JP2008532476A - Complex binding protein - Google Patents

Complex binding protein Download PDF

Info

Publication number
JP2008532476A
JP2008532476A JP2007525760A JP2007525760A JP2008532476A JP 2008532476 A JP2008532476 A JP 2008532476A JP 2007525760 A JP2007525760 A JP 2007525760A JP 2007525760 A JP2007525760 A JP 2007525760A JP 2008532476 A JP2008532476 A JP 2008532476A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
tie1
antibody
variable domain
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2007525760A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2008532476A5 (en
Inventor
クライブ アール． ウッド，
ダニエル ティー． ドランスフィールド，
ヘンク ピータース，
ルネ フート，
サイモン イー． ハフトン，
Original Assignee
ダイアックス コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2004/026116 external-priority patent/WO2005019267A2/en
Priority claimed from US11/049,536 external-priority patent/US7871610B2/en
Application filed by ダイアックス コーポレーション filed Critical ダイアックス コーポレーション
Publication of JP2008532476A publication Critical patent/JP2008532476A/en
Publication of JP2008532476A5 publication Critical patent/JP2008532476A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
    • G01N2333/91215—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases with a definite EC number (2.7.1.-)

Abstract

Ｔｉｅ１及びＴｉｅ２は膜貫通ドメインを包含するレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Ｔｉｅ１及びＴｉｅ２は内皮細胞上に存在する。本開示は内皮細胞の活性及び新脈管形成を阻害するものを包含するＴｉｅ１、Ｔｉｅ２及びＡｎｇに結合する抗体のような薬剤を説明する。薬剤は新脈管形成関連障害を治療するために使用できる。一局面において、本発明は、被験体におけるＴｉｅ複合体形成またはＴｉｅ複合体成分間の相互作用を調節する方法を特徴とする。Tie1 and Tie2 are receptor tyrosine kinase proteins that include a transmembrane domain. Tie1 and Tie2 are present on endothelial cells. The present disclosure describes agents such as antibodies that bind to Tie1, Tie2, and Ang, including those that inhibit endothelial cell activity and angiogenesis. The drug can be used to treat angiogenesis-related disorders. In one aspect, the invention features a method of modulating Tie complex formation or interaction between Tie complex components in a subject.

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国出願番号１１／０４９，５３６（２００５年２月２日出願）の一部継続出願であり、この１１／０４９，５３６は、米国出願番号１０／９１６，８４０（２００４年８月１２日出願）の一部継続出願であり、これは米国出願番号６０／４９４，７１３号（２００３年８月１２日出願）に対して優先権を主張する。本出願はまた、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６１１６（２００４年８月１２日出願）の一部継続出願であり、これは米国出願番号６０／４９４，７１３（２００３年８月１２日出願）に対して優先権を主張する。上記出願の各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。 (Cross-reference of related applications)
This application is a continuation-in-part of U.S. Application No. 11 / 049,536 (filed February 2, 2005), which is a U.S. Application No. 10 / 916,840 (August 2004). Which is a continuation-in-part of US application No. 60 / 494,713 (filed Aug. 12, 2003). This application is also a continuation-in-part of PCT / US2004 / 026116 (filed 12 August 2004), which has priority over US application number 60 / 494,713 (filed 12 August 2003). Insist on the right. The contents of each of the above applications are hereby incorporated by reference in their entirety.

（背景）
血管により供給される酸素および栄養素は、組織の発達と機能にとって極めて重要である。実際、心臓血管系は胚で発達する最初の器官系である。器官形成中および組織または腫瘍の発達中、成長細胞の循環系への近接は、血管および器官実質の調和した成長によって確保される。血管の発達または血管形成を調節することにより病気を予防または治療することが可能であり得る。 (background)
Oxygen and nutrients supplied by blood vessels are vital to tissue development and function. In fact, the cardiovascular system is the first organ system that develops in the embryo. During organogenesis and tissue or tumor development, proximity of the growing cells to the circulatory system is ensured by coordinated growth of blood vessels and organ parenchyma. It may be possible to prevent or treat disease by modulating blood vessel development or angiogenesis.

血管は、内皮細胞の内層および周皮細胞または平滑筋細胞の外層からなる。最初の管状構造物は内皮細胞により形成され、続いてこの内皮細胞は、周皮細胞および平滑筋細胞を補充して形成された管状構造物を外筒で覆う。中胚葉に由来する内皮前駆細胞の分散した個体群からの血管のｄｅ ｎｏｖｏ形成を脈管形成と呼ぶ。この初生のネットワークは、発芽、***および再造形等の連続的な形態形成のイベントを受けて、大きい血管から分岐した小さな血管までの階層血管ネットワークを発生させる。これらの連続的な形態形成のイベントをまとめて血管形成と呼ぶ。以前の研究は、血管の脈管形成と血管形成の発達を媒介する多くの内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）およびそれらの同起源のリガンドを同定した。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーおよびそれらのリセプターは初期の胚の脈管叢組織の形成中に機能する一方で、アンギオポイエチン（Ａｎｇ）およびそれらのレセプターＴｉｅ２、ならびにエフリンおよびそれらのＥｐｈレセプターがその後の再造形プロセスに関与する。血管形成およびリンパ管形成応答に関与するレセプターの検討については、例えば、非特許文献１を参照されたい。   Blood vessels consist of an inner layer of endothelial cells and an outer layer of pericytes or smooth muscle cells. The first tubular structure is formed by endothelial cells, which then cover the tubular structure formed by replenishing pericytes and smooth muscle cells with an outer cylinder. De novo formation of blood vessels from a dispersed population of endothelial progenitor cells derived from mesoderm is called angiogenesis. This nascent network generates a hierarchical vascular network from large blood vessels to small branched blood vessels in response to continuous morphogenesis events such as germination, division and remodeling. These continuous morphogenesis events are collectively referred to as angiogenesis. Previous studies have identified a number of endothelial cell specific receptor tyrosine kinases (RTKs) and their cognate ligands that mediate vascular angiogenesis and development of angiogenesis. Members of the vascular endothelial growth factor (VEGF) family and their receptors function during the formation of early embryonic vascular plexus tissue, while angiopoietin (Ang) and their receptors Tie2, and ephrin and their Eph The receptor is involved in the subsequent remodeling process. For the examination of receptors involved in angiogenesis and lymphangiogenesis response, see, for example, Non-Patent Document 1.

Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２は、内皮細胞および造血細胞でほとんど排他的に発現されるＲＴＫである。これらの２つのレセプターは、胚形成の間の脈管構造の正常な発達に必要とされる。これら２つのＴｉｅレセプターは、他のＲＴＫファミリーメンバーとは異なり細胞外ＥＧＦホモロジードメインを含むので、ＲＴＫサブファミリーを形成する。例えば、非特許文献２および特許文献１を参照のこと。マウスにおけるＴｉｅ１遺伝子の標的された破壊は、広範な出血および欠損微小血管完全性によって特徴付けられる致死性の表現型を生じる。例えば、非特許文献３を参照のこと。Ｔｉｅ２ヌル胚は、内皮細胞周囲を支持する細胞の不適切な漸増に起因する、脈管再構築および成熟の欠損を有する。脈管形成（Ａｎｇ、例えば、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）は、Ｔｉｅ２と相互作用するタンパク質である。
国際公開第９３／１４１２４号パンフレット Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ （２００１）２：２５７ Ｐａｒｔａｎｅｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２，（１９９２），１６９８ Ｐｕｒｉら，ＥＭＢＯ Ｊ．１４，（１９９５），５８８４ Tie1 and Tie2 are RTKs that are almost exclusively expressed in endothelial cells and hematopoietic cells. These two receptors are required for normal development of the vasculature during embryogenesis. These two Tie receptors, unlike other RTK family members, contain an extracellular EGF homology domain, thus forming the RTK subfamily. For example, see Non-Patent Document 2 and Patent Document 1. Targeted disruption of the Tie1 gene in mice results in a lethal phenotype characterized by extensive bleeding and defective microvascular integrity. For example, see Non-Patent Document 3. Tie2 null embryos have defects in vascular remodeling and maturation due to inappropriate recruitment of cells supporting the periphery of endothelial cells. Angiogenesis (Ang, eg, Ang1, Ang2, Ang3 and Ang4) is a protein that interacts with Tie2.
International Publication No. 93/14124 Pamphlet Jones et al. Nat. Rev. Molec. Cell Biol (2001) 2: 257 Partanen, Mol. Cell Biol. 12, (1992), 1698 Puri et al., EMBO J. et al. 14, (1995), 5884

（要旨）
一局面において、本発明は、被験体におけるＴｉｅ複合体形成またはＴｉｅ複合体成分間の相互作用を調節する方法を特徴とする。その方法はＴｉｅ１に結合する薬剤を被験体に投与することを包含する。例えば薬剤はＴｉｅ１自己会合（例えばホモ２量体化）を促進し、または、以下のもの、すなわちＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチン（Ａｎｇ；例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３またはＡｎｇ４）の少なくとも２つの間の会合に拮抗する。一実施形態において、薬剤の結合はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合はＴｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。 (Summary)
In one aspect, the invention features a method of modulating Tie complex formation or interaction between Tie complex components in a subject. The method includes administering to the subject an agent that binds to Tiel. For example, the agent promotes Tie1 self-association (eg, homodimerization) or in an association between at least two of the following: Tie1, Tie2, and angiopoietin (Ang; eg, Ang1, Ang2, Ang3 or Ang4) Antagonize. In one embodiment, drug binding antagonizes formation of a heteromeric complex of Tie1, Tie2, and Ang. In another embodiment, drug binding can antagonize the association between Tie1 and Tie2, between Tie1 and Ang, or between Tie2 and Ang.

一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、薬剤はＴｉｅ１の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりＴｉｅ１をＴｉｅ１と会合させ、そしてＴｉｅ１のＴｉｅ２および／またはＡｎｇとの会合を防止する。薬剤はＴｉｅ１への結合のために少なくとも２つの結合価を有する。一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１のリン酸化、例えばＴｉｅ１の自己リン酸化を増大させる。この増大はＴｉｅ１の自己会合に依存することができるが必須ではない。   In one embodiment, the agent binds to Tie1. In one embodiment, the agent antagonizes the formation of a heteromeric complex of Tie1, Tie2, and Ang. In another embodiment, the agent can antagonize the association between Tie1 and Tie2, between Tie1 and Ang, or between Tie2 and Ang. In another embodiment, the agent enhances Tie1 self-association, eg, homodimerization, and thereby associates Tie1 with Tie1 and prevents association of Tie1 with Tie2 and / or Ang. The drug has at least two valencies for binding to Tie1. In one embodiment, the agent increases Tie1 phosphorylation, eg, Tie1 autophosphorylation. This increase can be dependent on Tie1 self-association, but is not essential.

一実施形態において、薬剤は、ヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインに結合するタンパク質、例えば抗体を包含する。例えば、抗体は以下のもの、即ち、ヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換えのもののうち１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１の第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ１）または第２のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ２）に結合することができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のＥＧＦ様ドメイン（例えば第１、第２または第３のＥＧＦ様ドメイン）に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号２のアミノ酸残基２４〜１２４、７４〜１７４、１２４〜２２４、１７４〜２７４、２２４〜３２４、２７４〜３７４、３２４〜４２４、３７４〜４７４、４２４〜５２４、４７４〜５７４、５２４〜６２４、５７４〜６７４、６２４〜７２４、６７４〜７５９または７２４〜７５９に結合する。   In one embodiment, the agent includes a protein, such as an antibody, that binds to the extracellular domain of human Tie1. For example, the antibody can be one or more of the following: human, humanized, non-immunogenic, isolated, monoclonal and recombinant. In one embodiment, the antibody can bind to the first Ig-like C2-type domain (Ig1) or the second Ig-like C2-type domain (Ig2) of Tie1. In one embodiment, the antibody binds to an EGF-like domain of Tie1 (eg, a first, second or third EGF-like domain). In one embodiment, the antibody binds to a fibronectin type III repeat of Tie1. In one embodiment, the antibody has amino acid residues 24-124, 74-174, 124-224, 174-274, 224-324, 274-374, 324-424, 374-474, 424-524, SEQ ID NO: 2. 474-574, 524-624, 574-674, 624-724, 674-759 or 724-759.

一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１エクトドメインに結合するタンパク質を包含し、そして、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含する。タンパク質は更に以下、即ち、（１）可変ドメイン配列の少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体のＣＤＲ少なくとも１つ（例えばＥ３またはＥ３ｂ抗体のＣＤＲ１、２または３つ）を含み；（２）可変ドメイン配列の少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含み、（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であり、そして（４）タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３またはＥ３ｂと競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３またはＥ３ｂにより結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するという特性の１つ以上を包含する。Ｔｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する抗原結合部位を含む抗体の例は、Ｍ００４４Ｂ０８、Ｍ００５６Ｇ０８、Ｍ００４５Ｂ０３、Ｍ００５３Ｆ０４、Ｍ００５５Ｅ１０、Ｍ００６０Ｈ０１、Ｍ００５４Ｈ１０、Ｍ００５８Ｆ０３および関連する抗体を包含する。   In one embodiment, the agent includes a protein that binds to the Tiel ectodomain and includes a heavy chain (HC) immunoglobulin variable domain sequence and a light chain (LC) immunoglobulin variable domain sequence. The protein further comprises: (1) at least one of the variable domain sequences comprises at least one CDR of an E3 or E3b antibody (eg, CDR1, 2, or 3 of an E3 or E3b antibody); (2) of the variable domain sequence At least one comprises a CDR sequence that is at least 85% identical to the CDRs of the corresponding variable domain of the E3 or E3b antibody, and (3) at least one of the variable domains is at least a corresponding immunoglobulin variable domain of the E3 or E3b antibody One of the characteristics that the protein is 85% identical and (4) the protein competes with E3 or E3b for binding to Tie1 or binds to an epitope that overlaps with the epitope bound by E3 or E3b on Tie1 Includes one or more. Examples of antibodies comprising antigen binding sites that compete with E3 for binding to Tie1 include M0044B08, M0056G08, M0045B03, M0053F04, M0055E10, M0060H01, M0054H10, M0058F03 and related antibodies.

一実施形態において、薬剤はＥ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメイン、または、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインと少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９８、９９％同一の配列を包含する。一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列はＥ３またはＥ３ｂクローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含し、そしてＬＣ可変ドメイン配列はＥ３またはＥ３ｂクローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含する。一実施形態において、薬剤はＥ３またはＥ３ｂ抗体を含む。ＬＣ可変ドメイン配列は配列番号１１６を包含することができる。ＨＣ可変ドメイン配列は配列番号１１４を包含することができる。一実施形態において、ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態においては、薬剤は配列番号７２３および配列番号７２４を包含する。   In one embodiment, the agent is an HC and / or LC variable domain of an E3 or E3b antibody, or an HC and / or LC variable domain of an E3 or E3b antibody and at least 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% Includes identical sequences. In one embodiment, the amino acid sequence of the HC variable domain sequence includes CDR1, CDR2 and CDR3 from an E3 or E3b clone, and the LC variable domain sequence includes CDR1, CDR2 and CDR3 from an E3 or E3b clone. In one embodiment, the agent comprises an E3 or E3b antibody. The LC variable domain sequence can include SEQ ID NO: 116. The HC variable domain sequence can include SEQ ID NO: 114. In one embodiment, the HC and LC framework regions are human. In one embodiment, the agent includes SEQ ID NO: 723 and SEQ ID NO: 724.

一実施形態において、薬剤はＴｉｅ２に結合する。一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、薬剤はＴｉｅ２の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりＴｉｅ２をＴｉｅ２と会合させ、そしてＴｉｅ２のＴｉｅ１および／またはＡｎｇとの会合を防止する。一実施形態において、薬剤は、ヒトＴｉｅ２の細胞外ドメインに結合するタンパク質、例えば抗体を包含する。例えば、抗体は以下のもの、即ち、ヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換えのもののうち１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２の第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ１）または第２のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ２）に結合することができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２のＥＧＦ様ドメイン（例えば第１、第２または第３のＥＧＦ様ドメイン）に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号１６２のアミノ酸残基１９〜１１９、６９〜１６９、１１９〜２２９、１６９〜２６９、２２９〜３２９、２６９〜３６９、３２９〜４２９、３６９〜４６９、４２９〜５２９、４６９〜５６９、５２９〜６２９、５６９〜６６９、６２９〜７２９、６６９〜７４５または７２９〜７４５に結合する。   In one embodiment, the agent binds to Tie2. In one embodiment, the agent antagonizes the formation of a heteromeric complex of Tie1, Tie2, and Ang. In another embodiment, drug binding can antagonize the association between Tie1 and Tie2, between Tie1 and Ang, or between Tie2 and Ang. In another embodiment, the agent enhances Tie2 self-association, eg, homodimerization, and thereby associates Tie2 with Tie2 and prevents association of Tie2 with Tie1 and / or Ang. In one embodiment, the agent includes a protein, such as an antibody, that binds to the extracellular domain of human Tie2. For example, the antibody can be one or more of the following: human, humanized, non-immunogenic, isolated, monoclonal and recombinant. In one embodiment, the antibody can bind to the first Ig-like C2-type domain (Ig1) or the second Ig-like C2-type domain (Ig2) of Tie2. In one embodiment, the antibody binds to an EGF-like domain of Tie2 (eg, a first, second or third EGF-like domain). In one embodiment, the antibody binds to a fibronectin type III repeat of Tie2. In one embodiment, the antibody has amino acid residues 19-119, 69-169, 119-229, 169-269, 229-329, 269-369, 329-429, 369-469, 429-529, SEQ ID NO: 162, It binds to 469-569, 529-629, 569-669, 629-729, 669-745 or 729-745.

一実施形態において、薬剤はＡｎｇ（例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３またはＡｎｇ４）に結合する。一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。一実施形態において、薬剤はＡｎｇに結合する抗体のようなタンパク質を包含する。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のＮ末端ドメイン（例えばＡｎｇ１のＮ末端５０アミノ酸）に結合する。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のコイルドコイルドメインに結合する。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のフィブリノーゲン様ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号１６３のアミノ酸残基１〜１００、５０〜１５０、１００〜２００、１５０〜２５０、２００〜３００、２５０〜３５０、３００〜４００、３５０〜４５０、４００〜４９７または４５０〜４９７に結合する。   In one embodiment, the agent binds to Ang (eg, Ang1, Ang2, Ang3 or Ang4). In one embodiment, the agent antagonizes the formation of a heteromeric complex of Tie1, Tie2, and Ang. In another embodiment, drug binding can antagonize the association between Tie1 and Tie2, between Tie1 and Ang, or between Tie2 and Ang. In one embodiment, the agent includes a protein such as an antibody that binds to Ang. For example, the antibody can be one or more of human, humanized, non-immunogenic, isolated, monoclonal and recombinant. In one embodiment, the antibody binds to the N-terminal domain of Ang1 (eg, the N-terminal 50 amino acids of Ang1). In one embodiment, the antibody binds to the coiled-coil domain of Ang1. In one embodiment, the antibody binds to the fibrinogen-like domain of Ang1. In one embodiment, the antibody has amino acid residues 1-100, 50-150, 100-200, 150-250, 200-300, 250-350, 300-400, 350-450, 400-497 of SEQ ID NO: 163 or It binds to 450-497.

一実施形態において、薬剤は重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含するタンパク質を含む。一実施形態において、ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態において。薬剤はまたＦｃドメインも包含する。一実施形態において、薬剤はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインを包含する。一実施形態において、重鎖の定常ドメインはアロタイプ、（ａ，ｚ）アロタイプまたは何れかの他のアロタイプである。   In one embodiment, the agent comprises a protein that includes a heavy chain (HC) immunoglobulin variable domain sequence and a light chain (LC) immunoglobulin variable domain sequence. In one embodiment, the HC and LC framework regions are human. In one embodiment. The agent also includes an Fc domain. In one embodiment, the agent comprises a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant domain. In one embodiment, the constant domain of the heavy chain is an allotype, an (a, z) allotype, or any other allotype.

一実施形態において、薬剤は血管発生または新脈管形成を低減するために有効な量において投与される。一実施形態において、被験体は新脈管形成関連障害を有する。一実施形態において、被験体は例えば新生物障害、転移癌、新脈管構造依存性の癌または腫瘍、炎症性障害、関節リウマチまたは乾癬を有する。一実施形態において、タンパク質は全身投与される。   In one embodiment, the agent is administered in an amount effective to reduce angiogenesis or angiogenesis. In one embodiment, the subject has an angiogenesis-related disorder. In one embodiment, the subject has, for example, a neoplastic disorder, metastatic cancer, angiogenesis-dependent cancer or tumor, inflammatory disorder, rheumatoid arthritis or psoriasis. In one embodiment, the protein is administered systemically.

別の実施形態においては、タンパク質は以下の活動、即ち、新芽形成、分離、血管リモデリング、脈管形成および細管形成の１つ以上を低減するために有効な量で投与される。方法は本明細書に記載する他の特徴を包含する。   In another embodiment, the protein is administered in an amount effective to reduce one or more of the following activities: sprouting, separation, vascular remodeling, vasculogenesis and tubule formation. The method includes other features described herein.

一局面において、本発明は被験体における内皮細胞活性を低減または阻害する方法を包含し、その方法は、被験体において内皮細胞活性を低減または阻害するために有効な量のＴｉｅ複合体形成を低減または阻害する薬剤を投与することを包含する。方法は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。   In one aspect, the invention encompasses a method of reducing or inhibiting endothelial cell activity in a subject, the method reducing the formation of an amount of Tie complex effective to reduce or inhibit endothelial cell activity in the subject. Or administration of an inhibitory agent. The method can include other features described herein.

一局面において、本発明はＴｉｅ１のリン酸化を促進する薬剤を投与することによる内皮細胞活性を低減する方法を包含する。一実施形態において、リン酸化は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。   In one aspect, the present invention includes a method of reducing endothelial cell activity by administering an agent that promotes phosphorylation of Tie1. In one embodiment, phosphorylation reduces endothelial cell differentiation, such as sprouting, separation and tube formation.

別の局面において、本発明は内皮細胞活性を低減する方法を包含し、方法はシグナリング経路を活性化する薬剤を投与することによる。一実施形態においてシグナリング経路は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。例えば薬剤はＴｉｅ１自己リン酸化を増大させる。方法は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。   In another aspect, the invention encompasses a method of reducing endothelial cell activity, wherein the method is by administering an agent that activates a signaling pathway. In one embodiment, the signaling pathway reduces endothelial cell differentiation, such as sprouting, separation and tube formation. For example, the drug increases Tie1 autophosphorylation. The method can include other features described herein.

一局面において、本発明は被験体におけるＴｉｅ複合体形成を調節するための抗体を包含し、ここで抗体は以下のもの、即ち、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチン（Ａｎｇ）の少なくとも２つの間の会合に拮抗する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ複合体成分に、または、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇの１つ以上に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態において、抗体は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。   In one aspect, the invention includes an antibody for modulating Tie complex formation in a subject, wherein the antibody is an association between at least two of the following: Tie1, Tie2, and Angiopoietin (Ang). Antagonize. In one embodiment, the antibody binds to a Tie complex component or to one or more of Tie1, Tie2, and Ang. In one embodiment, the antibody antagonizes the formation of a heteromeric complex of Tie1, Tie2, and Ang. In another embodiment, the antibody can antagonize the association between Tie1 and Tie2, between Tie1 and Ang, or between Tie2 and Ang.

一実施形態において、抗体はＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、抗体はＴｉｅ１の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりＴｉｅ１をＴｉｅ１と会合させ、そしてＴｉｅ１のＴｉｅ２および／またはＡｎｇとの会合を防止する。別の実施形態において、抗体はＴｉｅ１のリン酸化を増大および／またはＴｉｅ１のＴｉｅ２またはＡｎｇとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインに結合する抗体を包含する。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１の第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ１）または第２のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ２）に結合することができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のＥＧＦ様ドメイン（例えば第１、第２または第３のＥＧＦ様ドメイン）に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のフィブロネクチンＩＩＩ型リピート領域に結合する。一実施形態において、抗体は配列番号２のアミノ酸残基２４〜１２４、７４〜１７４、１２４〜２２４、１７４〜２７４、２２４〜３２４、２７４〜３７４、３２４〜４２４、３７４〜４７４、４２４〜５２４、４７４〜５７４、５２４〜６２４、５７４〜６７４、６２４〜７２４、６７４〜７５９または７２４〜７５９に結合する。   In one embodiment, the antibody binds to Tie1. In one embodiment, the antibody antagonizes the formation of a heteromeric complex of Tie1, Tie2, and Ang. In another embodiment, antibody binding can antagonize the association between Tie1 and Tie2, between Tie1 and Ang, or between Tie2 and Ang. In another embodiment, the antibody enhances Tie1 self-association, eg, homodimerization, and thereby associates Tie1 with Tie1 and prevents association of Tie1 with Tie2 and / or Ang. In another embodiment, the antibody increases Tie1 phosphorylation and / or prevents association of Tie1 with Tie2 or Ang. In one embodiment, the antibody includes an antibody that binds to the extracellular domain of human Tie1. For example, the antibody can be one or more of human, humanized, non-immunogenic, isolated, monoclonal and recombinant. In one embodiment, the antibody can bind to the first Ig-like C2-type domain (Ig1) or the second Ig-like C2-type domain (Ig2) of Tie1. In one embodiment, the antibody binds to an EGF-like domain of Tie1 (eg, a first, second or third EGF-like domain). In one embodiment, the antibody binds to the fibronectin type III repeat region of Tie1. In one embodiment, the antibody has amino acid residues 24-124, 74-174, 124-224, 174-274, 224-324, 274-374, 324-424, 374-474, 424-524, SEQ ID NO: 2. 474-574, 524-624, 574-674, 624-724, 674-759 or 724-759.

一実施形態において、抗体はＴｉｅ１エクトドメインに結合し、そして重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含し、タンパク質は更に以下、即ち、（１）可変ドメイン配列の少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体のＣＤＲ少なくとも１つを含み；（２）可変ドメイン配列の少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含み、（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であり、そして（４）タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３またはＥ３ｂと競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３またはＥ３ｂにより結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するという特性の１つ以上を包含する。例えば、抗体は少なくとも２価であり、例えばＴｉｅ１に結合する抗原結合部位少なくとも２つを有する。一実施形態において、抗体はＥ３、Ｅ３ｂ（例えばＤＸ−２２２０）またはＤＸ−２２４０を含む。   In one embodiment, the antibody binds to the Tie1 ectodomain and includes a heavy chain (HC) immunoglobulin variable domain sequence and a light chain (LC) immunoglobulin variable domain sequence, wherein the protein is further: (1) At least one of the variable domain sequences comprises at least one CDR of an E3 or E3b antibody; (2) a CDR that is at least 85% identical in total to the CDR of the corresponding variable domain of the E3 or E3b antibody (3) whether at least one of the variable domains is at least 85% identical to the corresponding immunoglobulin variable domain of the E3 or E3b antibody, and (4) the protein competes with E3 or E3b for binding to Tie1 Or by E3 or E3b on Tie1 Includes one or more of the characteristics of binding to an epitope epitope overlaps with engaged. For example, an antibody is at least bivalent and has at least two antigen binding sites that bind, for example, Tie1. In one embodiment, the antibody comprises E3, E3b (eg, DX-2220) or DX-2240.

一実施形態において、抗体はＥ３またはＥ３ｂ由来の可変ドメイン１つ以上、または、そのような可変ドメインに少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９８、９９％同一の可変ドメイン配列を包含する。一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列はＥ３またはＥ３ｂクローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を包含し、そしてＬＣ可変ドメイン配列はＥ３またはＥ３ｂクローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を包含する。一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列は配列番号１１６を包含する。一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列は配列番号１１４を包含する。一実施形態において、ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はヒト型である。   In one embodiment, the antibody comprises one or more variable domains from E3 or E3b, or variable domain sequences that are at least 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% identical to such variable domains. In one embodiment, the amino acid sequence of the HC variable domain sequence includes CDR1, CDR2 and CDR3 sequences from an E3 or E3b clone, and the LC variable domain sequence includes CDR1, CDR2 and CDR3 sequences from an E3 or E3b clone. . In one embodiment, the LC variable domain sequence includes SEQ ID NO: 116. In one embodiment, the HC variable domain sequence includes SEQ ID NO: 114. In one embodiment, the HC and LC framework regions are human.

一実施形態において、抗体はＴｉｅ２に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、抗体はＴｉｅ２の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりＴｉｅ２をＴｉｅ２と会合させ、そしてＴｉｅ２のＴｉｅ１またはＡｎｇとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のリン酸化を増大させる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のＴｉｅ２またはＡｎｇとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はヒトＴｉｅ２の細胞外ドメインに結合する抗体を包含する。抗体はこれ等の特性の１つ以上を有してよく、例えば抗体はＴｉｅ１のリン酸化を促進し、Ｔｉｅ１のＴｉｅ２またはＡｎｇとの会合を防止してよい。   In one embodiment, the antibody binds to Tie2. In one embodiment, the antibody antagonizes the formation of a heteromeric complex of Tie1, Tie2, and Ang. In another embodiment, antibody binding can antagonize the association between Tie1 and Tie2, between Tie1 and Ang, or between Tie2 and Ang. In another embodiment, the antibody enhances Tie2 self-association, eg, homodimerization, and thereby associates Tie2 with Tie2 and prevents association of Tie2 with Tie1 or Ang. In one embodiment, the antibody increases phosphorylation of Tie1. In one embodiment, the antibody prevents association of Tie1 with Tie2 or Ang. In one embodiment, the antibody includes an antibody that binds to the extracellular domain of human Tie2. An antibody may have one or more of these properties, for example, the antibody may promote Tie1 phosphorylation and prevent association of Tie1 with Tie2 or Ang.

例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２の第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ１）または第２のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ２）に結合することができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２のＥＧＦ様ドメイン（例えば第１、第２または第３のＥＧＦ様ドメイン）に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２のフィブロネクチンＩＩＩ型リピート領域に結合する。一実施形態において、抗体は配列番号１６２のアミノ酸残基１９〜１１９、６９〜１６９、１１９〜２２９、１６９〜２６９、２２９〜３２９、２６９〜３６９、３２９〜４２９、３６９〜４６９、４２９〜５２９、４６９〜５６９、５２９〜６２９、５６９〜６６９、６２９〜７２９、６６９〜７４５または７２９〜７４５に結合する。   For example, the antibody can be one or more of human, humanized, non-immunogenic, isolated, monoclonal and recombinant. In one embodiment, the antibody can bind to the first Ig-like C2-type domain (Ig1) or the second Ig-like C2-type domain (Ig2) of Tie2. In one embodiment, the antibody binds to an EGF-like domain of Tie2 (eg, a first, second or third EGF-like domain). In one embodiment, the antibody binds to the fibronectin type III repeat region of Tie2. In one embodiment, the antibody has amino acid residues 19-119, 69-169, 119-229, 169-269, 229-329, 269-369, 329-429, 369-469, 429-529, SEQ ID NO: 162, It binds to 469-569, 529-629, 569-669, 629-729, 669-745 or 729-745.

一実施形態において、抗体はＡｎｇに結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のＮ末端ドメイン（例えばＡｎｇ１のＮ末端５０アミノ酸）に結合する。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のコイルドコイルドメインに結合する。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のフィブリノーゲン様ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号１６３のアミノ酸残基１〜１００、５０〜１５０、１００〜２００、１５０〜２５０、２００〜３００、２５０〜３５０、３００〜４００、３５０〜４５０、４００〜４９７または４５０〜４９７に結合する。   In one embodiment, the antibody binds Ang. In one embodiment, the antibody antagonizes the formation of a heteromeric complex of Tie1, Tie2, and Ang. In another embodiment, antibody binding can antagonize the association between Tie1 and Tie2, between Tie1 and Ang, or between Tie2 and Ang. For example, the antibody can be one or more of human, humanized, non-immunogenic, isolated, monoclonal and recombinant. In one embodiment, the antibody binds to the N-terminal domain of Ang1 (eg, the N-terminal 50 amino acids of Ang1). In one embodiment, the antibody binds to the coiled-coil domain of Ang1. In one embodiment, the antibody binds to the fibrinogen-like domain of Ang1. In one embodiment, the antibody has amino acid residues 1-100, 50-150, 100-200, 150-250, 200-300, 250-350, 300-400, 350-450, 400-497 of SEQ ID NO: 163 or It binds to 450-497.

一実施形態において、抗体は重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含する。   In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain (HC) immunoglobulin variable domain sequence and a light chain (LC) immunoglobulin variable domain sequence.

一実施形態において、ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態において、抗体はまたＦｃドメインを包含する。一実施形態において、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインを包含する。   In one embodiment, the HC and LC framework regions are human. In one embodiment, the antibody also includes an Fc domain. In one embodiment, the antibody comprises a constant domain of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.

一実施形態において、抗体は血管発生または新脈管形成を低減するために有効な量において投与される。一実施形態において、抗体は全身投与される。一実施形態において、抗体は以下の活動、即ち、新芽形成、分離、血管リモデリング、脈管形成および細管形成の１つ以上を低減するために有効な量で投与される。   In one embodiment, the antibody is administered in an amount effective to reduce angiogenesis or angiogenesis. In one embodiment, the antibody is administered systemically. In one embodiment, the antibody is administered in an amount effective to reduce one or more of the following activities: sprouting, separation, vascular remodeling, vasculogenesis and tubule formation.

一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体の可変ドメイン１つ以上を包含する単離されたタンパク質を包含する。   In one aspect, the invention includes an isolated protein that includes one or more of the variable domains of an antibody described herein.

一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体の可変ドメインを包含するポリペプチドをコードするコーディング配列を包含する核酸を包含する。   In one aspect, the invention includes a nucleic acid that includes a coding sequence that encodes a polypeptide that includes a variable domain of an antibody described herein.

一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体を包含する薬学的組成物を包含する。組成物および抗体は本明細書記載の他の特徴を包含できる。   In one aspect, the invention includes pharmaceutical compositions that include the antibodies described herein. Compositions and antibodies can include other features described herein.

一局面において、本発明は新脈管形成関連障害の治療のための本明細書記載の抗体を包含する。抗体および治療は本明細書記載の他の特徴を包含できる。   In one aspect, the invention includes an antibody described herein for the treatment of an angiogenesis-related disorder. Antibodies and therapies can include other features described herein.

一局面において、本発明は新脈管形成関連障害を治療するための医薬の製造のための本明細書記載の抗体を包含する。医薬および抗体は本明細書記載の他の特徴を包含できる。   In one aspect, the invention includes an antibody described herein for the manufacture of a medicament for treating an angiogenesis-related disorder. Drugs and antibodies can include other features described herein.

一局面において、本発明は第２の治療、例えば抗癌療法と組み合わせて第１の薬剤を投与することを包含する第１の治療を提供する方法を包含する。第１の薬剤はＴｉｅ複合体形成を低減するか、またはＴｉｅ１ホモ二量体化を増大させる薬剤である。例えば第１の薬剤はＴｉｅ１結合タンパク質である。一実施形態において、第２の療法は放射線療法または手術を包含する。一実施形態において、第２の療法は第２の薬剤を投与することを包含する。例えば、第２の薬剤はＴｉｅ複合体形成を拮抗または低減するか、またはＴｉｅ１ホモ二量体化を増大させる。一実施形態において、第２の薬剤はＶＥＧＦ経路を介したシグナリングに拮抗する薬剤、例えばＶＥＧＦ拮抗剤抗体、例えばベバシズマブ；ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害剤またはＶＥＧＦ経路シグナリングに拮抗する他の薬剤である。後述する「複合療法」も参照できる。   In one aspect, the invention includes a method of providing a first treatment comprising administering a first agent in combination with a second treatment, eg, an anti-cancer therapy. The first agent is an agent that reduces Tie complex formation or increases Tie1 homodimerization. For example, the first agent is a Tie1 binding protein. In one embodiment, the second therapy includes radiation therapy or surgery. In one embodiment, the second therapy includes administering a second agent. For example, the second agent antagonizes or reduces Tie complex formation or increases Tie1 homodimerization. In one embodiment, the second agent is an agent that antagonizes signaling through the VEGF pathway, such as a VEGF antagonist antibody, such as bevacizumab; a VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor or other agent that antagonizes VEGF pathway signaling. Reference can also be made to “combination therapy” described below.

別の局面において、本発明はＴｉｅ複合体形成を低減する薬剤および抗癌剤を包含する組成物を包含する。例えば、抗癌剤はＴｉｅ複合体形成に拮抗する第２の薬剤またはＶＥＧＦ経路に拮抗する第２の薬剤であることができる。   In another aspect, the invention includes a composition comprising an agent that reduces Tie complex formation and an anticancer agent. For example, the anticancer agent can be a second agent that antagonizes Tie complex formation or a second agent that antagonizes the VEGF pathway.

一局面において、本発明はＴｉｅ１リン酸化を促進することにより内皮細胞活性を低減する抗体を特徴とする。例えば抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。   In one aspect, the invention features an antibody that reduces endothelial cell activity by promoting Tie1 phosphorylation. For example, antibodies reduce endothelial cell differentiation, such as sprouting, separation and tube formation.

一つの局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。この結合タンパク質は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合する。例えば、このタンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤで結合する。 In one aspect, the invention is characterized by a protein (eg, an isolated protein) that comprises a heavy chain immunoglobulin variable domain sequence and a light chain immunoglobulin variable domain sequence and that binds to a Tie1 ectodomain. This binding protein binds to the Tie1 ectodomain. For example, the protein binds with 10 -8 M, 5 · 10 -9 M, 10 -9 M, 10 -10 M, 10 -11 M or less than 10 -12 M affinity K D.

一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のＣＤＲは、ヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）または合成のものである。一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域は、ヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）のものである。   In one embodiment, the one or more CDRs of the heavy and / or light chain variable domain sequences are human, primate, non-rodent (eg, non-mouse or non-rat) or synthetic. In one embodiment, the one or more framework regions of the heavy and / or light chain variable domain sequences are human, primate or non-rodent (eg, non-mouse or non-rat).

一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を含む：
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ１：
（ＡＧＳＲ）−Ｙ−（ＧＶＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＦ）（配列番号１１７）
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ２：
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１２１）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）または
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＰＳ）−Ｔ−（ＹＶＨ）−Ｙ−Ａ−Ｄ（配列番号７２２）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）；
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ３：
Ｖ−（４または５残基）−Ｆ−Ｄ−（Ｉ／Ｙ）（配列番号１２４）、
Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２５）、
（ＧＶ）−Ｎ−Ｙ−Ｙ−（ＧＹＤ）−Ｓ−（ＳＤ）−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２６）、
（ＧＶＤ）−（ＡＧＬＮ）−（ＬＹＲ）−（ＧＳＴＬＹＨ）−（ＧＹＤ）−（ＡＧＳＹＦＰ）−（ＳＦＤ）−（ＡＧＹＤ）−（ＩＹ）−（ＧＦＤ）−（ＹＤＰ）−（ＩＰ）−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２７）、
Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）、
ＶＮＹＹＤＳＳＧＹＧＰＩＡＰＧＬＤＹ（配列番号１２８）または
Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−（ＡＹ）−Ｆ−Ｄ−（Ｙ１）（配列番号７０５）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）。 In one embodiment, the heavy chain variable domain sequence includes one or more of the following properties:
i) HC CDR1 comprising an amino acid sequence as follows:
(AGSR) -Y- (GVK) -M- (GSVF) (SEQ ID NO: 117)
(AGSIMHRH) -Y- (GVMK) -M- (GSVMMFH) (SEQ ID NO: 118) or (AGSIMRNH) -Y- (AGTVMKPQ) -M- (AGSTMVMYWFKH) (SEQ ID NO: 119);
ii) HC CDR2 comprising an amino acid sequence as follows:
X-I-Y-P-S-G-G-G-X-T-X-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 120) (wherein X is any amino acid) ,
(GSV) -I- (SY) -PSG-G- (WQ) -T- (GY) (SEQ ID NO: 121),
(GSV) -I- (SY) -PSG-G- (WNQ) -T- (GY) (SEQ ID NO: 160)
(GSV) -I- (SY) -PSG-G- (WQ) -T- (GY) -Y-A-D-S-VK-G (SEQ ID NO: 122)
(GSVW) -I- (SY) -PSG-G- (AGVMYWPQH) -T- (AGSTLVMYFKH) (SEQ ID NO: 123) or XI-Y-P-S-GG- (WPS) -T- (YVH) -YA-D (SEQ ID NO: 722) (wherein X is any amino acid);
iii) HC CDR3 comprising an amino acid sequence as follows:
V- (4 or 5 residues) -FD- (I / Y) (SEQ ID NO: 124),
G-Y-G-P-I-A-P-G-L-D-Y (SEQ ID NO: 125),
(GV) -N-Y-Y- (GYD) -S- (SD) -G-Y-G-P-I-A-P-G-L-D-Y (SEQ ID NO: 126),
(GVD)-(AGLN)-(LYR)-(GSTLYH)-(GYD)-(AGSYFP)-(SFD)-(AGYD)-(IY)-(GFD)-(YDP)-(IP) -A- P-G-L-D (SEQ ID NO: 127),
A-P-R-G-Y-S-Y-G-Y-Y-Y (SEQ ID NO: 727),
VNYYDSSGYGPIAPGLDY (SEQ ID NO: 128) or GX-X-G- (AY) -FD- (Y1) (SEQ ID NO: 705) (wherein X is any amino acid).

一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を含む：
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ１：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−Ｘ１−Ｙ−Ｌ−（ＡＮ）（配列番号１２９）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−Ｓ−（ＹＳ）−Ｌ−（ＡＬＮ）（配列番号７０６）、
Ｔ−Ｇ−Ｔ−（ＳＮ）−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｇ−（ＧＳ）−Ｙ（配列番号７０７）、
（ＳＣＱ）−（ＧＳ）−（ＤＳ）−（ＮＳ）−（ＩＬ）−（ＧＲ）−Ｓ−（ＹＫＮ）−（ＹＳ）−（ＶＡ）（配列番号７０８）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｚ−Ｌ（配列番号１３０）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）（配列番号１３１）または
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または不在であり得る）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＳＲ２：
Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３３）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３４）、
（ＤＧ）−（ＡＶ）−Ｓ−Ｎ−（ＲＬ）−（ＡＰ）−（ＳＴ）（配列番号７０９）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３５）または
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）；および
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ３：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）、
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３７）、
（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３８）、
Ｑ−Ｑ−Ｘ−Ｓ−（ＳＮ）−（ＷＳ）−Ｐ−Ｘ−Ｔ−Ｆ（配列番号７１０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｙ−（ＴＧ）−（ＳＧ）−Ｓ−（ＰＧＳ）−（ＴＮ）−Ｘ−（ＶＴ）（配列番号７１１）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｑ−Ｑ−（ＹＲ）−（ＧＳ）−Ｓ−（ＳＷ）−Ｐ−Ｒ−Ｘ１−Ｔ（配列番号１３９）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または不在であり得る）、
Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）、
（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＴＩ）（配列番号１４０）または
（ＬＱ）−（ＬＲＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＡＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＳＶＲＰ）−（ＳＴＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＳＴＩ）（配列番号１４１）。 In one embodiment, the light chain variable domain sequence includes one or more of the following properties:
i) LC CDR1 comprising the amino acid sequence as follows:
RASAQSS- (IV) -S- (SR) -X1-YL- (AN) (SEQ ID NO: 129),
R-ASSQSS- (IV) -SS- (YS) -L- (ALN) (SEQ ID NO: 706),
T-G-T- (SN) -SDVG- (GS) -Y (SEQ ID NO: 707),
(SCQ)-(GS)-(DS)-(NS)-(IL)-(GR) -S- (YKN)-(YS)-(VA) (SEQ ID NO: 708),
R-A-S-Q-S-V-S-S-Z-L (SEQ ID NO: 130),
R-A-S-Q-S- (IV) -S- (SR) (SY)-(LY)-(ALN) (SEQ ID NO: 131) or R-A-S- (REQ)-(GSTRN)- (IV)-(GSTIRN)-(STIRH) -X1- (SYWNH)-(LV)-(ASN) (SEQ ID NO: 132) (wherein X1 may be serine or absent);
ii) LC CSR2 comprising an amino acid sequence as follows:
X-A-S-X-R-A-T (SEQ ID NO: 133) (wherein X can be any amino acid),
(AGD) -AS- (STN) -RAT (SEQ ID NO: 134),
(DG)-(AV) -SN- (RL)-(AP)-(ST) (SEQ ID NO: 709),
(AGD) -AS- (STN)-(LR)-(AEQ)-(ST) (SEQ ID NO: 135) or (AGTKDEH) -AS- (STN)-(LR)-(AVEQ)-( ST) (SEQ ID NO: 136); and iii) LC CDR3 comprising an amino acid sequence as follows:
QQ- (SYFR)-(GSYN) -S- (STYW)-(RP)-(LWRH)-(TIY) (SEQ ID NO: 161),
QQ- (SYFR)-(GSYN) -S- (STYW)-(RP)-(LWR)-(TIY) -T (SEQ ID NO: 137),
(LQ) -Q- (SYFR)-(GSYN)-(SKN)-(STYW)-(RP)-(LWR)-(TIY) -T (SEQ ID NO: 138),
Q-Q-X-S- (SN)-(WS) -PX-TF (SEQ ID NO: 710) (wherein X is any amino acid),
Y- (TG)-(SG) -S- (PGS)-(TN) -X- (VT) (SEQ ID NO: 711) (wherein X is any amino acid),
QQ- (YR)-(GS) -S- (SW) -PR-X1-T (SEQ ID NO: 139), wherein X1 can be any amino acid or absent.
Q-Q-F-N-S-Y-P-H (SEQ ID NO: 728),
(LQ)-(LQ)-(SYFRD)-(GSYN)-(STRKN)-(STYWF)-(RP)-(ILMWRH)-(TIY)-(TI) (SEQ ID NO: 140) or (LQ)-( LRQ)-(SYFRD)-(GSYN)-(ASTRKN)-(STYWF)-(SVRP)-(STILMWRH)-(TIY)-(STI) (SEQ ID NO: 141).

一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を有する：
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ１：
Ｓ−Ｘ−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１４２）または
Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、ＧまたＲ）であり、Ｘ２は任意のアミノ酸（例えば、ＹまたはＮ）であり、Ｘ３は任意のアミノ酸（例えば、Ｆ、ＮまたはＫ）であり、Ｘ４は任意のアミノ酸（例えば、脂肪族、例えば
ＶまたはＡ）である）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ２：
（ＤＥ）−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４４）、
（ＤＥ）−（ＶＤ）−（ＳＴＤＮ）−（ＹＲＤＮ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４５）；
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ３：
（ＳＱ）−Ｓ−（ＳＹ）−（ＡＳＩＤ）−（ＧＳＲ）−（ＳＴ）−（ＳＴＲＮ）−（ＳＴＹＲ）−（ＡＴＬＹ）−（ＳＶＷＱ）（配列番号１４６）。 In one embodiment, the light chain variable domain sequence has one or more of the following properties:
i) LC CDR1 comprising the amino acid sequence as follows:
S-X- (ND)-(IV)-(AG) -X1-X2-X3 (SEQ ID NO: 142) or T- (GR)-(ST) -S-X5- (ND)-(IV)-( AG) -X1-X2-X3-Y-X4-S (SEQ ID NO: 143) (wherein X1 is any amino acid (eg, G or R) and X2 is any amino acid (eg, Y or N)) X3 is any amino acid (eg F, N or K) and X4 is any amino acid (eg aliphatic, eg V or A);
ii) LC CDR2 comprising an amino acid sequence as follows:
(DE) -VN-N-R-P-S (SEQ ID NO: 144),
(DE)-(VD)-(STDN)-(YRDN) -RPS (SEQ ID NO: 145);
iii) LC CDR3 comprising an amino acid sequence as follows:
(SQ) -S- (SY)-(ASID)-(GSR)-(ST)-(STRN)-(STYR)-(ATLY)-(SVWQ) (SEQ ID NO: 146).

一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ２は以下のとおりのアミノ酸配列を含む：
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４７）または（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４８）。 In one embodiment, the HC CDR2 comprises an amino acid sequence as follows:
(GSVW) -I- (SY) -P-SG-G- (AGVMYWPQH) -T- (AGSTLVMYFKH) -Y- (AT) -DSVVKG (SEQ ID NO: 147) or (GSV) -I- (SY) -P-SG-G- (WQ) -T- (GY) -Y- (AT) -DSVVKG (SEQ ID NO: 148).

一実施形態において、タンパク質は、ｐ−Ｆ３、Ｅ３またはＥ３ｂの対応するＣＤＲ配列に関連するＨＣ ＣＤＲ１およびＨＣ ＣＤＲ２配列を含む。例えば、タンパク質は、配列ＭＹＧＭ（配列番号１４９）をＨＣ ＣＤＲ１に対応する位置に含む。この配列の後に小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリンまたはセリンが続き得る。別の実施例において、タンパク質は、配列ＶＩＳＰＳＧＧＸ１ＴＸ２ＹＡＤＳＡＶＫＧ（配列番号１５０）をＨＣ ＣＤＲ２に対応する位置に含む。例えば、Ｘ１は親水性アミノ酸、例えばグルタミンまたはアスパラギンであり得る。例えば、Ｘ２は小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリンまたはセリンであり得る。 In one embodiment, the protein comprises HC CDR1 and HC CDR2 sequences that are related to the corresponding CDR sequences of p-F3, E3, or E3b. For example, the protein includes the sequence MYGM (SEQ ID NO: 149) at a position corresponding to HC CDR1. This sequence can be followed by small amino acids such as glycine, alanine, valine or serine. In another example, the protein comprises the sequence VISPSGGX 1 TX 2 YADSAVKG (SEQ ID NO: 150) at a position corresponding to HC CDR2. For example, X 1 can be a hydrophilic amino acid, such as glutamine or asparagine. For example, X 2 is small amino acid such as glycine, alanine may be a valine or serine.

一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は以下の特徴、即ち、Ｋａｂａｔ３１位におけるアミノ酸残基がＡ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴ、例えばＨ、Ｎ、ＲまたはＳであり；Ｋａｂａｔ３２位におけるアミノ酸残基がＹであり；Ｋａｂａｔ３３位におけるアミノ酸残基がＧ、Ｋ、Ｐ、ＲまたはＶ、例えばＫまたはＶであり；Ｋａｂａｔ３４位におけるアミノ酸残基がＭであり；Ｋａｂａｔ３５位におけるアミノ酸残基がＡ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＳまたはＶ、例えばＧＨＭまたはＶであり；Ｋａｂａｔ５０位におけるアミノ酸残基がＧ、Ｒ、ＳまたはＶ、例えばＳまたはＶであり；Ｋａｂａｔ５１位におけるアミノ酸残基がＩであり；Ｋａｂａｔ５２位におけるアミノ酸残基がＳまたはＹ、例えばＹであり；Ｋａｂａｔ５２ａ位におけるアミノ酸残基がＰまたはＳ、例えばＰであり；Ｋａｂａｔ５３位におけるアミノ酸残基がＳであり；Ｋａｂａｔ５４位におけるアミノ酸残基がＧであり；Ｋａｂａｔ５５位におけるアミノ酸残基がＧであり；Ｋａｂａｔ５６位におけるアミノ酸残基がＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｑ、ＷまたはＹ、例えばＡ、ＷまたはＹであり；Ｋａｂａｔ５７位におけるアミノ酸残基がＴであり；Ｋａｂａｔ５８位におけるアミノ酸残基がＲ、Ｓ、ＴまたはＹ、例えばＹであること；の１つ以上を有することができる。一実施形態において、ＣＤＲ３の長さは８〜１８アミノ酸、例えば８〜１２、８〜１０、または１５〜１７アミノ酸である。   In one embodiment, the heavy chain variable domain sequence has the following characteristics: the amino acid residue at position Kabat 31 is A, H, K, N, Q, R, S or T, such as H, N, R or S The amino acid residue at Kabat position 32 is Y; the amino acid residue at Kabat position 33 is G, K, P, R or V, such as K or V; the amino acid residue at Kabat position 34 is M; at Kabat position 35; The amino acid residue is A, G, H, I, L, M, S or V, eg GHM or V; the amino acid residue at position Kabat 50 is G, R, S or V, eg S or V; Kabat51 The amino acid residue in position is I; the amino acid residue in position Kabat 52 is S or Y, eg Y; in position Kabat 52a The amino acid residue in the Kabat position 53 is G; the amino acid residue in the Kabat position 54 is G; the amino acid residue in the Kabat position 55 is G; in the Kabat position 56; The amino acid residue is A, F, H, I, Q, W or Y, for example A, W or Y; the amino acid residue at Kabat 57 is T; the amino acid residue at Kabat 58 is R, S, T Or one or more of Y, for example Y. In one embodiment, the length of CDR3 is 8-18 amino acids, such as 8-12, 8-10, or 15-17 amino acids.

一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲは、本明細書中に記載される抗体のＨＣ可変ドメインにも適合するモチーフに適合する。同様に、一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲは、本明細書中に記載される抗体のＬＣ可変ドメインにも適合するモチーフに適合する。さらに別の実施形態において、ＣＤＲに適合したモチーフは、本明細書中に記載される抗体で対となるＨＣおよびＬＣに基づく。   In one embodiment, two or three CDRs of the HC variable domain sequence match a motif that is also compatible with the HC variable domain of the antibodies described herein. Similarly, in one embodiment, two or three CDRs of an LC variable domain sequence match a motif that is also compatible with the LC variable domain of an antibody described herein. In yet another embodiment, CDR matched motifs are based on HC and LC paired with the antibodies described herein.

一実施形態において、Ｈ１およびＨ２の超可変ループは、本明細書中に記載される抗体と同じ標準構造を有する。一実施形態において、Ｌ１とＬ２の超可変ループは本明細書中に記載の抗体と同じ標準構造を有する。   In one embodiment, the H1 and H2 hypervariable loops have the same standard structure as the antibodies described herein. In one embodiment, the L1 and L2 hypervariable loops have the same standard structure as the antibodies described herein.

一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列は少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも３個、４個または５個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１５個、１６個または１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１０個、１２個、１４個、１５個、１６個または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１４個、１５個、１６個または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも７個または８個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ３配列と同一である。   In one embodiment, the HC CDR1 amino acid sequence has a length of at least 5 amino acids, of which at least 3, 4 or 5 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1, p-A10. , P-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s -C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or the CDR1 sequence of the HC of another antibody described herein. In one embodiment, the HC CDR2 amino acid sequence has a length of at least 15, 16, or 17 amino acids, of which at least 10, 12, 14, 15, 16, or 17 amino acids Clones E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s -H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or as described herein It is identical to the CDR2 sequence of HC of another antibody. In one embodiment, the HC CDR2 amino acid sequence has a length of at least 17 amino acids, of which at least 14, 15, 16, or 17 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1 , P-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s Identical to the CDR2 sequence of HC of B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or another antibody described herein. is there. In one embodiment, the HC CDR3 amino acid sequence has a length of at least 7 or 8 amino acids, of which at least 5, 6, 7 or 8 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s- HC CDR3 sequence of B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or another antibody described herein Is the same.

一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲは本明細書中に記載されるモチーフに適合して、該モチーフは本明細書中に記載されるクローン、例えばＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣ可変ドメインに適合するモチーフの組となる。例えば、このタンパク質は、配列番号１１８および配列番号１６０、例えばＥ３ ＨＣ可変ドメインに適合するモチーフを含み得る。   In one embodiment, two or three CDRs of the HC variable domain sequence are matched to a motif described herein, which motif is a clone described herein, eg, E3, E3b, G2 , P-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s HC variable domains of B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or another antibody described herein A set of motifs that match For example, the protein can include a motif that matches SEQ ID NO: 118 and SEQ ID NO: 160, eg, the E3 HC variable domain.

一実施形態において、ＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列は、少なくとも１０個、１１個または１２個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７個、８個、９個、１０個または１１個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施形態において、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも６個または７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５個、６個または７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも８個、９個または１０個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７個、８個、９個または１０個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣのＣＤＲ３配列と同一である。   In one embodiment, the LC CDR1 amino acid sequence has a length of at least 10, 11, or 12 amino acids, of which at least 7, 8, 9, 10, or 11 amino acids are cloned E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or another described herein It is identical to the CDR1 sequence of the antibody LC. In one embodiment, the LC CDR2 amino acid sequence has a length of at least 6 or 7 amino acids, of which at least 5, 6 or 7 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1 , P-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s Identical to the CDR2 sequence of the LC of B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or another antibody described herein. is there. In one embodiment, the LC CDR3 amino acid sequence has a length of at least 8, 9, or 10 amino acids, of which at least 7, 8, 9, or 10 amino acids are clones E3, E3b , G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2 , S-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or LC of another antibody described herein Is identical to the CDR3 sequence of

一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲは、本明細書中に記載されるモチーフに適合して、該モチーフが、本明細書中に記載されるクローン、例えばＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣ可変ドメインに適合するモチーフの組となる。例えば、このタンパク質は、配列番号１３２、配列番号１３６および配列番号１６１、例えばＥ３ ＬＣ可変ドメインに適合するモチーフを含み得る。   In one embodiment, two or three CDRs of the LC variable domain sequence are matched to a motif described herein and the motif is a clone described herein, eg, E3, E3b , G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2 , S-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or LC of another antibody described herein It is a set of motifs that match the variable domain. For example, the protein can include a motif that matches SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, and SEQ ID NO: 161, eg, the E3 LC variable domain.

一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。   In one embodiment, the amino acid sequence of the HC variable domain sequence is clone E3, E3b, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3. , P-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s The amino acid sequence of the HC variable domain of G10, s-H4, or another antibody described herein, and at least 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98 %, 99% or 100% identical.

一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。   In one embodiment, the amino acid sequence of the LC variable domain sequence is clone E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p. -F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10 , S-H4, or the amino acid sequence of the LC variable domain of another antibody described herein, and at least 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% or 100% identical.

一実施形態において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、および本明細書中の任意の他の抗体からなる群から選択されるクローンのＨＣおよびＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。   In one embodiment, the amino acid sequences of the HC and LC variable domain sequences are E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s- HC and LC variable domain amino acid sequences of clones selected from the group consisting of G10, s-H4, and any other antibody herein, and at least 70%, 80%, 85%, 90%, 92 %, 95%, 97%, 98%, 99% or 100% identical.

一実施形態において、ＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインの一つ以上のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４）のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣおよびＬＣ可変ドメインの対応するフレームワーク領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。   In one embodiment, the amino acid sequence of one or more framework regions of the HC and / or LC variable domains (eg, FR1, FR2, FR3 and / or FR4) is clone E3, E3b, G2, p-A1, p -A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9 , S-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or the corresponding frame of the HC and LC variable domains of another antibody described herein It is at least 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the work area.

一実施形態において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列はＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４または本明細書に記載した他の抗体の可変ドメインをコードする核酸にハイブリダイズ（例えば高ストリンジェンシー下）する核酸によりコードされる配列を含む。   In one embodiment, the amino acid sequences of the HC and LC variable domain sequences are E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p -F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10 Or a sequence encoded by a nucleic acid that hybridizes (eg, under high stringency) to a nucleic acid encoding a variable domain of s-H4 or other antibody described herein.

一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。   In one embodiment, the light chain variable domain sequence is human or non-immunogenic in humans. In one embodiment, the heavy chain variable domain sequence is human or non-immunogenic in humans.

タンパク質は、Ｔｉｅ１を発現する細胞、例えば内皮細胞に結合し得る。一実施形態において、タンパク質は、血小板（例えば、静止および／または活性化血小板）に実質的に結合しない（例えば、検出可能に結合しない）。   The protein may bind to cells that express Tie1, such as endothelial cells. In one embodiment, the protein does not substantially bind (eg, does not detectably bind) to platelets (eg, quiescent and / or activated platelets).

一実施形態において、タンパク質はインビトロのＨＵＶＥＣによる管形成を阻害する。例えば、Ｅ３抗体はインビトロのＨＵＶＥＣによる管形成を阻害する（例えば実施例１８に記載の条件下）。一実施形態において、タンパク質はインビボＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグ試験において新脈管形成を阻害する。例えばＥ３抗体は例示的な試験（例えば実施例２１に記載する例示的な試験を参照）において新脈管形成を阻害できる。   In one embodiment, the protein inhibits tube formation by in vitro HUVEC. For example, the E3 antibody inhibits tube formation by HUVEC in vitro (eg, under the conditions described in Example 18). In one embodiment, the protein inhibits angiogenesis in an in vivo MATRIGEL® plug test. For example, the E3 antibody can inhibit angiogenesis in an exemplary test (see, eg, the exemplary test described in Example 21).

一実施形態において、タンパク質は、組織切片中のメラノーマ関連構造物（例えば、メラノーマ組織）のみならず、周囲構造物の抗原を認識する。一実施形態において、タンパク質は、組織切片中の正常な皮膚の血管を染色しない。   In one embodiment, the protein recognizes the antigen of surrounding structures as well as melanoma associated structures (eg, melanoma tissue) in tissue sections. In one embodiment, the protein does not stain normal skin vessels in the tissue section.

一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１に特異的に結合し、例えば、該タンパク質は別のヒトタンパク質（例えば、Ｉｇ様ドメイン、ＥＧＦ様ドメインまたはフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートを有するＴｉｅ１以外の天然タンパク質であるＴｉｅ２、またはヒト血清アルブミン）に比較して、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、１０３倍または１０４倍、優先的にＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、タンパク質は、本明細書中に記載されるＴｉｅ１ドメインに結合する。 In one embodiment, the protein specifically binds to Tie1, for example, the protein is another human protein (eg, Tie2, which is a natural protein other than Tie1 having an Ig-like domain, an EGF-like domain, or a fibronectin type III repeat, Or at least 10 times, 50 times, 100 times, 10 3 times or 10 4 times as compared to human serum albumin), preferentially binds to Tie1. In one embodiment, the protein binds to the Tie1 domain described herein.

別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１の活性を調節するタンパク質（例えば、単離タンパク質）、例えばＴｉｅ１レセプターにより特徴付けられる。例えば、このタンパク質は天然のものではない。一実施形態において、タンパク質は、ＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のＣＤＲは、ヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）または合成のものである。一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域は、ヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）のものである。別の実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリン可変ドメインを実質的に含まず、例えばタンパク質は、独立してＴｉｅ１と相互作用するペプチド、または免疫グロブリン可変ドメインを含まないポリペプチドを含む。   In another aspect, the invention is characterized by a protein that modulates the activity of Tie1 (eg, an isolated protein), such as a Tie1 receptor. For example, this protein is not natural. In one embodiment, the protein comprises HC and LC immunoglobulin variable domain sequences. In one embodiment, the one or more CDRs of the heavy and / or light chain variable domain sequences are human, primate, non-rodent (eg, non-mouse or non-rat) or synthetic. In one embodiment, the one or more framework regions of the heavy and / or light chain variable domain sequences are human, primate or non-rodent (eg, non-mouse or non-rat). In another embodiment, the protein is substantially free of immunoglobulin variable domains, eg, the protein comprises a peptide that interacts independently with Tie1, or a polypeptide that does not contain an immunoglobulin variable domain.

