結合フラグメントの例として、(i)Fabフラグメント、すなわちVL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価フラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した二つのFabフラグメントを含む二価フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al.(1989)Nature 341:544−546);ならびに(vi)官能性を保持する単離された相補性決定ドメイン(CDR)が挙げられる。さらに、Fvフラグメントの二つのドメインであるVLおよびVHは、別個の遺伝子によりコードされているが、それらは組換え法を使用して、合成リンカーにより結合され得る。この合成リンカーは、VLおよびVH領域が対となり、単一鎖Fv(scFv)として公知の一価分子を形成する単一タンパク質鎖として、これらの領域が作製されることを可能とする。例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423−426;およびHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883を参照されたい。
抗体フラグメントは、当業者に公知の従来的な技術を含む任意の適切な技術を使用して得られる。用語「単一特異性抗体」とは、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語は、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含み、本明細書中で使用される場合、単一の分子組成を有する抗体またはそのフラグメントの調製物をいう。本明細書中で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、IgMまたはIgG1)をいう。
一実施形態において、抗体のHCまたはLCは、ヒト生殖細胞系配列によりコードされるアミノ酸配列に対応する配列、例えばフレームワーク領域および/またはCDR中のものを含む。例えば抗体は、ヒトDP47抗体由来の配列を含み得る。一実施形態において、抗体の一つ以上のコドンが、生殖細胞系核酸配列に関して変更されるが、同一のアミノ酸配列をコードするように選択される。コドンは、例えば、特定の系において発現を最適化したり、制限酵素部位を作製したり、サイレントフィンガープリントを作製するよう選択し得る。
一実施形態において、抗体HCのCDR2は、DP47のCDR2に見られるアミノ酸と同一である少なくとも11、12、13、14または15アミノ酸位置を含む。
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域とは、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」免疫グロブリンの説明は、例えば、米国特許第6,407,213号および米国特許第5,693,762号を含む。
「有効なヒト」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「有効なヒト」抗体は、抗体が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトアミノ酸位置を含む抗体である。
本明細書においては、「Tie複合体」とはTie1、Tie2およびアンジオポエチン(Ang)を包含するヘテロマー複合体を指す。複合体はTie1およびTie2の細胞外ドメインの会合により部分的には形成され、そして更にAngも包含する。本明細書においては、「複合体メンバー」とはヘテロマーTie複合体に包含されるタンパク質を指す。従って、Tie1、Tie2およびAngは全て複合体メンバーである。「Ang」という用語は全てのアンジオポエチン、例えばAng1、Ang2、Ang3およびAng4を包含する。ヘテロマーTie複合体はTie1、Tie2およびAng以外に他のタンパク質も包含できる。複合体形成に拮抗するタンパク質またはリガンドは複合体の他のメンバーの少なくとも1つとのTie1、Tie2またはAngの会合を阻害または低減し、そしてこれにより、Tie2シグナリングおよび下流の作用、例えば新脈管形成を低減する。新脈管形成は初期の血管の形成および後期の血管のリモデリングおよび形態学的変化を包含する血管の発生(例えば血管またはリンパ管の発生)の全ての段階を包含する。
本明細書においては、「アゴニスト」および「拮抗剤」という用語は特定の活性または作用の意味における特性を説明するものである。例えばE3またはE3b抗体はTie1の自己会合(例えばホモ二量体化)を促進するという意味においてアゴニストであることができ、そしてなお、HUVECによるTie複合体の形成および管形成を低減または阻害するという意味においては拮抗剤である。同様に、Tie1シグナリング経路の意味においてアゴニストである薬剤は内皮細胞の新芽形成、分離および管形成の意味においては拮抗剤であることができる。
「Tie1エクトドメイン」という用語はTie1タンパク質の細胞外領域、例えば配列番号2のアミノ酸25〜759を概ね包含する領域を指す。他の例示される領域はEGF様ドメイン1つ以上(例えば配列番号2の214〜256、258〜303、303〜345、214〜303、258〜345または214〜345);Ig様C2型ドメイン1つ以上(例えば43〜105、43〜426、372〜426);フィブロネクチンIII型リピートの1つ以上(例えば配列番号2の446〜540、543〜639、643〜744、446〜639、543〜744または446〜744);およびこれ等の組み合わせを包含する領域である。「第1のIg様C2型ドメイン」および「Ig1」という用語は、他のIg様C2型ドメイン(第2のこのようなドメイン)と相対比較して、タンパク質のアミノ末端に最も近く位置するTie1またはTie2における免疫グロブリン様ドメインを指す。例えばTie1については、第1の免疫グロブリン様C2型ドメインは概ね残基43〜概ね残基105に位置し、そして第2の免疫グロブリン様C2型ドメインは概ね残基372〜概ね残基426に位置する。
本明細書中で使用される場合、「結合親和性」とは、見掛け会合定数Kaをいう。Kaは、解離定数(Kd)の逆数である。リガンドは、例えば特定の標的分子に対して少なくとも105M−1、106M−1、107M−1または108M−1の結合親和性を有する。第二標的に比較して、第一標的に対するリガンドの高い親和性結合は、第二標的への結合に関するKa(または絶対値Kd)よりも、第一標的への結合に関する高いKa(または小さい絶対値Kd)により示し得る。そのような場合、リガンドは、第二標的に比較して第一標的に対する特異性を有する。結合親和性の違いは(例えば、特異性または他の比較に関して)、少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍または1000倍であり得る。例えば、Tie1結合タンパク質は、別の抗原、例えばTie2、EGF、フィブロネクチンまたはヒト血清アルブミンよりも少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍または1000倍、優先的にTieと結合し得る。Tie1結合タンパク質はまた、種特異的または種一般的(例えば、二種類以上の種に由来するTie1タンパク質に結合し得る)であり得る。
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ELISA、表面プラズモン共鳴または分光法(例えば、発光アッセイを用いる)等の種々の方法により決定され得る。これらの技術を使用して、結合または遊離のリガンドの濃度をリガンド(または標的)濃度の関数として測定し得る。結合リガンド([結合])の濃度は、遊離リガンド([遊離])の濃度および標的上のリガンドの結合部位の濃度に関連付けられ、ここで(N)は下記式による1標的分子あたりの結合部位の数である。
[結合]=N・[遊離]/((1/Ka)+[遊離])
Kaの定量的測定はルーチンではあるが、必ずしも正確なKaの測定を行う必要はなく、例えば、ELISAまたはFACS分析等の方法を使用して決定される親和性の定性的測定値を得れば十分な場合もあるが、Kaに比例するので、より高い親和性が、参照よりも例えば2倍、5倍、10倍、20倍または50倍高いかどうかの決定等の比較に使用し得る。結合親和性は、典型的には0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005%(v/v)界面活性剤P20中で評価する。
Kaの定量的測定はルーチンではあるが、必ずしも正確なKaの測定を行う必要はなく、例えば、ELISAまたはFACS分析等の方法を使用して決定される親和性の定性的測定値を得れば十分な場合もあるが、Kaに比例するので、より高い親和性が、参照よりも例えば2倍、5倍、10倍、20倍または50倍高いかどうかの決定等の比較に使用し得る。結合親和性は、典型的には0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005%(v/v)界面活性剤P20中で評価する。
「単離された組成物」は、単離された組成物を入手し得る天然サンプルの少なくとも一つの成分の少なくとも90%から取り除かれる組成物をいう。人工的または天然に生成される組成物は、種または目的の種の個体群が重量/重量で少なくとも5%、10%、25%、50%、75%、80%、90%、95%、98%または99%純粋である場合に、「少なくとも」ある程度の純度を有する「組成物」となり得る。
「エピトープ」は、リガンド、例えば抗原結合タンパク質(例えばFabまたは抗体)が結合する標的化合物上の部位をいう。この標的化合物がタンパク質である場合、例えばエピトープは、リガンドが結合するアミノ酸を言い得る。オーバーラップするエピトープは、少なくとも一つの共通アミノ酸残基を含んでいる。
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同一」(または「実質的に相同」)とは、第一および第二のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が類似の活性を有するように、第二アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に同一または等価な(例えば、類似の側鎖、例えば保存アミノ酸置換物を有する)十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第一のアミノ酸配列またはヌクレオチ配列をいうために本明細書中で使用される。抗体の場合、第二の抗体は同じ特異性を有し、同上のものの少なくとも50%の親和性を有する。
本明細書中に開示される配列に類似または相同(例えば少なくとも約85%の配列同一性)である配列もまた、本出願の一部である。一部の実施形態において、配列同一性は、約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上であり得る。あるいは、核酸セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件(例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件)下で、該ストランドの補体にハイブリダイズする場合、実質的な同一性が存在する。核酸は全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製されるか、実質的に純粋な形態で存在して得る。
二つの配列間の「相同性」または「配列同一性」(これらの用語は本明細書中で相互交換可能に使用される)の算定は、下記のとおり実施される。それら配列は、最適な比較の目的のために配列する(例えば、最適配列のために、第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一つまたは両方にギャップを導入し得、比較の目的のために、非相同配列を無視し得る)。好ましい実施形態において、比較の目的のために配列される参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、よりさらに好ましくは少なくとも60%、よりさらに好ましくは少なくとも70%、80%、90%、100%である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列中の位置が、第二配列中の対応する位置として、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、それらの分子はその位置において同一である(本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同義である)。二つの配列間の相同性パーセントは、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、二つの配列の最適配列のために導入される必要のある配列により共有される同一位置の数の関数である。
配列の比較および二配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、二アミノ酸配列間の同一性パーセントを、Blossum 62マトリックスかまたはPAM250マトリックス、ならびに16、14、12、10、8、6または4のギャップウエイトおよび1、2、3、4、5または6の長さウエイトを使用して、GSGソフトウエアパッケージのGAPプログラムに組み込まれたNeedleman and Wunsch((1970)J. Mol. Biol. 48:444−453)アルゴリズムを使用して決定する。さらに別の好ましい実施形態において、二ヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、NWSgapdna.CMPマトリックスならびに40、50、60、70または80のギャップウエイトおよび1、2、3、4、5または6の長さウエイトを使用して、GCGソフトウエアパッケージのGAPプログラムを使用して決定する。特に好ましいパラメーターの組(および分子が、本明細書中に記載される配列同一性または相同性制限の範囲にある場合に、どのパラメーターを決定に適用するか不確かな場合に用いられるべきパラメーター組)は、ギャップペナルティー12、ギャップ拡張ペナルティー4およびフレームシフトギャップペナルティー5を用いるBlossum62スコアリングマトリックスである。
本明細書中で使用される場合、用語「相同」とは、「類似」と同義であり、目的の配列が、一つ以上のアミノ酸置換物の存在により参照配列と異なることを意味する(但し、適度のアミノ酸挿入または欠損は存在し得る)。参照配列に対する相同性または類似性の程度を算定する現在のところ好ましい手段は、それぞれの場合で、算定された配列関連性の有意性を決定するためのアルゴリズムデフォルトまたは推奨されるパラメーターを使用したBLASTアルゴリズム(the National Center of Biotechnology Information(NCBI),National Institutes of Health,Bethesda MDから入手可能)を使用することによる。二アミノ酸配列間または二ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、PAM120ウエイト残基表、ギャップ長さペナルティー12およびギャップペナルティー4を使用して、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれたE.Meyers and W.Miller((1989)CABIOS, 4:11−17)のアルゴリズムを使用しても決定し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6に見出され得る。水性法および非水性法がこの引用文献に記載されており、いずれの方法も使用し得る。本明細書中で言及されるハイブリダイゼーションの具体的な条件は、以下のとおりである:1)約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く少なくとも50℃での0.2×SSC、0.1%SDSでの二回の洗浄(洗浄の温度は、低ストリンジェンシー条件では55℃まで上昇させ得る);2)約45℃での6×SSC中の中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く60℃での0.2×SSC、0.1%SDSでの一回以上の洗浄;3)約45℃での6×SSC中の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く65℃での0.2×SSC、0.1%SDSでの一回以上の洗浄;および4)非常に高いストリンジェンシー条件は、65℃の0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDS、それに続く65℃での0.2×SSC、1%SDSでの一回以上の洗浄。
本明細書中に記載されるタンパク質は、本明細書中に記載される特定のタンパク質に対し、機能に対して実質的な効果を有さない変異(例えば、保存アミノ酸置換または非必須アミノ酸置換)を有し得ることが理解される。特定の置換が許容されるかどうか、つまり、結合活性等の所望の生物学的特性に悪影響を与えるかどうかを、Bowieら(1990)Science 247:1306−1310に記載されるように決定し得る。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。例えば、フレームワークおよびCDRアミノ酸残基が、一つ以上の同類置換を含むことが可能である。
「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を無効にすることなく、さらに好ましくは生物学的活性を実質的に変えることなく、結合物質(例えば、抗体)の野生型配列から変更させる得る残基であるが、「必須」アミノ酸残基はそのような変化を生じさせる。
一般的に、「X」がアミノ酸残基を示すために用いられる場合、任意のアミノ酸(例えば20種類の天然アミノ酸のいずれか)または少なくともその部分集合(例えば、19種類の非システインアミノ酸のいずれか)を、その位置で使用し得る。
用語「ポリペプチド」または「ペプチド」(これらは相互交換可能に使用し得る)とは、ペプチド結合により連結された長さが3以上のアミノ酸、例えば3〜30、12〜60、もしくは30〜300、または300アミノ酸を超えるポリマーをいう。ポリペプチドは一つ以上の非天然アミノ酸を含み得る。典型的にポリペプチドは、天然アミノ酸のみを含む。「タンパク質」は、一つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。したがって、用語「タンパク質」は、ポリペプチドを包含する。タンパク質またはポリペプチドは、一種以上の改変、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化等を含み得る。用語「小さいペプチド」は、長さが3〜30アミノ酸、例えば長さが8〜24アミノ酸であるポリペプチドを記載するために使用され得る。
統計的な有意性を、任意の技術分野で公知の方法により決定し得る。例示的な統計的検定としては、スチューデントT試験、Mann Whitney U非パラメーター試験およびWilcoxon非パラメーター統計的検定を含む。一部の統計的に有意な関係は、0.05または0.02未満のP値を有する。特定のリガンドは、統計的に有意な差(例えば、P値<0.05または0.02)を、例えば特異性または結合性について示し得る。
本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な説明および別添の特許請求の範囲からより明白となる。本発明の実施形態は、本明細書中に記載される特徴のいかなる組合せも含み得る。いかなる場合も、用語「実施形態」は、本明細書中(例えば、別の実施形態)に開示される1つ以上の他の特徴を必ずしも排除しない。本出願で引用されたすべての参考文献、特許出願および公開された特許の内容を、本明細書中で参考として明確に援用される。
(詳細な説明)
本開示は特に、Tie複合体の成分、例えばTie1、Tie2およびAngに結合する薬剤(結合タンパク質およびリガンドとも称する)を提供する。このような薬剤の例は、タンパク質、例えば小型ペプチド(例えば7〜25アミノ酸の環状または線状ペプチド)、ポリペプチド(例えば少なくとも20アミノ酸のポリペプチド)、または多重鎖のタンパク質(例えば少なくとも2つのペプチドまたはポリペプチドを包含する)を包含する。多重鎖タンパク質の例は別個の重鎖および軽鎖を有するIgG完全長抗体である。ポリペプチドの例は1本鎖抗体である。
本開示は特に、Tie複合体の成分、例えばTie1、Tie2およびAngに結合する薬剤(結合タンパク質およびリガンドとも称する)を提供する。このような薬剤の例は、タンパク質、例えば小型ペプチド(例えば7〜25アミノ酸の環状または線状ペプチド)、ポリペプチド(例えば少なくとも20アミノ酸のポリペプチド)、または多重鎖のタンパク質(例えば少なくとも2つのペプチドまたはポリペプチドを包含する)を包含する。多重鎖タンパク質の例は別個の重鎖および軽鎖を有するIgG完全長抗体である。ポリペプチドの例は1本鎖抗体である。
薬剤は特定の特性、例えばTie1/Tie2/Ang複合体形成に拮抗する能力、Tie1ホモ二量体化を促進する能力およびTie1リン酸化を促進する能力を有するものを選択できる。例えばTie1、Tie2またはAngに結合する薬剤はヘテロマーTie複合体の形成に拮抗するその能力に関して試験できる。この複合体の拮抗によりTie2シグナリングおよびその下流の作用、例えば新脈管形成の促進が低減される。
Tie1は、膜貫通ドメインを含むレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Tie1は、ほぼ内皮細胞のみに存在する。したがって、Tie1結合タンパク質を使用して、例えば内皮細胞を特異的に認識し、または標的とし得る。また、一部のTie1結合タンパク質を、内皮細胞と共働または拮抗させるために使用し得る。一部の実施形態において、これらのTie1結合タンパク質は、特定の構造的特徴物(例えば下記の特徴物)、下記の特徴物の組み合わせ、および/または下記の構造的特徴物に少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに対して親和性を有する(配列は、下記の実施例1、配列番号2に与えられるアミノ酸配列に関連する)。
アンジオポエチンはTie2に結合するリガンドのファミリーである。一部のAng結合タンパク質(例えば抗体または人工Ang結合タンパク質)は内皮細胞をアゴナイズまたは拮抗するために使用できる。一部の実施形態においては、これ等のAng結合タンパク質は特定の構造的特徴、特徴の組み合わせ、および/または、構造的特徴において少なくとも1つのアミノ酸を包含するエピトープに対する親和性を有している。例示される構造的特徴は約50アミノ酸のN末端領域、コイルドコイルドメインまたはフィブリノーゲン様ドメインを包含する。
Ang結合タンパク質の例はAngの多量体化を阻害するタンパク質(例えば4量体を形成するAngタンパク質の能力)、Ang−Tie2相互作用を阻害するタンパク質、およびTie1−Tie2−Angの三元複合体を阻害するタンパク質を包含する。阻害性のタンパク質は既存の相互作用を妨害することにより、または、相互作用の発生を防止することにより機能することができる。
Tie1およびTie2はその細胞外ドメインを介して会合し、そしてアンジオポエチン(Ang)、例えばAng1、Ang2、Ang3およびAng4とのヘテロマー複合体を形成することができる。このヘテロマー複合体はTie2により媒介される細胞内シグナリングカスケードを活性化する。即ち、このヘテロマー複合体の拮抗性の形成はTie2シグナリングおよびその下流の作用、例えば新脈管形成を阻害することへの新しい試み方を提供する。複合体形成はTie1またはTie2の細胞外ドメインに結合するか、または、Angに結合するタンパク質により拮抗されることができ、これによりその複合体へのリクルートメントを防止するか、またはその多量体化を防止する。
Tie1に結合するタンパク質を発見するための1つの方法は、ライブラリーを準備すること、および、Tie1抗原またはそのフラグメントに結合するタンパク質をコードするメンバー1つ以上をライブラリーから選択することを包含する(例えば細胞外ドメイン、EGFドメイン、フィブロネクチンリピートまたはIgスーパーファミリードメイン(例えばIg様C2型2ドメイン))。選択は多くの方法において実施できる。例えばライブラリーはディスプレイライブラリであることができる。Tie1にタグ付けし、組換え発現させることができる。Tie1を精製し、支持体、例えばアフィニティービーズまたは常磁性体ビーズまたは他の磁気的に応答する粒子に結合させる。Tie1はまた細胞表面上で発現させることもできる。例えばTie1が活性化された場合にのみ細胞に特異的に結合するディスプレイライブラリのメンバーを選択できる。類似した操作法を実施することによりTie2またはそのフラグメントに結合するタンパク質を発見することができる(例えば細胞外ドメイン、EGFドメイン、フィブロネクチンリピートまたはIgスーパーファミリードメイン(例えばIg様C2型2ドメイン))。類似した方法を実施することによりAngまたはそのフラグメントに結合するタンパク質を発見することもできる(例えばN末端ドメイン、コイルドコイルドメインまたはフィブリノーゲン様ドメイン)。
Tie複合体メンバーに結合できるものとして発見されたタンパク質はそのヘテロマー複合体形成に拮抗する能力、Tie1リン酸化を促進する能力、および/または、Tie1ホモ2量体形成を促進する能力について後述する実施例に記載する通り試験することができる。ヘテロマー複合体の拮抗性の形成として発見されたタンパク質はそのような治療を必要とする被験体、例えば新脈管構造依存性癌または腫瘍または他の新脈管形成関連障害を有する被験体を治療するための薬学的組成物中に使用できる。
(例示されるTie1モジュレーター)
一実施形態において、Tie1結合タンパク質はTie1の活性を調節できる。例えばTie1結合タンパク質は実施例2に記載するTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験においてTie1アゴニストまたは拮抗剤として機能できる。このTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験におけるTie1アゴニストは特定の条件、例えばTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験の条件の下に内皮細胞の特定の活性を刺激することができる。
一実施形態において、Tie1結合タンパク質はTie1の活性を調節できる。例えばTie1結合タンパク質は実施例2に記載するTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験においてTie1アゴニストまたは拮抗剤として機能できる。このTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験におけるTie1アゴニストは特定の条件、例えばTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験の条件の下に内皮細胞の特定の活性を刺激することができる。
一部のTie1結合タンパク質は内皮細胞におけるホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3キナーゼ)活性および/またはAktキナーゼ活性を増大させる。Kontos等はTie1の原形質ドメインがPI3キナーゼのp85サブユニットと会合してPI3キナーゼ活性を活性化することができることを示唆している。Kontos et al.(2002)Mol.Cell.Biol.22:1704−1713。Tie1原形質ドメインはまたタンパク質チロシンホスファターゼShp2とも会合する。例えばMarron et al.(2000)Adv.Exp.Med.Biol.476:35−46を参照できる。
一部のTie結合タンパク質はTie1の原形質ドメイン、例えば概ねアミノ酸1117におけるモチーフYVNにおけるチロシンの二量体化および/またはチロシンリン酸化(例えば自己リン酸化の結果として)を増大させる場合がある。
Tie1結合タンパク質は細胞試験において評価できる(例えば実施例2において後述するTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験において)。例示される細胞試験は成長因子レセプターの細胞内ドメインに融合されたTie1エクトドメインを包含するキメラレセプターが発現される成長因子依存性細胞を用いる。細胞は必須成長因子の非存在下であるがただし被験化合物、例えばTie1結合タンパク質の存在下において生育する能力について評価する。Tie1結合タンパク質がTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験においてTie1をアゴナイズする場合は、Tie1キメラのシグナリング活性はその同族体レセプターを介して必要な成長因子による刺激の代替となりえる。即ち、必要な成長因子の非存在下における細胞の生存は、Tie1結合タンパク質がTie1エクトドメインと相互作用をすることの指標として用いることができる。
Tie1/EpoRキメラBaF3細胞試験におけるTie1アゴニストは他の条件下、例えばインビボにおいて、Tie1活性の阻害剤として挙動する場合があり、そしてインビトロの特性とは無関係にインビボの新脈管形成の阻害剤として有用であってよい。
Tie1結合タンパク質は例えば内皮細胞の活性を低減するために使用できる。例えば一部のTie1結合タンパク質は内皮細胞におけるホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3キナーゼ)活性、Shp2活性および/またはAktキナーゼ活性を低減するために使用できる。一部のTie1結合タンパク質はまたTie1の原形質ドメイン、例えば概ねアミノ酸1117におけるモチーフYVNにおけるチロシンの二量体化および/またはチロシンリン酸化(例えば自己リン酸化の結果として)を低減する場合がある。
Tie1結合タンパク質は細胞試験において活性を評価できる。例えば結合タンパク質は、本明細書に記載した細胞試験(例えば実施例2において後述するTie1/EpoRキメラBaF3細胞試験)において、他のリガンド、例えばE3抗体がTie1活性を調節することを防止する能力について試験することができる。
(ディスプレイライブラリ)
多くの方法を、Tie1、Tie2、Ang、そのフラグメント、1つ以上のこれらのタンパク質またはそのフラグメントを含む複合体に結合するタンパク質を同定するために使用し得る。一実施形態において、ディスプレイライブラリは、そのようなタンパク質を同定するために使用される。ディスプレイライブラリは、実体の集合であり;各実体は、利用可能なタンパク質成分、およびこのタンパク質成分をコードまたは同定する回収可能な成分を含む。タンパク質成分は、任意の長さ(例えば、3アミノ酸〜300を超えるアミノ酸)であり得る。選択において、ライブラリーの各メンバーのタンパク質成分を標的(例えば、Tie1タンパク質)により調べ、このタンパク質成分がその標的に結合する場合、ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば支持体上の保持により同定する。この方法を、他の標的(例えば、Tie2、Ang、そのフラグメント、1つ以上のこれらのタンパク質またはそれらのフラグメントを含む複合体)に適合させ得る。
多くの方法を、Tie1、Tie2、Ang、そのフラグメント、1つ以上のこれらのタンパク質またはそのフラグメントを含む複合体に結合するタンパク質を同定するために使用し得る。一実施形態において、ディスプレイライブラリは、そのようなタンパク質を同定するために使用される。ディスプレイライブラリは、実体の集合であり;各実体は、利用可能なタンパク質成分、およびこのタンパク質成分をコードまたは同定する回収可能な成分を含む。タンパク質成分は、任意の長さ(例えば、3アミノ酸〜300を超えるアミノ酸)であり得る。選択において、ライブラリーの各メンバーのタンパク質成分を標的(例えば、Tie1タンパク質)により調べ、このタンパク質成分がその標的に結合する場合、ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば支持体上の保持により同定する。この方法を、他の標的(例えば、Tie2、Ang、そのフラグメント、1つ以上のこれらのタンパク質またはそれらのフラグメントを含む複合体)に適合させ得る。
保持されるディスプレーライブラリーメンバーを、支持体から回収し、分析する。この分析は、類似または異なる条件下での増幅およびその後の選択を含み得る。例えば、ポジティブ選択およびネガティブ選択を交互に行い得る。この分析はまた、タンパク質成分のアミノ酸配列の決定および詳細な特性付けのためのタンパク質成分の精製を含み得る。種々のフォーマットを、ディスプレイライブラリに対して使用し得る。例としては以下が挙げられる。
(ファージディスプレー)
一つのフォーマットは、ウイルス、特にバクテリオファージを利用する。このフォーマットは「ファージディスプレー」と呼ばれる。タンパク質成分は、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質に共有結合する。この結合は、コートタンパク質に融合させたタンパク質成分をコードする核酸の翻訳から生じる。この結合は、柔軟性のあるペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、またはストップコドンの阻害の結果として導入されるアミノ酸を含み得る。ファージディスプレーは、例えばLadner et al.、米国特許第5,223,409号;Smith(1985)Science 228:1315−1317;WO92/18619;WO91/17271;WO92/20791;WO92/15679;WO93/01288;WO92/01047;WO92/09690;WO90/02809;de Haard et al.(1999)J.Biol.Chem 274:18218−30;Hoogenboom et al.(1998)Immunotechnology 4:1−20;Hoogenboom et al.(2000)Immunol Today 2:371−8;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370−1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81−85;Huse et al.(1989)Science 246:1275−1281;Griffiths et al.(1993)EMBO J 12:725−734;Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889−896;Clackson et al.(1991)Nature 352:624−628;Gram et al.(1992)PNAS 89:3576−3580;Garrard et al.(1991)Bio/Technology 9:1373−1377;Rebar et al.(1996)Methods Enzymol. 267:129−49;Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133−4137;およびBarbas et al.(1991)PNAS 88:7978−7982に記載されている。
一つのフォーマットは、ウイルス、特にバクテリオファージを利用する。このフォーマットは「ファージディスプレー」と呼ばれる。タンパク質成分は、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質に共有結合する。この結合は、コートタンパク質に融合させたタンパク質成分をコードする核酸の翻訳から生じる。この結合は、柔軟性のあるペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、またはストップコドンの阻害の結果として導入されるアミノ酸を含み得る。ファージディスプレーは、例えばLadner et al.、米国特許第5,223,409号;Smith(1985)Science 228:1315−1317;WO92/18619;WO91/17271;WO92/20791;WO92/15679;WO93/01288;WO92/01047;WO92/09690;WO90/02809;de Haard et al.(1999)J.Biol.Chem 274:18218−30;Hoogenboom et al.(1998)Immunotechnology 4:1−20;Hoogenboom et al.(2000)Immunol Today 2:371−8;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370−1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81−85;Huse et al.(1989)Science 246:1275−1281;Griffiths et al.(1993)EMBO J 12:725−734;Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889−896;Clackson et al.(1991)Nature 352:624−628;Gram et al.(1992)PNAS 89:3576−3580;Garrard et al.(1991)Bio/Technology 9:1373−1377;Rebar et al.(1996)Methods Enzymol. 267:129−49;Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133−4137;およびBarbas et al.(1991)PNAS 88:7978−7982に記載されている。
ファージディスプレーシステムは、繊維状ファージ(ファージf1、fdおよびM13)ならびに他のバクテリオファージ(例えば、T7バクテリオファージおよびラムドイドファージ;例えばSantini(1998)J.Mol.Biol.282:125−135;Rosenberg et al.(1996)Innovations 6:1−6;Houshm et al.(1999)Anal Biochem 268:363−370を参照)について開発された。繊維状ファージディスプレーシステムは、典型的には、遺伝子IIIタンパク質等のマイナーコートタンパク質および遺伝子VIIIタンパク質、メジャーコートタンパク質への融合物を使用するが、遺伝子VIタンパク質、遺伝子VIIタンパク質、遺伝子IXタンパク質またはそのドメイン等、他のコートタンパク質への融合物もまた使用し得る(例えば、WO00/71694を参照)。一実施形態において、この融合は、遺伝子IIIタンパク質のドメイン、例えばアンカードメインまたは「スタンプ」への融合である(例えば、遺伝子IIIタンパク質アンカードメインの説明については、米国特許第5,658,727号を参照)。示されるタンパク質を、非ペプチド結合、例えば非共有結合または非ペプチド共有結合を使用して、コートに物理的に会合させ得る。例えば、ジスルフィド結合および/またはc−fosおよびc−junコイル状コイルを、物理的会合のために使用し得る(例えば、Crameri et al.(1993)Gene 137:69およびWO01/05950を参照)。
タンパク質成分を示すバクテリオファージを生育し得、標準的なファージ調製法、例えば生育培地からのPEG析出を使用して集め得る。個々のディスプレーファージの選択後に、選択されたファージを使用して細胞を感染させることにより、選択されたタンパク質成分をコードする核酸が得られる。個々のコロニーまたはプラークを集め、核酸を単離し、配列決定し得る。
(細胞系ディスプレー)
さらに別のフォーマットにおいて、ライブラリーは細胞ディスプレイライブラリである。タンパク質は、細胞、例えば真核または原核細胞の表面に示される。例示的な原核細胞としては、E.coli細胞、B.subtilis細胞および胞子(例えばLu et al.(1995)Biotechnology 13:366)が挙げられる。例示的な真核細胞としては、酵母(例えば、Saccharomyces cerevisiae、Shizosaccharomyces pombe、HanseulaまたはPichia pastoris)が挙げられる。酵母表面ディスプレーは、例えば、Fabフラグメント等の免疫グロブリンタンパク質を示すために使用し得る酵母ディスプレーシステムならびに重鎖および軽鎖の組合せを生むための交配の使用を記載するBoderおよびWittrup(1997)Nat.Biotechnol.15:553−557およびWO03/029456に記載されている。
さらに別のフォーマットにおいて、ライブラリーは細胞ディスプレイライブラリである。タンパク質は、細胞、例えば真核または原核細胞の表面に示される。例示的な原核細胞としては、E.coli細胞、B.subtilis細胞および胞子(例えばLu et al.(1995)Biotechnology 13:366)が挙げられる。例示的な真核細胞としては、酵母(例えば、Saccharomyces cerevisiae、Shizosaccharomyces pombe、HanseulaまたはPichia pastoris)が挙げられる。酵母表面ディスプレーは、例えば、Fabフラグメント等の免疫グロブリンタンパク質を示すために使用し得る酵母ディスプレーシステムならびに重鎖および軽鎖の組合せを生むための交配の使用を記載するBoderおよびWittrup(1997)Nat.Biotechnol.15:553−557およびWO03/029456に記載されている。
(リボソームディスプレー)
RNAおよびこのRNAによりコードされるポリペプチドは、このRNAを翻訳し、発生期のポリペプチドをなお付着させているリボソームを安定化することによって物理的に会合させ得る。典型的には、高い二価Mg2+濃度および低い温度が使用される。例えば、Mattheakis et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022およびHanes et al.(2000)Nat Biotechnol.18:1287−92;Hanes et al.(2000)Methods Enzymol.328:404−30;およびSchaffitzel et al.(1999)J Immunol Methods.231(1−2):119−35を参照されたい。
RNAおよびこのRNAによりコードされるポリペプチドは、このRNAを翻訳し、発生期のポリペプチドをなお付着させているリボソームを安定化することによって物理的に会合させ得る。典型的には、高い二価Mg2+濃度および低い温度が使用される。例えば、Mattheakis et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022およびHanes et al.(2000)Nat Biotechnol.18:1287−92;Hanes et al.(2000)Methods Enzymol.328:404−30;およびSchaffitzel et al.(1999)J Immunol Methods.231(1−2):119−35を参照されたい。
(ポリペプチド−核酸融合物)
別のフォーマットは、ポリペプチド−核酸融合物を利用する。共有結合させたピュロマイシン基を含むポリペプチド−核酸融合物は、例えばRoberts and Szostak(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12297−12302および米国特許第6,207,446号に記載されるように、mRNAのインビトロ翻訳により生じさせ得る。次いで、mRNAをDNAへと逆転写し、ポリペプチドに架橋させ得る。
別のフォーマットは、ポリペプチド−核酸融合物を利用する。共有結合させたピュロマイシン基を含むポリペプチド−核酸融合物は、例えばRoberts and Szostak(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12297−12302および米国特許第6,207,446号に記載されるように、mRNAのインビトロ翻訳により生じさせ得る。次いで、mRNAをDNAへと逆転写し、ポリペプチドに架橋させ得る。
(他のディスプレーフォーマット)
さらに別のディスプレーフォーマットは、タンパク質成分が、ポリペプチドを同定する非核酸タグに結合した非生物学的ディスプレーである。例えば、このタグは、ポリペプチドを示すビーズに結合させた化学タグまたは高周波タグであり得る(例えば、米国特許第5,874,214号を参照)。
さらに別のディスプレーフォーマットは、タンパク質成分が、ポリペプチドを同定する非核酸タグに結合した非生物学的ディスプレーである。例えば、このタグは、ポリペプチドを示すビーズに結合させた化学タグまたは高周波タグであり得る(例えば、米国特許第5,874,214号を参照)。
ディスプレー技術はまた、結合タンパク質(例えば、標的の特定のエピトープと相互作用する抗体)を得るために使用され得る。これは、例えば、特定のエピトープが欠如するか、またはエピトープ内で(例えばアラニンにより)変異させた競合する非標的分子を使用することにより実施し得る。そのような非標的分子は、ディスプレイライブラリを標的に結合させる際に競合する分子として、または、例えば標的に対して特異的ではないディスプレーライブラリーメンバーを解離させる洗浄溶液中に捕捉するための前溶出剤として、下記のようなネガティブ選択手順に使用し得る。