一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１タンパク質の活性、例えば実施例２に記載したＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３２おける活性を活性化する。この試験において活性化を示すタンパク質は他の条件、例えばインビボにおいて拮抗剤として挙動できる。   In one embodiment, the protein activates the activity of the Tie1 protein, eg, the activity in the Tie1 / EpoR chimeric BaF32 described in Example 2. Proteins that show activation in this test can behave as antagonists in other conditions, such as in vivo.

一実施形態において、タンパク質は、Ｅ３、Ｅ３ｂもしくは他の抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、Ｅ３、Ｅ３ｂもしくは本明細書中に記載の他の抗体の各ＣＤＲと、ＣＤＲ領域において少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、同一であるＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３、Ｅ３ｂもしくは本明細書中に記載の他の抗体と競合するか、あるいはＥ３、Ｅ３ｂもしくは本明細書中に記載の他の抗体により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープ、またはＥ３、Ｅ３ｂもしくは本明細書中に記載の他の抗体により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つもしくは三つの残基を有するエピトープに結合する。   In one embodiment, the protein comprises at least 70% in the CDR regions of the HC and LC immunoglobulin variable domains of E3, E3b or other antibodies, each CDR of E3, E3b or other antibodies described herein, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%, identical HC and / or LC immunoglobulin variable Contains domain sequences. In one embodiment, the protein competes with E3, E3b, or other antibodies described herein for binding to Tie1, or is recognized by E3, E3b, or other antibodies described herein. It binds to an epitope that overlaps with an epitope, or an epitope that has at least one, two, or three residues in common with an epitope recognized by E3, E3b or other antibodies described herein.

一実施形態において、活性化タンパク質は、Ｔｉｅ１細胞外ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメイン等のキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存性細胞が、ＩＬ−３の不在において生存することを可能とする。   In one embodiment, the activating protein allows IL-3-dependent cells that express chimeric receptors such as the Tie1 extracellular domain and the EpoR intracellular domain to survive in the absence of IL-3.

一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１の二量体化を引き起こし得る。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１のＲＴＫドメインの自己リン酸化を引き起こし得る。   In one embodiment, the protein may cause dimerization of Tie1. In one embodiment, the protein may cause autophosphorylation of the RTK domain of Tie1.

一実施形態において、タンパク質は、Ｅ３もしくはＥ３ｂ抗体と共働して、（例えば、Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞アッセイにおいて）Ｔｉｅの活性を活性化する。一実施形態において、タンパク質は、Ｇ２もしくはＣ７抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域において少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、同一であるドメインを含む。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１への結合に関してＧ２もしくはＣ７と競合するか、あるいはＧ２もしくはＣ７により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープ、またはＧ２もしくはＣ７により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つもしくは三つの残基を有するエピトープに結合する。   In one embodiment, the protein synergizes with the E3 or E3b antibody to activate the activity of Tie (eg, in a Tie1 / EpoR chimeric BaF3 cell assay). In one embodiment, the protein is at least 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, HC and LC immunoglobulin variable domains of the G2 or C7 antibody, or CDR regions, Contains domains that are 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical. In one embodiment, the protein competes with G2 or C7 for binding to Tie1, or overlaps with an epitope recognized by G2 or C7, or at least one common with an epitope recognized by G2 or C7 It binds to an epitope with one, two or three residues.

別の実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１タンパク質の活性を中和する。例えば、このタンパク質は、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体の能力を少なくとも部分的に阻害して、Ｔｉｅタンパク質に作用し得る。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１細胞外ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメイン等のキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存性細胞がＩＬ−３の不在において生存することを可能とするＥ３またはＥ３ｂ抗体の能力を少なくとも部分的に阻害し得る。   In another embodiment, the protein neutralizes the activity of the Tiel protein. For example, the protein can act on the Tie protein, at least partially inhibiting the ability of the E3 or E3b antibody. In one embodiment, the protein is an E3 or E3b antibody ability that allows IL-3 dependent cells expressing chimeric receptors such as Tie1 extracellular domain and EpoR intracellular domain to survive in the absence of IL-3. May be at least partially inhibited.

一実施形態において、タンパク質のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｂ２またはＤ１１の各免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、同一であるアミノ酸配列を含む。   In one embodiment, the HC and LC immunoglobulin variable domain sequences of the protein are at least 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92% of the amino acid sequence of each B2 or D11 immunoglobulin variable domain Contains amino acid sequences that are 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical.

一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、Ｂ２、Ｄ１１、Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３およびＰ−Ｃ６からなる群から選択される抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、あるいはＣＤＲ領域において各抗体のＣＤＲ領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、同一である免疫グロブリンドメインを含む。例えば、このタンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和力ＫＤで結合する。 In one embodiment, the Tie1 binding protein is in the HC and LC immunoglobulin variable domains or CDR regions of an antibody selected from the group consisting of B2, D11, A2, A10, P-B1, P-B3 and P-C6. CDR regions of each antibody and at least 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%, Contains immunoglobulin domains that are identical. For example, the protein binds with 10 -8 M, 5 · 10 -9 M, 10 -9 M, 10 -10 M, 10 -11 M or 10 -12 M less affinity K D.

一実施形態において、タンパク質は、天然のＴｉｅ１結合タンパク質の能力がＴｉｅタンパク質と相互作用することを少なくとも部分的に阻害し得る。   In one embodiment, the protein may at least partially inhibit the ability of the native Tie1-binding protein to interact with the Tie protein.

タンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、例えば、蛍光励起細胞分離により検出されるように、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合するが、血小板には実質的に結合しない抗体（例えば、単離された抗体）により特徴付けられる。例えば、抗体は、活性化血小板および／または静止血小板には実質的に結合しない。一実施形態において、抗体は内皮細胞に結合する。一実施形態において、タンパク質はモノクローナル抗体である。この抗体は、他の特性を有する他のＴｉｅ１結合抗体を含まない（例えば、血小板と結合するＴｉｅ１結合抗体を含まない）調製物中に提供し得る。この抗体は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   In another aspect, the invention is characterized by an antibody (eg, an isolated antibody) that binds to the Tie1 ectodomain but does not substantially bind to platelets, as detected, for example, by fluorescence-excited cell separation. Attached. For example, the antibody does not substantially bind to activated and / or resting platelets. In one embodiment, the antibody binds to endothelial cells. In one embodiment, the protein is a monoclonal antibody. The antibody may be provided in a preparation that does not include other Tie1-binding antibodies with other properties (eg, does not include Tie1-binding antibodies that bind to platelets). The antibody can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、非刺激状態の内因性Ｔｉｅ１タンパク質と比較して、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体により安定化した立体配座のＴｉｅ１タンパク質に優先的に結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１に独立して結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。   In another aspect, the invention provides a protein (eg, isolated) that binds preferentially to a conformational Tie1 protein stabilized by an E3 or E3b antibody as compared to an unstimulated endogenous Tie1 protein. Protein). In one embodiment, the protein comprises immunoglobulin HC and LC domains. In another embodiment, the protein comprises a peptide that binds independently to Tie1 (eg, a peptide of less than 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, or 14 amino acids in length). For example, the peptide can contain one, two or three disulfide bonds. The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、単量体Ｔｉｅ１タンパク質に比較して、二量体立体配座のＴｉｅ１タンパク質に優先的に結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してＴｉｅ１に結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   In another aspect, the invention is characterized by a protein (eg, an isolated protein) that preferentially binds to a dimeric conformation Tie1 protein as compared to a monomeric Tie1 protein. In one embodiment, the protein comprises immunoglobulin HC and LC domains. In another embodiment, the protein comprises a peptide that independently binds to Tiel (eg, a peptide of less than 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, or 14 amino acids in length). For example, the peptide can contain one, two or three disulfide bonds. The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、ＡｎｇまたはＴｉｅ１との相互作用に偏する立体配座のＴｉｅ２タンパク質に優先的に結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してＴｉｅ２に結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。本発明はまた、これらの特性のうちの１つ以上を有する核酸アプタマーにより特徴付けられる。   In another aspect, the invention is characterized by proteins (eg, isolated proteins) that preferentially bind to a conformational Tie2 protein that is biased towards interaction with Ang or Tie1. In one embodiment, the protein comprises immunoglobulin HC and LC domains. In another embodiment, the protein comprises a peptide that independently binds to Tie2 (eg, a peptide of less than 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, or 14 amino acids in length). For example, the peptide can contain one, two or three disulfide bonds. The protein can include other features described herein. The invention is also characterized by nucleic acid aptamers that have one or more of these properties.

別の実施形態において、本発明はＡｎｇタンパク質に優先的に結合し、そしてＴｉｅ１およびＴｉｅ２との相互作用を調節（例えば阻害）するタンパク質（例えば単離されたタンパク質）を特徴とする。一実施形態において、タンパク質は免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを包含する。別の実施形態において、タンパク質はＡｎｇに独立して結合するペプチド（例えば３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸より短い長さのもの）を包含する。例えばペプチドはジスルフィド結合１、２または３つを含むことができる。タンパク質は本明細書に記載した他の特徴を包含できる。本発明は又これ等の特性の１つ以上を有する核酸アプタマーを包含する。   In another embodiment, the invention features a protein (eg, an isolated protein) that preferentially binds Ang protein and modulates (eg, inhibits) interaction with Tie1 and Tie2. In one embodiment, the protein includes immunoglobulin HC and LC domains. In another embodiment, the protein includes peptides that bind independently to Ang (eg, shorter than 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, or 14 amino acids). For example, the peptide can contain one, two or three disulfide bonds. The protein can include other features described herein. The invention also encompasses nucleic acid aptamers that have one or more of these properties.

別の局面において、本発明は、２×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴｉｅ１外部ドメインのエピトープに結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。このエピトープは、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４もしくは本明細書中に記載される別の抗体が結合したエピトープ、または少なくとも一つ、二つもしくは三つの共通する残基を含むエピトープとオーバーラップするか、またはその一部であるか、またはそれを含む。例えば、このタンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和力ＫＤで結合する。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してＴｉｅ１に結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。本発明はまた、これらの特性のうちの１つ以上を有する核酸アプタマーにより特徴付けられる。 In another aspect, the present invention is characterized by proteins that bind to an epitope of the Tie1 ectodomain at 2 × 10 -7 M of less than K D (e.g., an isolated protein). This epitope is E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or as described herein Overlaps with, is part of, or includes an epitope bound by another antibody to be bound, or an epitope comprising at least one, two or three common residues. For example, the protein binds with 10 -8 M, 5 · 10 -9 M, 10 -9 M, 10 -10 M, 10 -11 M or 10 -12 M less affinity K D. In one embodiment, the protein comprises immunoglobulin HC and LC domains. In another embodiment, the protein comprises a peptide that independently binds to Tiel (eg, a peptide of less than 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, or 14 amino acids in length). For example, the peptide can contain one, two or three disulfide bonds. The protein can include other features described herein. The invention is also characterized by nucleic acid aptamers that have one or more of these properties.

別の局面において、本発明は、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＴｉｅ１外部ドメインへの結合を競合的に阻害するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してＴｉｅ１に結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   In another aspect, the present invention relates to E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3. , S-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or book Characterized by a protein (eg, an isolated protein) that competitively inhibits the binding of another antibody described herein to the Tie1 ectodomain. In one embodiment, the protein comprises immunoglobulin HC and LC domains. In another embodiment, the protein comprises a peptide that independently binds to Tiel (eg, a peptide of less than 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, or 14 amino acids in length). For example, the peptide can contain one, two or three disulfide bonds. The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつＴｉｅ１外部ドメインの活性を中和するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１は：Ｑ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ（配列番号１５１）またはＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ａ（配列番号１５２）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて脂肪族、例えばイソロイシンもしくはバリンである）を含む。   In another aspect, the invention is characterized by a protein (eg, an isolated protein) comprising a heavy chain immunoglobulin variable domain sequence and a light chain immunoglobulin variable domain sequence and neutralizing the activity of a Tie1 ectodomain. It is done. In one embodiment, the CDR1 of the light chain variable domain sequence is: QSXSSS (SEQ ID NO: 151) or RASSSQSSXSYYLA (SEQ ID NO: 152) wherein X is any amino acid or optionally aliphatic, such as isoleucine or valine.

一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ２は：Ａ−Ｓ−Ｘ１−Ｒ−Ｘ２−Ｔ（配列番号１５３）またはＤ−Ａ−Ｓ−Ｘ１−Ｒ−Ｘ２−Ｔ（配列番号１５４）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて親水性アミノ酸、例えばセリンもしくはアスパラギンであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて脂肪族もしくは小さい脂肪族、例えばアラニンもしくはバリンである）を含む。一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ３は；Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２−Ｗ−Ｐ−Ｒ（配列番号１５５）またはＸ１−Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２−Ｗ−Ｐ−Ｒ−Ｔ（配列番号１５６）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてロイシンもしくはグルタミンであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてリジンもしくはセリンである）を含む。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１への結合に関してＢ２および／またはＤ１１抗体と競合するか、あるいはＢ２および／またはＤ１１のＴｉｅ１への結合を競合的に阻害する。 In one embodiment, the CDR2 of the light chain variable domain sequence: A-S-X 1 -R -X 2 -T ( SEQ ID NO: 153) or D-A-S-X 1 -R-X 2 -T ( SEQ No. 154) wherein X 1 is any amino acid or optionally a hydrophilic amino acid such as serine or asparagine and X 2 is any amino acid or optionally aliphatic Or a small aliphatic, such as alanine or valine). In one embodiment, the CDR3 of the light chain variable domain sequence; Q-R-S-X 2 -W-P-R ( SEQ ID NO: 155) or X 1 -Q-R-S- X 2 -W-P- RT (SEQ ID NO: 156) (wherein X 1 is any amino acid, or optionally leucine or glutamine, X 2 is any amino acid, or optionally lysine or Is serine). In one embodiment, the protein competes with B2 and / or D11 antibodies for binding to Tie1, or competitively inhibits binding of B2 and / or D11 to Tie1.

一実施形態において、タンパク質は、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体により刺激されるＴｉｅ１活性を中和する。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１の二量体化を阻害する。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   In one embodiment, the protein neutralizes Tie1 activity stimulated by E3 or E3b antibodies. In one embodiment, the protein inhibits dimerization of Tie1. The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質であって、該タンパク質がＴｉｅ１外部ドメインに結合し、かつヒトまたは非マウス定常ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常ドメイン）を含む単離された単一特異性タンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   In another aspect, the invention provides a protein comprising a heavy chain immunoglobulin variable domain sequence and a light chain immunoglobulin variable domain sequence, wherein the protein binds to a Tie1 ectodomain and a human or non-mouse constant domain (eg, , Human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant domains). The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合する単離されたヒト抗体により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   In another aspect, the invention is characterized by an isolated human antibody that binds to the Tie1 ectodomain. The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ起源が非ヒトであって５個、４個、３個もしくは２個未満のペプチド（長さが６〜９アミノ酸のペプチド）または潜在的なヒトＴ細胞エピトープである５個、４個、３個または２個未満のペプチドを含む単離された抗体（例えば、単離された抗体）により特徴付けられる。一実施形態において、抗体は、起源が非ヒトであるか、または潜在的なヒトＴ細胞エピトープであるペプチド（長さが６〜９アミノ酸のもの）は含まない。   In another aspect, the invention relates to a peptide that binds to the Tie1 ectodomain and is of non-human origin and less than 5, 4, 3, or 2 (a peptide having a length of 6-9 amino acids) or Characterized by an isolated antibody (eg, an isolated antibody) comprising less than 5, 4, 3, or 2 peptides that are potential human T cell epitopes. In one embodiment, the antibody does not include peptides (of 6-9 amino acids in length) that are non-human in origin or are potential human T cell epitopes.

一実施形態において、抗体は、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を含む方法により得られる。例えば、この抗体は、脱免疫化される（例えば、完全に脱免疫化される）。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   In one embodiment, the antibody is obtained by a method comprising deimmunization. For example, the antibody is deimmunized (eg, fully deimmunized). The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ改変Ｆｃドメイン（例えば、改変ヒトＦｃドメイン）を含む単離された抗体により特徴付けられる。例えば、抗体は、例えばＦｃ機能を変える改変を含み得る。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を、一つ以上の残基、例えば米国特許第５，６４８，２６０号中の番号によると、例えば残基２３４と２３７のうちの一つ以上において変異させ得る。他の例示的な改変は、米国特許第５，６４８，２６０号に記載される改変を含む。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。   In another aspect, the invention is characterized by an isolated antibody that binds to the Tie1 ectodomain and includes a modified Fc domain (eg, a modified human Fc domain). For example, the antibody can include modifications that alter, for example, Fc function. For example, the human IgG1 constant region can be mutated at one or more residues, eg, one or more of residues 234 and 237, eg, according to numbers in US Pat. No. 5,648,260. Other exemplary modifications include those described in US Pat. No. 5,648,260. The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和力ＫＤでＴｉｅ１レセプターに結合する単離されたタンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。 In another aspect, the invention provides an affinity K D of less than 10 −7 M, 10 −8 M, 5 · 10 −9 M, 10 −9 M, 10 −10 M, 10 −11 M or 10 −12 M. Characterized by an isolated protein that binds to the Tiel receptor. The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質であって、該タンパク質がＴｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ例えば、非霊長類ＣＤＲ（例えば、非マウスまたは非ウサギＣＤＲ）または合成ＣＤＲである少なくとも一つ以上のＣＤＲを含む、単離されたタンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。   In another aspect, the invention provides a protein comprising a heavy chain immunoglobulin variable domain sequence and a light chain immunoglobulin variable domain sequence, wherein the protein binds to a Tie1 ectodomain and, for example, a non-primate CDR (eg, , Non-mouse or non-rabbit CDR) or a synthetic CDR, characterized by an isolated protein comprising at least one CDR. The protein can include other features described herein.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンＨＣ可変ドメインを包含するポリペプチドをコードするコーディング配列を包含する単離された核酸を特徴とする。核酸またはポリペプチドは本明細書に記載した他の特徴１つ以上を包含できる。核酸は改変されたコドン１つ以上を包含できる。一実施形態において、核酸は配列番号７２５および／または７２６を包含する。また、特徴となるのは、配列番号７２５および／または７２６を包含する哺乳類発現ベクターである。   In another aspect, the invention features an isolated nucleic acid that includes a coding sequence that encodes a polypeptide that includes an immunoglobulin HC variable domain of an antigen binding protein that binds to Tiel. The nucleic acid or polypeptide can include one or more of the other features described herein. The nucleic acid can include one or more modified codons. In one embodiment, the nucleic acid includes SEQ ID NO: 725 and / or 726. Also featured is a mammalian expression vector comprising SEQ ID NO: 725 and / or 726.

一実施形態において核酸は更に免疫グロブリンＨＣ可変ドメイン、例えば本明細書に記載したＨＣドメインを包含するポリペプチドをコードする第２のコーディング配列を包含する。一実施形態において、核酸は更にコーディング配列に作動可能に連結したプロモーターを包含する。   In one embodiment, the nucleic acid further includes a second coding sequence that encodes a polypeptide that includes an immunoglobulin HC variable domain, eg, an HC domain described herein. In one embodiment, the nucleic acid further includes a promoter operably linked to the coding sequence.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンＨＣまたはＬＣ可変ドメインを集合的に包含するポリペプチド鎖１つ以上をコードするコーディング配列１つ以上を包含する核酸を特徴とする。一実施形態において、可変ドメイン少なくとも１つをコードする核酸セグメントは例えばストリンジェントな条件下（例えば高ストリンジェンシー条件下）で本明細書に記載した核酸にハイブリダイズし、例えば可変ドメインをコードする領域にハイブリダイズし、そして、そのような領域に長さの少なくとも８０、８５、９０、９５または９８％である。核酸は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。   In another aspect, the invention features a nucleic acid that includes one or more coding sequences that encode one or more polypeptide chains that collectively include immunoglobulin HC or LC variable domains of an antigen binding protein that binds to Tie1. To do. In one embodiment, a nucleic acid segment encoding at least one variable domain hybridizes to a nucleic acid described herein, eg, under stringent conditions (eg, under high stringency conditions), eg, a region encoding a variable domain And is at least 80, 85, 90, 95 or 98% of the length in such a region. The nucleic acid can include other features described herein.

別の局面において、本発明は抗原結合タンパク質のＨＣ可変ドメインを包含するポリペプチドをコードする第１の核酸配列および抗原結合タンパク質のＬＣ可変ドメインを包含するポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含有する宿主細胞を特徴とし、ここで抗原結合タンパク質は２×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、ＨＣまたはＬＣ可変ドメインはヒトＣＤＲ少なくとも１つを包含する。抗原結合タンパク質は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。 In another aspect, the invention provides a first nucleic acid sequence encoding a polypeptide that includes an HC variable domain of an antigen binding protein and a second nucleic acid sequence that encodes a polypeptide that includes an LC variable domain of the antigen binding protein. features a host cell containing, where the antigen binding protein binds to Tie1 at 2 × 10 -7 M of less than K D. In one embodiment, the HC or LC variable domain includes at least one human CDR. Antigen binding proteins can include other features described herein.

別の局面において、本発明はＨＣ可変領域を包含するポリペプチドをコードする第１の核酸およびＬＣ可変領域を包含するポリペプチドをコードする第２の核酸を含有する宿主細胞を特徴とし、ここでＨＣおよびＬＣの可変領域は各々、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０およびｓ−Ｈ４よりなる群から選択されるクローンのＨＣおよびＬＣ可変ドメインの対応するアミノ酸配列に少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一のものを包含する。抗原結合タンパク質は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。   In another aspect, the invention features a host cell containing a first nucleic acid encoding a polypeptide that includes an HC variable region and a second nucleic acid that encodes a polypeptide that includes an LC variable region, wherein The variable regions of HC and LC are E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, respectively. , S-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10 and s-H4. Includes at least 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 or 100% identical to the corresponding amino acid sequence of the HC and LC variable domains of a clone selected from the group. Antigen binding proteins can include other features described herein.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１と相互作用する本明細書に記載したタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを包含する薬学的組成物を特徴とする。   In another aspect, the invention features a pharmaceutical composition that includes a protein described herein that interacts with Tie1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１と相互作用する本明細書に記載したタンパク質を包含する治療用組成物を特徴とし、ここで組成物は滅菌され、被験体への投与のために適している。   In another aspect, the invention features a therapeutic composition that includes a protein described herein that interacts with Tie1, wherein the composition is sterilized and suitable for administration to a subject. .

別の局面において、本発明はＴｉｅ１細胞外ドメインを包含するキメラレセプターおよびシグナルを発生できる非相同の細胞内配列を発現するシグナル依存性またはシグナル応答性の細胞を準備すること；細胞に候補化合物を接触させること；およびシグナルに依存している細胞の特性を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、細胞内配列はＥｐｏＲタンパク質の細胞内配列の少なくとも領域を包含する。方法は例えば候補化合物または複数の化合物の活性を評価するために使用できる。   In another aspect, the present invention provides a signal-dependent or signal-responsive cell expressing a chimeric receptor comprising a Tie1 extracellular domain and a heterologous intracellular sequence capable of generating a signal; Characterized in that it comprises contacting; and assessing the characteristics of the cells that are dependent on the signal. In one embodiment, the intracellular sequence includes at least a region of the intracellular sequence of the EpoR protein. The method can be used, for example, to assess the activity of a candidate compound or compounds.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１細胞外ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメインを包含するキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存細胞を提供すること；ＩＬ−３の濃度が細胞の生存性を持続させるために十分ではない条件下で細胞に候補化合物を接触させること；および細胞の特性を評価することを包含する方法を特徴とする。方法は例えば候補化合物または複数の化合物の活性を評価するために使用できる。一実施形態において、特性は生存性である。一実施形態において評価することはＭＴＴ試験を包含する。一実施形態において、方法は更に被験体に候補化合物を投与することを包含する。例えば、候補化合物は、タンパク質、例えば免疫グロブリン可変ドメインを包含するタンパク質を包含する。   In another aspect, the present invention provides IL-3-dependent cells that express a chimeric receptor comprising a Tie1 extracellular domain and an EpoR intracellular domain; for the concentration of IL-3 to sustain cell viability Features a method that includes contacting a candidate compound with a cell under conditions that are not sufficient; and evaluating the properties of the cell. The method can be used, for example, to assess the activity of a candidate compound or compounds. In one embodiment, the property is viability. Assessing in one embodiment includes an MTT test. In one embodiment, the method further comprises administering the candidate compound to the subject. For example, candidate compounds include proteins, eg, proteins that include immunoglobulin variable domains.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１活性を調節する化合物を発見する方法を特徴とする。方法は、化合物候補複数を準備すること；および本明細書に記載した方法を用いて複数の化合物の各々を評価することを包含する。   In another aspect, the invention features a method of discovering a compound that modulates Tie1 activity. The method includes providing a plurality of compound candidates; and evaluating each of the plurality of compounds using the methods described herein.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する培養細胞を特徴とする。一実施形態において、細胞内配列はＥｐｏＲ細胞内ドメインの領域を包含する。一実施形態において、細胞は生存性のためにはＩＬ−３またはＴｉｅ１を必要とする。例えば、細胞はキメラ膜貫通タンパク質の非存在下ではＩＬ−３依存性であるが、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体の存在下およびＩＬ−３の非存在下では生存性である。   In another aspect, the invention features a cultured cell that expresses a chimeric transmembrane protein that includes a region of the Tie1 extracellular domain and a heterologous intracellular sequence. In one embodiment, the intracellular sequence includes a region of the EpoR intracellular domain. In one embodiment, the cells require IL-3 or Tiel for viability. For example, cells are IL-3 dependent in the absence of chimeric transmembrane proteins, but are viable in the presence of E3 or E3b antibodies and in the absence of IL-3.

別の局面において、本発明は単離された哺乳類細胞（例えばＴｉｅ１細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する細胞）およびＴｉｅ１結合タンパク質を包含する調製品を特徴とし、ここでＴｉｅ１結合タンパク質は細胞の生存正の維持のために必要である。   In another aspect, the invention provides an isolated mammalian cell (eg, a cell that expresses a chimeric transmembrane protein that includes a region of the Tie1 extracellular domain and a heterologous intracellular sequence) and a Tie1 binding protein. Where the Tiel binding protein is required for the maintenance of cell viability.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１結合タンパク質およびＴｉｅ１細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する培養細胞を包含するキットを特徴とする。   In another aspect, the invention features a kit that includes cultured cells that express a chimeric transmembrane protein that includes a region of Tie1 binding protein and a Tie1 extracellular domain and a heterologous intracellular sequence.

別の局面において、本発明は候補化合物を評価する方法を特徴とする。方法は（ｉ）（ａ）Ｔｉｅ１細胞外ドメインおよびキナーゼドメインの領域を包含する不溶性タンパク質および（ｂ）ＡＴＰを含有する細胞または膜の画分；（ｉｉ）キナーゼドメインの活性を改変するリガンド；および（ｉｉｉ）候補化合物を包含する調製品を準備すること；および不溶性タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する。   In another aspect, the invention features a method of evaluating a candidate compound. The method comprises (i) (a) an insoluble protein comprising a region of Tie1 extracellular domain and kinase domain and (b) a fraction of cells or membranes containing ATP; (ii) a ligand that modifies the activity of the kinase domain; and (Iii) providing a preparation comprising the candidate compound; and assessing the state of phosphorylation of the insoluble protein.

別の局面において、本発明は候補化合物を評価する方法を特徴とする。方法は（ｉ）Ｔｉｅ１タンパク質またはＴｉｅ１細胞外ドメインの領域を少なくとも包含する膜貫通タンパク質およびＡＴＰを包含する細胞または膜画分、（ｉｉ）Ｔｉｅ１または膜貫通タンパク質の自己リン酸化を促進するリガンド；および（ｉｉｉ）候補化合物を包含する調製品を準備すること；およびＴｉｅ１タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する。   In another aspect, the invention features a method of evaluating a candidate compound. The method comprises (i) a cell or membrane fraction comprising a transmembrane protein and ATP comprising at least a region of Tie1 protein or Tie1 extracellular domain; (ii) a ligand that promotes autophosphorylation of Tie1 or transmembrane protein; and (Iii) providing a preparation comprising the candidate compound; and assessing the phosphorylation status of the Tie1 protein.

一実施形態において、リガンドは抗体である。一実施形態において、リガンドはＥ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。一実施形態において、方法は更に被験体に候補化合物を投与することを包含する。   In one embodiment, the ligand is an antibody. In one embodiment, the ligand includes a domain that is at least 90% identical to the HC and LC immunoglobulin variable domains or CDR regions of an E3 or E3b antibody. In one embodiment, the method further comprises administering the candidate compound to the subject.

別の局面において、本発明は（ｉ）Ｔｉｅ１細胞外ドメインの領域少なくとも１つを包含する膜貫通タンパク質およびＡＴＰを包含する細胞または膜画分；および（ｉｉ）Ｔｉｅ１または膜貫通タンパク質の自己リン酸化を促進するリガンドを包含する調製品を準備すること；および膜貫通タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する方法を特徴とする。   In another aspect, the present invention provides (i) a transmembrane protein comprising at least one region of the Tie1 extracellular domain and a cell or membrane fraction comprising ATP; and (ii) autophosphorylation of Tie1 or transmembrane protein. Characterized in that the method comprises providing a preparation containing a ligand that promotes; and assessing the state of phosphorylation of a transmembrane protein.

別の局面において、本発明は（ｉ）Ｔｉｅ１の自己リン酸化をアゴナイズすることができ、および／または（ｉｉ）Ｔｉｅ１細胞外ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメインを包含するキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存性細胞をＩＬ−３の濃度が細胞の生存性を持続させるために十分ではない条件下で生存性に維持することができるリガンドに哺乳類細胞を接触させること；および哺乳類細胞を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、細胞は内因性のＴｉｅ１タンパク質を発現する。一実施形態において、細胞は内皮細胞である。一実施形態において、方法は更にリガンド以外の被験化合物に哺乳類細胞を接触させることを包含する。例えばリガンドは抗体である。例えば、リガンドはＥ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。   In another aspect, the invention depends on IL-3 to express (i) autophosphorylation of Tie1 and / or (ii) a chimeric receptor comprising a Tie1 extracellular domain and an EpoR intracellular domain Contacting the mammalian cell with a ligand capable of maintaining the sex cell viable under conditions where the concentration of IL-3 is not sufficient to maintain cell viability; and evaluating the mammalian cell It features a method to do. In one embodiment, the cell expresses endogenous Tie1 protein. In one embodiment, the cell is an endothelial cell. In one embodiment, the method further comprises contacting the mammalian cell with a test compound other than the ligand. For example, the ligand is an antibody. For example, the ligand includes a domain that is at least 90% identical to the HC and LC immunoglobulin variable domains or CDR regions of an E3 or E3b antibody.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１の活性を調節できる薬剤に哺乳類細部またはその画分を接触させること；および哺乳類細胞またはその画分を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は細胞生存時に細胞に接触させ、そして評価は細胞の画分を単離することを包含する。一実施形態において、薬剤はタンパク質、例えば抗体またはペプチドである。一実施形態において、薬剤はＥ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＥ３またはＥ３ｂ抗体のＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はＢ２またはＤ１１抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＢ２またはＤ１１抗体のＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はＡ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３またはＰ−Ｃ６抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＡ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３またはＰ−Ｃ６抗体のＣＤＲ領域に少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はＧ２またはＣ７抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＧ２またはＣ７抗体のＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。薬剤は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。   In another aspect, the invention features a method that includes contacting a mammalian detail or fraction thereof with an agent capable of modulating Tie1 activity; and evaluating a mammalian cell or fraction thereof. In one embodiment, the agent is contacted with the cell during cell survival, and the assessment includes isolating a fraction of the cell. In one embodiment, the agent is a protein, such as an antibody or peptide. In one embodiment, the agent includes a domain that is at least 90% identical to the HC and LC immunoglobulin variable domains of an E3 or E3b antibody or the CDR regions of an E3 or E3b antibody. In one embodiment, the agent includes a HC and LC immunoglobulin variable domain of a B2 or D11 antibody or a domain that is at least 90% identical to a CDR region of a B2 or D11 antibody. In one embodiment, the agent is an HC and LC immunoglobulin variable domain of an A2, A10, P-B1, P-B3 or P-C6 antibody or a CDR of an A2, A10, P-B1, P-B3 or P-C6 antibody. Includes domains that are at least 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% identical in the region. In one embodiment, the agent includes a HC and LC immunoglobulin variable domain of a G2 or C7 antibody or a domain that is at least 90% identical to a CDR region of a G2 or C7 antibody. The agent can include other features described herein.

別の局面において、本発明は被験化合物を評価する方法を特徴とする。方法は被験化合物存在下のＴｉｅ１の活性を調節する薬剤とＴｉｅ１細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質との間の相互作用を評価することを包含する。一実施形態において、薬剤、被験化合物は、８０００、７０００、６０００、５０００または３０００ダルトン未満の分子量を有する小型有機化合物である。例えば評価は、被験化合物の存在下、薬剤にＴｉｅ１細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質を包含する細胞を接触させることを包含する。別の例においては、評価はＴｉｅ１細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質、薬剤および被験化合物を包含する無細胞調製品を形成することを包含する。   In another aspect, the invention features a method of evaluating a test compound. The method includes evaluating an interaction between an agent that modulates the activity of Tie1 in the presence of a test compound and a protein that includes at least a region of the Tie1 extracellular domain. In one embodiment, the drug, test compound is a small organic compound having a molecular weight of less than 8000, 7000, 6000, 5000 or 3000 Daltons. For example, evaluation involves contacting a cell comprising a protein comprising at least a region of the Tie1 extracellular domain with an agent in the presence of a test compound. In another example, the evaluation includes forming a cell-free preparation that includes a protein, agent, and test compound that includes at least a region of the Tie1 extracellular domain.

別の局面において、本発明は（ｉ）Ｔｉｅ１細胞外ドメインを包含するタンパク質、および（ｉｉ）Ｔｉｅ１の活性を調節（例えばアゴナイズまたは拮抗）できるＴｉｅ１結合タンパク質を包含する人工タンパク質複合体を特徴とする。一実施形態において、リガンドは抗体（例えば本明細書に記載した抗体）である。例えば、リガンドはＥ３、Ｅ３ｂ、Ｂ２、Ｄ１１、Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３、Ｐ−Ｃ６、Ｇ２およびＣ７よりなる群から選択される抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたは対応する抗体のＣＤＲ領域にＣＤＲ領域において少なくとも９０％同一である免疫グロブリンドメインを包含する。一実施形態において、複合体は哺乳類細胞の膜画分中、および／または、被験体中に存在する。   In another aspect, the invention features an artificial protein complex that includes (i) a protein that includes a Tie1 extracellular domain, and (ii) a Tie1 binding protein that can modulate (eg, agonize or antagonize) the activity of Tie1. . In one embodiment, the ligand is an antibody (eg, an antibody described herein). For example, the ligand is an HC and LC immunoglobulin variable domain of an antibody selected from the group consisting of E3, E3b, B2, D11, A2, A10, P-B1, P-B3, P-C6, G2 and C7 or corresponding Includes an immunoglobulin domain that is at least 90% identical in the CDR region to the CDR region of the antibody. In one embodiment, the complex is present in the membrane fraction of mammalian cells and / or in the subject.

別の局面において、本発明はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇと相互作用するタンパク質（例えば本明細書に記載したタンパク質）を包含する組成物を、被験体における新脈管形成を低減するため、または、他の態様において被験体における障害を治療または防止するために有効な量で被験体に投与することを包含する方法を特徴とする。例えばタンパク質は１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤでＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する。 In another aspect, the invention provides a composition comprising a protein that interacts with Tie1, Tie2, or Ang (eg, a protein described herein) to reduce angiogenesis in a subject, or otherwise In some embodiments, the method comprises administering to the subject in an amount effective to treat or prevent a disorder in the subject. For example protein binds to Tie1, Tie2, or Ang at 10 -8 M, 5 · 10 -9 M, 10 -9 M, 10 -10 M, 10 -11 M or less than 10 -12 M affinity K D.

一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１結合タンパク質である。タンパク質は少なくとも２つの結合価を有し、その各々がＴｉｅ１に結合する。例えば結合価の少なくとも１、２または全てがＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する結合部位であることができる。一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合するか、またはＴｉｅ１上のＥ３により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合する。   In one embodiment, the protein is a Tiel binding protein. The protein has at least two valencies, each of which binds to Tie1. For example, at least 1, 2 or all of the valencies can be binding sites that compete with E3 for binding to Tie1. In one embodiment, the protein binds to an epitope that competes with E3 for binding to Tie1 or overlaps with an epitope bound by E3 on Tie1.

一実施形態において、タンパク質は重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。タンパク質は更に、以下の特性、即ち、（１）Ｅ３抗体のＣＤＲ少なくとも１つを含む可変ドメイン配列少なくとも１つ；（２）Ｅ３抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含む可変ドメイン配列少なくとも１つ；（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であること；および（４）タンパク質がＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合すること、の１つ以上を包含する。   In one embodiment, the protein comprises a heavy chain immunoglobulin variable domain sequence and a light chain immunoglobulin variable domain sequence. The protein further has the following properties: (1) at least one variable domain sequence comprising at least one CDR of the E3 antibody; (2) a total of at least 85% identical to the CDR of the corresponding variable domain of the E3 antibody At least one variable domain sequence comprising a CDR sequence; (3) at least one of the variable domains is at least 85% identical to the corresponding immunoglobulin variable domain of the E3 antibody; and (4) the protein is E3 for binding to Tie1. Binding to an epitope that competes with or overlaps with the epitope bound by E3 on Tie1.

一実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン配列のＣＤＲの１つ以上はヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば非マウスまたは非ラット）または合成の型である。一実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン配列のフレームワーク領域の１つ以上はヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば非マウスまたは非ラット）型である。   In one embodiment, one or more of the CDRs of the heavy and / or light chain variable domain sequences are human, primate, non-rodent (eg, non-mouse or non-rat) or synthetic. In one embodiment, one or more of the framework regions of the heavy and / or light chain variable domain sequences are human, primate or non-rodent (eg, non-mouse or non-rat) types.

一実施形態において、重鎖は、以下の特性のうちの一つ以上を有する。   In one embodiment, the heavy chain has one or more of the following properties.

ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ１：
（ＡＧＳＲ）−Ｙ−（ＧＶＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＦ）（配列番号１１７）、
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ２：
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１２１）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）、
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）；または
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＰＳ）−Ｔ−（ＹＶＨ）−Ｙ−Ａ−Ｄ（配列番号７０４）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）；
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ３：
Ｖ−（４または５残基）−Ｆ−Ｄ−（Ｉ／Ｙ）（配列番号１２４）、
Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２５）、
（ＧＶ）−Ｎ−Ｙ−Ｙ−（ＧＹＤ）−Ｓ−（ＳＤ）−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２６）、
（ＧＶＤ）−（ＡＧＬＮ）−（ＬＹＲ）−（ＧＳＴＬＹＨ）−（ＧＹＤ）−（ＡＧＳＹＦＰ）−（ＳＦＤ）−（ＡＧＹＤ）−（ＩＹ）−（ＧＦＤ）−（ＹＤＰ）−（ＩＰ）−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２７）、
ＶＮＹＹＤＳＳＧＹＧＰＩＡＰＧＬＤＹ（配列番号１２８）または
Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−（ＡＹ）−Ｆ−Ｄ−（ＹＩ）（配列番号７０５）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）。 i) HC CDR1 comprising an amino acid sequence as follows:
(AGSR) -Y- (GVK) -M- (GSVF) (SEQ ID NO: 117),
(AGSIMHRH) -Y- (GVMK) -M- (GSVMMFH) (SEQ ID NO: 118) or (AGSIMRNH) -Y- (AGTVMKPQ) -M- (AGSTMVMYWFKH) (SEQ ID NO: 119);
ii) HC CDR2 comprising an amino acid sequence as follows:
X-I-Y-P-S-G-G-G-X-T-X-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 120) (wherein X is any amino acid) ,
(GSV) -I- (SY) -PSG-G- (WQ) -T- (GY) (SEQ ID NO: 121),
(GSV) -I- (SY) -PSG-G- (WQ) -T- (GY) -Y-A-D-S-VK-G (SEQ ID NO: 122),
(GSVW) -I- (SY) -PSG-G- (AGVMYWPQH) -T- (AGSTLVMYFKH) (SEQ ID NO: 123); or XI-Y-P-S-GG- (WPS) ) -T- (YVH) -Y-A-D (SEQ ID NO: 704) (wherein X is any amino acid);
iii) HC CDR3 comprising an amino acid sequence as follows:
V- (4 or 5 residues) -FD- (I / Y) (SEQ ID NO: 124),
G-Y-G-P-I-A-P-G-L-D-Y (SEQ ID NO: 125),
(GV) -N-Y-Y- (GYD) -S- (SD) -G-Y-G-P-I-A-P-G-L-D-Y (SEQ ID NO: 126),
(GVD)-(AGLN)-(LYR)-(GSTLYH)-(GYD)-(AGSYFP)-(SFD)-(AGYD)-(IY)-(GFD)-(YDP)-(IP) -A- P-G-L-D (SEQ ID NO: 127),
VNYYDSSGYGPIAPGLDY (SEQ ID NO: 128) or G-X-X-G- (AY) -FD- (YI) (SEQ ID NO: 705) (wherein X is any amino acid).

一実施形態において、軽鎖は、以下の特性のうちの一つ以上を含む：
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−Ｘ１−Ｙ−Ｌ−（ＡＮ）（配列番号１２９）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−Ｓ−（ＹＳ）−Ｌ−（ＡＬＮ）（配列番号７０６）、
Ｔ−Ｇ−Ｔ−（ＳＮ）−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｇ−（ＧＳ）−Ｙ（配列番号７０７）、
（ＳＧＱ）−（ＧＳ）−（ＤＳ）−（ＮＳ）−（ＩＬ）−（ＧＲ）−Ｓ−（ＹＫＮ）−（ＹＳ）−（ＶＡ）（配列番号７０８）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｌ（配列番号１３０）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）（配列番号１３１）または
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または不在であり得る）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ２：
Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３３）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３４）、
（ＤＧ）−（ＡＶ）−Ｓ−Ｎ−（ＲＬ）−（ＡＰ）−（ＳＴ）（配列番号７０９）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３５）または
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）；および
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ３：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３７）、
（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３８）、
Ｑ−Ｑ−Ｘ−Ｓ−（ＳＮ）−（ＷＳ）−Ｐ−Ｘ−Ｔ−Ｆ（配列番号７１０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｙ−（ＴＧ）−（ＳＧ）−Ｓ−（ＰＧＳ）−（ＴＮ）−Ｘ−（ＶＴ）（配列番号７１１）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｑ−Ｑ−（ＹＲ）−（ＧＳ）−Ｓ−（ＳＷ）−Ｐ−Ｒ−Ｘ１−Ｔ（配列番号１３９）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または存在しない）、
（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＴＩ）（配列番号１４０）または
（ＬＱ）−（ＬＲＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＡＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＳＶＲＰ）−（ＳＴＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＳＴＩ）（配列番号１４１）。 In one embodiment, the light chain comprises one or more of the following properties:
i) Light chain CDR1 comprising an amino acid sequence as follows:
RASAQSS- (IV) -S- (SR) -X1-YL- (AN) (SEQ ID NO: 129),
R-ASSQSS- (IV) -SS- (YS) -L- (ALN) (SEQ ID NO: 706),
T-G-T- (SN) -SDVG- (GS) -Y (SEQ ID NO: 707),
(SGQ)-(GS)-(DS)-(NS)-(IL)-(GR) -S- (YKN)-(YS)-(VA) (SEQ ID NO: 708),
R-A-S-Q-S-V-S-S-X-L (SEQ ID NO: 130),
R-A-S-Q-S- (IV) -S- (SR)-(SY)-(LY)-(ALN) (SEQ ID NO: 131) or R-A-S- (REQ)-(GSTRN) -(IV)-(GSTIRN)-(STIRH) -X1- (SYWNH)-(LV)-(ASN) (SEQ ID NO: 132), wherein X1 may be serine or absent;
ii) LC CDR2 comprising an amino acid sequence as follows:
X-A-S-X-R-A-T (SEQ ID NO: 133) (wherein X can be any amino acid),
(AGD) -AS- (STN) -RAT (SEQ ID NO: 134),
(DG)-(AV) -SN- (RL)-(AP)-(ST) (SEQ ID NO: 709),
(AGD) -AS- (STN)-(LR)-(AEQ)-(ST) (SEQ ID NO: 135) or (AGTKDEH) -AS- (STN)-(LR)-(AVEQ)-( ST) (SEQ ID NO: 136); and iii) LC CDR3 comprising an amino acid sequence as follows:
QQ- (SYFR)-(GSYN) -S- (STYW)-(RP)-(LWR)-(TIY) -T (SEQ ID NO: 137),
(LQ) -Q- (SYFR)-(GSYN)-(SKN)-(STYW)-(RP)-(LWR)-(TIY) -T (SEQ ID NO: 138),
Q-Q-X-S- (SN)-(WS) -PX-TF (SEQ ID NO: 710) (wherein X is any amino acid),
Y- (TG)-(SG) -S- (PGS)-(TN) -X- (VT) (SEQ ID NO: 711) (wherein X is any amino acid),
QQ- (YR)-(GS) -S- (SW) -PR-X1-T (SEQ ID NO: 139) (wherein X1 is any amino acid or absent),
(LQ)-(LQ)-(SYFRD)-(GSYN)-(STRKN)-(STYWF)-(RP)-(ILMWRH)-(TIY)-(TI) (SEQ ID NO: 140) or (LQ)-( LRQ)-(SYFRD)-(GSYN)-(ASTRKN)-(STYWF)-(SVRP)-(STILMWRH)-(TIY)-(STI) (SEQ ID NO: 141).

一実施形態において、重鎖は以下の特性：
ｉ）下記：
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または、
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）
のアミノ酸配列を包含するＨＣ ＣＤＲ１；
ｉｉ）下記：
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＮＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＮＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）、または、
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）、
のアミノ酸配列を包含するＨＣ ＣＤＲ２；
ｉｉｉ）下記：
ＡＰＲＧＹＳＹＧＹＹＹ（配列番号７１２）
のアミノ酸配列を包含するＨＣ ＣＤＲ３；
の１つ以上を包含する。 In one embodiment, the heavy chain has the following properties:
i) The following:
(AGSIMRH) -Y- (GVMK) -M- (GSVMMFH) (SEQ ID NO: 118) or
(AGSIMRNH) -Y- (AGTVMKPQ) -M- (AGSTMVMYWFKH) (SEQ ID NO: 119)
HC CDR1 comprising the amino acid sequence of
ii) The following:
(GSV) -I- (SY) -PSG-G- (NWQ) -T- (GY) (SEQ ID NO: 160),
(GSV) -I- (SY) -PSG-G- (NWQ) -T- (GY) -YA-DSVVK-G (SEQ ID NO: 122), or
(GSVW) -I- (SY) -PSG-G- (AGVMYWPQH) -T- (AGSTLVMYFKH) (SEQ ID NO: 123),
HC CDR2 comprising the amino acid sequence of
iii) The following:
APRGSYSYGYY (SEQ ID NO: 712)
HC CDR3 comprising the amino acid sequence of
One or more of.

一実施形態において、軽鎖は以下の特性：ｉ）以下：Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）、ただしＸ１はセリンまたは非存在であるもののアミノ酸配列を包含するＬＣＣＤＲ１；ｉｉ）以下：（ＴＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号７１３）または（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）のアミノ酸配列を包含するＬＣＣＤＲ２；およびｉｉｉ）以下：Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＨＷＲ）−（ＴＩＹ）（配列番号７１４）、（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＨＷＲ）−（ＴＩＹ）（配列番号７１５）、または、（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号７１６）のアミノ酸配列を包含するＬＣＣＤＲ３；の１つ以上を包含する。   In one embodiment, the light chain has the following properties: i) the following: R-A-S- (REQ)-(GSTRN)-(IV)-(GSTIRN)-(STIRH) -X1- (SYWNH)-(LV )-(ASN) (SEQ ID NO: 132), wherein XCR is serine or includes an amino acid sequence that is absent; ii) the following: (TAGD) -AS- (STN)-(LR)-(AEQ) )-(ST) (SEQ ID NO: 713) or (AGTKDEH) -AS- (STN)-(LR)-(AVEQ)-(ST) (SEQ ID NO: 136) comprising the amino acid sequence LCCRCR2; and iii) The following: QQ- (SYFR)-(GSYN) -S- (STYW)-(RP)-(LHWR)-(TIY) (SEQ ID NO: 714), (LQ) -Q- (SYFR)-(GSYN) -(SKN)-(STYW)-(RP)-(LHWR)-(TIY) (SEQ ID NO: 715) or (LQ)-(LQ)-(SYFRD)-(GSYN)-(STRKN)-(STYWF) )-(RP)-(ILMWRH)-(TIY) (SEQ ID NO: 716).

一実施形態において、軽鎖は以下の特性のうちの一つ以上を含む：ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ１：Ｓ−Ｘ−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列場号１４２）またはＴ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、ＧまたはＲ）であり、Ｘ２は任意のアミノ酸（例えば、ＹまたはＮ）であり、Ｘ３は任意のアミノ酸（例えば、Ｆ、ＮまたはＫ）であり、Ｘ４は任意のアミノ酸（例えば、脂肪族、例えば、ＶまたはＡ）である）；ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ２：（ＤＥ）−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４４）；（ＤＥ）−（ＶＤ）−（ＳＴＤＮ）−（ＹＲＤＮ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４５）；ｖ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ ＣＤＲ３：（ＳＱ）−Ｓ−（ＳＹ）−（ＡＳＩＤ）−（ＧＳＲ）−（ＳＴ）−（ＳＴＲＮ）−（ＳＴＹＲ）−（ＡＴＬＹ）−（ＳＶＷＱ）（配列番号１４６）。   In one embodiment, the light chain comprises one or more of the following properties: i) LC CDR1: S-X- (ND)-(IV)-(AG) -X1 comprising an amino acid sequence as follows: -X2-X3 (sequence field number 142) or T- (GR)-(ST) -S-X5- (ND)-(IV)-(AG) -X1-X2-X3-Y-X4-S (sequence) No. 143) wherein X1 is any amino acid (eg G or R), X2 is any amino acid (eg Y or N) and X3 is any amino acid (eg F, N or K) And X4 is any amino acid (eg, aliphatic, eg, V or A); iii) LC CDR2 comprising the amino acid sequence as follows: (DE) -V—N—N—R— PS (SEQ ID NO: 144); (DE)-(VD)-(STD N)-(YRDN) -RPS (SEQ ID NO: 145); v) LC CDR3 comprising the amino acid sequence as follows: (SQ) -S- (SY)-(ASID)-(GSR)-( ST)-(STRN)-(STYR)-(ATLY)-(SVWQ) (SEQ ID NO: 146).

一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ２は、以下のとおりのアミノ酸配列を含む：（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４７）または（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４８）。   In one embodiment, HC CDR2 comprises the amino acid sequence as follows: (GSVW) -I- (SY) -P-SG-G- (AGVMYWPQH) -T- (AGSTLVMYFKH) -Y- (AT)- DSVK-G (SEQ ID NO: 147) or (GSV) -I- (SY) -P-SG-G- (WQ) -T- (GY) -Y- (AT) -DS -VKG (SEQ ID NO: 148).

一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列は、少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも３個、４個または５個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１５個、１６個または１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１０個、１２個、１４個、１５個、１６個または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１４個、１５個、１６個または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも７個または８個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ３配列と同一である。   In one embodiment, the HC CDR1 amino acid sequence has a length of at least 5 amino acids, of which at least 3, 4 or 5 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1, p- A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, It is identical to the CDR1 sequence of HC of s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or another antibody described herein. In one embodiment, the HC CDR2 amino acid sequence has a length of at least 15, 16, or 17 amino acids, of which at least 10, 12, 14, 15, 16, or 17 amino acids Clones E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s -H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or as described herein It is identical to the HC CDR2 sequence of another antibody. In one embodiment, the HC CDR2 amino acid sequence has a length of at least 17 amino acids, of which at least 14, 15, 16, or 17 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1 , P-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s Identical to the CDR2 sequence of HC of B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or another antibody described herein . In one embodiment, the HC CDR3 amino acid sequence has a length of at least 7 or 8 amino acids, of which at least 5, 6, 7 or 8 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s- HC CDR3 sequence of B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or another antibody described herein Are the same.

一実施形態において、ＬＣＣＤＲ１アミノ酸配列は少なくとも１０、１１または１２アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９、１０または１１アミノ酸はクローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書に記載した他の抗体のＬＣ ＣＤＲ１配列と同一である。一実施形態において、ＬＣＣＤＲ２アミノ酸配列は少なくとも６または７アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５、６または７アミノ酸はクローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書に記載した他の抗体のＬＣ ＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＬＣＣＤＲ３アミノ酸配列は少なくとも８，９または１０アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９または１０アミノ酸はクローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書に記載した他の抗体のＬＣ ＣＤＲ３配列と同一である。   In one embodiment, the LCCR1 amino acid sequence has a length of at least 10, 11, or 12 amino acids, of which at least 7, 8, 9, 10 or 11 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1, p-A10 , P-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s It is identical to the LC CDR1 sequence of C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or other antibodies described herein. In one embodiment, the LCCR2 amino acid sequence has a length of at least 6 or 7 amino acids, of which at least 5, 6 or 7 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p -B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2 , S-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or other CDR LC2 sequences of other antibodies described herein. In one embodiment, the LCCR3 amino acid sequence has a length of at least 8, 9, or 10 amino acids, of which at least 7, 8, 9 or 10 amino acids are clones E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p -B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10 , S-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or the same as the LC CDR3 sequence of other antibodies described herein.

一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。   In one embodiment, the amino acid sequence of the HC variable domain sequence is clone E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p. -F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10 , S-H4 or the amino acid sequence of the HC variable domain of another antibody described herein and at least 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99 % Or 100% identical.

一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。   In one embodiment, the amino acid sequence of the LC variable domain sequence is clone E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p. -F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10 , S-H4 or the amino acid sequence of the LC variable domain of another antibody described herein and at least 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99 % Or 100% identical.

一実施形態において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０およびｓ−Ｈ４からなる群から選択されるクローンのＨＣおよびＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。   In one embodiment, the amino acid sequences of the HC and LC variable domain sequences are E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s- HC and LC variable domain amino acid sequences of clones selected from the group consisting of G10 and s-H4 and at least 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99 % Or 100% identical.

一実施形態において、ＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインの一つ以上のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４）のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣおよびＬＣ可変ドメインの対応するフレームワーク領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。   In one embodiment, the amino acid sequence of one or more framework regions of the HC and / or LC variable domain (eg, FR1, FR2, FR3, and / or FR4) is clone E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s- Corresponding frames of the HC and LC variable domains of B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4 or another antibody described herein It is at least 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to the work area.

一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列はヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。   In one embodiment, the light chain variable domain sequence is human or non-immunogenic in humans. In one embodiment, the heavy chain variable domain sequence is human or non-immunogenic in humans.

タンパク質は、Ｔｉｅ１を発現する細胞、例えば内皮細胞に結合し得る。一実施形態において、タンパク質は、血小板に実質的に結合しない（例えば検出可能に結合しない）。   The protein may bind to cells that express Tie1, such as endothelial cells. In one embodiment, the protein does not substantially bind to platelets (eg, does not detectably bind).

一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１に特異的に結合し、例えば、別のヒトタンパク質（例えば、Ｉｇ様ドメイン、ＥＧＦ様ドメインまたはフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートを有するＴｉｅ１以外の天然タンパク質であるＴｉｅ２、またはヒト血清アルブミン）と比較して、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、１０３倍または１０４倍、優先的にＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、タンパク質は、本明細書中に記載のＴｉｅ１ドメインに結合する。 In one embodiment, the protein specifically binds to Tie1, eg, another human protein (eg, Tie2, which is a natural protein other than Tie1 having an Ig-like domain, an EGF-like domain, or a fibronectin type III repeat, or human It binds preferentially to Tie1 at least 10 times, 50 times, 100 times, 10 3 times or 10 4 times compared to serum albumin). In one embodiment, the protein binds to the Tie1 domain described herein.

一実施形態において、タンパク質は局所的に送達される。一実施形態において、タンパク質は全身に送達される。   In one embodiment, the protein is delivered locally. In one embodiment, the protein is delivered systemically.

一実施形態において、被験体は、血管形成の低減を必要とするか、またはそのように同定されている。例えば、この被験体は、血管形成関連疾患を有する。別の例において、被験体は、腫瘍性障害、例えば、転移性癌を有する。例えば、この被験体は、血管形成に依存する癌または腫瘍を有する。腫瘍は固形腫瘍、例えば直径が少なくとも１、２、３、５、８または１０ｍｍの腫瘍であることができる。一実施形態において、固形腫瘍は低酸素コアを有する。方法は更に代謝拮抗剤（例えば５−ＦＵとロイコボリン）、イリノテカン（または他のトポイソメラーゼ阻害剤）、ドキソルビシン、ベバシズマブまたはこれ等の薬剤の全てを投与することを包含してよい。方法は拮抗剤投与前に、被験体を評価することおよび被験体における固形腫瘍を検出することを包含できる。   In one embodiment, the subject is in need of or identified as having reduced angiogenesis. For example, the subject has an angiogenesis-related disease. In another example, the subject has a neoplastic disorder, eg, metastatic cancer. For example, the subject has a cancer or tumor that depends on angiogenesis. The tumor can be a solid tumor, for example a tumor having a diameter of at least 1, 2, 3, 5, 8 or 10 mm. In one embodiment, the solid tumor has a hypoxic core. The method may further comprise administering an antimetabolite (eg, 5-FU and leucovorin), irinotecan (or other topoisomerase inhibitor), doxorubicin, bevacizumab or all of these agents. The method can include evaluating the subject and detecting a solid tumor in the subject prior to administration of the antagonist.

別の実施形態においては、被験体は炎症性障害、例えば関節リウマチ、乾癬、リウマチ様またはリウマチ性の炎症性疾患、または他の慢性炎症障害、例えば慢性喘息、動脈または移植後のアテローム性動脈硬化症および子宮内膜症を有する。治療できる他の障害は、脱調節された、または望ましくない新脈管形成、例えば眼の新生血管形成、例えば網膜症（糖尿病性網膜症および加齢関連黄斑変性を包含する）、血管芽腫、血管腫および動脈硬化を包含する。   In another embodiment, the subject has an inflammatory disorder such as rheumatoid arthritis, psoriasis, rheumatoid or rheumatic inflammatory disease, or other chronic inflammatory disorder such as chronic asthma, artery or post-transplant atherosclerosis. And endometriosis. Other disorders that can be treated include deregulated or undesirable angiogenesis, such as ocular neovascularization, such as retinopathy (including diabetic retinopathy and age-related macular degeneration), hemangioblastoma, Includes hemangiomas and arteriosclerosis.

一実施形態において、タンパク質を、以下の活性のうちの一つ以上を低減するのに有効な量で投与する：血管の出芽、***および再造形。一実施形態において、タンパク質を、脈管形成または細管形成を低減させるのに有効な量で投与する。   In one embodiment, the protein is administered in an amount effective to reduce one or more of the following activities: vascular budding, division and remodeling. In one embodiment, the protein is administered in an amount effective to reduce angiogenesis or tubule formation.

一実施形態において、該方法はさらに、投与前に、血管形成の低減を必要とする被験体として被験体を同定する工程を包含する。一実施形態において、この方法はさらに、タンパク質を連続的または別個の丸薬にて投与する工程を包含する。一実施形態において、この方法はさらに、投与期間中の被験体をモニタリングする工程を包含する。例えば、このモニタリングは、被験体の血管を（局所的または全体的に）画像化する工程を包含する。別の例において、このモニタリングは、被験体において、腫瘍の大きさまたは腫瘍の容量を評価する工程を包含する。   In one embodiment, the method further comprises identifying the subject as a subject in need of reduced angiogenesis prior to administration. In one embodiment, the method further comprises administering the protein in sequential or separate pills. In one embodiment, the method further comprises monitoring the subject during the administration period. For example, this monitoring involves imaging (locally or globally) the blood vessels of the subject. In another example, the monitoring includes assessing tumor size or tumor volume in the subject.

別の局面において、本発明は：本明細書中に記載のタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１活性を低下させるタンパク質）を含む組成物を、被験体のＴｉｅ１活性を低下させるのに有効な量で被験体に投与する工程を含む方法により特徴付けられる。この方法は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。   In another aspect, the invention provides: to a subject an amount of a composition comprising a protein described herein (eg, a protein that reduces Tie1 activity) in an amount effective to reduce the subject's Tie1 activity. Characterized by a method comprising the step of administering. This method may include other features described herein.

別の局面において、本発明は：本明細書中に記載のタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１活性を調節し得るタンパク質）を含む組成物を、被験体の内皮細胞の活性を調節するのに有効な量で被験体に投与する工程を包含する方法により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、循環中に送達される。   In another aspect, the invention provides: a composition comprising a protein described herein (eg, a protein capable of modulating Tie1 activity) in an amount effective to modulate the activity of a subject's endothelial cells. Characterized by a method comprising administering to a subject. In one embodiment, the protein is delivered into the circulation.

一実施形態において、組成物は、内皮細胞を治療に対して増感させ、増感させた内皮細胞を阻害、死滅、剥離または抑止する治療を被験体に提供するのに有効である。   In one embodiment, the composition is effective to sensitize endothelial cells to the treatment and provide the subject with a treatment that inhibits, kills, detaches or depletes the sensitized endothelial cells.

別の局面において、本発明は：（ｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下において、サンプル（および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）を、Ｔｉｅ１に結合するタンパク質、例えば本明細書中に記載のタンパク質と接触させる工程；ならびに（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とサンプル（および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）との複合体の形成を検出する工程を含む方法により特徴付けられる。   In another aspect, the present invention provides: (i) binding a sample (and optionally a reference sample, eg, a control sample) to Tie1 under conditions where interaction between the Tie1 binding protein and the Tie1 protein can occur. Contacting the protein, eg, a protein described herein; and (ii) detecting the formation of a complex between the Tiel binding protein and the sample (and optionally a reference sample, eg, a control sample). Characterized by the method of inclusion.

別の局面において、本発明は：（ｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下において、Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を、被験体（および必要に応じて、コントロール被験体）に投与する工程；ならびに（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質と被験体のＴｉｅ１分子との複合体の形成を検出する工程、あるいは被験体中のＴｉｅ１結合タンパク質の分布またはＴｉｅ１結合タンパク質の少なくとも一つの位置を検出する工程を含む方法により特徴付けられる。一実施形態において、Ｔｉｅ１タンパク質は、Ｔｉｅ１の活性を調節しない。Ｔｉｅ１結合タンパク質は、本明細書中に記載のタンパク質であり得る。一実施形態において、リガンドは、活性化Ｔｉｅ１を検出する。   In another aspect, the invention provides: (i) subjecting a Tie1 binding protein (eg, an antibody or antigen binding fragment thereof) to a subject (and optionally) under conditions that allow interaction between the Tie1 binding protein and the Tie1 protein. And (ii) detecting the formation of a complex between the Tie1 binding protein and the subject Tie1 molecule, or the distribution of the Tie1 binding protein in the subject or the Tie1 binding protein. Characterized by a method comprising detecting at least one position of. In one embodiment, the Tie1 protein does not modulate the activity of Tie1. The Tiel binding protein can be a protein described herein. In one embodiment, the ligand detects activated Tie1.

Ｔｉｅ１に結合する抗体は好ましくは単一特異性、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。例えば、この抗体は生細胞上のＴｉｅ１、例えば内因性Ｔｉｅ１分子または異種核酸から発現するＴｉｅ１分子を認識し得る。一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、主要な内皮細胞と相互作用する。用語「単一特異性抗体」は、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語は、単一の分子種として、例えば同種の単離細胞の個体群から生成される抗体をいう「モノクローナル抗体」を含む。「モノクローナル抗体組成物」とは、抗体の単一分子種を含む組成物中の抗体またはそのフラグメントの調製物をいう。一実施形態において、モノクローナル抗体は、哺乳動物細胞により生成される。一種以上のモノクローナル抗体種を組み合わせ得る。   The antibody that binds to Tiel is preferably monospecific, eg, a monoclonal antibody, or an antigen-binding fragment thereof. For example, the antibody can recognize Tie1 on living cells, eg, an endogenous Tie1 molecule or a Tie1 molecule expressed from a heterologous nucleic acid. In one embodiment, the Tiel binding protein interacts with primary endothelial cells. The term “monospecific antibody” refers to an antibody that exhibits a single binding specificity and affinity for a particular target, eg, epitope. The term includes “monoclonal antibodies” which refer to antibodies produced from a population of isolated cells of the same species, for example as a single molecular species. “Monoclonal antibody composition” refers to a preparation of an antibody or fragment thereof in a composition comprising a single molecular species of antibody. In one embodiment, monoclonal antibodies are produced by mammalian cells. One or more monoclonal antibody species can be combined.

Ｔｉｅ１結合抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤおよびＩｇＥ）であり得るか、または抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖフラグメント）のみを含み得る（例えば、Ｆｃドメイン、またはＣＨ２、ＣＨ３もしくはＣＨ４配列を含まない）。この抗体は、二つの重鎖免疫グロブリンおよび二つの軽鎖免疫グロブリンを含み得るか、または単一鎖抗体であり得る。抗体は、必要に応じて、κ、λ、α、γ、δ、εまたはμ定常領域遺伝子から選択される定常領域を含み得る。Ｔｉｅ１結合抗体は、実質的にヒト抗体からの重鎖および軽鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域またはその一部を含み得る。 Tie1-binding antibodies can be full length (eg, IgG (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (eg, IgA1, IgA2), IgD and IgE) or antigen-binding fragments (eg, Fab , F (ab ′) 2 or scFv fragments) (eg, without Fc domains or CH2, CH3 or CH4 sequences). The antibody can comprise two heavy chain immunoglobulins and two light chain immunoglobulins, or can be a single chain antibody. The antibody may optionally comprise a constant region selected from κ, λ, α, γ, δ, ε or μ constant region genes. Tie1-binding antibodies can comprise heavy and light chain constant regions substantially from human antibodies, eg, human IgG1 constant regions or portions thereof.

一実施形態において、抗体（またはそのフラグメント）は、組換え抗体または改変抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化またはインビトロで生成される抗体である。用語「組換え」または「改変」ヒト抗体は、本明細書中で使用される場合、組換え手段により調製、発現、作成または単離されるすべての抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組換え体から単離させた抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入動物（例えば、マウス）から単離させた抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他ＤＮＡ配列へのスプライシングをともなう任意の他の手段により調製、発現、作成もしくは単離された抗体を含むことが意図される。そのような組換え抗体は、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、インビトロで生成される抗体を含み、必要に応じて、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含み得る。   In one embodiment, the antibody (or fragment thereof) is a recombinant or modified antibody, such as a chimeric, humanized, deimmunized or in vitro generated antibody. The term “recombinant” or “modified” human antibody as used herein refers to any antibody prepared, expressed, produced or isolated by recombinant means, eg, recombinant transfected into a host cell. An antibody expressed using an expression vector, an antibody isolated from a recombinant, a combinatorial antibody library, an antibody isolated from a human immunoglobulin transgenic animal (eg, a mouse), or a human immunoglobulin gene sequence It is intended to include antibodies prepared, expressed, generated or isolated by any other means with splicing to other DNA sequences. Such recombinant antibodies include humanized antibodies, CDR-grafted antibodies, chimeric antibodies, deimmunized antibodies, antibodies generated in vitro, and optionally constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. Can be included.

一実施形態において、抗体は、Ｔｉｅ１に結合する公知のモノクローナル抗体（例えば、ＷＯ９５／２６３６４に記載される抗体、例えば３Ｃ４Ｃ７Ｇ６および１０Ｆ１１Ｇ６）が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。別の実施形態において、抗体は、Ｔｉｅ１に結合する公知のモノクローナル抗体、例えば、３Ｃ４Ｃ７Ｇ６および１０Ｆ１１Ｇ６と競合しない。さらに別の実施形態において、抗体は、本明細書中に記載されるリガンド、例えば、Ｅ３抗体と競合しない。   In one embodiment, the antibody binds to a different epitope than the epitope to which known monoclonal antibodies that bind to Tie1 (eg, antibodies described in WO95 / 26364, such as 3C4C7G6 and 10F11G6) bind. In another embodiment, the antibody does not compete with known monoclonal antibodies that bind to Tie1, such as 3C4C7G6 and 10F11G6. In yet another embodiment, the antibody does not compete with a ligand described herein, eg, an E3 antibody.

本明細書中に開示されるタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合するタンパク質）のオーバーラップしているエピトープと結合するか、あるいはこれらのタンパク質の結合を競合的に阻害する抗体または他の因子（例えば、タンパク質または非タンパク質因子）もまた、本発明の範囲内にある。例えば、抗体または他の因子は、単一特異性抗体、例えば、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載される別の抗体のオーバーラップしているエピトープと結合するか、あるいはこの抗体のＴｉｅ１への結合を競合的に阻害するか、またはその逆である（例えば、リガンドの結合を競合的に阻害する単一特異性抗体）。オーバーラップしているエピトープは、少なくとも一つの共通するアミノ酸を含み得る。互いの結合を競合的に阻害する因子は、オーバーラッピングするエピトープに必ずしも結合しない。例えば、それらは立体傷害により、またはＴｉｅ１の立体配座を変えることにより結合を阻害し得る。   Antibodies or other antibodies that bind to overlapping epitopes of the proteins disclosed herein (eg, proteins that bind to Tie1, Tie2, or Ang) or that competitively inhibit the binding of these proteins Factors (eg, protein or non-protein factors) are also within the scope of the invention. For example, the antibody or other factor may be a monospecific antibody such as E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3. , P-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s Binds to an overlapping epitope of G10, s-H4 or another antibody described herein, or competitively inhibits binding of this antibody to Tiel, or vice versa Some (eg, monospecific antibodies that competitively inhibit ligand binding). Overlapping epitopes can include at least one common amino acid. Factors that competitively inhibit each other's binding do not necessarily bind to overlapping epitopes. For example, they can inhibit binding by steric hindrance or by changing the conformation of Tie1.

結合タンパク質の任意の組合せ、例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの異なるドメインに結合する二つ以上の抗体（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの細胞外ドメイン上の二つの異なるエピトープに結合する抗体（例えば、二重特異性抗体））の組み合わせは、本発明の範囲内にある。   Any combination of binding proteins, eg, two or more antibodies that bind to different domains of Tie1, Tie2, or Ang (eg, antibodies that bind to two different epitopes on the extracellular domain of Tie1, Tie2, or Ang (eg, Combinations of bispecific antibodies)) are within the scope of the invention.

一実施形態において、Ｔｉｅ１結合抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも一つの軽鎖もしくは重鎖の免疫グロブリン（または好ましくは、少なくとも一つの軽鎖免疫グロブリンおよび少なくとも一つの重鎖免疫グロブリン）を含む。好ましくは、各免疫グロブリンは、抗Ｔｉｅ１軽鎖もしくは重鎖の可変領域のそれぞれから、すなわち、本明細書中に記載される抗体（例えばＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体）の可変領域から、ＣＤＲに実質的に同一である少なくとも一つ、二つ、好ましくは三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖または重鎖可変領域を含む。   In one embodiment, the Tie1-binding antibody or antigen-binding fragment thereof comprises at least one light or heavy chain immunoglobulin (or preferably at least one light chain immunoglobulin and at least one heavy chain immunoglobulin). Preferably, each immunoglobulin is derived from each of the anti-Tie1 light chain or heavy chain variable regions, ie, the antibodies described herein (eg, E3, E3b, G2, p-A1, p-A10, p -B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10 S-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10, s-H4, or another antibody described herein), at least substantially identical to the CDRs It includes a light chain or heavy chain variable region having one, two, and preferably three, complementarity determining regions (CDRs).

一局面において、本発明はＴｉｅ１リン酸化を増大させることにより内皮細胞活性を低減する薬剤（例えば抗体）を特徴とする。一実施形態において、抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。   In one aspect, the invention features an agent (eg, an antibody) that reduces endothelial cell activity by increasing Tie1 phosphorylation. In one embodiment, the antibody reduces endothelial cell differentiation, such as sprouting, separation and tube formation.

一局面において、本発明はシグナリング経路を活性化することにより内皮細胞活性を低減する薬剤（例えば抗体）を特徴とする。一実施形態において、抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。この薬剤誘導作用はＴｉｅ１の自己会合とは独立しているか、依存していることができる。   In one aspect, the invention features an agent (eg, an antibody) that reduces endothelial cell activity by activating a signaling pathway. In one embodiment, the antibody reduces endothelial cell differentiation, such as sprouting, separation and tube formation. This drug-inducing action can be independent or dependent of Tie1 self-association.

１つの局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質により特徴付けられ、このタンパク質は、Ｔｉｅ１と結合し、外部ドメインおよび重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、以下の特性の１つ以上を含む：ｉ）   In one aspect, the invention is characterized by an isolated protein comprising a heavy chain immunoglobulin variable domain sequence and a light chain immunoglobulin variable domain sequence, wherein the protein binds Tie1 and the ectodomain and heavy chain The immunoglobulin variable domain sequence includes one or more of the following properties: i)

Figure 2008532476
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＨＣ ＣＤＲ１；ｉｉ）
Figure 2008532476
 HC CDR1 comprising an amino acid sequence of a clone from the group consisting of or a sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical to such a sequence; ii)

Figure 2008532476
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＨＣ ＣＤＲ２；ｉｉｉ）
Figure 2008532476
 HC CDR2 comprising an amino acid sequence of a clone from the group consisting of or a sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical to such a sequence; iii)

Figure 2008532476
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＨＣ ＣＤＲ３。
Figure 2008532476
 HC CDR3 comprising an amino acid sequence of a clone from the group consisting of or a sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical to such a sequence.

一実施形態において、タンパク質はまた、１つ以上の以下の特性を含む軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む：ｉ）   In one embodiment, the protein also comprises a light chain immunoglobulin variable domain sequence that includes one or more of the following properties: i)

Figure 2008532476
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＬＣ ＣＤＲ１；ｉｉ）
Figure 2008532476
 LC CDR1 comprising the amino acid sequence of a clone from the group consisting of or a sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical to such a sequence; ii)

Figure 2008532476
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＬＣ ＣＤＲ２；ｉｉｉ）
Figure 2008532476
 LC CDR2 comprising the amino acid sequence of a clone from the group consisting of or a sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical to such a sequence; iii)

Figure 2008532476
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＬＣ ＣＤＲ３。
Figure 2008532476
 LC CDR3 comprising an amino acid sequence of a clone from the group consisting of or a sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical to such a sequence.

一実施形態において、タンパク質は、クローンのＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列   In one embodiment, the protein is an amino acid sequence of a clonal HC variable domain

Figure 2008532476
と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列を含む。
Figure 2008532476
 And the amino acid sequence of the HC variable domain sequence that is at least 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical.

一実施形態において、タンパク質は、クローンのＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列   In one embodiment, the protein is an amino acid sequence of a clonal LC variable domain

Figure 2008532476
と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列を含む。
Figure 2008532476
 And amino acid sequences of LC variable domain sequences that are at least 70%, 75%, 80%, 85%, or 90% identical.

本明細書中に記載の抗体または他の結合タンパク質（例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質、Ｔｉｅ２結合タンパク質またはＡｎｇ結合タンパク質）を、被験体に投与し得、または非誘導体化形態もしくは非結合体化形態でインビトロに用い得る。他の実施形態において、結合タンパク質を、誘導体化、改変し得、あるいは別の機能性分子、例えば別のタンパク質（例えば、Ｆｃドメインの１つ、ＨＳＡなど）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）同位体、細胞または不溶性支持体に結合させ得る。例えば、結合タンパク質は、１つ以上の他の分子的実体、とりわけ例えば、抗体（例えば、タンパク質が二重特異性または多重特異性抗体を形成する抗体である場合）、毒素、放射性同位体、治療（例えば、細胞毒性または細胞静止）因子または部分に機能的に（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合またはそれ以外によって）連結し得る。例えば、結合タンパク質は、放射性イオン（例えば、α−、γ−またはβ−エミッター）、例えばヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、レニウム（１８６Ｒｅ）またはビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）に連結し得る。 An antibody or other binding protein (eg, a Tie1-binding protein, Tie2-binding protein, or Ang-binding protein) described herein can be administered to a subject, or in vitro in an underivatized or unconjugated form Can be used. In other embodiments, the binding protein can be derivatized, modified, or another functional molecule, such as another protein (eg, one of the Fc domains, HSA, etc.), a polymer (eg, PEG) isotope, It can be bound to cells or an insoluble support. For example, a binding protein can include one or more other molecular entities, among others, for example, antibodies (eg, when the protein is an antibody that forms bispecific or multispecific antibodies), toxins, radioisotopes, therapeutics It may be operably linked (eg, by chemical binding, gene fusion, non-covalent association or otherwise) to a factor or moiety (eg, cytotoxic or cytostatic). For example, the binding protein can be a radioactive ion (eg, α-, γ- or β-emitter), such as iodine ( 131 I or 125 I), yttrium ( 90 Y), lutetium ( 177 Lu), actinium ( 225 Ac), It can be linked to rhenium ( 186 Re) or bismuth ( 212 Bi or 213 Bi).

別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメイン、例えば本明細書中に記載の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインを含むポリペプチドをコードするコード配列を含む核酸により特徴付けられる。例えば、核酸として、本明細書中に記載される特定の核酸配列、本明細書中に記載されるアミノ酸配列（例えば、特定の核酸配列）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、同一である核酸、または本明細書中に記載される核酸配列（例えば、特定の核酸配列、例えば   In another aspect, the present invention encodes a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy or light chain variable domain that binds to Tiel, eg, an immunoglobulin heavy or light chain variable domain described herein. Characterized by a nucleic acid comprising a coding sequence. For example, as a nucleic acid, a specific nucleic acid sequence described herein, an amino acid sequence described herein (eg, a specific nucleic acid sequence) and at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, identical nucleic acids, or nucleic acid sequences described herein (eg, specific nucleic acid sequences such as

Figure 2008532476
のうちの１つ以上の可変ドメインをコードする核酸配列）と（例えば、本明細書中に記載される条件下、例えば高緊縮条件下で）特異的にハイブリダイズする核酸、あるいはそのフラグメント（例えば、ＣＤＲをコードするフラグメント）を挙げ得る。
Figure 2008532476
 A nucleic acid that specifically hybridizes (eg, under the conditions described herein, eg, under high stringency conditions), or a fragment thereof (eg, a nucleic acid sequence encoding one or more variable domains) , Fragments encoding CDRs).

本明細書中に記載の核酸は、さらに、コード配列に作動可能に連結させたプロモーターを含み得る。核酸は、第一および第二のコード配列を含み得、例えば、ここで第一のコード配列は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードし、第二のコード配列は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。   The nucleic acids described herein can further include a promoter operably linked to the coding sequence. The nucleic acid can comprise a first and second coding sequence, for example, wherein the first coding sequence encodes a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain variable domain and the second coding sequence comprises an immunoglobulin light chain. It encodes a polypeptide comprising a chain variable domain.

別の局面において、本発明は、重鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第一核酸および軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第二核酸を含む宿主細胞により特徴付けられる。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、結合してＴｉｅ１結合タンパク質を形成し得る。これらの可変領域は、本明細書中に記載される一つ以上の特性（例えば本明細書中に記載される配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性）を有し得る。本発明はまた、Ｔｉｅ１結合抗体を提供する方法を含む。この方法は、本明細書中に記載される宿主細胞を提供する工程；ならびに軽鎖および重鎖の可変領域の集合体が、Ｔｉｅ１と相互作用する抗原結合タンパク質を形成し得る条件下で、宿主細胞中に第一および第二の核酸を発現させる工程を含み得る。   In another aspect, the invention is characterized by a host cell comprising a first nucleic acid encoding a polypeptide comprising a heavy chain variable region and a second nucleic acid encoding a polypeptide comprising a light chain variable region. The heavy chain variable region and the light chain variable region can combine to form a Tiel binding protein. These variable regions may have one or more properties described herein (eg, at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% with the sequences described herein). 97%, 98% or 99% identity). The invention also includes a method of providing a Tiel binding antibody. The method provides a host cell as described herein; and under conditions where the collection of light and heavy chain variable regions can form an antigen binding protein that interacts with Tie1. Expressing the first and second nucleic acids in the cell can be included.

別の局面において、本発明は、組成物、例えば、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤、および本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合タンパク質（例えば、抗体またはそのフラグメント）のうちの少なくとも一つを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、組成物（例えば、薬学的組成物）は、上記Ｔｉｅ１結合タンパク質の二つ以上からなる組合せを含む。   In another aspect, the present invention relates to compositions, eg, pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers, and Tie1-binding proteins (eg, antibodies or fragments thereof) described herein. Pharmaceutical compositions comprising at least one of them are provided. In one embodiment, the composition (eg, pharmaceutical composition) comprises a combination of two or more of the above Tie1-binding proteins.

別の局面において、本発明は、単独での使用または他の治療様式（例えば、細胞静止剤または標識剤、例えば本明細書中に記載される細胞毒剤または標識剤）と組み合わせての使用のためのＴｉｅ１結合抗体（またはそのフラグメント）、例えば本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合抗体（またはそのフラグメント）を、Ｔｉｅ１抗体の使用法またはＴｉｅ１関連疾患、例えば内皮細胞関連疾患、例えば関節リウマチまたは転移性癌を治療、予防または検出するような薬剤の組合せについての説明書とともに含むキットにより特徴付けられる。   In another aspect, the present invention provides for use alone or in combination with other therapeutic modalities (eg, cytostatic or labeling agents, such as the cytotoxic or labeling agents described herein). A Tie1-binding antibody (or fragment thereof) for use in, for example, a Tie1-binding antibody (or fragment thereof) as described herein, for use of a Tie1 antibody or a Tie1-related disease, eg, an endothelial cell related disease, eg, rheumatoid arthritis or Characterized by a kit that includes instructions for a combination of agents to treat, prevent or detect metastatic cancer.

別の局面において、Ｔｉｅ１に結合する結合タンパク質は免疫グロブリンではないポリペプチドである。例えばポリペプチドは可変の長さ、例えば４〜１００アミノ酸残基長、好ましくは５〜７５、６〜５０、または７〜４０アミノ酸残基長、またはより好ましくは８〜３０または１０〜２５アミノ酸残基長のものであることができる。一部の実施形態においては、ポリペプチドは非標準的な、または、合成のアミノ酸残基、例えばノルロイシン、セレノシステイン、ピロリジン等を包含する。一部の実施形態においては、ポリペプチドは交差結合基、例えばジスルフィド結合を形成するシステイン残基２つ、またはペプチドを環化するために使用できる化学的交差結合部分の何らかの別の型を包含する。他の好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、例えばポリペプチドの溶解度または循環半減期を増大させるために、ポリエチレングリコールまたは可溶性タンパク質への融合を用いるなどして修飾することができる。   In another aspect, the binding protein that binds to Tie1 is a polypeptide that is not an immunoglobulin. For example, the polypeptide may be of variable length, such as 4 to 100 amino acid residues long, preferably 5 to 75, 6 to 50, or 7 to 40 amino acid residues long, or more preferably 8 to 30 or 10 to 25 amino acid residues. It can be of the base length. In some embodiments, the polypeptide includes non-standard or synthetic amino acid residues such as norleucine, selenocysteine, pyrrolidine and the like. In some embodiments, the polypeptide includes a cross-linking group, such as two cysteine residues that form a disulfide bond, or some other type of chemical cross-linking moiety that can be used to cyclize the peptide. . In other preferred embodiments, the polypeptide can be modified, such as by using a fusion to polyethylene glycol or a soluble protein, eg, to increase the solubility or circulating half-life of the polypeptide.

標的結合タンパク質は別のタンパク質、例えばアミノまたはカルボキシ末端おいて標的に結合しないタンパク質と物理的に会合（例えば融合）することができる。例えば、標的結合タンパク質は血清中滞留を増大させるか、安定性を改変するタンパク質、例えばアルブミン、例えば血清アルブミン、例えばＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）と会合（例えば融合）することができる。別の例においては、標的結合タンパク質は精製を容易にする部分、例えば精製タグ、例えばＨｉｓ、ＰＥＧ、または官能性の部分、例えばＦｃに物理的に会合（例えば融合）される。   A target binding protein can be physically associated (eg, fused) with another protein, eg, a protein that does not bind the target at the amino or carboxy terminus. For example, the target binding protein can be associated (eg, fused) with a protein that increases serum retention or alters stability, such as albumin, eg, serum albumin, eg, HSA (human serum albumin). In another example, the target binding protein is physically associated (eg, fused) to a moiety that facilitates purification, eg, a purification tag such as His, PEG, or a functional moiety such as Fc.

別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１に特異的に結合するタンパク質を同定する方法により特徴付けられる。好ましい実施形態において、本発明は：Ｔｉｅ１抗原を提供する工程；ディスプレイライブラリ（例えば、ファージディスプレイライブラリーメンバー）を提供する工程；このライブラリーに存在するメンバーを同定する工程を包含し、このメンバーが、Ｔｉｅ１抗原に特異的に結合するタンパク質を発現する。用語「Ｔｉｅ１抗原」は、長さが少なくとも８アミノ酸であるＴｉｅ１の任意の抗原フラグメントをいう。例えば、Ｔｉｅ１抗原として、Ｔｉｅ１外部ドメインフラグメント、例えば、折り畳まれたタンパク質ドメインを含むフラグメント（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）が挙げ得る。一部の実施形態において、Ｔｉｅ１抗原はヒト起源であり、例えばヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインまたはそのフラグメント（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）を含む。このＴｉｅ１抗原は、必要に応じて別のポリペプチド（例えばＦｃドメイン）に融合させた組換えポリペプチドであり得、またはＴｉｅ１をその表面に発現する細胞（例えば、内皮細胞）であり得る。他の好ましい実施形態において、Ｔｉｅ１抗原は、活性化立体配座を有し、例えばＴｉｅ１抗原は、二量体立体配座または本明細書中に記載されるＥ３もしくはＥ３ｂ抗体により安定化した立体配座である。   In another aspect, the invention is characterized by a method for identifying a protein that specifically binds to Tiel. In a preferred embodiment, the invention includes: providing a Tiel antigen; providing a display library (eg, a phage display library member); identifying a member present in the library, wherein the member comprises Expresses a protein that specifically binds to the Tie1 antigen. The term “Tie1 antigen” refers to any antigen fragment of Tie1 that is at least 8 amino acids in length. For example, a Tie1 antigen can include a Tie1 ectodomain fragment, eg, a fragment that includes a folded protein domain (eg, a fragment described herein). In some embodiments, the Tie1 antigen is of human origin, including, for example, the extracellular domain of human Tie1 or a fragment thereof (eg, a fragment described herein). The Tie1 antigen can be a recombinant polypeptide fused to another polypeptide (eg, an Fc domain) as necessary, or can be a cell (eg, an endothelial cell) that expresses Tie1 on its surface. In other preferred embodiments, the Tie1 antigen has an activated conformation, eg, the Tie1 antigen is a dimeric conformation or a conformation stabilized by an E3 or E3b antibody as described herein. The seat.

本明細書中に記載される方法は、例えば実質的に完全なゲノム（例えば改変遺伝子ＩＩＩを含む）を有するバクテリオファージに基づくライブラリーおよびファージミド核酸を含むバクテリオファージ粒子に基づくライブラリーに適用可能である。用語「バクテリオファージライブラリーメンバー」および「ファージ」は、両種のライブラリーのメンバーを包含する。用語「バクテリオファージ粒子」は、核酸をパッケージするバクテリオファージコートタンパク質から形成された粒子をいう。パッケージした核酸は、改変バクテリオファージゲノムまたはファージミドであり得、例えば、バクテリオファージの複製開始点を含むが基本的なファージ遺伝子を欠如し、「ヘルパーファージ」またはｉｎ ｔｒａｎｓで供給されるファージ遺伝子の助けなくしてはＥ．ｃｏｌｉで増殖し得ない核酸であり得る。   The methods described herein are applicable, for example, to bacteriophage-based libraries with substantially complete genomes (eg, including modified gene III) and bacteriophage particle-based libraries that include phagemid nucleic acids. is there. The terms “bacteriophage library member” and “phage” encompass members of both types of libraries. The term “bacteriophage particles” refers to particles formed from bacteriophage coat proteins that package nucleic acids. The packaged nucleic acid can be a modified bacteriophage genome or a phagemid, for example, including a bacteriophage origin of replication but lacking a basic phage gene and helping a phage gene supplied in “helper phage” or in trans. Without E. It can be a nucleic acid that cannot grow in E. coli.

他の実施形態において、本発明は、Ｔｉｅ１に特異的に結合するタンパク質を同定する方法により特徴付けられる。該方法は、Ｔｉｅ１抗原（例えば、Ｔｉｅ１外部ドメインの領域）を提供する工程；非ヒト動物をＴｉｅ１抗原により免疫する工程；ならびにＴｉｅ１と相互作用する免疫グロブリンを産生する細胞を単離する工程を包含する。例えば、この方法は、動物（例えば、免疫マウス）の脾臓からハイブリドーマ細胞を作製する工程；ならびにＴｉｅ１抗原に特異的に結合する抗体を発現する個々のハイブリドーマ細胞株を同定する工程を包含する。例えば、この
好ましい実施形態において、Ｔｉｅ１抗原はヒト起源であり、例えばヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインまたはその一部のフラグメント（例えば、Ｔｉｅ１のＨＡ結合ドメイン）を含む。Ｔｉｅ１抗原は、別のポリペプチド（例えば、精製ハンドル（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｈａｎｄｌｅ））に必要に応じて融合させた組換えポリペプチドであり得、またはＴｉｅ１（例えば、内皮細胞）をその表面に発現する細胞であり得る。他の好ましい実施形態において、Ｔｉｅ１抗原は活性化立体配座を有し、例えば二量体化している。 In other embodiments, the invention is characterized by a method of identifying proteins that specifically bind to Tie1. The method includes providing a Tie1 antigen (eg, a region of the Tie1 ectodomain); immunizing a non-human animal with the Tie1 antigen; and isolating cells that produce immunoglobulins that interact with Tie1. To do. For example, the method includes generating hybridoma cells from the spleen of an animal (eg, an immunized mouse); and identifying individual hybridoma cell lines that express antibodies that specifically bind to the Tiel antigen. For example, in this preferred embodiment, the Tie1 antigen is of human origin and includes, for example, the extracellular domain of human Tie1 or a fragment thereof (eg, the HA binding domain of Tie1). The Tie1 antigen can be a recombinant polypeptide optionally fused to another polypeptide (eg, a purification handle) or in cells that express Tie1 (eg, endothelial cells) on its surface. possible. In other preferred embodiments, the Tie1 antigen has an activated conformation, eg, is dimerized.

好ましい実施形態において、この方法は、さらに、同定されたファージまたはハイブリドーマから核酸分子を単離する工程を包含し、この核酸分子が、Ｔｉｅ１抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは抗体をコードする。この単離した核酸分子を、本明細書中に記載されるように、治療因子を生成するために使用し得る。   In a preferred embodiment, the method further comprises isolating a nucleic acid molecule from the identified phage or hybridoma, wherein the nucleic acid molecule encodes a polypeptide or antibody that specifically binds to the Tiel antigen. This isolated nucleic acid molecule can be used to generate a therapeutic agent, as described herein.

別の局面において、本発明は、本明細書中に記載の方法により同定されるタンパク質をコードする核酸により特徴付けられる。好ましい実施形態において、核酸は、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン、または本明細書中に記載される免疫グロブリンフラグメントをコードする配列を含む。例えば、本発明は、本明細書中に記載されるようなＴｉｅ１結合抗体分子の重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれコードする第一および第二の核酸により特徴付けられる。ともに機能する重鎖と軽鎖をコードする配列は、異なる核酸分子上または同じ核酸分子上に存在し得る。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される核酸を含む宿主細胞およびベクターにより特徴付けられる。   In another aspect, the invention is characterized by a nucleic acid encoding a protein identified by the methods described herein. In a preferred embodiment, the nucleic acid comprises sequences encoding heavy and light chain immunoglobulins, or immunoglobulin fragments described herein. For example, the invention is characterized by first and second nucleic acids encoding the heavy and light chain variable regions, respectively, of a Tie1-binding antibody molecule as described herein. The sequences encoding heavy and light chains that function together can be on different nucleic acid molecules or on the same nucleic acid molecule. In another aspect, the invention is characterized by host cells and vectors that contain the nucleic acids described herein.

さらに別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１結合抗体、またはその抗原結合フラグメントを生成する方法により特徴付けられる。この方法は：重鎖可変領域（例えば、本明細書中に記載されるような重鎖可変領域）を含むポリペプチドをコードする第一核酸を含む宿主細胞を提供する工程；軽鎖可変領域（例えば、本明細書中に記載されるような軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第二核酸を提供する工程；ならびに上記軽鎖および重鎖の可変領域の集合体が、Ｔｉｅ１と相互作用する抗原結合タンパク質を形成し得る条件下で、上記第一および第二の核酸を宿主細胞中に発現させる工程を包含する。これら第一および第二の核酸は、連結または未連結であり得、例えば同じベクターまたは異なるベクター上にそれぞれ発現し得る。第一および第二の核酸は、同じ分子の成分であり得、または異なる分子（例えば、異なる染色体またはプラスミド）上に存在し得る。   In yet another aspect, the invention is characterized by a method of producing a Tiel binding antibody, or antigen binding fragment thereof. The method comprises: providing a host cell comprising a first nucleic acid encoding a polypeptide comprising a heavy chain variable region (eg, a heavy chain variable region as described herein); a light chain variable region ( For example, providing a second nucleic acid encoding a polypeptide comprising a light chain variable region as described herein; and a collection of the light and heavy chain variable regions interacts with Tie1 Expressing the first and second nucleic acids in a host cell under conditions that can form an antigen binding protein that can be linked or unlinked, For example, the first and second nucleic acids can be components of the same molecule or can be present on different molecules (eg, different chromosomes or plasmids). That.

宿主細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞）、または原核細胞（例えば、大腸菌）であり得る。例えば哺乳動物細胞は、培養細胞または細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞として、リンパ球細胞株（例えば、ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９４、卵母細胞および形質転換動物の細胞（例えば、哺乳動物内皮細胞）が挙げられる。例えば、本明細書中に記載される抗体をコードする核酸は、形質転換動物において発現し得る。一実施形態において、核酸を組織特異的プロモーター（例えば、乳腺特異的プロモーター）の制御下に置き、抗体を形質転換動物中に生成する。例えば、抗体分子は、形質転換動物（例えば、遺伝子導入ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたは齧歯動物）の乳中で分泌される。単鎖抗体を生成するために、重鎖および軽鎖の可変ドメインの両方を含む単一ポリペプチドをコードするように核酸を構成する。   Host cells can be eukaryotic cells (eg, mammalian cells, insect cells, yeast cells) or prokaryotic cells (eg, E. coli). For example, the mammalian cell can be a cultured cell or cell line. Exemplary mammalian cells include lymphocyte cell lines (eg, NS0), Chinese hamster ovary cells (CHO), COS cells, HEK294, oocytes and cells of transformed animals (eg, mammalian endothelial cells). It is done. For example, nucleic acids encoding the antibodies described herein can be expressed in transformed animals. In one embodiment, the nucleic acid is placed under the control of a tissue specific promoter (eg, a mammary gland specific promoter) and the antibody is produced in the transformed animal. For example, antibody molecules are secreted in the milk of transgenic animals (eg, transgenic cows, pigs, horses, sheep, goats or rodents). To generate a single chain antibody, the nucleic acid is configured to encode a single polypeptide that includes both the heavy and light chain variable domains.

Ｔｉｅ１は、広範な癌に関連して過剰発現することがわかった。Ｔｉｅ結合タンパク質（例えば、抗体）を有する腫瘍脈管構造上のＴｉｅ１の標的化を、腫瘍成長および転移が低減するように脈管構造を阻害、破壊、さもなければ中和するために使用し得る。これらのタンパク質は、例えば毒性ペイロードと結合し得、または直接的な機能的阻害を媒介し得る。ＡＤＣＣの原因となり得るタンパク質（例えば、Ｆｃドメインを有するタンパク質）もまた使用し得る。   Tiel was found to be overexpressed in association with a wide range of cancers. Targeting Tie1 on tumor vasculature with Tie binding proteins (eg, antibodies) can be used to inhibit, destroy, or otherwise neutralize vasculature such that tumor growth and metastasis are reduced . These proteins can, for example, bind to a toxic payload or mediate direct functional inhibition. Proteins that can cause ADCC (eg, proteins having an Fc domain) can also be used.

別の局面において、本発明は、細胞（例えば内皮細胞）の活性、例えば、細胞（例えば内皮細胞（例えば、癌（例えば、腫瘍）周辺の内皮細胞）の増殖、付着、成長または生存等の細胞活性を阻害する方法により特徴付けられる。例示的な方法は、細胞を、細胞の付着、移動、成長または増殖を阻害するのに十分な量でＴｉｅ１結合タンパク質と接触させる工程を包含する。Ｔｉｅ１結合タンパク質を投与する方法は、例えば障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、例えば炎症性障害（例えば、関節リウマチ、狼瘡、再狭窄、乾癬、移植片対宿主反応または多発性硬化症）または癌障害（例えば、悪性または転移性疾患）を治療または予防するのに有効な量のＴｉｅ１結合タンパク質を、被験体（例えば、実験動物またはヒト患者）に投与することにより、該疾患を治療または予防するために使用し得る。   In another aspect, the invention relates to the activity of a cell (eg, endothelial cell), such as the proliferation, attachment, growth or survival of a cell (eg, an endothelial cell (eg, an endothelial cell surrounding a cancer (eg, tumor)). Characterized by a method of inhibiting activity, an exemplary method comprises contacting a cell with a Tie1 binding protein in an amount sufficient to inhibit cell attachment, migration, growth or proliferation. Methods of administering the protein include, for example, disorders, such as inflammatory disorders (eg, rheumatoid arthritis, lupus, restenosis, psoriasis, graft-versus-host reaction or multiple sclerosis) or cancer disorders (eg, malignant or metastatic) By administering to a subject (eg, a laboratory animal or a human patient) an amount of Tie1-binding protein effective to treat or prevent It may be used to treat or prevent the disease.

Ｔｉｅ１結合タンパク質を、血管形成関連障害、特に血管形成依存性癌および腫瘍を処置または予防するために使用し得る。血管形成関連疾患としては、これらに限定されないが、固形腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；関節リウマチ）；乾癬；眼血管形成疾患、例えば、糖尿病性網膜症、早熟性網膜症、黄班変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症、ルベオーシス；Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群；心筋血管形成；プラーク新血管形成；末梢血管拡張症；血友病関節；血管線維腫；および傷の肉芽形成が挙げられる。   Tie1-binding proteins may be used to treat or prevent angiogenesis-related disorders, particularly angiogenesis-dependent cancers and tumors. Angiogenesis-related diseases include, but are not limited to, solid tumors; tumor metastasis; benign tumors (eg, hemangiomas, acoustic neuromas, neurofibromas, trachoma, and pyogenic granulomas; rheumatoid arthritis); psoriasis; ocular blood vessels Plastic diseases such as diabetic retinopathy, premature retinopathy, macular degeneration, corneal transplant rejection, neovascular glaucoma, post-lens fibroplasia, rubeosis; Osler-Webber syndrome; myocardial angiogenesis; plaque neovascularization; Vasodilatation; hemophilia joints; angiofibromas; and wound granulation.

「血管形成依存性癌および腫瘍」は、それらの成長（容積および／または質量の拡大）のために、血管の数および密度を増大して血液を供給することを必要とする癌腫瘍である。一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、そのような癌および腫瘍の退縮を引き起こす。「退縮」とは腫瘍の質量および大きさの縮小、例えば少なくとも２％、５％、１０％または２５％の減少をいう。   “Angiogenesis-dependent cancers and tumors” are cancerous tumors that require an increased number and density of blood vessels to supply blood for their growth (volume and / or mass expansion). In one embodiment, the Tiel binding protein causes such cancer and tumor regression. “Regression” refers to a reduction in tumor mass and size, eg, a reduction of at least 2%, 5%, 10% or 25%.

更に又、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２は造血細胞中で発現される（Ｋｕｋｋ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９８：１９５；Ｉｗａｍａ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９５：３０１）。従って、別の実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は造血状態、例えば造血系の癌を治療するために使用される。造血系の癌の例は、造血系起源の過形成／新生物の細胞、例えば骨髄様、リンパ様または赤血球様の系統から生じる細胞またはその前駆細胞から誘導された癌を包含する。例示される癌は急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ），非ホジキンリンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、脊髄形成異常症候群およびホジキン病を包含する。   Furthermore, Tie1 and Tie2 are expressed in hematopoietic cells (Kukk et al (1997) Br. J. Haematol. 98: 195; Iwama et al (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 301). Thus, in another embodiment, the Tiel binding protein is used to treat a hematopoietic condition, such as a hematopoietic cancer. Examples of hematopoietic cancers include those derived from hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin, such as cells originating from myeloid, lymphoid or erythroid lineages or precursor cells thereof. Exemplary cancers are acute promyelocytic leukemia (APML), acute myeloid leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia (CML), acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), prolymphoid. Leukemia (PLL), hairy cell leukemia (HLL) and Waldenstrom macroglobulinemia (WM), non-Hodgkin lymphoma, peripheral T-cell lymphoma, adult T-cell leukemia / lymphoma (ATL), cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) , Large granular lymphocytic leukemia (LGF), B-cell chronic lymphocytic leukemia, myelodysplastic syndrome and Hodgkin's disease.

別の特徴においては、本発明は細胞（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）、例えば内皮細胞、例えば癌、例えば腫瘍の近接部の内皮細胞を接触させる方法を特徴とする。方法はＴｉｅ１と相互作用する薬剤（例えばタンパク質）、例えば本明細書に記載したタンパク質を準備すること、および検出可能なリガンド−細胞複合体少なくとも１つが形成されるのに十分な量のタンパク質に細胞を接触させることを包含することができる。タンパク質は例えば標識または細部毒性の実体、例えば免疫グロブリンＦｃドメインまたは細胞毒性剤を包含できる。   In another aspect, the invention features a method of contacting a cell (in vitro, ex vivo or in vivo), eg, an endothelial cell, eg, an endothelial cell in the vicinity of a cancer, eg, a tumor. The method prepares an agent (eg, a protein) that interacts with Tie1, eg, a protein described herein, and cells into an amount of protein sufficient to form at least one detectable ligand-cell complex. Can be included. The protein can include, for example, a label or a detail toxic entity such as an immunoglobulin Fc domain or a cytotoxic agent.

別の局面において、本発明は例えば被験体にアジュバント療法として本明細書に記載した薬剤を投与することを特徴とする。アジュバント療法は腫瘍の全てまたは部分を除去する手術を被験体が受けた後（例えば神経膠芽細胞腫または結腸直腸癌、乳癌または肺癌の手術の後）に被験体に投与される術後治療薬であることができる。例えば、薬剤はＴｉｅ１複合体形成を阻害するか、Ｔｉｅ１ホモ二量体化を促進するか、または、Ｔｉｅ１リン酸化を増大させるタンパク質である。例えば薬剤はＴｉｅ１に結合するタンパク質（例えば抗Ｔｉｅ１抗体）である。一実施形態において、薬剤は手術の６、１２、２４、４８または１００時間以内に投与する。薬剤は手術前並びに後に投与できる。   In another aspect, the invention features, for example, administering to a subject an agent described herein as an adjuvant therapy. Adjuvant therapy is a post-operative treatment that is administered to a subject after the subject has undergone surgery to remove all or part of the tumor (eg, after surgery for glioblastoma or colorectal cancer, breast cancer, or lung cancer) Can be. For example, the agent is a protein that inhibits Tie1 complex formation, promotes Tie1 homodimerization, or increases Tie1 phosphorylation. For example, the drug is a protein that binds to Tie1 (eg, an anti-Tie1 antibody). In one embodiment, the agent is administered within 6, 12, 24, 48 or 100 hours of surgery. The drug can be administered before and after surgery.

例示される薬剤は（ａ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインに少なくとも８５、９０、９５、９８または９９％同一である重鎖可変ドメイン配列およびＥ３抗体の軽鎖可変ドメインに少なくとも８５、９０、９５、９８または９９％同一である軽鎖可変ドメイン配列；（ｂ）Ｔｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列；または（ｃ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲの１、２または３つおよびＥ３抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲの１、２または３つ、を包含するＴｉｅ１結合剤である。本明細書に記載する他のＴｉｅ１結合剤、例えば、Ｍ００５９Ａ０２、Ｍ００４５Ａ０２＊、Ｍ００５４Ｇ０５、Ｍ００５３Ｆ０５、Ｍ００５３Ｇ０５、Ｍ００６１Ｃ０６、Ｍ００４５Ｂ０１、Ｍ００４６Ｇ１２、Ｍ００４６Ｈ１１、Ｍ００５３Ａ０２、Ｍ００５３Ａ０５、Ｍ００４６Ｂ０６、Ｍ００４４Ｂ１０、Ｍ００４４Ｂ０８、Ｍ００５６Ｇ０８、Ｍ００４５Ｂ０３、Ｍ００５３Ｆ０４、Ｍ００５５Ｅ１０、Ｍ００６０Ｈ０１、Ｍ００５４Ｈ１０またはＭ００５８Ｆ０３の重鎖可変ドメインに少なくとも８５、９０、９５、９８、９９％または１００％同一である重鎖可変ドメイン配列、およびＭ００５９Ａ０２、Ｍ００４５Ａ０２＊、Ｍ００５４Ｇ０５、Ｍ００５３Ｆ０５、Ｍ００５３Ｇ０５、Ｍ００６１Ｃ０６、Ｍ００４５Ｂ０１、Ｍ００４６Ｇ１２、Ｍ００４６Ｈ１１、Ｍ００５３Ａ０２、Ｍ００５３Ａ０５、Ｍ００４６Ｂ０６、Ｍ００４４Ｂ１０、Ｍ００４４Ｂ０８、Ｍ００５６Ｇ０８、Ｍ００４５Ｂ０３、Ｍ００５３Ｆ０４、Ｍ００５５Ｅ１０、Ｍ００６０Ｈ０１、Ｍ００５４Ｈ１０またはＭ００５８Ｆ０３の軽鎖可変ドメインに少なくとも８５、９０、９５、９８、９９％または１００％同一である軽鎖可変ドメイン配列を包含するＴｉｅ１結合剤も使用できる。 Exemplary agents are (a) a heavy chain variable domain sequence that is at least 85, 90, 95, 98, or 99% identical to the heavy chain variable domain of the E3 antibody and at least 85, 90, 95 to the light chain variable domain of the E3 antibody. A light chain variable domain sequence that is 98 or 99% identical; (b) a heavy and light chain variable domain sequence that forms an antigen binding site that competes with E3 for binding to Tie1; or (c) an E3 antibody A Tie1 binding agent comprising one, two or three of the CDRs of the heavy chain variable domain and one, two or three of the CDRs of the light chain variable domain of the E3 antibody. Other Tie1 binders described herein, such as M0059A02, M0045A02 * , M0054G05, M0053F05, M0053G05, M0061C06, M0045B01, M0046G12, M0046H11, M0053A02, M0053A05, M0046B06, M0044B10, M0044B08, M0056B03, M0056B03 A heavy chain variable domain sequence that is at least 85, 90, 95, 98, 99% or 100% identical to the heavy chain variable domain of M0060H01, M0054H10 or M0058F03, and M0059A02, M0045A02 * , M0054G05, M0053F05, M0053G05, M0061C06, M0045B0 1, M0046G12, M0046H11, M0053A02, M0053A05, M0046B06, M0044B10, M0044B08, M0056G08, M0045B03, M0053F04, M0055E10, M0060H01, M0060H10 or M0058H03 or M0058F03 light chain variable domains at least 85, 90, 95, 98, 99% or 100% A Tie1 binding agent comprising a light chain variable domain sequence can also be used.

別の局面において、本発明は、治療、例えば細胞の阻害、除去または殺傷、または、細胞の活性少なくとも１つの弱化の方法を特徴とする。方法はＴｉｅ１結合タンパク質、例えば本明細書に記載したリガンドを準備すること、および、細胞の活性少なくとも１つを弱化、細胞を阻害、除去または殺傷するために十分な量のタンパク質に細胞を接触させることを包含する。接触はインビトロまたはインビボであってよい。例えば細胞は内皮細胞、例えば癌、例えば腫瘍の近接部にある内皮細胞であることができる。タンパク質は細胞毒性の実体を包含できる。Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書に記載した他の薬剤を投与する方法は、例えば障害、例えば内皮細胞系の障害、血管障害、創傷治癒または癌性の障害（例えば悪性または転移性の障害）を治療または防止するために、そのような障害を治療または防止するために十分な量のＴｉｅ１結合タンパク質を被験体（例えば実験動物またはヒト患者）に投与することにより、使用することができる。   In another aspect, the invention features a method of treatment, eg, inhibition, removal or killing of cells, or attenuation of at least one activity of cells. The method provides a Tie1-binding protein, eg, a ligand described herein, and contacts the cell with a sufficient amount of protein to attenuate, inhibit, remove or kill the cell at least one of the activity of the cell. Including that. Contact may be in vitro or in vivo. For example, the cell can be an endothelial cell, eg, an endothelial cell in the vicinity of a cancer, eg, a tumor. Proteins can include cytotoxic entities. Methods of administering a Tie1-binding protein or other agent described herein treat, for example, disorders such as disorders of the endothelial cell system, vascular disorders, wound healing or cancerous disorders (eg malignant or metastatic disorders) Or to prevent, an amount of Tiel binding protein sufficient to treat or prevent such a disorder can be used by administering to a subject (eg, an experimental animal or a human patient).

Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子は、例えばインビトロまたはエクスビボで培養中の細胞に使用し得る。例えば、内皮細胞（例えば、癌生検材料中の内皮細胞）を、インビトロにおいて培地中で培養し得、Ｔｉｅ１結合タンパク質を培地に加えることにより、接触工程を実施し得る。この方法を、被験体に存在する細胞（例えば、癌性または転移性細胞）に対して、インビボ（例えば、治療または予防）プロトコルの一部として実施し得る。インビボ実施形態について、接触工程を被験体中で実施し、この工程は、タンパク質の細胞への結合および細胞の付着、移動、成長または増殖の阻害の両方を可能とするのに有効な条件下で、Ｔｉｅ１結合タンパク質を被験体に投与する工程を包含する。   Tie1-binding proteins or other factors described herein may be used for cells in culture, for example in vitro or ex vivo. For example, endothelial cells (eg, endothelial cells in a cancer biopsy) can be cultured in culture in vitro, and the contacting step can be performed by adding Tiel binding protein to the culture. This method can be performed as part of an in vivo (eg, therapeutic or prophylactic) protocol for cells (eg, cancerous or metastatic cells) present in a subject. For in vivo embodiments, the contacting step is performed in a subject under conditions effective to allow both binding of the protein to the cell and inhibition of cell attachment, migration, growth or proliferation. Administering a Tie1-binding protein to the subject.

Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子を、例えば、造血癌、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移病巣、特に、血液供給または血管形成を必要とする腫瘍等の癌性疾患を処置または予防するために使用し得る。固形腫瘍の例としては、例えば、種々の器官系（例えば、肺、胸、リンパ節、胃腸管（例えば、結腸）および尿生殖器管（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、咽頭を侵す）の肉腫、腺癌および癌腫等の悪性腫瘍、ならびに、例えば、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌腫、肝臓癌、肺の非小細胞癌腫、小腸癌および食道癌等の悪性腫瘍を含む腺癌が挙げられる。被験体は、哺乳動物、例えば霊長類、好ましくは高等霊長類、例えばヒト（例えば、本明細書中に記載される障害、例えば内皮細胞に基づく障害、例えば癌を有するかまたはその危険性のある患者）であり得る。   Tie1-binding protein or other factors described herein to treat cancerous diseases such as, for example, hematopoietic cancers, solid tumors, soft tissue tumors and metastatic foci, particularly tumors that require blood supply or angiogenesis Or it can be used to prevent. Examples of solid tumors include, for example, various organ systems (eg, lung, breast, lymph node, gastrointestinal tract (eg, colon) and genitourinary tract (eg, kidney, urothelial cells), pharynx) Adenocarcinoma including malignant tumors such as sarcomas, adenocarcinomas and carcinomas, and malignant tumors such as, for example, most colon cancers, rectal cancers, renal cell carcinomas, liver cancers, non-small cell carcinomas of the lung, small intestine cancers and esophageal cancers Is mentioned. The subject is a mammal, such as a primate, preferably a higher primate, such as a human (e.g., having or at risk of a disorder described herein, such as a disorder based on endothelial cells, such as cancer. Patient).

Ｔｉｅ１結合抗体またはそのフラグメント、例えば本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合抗体またはそのフラグメントを、被験体に対して、全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、鼻腔内、経皮、または吸入により）、局所的に、または鼻、喉および気管支等の粘膜への適用により投与し得る。   A Tie1-binding antibody or fragment thereof, eg, a Tie1-binding antibody or fragment thereof described herein, is administered to a subject systemically (eg, oral, parenteral, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal). (Internally, intranasally, transdermally or by inhalation), topically, or by application to mucous membranes such as the nose, throat and bronchi.

これらの方法は、例えば：腫瘍サイズの減少；癌マーカー（例えば、癌特異抗原レベル）の減少；新しい病巣出現（例えば骨スキャンにおいて）の減少；新たな疾患関連症状の出現の減少；または軟組織塊の大きさの減少または安定化；あるいは臨床転帰の改善に関連する任意のパラメーターのうちの一つ以上の減少について、被験体をモニタリングする工程をさらに包含し得る。被験体は、以下の期間：処置開始前；処置中；または処置の一つ以上の要素を投与した後の一つ以上の期間中、モニタリングし得る。モニタリングは、同じＴｉｅ１結合タンパク質によるさらなる処置の必要性、またはさらなる因子によるさらなる処置の必要性を評価するために使用し得る。一般的に、上記パラメーターの一つ以上の減少は、被験体の状態の改善を示す。モニタリングに関する情報は、例えば電子形態またはデジタル形態で記録され得る。   These methods include, for example: reducing tumor size; reducing cancer markers (eg, cancer-specific antigen levels); reducing the appearance of new lesions (eg, in bone scans); reducing the appearance of new disease-related symptoms; or soft tissue mass The method may further comprise monitoring the subject for a reduction or stabilization of the size of; or a reduction of one or more of any parameters associated with improved clinical outcome. A subject can be monitored for the following periods: before the start of treatment; during treatment; or during one or more periods after administration of one or more elements of treatment. Monitoring can be used to assess the need for further treatment with the same Tie1-binding protein, or the need for further treatment with additional factors. In general, a decrease in one or more of the above parameters indicates an improvement in the condition of the subject. Information regarding monitoring may be recorded, for example, in electronic or digital form.

Ｔｉｅ１結合タンパク質は、非結合体化形態にて単独で使用することにより、Ｔｉｅ１発現細胞の付着、移動または溢出を阻害するか、またはＴｉｅ１発現細胞を剥離または死滅させ得る。Ｔｉｅ１結合タンパク質が抗体である場合、剥離または死滅を、例えば、補体媒介細胞溶解および／またはエフェクター細胞媒介細胞死滅等の抗体依存性細胞死滅機構により媒介し得る。他の実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、Ｔｉｅ１発現細胞を死滅または剥離するのに効果的な物質、例えば、細胞毒性因子または細胞毒性部分に結合（例えば、直接的かまたは間接的な物理的会合、共有または非共有結合）し得る。例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、放射性イオン（例えば、α−、γ−またはβ−エミッター）、例えば、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）またはビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）に結合し得る。 Tie1-binding proteins can be used alone in unconjugated form to inhibit the attachment, migration or overflow of Tie1-expressing cells or to detach or kill Tie1-expressing cells. When the Tie1-binding protein is an antibody, detachment or death can be mediated by antibody-dependent cell killing mechanisms such as, for example, complement-mediated cell lysis and / or effector cell-mediated cell killing. In other embodiments, the Tie1-binding protein binds to a substance effective to kill or detach a Tie1-expressing cell, such as a cytotoxic factor or cytotoxic moiety (eg, direct or indirect physical association). Shared or non-covalent). For example, Tie1-binding proteins are radioactive ions (eg, α-, γ- or β-emitters), such as iodine ( 131 I or 125 I), yttrium ( 90 Y), lutetium ( 177 Lu), actinium ( 225 Ac ) Or bismuth ( 212 Bi or 213 Bi).

本発明の方法および本明細書中に記載される組成物を、他の治療様式と組合せて使用し得る。一実施形態において、これらの方法は、Ｔｉｅ１結合タンパク質、例えば、Ｔｉｅ１結合抗体またはそのフラグメントを、疾患を処置または予防するのに有効な量で、細胞毒性因子と組み合せて、被験体に投与する工程を包含する。Ｔｉｅ１結合タンパク質および細胞毒性因子は、同時または逐次的に投与され得る。他の実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子は、外科的および／または放射線手法と組み合わせて使用される。   The methods of the invention and the compositions described herein may be used in combination with other treatment modalities. In one embodiment, these methods comprise administering to a subject a Tie1-binding protein, eg, a Tie1-binding antibody or fragment thereof, in combination with a cytotoxic agent, in an amount effective to treat or prevent the disease. Is included. The Tiel binding protein and cytotoxic factor can be administered simultaneously or sequentially. In other embodiments, the Tiel binding protein or other factors described herein are used in combination with surgical and / or radiation techniques.

別の局面において、本発明は、サンプル中、インビトロ（例えば、生物学的サンプル、組織生検材料、例えば癌病巣）で、Ｔｉｅ１タンパク質またはＴｉｅ１を発現する細胞（例えば内皮細胞）の存在を検出するための方法により特徴付けられる。この主題の方法を、本明細書中に記載される障害（例えば、癌障害）を評価、例えば診断または段階付けるために使用し得る。この方法は：（ｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、サンプル（および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）を、本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合タンパク質と接触させる工程；ならびに（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とサンプル（および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）との複合体の形成を検出する工程を包含する。複合体の形成は、Ｔｉｅ１タンパク質（例えば、活性化Ｔｉｅ１タンパク質）の存在を示すものであり、本明細書中に記載される処置に対する適合性または必要性を示し得る。例えば、参照サンプル、例えばコントロールサンプルに比較して、サンプル中の複合体の形成の統計的に有意な変化は、このサンプル中のＴｉｅ１（例えば、活性化Ｔｉｅ１）の存在を示している。   In another aspect, the present invention detects the presence of cells expressing Tie1 protein or Tie1 (eg, endothelial cells) in a sample in vitro (eg, biological sample, tissue biopsy, eg, cancer lesion). Characterized by a method for The subject methods can be used to assess, eg, diagnose or stage, a disorder described herein (eg, a cancer disorder). This method includes: (i) A sample (and optionally a reference sample, eg, a control sample), under conditions where interaction between Tie1 binding protein and Tie1 protein can occur, and a Tie1 described herein. Contacting the binding protein; and (ii) detecting the formation of a complex between the Tiel binding protein and the sample (and optionally a reference sample, eg, a control sample). Complex formation is indicative of the presence of Tie1 protein (eg, activated Tie1 protein) and may indicate suitability or need for the treatments described herein. For example, a statistically significant change in complex formation in a sample compared to a reference sample, such as a control sample, indicates the presence of Tie1 (eg, activated Tie1) in this sample.

さらに別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１（例えば、活性化Ｔｉｅ１）の存在をインビボ（例えば、被験体中のインビボ画像化）で検出するための方法を提供する。この主題の発明を、本明細書中に記載される障害、例えば癌障害を評価、例えば診断、位置特定または段階付けるために使用し得る。この方法は：（ｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を、被験体（および必要に応じて、コントロール被験体）に投与する工程；ならびに（ｉｉ）このＴｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１との複合体の形成を検出する工程を包含し、参照（例えば、コントロール被験体または被験体のベースライン）に比較して、被験体中の複合体形成の統計的に有意な変化が、Ｔｉｅ１の存在を示している。被験体内の特定の位置でのＴｉｅ１の存在は、内皮細胞関連障害、例えば、血管形成関連障害（例えば、癌（例えば転移性癌））、または本明細書中に記載される他の血管形成関連障害を示すことができる。   In yet another aspect, the present invention provides a method for detecting the presence of Tie1 (eg, activated Tie1) in vivo (eg, in vivo imaging in a subject). The subject invention can be used to evaluate, eg, diagnose, localize, or stage a disorder described herein, eg, a cancer disorder. This method includes: (i) under conditions where interaction between a Tie1 binding protein and a Tie1 protein can occur, a Tie1 binding protein (eg, an antibody or antigen binding fragment thereof) is treated with a subject (and optionally a control subject). And (ii) detecting the formation of a complex between this Tie1-binding protein and Tie1, and compared to a reference (eg, a control subject or subject's baseline), A statistically significant change in complex formation in the subject indicates the presence of Tie1. The presence of Tie1 at a particular location within a subject may indicate an endothelial cell related disorder, such as an angiogenesis related disorder (eg, cancer (eg, metastatic cancer)), or other angiogenesis related as described herein. Can indicate a failure.

腫瘍細胞はＴｉｅ１を発現することができる。一局面において、本発明は被験体由来のサンプルを準備し、そして、サンプル中の細胞内のＴｉｅ１発現を評価する方法を特徴とする。一実施形態において、Ｔｉｅ１発現水準の評価の結果を比較コントロール、例えば比較コントロール数値または比較コントロール特性と比較する。例えば、評価されたサンプル上のＴｉｅ１発現は比較参照の数値と同様、低値または高値であってよい。比較コントロールの数値または性質はコントロールサンプル、統計値（例えば平均、メジアン等）または任意の数値を用いながら測定される。例えばコントロールサンプルは正常サンプル、例えば同じか異なる被験体に由来する腫瘍細胞を含まない使用であることができる。比較コントロールと相対比較した場合の変化（例えば増大）はサンプルが腫瘍細胞を包含すること、例えば被験体が腫瘍保有としての適応症であることを示している。   Tumor cells can express Tie1. In one aspect, the invention features a method for preparing a sample from a subject and assessing intracellular Tie1 expression in the sample. In one embodiment, the result of the assessment of Tie1 expression level is compared to a comparative control, such as a comparative control value or a comparative control characteristic. For example, Tie1 expression on the evaluated sample can be low or high, as well as the comparative reference number. The numerical value or nature of the comparative control is measured using control samples, statistical values (eg, average, median, etc.) or any numerical value. For example, a control sample can be a normal sample, eg, a use that does not include tumor cells from the same or different subjects. A change (eg, increase) relative to a comparative control indicates that the sample includes tumor cells, eg, the subject is an indication for having a tumor.

他の実施形態において、本明細書中に記載される障害（例えば、炎症または癌障害）を診断または段階付ける方法を提供する。この方法は：（ｉ）この障害を有するか、またはその危険性のある被験体を同定する工程；（ｉｉ）この障害に侵された組織または細胞のサンプルを入手する工程；（ｉｉｉ）結合因子とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、このサンプルまたはコントロールサンプルを、Ｔｉｅ１結合タンパク質と接触させる工程（ｉｖ）ならびに複合体の形成を検出する工程を包含する。参照サンプル、例えばコントロールサンプルに対して、Ｔｉｅ１結合タンパク質との複合体の形成の統計的に有意な増加は、障害または障害の段階を示している。例えば、固形腫瘍に位置する腫瘍細胞上の活性化Ｔｉｅ１の発見は、腫瘍が転移性癌に進行していることを示し得る。   In other embodiments, methods of diagnosing or staging the disorders described herein (eg, inflammation or cancer disorders) are provided. The method includes: (i) identifying a subject having or at risk for the disorder; (ii) obtaining a sample of tissue or cells affected by the disorder; (iii) a binding agent Contacting the sample or control sample with a Tie1 binding protein under conditions that allow interaction between the Tie1 protein and Tie1 protein (iv) as well as detecting the formation of a complex. A statistically significant increase in complex formation with a Tiel binding protein relative to a reference sample, eg, a control sample, indicates a disorder or stage of disorder. For example, the discovery of activated Tie1 on tumor cells located in solid tumors may indicate that the tumor has progressed to metastatic cancer.