(反復選択)
一つの好ましい実施形態において、ディスプレイライブラリ技術を反復様式で使用する。第一のディスプレイライブラリを使用して、標的に対する一つ以上の結合タンパク質を同定する。次いで、これらのタンパク質を、例えば変異誘発法を使用して改変し、第二のディスプレイライブラリを形成する。次いで、高親和性結合タンパク質を、例えばさらに高いストリンジェンシーまたはさらに競合的な結合および洗浄条件を使用することにより、第二ライブラリーから選択する。
一つの好ましい実施形態において、ディスプレイライブラリ技術を反復様式で使用する。第一のディスプレイライブラリを使用して、標的に対する一つ以上の結合タンパク質を同定する。次いで、これらのタンパク質を、例えば変異誘発法を使用して改変し、第二のディスプレイライブラリを形成する。次いで、高親和性結合タンパク質を、例えばさらに高いストリンジェンシーまたはさらに競合的な結合および洗浄条件を使用することにより、第二ライブラリーから選択する。
一部の実施において、変異誘発は、公知の領域または結合インターフェースにあると思われる領域を標的とする。例えば、同定された結合タンパク質が抗体である場合、変異誘発を、本明細書中に記載されるように重鎖または軽鎖のCDR領域に向けさせ得る。さらに、変異誘発を、CDRの近くのまたはCDRに隣接するフレームワーク領域、例えば、CDR結合部の特に10、5または3アミノ酸内のフレームワーク領域に向けさせ得る。抗体の場合、変異誘発を、例えば正確な段階的改善のために、1個または2〜3個のCDRに限定することもできる。
一部の例示的な変異誘発技術として、エラープローンPCR(Leung et al.(1989)Technique 1:11−15)、組換え(例えば、USSN 10/279,633を参照)、ランダム切断を使用するDNAシャッフリング(Stemmer(1994)Nature 389−391;「核酸シャッフリング」と呼ばれる)、RACHITT(商標)(Coco et al.(2001)Nature Biotech.19:354)、部位特異的変異誘発(Zoller et al.(1987)Nucl Acids Res 10:6487−6504)、カセット変異誘発(Reidhaar−Olson(1991)Methods Enzymol.208:564−586)および縮重オリゴヌクレオチドの取り込み(Griffiths et al.(1994)EMBO J 13:3245)が挙げられる。
反復選択の一例において、本明細書中に記載される方法を使用して、標的に対する少なくとも最少の結合特異性または最少の活性、例えば1nM、10nMまたは100nMを超える結合の平衡解離定数でTie1に結合する結合タンパク質をディスプレイライブラリからまず同定する。最初に同定された結合タンパク質をコードする核酸配列を、変異の導入のための鋳型核酸として使用し、例えば、最初の結合タンパク質と比較して特性(例えば、結合親和性、反応速度または安定性)を向上させた第二結合タンパク質を同定する。
(オフ−レート選択)
遅い解離速度は、特にポリペプチドとそれらの標的との相互作用に関して高い親和性を
予測し得るので、本明細書中に記載される方法を使用して、標的との結合相互作用に関して所望の(すなわち低下した)動態学的解離速度を有する結合タンパク質を単離し得る。
遅い解離速度は、特にポリペプチドとそれらの標的との相互作用に関して高い親和性を
予測し得るので、本明細書中に記載される方法を使用して、標的との結合相互作用に関して所望の(すなわち低下した)動態学的解離速度を有する結合タンパク質を単離し得る。
解離が遅い結合タンパク質をディスプレイライブラリから選択するために、固定した標的にライブラリーを接触させる。次いで、この固定した標的を、非特異的または弱く結合する生体分子を除去する第一溶液で洗浄する。次いで、固定した標的を、飽和量の遊離標的、すなわち粒子に結合しない標的の複製を含む第二溶液で溶出する。遊離標的は、標的から解離する生体分子に結合する。再結合は、さらに低い濃度の固定した標識に対して飽和量の遊離標的により効果的に妨げられる。
第二溶液は、実質的に生理学的またはストリンジェントである溶液条件を有し得る。典型的には、第二溶液の溶液条件は第一溶液の溶液条件と同一である。第二溶液の分画は、後の分画から先のものを区別するために時間的順序で集められる。後の分画は先の分画中の生体分子よりも標的から遅い速度で解離する生体分子を含む。また、長期のインキュベーション後でさえも標的に結合したままであるディスプレーライブラリーメンバーを回収することも可能である。これらはカオトロピック条件を使用して解離させるか、もしくは標的に結合させながら増幅し得る。例えば、標的に結合したファージを、細菌細胞に接触させ得る。
(特異性のための選択とスクリーニング)
「選択」とは、ディスプレイライブラリの多くのメンバーを標的に接触させ、結合したものを回収、増殖させるプロセスをいう。この選択は、例えば1010メンバーを超える多くのメンバーを有するライブラリーからの選択であり得る。「スクリーニング」とは、単離されたライブラリーメンバーを標的への結合について一つずつ調べるプロセスをいう。自動化により、数千の候補物質を高度な並行プロセスでスクリーニングし得る。本明細書中に記載されるディスプレイライブラリ選択法は、非標的分子に結合するディスプレーライブラリーメンバーを捨てる選択プロセスを含み得る。非標的分子の例として、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリードメインまたはEGFドメインを含む分子の細胞外ドメイン、およびTie1以外(例えば、Tie2)またはTie2以外(例えば、Tie1)またはTie1およびTie2以外のレセプターチロシンキナーゼが挙げられる。一つの実施において、いわゆる「ネガティブ選択」工程を、標的と、関連する非標的分子と、関連するが異なる非標的分子とを区別するために使用される。ディスプレイライブラリまたはそのプールを非標的分子に接触させる。非標的に結合しないサンプルのメンバーを集め、その後の標的分子への結合のための選択か、場合によってはその後のネガティブ選択のためにも使用する。ネガティブ選択工程は、標的分子に結合するライブラリーメンバーの選択前でも選択後でもよい。
「選択」とは、ディスプレイライブラリの多くのメンバーを標的に接触させ、結合したものを回収、増殖させるプロセスをいう。この選択は、例えば1010メンバーを超える多くのメンバーを有するライブラリーからの選択であり得る。「スクリーニング」とは、単離されたライブラリーメンバーを標的への結合について一つずつ調べるプロセスをいう。自動化により、数千の候補物質を高度な並行プロセスでスクリーニングし得る。本明細書中に記載されるディスプレイライブラリ選択法は、非標的分子に結合するディスプレーライブラリーメンバーを捨てる選択プロセスを含み得る。非標的分子の例として、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリードメインまたはEGFドメインを含む分子の細胞外ドメイン、およびTie1以外(例えば、Tie2)またはTie2以外(例えば、Tie1)またはTie1およびTie2以外のレセプターチロシンキナーゼが挙げられる。一つの実施において、いわゆる「ネガティブ選択」工程を、標的と、関連する非標的分子と、関連するが異なる非標的分子とを区別するために使用される。ディスプレイライブラリまたはそのプールを非標的分子に接触させる。非標的に結合しないサンプルのメンバーを集め、その後の標的分子への結合のための選択か、場合によってはその後のネガティブ選択のためにも使用する。ネガティブ選択工程は、標的分子に結合するライブラリーメンバーの選択前でも選択後でもよい。
別の実施において、スクリーニング工程を使用する。ディスプレーライブラリーメンバーを標的分子との結合のために単離した後に、各単離ライブラリーメンバーを、非標識分子(例えば、上記の非標的)との結合能力について調べる。例えば、高スループットELISAスクリーニングを、このデータを得るために使用し得る。また、ELISAスクリーニングを、標的に対する各ライブラリーメンバーの結合に関する定量的なデータを得るために使用し得る。非標的結合データおよび標的結合データを比較して(例えば、コンピュータおよびソフトウエアを使用して)、Tie1、Tie2、Ang、そのフラグメント、または1つ以上のそのような成分を含む複合体に特異的に結合するライブラリーメンバーを同定する。
本明細書中に記載されるディスプレイライブラリの選択およびスクリーニング法は、標的分子上の特定の部位に結合するディスプレーライブラリーメンバーについての選択または選択するスクリーニングプロセスを含み得る。例えば、高濃度の本明細書中に記載される抗体による溶出を使用して、溶出に使用された抗体が結合するエピトープに近いか、またはそれにオーバーラップするエピトープに結合するファージを選択し得る。したがって、緩衝液中にE3抗体の使用の有無に関わらずELISAを実施することにより、Tie1のE3結合部位に結合するファージがスクリーニングし得る。
以下の記載は、ファージミドFabライブラリーを使用して、Tie1に結合する抗体を同定する一つの例示的方法を提供する。例えば、三回の選択を、標的タンパク質の減少量(例えば、一回目、二回目および三回目でそれぞれ100μg、50μgおよび50μg)を用いて実施し得る。標的はストレプトアビジン被覆磁気ビーズ(Dynal)に固定化する。ライブラリーを、各回の選択前のストレプトアビジン被覆磁気ビーズに対して、および必要に応じて共通の精製ハンドルを含み得る無関係のタンパク質に対して除去(deplete)する。例えば、標的がFcドメインとの融合物として生成される場合、ライブラリーを可溶性Trail−Fc(市販のFc融合タンパク質)に対して除去し得る。この除去プロセスはFcバインダーを除去する。
各回の選択は、例えば、2サイクルのストレプトアビジン磁気ビーズ除去、1サイクルのファージのTie1被覆ビーズへの結合、10サイクルの洗浄、結合ファージの溶出、および次回のために濃縮したファージの増殖を含み得る。10回の洗浄後、Tie1被覆ビーズに結合したファージを直接的に増幅し得るか、または増幅前に溶出し得る。三回の選択後、個々のクローンを96ウエルマイクロタイタープレートで生育させ、ファージELISAによりTie1結合活性について個々にスクリーニングし得る。ELISAは、Tie1、特異性コントロールおよび関連のないコントロールへの結合の評価を含み得る。単離物を、選択プロセスから生じる多様性を決定するためにDNAフィンガープリンティングし得る。例えばポジティブ単離物は、オリゴヌクレオチドプライマーM13リバースおよび遺伝子IIIフォワードによりPCR増幅され得る(例えば、Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581を参照)。生成物は、BstNIフィンガープリンティングにより分析し得る。
結合タンパク質を示すファージによるELISAを実施する例示的な方法は、以下のとおりである。個々のクローンを生育させ、既に記載されるように(Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581)回収し得る。ELISAのために、96ウェルImmulon 2HBプレート(Thermo Labsystems)をPBS中ImmunoPure(商標)ストレプトアビジン(Pierce)1μg/ウェルで被覆し、4℃で一晩インキュベートする。PBSで3回洗浄後、100μLのビオチニル化Tie1タンパク質を固定化ストレプトアビジンと室温で30〜60分間結合させる。次いで、Tie1被覆ウェルを300μLの2%乳/1×PBS/0.05%Tween(2%MPBST)で、37℃にて2時間、ブロックする。これらのウェルを、2%MPBSTで室温にて一時間ブロックしておいた100μLのファージ培養上清とともにインキュベートする。ウェルを1×PBS/Tween0.1%(PBST)で5回洗浄し、抗M13−HRP第二抗体の1:5,000希釈物100μLとともに、室温にて1時間、インキュベートする。これらのウェルを、TMB溶液による展開前にPBSTで5回洗浄し、630nmで読む。
細胞ELISAのために、細胞をPBSで一回洗浄し、PBSの1×106〜2×106細胞/mLの濃度で再懸濁させる。96ウェル組織培養プレート(Falcon,VWR)の1ウェルあたり1〜2×105細胞の最終濃度を使用し得る。これらの細胞を、等量の0.2%グルタルアルデヒド(Sigma−Aldrich)を加え、37℃で12分間インキュベートすることにより固定する。次いで、自動プレート洗浄器(Bio−Tek Instruments,Inc.)を使用して、それらをPBSで三回洗浄し、200μLの2%MPBSTで室温にて一時間ブロックする。このELISAの残りの手順を、1×PBS/Tween0.05%を洗浄およびインキュベーションに使用する以外は上記のように実施し得る。
(生殖細胞系抗体)
抗体の可変領域を一つ以上の生殖細胞系配列にさらに類似させるために、Tie1、Tie2、またはAngに結合する抗体(例えば、本明細書中に記載される抗体)を改変し得る。例えば、抗体は、一つ、二つ、三つまたはそれ以上のアミノ酸置換を、例えばフレームワークまたはCDR領域に含み得、それを参照生殖細胞系配列にさらに類似させ得る。一つの例示的な生殖細胞系列化方法は;単離された抗体の配列に類似する(例えば、特定のデータベースで最も類似する)一つ以上の生殖細胞系配列を同定する工程を包含し得る。次いで、(アミノ酸レベルでの)変異を、付加的に、組み合わせて、またはその両方で単離された抗体中に引き起こし得る。例えば、いくつかまたはすべての可能な生殖細胞系変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーを作る。次いで、変異抗体を評価して、例えば、単離抗体に対して一つ以上のさらなる生殖細胞系残基を有し、かつなお有用である(例えば、機能的な活性を有する)抗体を同定する。一実施形態において、できるだけ多くの生殖細胞系残基を単離抗体に導入する。
抗体の可変領域を一つ以上の生殖細胞系配列にさらに類似させるために、Tie1、Tie2、またはAngに結合する抗体(例えば、本明細書中に記載される抗体)を改変し得る。例えば、抗体は、一つ、二つ、三つまたはそれ以上のアミノ酸置換を、例えばフレームワークまたはCDR領域に含み得、それを参照生殖細胞系配列にさらに類似させ得る。一つの例示的な生殖細胞系列化方法は;単離された抗体の配列に類似する(例えば、特定のデータベースで最も類似する)一つ以上の生殖細胞系配列を同定する工程を包含し得る。次いで、(アミノ酸レベルでの)変異を、付加的に、組み合わせて、またはその両方で単離された抗体中に引き起こし得る。例えば、いくつかまたはすべての可能な生殖細胞系変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーを作る。次いで、変異抗体を評価して、例えば、単離抗体に対して一つ以上のさらなる生殖細胞系残基を有し、かつなお有用である(例えば、機能的な活性を有する)抗体を同定する。一実施形態において、できるだけ多くの生殖細胞系残基を単離抗体に導入する。
一実施形態において、変異誘発を使用して、一つ以上の生殖細胞系残基を置換するかまたはCDR領域に挿入する。例えば、生殖細胞系CDR残基は、改変される可変領域に対して類似(例えば、最も類似)する生殖細胞系配列からのものであり得る。変異誘発後、抗体の活性(例えば、結合または他の機能的な活性)を評価して、生殖細胞系残基(単数または複数)が許容されるかどうかを決定し得る。類似の変異誘発をフレームワーク領域内で実施し得る。
生殖細胞系配列の選択は異なる方法で実施し得る。例えば、生殖細胞系配列が、選択性または類似性についての所定の基準、例えば、少なくともある程度の割合の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または99.5%の同一性を満たす場合、この生殖細胞系配列を選択し得る。選択は、少なくとも2、3、5または10の生殖細胞系配列を使用して実施し得る。CDR1およびCDR2の場合、類似の生殖細胞系配列の同定は、そのような一つの配列を選択することを含み得る。CDR3の場合、類似の生殖細胞系配列の同定は、そのような一つの配列を選択することを含み得るが、アミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に別個に寄与する二つの生殖細胞系配列の使用を含み得る。他の実施において、二つまたは三つ以上の生殖細胞系配列を、例えば共通配列を形成するために使用する。
一実施形態において、特定の参照可変ドメイン配列、例えば本明細書中に記載される配列に関して、関連可変ドメイン配列が、参照CDR配列中の残基(ヒト生殖細胞系配列(すなわち、ヒト生殖細胞系核酸によりコードされるアミノ酸配列)で対応する位置の残基と同一である残基)と同一でないCDRアミノ酸位置の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%を有する。
一実施形態において、特定の参照可変ドメイン配列、例えば本明細書中に記載される配列に関して、関連可変ドメイン配列が、ヒト生殖細胞系配列、例えば、参照可変ドメイン配列に関連した生殖細胞系配列からのFR配列に同一であるFR領域の少なくとも30%、50%、60%、70%、80%、90%または100%を有する。
したがって、感心の所与の抗体に類似の活性を有するが、一つ以上の生殖細胞系配列、特に一つ以上のヒト生殖細胞系配列にさらに類似する抗体を単離し得る。例えば、抗体はCDR(例えばフレームワーク領域)以外の領域中の生殖細胞系配列に少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%同一であり得る。さらに、抗体は、改変される可変領域に類似する(例えば、最も類似する)生殖細胞系配列からの生殖細胞系残基である、CDR領域中の少なくとも1個、2個、3個、4個または5個の生殖細胞系残基を含み得る。主要な関心の生殖細胞系配列はヒト生殖細胞系配列である。抗体の活性(例えば、結合活性)は元の抗体のファクター、すなわち100、10、5、2、0.5、0.1および0.001の範囲内であり得る。
Vカッパの例示的生殖細胞系参照配列として、O12/O2、O18/O8、A20、A30、L14、L1、L15、L4/18a、L5/L19、L8、L23、L9、L24、L11、L12、O11/O1、A17、A1、A18、A2、A19/A3、A23、A27、A11、L2/L16、L6、L20、L25、B3、B2、A26/A10およびA14が挙げられる。例えばTomlinson et al.(1995)EMBO J.14(18):4628−3を参照されたい。
HC可変ドメインについての生殖細胞系参照配列は、特定の標準構造、例えば、H1およびH2超可変ループ中の1〜3構造物を有する配列に基づき得る。免疫グロブリン可変ドメインの超可変ループの標準構造を、Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227:799−817;Tomlinson et al.(1992)J.Mol.Biol.227:776−798);およびTomlinson et al.(1995)EMBO J.14(18):4628−38に記載のようにその配列から推測し得る。1〜3構造を有する例示的配列として:DP−1、DP−8、DP−12、DP−2、DP−25、DP−15、DP−7、DP−4、DP−31、DP−32、DP−33、DP−35、DP−40、7−2、hv3005、hv3005f3、DP−46、DP−47、DP−58、DP−49、DP−50、DP−51、DP−53およびDP−54が挙げられる。
(多様性)
ディスプレイライブラリおよび他のライブラリーは、示されたポリペプチドの一つ以上の位置で変異を含む。所与の位置での変異は合成または天然のものであり得る。一部ライブラリーには、合成および天然の多様性の両方が含まれる。
ディスプレイライブラリおよび他のライブラリーは、示されたポリペプチドの一つ以上の位置で変異を含む。所与の位置での変異は合成または天然のものであり得る。一部ライブラリーには、合成および天然の多様性の両方が含まれる。
(合成的多様性)
ライブラリーは、人工的に合成された配列を起源とする多様な核酸配列の領域を含み得る。典型的には、これらは、各所与の位置でのヌクレオチドの分布を含む縮重オリゴヌクレオチドの集団から形成される。所与の配列の包含は分布に関してランダムである。合成的多様性を生む縮重の一例は、NNN(ここで、Nは等しい比率の4ヌクレオチドのいずれかである)を含むオリゴヌクレオチドである。
ライブラリーは、人工的に合成された配列を起源とする多様な核酸配列の領域を含み得る。典型的には、これらは、各所与の位置でのヌクレオチドの分布を含む縮重オリゴヌクレオチドの集団から形成される。所与の配列の包含は分布に関してランダムである。合成的多様性を生む縮重の一例は、NNN(ここで、Nは等しい比率の4ヌクレオチドのいずれかである)を含むオリゴヌクレオチドである。
合成的多様性は、例えば、所与のトリヌクレオチドでの核酸配列のコドンの数をNNNよりも小さい分布に限定するようにさらに阻害し得る。例えば、そのような分布は、コドンの幾つかの位置の4個未満のヌクレオチドを使用して構築し得る。さらに、トリヌクレオチド付加技術を使用して、分布をさらに阻害し得る。いわゆる「トリヌクレオチド付加技術」は、例えば、Wells et al.(1985)Gene 34:315−323、US4,760,025およびUS5,869,644に記載される。
(天然の多様性)
ライブラリーは、異なる天然配列を起源とする(またはそれに基づいて合成された)多様な核酸配列の領域を含み得る。ディスプレイライブラリに含み得る天然の多様性の例は、免疫細胞に存在する配列の多様性である(下記も参照)。核酸はこれらの免疫細胞から調製され、ポリペプチドディスプレーのフォーマットに取り入れられる。
ライブラリーは、異なる天然配列を起源とする(またはそれに基づいて合成された)多様な核酸配列の領域を含み得る。ディスプレイライブラリに含み得る天然の多様性の例は、免疫細胞に存在する配列の多様性である(下記も参照)。核酸はこれらの免疫細胞から調製され、ポリペプチドディスプレーのフォーマットに取り入れられる。
(抗体ディスプレイライブラリ)
一実施形態において、ディスプレイライブラリはタンパク質の多様なプールを表わし、各々のタンパク質は、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン可変ドメインを含む。ディスプレイライブラリは、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化」抗体を同定するのに特に有用である。そのような抗体を、内皮関連障害、例えば、転移性癌等のヒト障害を処置する治療法として使用し得る。抗体の定常領域とフレームワーク領域はヒトのものであるために、これらの治療抗体は抗原として認識され、標的とされることを自ら避け得る。また、定常領域はヒト免疫系のエフェクター機能を補充するために最適化される。インビトロのディスプレー選択プロセスは、正常なヒト免疫系が自己抗原に対する抗体を生成することができないことを克服する。
一実施形態において、ディスプレイライブラリはタンパク質の多様なプールを表わし、各々のタンパク質は、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン可変ドメインを含む。ディスプレイライブラリは、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化」抗体を同定するのに特に有用である。そのような抗体を、内皮関連障害、例えば、転移性癌等のヒト障害を処置する治療法として使用し得る。抗体の定常領域とフレームワーク領域はヒトのものであるために、これらの治療抗体は抗原として認識され、標的とされることを自ら避け得る。また、定常領域はヒト免疫系のエフェクター機能を補充するために最適化される。インビトロのディスプレー選択プロセスは、正常なヒト免疫系が自己抗原に対する抗体を生成することができないことを克服する。
典型的な抗体ディスプレイライブラリは、VHドメインおよびVLドメインを含むポリペプチドを示す。「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインをいう。免疫グロブリンドメインは典型的には約7つのβストランドから構成される二つのβシートおよび、保存されたジスルフィド結合を含む(例えば、A.F. Williams and A.N.Barclay 1988 Ann.Rev Immunol.6:381−405を参照)。免疫グロブリン可変領域の超可変ループの標準構造は、Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227:799−817;Tomlinson et al.(1992)J.Mol.Biol.227:776−798);およびTomlinson et al.(1995)EMBO J.14(18):4628−38に記載のように、その配列から推測し得る。ディスプレイライブラリは、抗体をFabフラグメント(例えば、二つのポリペプチド鎖を使用するもの)または単鎖Fv(例えば、単一のポリペプチド鎖を使用するもの)として示し得る。他のフォーマットも使用し得る。
Fabおよび他のフォーマットの場合のように、示された抗体は、軽鎖または重鎖の一部として定常領域を含み得る。一実施形態において、各鎖は、例えばFabの場合のように、一つの定常領域を含む。他の実施形態において、さらなる定常領域が示される。
抗体ライブラリーを多くのプロセスにより構築し得る(例えば、de Haard et al.(1999)J.Biol.Chem 274:18218−30;Hoogenboom et al.(1998)Immunotechnology 4:1−20およびHoogenboom et al.(2000)Immunol Today 21:371−8を参照)。さらに、各プロセスの要素は、他のプロセスの要素と組み合わせ得る。変異が単一の免疫グロブリンドメイン(例えば、VHまたはVL)または複数の免疫グロブリンドメイン(例えば、VHおよびVL)中に導入されるように、これらのプロセスを使用し得る。変異は、例えば、重鎖および軽鎖可変ドメインのいずれかまたは両方のそのような領域に言及するCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3およびFR4の一つ以上の領域において、免疫グロブリン可変ドメイン中に導入し得る。一実施形態において、変異を所与の可変ドメインのすべての三つのCDR中に導入する。別の好ましい実施形態において、変異を例えば重鎖可変ドメインのCDR1およびCDR2に導入する。いずれの組合せも可能である。
一つのプロセスにおいて、抗体ライブラリーは、CDRをコードする多様なオリゴヌクレオチドを、核酸の対応するドメインに挿入することにより構築される。オリゴヌクレオチドはモノマーヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを使用して合成し得る。例えば、Knappik et al.(2000)J.Mol.Biol.296:57−86は、トリヌクレオチド合成およびオリゴヌクレオチドを受容するために設計された制限部位を用いた鋳型を使用してオリゴヌクレオチドをコードするCDRを構築するための方法を記載している。
別のプロセスにおいて、動物、例えば、非ヒト動物(例えば、げっ歯類)をTie1で免疫する。動物は、必要に応じて、抗原で追加免疫して、応答をさらに刺激する。次いで、脾臓細胞を動物から単離し、VHおよび/またはVLドメインをコードする核酸を増幅し、ディスプレイライブラリでの発現のためにクローニングする。非ヒト動物は一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列を含み得る。例えば、動物は完全なヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み得る。また、動物は不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子座を有し得る。
さらに別のプロセスにおいて、抗体ライブラリーは、単純な(naive)生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子(例えば、ヒト遺伝子)から増幅された核酸から構築される。この増幅された核酸はVHおよび/またはVLドメインをコードする核酸を含む。免疫グロブリンをコードする核酸の供給源を以下に記載する。増幅は、例えば保存定常領域にアニールするプライマーを用いるPCR、または別の増幅方法を含み得る。
免疫グロブリンドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸は、例えばヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダまたはげっ歯類の免疫細胞から得られる。一例において、細胞は特定の性質について選択される。成熟の多様な段階のB細胞を選択し得る。別の例において、B細胞はナイーブである。
一実施形態において、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、表面結合IgM、IgDまたはIgG分子を発現するB細胞を選別する。さらに、IgGの異なるアイソタイプを発現するB細胞を単離し得る。別の好ましい実施形態において、B細胞またはT細胞をインビトロで培養する。これらの細胞を、例えばフィーダー細胞とともに培養するか、またはマイトジェンもしくは他の調節剤(例えばCD40に対する抗体、CD40リガンドまたはCD20、酢酸ミリスチン酸ホルボール、細菌性脂質多糖体、コンカナバリンA、フィトヘマグルチニンまたはアメリカヤマゴボウマイトジェン)を加えることによりインビトロで刺激し得る。
さらに別の実施形態において、細胞を、免疫障害(例えば、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、脈管炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症または抗リン脂質症候群)を有する被験体から単離する。被験体はヒトまたは動物、例えばヒト疾患用の動物モデルまたは類似の障害を有する動物であり得る。さらに別の実施形態において、細胞を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物から単離する。
一つの好ましい実施形態において、細胞は体細胞超変異のプログラムを活性化している。例えば、抗免疫グロブリン、抗CD40および抗CD38抗体による処理によって、細胞を免疫グロブリン遺伝子の体細胞変異誘発を受けるように刺激し得る(例えば、Bergthorsdottir et al.(2001)J Immunol.166:2228を参照)。別の実施形態において、細胞はナイーブである。
免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を、下記の例示的な方法により天然のレパートリーより単離し得る。最初に、RNAを免疫細胞から単離する。全長(すなわち、キャップされた)mRNAを(例えば、キャップされていないRNAをウシ小腸ホスファターゼにより脱リン酸化することにより)分離する。次いで、キャップをタバコ酸性ピロホスファターゼで除去し、逆転写を使用してcDNAを生成する。
第一(アンチセンス)鎖の逆転写を、任意の適切なプライマーを用いる任意の方法により実施し得る。例えば、de Haard et al.(1999)J.Biol.Chem 274:18218−30を参照されたい。プライマー結合領域は、例えば異なるアイソタイプの免疫グロブリンを逆転写するために、異なる免疫グロブリン間で一定であり得る。プライマー結合領域はまた、特定のアイソタイプの免疫グロブリンに特異的であり得る。典型的には、プライマーは少なくとも一つのCDRをコードする配列に対して3’である領域に特異的である。別の実施形態において、ポリ−dTプライマーが使用され得る(そして重鎖遺伝子にとって好ましくあり得る)。
合成配列を逆転写鎖の3’末端に連結し得る。合成配列を、逆転写後のPCR増幅中のフォワードプライマー結合のプライマー結合部位として使用し得る。合成配列の使用は、利用可能な多様性を完全に捕捉する異なるフォワードプライマーのプールを使用する必要性を回避し得る。
次いで、例えば、一回以上の回数で、可変ドメインをコードする遺伝子を増幅する。複数の回数を用いる場合、ネステドプライマーを、高められた正確性のために使用し得る。次いで、この増幅した核酸を、ディスプレーライブラリーベクターにクローニングする。
核酸配列を増幅する任意の方法を、増幅のために使用し得る。多様性を最大化し、多様性を偏らせない方法が好ましい。多様な技術を、核酸増幅のために使用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR;米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,202号、Saiki,et al.(1985)Science 230,1350−1354)は、核酸合成の一巡を駆動する多様な温度のサイクルを利用する。転写に基づく方法は、RNAポリメラーゼによりRNA合成を利用して核酸を増幅する(米国特許第6,066,457号、米国特許第6,132,997号、米国特許第5,716,785号、Sarkar et al.,Science(1989)244:331−34;Stofler et al.,Science(1988)239:491)。NASBA(米国特許第5,130,238号、米国特許第5,409,818号および米国特許第5,554,517号)は転写、逆転写、およびRNASEHに基づく分解のサイクルを利用してDNAサンプルを増幅する。さらに他の増幅方法は、ローリングサークル増幅(RCA;米国特許第5,854,033号および米国特許第6,143,495号)および鎖置換増幅(SDA;米国特許第5,455,166号および米国特許第5,624,825号)を含む。
(第二スクリーニング法)
標的に結合する候補ディスプレーライブラリーメンバーの選択後、各候補ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば標的に対するその結合性をさらに特性付けるためにさらに分析し得る。同様に、他の方法により得られる候補結合タンパク質(例えば免疫化等による)も分析し得る。各候補結合タンパク質は、一種類以上の第二スクリーニングアッセイに供し得る。アッセイは、結合的性質、触媒的性質、生理学的性質(例えば、細胞毒性、腎臓クリアランス、免疫原性)、構造的性質(例えば、安定性、立体配座、オリゴマー化状態)または別の機能的性質に関するものであり得る。同じアッセイは繰返して使用され得るが、例えばpH、イオンまたは熱感受性を決定するために異なる条件で使用され得る。
標的に結合する候補ディスプレーライブラリーメンバーの選択後、各候補ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば標的に対するその結合性をさらに特性付けるためにさらに分析し得る。同様に、他の方法により得られる候補結合タンパク質(例えば免疫化等による)も分析し得る。各候補結合タンパク質は、一種類以上の第二スクリーニングアッセイに供し得る。アッセイは、結合的性質、触媒的性質、生理学的性質(例えば、細胞毒性、腎臓クリアランス、免疫原性)、構造的性質(例えば、安定性、立体配座、オリゴマー化状態)または別の機能的性質に関するものであり得る。同じアッセイは繰返して使用され得るが、例えばpH、イオンまたは熱感受性を決定するために異なる条件で使用され得る。
適切であれば、アッセイは、ディスプレーライブラリーメンバーを直接に使用するか、あるいは示されたポリペプチドをコードする核酸から生成された組換えポリペプチド、または示されたポリペプチドの配列に基づいて合成された合成ペプチドを使用し得る。結合的性質ための例示的なアッセイは、以下を含む。
(ELISA)
ディスプレイライブラリによりコードされるタンパク質を、結合的性質に関してELISAアッセイを使用してスクリーニングすることもできる。例えば、各タンパク質を、底表面が標的(例えば、限定量の標的)で被覆されたマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄して非特異的結合のポリペプチドを除去する。次いで、プレートに結合したタンパク質の量を、ポリペプチド(例えば、ポリペプチドのタグまたは定常部)を認識し得る抗体を用いてプレートを調べることにより決定する。抗体は、適切な基質が提供される場合に発色生成物を生成するアルカリホスファターゼ等の酵素に結合させる。タンパク質を、細胞から精製し得、または例えば繊維状バクテリオファージコートとの融合物としてディスプレーライブラリーフォーマットでアッセイし得る。あるいは、標的分子(例えば、Tie1、Tie2またはAng)を発現する細胞(例えば生存するものまたは固定されたもの)を、マイクロタイタープレート中にプレートし、ディスプレイライブラリに存在するか、選択によりディスプレイライブラリから得られたペプチド/抗体の親和性を調べるために使用し得る。
ディスプレイライブラリによりコードされるタンパク質を、結合的性質に関してELISAアッセイを使用してスクリーニングすることもできる。例えば、各タンパク質を、底表面が標的(例えば、限定量の標的)で被覆されたマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄して非特異的結合のポリペプチドを除去する。次いで、プレートに結合したタンパク質の量を、ポリペプチド(例えば、ポリペプチドのタグまたは定常部)を認識し得る抗体を用いてプレートを調べることにより決定する。抗体は、適切な基質が提供される場合に発色生成物を生成するアルカリホスファターゼ等の酵素に結合させる。タンパク質を、細胞から精製し得、または例えば繊維状バクテリオファージコートとの融合物としてディスプレーライブラリーフォーマットでアッセイし得る。あるいは、標的分子(例えば、Tie1、Tie2またはAng)を発現する細胞(例えば生存するものまたは固定されたもの)を、マイクロタイタープレート中にプレートし、ディスプレイライブラリに存在するか、選択によりディスプレイライブラリから得られたペプチド/抗体の親和性を調べるために使用し得る。
(細胞結合アッセイ)
結合タンパク質(例えば、Tie1、Tie2またはAng結合タンパク質)を、一つ以上の細胞タイプ、例えば内皮細胞または血小板と相互作用する能力について評価し得る。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、タンパク質と細胞との相互作用を調べる一つの例示的な方法である。この結合タンパク質を、細胞への結合前またはその後に蛍光体により直接または間接的に標識し、次いで細胞をFACS選別機でカウントする。
結合タンパク質(例えば、Tie1、Tie2またはAng結合タンパク質)を、一つ以上の細胞タイプ、例えば内皮細胞または血小板と相互作用する能力について評価し得る。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、タンパク質と細胞との相互作用を調べる一つの例示的な方法である。この結合タンパク質を、細胞への結合前またはその後に蛍光体により直接または間接的に標識し、次いで細胞をFACS選別機でカウントする。
例えば、下記の方法を使用して、Tie1結合タンパク質が血小板または他の細胞タイプと相互作用するかどうか評価し得る。
血小板の単離。ヒト血液は、説明を受けて同意した健康なボランティアから得られる。例えば、静脈血を1/6容量のACD(100mlのdH2O中の2.5gのクエン酸ナトリウム、1.5gのクエン酸および2.5gのグルコース)に集める。血液を、800×gで室温にて15分間遠心分離機で分離し、血小板に富む血漿を取り出し、37℃にて60分間、1mMアセチルサリチル酸の存在下にインキュベートした後に、1000×gで室温にて10分間、遠心分離機で分離する。血小板のペレットを、HEPES緩衝Tyrode溶液(137mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl2、3mM NaH2PO4、5mMグルコース、10mM HEPES、pH7.4、0.2%ウシ血清アルブミンおよび0.05U/mLアピラーゼ)で、2×108細胞/mlの密度で再懸濁し得る。例えば、Kornecki et al.(1990)J Biol Chem.265:10,042−10,048およびNaik et al.(1995)Biochem J.310:155−162)も参照されたい。
FACS。例えば、血小板のFACS分析に関し、細胞を、0.1%BSA/PBS(4×105細胞/サンプル)中、PGE1(1mg/mL)の存在下に再懸濁し、候補Tie1結合タンパク質(例えば、約5μg/mL)またはコントロールとともにインキュベートし得る。22℃での1時間のインキュベーション後に、細胞を、0.1%BSA/PBSで洗浄し、50μLの1/100希釈FITC標識二次抗体で処理し、30分間氷上でインキュベートし、洗浄し、0.1%BSA/PBSに再懸濁する。サンプルをイムノサイトメトリーシステムズフローサイトメーター(FACSORT(商標),Becton Dickinson,San Jose,CA)を使用して分析する。例えば、Malgorzata et al.(2000)Blood,Vol.95 No.8(4月15日)pp.2600〜2609も参照されたい。
さらに、単離血小板からのSDS−page分離タンパク質のウェスタン分析、および免疫沈降により血小板を評価し得る。さらに他の方法は、Ti1結合タンパク質が結合している(例えば被覆している)表面に細胞を結合する工程を包含する。
他の細胞タイプは当該技術分野で公知の方法により、FACSのために調製し得る。
(均一結合アッセイ)
候補ポリペプチドの標的との結合性相互作用を、均一アッセイを使用して分析し得る(すなわちアッセイのすべての成分を加えた後、さらなる液体操作を必要としない)。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を均一アッセイとして使用し得る(例えば、Lakowiczら、米国特許第5,631,169号;Stavrianopoulosら、米国特許第4,868,103号を参照)。第一分子(例えば、分画中に同定された分子)上の蛍光体標識を、その放出される蛍光エネルギーが、第二分子(例えば標識)が第一分子に接近している場合に第二分子上の蛍光標識により吸収され得るように選択する。第二分子上の蛍光標識は、それが転移エネルギーを吸収する際に蛍光を発する。標識間のエネルギー転移の効率は、それらの分子を分ける距離に関連するので、それら分子間の空間的関係を評価し得る。結合が分子間に起こる状況において、アッセイでの「レセプター」分子標識の蛍光発光を最大とすべきである。FRETによるモニタリングに適するように構成される結合事象は、当該技術分野で周知の標準的な蛍光検出手段により(例えば、蛍光光度計を使用して)、好都合に測定し得る。第一または第二の結合分子の量を滴定することにより、結合曲線を生成して平衡結合定数を推測し得る。
候補ポリペプチドの標的との結合性相互作用を、均一アッセイを使用して分析し得る(すなわちアッセイのすべての成分を加えた後、さらなる液体操作を必要としない)。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を均一アッセイとして使用し得る(例えば、Lakowiczら、米国特許第5,631,169号;Stavrianopoulosら、米国特許第4,868,103号を参照)。第一分子(例えば、分画中に同定された分子)上の蛍光体標識を、その放出される蛍光エネルギーが、第二分子(例えば標識)が第一分子に接近している場合に第二分子上の蛍光標識により吸収され得るように選択する。第二分子上の蛍光標識は、それが転移エネルギーを吸収する際に蛍光を発する。標識間のエネルギー転移の効率は、それらの分子を分ける距離に関連するので、それら分子間の空間的関係を評価し得る。結合が分子間に起こる状況において、アッセイでの「レセプター」分子標識の蛍光発光を最大とすべきである。FRETによるモニタリングに適するように構成される結合事象は、当該技術分野で周知の標準的な蛍光検出手段により(例えば、蛍光光度計を使用して)、好都合に測定し得る。第一または第二の結合分子の量を滴定することにより、結合曲線を生成して平衡結合定数を推測し得る。
(表面プラズモン共鳴(SPR))
ディスプレイライブラリから単離された分子と標的との結合相互作用を、SPRを私用して分析し得る。SPRまたは生体分子相互作用解析(BIA)は、いずれの相互作用物質を標識することなしにリアルタイムで生物特異的相互作用を検出する。BIAチップの結合表面における質量変化(結合事象を示す)は、表面に近い光の屈折率の変化をもたらす(表面プラズモン共鳴(SPR)の光学的現象)。屈折度の変化は、生体分子間のリアルタイム反応を示すものとして測定される検出可能なシグナルを生じる。SPRを使用する方法は、例えば、米国特許第5,641,640号;Raether(1988)Surface Plasmons Springer Verlag;Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338−2345;Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699−705およびBLAcore International AB(Uppsala,Sweden)により提供されるオンラインリソース)に記載されている。
ディスプレイライブラリから単離された分子と標的との結合相互作用を、SPRを私用して分析し得る。SPRまたは生体分子相互作用解析(BIA)は、いずれの相互作用物質を標識することなしにリアルタイムで生物特異的相互作用を検出する。BIAチップの結合表面における質量変化(結合事象を示す)は、表面に近い光の屈折率の変化をもたらす(表面プラズモン共鳴(SPR)の光学的現象)。屈折度の変化は、生体分子間のリアルタイム反応を示すものとして測定される検出可能なシグナルを生じる。SPRを使用する方法は、例えば、米国特許第5,641,640号;Raether(1988)Surface Plasmons Springer Verlag;Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338−2345;Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699−705およびBLAcore International AB(Uppsala,Sweden)により提供されるオンラインリソース)に記載されている。
SPRからの情報を使用して、平衡解離定数(Kd)、および生体分子の標的への結合に関するKonとKoff等の動態学的パラメーターの正確で定量的な測定を提供し得る。そのようなデータを、異なる生体分子を比較するために使用し得る。例えば、異なるタンパク質を比較して、標的に対する高い親和性を有するか個体、または遅いKoffを有する個体を同定し得る。この情報を、構造/活性の関係(SAR)を進展させるためにも使用し得る。例えば、親タンパク質の成熟したものの動態学的パラメーターおよび平衡結合パラメーターを親タンパク質のパラメーターと比較し得る。特定の結合パラメーター、例えば高い親和性および遅いKoffに関係する所与の位置の変異アミノ酸を同定し得る。この情報は、構造的モデル化(例えば、ホモロジーモデリング、エネルギー最少化、または結晶構造解析もしくはNMRによる構造決定を使用する)と組み合わせ得る。その結果、タンパク質とその標的との物理的相互作用の理解を公式化し、他の設計プロセスを案内するために使用し得る。
(タンパク質アレイ)
ディスプレイライブラリから同定されたタンパク質を、固体支持体(例えばビーズまたはアレイ)に固定化し得る。タンパク質アレイのために、各ポリペプチドを支持体上の独自のアドレスに固定化する。典型的には、アドレスは二次元アドレスである。タンパク質アレイを以下に説明する(例えば、診断を参照)。タンパク質アレイを使用して、任意の複数のタンパク質を、例えばTie1、Tie2またはAngとの相互作用に関して評価することも可能である。
ディスプレイライブラリから同定されたタンパク質を、固体支持体(例えばビーズまたはアレイ)に固定化し得る。タンパク質アレイのために、各ポリペプチドを支持体上の独自のアドレスに固定化する。典型的には、アドレスは二次元アドレスである。タンパク質アレイを以下に説明する(例えば、診断を参照)。タンパク質アレイを使用して、任意の複数のタンパク質を、例えばTie1、Tie2またはAngとの相互作用に関して評価することも可能である。
(細胞アッセイ)
ライブラリーを宿主細胞に形質転換することにより、候補タンパク質をライブラリーから選択し得る;ライブラリーは、ディスプレイライブラリから事前に同定し得る。例えば、ライブラリーは、ポリペプチドをコードし、かつ発現を(例えばタンパク質が細胞内に産生され、細胞から分泌され、または細胞表面に結合するように)方向付けるセグメントを含むベクター核酸配列を含み得る。これらの細胞を、Tie1、Tie2またはAngと結合する(例えば、細胞の表現型または細胞媒介活性の変化により検出されるような)タンパク質に関してスクリーニングまたは選択し得る。例えば、Tie1に結合する抗体の場合、その活性は自己リン酸化、PI3キナーゼの活性化、AKTの活性化、または内皮細胞活性の変化(例えば、増殖)であり得る。
ライブラリーを宿主細胞に形質転換することにより、候補タンパク質をライブラリーから選択し得る;ライブラリーは、ディスプレイライブラリから事前に同定し得る。例えば、ライブラリーは、ポリペプチドをコードし、かつ発現を(例えばタンパク質が細胞内に産生され、細胞から分泌され、または細胞表面に結合するように)方向付けるセグメントを含むベクター核酸配列を含み得る。これらの細胞を、Tie1、Tie2またはAngと結合する(例えば、細胞の表現型または細胞媒介活性の変化により検出されるような)タンパク質に関してスクリーニングまたは選択し得る。例えば、Tie1に結合する抗体の場合、その活性は自己リン酸化、PI3キナーゼの活性化、AKTの活性化、または内皮細胞活性の変化(例えば、増殖)であり得る。
別の実施形態において、細胞のライブラリーは、細胞アレイの形を有する。細胞アレイは、任意の適切な検出可能活性に関して同様にスクリーニングし得る。他の実施形態において、競合結合アッセイを使用して、Tie1と結合させる参照タンパク質と競合するタンパク質を同定する。同様に、エピトープマッピングを使用して、Tieの特定のエピトープと結合するタンパク質を同定し得る。Tie1のフラグメントおよび変異体を、結合タンパク質同定プロセス、例えば特性付け、スクリーニングまたは免疫化の一つ以上にも使用し得る。
(標的結合抗体を得る方法)
ディスプレイライブラリの使用に加えて、標的結合抗体を得るため、またはディスプレイライブラリの使用と組み合わせて他の方法を使用し得る。例えば、Tie1外部ドメインまたはその領域を、非ヒト動物、例えばげっ歯類における抗原として使用し得る。同様に、Tie2もしくはAng、またはその領域を、非ヒト動物、例えばげっ歯類における抗原として使用し得る。
ディスプレイライブラリの使用に加えて、標的結合抗体を得るため、またはディスプレイライブラリの使用と組み合わせて他の方法を使用し得る。例えば、Tie1外部ドメインまたはその領域を、非ヒト動物、例えばげっ歯類における抗原として使用し得る。同様に、Tie2もしくはAng、またはその領域を、非ヒト動物、例えばげっ歯類における抗原として使用し得る。
一実施形態において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトIg遺伝子座の大型フラグメントを用いてマウス抗体産生を欠如するマウス系統を設計し得る。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的Mabを生成かつ選択し得る。例えば、XenoMouse(商標),Green et al.Nature Genetics 7:13−21(1994),US20030070185、WO96/34096(1996年10月31日公開)およびPCT出願第PCT/US96/05928号(1996日4月29日出願)を参照されたい。
別の実施形態において、モノクローナル抗体を、非ヒト動物から得、次いで改変、例えばヒト化または脱免疫化する。Winterは、ヒト化抗体を調製するために使用し得るCDRグラフト化法を記載している(英国特許出願GB2188638A(1987年3月26日出願);Winter US5,225,539)。特定のヒト抗体のすべてのCDRが、非ヒトCDRの少なくとも一部で置換されるか、またはCDRの一部のみが、非ヒトCDRで置換され得る。ヒト化抗体を所定の抗原に結合させるために必要とされる、CDRの数を取り替えさえすればよい。
ヒト化抗体を、抗原結合に直接関与しないFv可変領域の配列を、ヒトFv可変ドメインからの等価な配列で置換することにより生成し得る。ヒト化抗体を生成する一般的方法は、Morrison,S.L.,1985,Science 229:1202−1207,Oi et al.,1986,BioTechniques 4:214およびQueenら、US5,585,089、US5,693,761およびUS5,693,762により提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも一つからの免疫グロブリンFv可変領域の全てまたは一部をコードする核酸配列を、単離、操作および発現する工程を包含する。そのような核酸の供給源は、当業者に周知であり、例えば上記のように所定の標的に対して抗体を産生するハイブリドーマから得られ得る。次いで、ヒト化抗体またはそのフラグメントをコードする組換えDNAを、適切な発現ベクターにクローニングし得る。
標的結合抗体はまた、WO98/52976およびWO00/34317(これらの内容は、本明細書中に参考として、具体的に援用される)に開示の方法によりヒトT細胞エピトープの特異的な欠失または「脱免疫化」により改変され得る。簡単に説明すると、抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、MHCクラスIIに結合するペプチドに関して分析し得る;これらのペプチドは(WO98/52976およびWO00/34317に定義されるような)潜在的なT細胞エピトープに相当する。潜在的なT細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレディング(peptide threading)」と呼ばれるコンピュータモデル化アプローチを適用し得、さらにヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースを、WO98/52976およびWO00/34317に記載されるようなVHおよびVL配列に存在するモチーフを求めて調べ得る。これらのモチーフは、任意の18種類の主要なMHCクラスII DRアロタイプに結合し、したがって、潜在的なT細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なT細胞エピトープを、可変領域中の少数のアミノ酸残基を、好ましくは単一アミノ酸置換によって置換することで除去し得る。可能な保存的置換が行なわれる限り、ヒト生殖細胞系抗体配列中のこの位置に共通するアミノ酸を、しばしば、しかし排他的ではなく、使用し得る。ヒト生殖細胞系配列は、Tomlinson, I.A.et al.(1992)J.Mol.Biol.227:776−798;Cook,G.P.et al.(1995)Immunol.Today Vol.16(5):237−242;Chothia,D.et al.(1992)J.Mol.Bio.227:799−817に開示されている。V BASEディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する(Tomlinson,I.A.ら(編)MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)。脱免疫変化を同定した後、VHとVLをコードする核酸を、変異誘発または他の合成方法(例えば、デノボ合成、カセット置換等)により構築し得る。変異誘発された可変配列は、必要に応じて、ヒト定常領域(例えば、ヒトIgG1またはκ定常領域)に融合させ得る。
ある場合においては、潜在的なT細胞エピトープは、抗体機能に重要であると知られているか、予測されている残基を含む。例えば、潜在的なT細胞エピトープは、通常、CDRに偏向する。さらに、潜在的なT細胞エピトープは、抗体の構造および結合にとって重要なフレームワーク残基に生じ得る。これらの潜在的なエピトープを除去する変化は、ある場合では、例えば、変化する場合および変化しない場合で鎖を作製し検査することによるさらに厳密な検査を必要とする。可能な場合には、CDRにオーバーラップする潜在的なT細胞エピトープをCDR外での置換により除去した。ある場合では、CDR内の変更は単なるオプションであり、したがって、この置換がある場合およびない場合の変異体を検査すべきである。他の場合には、潜在的なT細胞エピトープを除去するために必要とされる置換は、抗体結合に決定的であり得るフレームワーク内の残基位置にある。これらの場合、この置換がある場合およびない場合の変異体を検査すべきである。よって、ある場合では、最適な脱免疫化抗体を同定するために、いくつかの変異体脱免疫化重鎖および軽鎖可変領域を設計し、多様な重鎖/軽鎖組合せを検査する。次いで、異なる変異体の結合親和性を、脱免疫化の程度、すなわち可変領域に残る潜在的なT細胞エピトープの数と共に考慮することにより、最終的な脱免疫化抗体の選択を行い得る。脱免疫化は、非ヒト配列を含む抗体、例えば、ネズミの抗体または他の非ヒトモノクローナル抗体を改変するために使用され得る。脱免疫化は、ディスプレイライブラリから単離された抗体を改変するために使用され得る。
(内皮細胞アッセイ)
標的結合タンパク質または候補結合タンパク質を、細胞アッセイを使用して特性付け、例えば、結合タンパク質が細胞に接触した場合の細胞表現型または他の活性の変化を評価し得る。典型的には、この細胞は、Tieの外部ドメインの少なくとも一部を含むタンパク質を発現する。一部実施形態において、この細胞は、Tie1(例えば全長の成熟Tie1タンパク質)、Tie2を発現し、および/またはAngと接触する。
標的結合タンパク質または候補結合タンパク質を、細胞アッセイを使用して特性付け、例えば、結合タンパク質が細胞に接触した場合の細胞表現型または他の活性の変化を評価し得る。典型的には、この細胞は、Tieの外部ドメインの少なくとも一部を含むタンパク質を発現する。一部実施形態において、この細胞は、Tie1(例えば全長の成熟Tie1タンパク質)、Tie2を発現し、および/またはAngと接触する。
内皮細胞増殖。内皮増殖阻害活性について、ウシ毛管内皮細胞増殖アッセイ、ニワトリCAMアッセイ、マウス角膜アッセイ等の生物学的活性アッセイを使用し、移植腫瘍に対する結合タンパク質の効果を評価して、候補結合タンパク質を検査し得る。ニワトリCAMアッセイは、例えば、O’Reilly et al.“Angiogenic Regulation of Metastatic Growth”Cell,vol.79(2)、1994年10月21日、pp.315〜328に記載されている。簡単に説明すると、インタクトな卵黄を有する3日齢のニワトリ胚を卵から分離して、ペトリ皿に置く。三日間のインキュベーション後、検査すべきタンパク質を含むメチルセルロースディスクを、個々の胚のCAMに適用する。48時間のインキュベーション後、胚およびCAMを観察して、内皮細胞の成長が阻害されるかどうかを決定する。マウス角膜アッセイは、成長因子含有ペレットを疑われる内皮成長阻害物質を含む別のペレットとともに、マウスの角膜に移植すること、角膜で作られた毛細管のパターンを観察することを包含する。
血管形成。血管形成は、例えば、臍静脈、冠状動脈または皮膚細胞等の多様な内皮細胞系を用いてアッセイし得る。適切なアッセイとして、増殖を測定するアラマーブルー系アッセイ(Biosource Internationalから利用可能);血管形成増強物質または阻害物質の存在または不在下に、細胞の膜貫通移動を測定するBecton Dickinson Falcon HTS FluoroBlock(商標)細胞培養挿入物の使用等の、蛍光分子を使用する移動アッセイ;およびMATRIGEL(商標)(Becton Dickinson)またはコラーゲンI上の内皮細胞による管状構造物の形成に基づく細管形成アッセイが挙げられる。
細胞付着。細胞付着アッセイは、候補標的結合タンパク質の存在または不在下に、細胞の精製付着タンパク質への付着または細胞同士の付着を測定する。細胞/タンパク質付着アッセイは、細胞の精製タンパク質への付着を調節する物質の能力を測定する。例えば、組換えタンパク質を生成し、PBSで2.5g/mLに希釈し、マイクロタイタープレートのウェルを被覆するために使用する。ネガティブコントロールに使用されるウェルは、被覆しない。次いで、被覆したウェルを洗浄し、1%BSAでブロックし、再び洗浄する。化合物を、最終検査濃度の2倍まで希釈し、ブロックされ被覆されたウェルに加える。次いで、細胞をウェルに加え、未結合の細胞を洗浄除去する。保持された細胞を、カルセイン−AM等の膜浸透性蛍光染料を加えることによりプレート上で直接標識し、そのシグナルを蛍光マイクロプレートリーダーで定量する。
細胞/細胞付着アッセイを、細胞の細胞同士の結合を調節する候補標的結合タンパク質の能力を測定するために使用し得る。これらのアッセイは、選択された付着タンパク質を天然に、または組換えにより発現する細胞を使用し得る。例示的なアッセイにおいて、細胞付着タンパク質を発現する細胞を、他の細胞(同じ細胞タイプ以上のものか、または細胞が付着する別のタイプの細胞)とともにマルチウエルプレートのウェルにプレートする。付着し得る細胞を、BCECF等の膜浸透性蛍光染料で標識し、候補結合タンパク質の存在下で単層に付着させる。未結合細胞を洗浄除去し、蛍光プレートリーダーを使用して結合細胞を検出する。高スループット細胞付着アッセイもまた、記載されている。例えば、Falsey J R et al.,Bioconjug Chem.May−June 2001;12(3):346−53を参照されたい。
管形成。管形成アッセイを、一般的に、細胞外マトリックスの環境を刺激するマトリックス基質上に管構造物を形成する培養細胞(一般的に、内皮細胞)の能力をモニターするために使用し得る。例示的な基質として、4℃にて液体であり、37℃にて固体ゲルを形成するMATRIGEL(商標)(Becton Dickinson)、すなわち、ラミニン、コラーゲンIVおよびへパリン硫酸プロテオグリカンを含む基底膜タンパク質の抽出物が挙げられる。他の適切なマトリックスは、コラーゲン、フィブロネクチンおよび/またはフィブリン等の細胞外成分を含む。細胞を、前血管形成刺激物質により刺激し、それらの細管形成能力を画像化により検出する。細管は、刺激を用いて一晩インキュベーションした後に一般的に検出し得るが、それよりも長い時間枠または短い時間枠も使用し得る。管形成アッセイは、当該技術分野で周知である(例えば、Jones M K et al.,1999,Nature Medicine 5:1418−1423)。これらのアッセイは伝統的に血清によるか、または成長因子FGFもしくはVEGFによる刺激を伴う。一実施形態において、このアッセイは無血清培地で培養された細胞を用いて実施する。一実施形態において、アッセイを、一つ以上の前血管形成物質、例えば炎症性血管形成因子(例えば、TNF−αまたはFGF、VEGF、フォルボールミリステートアセテート(PMA)、TNF−α、エフリン)の存在下で行われる。
細胞移動。内皮細胞移動の例示的アッセイは、ヒト微小血管内皮(HMVEC)移動アッセイである。例えば、Tolsma et al.(1993)J.Cell Biol 122,497−511を参照。移動アッセイは当該技術分野で公知の(例えば、Paik J H et al.,2001,J Biol Chem 276:11830−11837を参照)。一例において、培養内皮細胞を、典型的な細胞サイズよりも一般的に小さい気孔サイズのマトリックス被覆多孔性薄膜上にまく。この薄膜は、典型的にはトランスウエルポリカーボネート膜(Corning Costar Corporation,Cambridge,Mass.)等の膜であり、一般的に、前血管形成刺激を含む低いチャンバーと液体中で接触した上部チャンバーの一部である。移動は一般的に刺激を用いた一晩のインキュベーション後にアッセイするが、それよりも長い時間枠または短い時間枠も使用し得る。移動は薄膜を横断する細胞の数として評価し、ヘモトキシリン溶液(VWR Scientific.)による細胞の染色によるか、または細胞数の決定の任意の他の方法により検出し得る。別の例示的な設定では、細胞を蛍光標識し、移動を蛍光の読み、例えばFalcon HTS FLUOROBLOC(商標)(Becton Dickinson)を使用して検出する。一部の移動が刺激の不存在下に観察される一方で、移動は前血管形成因子に応答して大きく増加する。このアッセイを使用して、標的結合タンパク質の内皮細胞移動に対する効果を検査し得る。
出芽アッセイ。例示的な出芽アッセイは、コラーゲンゲル系マトリックスに埋め込まれた内皮細胞(「スフェロイド」)の細胞数で定義されるスフェロイド集合体を使用する三次元のインビトロ血管形成アッセイである。スフェロイドは、細胞外マトリックス中への侵入による毛細管様構造物の出芽(「細胞出芽」という)とその後の複合体合流ネットワーク形成の出発点となり得る(Korff and Augustin,1999,J Cell Sci 112:3249−58)。例示的な実験設定において、スフェロイドは、400個のヒト臍静脈内皮細胞を、非吸着性の96ウエルプレートの各ウェルに分注し、スフェロイドを一晩凝集させることにより調製される(Korff and Augustin:J Cell Sci 143:1341−52,1998)。スフェロイドを採取し、900μlのメトセル−コラーゲン溶液にまき、24ウエルプレートの各ウェルに分注し、コラーゲンゲルを重合させる。試験物質を30分後に、試験物質の10倍濃度作用希釈物の100μlをゲル上部に分注することによって加える。プレートを37℃にて24時間インキュベートする。実験インキュベーション時間の最後にパラホルムアルデヒドを加えることにより皿を固定する。内皮細胞の出芽強度を、自動化イメージ分析システムにより定量して、1スフェロイドあたりの累積出芽丈を決定し得る。
一部実施形態において、標的結合タンパク質は、本明細書中に記載されるアッセイ、例えば本明細書中に記載される細胞アッセイに対し、統計的に有意な効果を有する。
(タンパク質産生)
標準的な組換え核酸法を使用して、Tie1、Tie2またはAngに結合する結合タンパク質を発現し得る。例えば、Sambrook & Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)に記載の技術を参照されたい。一般的に、結合タンパク質をコードする核酸配列を、核酸発現ベクターにクローニングする。タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖を発現ベクター、例えば同じまたは異なる細胞で発現される同じまたは異なるベクターにクローニングし得る。抗体を産生する方法も、以下に提供する。
標準的な組換え核酸法を使用して、Tie1、Tie2またはAngに結合する結合タンパク質を発現し得る。例えば、Sambrook & Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)に記載の技術を参照されたい。一般的に、結合タンパク質をコードする核酸配列を、核酸発現ベクターにクローニングする。タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖を発現ベクター、例えば同じまたは異なる細胞で発現される同じまたは異なるベクターにクローニングし得る。抗体を産生する方法も、以下に提供する。
(抗体産生)
一部の抗体(例えば、Fab)を、細菌細胞(例えば、E.coli細胞)中に生成し得る。例えば、Fabが、ディスプレー実体とバクテリオファージタンパク質(またはそのフラグメント)との間の阻害ストップコドンを含むファージディスプレーベクター中の配列によりコードされている場合、ベクター核酸を、ストップコドンを阻害し得ない細菌細胞中に移し替え得る。この場合Fabは、遺伝子IIIタンパク質に融合せず、培地中に分泌される。
一部の抗体(例えば、Fab)を、細菌細胞(例えば、E.coli細胞)中に生成し得る。例えば、Fabが、ディスプレー実体とバクテリオファージタンパク質(またはそのフラグメント)との間の阻害ストップコドンを含むファージディスプレーベクター中の配列によりコードされている場合、ベクター核酸を、ストップコドンを阻害し得ない細菌細胞中に移し替え得る。この場合Fabは、遺伝子IIIタンパク質に融合せず、培地中に分泌される。
抗体はまた、真核細胞中に生成され得る。一実施形態において、これらの抗体(例えば、scFv)は酵母細胞、例えばPichia(例えば、Powers et al.(2001)J Immunol Methods.251:123−35を参照)、HanseulaまたはSaccharomyces中で発現される。
一実施形態において、抗体は哺乳動物細胞で作られる。クローン抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するのに好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(Urlaub and Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220に記載のdhfr−CHO細胞を含み、例えばKaufman and Sharp(1982)Mol.Biol.159:602−621に記載のようにDHFR選択可能マーカーとともに使用される)、リンパ球細胞株、例えば、NS0ミエローマ細胞およびSP2細胞、COS細胞、HEK 293T細胞、およびトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物からの細胞が挙げられる。例えば、細胞は乳腺の外皮細胞である。
免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列(例えば、複製開始点)および選択可能マーカー遺伝子等の付加的な配列を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、米国特許第4,399,216号、米国特許第4,634,665号および米国特許第5,179,017号を参照)。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等の薬品に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅によるdhfr−宿主細胞における使用用)およびneo遺伝子(G418選択用)が挙げられる。別の例示的な発現系は、Lonza Group Ltd.CHから利用可能なグルタミンシンターゼ(GS)ベクター系である(例えば、Clark et al.(2004)BioProcess International 2(4):48−52;Barnes et al.(2002)Biotech Bioeng.81(6):631−639を参照)。
抗体またはその抗原結合部分の組換え発現の例示的な系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりdhfr−CHO細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖および軽鎖の遺伝子を、エンハンサー/プロモーター調節要素(例えば、SV40、CMV、アデノウイルス等に由来するもの、例えばCMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節要素またはSV40エンハンサー/AdMLPプロモーター調節要素)にそれぞれ作動可能に連結させて遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターはまた、DHFR遺伝子を有し、これはこのベクターをトランスフェクトしたCHO細胞の、メトトレキセート選択/増幅を使用した選択を可能とする。選択された形質転換宿主細胞を培養して抗体重鎖および軽鎖を発現させ、インタクトな抗体を培養培地から回収する。標準的な分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収する。例えば、一部の抗体は、プロテインAまたはプロテインGによるアフィニティークロマトグラフィーにより単離し得る。
コドンの使用は宿主細胞のコドンバイアスに合致させることができ、例えばCHO細胞の場合は、これはコドンバイアスCricetulus griseus遺伝子に合致させる。更に又、極めて高い(>80%)または極めて低い(<30%)GC含量の領域は可能な場合は回避することができる。旨適化過程の間、以下のシス作用配列モチーフ、即ち、内部TATAボックス;カイ部位およびリボソーム進入部位;ATリッチまたはGCリッチ配列ストレッチ;ARE、INS、CRS配列エレメント;リピート配列およびRNA二次構造;および(クリプティック)スプライスドナーおよびアクセプターの部位、分岐点、は回避する。2つのSTOPコドンを用いることにより効率的な終止を確保することができる。配列のコドン旨適化はSharp,P.M.,Li,W.H.,Nucleic Acids Res.15(3).1987に従って評価することができる。標準的なコドンアダプテーション指数(CAI)を使用できる。希少なコドンは0〜40のクオリティークラスを有するものを包含する。
本発明は例えば向上したコドンまたは配列の特徴を包含するように本明細書に記載した配列と相対比較して改変されている単離された核酸分子を特徴とし、重鎖または軽鎖のコーディング配列を含む単離された核酸分子を包含する。例えば重鎖または軽鎖のコーディング配列内のコドンの少なくとも30、40、50、60、65、70、75または80%が哺乳類細胞における非希少または頻繁なコドンであるか、または、重鎖または軽鎖のコーディング配列が哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター細胞(Crecetulus griseus)において50、45、40、35、30、25、20、15、10%未満の希少コドンを包含する。一実施形態において、コドンアダプテーション指数は0.6、0.7、0.8、0.85、0.90、0.92、0.94、0.95、0.96、0.97または0.98より高値である。
一実施形態において、重鎖コーディング配列は(i)本明細書に記載した抗体重鎖(例えば配列番号723に示すE3重鎖)を含むポリペプチド、(ii)本明細書に記載した抗体重鎖コーディング配列(例えば配列番号723)に少なくとも85、90、95、96、97、98または99%同一であるポリペプチド、または(iii)本明細書に記載した抗体重鎖可変ドメイン(例えばE3重鎖可変ドメイン)のCDRを有する重鎖可変ドメイン配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態において、重鎖コーディング配列は少なくとも2、3、5、6、8、9、10または15コドンにおいて配列番号703と異なる。
一実施形態において、軽鎖コーディング配列は(i)本明細書に記載した抗体軽鎖(例えば配列番号724に示すE3軽鎖)を含むポリペプチド、(ii)本明細書に記載した抗体軽鎖コーディング配列(例えば配列番号724)に少なくとも85、90、95、96、97、98または99%同一であるポリペプチド、または(iii)本明細書に記載した抗体軽鎖可変ドメイン(例えばE3軽鎖可変ドメイン)のCDRを有する軽鎖可変ドメイン配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態において、軽鎖コーディング配列は少なくとも3、5、6、8、9、10または15コドンにおいて配列番号702と異なる。
一実施形態において、例えばala−GCGコドン1つ以上はGCCに変更することができ;arg−CGTコドン1つ以上はCGCに変更することができ;pro−CCGコドン1つ以上はCCC、CCTまたはCCAに変更することができ;ser−TCGコドン1つ以上はTCCに変更することができ;および/またはthr−ACGコドン1つ以上はACCに変更することができる。
コドン改変(例えばコドン旨適化)配列を抗体の製造に使用できる。例示される方法は抗体コーディング核酸を包含する哺乳類細胞を準備すること、および、細胞内に核酸を発現させること、例えばタンパク質が発現される条件下に細胞を維持することを包含する。抗体コーディング核酸は哺乳類発現ベクター、例えば細胞内に導入されたベクター内に提供することができる。細胞は非ヒト哺乳類細胞、たとえばCHO細胞でありうる。
Fcドメインを含む抗体のために、抗体産生系は、好ましくはFc領域がグリコシル化されている抗体を合成する。例えば、IgG分子のFcドメインは、CH2ドメイン中のアスパラギン297でグリコシル化されている。このアスパラギンは、二分岐型のオリゴ糖による修飾部位である。このグリコシル化はFcγレセプターおよび補体C1qにより媒介されるエフェクター機能に必要とされることが、示されている(Burton and Woof(1992)Adv.Immunol.51:1−84;Jefferis et al.(1998)Immunol.Rev.163:59−76)。好ましい実施形態において、Fcドメインは、アスパラギン297に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系で生成される。Fcドメインはまた、他の真核翻訳後修飾を含み得る。
抗体はまた、トランスジェニック動物により生成され得る。例えば、US5,849,992は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺で抗体を発現する方法を記載している。乳特異的プロモーター、ならびに関心の抗体および分泌のためのシグナル配列をコードする核酸を含むトランスジーンが構築される。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌により産生される乳は、そこで分泌された関心の抗体を含んでいる。この抗体を乳から精製し得、または一部の利用においては直接的に使用し得る。
Tie1、Tie2またはAngに結合する抗体を、例えば天然、ヒトまたは部分的にヒトの免疫グロブリン遺伝子座を有する例えば動物を使用して、免疫化によっても生成し得る。そのような抗体は、任意のアロタイプ、例えば、a,zアロタイプ、fアロタイプまたは非Aアロタイプであり得る。非ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列、例えば特定の位置で、例えば以下の位置の一つ以上(好ましくは少なくとも5、10、12またはすべて)で共通ヒトアミノ酸残基の置換を含むようにも改変し得る:(軽鎖の可変ドメインのFRにおいて)、4L、35L、36L、38L、43L、44L、58L、46L、62L、63L、64L、65L、66L、67L、68L、69L、70L、71L、73L、85L、87L、98Lおよび/または(重鎖の可変ドメインのFRにおいて)2H、4H、24H、36H、37H、39H、43H、45H、49H、58H、60H、67H、68H、69H、70H、73H、74H、75H、78H、91H、92H、93Hおよび/または103H(Kabatのナンバリングによる)。例えば、US6,407,213を参照されたい。
(Tie1産生)
Tie1外部ドメインタンパク質、Tie1タンパク質またはTie1リポソームを生成する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、WO93/14124を参照されたい。Tie2およびAngを生成する方法は、同様に公知である。例えば、米国特許第6,521,424号、米国特許第6,376,653号;WO96/11269;WO96/31598を参照されたい。
Tie1外部ドメインタンパク質、Tie1タンパク質またはTie1リポソームを生成する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、WO93/14124を参照されたい。Tie2およびAngを生成する方法は、同様に公知である。例えば、米国特許第6,521,424号、米国特許第6,376,653号;WO96/11269;WO96/31598を参照されたい。
(ビオチニル化法)
多様な方法が、タンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質または標的タンパク質をビオチニル化するために利用し得る。例えば、タンパク質を5倍モル過剰のスルホ−NHS−SS−ビオチンと共に、50mM HEPES、pH8.0、100mM NaCl中で、4℃にて一晩インキュベートし得る。遊離ビオチンは、例えば10kDa分子量カットオフメンブレンを有するBIOMAX(登録商標)装置を使用して、PBS、0.01%Tween20へのバッファー交換または透析により除去する。タンパク質1モルあたりに導入されるビオチン分子の数は、製造者(Pierce)により記載されるようにHABAアッセイを使用して決定し得る。
多様な方法が、タンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質または標的タンパク質をビオチニル化するために利用し得る。例えば、タンパク質を5倍モル過剰のスルホ−NHS−SS−ビオチンと共に、50mM HEPES、pH8.0、100mM NaCl中で、4℃にて一晩インキュベートし得る。遊離ビオチンは、例えば10kDa分子量カットオフメンブレンを有するBIOMAX(登録商標)装置を使用して、PBS、0.01%Tween20へのバッファー交換または透析により除去する。タンパク質1モルあたりに導入されるビオチン分子の数は、製造者(Pierce)により記載されるようにHABAアッセイを使用して決定し得る。
(薬学的組成物)
別の局面において、本発明は、Tie1、Tie2またはAngに結合する物質、例えばTie1、Tie2またはAngに結合すると同定された、あるいは本明細書中に記載さる抗体分子、他のポリペプチドまたはペプチドを含み、薬学的に受容可能なキャリアとともに処方された組成物、例えば薬学的に受容可能な組成物を提供する。薬学的組成物は、標識結合タンパク質(例えば、インビボ画像化用)ならびに治療組成物を包含する。
別の局面において、本発明は、Tie1、Tie2またはAngに結合する物質、例えばTie1、Tie2またはAngに結合すると同定された、あるいは本明細書中に記載さる抗体分子、他のポリペプチドまたはペプチドを含み、薬学的に受容可能なキャリアとともに処方された組成物、例えば薬学的に受容可能な組成物を提供する。薬学的組成物は、標識結合タンパク質(例えば、インビボ画像化用)ならびに治療組成物を包含する。
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒体、被覆物、抗細菌および抗カビ剤、等張吸収遅延剤等を含む。好ましくは、キャリアは(例えば、注射または点滴による)静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に適している。投与経路に応じて、結合タンパク質は、化合物を不活性化し得る酸の作用および他の自然な状態から該化合物を保護する物質で被覆され得る。
「薬学的に受容可能な塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、任意の望ましくない毒物学的効果を付与しない塩をいう(例えば、Berge,S.M.,et al.(1977)J.Pharm.Sci.66:1−19)。そのような塩の例として、酸付加塩と塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等に由来する塩、ならびに非毒性の有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等に由来する塩が挙げられる。塩基付加塩として、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等に由来する塩、ならびに非毒性の有機アミン、例えば、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、N−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来する塩が挙げられる。
組成物は、多様な形態であり得る。これらは、例えば、液体、半固体および固体投与形態、例えば溶液(例えば、注射可能溶液および点滴可能溶液)、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉剤、リポソームおよび座薬を含む。好ましい形態は、投与および治療的利用の意図される形態に依存する。典型的な好ましい組成物は、例えばヒトに抗体を投与するために使用される組成物と類似組成物等、注射可能溶液または点滴可能溶液の形態である。投与の好ましい形態は、非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。好ましい実施形態において、標的結合タンパク質は、静脈内点滴または注射により投与される。別の好ましい実施形態において、標的結合タンパク質は、筋肉内注射または皮下注射により投与される。
語句「非経口投与」および「非経口に投与される」とは、本明細書中で使用される場合、腸内および局所投与以外の通常注射による投与形態を意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、胸膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、角皮下、動脈内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射ならびに点滴が挙げられる。
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高薬物濃度に適する他次元の構造物として調合し得る。無菌の注射可能な溶液は、結合タンパク質を、必要とされる上記成分の一つまたはその組合せとともに適切な溶媒中に必要とされる量で混合し、続いてろ過滅菌することにより調製し得る。一般的に、分散液は、塩基性分散媒体および上記からの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を混合することにより調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、先に無菌ろ過した溶液から活性成分および任意の更なる所望の成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチン等の塗料の使用により、分散液の場合に必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを、この組成物に含ませることによりもたらされ得る。
本明細書中に記載される結合タンパク質を、当該技術分野で公知の種々の方法により投与し得るが、多くの利用のために好ましい投与経路/形態は、静脈注射または点滴である。例えば、治療の利用のために、標的結合タンパク質は、例えば、30mg/分、20mg/分、10mg/分、5mg/分または1mg/分未満の速度で静脈内点滴により投与して、約1〜100mg/m2または7〜25mg/m2の用量を達成し得る。投与経路および/または形態は、所望の結果に応じて変更する。ある実施形態において、活性化合物は、移植物等の制御された放出調合物およびマイクロカプセル化送達系等、該化合物を急速な放出に対して保護するキャリアとともに調製し得る。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解可能で生物適合性のポリマーを使用し得る。そのような処方物の多くの調製方法が特許されているか、一般的に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978を参照されたい。
ある実施形態において、結合タンパク質を、例えば不活性希釈液または同化可能な食用キャリアとともに経口投与し得る。また、この化合物(および所望であれば、他の成分)を、硬質または軟質のゼラチンカプセルに封入するか、錠剤へと圧縮するか、あるいは被験体の食事に直接混合し得る。経口治療投与のために、この化合物を、賦形剤とともに混合し、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤等の形態で使用し得る。本明細書中に記載される化合物を非経口投与以外で投与するために、化合物の不活化を防止する物質で化合物を被覆するか、または化合物をこの物質とともに投与することが必要となり得る。
薬学的組成物を、当該技術分野で公知の医療デバイスにより投与し得る。例えば、好ましい実施形態において、薬学的組成物を、米国特許第5,399,163号、米国特許第5,383,851号、米国特許第5,312,335号、米国特許第5,064,413号、米国特許第4,941,880号、米国特許第4,790,824号または米国特許第4,596,556号で開示されるデバイス等の無針皮下注射デバイスにより投与し得る。移植物およびモジュールの例として、医薬を調節速度で投与する移植可能なマイクロ点滴ポンプを開示している米国特許第4,487,603号、医薬を経皮で投与する治療デバイスを開示している米国特許第4,486,194号、医薬を正確な点滴速度で送達する医薬点滴ポンプを開示している米国特許第4,447,233号、連続的な薬物送達用の変流量移植可能点滴装置を開示している米国特許第4,447,224号、マルチチャンバー区画を有する浸透薬物送達システムを開示している米国特許第4,439,196号および浸透医薬供給システムを開示する米国特許第4,475,196号が挙げられる。勿論、多くの他のそのような移植物、送達システムおよびモジュールもまた、公知である。
ある実施形態において、本明細書中に記載される結合タンパク質は、インビボでの適切な分布を保証するように処方し得る。例えば、血液脳関門(BBB)は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療タンパク質が、(所望なら)BBBを確実に横断させるために、それらを、例えばリポソーム中に処方し得る。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第4,522,811号;米国特許第5,374,548号;および米国特許第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に運ばれる一つ以上の部分を含み得、したがって、標的薬物送達を向上させ得る(例えば、V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685を参照)。