好ましくは、インビボおよびインビトロ診断法に使用されるＴｉｅ１結合タンパク質を、結合または非結合の結合因子の検出を促進する検出可能な物質で、直接的または間接的に標識する。適切な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、放射性イオン、例えば、インジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、イオウ（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）またはリン（３２Ｐ）に結合する。別の実施形態において、このＴｉｅ１結合タンパク質を、ＮＭＲ造影剤で標識する。 Preferably, the Tiel binding protein used in in vivo and in vitro diagnostic methods is directly or indirectly labeled with a detectable substance that facilitates the detection of bound or unbound binding agent. Suitable detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials and radioactive materials. In one embodiment, the Tie1 binding protein is a radioactive ion, such as indium ( 111 In), iodine ( 131 I or 125 I), yttrium ( 90 Y), actinium ( 225 Ac), bismuth ( 212 Bi or 213 Bi). , Sulfur ( 35 S), carbon ( 14 C), tritium ( 3 H), rhodium ( 188 Rh) or phosphorus ( 32 P). In another embodiment, the Tiel binding protein is labeled with an NMR contrast agent.

一局面において、本発明は腫瘍の脈管構造を画像化する方法を特徴とし、方法はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合するタンパク質、例えば本明細書に記載したタンパク質を準備すること、ただしここでタンパク質は画像化剤に物理的に会合しているものであること；例えば腫瘍を有する患者にタンパク質を投与すること；および、例えば腫瘍の脈管構造を検出するために患者を画像化することを包含する。   In one aspect, the invention features a method of imaging tumor vasculature, the method comprising providing a protein that binds to Tie1, Tie2, or Ang, eg, a protein described herein, wherein the protein Includes being physically associated with the imaging agent; for example, administering the protein to a patient having a tumor; and, for example, imaging the patient to detect tumor vasculature To do.

一局面において、本発明は血液骨新生物障害を有する患者を治療する方法を特徴とし、方法は血液骨新生物障害（例えば造血細胞の増殖性障害、例えば白血病）を有する患者にＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合するタンパク質、例えば本明細書に記載したタンパク質を投与することにより障害を治療することを包含する。   In one aspect, the invention features a method of treating a patient having a blood bone neoplastic disorder, wherein the method includes treating a patient with a blood bone neoplastic disorder (eg, a hematopoietic cell proliferative disorder, eg, leukemia) with Tie1, Tie2, or It includes treating a disorder by administering a protein that binds Ang, eg, a protein described herein.

一局面において、本発明は被験体を診断および治療する方法を特徴とし、方法はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに関連するパラメーターを評価すること；およびパラメーターが比較コントロールと相対比較して改変されている場合は本明細書に記載したタンパク質を患者に投与することにより被験体を治療することを包含する。一実施形態において、パラメーターは例えば被験体の組織中のタンパク質またはｍＲＮＡの水準を示す数値を包含する。一実施形態において、比較コントロールは比較コントロールの被験体、例えば年齢／性別がマッチした被験体、例えばコントロールまたは正常な被験体に関して求めた数値を包含する。   In one aspect, the invention features a method of diagnosing and treating a subject, the method assessing a parameter associated with Tie1, Tie2, or Ang; and where the parameter is modified relative to a comparative control Includes treating a subject by administering to a patient a protein described herein. In one embodiment, the parameter includes a numerical value indicating, for example, the level of protein or mRNA in the subject's tissue. In one embodiment, the comparative control includes a numerical value determined for a comparative control subject, eg, an age / gender matched subject, eg, a control or normal subject.

一局面において、本発明は被験体を治療する方法を特徴とし、方法は、比較コントロールと比較して上昇したＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの生体分子または活性を有する被験体に本明細書に記載したタンパク質を投与することを包含する。方法は例えば被験体が比較コントロールと比較して上昇したＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの生体分子または活性を有するかどうかを調べるために被験体を評価することを包含できる。一実施形態において、被験体は上昇したＴｉｅ１タンパク質またはｍＲＮＡ水準を有する。   In one aspect, the invention features a method of treating a subject, wherein the method includes a protein described herein in a subject having elevated Tie1, Tie2, or Ang biomolecules or activity compared to a comparative control. Administration. The method can include, for example, evaluating the subject to see if the subject has elevated Tie1, Tie2, or Ang biomolecules or activity compared to a comparative control. In one embodiment, the subject has elevated Tie1 protein or mRNA levels.

本発明はまた、広範なアミノ酸配列および核酸配列、例えば、本明細書中に記載される配列または本明細書中に記載される配列に関連する配列を包含するポリペプチドおよび核酸を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に記載される各ポリペプチドをコードする核酸により特徴付けられる。この核酸は、同系コドン、または各々のポリペプチドを産生するように翻訳され得る任意の組のコドンを含み得る。そのようなポリペプチドは、多鎖タンパク質の個々のサブユニット、例えば、複数の異なるポリペプチド鎖を含む抗体を含む。この核酸はまた、発現されない核酸フラグメントまたはベクターであり得るが、免疫グロブリン可変領域（例えば、本明細書中に記載されるＣＤＲ等）の少なくとも一部またはその補体をコードする配列を含む。そのような核酸を、有用な構築物、細胞およびタンパク質を調製するために使用し得る。さらに、本発明は、本明細書中に記載される核酸を含む宿主細胞により特徴付けられる。この細胞は、本明細書中に記載されるタンパク質を、例えばその表面に発現し得る。本発明はまた、本明細書中に記載される核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、または本明細書中に記載される核酸にハイブリダイズするタンパク質を含む。   The invention also provides polypeptides and nucleic acids that encompass a wide range of amino acid and nucleic acid sequences, eg, sequences described herein or sequences related to sequences described herein. For example, the invention is characterized by a nucleic acid that encodes each polypeptide described herein. The nucleic acid can include cognate codons, or any set of codons that can be translated to produce the respective polypeptide. Such polypeptides include individual subunits of multi-chain proteins, eg, antibodies that include multiple different polypeptide chains. The nucleic acid can also be a non-expressed nucleic acid fragment or vector, but includes a sequence encoding at least a portion of an immunoglobulin variable region (eg, a CDR described herein, etc.) or its complement. Such nucleic acids can be used to prepare useful constructs, cells and proteins. Furthermore, the invention is characterized by a host cell comprising the nucleic acid described herein. The cell may express the protein described herein, for example, on its surface. The invention also includes a protein comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid described herein, or a protein that hybridizes to a nucleic acid described herein.

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質をいう。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書中ではＶＨと略す）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書中ではＶＬと略す）を含み得る。別の例において、抗体は、二つの重（Ｈ）鎖可変領域および二つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄフラグメント、ＦｖフラグメントおよびｄＡｂフラグメント）ならびに完全抗体を包含する。 As used herein, the term “antibody” refers to a protein comprising at least one immunoglobulin variable domain or immunoglobulin variable domain sequence. For example, an antibody can comprise a heavy (H) chain variable region (abbreviated herein as VH) and a light (L) chain variable region (abbreviated herein as VL). In another example, the antibody comprises two heavy (H) chain variable regions and two light (L) chain variable regions. The term “antibody” includes antigen-binding fragments of antibodies (eg, single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ′) 2 , Fd fragments, Fv fragments and dAb fragments) and intact antibodies.

ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が点在する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割され得る。このフレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照）。Ｋａｂａｔの定義を、本明細書中で使用する。ＶＨおよびＶＬのそれぞれは、典型的には三つのＣＤＲおよび四つのＦＲから成っており、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。   The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions called “complementarity determining regions” (“CDRs”) interspersed with more conserved regions called “framework regions” (FR). The framework regions and CDR ranges are precisely defined (Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Institute, Fifth Edition, US Department of Health. , NIH Publication No. 91-3242 and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). The Kabat definition is used herein. Each of VH and VL typically consists of three CDRs and four FRs, arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The

「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインをいう。免疫グロブリンドメインは、典型的には約７つのβストランドから構成される二つのβシート、および保存されたジスルフィド結合を含む（例えば、Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ａ．Ｎ． Ｂａｒｃｌａｙ １９８８ Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照）。免疫グロブリン可変領域の超可変ループの標準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５） ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１８）：４６２８−３８に記載されるように、その配列から推測され得る。   “Immunoglobulin domain” refers to a domain derived from the variable or constant domain of an immunoglobulin molecule. The immunoglobulin domain typically includes two β-sheets composed of about seven β-strands and a conserved disulfide bond (eg, AF Williams and AN Barclay 1988 Ann. Rev Immunol). .6: 381-405). The standard structure of the hypervariable loop of the immunoglobulin variable region is described in Chothia et al. (1992) J. MoI. Mol. Biol. 227: 799-817; Tomlinson et al. (1992) J. MoI. Mol. Biol. 227: 776-798); and Tomlinson et al. (1995) EMBO J. et al. 14 (18): 4628-38 can be deduced from the sequence.

本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成し得るアミノ酸配列をいう。例えばこの配列は、天然の可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含み得る。例えばこの配列は、一つ、二つまたはそれ以上のＮまたはＣ末端アミノ酸、内部アミノ酸を除外し得、一つ以上の挿入物または付加的な末端アミノ酸を含み得、あるいは他の改変物を含み得る。一実施形態において、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と会合して、標的結合構造物（または「抗原結合部位」）、例えばＴｉｅ１と相互作用する（例えばＴｉｅ１へ結合するか、またはＴｉｅ１を阻害する）構造物を形成し得る。   As used herein, an “immunoglobulin variable domain sequence” refers to an amino acid sequence that can form the structure of an immunoglobulin variable domain. For example, the sequence can include all or part of the amino acid sequence of a natural variable domain. For example, the sequence may exclude one, two or more N or C terminal amino acids, internal amino acids, may include one or more inserts or additional terminal amino acids, or may include other modifications. obtain. In one embodiment, a polypeptide comprising an immunoglobulin variable domain sequence associates with another immunoglobulin variable domain sequence and interacts with a target binding structure (or “antigen binding site”), eg, Tie1 (eg, Tie1). Or a structure that inhibits Tie1).

抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖定常領域の全てまたは一部をさらに含むことで、それぞれ免疫グロブリン重鎖または軽鎖を形成し得る。一実施形態において、抗体は二つの免疫グロブリン重鎖および二つの免疫グロブリン軽鎖からなる四量体であり、これらの免疫グロブリン重鎖または軽鎖は、例えばジスルフィド結合により相互に結びついている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の三つのドメインを含む。軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および典型的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）等の宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。用語「抗体」とは、ＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（ならびにそれらのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンの軽鎖は、κまたはλ型であり得る。一実施形態において、抗体は、グリコシル化している。抗体は、抗体依存性細胞毒性および／または補体媒介細胞毒性に対して機能し得る。   The VH or VL chain of an antibody can further comprise all or part of a heavy or light chain constant region, to form an immunoglobulin heavy or light chain, respectively. In one embodiment, the antibody is a tetramer composed of two immunoglobulin heavy chains and two immunoglobulin light chains, which immunoglobulin heavy or light chains are linked to each other by, for example, disulfide bonds. The heavy chain constant region includes three domains, CH1, CH2 and CH3. The light chain constant region includes a CL domain. The variable region of the heavy and light chains contains a binding domain that interacts with an antigen. The constant region of an antibody typically mediates the binding of the antibody to host tissues or factors such as diverse cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component of the typical complement system (Clq). . The term “antibody” includes intact immunoglobulins of type IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (and their subtypes). The light chain of an immunoglobulin can be of the kappa or lambda type. In one embodiment, the antibody is glycosylated. The antibody may function against antibody-dependent cytotoxicity and / or complement-mediated cytotoxicity.

抗体の一つ以上の領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、一つ以上の可変領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、一つ以上のＣＤＲが、ヒトのもの（例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３）であり得る。各軽鎖ＣＤＲは、ヒトものであり得る。ＨＣ ＣＤＲ３は、ヒトものであり得る。一つ以上のフレームワーク領域が、ヒトのもの（例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）であり得る。一実施形態において、全てのフレームワーク領域はヒトのもの（例えば、ヒトの体細胞、例えば免疫グロブリンを産生する造血細胞、または非造血細胞に由来する）であり得る。一実施形態において、ヒト配列は、例えば生殖細胞系核酸によりコードされる生殖細胞系配列である。一つ以上の定常領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。別の実施形態において、フレームワーク領域（例えば、集団的にＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、または集団的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）または抗体全体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％または９８％がヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は、集団的に、軽鎖または重鎖配列をコードする座のヒト生殖細胞系Ｖセグメントによりコードされるヒト配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。   One or more regions of an antibody can be human and effectively human. For example, the one or more variable regions can be human and effectively human. For example, the one or more CDRs can be human (eg, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, and LC CDR3). Each light chain CDR can be human. The HC CDR3 can be human. One or more framework regions can be human (eg, FR1, FR2, FR3 and FR4 of HC or LC). In one embodiment, all framework regions can be human (eg, derived from human somatic cells, eg, hematopoietic cells that produce immunoglobulins, or non-hematopoietic cells). In one embodiment, the human sequence is a germline sequence, eg, encoded by a germline nucleic acid. One or more of the constant regions can be human and effectively human. In another embodiment, at least 70%, 75%, 80%, 85% of the framework regions (eg, collectively FR1, FR2 and FR3, or collectively FR1, FR2, FR3 and FR4) or the whole antibody, 90%, 92%, 95% or 98% can be human, and effectively human. For example, FR1, FR2 and FR3 are collectively at least 70%, 75%, 80%, 85% of a human sequence encoded by a human germline V segment at a locus encoding a light or heavy chain sequence. , 90%, 92%, 95%, 98% or 99% identical.

抗体の全てまたは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによりコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン軽鎖（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）にて可変領域遺伝子によりコードされ、ＣＯＯＨ末端にてκまたはλ定常領域遺伝子によりコードされている。全長免疫グロブリン重鎖（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、同様に可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記の定常領域遺伝子のうちの一つ、例えばγ（約３３０アミノ酸をコードする）によりコードされている。軽鎖は、軽鎖可変ドメインを含む任意のポリペプチドをいう。重鎖は、重鎖可変ドメインを含む任意のポリペプチドをいう。 All or part of an antibody can be encoded by an immunoglobulin gene or a segment thereof. Exemplary human immunoglobulin genes include κ, λ, α (IgA1 and IgA2), γ (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε, and μ constant region genes, and the myriad immunoglobulin variable region genes. Can be mentioned. A full-length immunoglobulin light chain (about 25 Kd or 214 amino acids) is encoded by a variable region gene at the NH 2 terminus (about 110 amino acids) and by a κ or λ constant region gene at the COOH terminus. A full-length immunoglobulin heavy chain (approximately 50 Kd or 446 amino acids) is similarly encoded by a variable region gene (approximately 116 amino acids) and one of the other above constant region genes, eg, γ (encoding approximately 330 amino acids). Has been. Light chain refers to any polypeptide comprising a light chain variable domain. Heavy chain refers to any polypeptide comprising a heavy chain variable domain.

全長抗体（または単に「抗体部分」または「フラグメント」）の「抗原結合フラグメント」との用語は、本明細書中で使用される場合、目的の標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の一つ以上のフラグメントをいう。全長抗体の「抗原結合フラグメント」との用語に包含される結合フラグメントの例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）官能性を保持する単離された相補性決定ドメイン（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの二つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、それらは組換え法を使用して、合成リンカーにより結合され得る。この合成リンカーは、ＶＬおよびＶＨ領域が対となり、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知の一価分子を形成する単一タンパク質鎖として、これらの領域が作製されることを可能とする。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。 The term “antigen-binding fragment” of a full-length antibody (or simply “antibody portion” or “fragment”), as used herein, is a full-length antibody that retains the ability to specifically bind to a target of interest. One or more fragments. Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding fragment” of a full-length antibody include: (i) Fab fragments, ie monovalent fragments consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) F (ab ′) 2 fragments, ie a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) an Fv consisting of the VL and VH domains of the single arm of the antibody Fragments; (v) dAb fragments consisting of VH domains (Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546); and (vi) isolated complementarity determining domains (CDRs) that retain functionality . Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by separate genes, they can be joined by a synthetic linker using recombinant methods. This synthetic linker allows the VL and VH regions to be paired and make these regions as a single protein chain that forms a monovalent molecule known as a single chain Fv (scFv). For example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883.

抗体フラグメントは、当業者に公知の従来的な技術を含む任意の適切な技術を使用して得られる。用語「単一特異性抗体」とは、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語は、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含み、本明細書中で使用される場合、単一の分子組成を有する抗体またはそのフラグメントの調製物をいう。本明細書中で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。   Antibody fragments are obtained using any suitable technique, including conventional techniques known to those skilled in the art. The term “monospecific antibody” refers to an antibody that exhibits a single binding specificity and affinity for a particular target, eg, epitope. The term includes “monoclonal antibodies” or “monoclonal antibody compositions” and, as used herein, refers to a preparation of antibodies or fragments thereof having a single molecular composition. As used herein, “isotype” refers to the antibody class (eg, IgM or IgG1) that is encoded by heavy chain constant region genes.

一実施形態において、抗体のＨＣまたはＬＣは、ヒト生殖細胞系配列によりコードされるアミノ酸配列に対応する配列、例えばフレームワーク領域および／またはＣＤＲ中のものを含む。例えば抗体は、ヒトＤＰ４７抗体由来の配列を含み得る。一実施形態において、抗体の一つ以上のコドンが、生殖細胞系核酸配列に関して変更されるが、同一のアミノ酸配列をコードするように選択される。コドンは、例えば、特定の系において発現を最適化したり、制限酵素部位を作製したり、サイレントフィンガープリントを作製するよう選択し得る。   In one embodiment, the HC or LC of the antibody comprises a sequence corresponding to an amino acid sequence encoded by a human germline sequence, such as those in the framework regions and / or CDRs. For example, the antibody can comprise a sequence derived from a human DP47 antibody. In one embodiment, one or more codons of the antibody are altered with respect to the germline nucleic acid sequence, but are selected to encode the same amino acid sequence. Codons can be selected, for example, to optimize expression in a particular system, create restriction enzyme sites, or create a silent fingerprint.

一実施形態において、抗体ＨＣのＣＤＲ２は、ＤＰ４７のＣＤＲ２に見られるアミノ酸と同一である少なくとも１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸位置を含む。   In one embodiment, the CDR2 of antibody HC comprises at least 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid positions that are identical to the amino acids found in CDR2 of DP47.

「ヒト化」免疫グロブリン可変領域とは、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」免疫グロブリンの説明は、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号および米国特許第５，６９３，７６２号を含む。   A “humanized” immunoglobulin variable region is an immunoglobulin variable region comprising a sufficient number of human framework amino acid positions such that the immunoglobulin variable region does not elicit an immunogenic response in a normal human. Descriptions of “humanized” immunoglobulins include, for example, US Pat. No. 6,407,213 and US Pat. No. 5,693,762.

「有効なヒト」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「有効なヒト」抗体は、抗体が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトアミノ酸位置を含む抗体である。   An “effective human” immunoglobulin variable region is an immunoglobulin variable region comprising a sufficient number of human framework amino acid positions such that the immunoglobulin variable region does not elicit an immunogenic response in a normal human. An “effective human” antibody is an antibody that contains a sufficient number of human amino acid positions such that the antibody does not elicit an immunogenic response in a normal human.

本明細書においては、「Ｔｉｅ複合体」とはＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチン（Ａｎｇ）を包含するヘテロマー複合体を指す。複合体はＴｉｅ１およびＴｉｅ２の細胞外ドメインの会合により部分的には形成され、そして更にＡｎｇも包含する。本明細書においては、「複合体メンバー」とはヘテロマーＴｉｅ複合体に包含されるタンパク質を指す。従って、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇは全て複合体メンバーである。「Ａｎｇ」という用語は全てのアンジオポエチン、例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４を包含する。ヘテロマーＴｉｅ複合体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇ以外に他のタンパク質も包含できる。複合体形成に拮抗するタンパク質またはリガンドは複合体の他のメンバーの少なくとも１つとのＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの会合を阻害または低減し、そしてこれにより、Ｔｉｅ２シグナリングおよび下流の作用、例えば新脈管形成を低減する。新脈管形成は初期の血管の形成および後期の血管のリモデリングおよび形態学的変化を包含する血管の発生（例えば血管またはリンパ管の発生）の全ての段階を包含する。   As used herein, “Tie complex” refers to a heteromeric complex that includes Tie1, Tie2, and Angiopoietin (Ang). The complex is formed in part by the association of the extracellular domains of Tie1 and Tie2, and also includes Ang. As used herein, “complex member” refers to a protein encompassed by a heteromeric Tie complex. Thus, Tie1, Tie2, and Ang are all complex members. The term “Ang” encompasses all angiopoietins such as Ang1, Ang2, Ang3 and Ang4. The heteromeric Tie complex can include other proteins besides Tie1, Tie2, and Ang. A protein or ligand that antagonizes complex formation inhibits or reduces the association of Tie1, Tie2, or Ang with at least one of the other members of the complex, and thereby Tie2 signaling and downstream effects such as angiogenesis Reduce. Angiogenesis encompasses all stages of blood vessel development (eg, blood vessel or lymphatic vessel development), including early blood vessel formation and late blood vessel remodeling and morphological changes.

本明細書においては、「アゴニスト」および「拮抗剤」という用語は特定の活性または作用の意味における特性を説明するものである。例えばＥ３またはＥ３ｂ抗体はＴｉｅ１の自己会合（例えばホモ二量体化）を促進するという意味においてアゴニストであることができ、そしてなお、ＨＵＶＥＣによるＴｉｅ複合体の形成および管形成を低減または阻害するという意味においては拮抗剤である。同様に、Ｔｉｅ１シグナリング経路の意味においてアゴニストである薬剤は内皮細胞の新芽形成、分離および管形成の意味においては拮抗剤であることができる。   As used herein, the terms “agonist” and “antagonist” describe a property in the sense of a particular activity or action. For example, an E3 or E3b antibody can be an agonist in the sense of promoting Tie1 self-association (eg, homodimerization) and still reduce or inhibit formation of Tie complexes and tube formation by HUVEC In the sense, it is an antagonist. Similarly, an agent that is an agonist in the sense of the Tie1 signaling pathway can be an antagonist in the sense of endothelial cell sprouting, separation and tube formation.

「Ｔｉｅ１エクトドメイン」という用語はＴｉｅ１タンパク質の細胞外領域、例えば配列番号２のアミノ酸２５〜７５９を概ね包含する領域を指す。他の例示される領域はＥＧＦ様ドメイン１つ以上（例えば配列番号２の２１４〜２５６、２５８〜３０３、３０３〜３４５、２１４〜３０３、２５８〜３４５または２１４〜３４５）；Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１つ以上（例えば４３〜１０５、４３〜４２６、３７２〜４２６）；フィブロネクチンＩＩＩ型リピートの１つ以上（例えば配列番号２の４４６〜５４０、５４３〜６３９、６４３〜７４４、４４６〜６３９、５４３〜７４４または４４６〜７４４）；およびこれ等の組み合わせを包含する領域である。「第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン」および「Ｉｇ１」という用語は、他のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（第２のこのようなドメイン）と相対比較して、タンパク質のアミノ末端に最も近く位置するＴｉｅ１またはＴｉｅ２における免疫グロブリン様ドメインを指す。例えばＴｉｅ１については、第１の免疫グロブリン様Ｃ２型ドメインは概ね残基４３〜概ね残基１０５に位置し、そして第２の免疫グロブリン様Ｃ２型ドメインは概ね残基３７２〜概ね残基４２６に位置する。   The term “Tie1 ectodomain” refers to the extracellular region of the Tie1 protein, eg, a region that generally includes amino acids 25-759 of SEQ ID NO: 2. Other exemplified regions are one or more EGF-like domains (eg, 214-256, 258-303, 303-345, 214-303, 258-345 or 214-345 of SEQ ID NO: 2); Ig-like C2-type domain 1 One or more (eg 43-105, 43-426, 372-426); one or more of fibronectin type III repeats (eg SEQ ID NO: 2 446-540, 543-639, 643-744, 446-639, 543-744) Or 446-744); and combinations thereof. The terms “first Ig-like C2-type domain” and “Ig1” refer to Tie1 located closest to the amino terminus of a protein relative to other Ig-like C2-type domains (second such domain). Or refers to the immunoglobulin-like domain in Tie2. For example, for Tie1, the first immunoglobulin-like C2 type domain is located at about residue 43 to about residue 105, and the second immunoglobulin-like C2 type domain is located at about residue 372 to about residue 426. To do.

本明細書中で使用される場合、「結合親和性」とは、見掛け会合定数Ｋａをいう。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。リガンドは、例えば特定の標的分子に対して少なくとも１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１または１０８Ｍ−１の結合親和性を有する。第二標的に比較して、第一標的に対するリガンドの高い親和性結合は、第二標的への結合に関するＫａ（または絶対値Ｋｄ）よりも、第一標的への結合に関する高いＫａ（または小さい絶対値Ｋｄ）により示し得る。そのような場合、リガンドは、第二標的に比較して第一標的に対する特異性を有する。結合親和性の違いは（例えば、特異性または他の比較に関して）、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍であり得る。例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、別の抗原、例えばＴｉｅ２、ＥＧＦ、フィブロネクチンまたはヒト血清アルブミンよりも少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍、優先的にＴｉｅと結合し得る。Ｔｉｅ１結合タンパク質はまた、種特異的または種一般的（例えば、二種類以上の種に由来するＴｉｅ１タンパク質に結合し得る）であり得る。 As used herein, "binding affinity" refers to the apparent association constant K a. Ka is the reciprocal of the dissociation constant (K d ). The ligand has, for example, a binding affinity of at least 10 5 M −1 , 10 6 M −1 , 10 7 M −1 or 10 8 M −1 for a particular target molecule. Compared to the second target, high affinity binding of ligand to the first target, than K for binding to the second target a (or absolute value K d), a high K a for binding to the first target ( Or it can be indicated by a small absolute value K d ). In such cases, the ligand has specificity for the first target compared to the second target. The difference in binding affinity can be at least 1.5 fold, 2 fold, 5 fold, 10 fold, 50 fold, 100 fold or 1000 fold (eg, for specificity or other comparisons). For example, the Tie1-binding protein is preferentially at least 1.5 times, 2 times, 5 times, 10 times, 50 times, 100 times or 1000 times more than another antigen such as Tie2, EGF, fibronectin or human serum albumin. Can bind to Tie. Tie1-binding proteins can also be species specific or species general (eg, can bind to a Tie1 protein from more than one species).

結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴または分光法（例えば、発光アッセイを用いる）等の種々の方法により決定され得る。これらの技術を使用して、結合または遊離のリガンドの濃度をリガンド（または標的）濃度の関数として測定し得る。結合リガンド（［結合］）の濃度は、遊離リガンド（［遊離］）の濃度および標的上のリガンドの結合部位の濃度に関連付けられ、ここで（Ｎ）は下記式による１標的分子あたりの結合部位の数である。   The binding affinity can be determined by various methods such as equilibrium dialysis, equilibrium binding, gel filtration, ELISA, surface plasmon resonance or spectroscopy (eg, using a luminescence assay). These techniques can be used to measure the concentration of bound or free ligand as a function of ligand (or target) concentration. The concentration of binding ligand ([binding]) is related to the concentration of free ligand ([free]) and the concentration of the binding site of the ligand on the target, where (N) is the binding site per target molecule according to the formula: Is the number of

［結合］＝Ｎ・［遊離］／（（１／Ｋａ）＋［遊離］）
Ｋａの定量的測定はルーチンではあるが、必ずしも正確なＫａの測定を行う必要はなく、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析等の方法を使用して決定される親和性の定性的測定値を得れば十分な場合もあるが、Ｋａに比例するので、より高い親和性が、参照よりも例えば２倍、５倍、１０倍、２０倍または５０倍高いかどうかの決定等の比較に使用し得る。結合親和性は、典型的には０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０中で評価する。 [Binding] = N · [Free] / ((1 / Ka) + [Free])
Obtained Quantitative determination of K a is a routine, it is not always necessary to measure the exact K a, for example, a qualitative measure of affinity is determined using ELISA or method of FACS analysis or the like May be sufficient, but since it is proportional to Ka, it is used for comparisons such as determining whether higher affinity is, for example, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold or 50-fold higher than the reference. obtain. Binding affinity is typically assessed in 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA and 0.005% (v / v) surfactant P20.

「単離された組成物」は、単離された組成物を入手し得る天然サンプルの少なくとも一つの成分の少なくとも９０％から取り除かれる組成物をいう。人工的または天然に生成される組成物は、種または目的の種の個体群が重量／重量で少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％純粋である場合に、「少なくとも」ある程度の純度を有する「組成物」となり得る。   An “isolated composition” refers to a composition that is removed from at least 90% of at least one component of a natural sample from which the isolated composition is available. An artificially or naturally produced composition is at least 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95% by weight / weight of a species or population of a species of interest. When it is 98% or 99% pure, it can be a “composition” having “at least” some degree of purity.

「エピトープ」は、リガンド、例えば抗原結合タンパク質（例えばＦａｂまたは抗体）が結合する標的化合物上の部位をいう。この標的化合物がタンパク質である場合、例えばエピトープは、リガンドが結合するアミノ酸を言い得る。オーバーラップするエピトープは、少なくとも一つの共通アミノ酸残基を含んでいる。   “Epitope” refers to a site on a target compound to which a ligand, eg, an antigen binding protein (eg, Fab or antibody) binds. Where the target compound is a protein, for example, an epitope can refer to an amino acid to which a ligand binds. Overlapping epitopes include at least one common amino acid residue.

本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同一」（または「実質的に相同」）とは、第一および第二のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が類似の活性を有するように、第二アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に同一または等価な（例えば、類似の側鎖、例えば保存アミノ酸置換物を有する）十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第一のアミノ酸配列またはヌクレオチ配列をいうために本明細書中で使用される。抗体の場合、第二の抗体は同じ特異性を有し、同上のものの少なくとも５０％の親和性を有する。   As used herein, the term “substantially identical” (or “substantially homologous”) means that the first and second amino acid sequences or nucleotide sequences have similar activities. To refer to a first amino acid sequence or nucleotide sequence comprising a sufficient number of amino acid residues or nucleotides that are identical or equivalent to a two amino acid sequence or nucleotide sequence (eg, having similar side chains, eg, conserved amino acid substitutions) As used herein. In the case of an antibody, the second antibody has the same specificity and at least 50% affinity than the above.

本明細書中に開示される配列に類似または相同（例えば少なくとも約８５％の配列同一性）である配列もまた、本出願の一部である。一部の実施形態において、配列同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であり得る。あるいは、核酸セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、該ストランドの補体にハイブリダイズする場合、実質的な同一性が存在する。核酸は全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製されるか、実質的に純粋な形態で存在して得る。   Sequences that are similar or homologous (eg, at least about 85% sequence identity) to the sequences disclosed herein are also part of this application. In some embodiments, the sequence identity is about 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more obtain. Alternatively, substantial identity exists when a nucleic acid segment hybridizes to the complement of the strand under selective hybridization conditions (eg, highly stringent hybridization conditions). The nucleic acid can be present in whole cells, in cell lysates, or partially purified or present in substantially pure form.

二つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これらの用語は本明細書中で相互交換可能に使用される）の算定は、下記のとおり実施される。それら配列は、最適な比較の目的のために配列する（例えば、最適配列のために、第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一つまたは両方にギャップを導入し得、比較の目的のために、非相同配列を無視し得る）。好ましい実施形態において、比較の目的のために配列される参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、よりさらに好ましくは少なくとも６０％、よりさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列中の位置が、第二配列中の対応する位置として、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、それらの分子はその位置において同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同義である）。二つの配列間の相同性パーセントは、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、二つの配列の最適配列のために導入される必要のある配列により共有される同一位置の数の関数である。   Calculations of “homology” or “sequence identity” between two sequences (the terms are used interchangeably herein) are performed as follows. The sequences are arranged for optimal comparison purposes (e.g., for optimal sequences, gaps may be introduced in one or both of the first and second amino acid or nucleic acid sequences, for comparison purposes) And non-homologous sequences can be ignored). In a preferred embodiment, the length of a reference sequence arranged for comparison purposes is at least 30%, preferably at least 40%, more preferably at least 50%, even more preferably at least at least the length of the reference sequence. 60%, even more preferably at least 70%, 80%, 90%, 100%. The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position (as used herein, Amino acid or nucleic acid “identity” is synonymous with amino acid or nucleic acid “homology”). The percent homology between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences that need to be introduced for the optimal sequence of the two sequences, taking into account the number of gaps and the length of each gap. It is.

配列の比較および二配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、二アミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスかまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウエイトを使用して、ＧＳＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して決定する。さらに別の好ましい実施形態において、二ヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウエイトを使用して、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定する。特に好ましいパラメーターの組（および分子が、本明細書中に記載される配列同一性または相同性制限の範囲にある場合に、どのパラメーターを決定に適用するか不確かな場合に用いられるべきパラメーター組）は、ギャップペナルティー１２、ギャップ拡張ペナルティー４およびフレームシフトギャップペナルティー５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。   Comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a mathematical algorithm. In a preferred embodiment, the percent identity between two amino acid sequences is calculated as either a Blossum 62 matrix or a PAM250 matrix, and a gap weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6 or 4 and 1, 2, 3, 4, 5 Alternatively, a length of 6 is used and determined using the Needleman and Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453) algorithm incorporated into the GAP program of the GSG software package. In yet another preferred embodiment, the percent identity between two nucleotide sequences is determined by NWSgapdna. Determine using the GAP program in the GCG software package using the CMP matrix and 40, 50, 60, 70 or 80 gap weights and 1, 2, 3, 4, 5 or 6 length weights. A particularly preferred set of parameters (and the set of parameters to be used when it is uncertain which parameters apply to a determination when the molecule is within the sequence identity or homology limits described herein) Is a Blossum 62 scoring matrix using gap penalty 12, gap extension penalty 4, and frame shift gap penalty 5.

本明細書中で使用される場合、用語「相同」とは、「類似」と同義であり、目的の配列が、一つ以上のアミノ酸置換物の存在により参照配列と異なることを意味する（但し、適度のアミノ酸挿入または欠損は存在し得る）。参照配列に対する相同性または類似性の程度を算定する現在のところ好ましい手段は、それぞれの場合で、算定された配列関連性の有意性を決定するためのアルゴリズムデフォルトまたは推奨されるパラメーターを使用したＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤから入手可能）を使用することによる。二アミノ酸配列間または二ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、ギャップ長さペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７）のアルゴリズムを使用しても決定し得る。   As used herein, the term “homologous” is synonymous with “similar” and means that the sequence of interest differs from the reference sequence by the presence of one or more amino acid substitutions (provided that Moderate amino acid insertions or deletions may exist). The currently preferred means of calculating the degree of homology or similarity to a reference sequence is in each case BLAST using algorithm defaults or recommended parameters to determine the significance of the calculated sequence relatedness By using an algorithm (available from the National Center of Biotechnology Information (NCBI), National Institutes of Health, Bethesda MD). The percent identity between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences is calculated using the PAM120 weight residue table, gap length penalty 12 and gap penalty 4 using the E. coli program incorporated into the ALIGN program (version 2.0). Meyers and W.M. It can also be determined using the algorithm of Miller ((1989) CABIOS, 4: 11-17).

本明細書中で使用される場合、用語「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。水性法および非水性法がこの引用文献に記載されており、いずれの方法も使用し得る。本明細書中で言及されるハイブリダイゼーションの具体的な条件は、以下のとおりである：１）約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの二回の洗浄（洗浄の温度は、低ストリンジェンシー条件では５５℃まで上昇させ得る）；２）約４５℃での６×ＳＳＣ中の中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄；３）約４５℃での６×ＳＳＣ中の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄；および４）非常に高いストリンジェンシー条件は、６５℃の０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、それに続く６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄。   As used herein, the term “hybridizes under low stringency, moderate stringency, high stringency, or very high stringency conditions” describes conditions for hybridization and washing. . Guidelines for carrying out hybridization reactions can be found in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N .; Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Aqueous and non-aqueous methods are described in this reference and either method can be used. Specific conditions for hybridization referred to herein are as follows: 1) Low stringency hybridization conditions in 6 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C. Subsequent two washes with 0.2 × SSC, 0.1% SDS at least 50 ° C. (the temperature of the wash can be increased to 55 ° C. under low stringency conditions); 2) at about 45 ° C. Medium stringency hybridization conditions in 6 × SSC, followed by one or more washes with 0.2 × SSC at 60 ° C., 0.1% SDS; 3) high in 6 × SSC at about 45 ° C. Stringency hybridization conditions, followed by one or more washes with 0.2 × SSC, 0.1% SDS at 65 ° C .; and 4) very high stringers Sea conditions, sodium 65 ° C. 0.5M phosphate, 7% SDS, and washing one or more times with 0.2 × SSC, 1% SDS at subsequent 65 ° C. to it.

本明細書中に記載されるタンパク質は、本明細書中に記載される特定のタンパク質に対し、機能に対して実質的な効果を有さない変異（例えば、保存アミノ酸置換または非必須アミノ酸置換）を有し得ることが理解される。特定の置換が許容されるかどうか、つまり、結合活性等の所望の生物学的特性に悪影響を与えるかどうかを、Ｂｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０に記載されるように決定し得る。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。例えば、フレームワークおよびＣＤＲアミノ酸残基が、一つ以上の同類置換を含むことが可能である。   The proteins described herein are mutations that do not have a substantial effect on function (eg, conservative amino acid substitutions or non-essential amino acid substitutions) relative to the specific proteins described herein. It is understood that Whether certain substitutions are permissible, ie, adversely affect a desired biological property such as binding activity, can be determined as described in Bowie et al. (1990) Science 247: 1306-1310. . A “conservative amino acid substitution” is an amino acid substitution in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. A family of amino acid residues having similar side chains has been defined in the art. These families include amino acids with base side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains (eg, glycine, asparagine) , Glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids having non-polar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), amino acids having β-branched side chains (eg, threonine) , Valine, isoleucine) and amino acids having aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). For example, framework and CDR amino acid residues can contain one or more conservative substitutions.

「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を無効にすることなく、さらに好ましくは生物学的活性を実質的に変えることなく、結合物質（例えば、抗体）の野生型配列から変更させる得る残基であるが、「必須」アミノ酸残基はそのような変化を生じさせる。   “Non-essential” amino acid residues may be altered from the wild-type sequence of the binding agent (eg, antibody) without negating the biological activity, more preferably without substantially altering the biological activity. Although it is a residue, an “essential” amino acid residue causes such a change.

一般的に、「Ｘ」がアミノ酸残基を示すために用いられる場合、任意のアミノ酸（例えば２０種類の天然アミノ酸のいずれか）または少なくともその部分集合（例えば、１９種類の非システインアミノ酸のいずれか）を、その位置で使用し得る。   In general, when “X” is used to denote an amino acid residue, any amino acid (eg, any of the 20 natural amino acids) or at least a subset thereof (eg, any of the 19 non-cysteine amino acids) ) May be used at that location.

用語「ポリペプチド」または「ペプチド」（これらは相互交換可能に使用し得る）とは、ペプチド結合により連結された長さが３以上のアミノ酸、例えば３〜３０、１２〜６０、もしくは３０〜３００、または３００アミノ酸を超えるポリマーをいう。ポリペプチドは一つ以上の非天然アミノ酸を含み得る。典型的にポリペプチドは、天然アミノ酸のみを含む。「タンパク質」は、一つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。したがって、用語「タンパク質」は、ポリペプチドを包含する。タンパク質またはポリペプチドは、一種以上の改変、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化等を含み得る。用語「小さいペプチド」は、長さが３〜３０アミノ酸、例えば長さが８〜２４アミノ酸であるポリペプチドを記載するために使用され得る。   The term “polypeptide” or “peptide” (which may be used interchangeably) refers to three or more amino acids linked by peptide bonds, eg 3-30, 12-60, or 30-300. Or a polymer of more than 300 amino acids. A polypeptide can include one or more unnatural amino acids. Typically, a polypeptide contains only natural amino acids. A “protein” can include one or more polypeptide chains. Thus, the term “protein” encompasses polypeptides. A protein or polypeptide can include one or more modifications, such as glycosylation, amidation, phosphorylation, and the like. The term “small peptide” can be used to describe a polypeptide that is 3-30 amino acids in length, eg, 8-24 amino acids in length.

統計的な有意性を、任意の技術分野で公知の方法により決定し得る。例示的な統計的検定としては、スチューデントＴ試験、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ非パラメーター試験およびＷｉｌｃｏｘｏｎ非パラメーター統計的検定を含む。一部の統計的に有意な関係は、０．０５または０．０２未満のＰ値を有する。特定のリガンドは、統計的に有意な差（例えば、Ｐ値＜０．０５または０．０２）を、例えば特異性または結合性について示し得る。   Statistical significance can be determined by methods known in any technical field. Exemplary statistical tests include Student T test, Mann Whitney U non-parametric test and Wilcoxon non-parametric statistical test. Some statistically significant relationships have a P value of less than 0.05 or 0.02. Certain ligands may exhibit statistically significant differences (eg, P values <0.05 or 0.02), eg, for specificity or binding.

本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な説明および別添の特許請求の範囲からより明白となる。本発明の実施形態は、本明細書中に記載される特徴のいかなる組合せも含み得る。いかなる場合も、用語「実施形態」は、本明細書中（例えば、別の実施形態）に開示される１つ以上の他の特徴を必ずしも排除しない。本出願で引用されたすべての参考文献、特許出願および公開された特許の内容を、本明細書中で参考として明確に援用される。   Other features and advantages of the invention will become more apparent from the following detailed description and the appended claims. Embodiments of the invention can include any combination of features described herein. In any case, the term “embodiment” does not necessarily exclude one or more other features disclosed herein (eg, another embodiment). The contents of all references, patent applications and published patents cited in this application are hereby expressly incorporated by reference.

（詳細な説明）
本開示は特に、Ｔｉｅ複合体の成分、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇに結合する薬剤（結合タンパク質およびリガンドとも称する）を提供する。このような薬剤の例は、タンパク質、例えば小型ペプチド（例えば７〜２５アミノ酸の環状または線状ペプチド）、ポリペプチド（例えば少なくとも２０アミノ酸のポリペプチド）、または多重鎖のタンパク質（例えば少なくとも２つのペプチドまたはポリペプチドを包含する）を包含する。多重鎖タンパク質の例は別個の重鎖および軽鎖を有するＩｇＧ完全長抗体である。ポリペプチドの例は１本鎖抗体である。 (Detailed explanation)
The disclosure specifically provides agents (also referred to as binding proteins and ligands) that bind to components of the Tie complex, such as Tie1, Tie2, and Ang. Examples of such agents are proteins, such as small peptides (eg, 7-25 amino acid cyclic or linear peptides), polypeptides (eg, at least 20 amino acid polypeptides), or multi-chain proteins (eg, at least two peptides). Or a polypeptide). An example of a multi-chain protein is an IgG full-length antibody with separate heavy and light chains. An example of a polypeptide is a single chain antibody.

薬剤は特定の特性、例えばＴｉｅ１／Ｔｉｅ２／Ａｎｇ複合体形成に拮抗する能力、Ｔｉｅ１ホモ二量体化を促進する能力およびＴｉｅ１リン酸化を促進する能力を有するものを選択できる。例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する薬剤はヘテロマーＴｉｅ複合体の形成に拮抗するその能力に関して試験できる。この複合体の拮抗によりＴｉｅ２シグナリングおよびその下流の作用、例えば新脈管形成の促進が低減される。   Agents can be selected that have certain properties, such as the ability to antagonize Tie1 / Tie2 / Ang complex formation, the ability to promote Tie1 homodimerization and the ability to promote Tie1 phosphorylation. For example, agents that bind to Tie1, Tie2, or Ang can be tested for their ability to antagonize the formation of heteromeric Tie complexes. Antagonism of this complex reduces Tie2 signaling and its downstream actions, such as promoting angiogenesis.

Ｔｉｅ１は、膜貫通ドメインを含むレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Ｔｉｅ１は、ほぼ内皮細胞のみに存在する。したがって、Ｔｉｅ１結合タンパク質を使用して、例えば内皮細胞を特異的に認識し、または標的とし得る。また、一部のＴｉｅ１結合タンパク質を、内皮細胞と共働または拮抗させるために使用し得る。一部の実施形態において、これらのＴｉｅ１結合タンパク質は、特定の構造的特徴物（例えば下記の特徴物）、下記の特徴物の組み合わせ、および／または下記の構造的特徴物に少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに対して親和性を有する（配列は、下記の実施例１、配列番号２に与えられるアミノ酸配列に関連する）。   Tie1 is a receptor tyrosine kinase protein that contains a transmembrane domain. Tie1 is present almost exclusively in endothelial cells. Thus, Tie1-binding proteins can be used to specifically recognize or target, for example, endothelial cells. Some Tie1-binding proteins can also be used to synergize or antagonize endothelial cells. In some embodiments, these Tie1-binding proteins contain at least one amino acid in a particular structural feature (eg, a feature described below), a combination of features described below, and / or a structural feature described below. It has an affinity for the containing epitope (the sequence is related to the amino acid sequence given in Example 1, SEQ ID NO: 2 below).

Figure 2008532476
Ｔｉｅ２は膜貫通ドメインを包含するレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Ｔｉｅ２はほぼ内皮細胞上のみに存在する。従って例えば内皮細胞を特異的に認識するか、これをターゲティングするためにＴｉｅ２結合タンパク質を使用することができる。一部のＴｉｅ２結合タンパク質はまた内皮細胞の活性を調節（例えばアゴナイズまたは拮抗）するためにも使用できる。一部の実施形態においては、これ等のＴｉｅ２結合タンパク質は特定の構造的特徴、特徴の組み合わせ、および／または、構造的特徴において少なくとも１つのアミノ酸を包含するエピトープに対する親和性を有している。Ｔｉｅ２の構造的特徴の例は、２つのＩｇ様ドメイン、３つのＥＧＦ様ドメインおよび３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを包含する。
Figure 2008532476
 Tie2 is a receptor tyrosine kinase protein that includes a transmembrane domain. Tie2 exists almost only on endothelial cells. Thus, for example, a Tie2 binding protein can be used to specifically recognize or target endothelial cells. Some Tie2-binding proteins can also be used to modulate (eg, agonize or antagonize) endothelial cell activity. In some embodiments, these Tie2 binding proteins have an affinity for a particular structural feature, combination of features, and / or epitopes that include at least one amino acid in the structural feature. Examples of structural features of Tie2 include two Ig-like domains, three EGF-like domains and three fibronectin type III domains.

アンジオポエチンはＴｉｅ２に結合するリガンドのファミリーである。一部のＡｎｇ結合タンパク質（例えば抗体または人工Ａｎｇ結合タンパク質）は内皮細胞をアゴナイズまたは拮抗するために使用できる。一部の実施形態においては、これ等のＡｎｇ結合タンパク質は特定の構造的特徴、特徴の組み合わせ、および／または、構造的特徴において少なくとも１つのアミノ酸を包含するエピトープに対する親和性を有している。例示される構造的特徴は約５０アミノ酸のＮ末端領域、コイルドコイルドメインまたはフィブリノーゲン様ドメインを包含する。   Angiopoietin is a family of ligands that bind to Tie2. Some Ang binding proteins (eg, antibodies or artificial Ang binding proteins) can be used to agonize or antagonize endothelial cells. In some embodiments, these Ang binding proteins have an affinity for specific structural features, combinations of features, and / or epitopes that include at least one amino acid in the structural features. Exemplary structural features include an N-terminal region of about 50 amino acids, a coiled-coil domain or a fibrinogen-like domain.

Ａｎｇ結合タンパク質の例はＡｎｇの多量体化を阻害するタンパク質（例えば４量体を形成するＡｎｇタンパク質の能力）、Ａｎｇ−Ｔｉｅ２相互作用を阻害するタンパク質、およびＴｉｅ１−Ｔｉｅ２−Ａｎｇの三元複合体を阻害するタンパク質を包含する。阻害性のタンパク質は既存の相互作用を妨害することにより、または、相互作用の発生を防止することにより機能することができる。   Examples of Ang-binding proteins are proteins that inhibit Ang multimerization (eg, the ability of Ang proteins to form tetramers), proteins that inhibit Ang-Tie2 interactions, and Tie1-Tie2-Ang ternary complexes Including proteins that inhibit Inhibitory proteins can function by interfering with existing interactions or by preventing the occurrence of interactions.

Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２はその細胞外ドメインを介して会合し、そしてアンジオポエチン（Ａｎｇ）、例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４とのヘテロマー複合体を形成することができる。このヘテロマー複合体はＴｉｅ２により媒介される細胞内シグナリングカスケードを活性化する。即ち、このヘテロマー複合体の拮抗性の形成はＴｉｅ２シグナリングおよびその下流の作用、例えば新脈管形成を阻害することへの新しい試み方を提供する。複合体形成はＴｉｅ１またはＴｉｅ２の細胞外ドメインに結合するか、または、Ａｎｇに結合するタンパク質により拮抗されることができ、これによりその複合体へのリクルートメントを防止するか、またはその多量体化を防止する。   Tie1 and Tie2 associate through their extracellular domains and can form heteromeric complexes with angiopoietin (Ang), such as Ang1, Ang2, Ang3 and Ang4. This heteromeric complex activates the intracellular signaling cascade mediated by Tie2. Thus, the antagonistic formation of this heteromeric complex provides a new approach to inhibiting Tie2 signaling and its downstream actions such as angiogenesis. Complex formation can bind to the extracellular domain of Tie1 or Tie2 or be antagonized by a protein that binds Ang, thereby preventing recruitment to the complex or multimerization thereof To prevent.

Ｔｉｅ１に結合するタンパク質を発見するための１つの方法は、ライブラリーを準備すること、および、Ｔｉｅ１抗原またはそのフラグメントに結合するタンパク質をコードするメンバー１つ以上をライブラリーから選択することを包含する（例えば細胞外ドメイン、ＥＧＦドメイン、フィブロネクチンリピートまたはＩｇスーパーファミリードメイン（例えばＩｇ様Ｃ２型２ドメイン））。選択は多くの方法において実施できる。例えばライブラリーはディスプレイライブラリであることができる。Ｔｉｅ１にタグ付けし、組換え発現させることができる。Ｔｉｅ１を精製し、支持体、例えばアフィニティービーズまたは常磁性体ビーズまたは他の磁気的に応答する粒子に結合させる。Ｔｉｅ１はまた細胞表面上で発現させることもできる。例えばＴｉｅ１が活性化された場合にのみ細胞に特異的に結合するディスプレイライブラリのメンバーを選択できる。類似した操作法を実施することによりＴｉｅ２またはそのフラグメントに結合するタンパク質を発見することができる（例えば細胞外ドメイン、ＥＧＦドメイン、フィブロネクチンリピートまたはＩｇスーパーファミリードメイン（例えばＩｇ様Ｃ２型２ドメイン））。類似した方法を実施することによりＡｎｇまたはそのフラグメントに結合するタンパク質を発見することもできる（例えばＮ末端ドメイン、コイルドコイルドメインまたはフィブリノーゲン様ドメイン）。   One method for discovering proteins that bind to Tie1 involves preparing a library and selecting from the library one or more members that encode proteins that bind to a Tie1 antigen or fragment thereof. (Eg extracellular domain, EGF domain, fibronectin repeat or Ig superfamily domain (eg Ig-like C2 type 2 domain)). Selection can be performed in a number of ways. For example, the library can be a display library. Tie1 can be tagged and recombinantly expressed. Tie1 is purified and bound to a support, such as affinity beads or paramagnetic beads or other magnetically responsive particles. Tie1 can also be expressed on the cell surface. For example, display library members that specifically bind to cells only when Tie1 is activated can be selected. Similar procedures can be performed to find proteins that bind to Tie2 or fragments thereof (eg, extracellular domain, EGF domain, fibronectin repeat or Ig superfamily domain (eg, Ig-like C2-type 2 domain)). Similar methods can be performed to find proteins that bind to Ang or fragments thereof (eg, N-terminal domain, coiled-coil domain, or fibrinogen-like domain).

Ｔｉｅ複合体メンバーに結合できるものとして発見されたタンパク質はそのヘテロマー複合体形成に拮抗する能力、Ｔｉｅ１リン酸化を促進する能力、および／または、Ｔｉｅ１ホモ２量体形成を促進する能力について後述する実施例に記載する通り試験することができる。ヘテロマー複合体の拮抗性の形成として発見されたタンパク質はそのような治療を必要とする被験体、例えば新脈管構造依存性癌または腫瘍または他の新脈管形成関連障害を有する被験体を治療するための薬学的組成物中に使用できる。   Proteins discovered as capable of binding to Tie complex members are described below for their ability to antagonize heteromeric complex formation, ability to promote Tie1 phosphorylation, and / or ability to promote Tie1 homodimer formation. It can be tested as described in the examples. Proteins discovered as antagonistic formation of heteromeric complexes treat subjects with such treatment, such as subjects with angiogenesis-dependent cancers or tumors or other angiogenesis-related disorders Can be used in pharmaceutical compositions.

（例示されるＴｉｅ１モジュレーター）
一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質はＴｉｅ１の活性を調節できる。例えばＴｉｅ１結合タンパク質は実施例２に記載するＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験においてＴｉｅ１アゴニストまたは拮抗剤として機能できる。このＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験におけるＴｉｅ１アゴニストは特定の条件、例えばＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験の条件の下に内皮細胞の特定の活性を刺激することができる。 (Tie1 modulator exemplified)
In one embodiment, the Tie1 binding protein can modulate the activity of Tie1. For example, a Tie1 binding protein can function as a Tie1 agonist or antagonist in the Tie1 / EpoR chimeric BaF3 cell test described in Example 2. The Tie1 agonist in this Tie1 / EpoR chimeric BaF3 cell test can stimulate specific activity of endothelial cells under specific conditions, eg, conditions of the Tie1 / EpoR chimeric BaF3 cell test.

一部のＴｉｅ１結合タンパク質は内皮細胞におけるホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性および／またはＡｋｔキナーゼ活性を増大させる。Ｋｏｎｔｏｓ等はＴｉｅ１の原形質ドメインがＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットと会合してＰＩ３キナーゼ活性を活性化することができることを示唆している。Ｋｏｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２：１７０４−１７１３。Ｔｉｅ１原形質ドメインはまたタンパク質チロシンホスファターゼＳｈｐ２とも会合する。例えばＭａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４７６：３５−４６を参照できる。   Some Tie1-binding proteins increase phosphatidylinositol 3 kinase (PI3 kinase) activity and / or Akt kinase activity in endothelial cells. Kontos et al. Suggest that the protoplasmic domain of Tie1 can associate with the p85 subunit of PI3 kinase and activate PI3 kinase activity. Kontos et al. (2002) Mol. Cell. Biol. 22: 1704-1713. The Tie1 protoplasmic domain is also associated with the protein tyrosine phosphatase Shp2. For example, Marron et al. (2000) Adv. Exp. Med. Biol. 476: 35-46.

一部のＴｉｅ結合タンパク質はＴｉｅ１の原形質ドメイン、例えば概ねアミノ酸１１１７におけるモチーフＹＶＮにおけるチロシンの二量体化および／またはチロシンリン酸化（例えば自己リン酸化の結果として）を増大させる場合がある。   Some Tie binding proteins may increase tyrosine dimerization and / or tyrosine phosphorylation (eg, as a result of autophosphorylation) in the protoplasmic domain of Tie1, eg, the motif YVN at approximately amino acid 1117.

Ｔｉｅ１結合タンパク質は細胞試験において評価できる（例えば実施例２において後述するＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験において）。例示される細胞試験は成長因子レセプターの細胞内ドメインに融合されたＴｉｅ１エクトドメインを包含するキメラレセプターが発現される成長因子依存性細胞を用いる。細胞は必須成長因子の非存在下であるがただし被験化合物、例えばＴｉｅ１結合タンパク質の存在下において生育する能力について評価する。Ｔｉｅ１結合タンパク質がＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験においてＴｉｅ１をアゴナイズする場合は、Ｔｉｅ１キメラのシグナリング活性はその同族体レセプターを介して必要な成長因子による刺激の代替となりえる。即ち、必要な成長因子の非存在下における細胞の生存は、Ｔｉｅ１結合タンパク質がＴｉｅ１エクトドメインと相互作用をすることの指標として用いることができる。   Tie1-binding protein can be evaluated in cell tests (eg, in the Tie1 / EpoR chimeric BaF3 cell test described below in Example 2). An exemplary cellular test uses growth factor-dependent cells in which a chimeric receptor comprising a Tie1 ectodomain fused to the intracellular domain of the growth factor receptor is expressed. Cells are evaluated for their ability to grow in the absence of essential growth factors, but in the presence of a test compound, such as a Tie1-binding protein. When the Tie1-binding protein agonizes Tie1 in the Tie1 / EpoR chimeric BaF3 cell assay, the signaling activity of the Tie1 chimera may be an alternative to stimulation by the required growth factor through its homologous receptor. That is, cell survival in the absence of the required growth factor can be used as an indicator that the Tie1 binding protein interacts with the Tie1 ectodomain.

Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験におけるＴｉｅ１アゴニストは他の条件下、例えばインビボにおいて、Ｔｉｅ１活性の阻害剤として挙動する場合があり、そしてインビトロの特性とは無関係にインビボの新脈管形成の阻害剤として有用であってよい。   Tie1 agonists in the Tie1 / EpoR chimeric BaF3 cell assay may behave as inhibitors of Tie1 activity under other conditions, eg in vivo, and as inhibitors of in vivo angiogenesis regardless of in vitro properties May be useful.

Ｔｉｅ１結合タンパク質は例えば内皮細胞の活性を低減するために使用できる。例えば一部のＴｉｅ１結合タンパク質は内皮細胞におけるホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性、Ｓｈｐ２活性および／またはＡｋｔキナーゼ活性を低減するために使用できる。一部のＴｉｅ１結合タンパク質はまたＴｉｅ１の原形質ドメイン、例えば概ねアミノ酸１１１７におけるモチーフＹＶＮにおけるチロシンの二量体化および／またはチロシンリン酸化（例えば自己リン酸化の結果として）を低減する場合がある。   Tie1-binding proteins can be used, for example, to reduce endothelial cell activity. For example, some Tie1-binding proteins can be used to reduce phosphatidylinositol 3 kinase (PI3 kinase) activity, Shp2 activity and / or Akt kinase activity in endothelial cells. Some Tie1-binding proteins may also reduce tyrosine dimerization and / or tyrosine phosphorylation (eg, as a result of autophosphorylation) in the protoplasmic domain of Tie1, eg, the motif YVN at approximately amino acid 1117.

Ｔｉｅ１結合タンパク質は細胞試験において活性を評価できる。例えば結合タンパク質は、本明細書に記載した細胞試験（例えば実施例２において後述するＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験）において、他のリガンド、例えばＥ３抗体がＴｉｅ１活性を調節することを防止する能力について試験することができる。   Tie1-binding protein can be assessed for activity in cell tests. For example, the binding protein may be used for the ability to prevent other ligands, such as E3 antibodies, from modulating Tie1 activity in the cell tests described herein (eg, the Tie1 / EpoR chimeric BaF3 cell test described below in Example 2). Can be tested.

（ディスプレイライブラリ）
多くの方法を、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ、そのフラグメント、１つ以上のこれらのタンパク質またはそのフラグメントを含む複合体に結合するタンパク質を同定するために使用し得る。一実施形態において、ディスプレイライブラリは、そのようなタンパク質を同定するために使用される。ディスプレイライブラリは、実体の集合であり；各実体は、利用可能なタンパク質成分、およびこのタンパク質成分をコードまたは同定する回収可能な成分を含む。タンパク質成分は、任意の長さ（例えば、３アミノ酸〜３００を超えるアミノ酸）であり得る。選択において、ライブラリーの各メンバーのタンパク質成分を標的（例えば、Ｔｉｅ１タンパク質）により調べ、このタンパク質成分がその標的に結合する場合、ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば支持体上の保持により同定する。この方法を、他の標的（例えば、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ、そのフラグメント、１つ以上のこれらのタンパク質またはそれらのフラグメントを含む複合体）に適合させ得る。 (Display library)
Many methods can be used to identify proteins that bind to a complex comprising Tie1, Tie2, Ang, fragments thereof, one or more of these proteins or fragments thereof. In one embodiment, the display library is used to identify such proteins. A display library is a collection of entities; each entity includes an available protein component and a recoverable component that encodes or identifies the protein component. The protein component can be of any length (eg, 3 amino acids to over 300 amino acids). In selection, the protein component of each member of the library is examined by target (eg, Tiel protein), and if this protein component binds to that target, the display library member is identified, for example, by retention on the support. This method can be adapted to other targets (eg, complexes comprising Tie2, Ang, fragments thereof, one or more of these proteins or fragments thereof).

保持されるディスプレーライブラリーメンバーを、支持体から回収し、分析する。この分析は、類似または異なる条件下での増幅およびその後の選択を含み得る。例えば、ポジティブ選択およびネガティブ選択を交互に行い得る。この分析はまた、タンパク質成分のアミノ酸配列の決定および詳細な特性付けのためのタンパク質成分の精製を含み得る。種々のフォーマットを、ディスプレイライブラリに対して使用し得る。例としては以下が挙げられる。   Retained display library members are recovered from the support and analyzed. This analysis can include amplification under similar or different conditions and subsequent selection. For example, positive selection and negative selection can be performed alternately. This analysis may also include the determination of the amino acid sequence of the protein component and the purification of the protein component for detailed characterization. Various formats can be used for the display library. Examples include the following.

（ファージディスプレー）
一つのフォーマットは、ウイルス、特にバクテリオファージを利用する。このフォーマットは「ファージディスプレー」と呼ばれる。タンパク質成分は、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質に共有結合する。この結合は、コートタンパク質に融合させたタンパク質成分をコードする核酸の翻訳から生じる。この結合は、柔軟性のあるペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、またはストップコドンの阻害の結果として導入されるアミノ酸を含み得る。ファージディスプレーは、例えばＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１−２０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２：３７１−８；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；Ｒｅｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６７：１２９−４９；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８−７９８２に記載されている。 (Phage display)
One format utilizes viruses, particularly bacteriophages. This format is called “phage display”. The protein component is typically covalently linked to the bacteriophage coat protein. This binding results from translation of the nucleic acid encoding the protein component fused to the coat protein. This linkage may include amino acids introduced as a result of flexible peptide linkers, protease sites, or stop codon inhibition. Phage displays are described, for example, in Ladner et al. U.S. Pat. No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/010690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. MoI. Biol. Chem 274: 18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2: 371-8; Fuchs et al. (1991) Bio / Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibody Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio / Technology 9: 1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267: 129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; and Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982.