投与レジメンを、最適な所望される応答(例えば、治療的応答)を提供するように調節する。例えば、単一の巨丸薬を投与してもよいし、いくつかに分けた用量を経時的に投与してもよいし、用量を治療状況の必要性によって示されるように比例的に増減してもよい。非経口組成物を、投与の容易さおよび投薬量の均一性のための投薬単位形態で調合することは特に好都合である。本明細書中で使用される投薬単位形態は、治療をされる被験体に単位投薬量として適した物理的に別々の単位をいい;各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同して所望の治療効果を生じるように算定された所定量の活性化合物を含む。投薬単位形態の規格は、(a)活性化合物の独自の特性および達成すべき特定の治療効果および(b)個人における感受性処置のために活性化合物の配合技術分野に内在する制限により規定され、これらに直接的に依存し得る。
本明細書中に記載される抗体の治療有効量または予防有効量についての例示的で非限定的な範囲は、0.1mg〜20mg/kg、より好ましくは1mg〜10mg/kgである。標的結合タンパク質を、30mg、20mg、10mg、5mgまたは1mg/分未満の速度で静脈内点滴により投与して、約1mg〜100mg/m2または約5mg〜30mg/m2の用量を達成し得る。抗体よりも分子量の小さい結合タンパク質については、適正量を、比例的に小さくし得る。投薬量の値は、緩和すべき状態のタイプおよび重篤度により変更し得ることに注意すべきである。さらに、任意の特定の被験体に対しては、特異的投薬レジメンを、個人の必要性、および組成物を投与するかもしくは組成物投与を監督する者の専門的な判断に基づいて、経時的に調節すべきであり、本明細書中で提示する投薬量の範囲は例示的なものにすぎず、請求される組成物の範囲もしくは実施を限定する意図はないことを理解されるべきである。
薬学的組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本明細書中に記載される標的結合タンパク質を使用して調製し得る。「治療有効量」とは、所望の治療成果を達成するために必要な投与量で、そのために必要な期間、有効な量をいう。治療有効量の組成物は、個人の病状、年齢、性別および体重等の因子、および個人において所望の応答を誘発する結合タンパク質の能力に従って変更し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が組成物の任意の毒性または有害な効果にまさる量でもある。「治療有効量」は、好ましくは測定可能なパラメーター、例えば炎症または腫瘍の成長速度を、処置されない被験体と比較して、少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、なおさらに好ましくは少なくとも80%阻害する。化合物の測定可能なパラメーター(例えば、癌)の阻害能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系で評価し得る。あるいは、組成物のこの性質を、当業者に公知のアッセイによってインビトロでの阻害等の化合物の阻害能力を調べることにより評価し得る。
「予防有効量」とは、所望の予防成果を達成するために必要な投与量で、そのために必要な期間、有効な量をいう。典型的には、予防用量は疾患前または疾患の初期段階で被験体に使用されるために、予防有効量は、治療有効量よりも少なくなる。
Tie1、Tie2またはAngに結合する結合タンパク質および使用(例えば、処置、予防または診断における使用)に関する説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内にある。一実施形態において、診断用途についての説明書は、インビトロで、例えばサンプルで、例えば炎症障害または癌もしくは腫瘍性障害を有する患者からの生検または細胞中、あるいはインビボでTie1、Tie2またはAngを検出するための、標的結合タンパク質(例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または他のポリペプチドもしくはペプチド)の使用を含む。別の実施形態において、治療用途の説明書は、癌もしくは腫瘍性障害を有する患者において推奨される投与量および/または投与形態を含む。さらに、このキットは、診断剤または治療剤、例えば本明細書中に記載される診断剤または治療剤等の少なくとも一つのさらなる試薬および/または必要に応じて一つ以上の分離した医薬品に調合される一つ以上のさらなる標的結合タンパク質を含み得る。
一実施形態において、標的結合タンパク質(例えば、本明細書中に記載されるTie1抗体)を、遺伝子に基づくベクター(例えば、導入遺伝子)から、またはアデノウイルス送達により生成し得る。
(安定化および保持)
一実施形態において、標的結合タンパク質(例えば、本明細書中に記載されるTie1結合タンパク質、ポリペプチド、抗体またはアプタマー)を、循環中、例えば血液、血清、リンパ液または他の組織中でその安定化および/または保持を向上させる部分と物理的に会合させる。
一実施形態において、標的結合タンパク質(例えば、本明細書中に記載されるTie1結合タンパク質、ポリペプチド、抗体またはアプタマー)を、循環中、例えば血液、血清、リンパ液または他の組織中でその安定化および/または保持を向上させる部分と物理的に会合させる。
例えば、標的結合因子を、ポリマー、例えば、実質的に非抗原性のポリマー(例えば、ポリオキシアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシド)と会合させ得る。適切なポリマーは、重量により実質的に変化する。約200〜約35,000、約1,000〜約15,000、および2,000〜約12,500の範囲の数平均分子量を有するポリマーが本発明の目的のために通常選択される。の分子量が好ましく、2,000〜約12,5000が特に好ましい。
例えば、標的結合因子を、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンと複合化させ得る。そのようなポリマー非限定的なリストは、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、その共重合体およびそのブロック共重合体(但し、ブロック共重合体の水溶性は維持されている)を含む。さらなる有用なポリマーとして、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロック共重合体(Pluronics);ポリメタクリレート;カルボマー;糖モノマーD−マンノース、D−およびL−ガラクトース、フコース、フルクトース、D−キシロース、L−アラビノース、D−グルクロン酸、シアル酸、D−ガラクツロン酸、D−マンヌロン酸(例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸)、D−グルコサミン、D−ガラクトサミン、D−グルコースおよびノイラミン酸を含む分鎖または非分鎖の多糖、例えばホモ多糖およびヘテロ多糖、例えばラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖の多糖サブユニット、例えばヒアルロン酸;糖アルコールのポリマー、例えばポリソルビトールおよびポリマンニトール等;ヘパリンまたはヘパロンが挙げられる。
また、他の化合物、例えば細胞毒、標識、または他の標的因子、例えば別の標的結合因子もしくは非関連因子を、同じポリマーに連結し得る。モノ活性化アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド(PAO)、例えば、モノメトキシ末端ポリエチレングリコール(mPEG);C1−4アルキル末端ポリマー;およびビス活性化ポリエチレンオキシド(グリコール)を架橋のために使用し得る。例えば、US5,951,974を参照されたい。
その最も一般的な形態で、ポリ(エチレングリコール)、PEGは、ヒドロキシル基の末端を有し、以下の一般構造を有する、直鎖状または分枝状のポリエーテルである:
HO−(CH2CH2O)n−CH2CH2−OH
PEGは、エポキシ環上のヒドロキシドイオンの求核攻撃により開始されるエチレンオキシドのアニオン性開環重合により合成され得る。ポリペプチド改変に特に有用なのは、以下の一般構造を有するモノメトキシPEG、mPEGである:
CH3O−(CH2CH2O)n−CH2CH2−OH
さらなる説明については、例えばRoberts et al.(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54:459−476を参照されたい。
HO−(CH2CH2O)n−CH2CH2−OH
PEGは、エポキシ環上のヒドロキシドイオンの求核攻撃により開始されるエチレンオキシドのアニオン性開環重合により合成され得る。ポリペプチド改変に特に有用なのは、以下の一般構造を有するモノメトキシPEG、mPEGである:
CH3O−(CH2CH2O)n−CH2CH2−OH
さらなる説明については、例えばRoberts et al.(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54:459−476を参照されたい。
一実施形態において、架橋前のポリマーは水溶性である必要はないが、水溶性であるのが好ましい。一般的に、架橋後の生成物は水溶性であり、例えば、少なくとも約0.01mg/ml、より好ましくは少なくとも約0.1mg/ml、さらにより好ましくは少なくとも約1mg/mlの水溶性を示す。さらに、ポリマーは複合形態で高い免疫原性であるべきではなく、また、この複合体が静脈内点滴または注射等の経路により投与されることを意図するのであれば、そのような経路と適合しない粘度を有するべきではない。
一実施形態において、このポリマーは、反応性のある単一の基のみを含む。これはタンパク質分子の架橋を避けるのに役立つ。しかし、架橋を低減するために反応条件を最大化すること、または実質的に同質の誘導体を回収するために反応生成物をゲルろ過もしくはイオン交換クロマトグラフィーにより精製することは、本明細書中の範囲内にある。他の実施形態において、ポリマーは、複数の因子をポリマーの主鎖に連結するために二つ以上の反応基を含む。再び、ゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィーを使用して、所望の誘導体を実質的に同質な形態で回収し得る。
ポリマーの分子量は、約500,000Dまでの範囲であり得、好ましくは少なくとも約20,000D、または少なくとも約30,000D、または少なくとも約40,000Dである。選択される分子量は、達成される複合体の有効な大きさ、ポリマーの性質(例えば、直鎖状または分枝状等の構造)および誘導体化の程度に依存し得る。
共有結合による架橋は、例えばN末端アミノ基およびリジン残基に見受けられるイプシロンアミノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたは他の親水基への架橋によって標的結合因子(例えば、タンパク質)をポリマーへ連結するために使用し得る。ポリマーは、多官能性(普通は二官能性)架橋剤を使用することなく標的結合タンパク質に直接共有結合させ得る。アミノ基への共有結合は、シアヌル酸塩化物、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基(PEGアルコキシド+ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール;PEG+DMSOおよび無水酢酸、または塩化PEG+4−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシンイミジルエステル、活性化ジチオカルボネートPEG、2,4,5−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはP−ニトロフェニルクロロホルメート活性化PEG)に基づく公知の化学により達成される。カルボキシル基はカルボジイミドを使用してPEG−アミンに結合させることにより誘導体化し得る。スルフヒドリル基は、マレイミド置換PEG(例えば、アルコキシ−PEGアミン+スルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート)WO97/10847またはShearwater Polymers,Inc.,Huntsville,Alaから市販されているPEG−マレイミド)に結合させることにより誘導体化し得る。あるいは、例えばPedley et al.,Br.J.Cancer,70:1126−1130(1994)に記載されるように、結合タンパク質上の遊離アミノ基(例えば、リジン残基上のイプシロンアミノ基)を、2−イミノ−チオラン(Trautの試薬)によりチオール化し、次いで、PEGのマレイミド含有誘導体に結合させ得る。
標的結合因子(例えば、タンパク質)へ結合させ得る機能性PEGポリマーは、例えばShearwater Polymers,Inc.(Huntsville,Ala.)から入手し得る。そのような市販されているPEG誘導体として、例えば、アミノ−PEG、PEGアミノ酸エステル、PEG−ヒドラジド、PEG−チオール、PEG−スクシナート、カルボキシメチル化PEG、PEG−プロピオン酸、PEGアミノ酸、PEGスクシンイミジルスクシナート、PEGスクシンイミジルプロピオナート、カルボキシメチル化PEGのスクシンイミジルエステル、PEGのスクシンイミジルカルボネート、アミノ酸PEGのスクシンイミジルエステル、PEG−オキシカルボニルイミダゾール、PEG−ニトロフェニルカルボネート、PEGトレシレート(tresylate)、PEG−グリシジルエーテル、PEG−アルデヒド、PEGビニルスルホン、PEG−マレイミド、PEG−オルトピリジル−ジスルフィド、ヘテロ機能性PEG、PEGビニル誘導体、PEGシランおよびPEGホスフォリド(phospholide)が挙げられる。これらのPEG誘導体を結合させる反応条件は、Tie1結合タンパク質、PEG化の所望の程度、および利用されるPEG誘導体に応じて変更し得る。PEG誘導体の選択に伴う幾つかの因子として、所望の結合点(例えばリジンまたはシステインR基)、誘導体の加水分解安定性および反応性、結合の安定性、毒性および抗原性、分析の適切性等が挙げられる。任意の特定の誘導体の使用の具体的な説明は、製造者から入手し得る。
標的結合因子(例えば、Tie1結合タンパク質)およびポリマーの複合体は、例えばゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィー、例えばHPLCにより未反応の出発物質から分離し得る。複合物の非相同種は、互いから同様に精製される。また、未反応のアミノ酸のイオン的性質の違いのために、異なる種(例えば、一つまたは二つのPEG残基を有するもの)の分離も可能である。例えば、WO96/34015を参照されたい。
標的結合タンパク質は安定化または保持機能を与えるタンパク質、例えばアルブミン、例えばヒト血清アルブミンと物理的に会合させることもできる。US20040171794は血清アルブミンにタンパク質を物理的に会合させるための例示される方法を記載している。例えばヒトアルブミンの配列またはそのフラグメント、EP201239、EP322094WO97/24445、WO95/23857、特に米国特許20040171794およびWO01/79480の配列番号18に示されるヒトアルブミンの成熟型、または、他の脊椎動物由来のアルブミンまたはそのフラグメント、またはこれ等の分子の類縁体または変異体、またはそのフラグメントが例示される。他の例示されるヒト血清アルブミンタンパク質は以下のセットの点突然変異、Leu−407〜Ala、Leu−408〜Val、Val−409〜Ala、およびArg−410〜Ala;またはArg−410〜Ala、Lys−413〜Glu、およびLys−414〜Gln(例えば国際公開WO95/23857およびUS20040171794の配列番号18参照)の1つまたは両方を包含することができる。
(アプタマー)
一実施形態において、本発明は標的タンパク質結合剤、例えばアプタマーを特徴とする。核酸「アプタマー」という用語は本明細書においては、少なくとも5ヌクレオチドの内部非二重らせん核酸構造を包含するコンホーメーションを有する核酸分子を指す。アプタマーは自己相補性の領域を有する1本鎖核酸分子であることができる。例示されるアプタマーは核酸以外の標的分子に、例えばTie1、Tie2またはAngに結合する核酸分子を包含する。特定のアプタマーはまたTie複合体の形成を調節するか、または、本明細書に記載した標的結合剤の特性1つ以上を有してよく、そして標的結合タンパク質の代わりに使用できる。
一実施形態において、本発明は標的タンパク質結合剤、例えばアプタマーを特徴とする。核酸「アプタマー」という用語は本明細書においては、少なくとも5ヌクレオチドの内部非二重らせん核酸構造を包含するコンホーメーションを有する核酸分子を指す。アプタマーは自己相補性の領域を有する1本鎖核酸分子であることができる。例示されるアプタマーは核酸以外の標的分子に、例えばTie1、Tie2またはAngに結合する核酸分子を包含する。特定のアプタマーはまたTie複合体の形成を調節するか、または、本明細書に記載した標的結合剤の特性1つ以上を有してよく、そして標的結合タンパク質の代わりに使用できる。
選択されたアプタマーを標準的な核酸増幅操作法により回収できるため、アプタマーをインビトロでスクリーニングすることができる。方法は例えば選択の後期の回において、選択されたアプタマーをプールに分割し、そしてプール内の各アプタマーを蛍光団のような検出可能な標識で修飾することにより増強することができる。標識の特性を機能的に改変するアプタマーを有するプールを発見することができる。このようなプールを反復して分割し、再分析することにより、所望の特性を有する個々のアプタマーを発見することができる(例えばJhaveri et al.,Nature Biotechnol.18:1293参照)。
更に又、アプタマーをスクリーニングしてインビボの活性の有るもの得ることができる。例えば夾雑状態の核酸は、細胞内に導入された発現ベクター内にクローニングすることができる。発現された夾雑状態の核酸から得られるRNAアプタマーをスクリーニングして生物学的活性のあるものを得ることができる。活性を有する細胞を単離して選択されたRNAアプタマーに関する発現ベクターを回収することができる。
治療用オリゴマー(例えばアプタマー)の重要な特徴は投与されたオリゴマーの骨格の設計である。一部の実施形態においては、インビボで安定であり、オリゴマーがホスホジエステル結合を攻撃するヌクレアーゼのような内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるような構造のヌクレオシド内結合を骨格は含有する。同時に、オリゴマーは標的DNAまたはRNAにハイブリダイズするその能力を保持している(Agarwal,K.L.et al.(1979)Nucleic Acids Res.6:3009;Agarwal,S.et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:7079)。修飾されたオリゴヌクレオチドは代替となるヌクレオシド結合を用いて構築できる。これ等の例示される結合の数種はUhlmann,E. and Peyman,A.(1990)Chemical Reviews 90:543−584に記載されている。これ等に包含されるものは、メチルホスホネート(リン結合酸素の1つがメチルにより置き換えられているもの);ホスホロチオエート(イオウがこれ等の酸素の1つを置き換えている)および種々のアミデート(NH2または有機アミン誘導体、例えばモルホリデートまたはピペラジデートが酸素を置き換えている)である。これ等の置換により増強された安定性が得られる。WO91/15500はヌクレオシド内結合の1つ以上がイオウ系の結合、典型的にはホスホジエステルと同配性および等電性であるスルファメートジエステルで置き換えられている種々のオリゴヌクレオチド類縁体を記載している。WO89/12060は同様にスルフィド、スルホキシドおよびスルホンを含有する結合を開示している。WO86/05518は立体規則性重合体3’,5’結合の変異体を示唆している。米国特許5,079,151は2’,5’ホスホジエステル結合を介して1本鎖DNAに連結している分枝鎖RNAのmsDNA分子を開示している。米国特許5,264,562は式Y’CX’2Y’(ただし式中Y’は独立してOまたはSであり、そして各X’は安定化置換基であり独立して選択されるものである)の修飾された結合を記載している。モルホリノ型のヌクレオチド内結合は米国特許5,034,506に記載されており、一部の場合においては相補標的配列に対するオリゴマーの増大した親和性を与える。米国特許5,264,562および5,596,086は標的RNAおよびDNAへの強力なハイブリダイゼーションが可能な修飾されたヌクレオチド結合を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを開示している。
(処置)
Tie1、Tie2またはAngに結合する結合因子は、治療的および予防的有用性を有する。例えば、これらの結合因子は培養中、例えばインビトロまたはエクスビボで細胞に投与して、または被験体に例えばインビボで投与して、内皮細胞障害、血管発達障害、傷の治癒、炎症疾患および癌、特に転移性癌等の多様な障害の処置、予防および/または診断を行い得る。用語「処置する」または「処置」とは、因子を単独または一つ以上の他の因子(例えば第二因子)と組み合わせて被験体、例えば患者、例えば、疾患(例えば、本明細書中に記載される障害)、障害の症状または障害に対する疾病素質を有する患者に、例えば、障害、障害の症状または障害に対する疾病素質を治療、治癒(heal)、緩和、軽減、変化、矯正、改善、向上または影響するための、適用または投与をいう。細胞を処置するとは、細胞の活性の減少、例えば、細胞の管または脈管を形成する能力の減少をいう。減少は、活性の全体的な除去を必ずしも必要としないが、細胞の活性または数の減少、例えば統計的に有意な減少を必要とする。
Tie1、Tie2またはAngに結合する結合因子は、治療的および予防的有用性を有する。例えば、これらの結合因子は培養中、例えばインビトロまたはエクスビボで細胞に投与して、または被験体に例えばインビボで投与して、内皮細胞障害、血管発達障害、傷の治癒、炎症疾患および癌、特に転移性癌等の多様な障害の処置、予防および/または診断を行い得る。用語「処置する」または「処置」とは、因子を単独または一つ以上の他の因子(例えば第二因子)と組み合わせて被験体、例えば患者、例えば、疾患(例えば、本明細書中に記載される障害)、障害の症状または障害に対する疾病素質を有する患者に、例えば、障害、障害の症状または障害に対する疾病素質を治療、治癒(heal)、緩和、軽減、変化、矯正、改善、向上または影響するための、適用または投与をいう。細胞を処置するとは、細胞の活性の減少、例えば、細胞の管または脈管を形成する能力の減少をいう。減少は、活性の全体的な除去を必ずしも必要としないが、細胞の活性または数の減少、例えば統計的に有意な減少を必要とする。
本明細書中で使用される場合、疾患を処置するのに有効な結合因子の量、または「治療有効量」とは、被験体に対する一回または複数回の投与の際に、細胞、例えば内皮細胞(例えば、Tie1発現内皮細胞)または癌細胞(特にその転移細胞)を処置するのに、または、そのような処置のない場合に期待される以上に、治癒を長期化し、本明細書中に記載される障害を有する被験体を緩和、救済または改善するのに有効な結合因子の量をいう。ある場合には、治療有効量は、結合因子の、処置されないコントロールマウスと比較して、ヌードマウスモデルにおける異種移植片の腫瘍の大きさを低下させる能力を評価することにより確定し得る。本明細書中で使用される場合、腫瘍もしくは他の新生物の「成長の阻害」は、その成長および転移を遅延、中断、阻止または停止することをいい、必ずしも新生物成長の全体的な除去を示すものではない。
本明細書中で使用される場合、障害を予防するのに有効な標的結合因子の量、または標的結合因子の「予防有効量」は、被験体に対する一回または複数回の投与の際に、疾患(例えば内皮細胞関連障害、血管発達障害、炎症性疾患または癌)の発生または再発を防止または遅延するのに有効である標的結合因子、例えば、Tie1結合タンパク質(例えば、本発明中に記載のTie1結合抗原)の量を意味する。
治療することができる被験体はヒトおよび非ヒト動物を包含する。例えばヒトは異常な細胞増殖または細胞分化を特徴とする障害を有するヒト患者であることができる。「非ヒト動物」という用語は全ての脊椎動物、例えば非哺乳類(例えばニワトリ、両生類、爬虫類)および哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ等を包含する。
本明細書に記載した結合剤は例えば癌(例えば固形腫瘍)または新脈管形成関連障害を治療するために被験体において新脈管形成を低減するために使用できる。方法は例えば新脈管形成、障害の症状、または障害の進行を調節するために十分な量で患者に結合剤を投与することを包含する。薬剤(例えばTie1結合タンパク質、例えば抗Tie1抗体、例えばE3)は治療有効量が達成される前に複数回(例えば少なくとも2、3、5または10回)投与してよい。
結合剤、例えばTie1結合タンパク質は、癌の治療または防止のために使用できる。一実施形態において、Tie1結合タンパク質によるTie1活性の低減は腫瘍の近傍および周囲の新脈管形成を低減または防止することができ、これにより、腫瘍の生育を低減または防止する。別の実施形態においては、新生物は異常に増殖している内皮細胞または造血細胞を包含する。Tie1結合タンパク質は癌細胞自体を調節するため、例えばTie1を発現する新生物性の細胞を殺傷または除去するために使用できる。例えば細胞は造血細胞である。
処置され得る癌の例として、これらに限定されないが、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移病巣が挙げられる。固形腫瘍の具体例として、多様な器官系の悪性腫瘍、例えば肉腫、腺癌および癌腫、例えば、肺、胸、リンパ管、胃腸(例えば、結腸)および尿生殖器管(例えば、腎臓細胞、尿路上皮細胞)、咽頭、前立腺、卵巣に影響を与える腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えばほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞腺癌、肝臓癌、肺の非小細胞腺癌、小腸の癌等の腺癌を含む。また、上記癌の転移病巣を、本明細書中に記載されるTie1結合タンパク質および他の因子を使用して、処置または予防し得る。
処置され得る固形腫瘍の更なる例として、多様な器官系の悪性腫瘍、例えば肺、胸、リンパ節、胃腸(例えば結腸)および尿性器管、前立腺、卵巣、咽頭に影響を与える腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えばほとんどの結腸癌、腎臓細胞癌腫、前立腺癌および/または精巣癌、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌等の腺癌を治療するために有用でありうる。治療可能な例示的な固体腫瘍として、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、Ewing腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃腸系癌腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、泌尿生殖細胞系癌腫、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌腫、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、内分泌系癌、睾丸腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、非小細胞癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。
また、Tie1結合タンパク質を使用して、造血組織起源の過形成性/新生細胞、例えば、骨髄、リンパ球または赤血球系列に由来する細胞、またはその前駆細胞、特にTie1を発現するような細胞の増殖を阻害し得る。例えば、本明細書中に記載される結合タンパク質を、これらに限定されないが、急性前骨髄白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)および慢性骨髄性白血病(CML)(Vaickus,L.(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol.11:267−97に概説)等の、多様な骨髄障害の処置に使用し得る。処置され得るリンパ系悪性腫瘍として、これらに限定されないが、急性リンパ芽球白血病(ALL)、例えば、B由来ALLとT由来ALL、慢性リンパ性白血病(CLL)、前リンパ性白血病(PLL)、ヘアリーセル白血病(HLL)およびWaldenstromのマクログロブリン血症(WM)が挙げられるが、これらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなる形態として、非ホジキンスリンパ腫およびその変種、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大顆粒リンパ性白血病(LGF)ならびにホジキンス病が挙げられるが、これらに限定されない。Tie1は急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群(Verstovsek et al.2001,Leuk,Lmphoma)、B細胞慢性リンパ性白血病(Aguayo et al,2001.Leukemia Research 25(4):279−85.)において上方調節されることが示されるので、Tie1と相互作用する結合タンパク質を使用して、これら疾病の検出、処置または予防し得る。
従って、造血系障害、例えば造血系の癌を有するか、その危険性のある被験体を、Tie1結合タンパク質、例えばTie1ホモ二量体化を増大させるTie1結合タンパク質、またはTie複合体形成に拮抗する結合タンパク質を投与することにより治療することができる。例えばTie1結合タンパク質は抗Tie1抗体、例えば本明細書に記載した抗体であることができる。結合タンパク質の投与は例えば1回より多い投薬を用いながら治療濃度を達成するための複数回投与を包含できる。例えば、投与は約週一回、2日毎または3日毎等とすることができる。
Tie1と結合するタンパク質および他の因子を投与する方法は、「薬学的組成物」にも記載される。使用される分子の適切な投薬量は、被験体の年齢および体重ならびに使用される特定の薬剤に依存する。結合タンパク質を、望ましくない相互作用、例えば、天然または病理学的因子とTie1との間の相互作用を阻害、減少させる競合因子として使用し得る。
一実施形態において、Tie1結合タンパク質を使用して、細胞、例えば、内皮細胞をインビボで阻害する(例えば、細胞の少なくとも一つの活性を阻害し、増殖、移動、成長または生存力を低下させる)。結合タンパク質はそれだけで使用し得、または因子(例えば細胞毒薬物、細胞毒酵素、または放射性同位体と複合体化して使用し得る。この方法は、結合タンパク質をそれのみ、または細胞毒薬物と結合させて、そのような処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する。
Tie1結合タンパク質はTie1発現内皮細胞を認識し、そして癌細胞、例えば癌性の肺、肝臓、結腸、***、卵巣、上皮、喉頭および軟骨の細胞、そして特にその転移性の細胞に会合している(例えばその近接部にあるか、それと混在している)内皮細胞に結合することができるため、Tie1結合タンパク質は何れかのこのような細胞を阻害(例えば少なくとも1つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷)し、そして新脈管形成を阻害するために使用できる。癌近傍の内皮細胞活性を低減することは栄養、生育シグナル等に関して内皮細胞に依存している可能性の有る癌細胞を間接的に阻害(例えば少なくとも1つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷)することができる。
或いは、結合タンパク質は癌性の細胞の周辺の細胞に結合するが、癌性の細胞を直接または間接的に阻害(例えば少なくとも1つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷)するために十分癌性の細胞に接近している。即ち、Tie1結合タンパク質(例えば毒素で、例えば細胞毒で修飾されている)を用いて選択的に阻害(例えば癌性の組織における細胞を殺傷または除去)することができる(癌性の細胞自体および癌と会合しているかそれを侵襲している内皮細胞)。
結合タンパク質は種々の細胞毒性薬品、例えば治療薬、放射線を発する化合物、植物、カビまたは細菌を起源とする分子、生物学的タンパク質およびこれ等の混合物を送達するために使用してよい。細胞毒性薬品は細胞内で作用する細胞毒性薬剤、例えば毒素、短レンジ放射線発射物質、例えば短レンジ高エネルギーα線発射物質であることができる。
正常、良性の過形成性または癌性の細胞を殺傷または除去するためには、第1の結合タンパク質を、プロドラッグ活性化物質の近傍に存在する場合のみ活性化されるプロドラッグにコンジュゲートする。プロドラッグ活性化物質は第2の結合タンパク質、好ましくは標的分子上の非競合部位に結合するものにコンジュゲートする。2つの結合タンパク質が競合または非競合の結合部位に結合するかどうかは、従来の競合結合試験により調べることができる。例示される薬品−プロドラッグの対はBlakely et al.,(1996)Cancer Research,56:3287−3292に記載されている。
天然の補体依存性細胞毒性(CDC)または抗体依存性細胞毒性(ADCC)を介して抗原発現細胞を排除するためにTie1結合タンパク質をインビボで直接使用することができる。本明細書に記載した結合タンパク質は補体結合エフェクタードメイン、例えばIgG1、2または3のFc部分、または補体に結合するIgMの相当する部分を包含できる。一実施形態において、標的細胞の集団には本明細書に記載した結合剤および適切なエフェクター細胞をエクスビボで投与する。投与は補体または補体を含有する血清を添加することにより補給できる。更に本明細書に記載した結合タンパク質をコーティングした標的細胞の貪食作用は補体タンパク質の結合により向上させることができる。別の実施形態においては、補体結合エフェクタードメインを包含する結合タンパク質をコーティングした標的細胞を補体により溶解する。
癌を治療するための本明細書に記載した治療方法の使用は多くの利点を有する。Tie1の発現は腫瘍への栄養および酸素の供給を増大させるように血管およびリンパ管を包含する脈管構造の変化を刺激する腫瘍内部で生じる低酸素シグナルに応答して誘導される場合がある。特定のTie1結合タンパク質(例えばE3および関連抗体)はそれらが腫瘍の脈管構造の変化を阻害することができ、そして腫瘍内圧力の低下を誘発する可能性があるため、特に有効である場合がある。これ等の薬剤はまた従来の薬剤が腫瘍内に浸透することが困難であった状況において治療薬として非常に適している。更に又、Tie1結合タンパク質は造血を無影響下におくことができる。治療は臨床パラメーターを用いて有効にモニタリングできる。或いは、これ等のパラメーターを用いてそのような治療を何時使用すべきかを示すことができる。
Tie1結合タンパク質、例えばTie1ホモ二量体化を増大させるTie1結合タンパク質またはTie複合体形成に拮抗する結合タンパク質を被験体に投与することにより炎症性障害、例えば乾癬または関節リウマチを治療または防止することができる。
乾癬。乾癬は鱗片形成および炎症を特徴とする慢性の皮膚疾患である。乾癬が発症すると、典型的には皮膚のパッチが肥厚化、赤化し、そしてプラークと称される銀色味を帯びた鱗片で被覆されるようになる。乾癬は最も頻繁には肘、膝、頭皮、下部背面、顔面、手掌および足裏に生じる。疾患は又、手爪、足爪および口と生殖器の内部の軟組織に生じる場合も有る。乾癬患者の約10%が関節炎の症状をもたらす関節の炎症を有している。患者は統計Physician Global Assessment(sPGA)を用いて評価でき、そして、軽度〜極めて重度の6カテゴリの範囲のカテゴリ評点を受ける。評点はプラーク、鱗片化および紅斑に基づく。本発明の治療方法を用いてこれ等の指標の少なくとも1つの改善を達成することができる。
関節リウマチ(RA)は疼痛、浮腫、強直、および、主に関節機能の消失を誘発する慢性炎症性疾患である。RAは頻繁には滑膜、即ち保護嚢を形成している関節を包囲する膜において発症する。RAに罹患した多くの個体において白血球が循環系から滑膜に浸潤し、連続した異常な炎症(例えば滑膜炎)を誘発する。その結果、滑膜が炎症を起こし、発熱、赤色化、浮腫および疼痛を誘発する。軟骨内のコラーゲンが徐々に破壊され、関節空間が狭小化し、最終的には骨を損傷する。炎症は罹患領域に糜爛性の骨損傷を生じさせる。この過程の間、滑膜の細胞が成長し、異常に***し、正常では薄膜である滑膜を肥厚化し、そして浮腫を有する腫脹した触感の関節をもたらす。RAは種々の臨床的尺度で評価することができる。一部の例示される指標は総Sharp評点(TSS)、Sharp糜爛評点およびHAQ障害指数を包含する。本発明の治療方法を用いてこれ等の指標の少なくとも1つの改善を達成することができる。
Tie1結合タンパク質(例えばTie1のホモ二量体化を増大させるTie1結合タンパク質)またはTie複合体形成に拮抗する結合タンパク質を被験体に投与することにより網膜の障害、例えば増殖性網膜症、例えば糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、または未熟児網膜症;脈絡膜新生血管形成;水晶体新生血管形成;角膜新生血管形成;虹彩新生血管形成;または結膜新生血管形成を治療または防止することができる。結合タンパク質は病的な眼の新生血管形成に関連する網膜剥離の危険性を低減するために使用できる。一部の場合においては、結合タンパク質は結膜下投与により投与される。
(併用療法)
本明細書に記載した結合タンパク質は癌を治療するための他の治療法、例えば手術、放射線療法および化学療法の1つ以上と組み合わせて投与できる。例えばTie複合体形成に拮抗するか、またはTieシグナリング活性を調節するタンパク質(例えばTie1ホモ二量体化および/またはリン酸化を促進するタンパク質)はまた他の抗癌療法、例えば放射線療法、化学療法、手術または第2の薬剤の投与と組み合わせて使用できる。例えば第2の薬剤はVEGFのシグナリング経路にターゲティングするか、負の調節を行うものであることができる。この後者のクラスの例はVEGF拮抗剤(例えば抗VEGF抗体、例えばベバシズマブ)およびVEGFレセプター拮抗剤(例えば抗VEGFレセプター抗体)を包含する。1つの特定の組み合わせはベバシズマブを包含する。組み合わせは更に5−FUおよびロイコボリンおよび/またはイリノテカンを包含できる。
本明細書に記載した結合タンパク質は癌を治療するための他の治療法、例えば手術、放射線療法および化学療法の1つ以上と組み合わせて投与できる。例えばTie複合体形成に拮抗するか、またはTieシグナリング活性を調節するタンパク質(例えばTie1ホモ二量体化および/またはリン酸化を促進するタンパク質)はまた他の抗癌療法、例えば放射線療法、化学療法、手術または第2の薬剤の投与と組み合わせて使用できる。例えば第2の薬剤はVEGFのシグナリング経路にターゲティングするか、負の調節を行うものであることができる。この後者のクラスの例はVEGF拮抗剤(例えば抗VEGF抗体、例えばベバシズマブ)およびVEGFレセプター拮抗剤(例えば抗VEGFレセプター抗体)を包含する。1つの特定の組み合わせはベバシズマブを包含する。組み合わせは更に5−FUおよびロイコボリンおよび/またはイリノテカンを包含できる。
「併用」という用語は同じ患者を治療するために2つ以上の薬剤または療法を使用することを指し、ここで薬剤または療法の使用または作用は時間的にオーバーラップする。薬剤または療法は同時(例えば患者に投与される単一の製剤として、または、同時に投与される2つの別個の製剤として)または何れかの順序で逐次的に投与することができる。逐次的投与は異なる時間に行われる投与である。1つの薬剤と別の薬剤の投与の間の時間は数分、数時間、数日または数週間であることができる。本明細書に記載したTie1結合タンパク質の使用はまた、別の治療薬の投薬量を低減するため、例えば投与される別の薬剤に関わる副作用を低減するため、例えばベバシズマブのような抗VEGF抗体の副作用を低減するために使用できる。従って、複合とはTie1結合タンパク質非存在下で使用されるものよりも少なくとも10、20、30または50%低用量で第2の薬剤を投与することを包含することができる。
更に又、被験体は第1および第2の薬剤を投与することにより新脈管形成関連障害に対して治療されることができる。例えば、第1の薬剤は早期の段階の新脈管形成を調節し、そして第2の薬剤はその後の段階の新脈管形成を調節するか、またはやはり早期の段階の新脈管形成を調節する。第1および第2の薬剤は単一の薬学的組成物を用いて投与するか、別個に投与することができる。一実施形態において、第1の薬剤はVEGF経路拮抗剤(例えばVEGFの阻害剤(例えばVEGF−A、−Bまたは−C)またはVEGFレセプター(例えばKDRまたはVEGFレセプターIII(Flt4))またはbFGF経路拮抗剤(例えばbFGFに結合する抗体またはbFGFレセプター)である。他のVEGF経路拮抗剤もまた本明細書中または別途記載されている。一実施形態において、第2の薬剤は腫瘍内において、血管の組立および安定化を阻害または低減し、血管またはリンパ管の維持を妨害し、或いはリンパ管の分布を改変する。例えば、第2の薬剤はTie複合体の形成を阻害するか、またはTie1ホモ二量体化を促進するものを包含する。例えば第2の薬剤は本明細書に記載したTie1結合タンパク質である。
腫瘍が特定の大きさ(例えば〜1〜2mm)に達すれば、腫瘍はその体積を増大させる前に新しい脈管構造を必要とする。腫瘍新脈管形成の早期の段階は、宿主からの新しい血管の生育および血管による腫瘍の浸潤を刺激するための腫瘍からのシグナル、例えばVEGFの分泌を包含する。例えばVEGFは内皮細胞の増殖を刺激し、これが次に組立てられて血管となる。腫瘍新脈管形成の後期の段階は血管の組立および安定化をもたらすシグナルを包含できる。この組立および安定化には内皮細胞と血管の内皮細胞を包囲する血管周囲細胞との間の相互作用が関与している。例えばTie1は血管の組立および安定化において、および、血管周囲細胞と内皮細胞の間の会合の維持において、役割を果たしている。即ち、新脈管形成関連障害を治療するための効果的な治療には新脈管形成の早期の段階を調節する薬剤(例えばVEGF経路拮抗剤、例えば抗VEGF(例えばベバシズマブ)または抗VEGFレセプター(例えば抗KDR)抗体;または他の前脈管形成経路の拮抗剤、例えば抗bFGF抗体または抗bFGFレセプター(例えば抗bFGFレセプター−1、−2または−3)抗体)および腫瘍新脈管形成の後期の段階を調節する薬剤(例えばTie1の拮抗剤(例えば抗Tie1抗体(例えば本明細書に記載した抗体、例えばE3抗体))またはTie2の拮抗剤(例えば抗Tie2抗体)またはAngの抗体(例えば抗Ang抗体(例えば抗Ang2抗体)または抗Ang2ペプチド(例えば阻害性Ang2ペプチド))の組み合わせが関与する。これ等の薬剤の1つ以上を組み合わせて使用する。これ等の薬剤の1つ以上はまた他の抗癌療法、例えば放射線療法または化学療法と組み合わせて使用してよい。
例示されるVEGFレセプター拮抗剤はVEGFレセプターチロシンキナーゼの活性の阻害を包含する。4−[4−(1−アミノ−1−メチルエチル)フェニル]−2−[4−(2−モルホリン−4−イル−エチル)フェニルアミノ]ピリミジン−5−カルボニトリル(JNJ−17029259)は血管内皮成長因子レセプター−2(VEGF−R2)の経口使用可能な選択的ナノモル阻害剤である5−シアノピリミジンの構造クラスの1つである。別の例にはPIK−787/ZK22584(Astra−Zeneca)、SU5416、SU11248(Pfizer)およびZD6474([N−(4−ブロモ−2−フルオロフェニル)−6−メトキシ−7−[(1−メチルピペリジン−4−イル)メトキシ]キナゾリン−4−アミン])を包含する。Tie1結合タンパク質と組み合わせて使用できる更に他の薬剤は広域特異性のチロシンキナーゼ阻害剤、例えばSU6668である。例えばBergers,B.et al.(2003)J.Clin.Invest.111,1287−1295を参照できる。
第二の物質または治療法は、別の抗癌剤または治療法であり得る。抗癌剤の非限定的な例として、例えば、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害物質、代謝拮抗物質、***阻害物質、アルキル化剤、挿入剤、シグナル伝達経路に干渉可能な物質、アポトーシスを促進する物質、放射線、および他の腫瘍関連抗原に対する抗体(ネイキッド(naked)抗体、免疫毒素および放射性複合体を含む)が挙げられる。特定のクラスの抗癌剤の例を、以下に詳細に提供する:抗チューブリン/抗微小管(例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール);トポイソメラーゼI阻害物質(例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトザントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アンサクリン、エピルビシン、メルバロン(merbarone)、塩酸ピロキサントロン);代謝拮抗物質(例えば、5−フルオロウラシル(5−FU)、メトトレキセート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン/Ara−C、トリメトレキサート、ゲンシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン(pyrazofurin)、N−ホスホルアセチル−L−アスパレート=PALA、ペントスタチン、5−アザシチジン、5−アザ2’−デオキシシチジン、アラ−A、クラドリビン(cladribine)、5−フルオロウリジン、FUDR、チアゾフリン、N−[5−[N−(3,4−ジヒドロ−2−メチル−4−オキソキナゾリン−6−イルメチル)−N−メチルアミノ]−2−テノイル]−L−グルタミン酸;アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ミトマイシンC、BCNU=カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロランブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、窒素マスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、4−イポメアノール(ipomeanol);他の作用機構により作用する物質、例えば、ジヒドロレンペロン、スピロムスチンおよびデシペプチド;インターフェロン等の例えば抗腫瘍応答を増強する生物学的応答改変剤;アクチノマイシンD等のアポトーシス物質;および抗ホルモン、例えば、タモキシフェン等の抗エストロゲン、または例えば、4’−シアノ−3−(4−フルオロフェニルスルホニル)−2−ヒドロキシ−2−メチル−3’−(トリフルオロメチル)プロピオンアニリドなどの抗アンドロゲン。
併用療法は他の療法の副作用を低減する薬剤を投与することを包含してよい。薬剤は抗癌治療の副作用を低減する薬剤であることができる。例えば薬剤はロイコボリンであることができる。
Tie1結合タンパク質または本明細書に記載した他の結合タンパク質を投与することを包含する併用療法はまた別の新脈管形成関連障害(例えば癌以外の障害、例えば望ましくない内皮細胞増殖または望ましくない炎症が関わっている障害、例えば関節リウマチ)を有するかその危険性を有する被験体を治療するために使用できる。
(診断用途)
Tie1に結合する結合タンパク質(例えば、抗体、例えば本明細書中に記載される抗体)は、インビトロおよびインビボの診断、治療および予防の有用性を有する。
Tie1に結合する結合タンパク質(例えば、抗体、例えば本明細書中に記載される抗体)は、インビトロおよびインビボの診断、治療および予防の有用性を有する。
一つの局面において、本発明はTie1の存在を、インビトロ(例えば、組織、生検等のサンプル、例えば癌組織等の生物学的サンプル)またはインビボ(例えば、被験体者におけるインビボ画像化)で検出する診断方法を提供する。本方法は、(i)サンプルをTie結合タンパク質に接触させ;そして(ii)Tie1結合タンパク質とサンプルとの複合体の形成を検出する工程を包含する。この方法はまた、参照サンプル(例えば、コントロールサンプル)を結合タンパク質に接触させ、参照サンプルに対する複合体形成と比較した場合の結合タンパク質とサンプルとの複合体形成の程度を決定する工程を包含し得る。コントロールサンプルまたは被験体と比較した場合のサンプル中または被験体中の複合体の形成の変化、例えば統計的に有意な変化は、サンプル中のTie1の存在を示し得る。Tie1結合タンパク質は、結合または非結合の抗体の検出を容易とする検出可能な物質で、直接的または間接的に標識し得る。適切な検出可能な物質として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射活性物質が挙げられる。
Tie1結合タンパク質とTie1との複合体形成は、Tie1と結合する結合タンパク質かまたは非結合タンパク質のいずれかを測定または可視化することにより検出し得る。従来的な検出アッセイ、例えば酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)または組織免疫組織化学を使用し得る。さらにTie1結合タンパク質を標識するために、サンプル中のTie1の存在を、検出可能な物質で標識したスタンダードおよび非標識Tie1結合タンパク質を利用して競合免疫アッセイによって検定し得る。このアッセイの一例において、生物学的サンプル、標識スタンダードおよびTie1結合因子を合わせ、非標識結合タンパク質と結合した標識スタンダードの量を決定する。サンプル中のTie1の量は、Tie1結合因子に結合した標識スタンダードの量に逆比例する。
蛍光体および発色基標識結合タンパク質を調製し得る。抗体および他のタンパク質は、約310nmまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光部分は310nmを超える波長、好ましくは400nmを超える波長において、実質的な吸収を有するように選択されるべきである。多様な適切な蛍光体および発色基が、Stryer(1968)Science,162:526およびBrand,L.et al.(1972)Annual Review of Biochemistry,41:843−868に記載されている。結合タンパク質を、従来的な手順、例えば米国特許第3,940,475号、米国特許第4,289,747号および米国特許第4,376,110号に記載される手順により蛍光発色基で標識し得る。上記の所望の多くの性質を有する蛍光体の一方のグループは、フルオレセインおよびローダミンを含むキサンテン染料である。蛍光化合物のもう一方のグループはナフチルアミンである。蛍光体または発色基でいったん標識すると、結合タンパク質は、例えば蛍光顕微鏡(共焦点またはデコンボリューション顕微鏡等)を使用して、サンプル中のTie1の存在または位置を検出するために使用し得る。
(組織学的分析)
本明細書中に記載される結合タンパク質を使用して、免疫組織化学を実施し得る。例えば、抗体の場合、抗体を標識(例えば精製タグまたはエピトープタグ)を用いて合成するか、または標識または標識結合基を複合化することにより脱離可能に標識し得る。例えば、キレーターを抗体に連結し得る。次いでこの抗体を、例えば顕微鏡スライドグラス上の組織の固定片である組織学的調製物に接触させる。結合のためのインキュベーション後に、調製物を洗浄して非結合抗体を除去する。次いで調製物を、例えば顕微鏡を使用して分析して、抗体が調製物に結合したかどうかを同定する。該方法は、内皮細胞または内皮細胞により形成された組織、例えば血管を評価するために使用し得る。抗体(または他のポリペプチドもしくはペプチド)は、結合時に非標識であり得る。結合および洗浄後、抗体を標識して検出し得るようにする。
本明細書中に記載される結合タンパク質を使用して、免疫組織化学を実施し得る。例えば、抗体の場合、抗体を標識(例えば精製タグまたはエピトープタグ)を用いて合成するか、または標識または標識結合基を複合化することにより脱離可能に標識し得る。例えば、キレーターを抗体に連結し得る。次いでこの抗体を、例えば顕微鏡スライドグラス上の組織の固定片である組織学的調製物に接触させる。結合のためのインキュベーション後に、調製物を洗浄して非結合抗体を除去する。次いで調製物を、例えば顕微鏡を使用して分析して、抗体が調製物に結合したかどうかを同定する。該方法は、内皮細胞または内皮細胞により形成された組織、例えば血管を評価するために使用し得る。抗体(または他のポリペプチドもしくはペプチド)は、結合時に非標識であり得る。結合および洗浄後、抗体を標識して検出し得るようにする。
(タンパク質アレイ)
Tie1結合タンパク質は、タンパク質アレイ上に固定化し得る。タンパク質アレイを診断ツールとして、例えば医学的サンプル(例えば、単離された細胞、血液、血清、生検サンプル等)をスクリーニングし得る。勿論、タンパク質アレイはまた、例えばTie1または他の標的分子(例えばヒアルロン酸)に結合する他の結合タンパク質を含み得る。
Tie1結合タンパク質は、タンパク質アレイ上に固定化し得る。タンパク質アレイを診断ツールとして、例えば医学的サンプル(例えば、単離された細胞、血液、血清、生検サンプル等)をスクリーニングし得る。勿論、タンパク質アレイはまた、例えばTie1または他の標的分子(例えばヒアルロン酸)に結合する他の結合タンパク質を含み得る。
ポリペプチドアレイを生成する方法は、例えば、De Wildt et al.(2000)Nat.Biotechnol.18:989−994;Lueking et al.(1999)Anal.Biochem.270:103−111;Ge(2000)Nucleic Acids Res.28,e3,I−VII;MacBeath and Schreiber(2000)Science 289:1760−1763;WO01/40803およびWO99/51773A1に記載されている。アレイ用ポリペプチドは、例えば市販のロボット装置を使用して、高速でスポットし得る。アレイ基板は、例えばニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば表面改変ガラスであり得る。このアレイは、多孔性マトリックス、例えばアクリルアミド、アガロースまたは別のポリマーを含み得る。
例えばアレイは、例えば上記のDe Wildtに記載されるような抗体のアレイであり得る。結合タンパク質を作る細胞は、配列された(arrayed)フォーマットでフィルター上に生育し得る。ポリペプチド産生を誘導し、発現されたポリペプチドをフィルターに細胞位置で固定化する。タンパク質アレイを、標識標的に接触させて、各固定化ポリペプチドに対する標的の結合程度を決定し得る。標的が非標識の場合、例えば、標識プローブを使用するサンドイッチ法を使用して非標識標的の結合を検出し得る。アレイの各アドレスでの結合の程度に関する情報は、プロフィールとして、例えばコンピュータデータベースに保存し得る。タンパク質アレイを複製して、これを使用して、例えば標的および非標的の結合プロフィールを比較し得る。
(FACS(蛍光活性化細胞選別))
標的結合タンパク質を使用して、細胞(例えばサンプル(例えば、患者サンプル)中の細胞)を標識し得る。この結合タンパク質はまた、蛍光化合物に連結している(または連結可能である)。次いで、これらの細胞を、蛍光活性化細胞選別(例えば、Becton Dickinson Immunocytometry Systems,San Jose CAから入手可能な選別機を使用する;US5,627,037;5,030,002;および5,137,809も参照)を使用して選別し得る。細胞が選別機を通過するに際に、レーザービームが蛍光化合物を励起し、検出器が通過する細胞の数を計数し、蛍光化合物が細胞に連結しているかどうかを蛍光を検出することにより決定する。各細胞に結合した標識の量を定量し、分析してサンプルを特性付け得る。
標的結合タンパク質を使用して、細胞(例えばサンプル(例えば、患者サンプル)中の細胞)を標識し得る。この結合タンパク質はまた、蛍光化合物に連結している(または連結可能である)。次いで、これらの細胞を、蛍光活性化細胞選別(例えば、Becton Dickinson Immunocytometry Systems,San Jose CAから入手可能な選別機を使用する;US5,627,037;5,030,002;および5,137,809も参照)を使用して選別し得る。細胞が選別機を通過するに際に、レーザービームが蛍光化合物を励起し、検出器が通過する細胞の数を計数し、蛍光化合物が細胞に連結しているかどうかを蛍光を検出することにより決定する。各細胞に結合した標識の量を定量し、分析してサンプルを特性付け得る。
この選別機は、細胞を偏向させ、結合タンパク質に結合した細胞を、結合タンパク質に結合しない細胞から分離し得る。分離された細胞を、培養および/または特性付け得る。
(インビボ画像化)
さらに別の実施形態において、本発明は、Tie1を発現する癌組織の存在をインビボで検出する方法を提供する。この方法は、被験体にTie1結合タンパク質を投与する工程;および被験体においてTie1結合タンパク質を検出する工程を包含する。この検出工程は、複合体の位置または形成の時期を決定する工程を包含し得る。この方法は、被験体(例えば、被験体の体の部位)をスキャン、そうでない場合は画像化する工程を包含し得る。別の方法は、(i)被験体(例えば、癌または腫瘍性障害を有する患者)に検出可能なマーカーと複合化したTie1結合抗体を投与し;(ii)被験体を、Tie1発現組織または細胞に対するこの検出可能なマーカーを検出する手段に供する工程を包含する。例えば、この方法を使用して、血管または内皮細胞(例えばTie1発現内皮細胞)の位置を可視化し得る。被験体を、例えば、NMRまたは他の断層撮影手段により画像化し得る。
さらに別の実施形態において、本発明は、Tie1を発現する癌組織の存在をインビボで検出する方法を提供する。この方法は、被験体にTie1結合タンパク質を投与する工程;および被験体においてTie1結合タンパク質を検出する工程を包含する。この検出工程は、複合体の位置または形成の時期を決定する工程を包含し得る。この方法は、被験体(例えば、被験体の体の部位)をスキャン、そうでない場合は画像化する工程を包含し得る。別の方法は、(i)被験体(例えば、癌または腫瘍性障害を有する患者)に検出可能なマーカーと複合化したTie1結合抗体を投与し;(ii)被験体を、Tie1発現組織または細胞に対するこの検出可能なマーカーを検出する手段に供する工程を包含する。例えば、この方法を使用して、血管または内皮細胞(例えばTie1発現内皮細胞)の位置を可視化し得る。被験体を、例えば、NMRまたは他の断層撮影手段により画像化し得る。
診断用画像化に有用な標識の例として、131I、111In、123I、99mTc、32P、125I、3H、14Cおよび188Rh等の放射性標識、蛍光体およびローダミン等の蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放射断層撮影(「PET」)スキャナにより検出可能なポジトロン放射同位元素、ルシフェリン等の化学発光分析計、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼ等の酵素マーカーが挙げられる。また、短距離検出器プローブにより検出可能な放射性同位体等の短距離放射線エミッターを使用し得る。この結合タンパク質を、公知の技術を使用して、そのような試薬で標識し得る。例えば、抗体の放射標識に関する技術について、Wensel and Meares(1983)Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy,Elsevier,New YorkおよびD.Colcher et al.(1986)Meth.Enzymol.121:802−816を参照されたい。
放射標識結合タンパク質を、インビトロ診断試験のためにも使用し得る。放射性同位元素で標識されたタンパク質の特定の活性は、半減期、放射性標識の同位体の純度、およびこの標識をどのようにタンパク質に導入するかに依存する。
腫瘍関連新生血管形成に対する効果的な画像化剤が必要である。Tie1は腫瘍関連脈管構造においてアップレギュレートされる。本明細書に記載した結合タンパク質はそのような脈管構造の画像化のために使用できる。
本明細書に記載した結合タンパク質は数種の方法において画像化のために使用できる。結合タンパク質を99mTc、186Reまたは188Reのような画像化剤に対するキレート剤に物理的に会合、例えばカップリングさせることができる。99mTcおよび188Reはシングルフォトンエミッションコンピューター断層撮影(SPECT)画像化に適するガンマ線を発射する。放射性のフッ素(18F)、インジウム(111In)、ヨウ素(123I、131I)、ガリウム(6Ga、67Ga)、炭素(11C)、タリウム(201Tl)および他の元素を画像化剤として使用してよい。
本明細書に記載した結合タンパク質は数種の方法において画像化のために使用できる。結合タンパク質を99mTc、186Reまたは188Reのような画像化剤に対するキレート剤に物理的に会合、例えばカップリングさせることができる。99mTcおよび188Reはシングルフォトンエミッションコンピューター断層撮影(SPECT)画像化に適するガンマ線を発射する。放射性のフッ素(18F)、インジウム(111In)、ヨウ素(123I、131I)、ガリウム(6Ga、67Ga)、炭素(11C)、タリウム(201Tl)および他の元素を画像化剤として使用してよい。
結合タンパク質は又、画像化剤としての使用に適する放射性核種またはスピン標識を包含する粒子、例えばナノ粒子に、共有結合的または非共有結合的に結合することができる。結合タンパク質はMRIを介した画像化を可能にするスピン標識に連結できる。Botner等(Circulation.(2004)108:2023−2029)は例示されるガドリニウム標識ペプチドを用いたMRI画像化を記載している。本明細書に記載した結合タンパク質は画像化のために同様に標識できる。
Chen等(J.Nucl.Med.,(2004)45:1776−1783)は小型PEG分子(平均分子量3.4KDa)をカップリングするとαvβ3−結合ペプチドのその薬力学が向上したことを示している。結合タンパク質(例えばTie1、Tie2またはAng結合タンパク質)はクリアランス速度および経路を調節するためにPEG分子にカップリングできる。
陽電子発射断層撮影(PET)は64Cuおよび18Fのような陽電子発射物質のような画像化剤と共に使用できる。これ等の同位体はより入手し易くなっている。64Cuはキレート剤DOTA中に捕獲できる。DOTA誘導体はタンパク質に共有結合できる。一実施形態において、DOTA誘導体1つ以上をリジン側鎖基を介して結合タンパク質(例えばFab)に結合する。
Fab類はそれらがa)かなり急速に系から消失するため、注射数分内に画像化が可能になり、そしてb)効率的に腫瘍に浸透することから、画像化のために有用な結合剤である。
Tie1、Tie2またはAngに結合するFab類は例えばE.coli中、または真核細胞中で製造できる。Fab類はプロテインA上のクロマトグラフィーにより精製できる。イオン交換クロマトグラフィーもまた使用できる。画像化に使用するためには、所望の放射性核種または他の画像化剤に適するキレート形成基の共有結合により、使用時にFabを標識することができる。Fab類は又MRI画像化を可能にするために結合されたスピン標識を有することもできる。Fab類は又画像化に適する放射性核種またはスピン標識を包含する粒子(例えばナノ粒子)に結合することもできる。特定の実施形態においては、クリアランスの速度および経路を調節するためにPEG分子にFab類をカップリングしてよい。他の実施形態においては、Fab類はその急速なクリアランス特性を維持するためにPEGにはカップリングしない。
ポリペプチドの放射性同位体(例えば、14C、3H、35S、125I、32P、131I)による標識操作は、一般的に公知である。例えば、トリチウム標識化手順は、米国特許第4,302,438号に記載されている。例えばネズミのモノクローナル抗体に適合させるようなヨウ素化、トリチウム標識化および35S標識化手順は、例えば、Goding,J.W.(Monoclonal antibodies:principles and practice:production and application of monoclonal antibodies in cell biology,biochemistry,and immunology 2nd ed.London;Orlando:Academic Press,1986.pp.124−126)およびそこで引用された参考文献により記載されている。抗体等のポリペプチドをヨウ素化する他の手順は、Hunter and Greenwood(1962)Nature 144:945,David et al.(1974)Biochemistry 13:1014−1021および米国特許第3,867,517号および米国特許第4,376,110号に記載されている。画像化に有用な放射標識元素としては、例えば123I、131I、111Inおよび99mTcが挙げられる。抗体をヨウ素化する手順は、Greenwood,F.et al.(1963)Biochem.J.89:114−123;Marchalonis,J.(1969)Biochem.J.113:299−305;およびMorrison,M.et al.(1971)Immunochemistry 289−297により記載されている。99mTc標識化の手順は、Rhodes,B.et al.in Burchiel,S.et al.(eds.),Tumor Imaging:The Radioimmunochemical Detection of Cancer,New York:Masson 111−123(1982)およびそこで引用された参考文献により記載されている。111In標識化抗体に適した手順は、Hnatowich,D.J.et al.(1983)J.Immul.Methods,65:147−157,Hnatowich,D.et al.(1984)J.Applied Radiation,35:554−557およびBuckley,R.G.et al.(1984)F.E.B.S.166:202−204に記載されている。
放射標識結合タンパク質の場合、結合タンパク質は患者に投与され、結合タンパク質が反応する抗原を有する腫瘍に局在化され、例えばガンマカメラまたは放射断層撮影法を使用する、放射性核スキャンニング等の公知の技術を使用してインビボで検出または「画像化」される。例えば、A.R.Bradwell et al.,“Developments in Antibody Imaging”,Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin et al.,(eds.),pp.65−85(Academic Press 1985)を参照されたい。あるいは、ポジトロン放射トランスアキシャル断層撮影スキャナ、例えばBrookhaven National Laboratoryに位置するPet VIと呼ばれるもの等を、放射性標識がポジトロン(例えば、11C、18F、15Oおよび13N)を放射する場合に使用し得る。
(MRI造影剤)
磁気共鳴影像法(MRI)は、生体の被験体の内部特徴を視覚化するためにNMRを使用するもので、予後、診断、治療および手術に有用である。MRIは、明らかな有益性として放射性トレーサー化合物なしに使用し得る。いつくかのMRI技術が、EP−A−0 502 814に要約されている。一般的に、異なる環境下の水プロトンの緩和時間定数T1およびT2に関連する違いを使用して画像を作る。しかし、これらの違いは鮮明な高解像度画像を提供するには不十分であり得る。
磁気共鳴影像法(MRI)は、生体の被験体の内部特徴を視覚化するためにNMRを使用するもので、予後、診断、治療および手術に有用である。MRIは、明らかな有益性として放射性トレーサー化合物なしに使用し得る。いつくかのMRI技術が、EP−A−0 502 814に要約されている。一般的に、異なる環境下の水プロトンの緩和時間定数T1およびT2に関連する違いを使用して画像を作る。しかし、これらの違いは鮮明な高解像度画像を提供するには不十分であり得る。
これらの緩和時間定数の違いは造影剤により増強し得る。そのような造影剤の例として、多くの磁性剤、例えば(主にT1を変える)常磁性剤、および(主にT2応答を変える)強磁性または超常磁性剤が挙げられる。キレート(例えば、EDTA、DTPAおよびNTAキレート)は、幾つかの常磁性物質(例えば、Fe3+、Mn+2、Gd+3)を連結(およびその毒性を低下)するために使用し得る。他の物質は、例えば、直径が10μm未満で約10nMまでの粒子の形態であり得る。粒子は、強磁性、反強磁性または超常磁性の特性を有し得る。粒子は、例えば、マグネタイト(Fe3O4)、γ−Fe2O3、フェライト、および遷移元素の他の磁性無機化合物を含み得る。磁性粒子は、非磁性物質を有する磁性結晶および非磁性物質を有さない磁性結晶のうちの一つ以上の磁性結晶を含み得る。非磁性物質として、合成または天然のポリマー(例えば、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプン等)が挙げられる。
(i)実質的にすべての天然の豊富なフッ素原子が19F同位体であり、よって実質的にすべてのフッ素含有化合物がNMR活性であり;(ii)多くの化学的に活性なポリフルオロ化化合物、例えばトリフルオロ酢酸無水物が比較的安価で市販されており、かつ(iii)ヘモグロビン代用物として酸素を運ぶために利用されているペリフルオロ化ポリエーテル等の多くのフッ素化化合物が、ヒトにおける使用に対し医学的に受容可能であると見出されたゆえに、標的結合タンパク質はまた、NMR活性19F原子または複数のそのような原子を含む指示基(indicating group)により標識し得る。そのようなインキュベーションの時間を許した後、全身MRIを、Pykett(1982)Scientific American,246:78−88に記載される装置等の装置を使用して癌組織を検出し、画像化する。
標的結合タンパク質、例えば本明細書中に記載される結合タンパク質を評価することから得られた情報を機械に適合する媒体、例えばコンピュータ読み取り可能またはコンピュータアクセス可能な媒体上に記録し得る。この情報はコンピュータ表示として、例えばデータベース(例えば、結合タンパク質を使用した画像化の場合、一つまたは複数の被験体についての画像のデータベース)中に保存し得る。用語「コンピュータ表示」とは、コンピュータが処理し得る形態である情報を意味する。コンピュータ表示を保存する行為は、コンピュータによる処理に適した形態で情報を置く行為をいう。
また、Tie1に結合する結合タンパク質、および診断使用のための説明書、例えばインビトロで(例えば、サンプル、例えば癌または腫瘍性障害を有する患者からの生検材料または細胞中の)Tie1を検出するか、またはインビボで例えば被験体を画像化することによりTie1を検出するための標的結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、または他のポリペプチドもしくはペプチド)の使用のための説明書を含むキットも本発明の範囲にある。このキットは、標識または付加的な診断剤等の少なくとも一つの付加的な試薬をさらに含み得る。インビボ使用のために、結合タンパク質を、薬学的組成物として処方し得る。
下記例は、制限するものと解釈すべきではない。
(実施例1:Tie1配列)
例示的なTie1アミノ酸配列(配列番号2)は以下のとおりである:
例示的なTie1アミノ酸配列(配列番号2)は以下のとおりである:
(実施例2:選択と主要なスクリーニング)
本発明者らは、免疫グロブリンをFabフラグメントとして示す非常に大きなファージライブラリーからTie1特異的抗体を選択するためにファージディスプレーを使用した。Tie1に特異的な抗体を単離するために、ファージ表示Fab抗体ライブラリーを、ヒトFcまたはヒスチジン精製タグに対して融合させたTie1細胞外ドメインに対して選択した。
本発明者らは、免疫グロブリンをFabフラグメントとして示す非常に大きなファージライブラリーからTie1特異的抗体を選択するためにファージディスプレーを使用した。Tie1に特異的な抗体を単離するために、ファージ表示Fab抗体ライブラリーを、ヒトFcまたはヒスチジン精製タグに対して融合させたTie1細胞外ドメインに対して選択した。
溶液中の選択は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ(M−280−DYNAL(登録商標))上に補足されたビオチン標識抗原を使用して実施した。Tie1を発現する細胞上での選択は、KINGFISHER(商標)自動化磁気ビーズ捕捉デバイスを使用して実施した。固定化抗原上での選択は、Tie1−Fcで被覆したイムノチューブを使用して実施した。幾つかの選択法が使用された。
ストラタジー1:ラウンド1(500mMビオチン標識Tie1/磁気ビーズ)、ラウンド2(1×107Tie1発現細胞/Kingfisher)、ラウンド3(1×107Tie1発現細胞/Kingfisher)
ストラタジー2:ラウンド1(500mMビオチン標識Tie1/磁気ビーズ)、ラウンド2(1×107Tie1発現細胞/Kingfisher(商標))、(300mMビオチン標識Tie1/磁気ビーズ)
ストラタジー3:ラウンド1(5μg/mlのTie1 Fc被覆イムノチューブ)、ラウンド2(Tie1−Fc被覆イムノチューブ)、ラウンド3(Tie1 Fc被覆イムノチューブ+ヒトIgGを用いた除去)。
ストラタジー2:ラウンド1(500mMビオチン標識Tie1/磁気ビーズ)、ラウンド2(1×107Tie1発現細胞/Kingfisher(商標))、(300mMビオチン標識Tie1/磁気ビーズ)
ストラタジー3:ラウンド1(5μg/mlのTie1 Fc被覆イムノチューブ)、ラウンド2(Tie1−Fc被覆イムノチューブ)、ラウンド3(Tie1 Fc被覆イムノチューブ+ヒトIgGを用いた除去)。
選択ストラタジーから回収したライブラリーメンバーを、ファージELISAでの抗原結合について検査した。各単離物を、被覆Tie1 Fcへの結合について検査した。ストラタジー1は、いずれの結合クローンも同定しなかったが、ストラタジー2は13個のポジティブクローンを同定した(n=95)。ストラタジー3は86個の結合クローンを同定した(n=95)。
選択されたクローンの配列分析は、重鎖の選択されたCDR3に基づき分類し、独自のVH−CDR3配列を有する23個の異なる抗体を得た。
本発明者らは、ディスプレーライブラリーベクターからのVHおよびVLコード配列を、哺乳動物の発現ベクター系の二つのベクターに再クローニングすることにより、選択されたFabを完全なヒトの抗体として再フォーマットした。これらのベクターは、ヒトカッパ定常ドメインおよびヒトガンマ−1重鎖定常領域を含む。両ベクターを、対応する完全IgGの発現および生成のために哺乳動物CHO−K1細胞にトランスフェクトした。これらの抗体は下記を含む数種のアッセイを使用して特性付けた:1.Tie1をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞のウェスタンブロッティングおよび免疫沈降;2.Tie1をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞の免疫蛍光;3.BaF3細胞および主要ヒト内皮細胞中のTie1の刺激および阻害;ならびに4.ヒト組織の免疫染色。
本発明者らは、Tie1と相互作用する23個の抗体を同定した。図7〜36を参照されたい。再フォーマットされたクローンの配列確認後、それらをHEK293T細胞の一時的なトランスフェクションで使用した。成長後、IgGを、プロテインAカラムを使用して培養上清から精製した。精製したIgG1の量を、SDS−PAGEを使用して決定した。
Tie1特異的IgGの特異性を、マウス肺微小血管内皮細胞(LEII)、およびTie1発現構築物をトランスフェクトしたLEII−Tie1細胞で細胞ELISA全体により決定し得る。細胞を10,000細胞/ウェルの密度で96ウエルプレートにまき、4%パラホルムアルデヒドを使用して固定した。IgG1のLE11細胞への結合の染色および検出は、HRP複合ウサギ抗ヒトHRPによる標準的な標識およびTMB染色を使用して検出する。精製IgG1のLEII−Tie1をトランスフェクトした細胞への結合は、内因的に発現するTie1タンパク質に対して補正し得る。あるいは、内因性Tie1をほとんど持たない細胞または全くもたない細胞を、分析のためにも使用し得る。
結合抗体の少なくとも一つ(E3)は、BaF3細胞バイオアッセイでTie1活性化抗体として作用する。本発明者らは、一時的にトランスフェクトしたCOS1細胞およびヒト主要内皮細胞におけるE3 IgG処置に応答するTie1リン酸化を研究した。本発明者らの結果は、E3 IgGがTie1レセプターを活性化することを示す。BaF3細胞バイオアッセイ(「Tie1/EpoRキメラBAF細胞アッセイ」ともいわれる)は、Tie1レセプターを架橋するリガンドの能力の指標を提供し得る。アッセイは人為的であるため、非天然のTie−Epo融合タンパク質の架橋は、インビボ機能を調節するリガンドの能力を予測するかどうか分からない。
起こり得る天然のリガンドの代わりにE3を使用して、インビトロおよびインビボでのTie1のいくつかの機能を特性付け得る。E3と相互作用するTie1の領域は、Tie1活性化または阻害のために小分子化合物の標的となり得る。
E3は一つの特定のTie1活性化アッセイで作用するが、E3およびこのアッセイにおける他のポジティブ物はまた、他の機能に関して、または他のコンテキストにおいて阻害効果を有し得る。例えばE3は、HUVEC細胞による管形成を阻害し得る。以下を参照されたい。
さらに、本発明者らは、BaF3細胞生検においてE3により与えられた生存効果を阻害する二つの抗体を見出した。これらの二つの抗体は、BaF3アッセイにおいてE3により誘導されたTie1の二量体化を阻害し得る。B2およびD11の二つの抗体は、E3と組み合わせて使用される場合、Tie1/EpoR細胞の生存性を完全にブロックした。
(方法)
(細胞培養)
COS1細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)、グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)で培養した。ネズミのBa/F3前Bリンパ細胞を、10%FCS、グルタミン、抗生物質および2ng/mlインターロキン−3(Calbiochem)で補ったDMEMで培養した。PromoCell(Heidelberg,Germany)から入手したヒト皮膚微小管内皮細胞(HDMVEC)を、供給者により提供された内皮細胞培地で培養し、4〜7継代で使用した。
(細胞培養)
COS1細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)、グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)で培養した。ネズミのBa/F3前Bリンパ細胞を、10%FCS、グルタミン、抗生物質および2ng/mlインターロキン−3(Calbiochem)で補ったDMEMで培養した。PromoCell(Heidelberg,Germany)から入手したヒト皮膚微小管内皮細胞(HDMVEC)を、供給者により提供された内皮細胞培地で培養し、4〜7継代で使用した。
(ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降)
製造者の指示に従ってFUGENE6(Roche)を使用して、COS1細胞にpcDNA3−Tie1−V5(10cm細胞培養プレートあたり1μgのDNA)をトランスフェクトし、48時間インキュベート後、染色した。免疫沈降のために、Tie1をトランスフェクトした細胞およびHMVEC細胞を、アプロチニン、ロイペプチン、PMSFおよびバナジン酸ナトリウムを補ったDOC−RIPA細胞溶解緩衝液(50mMトリス塩酸、pH8.0、150mM NaCl、1% Triton−X100、0.1%SDS、1%DOC、10mM EDTA)に溶解させた。免疫沈降を、等量の細胞溶解物から、ポリクローナル抗ヒトTie1抗体(R&D)、モノクローナル抗V5抗体(Invitrogen)とともに、または23種類の抗Tie1抗体(1μg/ml)と一緒に1〜2時間インキュベートし、その後にプロテインG−セファロース(Amersham Pharmacia Biotech AB)とともに1時間インキュベートすることにより実施した。免疫沈降物をPBS−Tで二回およびPBSで二回洗浄した後に、Laemmli緩衝液による溶出および8%SDS−PAGE中での分離を行った。ブロットは、23種類の抗Tie1抗体(5μg/ml)、およびそれに続くHRPと複合化した抗ヒトFc抗体により精査した。
製造者の指示に従ってFUGENE6(Roche)を使用して、COS1細胞にpcDNA3−Tie1−V5(10cm細胞培養プレートあたり1μgのDNA)をトランスフェクトし、48時間インキュベート後、染色した。免疫沈降のために、Tie1をトランスフェクトした細胞およびHMVEC細胞を、アプロチニン、ロイペプチン、PMSFおよびバナジン酸ナトリウムを補ったDOC−RIPA細胞溶解緩衝液(50mMトリス塩酸、pH8.0、150mM NaCl、1% Triton−X100、0.1%SDS、1%DOC、10mM EDTA)に溶解させた。免疫沈降を、等量の細胞溶解物から、ポリクローナル抗ヒトTie1抗体(R&D)、モノクローナル抗V5抗体(Invitrogen)とともに、または23種類の抗Tie1抗体(1μg/ml)と一緒に1〜2時間インキュベートし、その後にプロテインG−セファロース(Amersham Pharmacia Biotech AB)とともに1時間インキュベートすることにより実施した。免疫沈降物をPBS−Tで二回およびPBSで二回洗浄した後に、Laemmli緩衝液による溶出および8%SDS−PAGE中での分離を行った。ブロットは、23種類の抗Tie1抗体(5μg/ml)、およびそれに続くHRPと複合化した抗ヒトFc抗体により精査した。
(免疫蛍光染色)
ガラスカバースリップ上のCOS1細胞に、製造者の指示に従ってFUGENE(商標)6(Roche)を使用して、pcDNA3−Tie1−V5(V5−エピトープをpcDNA3−Tie1の3末端に付加した)(10cmの細胞培養プレートあたり1μg DNA)を一時的にトランスフェクトし、48時間インキュベート後、染色した。細胞を、4℃にて10分間、4%パラホルムアルデヒドで固定した。必要であれば、これらの細胞を、PBS中の0.2% Triton X−100により5分間、浸透性にした。非特異的な結合部位を、PBS中の1%BSAで30分間インキュベートすることによりブロックした。次いでこれらの細胞を、抗Tie1抗体(5μg/ml)および抗V5抗体により室温にて1時間染色し、続いてFITC複合化抗ヒト抗体(DAKO、40μg/ml)およびTRITC複合化抗マウス抗体(DAKO、15μg/ml)とともに、30分間インキュベートした。Hoechst 33258フルオロクローム(Sigma、0.5μl/ml)を核の染色のために使用した。
ガラスカバースリップ上のCOS1細胞に、製造者の指示に従ってFUGENE(商標)6(Roche)を使用して、pcDNA3−Tie1−V5(V5−エピトープをpcDNA3−Tie1の3末端に付加した)(10cmの細胞培養プレートあたり1μg DNA)を一時的にトランスフェクトし、48時間インキュベート後、染色した。細胞を、4℃にて10分間、4%パラホルムアルデヒドで固定した。必要であれば、これらの細胞を、PBS中の0.2% Triton X−100により5分間、浸透性にした。非特異的な結合部位を、PBS中の1%BSAで30分間インキュベートすることによりブロックした。次いでこれらの細胞を、抗Tie1抗体(5μg/ml)および抗V5抗体により室温にて1時間染色し、続いてFITC複合化抗ヒト抗体(DAKO、40μg/ml)およびTRITC複合化抗マウス抗体(DAKO、15μg/ml)とともに、30分間インキュベートした。Hoechst 33258フルオロクローム(Sigma、0.5μl/ml)を核の染色のために使用した。
(BaF3バイオアッセイ)
バイオアッセイ用にTie1−EpoR発現Ba/F3細胞を作るために、BaF3前B細胞に、マウスエリスロポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと融合させたヒトTie1の細胞外ドメインを含むキメラレセプターを発現する核酸を安定的にトランスフェクトした。使用した核酸を、pEF−BOS発現ベクター中のTie1−EpoRキメラcDNAであった。キメラレセプターをコードする核酸を、ヒトTie1のPCR増幅細胞外部分(X60975のpb 37−2316)をEcoRI−BglIIフラグメントとしてmEpoR−pcDNAベクターにクローニングすることにより構築した。EpoRの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと融合させたTie1の細胞外部分からなるキメラレセプターをコードするcDNAを、pEF−BOS発現ベクターにサブクローニングした。ベクターを線状化し、pcDNA3.1(+)Zeoベクター(Invitrogen)とともにBaF3細胞へトランスフェクトした。安定した細胞プールを、250μg/ml Zeocinによる選択により生成した。幾つかのクローンにおけるTie1/EpoR融合タンパク質の発現を、EpoRに対する抗体によるウェスタンブロッティングにより分析した。
バイオアッセイ用にTie1−EpoR発現Ba/F3細胞を作るために、BaF3前B細胞に、マウスエリスロポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと融合させたヒトTie1の細胞外ドメインを含むキメラレセプターを発現する核酸を安定的にトランスフェクトした。使用した核酸を、pEF−BOS発現ベクター中のTie1−EpoRキメラcDNAであった。キメラレセプターをコードする核酸を、ヒトTie1のPCR増幅細胞外部分(X60975のpb 37−2316)をEcoRI−BglIIフラグメントとしてmEpoR−pcDNAベクターにクローニングすることにより構築した。EpoRの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと融合させたTie1の細胞外部分からなるキメラレセプターをコードするcDNAを、pEF−BOS発現ベクターにサブクローニングした。ベクターを線状化し、pcDNA3.1(+)Zeoベクター(Invitrogen)とともにBaF3細胞へトランスフェクトした。安定した細胞プールを、250μg/ml Zeocinによる選択により生成した。幾つかのクローンにおけるTie1/EpoR融合タンパク質の発現を、EpoRに対する抗体によるウェスタンブロッティングにより分析した。
アッセイを実施するために、Tie1−EpoRキメラを発現するBaF3細胞を、96ウエルマイクロタイタープレートに、指定された濃度の抗Tie1抗体の存在下で50000細胞/ウェルへと分割した。この研究で使用したE3抗体は、生殖細胞系E3抗体(DX−2220)であった。コントロールとして、Tie1−EcoRを発現しないZeocin耐性プールを使用した。48時間後、細胞の生存度は、MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリムブロミド(Sigma)、0.5mg/ml)を加え、続いてさらに2時間培養し、等しい容量の細胞溶解溶液(10%SDS、10mM HCl)を加え、一晩37℃にてインキュベートすることにより決定した。吸光度は540nmで測定した。
(Tie1リン酸化アッセイ)
COS1細胞にpcDNA3−Tie1−V5をトランスフェクトした。トランスフェクトの24時間後、これらの細胞の血清を8時間欠乏させ、次いでE3 IgGで処理した。Tie1リン酸化アッセイのために、指示されるとおり、HDMVECを10cmの皿でコンフルエンス近くまで培養し、無血清培地で欠乏させ(8〜16時間)、刺激した。刺激後、これらの細胞を細胞溶解緩衝液(RIPA−DOC:50mMトリスHCl、pH8.0、150mM NaCl、1%Triton−X−100、0.1%SDS、0.5%DOC、10mM EDTAをアプロチニン、ロイペプチン、PMSFおよびバナジン酸ナトリウムで補ったもの)に溶解させた。トランスフェクトしたCOS1細胞またはHDMVECから浄化した溶解物を、抗V5または抗Tie1 B9でそれぞれ免疫沈降させた。タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロースに移し、抗ホスホチロシンおよび抗Tie1(R&Dシステム)抗体を使用してイムノブロットした。
COS1細胞にpcDNA3−Tie1−V5をトランスフェクトした。トランスフェクトの24時間後、これらの細胞の血清を8時間欠乏させ、次いでE3 IgGで処理した。Tie1リン酸化アッセイのために、指示されるとおり、HDMVECを10cmの皿でコンフルエンス近くまで培養し、無血清培地で欠乏させ(8〜16時間)、刺激した。刺激後、これらの細胞を細胞溶解緩衝液(RIPA−DOC:50mMトリスHCl、pH8.0、150mM NaCl、1%Triton−X−100、0.1%SDS、0.5%DOC、10mM EDTAをアプロチニン、ロイペプチン、PMSFおよびバナジン酸ナトリウムで補ったもの)に溶解させた。トランスフェクトしたCOS1細胞またはHDMVECから浄化した溶解物を、抗V5または抗Tie1 B9でそれぞれ免疫沈降させた。タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロースに移し、抗ホスホチロシンおよび抗Tie1(R&Dシステム)抗体を使用してイムノブロットした。
(ヒト組織の免疫染色)
免疫組織化学における抗Tie1抗体の反応性を評価するために、ヒト腎臓と肺の5μmの凍結切片を、室温にて30分間乾燥させ、冷アセトンで10分間固定した。スライドをPBSで洗浄し、PBS中0.03%H2O2で15分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させた。TNB(室温にて30分)を使用して、非特異的結合をブロックし、切片をTie1抗体とともに10μg/mlの濃度で一晩+4℃にてインキュベートした。PBSによる数回の洗浄後、ビオチニル化抗ヒト抗体(1:300、Zymed)を組織に加えた。シグナルを、TSAキットを使用することにより増幅し、AEC染色で検出した。
免疫組織化学における抗Tie1抗体の反応性を評価するために、ヒト腎臓と肺の5μmの凍結切片を、室温にて30分間乾燥させ、冷アセトンで10分間固定した。スライドをPBSで洗浄し、PBS中0.03%H2O2で15分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させた。TNB(室温にて30分)を使用して、非特異的結合をブロックし、切片をTie1抗体とともに10μg/mlの濃度で一晩+4℃にてインキュベートした。PBSによる数回の洗浄後、ビオチニル化抗ヒト抗体(1:300、Zymed)を組織に加えた。シグナルを、TSAキットを使用することにより増幅し、AEC染色で検出した。