ファージディスプレーシステムは、繊維状ファージ（ファージｆ１、ｆｄおよびＭ１３）ならびに他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージおよびラムドイドファージ；例えばＳａｎｔｉｎｉ（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２：１２５−１３５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ６：１−６；Ｈｏｕｓｈｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６８：３６３−３７０を参照）について開発された。繊維状ファージディスプレーシステムは、典型的には、遺伝子ＩＩＩタンパク質等のマイナーコートタンパク質および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質、メジャーコートタンパク質への融合物を使用するが、遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、遺伝子ＩＸタンパク質またはそのドメイン等、他のコートタンパク質への融合物もまた使用し得る（例えば、ＷＯ００／７１６９４を参照）。一実施形態において、この融合は、遺伝子ＩＩＩタンパク質のドメイン、例えばアンカードメインまたは「スタンプ」への融合である（例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質アンカードメインの説明については、米国特許第５，６５８，７２７号を参照）。示されるタンパク質を、非ペプチド結合、例えば非共有結合または非ペプチド共有結合を使用して、コートに物理的に会合させ得る。例えば、ジスルフィド結合および／またはｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎコイル状コイルを、物理的会合のために使用し得る（例えば、Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：６９およびＷＯ０１／０５９５０を参照）。   Phage display systems include filamentous phage (phage f1, fd, and M13) and other bacteriophages (eg, T7 bacteriophage and ramdoid phage; eg, Santini (1998) J. Mol. Biol. 282: 125-135; Rosenberg). et al. (1996) Innovations 6: 1-6; see Housh et al. (1999) Anal Biochem 268: 363-370). Filamentous phage display systems typically use a minor coat protein such as gene III protein and a fusion to gene VIII protein, major coat protein, but gene VI protein, gene VII protein, gene IX protein or its Fusions to other coat proteins, such as domains, can also be used (see, eg, WO00 / 71694). In one embodiment, the fusion is to a domain of a gene III protein, such as an anchor domain or “stamp” (see, eg, US Pat. No. 5,658,727 for a description of a gene III protein anchor domain. reference). The indicated protein may be physically associated with the coat using non-peptide bonds, such as non-covalent bonds or non-peptide covalent bonds. For example, disulfide bonds and / or c-fos and c-jun coiled coils can be used for physical association (see, eg, Crameri et al. (1993) Gene 137: 69 and WO 01/05950).

タンパク質成分を示すバクテリオファージを生育し得、標準的なファージ調製法、例えば生育培地からのＰＥＧ析出を使用して集め得る。個々のディスプレーファージの選択後に、選択されたファージを使用して細胞を感染させることにより、選択されたタンパク質成分をコードする核酸が得られる。個々のコロニーまたはプラークを集め、核酸を単離し、配列決定し得る。   Bacteriophages exhibiting protein components can be grown and collected using standard phage preparation methods such as PEG precipitation from growth media. After selection of the individual display phage, the selected phage is used to infect cells to obtain a nucleic acid encoding the selected protein component. Individual colonies or plaques can be collected and the nucleic acid isolated and sequenced.

（細胞系ディスプレー）
さらに別のフォーマットにおいて、ライブラリーは細胞ディスプレイライブラリである。タンパク質は、細胞、例えば真核または原核細胞の表面に示される。例示的な原核細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞および胞子（例えばＬｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３６６）が挙げられる。例示的な真核細胞としては、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、ＨａｎｓｅｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。酵母表面ディスプレーは、例えば、Ｆａｂフラグメント等の免疫グロブリンタンパク質を示すために使用し得る酵母ディスプレーシステムならびに重鎖および軽鎖の組合せを生むための交配の使用を記載するＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７およびＷＯ０３／０２９４５６に記載されている。 (Cell-based display)
In yet another format, the library is a cell display library. The protein is displayed on the surface of cells, such as eukaryotic or prokaryotic cells. Exemplary prokaryotic cells include E. coli. E. coli cells, B. coli. subtilis cells and spores (eg Lu et al. (1995) Biotechnology 13: 366). Exemplary eukaryotic cells include yeast (eg, Saccharomyces cerevisiae, Shizosaccharomyces pombe, Hanseula or Pichia pastoris). Yeast surface displays are described in, for example, Boder and Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15: 553-557 and WO 03/029456.

（リボソームディスプレー）
ＲＮＡおよびこのＲＮＡによりコードされるポリペプチドは、このＲＮＡを翻訳し、発生期のポリペプチドをなお付着させているリボソームを安定化することによって物理的に会合させ得る。典型的には、高い二価Ｍｇ２＋濃度および低い温度が使用される。例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２およびＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７−９２；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４０４−３０；およびＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１（１−２）：１１９−３５を参照されたい。 (Ribosome display)
The RNA and the polypeptide encoded by the RNA can be physically associated by translating the RNA and stabilizing the ribosome to which the nascent polypeptide is still attached. Typically, high divalent Mg 2+ concentrations and low temperatures are used. See, for example, Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18: 1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328: 404-30; and Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231 (1-2): 119-35.

（ポリペプチド−核酸融合物）
別のフォーマットは、ポリペプチド−核酸融合物を利用する。共有結合させたピュロマイシン基を含むポリペプチド−核酸融合物は、例えばＲｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２２９７−１２３０２および米国特許第６，２０７，４４６号に記載されるように、ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により生じさせ得る。次いで、ｍＲＮＡをＤＮＡへと逆転写し、ポリペプチドに架橋させ得る。 (Polypeptide-nucleic acid fusion)
Another format utilizes polypeptide-nucleic acid fusions. Polypeptide-nucleic acid fusions containing covalently linked puromycin groups are described, for example, in Roberts and Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12302 and US Pat. No. 6,207,446 may be generated by in vitro translation of mRNA. The mRNA can then be reverse transcribed into DNA and crosslinked to the polypeptide.

（他のディスプレーフォーマット）
さらに別のディスプレーフォーマットは、タンパク質成分が、ポリペプチドを同定する非核酸タグに結合した非生物学的ディスプレーである。例えば、このタグは、ポリペプチドを示すビーズに結合させた化学タグまたは高周波タグであり得る（例えば、米国特許第５，８７４，２１４号を参照）。 (Other display formats)
Yet another display format is a non-biological display in which the protein component is bound to a non-nucleic acid tag that identifies the polypeptide. For example, the tag can be a chemical tag or a radio frequency tag attached to beads representing the polypeptide (see, eg, US Pat. No. 5,874,214).

ディスプレー技術はまた、結合タンパク質（例えば、標的の特定のエピトープと相互作用する抗体）を得るために使用され得る。これは、例えば、特定のエピトープが欠如するか、またはエピトープ内で（例えばアラニンにより）変異させた競合する非標的分子を使用することにより実施し得る。そのような非標的分子は、ディスプレイライブラリを標的に結合させる際に競合する分子として、または、例えば標的に対して特異的ではないディスプレーライブラリーメンバーを解離させる洗浄溶液中に捕捉するための前溶出剤として、下記のようなネガティブ選択手順に使用し得る。   Display techniques can also be used to obtain binding proteins (eg, antibodies that interact with a specific epitope of a target). This can be done, for example, by using competing non-target molecules that lack a particular epitope or are mutated within the epitope (eg, by alanine). Such non-target molecules can be pre-eluted as a competing molecule in binding the display library to the target or, for example, in a wash solution that dissociates display library members that are not specific for the target. As an agent, it can be used in the following negative selection procedures.

（反復選択）
一つの好ましい実施形態において、ディスプレイライブラリ技術を反復様式で使用する。第一のディスプレイライブラリを使用して、標的に対する一つ以上の結合タンパク質を同定する。次いで、これらのタンパク質を、例えば変異誘発法を使用して改変し、第二のディスプレイライブラリを形成する。次いで、高親和性結合タンパク質を、例えばさらに高いストリンジェンシーまたはさらに競合的な結合および洗浄条件を使用することにより、第二ライブラリーから選択する。 (Iterative selection)
In one preferred embodiment, display library technology is used in an iterative fashion. The first display library is used to identify one or more binding proteins for the target. These proteins are then modified, for example using mutagenesis, to form a second display library. High affinity binding proteins are then selected from the second library, for example by using higher stringency or more competitive binding and wash conditions.

一部の実施において、変異誘発は、公知の領域または結合インターフェースにあると思われる領域を標的とする。例えば、同定された結合タンパク質が抗体である場合、変異誘発を、本明細書中に記載されるように重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に向けさせ得る。さらに、変異誘発を、ＣＤＲの近くのまたはＣＤＲに隣接するフレームワーク領域、例えば、ＣＤＲ結合部の特に１０、５または３アミノ酸内のフレームワーク領域に向けさせ得る。抗体の場合、変異誘発を、例えば正確な段階的改善のために、１個または２〜３個のＣＤＲに限定することもできる。   In some implementations, mutagenesis targets a known region or a region that appears to be at the binding interface. For example, if the identified binding protein is an antibody, mutagenesis can be directed to the CDR region of the heavy or light chain as described herein. Furthermore, mutagenesis can be directed to framework regions near or adjacent to the CDRs, eg, framework regions within the CDR binding region, particularly within 10, 5 or 3 amino acids. In the case of antibodies, mutagenesis can also be limited to one or a few CDRs, for example for precise stepwise improvement.

一部の例示的な変異誘発技術として、エラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５）、組換え（例えば、ＵＳＳＮ １０／２７９，６３３を参照）、ランダム切断を使用するＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３８９−３９１；「核酸シャッフリング」と呼ばれる）、ＲＡＣＨＩＴＴ（商標）（Ｃｏｃｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：６４８７−６５０４）、カセット変異誘発（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）および縮重オリゴヌクレオチドの取り込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ １３：３２４５）が挙げられる。   Some exemplary mutagenesis techniques use error-prone PCR (Leung et al. (1989) Technique 1: 11-15), recombination (see, eg, USSN 10 / 279,633), random cleavage. DNA shuffling (Stemmer (1994) Nature 389-391; called “nucleic acid shuffling”), RACHITT ™ (Coco et al. (2001) Nature Biotech. 19: 354), site-directed mutagenesis (Zoller et al. (1987) Nucl Acids Res 10: 6487-6504), cassette mutagenesis (Reidhaar-Olson (1991) Methods Enzymol. 208: 564-586) and degenerate oligonucleotides. Incorporation of leotide (Griffiths et al. (1994) EMBO J 13: 3245).

反復選択の一例において、本明細書中に記載される方法を使用して、標的に対する少なくとも最少の結合特異性または最少の活性、例えば１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭを超える結合の平衡解離定数でＴｉｅ１に結合する結合タンパク質をディスプレイライブラリからまず同定する。最初に同定された結合タンパク質をコードする核酸配列を、変異の導入のための鋳型核酸として使用し、例えば、最初の結合タンパク質と比較して特性（例えば、結合親和性、反応速度または安定性）を向上させた第二結合タンパク質を同定する。   In one example of iterative selection, the methods described herein are used to bind to Tie1 with an equilibrium dissociation constant of at least minimal binding specificity or minimal activity for the target, eg, greater than 1 nM, 10 nM or 100 nM. The binding protein to be identified is first identified from the display library. The nucleic acid sequence encoding the first identified binding protein is used as a template nucleic acid for the introduction of mutations, eg properties (eg binding affinity, kinetics or stability) compared to the first binding protein To identify a second binding protein that has improved

（オフ−レート選択）
遅い解離速度は、特にポリペプチドとそれらの標的との相互作用に関して高い親和性を
予測し得るので、本明細書中に記載される方法を使用して、標的との結合相互作用に関して所望の（すなわち低下した）動態学的解離速度を有する結合タンパク質を単離し得る。 (Off-rate selection)
The slow dissociation rate can predict high affinity, particularly with respect to the interactions between polypeptides and their targets, so the methods described herein can be used to achieve the desired ( Binding proteins with a reduced kinetic dissociation rate can be isolated.

解離が遅い結合タンパク質をディスプレイライブラリから選択するために、固定した標的にライブラリーを接触させる。次いで、この固定した標的を、非特異的または弱く結合する生体分子を除去する第一溶液で洗浄する。次いで、固定した標的を、飽和量の遊離標的、すなわち粒子に結合しない標的の複製を含む第二溶液で溶出する。遊離標的は、標的から解離する生体分子に結合する。再結合は、さらに低い濃度の固定した標識に対して飽和量の遊離標的により効果的に妨げられる。   In order to select a binding protein with slow dissociation from the display library, the library is contacted with an immobilized target. The immobilized target is then washed with a first solution that removes nonspecific or weakly bound biomolecules. The immobilized target is then eluted with a second solution containing a saturating amount of free target, ie, a replica of the target that does not bind to the particles. Free targets bind to biomolecules that dissociate from the target. Rebinding is effectively prevented by a saturating amount of free target against a lower concentration of immobilized label.

第二溶液は、実質的に生理学的またはストリンジェントである溶液条件を有し得る。典型的には、第二溶液の溶液条件は第一溶液の溶液条件と同一である。第二溶液の分画は、後の分画から先のものを区別するために時間的順序で集められる。後の分画は先の分画中の生体分子よりも標的から遅い速度で解離する生体分子を含む。また、長期のインキュベーション後でさえも標的に結合したままであるディスプレーライブラリーメンバーを回収することも可能である。これらはカオトロピック条件を使用して解離させるか、もしくは標的に結合させながら増幅し得る。例えば、標的に結合したファージを、細菌細胞に接触させ得る。   The second solution can have solution conditions that are substantially physiological or stringent. Typically, the solution conditions of the second solution are the same as the solution conditions of the first solution. The fractions of the second solution are collected in chronological order to distinguish the former from the later fractions. Later fractions contain biomolecules that dissociate at a slower rate from the target than biomolecules in the previous fraction. It is also possible to recover display library members that remain bound to the target even after prolonged incubation. These can be dissociated using chaotropic conditions or amplified while bound to the target. For example, phage bound to a target can be contacted with bacterial cells.

（特異性のための選択とスクリーニング）
「選択」とは、ディスプレイライブラリの多くのメンバーを標的に接触させ、結合したものを回収、増殖させるプロセスをいう。この選択は、例えば１０１０メンバーを超える多くのメンバーを有するライブラリーからの選択であり得る。「スクリーニング」とは、単離されたライブラリーメンバーを標的への結合について一つずつ調べるプロセスをいう。自動化により、数千の候補物質を高度な並行プロセスでスクリーニングし得る。本明細書中に記載されるディスプレイライブラリ選択法は、非標的分子に結合するディスプレーライブラリーメンバーを捨てる選択プロセスを含み得る。非標的分子の例として、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリードメインまたはＥＧＦドメインを含む分子の細胞外ドメイン、およびＴｉｅ１以外（例えば、Ｔｉｅ２）またはＴｉｅ２以外（例えば、Ｔｉｅ１）またはＴｉｅ１およびＴｉｅ２以外のレセプターチロシンキナーゼが挙げられる。一つの実施において、いわゆる「ネガティブ選択」工程を、標的と、関連する非標的分子と、関連するが異なる非標的分子とを区別するために使用される。ディスプレイライブラリまたはそのプールを非標的分子に接触させる。非標的に結合しないサンプルのメンバーを集め、その後の標的分子への結合のための選択か、場合によってはその後のネガティブ選択のためにも使用する。ネガティブ選択工程は、標的分子に結合するライブラリーメンバーの選択前でも選択後でもよい。 (Selection and screening for specificity)
“Selection” refers to the process of bringing many members of a display library into contact with a target and recovering and growing the bound ones. This selection can be from a library having many members, for example, more than 10 10 members. “Screening” refers to the process of examining isolated library members one by one for binding to a target. With automation, thousands of candidate substances can be screened in a highly parallel process. The display library selection methods described herein can include a selection process that discards display library members that bind to non-target molecules. Examples of non-target molecules include, for example, the extracellular domain of a molecule comprising an immunoglobulin superfamily domain or EGF domain, and a receptor tyrosine kinase other than Tie1 (eg Tie2) or other than Tie2 (eg Tie1) or other than Tie1 and Tie2. Is mentioned. In one implementation, a so-called “negative selection” process is used to distinguish between targets, related non-target molecules, and related but different non-target molecules. The display library or pool thereof is contacted with non-target molecules. Sample members that do not bind to the non-target are collected and used for subsequent selection to the target molecule or, in some cases, for subsequent negative selection. The negative selection step may be before or after selection of the library member that binds to the target molecule.

別の実施において、スクリーニング工程を使用する。ディスプレーライブラリーメンバーを標的分子との結合のために単離した後に、各単離ライブラリーメンバーを、非標識分子（例えば、上記の非標的）との結合能力について調べる。例えば、高スループットＥＬＩＳＡスクリーニングを、このデータを得るために使用し得る。また、ＥＬＩＳＡスクリーニングを、標的に対する各ライブラリーメンバーの結合に関する定量的なデータを得るために使用し得る。非標的結合データおよび標的結合データを比較して（例えば、コンピュータおよびソフトウエアを使用して）、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ、そのフラグメント、または１つ以上のそのような成分を含む複合体に特異的に結合するライブラリーメンバーを同定する。   In another implementation, a screening step is used. After the display library member is isolated for binding to the target molecule, each isolated library member is examined for the ability to bind to an unlabeled molecule (eg, the non-target described above). For example, a high throughput ELISA screen can be used to obtain this data. An ELISA screen can also be used to obtain quantitative data regarding the binding of each library member to the target. Compare non-target binding data and target binding data (eg, using a computer and software) specific to Tie1, Tie2, Ang, a fragment thereof, or a complex containing one or more such components Identify library members that bind to.

本明細書中に記載されるディスプレイライブラリの選択およびスクリーニング法は、標的分子上の特定の部位に結合するディスプレーライブラリーメンバーについての選択または選択するスクリーニングプロセスを含み得る。例えば、高濃度の本明細書中に記載される抗体による溶出を使用して、溶出に使用された抗体が結合するエピトープに近いか、またはそれにオーバーラップするエピトープに結合するファージを選択し得る。したがって、緩衝液中にＥ３抗体の使用の有無に関わらずＥＬＩＳＡを実施することにより、Ｔｉｅ１のＥ３結合部位に結合するファージがスクリーニングし得る。   The display library selection and screening methods described herein may include a screening process that selects or selects for display library members that bind to specific sites on the target molecule. For example, elution with high concentrations of the antibodies described herein can be used to select phage that bind to an epitope that is close to or overlaps with the epitope to which the antibody used for elution binds. Therefore, phages that bind to the E3 binding site of Tie1 can be screened by performing an ELISA with or without E3 antibody in the buffer.

以下の記載は、ファージミドＦａｂライブラリーを使用して、Ｔｉｅ１に結合する抗体を同定する一つの例示的方法を提供する。例えば、三回の選択を、標的タンパク質の減少量（例えば、一回目、二回目および三回目でそれぞれ１００μｇ、５０μｇおよび５０μｇ）を用いて実施し得る。標的はストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に固定化する。ライブラリーを、各回の選択前のストレプトアビジン被覆磁気ビーズに対して、および必要に応じて共通の精製ハンドルを含み得る無関係のタンパク質に対して除去（ｄｅｐｌｅｔｅ）する。例えば、標的がＦｃドメインとの融合物として生成される場合、ライブラリーを可溶性Ｔｒａｉｌ−Ｆｃ（市販のＦｃ融合タンパク質）に対して除去し得る。この除去プロセスはＦｃバインダーを除去する。   The following description provides one exemplary method for identifying antibodies that bind to Tiel using a phagemid Fab library. For example, three selections may be performed using a target protein reduction (eg, 100 μg, 50 μg and 50 μg for the first, second and third, respectively). The target is immobilized on streptavidin-coated magnetic beads (Dynal). The library is depleted against streptavidin-coated magnetic beads prior to each round of selection and, optionally, to unrelated proteins that may include a common purification handle. For example, if the target is generated as a fusion with an Fc domain, the library can be removed against soluble Trail-Fc (a commercially available Fc fusion protein). This removal process removes the Fc binder.

各回の選択は、例えば、２サイクルのストレプトアビジン磁気ビーズ除去、１サイクルのファージのＴｉｅ１被覆ビーズへの結合、１０サイクルの洗浄、結合ファージの溶出、および次回のために濃縮したファージの増殖を含み得る。１０回の洗浄後、Ｔｉｅ１被覆ビーズに結合したファージを直接的に増幅し得るか、または増幅前に溶出し得る。三回の選択後、個々のクローンを９６ウエルマイクロタイタープレートで生育させ、ファージＥＬＩＳＡによりＴｉｅ１結合活性について個々にスクリーニングし得る。ＥＬＩＳＡは、Ｔｉｅ１、特異性コントロールおよび関連のないコントロールへの結合の評価を含み得る。単離物を、選択プロセスから生じる多様性を決定するためにＤＮＡフィンガープリンティングし得る。例えばポジティブ単離物は、オリゴヌクレオチドプライマーＭ１３リバースおよび遺伝子ＩＩＩフォワードによりＰＣＲ増幅され得る（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１を参照）。生成物は、ＢｓｔＮＩフィンガープリンティングにより分析し得る。   Each round of selection includes, for example, 2 cycles of streptavidin magnetic bead removal, 1 cycle of phage binding to Tie1-coated beads, 10 cycles of washing, elution of bound phage, and growth of enriched phage for the next time. obtain. After 10 washes, the phage bound to the Tiel coated beads can be amplified directly or eluted before amplification. After three rounds of selection, individual clones can be grown in 96 well microtiter plates and individually screened for Tiel binding activity by phage ELISA. The ELISA can include assessment of binding to Tiel, specificity controls and unrelated controls. Isolates can be DNA fingerprinted to determine the diversity resulting from the selection process. For example, positive isolates can be PCR amplified with oligonucleotide primers M13 reverse and gene III forward (see, eg, Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581). The product can be analyzed by BstNI fingerprinting.

結合タンパク質を示すファージによるＥＬＩＳＡを実施する例示的な方法は、以下のとおりである。個々のクローンを生育させ、既に記載されるように（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）回収し得る。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ中ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（商標）ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）１μｇ／ウェルで被覆し、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳで３回洗浄後、１００μＬのビオチニル化Ｔｉｅ１タンパク質を固定化ストレプトアビジンと室温で３０〜６０分間結合させる。次いで、Ｔｉｅ１被覆ウェルを３００μＬの２％乳／１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（２％ＭＰＢＳＴ）で、３７℃にて２時間、ブロックする。これらのウェルを、２％ＭＰＢＳＴで室温にて一時間ブロックしておいた１００μＬのファージ培養上清とともにインキュベートする。ウェルを１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０．１％（ＰＢＳＴ）で５回洗浄し、抗Ｍ１３−ＨＲＰ第二抗体の１：５，０００希釈物１００μＬとともに、室温にて１時間、インキュベートする。これらのウェルを、ＴＭＢ溶液による展開前にＰＢＳＴで５回洗浄し、６３０ｎｍで読む。   An exemplary method for performing an ELISA with phage that displays binding protein is as follows. Individual clones can be grown and recovered as previously described (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581). For ELISA, 96-well Immulon 2HB plates (Thermo Labsystems) are coated with 1 μg / well of ImmunoPure ™ streptavidin (Pierce) in PBS and incubated overnight at 4 ° C. After washing 3 times with PBS, 100 μL of biotinylated Tiel protein is bound to immobilized streptavidin for 30-60 minutes at room temperature. Tie1-coated wells are then blocked with 300 μL of 2% milk / 1 × PBS / 0.05% Tween (2% MPBST) for 2 hours at 37 ° C. These wells are incubated with 100 μL of phage culture supernatant that has been blocked with 2% MPBST for 1 hour at room temperature. The wells are washed 5 times with 1 × PBS / Tween 0.1% (PBST) and incubated with 100 μL of a 1: 5,000 dilution of anti-M13-HRP secondary antibody for 1 hour at room temperature. These wells are washed 5 times with PBST prior to development with TMB solution and read at 630 nm.

細胞ＥＬＩＳＡのために、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳの１×１０６〜２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させる。９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＶＷＲ）の１ウェルあたり１〜２×１０５細胞の最終濃度を使用し得る。これらの細胞を、等量の０．２％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、３７℃で１２分間インキュベートすることにより固定する。次いで、自動プレート洗浄器（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、それらをＰＢＳで三回洗浄し、２００μＬの２％ＭＰＢＳＴで室温にて一時間ブロックする。このＥＬＩＳＡの残りの手順を、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０．０５％を洗浄およびインキュベーションに使用する以外は上記のように実施し得る。 For cell ELISA, cells are washed once with PBS and resuspended at a concentration of 1 × 10 6 to 2 × 10 6 cells / mL in PBS. A final concentration of 1-2 × 10 5 cells per well of a 96 well tissue culture plate (Falcon, VWR) may be used. These cells are fixed by adding an equal volume of 0.2% glutaraldehyde (Sigma-Aldrich) and incubating at 37 ° C. for 12 minutes. They are then washed three times with PBS using an automatic plate washer (Bio-Tek Instruments, Inc.) and blocked with 200 μL of 2% MPBST for 1 hour at room temperature. The remaining procedures of this ELISA can be performed as described above except that 1 × PBS / Tween 0.05% is used for washing and incubation.

（生殖細胞系抗体）
抗体の可変領域を一つ以上の生殖細胞系配列にさらに類似させるために、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、またはＡｎｇに結合する抗体（例えば、本明細書中に記載される抗体）を改変し得る。例えば、抗体は、一つ、二つ、三つまたはそれ以上のアミノ酸置換を、例えばフレームワークまたはＣＤＲ領域に含み得、それを参照生殖細胞系配列にさらに類似させ得る。一つの例示的な生殖細胞系列化方法は；単離された抗体の配列に類似する（例えば、特定のデータベースで最も類似する）一つ以上の生殖細胞系配列を同定する工程を包含し得る。次いで、（アミノ酸レベルでの）変異を、付加的に、組み合わせて、またはその両方で単離された抗体中に引き起こし得る。例えば、いくつかまたはすべての可能な生殖細胞系変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーを作る。次いで、変異抗体を評価して、例えば、単離抗体に対して一つ以上のさらなる生殖細胞系残基を有し、かつなお有用である（例えば、機能的な活性を有する）抗体を同定する。一実施形態において、できるだけ多くの生殖細胞系残基を単離抗体に導入する。 (Germline antibody)
To further resemble the variable region of the antibody to one or more germline sequences, antibodies that bind to Tie1, Tie2, or Ang (eg, the antibodies described herein) can be modified. For example, an antibody can include one, two, three or more amino acid substitutions, eg, in a framework or CDR region, which can be further similar to a reference germline sequence. One exemplary germline method can include; identifying one or more germline sequences that are similar to the sequence of the isolated antibody (eg, most similar in a particular database). Mutations (at the amino acid level) can then be induced in antibodies isolated additionally, in combination, or both. For example, a nucleic acid library is created that includes sequences encoding some or all possible germline mutations. The mutant antibody is then evaluated to identify, for example, antibodies that have one or more additional germline residues relative to the isolated antibody and that are still useful (eg, have functional activity). . In one embodiment, as many germline residues as possible are introduced into the isolated antibody.

一実施形態において、変異誘発を使用して、一つ以上の生殖細胞系残基を置換するかまたはＣＤＲ領域に挿入する。例えば、生殖細胞系ＣＤＲ残基は、改変される可変領域に対して類似（例えば、最も類似）する生殖細胞系配列からのものであり得る。変異誘発後、抗体の活性（例えば、結合または他の機能的な活性）を評価して、生殖細胞系残基（単数または複数）が許容されるかどうかを決定し得る。類似の変異誘発をフレームワーク領域内で実施し得る。   In one embodiment, mutagenesis is used to replace one or more germline residues or insert into CDR regions. For example, germline CDR residues can be from germline sequences that are similar (eg, most similar) to the variable region being modified. After mutagenesis, the activity of the antibody (eg, binding or other functional activity) can be evaluated to determine whether germline residue (s) are tolerated. Similar mutagenesis can be performed within the framework regions.

生殖細胞系配列の選択は異なる方法で実施し得る。例えば、生殖細胞系配列が、選択性または類似性についての所定の基準、例えば、少なくともある程度の割合の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を満たす場合、この生殖細胞系配列を選択し得る。選択は、少なくとも２、３、５または１０の生殖細胞系配列を使用して実施し得る。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、類似の生殖細胞系配列の同定は、そのような一つの配列を選択することを含み得る。ＣＤＲ３の場合、類似の生殖細胞系配列の同定は、そのような一つの配列を選択することを含み得るが、アミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に別個に寄与する二つの生殖細胞系配列の使用を含み得る。他の実施において、二つまたは三つ以上の生殖細胞系配列を、例えば共通配列を形成するために使用する。   The selection of germline sequences can be performed in different ways. For example, if the germline sequence is a predetermined criterion for selectivity or similarity, eg, at least some percentage of identity, eg, at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 This germline sequence may be selected if it meets%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% identity. The selection can be performed using at least 2, 3, 5 or 10 germline sequences. In the case of CDR1 and CDR2, identification of similar germline sequences can include selecting one such sequence. In the case of CDR3, identification of a similar germline sequence may involve selecting one such sequence, but the use of two germline sequences that contribute separately to the amino and carboxy terminal portions. May be included. In other implementations, two or more germline sequences are used, eg, to form a consensus sequence.

一実施形態において、特定の参照可変ドメイン配列、例えば本明細書中に記載される配列に関して、関連可変ドメイン配列が、参照ＣＤＲ配列中の残基（ヒト生殖細胞系配列（すなわち、ヒト生殖細胞系核酸によりコードされるアミノ酸配列）で対応する位置の残基と同一である残基）と同一でないＣＤＲアミノ酸位置の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を有する。   In one embodiment, for a particular reference variable domain sequence, eg, a sequence described herein, the related variable domain sequence is a residue in the reference CDR sequence (human germline sequence (ie, human germline At least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% of the CDR amino acid positions that are not identical to the residues at the corresponding positions in the amino acid sequence encoded by the nucleic acid) , 95% or 100%.

一実施形態において、特定の参照可変ドメイン配列、例えば本明細書中に記載される配列に関して、関連可変ドメイン配列が、ヒト生殖細胞系配列、例えば、参照可変ドメイン配列に関連した生殖細胞系配列からのＦＲ配列に同一であるＦＲ領域の少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を有する。   In one embodiment, with respect to a particular reference variable domain sequence, eg, a sequence described herein, the related variable domain sequence is derived from a human germline sequence, eg, a germline sequence associated with the reference variable domain sequence. Have at least 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% of the FR region that is identical to the FR sequence.

したがって、感心の所与の抗体に類似の活性を有するが、一つ以上の生殖細胞系配列、特に一つ以上のヒト生殖細胞系配列にさらに類似する抗体を単離し得る。例えば、抗体はＣＤＲ（例えばフレームワーク領域）以外の領域中の生殖細胞系配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％同一であり得る。さらに、抗体は、改変される可変領域に類似する（例えば、最も類似する）生殖細胞系配列からの生殖細胞系残基である、ＣＤＲ領域中の少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の生殖細胞系残基を含み得る。主要な関心の生殖細胞系配列はヒト生殖細胞系配列である。抗体の活性（例えば、結合活性）は元の抗体のファクター、すなわち１００、１０、５、２、０．５、０．１および０．００１の範囲内であり得る。   Thus, antibodies can be isolated that have similar activity to a given antibody of interest but are more similar to one or more germline sequences, particularly one or more human germline sequences. For example, the antibody may be at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 to germline sequences in regions other than the CDRs (eg, framework regions). %, May be 99.5% identical. In addition, the antibody has at least 1, 2, 3, 4 in the CDR regions that are germline residues from germline sequences that are similar (eg, most similar) to the variable region being modified. Or it may contain 5 germline residues. The germline sequence of primary interest is the human germline sequence. The activity (eg, binding activity) of the antibody can be within the factor of the original antibody, ie, 100, 10, 5, 2, 0.5, 0.1 and 0.001.

Ｖカッパの例示的生殖細胞系参照配列として、Ｏ１２／Ｏ２、Ｏ１８／Ｏ８、Ａ２０、Ａ３０、Ｌ１４、Ｌ１、Ｌ１５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５／Ｌ１９、Ｌ８、Ｌ２３、Ｌ９、Ｌ２４、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｏ１１／Ｏ１、Ａ１７、Ａ１、Ａ１８、Ａ２、Ａ１９／Ａ３、Ａ２３、Ａ２７、Ａ１１、Ｌ２／Ｌ１６、Ｌ６、Ｌ２０、Ｌ２５、Ｂ３、Ｂ２、Ａ２６／Ａ１０およびＡ１４が挙げられる。例えばＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１８）：４６２８−３を参照されたい。   Exemplary germline reference sequences for V kappa include O12 / O2, O18 / O8, A20, A30, L14, L1, L15, L4 / 18a, L5 / L19, L8, L23, L9, L24, L11, L12, O11 / O1, A17, A1, A18, A2, A19 / A3, A23, A27, A11, L2 / L16, L6, L20, L25, B3, B2, A26 / A10 and A14. See, for example, Tomlinson et al. (1995) EMBO J. et al. 14 (18): 4628-3.

ＨＣ可変ドメインについての生殖細胞系参照配列は、特定の標準構造、例えば、Ｈ１およびＨ２超可変ループ中の１〜３構造物を有する配列に基づき得る。免疫グロブリン可変ドメインの超可変ループの標準構造を、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１８）：４６２８−３８に記載のようにその配列から推測し得る。１〜３構造を有する例示的配列として：ＤＰ−１、ＤＰ−８、ＤＰ−１２、ＤＰ−２、ＤＰ−２５、ＤＰ−１５、ＤＰ−７、ＤＰ−４、ＤＰ−３１、ＤＰ−３２、ＤＰ−３３、ＤＰ−３５、ＤＰ−４０、７−２、ｈｖ３００５、ｈｖ３００５ｆ３、ＤＰ−４６、ＤＰ−４７、ＤＰ−５８、ＤＰ−４９、ＤＰ−５０、ＤＰ−５１、ＤＰ−５３およびＤＰ−５４が挙げられる。   Germline reference sequences for HC variable domains can be based on specific standard structures, eg, sequences having 1-3 structures in the H1 and H2 hypervariable loops. The standard structure of the hypervariable loop of an immunoglobulin variable domain is described in Chothia et al. (1992) J. MoI. Mol. Biol. 227: 799-817; Tomlinson et al. (1992) J. MoI. Mol. Biol. 227: 776-798); and Tomlinson et al. (1995) EMBO J. et al. 14 (18): 4628-38 can be deduced from the sequence. Exemplary sequences having 1-3 structures: DP-1, DP-8, DP-12, DP-2, DP-25, DP-15, DP-7, DP-4, DP-31, DP-32 , DP-33, DP-35, DP-40, 7-2, hv3005, hv3005f3, DP-46, DP-47, DP-58, DP-49, DP-50, DP-51, DP-53 and DP -54.

（多様性）
ディスプレイライブラリおよび他のライブラリーは、示されたポリペプチドの一つ以上の位置で変異を含む。所与の位置での変異は合成または天然のものであり得る。一部ライブラリーには、合成および天然の多様性の両方が含まれる。 (Diversity)
Display libraries and other libraries contain mutations at one or more positions of the indicated polypeptides. The mutation at a given position can be synthetic or natural. Some libraries include both synthetic and natural diversity.

（合成的多様性）
ライブラリーは、人工的に合成された配列を起源とする多様な核酸配列の領域を含み得る。典型的には、これらは、各所与の位置でのヌクレオチドの分布を含む縮重オリゴヌクレオチドの集団から形成される。所与の配列の包含は分布に関してランダムである。合成的多様性を生む縮重の一例は、ＮＮＮ（ここで、Ｎは等しい比率の４ヌクレオチドのいずれかである）を含むオリゴヌクレオチドである。 (Synthetic diversity)
A library can include regions of diverse nucleic acid sequences originating from artificially synthesized sequences. Typically, these are formed from a population of degenerate oligonucleotides that contain a distribution of nucleotides at each given position. The inclusion of a given sequence is random with respect to the distribution. An example of a degeneracy that produces synthetic diversity is an oligonucleotide comprising NNN, where N is any of an equal ratio of 4 nucleotides.

合成的多様性は、例えば、所与のトリヌクレオチドでの核酸配列のコドンの数をＮＮＮよりも小さい分布に限定するようにさらに阻害し得る。例えば、そのような分布は、コドンの幾つかの位置の４個未満のヌクレオチドを使用して構築し得る。さらに、トリヌクレオチド付加技術を使用して、分布をさらに阻害し得る。いわゆる「トリヌクレオチド付加技術」は、例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３、ＵＳ４，７６０，０２５およびＵＳ５，８６９，６４４に記載される。   Synthetic diversity can further inhibit, for example, to limit the number of codons of a nucleic acid sequence at a given trinucleotide to a distribution smaller than NNN. For example, such a distribution can be constructed using less than 4 nucleotides at several positions of the codon. In addition, trinucleotide addition techniques can be used to further inhibit distribution. The so-called “trinucleotide addition technology” is described in, for example, Wells et al. (1985) Gene 34: 315-323, US 4,760,025 and US 5,869,644.

（天然の多様性）
ライブラリーは、異なる天然配列を起源とする（またはそれに基づいて合成された）多様な核酸配列の領域を含み得る。ディスプレイライブラリに含み得る天然の多様性の例は、免疫細胞に存在する配列の多様性である（下記も参照）。核酸はこれらの免疫細胞から調製され、ポリペプチドディスプレーのフォーマットに取り入れられる。 (Natural diversity)
A library can include regions of diverse nucleic acid sequences that originate from (or are synthesized on) different natural sequences. An example of natural diversity that can be included in a display library is the diversity of sequences present in immune cells (see also below). Nucleic acids are prepared from these immune cells and incorporated into a polypeptide display format.

（抗体ディスプレイライブラリ）
一実施形態において、ディスプレイライブラリはタンパク質の多様なプールを表わし、各々のタンパク質は、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン可変ドメインを含む。ディスプレイライブラリは、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化」抗体を同定するのに特に有用である。そのような抗体を、内皮関連障害、例えば、転移性癌等のヒト障害を処置する治療法として使用し得る。抗体の定常領域とフレームワーク領域はヒトのものであるために、これらの治療抗体は抗原として認識され、標的とされることを自ら避け得る。また、定常領域はヒト免疫系のエフェクター機能を補充するために最適化される。インビトロのディスプレー選択プロセスは、正常なヒト免疫系が自己抗原に対する抗体を生成することができないことを克服する。 (Antibody display library)
In one embodiment, the display library represents a diverse pool of proteins, each protein comprising an immunoglobulin domain, eg, an immunoglobulin variable domain. Display libraries are particularly useful, for example, to identify human or “humanized” antibodies that recognize human antigens. Such antibodies can be used as therapeutics to treat endothelium related disorders, eg, human disorders such as metastatic cancer. Since the constant and framework regions of the antibody are human, these therapeutic antibodies can themselves be avoided as being recognized and targeted as antigens. The constant region is also optimized to supplement the effector functions of the human immune system. The in vitro display selection process overcomes the inability of the normal human immune system to generate antibodies against self antigens.

典型的な抗体ディスプレイライブラリは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むポリペプチドを示す。「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインをいう。免疫グロブリンドメインは典型的には約７つのβストランドから構成される二つのβシートおよび、保存されたジスルフィド結合を含む（例えば、Ａ．Ｆ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ａ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ １９８８ Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照）。免疫グロブリン可変領域の超可変ループの標準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１８）：４６２８−３８に記載のように、その配列から推測し得る。ディスプレイライブラリは、抗体をＦａｂフラグメント（例えば、二つのポリペプチド鎖を使用するもの）または単鎖Ｆｖ（例えば、単一のポリペプチド鎖を使用するもの）として示し得る。他のフォーマットも使用し得る。   A typical antibody display library shows a polypeptide comprising a VH domain and a VL domain. “Immunoglobulin domain” refers to a domain derived from the variable or constant domain of an immunoglobulin molecule. An immunoglobulin domain typically includes two β-sheets composed of about seven β-strands and a conserved disulfide bond (see, eg, AF Williams and AN Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6: 381-405). The standard structure of the hypervariable loop of the immunoglobulin variable region is described in Chothia et al. (1992) J. MoI. Mol. Biol. 227: 799-817; Tomlinson et al. (1992) J. MoI. Mol. Biol. 227: 776-798); and Tomlinson et al. (1995) EMBO J. et al. 14 (18): 4628-38 can be deduced from the sequence. The display library can show antibodies as Fab fragments (eg, using two polypeptide chains) or single chain Fv (eg, using a single polypeptide chain). Other formats can also be used.

Ｆａｂおよび他のフォーマットの場合のように、示された抗体は、軽鎖または重鎖の一部として定常領域を含み得る。一実施形態において、各鎖は、例えばＦａｂの場合のように、一つの定常領域を含む。他の実施形態において、さらなる定常領域が示される。   As in the case of Fab and other formats, the indicated antibodies can include a constant region as part of a light or heavy chain. In one embodiment, each chain contains one constant region, such as in the case of a Fab. In other embodiments, additional constant regions are indicated.

抗体ライブラリーを多くのプロセスにより構築し得る（例えば、ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１−２０およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２１：３７１−８を参照）。さらに、各プロセスの要素は、他のプロセスの要素と組み合わせ得る。変異が単一の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）または複数の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬ）中に導入されるように、これらのプロセスを使用し得る。変異は、例えば、重鎖および軽鎖可変ドメインのいずれかまたは両方のそのような領域に言及するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の一つ以上の領域において、免疫グロブリン可変ドメイン中に導入し得る。一実施形態において、変異を所与の可変ドメインのすべての三つのＣＤＲ中に導入する。別の好ましい実施形態において、変異を例えば重鎖可変ドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に導入する。いずれの組合せも可能である。   Antibody libraries can be constructed by a number of processes (see, for example, de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274: 18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20 and Hoogenboom et al. (See (2000) Immunol Today 21: 371-8). Further, each process element may be combined with other process elements. These processes can be used such that the mutation is introduced into a single immunoglobulin domain (eg, VH or VL) or multiple immunoglobulin domains (eg, VH and VL). Mutations can occur, for example, in immunoglobulin variable domains in one or more regions of CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 and FR4 that refer to such regions in either or both heavy and light chain variable domains. Can be introduced inside. In one embodiment, mutations are introduced into all three CDRs of a given variable domain. In another preferred embodiment, mutations are introduced into, for example, heavy chain variable domain CDR1 and CDR2. Any combination is possible.

一つのプロセスにおいて、抗体ライブラリーは、ＣＤＲをコードする多様なオリゴヌクレオチドを、核酸の対応するドメインに挿入することにより構築される。オリゴヌクレオチドはモノマーヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを使用して合成し得る。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６は、トリヌクレオチド合成およびオリゴヌクレオチドを受容するために設計された制限部位を用いた鋳型を使用してオリゴヌクレオチドをコードするＣＤＲを構築するための方法を記載している。   In one process, an antibody library is constructed by inserting various oligonucleotides encoding CDRs into the corresponding domains of the nucleic acid. Oligonucleotides can be synthesized using monomeric nucleotides or trinucleotides. For example, Knappik et al. (2000) J. Org. Mol. Biol. 296: 57-86 describes a method for constructing CDRs encoding oligonucleotides using templates with restriction sites designed to accept trinucleotide synthesis and oligonucleotides.

別のプロセスにおいて、動物、例えば、非ヒト動物（例えば、げっ歯類）をＴｉｅ１で免疫する。動物は、必要に応じて、抗原で追加免疫して、応答をさらに刺激する。次いで、脾臓細胞を動物から単離し、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸を増幅し、ディスプレイライブラリでの発現のためにクローニングする。非ヒト動物は一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列を含み得る。例えば、動物は完全なヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み得る。また、動物は不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子座を有し得る。   In another process, animals, such as non-human animals (eg, rodents) are immunized with Tiel. Animals are boosted with antigen as necessary to further stimulate the response. Spleen cells are then isolated from the animal and nucleic acids encoding the VH and / or VL domains are amplified and cloned for expression in a display library. The non-human animal can contain one or more human immunoglobulin gene sequences. For example, an animal can contain a complete human immunoglobulin locus. The animal may also have an inactivated endogenous immunoglobulin locus.

さらに別のプロセスにおいて、抗体ライブラリーは、単純な（ｎａｉｖｅ）生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト遺伝子）から増幅された核酸から構築される。この増幅された核酸はＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸を含む。免疫グロブリンをコードする核酸の供給源を以下に記載する。増幅は、例えば保存定常領域にアニールするプライマーを用いるＰＣＲ、または別の増幅方法を含み得る。   In yet another process, an antibody library is constructed from nucleic acids amplified from a native germline immunoglobulin gene (eg, a human gene). The amplified nucleic acid includes nucleic acid encoding a VH and / or VL domain. The sources of nucleic acids encoding immunoglobulins are described below. Amplification can include, for example, PCR using primers that anneal to the conserved constant region, or another amplification method.

免疫グロブリンドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸は、例えばヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダまたはげっ歯類の免疫細胞から得られる。一例において、細胞は特定の性質について選択される。成熟の多様な段階のＢ細胞を選択し得る。別の例において、Ｂ細胞はナイーブである。   Nucleic acids encoding immunoglobulin domains or fragments thereof are obtained, for example, from human, primate, mouse, rabbit, camel or rodent immune cells. In one example, the cells are selected for a particular property. B cells at various stages of maturation can be selected. In another example, the B cell is naïve.

一実施形態において、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、表面結合ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＧ分子を発現するＢ細胞を選別する。さらに、ＩｇＧの異なるアイソタイプを発現するＢ細胞を単離し得る。別の好ましい実施形態において、Ｂ細胞またはＴ細胞をインビトロで培養する。これらの細胞を、例えばフィーダー細胞とともに培養するか、またはマイトジェンもしくは他の調節剤（例えばＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ２０、酢酸ミリスチン酸ホルボール、細菌性脂質多糖体、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニンまたはアメリカヤマゴボウマイトジェン）を加えることによりインビトロで刺激し得る。   In one embodiment, fluorescence activated cell sorting (FACS) is used to sort B cells that express surface-bound IgM, IgD, or IgG molecules. In addition, B cells expressing different isotypes of IgG can be isolated. In another preferred embodiment, B cells or T cells are cultured in vitro. These cells are cultured with, for example, feeder cells or mitogens or other modulators (eg antibodies to CD40, CD40 ligand or CD20, phorbol myristate acetate, bacterial lipid polysaccharide, concanavalin A, phytohemagglutinin or American pokeweed Can be stimulated in vitro by adding mitogens.

さらに別の実施形態において、細胞を、免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、脈管炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症または抗リン脂質症候群）を有する被験体から単離する。被験体はヒトまたは動物、例えばヒト疾患用の動物モデルまたは類似の障害を有する動物であり得る。さらに別の実施形態において、細胞を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物から単離する。   In yet another embodiment, the cells are isolated from a subject having an immune disorder (eg, systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis, vasculitis, Sjogren's syndrome, systemic sclerosis or antiphospholipid syndrome). . The subject can be a human or animal, eg, an animal model for human disease or an animal with a similar disorder. In yet another embodiment, the cells are isolated from a transgenic non-human animal comprising a human immunoglobulin locus.

一つの好ましい実施形態において、細胞は体細胞超変異のプログラムを活性化している。例えば、抗免疫グロブリン、抗ＣＤ４０および抗ＣＤ３８抗体による処理によって、細胞を免疫グロブリン遺伝子の体細胞変異誘発を受けるように刺激し得る（例えば、Ｂｅｒｇｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２２２８を参照）。別の実施形態において、細胞はナイーブである。   In one preferred embodiment, the cell has activated a program of somatic hypermutation. For example, cells can be stimulated to undergo somatic mutagenesis of immunoglobulin genes by treatment with anti-immunoglobulin, anti-CD40 and anti-CD38 antibodies (see, eg, Bergthorsdottil et al. (2001) J Immunol. 166: 2228). reference). In another embodiment, the cell is naïve.

免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を、下記の例示的な方法により天然のレパートリーより単離し得る。最初に、ＲＮＡを免疫細胞から単離する。全長（すなわち、キャップされた）ｍＲＮＡを（例えば、キャップされていないＲＮＡをウシ小腸ホスファターゼにより脱リン酸化することにより）分離する。次いで、キャップをタバコ酸性ピロホスファターゼで除去し、逆転写を使用してｃＤＮＡを生成する。   Nucleic acids encoding immunoglobulin variable domains can be isolated from the natural repertoire by the following exemplary method. First, RNA is isolated from immune cells. Full length (ie, capped) mRNA is separated (eg, by dephosphorylating uncapped RNA with bovine intestinal phosphatase). The cap is then removed with tobacco acid pyrophosphatase and reverse transcription is used to generate the cDNA.

第一（アンチセンス）鎖の逆転写を、任意の適切なプライマーを用いる任意の方法により実施し得る。例えば、ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：１８２１８−３０を参照されたい。プライマー結合領域は、例えば異なるアイソタイプの免疫グロブリンを逆転写するために、異なる免疫グロブリン間で一定であり得る。プライマー結合領域はまた、特定のアイソタイプの免疫グロブリンに特異的であり得る。典型的には、プライマーは少なくとも一つのＣＤＲをコードする配列に対して３’である領域に特異的である。別の実施形態において、ポリ−ｄＴプライマーが使用され得る（そして重鎖遺伝子にとって好ましくあり得る）。   Reverse transcription of the first (antisense) strand can be performed by any method using any suitable primer. For example, de Haard et al. (1999) J. MoI. Biol. See Chem 274: 18218-30. The primer binding region can be constant between different immunoglobulins, eg, to reverse transcribe immunoglobulins of different isotypes. The primer binding region can also be specific for a particular isotype of immunoglobulin. Typically, a primer is specific for a region that is 3 'to a sequence encoding at least one CDR. In another embodiment, poly-dT primers can be used (and may be preferred for heavy chain genes).

合成配列を逆転写鎖の３’末端に連結し得る。合成配列を、逆転写後のＰＣＲ増幅中のフォワードプライマー結合のプライマー結合部位として使用し得る。合成配列の使用は、利用可能な多様性を完全に捕捉する異なるフォワードプライマーのプールを使用する必要性を回避し得る。   A synthetic sequence can be linked to the 3 'end of the reverse transcribed strand. The synthetic sequence can be used as a primer binding site for forward primer binding during PCR amplification after reverse transcription. The use of synthetic sequences may avoid the need to use a pool of different forward primers that fully capture the available diversity.

次いで、例えば、一回以上の回数で、可変ドメインをコードする遺伝子を増幅する。複数の回数を用いる場合、ネステドプライマーを、高められた正確性のために使用し得る。次いで、この増幅した核酸を、ディスプレーライブラリーベクターにクローニングする。   Next, for example, the gene encoding the variable domain is amplified one or more times. When multiple times are used, nested primers can be used for increased accuracy. The amplified nucleic acid is then cloned into a display library vector.

核酸配列を増幅する任意の方法を、増幅のために使用し得る。多様性を最大化し、多様性を偏らせない方法が好ましい。多様な技術を、核酸増幅のために使用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号、Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１３５４）は、核酸合成の一巡を駆動する多様な温度のサイクルを利用する。転写に基づく方法は、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を利用して核酸を増幅する（米国特許第６，０６６，４５７号、米国特許第６，１３２，９９７号、米国特許第５，７１６，７８５号、Ｓａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３３１−３４；Ｓｔｏｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４９１）。ＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号、米国特許第５，４０９，８１８号および米国特許第５，５５４，５１７号）は転写、逆転写、およびＲＮＡＳＥＨに基づく分解のサイクルを利用してＤＮＡサンプルを増幅する。さらに他の増幅方法は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ；米国特許第５，８５４，０３３号および米国特許第６，１４３，４９５号）および鎖置換増幅（ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号および米国特許第５，６２４，８２５号）を含む。   Any method of amplifying nucleic acid sequences can be used for amplification. A method that maximizes diversity and does not bias diversity is preferred. A variety of techniques can be used for nucleic acid amplification. The polymerase chain reaction (PCR; US Pat. No. 4,683,195 and US Pat. No. 4,683,202, Saiki, et al. (1985) Science 230, 1350-1354) drives a round of nucleic acid synthesis. Utilize various temperature cycles. Transcription based methods amplify nucleic acids using RNA synthesis with RNA polymerase (US Pat. No. 6,066,457, US Pat. No. 6,132,997, US Pat. No. 5,716,785), Sarkar et al., Science (1989) 244: 331-34; Stofler et al., Science (1988) 239: 491). NASBA (US Pat. No. 5,130,238, US Pat. No. 5,409,818 and US Pat. No. 5,554,517) utilizes a cycle of transcription, reverse transcription, and RNASEH-based degradation to make DNA Amplify the sample. Still other amplification methods include rolling circle amplification (RCA; US Pat. No. 5,854,033 and US Pat. No. 6,143,495) and strand displacement amplification (SDA; US Pat. No. 5,455,166) and U.S. Pat. No. 5,624,825).

（第二スクリーニング法）
標的に結合する候補ディスプレーライブラリーメンバーの選択後、各候補ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば標的に対するその結合性をさらに特性付けるためにさらに分析し得る。同様に、他の方法により得られる候補結合タンパク質（例えば免疫化等による）も分析し得る。各候補結合タンパク質は、一種類以上の第二スクリーニングアッセイに供し得る。アッセイは、結合的性質、触媒的性質、生理学的性質（例えば、細胞毒性、腎臓クリアランス、免疫原性）、構造的性質（例えば、安定性、立体配座、オリゴマー化状態）または別の機能的性質に関するものであり得る。同じアッセイは繰返して使用され得るが、例えばｐＨ、イオンまたは熱感受性を決定するために異なる条件で使用され得る。 (Second screening method)
After selection of candidate display library members that bind to the target, each candidate display library member can be further analyzed, for example, to further characterize its binding to the target. Similarly, candidate binding proteins obtained by other methods (eg, by immunization, etc.) can also be analyzed. Each candidate binding protein can be subjected to one or more secondary screening assays. Assays can be binding, catalytic, physiological (eg, cytotoxic, renal clearance, immunogenic), structural (eg, stability, conformation, oligomerization state) or another functional It can be related to properties. The same assay can be used repeatedly, but can be used at different conditions, for example to determine pH, ions or heat sensitivity.

適切であれば、アッセイは、ディスプレーライブラリーメンバーを直接に使用するか、あるいは示されたポリペプチドをコードする核酸から生成された組換えポリペプチド、または示されたポリペプチドの配列に基づいて合成された合成ペプチドを使用し得る。結合的性質ための例示的なアッセイは、以下を含む。   Where appropriate, assays can be used directly with display library members or synthesized based on recombinant polypeptides generated from nucleic acids encoding the indicated polypeptides, or sequences of the indicated polypeptides. Synthesized peptides can be used. Exemplary assays for binding properties include:

（ＥＬＩＳＡ）
ディスプレイライブラリによりコードされるタンパク質を、結合的性質に関してＥＬＩＳＡアッセイを使用してスクリーニングすることもできる。例えば、各タンパク質を、底表面が標的（例えば、限定量の標的）で被覆されたマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄して非特異的結合のポリペプチドを除去する。次いで、プレートに結合したタンパク質の量を、ポリペプチド（例えば、ポリペプチドのタグまたは定常部）を認識し得る抗体を用いてプレートを調べることにより決定する。抗体は、適切な基質が提供される場合に発色生成物を生成するアルカリホスファターゼ等の酵素に結合させる。タンパク質を、細胞から精製し得、または例えば繊維状バクテリオファージコートとの融合物としてディスプレーライブラリーフォーマットでアッセイし得る。あるいは、標的分子（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇ）を発現する細胞（例えば生存するものまたは固定されたもの）を、マイクロタイタープレート中にプレートし、ディスプレイライブラリに存在するか、選択によりディスプレイライブラリから得られたペプチド／抗体の親和性を調べるために使用し得る。 (ELISA)
Proteins encoded by the display library can also be screened using an ELISA assay for binding properties. For example, each protein is contacted with a microtiter plate whose bottom surface is coated with a target (eg, a limited amount of target). The plate is washed with buffer to remove non-specifically bound polypeptides. The amount of protein bound to the plate is then determined by examining the plate with an antibody capable of recognizing a polypeptide (eg, a polypeptide tag or constant portion). The antibody is conjugated to an enzyme, such as alkaline phosphatase, that produces a colored product when an appropriate substrate is provided. The protein can be purified from the cells or assayed in a display library format, eg, as a fusion with a filamentous bacteriophage coat. Alternatively, cells (eg, live or fixed) that express the target molecule (eg, Tie1, Tie2, or Ang) are plated into microtiter plates and present in the display library or optionally from the display library. It can be used to determine the affinity of the resulting peptide / antibody.

（細胞結合アッセイ）
結合タンパク質（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇ結合タンパク質）を、一つ以上の細胞タイプ、例えば内皮細胞または血小板と相互作用する能力について評価し得る。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、タンパク質と細胞との相互作用を調べる一つの例示的な方法である。この結合タンパク質を、細胞への結合前またはその後に蛍光体により直接または間接的に標識し、次いで細胞をＦＡＣＳ選別機でカウントする。 (Cell binding assay)
A binding protein (eg, Tie1, Tie2, or Ang binding protein) can be evaluated for the ability to interact with one or more cell types, eg, endothelial cells or platelets. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is one exemplary method for examining protein-cell interactions. The binding protein is labeled directly or indirectly with a fluorophore before or after binding to the cells, and the cells are then counted with a FACS sorter.

例えば、下記の方法を使用して、Ｔｉｅ１結合タンパク質が血小板または他の細胞タイプと相互作用するかどうか評価し得る。   For example, the following method can be used to assess whether a Tiel binding protein interacts with platelets or other cell types.

血小板の単離。ヒト血液は、説明を受けて同意した健康なボランティアから得られる。例えば、静脈血を１／６容量のＡＣＤ（１００ｍｌのｄＨ２Ｏ中の２．５ｇのクエン酸ナトリウム、１．５ｇのクエン酸および２．５ｇのグルコース）に集める。血液を、８００×ｇで室温にて１５分間遠心分離機で分離し、血小板に富む血漿を取り出し、３７℃にて６０分間、１ｍＭアセチルサリチル酸の存在下にインキュベートした後に、１０００×ｇで室温にて１０分間、遠心分離機で分離する。血小板のペレットを、ＨＥＰＥＳ緩衝Ｔｙｒｏｄｅ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．２％ウシ血清アルブミンおよび０．０５Ｕ／ｍＬアピラーゼ）で、２×１０８細胞／ｍｌの密度で再懸濁し得る。例えば、Ｋｏｒｎｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６５：１０，０４２−１０，０４８およびＮａｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３１０：１５５−１６２）も参照されたい。 Platelet isolation. Human blood is obtained from healthy volunteers who received explanations and agreed. For example, venous blood is collected in 1/6 volume of ACD (2.5 g sodium citrate, 1.5 g citric acid and 2.5 g glucose in 100 ml dH 2 O). The blood is separated by centrifugation at 800 × g for 15 minutes at room temperature, the platelet-rich plasma is removed and incubated at 37 ° C. for 60 minutes in the presence of 1 mM acetylsalicylic acid, then at 1000 × g to room temperature. For 10 minutes. Platelet pellets were added to HEPES buffered Tyrode solution (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 3 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4, 0.2% bovine serum albumin and 0.05 U / mL apyrase) and can be resuspended at a density of 2 × 10 8 cells / ml. For example, Kornecki et al. (1990) J Biol Chem. 265: 10,042-10,048 and Naik et al. (1995) Biochem J. et al. 310: 155-162).

ＦＡＣＳ。例えば、血小板のＦＡＣＳ分析に関し、細胞を、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（４×１０５細胞／サンプル）中、ＰＧＥ１（１ｍｇ／ｍＬ）の存在下に再懸濁し、候補Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば、約５μｇ／ｍＬ）またはコントロールとともにインキュベートし得る。２２℃での１時間のインキュベーション後に、細胞を、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、５０μＬの１／１００希釈ＦＩＴＣ標識二次抗体で処理し、３０分間氷上でインキュベートし、洗浄し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁する。サンプルをイムノサイトメトリーシステムズフローサイトメーター（ＦＡＣＳＯＲＴ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析する。例えば、Ｍａｌｇｏｒｚａｔａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９５ Ｎｏ．８（４月１５日）ｐｐ．２６００〜２６０９も参照されたい。 FACS. For example, for FACS analysis of platelets, cells are resuspended in 0.1% BSA / PBS (4 × 10 5 cells / sample) in the presence of PGE1 (1 mg / mL) and candidate Tie1 binding proteins (eg, About 5 μg / mL) or with controls. After 1 hour incubation at 22 ° C., cells were washed with 0.1% BSA / PBS, treated with 50 μL of 1/100 diluted FITC-labeled secondary antibody, incubated for 30 minutes on ice, washed, 0 Resuspend in 1% BSA / PBS. Samples are analyzed using an immunocytometry systems flow cytometer (FACSORT ™, Becton Dickinson, San Jose, Calif.). For example, Malgorzata et al. (2000) Blood, Vol. 95 No. 8 (April 15th) pp. See also 2600-2609.

さらに、単離血小板からのＳＤＳ−ｐａｇｅ分離タンパク質のウェスタン分析、および免疫沈降により血小板を評価し得る。さらに他の方法は、Ｔｉ１結合タンパク質が結合している（例えば被覆している）表面に細胞を結合する工程を包含する。   In addition, platelets can be assessed by Western analysis of SDS-page separated proteins from isolated platelets, and immunoprecipitation. Yet another method involves binding cells to a surface to which Ti1-binding protein is bound (eg, coated).

他の細胞タイプは当該技術分野で公知の方法により、ＦＡＣＳのために調製し得る。   Other cell types can be prepared for FACS by methods known in the art.

（均一結合アッセイ）
候補ポリペプチドの標的との結合性相互作用を、均一アッセイを使用して分析し得る（すなわちアッセイのすべての成分を加えた後、さらなる液体操作を必要としない）。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を均一アッセイとして使用し得る（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照）。第一分子（例えば、分画中に同定された分子）上の蛍光体標識を、その放出される蛍光エネルギーが、第二分子（例えば標識）が第一分子に接近している場合に第二分子上の蛍光標識により吸収され得るように選択する。第二分子上の蛍光標識は、それが転移エネルギーを吸収する際に蛍光を発する。標識間のエネルギー転移の効率は、それらの分子を分ける距離に関連するので、それら分子間の空間的関係を評価し得る。結合が分子間に起こる状況において、アッセイでの「レセプター」分子標識の蛍光発光を最大とすべきである。ＦＲＥＴによるモニタリングに適するように構成される結合事象は、当該技術分野で周知の標準的な蛍光検出手段により（例えば、蛍光光度計を使用して）、好都合に測定し得る。第一または第二の結合分子の量を滴定することにより、結合曲線を生成して平衡結合定数を推測し得る。 (Homogeneous binding assay)
The binding interaction of the candidate polypeptide with the target can be analyzed using a homogeneous assay (ie, no additional liquid handling is required after all components of the assay have been added). For example, fluorescence resonance energy transfer (FRET) can be used as a homogeneous assay (see, eg, Lakowicz et al., US Pat. No. 5,631,169; Stavrianopoulos et al., US Pat. No. 4,868,103). A fluorophore label on a first molecule (eg, a molecule identified in a fraction) is used to cause the emitted fluorescence energy to be second when the second molecule (eg, label) is close to the first molecule. Select such that it can be absorbed by a fluorescent label on the molecule. The fluorescent label on the second molecule fluoresces when it absorbs the transfer energy. Since the efficiency of energy transfer between labels is related to the distance separating the molecules, the spatial relationship between the molecules can be assessed. In situations where binding occurs between molecules, the fluorescence emission of the “receptor” molecule label in the assay should be maximized. Binding events configured to be suitable for monitoring by FRET can be conveniently measured by standard fluorescence detection means well known in the art (eg, using a fluorimeter). By titrating the amount of the first or second binding molecule, a binding curve can be generated to estimate the equilibrium binding constant.

（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））
ディスプレイライブラリから単離された分子と標的との結合相互作用を、ＳＰＲを私用して分析し得る。ＳＰＲまたは生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）は、いずれの相互作用物質を標識することなしにリアルタイムで生物特異的相互作用を検出する。ＢＩＡチップの結合表面における質量変化（結合事象を示す）は、表面に近い光の屈折率の変化をもたらす（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）。屈折度の変化は、生体分子間のリアルタイム反応を示すものとして測定される検出可能なシグナルを生じる。ＳＰＲを使用する方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５およびＢＬＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるオンラインリソース）に記載されている。 (Surface plasmon resonance (SPR))
Binding interactions between molecules isolated from display libraries and targets can be analyzed using SPR. SPR or biomolecular interaction analysis (BIA) detects biospecific interactions in real time without labeling any of the interactants. A change in mass at the binding surface of the BIA chip (indicating a binding event) results in a change in the refractive index of light close to the surface (surface plasmon resonance (SPR) optical phenomenon). The change in refractive index produces a detectable signal that is measured as indicative of a real-time reaction between biomolecules. Methods using SPR are described, for example, in US Pat. No. 5,641,640; Raether (1988) Surface Plasmas Springer Verlag; Sjorander and Urbanicky (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705 and BLAcore International AB (online resources provided by Uppsala, Sweden).

ＳＰＲからの情報を使用して、平衡解離定数（Ｋｄ）、および生体分子の標的への結合に関するＫｏｎとＫｏｆｆ等の動態学的パラメーターの正確で定量的な測定を提供し得る。そのようなデータを、異なる生体分子を比較するために使用し得る。例えば、異なるタンパク質を比較して、標的に対する高い親和性を有するか個体、または遅いＫｏｆｆを有する個体を同定し得る。この情報を、構造／活性の関係（ＳＡＲ）を進展させるためにも使用し得る。例えば、親タンパク質の成熟したものの動態学的パラメーターおよび平衡結合パラメーターを親タンパク質のパラメーターと比較し得る。特定の結合パラメーター、例えば高い親和性および遅いＫｏｆｆに関係する所与の位置の変異アミノ酸を同定し得る。この情報は、構造的モデル化（例えば、ホモロジーモデリング、エネルギー最少化、または結晶構造解析もしくはＮＭＲによる構造決定を使用する）と組み合わせ得る。その結果、タンパク質とその標的との物理的相互作用の理解を公式化し、他の設計プロセスを案内するために使用し得る。 Information from the SPR can be used to provide an accurate and quantitative measurement of the equilibrium dissociation constant (K d ) and kinetic parameters such as K on and K off regarding the binding of biomolecules to the target. Such data can be used to compare different biomolecules. For example, different proteins can be compared to identify individuals with high affinity for the target or individuals with a slow K off . This information can also be used to develop structure / activity relationships (SAR). For example, the kinetic parameters and equilibrium binding parameters of a mature version of the parent protein can be compared to the parameters of the parent protein. One can identify mutant amino acids at a given position that are associated with specific binding parameters, eg, high affinity and slow K off . This information may be combined with structural modeling (eg, using homology modeling, energy minimization, or crystal structure analysis or NMR structure determination). As a result, it can be used to formulate an understanding of the physical interaction between a protein and its target and guide other design processes.

（タンパク質アレイ）
ディスプレイライブラリから同定されたタンパク質を、固体支持体（例えばビーズまたはアレイ）に固定化し得る。タンパク質アレイのために、各ポリペプチドを支持体上の独自のアドレスに固定化する。典型的には、アドレスは二次元アドレスである。タンパク質アレイを以下に説明する（例えば、診断を参照）。タンパク質アレイを使用して、任意の複数のタンパク質を、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇとの相互作用に関して評価することも可能である。 (Protein array)
Proteins identified from the display library can be immobilized on a solid support (eg, a bead or array). For protein arrays, each polypeptide is immobilized at a unique address on the support. Typically, the address is a two-dimensional address. Protein arrays are described below (see, eg, Diagnosis). Using protein arrays, any plurality of proteins can be evaluated for interaction with, for example, Tie1, Tie2, or Ang.

（細胞アッセイ）
ライブラリーを宿主細胞に形質転換することにより、候補タンパク質をライブラリーから選択し得る；ライブラリーは、ディスプレイライブラリから事前に同定し得る。例えば、ライブラリーは、ポリペプチドをコードし、かつ発現を（例えばタンパク質が細胞内に産生され、細胞から分泌され、または細胞表面に結合するように）方向付けるセグメントを含むベクター核酸配列を含み得る。これらの細胞を、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇと結合する（例えば、細胞の表現型または細胞媒介活性の変化により検出されるような）タンパク質に関してスクリーニングまたは選択し得る。例えば、Ｔｉｅ１に結合する抗体の場合、その活性は自己リン酸化、ＰＩ３キナーゼの活性化、ＡＫＴの活性化、または内皮細胞活性の変化（例えば、増殖）であり得る。 (Cell assay)
Candidate proteins can be selected from the library by transforming the library into host cells; the library can be previously identified from the display library. For example, a library can include vector nucleic acid sequences that encode a polypeptide and include segments that direct expression (eg, such that the protein is produced intracellularly, secreted from the cell, or bound to the cell surface). . These cells can be screened or selected for proteins that bind to Tie1, Tie2, or Ang (eg, as detected by a change in cell phenotype or cell-mediated activity). For example, in the case of an antibody that binds to Tiel, the activity can be autophosphorylation, PI3 kinase activation, AKT activation, or a change in endothelial cell activity (eg, proliferation).

別の実施形態において、細胞のライブラリーは、細胞アレイの形を有する。細胞アレイは、任意の適切な検出可能活性に関して同様にスクリーニングし得る。他の実施形態において、競合結合アッセイを使用して、Ｔｉｅ１と結合させる参照タンパク質と競合するタンパク質を同定する。同様に、エピトープマッピングを使用して、Ｔｉｅの特定のエピトープと結合するタンパク質を同定し得る。Ｔｉｅ１のフラグメントおよび変異体を、結合タンパク質同定プロセス、例えば特性付け、スクリーニングまたは免疫化の一つ以上にも使用し得る。   In another embodiment, the library of cells has the form of a cell array. Cell arrays can be similarly screened for any suitable detectable activity. In other embodiments, a competitive binding assay is used to identify proteins that compete with a reference protein that binds to Tiel. Similarly, epitope mapping can be used to identify proteins that bind to a particular epitope of Tie. Tie1 fragments and variants may also be used in one or more of the binding protein identification processes, eg, characterization, screening or immunization.

（標的結合抗体を得る方法）
ディスプレイライブラリの使用に加えて、標的結合抗体を得るため、またはディスプレイライブラリの使用と組み合わせて他の方法を使用し得る。例えば、Ｔｉｅ１外部ドメインまたはその領域を、非ヒト動物、例えばげっ歯類における抗原として使用し得る。同様に、Ｔｉｅ２もしくはＡｎｇ、またはその領域を、非ヒト動物、例えばげっ歯類における抗原として使用し得る。 (Method for obtaining target-binding antibody)
In addition to the use of display libraries, other methods may be used to obtain target binding antibodies or in combination with the use of display libraries. For example, the Tie1 ectodomain or region thereof can be used as an antigen in non-human animals such as rodents. Similarly, Tie2 or Ang, or a region thereof, can be used as an antigen in non-human animals such as rodents.

一実施形態において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大型フラグメントを用いてマウス抗体産生を欠如するマウス系統を設計し得る。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的Ｍａｂを生成かつ選択し得る。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標），Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４），ＵＳ２００３００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号（１９９６日４月２９日出願）を参照されたい。   In one embodiment, the non-human animal includes at least a portion of a human immunoglobulin gene. For example, large strains of the human Ig locus can be used to design mouse strains that lack mouse antibody production. Hybridoma technology can be used to generate and select antigen-specific Mabs from genes with the desired specificity. See, for example, XenoMouse ™, Green et al. See Nature Genetics 7: 13-21 (1994), US2003070185, WO96 / 34096 (published Oct. 31, 1996) and PCT Application No. PCT / US96 / 05928 (filed Apr. 29, 1996).

別の実施形態において、モノクローナル抗体を、非ヒト動物から得、次いで改変、例えばヒト化または脱免疫化する。Ｗｉｎｔｅｒは、ヒト化抗体を調製するために使用し得るＣＤＲグラフト化法を記載している（英国特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ（１９８７年３月２６日出願）；Ｗｉｎｔｅｒ ＵＳ５，２２５，５３９）。特定のヒト抗体のすべてのＣＤＲが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置換されるか、またはＣＤＲの一部のみが、非ヒトＣＤＲで置換され得る。ヒト化抗体を所定の抗原に結合させるために必要とされる、ＣＤＲの数を取り替えさえすればよい。   In another embodiment, monoclonal antibodies are obtained from non-human animals and then modified, eg, humanized or deimmunized. Winter describes a CDR grafting method that can be used to prepare humanized antibodies (UK patent application GB2188638A (filed March 26, 1987); Winter US 5,225,539). All CDRs of a particular human antibody can be replaced with at least a portion of a non-human CDR, or only a portion of a CDR can be replaced with a non-human CDR. It is only necessary to replace the number of CDRs required to bind the humanized antibody to a given antigen.

ヒト化抗体を、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変ドメインからの等価な配列で置換することにより生成し得る。ヒト化抗体を生成する一般的方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７，Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４およびＱｕｅｅｎら、ＵＳ５，５８５，０８９、ＵＳ５，６９３，７６１およびＵＳ５，６９３，７６２により提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも一つからの免疫グロブリンＦｖ可変領域の全てまたは一部をコードする核酸配列を、単離、操作および発現する工程を包含する。そのような核酸の供給源は、当業者に周知であり、例えば上記のように所定の標的に対して抗体を産生するハイブリドーマから得られ得る。次いで、ヒト化抗体またはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローニングし得る。   Humanized antibodies can be generated by replacing sequences of the Fv variable region that are not directly involved in antigen binding with equivalent sequences from human Fv variable domains. General methods for generating humanized antibodies are described in Morrison, S .; L. , 1985, Science 229: 1202-1207, Oi et al. , 1986, BioTechniques 4: 214 and Queen et al., US 5,585,089, US 5,693,761 and US 5,693,762. These methods include isolating, manipulating and expressing a nucleic acid sequence encoding all or part of an immunoglobulin Fv variable region from at least one of a heavy or light chain. Such nucleic acid sources are well known to those skilled in the art and can be obtained, for example, from hybridomas that produce antibodies against a given target, as described above. The recombinant DNA encoding the humanized antibody or fragment thereof can then be cloned into an appropriate expression vector.

標的結合抗体はまた、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７（これらの内容は、本明細書中に参考として、具体的に援用される）に開示の方法によりヒトＴ細胞エピトープの特異的な欠失または「脱免疫化」により改変され得る。簡単に説明すると、抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに関して分析し得る；これらのペプチドは（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に定義されるような）潜在的なＴ細胞エピトープに相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレディング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と呼ばれるコンピュータモデル化アプローチを適用し得、さらにヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されるようなＶＨおよびＶＬ配列に存在するモチーフを求めて調べ得る。これらのモチーフは、任意の１８種類の主要なＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプに結合し、したがって、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープを、可変領域中の少数のアミノ酸残基を、好ましくは単一アミノ酸置換によって置換することで除去し得る。可能な保存的置換が行なわれる限り、ヒト生殖細胞系抗体配列中のこの位置に共通するアミノ酸を、しばしば、しかし排他的ではなく、使用し得る。ヒト生殖細胞系配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２７：７９９−８１７に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら（編）ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。脱免疫変化を同定した後、ＶＨとＶＬをコードする核酸を、変異誘発または他の合成方法（例えば、デノボ合成、カセット置換等）により構築し得る。変異誘発された可変配列は、必要に応じて、ヒト定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域）に融合させ得る。 Target binding antibodies can also be obtained by specific deletion of human T cell epitopes or by the methods disclosed in WO 98/52976 and WO 00/34317, the contents of which are specifically incorporated herein by reference. It can be modified by “deimmunization”. Briefly, the heavy and light chain variable regions of an antibody can be analyzed for peptides that bind to MHC class II; these peptides are potential (as defined in WO 98/52976 and WO 00/34317). Corresponds to a T cell epitope. For the detection of potential T cell epitopes, a computer modeling approach called “peptide threading” can be applied, and a database of human MHC class II binding peptides is also available in WO 98/52976 and WO 00/34317. The motifs present in the VH and VL sequences as described in can be determined and examined. These motifs bind to any of the 18 major MHC class II DR allotypes and therefore constitute potential T cell epitopes. Detected potential T cell epitopes can be removed by replacing a small number of amino acid residues in the variable region, preferably by a single amino acid substitution. As long as possible conservative substitutions are made, an amino acid common to this position in the human germline antibody sequence can often, but not exclusively, be used. Human germline sequences are described in Tomlinson, I .; A. et al. (1992) J. MoI. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G .; P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D .; et al. (1992) J. MoI. Mol. Bio. 227: 799-817. The V BASE directory provides a comprehensive directory of human immunoglobulin variable region sequences (Tomlinson, IA, et al. (Ed.) MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, UK). After identifying deimmunization changes, nucleic acids encoding VH and VL can be constructed by mutagenesis or other synthetic methods (eg, de novo synthesis, cassette replacement, etc.). Mutagenized variable sequences can be fused to human constant regions (eg, human IgG1 or kappa constant regions), if desired.

ある場合においては、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体機能に重要であると知られているか、予測されている残基を含む。例えば、潜在的なＴ細胞エピトープは、通常、ＣＤＲに偏向する。さらに、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体の構造および結合にとって重要なフレームワーク残基に生じ得る。これらの潜在的なエピトープを除去する変化は、ある場合では、例えば、変化する場合および変化しない場合で鎖を作製し検査することによるさらに厳密な検査を必要とする。可能な場合には、ＣＤＲにオーバーラップする潜在的なＴ細胞エピトープをＣＤＲ外での置換により除去した。ある場合では、ＣＤＲ内の変更は単なるオプションであり、したがって、この置換がある場合およびない場合の変異体を検査すべきである。他の場合には、潜在的なＴ細胞エピトープを除去するために必要とされる置換は、抗体結合に決定的であり得るフレームワーク内の残基位置にある。これらの場合、この置換がある場合およびない場合の変異体を検査すべきである。よって、ある場合では、最適な脱免疫化抗体を同定するために、いくつかの変異体脱免疫化重鎖および軽鎖可変領域を設計し、多様な重鎖／軽鎖組合せを検査する。次いで、異なる変異体の結合親和性を、脱免疫化の程度、すなわち可変領域に残る潜在的なＴ細胞エピトープの数と共に考慮することにより、最終的な脱免疫化抗体の選択を行い得る。脱免疫化は、非ヒト配列を含む抗体、例えば、ネズミの抗体または他の非ヒトモノクローナル抗体を改変するために使用され得る。脱免疫化は、ディスプレイライブラリから単離された抗体を改変するために使用され得る。   In some cases, potential T cell epitopes include residues that are known or predicted to be important for antibody function. For example, potential T cell epitopes are usually biased towards CDRs. Furthermore, potential T cell epitopes can occur at framework residues important for antibody structure and binding. Changes that remove these potential epitopes may in some cases require more rigorous inspection, for example by creating and inspecting the chains when changing and not changing. Where possible, potential T cell epitopes that overlap the CDRs were removed by substitutions outside the CDRs. In some cases, changes in the CDRs are merely optional and therefore variants with and without this substitution should be examined. In other cases, the substitution required to remove a potential T cell epitope is at a residue position within the framework that may be critical for antibody binding. In these cases, variants with and without this substitution should be examined. Thus, in some cases, several mutant deimmunized heavy and light chain variable regions are designed and various heavy / light chain combinations are examined to identify the optimal deimmunized antibody. The final deimmunized antibody selection can then be made by considering the binding affinity of the different mutants along with the degree of deimmunization, ie, the number of potential T cell epitopes remaining in the variable region. Deimmunization can be used to modify antibodies that contain non-human sequences, such as murine antibodies or other non-human monoclonal antibodies. Deimmunization can be used to modify antibodies isolated from display libraries.

（内皮細胞アッセイ）
標的結合タンパク質または候補結合タンパク質を、細胞アッセイを使用して特性付け、例えば、結合タンパク質が細胞に接触した場合の細胞表現型または他の活性の変化を評価し得る。典型的には、この細胞は、Ｔｉｅの外部ドメインの少なくとも一部を含むタンパク質を発現する。一部実施形態において、この細胞は、Ｔｉｅ１（例えば全長の成熟Ｔｉｅ１タンパク質）、Ｔｉｅ２を発現し、および／またはＡｎｇと接触する。 (Endothelial cell assay)
Target binding proteins or candidate binding proteins can be characterized using cellular assays, for example, to assess changes in cell phenotype or other activity when the binding protein contacts the cell. Typically, the cell expresses a protein that includes at least a portion of the ectodomain of Tie. In some embodiments, the cell expresses Tie1 (eg, full-length mature Tie1 protein), Tie2, and / or contacts Ang.

内皮細胞増殖。内皮増殖阻害活性について、ウシ毛管内皮細胞増殖アッセイ、ニワトリＣＡＭアッセイ、マウス角膜アッセイ等の生物学的活性アッセイを使用し、移植腫瘍に対する結合タンパク質の効果を評価して、候補結合タンパク質を検査し得る。ニワトリＣＡＭアッセイは、例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．“Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ”Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７９（２）、１９９４年１０月２１日、ｐｐ．３１５〜３２８に記載されている。簡単に説明すると、インタクトな卵黄を有する３日齢のニワトリ胚を卵から分離して、ペトリ皿に置く。三日間のインキュベーション後、検査すべきタンパク質を含むメチルセルロースディスクを、個々の胚のＣＡＭに適用する。４８時間のインキュベーション後、胚およびＣＡＭを観察して、内皮細胞の成長が阻害されるかどうかを決定する。マウス角膜アッセイは、成長因子含有ペレットを疑われる内皮成長阻害物質を含む別のペレットとともに、マウスの角膜に移植すること、角膜で作られた毛細管のパターンを観察することを包含する。   Endothelial cell proliferation. Candidate binding proteins can be tested for endothelial growth inhibitory activity using biological activity assays such as bovine capillary endothelial cell proliferation assay, chicken CAM assay, mouse corneal assay, etc. to assess the effect of binding protein on transplanted tumors . The chicken CAM assay is described, for example, in O'Reilly et al. “Angiogenic Regulation of Metallic Growth” Cell, vol. 79 (2), October 21, 1994, pp. 315-328. Briefly, a 3 day old chick embryo with intact yolk is separated from the egg and placed in a petri dish. After three days of incubation, a methylcellulose disc containing the protein to be examined is applied to the CAM of individual embryos. After 48 hours incubation, the embryos and CAM are observed to determine if endothelial cell growth is inhibited. The mouse corneal assay involves transplanting a growth factor-containing pellet into a mouse cornea with another pellet containing a suspected endothelial growth inhibitor and observing the capillary pattern made in the cornea.

血管形成。血管形成は、例えば、臍静脈、冠状動脈または皮膚細胞等の多様な内皮細胞系を用いてアッセイし得る。適切なアッセイとして、増殖を測定するアラマーブルー系アッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから利用可能）；血管形成増強物質または阻害物質の存在または不在下に、細胞の膜貫通移動を測定するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆａｌｃｏｎ ＨＴＳ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ（商標）細胞培養挿入物の使用等の、蛍光分子を使用する移動アッセイ；およびＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはコラーゲンＩ上の内皮細胞による管状構造物の形成に基づく細管形成アッセイが挙げられる。   Angiogenesis. Angiogenesis can be assayed using a variety of endothelial cell lines such as, for example, umbilical veins, coronary arteries or skin cells. Suitable assays include an Alamar Blue-based assay that measures proliferation (available from Biosource International); a Becton Dickinson Falcon HTS FluoroBlock that measures transmembrane migration of cells in the presence or absence of angiogenesis enhancers or inhibitors ( Migration assays using fluorescent molecules, such as the use of TM cell culture inserts; and tubule formation assays based on the formation of tubular structures by endothelial cells on MATRIGEL ™ (Becton Dickinson) or collagen I.

細胞付着。細胞付着アッセイは、候補標的結合タンパク質の存在または不在下に、細胞の精製付着タンパク質への付着または細胞同士の付着を測定する。細胞／タンパク質付着アッセイは、細胞の精製タンパク質への付着を調節する物質の能力を測定する。例えば、組換えタンパク質を生成し、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬに希釈し、マイクロタイタープレートのウェルを被覆するために使用する。ネガティブコントロールに使用されるウェルは、被覆しない。次いで、被覆したウェルを洗浄し、１％ＢＳＡでブロックし、再び洗浄する。化合物を、最終検査濃度の２倍まで希釈し、ブロックされ被覆されたウェルに加える。次いで、細胞をウェルに加え、未結合の細胞を洗浄除去する。保持された細胞を、カルセイン−ＡＭ等の膜浸透性蛍光染料を加えることによりプレート上で直接標識し、そのシグナルを蛍光マイクロプレートリーダーで定量する。   Cell attachment. Cell attachment assays measure the attachment of cells to purified attachment proteins or between cells in the presence or absence of candidate target binding proteins. Cell / protein attachment assays measure the ability of a substance to modulate the attachment of cells to purified protein. For example, recombinant protein is produced and diluted to 2.5 g / mL with PBS and used to coat the wells of a microtiter plate. Wells used for negative controls are not coated. The coated wells are then washed, blocked with 1% BSA, and washed again. Compounds are diluted to twice the final test concentration and added to the blocked and coated wells. Cells are then added to the wells and unbound cells are washed away. Retained cells are labeled directly on the plate by adding a membrane permeable fluorescent dye such as calcein-AM and the signal is quantified with a fluorescent microplate reader.

細胞／細胞付着アッセイを、細胞の細胞同士の結合を調節する候補標的結合タンパク質の能力を測定するために使用し得る。これらのアッセイは、選択された付着タンパク質を天然に、または組換えにより発現する細胞を使用し得る。例示的なアッセイにおいて、細胞付着タンパク質を発現する細胞を、他の細胞（同じ細胞タイプ以上のものか、または細胞が付着する別のタイプの細胞）とともにマルチウエルプレートのウェルにプレートする。付着し得る細胞を、ＢＣＥＣＦ等の膜浸透性蛍光染料で標識し、候補結合タンパク質の存在下で単層に付着させる。未結合細胞を洗浄除去し、蛍光プレートリーダーを使用して結合細胞を検出する。高スループット細胞付着アッセイもまた、記載されている。例えば、Ｆａｌｓｅｙ Ｊ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ ２００１；１２（３）：３４６−５３を参照されたい。   A cell / cell adhesion assay can be used to measure the ability of a candidate target binding protein to modulate cell-cell binding of cells. These assays may use cells that naturally or recombinantly express the selected adhesion protein. In an exemplary assay, cells that express a cell adhesion protein are plated in wells of a multi-well plate along with other cells (more than the same cell type, or another type of cell to which the cells adhere). Cells that can attach are labeled with a membrane permeable fluorescent dye such as BCECF and attached to the monolayer in the presence of the candidate binding protein. Unbound cells are washed away and bound cells are detected using a fluorescent plate reader. High throughput cell adhesion assays have also been described. See, for example, Falsey JR et al. Bioconjug Chem. See May-June 2001; 12 (3): 346-53.

管形成。管形成アッセイを、一般的に、細胞外マトリックスの環境を刺激するマトリックス基質上に管構造物を形成する培養細胞（一般的に、内皮細胞）の能力をモニターするために使用し得る。例示的な基質として、４℃にて液体であり、３７℃にて固体ゲルを形成するＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、すなわち、ラミニン、コラーゲンＩＶおよびへパリン硫酸プロテオグリカンを含む基底膜タンパク質の抽出物が挙げられる。他の適切なマトリックスは、コラーゲン、フィブロネクチンおよび／またはフィブリン等の細胞外成分を含む。細胞を、前血管形成刺激物質により刺激し、それらの細管形成能力を画像化により検出する。細管は、刺激を用いて一晩インキュベーションした後に一般的に検出し得るが、それよりも長い時間枠または短い時間枠も使用し得る。管形成アッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ Ｍ Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１４１８−１４２３）。これらのアッセイは伝統的に血清によるか、または成長因子ＦＧＦもしくはＶＥＧＦによる刺激を伴う。一実施形態において、このアッセイは無血清培地で培養された細胞を用いて実施する。一実施形態において、アッセイを、一つ以上の前血管形成物質、例えば炎症性血管形成因子（例えば、ＴＮＦ−αまたはＦＧＦ、ＶＥＧＦ、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ＴＮＦ−α、エフリン）の存在下で行われる。   Tube formation. Tube formation assays can generally be used to monitor the ability of cultured cells (typically endothelial cells) to form tube structures on a matrix substrate that stimulates the environment of the extracellular matrix. As an exemplary substrate, MATRIGEL ™ (Becton Dickinson) that is liquid at 4 ° C. and forms a solid gel at 37 ° C., ie, extraction of basement membrane proteins including laminin, collagen IV and heparin sulfate proteoglycans Things. Other suitable matrices include extracellular components such as collagen, fibronectin and / or fibrin. Cells are stimulated with a pro-angiogenic stimulant and their ability to form tubules is detected by imaging. Tubules can generally be detected after overnight incubation with stimuli, although longer or shorter time frames may be used. Tube formation assays are well known in the art (eg, Jones M K et al., 1999, Nature Medicine 5: 1418-1423). These assays traditionally involve stimulation with serum or growth factors FGF or VEGF. In one embodiment, the assay is performed using cells cultured in serum-free medium. In one embodiment, the assay comprises one or more pro-angiogenic agents, such as inflammatory angiogenic factors (eg, TNF-α or FGF, VEGF, phorbol myristate acetate (PMA), TNF-α, ephrin). Done in the presence.

細胞移動。内皮細胞移動の例示的アッセイは、ヒト微小血管内皮（ＨＭＶＥＣ）移動アッセイである。例えば、Ｔｏｌｓｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２２，４９７−５１１を参照。移動アッセイは当該技術分野で公知の（例えば、Ｐａｉｋ Ｊ Ｈ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１１８３０−１１８３７を参照）。一例において、培養内皮細胞を、典型的な細胞サイズよりも一般的に小さい気孔サイズのマトリックス被覆多孔性薄膜上にまく。この薄膜は、典型的にはトランスウエルポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）等の膜であり、一般的に、前血管形成刺激を含む低いチャンバーと液体中で接触した上部チャンバーの一部である。移動は一般的に刺激を用いた一晩のインキュベーション後にアッセイするが、それよりも長い時間枠または短い時間枠も使用し得る。移動は薄膜を横断する細胞の数として評価し、ヘモトキシリン溶液（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．）による細胞の染色によるか、または細胞数の決定の任意の他の方法により検出し得る。別の例示的な設定では、細胞を蛍光標識し、移動を蛍光の読み、例えばＦａｌｃｏｎ ＨＴＳ ＦＬＵＯＲＯＢＬＯＣ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して検出する。一部の移動が刺激の不存在下に観察される一方で、移動は前血管形成因子に応答して大きく増加する。このアッセイを使用して、標的結合タンパク質の内皮細胞移動に対する効果を検査し得る。   Cell migration. An exemplary assay for endothelial cell migration is the human microvascular endothelial (HMVEC) migration assay. See, for example, Tolsma et al. (1993) J. Am. See Cell Biol 122, 497-511. Migration assays are known in the art (see, eg, Paik J H et al., 2001, J Biol Chem 276: 11830-11837). In one example, cultured endothelial cells are plated on a matrix-coated porous membrane with a pore size that is generally smaller than the typical cell size. This thin film is typically a membrane such as a transwell polycarbonate membrane (Corning Coaster Corporation, Cambridge, Mass.), And is generally one of the upper chambers in liquid contact with a lower chamber containing pre-angiogenic stimuli. Part. Migration is generally assayed after overnight incubation with stimuli, although longer or shorter time frames may be used. Migration is assessed as the number of cells crossing the membrane and can be detected by staining cells with a hemotoxylin solution (VWR Scientific.) Or by any other method of cell number determination. In another exemplary setting, cells are fluorescently labeled and migration is detected using a fluorescence reading, eg, Falcon HTS FLUOROBLOC ™ (Becton Dickinson). While some migration is observed in the absence of stimulation, migration is greatly increased in response to pro-angiogenic factors. This assay can be used to examine the effect of target binding proteins on endothelial cell migration.

出芽アッセイ。例示的な出芽アッセイは、コラーゲンゲル系マトリックスに埋め込まれた内皮細胞（「スフェロイド」）の細胞数で定義されるスフェロイド集合体を使用する三次元のインビトロ血管形成アッセイである。スフェロイドは、細胞外マトリックス中への侵入による毛細管様構造物の出芽（「細胞出芽」という）とその後の複合体合流ネットワーク形成の出発点となり得る（Ｋｏｒｆｆ ａｎｄ Ａｕｇｕｓｔｉｎ，１９９９，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１２：３２４９−５８）。例示的な実験設定において、スフェロイドは、４００個のヒト臍静脈内皮細胞を、非吸着性の９６ウエルプレートの各ウェルに分注し、スフェロイドを一晩凝集させることにより調製される（Ｋｏｒｆｆ ａｎｄ Ａｕｇｕｓｔｉｎ：Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １４３：１３４１−５２，１９９８）。スフェロイドを採取し、９００μｌのメトセル−コラーゲン溶液にまき、２４ウエルプレートの各ウェルに分注し、コラーゲンゲルを重合させる。試験物質を３０分後に、試験物質の１０倍濃度作用希釈物の１００μｌをゲル上部に分注することによって加える。プレートを３７℃にて２４時間インキュベートする。実験インキュベーション時間の最後にパラホルムアルデヒドを加えることにより皿を固定する。内皮細胞の出芽強度を、自動化イメージ分析システムにより定量して、１スフェロイドあたりの累積出芽丈を決定し得る。   Budding assay. An exemplary budding assay is a three-dimensional in vitro angiogenesis assay that uses spheroid aggregates defined by the number of endothelial cells (“spheroids”) embedded in a collagen gel-based matrix. Spheroids can serve as a starting point for the budding of capillary-like structures by entry into the extracellular matrix (referred to as “cell budding”) and subsequent complex confluence network formation (Korff and Augustin, 1999, J Cell Sci 112: 3249). -58). In an exemplary experimental setting, spheroids are prepared by dispensing 400 human umbilical vein endothelial cells into each well of a non-adsorbing 96-well plate and allowing the spheroids to aggregate overnight (Korff and Augustin). : J Cell Sci 143: 1341-52, 1998). Spheroids are collected, spread in 900 μl of methocel-collagen solution, dispensed into each well of a 24-well plate, and collagen gel is polymerized. The test substance is added after 30 minutes by dispensing 100 μl of a 10-fold working dilution of the test substance on top of the gel. The plate is incubated at 37 ° C. for 24 hours. Fix the dishes by adding paraformaldehyde at the end of the experimental incubation period. The budding intensity of the endothelial cells can be quantified by an automated image analysis system to determine the cumulative budding height per spheroid.

一部実施形態において、標的結合タンパク質は、本明細書中に記載されるアッセイ、例えば本明細書中に記載される細胞アッセイに対し、統計的に有意な効果を有する。   In some embodiments, the target binding protein has a statistically significant effect on the assays described herein, eg, the cellular assays described herein.

（タンパク質産生）
標準的な組換え核酸法を使用して、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する結合タンパク質を発現し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照されたい。一般的に、結合タンパク質をコードする核酸配列を、核酸発現ベクターにクローニングする。タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖を発現ベクター、例えば同じまたは異なる細胞で発現される同じまたは異なるベクターにクローニングし得る。抗体を産生する方法も、以下に提供する。 (Protein production)
Standard recombinant nucleic acid methods can be used to express binding proteins that bind to Tie1, Tie2, or Ang. For example, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001) and Ausubel et al. See, Techniques in Molecular Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY) (1989) Generally, a nucleic acid sequence encoding a binding protein is cloned into a nucleic acid expression vector. If the protein contains multiple polypeptide chains, each chain can be cloned into an expression vector, eg, the same or different vector expressed in the same or different cells, Methods for producing antibodies are also provided below.

（抗体産生）
一部の抗体（例えば、Ｆａｂ）を、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中に生成し得る。例えば、Ｆａｂが、ディスプレー実体とバクテリオファージタンパク質（またはそのフラグメント）との間の阻害ストップコドンを含むファージディスプレーベクター中の配列によりコードされている場合、ベクター核酸を、ストップコドンを阻害し得ない細菌細胞中に移し替え得る。この場合Ｆａｂは、遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合せず、培地中に分泌される。 (Antibody production)
Some antibodies (eg, Fab) can be produced in bacterial cells (eg, E. coli cells). For example, if the Fab is encoded by a sequence in a phage display vector that includes an inhibitory stop codon between the display entity and the bacteriophage protein (or fragment thereof), the vector nucleic acid may not be able to inhibit the stop codon. Can be transferred into cells. In this case, the Fab is not fused to the gene III protein and is secreted into the medium.

抗体はまた、真核細胞中に生成され得る。一実施形態において、これらの抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は酵母細胞、例えばＰｉｃｈｉａ（例えば、Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５１：１２３−３５を参照）、ＨａｎｓｅｕｌａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中で発現される。   Antibodies can also be generated in eukaryotic cells. In one embodiment, these antibodies (eg, scFv) are expressed in yeast cells such as Pichia (see, eg, Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251: 123-35), Hanseula or Saccharomyces. .

一実施形態において、抗体は哺乳動物細胞で作られる。クローン抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するのに好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含み、例えばＫａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０２−６２１に記載のようにＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される）、リンパ球細胞株、例えば、ＮＳ０ミエローマ細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞、およびトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物からの細胞が挙げられる。例えば、細胞は乳腺の外皮細胞である。 In one embodiment, the antibody is made in a mammalian cell. Preferred mammalian host cells for expressing cloned antibodies or antigen-binding fragments thereof are Chinese hamster ovary (CHO cells) (Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220. dhfr - CHO cells, including, for example, DHFR selectable markers as described in Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 602-621), lymphocyte cell lines such as NS0 myeloma cells and SP2 Cells, COS cells, HEK 293T cells, and cells from transgenic animals, such as transgenic mammals. For example, the cells are mammary gland coat cells.

免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択可能マーカー遺伝子等の付加的な配列を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号および米国特許第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等の薬品に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅によるｄｈｆｒ−宿主細胞における使用用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。別の例示的な発現系は、Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．ＣＨから利用可能なグルタミンシンターゼ（ＧＳ）ベクター系である（例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２（４）：４８−５２；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．８１（６）：６３１−６３９を参照）。 In addition to the nucleic acid sequence encoding the immunoglobulin domain, the recombinant expression vector has additional sequences such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (eg, origins of replication) and selectable marker genes. obtain. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (eg, US Pat. No. 4,399,216, US Pat. No. 4,634,665 and US Pat. No. 5,179,017). Issue). For example, typically the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, on a host cell into which the vector has been introduced. Preferred selectable marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr - host cells by methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection). Another exemplary expression system is Lonza Group Ltd. Glutamine synthase (GS) vector system available from CH (eg Clark et al. (2004) BioProcess International 2 (4): 48-52; Barnes et al. (2002) Biotech Bioeng. 81 (6): 631-639).

抗体またはその抗原結合部分の組換え発現の例示的な系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖および軽鎖の遺伝子を、エンハンサー／プロモーター調節要素（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルス等に由来するもの、例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素）にそれぞれ作動可能に連結させて遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子を有し、これはこのベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の、メトトレキセート選択／増幅を使用した選択を可能とする。選択された形質転換宿主細胞を培養して抗体重鎖および軽鎖を発現させ、インタクトな抗体を培養培地から回収する。標準的な分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収する。例えば、一部の抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィーにより単離し得る。 In an exemplary system for recombinant expression of an antibody or antigen-binding portion thereof, a recombinant expression vector encoding both antibody heavy and antibody light chains is introduced into dhfr - CHO cells by calcium phosphate mediated transfection. Within the recombinant expression vector, the antibody heavy and light chain genes are combined with enhancer / promoter regulatory elements (eg, those derived from SV40, CMV, adenovirus, etc., eg, CMV enhancer / AdMLP promoter regulatory element or SV40 enhancer / AdMLP Each operably linked to a promoter regulatory element) to drive high level transcription of the gene. The recombinant expression vector also has a DHFR gene, which allows selection of CHO cells transfected with this vector using methotrexate selection / amplification. The selected transformed host cells are cultured to express the antibody heavy and light chains and intact antibody is recovered from the culture medium. Using standard molecular biology techniques, recombinant expression vectors are prepared, transfected into host cells, transformants are selected, host cells are cultured, and antibodies are recovered from the culture medium. For example, some antibodies can be isolated by affinity chromatography with protein A or protein G.

コドンの使用は宿主細胞のコドンバイアスに合致させることができ、例えばＣＨＯ細胞の場合は、これはコドンバイアスＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ遺伝子に合致させる。更に又、極めて高い（＞８０％）または極めて低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は可能な場合は回避することができる。旨適化過程の間、以下のシス作用配列モチーフ、即ち、内部ＴＡＴＡボックス；カイ部位およびリボソーム進入部位；ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列ストレッチ；ＡＲＥ、ＩＮＳ、ＣＲＳ配列エレメント；リピート配列およびＲＮＡ二次構造；および（クリプティック）スプライスドナーおよびアクセプターの部位、分岐点、は回避する。２つのＳＴＯＰコドンを用いることにより効率的な終止を確保することができる。配列のコドン旨適化はＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，Ｌｉ，Ｗ．Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（３）．１９８７に従って評価することができる。標準的なコドンアダプテーション指数（ＣＡＩ）を使用できる。希少なコドンは０〜４０のクオリティークラスを有するものを包含する。   The use of the codon can be matched to the codon bias of the host cell, for example in the case of CHO cells this is matched to the codon bias Cricetulus grieseus gene. Furthermore, regions with very high (> 80%) or very low (<30%) GC content can be avoided if possible. During the odor optimization process, the following cis-acting sequence motifs: internal TATA box; chi-site and ribosome entry site; AT-rich or GC-rich sequence stretch; ARE, INS, CRS sequence elements; repeat sequences and RNA secondary structure And avoid (cryptic) splice donor and acceptor sites, branch points. Efficient termination can be ensured by using two STOP codons. The codon effect optimization of the sequence is described in Sharp, P. et al. M.M. Li, W .; H. , Nucleic Acids Res. 15 (3). It can be evaluated according to 1987. A standard codon adaptation index (CAI) can be used. Rare codons include those having a quality class of 0-40.

本発明は例えば向上したコドンまたは配列の特徴を包含するように本明細書に記載した配列と相対比較して改変されている単離された核酸分子を特徴とし、重鎖または軽鎖のコーディング配列を含む単離された核酸分子を包含する。例えば重鎖または軽鎖のコーディング配列内のコドンの少なくとも３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５または８０％が哺乳類細胞における非希少または頻繁なコドンであるか、または、重鎖または軽鎖のコーディング配列が哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター細胞（Ｃｒｅｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）において５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０％未満の希少コドンを包含する。一実施形態において、コドンアダプテーション指数は０．６、０．７、０．８、０．８５、０．９０、０．９２、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７または０．９８より高値である。   The invention features, for example, an isolated nucleic acid molecule that has been modified relative to the sequences described herein to include improved codon or sequence characteristics, such as heavy or light chain coding sequences. An isolated nucleic acid molecule comprising For example, at least 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75 or 80% of the codons in the heavy or light chain coding sequence are non-rare or frequent codons in mammalian cells, or heavy or light The coding sequence of the strand includes less than 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10% of rare codons in mammalian cells such as Chinese hamster cells. In one embodiment, the codon adaptation index is 0.6, 0.7, 0.8, 0.85, 0.90, 0.92, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97 or 0. Higher than .98.

一実施形態において、重鎖コーディング配列は（ｉ）本明細書に記載した抗体重鎖（例えば配列番号７２３に示すＥ３重鎖）を含むポリペプチド、（ｉｉ）本明細書に記載した抗体重鎖コーディング配列（例えば配列番号７２３）に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるポリペプチド、または（ｉｉｉ）本明細書に記載した抗体重鎖可変ドメイン（例えばＥ３重鎖可変ドメイン）のＣＤＲを有する重鎖可変ドメイン配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態において、重鎖コーディング配列は少なくとも２、３、５、６、８、９、１０または１５コドンにおいて配列番号７０３と異なる。   In one embodiment, the heavy chain coding sequence comprises (i) a polypeptide comprising an antibody heavy chain described herein (eg, the E3 heavy chain set forth in SEQ ID NO: 723), (ii) an antibody heavy chain described herein. A polypeptide that is at least 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% identical to a coding sequence (eg, SEQ ID NO: 723), or (iii) an antibody heavy chain variable domain (eg, an E3 heavy chain) described herein It encodes a polypeptide comprising a heavy chain variable domain sequence with a variable domain (CDR). In one embodiment, the heavy chain coding sequence differs from SEQ ID NO: 703 at least 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10 or 15 codons.

一実施形態において、軽鎖コーディング配列は（ｉ）本明細書に記載した抗体軽鎖（例えば配列番号７２４に示すＥ３軽鎖）を含むポリペプチド、（ｉｉ）本明細書に記載した抗体軽鎖コーディング配列（例えば配列番号７２４）に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるポリペプチド、または（ｉｉｉ）本明細書に記載した抗体軽鎖可変ドメイン（例えばＥ３軽鎖可変ドメイン）のＣＤＲを有する軽鎖可変ドメイン配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態において、軽鎖コーディング配列は少なくとも３、５、６、８、９、１０または１５コドンにおいて配列番号７０２と異なる。   In one embodiment, the light chain coding sequence is (i) a polypeptide comprising an antibody light chain as described herein (eg, an E3 light chain as set forth in SEQ ID NO: 724), (ii) an antibody light chain as described herein. A polypeptide that is at least 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% identical to a coding sequence (eg, SEQ ID NO: 724), or (iii) an antibody light chain variable domain (eg, an E3 light chain) described herein It encodes a polypeptide comprising a light chain variable domain sequence having a variable domain CDR. In one embodiment, the light chain coding sequence differs from SEQ ID NO: 702 at least 3, 5, 6, 8, 9, 10 or 15 codons.

一実施形態において、例えばａｌａ−ＧＣＧコドン１つ以上はＧＣＣに変更することができ；ａｒｇ−ＣＧＴコドン１つ以上はＣＧＣに変更することができ；ｐｒｏ−ＣＣＧコドン１つ以上はＣＣＣ、ＣＣＴまたはＣＣＡに変更することができ；ｓｅｒ−ＴＣＧコドン１つ以上はＴＣＣに変更することができ；および／またはｔｈｒ−ＡＣＧコドン１つ以上はＡＣＣに変更することができる。   In one embodiment, for example, one or more ala-GCG codons can be changed to GCC; one or more arg-CGT codons can be changed to CGC; one or more pro-CCG codons can be CCC, CCT or One or more ser-TCG codons can be changed to TCC; and / or one or more thr-ACG codons can be changed to ACC.

コドン改変（例えばコドン旨適化）配列を抗体の製造に使用できる。例示される方法は抗体コーディング核酸を包含する哺乳類細胞を準備すること、および、細胞内に核酸を発現させること、例えばタンパク質が発現される条件下に細胞を維持することを包含する。抗体コーディング核酸は哺乳類発現ベクター、例えば細胞内に導入されたベクター内に提供することができる。細胞は非ヒト哺乳類細胞、たとえばＣＨＯ細胞でありうる。   Codon modification (eg, codon optimization) sequences can be used in the production of antibodies. Exemplary methods include providing a mammalian cell containing the antibody-encoding nucleic acid, and expressing the nucleic acid in the cell, eg, maintaining the cell under conditions in which the protein is expressed. The antibody-encoding nucleic acid can be provided in a mammalian expression vector, eg, a vector that has been introduced into the cell. The cell can be a non-human mammalian cell, such as a CHO cell.

Ｆｃドメインを含む抗体のために、抗体産生系は、好ましくはＦｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成する。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７でグリコシル化されている。このアスパラギンは、二分岐型のオリゴ糖による修飾部位である。このグリコシル化はＦｃγレセプターおよび補体Ｃ１ｑにより媒介されるエフェクター機能に必要とされることが、示されている（Ｂｕｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｏｏｆ（１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。好ましい実施形態において、Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系で生成される。Ｆｃドメインはまた、他の真核翻訳後修飾を含み得る。   For antibodies comprising an Fc domain, the antibody production system preferably synthesizes antibodies in which the Fc region is glycosylated. For example, the Fc domain of an IgG molecule is glycosylated with asparagine 297 in the CH2 domain. This asparagine is a site modified by a biantennary oligosaccharide. It has been shown that this glycosylation is required for effector functions mediated by Fcγ receptors and complement C1q (Burton and Woof (1992) Adv. Immunol. 51: 1-84; Jefferis et al. ( 1998) Immunol.Rev.163: 59-76). In a preferred embodiment, the Fc domain is generated in a mammalian expression system that appropriately glycosylates the residue corresponding to asparagine 297. The Fc domain can also include other eukaryotic post-translational modifications.

抗体はまた、トランスジェニック動物により生成され得る。例えば、ＵＳ５，８４９，９９２は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺で抗体を発現する方法を記載している。乳特異的プロモーター、ならびに関心の抗体および分泌のためのシグナル配列をコードする核酸を含むトランスジーンが構築される。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌により産生される乳は、そこで分泌された関心の抗体を含んでいる。この抗体を乳から精製し得、または一部の利用においては直接的に使用し得る。   Antibodies can also be produced by transgenic animals. For example, US 5,849,992 describes a method for expressing an antibody in the mammary gland of a transgenic mammal. A transgene is constructed that includes a milk-specific promoter and nucleic acids encoding the antibody of interest and a signal sequence for secretion. Milk produced by such transgenic mammal females contains the antibody of interest secreted therein. The antibody can be purified from the milk or used directly in some applications.

Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する抗体を、例えば天然、ヒトまたは部分的にヒトの免疫グロブリン遺伝子座を有する例えば動物を使用して、免疫化によっても生成し得る。そのような抗体は、任意のアロタイプ、例えば、ａ，ｚアロタイプ、ｆアロタイプまたは非Ａアロタイプであり得る。非ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列、例えば特定の位置で、例えば以下の位置の一つ以上（好ましくは少なくとも５、１０、１２またはすべて）で共通ヒトアミノ酸残基の置換を含むようにも改変し得る：（軽鎖の可変ドメインのＦＲにおいて）、４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、５８Ｌ、４６Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７３Ｌ、８５Ｌ、８７Ｌ、９８Ｌおよび／または（重鎖の可変ドメインのＦＲにおいて）２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、３６Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４３Ｈ、４５Ｈ、４９Ｈ、５８Ｈ、６０Ｈ、６７Ｈ、６８Ｈ、６９Ｈ、７０Ｈ、７３Ｈ、７４Ｈ、７５Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９２Ｈ、９３Ｈおよび／または１０３Ｈ（Ｋａｂａｔのナンバリングによる）。例えば、ＵＳ６，４０７，２１３を参照されたい。   Antibodies that bind to Tiel, Tie2, or Ang can also be generated by immunization, using, for example, animals having, for example, natural, human or partially human immunoglobulin loci. Such antibodies can be of any allotype, for example a, z allotype, f allotype or non-A allotype. Non-human antibodies are also modified to include substitutions of common human amino acid residues at human immunoglobulin sequences, eg, at specific positions, eg, at one or more of the following positions (preferably at least 5, 10, 12 or all): Can: (in the FR of the light chain variable domain) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L and / or (in the FR of the variable domain of the heavy chain) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H and / or 103H (Kabat numbering According). See for example US 6,407,213.

（Ｔｉｅ１産生）
Ｔｉｅ１外部ドメインタンパク質、Ｔｉｅ１タンパク質またはＴｉｅ１リポソームを生成する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、ＷＯ９３／１４１２４を参照されたい。Ｔｉｅ２およびＡｎｇを生成する方法は、同様に公知である。例えば、米国特許第６，５２１，４２４号、米国特許第６，３７６，６５３号；ＷＯ９６／１１２６９；ＷＯ９６／３１５９８を参照されたい。 (Tie1 production)
Methods for producing Tie1 ectodomain protein, Tie1 protein or Tie1 liposomes are known in the art. See, for example, WO 93/14124. Methods for producing Tie2 and Ang are likewise known. See, for example, US Pat. No. 6,521,424, US Pat. No. 6,376,653; WO 96/11269; WO 96/31598.

（ビオチニル化法）
多様な方法が、タンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質または標的タンパク質をビオチニル化するために利用し得る。例えば、タンパク質を５倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンと共に、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で、４℃にて一晩インキュベートし得る。遊離ビオチンは、例えば１０ｋＤａ分子量カットオフメンブレンを有するＢＩＯＭＡＸ（登録商標）装置を使用して、ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０へのバッファー交換または透析により除去する。タンパク質１モルあたりに導入されるビオチン分子の数は、製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）により記載されるようにＨＡＢＡアッセイを使用して決定し得る。 (Biotinylation method)
A variety of methods can be utilized to biotinylate proteins, such as immunoglobulin proteins or target proteins. For example, the protein can be incubated with a 5-fold molar excess of sulfo-NHS-SS-biotin in 50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM NaCl overnight at 4 ° C. Free biotin is removed by buffer exchange or dialysis to PBS, 0.01% Tween 20, for example using a BIOMAX® instrument with a 10 kDa molecular weight cut-off membrane. The number of biotin molecules introduced per mole of protein can be determined using the HABA assay as described by the manufacturer (Pierce).

（薬学的組成物）
別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する物質、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合すると同定された、あるいは本明細書中に記載さる抗体分子、他のポリペプチドまたはペプチドを含み、薬学的に受容可能なキャリアとともに処方された組成物、例えば薬学的に受容可能な組成物を提供する。薬学的組成物は、標識結合タンパク質（例えば、インビボ画像化用）ならびに治療組成物を包含する。 (Pharmaceutical composition)
In another aspect, the present invention provides an antibody molecule, other polypeptide or peptide that has been identified to bind to Tie1, Tie2, or Ang, eg, Tie1, Tie2, or Ang, or is described herein. Compositions comprising and formulated with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, pharmaceutically acceptable compositions are provided. Pharmaceutical compositions include labeled binding proteins (eg, for in vivo imaging) as well as therapeutic compositions.

本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒体、被覆物、抗細菌および抗カビ剤、等張吸収遅延剤等を含む。好ましくは、キャリアは（例えば、注射または点滴による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に適している。投与経路に応じて、結合タンパク質は、化合物を不活性化し得る酸の作用および他の自然な状態から該化合物を保護する物質で被覆され得る。   As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” refers to any physiologically compatible solvent, dispersion medium, coating, antibacterial and antifungal agent, isotonic absorption delaying agent. Etc. Preferably, the carrier is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (eg, by injection or infusion). Depending on the route of administration, the binding protein can be coated with a substance that protects the compound from the action of acids and other natural conditions that can inactivate the compound.

「薬学的に受容可能な塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、任意の望ましくない毒物学的効果を付与しない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９）。そのような塩の例として、酸付加塩と塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等に由来する塩、ならびに非毒性の有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等に由来する塩が挙げられる。塩基付加塩として、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等に由来する塩、ならびに非毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来する塩が挙げられる。   “Pharmaceutically acceptable salt” refers to a salt that retains the desired biological activity of the parent compound and does not impart any undesirable toxicological effects (eg, Berge, SM, et al. al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Examples of such salts include acid addition salts and base addition salts. Acid addition salts include salts derived from non-toxic inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, phosphorous acid, and non-toxic organic acids such as fatty acids. And salts derived from group mono- and dicarboxylic acids, phenyl-substituted alkanoic acids, hydroxyalkanoic acids, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids and the like. Base addition salts include salts derived from alkaline earth metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium, etc., as well as non-toxic organic amines such as N, N′-dibenzylethylenediamine, N-methylglucamine, chloro Examples include salts derived from procaine, choline, diethanolamine, ethylenediamine, procaine and the like.

組成物は、多様な形態であり得る。これらは、例えば、液体、半固体および固体投与形態、例えば溶液（例えば、注射可能溶液および点滴可能溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉剤、リポソームおよび座薬を含む。好ましい形態は、投与および治療的利用の意図される形態に依存する。典型的な好ましい組成物は、例えばヒトに抗体を投与するために使用される組成物と類似組成物等、注射可能溶液または点滴可能溶液の形態である。投与の好ましい形態は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、標的結合タンパク質は、静脈内点滴または注射により投与される。別の好ましい実施形態において、標的結合タンパク質は、筋肉内注射または皮下注射により投与される。   The composition can be in a variety of forms. These include, for example, liquid, semi-solid and solid dosage forms such as solutions (eg, injectable solutions and instillable solutions), dispersions or suspensions, tablets, pills, powders, liposomes and suppositories. The preferred form depends on the intended form of administration and therapeutic use. A typical preferred composition is in the form of an injectable or instillable solution, such as, for example, a composition similar to that used to administer antibodies to humans. The preferred mode of administration is parenteral (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular). In preferred embodiments, the target binding protein is administered by intravenous infusion or injection. In another preferred embodiment, the target binding protein is administered by intramuscular or subcutaneous injection.

語句「非経口投与」および「非経口に投与される」とは、本明細書中で使用される場合、腸内および局所投与以外の通常注射による投与形態を意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、胸膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、角皮下、動脈内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射ならびに点滴が挙げられる。   The phrases “parenteral administration” and “administered parenterally” as used herein mean, but are not limited to, administration forms by normal injection other than enteral and topical administration, Intravenous, intramuscular, intraarterial, intrathecal, intracapsular, intrapleural, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, intratracheal, subcutaneous, subcutaneous, intraarterial, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, hard Intramembrane and intrasternal injection and infusion.

組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高薬物濃度に適する他次元の構造物として調合し得る。無菌の注射可能な溶液は、結合タンパク質を、必要とされる上記成分の一つまたはその組合せとともに適切な溶媒中に必要とされる量で混合し、続いてろ過滅菌することにより調製し得る。一般的に、分散液は、塩基性分散媒体および上記からの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を混合することにより調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、先に無菌ろ過した溶液から活性成分および任意の更なる所望の成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチン等の塗料の使用により、分散液の場合に必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを、この組成物に含ませることによりもたらされ得る。   The composition may be formulated as a solution, microemulsion, dispersion, liposome, or other dimension structure suitable for high drug concentrations. Sterile injectable solutions can be prepared by mixing the binding protein in the required amount in a suitable solvent with one or a combination of the above ingredients required followed by filter sterilization. Generally, dispersions are prepared by mixing the active compound with a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from above. In the case of sterile powders for preparing sterile injectable solutions, the preferred method of preparation is vacuum drying and lyophilization to produce a powder of the active ingredient and any further desired ingredients from a previously sterile filtered solution . The proper fluidity of a solution can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent that delays absorption, for example, monostearate salts and gelatin.

本明細書中に記載される結合タンパク質を、当該技術分野で公知の種々の方法により投与し得るが、多くの利用のために好ましい投与経路／形態は、静脈注射または点滴である。例えば、治療の利用のために、標的結合タンパク質は、例えば、３０ｍｇ／分、２０ｍｇ／分、１０ｍｇ／分、５ｍｇ／分または１ｍｇ／分未満の速度で静脈内点滴により投与して、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量を達成し得る。投与経路および／または形態は、所望の結果に応じて変更する。ある実施形態において、活性化合物は、移植物等の制御された放出調合物およびマイクロカプセル化送達系等、該化合物を急速な放出に対して保護するキャリアとともに調製し得る。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解可能で生物適合性のポリマーを使用し得る。そのような処方物の多くの調製方法が特許されているか、一般的に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。 Although the binding proteins described herein can be administered by various methods known in the art, the preferred route / form of administration for many uses is intravenous injection or infusion. For example, for therapeutic use, the target binding protein may be administered by intravenous infusion at a rate of, for example, less than 30 mg / min, 20 mg / min, 10 mg / min, 5 mg / min, or 1 mg / min, about 1 to It may achieve a dose of 100 mg / m 2 or 7~25mg / m 2. The route of administration and / or form will vary depending on the desired results. In certain embodiments, the active compounds can be prepared with carriers that will protect the compound against rapid release, such as a controlled release formulation, such as an implant, and a microencapsulated delivery system. Biodegradable and biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid may be used. Many methods for the preparation of such formulations are patented or generally known. For example, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. MoI. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978.

ある実施形態において、結合タンパク質を、例えば不活性希釈液または同化可能な食用キャリアとともに経口投与し得る。また、この化合物（および所望であれば、他の成分）を、硬質または軟質のゼラチンカプセルに封入するか、錠剤へと圧縮するか、あるいは被験体の食事に直接混合し得る。経口治療投与のために、この化合物を、賦形剤とともに混合し、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤等の形態で使用し得る。本明細書中に記載される化合物を非経口投与以外で投与するために、化合物の不活化を防止する物質で化合物を被覆するか、または化合物をこの物質とともに投与することが必要となり得る。   In certain embodiments, the binding protein can be orally administered, for example, with an inert diluent or an assimilable edible carrier. The compound (and other ingredients, if desired) can also be enclosed in hard or soft gelatin capsules, compressed into tablets, or mixed directly into the subject's diet. For oral therapeutic administration, this compound is mixed with excipients and used in the form of ingestible tablets, buccals, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, cachets, etc. obtain. In order to administer a compound described herein other than parenteral, it may be necessary to coat the compound with a substance that prevents inactivation of the compound or to administer the compound with this substance.

薬学的組成物を、当該技術分野で公知の医療デバイスにより投与し得る。例えば、好ましい実施形態において、薬学的組成物を、米国特許第５，３９９，１６３号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，７９０，８２４号または米国特許第４，５９６，５５６号で開示されるデバイス等の無針皮下注射デバイスにより投与し得る。移植物およびモジュールの例として、医薬を調節速度で投与する移植可能なマイクロ点滴ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、医薬を経皮で投与する治療デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号、医薬を正確な点滴速度で送達する医薬点滴ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達用の変流量移植可能点滴装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバー区画を有する浸透薬物送達システムを開示している米国特許第４，４３９，１９６号および浸透医薬供給システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。勿論、多くの他のそのような移植物、送達システムおよびモジュールもまた、公知である。   The pharmaceutical composition may be administered by medical devices known in the art. For example, in a preferred embodiment, the pharmaceutical composition is prepared from US Pat. No. 5,399,163, US Pat. No. 5,383,851, US Pat. No. 5,312,335, US Pat. No. 5,064, 413, US Pat. No. 4,941,880, US Pat. No. 4,790,824 or US Pat. No. 4,596,556 can be administered by a needleless hypodermic injection device. As an example of an implant and module, U.S. Pat. No. 4,487,603, which discloses an implantable micro-infusion pump that administers medication at a controlled rate, discloses a therapeutic device that administers medication transdermally. U.S. Pat. No. 4,486,194, U.S. Pat. No. 4,447,233, which discloses a pharmaceutical infusion pump that delivers medication at a precise infusion rate, a variable flow rate implantable infusion device for continuous drug delivery U.S. Pat. No. 4,447,224, U.S. Pat. No. 4,439,196, which discloses an osmotic drug delivery system having a multi-chamber compartment, and U.S. Pat. No. 4, which discloses an osmotic drug delivery system. 475,196. Of course, many other such implants, delivery systems and modules are also known.

ある実施形態において、本明細書中に記載される結合タンパク質は、インビボでの適切な分布を保証するように処方し得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療タンパク質が、（所望なら）ＢＢＢを確実に横断させるために、それらを、例えばリポソーム中に処方し得る。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；米国特許第５，３７４，５４８号；および米国特許第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に運ばれる一つ以上の部分を含み得、したがって、標的薬物送達を向上させ得る（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。   In certain embodiments, the binding proteins described herein can be formulated to ensure proper distribution in vivo. For example, the blood brain barrier (BBB) eliminates many highly hydrophilic compounds. In order to ensure that the therapeutic proteins of the invention cross the BBB (if desired), they can be formulated, for example, in liposomes. See, for example, US Pat. No. 4,522,811; US Pat. No. 5,374,548; and US Pat. No. 5,399,331 for methods of producing liposomes. Liposomes can contain one or more moieties that are selectively delivered to specific cells or organs, and thus can improve targeted drug delivery (eg, VV Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29). : 685).