(結果)
Tie1をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞のウェスタンブロッティング、免疫沈降および免疫蛍光(表1を参照)。
Tie1をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞のウェスタンブロッティング、免疫沈降および免疫蛍光(表1を参照)。
(Tie1−EpoRをトランスフェクトしたBa/F3細胞およびヒト主要内皮細胞におけるTie1の刺激および阻害)
Tie1に対するリガンドは同定されなかったが、本発明者らはTie1結合タンパク質の以下の効率的なスクリーニング法を使用した。インターロイキン−3依存前Bリンパ球(Ba/F3)細胞に、Tie1−EpoR融合タンパク質を発現する構築物をトランスフェクトした。BaF3細胞はIL−3依存性であるために、それらはIL−3が提供されないと死滅する。しかし、Tie−EpoRレセプターを発現するBaF3細胞は、培地が、天然リガンドかまたは人工的模倣物のいずれかであるTie1結合タンパク質を含む場合、生存または増殖し得る。細胞生存は、例えばミトコンドリアの活性を測定する比色MTTアッセイにより定量し得る。
Tie1に対するリガンドは同定されなかったが、本発明者らはTie1結合タンパク質の以下の効率的なスクリーニング法を使用した。インターロイキン−3依存前Bリンパ球(Ba/F3)細胞に、Tie1−EpoR融合タンパク質を発現する構築物をトランスフェクトした。BaF3細胞はIL−3依存性であるために、それらはIL−3が提供されないと死滅する。しかし、Tie−EpoRレセプターを発現するBaF3細胞は、培地が、天然リガンドかまたは人工的模倣物のいずれかであるTie1結合タンパク質を含む場合、生存または増殖し得る。細胞生存は、例えばミトコンドリアの活性を測定する比色MTTアッセイにより定量し得る。
BaF3細胞アッセイからの結果は、検査した23種類の異なるモノクローナル抗体のうち、わずかにE3 IgGのみがTie1−EpoR細胞の生存を促進し得たが、コントロールとして使用されたEpoR BaF3細胞の生存度はE3 IgGによって影響されなかったことを示した。E3 FabフラグメントはTie1−EpoR細胞の生存度に効果を有さなかったので、免疫グロブリン分子のIgG部分はE3 IgGの生存作用に必要ではなかった。50ng/mlのE3 IgGの濃度は、Tie1−EpoR細胞生存アッセイにおいてほぼ最大の生存度を与え、この生存度は、用量依存的であった。
Tie1の細胞外ドメインに結合するE3 IgGがTie1の自己リン酸化を誘導するかどうかを検査するために、E3 IgG処理に応答するTie1レセプターリン酸化レベルを一時的にトランスフェクトしたCOS1細胞およびヒト主要内皮細胞において調査した。COS1細胞に、V5タグ付きの全長Tie1 cDNAを含む発現ベクターをトランスフェクトし、血清欠乏後にこれらの細胞をE3 IgG(200ng/ml)で処理した。細胞溶解物を幾つかの時間点で抽出し、Tie1を抗V5で免疫沈降させた後、抗ホスホチロシンおよび抗Tie1抗体を使用したウェスタンブロッティングを行った。その結果は、Tie1は10〜30分間のE3 IgG刺激後にチロシンリン酸化されることを示した。E3 IgGが主要内皮細胞中のTie1リン酸化を誘発するかどうかを決定するために、HDMVEC細胞を血清欠乏させ、幾つかの濃度のE3で60分間刺激した。次いで、Tie1を細胞溶解物から免疫沈降させ、抗ホスホチロシンブロッティング分析に供したところ、50〜200ng/mlでのE3 IgG刺激に続き、レセプターリン酸化を示した。さらに高い濃度のE3(500〜1000ng/ml)がTie1リン酸化を誘発したが、その応答はより急速で、刺激の5分後に最も顕著であった。
E3 IgG誘発Tie1活性化の動態を調べるために、細胞をE3 IgG(200ng/ml)で刺激し、リセプターリン酸化を様々な時間点で調査した。Tie1リン酸化はE3 IgG処理の15〜30分後に最も激しかったが、リン酸化は1時間に及び持続した。
調査された任意の他のモノクローナル抗体が、Tie1−EpoR Ba/F3アッセイにおいてE3 IgGの生存効果を阻害するかどうかを決定するために、抗体をE3 IgGと組み合わせて研究した。100ng/ml濃度のE3 IgGを、100(1:1)または500(1:5)ng/mlの他の抗体とともに使用して、Tie1−EpoR細胞の生存度を測定した。E3 IgGと試験抗体(1:1および1:5の比率にある)との両方の組合せからの結果は類似しており、23抗体のうち2抗体(B2およびD11)がE3 IgGの生存効果を完全にブロックしたことを示した。幾つかの抗体(A2、A10、P−B1、P−B3およびP−C6)は、E3 IgGの生存作用をある程度阻害し、抗体のうち2つ(G2およびC7)が、E3 IgGとの組合せにおいてTie1/EpoR BaF3細胞の生存を促進した。
(ヒト組織の免疫染色)
抗Tie1抗体は、培養細胞中のヒトTie1と反応する。ビオチニル化抗Tie1抗体を使用して、標識ストレプトアビジンまたはアビジンを使用して結合抗体を検出することにより、抗体が肺および腎臓ならびに腫瘍からのヒト組織サンプルを染色し得るかどうかを決定することもできる。
抗Tie1抗体は、培養細胞中のヒトTie1と反応する。ビオチニル化抗Tie1抗体を使用して、標識ストレプトアビジンまたはアビジンを使用して結合抗体を検出することにより、抗体が肺および腎臓ならびに腫瘍からのヒト組織サンプルを染色し得るかどうかを決定することもできる。
(実施例3:例示的配列)
例示的な免疫グロブリン可変ドメインの配列を、図7〜36に示す。
例示的な免疫グロブリン可変ドメインの配列を、図7〜36に示す。
(実施例4:抗Tie1 E3−IgGを使用したHUVEC細胞による管形成の阻害
)
インビトロでの血管形成を阻害するE3の能力を明らかにするために、ヒト臍帯内皮細胞(HUVEC)による管形成を阻害する能力について精製Eを調査した。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、新鮮なヒト臍帯静脈をトリプシン−EDTA(1×)(Gibco/Invitrogen)で37℃にて20〜25分間、処理することにより得た。これらの細胞を、接着因子(AF)(Cascade Biologics)で被覆したT−25フラスコ中、10%FCS、0.4%BBE、1% 1−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったRPMI1640培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−EDTAで分離して、二代または三代の継代でコンフルエントになったときに使用した。これらの細胞を1:2の分離比率で、単層の約60〜80%のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。細胞を分離するために、HUVEC単層をトリプシン/EDTA(500μl/皿)で37℃にて3分間処理した。トリプシン活性を、3体積分の完全RPMI培地を加えることにより停止した。これらの細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰返して分離し、最後にPBSで洗浄した。
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インビトロでの血管形成を阻害するE3の能力を明らかにするために、ヒト臍帯内皮細胞(HUVEC)による管形成を阻害する能力について精製Eを調査した。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、新鮮なヒト臍帯静脈をトリプシン−EDTA(1×)(Gibco/Invitrogen)で37℃にて20〜25分間、処理することにより得た。これらの細胞を、接着因子(AF)(Cascade Biologics)で被覆したT−25フラスコ中、10%FCS、0.4%BBE、1% 1−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったRPMI1640培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−EDTAで分離して、二代または三代の継代でコンフルエントになったときに使用した。これらの細胞を1:2の分離比率で、単層の約60〜80%のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。細胞を分離するために、HUVEC単層をトリプシン/EDTA(500μl/皿)で37℃にて3分間処理した。トリプシン活性を、3体積分の完全RPMI培地を加えることにより停止した。これらの細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰返して分離し、最後にPBSで洗浄した。
二継代後、HUVECを、7.5体積分の2mg/mlコラーゲン(コラーゲンR;Serva,Heidelberg,Germany)、1体積分の10×MEM、1.5体積分のNaHCO3(15.6mg/ml)を混合することにより調製されたコラーゲンゲル(1.5mg/mlのコラーゲンI 50μl)上のそれらの培養培地(96ウエルプレートで40×103/50μl/ウェル)にまき、約1体積分のNaOHによりpHを7.4に調節した。次いで、1時間30分後に培養培地を捨て、これらの細胞をコラーゲンの新しい層(1.5mg/ml、新しい調製物、50μl/ウェル)で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、E3抗体(1ng/ml〜10μg/ml)の存在下または不存在下に各ウェルに加えた。このアッセイを、コントロール(1ng/ml〜10μg/ml)として使用されるストレプトアビジン抗体を用いて実施した。培養表面上の管ネットワークの全長を、METAVUE(商標)ソフトウエア(Universal Imaging Corporation)により×40倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を、視野±SEM(相対単位)あたりの平均管面積として示した。各アッセイを少なくとも3回実施した。
E3は、10ng/mlの濃度でさえもHUVECによる管形成の有力な阻害物質である。コントロール抗ストレプトアビジンは、HUVECの管を形成する能力に対して効果を有さない。この結果は、E3が血管形成の少なくとも一局面を阻害し得ることを示している。
(実施例5:調和させた腫瘍および正常組織切片に結合するE3の免疫組織化学的分析)
主要な腫瘍および正常組織におけるE3のTie1への結合を評価するために、抗体をIgGとして生成し、ビオチン標識した。E3抗体ならびに二つの他の抗Tie1抗体B2およびD11を全長IgG分子として再フォーマットした。これらのIgGをコードする核酸を、HEK293T細胞に一時的にトランスフェクトした。一時的な細胞トランスフェクション用のプラスミド調製を、HP−GENELUTE(商標)MIDI調製キット(Sigma、カタログ番号NA0200)を使用して実施した。HEK293T細胞(GenHunter Corp.カタログ番号Q401)をトランスフェクションの24時間前にまいた;10cm培養皿一枚あたり6×106細胞をプレートした。LIPOFECTAMINE(商標)2000試薬(Invitrogen、カタログ番号11668019)を製造者の指示に従って使用し、トランスフェクションを実施した。10cm皿1枚あたり5マイクログラムのプラスミドDNAを使用した。細胞を、10%「超低IgG」ウシ胎仔血清(Invitrogen、カタログ番号16250078)を補ったDMEM(Invitrogen、カタログ番号31966021)中、37℃にて5%CO2で、水飽和雰囲気下で培養した。馴化培地をトランスフェクションの72時間および144時間後に集め、プールし、滅菌ろ過した。
主要な腫瘍および正常組織におけるE3のTie1への結合を評価するために、抗体をIgGとして生成し、ビオチン標識した。E3抗体ならびに二つの他の抗Tie1抗体B2およびD11を全長IgG分子として再フォーマットした。これらのIgGをコードする核酸を、HEK293T細胞に一時的にトランスフェクトした。一時的な細胞トランスフェクション用のプラスミド調製を、HP−GENELUTE(商標)MIDI調製キット(Sigma、カタログ番号NA0200)を使用して実施した。HEK293T細胞(GenHunter Corp.カタログ番号Q401)をトランスフェクションの24時間前にまいた;10cm培養皿一枚あたり6×106細胞をプレートした。LIPOFECTAMINE(商標)2000試薬(Invitrogen、カタログ番号11668019)を製造者の指示に従って使用し、トランスフェクションを実施した。10cm皿1枚あたり5マイクログラムのプラスミドDNAを使用した。細胞を、10%「超低IgG」ウシ胎仔血清(Invitrogen、カタログ番号16250078)を補ったDMEM(Invitrogen、カタログ番号31966021)中、37℃にて5%CO2で、水飽和雰囲気下で培養した。馴化培地をトランスフェクションの72時間および144時間後に集め、プールし、滅菌ろ過した。
PBSで平衡化した100μlのプロテインAビーズ(rプロテインAセファロース4ファストフロー、Amersham Biosciences、カタログ番号17−1279−01)を細胞培養上清に加え、これらを4℃にて一晩、例えば50mlチューブ中で回転させた。ビーズを遠心分離で集め、96ウェルろ過プレート(UNI−FILTER 800GF/B、Whatman、カタログ番号7700−2803)に移し、真空マニホールド(Macherey Nagel、カタログ番号760681)を使用してPBSで徹底的に洗浄した。抗体の溶出を、ビーズを400μlの12.5mMのクエン酸に再懸濁することにより達成した。30〜60秒のインキュベーション後、真空マニホールドを使用して、ビーズ溶出液を96ウエルコレクションプレート(UNIPLATE750、Whatman、カタログ番号7701−5750)のウェルに集めた。コレクションプレートの各ウェルは、60μlの1M HEPES(pH7.5)緩衝液を含み、溶出分画を即座に中和した。溶出工程を抗体回収を最大化するために二回実施した。次いで、溶出サンプルを、透析カセット(Slide−A−Lyser Dialysis Cassettes、MWCO10,000、Pierce、カタログ番号66380)を使用して、PBSに対して透析し、1mg/ml溶液が1.35の吸光度を有すると想定して、タンパク質濃度を280nmでの吸収から決定した。調製物の品質を、還元および非還元SDS−PAGEにより分析した。
Tie1抗体を、EZ−リンクスルホ−NHS−SS―ビオチン(Pierce、カタログ21331)を使用してビオチニル化した。Tie−1/FcおよびTie−1−Hisについては、反応を2時間、氷上で、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中、5倍モル過剰のビオチニル化剤の存在下で実施した。抗体については、反応を2時間、氷上でPBS中、15倍モル過剰のEZ−リンクスルホ−NHS−SS−ビオチンの存在下で実施した。この反応を、Tris−HCl、pH7.5(50mMの最終濃度)の添加により停止し、続いて氷上で1時間インキュベートした。次いで、サンプルをPBSに対して透析した。
種々の正常および腫瘍組織切片を、ビオチニル化抗体で染色した。マウスモノクローナル抗体抗Tie1抗体(7e8)(Alitalo laboratory,University of Helsinki)をポジティブコントロールとして使用した。一次抗体なしの切片を、ネガティブコントロールとした。すべてのサンプルは新鮮な凍結組織であり、染色をTSAキット(Perkin−Elmer Life Sciences)を用いて実施した。アセトン固定(10〜20分、−20℃)後、スライドを0.73%H2O2で10分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を減少させ、続いてTNB緩衝液で30分間ブロックした。切片(5〜10mm厚)を、一次抗体(10μg/ml)とともに、4℃にて一晩、インキュベートした。マウスモノクローナル抗tie1抗体(7e8)を有する切片を、ストレプトアビジン−HRPを加える前にビオチニル化抗マウス抗体(VectaStain)で処理した。シグナルを、TSAキットを使用して増幅し、AEC(235ml NaAc、15ml AEC(保存溶液:1600mgの3−アミノ−9−エチル−カルバゾールおよび480mlのN−ジメチルホルムアミド)、250μlのH2O2)により可視化した。
一般に、Tie−1発現は、調和する正常な組織を比較した場合、腫瘍組織中で上方調節された。しかし、腫瘍組織において、抗Tie1抗体は脈管に加えて他の構造物を染色した。さらに、あるエピトープの発現で若干の組織特異性が観察された。例えば、E3抗体は肺および腎臓中の脈管を染色したが皮膚では染色せず、一方、B2抗体は胸よりも他の正常な組織で血管を非常に弱く染色した。Tie−1の外部ドメインの腫瘍組織への放出は、観察された違いを説明し得る。
皮膚組織において、E3、B2およびD11抗体は、血管を非常に弱く染色したが、ネズミ7e8コントロール抗体は正常な皮膚で明瞭な染色を与えた。メラノーマ組織において、7e8抗体は脈管のみを染色したが、E3、B2およびD11抗体も他の周囲構造物を染色した。染色パターンは、E3、B2およびD11抗体3抗体すべてについて類似していた。
肺組織において、本発明者らは、E3抗体が肺の大静脈を特に明瞭に染色することを観察したが、D11および7e8はわずかな染色を与えた。B2はこれらの同じ静脈を染色しなかった。Tie−1の発現は、肺癌腫を劇的に上方調節し、すべての抗体は、正常な肺からのサンプルよりも肺癌腫を有するサンプル中でより強く脈管を染色した。肺腫瘍において、E3、B2およびD11抗体は、脈管以外の構造物を染色した。
腎臓において、E3およびD11抗体は脈管に加えて腎臓細管を染色した。B2は細管または脈管の非常に弱い染色のみを与えたが、7e8は血管のみを染色した。副腎腫組織において、E3抗体のみが明瞭な染色を与えた。
胸において、E3は乳腺組織の静脈および毛細管で最も明るい染色を与え、B2および7e8は類似の染色を与えたが、D11はこれらの構造をかなり弱く染色した。乳癌腫において、Tie−1発現は実質的に上方調節され、E3、B2およびD11抗体は脈管に加えて他の構造物も染色した。
(実施例6:フローサイトメトリーを使用した抗Tie1 E3−IgGのマウス内皮細胞系への結合)
本発明者らは、E3がマウスTie1とin situで交差反応するかどうかを評価し、よって、本発明者らがマウス腫瘍異種移植模型におけるE3活性を評価し得る場合は、マウス内皮細胞への結合を検査し、ヒト細胞系およびトランスフェクトした細胞系と比較した。
本発明者らは、E3がマウスTie1とin situで交差反応するかどうかを評価し、よって、本発明者らがマウス腫瘍異種移植模型におけるE3活性を評価し得る場合は、マウス内皮細胞への結合を検査し、ヒト細胞系およびトランスフェクトした細胞系と比較した。
Tie−1抗体およびコントロールMabのマウス内皮細胞への特異的な結合を、フローサイトメトリー分析(FACSscan,Becton Dickinson,Oxnard,Epics,Coulter)により測定した。マウス内皮細胞系であるMS1、Le−2、Bend3、SVEC(ATCC,Rockville)およびTie−1をトランスフェクトしたLe−2細胞を染色した。細胞染色は既存のプロトコルから改良された。約200,000細胞を各実験に使用した:トリプシン処理後、細胞をPBS中で一回洗浄し、PBS、10%熱不活化ヒト血清(インキュベーション緩衝液)に再懸濁した。特異性を検査するために、抗体を異なる希釈で室温にて1時間インキュベートした。細胞を遠心分離により3分間611gで遠沈させた。インキュベーションとインキュベーションの間に細胞をPBSで二回洗浄した。次いで、関連するビオチニル化抗体(ストレプトアビジンに対するA2、Tie−1に対するE3)を加え、室温にて1時間インキュベートした。軽鎖を生殖細胞系列化するE3 DX−2210抗体を、これらの調査に使用した。この後に、インキュベーション緩衝液中で、室温にて1時間、ストレプトアビジン−R−フィコエリトリン(Dako,Glostrup,Denmark)とともにインキュベートした。最終インキュベーション工程後、結合抗体を、FACSCanおよびEpics Altra(Becton Dickinson,Oxnard,Coulter)によるフローサイトメトリーを用いることにより検出し、結果を分析した。
インキュベーション中0.1%の最終濃度でインキュベーション緩衝液にサポニンを加える以外は、細胞内Tie−1を上記のように測定した。抗Tie−1抗体E3は、in situでE3のマウスおよびヒトTie1との交差反応性を示すマウス内皮細胞系に結合する。フローサイトメトリーによって検出されるマウス細胞系中の結合パターンは、マウス細胞において、主要ヒト内皮細胞系と比較して高い細胞表面染色が存在する点において、HUVECでの結合パターンとは異なる。DX−2210をマウス内皮細胞系ならびにHUVECコントロール細胞の両方を、明確に染色した。これらの細胞をサポニンで処理した際、蛍光シグナルが変化したが、このことは、隔離されたTie1のかなりの細胞内プールを示している。
(実施例7:フローサイトメトリーを使用するヒト血小板に結合する抗Tie1 E3−IgGの決定)
Tie−1に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清(R&D systems)を用いる結合実験は、以前の研究でヒト血小板への結合を示した(Tsiamis et al.,(2000)J.Vasc.Res.37:437−42)。この研究からの結論は、血小板が、Tie1の発達の問題を示し得るTie−1免疫反応の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体E3が血小板に結合するかどうかを決定するために、本発明者らは、活性化および非活性化の両方の血小板に対するフローサイトメトリー分析を実施し、染色パターンを精製抗Tie1ポリクローナル血清と比較した。
Tie−1に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清(R&D systems)を用いる結合実験は、以前の研究でヒト血小板への結合を示した(Tsiamis et al.,(2000)J.Vasc.Res.37:437−42)。この研究からの結論は、血小板が、Tie1の発達の問題を示し得るTie−1免疫反応の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体E3が血小板に結合するかどうかを決定するために、本発明者らは、活性化および非活性化の両方の血小板に対するフローサイトメトリー分析を実施し、染色パターンを精製抗Tie1ポリクローナル血清と比較した。
血小板活性化を避けるために、血小板GelSepキット(Biocytex,Marseille,France)キットを製造者の指標に従って使用し、健康なドナーの血漿からヒト血小板を単離した。血小板を、トロンビンを0.8U/mlの最終濃度に加えることにより活性化した。活性化血小板を非活性化血小板から区別するために、二重染色をTie−1抗体/コントロール抗体および抗体CD42(全血小板)またはCD62(活性化血小板)を用いて実施した。
調製後、血小板をGelSepキット、10%熱不活化ヒト血清(インキュベーション緩衝液)の緩衝液2に再懸濁し、1時間インキュベートした。特異性を検査するために、ビオチニル化抗体であるヒト抗Tie1(E3)、ヒト抗ストレプトアビジン(A2−SV、Tie1と結合しない抗体)、ヒト抗FITCおよびヤギ抗Tie(R&D systems)を、1検査あたり500000血小板とともに、異なる希釈(2μg/ml、10μg/ml)で一時間、室温でインキュベートした。血小板を遠心分離により10分間611gで遠沈させた。インキュベーションとインキュベーションの間に血小板をGelSepキットの緩衝液1で二回洗浄した。次いで、抗CD42−PercPまたは抗CD62−PercPとともにストレプトアビジン−R−フィコエリトリンを室温にて30分間、インキュベーション緩衝液中でインキュベートした。最後のインキュベーションおよび洗浄後に、結合タンパク質の検出をFACSscanおよびEpics Altra(Becton Dickinson,Oxnard,Coulter)によるフローサイトメトリーを用いて実施し、結果を分析した。細胞は、非活性化血小板を用いた場合、全血小板についてSSCおよび抗CD42−PercP上でゲート(gate)され、活性化血小板についてSSCおよび抗CD62−PercP上でゲートされた。
ポリクローナルヤギ抗Tie−1抗体は、検査された条件下に血小板に実際に結合する。この結合は、血小板が活性化されている場合は少ない。コントロール的に、ヒト抗Tie1抗体E3は、全血小板に対しても、活性化血小板に対しても有意な結合を示さない(図1)。
(実施例10:抗Tie1 E3−IgGによる免疫沈降を使用したヒト血小板におけるTie1免疫反応性の評価)
Tie−1に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清(R&D Systems)を用いる以前の研究は、ヒト血小板への結合を示した(Tsiamis et al.,2000)。この研究からの結論は、血小板が、Tie1の発達の問題を示し得るTie−1免疫反応性の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体E3が血小板に結合する可能性を排除するために、血小板およびHUVECから調製された溶解物の免疫沈降を実施した。活性化と不活性化の両方の血小板を調査した。
Tie−1に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清(R&D Systems)を用いる以前の研究は、ヒト血小板への結合を示した(Tsiamis et al.,2000)。この研究からの結論は、血小板が、Tie1の発達の問題を示し得るTie−1免疫反応性の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体E3が血小板に結合する可能性を排除するために、血小板およびHUVECから調製された溶解物の免疫沈降を実施した。活性化と不活性化の両方の血小板を調査した。
抗Tie−1抗体であるB2、D11、E3、ヤギポリクローナル抗体AF619(R&D)およびネガティブコントロール抗体抗FITCおよび抗ストレプトアビジンを使用した。HUVECをトリプシン処理により培養皿から回収し、血小板を血小板GelSepキット(Biocytex,Marseille,France)を製造者の指針に従って用い、調製した。一回の免疫沈降実験につき、3〜5×106および3×108細胞血小板を、検査された各抗体のために使用した。血小板および細胞をPBSで洗浄し、1400rpmで4分間遠沈させ、上清を除去した。次いで、細胞を、50mMトリスHCl、pH7.5、150mM NaCl、0.5%デオキシコール酸(DOC)および0.5%NP−40を含む1ml細胞溶解緩衝液中で5分間、溶解させた。溶解した細胞を10分間、14,000rpmで遠沈させ、5μg/ml抗体を上清に加え、ローテータ上で4℃にてインキュベートした。100μl/サンプルプロテインAビーズ(Uppsala,Sweden)を細胞溶解緩衝液で3回洗浄し(遠心速度:15秒、2000rpm)、次いで抗体とともにインキュベートした細胞溶解物を、4℃にて30分間加えた。次いで、ビーズを、50mMトリスHCl、pH7.5、400mM NaCl、0.5%DOC、0.5%NP−40を含む洗浄緩衝液で3回洗浄した。最後に、ビーズを遠沈させ、ペレットをサンプル緩衝液に等量で再懸濁させて、SDS−pageおよびウェスタンブロッティングを実施した。ウェスタンブロッティングにおいて、Tie−1をポリクローナルヤギ抗Tie−1抗体で検出した。この研究の結論は、E3は、HUVECにおいてTie−1を免疫沈降し得るが、血小板においては免疫沈降し得ないということである。
(実施例8:抗Tie1 E3−IgGによる染色によって決定されたHUVEC細胞中のTie1の分布)
本発明者らは、HUVEC中のE3の染色パターンを、共焦点顕微鏡を使用して分析した。HUVECをトリプシン処理し、PBSで洗浄し、60000細胞の密度でゼラチン被覆顕微鏡スライド上にスポットし、24時間加湿インキュベーターで37℃にてインキュベートした。細胞を風乾し、4%パラホルムアルデヒドで室温にて20分間固定した。スライドを、PBSで洗浄した。これらのスライドを、10%熱不活化ヒト血清(インキュベーション緩衝液)とともにインキュベートした。
本発明者らは、HUVEC中のE3の染色パターンを、共焦点顕微鏡を使用して分析した。HUVECをトリプシン処理し、PBSで洗浄し、60000細胞の密度でゼラチン被覆顕微鏡スライド上にスポットし、24時間加湿インキュベーターで37℃にてインキュベートした。細胞を風乾し、4%パラホルムアルデヒドで室温にて20分間固定した。スライドを、PBSで洗浄した。これらのスライドを、10%熱不活化ヒト血清(インキュベーション緩衝液)とともにインキュベートした。
Tie−1への特異的な結合を測定するために、ビオチニル化抗体E3およびビオチニル化ネガティブコントロール抗体A2を、10μg/mlの濃度で使用し、室温にて一時間インキュベートした。スライドを、PBSで二回洗浄した。次いで、ストレプトアビジン−R−フィコエリトリン(Dako,Glostrup、Denmark)を加え、室温にて一時間インキュベートした。最後のインキュベーションおよび洗浄後、結合抗体の検出を、共焦点顕微鏡を用いて実施した。
E3は、共焦点顕微鏡により検出されたように特異的にHUVECに結合する。染色は主に細胞内に位置し、細胞表面局在Tie1の小さいプールと比べてTie1の大きな細胞内プールを示唆する。このE3の所在は、細胞骨格タンパク質とTie1との共存と一致した。
(実施例9:抗Tie1 E3のフレームワーク領域に置かれた体細胞変異の生殖細胞系列残基への変換)
ヒトにおけるE3の潜在的な免疫原性を減少させるために、LCフレームワーク領域中のすべての非生殖細胞系列アミノ酸残基を訂正して生殖細胞系列に戻した。E3のLCを、すべてのκおよびλ軽鎖生殖細胞系列遺伝子を含むデータベースで調製した最初の分析を実施した。このE3のLCは、DPK4に最も近い相同性を有することが示され、生殖細胞系列フレームワーク領域に対してE3中に三つの置換が同定された。
ヒトにおけるE3の潜在的な免疫原性を減少させるために、LCフレームワーク領域中のすべての非生殖細胞系列アミノ酸残基を訂正して生殖細胞系列に戻した。E3のLCを、すべてのκおよびλ軽鎖生殖細胞系列遺伝子を含むデータベースで調製した最初の分析を実施した。このE3のLCは、DPK4に最も近い相同性を有することが示され、生殖細胞系列フレームワーク領域に対してE3中に三つの置換が同定された。
本発明者らは、DPK4生殖細胞系列フレームワーク領域と同一の配列を含むようにLCフレームワーク領域を改変したE3の生殖細胞系列の変種を構築した。生殖細胞系列E3抗体は、所望の配列をコードする核酸を設計することにより構築した。E3 LC変異ドメインをコードする核酸に対する変更は、PCRおよび他の標準的な分子生物学的技術により行い、核酸配列決定により確かめた。
例示的な生殖細胞系列化軽鎖可変ドメインE3配列は以下のとおりである:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGHYLAWYQQKPGKVPKLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQFNSYPHTFGQGTRLEIK(配列番号159)。変更位置に下線が付けてある。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGHYLAWYQQKPGKVPKLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQFNSYPHTFGQGTRLEIK(配列番号159)。変更位置に下線が付けてある。
本発明者らは、E3抗体の生殖細胞系列化変種を可溶性FabおよびIgGの両方として生成した。ポジティブsFABを発現するクローンのFabカセットを、オリゴヌクレオチドでPCR増幅し、ヒトIgG4Fc領域を含む哺乳動物の発現ベクター中に連結し、XL1 Blue MRF’細胞中にエレクトロポレートした。原核リボソーム結合配列および遺伝子の3リーダー配列を哺乳動物の内部リボソーム入口および重鎖リーダー配列によって置換した。再フォーマットした抗体クローンを配列決定してクローニング操作後に正確性を確かめた。無エンドトキシンDNAを調製し、一時的トランスフェクションの研究に用いた。
(実施例10:ELISAにおける組換えTie1−Fcへの結合のための生殖細胞系列化抗Tie1 E3−Fabの生成および検査)
E3フレームワークの任意の体細胞変異の生殖細胞系列残基への変換が、結合活性になんらかの効果を有するかどうかを評価するために、可溶性Fabを生成した。親E3 Fabを含む可溶性発現ベクターおよび生殖細胞系列化E3 Fab構築物を、100μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを含む2×TYブロスで30℃にて一晩生育し、この一晩の培養物の4mlを使用して、100μg/mlのアンピシリンおよび0.1%のグルコースを含む400mlの2×TYブロスに接種した。細胞を37℃で0.8〜1.0のOD600まで生育し、1mMのIPTGを加え、培養物を30℃で4時間維持した。培養物を4,000rpmで4℃にて15分間遠沈させた。上清を捨て、ペレットを、プロテアーゼ阻害物質(プロテアーゼ阻害物質反応混液錠剤[Roche]:1錠剤を1mlの水に溶解し、TES緩衝液で50倍に希釈する)を含む4.8mlの氷冷TES緩衝液(0.2Mトリス塩酸、0.5mM EDTA、0.5Mスクロース、pH8.0)に再懸濁させた。50mlのFalconチューブに移し、氷上に5〜10分間置く。このインキュベーション中、遠心ボトルを、プロテアーゼ阻害物質を含む5.25mlのTES:H2O(1:3)で洗浄し、これを細胞に加える。20分間以上氷上でインキュベートする。3000gで4℃にて15分間回転させ、上清を新しい遠心チューブに移す。細胞ペレットを、15mMのMgSO4およびプロテアーゼ阻害物質を含む6mlのTESに再懸濁し、氷上で15分間インキュベートする。3000gで15分間、4℃にて遠心する。上清を遠心チューブに移し、8000gで4℃にて20分間回転させる。上清を集め、PBSに対して透析する。Fabを金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。透析したペリプラズム抽出物を1mlのTALON(商標)金属アフィニティー樹脂(Clontech)とともにインキュベートし、室温にて2時間回転させる。ビーズを空の重力カラム(Poly−Prepクロマトグラフィーカラム、Bio−Rad、カタログ731−1550)に移す。ビーズをPBS中の5mMイミダゾールで洗浄し、FabをPBS中の150mMイミダゾールにより溶出する。透析カセット(SLIDE−A−LYSER(商標)透析カセット、MWCO 10,000、Pierce、カタログ番号66380)を使用してPBSに対して透析し、1mg/ml溶液が0.86の吸光度を有するとみなして280nmでの吸光度からタンパク質濃度を決定する。調製物の品質を、還元および非還元SDS−PAGEにより分析し得る。
E3フレームワークの任意の体細胞変異の生殖細胞系列残基への変換が、結合活性になんらかの効果を有するかどうかを評価するために、可溶性Fabを生成した。親E3 Fabを含む可溶性発現ベクターおよび生殖細胞系列化E3 Fab構築物を、100μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを含む2×TYブロスで30℃にて一晩生育し、この一晩の培養物の4mlを使用して、100μg/mlのアンピシリンおよび0.1%のグルコースを含む400mlの2×TYブロスに接種した。細胞を37℃で0.8〜1.0のOD600まで生育し、1mMのIPTGを加え、培養物を30℃で4時間維持した。培養物を4,000rpmで4℃にて15分間遠沈させた。上清を捨て、ペレットを、プロテアーゼ阻害物質(プロテアーゼ阻害物質反応混液錠剤[Roche]:1錠剤を1mlの水に溶解し、TES緩衝液で50倍に希釈する)を含む4.8mlの氷冷TES緩衝液(0.2Mトリス塩酸、0.5mM EDTA、0.5Mスクロース、pH8.0)に再懸濁させた。50mlのFalconチューブに移し、氷上に5〜10分間置く。このインキュベーション中、遠心ボトルを、プロテアーゼ阻害物質を含む5.25mlのTES:H2O(1:3)で洗浄し、これを細胞に加える。20分間以上氷上でインキュベートする。3000gで4℃にて15分間回転させ、上清を新しい遠心チューブに移す。細胞ペレットを、15mMのMgSO4およびプロテアーゼ阻害物質を含む6mlのTESに再懸濁し、氷上で15分間インキュベートする。3000gで15分間、4℃にて遠心する。上清を遠心チューブに移し、8000gで4℃にて20分間回転させる。上清を集め、PBSに対して透析する。Fabを金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。透析したペリプラズム抽出物を1mlのTALON(商標)金属アフィニティー樹脂(Clontech)とともにインキュベートし、室温にて2時間回転させる。ビーズを空の重力カラム(Poly−Prepクロマトグラフィーカラム、Bio−Rad、カタログ731−1550)に移す。ビーズをPBS中の5mMイミダゾールで洗浄し、FabをPBS中の150mMイミダゾールにより溶出する。透析カセット(SLIDE−A−LYSER(商標)透析カセット、MWCO 10,000、Pierce、カタログ番号66380)を使用してPBSに対して透析し、1mg/ml溶液が0.86の吸光度を有するとみなして280nmでの吸光度からタンパク質濃度を決定する。調製物の品質を、還元および非還元SDS−PAGEにより分析し得る。
0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8.5)100マイクロリットルあたり、500ngまたは50ngの精製組換えヒトTie1−Fc標的抗原でIMMULON(商標)2HBプレートのウェルを一晩被覆した。親のE3、E3生殖細胞系列(E3g)またはネガティブコントロール可溶性Fabを、PBSTの100マイクロリットルあたり5マイクログラムかまたは1マイクログラムでウェルに充填した。組換えヒトTie1−Fc標的抗原を、適切な量の酢酸に溶解し、次に0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9.6)中に100マイクロリットルあたり500ngおよび50ngの最終濃度に希釈する。標的抗原をウェルに加えた後、マイクロタイタープレートを一晩4℃でインキュベートする。次に、このプレートをPBSTで5回洗浄し、37℃で2時間、PBS中の1%BSAでブロックする。このプレートを再び洗浄緩衝液でプレート回洗浄し、PBSTおよびPBST100マイクロリットルあたり5または1マイクログラムの精製Fabの1ウェルあたり100マイクロリットルを加えた後、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで7回洗浄した後、PBST中の抗sFab−HRPの100マイクロリットルの1:5000希釈物を加えた(Pierce Product#31414)。ウェルを7回洗浄した後、100マイクロリットルのTMB−H2O2溶液を各ウェルに加え、プレートをELISAで630nmにて読んだ。E3および生殖細胞系列化E3の両方が、このアッセイで組換えヒトTie−1−Fc標的抗原に結合した。
(実施例11:BIAコアにおける組換えヒトTie1への結合のための生殖細胞系列化抗Tie1 E3−Fabの生産および検査)
組換え精製ヒトTie1 −Fc抗原(原液 2.45mg/ml)を、EZ−リンクスルホ−NHS−SS−ビオチン(Pierce,カタログ21331)を使用してビオチニル化した。この反応を、2時間、氷上で、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中で、5倍モル過剰のビオチニル化剤の存在下で実施し、トリスHCl、pH7.5(50mM最終濃度)を加えて停止し、続いて氷上で1時間インキュベートした。次いで、サンプルをPBSに対して透析した。次いで、抗原をHBS中で1/100倍に希釈し、次いで、ストレプトアビジンチップ上に捕捉した。これを830RU(共鳴単位)の密度に被覆した。すべての分析を、HBS緩衝液中で実施した。親Fab E3および生殖細胞系列化E3 Fabを上記のように調製した。0.587mg/ml(11740nM)の原液をHBS+BSA中で1/587に希釈して、20nMの原液を得て、生殖細胞系列化Fab E3 0.025mg/ml(500nM)をHBS+BSA中で1/25に希釈して20nMの原液を得た。連続的な希釈物を各Fab調製物から作製し、10nM、5nM、2.5nMおよび1.25nM溶液を得た。会合フェーズとして、サンプルを30μl/分で4分間、注入(kinject)プログラムを使用して注入した。10分間の解離フェーズが続き、いずれの残っているサンプルも、18秒間の5mM NaOH+1M NaClの一回の注入によりTie−1 Fc表面から50μl/分の流速で取り除いた。すべてのサンプルについて実施し、2部1式(in duplicate)で分析した。
組換え精製ヒトTie1 −Fc抗原(原液 2.45mg/ml)を、EZ−リンクスルホ−NHS−SS−ビオチン(Pierce,カタログ21331)を使用してビオチニル化した。この反応を、2時間、氷上で、50mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6中で、5倍モル過剰のビオチニル化剤の存在下で実施し、トリスHCl、pH7.5(50mM最終濃度)を加えて停止し、続いて氷上で1時間インキュベートした。次いで、サンプルをPBSに対して透析した。次いで、抗原をHBS中で1/100倍に希釈し、次いで、ストレプトアビジンチップ上に捕捉した。これを830RU(共鳴単位)の密度に被覆した。すべての分析を、HBS緩衝液中で実施した。親Fab E3および生殖細胞系列化E3 Fabを上記のように調製した。0.587mg/ml(11740nM)の原液をHBS+BSA中で1/587に希釈して、20nMの原液を得て、生殖細胞系列化Fab E3 0.025mg/ml(500nM)をHBS+BSA中で1/25に希釈して20nMの原液を得た。連続的な希釈物を各Fab調製物から作製し、10nM、5nM、2.5nMおよび1.25nM溶液を得た。会合フェーズとして、サンプルを30μl/分で4分間、注入(kinject)プログラムを使用して注入した。10分間の解離フェーズが続き、いずれの残っているサンプルも、18秒間の5mM NaOH+1M NaClの一回の注入によりTie−1 Fc表面から50μl/分の流速で取り除いた。すべてのサンプルについて実施し、2部1式(in duplicate)で分析した。
センサーグラムを、BIAEVALUATION(商標)ソフトウエア3.1で1:1モデルを用いる同時ka/kd適合プログラムを使用して分析した。分析から、E3抗体の生殖細胞系列化は抗体の結合活性に対して最少の効果を有したことがわかる。
(実施例12:BIAコアを使用した組換えヒトTie1への結合についての生殖細胞系列化抗Tie1 E3−IgGと親抗Tie1 E3との親和性比較)
結合挙動が、体細胞変異の生殖細胞系列残基へ変換して戻すことにより影響を受けるかどうかを評価するために、生殖細胞系列化抗体を生成し、IgGとして検査した。生殖細胞系列化E3−IgG構築物を使用してHEK293T細胞に一時的にトランスフェクトし、この構築物を精製した。
結合挙動が、体細胞変異の生殖細胞系列残基へ変換して戻すことにより影響を受けるかどうかを評価するために、生殖細胞系列化抗体を生成し、IgGとして検査した。生殖細胞系列化E3−IgG構築物を使用してHEK293T細胞に一時的にトランスフェクトし、この構築物を精製した。
生殖細胞系列化E3 IgG1原液0.63mg/mlをpH4.5の緩衝液で1/50に希釈し、親E3 IgG1原液0.56mg/ml(2143−001)をpH4.5の緩衝液で1/50に希釈した。IgGを直接的にCM5チップに被覆した。チップの表面を0.05M NHS/0.2M EDCの7分間のパルスで活性化させ、780RU生殖細胞系列化E3−IgGおよび728非生殖細胞系列E3 IgGが表面に被覆されるまでIgGを流した。すべてのフロー細胞を、続いて1M塩酸エタノールアミン、pH8.5の7分間のパルスで脱活性化した。すべての分析をHBS緩衝液中で実施した。精製組換えヒトTie1 FcをHBSで1/28.7に希釈して、400nMの原液を得た。連続的な希釈物を作製して、200nM、100nM、50nMおよび25nMのTie1 Fc原液を得た。会合フェーズの分析ために、サンプルは30μl/分で8.3分間、注入(kinject)プログラムを使用して注入した。この後に40分間の解離フェーズが続いた。表面に会合して残っている任意の抗原を、30秒間の10mMグリシン、pH1.5の二回の注入によりIgG表面から50μl/分の流速で剥ぎ取った。すべてのサンプルについて実施し、2部1式で分析した。
センサーグラムを、BIAEVALUATION(商標)ソフトウエア3.1で1:1モデルを用いる同時ka/kd適合プログラムを使用して分析した。生殖細胞系列化はヒトTie1