投与レジメンを、最適な所望される応答（例えば、治療的応答）を提供するように調節する。例えば、単一の巨丸薬を投与してもよいし、いくつかに分けた用量を経時的に投与してもよいし、用量を治療状況の必要性によって示されるように比例的に増減してもよい。非経口組成物を、投与の容易さおよび投薬量の均一性のための投薬単位形態で調合することは特に好都合である。本明細書中で使用される投薬単位形態は、治療をされる被験体に単位投薬量として適した物理的に別々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同して所望の治療効果を生じるように算定された所定量の活性化合物を含む。投薬単位形態の規格は、（ａ）活性化合物の独自の特性および達成すべき特定の治療効果および（ｂ）個人における感受性処置のために活性化合物の配合技術分野に内在する制限により規定され、これらに直接的に依存し得る。   Dosage regimens are adjusted to provide the optimum desired response (eg, a therapeutic response). For example, a single bolus may be administered, divided doses may be administered over time, and doses may be increased or decreased proportionally as indicated by the needs of the treatment situation. Also good. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. As used herein, dosage unit form refers to a physically discrete unit suitable as a unit dosage for the subject being treated; each unit is in association with the required pharmaceutical carrier. Contains a predetermined amount of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect. The unit dosage form specifications are defined by (a) the unique properties of the active compound and the specific therapeutic effect to be achieved and (b) the limitations inherent in the compounding art of active compounds for sensitive treatment in individuals, Can depend directly on

本明細書中に記載される抗体の治療有効量または予防有効量についての例示的で非限定的な範囲は、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。標的結合タンパク質を、３０ｍｇ、２０ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇまたは１ｍｇ／分未満の速度で静脈内点滴により投与して、約１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｍ２または約５ｍｇ〜３０ｍｇ／ｍ２の用量を達成し得る。抗体よりも分子量の小さい結合タンパク質については、適正量を、比例的に小さくし得る。投薬量の値は、緩和すべき状態のタイプおよび重篤度により変更し得ることに注意すべきである。さらに、任意の特定の被験体に対しては、特異的投薬レジメンを、個人の必要性、および組成物を投与するかもしくは組成物投与を監督する者の専門的な判断に基づいて、経時的に調節すべきであり、本明細書中で提示する投薬量の範囲は例示的なものにすぎず、請求される組成物の範囲もしくは実施を限定する意図はないことを理解されるべきである。 An exemplary, non-limiting range for a therapeutically or prophylactically effective amount of the antibodies described herein is 0.1 mg to 20 mg / kg, more preferably 1 mg to 10 mg / kg. A target binding protein, 30 mg, 20 mg, 10 mg, was administered by intravenous infusion at 5mg or 1mg / min rate of less than to achieve a dose of about 1 mg to 100 mg / m 2 or about 5mg~30mg / m 2. For binding proteins that have a lower molecular weight than the antibody, the appropriate amount can be made proportionally smaller. It should be noted that dosage values can vary depending on the type and severity of the condition to be alleviated. In addition, for any particular subject, a specific dosing regimen may be determined over time based on the individual needs and the professional judgment of the person administering or supervising the administration of the composition. It should be understood that the dosage ranges presented herein are exemplary only and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions. .

薬学的組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本明細書中に記載される標的結合タンパク質を使用して調製し得る。「治療有効量」とは、所望の治療成果を達成するために必要な投与量で、そのために必要な期間、有効な量をいう。治療有効量の組成物は、個人の病状、年齢、性別および体重等の因子、および個人において所望の応答を誘発する結合タンパク質の能力に従って変更し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が組成物の任意の毒性または有害な効果にまさる量でもある。「治療有効量」は、好ましくは測定可能なパラメーター、例えば炎症または腫瘍の成長速度を、処置されない被験体と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおさらに好ましくは少なくとも８０％阻害する。化合物の測定可能なパラメーター（例えば、癌）の阻害能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系で評価し得る。あるいは、組成物のこの性質を、当業者に公知のアッセイによってインビトロでの阻害等の化合物の阻害能力を調べることにより評価し得る。   A pharmaceutical composition may be prepared using a “therapeutically effective amount” or “prophylactically effective amount” of a target binding protein described herein. A “therapeutically effective amount” refers to an amount that is necessary to achieve a desired therapeutic result and is effective for a period required for that purpose. A therapeutically effective amount of the composition may vary according to factors such as the individual's condition, age, sex and weight, and the ability of the binding protein to elicit the desired response in the individual. A therapeutically effective amount is also an amount at which a therapeutically beneficial effect exceeds any toxic or deleterious effects of the composition. A “therapeutically effective amount” preferably has a measurable parameter, such as inflammation or tumor growth rate, of at least about 20%, more preferably at least about 40%, even more preferably at least compared to an untreated subject. Inhibits about 60%, even more preferably at least 80%. The ability of a compound to inhibit a measurable parameter (eg, cancer) can be assessed in an animal model system that predicts efficacy in human tumors. Alternatively, this property of the composition can be assessed by examining the ability of the compound to inhibit, such as inhibition in vitro, by assays known to those skilled in the art.

「予防有効量」とは、所望の予防成果を達成するために必要な投与量で、そのために必要な期間、有効な量をいう。典型的には、予防用量は疾患前または疾患の初期段階で被験体に使用されるために、予防有効量は、治療有効量よりも少なくなる。   “Prophylactically effective amount” refers to an amount that is necessary to achieve a desired preventive result and is effective for a period necessary for that purpose. Typically, since a prophylactic dose is used in subjects prior to or at an earlier stage of disease, the prophylactically effective amount will be less than the therapeutically effective amount.

Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する結合タンパク質および使用（例えば、処置、予防または診断における使用）に関する説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内にある。一実施形態において、診断用途についての説明書は、インビトロで、例えばサンプルで、例えば炎症障害または癌もしくは腫瘍性障害を有する患者からの生検または細胞中、あるいはインビボでＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇを検出するための、標的結合タンパク質（例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または他のポリペプチドもしくはペプチド）の使用を含む。別の実施形態において、治療用途の説明書は、癌もしくは腫瘍性障害を有する患者において推奨される投与量および／または投与形態を含む。さらに、このキットは、診断剤または治療剤、例えば本明細書中に記載される診断剤または治療剤等の少なくとも一つのさらなる試薬および／または必要に応じて一つ以上の分離した医薬品に調合される一つ以上のさらなる標的結合タンパク質を含み得る。   Also within the scope of the invention are kits comprising binding proteins that bind to Tie1, Tie2, or Ang and instructions for use (eg, use in treatment, prevention or diagnosis). In one embodiment, the instructions for diagnostic use detect Tie1, Tie2, or Ang in vitro, eg, in a sample, eg, in a biopsy or cell from a patient with an inflammatory disorder or cancer or neoplastic disorder, or in vivo To use a target binding protein (eg, an antibody or antigen-binding fragment thereof, or other polypeptide or peptide). In another embodiment, the instructions for therapeutic use include recommended dosages and / or dosage forms in patients with cancer or neoplastic disorders. Further, the kit is formulated into a diagnostic or therapeutic agent, such as at least one additional reagent such as the diagnostic or therapeutic agent described herein and / or optionally one or more separate pharmaceutical products. One or more additional target binding proteins.

一実施形態において、標的結合タンパク質（例えば、本明細書中に記載されるＴｉｅ１抗体）を、遺伝子に基づくベクター（例えば、導入遺伝子）から、またはアデノウイルス送達により生成し得る。   In one embodiment, a target binding protein (eg, a Tiel antibody described herein) can be generated from a gene-based vector (eg, a transgene) or by adenoviral delivery.

（安定化および保持）
一実施形態において、標的結合タンパク質（例えば、本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合タンパク質、ポリペプチド、抗体またはアプタマー）を、循環中、例えば血液、血清、リンパ液または他の組織中でその安定化および／または保持を向上させる部分と物理的に会合させる。 (Stabilization and retention)
In one embodiment, the target binding protein (eg, a Tie1 binding protein, polypeptide, antibody or aptamer described herein) is stabilized in the circulation, eg, blood, serum, lymph, or other tissue. And / or physically associated with a moiety that improves retention.

例えば、標的結合因子を、ポリマー、例えば、実質的に非抗原性のポリマー（例えば、ポリオキシアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシド）と会合させ得る。適切なポリマーは、重量により実質的に変化する。約２００〜約３５，０００、約１，０００〜約１５，０００、および２，０００〜約１２，５００の範囲の数平均分子量を有するポリマーが本発明の目的のために通常選択される。の分子量が好ましく、２，０００〜約１２，５０００が特に好ましい。   For example, the target binding agent can be associated with a polymer, eg, a substantially non-antigenic polymer (eg, polyoxyalkylene oxide or polyethylene oxide). Suitable polymers vary substantially by weight. Polymers having number average molecular weights in the range of about 200 to about 35,000, about 1,000 to about 15,000, and 2,000 to about 12,500 are usually selected for the purposes of the present invention. Is preferred, with 2,000 to about 12,5000 being particularly preferred.

例えば、標的結合因子を、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンと複合化させ得る。そのようなポリマー非限定的なリストは、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、その共重合体およびそのブロック共重合体（但し、ブロック共重合体の水溶性は維持されている）を含む。さらなる有用なポリマーとして、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロック共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）；ポリメタクリレート；カルボマー；糖モノマーＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸を含む分鎖または非分鎖の多糖、例えばホモ多糖およびヘテロ多糖、例えばラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖の多糖サブユニット、例えばヒアルロン酸；糖アルコールのポリマー、例えばポリソルビトールおよびポリマンニトール等；ヘパリンまたはヘパロンが挙げられる。   For example, the target binding agent can be complexed with a water soluble polymer such as a hydrophilic polyvinyl polymer such as polyvinyl alcohol and polyvinyl pyrrolidone. Such polymer non-limiting lists include polyalkylene oxide homopolymers such as polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol, polyoxyethylenated polyols, copolymers thereof and block copolymers thereof (provided that block copolymer The water solubility of the coalescence is maintained). Further useful polymers include polyoxyalkylenes such as polyoxyethylene, polyoxypropylene and block copolymers of polyoxyethylene and polyoxypropylene (Pluronics); polymethacrylates; carbomers; sugar monomers D-mannose, D- and L -Galactose, fucose, fructose, D-xylose, L-arabinose, D-glucuronic acid, sialic acid, D-galacturonic acid, D-mannuronic acid (eg polymannuronic acid or alginic acid), D-glucosamine, D-galactosamine, D Branched or unbranched polysaccharides including glucose and neuraminic acid, such as homopolysaccharides and heteropolysaccharides such as lactose, amylopectin, starch, hydroxyethyl starch, amylose, dextran sulfate Tran, dextran, dextrins, glycogen, or the polysaccharide subunit of acid mucopolysaccharides, such as hyaluronic acid; polymers of sugar alcohols, such as poly and polymannitol like; heparin or Heparon the like.

また、他の化合物、例えば細胞毒、標識、または他の標的因子、例えば別の標的結合因子もしくは非関連因子を、同じポリマーに連結し得る。モノ活性化アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、モノメトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）；Ｃ１−４アルキル末端ポリマー；およびビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）を架橋のために使用し得る。例えば、ＵＳ５，９５１，９７４を参照されたい。 In addition, other compounds, such as cytotoxins, labels, or other target factors, such as another target binding factor or unrelated factor, may be linked to the same polymer. Mono-activated alkoxy-terminated polyalkylene oxides (PAO), such as monomethoxy-terminated polyethylene glycol (mPEG); C 1-4 alkyl-terminated polymers; and bis-activated polyethylene oxide (glycol) can be used for crosslinking. See, for example, US 5,951,974.

その最も一般的な形態で、ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧは、ヒドロキシル基の末端を有し、以下の一般構造を有する、直鎖状または分枝状のポリエーテルである：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ＰＥＧは、エポキシ環上のヒドロキシドイオンの求核攻撃により開始されるエチレンオキシドのアニオン性開環重合により合成され得る。ポリペプチド改変に特に有用なのは、以下の一般構造を有するモノメトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧである：
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
さらなる説明については、例えばＲｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９−４７６を参照されたい。 In its most common form, poly (ethylene glycol), PEG is a linear or branched polyether having a hydroxyl group end and the following general structure:
HO- (CH 2 CH 2 O) n -CH 2 CH 2 -OH
PEG can be synthesized by anionic ring-opening polymerization of ethylene oxide initiated by nucleophilic attack of hydroxide ions on the epoxy ring. Particularly useful for polypeptide modification is monomethoxy PEG, mPEG, having the following general structure:
CH 3 O- (CH 2 CH 2 O) n -CH 2 CH 2 -OH
For further explanation see, for example, Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476.

一実施形態において、架橋前のポリマーは水溶性である必要はないが、水溶性であるのが好ましい。一般的に、架橋後の生成物は水溶性であり、例えば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。さらに、ポリマーは複合形態で高い免疫原性であるべきではなく、また、この複合体が静脈内点滴または注射等の経路により投与されることを意図するのであれば、そのような経路と適合しない粘度を有するべきではない。   In one embodiment, the polymer prior to crosslinking need not be water soluble, but is preferably water soluble. In general, the product after crosslinking is water soluble, eg, exhibits a water solubility of at least about 0.01 mg / ml, more preferably at least about 0.1 mg / ml, and even more preferably at least about 1 mg / ml. . Furthermore, the polymer should not be highly immunogenic in complex form and is not compatible with such routes if the conjugate is intended to be administered by routes such as intravenous infusion or injection. Should not have viscosity.

一実施形態において、このポリマーは、反応性のある単一の基のみを含む。これはタンパク質分子の架橋を避けるのに役立つ。しかし、架橋を低減するために反応条件を最大化すること、または実質的に同質の誘導体を回収するために反応生成物をゲルろ過もしくはイオン交換クロマトグラフィーにより精製することは、本明細書中の範囲内にある。他の実施形態において、ポリマーは、複数の因子をポリマーの主鎖に連結するために二つ以上の反応基を含む。再び、ゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィーを使用して、所望の誘導体を実質的に同質な形態で回収し得る。   In one embodiment, the polymer contains only a single group that is reactive. This helps to avoid cross-linking of protein molecules. However, maximizing reaction conditions to reduce cross-linking, or purifying the reaction product by gel filtration or ion exchange chromatography to recover substantially homogeneous derivatives is described herein. Is in range. In other embodiments, the polymer comprises two or more reactive groups to link multiple factors to the polymer backbone. Again, gel filtration or ion exchange chromatography can be used to recover the desired derivative in a substantially homogeneous form.

ポリマーの分子量は、約５００，０００Ｄまでの範囲であり得、好ましくは少なくとも約２０，０００Ｄ、または少なくとも約３０，０００Ｄ、または少なくとも約４０，０００Ｄである。選択される分子量は、達成される複合体の有効な大きさ、ポリマーの性質（例えば、直鎖状または分枝状等の構造）および誘導体化の程度に依存し得る。   The molecular weight of the polymer can range up to about 500,000 D, and is preferably at least about 20,000 D, or at least about 30,000 D, or at least about 40,000 D. The molecular weight selected can depend on the effective size of the complex achieved, the nature of the polymer (eg, linear or branched structure) and the degree of derivatization.

共有結合による架橋は、例えばＮ末端アミノ基およびリジン残基に見受けられるイプシロンアミノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたは他の親水基への架橋によって標的結合因子（例えば、タンパク質）をポリマーへ連結するために使用し得る。ポリマーは、多官能性（普通は二官能性）架橋剤を使用することなく標的結合タンパク質に直接共有結合させ得る。アミノ基への共有結合は、シアヌル酸塩化物、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、または塩化ＰＥＧ＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシンイミジルエステル、活性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく公知の化学により達成される。カルボキシル基はカルボジイミドを使用してＰＥＧ−アミンに結合させることにより誘導体化し得る。スルフヒドリル基は、マレイミド置換ＰＥＧ（例えば、アルコキシ−ＰＥＧアミン＋スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）ＷＯ９７／１０８４７またはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａから市販されているＰＥＧ−マレイミド）に結合させることにより誘導体化し得る。あるいは、例えばＰｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１２６−１１３０（１９９４）に記載されるように、結合タンパク質上の遊離アミノ基（例えば、リジン残基上のイプシロンアミノ基）を、２−イミノ−チオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）によりチオール化し、次いで、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体に結合させ得る。   Covalent cross-linking can be achieved by targeting the binding agent (eg, protein ) Can be used to link to the polymer. The polymer can be covalently linked directly to the target binding protein without the use of a polyfunctional (usually bifunctional) crosslinker. Covalent attachment to the amino group includes cyanuric acid chloride, carbonyldiimidazole, aldehyde reactive group (PEG alkoxide + diethyl acetal of bromoacetaldehyde; PEG + DMSO and acetic anhydride, or phenoxide of PEG + 4-hydroxybenzaldehyde chloride, activated succinimid Ester, activated dithiocarbonate PEG, 2,4,5-trichlorophenyl chloroformate or P-nitrophenyl chloroformate activated PEG). The carboxyl group can be derivatized by conjugation to PEG-amine using carbodiimide. Sulfhydryl groups are described in maleimide-substituted PEG (eg, alkoxy-PEG amine + sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate) WO 97/10847 or Shearwater Polymers, Inc. PEG-maleimide commercially available from Huntsville, Ala). Alternatively, see, for example, Pedley et al. , Br. J. et al. Cancer, 70: 1126-1130 (1994), free amino groups on binding proteins (eg, epsilon amino groups on lysine residues) can be converted to thiols by 2-imino-thiolane (Traut's reagent). And then coupled to a maleimide-containing derivative of PEG.

標的結合因子（例えば、タンパク質）へ結合させ得る機能性ＰＥＧポリマーは、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．）から入手し得る。そのような市販されているＰＥＧ誘導体として、例えば、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−スクシナート、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシンイミジルスクシナート、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオナート、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジルカルボネート、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカルボネート、ＰＥＧトレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、ヘテロ機能性ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシランおよびＰＥＧホスフォリド（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｄｅ）が挙げられる。これらのＰＥＧ誘導体を結合させる反応条件は、Ｔｉｅ１結合タンパク質、ＰＥＧ化の所望の程度、および利用されるＰＥＧ誘導体に応じて変更し得る。ＰＥＧ誘導体の選択に伴う幾つかの因子として、所望の結合点（例えばリジンまたはシステインＲ基）、誘導体の加水分解安定性および反応性、結合の安定性、毒性および抗原性、分析の適切性等が挙げられる。任意の特定の誘導体の使用の具体的な説明は、製造者から入手し得る。   Functional PEG polymers that can be conjugated to target binding agents (eg, proteins) are described in, for example, Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.). Examples of such commercially available PEG derivatives include amino-PEG, PEG amino acid ester, PEG-hydrazide, PEG-thiol, PEG-succinate, carboxymethylated PEG, PEG-propionic acid, PEG amino acid, PEG succinimid. Rusuccinate, PEG succinimidyl propionate, succinimidyl ester of carboxymethylated PEG, succinimidyl carbonate of PEG, succinimidyl ester of amino acid PEG, PEG-oxycarbonylimidazole, PEG-nitrophenyl Carbonate, PEG tresylate, PEG-glycidyl ether, PEG-aldehyde, PEG vinyl sulfone, PEG-maleimide, PEG-orthopyridyl-disulfide, Hetero functional PEG, PEG vinyl derivatives, PEG silanes and PEG Hosuforido (phospholide) is. The reaction conditions for conjugating these PEG derivatives can vary depending on the Tiel binding protein, the desired degree of PEGylation, and the PEG derivative utilized. Some factors associated with the choice of PEG derivatives include the desired point of attachment (eg, lysine or cysteine R group), hydrolytic stability and reactivity of the derivative, binding stability, toxicity and antigenicity, analytical suitability, etc. Is mentioned. Specific instructions for the use of any particular derivative can be obtained from the manufacturer.

標的結合因子（例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質）およびポリマーの複合体は、例えばゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣにより未反応の出発物質から分離し得る。複合物の非相同種は、互いから同様に精製される。また、未反応のアミノ酸のイオン的性質の違いのために、異なる種（例えば、一つまたは二つのＰＥＧ残基を有するもの）の分離も可能である。例えば、ＷＯ９６／３４０１５を参照されたい。   The complex of target binding agent (eg, Tie1 binding protein) and polymer can be separated from unreacted starting material by, eg, gel filtration or ion exchange chromatography, eg, HPLC. Complex heterologous species are similarly purified from each other. It is also possible to separate different species (eg having one or two PEG residues) due to differences in the ionic properties of unreacted amino acids. See for example WO 96/34015.

標的結合タンパク質は安定化または保持機能を与えるタンパク質、例えばアルブミン、例えばヒト血清アルブミンと物理的に会合させることもできる。ＵＳ２００４０１７１７９４は血清アルブミンにタンパク質を物理的に会合させるための例示される方法を記載している。例えばヒトアルブミンの配列またはそのフラグメント、ＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７、特に米国特許２００４０１７１７９４およびＷＯ０１／７９４８０の配列番号１８に示されるヒトアルブミンの成熟型、または、他の脊椎動物由来のアルブミンまたはそのフラグメント、またはこれ等の分子の類縁体または変異体、またはそのフラグメントが例示される。他の例示されるヒト血清アルブミンタンパク質は以下のセットの点突然変異、Ｌｅｕ−４０７〜Ａｌａ、Ｌｅｕ−４０８〜Ｖａｌ、Ｖａｌ−４０９〜Ａｌａ、およびＡｒｇ−４１０〜Ａｌａ；またはＡｒｇ−４１０〜Ａｌａ、Ｌｙｓ−４１３〜Ｇｌｕ、およびＬｙｓ−４１４〜Ｇｌｎ（例えば国際公開ＷＯ９５／２３８５７およびＵＳ２００４０１７１７９４の配列番号１８参照）の１つまたは両方を包含することができる。   The target binding protein can also be physically associated with a protein that provides a stabilizing or retention function, such as albumin, eg, human serum albumin. US20040171794 describes an exemplary method for physically associating proteins with serum albumin. For example, the sequence of human albumin or a fragment thereof, EP201239, EP322094 WO97 / 24445, WO95 / 23857, in particular the mature form of human albumin shown in SEQ ID NO: 18 of US Patent 20040171794 and WO01 / 79480, or albumin from other vertebrates or Examples thereof are fragments, analogs or variants of these molecules, or fragments thereof. Other exemplary human serum albumin proteins are the following set of point mutations: Leu-407-Ala, Leu-408-Val, Val-409-Ala, and Arg-410-Ala; or Arg-410-Ala, One or both of Lys-413-Glu and Lys-414-Gln (see, eg, International Publication No. WO95 / 23857 and US20040117794, SEQ ID NO: 18) can be included.

（アプタマー）
一実施形態において、本発明は標的タンパク質結合剤、例えばアプタマーを特徴とする。核酸「アプタマー」という用語は本明細書においては、少なくとも５ヌクレオチドの内部非二重らせん核酸構造を包含するコンホーメーションを有する核酸分子を指す。アプタマーは自己相補性の領域を有する１本鎖核酸分子であることができる。例示されるアプタマーは核酸以外の標的分子に、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する核酸分子を包含する。特定のアプタマーはまたＴｉｅ複合体の形成を調節するか、または、本明細書に記載した標的結合剤の特性１つ以上を有してよく、そして標的結合タンパク質の代わりに使用できる。 (Aptamer)
In one embodiment, the invention features a target protein binding agent, such as an aptamer. The term nucleic acid “aptamer” as used herein refers to a nucleic acid molecule having a conformation that includes an internal non-duplex nucleic acid structure of at least 5 nucleotides. Aptamers can be single-stranded nucleic acid molecules having self-complementary regions. Exemplary aptamers include nucleic acid molecules that bind to target molecules other than nucleic acids, eg, Tie1, Tie2, or Ang. Certain aptamers may also modulate the formation of Tie complexes or have one or more of the properties of the targeted binding agent described herein and can be used in place of the targeted binding protein.

選択されたアプタマーを標準的な核酸増幅操作法により回収できるため、アプタマーをインビトロでスクリーニングすることができる。方法は例えば選択の後期の回において、選択されたアプタマーをプールに分割し、そしてプール内の各アプタマーを蛍光団のような検出可能な標識で修飾することにより増強することができる。標識の特性を機能的に改変するアプタマーを有するプールを発見することができる。このようなプールを反復して分割し、再分析することにより、所望の特性を有する個々のアプタマーを発見することができる（例えばＪｈａｖｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２９３参照）。   Aptamers can be screened in vitro because selected aptamers can be recovered by standard nucleic acid amplification procedures. The method can be enhanced, for example, in later rounds of selection, by dividing the selected aptamer into pools and modifying each aptamer in the pool with a detectable label such as a fluorophore. Pools with aptamers that functionally alter the properties of the label can be found. Such pools can be iteratively divided and re-analyzed to find individual aptamers with the desired properties (see, eg, Jhaberi et al., Nature Biotechnol. 18: 1293).

更に又、アプタマーをスクリーニングしてインビボの活性の有るもの得ることができる。例えば夾雑状態の核酸は、細胞内に導入された発現ベクター内にクローニングすることができる。発現された夾雑状態の核酸から得られるＲＮＡアプタマーをスクリーニングして生物学的活性のあるものを得ることができる。活性を有する細胞を単離して選択されたＲＮＡアプタマーに関する発現ベクターを回収することができる。   Furthermore, aptamers can be screened for in vivo activity. For example, a contaminated nucleic acid can be cloned into an expression vector introduced into the cell. An RNA aptamer obtained from the expressed nucleic acid in a contaminated state can be screened to obtain a biologically active one. An active vector can be isolated and the expression vector for the selected RNA aptamer can be recovered.

治療用オリゴマー（例えばアプタマー）の重要な特徴は投与されたオリゴマーの骨格の設計である。一部の実施形態においては、インビボで安定であり、オリゴマーがホスホジエステル結合を攻撃するヌクレアーゼのような内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるような構造のヌクレオシド内結合を骨格は含有する。同時に、オリゴマーは標的ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズするその能力を保持している（Ａｇａｒｗａｌ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３００９；Ａｇａｒｗａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：７０７９）。修飾されたオリゴヌクレオチドは代替となるヌクレオシド結合を用いて構築できる。これ等の例示される結合の数種はＵｈｌｍａｎｎ，Ｅ． ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３−５８４に記載されている。これ等に包含されるものは、メチルホスホネート（リン結合酸素の１つがメチルにより置き換えられているもの）；ホスホロチオエート（イオウがこれ等の酸素の１つを置き換えている）および種々のアミデート（ＮＨ２または有機アミン誘導体、例えばモルホリデートまたはピペラジデートが酸素を置き換えている）である。これ等の置換により増強された安定性が得られる。ＷＯ９１／１５５００はヌクレオシド内結合の１つ以上がイオウ系の結合、典型的にはホスホジエステルと同配性および等電性であるスルファメートジエステルで置き換えられている種々のオリゴヌクレオチド類縁体を記載している。ＷＯ８９／１２０６０は同様にスルフィド、スルホキシドおよびスルホンを含有する結合を開示している。ＷＯ８６／０５５１８は立体規則性重合体３’，５’結合の変異体を示唆している。米国特許５，０７９，１５１は２’，５’ホスホジエステル結合を介して１本鎖ＤＮＡに連結している分枝鎖ＲＮＡのｍｓＤＮＡ分子を開示している。米国特許５，２６４，５６２は式Ｙ’ＣＸ’２Ｙ’（ただし式中Ｙ’は独立してＯまたはＳであり、そして各Ｘ’は安定化置換基であり独立して選択されるものである）の修飾された結合を記載している。モルホリノ型のヌクレオチド内結合は米国特許５，０３４，５０６に記載されており、一部の場合においては相補標的配列に対するオリゴマーの増大した親和性を与える。米国特許５，２６４，５６２および５，５９６，０８６は標的ＲＮＡおよびＤＮＡへの強力なハイブリダイゼーションが可能な修飾されたヌクレオチド結合を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを開示している。 An important feature of therapeutic oligomers (eg aptamers) is the design of the backbone of the administered oligomer. In some embodiments, the scaffold contains intranucleoside linkages that are stable in vivo and are structured such that the oligomers are resistant to endogenous nucleases such as nucleases that attack phosphodiester linkages. At the same time, the oligomer retains its ability to hybridize to the target DNA or RNA (Agarwal, KL et al. (1979) Nucleic Acids Res. 6: 3009; Agarwal, S. et al. (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079). Modified oligonucleotides can be constructed using alternative nucleoside linkages. Some of these exemplified linkages are Uhlmann, E .; and Peyman, A .; (1990) Chemical Reviews 90: 543-584. Included among these are methyl phosphonates (where one of the phosphorus-bound oxygens is replaced by methyl); phosphorothioates (where sulfur replaces one of these oxygens) and various amidates (NH 2 Or an organic amine derivative such as morpholidate or piperazidate replacing oxygen). These substitutions provide enhanced stability. WO 91/15500 describes various oligonucleotide analogs in which one or more of the intranucleoside linkages are replaced with sulfur-based linkages, typically sulfamate diesters that are isotropic and isoelectric with phosphodiesters. is doing. WO 89/12060 likewise discloses linkages containing sulfides, sulfoxides and sulfones. WO86 / 05518 suggests a variant of the stereoregular polymer 3 ′, 5 ′ linkage. US Pat. No. 5,079,151 discloses msRNA molecules of branched RNA linked to single stranded DNA via 2 ′, 5 ′ phosphodiester bonds. US Pat. No. 5,264,562 shows the formula Y′CX ′ 2 Y ′ where Y ′ is independently O or S, and each X ′ is a stabilizing substituent and is independently selected The modified linkage is described. Morpholino-type intranucleotide linkages are described in US Pat. No. 5,034,506, and in some cases provide increased affinity of oligomers for complementary target sequences. US Pat. Nos. 5,264,562 and 5,596,086 disclose modified oligonucleotides having modified nucleotide linkages capable of strong hybridization to target RNA and DNA.

（処置）
Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する結合因子は、治療的および予防的有用性を有する。例えば、これらの結合因子は培養中、例えばインビトロまたはエクスビボで細胞に投与して、または被験体に例えばインビボで投与して、内皮細胞障害、血管発達障害、傷の治癒、炎症疾患および癌、特に転移性癌等の多様な障害の処置、予防および／または診断を行い得る。用語「処置する」または「処置」とは、因子を単独または一つ以上の他の因子（例えば第二因子）と組み合わせて被験体、例えば患者、例えば、疾患（例えば、本明細書中に記載される障害）、障害の症状または障害に対する疾病素質を有する患者に、例えば、障害、障害の症状または障害に対する疾病素質を治療、治癒（ｈｅａｌ）、緩和、軽減、変化、矯正、改善、向上または影響するための、適用または投与をいう。細胞を処置するとは、細胞の活性の減少、例えば、細胞の管または脈管を形成する能力の減少をいう。減少は、活性の全体的な除去を必ずしも必要としないが、細胞の活性または数の減少、例えば統計的に有意な減少を必要とする。 (treatment)
Binding agents that bind to Tie1, Tie2, or Ang have therapeutic and prophylactic utility. For example, these binding agents are administered to cells in culture, for example in vitro or ex vivo, or administered to a subject, for example in vivo, to treat endothelial cell disorders, vascular development disorders, wound healing, inflammatory diseases and cancer, especially Various disorders such as metastatic cancer can be treated, prevented and / or diagnosed. The term “treat” or “treatment” refers to a subject, eg, a patient, eg, a disease (eg, as described herein), alone or in combination with one or more other factors (eg, a second factor). A disorder, a symptom of the disorder, or a predisposition to the disorder, such as treating, healing, mitigating, reducing, changing, correcting, improving, improving, or treating the disorder, a symptom of the disorder or a predisposition to the disorder, or Refers to application or administration to affect. Treating a cell refers to a decrease in the activity of the cell, eg, a decrease in the ability of the cell to form a tube or vessel. The reduction does not necessarily require an overall removal of activity, but requires a reduction in the activity or number of cells, for example a statistically significant reduction.

本明細書中で使用される場合、疾患を処置するのに有効な結合因子の量、または「治療有効量」とは、被験体に対する一回または複数回の投与の際に、細胞、例えば内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ１発現内皮細胞）または癌細胞（特にその転移細胞）を処置するのに、または、そのような処置のない場合に期待される以上に、治癒を長期化し、本明細書中に記載される障害を有する被験体を緩和、救済または改善するのに有効な結合因子の量をいう。ある場合には、治療有効量は、結合因子の、処置されないコントロールマウスと比較して、ヌードマウスモデルにおける異種移植片の腫瘍の大きさを低下させる能力を評価することにより確定し得る。本明細書中で使用される場合、腫瘍もしくは他の新生物の「成長の阻害」は、その成長および転移を遅延、中断、阻止または停止することをいい、必ずしも新生物成長の全体的な除去を示すものではない。   As used herein, the amount of a binding agent effective to treat a disease, or “therapeutically effective amount” refers to a cell, eg, an endothelium, upon single or multiple administrations to a subject. Prolonged healing beyond what would be expected to treat cells (eg, Tie1-expressing endothelial cells) or cancer cells (especially their metastatic cells) or in the absence of such treatment, Refers to the amount of binding agent effective to alleviate, rescue or ameliorate a subject having the described disorder. In some cases, a therapeutically effective amount can be determined by assessing the ability of the binding agent to reduce tumor size of the xenograft in a nude mouse model compared to untreated control mice. As used herein, “inhibition of growth” of a tumor or other neoplasm refers to delaying, interrupting, preventing or stopping its growth and metastasis, and not necessarily the overall elimination of neoplastic growth. It does not indicate.

本明細書中で使用される場合、障害を予防するのに有効な標的結合因子の量、または標的結合因子の「予防有効量」は、被験体に対する一回または複数回の投与の際に、疾患（例えば内皮細胞関連障害、血管発達障害、炎症性疾患または癌）の発生または再発を防止または遅延するのに有効である標的結合因子、例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば、本発明中に記載のＴｉｅ１結合抗原）の量を意味する。   As used herein, an amount of a target binding agent effective to prevent a disorder, or a “prophylactically effective amount” of a target binding agent, is defined as one or more administrations to a subject. Target binding agents that are effective in preventing or delaying the development or recurrence of diseases (eg, endothelial cell related disorders, vascular development disorders, inflammatory diseases or cancer), eg, Tie1-binding proteins (eg, as described in the present invention) Means the amount of Tie1-binding antigen).

治療することができる被験体はヒトおよび非ヒト動物を包含する。例えばヒトは異常な細胞増殖または細胞分化を特徴とする障害を有するヒト患者であることができる。「非ヒト動物」という用語は全ての脊椎動物、例えば非哺乳類（例えばニワトリ、両生類、爬虫類）および哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ等を包含する。   Subjects that can be treated include human and non-human animals. For example, the human can be a human patient having a disorder characterized by abnormal cell proliferation or cell differentiation. The term “non-human animal” includes all vertebrates such as non-mammals (eg chickens, amphibians, reptiles) and mammals such as non-human primates, sheep, dogs, cows, pigs and the like.

本明細書に記載した結合剤は例えば癌（例えば固形腫瘍）または新脈管形成関連障害を治療するために被験体において新脈管形成を低減するために使用できる。方法は例えば新脈管形成、障害の症状、または障害の進行を調節するために十分な量で患者に結合剤を投与することを包含する。薬剤（例えばＴｉｅ１結合タンパク質、例えば抗Ｔｉｅ１抗体、例えばＥ３）は治療有効量が達成される前に複数回（例えば少なくとも２、３、５または１０回）投与してよい。   The binding agents described herein can be used, for example, to reduce angiogenesis in a subject to treat cancer (eg, a solid tumor) or angiogenesis-related disorders. The method includes, for example, administering the binding agent to the patient in an amount sufficient to modulate angiogenesis, symptoms of the disorder, or progression of the disorder. The agent (eg, Tie1-binding protein, eg, anti-Tie1 antibody, eg, E3) may be administered multiple times (eg, at least 2, 3, 5 or 10 times) before a therapeutically effective amount is achieved.

結合剤、例えばＴｉｅ１結合タンパク質は、癌の治療または防止のために使用できる。一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質によるＴｉｅ１活性の低減は腫瘍の近傍および周囲の新脈管形成を低減または防止することができ、これにより、腫瘍の生育を低減または防止する。別の実施形態においては、新生物は異常に増殖している内皮細胞または造血細胞を包含する。Ｔｉｅ１結合タンパク質は癌細胞自体を調節するため、例えばＴｉｅ１を発現する新生物性の細胞を殺傷または除去するために使用できる。例えば細胞は造血細胞である。   Binders such as Tie1 binding proteins can be used for the treatment or prevention of cancer. In one embodiment, reduction of Tie1 activity by a Tie1 binding protein can reduce or prevent angiogenesis near and around the tumor, thereby reducing or preventing tumor growth. In another embodiment, the neoplasm includes abnormally proliferating endothelial cells or hematopoietic cells. Tie1-binding proteins can be used to regulate cancer cells themselves, for example to kill or remove neoplastic cells that express Tie1. For example, the cell is a hematopoietic cell.

処置され得る癌の例として、これらに限定されないが、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移病巣が挙げられる。固形腫瘍の具体例として、多様な器官系の悪性腫瘍、例えば肉腫、腺癌および癌腫、例えば、肺、胸、リンパ管、胃腸（例えば、結腸）および尿生殖器管（例えば、腎臓細胞、尿路上皮細胞）、咽頭、前立腺、卵巣に影響を与える腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えばほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞腺癌、肝臓癌、肺の非小細胞腺癌、小腸の癌等の腺癌を含む。また、上記癌の転移病巣を、本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合タンパク質および他の因子を使用して、処置または予防し得る。   Examples of cancers that can be treated include, but are not limited to, solid tumors, soft tissue tumors, and metastatic lesions. Specific examples of solid tumors include malignant tumors of various organ systems such as sarcomas, adenocarcinomas and carcinomas such as lungs, breasts, lymphatics, gastrointestinal (eg colon) and genitourinary tracts (eg kidney cells, urinary tract) Skin cells), tumors affecting the pharynx, prostate, ovary, as well as malignant tumors such as most colon cancer, rectal cancer, renal cell adenocarcinoma, liver cancer, non-small cell adenocarcinoma of the lung, cancer of the small intestine Including cancer. In addition, metastatic lesions of the cancer can be treated or prevented using the Tie1-binding proteins and other factors described herein.

処置され得る固形腫瘍の更なる例として、多様な器官系の悪性腫瘍、例えば肺、胸、リンパ節、胃腸（例えば結腸）および尿性器管、前立腺、卵巣、咽頭に影響を与える腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えばほとんどの結腸癌、腎臓細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣癌、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌等の腺癌を治療するために有用でありうる。治療可能な例示的な固体腫瘍として、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、Ｅｗｉｎｇ腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃腸系癌腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、泌尿生殖細胞系癌腫、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌腫、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、内分泌系癌、睾丸腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、非小細胞癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。   Further examples of solid tumors that can be treated include malignant tumors of various organ systems such as lung, breast, lymph nodes, gastrointestinal (eg colon) and urinary tract, prostate, ovary, pharyngeal tumors, and malignant It may be useful to treat tumors such as adenocarcinoma such as most colon cancer, renal cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular cancer, non-small cell lung carcinoma, small intestine cancer and esophageal cancer. Exemplary solid tumors that can be treated include fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, hemangiosarcoma, endothelial sarcoma, lymphangiosarcoma, lymphatic endothelial sarcoma, synovial tumor, mesothelioma Tumor, Ewing tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, gastrointestinal carcinoma, colon carcinoma, pancreatic cancer, breast cancer, urogenital cell carcinoma, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland Carcinoma, sebaceous carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinoma, cystadenocarcinoma, medullary cancer, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, liver cancer, cholangiocarcinoma, choriocarcinoma, seminoma, fetal carcinoma, Wilms tumor, Cervical cancer, endocrine cancer, testicular tumor, lung carcinoma, small cell lung carcinoma, non-small cell carcinoma, bladder carcinoma, epithelial carcinoma, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, Pineal tumor, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblast Cell tumor and retinoblastoma, and the like.

また、Ｔｉｅ１結合タンパク質を使用して、造血組織起源の過形成性／新生細胞、例えば、骨髄、リンパ球または赤血球系列に由来する細胞、またはその前駆細胞、特にＴｉｅ１を発現するような細胞の増殖を阻害し得る。例えば、本明細書中に記載される結合タンパク質を、これらに限定されないが、急性前骨髄白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７に概説）等の、多様な骨髄障害の処置に使用し得る。処置され得るリンパ系悪性腫瘍として、これらに限定されないが、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、例えば、Ｂ由来ＡＬＬとＴ由来ＡＬＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＬＬ）およびＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍのマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなる形態として、非ホジキンスリンパ腫およびその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ性白血病（ＬＧＦ）ならびにホジキンス病が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｉｅ１は急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群（Ｖｅｒｓｔｏｖｓｅｋ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｌｅｕｋ，Ｌｍｐｈｏｍａ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ａｇｕａｙｏ ｅｔ ａｌ，２００１．Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（４）：２７９−８５．）において上方調節されることが示されるので、Ｔｉｅ１と相互作用する結合タンパク質を使用して、これら疾病の検出、処置または予防し得る。   Also, using Tie1-binding protein to proliferate hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic tissue origin, such as cells derived from bone marrow, lymphocytes or erythroid lineage, or progenitor cells thereof, particularly cells expressing Tie1 Can be inhibited. For example, the binding proteins described herein include, but are not limited to, acute promyelocytic leukemia (APML), acute myeloid leukemia (AML), and chronic myelogenous leukemia (CML) (Vaikus, L. (1991). ) Crit Rev. in Oncol./Hemotol.11:267-97), etc.). Lymphoid malignancies that can be treated include, but are not limited to, acute lymphoblastic leukemia (ALL), such as B-derived ALL and T-derived ALL, chronic lymphocytic leukemia (CLL), prolymphocytic leukemia (PLL), Examples include, but are not limited to, hairy cell leukemia (HLL) and Waldenstrom's macroglobulinemia (WM). Additional forms of malignant lymphoma include non-Hodgkins lymphoma and variants thereof, peripheral T-cell lymphoma, adult T-cell leukemia / lymphoma (ATL), cutaneous T-cell lymphoma (CTCL), large granular lymphocytic leukemia (LGF) and Hodgkins disease For example, but not limited to. Tie1 is up in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome (Verstovsek et al. 2001, Leuk, Lmphoma), B-cell chronic lymphocytic leukemia (Aguayo et al, 2001. Leukemia Research 25 (4): 279-85.) As shown to be modulated, binding proteins that interact with Tie1 may be used to detect, treat or prevent these diseases.

従って、造血系障害、例えば造血系の癌を有するか、その危険性のある被験体を、Ｔｉｅ１結合タンパク質、例えばＴｉｅ１ホモ二量体化を増大させるＴｉｅ１結合タンパク質、またはＴｉｅ複合体形成に拮抗する結合タンパク質を投与することにより治療することができる。例えばＴｉｅ１結合タンパク質は抗Ｔｉｅ１抗体、例えば本明細書に記載した抗体であることができる。結合タンパク質の投与は例えば１回より多い投薬を用いながら治療濃度を達成するための複数回投与を包含できる。例えば、投与は約週一回、２日毎または３日毎等とすることができる。   Thus, a subject having or at risk for a hematopoietic disorder, eg, a hematopoietic cancer, antagonizes Tie1 binding protein, eg, Tie1 binding protein that increases Tie1 homodimerization, or Tie complex formation. It can be treated by administering the binding protein. For example, the Tie1 binding protein can be an anti-Tie1 antibody, eg, an antibody described herein. Administration of the binding protein can include multiple doses to achieve therapeutic concentrations, for example using more than one dose. For example, administration can be about once a week, every 2 days, every 3 days, etc.

Ｔｉｅ１と結合するタンパク質および他の因子を投与する方法は、「薬学的組成物」にも記載される。使用される分子の適切な投薬量は、被験体の年齢および体重ならびに使用される特定の薬剤に依存する。結合タンパク質を、望ましくない相互作用、例えば、天然または病理学的因子とＴｉｅ１との間の相互作用を阻害、減少させる競合因子として使用し得る。   Methods for administering proteins and other factors that bind to Tiel are also described in “Pharmaceutical compositions”. The appropriate dosage of the molecule used depends on the age and weight of the subject and the particular drug used. The binding protein may be used as a competing factor that inhibits or reduces undesired interactions, such as interactions between natural or pathological factors and Tie1.

一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質を使用して、細胞、例えば、内皮細胞をインビボで阻害する（例えば、細胞の少なくとも一つの活性を阻害し、増殖、移動、成長または生存力を低下させる）。結合タンパク質はそれだけで使用し得、または因子（例えば細胞毒薬物、細胞毒酵素、または放射性同位体と複合体化して使用し得る。この方法は、結合タンパク質をそれのみ、または細胞毒薬物と結合させて、そのような処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する。   In one embodiment, a Tie1-binding protein is used to inhibit a cell, eg, an endothelial cell, in vivo (eg, inhibit at least one activity of the cell and reduce proliferation, migration, growth or viability). The binding protein can be used by itself or can be used in complex with a factor (eg, a cytotoxic drug, cytotoxic enzyme, or radioisotope. This method can bind the binding protein alone or with a cytotoxic drug. And administering to a subject in need of such treatment.

Ｔｉｅ１結合タンパク質はＴｉｅ１発現内皮細胞を認識し、そして癌細胞、例えば癌性の肺、肝臓、結腸、***、卵巣、上皮、喉頭および軟骨の細胞、そして特にその転移性の細胞に会合している（例えばその近接部にあるか、それと混在している）内皮細胞に結合することができるため、Ｔｉｅ１結合タンパク質は何れかのこのような細胞を阻害（例えば少なくとも１つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷）し、そして新脈管形成を阻害するために使用できる。癌近傍の内皮細胞活性を低減することは栄養、生育シグナル等に関して内皮細胞に依存している可能性の有る癌細胞を間接的に阻害（例えば少なくとも１つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷）することができる。   Tie1-binding protein recognizes Tie1-expressing endothelial cells and is associated with cancer cells such as cancerous lung, liver, colon, breast, ovary, epithelial, laryngeal and cartilage cells, and in particular their metastatic cells A Tie1-binding protein inhibits any such cell (eg, inhibits at least one activity, grows and proliferates) because it can bind to endothelial cells (eg, in its vicinity or mixed with it). Can be used to reduce or kill) and inhibit angiogenesis. Reducing endothelial cell activity in the vicinity of cancer indirectly inhibits cancer cells that may depend on endothelial cells for nutrition, growth signals, etc. (eg, inhibit at least one activity, reduce growth and proliferation, Or can be killed).

或いは、結合タンパク質は癌性の細胞の周辺の細胞に結合するが、癌性の細胞を直接または間接的に阻害（例えば少なくとも１つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷）するために十分癌性の細胞に接近している。即ち、Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば毒素で、例えば細胞毒で修飾されている）を用いて選択的に阻害（例えば癌性の組織における細胞を殺傷または除去）することができる（癌性の細胞自体および癌と会合しているかそれを侵襲している内皮細胞）。   Alternatively, the binding protein binds to cells surrounding the cancerous cell but directly or indirectly inhibits the cancerous cell (eg, inhibits at least one activity, reduces growth and proliferation, or kills). Close enough to cancerous cells. That is, Tie1-binding proteins (eg, with toxins, eg, modified with cytotoxins) can be used to selectively inhibit (eg, kill or remove cells in cancerous tissue) (the cancerous cells themselves and Endothelial cells associated with or invading cancer).

結合タンパク質は種々の細胞毒性薬品、例えば治療薬、放射線を発する化合物、植物、カビまたは細菌を起源とする分子、生物学的タンパク質およびこれ等の混合物を送達するために使用してよい。細胞毒性薬品は細胞内で作用する細胞毒性薬剤、例えば毒素、短レンジ放射線発射物質、例えば短レンジ高エネルギーα線発射物質であることができる。   The binding proteins may be used to deliver a variety of cytotoxic agents, such as therapeutic agents, radiation emitting compounds, molecules originating from plants, molds or bacteria, biological proteins and mixtures thereof. The cytotoxic agent can be a cytotoxic agent that acts intracellularly, such as a toxin, a short range radiation projectile, such as a short range high energy alpha projectile.

正常、良性の過形成性または癌性の細胞を殺傷または除去するためには、第１の結合タンパク質を、プロドラッグ活性化物質の近傍に存在する場合のみ活性化されるプロドラッグにコンジュゲートする。プロドラッグ活性化物質は第２の結合タンパク質、好ましくは標的分子上の非競合部位に結合するものにコンジュゲートする。２つの結合タンパク質が競合または非競合の結合部位に結合するかどうかは、従来の競合結合試験により調べることができる。例示される薬品−プロドラッグの対はＢｌａｋｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６：３２８７−３２９２に記載されている。   To kill or remove normal, benign hyperplastic or cancerous cells, a first binding protein is conjugated to a prodrug that is activated only when present in the vicinity of the prodrug activator. . The prodrug activator is conjugated to a second binding protein, preferably one that binds to a non-competitive site on the target molecule. Whether two binding proteins bind to competitive or non-competitive binding sites can be determined by conventional competitive binding tests. Exemplary drug-prodrug pairs are described in Blakely et al. (1996) Cancer Research, 56: 3287-3292.

天然の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を介して抗原発現細胞を排除するためにＴｉｅ１結合タンパク質をインビボで直接使用することができる。本明細書に記載した結合タンパク質は補体結合エフェクタードメイン、例えばＩｇＧ１、２または３のＦｃ部分、または補体に結合するＩｇＭの相当する部分を包含できる。一実施形態において、標的細胞の集団には本明細書に記載した結合剤および適切なエフェクター細胞をエクスビボで投与する。投与は補体または補体を含有する血清を添加することにより補給できる。更に本明細書に記載した結合タンパク質をコーティングした標的細胞の貪食作用は補体タンパク質の結合により向上させることができる。別の実施形態においては、補体結合エフェクタードメインを包含する結合タンパク質をコーティングした標的細胞を補体により溶解する。   Tie1-binding proteins can be used directly in vivo to eliminate antigen-expressing cells via natural complement dependent cytotoxicity (CDC) or antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC). The binding proteins described herein can include complement binding effector domains, such as the Fc portion of IgG1, 2, or 3, or a corresponding portion of IgM that binds complement. In one embodiment, the population of target cells is administered the binding agent described herein and the appropriate effector cells ex vivo. Administration can be supplemented by adding complement or serum containing complement. Furthermore, phagocytosis of target cells coated with the binding proteins described herein can be improved by binding of complement proteins. In another embodiment, target cells coated with a binding protein comprising a complement binding effector domain are lysed by complement.

癌を治療するための本明細書に記載した治療方法の使用は多くの利点を有する。Ｔｉｅ１の発現は腫瘍への栄養および酸素の供給を増大させるように血管およびリンパ管を包含する脈管構造の変化を刺激する腫瘍内部で生じる低酸素シグナルに応答して誘導される場合がある。特定のＴｉｅ１結合タンパク質（例えばＥ３および関連抗体）はそれらが腫瘍の脈管構造の変化を阻害することができ、そして腫瘍内圧力の低下を誘発する可能性があるため、特に有効である場合がある。これ等の薬剤はまた従来の薬剤が腫瘍内に浸透することが困難であった状況において治療薬として非常に適している。更に又、Ｔｉｅ１結合タンパク質は造血を無影響下におくことができる。治療は臨床パラメーターを用いて有効にモニタリングできる。或いは、これ等のパラメーターを用いてそのような治療を何時使用すべきかを示すことができる。   The use of the treatment methods described herein for treating cancer has many advantages. Tie1 expression may be induced in response to hypoxic signals generated within the tumor that stimulate changes in vasculature, including blood vessels and lymph vessels, to increase nutrient and oxygen supply to the tumor. Certain Tie1-binding proteins (eg, E3 and related antibodies) may be particularly effective because they can inhibit changes in tumor vasculature and can induce a decrease in intratumoral pressure. is there. These drugs are also very suitable as therapeutic agents in situations where it has been difficult for conventional drugs to penetrate into the tumor. Furthermore, the Tie1-binding protein can leave hematopoiesis unaffected. Treatment can be effectively monitored using clinical parameters. Alternatively, these parameters can be used to indicate when such treatment should be used.

Ｔｉｅ１結合タンパク質、例えばＴｉｅ１ホモ二量体化を増大させるＴｉｅ１結合タンパク質またはＴｉｅ複合体形成に拮抗する結合タンパク質を被験体に投与することにより炎症性障害、例えば乾癬または関節リウマチを治療または防止することができる。   Treating or preventing an inflammatory disorder, such as psoriasis or rheumatoid arthritis, by administering to a subject a Tie1-binding protein, such as a Tie1-binding protein that increases Tie1 homodimerization or a binding protein that antagonizes Tie complex formation Can do.

乾癬。乾癬は鱗片形成および炎症を特徴とする慢性の皮膚疾患である。乾癬が発症すると、典型的には皮膚のパッチが肥厚化、赤化し、そしてプラークと称される銀色味を帯びた鱗片で被覆されるようになる。乾癬は最も頻繁には肘、膝、頭皮、下部背面、顔面、手掌および足裏に生じる。疾患は又、手爪、足爪および口と生殖器の内部の軟組織に生じる場合も有る。乾癬患者の約１０％が関節炎の症状をもたらす関節の炎症を有している。患者は統計Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ｓＰＧＡ）を用いて評価でき、そして、軽度〜極めて重度の６カテゴリの範囲のカテゴリ評点を受ける。評点はプラーク、鱗片化および紅斑に基づく。本発明の治療方法を用いてこれ等の指標の少なくとも１つの改善を達成することができる。   psoriasis. Psoriasis is a chronic skin disease characterized by scaly formation and inflammation. When psoriasis develops, skin patches typically become thickened, reddened, and covered with a silvery scale called plaque. Psoriasis most often occurs on the elbows, knees, scalp, lower back, face, palms and soles. The disease can also occur in hand nails, toenails and soft tissues inside the mouth and genitals. About 10% of patients with psoriasis have joint inflammation that causes symptoms of arthritis. Patients can be assessed using the statistical Physician Global Assessment (sPGA) and receive category scores ranging from mild to very severe six categories. The score is based on plaque, scaly and erythema. At least one improvement of these indicators can be achieved using the treatment methods of the present invention.

関節リウマチ（ＲＡ）は疼痛、浮腫、強直、および、主に関節機能の消失を誘発する慢性炎症性疾患である。ＲＡは頻繁には滑膜、即ち保護嚢を形成している関節を包囲する膜において発症する。ＲＡに罹患した多くの個体において白血球が循環系から滑膜に浸潤し、連続した異常な炎症（例えば滑膜炎）を誘発する。その結果、滑膜が炎症を起こし、発熱、赤色化、浮腫および疼痛を誘発する。軟骨内のコラーゲンが徐々に破壊され、関節空間が狭小化し、最終的には骨を損傷する。炎症は罹患領域に糜爛性の骨損傷を生じさせる。この過程の間、滑膜の細胞が成長し、異常に***し、正常では薄膜である滑膜を肥厚化し、そして浮腫を有する腫脹した触感の関節をもたらす。ＲＡは種々の臨床的尺度で評価することができる。一部の例示される指標は総Ｓｈａｒｐ評点（ＴＳＳ）、Ｓｈａｒｐ糜爛評点およびＨＡＱ障害指数を包含する。本発明の治療方法を用いてこれ等の指標の少なくとも１つの改善を達成することができる。   Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that induces pain, edema, tonicity and mainly loss of joint function. RA frequently develops in the synovium, the membrane surrounding the joint that forms the protective sac. In many individuals with RA, leukocytes infiltrate the synovium from the circulatory system and induce a continuous abnormal inflammation (eg, synovitis). As a result, the synovium becomes inflamed and induces fever, redness, edema and pain. Collagen in the cartilage is gradually destroyed, the joint space is narrowed, and eventually the bone is damaged. Inflammation causes erosive bone damage in the affected area. During this process, synovial cells grow, divide abnormally, thicken the synovium, which is normally a thin film, and result in a swollen tactile joint with edema. RA can be assessed on various clinical scales. Some exemplary indicators include total Sharp score (TSS), Sharp score, and HAQ disability index. At least one improvement of these indicators can be achieved using the treatment methods of the present invention.

Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えばＴｉｅ１のホモ二量体化を増大させるＴｉｅ１結合タンパク質）またはＴｉｅ複合体形成に拮抗する結合タンパク質を被験体に投与することにより網膜の障害、例えば増殖性網膜症、例えば糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、または未熟児網膜症；脈絡膜新生血管形成；水晶体新生血管形成；角膜新生血管形成；虹彩新生血管形成；または結膜新生血管形成を治療または防止することができる。結合タンパク質は病的な眼の新生血管形成に関連する網膜剥離の危険性を低減するために使用できる。一部の場合においては、結合タンパク質は結膜下投与により投与される。   Retinal disorders, eg proliferative retinopathy, eg diabetic Retinopathy, ischemic retinopathy, or retinopathy of prematurity; choroidal neovascularization; lens neovascularization; corneal neovascularization; iris neovascularization; or conjunctival neovascularization can be treated or prevented. Binding proteins can be used to reduce the risk of retinal detachment associated with pathological ocular neovascularization. In some cases, the binding protein is administered by subconjunctival administration.

（併用療法）
本明細書に記載した結合タンパク質は癌を治療するための他の治療法、例えば手術、放射線療法および化学療法の１つ以上と組み合わせて投与できる。例えばＴｉｅ複合体形成に拮抗するか、またはＴｉｅシグナリング活性を調節するタンパク質（例えばＴｉｅ１ホモ二量体化および／またはリン酸化を促進するタンパク質）はまた他の抗癌療法、例えば放射線療法、化学療法、手術または第２の薬剤の投与と組み合わせて使用できる。例えば第２の薬剤はＶＥＧＦのシグナリング経路にターゲティングするか、負の調節を行うものであることができる。この後者のクラスの例はＶＥＧＦ拮抗剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブ）およびＶＥＧＦレセプター拮抗剤（例えば抗ＶＥＧＦレセプター抗体）を包含する。１つの特定の組み合わせはベバシズマブを包含する。組み合わせは更に５−ＦＵおよびロイコボリンおよび／またはイリノテカンを包含できる。 (Combination therapy)
The binding proteins described herein can be administered in combination with one or more of other therapies for treating cancer, such as surgery, radiation therapy, and chemotherapy. For example, proteins that antagonize Tie complex formation or modulate Tie signaling activity (eg, proteins that promote Tiel homodimerization and / or phosphorylation) may also be used in other anti-cancer therapies such as radiation therapy, chemotherapy Can be used in combination with surgery or administration of a second drug. For example, the second agent can be one that targets or negatively regulates the VEGF signaling pathway. Examples of this latter class include VEGF antagonists (eg anti-VEGF antibodies such as bevacizumab) and VEGF receptor antagonists (eg anti-VEGF receptor antibodies). One particular combination includes bevacizumab. The combination can further include 5-FU and leucovorin and / or irinotecan.

「併用」という用語は同じ患者を治療するために２つ以上の薬剤または療法を使用することを指し、ここで薬剤または療法の使用または作用は時間的にオーバーラップする。薬剤または療法は同時（例えば患者に投与される単一の製剤として、または、同時に投与される２つの別個の製剤として）または何れかの順序で逐次的に投与することができる。逐次的投与は異なる時間に行われる投与である。１つの薬剤と別の薬剤の投与の間の時間は数分、数時間、数日または数週間であることができる。本明細書に記載したＴｉｅ１結合タンパク質の使用はまた、別の治療薬の投薬量を低減するため、例えば投与される別の薬剤に関わる副作用を低減するため、例えばベバシズマブのような抗ＶＥＧＦ抗体の副作用を低減するために使用できる。従って、複合とはＴｉｅ１結合タンパク質非存在下で使用されるものよりも少なくとも１０、２０、３０または５０％低用量で第２の薬剤を投与することを包含することができる。   The term “combination” refers to the use of two or more drugs or therapies to treat the same patient, where the use or action of the drugs or therapies overlap in time. The drugs or therapies can be administered simultaneously (eg, as a single formulation administered to a patient, or as two separate formulations administered simultaneously) or sequentially in any order. Sequential administration is administration performed at different times. The time between administration of one drug and another drug can be minutes, hours, days or weeks. The use of the Tie1-binding protein described herein can also reduce the dosage of another therapeutic agent, eg, to reduce side effects associated with another agent being administered, such as anti-VEGF antibodies such as bevacizumab. Can be used to reduce side effects. Thus, conjugating can include administering a second agent at a dose that is at least 10, 20, 30 or 50% lower than that used in the absence of a Tiel binding protein.

更に又、被験体は第１および第２の薬剤を投与することにより新脈管形成関連障害に対して治療されることができる。例えば、第１の薬剤は早期の段階の新脈管形成を調節し、そして第２の薬剤はその後の段階の新脈管形成を調節するか、またはやはり早期の段階の新脈管形成を調節する。第１および第２の薬剤は単一の薬学的組成物を用いて投与するか、別個に投与することができる。一実施形態において、第１の薬剤はＶＥＧＦ経路拮抗剤（例えばＶＥＧＦの阻害剤（例えばＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃ）またはＶＥＧＦレセプター（例えばＫＤＲまたはＶＥＧＦレセプターＩＩＩ（Ｆｌｔ４））またはｂＦＧＦ経路拮抗剤（例えばｂＦＧＦに結合する抗体またはｂＦＧＦレセプター）である。他のＶＥＧＦ経路拮抗剤もまた本明細書中または別途記載されている。一実施形態において、第２の薬剤は腫瘍内において、血管の組立および安定化を阻害または低減し、血管またはリンパ管の維持を妨害し、或いはリンパ管の分布を改変する。例えば、第２の薬剤はＴｉｅ複合体の形成を阻害するか、またはＴｉｅ１ホモ二量体化を促進するものを包含する。例えば第２の薬剤は本明細書に記載したＴｉｅ１結合タンパク質である。   Furthermore, the subject can be treated for angiogenesis-related disorders by administering first and second agents. For example, a first agent regulates early stage angiogenesis and a second agent regulates later stage angiogenesis, or also regulates early stage angiogenesis. To do. The first and second agents can be administered using a single pharmaceutical composition or can be administered separately. In one embodiment, the first agent is a VEGF pathway antagonist (eg, an inhibitor of VEGF (eg, VEGF-A, -B or -C) or a VEGF receptor (eg, KDR or VEGF receptor III (Flt4)) or a bFGF pathway antagonist. Agents (eg, antibodies that bind to bFGF or bFGF receptors) Other VEGF pathway antagonists are also described herein or described separately.In one embodiment, the second agent is intratumoral, vascular. Inhibits or reduces assembly and stabilization, impedes the maintenance of blood vessels or lymphatic vessels, or alters the distribution of lymphatic vessels, eg, the second agent inhibits the formation of Tie complexes or Tie1 homozygous For example, the second agent is a Tie1-binding protein as described herein. That.