Fcに関してE3 IgGの結合活性に対して最少の影響力を有した。
Fcに関してE3 IgGの結合活性に対して最少の影響力を有した。
(実施例13:BIAコア中の組換えマウスTie1への結合のための生殖細胞系列化抗Tie1 E3−Fabの生産および試験)
マウスTie1−Fc抗原(0.5mg/ml原液)を、確立された手順を使用してビオチニル化し、HBSで1/100倍に希釈後、これをストレプトアビジンチップへの捕捉に使用した。これを740RUの共鳴値に被覆した。すべての分析をHBS緩衝液中で実施した。親Fab E3 0.587mg/ml(11740nM)をHBS+BSA中で1/587に希釈し、20nMの原液を得、生殖細胞系列化Fab E3 0.025mg/ml(500nM)をHBS+BSA中で1/25に希釈して20nMの原液を得た。連続的な希釈物を各Fab調製物から作製し、10nM、5nM、2.5nMおよび1.25nMを得た。会合フェーズのために、サンプルは30μl/分で4分間、注入(kinject)プログラムを用いて注入した。この後に10分間の解離フェーズが続き、いずれの残っているサンプルも、18秒間の50mM NaOH+1M NaClの一回の注入によりTie1 Fc表面から50μl/分の流速で剥ぎ取った。すべてのサンプルについて実施し、2部1式で分析した。
マウスTie1−Fc抗原(0.5mg/ml原液)を、確立された手順を使用してビオチニル化し、HBSで1/100倍に希釈後、これをストレプトアビジンチップへの捕捉に使用した。これを740RUの共鳴値に被覆した。すべての分析をHBS緩衝液中で実施した。親Fab E3 0.587mg/ml(11740nM)をHBS+BSA中で1/587に希釈し、20nMの原液を得、生殖細胞系列化Fab E3 0.025mg/ml(500nM)をHBS+BSA中で1/25に希釈して20nMの原液を得た。連続的な希釈物を各Fab調製物から作製し、10nM、5nM、2.5nMおよび1.25nMを得た。会合フェーズのために、サンプルは30μl/分で4分間、注入(kinject)プログラムを用いて注入した。この後に10分間の解離フェーズが続き、いずれの残っているサンプルも、18秒間の50mM NaOH+1M NaClの一回の注入によりTie1 Fc表面から50μl/分の流速で剥ぎ取った。すべてのサンプルについて実施し、2部1式で分析した。
センサーグラムを、BIAEVALUATION(商標)ソフトウエア3.1で1:1モデルを用いる同時ka/kd適合プログラムを使用して分析した。E3抗体の生殖細胞系列化は、抗体の結合活性に対して最少の効果を有した。
(実施例14:BIAコアを使用した組換えマウスTie1への結合に対する生殖細胞系列化抗Tie1 E3−IgGと親抗Tie1 E3との親和性比較)
結合挙動が、体細胞変異の生殖細胞系列へ変換して戻ることにより影響を受けるかどうかを評価するために、生殖細胞系列化抗体を生成し、IgGとして検査した。生殖細胞系列化E3を記載されるようにIgGに再フォーマットした。次いで、これを使用してHEK293T細胞に確立された手順を使用して一時的にトランスフェクトした。IgGを、確立された手順を使用するプロテインAカラムクロマトグラフィーを使用して培養上清から精製し、次いで、得られたIgGを、表面プラズモン共鳴(BIAコア)を使用して結合活性について検査した。生殖細胞系列化E3 IgG1原液0.63mg/ml(2146−002)を、pH4.5の緩衝液で1/50に希釈し、親E3 IgG1原液0.56mg/ml(2143−001)を、pH4.5の緩衝液で1/50に希釈した。IgGを直接的にCM5チップに被覆した。チップの表面を、0.05M NHS/0.2M EDCの7分間のパルスで活性化し、780RU生殖細胞系列E3−IgGおよび728非生殖細胞系列化E3 IgGが表面を被覆されるまでIgGを流した。すべての流れる細胞を、次に1M 塩酸エタノールアミン、pH8.5の7分間のパルスで脱活性化した。すべての分析を、HBS緩衝液中で実施した。精製した組換えマウスTie1 FcをHBSで1/6.5に希釈して、400nMの原液を得た。連続的な希釈物を作製し、200nM、100nM、50nMおよび25nMのTie1 Fc原液を得た。会合フェーズの分析ために、サンプルを30μl/分で8.3分間、注入(kinject)プログラムを使用して注入した。この後に40分間の解離フェーズが続いた。表面に会合して残っているいずれの抗原も、30秒間の10mMグリシン、pH1.5の二回の注入によりIgG表面から50μl/分の流速で除去した。すべてのサンプルについて実施し、2部1式で分析した。
結合挙動が、体細胞変異の生殖細胞系列へ変換して戻ることにより影響を受けるかどうかを評価するために、生殖細胞系列化抗体を生成し、IgGとして検査した。生殖細胞系列化E3を記載されるようにIgGに再フォーマットした。次いで、これを使用してHEK293T細胞に確立された手順を使用して一時的にトランスフェクトした。IgGを、確立された手順を使用するプロテインAカラムクロマトグラフィーを使用して培養上清から精製し、次いで、得られたIgGを、表面プラズモン共鳴(BIAコア)を使用して結合活性について検査した。生殖細胞系列化E3 IgG1原液0.63mg/ml(2146−002)を、pH4.5の緩衝液で1/50に希釈し、親E3 IgG1原液0.56mg/ml(2143−001)を、pH4.5の緩衝液で1/50に希釈した。IgGを直接的にCM5チップに被覆した。チップの表面を、0.05M NHS/0.2M EDCの7分間のパルスで活性化し、780RU生殖細胞系列E3−IgGおよび728非生殖細胞系列化E3 IgGが表面を被覆されるまでIgGを流した。すべての流れる細胞を、次に1M 塩酸エタノールアミン、pH8.5の7分間のパルスで脱活性化した。すべての分析を、HBS緩衝液中で実施した。精製した組換えマウスTie1 FcをHBSで1/6.5に希釈して、400nMの原液を得た。連続的な希釈物を作製し、200nM、100nM、50nMおよび25nMのTie1 Fc原液を得た。会合フェーズの分析ために、サンプルを30μl/分で8.3分間、注入(kinject)プログラムを使用して注入した。この後に40分間の解離フェーズが続いた。表面に会合して残っているいずれの抗原も、30秒間の10mMグリシン、pH1.5の二回の注入によりIgG表面から50μl/分の流速で除去した。すべてのサンプルについて実施し、2部1式で分析した。
センサーグラムを、BIAEVALUATION(商標)ソフトウエア3.1で1:1モデルを用いる同時ka/kd適合プログラムを使用して分析した。生殖細胞系列化プロセスは、マウスTie1 Fcに関するE3 IgGの結合活性に対し、最少の影響力を有した。
(実施例15:HUVECを用いる管形成アッセイにおける生殖細胞系列抗Tie1−E3および親抗Tie1−E3のIC50の比較)
生殖細胞系列化E3(DX−2220)とその親抗体(DX−2200)を、コラーゲンタイプIマトリックス中の管形成アッセイで評価した。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)(新しく単離したもの)を、ヒト臍帯静脈をトリプシン−EDTA(1×)(Gibco/Invitrogen)で37℃にて20〜25分間、処理することにより得た。次いで細胞を、接着因子(AF)(Cascade Biologics)で被覆したT−25フラスコ中、10%FCS、0.4%BBE、1% 1−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補ったRPMI1640培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−EDTAで分離し、二代または三代の継代でコンフルエントになったときに使用した。培養中これら細胞を1:2の分離比率で、単層の約60〜80%のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。HUVEC単層を、トリプシン/EDTA(500μl/皿)で37℃にて3分間処理した。トリプシン活性を、3体積分の完全RPMI培地を加えることにより停止した。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰り返すことにより分離し、最後にPBSで洗浄した。HUVEC(継代2)を、7.5体積分の2mg/mlコラーゲン(コラーゲンR;Serva,Heidelberg,Germany)、1体積分の10×MEM、1.5体積分のNaHCO3(15.6mg/ml)を混合することにより調製されたコラーゲンゲル(1.5mg/mlのコラーゲンI 50μl)上のそれらの培養培地(96−ウエルプレートの40×103/50μl/ウェル)にまき、約1体積分のNaOHによりpHを7.4に調節した。次いで、1時間30分後、培養培地を捨て、細胞をコラーゲンの新しい層(1.5mg/ml、新しい調製物、50μl/ウェル)で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、E3抗体(DX−2200)または生殖細胞系列化E3抗体(DX−2220)(0.1ng/ml〜100ng/ml)の存在下または不存在下に各ウェルに加えた。培養表面上の管ネットワークの全長を、METAVUE(商標)ソフトウエア(Universal Imaging Corporation)により×40倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を視野±SEM(相対単位)あたりの平均脈管面積として表した。各アッセイを少なくとも3回実施した。その結論は、3体細胞変異のE3中の生殖細胞系列アミノ酸への変換はE3の効力にほとんど効果を有さなかったということである。親E3(図2Aおよび図2B)および生殖細胞系列E3(図2Cおよび図2D)の両方は、10ng/ml未満、すなわち66pMのIC50を有してインビトロで管形成を阻害する。
生殖細胞系列化E3(DX−2220)とその親抗体(DX−2200)を、コラーゲンタイプIマトリックス中の管形成アッセイで評価した。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)(新しく単離したもの)を、ヒト臍帯静脈をトリプシン−EDTA(1×)(Gibco/Invitrogen)で37℃にて20〜25分間、処理することにより得た。次いで細胞を、接着因子(AF)(Cascade Biologics)で被覆したT−25フラスコ中、10%FCS、0.4%BBE、1% 1−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補ったRPMI1640培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−EDTAで分離し、二代または三代の継代でコンフルエントになったときに使用した。培養中これら細胞を1:2の分離比率で、単層の約60〜80%のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。HUVEC単層を、トリプシン/EDTA(500μl/皿)で37℃にて3分間処理した。トリプシン活性を、3体積分の完全RPMI培地を加えることにより停止した。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰り返すことにより分離し、最後にPBSで洗浄した。HUVEC(継代2)を、7.5体積分の2mg/mlコラーゲン(コラーゲンR;Serva,Heidelberg,Germany)、1体積分の10×MEM、1.5体積分のNaHCO3(15.6mg/ml)を混合することにより調製されたコラーゲンゲル(1.5mg/mlのコラーゲンI 50μl)上のそれらの培養培地(96−ウエルプレートの40×103/50μl/ウェル)にまき、約1体積分のNaOHによりpHを7.4に調節した。次いで、1時間30分後、培養培地を捨て、細胞をコラーゲンの新しい層(1.5mg/ml、新しい調製物、50μl/ウェル)で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、E3抗体(DX−2200)または生殖細胞系列化E3抗体(DX−2220)(0.1ng/ml〜100ng/ml)の存在下または不存在下に各ウェルに加えた。培養表面上の管ネットワークの全長を、METAVUE(商標)ソフトウエア(Universal Imaging Corporation)により×40倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を視野±SEM(相対単位)あたりの平均脈管面積として表した。各アッセイを少なくとも3回実施した。その結論は、3体細胞変異のE3中の生殖細胞系列アミノ酸への変換はE3の効力にほとんど効果を有さなかったということである。親E3(図2Aおよび図2B)および生殖細胞系列E3(図2Cおよび図2D)の両方は、10ng/ml未満、すなわち66pMのIC50を有してインビトロで管形成を阻害する。
予備研究は、DX−2240 Fabの一価のFabバージョンがHUVECにおける管形成を阻害し得ないことを示した。したがって、このアッセイにおいて、細胞ベースのアッセイでの効果を誘発するために二価性が必要である。
(実施例16:マウス内皮細胞を用いた管形成アッセイにおける生殖細胞系列化抗Tie1−E3の分析)
マウスTie1交差反応性およびマウスTie1に対する生物活性を評価するために、E3および生殖細胞系列化E3の両方を、マウス内皮細胞系(LEII)を使用してインビトロでの管形成を阻害する能力について評価した。
マウスTie1交差反応性およびマウスTie1に対する生物活性を評価するために、E3および生殖細胞系列化E3の両方を、マウス内皮細胞系(LEII)を使用してインビトロでの管形成を阻害する能力について評価した。
LEII肺マウス内皮細胞系(ATCC)を、T−25フラスコで、10%FCSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補ったGLUTAMAX(商標)(Life Technology Ltd.,Paisley,Scotland)を有するMEM培地中で培養した。培養中、細胞を1:5の分離比率で、単層の約80%のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。LEII単層を、トリプシン/EDTA(500μl/皿)で37℃にて3分間処理した。トリプシン活性は3体積分の完全MEM培地を加えることにより停止した。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰り返すことにより分離し、最後にPBSで洗浄した。LEII細胞を、基底膜(BIOCOAT(商標) Angiogenesis System;Becton Dickinson)上のそれらの培養培地(96ウエルプレートの20〜40×103/50μl)にまいた。MATRIGEL(商標)(37℃にて30分間、5%CO2環境)の重合後、所望の分子(4.105細胞/ml;50μl/ウエル)の存在下に完全培養培地に再懸濁させた内皮細胞懸濁液を各ウェルに加えた。次いで、血管形成アッセイプレートを37℃にて16〜18時間、5%CO2雰囲気でインキュベートした。次いで、管ネットワークの全長を、METAVUE(商標)ソフトウエア(Universal Imaging Corporation)により×40倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を、視野±SEM(相対単位)あたりの平均脈管面積として表した。各アッセイを少なくとも2回実施した。生殖細胞系列化E3はマウス内皮細胞における管形成の強力な阻害物質である。
(実施例17:抗Tie1−E3IgGを使用したマウス腫瘍組織切片の免疫組織学的分析)
本発明者らは、抗体E3がマウス異種移植片(xenograft)におけるマウス内皮細胞に結合するかどうかを決定した。免疫組織化学は、ビオチニル化E3 IgG1(a,zアロタイプ)抗体およびコントロール抗体である抗CD31(内皮細胞特異的マーカー)および抗PCNA(増殖細胞核抗原)を用いて実施した。SW480細胞(ATCC)を含むマウス異種移植片からのホルマリン固定腫瘍組織を、ヒト抗Tie1抗体E3の結合パターンについて検査した。パラフィン包埋組織の5μm切片を脱パラフィンし、再水和し、温かいクエン酸緩衝液(0.01Mクエン酸ナトリウム、95℃にてpH6)で45分間で前処理した。スライドを新しいクエン酸緩衝液で20分間冷却し、蒸留水ですすいだ。スライドを過酸化水素処理し(PBS中0.3%H2O2)、5%FCS、5%熱不活性化ヒト血清(HS)を含むPBSととともに1時間プレインキュベートした。抗体のインキュベーションとインキュベーションとの間に、スライドを3回5分間、PBSで洗浄した。ビオチニル化抗体E3とA2をPBS、10%HSで10μg/mlの濃度まで希釈し、1時間室温でインキュベートした。次に、スライドをアビジン−HRP(Dako)とともに30分間、室温でインキュベートした。染色をAEC(Vector Laboratories, Burlingame)とH2O2により検出した。ペルオキシダーゼ反応を水を加えて停止し、スライドをヘマトキシリンで向流染色した。組織をそれらの結合反応性について評価した。染色パターンは、マウス内皮細胞Tie1の染色に一致し、E3によって発現されるTie1はまた、マウス異種移植中のSW480腫瘍細胞により発現されるTie1に結合する。
本発明者らは、抗体E3がマウス異種移植片(xenograft)におけるマウス内皮細胞に結合するかどうかを決定した。免疫組織化学は、ビオチニル化E3 IgG1(a,zアロタイプ)抗体およびコントロール抗体である抗CD31(内皮細胞特異的マーカー)および抗PCNA(増殖細胞核抗原)を用いて実施した。SW480細胞(ATCC)を含むマウス異種移植片からのホルマリン固定腫瘍組織を、ヒト抗Tie1抗体E3の結合パターンについて検査した。パラフィン包埋組織の5μm切片を脱パラフィンし、再水和し、温かいクエン酸緩衝液(0.01Mクエン酸ナトリウム、95℃にてpH6)で45分間で前処理した。スライドを新しいクエン酸緩衝液で20分間冷却し、蒸留水ですすいだ。スライドを過酸化水素処理し(PBS中0.3%H2O2)、5%FCS、5%熱不活性化ヒト血清(HS)を含むPBSととともに1時間プレインキュベートした。抗体のインキュベーションとインキュベーションとの間に、スライドを3回5分間、PBSで洗浄した。ビオチニル化抗体E3とA2をPBS、10%HSで10μg/mlの濃度まで希釈し、1時間室温でインキュベートした。次に、スライドをアビジン−HRP(Dako)とともに30分間、室温でインキュベートした。染色をAEC(Vector Laboratories, Burlingame)とH2O2により検出した。ペルオキシダーゼ反応を水を加えて停止し、スライドをヘマトキシリンで向流染色した。組織をそれらの結合反応性について評価した。染色パターンは、マウス内皮細胞Tie1の染色に一致し、E3によって発現されるTie1はまた、マウス異種移植中のSW480腫瘍細胞により発現されるTie1に結合する。
(実施例18:MATRIGEL(登録商標)プラグ試験におけるE3活性)
E3IgG抗体の生殖細胞系の変異体をMATRIGEL(登録商標)プラグにおいてbFGFにより誘導された新脈管形成に関するインビボ試験において評価した。成長因子低減MATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences、カタログ番号354230)にbFGF(R&D Systems、カタログ番号234−FSE)を80ng/ml添加した。A2−SVまたはIgG4E3抗体(10μg/ml)またはPBSをNMRInu/nuマウスの腹部領域に皮下注射した(マトリゲル150μl/プラグ)。
E3IgG抗体の生殖細胞系の変異体をMATRIGEL(登録商標)プラグにおいてbFGFにより誘導された新脈管形成に関するインビボ試験において評価した。成長因子低減MATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences、カタログ番号354230)にbFGF(R&D Systems、カタログ番号234−FSE)を80ng/ml添加した。A2−SVまたはIgG4E3抗体(10μg/ml)またはPBSをNMRInu/nuマウスの腹部領域に皮下注射した(マトリゲル150μl/プラグ)。
第1の試験においては、bFGFおよび可溶性VEGFR−1(10μg/ml)を添加したMATRIGEL(登録商標)をマウス2匹に注射し、新脈管形成阻害剤に関するポジティブコントロールとした。移植後7日においてマウスを麻酔し、リン酸塩緩衝食塩水(PBS)中4%パラホルムアルデヒド(PFA)を心臓を介して灌流した。MATRIGEL(登録商標)プラグおよび肝臓の小片を摘出し、パラフィン包埋した。切片を切り出し、ヘマトキシリンエオシン染色した(H&E)。
染色によればPBSおよびA2−SV抗体投与プラグにおいてMATRIGEL(登録商標)の修飾および血管様構造の形成が明らかになった。E3抗体および可溶性VEGFR1添加プラグは単細胞を含有していたが、マトリックスの修飾や細胞の組織化の何れもこれ等のプラグには観察されなかった。この結果は生殖細胞系のE3抗体がインビボのMATRIGEL(登録商標)において新脈管形成を阻害することを示している。
第2の試験においては、マウスに上記の通り投与し、次に移植後8日に麻酔し、フルオレセインコンジュゲートトマト(lycopersicon esculemtum)レクチン(PBS200μl中100μg;Vector、カタログ番号FL−1171)を尾静脈内に注射した。5分間循環させた後、PBS10ml、次いでPBS中4%PFA10mlで心臓を介して灌流した。MATRIGEL(登録商標)プラグおよび腎臓の小片を摘出し、OCT(Tissue−Tek)中に凍結した。DAPI(Vector)を含有するVECTASHIELD(商標)マウント用培地を用いて切片上で核を可視化し、蛍光顕微鏡下に分析した。
フルオレセインレクチンによるMATRIGEL(登録商標)の染色によれば、PBSおよびコントロール抗体(A2−SV)を含有するプラグについては染色ポジティブ物質が判明したが、E3抗体含有プラグには染色は観察されなかった。コントロールとして同じマウス由来の腎臓および肝臓の血管はフルオレセインレクチンによる明確な染色を示していなかった。
これ等2つの実験の結果は、抗Tie1抗体E3がbFGF誘導新脈管形成をインビボで阻害できることを示唆している。
E3抗体の潜在的な抗新脈管形成活性を更に検討するために、MATRIGEL(登録商標)プラグにおけるbFGF誘導内皮細胞管形成に対するDX−2210(生殖細胞系軽鎖のE3抗体)の作用を調べる第3の試験を実施した。HUVEC、bFGFおよびXD−2210、A2−SV(ネガティブコントロールIgG)またはPBSを添加した成長因子低減MATRIGEL(登録商標)をBalb/cnu/nuマウスの腹部領域に皮下注射した(150MATRIGEL(登録商標)μl/プラグ)。移植後8日においてマウスを麻酔し、フルオレセインコンジュゲートトマト(lycopersicon esculemtum)レクチンを尾静脈内に注射した。5分間循環させた後、MATRIGEL(登録商標)プラグおよび肝臓と腎臓を摘出し、OCT培地中に凍結した。MATRIGEL(登録商標)プラグ中の血管の量を定量するために、切片を切り出し、抗CD31抗体を用いて内皮細胞含有量に関して染色するか、または、蛍光顕微鏡下に分析することにより機能的血管の量を評価した(トマトレクチン染色)(データ示さず)。更に又、単位面積当たりの血管の量を定量した。これ等の結果はMATRIGEL(登録商標)試験においてDX−2210がbFGF誘導新脈管形成を70%阻害したことを示していた(図3)。
(実施例19:複合体形成に対するリガンドの作用の評価)
Tie1、Tie2およびAngを包含するヘテロマー複合体の形成を阻害することにより、または、ヘテロマー複合体が形成された後にそれを妨害することによりその形成に拮抗する能力について、複合体メンバー、例えばTie1、Tie2およびアンジオポエチンに結合する候補タンパク質(例えばE3またはE3b抗体)を試験する。
Tie1、Tie2およびAngを包含するヘテロマー複合体の形成を阻害することにより、または、ヘテロマー複合体が形成された後にそれを妨害することによりその形成に拮抗する能力について、複合体メンバー、例えばTie1、Tie2およびアンジオポエチンに結合する候補タンパク質(例えばE3またはE3b抗体)を試験する。
複合体形成を妨害する候補タンパク質の能力を試験するために、Tie1およびTie2を発現する細胞に、Tie1および/またはTie2へのAngの結合を可能とするために十分な時間、Angを投与する。複合体が破壊されるために十分な時間、細胞を候補タンパク質と接触させる。細胞に膜非透過***差結合剤、例えばDTSSPを投与することによりタンパク質を化学的に交差結合させる。細胞溶解物を調製し、複合体メンバーに特異的な抗体を用いて免疫沈降に付す。免疫沈降したタンパク質をSDS−PAGE電気泳動で分離し、複合体メンバーに特異的な抗体を用いて免疫ブロッティングする。ポジティブコントロールの免疫沈降−免疫ブロッティングもまた実施し、その際、Tie1およびTie2を発現する細胞にAngは投与するが候補タンパク質は投与しないとするか、または、非特異的タンパク質を投与する。候補タンパク質の投与により、ポジティブコントロールと比較して、免疫沈降メンバーと会合している免疫沈降メンバーが結合していない複合体メンバーの量が減少していれば、候補タンパク質は複合体形成の拮抗剤である。
候補タンパク質が複合体形成を阻害するかどうか調べるために、Tie1およびTie2を発現する細胞に候補タンパク質を投与した後にAngを細胞に投与する以外は、同様の実験を実施する。細胞を候補タンパク質非存在下において複合体形成を可能にする十分な時間インキュベートする。上述した通り、細胞に候補タンパク質を投与しないか、または非特異的タンパク質を投与するポジティブコントロールを実施する。次に投与細胞を溶解し、そして免疫沈降および免疫ブロッティングを上述の通り実施する。
複合体形成を阻害するか、または複合体を破壊することにより複合体形成に拮抗する候補タンパク質は、次に、本明細書に記載する試験において新脈管形成に対するそれらの作用について試験する。
(実施例20:Tie2アミノ酸配列)
例示的なTie2アミノ酸配列は、以下のとおりである:
例示的なTie2アミノ酸配列は、以下のとおりである:
(実施例21:Ang1アミノ酸配列)
例示的なAng1アミノ酸配列は、以下のとおりである:
例示的なAng1アミノ酸配列は、以下のとおりである:
(実施例22:生殖細胞系の残基への抗Tie1E3重鎖のフレームワーク3領域に位置する突然変異の変換)
患者への投与の後のE3抗体の潜在的免疫原性の危険性を制限するため、フレームワーク領域内の全非生殖細胞系突然変異を生殖細胞系のアミノ酸残基に戻るように補正した。抗Tie1E03抗体をDyaxFab200ライブラリーから単離した。このライブラリーにおいて、HCフレームワーク領域は独特であり、DP47生殖細胞系セグメント(V3−32)に相当する。合成HC−CDR1−CDR2サブライブラリの構築はオーバーラップするオリゴヌクレオチドの組立とその後の部分的PCRサイクルを通じて行ったため、突然変異はこれ等の2工程の一方により導入されている可能性がある。従って、E03抗体のHCをDP47生殖細胞系遺伝子配列にアラインさせる分析を実施した。フレームワーク領域の3番に位置する1つの非生殖細胞系突然変異が発見され、ここではメチオニン残基がバリン残基により置き換えられていた。
患者への投与の後のE3抗体の潜在的免疫原性の危険性を制限するため、フレームワーク領域内の全非生殖細胞系突然変異を生殖細胞系のアミノ酸残基に戻るように補正した。抗Tie1E03抗体をDyaxFab200ライブラリーから単離した。このライブラリーにおいて、HCフレームワーク領域は独特であり、DP47生殖細胞系セグメント(V3−32)に相当する。合成HC−CDR1−CDR2サブライブラリの構築はオーバーラップするオリゴヌクレオチドの組立とその後の部分的PCRサイクルを通じて行ったため、突然変異はこれ等の2工程の一方により導入されている可能性がある。従って、E03抗体のHCをDP47生殖細胞系遺伝子配列にアラインさせる分析を実施した。フレームワーク領域の3番に位置する1つの非生殖細胞系突然変異が発見され、ここではメチオニン残基がバリン残基により置き換えられていた。
この突然変異を修復するための方策を設計した。生殖細胞系残基の導入はCDRのフレームワークにフランキングする領域における内部制限部位の存在により容易なものとした。実際、FAB310ライブラリー内に存在するHC−CDR1−CDR2サブライブラリの設計は、各CDRの夾雑化がフレームワークフランキング領域内の独特の制限部位の存在により可能となるような方法で行った。補正すべきバリン残基はXbaI部位の3’側近傍のFR3領域に位置するため、XbaI配列および補正されたメチオニン生殖細胞系残基の両方を含有するプライマーを設計した。変化はCH1領域においてアニーリングする3’リバースプライマー(CJ−リフトNheREV)と組み合わせたTopXbaI−Mフォワードプライマーを用いたPCRにより導入した。次に約180bpのPCRフラグメントを形成した。生殖細胞系PCRプライマーは以下の通りである:
(実施例23:生殖細胞系重鎖Tie1E3のクローニング)
E3重鎖に導入された生殖細胞系の残基が抗体の生物学的活性に影響するかどうか調べるために、生殖細胞系E3抗体(「E3b」またはDE−2220と称する)を含有する可溶性Fab発現ベクターを構築した。実施例22のPCRフラグメント一夜50U/μgXbaI制限酵素で消化した後、5時間25U/μgBstEIIで消化した。切断されたPCR産物を次に1%TAEアガロース分取用ゲル上で精製した。Tie1E3生殖細胞系軽鎖配列を含有する同様に消化されたファージミド発現ベクター(pMIDI)のライゲーションを室温で3時間実施した。5ナノグラムの新しくライゲーションした物質をTG1菌体内にエレクトロポレーションにより導入した。突然変異の補正の確認は20個の無作為に選択した単離体の重鎖の配列決定により行った。得られたコーディングコンストラクトはFabフォーマットにおける生殖細胞系HCおよび生殖細胞系LC配列をコードしている配列を含有していた。(FabE3bと称する)。
E3重鎖に導入された生殖細胞系の残基が抗体の生物学的活性に影響するかどうか調べるために、生殖細胞系E3抗体(「E3b」またはDE−2220と称する)を含有する可溶性Fab発現ベクターを構築した。実施例22のPCRフラグメント一夜50U/μgXbaI制限酵素で消化した後、5時間25U/μgBstEIIで消化した。切断されたPCR産物を次に1%TAEアガロース分取用ゲル上で精製した。Tie1E3生殖細胞系軽鎖配列を含有する同様に消化されたファージミド発現ベクター(pMIDI)のライゲーションを室温で3時間実施した。5ナノグラムの新しくライゲーションした物質をTG1菌体内にエレクトロポレーションにより導入した。突然変異の補正の確認は20個の無作為に選択した単離体の重鎖の配列決定により行った。得られたコーディングコンストラクトはFabフォーマットにおける生殖細胞系HCおよび生殖細胞系LC配列をコードしている配列を含有していた。(FabE3bと称する)。
(実施例24:E3b(DX−2220)の製造および精製)
E3bFab抗体をヒトIgG1に再フォーマットした。次にこのコンストラクトをHEK293T細胞を一過性にトランスフェクトするために使用した。一過性細胞トランスフェクションのためのプラスミド調製物はQiagenフィルタープラスミドマキシキット(Qiagen、カタログ番号12263)を用いて得た。HEK293T細胞(GenHunter Corp.,カタログ番号Q401)をトランスフェクション前24時間播種し;CELLSTACK(商標)(CellSTACK(商標)−10チャンバー、Corning、カタログ番号3271)培養容器当たり220×106個の細胞をプレーティングした。トランスフェクションはGeneJuice(商標)試薬(VWR、カタログ番号novg70967−3)を用いながら製造元の説明書に従って実施した。プラスミドDNA650マイクログラムをCELLSTACK(商標)当たり使用した。細胞は10%「超低濃度IgG」ウシ胎児血清(Invitrogen、カタログ番号16250078)を添加したDMEM(Invitrogen、カタログ番号31966021)中、37℃、5%CO2、水分飽和雰囲気下に培養した。トランスフェクション後72、144および216時間後にコンディショニングした培地を採取し、プールし、そして濾過滅菌した。
E3bFab抗体をヒトIgG1に再フォーマットした。次にこのコンストラクトをHEK293T細胞を一過性にトランスフェクトするために使用した。一過性細胞トランスフェクションのためのプラスミド調製物はQiagenフィルタープラスミドマキシキット(Qiagen、カタログ番号12263)を用いて得た。HEK293T細胞(GenHunter Corp.,カタログ番号Q401)をトランスフェクション前24時間播種し;CELLSTACK(商標)(CellSTACK(商標)−10チャンバー、Corning、カタログ番号3271)培養容器当たり220×106個の細胞をプレーティングした。トランスフェクションはGeneJuice(商標)試薬(VWR、カタログ番号novg70967−3)を用いながら製造元の説明書に従って実施した。プラスミドDNA650マイクログラムをCELLSTACK(商標)当たり使用した。細胞は10%「超低濃度IgG」ウシ胎児血清(Invitrogen、カタログ番号16250078)を添加したDMEM(Invitrogen、カタログ番号31966021)中、37℃、5%CO2、水分飽和雰囲気下に培養した。トランスフェクション後72、144および216時間後にコンディショニングした培地を採取し、プールし、そして濾過滅菌した。
細胞培養上澄みを0.5MNaCl含有PBSに対して平衡化させた25mlのrプロテインAFFカラム(GEHealthcare、カタログ番号17−1279−02)にロードした。カラムを0.5MNaCl含有PBS、次に0.1M酢酸ナトリウムpH5.0で洗浄してウシIgGを除去し、抗体を12.5mMクエン酸で溶出させた。抗体を含有する画分(5ml)を150μlの1Mトリス塩酸pH9.0を添加することにより中和した。
E3b抗体はカチオン交換により更に精製した。抗体を50mMクエン酸ナトリウム、pH5.0に対して透析し、そして同じ緩衝液で平衡化したHiLoad26/10SPセファロースHPカラム(GEHealthcare、カタログ番号17−1138−01)上にロードした。抗体を1MNaC含有50mMクエン酸ナトリウムpH5.0で溶出させた(10カラム容量で一次勾配)。抗体含有画分をプールし、PBSに対して透析した。抗体濃度は1mg/mlのタンパク質濃度が1.36の吸光度を有するものと仮定して280nmにおける吸光度から計算した。
(実施例25:BIAcoreにおけるTie1/FcへのE3b−IgG1の結合試験)
生殖細胞系E3bIgG1保存溶液(0.56mg/ml)および親E3IgG1保存溶液(0.41mg/ml)を10mM酢酸ナトリウムpH4.5で50倍希釈した。IgG類は直接CM5チップ上にコーティングした。チップの表面を0.05MNHS/0.2MEDCの7分パルスで活性化し、生殖細胞系E3bの823RUおよび親E3の788RUが表面上にコーティングされるまで、チップ上にIgGを流した。全ての流動細胞はその後、1M塩酸エタノールアミンpH8.5の7分パルスにより脱活性化した。その後の全ての実験はHBS緩衝液中で実施した。
生殖細胞系E3bIgG1保存溶液(0.56mg/ml)および親E3IgG1保存溶液(0.41mg/ml)を10mM酢酸ナトリウムpH4.5で50倍希釈した。IgG類は直接CM5チップ上にコーティングした。チップの表面を0.05MNHS/0.2MEDCの7分パルスで活性化し、生殖細胞系E3bの823RUおよび親E3の788RUが表面上にコーティングされるまで、チップ上にIgGを流した。全ての流動細胞はその後、1M塩酸エタノールアミンpH8.5の7分パルスにより脱活性化した。その後の全ての実験はHBS緩衝液中で実施した。
精製した組換えヒトTie1/FcをHBS中終濃度200、100、50、25および12.5nMに希釈した。サンプルをkinjectプログラムを用いながら8.3分間、30μl/分で注射した。その後50分の解離相を設けた。残存する抗原は全て、10mMグリシンpH1.5の30秒インジェクション2回により表面から除去した。
この方法を用いて得られたセンサーグラムを以下に示す。目視による分析によれば、解離(koff)は極めて緩徐であり(長い解離時間にも関わらず極めて少量の画分のTie1/Fcが解離した)、これは極めて堅固な相互作用を示唆している。興味深いことにここで測定したIgGの解離速度は相当するFab類(後述する実施例29参照)のものよりも遥かに緩徐であり、1価のFabから2価のIgGへの移行に際して親和性(アビディティ)が有意に増大することを示していた。
(実施例26::BIAcoreにおけるTie1/FcへのE3b−Favの結合試験)
生殖細胞系残基への体性の復帰突然変異の変換により結合挙動が何らかの影響を受けないかどうかを調べるために、親および生殖細胞系のE3b抗体を作成してFabフラグメントとしてBiacoreにおいて試験した。ここではIgG類に対して行ったこと(実施例28参照)とは対称的に、そして、1価の相互作用を測定するために、表面上に直接コーティングした抗原上にFab類を流した。
生殖細胞系残基への体性の復帰突然変異の変換により結合挙動が何らかの影響を受けないかどうかを調べるために、親および生殖細胞系のE3b抗体を作成してFabフラグメントとしてBiacoreにおいて試験した。ここではIgG類に対して行ったこと(実施例28参照)とは対称的に、そして、1価の相互作用を測定するために、表面上に直接コーティングした抗原上にFab類を流した。
組換えヒトTie1/FcをCM5チップ上にコーティングした。チップの表面をまず0.05MNHS/0.2MEDCの7分パルスで活性化し、次に750RUが表面上にコーティングされるまでチップ表面上にTie1/Fc(10mM酢酸ナトリウムpH4.0中2μg/ml)を流した。全ての流動細胞はその後、1M塩酸エタノールアミンpH8.5の7分パルスにより脱活性化した。その後の全ての実験はHBS緩衝液中で実施した。
親および生殖細胞系のE3bFabを調製した。連続希釈(50、25、12.5、6.25および3.125nM)をHBS緩衝液中に調製した。KINJECT(登録商標)プログラムを用いながら5.3分間、30μl/分でサンプルを注射した。その後10分の解離相を設け、残存するFabは50mMNaOH/1MNaClの単回18秒インジェクションにより表面から除去した。
1:1モデルと仮定しながらBIAEVALUATION(登録商標)ソフトウエア3.1の同時ka/kdフィッティングプログラムを用いてセンサーグラムを分析した。この分析により、E3抗体の生殖細胞系はTie1/Fcに対向した親和性に与える影響は僅かまたは皆無であることが証明された。
(実施例27:管形成試験における生物学的活性に関するE3b−IgGの試験)
本試験の目的は、親E3内の生殖細胞系に戻るようにHC突然変異を補正することが生物学的活性に対して何らかの作用を有するかどうか調べることであった。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(新しく単離)は37℃で20〜25分間トリプシン−EDTA(1×)(Gibco/Invitrogen)でヒト臍帯静脈を処理することにより得た。次に細胞を10%FCS、0.4%BBE、1%l−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシを添加したRPM1640培地中結合因子(AF)(Cascade Biologics)をコーティングしたT−25フラスコ中で培養した。一次培養物を温トリプシン−EDTAで脱着させ、第2または第3継代においてコンフルエントとなった時点で使用した。培養中は約60〜80%の単層の概ねの密度においてスプリット比1:2で細胞を培養することによりこれ等を増殖状態に維持した。HUVEC単層を3分間37℃においてトリプシン/EDTA(500μl/皿)で処理した。トリプシンの作用は完全RPMI培地3容量を添加することにより停止させた。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを反復して分離し、最後にPBSで洗浄した。HUVEC(第3継代)は、7.5容量の2mg/mlコラーゲン(CollagenR;Serva,Heidelberg,Germany)、1容量の10XMEM、1.5容量のNaHCO3(15.6mg/ml)およびpHを7.4に調節するための〜1容量のNaOHを混合することにより調製したコラーゲンゲル(コラーゲンI1.5mg/mlを50μl)上でその培地(40×103/50μl/96穴プレートウェル)中に播種した。1時間30分後、今度は培地を廃棄し、細胞を新しいコラーゲン層(1.5mg/ml、新しく調製、50μl/ウェル)で被覆した。ゲル重合後、E3b−IgG1または親E3抗体(1pg/ml〜10ng/ml)の存在下または非存在下、各ウェルに培地を添加した。内皮管形成は倒立顕微鏡を用いて評価した。低倍率(×40)における各ウェルの中央の顕微鏡写真を画像キャプチャーソフトウエアと共にNikonカメラを用いて撮った。顕微鏡写真における管形成はMETAVUE(商標)ソフトウエアを用いて定量的(総管長)に分析した(データ示さず)。完全内皮細胞生育培地中の未投与HUVECによる管形成をコントロールとして使用した。3連のウェルから得られた結果は、視野当たりの平均管面積±SEM(相対的単位)として表示した(図4)。結論として、E3b−IgG1は管形成を阻害する。HC突然変異の補正は生物学的活性に対して有意な作用を有さなかった。
本試験の目的は、親E3内の生殖細胞系に戻るようにHC突然変異を補正することが生物学的活性に対して何らかの作用を有するかどうか調べることであった。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(新しく単離)は37℃で20〜25分間トリプシン−EDTA(1×)(Gibco/Invitrogen)でヒト臍帯静脈を処理することにより得た。次に細胞を10%FCS、0.4%BBE、1%l−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシを添加したRPM1640培地中結合因子(AF)(Cascade Biologics)をコーティングしたT−25フラスコ中で培養した。一次培養物を温トリプシン−EDTAで脱着させ、第2または第3継代においてコンフルエントとなった時点で使用した。培養中は約60〜80%の単層の概ねの密度においてスプリット比1:2で細胞を培養することによりこれ等を増殖状態に維持した。HUVEC単層を3分間37℃においてトリプシン/EDTA(500μl/皿)で処理した。トリプシンの作用は完全RPMI培地3容量を添加することにより停止させた。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを反復して分離し、最後にPBSで洗浄した。HUVEC(第3継代)は、7.5容量の2mg/mlコラーゲン(CollagenR;Serva,Heidelberg,Germany)、1容量の10XMEM、1.5容量のNaHCO3(15.6mg/ml)およびpHを7.4に調節するための〜1容量のNaOHを混合することにより調製したコラーゲンゲル(コラーゲンI1.5mg/mlを50μl)上でその培地(40×103/50μl/96穴プレートウェル)中に播種した。1時間30分後、今度は培地を廃棄し、細胞を新しいコラーゲン層(1.5mg/ml、新しく調製、50μl/ウェル)で被覆した。ゲル重合後、E3b−IgG1または親E3抗体(1pg/ml〜10ng/ml)の存在下または非存在下、各ウェルに培地を添加した。内皮管形成は倒立顕微鏡を用いて評価した。低倍率(×40)における各ウェルの中央の顕微鏡写真を画像キャプチャーソフトウエアと共にNikonカメラを用いて撮った。顕微鏡写真における管形成はMETAVUE(商標)ソフトウエアを用いて定量的(総管長)に分析した(データ示さず)。完全内皮細胞生育培地中の未投与HUVECによる管形成をコントロールとして使用した。3連のウェルから得られた結果は、視野当たりの平均管面積±SEM(相対的単位)として表示した(図4)。結論として、E3b−IgG1は管形成を阻害する。HC突然変異の補正は生物学的活性に対して有意な作用を有さなかった。
(実施例28:例示されるTie1結合配列)
以下に示すものは免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインの例示される配列である:
以下に示すものは免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインの例示される配列である:
(実施例29:例示されるTie1抗体)
表5(図37)および6(図38)は本明細書に記載した例示される軽鎖および重鎖の可変領域のCDR領域を示す。図39(表9)は例示される抗体の一部の特性を示す。
表5(図37)および6(図38)は本明細書に記載した例示される軽鎖および重鎖の可変領域のCDR領域を示す。図39(表9)は例示される抗体の一部の特性を示す。
本明細書に記載した一部の抗体は関連する可変ドメインを包含する。同じ可変ドメインは異なるパートナーの可変ドメインと共に機能できる。例えば、M0044−G06およびM0044−B05はHC可変ドメインを共有しているが異なるLC可変ドメインを有し、これはM0044−G07とM0044−B05の場合と同様である。同じHC可変ドメインを有する他の抗体は、HC54(M0053−D12)と19(M0044−H05);HC59(M0053−F05)と19(M0044−H05);HC72(M0054−H10)と25(M0045−B03);およびHC98(M0056−F11)と57(M0053−E08)を包含する。同じLC可変ドメインを有する一部の抗体は、LC114(M0059−A06)と105(M0057−H07):LC130(M0062−E11)と106(M0057−H07):およびLC115(M0057−B02)と12(M0044−F03)を包含する。一部の抗体は同じCDR3を有する。例えばCDR3配列QGGGGRAFDIはM0056−C04およびM0056−F02に存在する。CDR3配列IAGGAYHLDYはM0056−E08およびM0061−C05に存在する。
一部の場合においては、抗体は非生殖細胞系の残基を包含する。このような非生殖細胞系の残基の1つ以上は例えば生殖細胞系の残基を回復するために修飾することができる。例示される非生殖細胞系残基はL45F(例えばM0053−D06参照);V48F(例えばM0062−C08参照);デルタS53(例えばM0045−B01;M0047−D03;M0055−D12;M0061−A03参照);デルタG54(例えばM0053−A03参照);T57I(例えばM0046−B10参照);E85D(例えばM0056−H12参照);T87M(例えばM0053−F06;M0055−E12;M0056−B08参照);V89L(例えばM0044−B08;M0047−D01;M0060−B02;M0062−H01参照);V89M(例えばM0044−B10;M0045−C12;M0045−D07;M0053−B11;M0055−B12;M0055−E06;M0056−A01;M0056−G12;M0058−G03;M0059−A06;M0060−H01;M0061−F07参照);V89T(例えばM0044−H07;M0046−A11;M0046−B10;M0047−D03;M0055−C07;M0055−D03;M0055−G02参照);A93T(例えばM0045−A02;M0053−F08;M0056−H12;M0058−E09;M0059−A02;M0061−C06;M0062−G06参照);およびT107K(例えばM0045−B03参照)を包含する。
(実施例30:DX−2220抗体の配列)
DX−2220は完全長のIgG1生殖細胞系ヒト抗Tie1抗体E3bである。DX−2220の配列は以下の通りである:
DX−2220は完全長のIgG1生殖細胞系ヒト抗Tie1抗体E3bである。DX−2220の配列は以下の通りである:
(実施例31:DX−2220はヌードマウスにおける結腸直腸癌異種移植腫瘍の進行を緩徐化させる)
マウス(nu/nu)に5×106個のSW−480(結腸直腸癌)細胞を皮下移植した。12日後、腫瘍が約100〜200mgに達した時点で、マウスを5群に分割し、以下の薬剤を投与(または未投与のまま)した。
1−未投与
2−ベヒクル(PBS)
3−シスプラチン(4mg/kg/IV、q2d×5回)
4−A2−SV(ネガティブコントロール抗体、10mg/kg、IP、q2d×14回)
5−DX−2220(抗Tie1抗体、10mg/kg、IP、q2d×14回)
試験全体を通じて、発生した何れの腫瘍の長さ(L)および幅(W)もカリブレーションされたvernierカリパスを用いてミリメートル単位で測定し、Lは2つの寸法のより長いほうとした。適宜、長球楕円に関する数式:M=(L×W2)/2を用いて腫瘍重量(M)をミリグラム単位で計算した。表7は群の各々に関する腫瘍の平均重量(mg)を示す。A2−SVはストレプトアビジンに結合するアイソタイプマッチ(IgG1)のネガティブコントロール抗体である。
マウス(nu/nu)に5×106個のSW−480(結腸直腸癌)細胞を皮下移植した。12日後、腫瘍が約100〜200mgに達した時点で、マウスを5群に分割し、以下の薬剤を投与(または未投与のまま)した。
1−未投与
2−ベヒクル(PBS)
3−シスプラチン(4mg/kg/IV、q2d×5回)
4−A2−SV(ネガティブコントロール抗体、10mg/kg、IP、q2d×14回)
5−DX−2220(抗Tie1抗体、10mg/kg、IP、q2d×14回)
試験全体を通じて、発生した何れの腫瘍の長さ(L)および幅(W)もカリブレーションされたvernierカリパスを用いてミリメートル単位で測定し、Lは2つの寸法のより長いほうとした。適宜、長球楕円に関する数式:M=(L×W2)/2を用いて腫瘍重量(M)をミリグラム単位で計算した。表7は群の各々に関する腫瘍の平均重量(mg)を示す。A2−SVはストレプトアビジンに結合するアイソタイプマッチ(IgG1)のネガティブコントロール抗体である。
(実施例32:BIACoreにおけるヒトおよびマウスTie1への結合のための生殖細胞系抗Tie1E3FabおよびIgGの製造および試験)
発現および精製。Fab類はペリプラズム内への分泌のためのPelBリーダー配列を含有する発現ベクターを用いてE.coli菌株TG1内で生産した。誘導のために使用した条件下において(1mMIPTG存在下30℃一夜インキュベート)、分泌されたFabの大部分はペリプラズムよりも培地中に局在した。分泌されたFabは清澄化された培地にプロテインA樹脂を添加することにより回収した。次にこのプロテインA樹脂をカラムに充填することによりPBS洗浄および50mMリン酸ナトリウム、150mMNaClpH2.5による溶離を容易にした。1MHEPESの半容量を添加することによりpHをほぼ中性とした後に緩衝液をPBSに交換した。精製された生殖細胞系E3(DX−2220)Fabの濃度はOD2801.4=1.0mg/mlを用いて求めた。
発現および精製。Fab類はペリプラズム内への分泌のためのPelBリーダー配列を含有する発現ベクターを用いてE.coli菌株TG1内で生産した。誘導のために使用した条件下において(1mMIPTG存在下30℃一夜インキュベート)、分泌されたFabの大部分はペリプラズムよりも培地中に局在した。分泌されたFabは清澄化された培地にプロテインA樹脂を添加することにより回収した。次にこのプロテインA樹脂をカラムに充填することによりPBS洗浄および50mMリン酸ナトリウム、150mMNaClpH2.5による溶離を容易にした。1MHEPESの半容量を添加することによりpHをほぼ中性とした後に緩衝液をPBSに交換した。精製された生殖細胞系E3(DX−2220)Fabの濃度はOD2801.4=1.0mg/mlを用いて求めた。
トランスフェクション剤としてLIPOFECTAMINE(登録商標)2000またはGENEJUICE(登録商標)の何れかを用いてHEK293T細胞中で一時的にIgGを生産した。抗体はトランスフェクション後72、144および216時間に採取した細胞から生産された。コンディショニングされた培地から得られたIgGの精製は本質的にはFabの精製に関して上記したプロトコルと同様に行った。精製されたIgGの濃度はOD2801.4=1.0mg/mlを用いて求めた。
前臨床の動物実験については、IgGは2段階の精製操作、即ちまずプロテインAクロマトグラフィー、次いでイオン交換クロマトグラフィー(IEX)を用いて精製した。精製されたIgGは内毒素濃度、浸出プロテインA、DNA含有量および宿主細胞タンパク質を試験するために生化学的分析に付した。
生化学的分析
FabおよびIgGのアフィニティー分析はBIAcore3000機器を用いて表面プラズモン共鳴により実施した。この分析のためには、Tie1の細胞外ドメインの2量体(Tie1−Fc融合タンパク質)および単量体(Tie1−HIS)の型の両方を使用した。これらの実験に使用したセンサーチップはCM5(デキストランコーティング)であり、これは標準的なアミンカップリング化学を介したチップへのタンパク質の固定を可能にする。流動抗体の濃度は表面プラズモン共鳴に基づいた方法を用いて測定した。高密度プロテインAセンサーチップを用いた場合、質量輸送制限条件下において、応答シグナルは被験サンプル中の抗体の濃度にのみ依存する。この方法はKDの正確な測定のために重要なパラメーターである抗体濃度の厳密な測定を可能にする。
FabおよびIgGのアフィニティー分析はBIAcore3000機器を用いて表面プラズモン共鳴により実施した。この分析のためには、Tie1の細胞外ドメインの2量体(Tie1−Fc融合タンパク質)および単量体(Tie1−HIS)の型の両方を使用した。これらの実験に使用したセンサーチップはCM5(デキストランコーティング)であり、これは標準的なアミンカップリング化学を介したチップへのタンパク質の固定を可能にする。流動抗体の濃度は表面プラズモン共鳴に基づいた方法を用いて測定した。高密度プロテインAセンサーチップを用いた場合、質量輸送制限条件下において、応答シグナルは被験サンプル中の抗体の濃度にのみ依存する。この方法はKDの正確な測定のために重要なパラメーターである抗体濃度の厳密な測定を可能にする。
Tie1HISタンパク質470RUをCM5センサーチップ上にコーティングし、5、20、100および500nMのFabを、系が質量輸送制限されない速度である4段階の異なる流量(10、30,50および80μl/s)においてチップ上に流動させた。速度論的データは、典型的には、被分析物の濃度の範囲と3つの異なるチップ被覆密度を用いて測定された。良好なシグナルを与えた最低コーティング密度から得られたデータを典型的に選択したところ、これは50〜100RUの範囲内にある場合が多かった。このような低いコーティング密度を用いることにより、2価の分析被験体(IgGまたはTie1Fc融合タンパク質)を用いる場合でさえも頻繁に、BIAEVALUATION(登録商標)3.0ソフトウエアを用いてセンサー曲線を1.1モデルにフィットさせることが可能となる。2価の分析被験体について1:1にフィットさせるモデルは不可能である場合には、曲線は2:1モデルを用いてフィットさせた。発生したデータは表8に示す通りである。
(実施例33:DX−2240の配列:生殖細胞系列化FアロトタイプE3抗体の配列)
(実施例34:GS−CHO細胞系統由来のDX−2240の特性化)
抗Tie1抗体DX−2240(軽鎖および重鎖の生殖細胞系およびf−アロタイプ)抗体をHEK293T細胞内で生産した。DX−2240を発現する安定なCHO細胞系統を作成した。標準的な分子生物学のクローニング技術を用いて、DX−2240由来の軽鎖および重鎖をLonza Group Ltd.CHから入手可能なグルタミンシンターゼ(GS)ベクター系に挿入した(例えばClark et al.(2004)BioProcess International 2(4):48−52;Barnes et al.(2002)Biotech Bioeng.81(6):531−639参照)。次に軽鎖および重鎖をそれぞれ含有する一重ベクターコンストラクトを組み合わせて単一の二重遺伝子ベクターを作成した。次にこのDNAコンストラクトを用いてMSX選択圧力下に生育する安定なCHO細胞系統を作成した。次にこれ等のクローンの1つを増殖させ、単一の40Lの攪拌バイオリアクターに播種し、12日間の過程に亘って運転した。この運転の終了後、清澄化CHO培養上澄み36リットルを200mlプロテインAXK50カラムにロードした。カラムをまずPBSpH7.4で洗浄し、次いで、PBS+0.4MNaClpH7.4で洗浄、次いで、PBSpH7.4で最終洗浄した後に低pH溶出を行った。DX−2240IgG1をまず0.1Mクエン酸NapH3.5で、次に同じ緩衝液のpH3.0を用いて溶出した。pH3.0においてシャープなタンパク質ピークが溶出した。pH3.0溶出物はDX−2240を示す優勢なピークとその直ぐ後に溶出する低濃度の夾雑物を含有していた。高水準の純度(>95%)のDX−2240が得られた。
抗Tie1抗体DX−2240(軽鎖および重鎖の生殖細胞系およびf−アロタイプ)抗体をHEK293T細胞内で生産した。DX−2240を発現する安定なCHO細胞系統を作成した。標準的な分子生物学のクローニング技術を用いて、DX−2240由来の軽鎖および重鎖をLonza Group Ltd.CHから入手可能なグルタミンシンターゼ(GS)ベクター系に挿入した(例えばClark et al.(2004)BioProcess International 2(4):48−52;Barnes et al.(2002)Biotech Bioeng.81(6):531−639参照)。次に軽鎖および重鎖をそれぞれ含有する一重ベクターコンストラクトを組み合わせて単一の二重遺伝子ベクターを作成した。次にこのDNAコンストラクトを用いてMSX選択圧力下に生育する安定なCHO細胞系統を作成した。次にこれ等のクローンの1つを増殖させ、単一の40Lの攪拌バイオリアクターに播種し、12日間の過程に亘って運転した。この運転の終了後、清澄化CHO培養上澄み36リットルを200mlプロテインAXK50カラムにロードした。カラムをまずPBSpH7.4で洗浄し、次いで、PBS+0.4MNaClpH7.4で洗浄、次いで、PBSpH7.4で最終洗浄した後に低pH溶出を行った。DX−2240IgG1をまず0.1Mクエン酸NapH3.5で、次に同じ緩衝液のpH3.0を用いて溶出した。pH3.0においてシャープなタンパク質ピークが溶出した。pH3.0溶出物はDX−2240を示す優勢なピークとその直ぐ後に溶出する低濃度の夾雑物を含有していた。高水準の純度(>95%)のDX−2240が得られた。
(実施例35:DX−2240抗体をコードする核酸の配列最適化)
CHO細胞内でのDX−2240の発現を向上させるために、旨適化されたコドンおよび配列を有する合成遺伝子を組み立てた。操作に含まれるものはコドンの旨適化、CpGアイランドおよびスプライス部位の分析である。旨適化DX−2240配列を合成し、そしてグルタミンシンターゼ(GS)ベクター系内に再フォーマットした。例示されるコドン旨適化配列は以下の通りである。
CHO細胞内でのDX−2240の発現を向上させるために、旨適化されたコドンおよび配列を有する合成遺伝子を組み立てた。操作に含まれるものはコドンの旨適化、CpGアイランドおよびスプライス部位の分析である。旨適化DX−2240配列を合成し、そしてグルタミンシンターゼ(GS)ベクター系内に再フォーマットした。例示されるコドン旨適化配列は以下の通りである。
(実施例36:マウスにおける薬物動態および生体分布試験)
DX−2240(HEK293T細胞内で生産)のインビボ薬物動態および安定性は、使用可能なチロシン残基上でタンパク質をヨウ素化すること、および、単回静脈内投与後のマウスにおける血漿クリアランスおよび安定性を測定することにより調べた。サンプルはIODO−GEN(登録商標)試薬を用いた間接的方法により放射性ヨウ素化した(Pierceの方法、Chizzonite et al.,(1991)J.Immunol.147:1548;(1992)J.Immunol.148:3117の記載参照)。サンプルを125I−NaI溶液と共に9分間インキュベートし、その時点においてチロシン(10mg/ml、飽和溶液)を添加することにより反応をクエンチングした。約15分後、5μl分を計数のための標準として採取した。各標識反応につき、125I標識物質(約0.6ml)を単一の5mlD塩1800ポリアクリルアミドカラム(Pierce)を用いて精製した。カラムを2.5%HSA含有25mMTris、0.4MNaCl、pH7.5で洗浄することにより非特異的部位を、そして次にHSAを含有しない同じ緩衝液で広範にブロッキングした。サンプルを適用し、カラムを0.3mlずつのシリーズで溶出した。全タンパク質画分中の適用放射能の回収は>75%であり、適用放射能の総回収量は>90%であった。標識タンパク質のピーク濃度を含有する画分を動物注射用にプールした。注射液を調製するために、プール物をトリス緩衝液(pH7.5)で希釈し、100μlの注射容量が約10μgの標識物質を含有するようにした。
DX−2240(HEK293T細胞内で生産)のインビボ薬物動態および安定性は、使用可能なチロシン残基上でタンパク質をヨウ素化すること、および、単回静脈内投与後のマウスにおける血漿クリアランスおよび安定性を測定することにより調べた。サンプルはIODO−GEN(登録商標)試薬を用いた間接的方法により放射性ヨウ素化した(Pierceの方法、Chizzonite et al.,(1991)J.Immunol.147:1548;(1992)J.Immunol.148:3117の記載参照)。サンプルを125I−NaI溶液と共に9分間インキュベートし、その時点においてチロシン(10mg/ml、飽和溶液)を添加することにより反応をクエンチングした。約15分後、5μl分を計数のための標準として採取した。各標識反応につき、125I標識物質(約0.6ml)を単一の5mlD塩1800ポリアクリルアミドカラム(Pierce)を用いて精製した。カラムを2.5%HSA含有25mMTris、0.4MNaCl、pH7.5で洗浄することにより非特異的部位を、そして次にHSAを含有しない同じ緩衝液で広範にブロッキングした。サンプルを適用し、カラムを0.3mlずつのシリーズで溶出した。全タンパク質画分中の適用放射能の回収は>75%であり、適用放射能の総回収量は>90%であった。標識タンパク質のピーク濃度を含有する画分を動物注射用にプールした。注射液を調製するために、プール物をトリス緩衝液(pH7.5)で希釈し、100μlの注射容量が約10μgの標識物質を含有するようにした。
放射標識化合物を含有する溶液を尾静脈注射により全マウスに投与した。投与後の所定時間において、動物を屠殺し、血液サンプルを採取して分析に付した。放射標識化合物の注射後の試験の時点は注射後約0、7、15、30、90分、4時間、8時間、16時間、24時間、48時間および72時間とした。各時点において4匹を屠殺した。屠殺時に0.5ml分の血液を抗凝固剤(0.02mlEDTA)管中に採取した。遠心分離によりにより血球から血漿を分離し、血漿画分を2区分に分割し、1つを凍結し、1つは即時分析用に4℃保存した。
分析では全サンプルのガンマカウンター計数を行った。この単回用量iv試験において、DX−2240は5時間未満の比較的短いマウス半減期を示した。これ等のマウスにおけるDX−2240の生体分布の分析によれば、肺(12.85%ID/g)、脾臓(7.44%ID/g)、腎臓(8.34%ID/g)、肝臓(5.42%ID/g)および心臓(4.04%ID/g)において30分後にこの抗体の一部の蓄積が判明した。DX−2240は内皮細胞の表面上のTie1とのその相互作用により、肺のような高度な脈管形成領域に蓄積すると考えられる。従って、DX−2240の複数の投与がマウス血清中のこの抗体の有効定常状態濃度を達成するためには必要となる場合がある。DX−2220を投与した腫瘍担持マウスから採集した3日毎の投薬後の眼血液並びに末梢血液のサンプルについてELISAを実施した。各場合において、血清中DX−2220濃度は平均500μg/mlであり、マウス中の短い血清中半減期にもかかわらず、この抗体の有効定常状態濃度がDX−2220の僅か3回の投与の後に達成できる。
更に又、DX−2240のインビボの安定性を試験するための血漿サンプルのSEC−HPLC分析を実施した。マウスにおけるDX−2240の不安定性は血清からのこの化合物の急速なクリアランスに寄与している可能性がある。SEC−HPLC分析は0分、30分、90分、24時間および72時間において2血漿サンプルに対して実施した。放射標識DX−2240の分析はこの化合物が分解および血漿中の成分との相互作用の両方に対してインビボで安定であることを示していた。従って、マウスにおけるDX−2240の比較的急速な半減期はこの化合物の分解によるものではない。
(実施例37:DX−2220はヌードマウスにおける肺癌異種移植腫瘍の進行を緩徐化する)
ヒトLNM35肺癌異種移植片を担持するマウスにおける腫瘍生育に対するDX−2220の作用を試験した。これ等の試験では、LMN35細胞は無胸腺ヌードマウスの胸部側面に皮下注射した。腫瘍細胞移植4日後、1週間3回20mg/kgの用量でDX−2220またはA2−SV(ネガティブコントロール抗体)の投与を開始した。腫瘍サイズは抗体投与後6、8および10日目に測定した。
ヒトLNM35肺癌異種移植片を担持するマウスにおける腫瘍生育に対するDX−2220の作用を試験した。これ等の試験では、LMN35細胞は無胸腺ヌードマウスの胸部側面に皮下注射した。腫瘍細胞移植4日後、1週間3回20mg/kgの用量でDX−2220またはA2−SV(ネガティブコントロール抗体)の投与を開始した。腫瘍サイズは抗体投与後6、8および10日目に測定した。
図6に示す通り、DX−2220はこのマウス異種移植片モデルにおいて腫瘍の進行を有意(p=0.037)に緩徐化(〜60%)した。更に又、DX−2220を投与したマウスは体重の有意な減少を示さなかった。これ等のデータを合わせれば、DX−2220はインビボにおいて有意な腫瘍生育阻害活性を有している。
(実施例38:DX−2220はヌードマウスにおける腫瘍の進行を緩徐化する)
上記したインビボの試験のほかに、4種の別のマウス異種移植試験を実施した。これ等の試験はSW−480またはLNM35試験において使用した何れかのプロトコルに従って実施した。これ等の試験の結果を以下に示す。
上記したインビボの試験のほかに、4種の別のマウス異種移植試験を実施した。これ等の試験はSW−480またはLNM35試験において使用した何れかのプロトコルに従って実施した。これ等の試験の結果を以下に示す。
LLC(マウス肺癌腫) 投与開始後14日目に20%阻害
PC−3(ヒト前立腺癌) 投与開始後28日目に24%阻害
LNM35#3(ヒト肺癌腫) 投与開始後21日目に30%阻害
Colo205(ヒト結腸直腸癌) 作用無し
これ等の結果はE3抗Tie1抗体が種々の腫瘍型に対して作用を有することを示唆し、このことは広範な治療用途を示している。
PC−3(ヒト前立腺癌) 投与開始後28日目に24%阻害
LNM35#3(ヒト肺癌腫) 投与開始後21日目に30%阻害
Colo205(ヒト結腸直腸癌) 作用無し
これ等の結果はE3抗Tie1抗体が種々の腫瘍型に対して作用を有することを示唆し、このことは広範な治療用途を示している。
(実施例39:正常組織の免疫組織化学分析)
E3抗Tie1抗体の免疫反応性の潜在的領域を評価するための一連の非悪性の正常ヒト組織に対する一連の免疫組織化学分析を実施した。最小限のバックグラウンドおよびシグナル最大検出をもたらすような、好ましい組織保存条件並びに旨適抗体濃度を調べるために、ビオチニル化DX−2220およびIgGアイソタイプコントロール抗体を用いて選択された正常ヒト組織の低温およびパラホルムアルデヒド固定切片の両方に対して抗体滴定実験を実施した。一次抗体として使用するビオチニル化DX−2220およびビオチニル化IgGアイソタイプコントロール抗体、および、発色原としてのDABと共にストレプトアビジンHRPよりなる基本的検出系を用いた試験のための一次抗体については、20μg/mlの濃度を選択した。組織は又、ポジティブコントロール抗体(抗CD31抗ビメンチン)で染色することにより、組織抗原を温存し、そして免疫組織化学分析に供することができるようにする。CD31およびビメンチン染色がポジティブである組織のみを残りの試験のために選択した。ネガティブコントロールは一次抗体に非存在下の隣接切片に対する全免疫組織化学的操作法を実施することよりなるものとした。スライドはNikon顕微鏡に連結したDVC1310Cデジタルカメラを用いて画像化した。
E3抗Tie1抗体の免疫反応性の潜在的領域を評価するための一連の非悪性の正常ヒト組織に対する一連の免疫組織化学分析を実施した。最小限のバックグラウンドおよびシグナル最大検出をもたらすような、好ましい組織保存条件並びに旨適抗体濃度を調べるために、ビオチニル化DX−2220およびIgGアイソタイプコントロール抗体を用いて選択された正常ヒト組織の低温およびパラホルムアルデヒド固定切片の両方に対して抗体滴定実験を実施した。一次抗体として使用するビオチニル化DX−2220およびビオチニル化IgGアイソタイプコントロール抗体、および、発色原としてのDABと共にストレプトアビジンHRPよりなる基本的検出系を用いた試験のための一次抗体については、20μg/mlの濃度を選択した。組織は又、ポジティブコントロール抗体(抗CD31抗ビメンチン)で染色することにより、組織抗原を温存し、そして免疫組織化学分析に供することができるようにする。CD31およびビメンチン染色がポジティブである組織のみを残りの試験のために選択した。ネガティブコントロールは一次抗体に非存在下の隣接切片に対する全免疫組織化学的操作法を実施することよりなるものとした。スライドはNikon顕微鏡に連結したDVC1310Cデジタルカメラを用いて画像化した。
ネガティブコントロール(または一次抗体)のスライドは腎尿細管上皮内および場合により顆粒球に散発する弱いバックグラウンド染色をしばしば示したが、全ての他の細胞型は、ポジティブコントロール細胞系統(HMEC、ヒト微小血管内皮細胞)およびポジティブコントロール結腸癌を含めて、均一にネガティブであった。IgGアイソタイプコントロール抗体は顆粒球、マクロファージ、副腎皮質、腎尿細管上皮、ファロピアン管上皮、肝細胞、ライディヒ細胞および甲状腺の弱いバックグラウンド染色を示した。ポジティブコントロールの細胞系統(HMEC)およびポジティブコントロールの結腸癌は無染色またはバックグラウンド染色を示した。
DX−2220はHMEC細胞系統内の中等度の膜染色、および、マクロファージ、一部の癌細胞および結腸癌ポジティブコントロールサンプル内の内皮細胞の染色を示した。正常組織内においては、抗体はマクロファージ、脳の小グリア細胞、頚部の扁平上皮の弱い乃至は中等度の染色、骨格筋、ランゲルハンス島および胎盤内皮の弱い染色を示した。これらの観察結果は、以前の報告から推測されるとおり、一部の内皮、造血および上皮の組織におけるTie1の低水準発現と合致している。ランゲルハンス島の染色は予想外であり、今後検討しなければならない。他の弱い染色の大部分はIgGアイソタイプコントロールで観察されたものと同様であった。IgGアイソタイプコントロールのバックグラウンドをDX−2220の分析結果から差し引けば、副腎、膀胱、血液、骨髄、ニューロン、***、結腸、内皮、眼、ファロピアン管、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ球、卵巣、膵臓外分泌腺、下垂体、前立腺、皮膚、脊髄、脾臓、精巣の精上皮、胸腺リンパ球、尿管および子宮を含めて、組織の大部分はネガティブであった。
(実施例40:血小板試験)
Tie1は血小板上に発現されるという報告があった(Tsiamis et al.(2000)J.Vasc.Res.37(6):437)。E3抗Tie1抗体との血小板免疫反応性の可能性はFACS分析および免疫沈降試験により調べた。DX−2220は血小板への有意な結合を示さず、そして血小板抽出物からTie1を免疫沈降させなかった。更に又血小板の集塊化および凝集に対するDX−2200およびDX−2210の作用も調べた。リストセチン、即ち血小板膜糖タンパク質GPIb(CD42)へのフォン・ビルブランド因子(vWF)の結合を媒介することにより血小板の集塊化を誘導するコファクターを血小板集塊化のポジティブコントロールとして使用した。トロンビン(比較コントロール)のような生理学的アゴニストに匹敵する動態および程度をもって血小板を活性化し、血小板凝集を誘導するためにポジティブコントロールとしてCD9に対する抗体を使用した。DX−2200およびその軽鎖生殖細胞系変異体DX−2210の何れも血小板の集塊化または凝集を誘導しなかった。
Tie1は血小板上に発現されるという報告があった(Tsiamis et al.(2000)J.Vasc.Res.37(6):437)。E3抗Tie1抗体との血小板免疫反応性の可能性はFACS分析および免疫沈降試験により調べた。DX−2220は血小板への有意な結合を示さず、そして血小板抽出物からTie1を免疫沈降させなかった。更に又血小板の集塊化および凝集に対するDX−2200およびDX−2210の作用も調べた。リストセチン、即ち血小板膜糖タンパク質GPIb(CD42)へのフォン・ビルブランド因子(vWF)の結合を媒介することにより血小板の集塊化を誘導するコファクターを血小板集塊化のポジティブコントロールとして使用した。トロンビン(比較コントロール)のような生理学的アゴニストに匹敵する動態および程度をもって血小板を活性化し、血小板凝集を誘導するためにポジティブコントロールとしてCD9に対する抗体を使用した。DX−2200およびその軽鎖生殖細胞系変異体DX−2210の何れも血小板の集塊化または凝集を誘導しなかった。
(実施例41:臍帯血幹細胞試験)
血液先祖細胞(幹細胞)への結合特性を評価するために、G−CSF可動化末梢血液細胞上の抗Tie1抗体(または適切なネガティブコントロール抗体)および骨髄細胞を用いたFACS分析を実施した。慨すれば細胞を10%熱不活性化ヒトAB血清/2%マウス血清でブロックした。結合はビオチニル化EDX−2220またはビオチニル化A2ネガティブコントロール抗体を用いて開始した。細胞を洗浄後、一次抗体をFITC標識ストレプトアビジンを用いて検出した。更に30分のインキュベーション時間の後、残存する赤血球を溶解し、そして遠心分離後に得られた細胞ペレットをPBSに再懸濁した後にFACS分析に付した。データの取得はFacsDiva(登録商標)ソフトウエアを用いてFACSCanto(登録商標)(Becton−Dickinson)上で実施した。SSC/CD45上の活動ゲーティングを使用した。先祖細胞をCD45+、CD34+細胞上でゲーティングし、そして少なくとも100,000CD45+CD34+計数値で自動的に獲得した。
血液先祖細胞(幹細胞)への結合特性を評価するために、G−CSF可動化末梢血液細胞上の抗Tie1抗体(または適切なネガティブコントロール抗体)および骨髄細胞を用いたFACS分析を実施した。慨すれば細胞を10%熱不活性化ヒトAB血清/2%マウス血清でブロックした。結合はビオチニル化EDX−2220またはビオチニル化A2ネガティブコントロール抗体を用いて開始した。細胞を洗浄後、一次抗体をFITC標識ストレプトアビジンを用いて検出した。更に30分のインキュベーション時間の後、残存する赤血球を溶解し、そして遠心分離後に得られた細胞ペレットをPBSに再懸濁した後にFACS分析に付した。データの取得はFacsDiva(登録商標)ソフトウエアを用いてFACSCanto(登録商標)(Becton−Dickinson)上で実施した。SSC/CD45上の活動ゲーティングを使用した。先祖細胞をCD45+、CD34+細胞上でゲーティングし、そして少なくとも100,000CD45+CD34+計数値で自動的に獲得した。
Tie1の発現は特定の造血系悪性疾患において報告されているが、本実験はネガティブコントロールのIgGA02およびE3抗Tie1抗体DX−2220は何れも、CD45+CD34+血液先祖細胞の染色はポジティブではなかったことを示している。この所見は特定の化学療法剤とは異なり、E3でTie1をターゲティングすることは幹細胞に対して悪影響を与えないという仮説を裏付けている。
(実施例42:インビトロ造血試験)
ヒト骨髄様および赤血球様の先祖細胞に対する抗Tie1抗体(DX−2220およびDX−2240)の作用をメチルセルロース系インビトロコロニー試験を用いて評価し、そして巨核球先祖細胞はコラーゲン系インビトロ試験に付した。DX−2220およびDX−2240の何れも100μg/mlまでの濃度ではこのインビトロ試験の特定の条件においてはコロニー形成を阻害しなかった。
ヒト骨髄様および赤血球様の先祖細胞に対する抗Tie1抗体(DX−2220およびDX−2240)の作用をメチルセルロース系インビトロコロニー試験を用いて評価し、そして巨核球先祖細胞はコラーゲン系インビトロ試験に付した。DX−2220およびDX−2240の何れも100μg/mlまでの濃度ではこのインビトロ試験の特定の条件においてはコロニー形成を阻害しなかった。
インビボの骨髄剥離モデルを用いたマウス造血系の回復に対するE3抗Tie1抗体DX−2240の作用を評価した。マウスに第0日に5−FUを注射し、次にDX−2240またはネガティブコントロール抗体の何れかを投与した。注射後の種々の時点(第2、4、6、8、10、12および14日)において、コントロール群および投与群からマウス4匹を屠殺し、末梢血および大腿骨を採取した。末梢血および大腿骨細胞を分析して以下を測定した。
・大腿骨当たりの総核化細胞
・骨髄様および赤血球様の先祖細胞の両方に関する骨髄コロニー形成細胞の頻度
・大腿骨当たりの総造血系CFC
・大腿骨当たりの総巨核球系CFC
・成熟細胞の総白血球数および分画分析
DX−2240は5−FU投与後のマウス造血系の回復に対する作用を有していなかった。このことはこれ等の試験条件下においてDX−2240が血液学的毒性を有さないというインビトロの所見を裏付けている。即ち、それは赤血球とリンパ球の生産を維持するために必要な正常な造血機能を妨害しないことから、治療薬として特に有用である。
・大腿骨当たりの総核化細胞
・骨髄様および赤血球様の先祖細胞の両方に関する骨髄コロニー形成細胞の頻度
・大腿骨当たりの総造血系CFC
・大腿骨当たりの総巨核球系CFC
・成熟細胞の総白血球数および分画分析
DX−2240は5−FU投与後のマウス造血系の回復に対する作用を有していなかった。このことはこれ等の試験条件下においてDX−2240が血液学的毒性を有さないというインビトロの所見を裏付けている。即ち、それは赤血球とリンパ球の生産を維持するために必要な正常な造血機能を妨害しないことから、治療薬として特に有用である。
抗Tie1抗体は又、移植腫瘍に対するその作用について評価した。腫瘍細胞をマウスの腹部領域に皮下注射した(Balb/Cnu/nu雌性マウス、5〜6週齢)。以下の腫瘍細胞、即ち肺癌腫(マウス同系Lewis肺癌腫(LLC));ヒト肺癌腫LNM35;攻撃的ヒト結腸癌腫クローン(SW480R)を試験した。抗Tie1抗体の投与は移植後4〜6日に開始した。抗Tie1抗体またはコントロール抗体(A2抗ストレプトアビジン抗体)を2日毎に20mg/kgで腹腔内投与した。腫瘍容量は2日毎に測定し、0.5×高さ×幅×深さで計算した。
E3抗Tie1抗体(別名DX−2240)はLLC(約20%の作用、p=0.078;ANOVA、単一ファクター試験)およびLNM35の原発腫瘍生育を阻害する。1つの試験において、この抗Tie1抗体は原発腫瘍生育を60%阻害している(最大応答)。(2日毎ではなく一週間に僅か2回の投薬で抗体の用量を倍増しても原発腫瘍生育に対しては中等度の作用しかもたらされなかった。)このSW480R腫瘍はこれ等の条件下では抗体投与に応答しなかった。実施例34に記載した通り、抗体はSW480細胞の腫瘍成育の阻害について(即ち誘導体SW480R細胞よりも)有効であった。
60%阻害が観察された実験から得た腫瘍切片の組織学的分析によれば、抗Tie1抗体投与腫瘍中の血管は、血管密度は改変されていなかったものの、異なる形態特徴を有していた。抗Tie1抗体投与腫瘍においては、血管は腫瘍細胞の小葉間に隔壁様の構造を形成していた。これ等の腫瘍は又、コントロール抗体投与腫瘍よりも高い壊死性を示していた。平滑筋の分布(抗平滑筋アクチン抗体染色により検出)も又改変されていた。抗Tie1抗体投与腫瘍におけるリンパ管もまたより散在しており、ある程度拡張しており、そして数例においては隣接する管腔が集合して糸状になっていた。これ等の観察結果は、この抗Tie抗体が、腫瘍の壊死および腫瘍内の血管の組織化に対して特有の作用を有していることを示している。
(実施例43:併用療法の評価)
動物モデルを使用して併用療法を評価することができる。例えば複合物(腹腔内)がHT29、COLO205またはPC3の異種移植片を有する雌性NCrnu/nuマウスにおける腫瘍生育を調節する能力について試験することができる。一部の例示される試験法を以下に示す。
動物モデルを使用して併用療法を評価することができる。例えば複合物(腹腔内)がHT29、COLO205またはPC3の異種移植片を有する雌性NCrnu/nuマウスにおける腫瘍生育を調節する能力について試験することができる。一部の例示される試験法を以下に示す。
他の実施形態は添付の特許請求の範囲に包含される。
Claims (28)
- 重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで該タンパク質がTie1エクトドメインに結合し、そして、
(A)該重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性:
i)(AGSIMRH)−Y−(GVMK)−M−(GSVMFH)(配列番号118)を包含するHC CDR1;
ii)(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WNQ)−T−(GY)(配列番号160)を包含するHC CDR2;および、
iii)A−P−R−G−Y−S−Y−G−Y−Y−Y(配列番号727)を包含するHC CDR3;
の1つ以上を含み;
および/または、
(B)該軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性:
i)R−A−S−(REQ)−(GSTRN)−(IV)−(GSTIRN)−(STIRH)−X1−(SYWNH)−(LV)−(ASN)(配列番号132)を包含するLC CDR1であって、ここでX1はセリンであるか非存在であり得る、LC CDR1;
ii)Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LWRH)−(TIY)(配列番号161)を包含するLC CDR2;および、
iii)Q−Q−F−N−S−Y−P−H(配列番号728)を包含するLC CDR3;
の1つ以上を含む、タンパク質。 - 前記重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が下記:
i)(AGSIMRH)−Y−(GVMK)−M−(GSVMFH)(配列番号118)を包含するHC CDR1;
ii)(GSV)−I−(SY)−P−S−G−G−(WNQ)−T−(GY)(配列番号160)を包含するHC CDR2;および、
iii)A−P−R−G−Y−S−Y−G−Y−Y−Y(配列番号727)を包含するHC CDR3;
を含む、請求項1に記載のタンパク質。 - 前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が下記:
i)R−A−S−(REQ)−(GSTRN)−(IV)−(GSTIRN)−(STIRH)−X1−(SYWNH)−(LV)−(ASN)(配列番号132)を包含するLC CDR1であって、ここでX1はセリンであるか非存在であり得る、LC CDR1;
ii)Q−Q−(SYFR)−(GSYN)−S−(STYW)−(RP)−(LWRH)−(TIY)(配列番号161)を包含するLC CDR2;および、
iii)Q−Q−F−N−S−Y−P−H(配列番号728)を包含するLC CDR3;
を含む、請求項1に記載のタンパク質。 - 前記HC可変ドメイン配列のアミノ酸配列がE3クローン由来のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含み、そして前記LC可変ドメイン配列がE3クローン由来のCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む、請求項1に記載のタンパク質。
- (i)E3抗体のHCおよび/またはLC免疫グロブリン可変ドメイン、(ii)それぞれE3抗体のHCおよびLC免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも85%同一であるHCおよび/またはLC免疫グロブリン可変ドメイン配列、あるいは(iii)それぞれE3のHCまたはLC可変ドメインをコードする核酸に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によりコードされるHCおよび/またはLC免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、請求項1に記載のタンパク質。
- インビトロでHUVEC細胞による管形成を阻害する、請求項1〜5の何れかに記載のタンパク質。
- 前記タンパク質がFabである、請求項1〜6の何れかに記載のタンパク質。
- 前記タンパク質がIgGである、請求項1〜7の何れかに記載のタンパク質。
- 重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで該タンパク質がTie1エクトドメインに結合し、そしてTie1への結合についてE3、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3,s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10またはs−H4と競合するか、あるいは、E3、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3,s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10またはs−H4により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するか、あるいは、E3、G2、p−A1、p−A10、p−B1、p−B3、p−C6、p−D12、p−F3、p−F4、p−G3,s−A10、s−H1、s−A2、s−B2、s−B9、s−C10、s−C2、s−C7、s−D11、s−E11、s−G10またはs−H4により認識されるエピトープと共通の少なくとも1、2または3つの残基を有するエピトープに結合する、タンパク質。
- 請求項1〜9の何れかに記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
- 被験体における脈管発生を阻害する方法であって、該方法が下記工程:
請求項1〜9の何れかに記載のTie1結合タンパク質を脈管発生の阻害が必要な障害を有するか、その危険性を有する被験体に投与する工程
を包含する、方法。 - 前記Tie1結合タンパク質が下記の特性:
(1)E3抗体の少なくとも2つのCDRを含む可変ドメイン配列のうちの少なくとも1つ;
(2)E3抗体の対応する可変ドメインのCDRに合計で少なくとも85%同一であるCDR配列を含む可変ドメイン配列のうちの少なくとも1つ;
(3)可変ドメインの少なくとも1つがE3抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも85%同一であること;
(4)タンパク質がTie1への結合に関してE3と競合するか、または、Tie1上のE3により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合すること、および、
(5)タンパク質がE3またはE3bのHCまたはLC可変ドメインをコードする核酸に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によりコードされるドメインを含むこと;
の1つ以上を含む、請求項11に記載の方法。 - 前記抗体がE3の可変ドメインを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記薬剤が被験体における脈管発生を低減するために有効な量および/または時間で投与される、請求項11〜13の何れかに記載の方法。
- 前記被験体が脈管構造依存性の癌または腫瘍を有する、請求項11〜14の何れかに記載の方法。
- 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項15に記載の方法。
- 抗癌療法である第2の療法を提供する工程を更に包含する、請求項11〜16の何れかに記載の方法。
- 前記第2の療法が化学療法である、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の療法が、VEGF経路を介したシグナリングを拮抗する薬剤を投与する工程を包含する、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の療法が、ベバシズマブを投与する工程を包含する、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の療法が、5−FU、ロイコボリンおよび/またはイリノテカンを投与する工程を包含する、請求項17に記載の方法。
- 術後のアジュバント療法を提供する方法であって、該方法が、腫瘍を除去するための手術を受けている被験体に請求項1に記載のTie1結合タンパク質を投与する工程を包含する、方法。
- 前記Tie1結合タンパク質が、(a)E3抗体の重鎖可変ドメインに少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン配列およびE3抗体の軽鎖可変ドメインに少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン配列;
(b)Tie1への結合に関してE3と競合する抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列;
または、
(c)E3抗体の重鎖可変ドメインのCDRのうちの1、2または3つ、および、E3抗体の軽鎖可変ドメインのCDRのうちの1、2または3つ;
を含む、請求項22に記載の方法。 - 手術の48時間以内に前記Tie1結合タンパク質が投与される、請求項22に記載の方法。
- 手術の前後に前記Tie1結合タンパク質が投与される、請求項22に記載の方法。
- 配列番号723および配列番号724を含む単離されたタンパク質。
- 各々がTie1に結合する2つの抗原結合部位を含む、請求項26に記載のタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列をコードする、単離された核酸。
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