腫瘍が特定の大きさ（例えば〜１〜２ｍｍ）に達すれば、腫瘍はその体積を増大させる前に新しい脈管構造を必要とする。腫瘍新脈管形成の早期の段階は、宿主からの新しい血管の生育および血管による腫瘍の浸潤を刺激するための腫瘍からのシグナル、例えばＶＥＧＦの分泌を包含する。例えばＶＥＧＦは内皮細胞の増殖を刺激し、これが次に組立てられて血管となる。腫瘍新脈管形成の後期の段階は血管の組立および安定化をもたらすシグナルを包含できる。この組立および安定化には内皮細胞と血管の内皮細胞を包囲する血管周囲細胞との間の相互作用が関与している。例えばＴｉｅ１は血管の組立および安定化において、および、血管周囲細胞と内皮細胞の間の会合の維持において、役割を果たしている。即ち、新脈管形成関連障害を治療するための効果的な治療には新脈管形成の早期の段階を調節する薬剤（例えばＶＥＧＦ経路拮抗剤、例えば抗ＶＥＧＦ（例えばベバシズマブ）または抗ＶＥＧＦレセプター（例えば抗ＫＤＲ）抗体；または他の前脈管形成経路の拮抗剤、例えば抗ｂＦＧＦ抗体または抗ｂＦＧＦレセプター（例えば抗ｂＦＧＦレセプター−１、−２または−３）抗体）および腫瘍新脈管形成の後期の段階を調節する薬剤（例えばＴｉｅ１の拮抗剤（例えば抗Ｔｉｅ１抗体（例えば本明細書に記載した抗体、例えばＥ３抗体））またはＴｉｅ２の拮抗剤（例えば抗Ｔｉｅ２抗体）またはＡｎｇの抗体（例えば抗Ａｎｇ抗体（例えば抗Ａｎｇ２抗体）または抗Ａｎｇ２ペプチド（例えば阻害性Ａｎｇ２ペプチド））の組み合わせが関与する。これ等の薬剤の１つ以上を組み合わせて使用する。これ等の薬剤の１つ以上はまた他の抗癌療法、例えば放射線療法または化学療法と組み合わせて使用してよい。   If a tumor reaches a certain size (e.g., ˜1-2 mm), the tumor requires new vasculature before it can increase its volume. Early stages of tumor angiogenesis include the secretion of new blood vessels from the host and secretion of signals from the tumor, such as VEGF, to stimulate tumor invasion by the blood vessels. For example, VEGF stimulates endothelial cell proliferation, which is then assembled into blood vessels. Late stages of tumor angiogenesis can include signals that result in vascular assembly and stabilization. This assembly and stabilization involves the interaction between the endothelial cells and the perivascular cells that surround the vascular endothelial cells. For example, Tie1 plays a role in the assembly and stabilization of blood vessels and in maintaining the association between perivascular cells and endothelial cells. Thus, effective treatments for treating angiogenesis-related disorders include agents that modulate the early stages of angiogenesis (eg, VEGF pathway antagonists such as anti-VEGF (eg, bevacizumab) or anti-VEGF receptors ( Anti-KDR) antibodies; or other antagonists of the proangiogenic pathway, such as anti-bFGF antibodies or anti-bFGF receptors (eg anti-bFGF receptor-1, -2 or -3) antibodies) and late stages of tumor angiogenesis An agent that modulates the stage (eg, an antagonist of Tie1 (eg, an anti-Tie1 antibody (eg, an antibody described herein, eg, E3 antibody)) or an antagonist of Tie2 (eg, an anti-Tie2 antibody) or an Ang antibody (eg, an anti-Tie1 antibody). A combination of an Ang antibody (eg, an anti-Ang2 antibody) or an anti-Ang2 peptide (eg, an inhibitory Ang2 peptide)) Given to. Using a combination of one or more which such drugs. This, etc. One or more may also other anti-cancer therapy agent may be used in combination with such as radiation therapy or chemotherapy.

例示されるＶＥＧＦレセプター拮抗剤はＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼの活性の阻害を包含する。４−［４−（１−アミノ−１−メチルエチル）フェニル］−２−［４−（２−モルホリン−４−イル−エチル）フェニルアミノ］ピリミジン−５−カルボニトリル（ＪＮＪ−１７０２９２５９）は血管内皮成長因子レセプター−２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）の経口使用可能な選択的ナノモル阻害剤である５−シアノピリミジンの構造クラスの１つである。別の例にはＰＩＫ−７８７／ＺＫ２２５８４（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＵ５４１６、ＳＵ１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）およびＺＤ６４７４（［Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［（１−メチルピペリジン−４−イル）メトキシ］キナゾリン−４−アミン］）を包含する。Ｔｉｅ１結合タンパク質と組み合わせて使用できる更に他の薬剤は広域特異性のチロシンキナーゼ阻害剤、例えばＳＵ６６６８である。例えばＢｅｒｇｅｒｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１２８７−１２９５を参照できる。   Exemplary VEGF receptor antagonists include inhibition of VEGF receptor tyrosine kinase activity. 4- [4- (1-Amino-1-methylethyl) phenyl] -2- [4- (2-morpholin-4-yl-ethyl) phenylamino] pyrimidine-5-carbonitrile (JNJ-17029259) is a blood vessel It is one of the structural classes of 5-cyanopyrimidine, an orally available selective nanomolar inhibitor of endothelial growth factor receptor-2 (VEGF-R2). Other examples include PIK-787 / ZK22584 (Astra-Zeneca), SU5416, SU11248 (Pfizer) and ZD6474 ([N- (4-bromo-2-fluorophenyl) -6-methoxy-7-[(1-methyl Piperidin-4-yl) methoxy] quinazolin-4-amine]). Yet another agent that can be used in combination with a Tie1-binding protein is a broad specificity tyrosine kinase inhibitor, such as SU6668. For example, Bergers, B .; et al. (2003) J. Org. Clin. Invest. 111, 1287-1295.

第二の物質または治療法は、別の抗癌剤または治療法であり得る。抗癌剤の非限定的な例として、例えば、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害物質、代謝拮抗物質、***阻害物質、アルキル化剤、挿入剤、シグナル伝達経路に干渉可能な物質、アポトーシスを促進する物質、放射線、および他の腫瘍関連抗原に対する抗体（ネイキッド（ｎａｋｅｄ）抗体、免疫毒素および放射性複合体を含む）が挙げられる。特定のクラスの抗癌剤の例を、以下に詳細に提供する：抗チューブリン／抗微小管（例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール）；トポイソメラーゼＩ阻害物質（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトザントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アンサクリン、エピルビシン、メルバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、塩酸ピロキサントロン）；代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキサート、ゲンシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパレート＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ２’−デオキシシチジン、アラ−Ａ、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ミトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロランブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、窒素マスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール（ｉｐｏｍｅａｎｏｌ）；他の作用機構により作用する物質、例えば、ジヒドロレンペロン、スピロムスチンおよびデシペプチド；インターフェロン等の例えば抗腫瘍応答を増強する生物学的応答改変剤；アクチノマイシンＤ等のアポトーシス物質；および抗ホルモン、例えば、タモキシフェン等の抗エストロゲン、または例えば、４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリドなどの抗アンドロゲン。   The second substance or treatment may be another anticancer agent or treatment. Non-limiting examples of anticancer agents include, for example, anti-microtubule agents, topoisomerase inhibitors, antimetabolites, mitotic inhibitors, alkylating agents, insertion agents, substances that can interfere with signal transduction pathways, substances that promote apoptosis, Radiation, and antibodies against other tumor-associated antigens, including naked antibodies, immunotoxins and radioactive complexes. Examples of specific classes of anti-cancer agents are provided in detail below: anti-tubulin / anti-microtubules (eg, paclitaxel, vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine, taxotere); topoisomerase I inhibitors (eg, irinotecan, topotecan, Camptothecin, doxorubicin, etoposide, mitozantrone, daunorubicin, idarubicin, teniposide, ansacrine, epirubicin, merbarone, pyroxanthrone hydrochloride; antimetabolite (eg, 5-fluorouracil (5-FU), methotrexate, 6-mercaptopurine , 6-thioguanine, fludarabine phosphate, cytarabine / Ara-C, trimetrexate, gencitabine, acivicin, alanosine, pyrazofurin (pyrazo urin), N-phosphoacetyl-L-aspartate = PALA, pentostatin, 5-azacytidine, 5-aza2′-deoxycytidine, ara-A, cladrivine, 5-fluorouridine, FUDR, thiazofurin, N -[5- [N- (3,4-dihydro-2-methyl-4-oxoquinazolin-6-ylmethyl) -N-methylamino] -2-thenoyl] -L-glutamic acid; alkylating agent such as cisplatin , Carboplatin, mitomycin C, BCNU = carmustine, melphalan, thiotepa, busulfan, chlorambucil, pricamycin, dacarbazine, ifosfamide phosphate, cyclophosphamide, nitrogen mustard, uracil mustard, pipobroman, 4-ipomeanol (ipomea) ol); substances acting by other mechanisms of action, such as dihydrolenperone, spiromustine and decipeptides; biological response modifiers, such as interferons, which enhance antitumor responses; apoptotic substances such as actinomycin D; Hormones such as antiestrogens such as tamoxifen or antiandrogens such as 4′-cyano-3- (4-fluorophenylsulfonyl) -2-hydroxy-2-methyl-3 ′-(trifluoromethyl) propionanilide .

併用療法は他の療法の副作用を低減する薬剤を投与することを包含してよい。薬剤は抗癌治療の副作用を低減する薬剤であることができる。例えば薬剤はロイコボリンであることができる。   Combination therapy may involve administering an agent that reduces the side effects of other therapies. The agent can be an agent that reduces the side effects of anti-cancer treatment. For example, the drug can be leucovorin.

Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書に記載した他の結合タンパク質を投与することを包含する併用療法はまた別の新脈管形成関連障害（例えば癌以外の障害、例えば望ましくない内皮細胞増殖または望ましくない炎症が関わっている障害、例えば関節リウマチ）を有するかその危険性を有する被験体を治療するために使用できる。   Combination therapies that involve administering a Tie1-binding protein or other binding protein described herein may also result in other angiogenesis-related disorders (eg, non-cancer disorders such as unwanted endothelial cell proliferation or unwanted inflammation). Can be used to treat a subject having or at risk of having a disorder associated with (eg, rheumatoid arthritis).

（診断用途）
Ｔｉｅ１に結合する結合タンパク質（例えば、抗体、例えば本明細書中に記載される抗体）は、インビトロおよびインビボの診断、治療および予防の有用性を有する。 (Diagnostic use)
Binding proteins that bind to Tiel (eg, antibodies, eg, the antibodies described herein) have diagnostic, therapeutic and prophylactic utility in vitro and in vivo.

一つの局面において、本発明はＴｉｅ１の存在を、インビトロ（例えば、組織、生検等のサンプル、例えば癌組織等の生物学的サンプル）またはインビボ（例えば、被験体者におけるインビボ画像化）で検出する診断方法を提供する。本方法は、（ｉ）サンプルをＴｉｅ結合タンパク質に接触させ；そして（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とサンプルとの複合体の形成を検出する工程を包含する。この方法はまた、参照サンプル（例えば、コントロールサンプル）を結合タンパク質に接触させ、参照サンプルに対する複合体形成と比較した場合の結合タンパク質とサンプルとの複合体形成の程度を決定する工程を包含し得る。コントロールサンプルまたは被験体と比較した場合のサンプル中または被験体中の複合体の形成の変化、例えば統計的に有意な変化は、サンプル中のＴｉｅ１の存在を示し得る。Ｔｉｅ１結合タンパク質は、結合または非結合の抗体の検出を容易とする検出可能な物質で、直接的または間接的に標識し得る。適切な検出可能な物質として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射活性物質が挙げられる。   In one aspect, the invention detects the presence of Tie1 in vitro (eg, a biological sample such as a tissue, biopsy, etc., eg, cancer tissue) or in vivo (eg, in vivo imaging in a subject). A diagnostic method is provided. The method includes the steps of (i) contacting the sample with a Tie binding protein; and (ii) detecting the formation of a complex between the Tie1 binding protein and the sample. The method can also include contacting a reference sample (eg, a control sample) with the binding protein and determining the extent of complexation between the binding protein and the sample as compared to the complex formation relative to the reference sample. . A change in the formation of a complex in a sample or subject as compared to a control sample or subject, eg, a statistically significant change, may indicate the presence of Tie1 in the sample. The Tiel binding protein can be directly or indirectly labeled with a detectable substance that facilitates detection of bound or unbound antibody. Suitable detectable substances include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials and radioactive materials.

Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１との複合体形成は、Ｔｉｅ１と結合する結合タンパク質かまたは非結合タンパク質のいずれかを測定または可視化することにより検出し得る。従来的な検出アッセイ、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学を使用し得る。さらにＴｉｅ１結合タンパク質を標識するために、サンプル中のＴｉｅ１の存在を、検出可能な物質で標識したスタンダードおよび非標識Ｔｉｅ１結合タンパク質を利用して競合免疫アッセイによって検定し得る。このアッセイの一例において、生物学的サンプル、標識スタンダードおよびＴｉｅ１結合因子を合わせ、非標識結合タンパク質と結合した標識スタンダードの量を決定する。サンプル中のＴｉｅ１の量は、Ｔｉｅ１結合因子に結合した標識スタンダードの量に逆比例する。   Complex formation between Tie1 binding protein and Tie1 can be detected by measuring or visualizing either bound or unbound protein that binds to Tie1. Conventional detection assays such as enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) or tissue immunohistochemistry may be used. In order to further label the Tie1 binding protein, the presence of Tie1 in the sample can be assayed by a competitive immunoassay utilizing a standard labeled with a detectable substance and an unlabeled Tie1 binding protein. In one example of this assay, a biological sample, a labeled standard and a Tiel binding agent are combined to determine the amount of labeled standard bound to unlabeled binding protein. The amount of Tie1 in the sample is inversely proportional to the amount of labeled standard bound to the Tie1 binding agent.

蛍光体および発色基標識結合タンパク質を調製し得る。抗体および他のタンパク質は、約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光部分は３１０ｎｍを超える波長、好ましくは４００ｎｍを超える波長において、実質的な吸収を有するように選択されるべきである。多様な適切な蛍光体および発色基が、Ｓｔｒｙｅｒ（１９６８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６２：５２６およびＢｒａｎｄ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４３−８６８に記載されている。結合タンパク質を、従来的な手順、例えば米国特許第３，９４０，４７５号、米国特許第４，２８９，７４７号および米国特許第４，３７６，１１０号に記載される手順により蛍光発色基で標識し得る。上記の所望の多くの性質を有する蛍光体の一方のグループは、フルオレセインおよびローダミンを含むキサンテン染料である。蛍光化合物のもう一方のグループはナフチルアミンである。蛍光体または発色基でいったん標識すると、結合タンパク質は、例えば蛍光顕微鏡（共焦点またはデコンボリューション顕微鏡等）を使用して、サンプル中のＴｉｅ１の存在または位置を検出するために使用し得る。   Fluorophores and chromophore labeled proteins can be prepared. Since antibodies and other proteins absorb light having a wavelength up to about 310 nm, the fluorescent moiety should be selected to have substantial absorption at wavelengths above 310 nm, preferably above 400 nm. . A variety of suitable phosphors and chromophores are described by Stryer (1968) Science, 162: 526 and Brand, L., et al. et al. (1972) Annual Review of Biochemistry, 41: 843-868. The binding protein is labeled with a fluorescent chromophore by conventional procedures such as those described in US Pat. No. 3,940,475, US Pat. No. 4,289,747 and US Pat. No. 4,376,110. Can do. One group of phosphors having many of the desired properties described above are xanthene dyes including fluorescein and rhodamine. Another group of fluorescent compounds is naphthylamine. Once labeled with a fluorophore or chromophore, the binding protein can be used to detect the presence or location of Tie1 in the sample using, for example, a fluorescence microscope (such as a confocal or deconvolution microscope).

（組織学的分析）
本明細書中に記載される結合タンパク質を使用して、免疫組織化学を実施し得る。例えば、抗体の場合、抗体を標識（例えば精製タグまたはエピトープタグ）を用いて合成するか、または標識または標識結合基を複合化することにより脱離可能に標識し得る。例えば、キレーターを抗体に連結し得る。次いでこの抗体を、例えば顕微鏡スライドグラス上の組織の固定片である組織学的調製物に接触させる。結合のためのインキュベーション後に、調製物を洗浄して非結合抗体を除去する。次いで調製物を、例えば顕微鏡を使用して分析して、抗体が調製物に結合したかどうかを同定する。該方法は、内皮細胞または内皮細胞により形成された組織、例えば血管を評価するために使用し得る。抗体（または他のポリペプチドもしくはペプチド）は、結合時に非標識であり得る。結合および洗浄後、抗体を標識して検出し得るようにする。 (Histological analysis)
Immunohistochemistry can be performed using the binding proteins described herein. For example, in the case of an antibody, the antibody can be synthesized using a label (eg, a purification tag or an epitope tag), or releasably labeled by conjugating a label or label binding group. For example, a chelator can be linked to the antibody. The antibody is then contacted with a histological preparation, for example a fixed piece of tissue on a microscope slide. Following incubation for binding, the preparation is washed to remove unbound antibody. The preparation is then analyzed, eg, using a microscope, to identify whether the antibody has bound to the preparation. The method can be used to evaluate endothelial cells or tissues formed by endothelial cells, such as blood vessels. The antibody (or other polypeptide or peptide) can be unlabeled upon binding. After binding and washing, the antibody is labeled so that it can be detected.

（タンパク質アレイ）
Ｔｉｅ１結合タンパク質は、タンパク質アレイ上に固定化し得る。タンパク質アレイを診断ツールとして、例えば医学的サンプル（例えば、単離された細胞、血液、血清、生検サンプル等）をスクリーニングし得る。勿論、タンパク質アレイはまた、例えばＴｉｅ１または他の標的分子（例えばヒアルロン酸）に結合する他の結合タンパク質を含み得る。 (Protein array)
The Tiel binding protein can be immobilized on a protein array. Protein arrays can be used as diagnostic tools, for example, to screen medical samples (eg, isolated cells, blood, serum, biopsy samples, etc.). Of course, the protein array may also include other binding proteins that bind, for example, Tie1 or other target molecules (eg, hyaluronic acid).

ポリペプチドアレイを生成する方法は、例えば、Ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９−９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１；Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，ｅ３，Ｉ−ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６０−１７６３；ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１に記載されている。アレイ用ポリペプチドは、例えば市販のロボット装置を使用して、高速でスポットし得る。アレイ基板は、例えばニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば表面改変ガラスであり得る。このアレイは、多孔性マトリックス、例えばアクリルアミド、アガロースまたは別のポリマーを含み得る。   Methods for generating polypeptide arrays are described, for example, in De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18: 989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270: 103-111; Ge (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289: 1760-1763; WO01 / 40803 and WO99 / 51773A1. Array polypeptides can be spotted at high speed using, for example, commercially available robotic devices. The array substrate can be, for example, nitrocellulose, plastic, glass, such as surface modified glass. The array can include a porous matrix such as acrylamide, agarose, or another polymer.

例えばアレイは、例えば上記のＤｅ Ｗｉｌｄｔに記載されるような抗体のアレイであり得る。結合タンパク質を作る細胞は、配列された（ａｒｒａｙｅｄ）フォーマットでフィルター上に生育し得る。ポリペプチド産生を誘導し、発現されたポリペプチドをフィルターに細胞位置で固定化する。タンパク質アレイを、標識標的に接触させて、各固定化ポリペプチドに対する標的の結合程度を決定し得る。標的が非標識の場合、例えば、標識プローブを使用するサンドイッチ法を使用して非標識標的の結合を検出し得る。アレイの各アドレスでの結合の程度に関する情報は、プロフィールとして、例えばコンピュータデータベースに保存し得る。タンパク質アレイを複製して、これを使用して、例えば標的および非標的の結合プロフィールを比較し得る。   For example, the array can be an array of antibodies, for example as described in De Wildt above. Cells that make the binding protein can grow on the filter in an arrayed format. Polypeptide production is induced and the expressed polypeptide is immobilized on the filter at the cellular location. The protein array can be contacted with a labeled target to determine the extent of target binding to each immobilized polypeptide. If the target is unlabeled, for example, a sandwich method using a labeled probe can be used to detect binding of the unlabeled target. Information regarding the extent of binding at each address of the array may be stored as a profile, for example in a computer database. Protein arrays can be replicated and used to compare, for example, target and non-target binding profiles.

（ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別））
標的結合タンパク質を使用して、細胞（例えばサンプル（例えば、患者サンプル）中の細胞）を標識し得る。この結合タンパク質はまた、蛍光化合物に連結している（または連結可能である）。次いで、これらの細胞を、蛍光活性化細胞選別（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡから入手可能な選別機を使用する；ＵＳ５，６２７，０３７；５，０３０，００２；および５，１３７，８０９も参照）を使用して選別し得る。細胞が選別機を通過するに際に、レーザービームが蛍光化合物を励起し、検出器が通過する細胞の数を計数し、蛍光化合物が細胞に連結しているかどうかを蛍光を検出することにより決定する。各細胞に結合した標識の量を定量し、分析してサンプルを特性付け得る。 (FACS (fluorescence activated cell sorting))
Target binding proteins can be used to label cells (eg, cells in a sample (eg, a patient sample)). The binding protein is also linked (or can be linked) to a fluorescent compound. These cells are then used to sort fluorescence-activated cells (eg, using a sorter available from Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose CA; US 5,627,037; 5,030,002; and 5,137, (See also 809). As the cells pass through the sorter, the laser beam excites the fluorescent compound, the detector counts the number of cells passing, and determines whether the fluorescent compound is attached to the cell by detecting the fluorescence. To do. The amount of label bound to each cell can be quantified and analyzed to characterize the sample.

この選別機は、細胞を偏向させ、結合タンパク質に結合した細胞を、結合タンパク質に結合しない細胞から分離し得る。分離された細胞を、培養および／または特性付け得る。   This sorter can deflect the cells and separate cells bound to the binding protein from cells that do not bind to the binding protein. Isolated cells can be cultured and / or characterized.

（インビボ画像化）
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｔｉｅ１を発現する癌組織の存在をインビボで検出する方法を提供する。この方法は、被験体にＴｉｅ１結合タンパク質を投与する工程；および被験体においてＴｉｅ１結合タンパク質を検出する工程を包含する。この検出工程は、複合体の位置または形成の時期を決定する工程を包含し得る。この方法は、被験体（例えば、被験体の体の部位）をスキャン、そうでない場合は画像化する工程を包含し得る。別の方法は、（ｉ）被験体（例えば、癌または腫瘍性障害を有する患者）に検出可能なマーカーと複合化したＴｉｅ１結合抗体を投与し；（ｉｉ）被験体を、Ｔｉｅ１発現組織または細胞に対するこの検出可能なマーカーを検出する手段に供する工程を包含する。例えば、この方法を使用して、血管または内皮細胞（例えばＴｉｅ１発現内皮細胞）の位置を可視化し得る。被験体を、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段により画像化し得る。 (In vivo imaging)
In yet another embodiment, the present invention provides a method for detecting in vivo the presence of cancer tissue expressing Tie1. The method includes administering a Tie1 binding protein to the subject; and detecting the Tie1 binding protein in the subject. This detection step can include determining the location or timing of formation of the complex. The method can include scanning a subject (eg, a body part of the subject), otherwise imaging. Another method comprises (i) administering a Tie1-binding antibody conjugated to a detectable marker to a subject (eg, a patient with a cancer or neoplastic disorder); (ii) treating the subject with a Tie1-expressing tissue or cell Subjecting to means for detecting this detectable marker for. For example, this method can be used to visualize the location of blood vessels or endothelial cells (eg, Tie1-expressing endothelial cells). The subject can be imaged, for example, by NMR or other tomographic means.

診断用画像化に有用な標識の例として、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃおよび１８８Ｒｈ等の放射性標識、蛍光体およびローダミン等の蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放射断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナにより検出可能なポジトロン放射同位元素、ルシフェリン等の化学発光分析計、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼ等の酵素マーカーが挙げられる。また、短距離検出器プローブにより検出可能な放射性同位体等の短距離放射線エミッターを使用し得る。この結合タンパク質を、公知の技術を使用して、そのような試薬で標識し得る。例えば、抗体の放射標識に関する技術について、Ｗｅｎｓｅｌ ａｎｄ Ｍｅａｒｅｓ（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＤ．Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６を参照されたい。 Examples of labels useful for diagnostic imaging include radiolabels such as 131 I, 111 In, 123 I, 99m Tc, 32 P, 125 I, 3 H, 14 C and 188 Rh, fluorescent materials such as phosphors and rhodamine Examples include labels, nuclear magnetic resonance activity labels, positron emission isotopes detectable by positron emission tomography ("PET") scanners, chemiluminescence analyzers such as luciferin, and enzyme markers such as peroxidase or phosphatase. Also, short range radiation emitters such as radioisotopes that can be detected by a short range detector probe may be used. The binding protein can be labeled with such reagents using known techniques. See, for example, Wensel and Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York and D. Colcher et al. (1986) Meth. Enzymol. 121: 802-816.

放射標識結合タンパク質を、インビトロ診断試験のためにも使用し得る。放射性同位元素で標識されたタンパク質の特定の活性は、半減期、放射性標識の同位体の純度、およびこの標識をどのようにタンパク質に導入するかに依存する。   Radiolabeled binding proteins can also be used for in vitro diagnostic tests. The specific activity of a protein labeled with a radioisotope depends on the half-life, the purity of the radiolabeled isotope, and how this label is introduced into the protein.

腫瘍関連新生血管形成に対する効果的な画像化剤が必要である。Ｔｉｅ１は腫瘍関連脈管構造においてアップレギュレートされる。本明細書に記載した結合タンパク質はそのような脈管構造の画像化のために使用できる。
本明細書に記載した結合タンパク質は数種の方法において画像化のために使用できる。結合タンパク質を９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅまたは１８８Ｒｅのような画像化剤に対するキレート剤に物理的に会合、例えばカップリングさせることができる。９９ｍＴｃおよび１８８Ｒｅはシングルフォトンエミッションコンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像化に適するガンマ線を発射する。放射性のフッ素（１８Ｆ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１２３Ｉ、１３１Ｉ）、ガリウム（６Ｇａ、６７Ｇａ）、炭素（１１Ｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）および他の元素を画像化剤として使用してよい。 There is a need for an effective imaging agent for tumor-associated neovascularization. Tie1 is upregulated in tumor associated vasculature. The binding proteins described herein can be used for imaging such vasculature.
The binding proteins described herein can be used for imaging in several ways. The binding protein can be physically associated, eg, coupled, to a chelator for an imaging agent such as 99m Tc, 186 Re or 188 Re. 99m Tc and 188 Re emit gamma rays suitable for single photon emission computed tomography (SPECT) imaging. Imaging radioactive fluorine ( 18 F), indium ( 111 In), iodine ( 123 I, 131 I), gallium ( 6 Ga, 67 Ga), carbon ( 11 C), thallium ( 201 Tl) and other elements It may be used as an agent.

結合タンパク質は又、画像化剤としての使用に適する放射性核種またはスピン標識を包含する粒子、例えばナノ粒子に、共有結合的または非共有結合的に結合することができる。結合タンパク質はＭＲＩを介した画像化を可能にするスピン標識に連結できる。Ｂｏｔｎｅｒ等（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（２００４）１０８：２０２３−２０２９）は例示されるガドリニウム標識ペプチドを用いたＭＲＩ画像化を記載している。本明細書に記載した結合タンパク質は画像化のために同様に標識できる。   The binding protein can also be covalently or non-covalently bound to particles, such as nanoparticles, including radionuclides or spin labels suitable for use as imaging agents. The binding protein can be linked to a spin label that allows for imaging via MRI. Botner et al. (Circulation. (2004) 108: 2023-2029) describe MRI imaging using an exemplary gadolinium labeled peptide. The binding proteins described herein can be similarly labeled for imaging.

Ｃｈｅｎ等（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，（２００４）４５：１７７６−１７８３）は小型ＰＥＧ分子（平均分子量３．４ＫＤａ）をカップリングするとαｖβ３−結合ペプチドのその薬力学が向上したことを示している。結合タンパク質（例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇ結合タンパク質）はクリアランス速度および経路を調節するためにＰＥＧ分子にカップリングできる。 Chen et al. (J. Nucl. Med., (2004) 45: 1776-1783) showed that coupling a small PEG molecule (average molecular weight 3.4 KDa) improved its pharmacodynamics of α v β 3 -linked peptides. Show. Binding proteins (eg, Tie1, Tie2, or Ang binding proteins) can be coupled to PEG molecules to regulate clearance rates and pathways.

陽電子発射断層撮影（ＰＥＴ）は６４Ｃｕおよび１８Ｆのような陽電子発射物質のような画像化剤と共に使用できる。これ等の同位体はより入手し易くなっている。６４Ｃｕはキレート剤ＤＯＴＡ中に捕獲できる。ＤＯＴＡ誘導体はタンパク質に共有結合できる。一実施形態において、ＤＯＴＡ誘導体１つ以上をリジン側鎖基を介して結合タンパク質（例えばＦａｂ）に結合する。 Positron emission tomography (PET) can be used with imaging agents such as positron emitting materials such as 64 Cu and 18 F. These isotopes are more readily available. 64 Cu can be captured in the chelating agent DOTA. DOTA derivatives can be covalently bound to proteins. In one embodiment, one or more DOTA derivatives are attached to a binding protein (eg, Fab) via a lysine side chain group.

Ｆａｂ類はそれらがａ）かなり急速に系から消失するため、注射数分内に画像化が可能になり、そしてｂ）効率的に腫瘍に浸透することから、画像化のために有用な結合剤である。   Fabs are useful binders for imaging because they a) disappear from the system fairly quickly, allowing imaging within minutes of injection, and b) efficiently penetrate the tumor. It is.

Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合するＦａｂ類は例えばＥ．ｃｏｌｉ中、または真核細胞中で製造できる。Ｆａｂ類はプロテインＡ上のクロマトグラフィーにより精製できる。イオン交換クロマトグラフィーもまた使用できる。画像化に使用するためには、所望の放射性核種または他の画像化剤に適するキレート形成基の共有結合により、使用時にＦａｂを標識することができる。Ｆａｂ類は又ＭＲＩ画像化を可能にするために結合されたスピン標識を有することもできる。Ｆａｂ類は又画像化に適する放射性核種またはスピン標識を包含する粒子（例えばナノ粒子）に結合することもできる。特定の実施形態においては、クリアランスの速度および経路を調節するためにＰＥＧ分子にＦａｂ類をカップリングしてよい。他の実施形態においては、Ｆａｂ類はその急速なクリアランス特性を維持するためにＰＥＧにはカップリングしない。   Fabs that bind to Tie1, Tie2, or Ang are described in, for example, E.I. can be produced in E. coli or in eukaryotic cells. Fabs can be purified by chromatography on protein A. Ion exchange chromatography can also be used. For use in imaging, the Fab can be labeled at the time of use by covalent attachment of a chelating group suitable for the desired radionuclide or other imaging agent. Fabs can also have a spin label attached to allow MRI imaging. Fabs can also be attached to particles (eg, nanoparticles) that include radionuclides or spin labels suitable for imaging. In certain embodiments, Fabs may be coupled to PEG molecules to modulate clearance rates and pathways. In other embodiments, Fabs do not couple to PEG to maintain their rapid clearance properties.

ポリペプチドの放射性同位体（例えば、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、１３１Ｉ）による標識操作は、一般的に公知である。例えば、トリチウム標識化手順は、米国特許第４，３０２，４３８号に記載されている。例えばネズミのモノクローナル抗体に適合させるようなヨウ素化、トリチウム標識化および３５Ｓ標識化手順は、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ；Ｏｒｌａｎｄｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６．ｐｐ．１２４−１２６）およびそこで引用された参考文献により記載されている。抗体等のポリペプチドをヨウ素化する他の手順は、Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５，Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４−１０２１および米国特許第３，８６７，５１７号および米国特許第４，３７６，１１０号に記載されている。画像化に有用な放射標識元素としては、例えば１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃが挙げられる。抗体をヨウ素化する手順は、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８９：１１４−１２３；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，Ｊ．（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３：２９９−３０５；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９７１）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８９−２９７により記載されている。９９ｍＴｃ標識化の手順は、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｓｓｏｎ １１１−１２３（１９８２）およびそこで引用された参考文献により記載されている。１１１Ｉｎ標識化抗体に適した手順は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：１４７−１５７，Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ，３５：５５４−５５７およびＢｕｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．１６６：２０２−２０４に記載されている。 Labeling with a radioactive isotope of a polypeptide (eg, 14 C, 3 H, 35 S, 125 I, 32 P, 131 I) is generally known. For example, a tritium labeling procedure is described in US Pat. No. 4,302,438. For example iodinated as to adapt to the murine monoclonal antibody, tritium labeling and 35 S labeling procedures, for example, Goding, J. W. (Monoclonal antigens: principals and practices: references and productions of applications and remnants. ing. Other procedures for iodination of polypeptides such as antibodies are described by Hunter and Greenwood (1962) Nature 144: 945, David et al. (1974) Biochemistry 13: 1014-1021 and US Pat. No. 3,867,517 and US Pat. No. 4,376,110. Radiolabeling elements useful for imaging include, for example, 123 I, 131 I, 111 In, and 99m Tc. The procedure for iodination of antibodies is described in Greenwood, F .; et al. (1963) Biochem. J. et al. 89: 114-123; Marchalonis, J. et al. (1969) Biochem. J. et al. 113: 299-305; and Morrison, M .; et al. (1971) Immunochemistry 289-297. The 99m Tc labeling procedure is described in Rhodes, B .; et al. in Burchiel, S .; et al. (Eds.), Tumor Imaging: The Radioimmunochemical Detection of Cancer, New York: Masson 111-123 (1982) and references cited therein. A suitable procedure for 111 In-labeled antibodies is described by Hnatwich, D .; J. et al. et al. (1983) J. Org. Immul. Methods, 65: 147-157, Hnatwich, D .; et al. (1984) J. Org. Applied Radiation, 35: 554-557 and Buckley, R.M. G. et al. (1984) F.R. E. B. S. 166: 202-204.

放射標識結合タンパク質の場合、結合タンパク質は患者に投与され、結合タンパク質が反応する抗原を有する腫瘍に局在化され、例えばガンマカメラまたは放射断層撮影法を使用する、放射性核スキャンニング等の公知の技術を使用してインビボで検出または「画像化」される。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐｐ．６５−８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）を参照されたい。あるいは、ポジトロン放射トランスアキシャル断層撮影スキャナ、例えばＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに位置するＰｅｔ ＶＩと呼ばれるもの等を、放射性標識がポジトロン（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎ）を放射する場合に使用し得る。 In the case of a radiolabeled binding protein, the binding protein is administered to a patient and is localized to a tumor having an antigen to which the binding protein reacts, known in the art such as radionuclear scanning using, for example, a gamma camera or radiation tomography. It is detected or “imaged” in vivo using techniques. For example, A.I. R. Bradwell et al. , “Developments in Antibody Imaging”, Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R .; W. Baldwin et al. , (Eds.), Pp. 65-85 (Academic Press 1985). Alternatively, use a positron emission transaxial tomography scanner, such as the one called Pet VI located in Brookhaven National Laboratory, where the radiolabel emits positrons (eg 11 C, 18 F, 15 O and 13 N) Can do.

（ＭＲＩ造影剤）
磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）は、生体の被験体の内部特徴を視覚化するためにＮＭＲを使用するもので、予後、診断、治療および手術に有用である。ＭＲＩは、明らかな有益性として放射性トレーサー化合物なしに使用し得る。いつくかのＭＲＩ技術が、ＥＰ−Ａ−０ ５０２ ８１４に要約されている。一般的に、異なる環境下の水プロトンの緩和時間定数Ｔ１およびＴ２に関連する違いを使用して画像を作る。しかし、これらの違いは鮮明な高解像度画像を提供するには不十分であり得る。 (MRI contrast agent)
Magnetic resonance imaging (MRI) uses NMR to visualize internal features of living subjects and is useful for prognosis, diagnosis, treatment and surgery. MRI can be used without radiotracer compounds as an obvious benefit. Some MRI techniques are summarized in EP-A-0 502 814. In general, the differences associated with the relaxation time constants T1 and T2 of water protons in different environments are used to create an image. However, these differences may be insufficient to provide a sharp high resolution image.

これらの緩和時間定数の違いは造影剤により増強し得る。そのような造影剤の例として、多くの磁性剤、例えば（主にＴ１を変える）常磁性剤、および（主にＴ２応答を変える）強磁性または超常磁性剤が挙げられる。キレート（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡおよびＮＴＡキレート）は、幾つかの常磁性物質（例えば、Ｆｅ３＋、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３）を連結（およびその毒性を低下）するために使用し得る。他の物質は、例えば、直径が１０μｍ未満で約１０ｎＭまでの粒子の形態であり得る。粒子は、強磁性、反強磁性または超常磁性の特性を有し得る。粒子は、例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライト、および遷移元素の他の磁性無機化合物を含み得る。磁性粒子は、非磁性物質を有する磁性結晶および非磁性物質を有さない磁性結晶のうちの一つ以上の磁性結晶を含み得る。非磁性物質として、合成または天然のポリマー（例えば、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプン等）が挙げられる。 These relaxation time constant differences can be enhanced by contrast agents. Examples of such contrast agents include many magnetic agents, such as paramagnetic agents (mainly changing T1) and ferromagnetic or superparamagnetic agents (mainly changing T2 response). Chelates (eg, EDTA, DTPA and NTA chelates) can be used to link (and reduce their toxicity) some paramagnetic materials (eg, Fe 3+ , Mn +2 , Gd +3 ). Other materials can be, for example, in the form of particles having a diameter of less than 10 μm and up to about 10 nM. The particles can have ferromagnetic, antiferromagnetic or superparamagnetic properties. The particles can include, for example, magnetite (Fe 3 O 4 ), γ-Fe 2 O 3 , ferrite, and other magnetic inorganic compounds of transition elements. The magnetic particles may include one or more magnetic crystals of a magnetic crystal having a nonmagnetic substance and a magnetic crystal having no nonmagnetic substance. Non-magnetic materials include synthetic or natural polymers (eg, sepharose, dextran, dextrin, starch, etc.).

（ｉ）実質的にすべての天然の豊富なフッ素原子が１９Ｆ同位体であり、よって実質的にすべてのフッ素含有化合物がＮＭＲ活性であり；（ｉｉ）多くの化学的に活性なポリフルオロ化化合物、例えばトリフルオロ酢酸無水物が比較的安価で市販されており、かつ（ｉｉｉ）ヘモグロビン代用物として酸素を運ぶために利用されているペリフルオロ化ポリエーテル等の多くのフッ素化化合物が、ヒトにおける使用に対し医学的に受容可能であると見出されたゆえに、標的結合タンパク質はまた、ＮＭＲ活性１９Ｆ原子または複数のそのような原子を含む指示基（ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）により標識し得る。そのようなインキュベーションの時間を許した後、全身ＭＲＩを、Ｐｙｋｅｔｔ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４６：７８−８８に記載される装置等の装置を使用して癌組織を検出し、画像化する。 (I) substantially all naturally abundant fluorine atoms are 19 F isotopes, and thus substantially all fluorine-containing compounds are NMR active; (ii) many chemically active polyfluorinations Many fluorinated compounds such as perfluorinated polyethers, such as perfluorinated polyethers, where compounds, such as trifluoroacetic anhydride, are commercially available at a relatively low cost and are (iii) used to carry oxygen as a hemoglobin substitute, are Because it has been found to be medically acceptable for use, the target binding protein can also be labeled with an NMR active 19 F atom or an indicating group containing a plurality of such atoms. After allowing time for such incubation, whole body MRI is used to detect and image cancerous tissue using devices such as those described in Pykett (1982) Scientific American, 246: 78-88.

標的結合タンパク質、例えば本明細書中に記載される結合タンパク質を評価することから得られた情報を機械に適合する媒体、例えばコンピュータ読み取り可能またはコンピュータアクセス可能な媒体上に記録し得る。この情報はコンピュータ表示として、例えばデータベース（例えば、結合タンパク質を使用した画像化の場合、一つまたは複数の被験体についての画像のデータベース）中に保存し得る。用語「コンピュータ表示」とは、コンピュータが処理し得る形態である情報を意味する。コンピュータ表示を保存する行為は、コンピュータによる処理に適した形態で情報を置く行為をいう。   Information obtained from evaluating the target binding protein, eg, a binding protein described herein, can be recorded on a machine-compatible medium, such as a computer readable or computer accessible medium. This information can be stored as a computer display, for example in a database (eg, a database of images for one or more subjects in the case of imaging using binding proteins). The term “computer display” means information in a form that can be processed by a computer. The act of saving a computer display refers to the act of placing information in a form suitable for processing by a computer.

また、Ｔｉｅ１に結合する結合タンパク質、および診断使用のための説明書、例えばインビトロで（例えば、サンプル、例えば癌または腫瘍性障害を有する患者からの生検材料または細胞中の）Ｔｉｅ１を検出するか、またはインビボで例えば被験体を画像化することによりＴｉｅ１を検出するための標的結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、または他のポリペプチドもしくはペプチド）の使用のための説明書を含むキットも本発明の範囲にある。このキットは、標識または付加的な診断剤等の少なくとも一つの付加的な試薬をさらに含み得る。インビボ使用のために、結合タンパク質を、薬学的組成物として処方し得る。   Also, a binding protein that binds to Tie1, and instructions for diagnostic use, such as detecting Tie1 in vitro (eg, in a sample, eg, biopsy material or cells from a patient with cancer or neoplastic disorder) Or a kit comprising instructions for use of a target binding protein (eg, an antibody or antigen-binding fragment thereof, or other polypeptide or peptide) to detect Tie1 in vivo, for example by imaging a subject Are also within the scope of the present invention. The kit may further comprise at least one additional reagent such as a label or an additional diagnostic agent. For in vivo use, the binding protein can be formulated as a pharmaceutical composition.

下記例は、制限するものと解釈すべきではない。   The following examples should not be construed as limiting.

（実施例１：Ｔｉｅ１配列）
例示的なＴｉｅ１アミノ酸配列（配列番号２）は以下のとおりである： (Example 1: Tie1 arrangement)
An exemplary Tie1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) is as follows:

Figure 2008532476
Ｔｉｅ１をコードする例示的な核酸配列（配列番号１）は以下のとおりである：
Figure 2008532476
 An exemplary nucleic acid sequence encoding Tie1 (SEQ ID NO: 1) is as follows:

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例２：選択と主要なスクリーニング）
本発明者らは、免疫グロブリンをＦａｂフラグメントとして示す非常に大きなファージライブラリーからＴｉｅ１特異的抗体を選択するためにファージディスプレーを使用した。Ｔｉｅ１に特異的な抗体を単離するために、ファージ表示Ｆａｂ抗体ライブラリーを、ヒトＦｃまたはヒスチジン精製タグに対して融合させたＴｉｅ１細胞外ドメインに対して選択した。 (Example 2: Selection and main screening)
We used phage display to select Tie1-specific antibodies from a very large phage library showing immunoglobulins as Fab fragments. To isolate antibodies specific for Tie1, a phage-displayed Fab antibody library was selected against the Tie1 extracellular domain fused to a human Fc or histidine purification tag.

溶液中の選択は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｍ−２８０−ＤＹＮＡＬ（登録商標））上に補足されたビオチン標識抗原を使用して実施した。Ｔｉｅ１を発現する細胞上での選択は、ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ（商標）自動化磁気ビーズ捕捉デバイスを使用して実施した。固定化抗原上での選択は、Ｔｉｅ１−Ｆｃで被覆したイムノチューブを使用して実施した。幾つかの選択法が使用された。   Selection in solution was performed using biotin-labeled antigen captured on streptavidin-coated magnetic beads (M-280-DYNAL®). Selection on cells expressing Tie1 was performed using a KINGFISHER ™ automated magnetic bead capture device. Selection on immobilized antigen was performed using immunotubes coated with Tie1-Fc. Several selection methods were used.

ストラタジー１：ラウンド１（５００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）、ラウンド２（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ）、ラウンド３（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ）
ストラタジー２：ラウンド１（５００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）、ラウンド２（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（商標））、（３００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）
ストラタジー３：ラウンド１（５μｇ／ｍｌのＴｉｅ１ Ｆｃ被覆イムノチューブ）、ラウンド２（Ｔｉｅ１−Ｆｃ被覆イムノチューブ）、ラウンド３（Ｔｉｅ１ Ｆｃ被覆イムノチューブ＋ヒトＩｇＧを用いた除去）。 Strategy 1: Round 1 (500 mM biotin-labeled Tie1 / magnetic beads), Round 2 (1 × 10 7 Tie1 expressing cells / Kingfisher), Round 3 (1 × 10 7 Tie1 expressing cells / Kingfisher)
Strategy 2: Round 1 (500 mM biotin-labeled Tie1 / magnetic beads), Round 2 (1 × 10 7 Tiel-expressing cells / Kingfisher ™), (300 mM biotin-labeled Tie1 / magnetic beads)
Strategy 3: Round 1 (5 μg / ml Tie1 Fc-coated immunotube), Round 2 (Tie1-Fc coated immunotube), Round 3 (removal using Tie1 Fc-coated immunotube + human IgG).

選択ストラタジーから回収したライブラリーメンバーを、ファージＥＬＩＳＡでの抗原結合について検査した。各単離物を、被覆Ｔｉｅ１ Ｆｃへの結合について検査した。ストラタジー１は、いずれの結合クローンも同定しなかったが、ストラタジー２は１３個のポジティブクローンを同定した（ｎ＝９５）。ストラタジー３は８６個の結合クローンを同定した（ｎ＝９５）。   Library members recovered from the selection strategy were tested for antigen binding in phage ELISA. Each isolate was tested for binding to the coated Tie1 Fc. Strategy 1 did not identify any binding clones, while Strategy 2 identified 13 positive clones (n = 95). Strategy 3 identified 86 binding clones (n = 95).

選択されたクローンの配列分析は、重鎖の選択されたＣＤＲ３に基づき分類し、独自のＶＨ−ＣＤＲ３配列を有する２３個の異なる抗体を得た。   Sequence analysis of selected clones classified based on the selected CDR3 of the heavy chain, resulting in 23 different antibodies with unique VH-CDR3 sequences.

本発明者らは、ディスプレーライブラリーベクターからのＶＨおよびＶＬコード配列を、哺乳動物の発現ベクター系の二つのベクターに再クローニングすることにより、選択されたＦａｂを完全なヒトの抗体として再フォーマットした。これらのベクターは、ヒトカッパ定常ドメインおよびヒトガンマ−１重鎖定常領域を含む。両ベクターを、対応する完全ＩｇＧの発現および生成のために哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。これらの抗体は下記を含む数種のアッセイを使用して特性付けた：１．Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞のウェスタンブロッティングおよび免疫沈降；２．Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞の免疫蛍光；３．ＢａＦ３細胞および主要ヒト内皮細胞中のＴｉｅ１の刺激および阻害；ならびに４．ヒト組織の免疫染色。   We reformatted the selected Fab as a fully human antibody by recloning the VH and VL coding sequences from the display library vector into two vectors of the mammalian expression vector system. . These vectors contain a human kappa constant domain and a human gamma-1 heavy chain constant region. Both vectors were transfected into mammalian CHO-K1 cells for expression and production of the corresponding complete IgG. These antibodies were characterized using several assays including: 1. Western blotting and immunoprecipitation of cells transfected with Tiel and major human endothelial cells; 2. immunofluorescence of cells transfected with Tiel and major human endothelial cells; 3. Stimulation and inhibition of Tie1 in BaF3 cells and primary human endothelial cells; Immunostaining of human tissue.

本発明者らは、Ｔｉｅ１と相互作用する２３個の抗体を同定した。図７〜３６を参照されたい。再フォーマットされたクローンの配列確認後、それらをＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的なトランスフェクションで使用した。成長後、ＩｇＧを、プロテインＡカラムを使用して培養上清から精製した。精製したＩｇＧ１の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して決定した。   We have identified 23 antibodies that interact with Tie1. See Figures 7-36. After sequence confirmation of the reformatted clones, they were used for transient transfection of HEK293T cells. After growth, IgG was purified from the culture supernatant using a protein A column. The amount of purified IgG1 was determined using SDS-PAGE.

Ｔｉｅ１特異的ＩｇＧの特異性を、マウス肺微小血管内皮細胞（ＬＥＩＩ）、およびＴｉｅ１発現構築物をトランスフェクトしたＬＥＩＩ−Ｔｉｅ１細胞で細胞ＥＬＩＳＡ全体により決定し得る。細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウエルプレートにまき、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した。ＩｇＧ１のＬＥ１１細胞への結合の染色および検出は、ＨＲＰ複合ウサギ抗ヒトＨＲＰによる標準的な標識およびＴＭＢ染色を使用して検出する。精製ＩｇＧ１のＬＥＩＩ−Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞への結合は、内因的に発現するＴｉｅ１タンパク質に対して補正し得る。あるいは、内因性Ｔｉｅ１をほとんど持たない細胞または全くもたない細胞を、分析のためにも使用し得る。   The specificity of Tie1-specific IgG can be determined by whole cell ELISA in mouse lung microvascular endothelial cells (LEII), and LEII-Tie1 cells transfected with Tie1 expression construct. Cells were seeded in 96-well plates at a density of 10,000 cells / well and fixed using 4% paraformaldehyde. Staining and detection of IgG1 binding to LE11 cells is detected using standard labeling and TMB staining with HRP-conjugated rabbit anti-human HRP. Binding of purified IgG1 to LEII-Tie1 transfected cells can be corrected for endogenously expressed Tie1 protein. Alternatively, cells with little or no endogenous Tie1 can be used for analysis.

結合抗体の少なくとも一つ（Ｅ３）は、ＢａＦ３細胞バイオアッセイでＴｉｅ１活性化抗体として作用する。本発明者らは、一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞およびヒト主要内皮細胞におけるＥ３ ＩｇＧ処置に応答するＴｉｅ１リン酸化を研究した。本発明者らの結果は、Ｅ３ ＩｇＧがＴｉｅ１レセプターを活性化することを示す。ＢａＦ３細胞バイオアッセイ（「Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢＡＦ細胞アッセイ」ともいわれる）は、Ｔｉｅ１レセプターを架橋するリガンドの能力の指標を提供し得る。アッセイは人為的であるため、非天然のＴｉｅ−Ｅｐｏ融合タンパク質の架橋は、インビボ機能を調節するリガンドの能力を予測するかどうか分からない。   At least one of the bound antibodies (E3) acts as a Tie1 activating antibody in the BaF3 cell bioassay. We studied Tie1 phosphorylation in response to E3 IgG treatment in transiently transfected COS1 cells and human primary endothelial cells. Our results indicate that E3 IgG activates the Tiel receptor. The BaF3 cell bioassay (also referred to as the “Tie1 / EpoR chimeric BAF cell assay”) can provide an indication of the ability of the ligand to crosslink the Tie1 receptor. Since the assay is artificial, it is not known whether cross-linking of the non-native Tie-Epo fusion protein predicts the ability of the ligand to modulate in vivo function.

起こり得る天然のリガンドの代わりにＥ３を使用して、インビトロおよびインビボでのＴｉｅ１のいくつかの機能を特性付け得る。Ｅ３と相互作用するＴｉｅ１の領域は、Ｔｉｅ１活性化または阻害のために小分子化合物の標的となり得る。   E3 can be used in place of a possible natural ligand to characterize some functions of Tie1 in vitro and in vivo. The region of Tie1 that interacts with E3 can be targeted by small molecule compounds for Tie1 activation or inhibition.

Ｅ３は一つの特定のＴｉｅ１活性化アッセイで作用するが、Ｅ３およびこのアッセイにおける他のポジティブ物はまた、他の機能に関して、または他のコンテキストにおいて阻害効果を有し得る。例えばＥ３は、ＨＵＶＥＣ細胞による管形成を阻害し得る。以下を参照されたい。   Although E3 acts in one particular Tie1 activation assay, E3 and other positives in this assay may also have an inhibitory effect on other functions or in other contexts. For example, E3 can inhibit tube formation by HUVEC cells. See below.

さらに、本発明者らは、ＢａＦ３細胞生検においてＥ３により与えられた生存効果を阻害する二つの抗体を見出した。これらの二つの抗体は、ＢａＦ３アッセイにおいてＥ３により誘導されたＴｉｅ１の二量体化を阻害し得る。Ｂ２およびＤ１１の二つの抗体は、Ｅ３と組み合わせて使用される場合、Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲ細胞の生存性を完全にブロックした。   In addition, the inventors have discovered two antibodies that inhibit the survival effect conferred by E3 in BaF3 cell biopsy. These two antibodies can inhibit the dimerization of Tie1 induced by E3 in the BaF3 assay. Two antibodies, B2 and D11, completely blocked the viability of Tie1 / EpoR cells when used in combination with E3.

（方法）
（細胞培養）
ＣＯＳ１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ネズミのＢａ／Ｆ３前Ｂリンパ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、抗生物質および２ｎｇ／ｍｌインターロキン−３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で補ったＤＭＥＭで培養した。ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したヒト皮膚微小管内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）を、供給者により提供された内皮細胞培地で培養し、４〜７継代で使用した。 (Method)
(Cell culture)
COS1 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), glutamine and antibiotics. Murine Ba / F3 pre-B lymphocytes were cultured in DMEM supplemented with 10% FCS, glutamine, antibiotics and 2 ng / ml interlokin-3 (Calbiochem). Human skin microtubule endothelial cells (HDMVEC) obtained from PromoCell (Heidelberg, Germany) were cultured in endothelial cell medium provided by the supplier and used at passages 4-7.

（ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降）
製造者の指示に従ってＦＵＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＣＯＳ１細胞にｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（１０ｃｍ細胞培養プレートあたり１μｇのＤＮＡ）をトランスフェクトし、４８時間インキュベート後、染色した。免疫沈降のために、Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞およびＨＭＶＥＣ細胞を、アプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦおよびバナジン酸ナトリウムを補ったＤＯＣ−ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１％ＳＤＳ、１％ＤＯＣ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解させた。免疫沈降を、等量の細胞溶解物から、ポリクローナル抗ヒトＴｉｅ１抗体（Ｒ＆Ｄ）、モノクローナル抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、または２３種類の抗Ｔｉｅ１抗体（１μｇ／ｍｌ）と一緒に１〜２時間インキュベートし、その後にプロテインＧ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）とともに１時間インキュベートすることにより実施した。免疫沈降物をＰＢＳ−Ｔで二回およびＰＢＳで二回洗浄した後に、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液による溶出および８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中での分離を行った。ブロットは、２３種類の抗Ｔｉｅ１抗体（５μｇ／ｍｌ）、およびそれに続くＨＲＰと複合化した抗ヒトＦｃ抗体により精査した。 (Western blotting and immunoprecipitation)
COS1 cells were transfected with pcDNA3-Tie1-V5 (1 μg DNA per 10 cm cell culture plate) using FUGENE6 (Roche) according to the manufacturer's instructions, incubated for 48 hours and then stained. For immunoprecipitation, cells transfected with Tie1 and HMVEC were treated with DOC-RIPA lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% supplemented with aprotinin, leupeptin, PMSF and sodium vanadate. Triton-X100, 0.1% SDS, 1% DOC, 10 mM EDTA). Immunoprecipitation was incubated from an equal volume of cell lysate with polyclonal anti-human Tie1 antibody (R & D), monoclonal anti-V5 antibody (Invitrogen) or with 23 anti-Tie1 antibodies (1 μg / ml) for 1-2 hours. And then incubated with protein G-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech AB) for 1 hour. The immunoprecipitates were washed twice with PBS-T and twice with PBS before elution with Laemmli buffer and separation in 8% SDS-PAGE. Blots were probed with 23 anti-Tie1 antibodies (5 μg / ml) followed by anti-human Fc antibody conjugated with HRP.

（免疫蛍光染色）
ガラスカバースリップ上のＣＯＳ１細胞に、製造者の指示に従ってＦＵＧＥＮＥ（商標）６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（Ｖ５−エピトープをｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１の３末端に付加した）（１０ｃｍの細胞培養プレートあたり１μｇ ＤＮＡ）を一時的にトランスフェクトし、４８時間インキュベート後、染色した。細胞を、４℃にて１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。必要であれば、これらの細胞を、ＰＢＳ中の０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により５分間、浸透性にした。非特異的な結合部位を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで３０分間インキュベートすることによりブロックした。次いでこれらの細胞を、抗Ｔｉｅ１抗体（５μｇ／ｍｌ）および抗Ｖ５抗体により室温にて１時間染色し、続いてＦＩＴＣ複合化抗ヒト抗体（ＤＡＫＯ、４０μｇ／ｍｌ）およびＴＲＩＴＣ複合化抗マウス抗体（ＤＡＫＯ、１５μｇ／ｍｌ）とともに、３０分間インキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８フルオロクローム（Ｓｉｇｍａ、０．５μｌ／ｍｌ）を核の染色のために使用した。 (Immunofluorescence staining)
COS1 cells on glass coverslips were added to pcDNA3-Tie1-V5 (V5-epitope added to the 3 terminus of pcDNA3-Tie1) using FUGENE ™ 6 (Roche) according to the manufacturer's instructions (10 cm 1 μg DNA per cell culture plate) was transiently transfected and incubated for 48 hours before staining. Cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes at 4 ° C. If necessary, these cells were permeabilized with 0.2% Triton X-100 in PBS for 5 minutes. Non-specific binding sites were blocked by incubating with 1% BSA in PBS for 30 minutes. These cells were then stained with anti-Tie1 antibody (5 μg / ml) and anti-V5 antibody for 1 hour at room temperature, followed by FITC-conjugated anti-human antibody (DAKO, 40 μg / ml) and TRITC-conjugated anti-mouse antibody ( DAKO, 15 μg / ml) for 30 minutes. Hoechst 33258 fluorochrome (Sigma, 0.5 μl / ml) was used for nuclear staining.

（ＢａＦ３バイオアッセイ）
バイオアッセイ用にＴｉｅ１−ＥｐｏＲ発現Ｂａ／Ｆ３細胞を作るために、ＢａＦ３前Ｂ細胞に、マウスエリスロポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと融合させたヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインを含むキメラレセプターを発現する核酸を安定的にトランスフェクトした。使用した核酸を、ｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクター中のＴｉｅ１−ＥｐｏＲキメラｃＤＮＡであった。キメラレセプターをコードする核酸を、ヒトＴｉｅ１のＰＣＲ増幅細胞外部分（Ｘ６０９７５のｐｂ ３７−２３１６）をＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントとしてｍＥｐｏＲ−ｐｃＤＮＡベクターにクローニングすることにより構築した。ＥｐｏＲの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと融合させたＴｉｅ１の細胞外部分からなるキメラレセプターをコードするｃＤＮＡを、ｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクターにサブクローニングした。ベクターを線状化し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにＢａＦ３細胞へトランスフェクトした。安定した細胞プールを、２５０μｇ／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎによる選択により生成した。幾つかのクローンにおけるＴｉｅ１／ＥｐｏＲ融合タンパク質の発現を、ＥｐｏＲに対する抗体によるウェスタンブロッティングにより分析した。 (BaF3 bioassay)
To make Tie1-EpoR expressing Ba / F3 cells for bioassay, a chimeric receptor comprising the extracellular domain of human Tie1 fused to the transmembrane and cytoplasmic domains of the mouse erythropoietin receptor on BaF3 pre-B cells. The expressed nucleic acid was stably transfected. The nucleic acid used was a Tie1-EpoR chimeric cDNA in the pEF-BOS expression vector. The nucleic acid encoding the chimeric receptor was constructed by cloning the PCR amplified extracellular portion of human Tie1 (pb 37-2316 of X60975) as an EcoRI-BglII fragment into the mEpoR-pcDNA vector. A cDNA encoding a chimeric receptor consisting of the extracellular portion of Tie1 fused to the transmembrane domain and intracellular domain of EpoR was subcloned into the pEF-BOS expression vector. The vector was linearized and transfected into BaF3 cells with pcDNA3.1 (+) Zeo vector (Invitrogen). A stable cell pool was generated by selection with 250 μg / ml Zeocin. Expression of the Tie1 / EpoR fusion protein in several clones was analyzed by Western blotting with an antibody against EpoR.

アッセイを実施するために、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲキメラを発現するＢａＦ３細胞を、９６ウエルマイクロタイタープレートに、指定された濃度の抗Ｔｉｅ１抗体の存在下で５００００細胞／ウェルへと分割した。この研究で使用したＥ３抗体は、生殖細胞系Ｅ３抗体（ＤＸ−２２２０）であった。コントロールとして、Ｔｉｅ１−ＥｃｏＲを発現しないＺｅｏｃｉｎ耐性プールを使用した。４８時間後、細胞の生存度は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリムブロミド（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ）を加え、続いてさらに２時間培養し、等しい容量の細胞溶解溶液（１０％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＨＣｌ）を加え、一晩３７℃にてインキュベートすることにより決定した。吸光度は５４０ｎｍで測定した。   To perform the assay, BaF3 cells expressing a Tie1-EpoR chimera were split into 96 well microtiter plates to 50000 cells / well in the presence of the indicated concentration of anti-Tie1 antibody. The E3 antibody used in this study was the germline E3 antibody (DX-2220). As a control, a Zeocin resistant pool that does not express Tie1-EcoR was used. After 48 hours, cell viability was determined by adding MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolim bromide (Sigma), 0.5 mg / ml) followed by Incubated for an additional 2 hours and determined by adding an equal volume of cell lysis solution (10% SDS, 10 mM HCl) and incubating overnight at 37 ° C. Absorbance was measured at 540 nm.

（Ｔｉｅ１リン酸化アッセイ）
ＣＯＳ１細胞にｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５をトランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後、これらの細胞の血清を８時間欠乏させ、次いでＥ３ ＩｇＧで処理した。Ｔｉｅ１リン酸化アッセイのために、指示されるとおり、ＨＤＭＶＥＣを１０ｃｍの皿でコンフルエンス近くまで培養し、無血清培地で欠乏させ（８〜１６時間）、刺激した。刺激後、これらの細胞を細胞溶解緩衝液（ＲＩＰＡ−ＤＯＣ：５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＤＯＣ、１０ｍＭ ＥＤＴＡをアプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦおよびバナジン酸ナトリウムで補ったもの）に溶解させた。トランスフェクトしたＣＯＳ１細胞またはＨＤＭＶＥＣから浄化した溶解物を、抗Ｖ５または抗Ｔｉｅ１ Ｂ９でそれぞれ免疫沈降させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、抗ホスホチロシンおよび抗Ｔｉｅ１（Ｒ＆Ｄシステム）抗体を使用してイムノブロットした。 (Tie1 phosphorylation assay)
COS1 cells were transfected with pcDNA3-Tie1-V5. Twenty-four hours after transfection, the serum of these cells was depleted for 8 hours and then treated with E3 IgG. For the Tiel phosphorylation assay, HDMVEC were cultured to near confluence in 10 cm dishes, depleted in serum-free medium (8-16 hours) and stimulated as indicated. After stimulation, these cells were treated with cell lysis buffer (RIPA-DOC: 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 10 mM EDTA). Aprotinin, leupeptin, PMSF and sodium vanadate). Lysates clarified from transfected COS1 cells or HDMVEC were immunoprecipitated with anti-V5 or anti-Tie1 B9, respectively. Proteins were separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose and immunoblotted using anti-phosphotyrosine and anti-Tie1 (R & D system) antibodies.

（ヒト組織の免疫染色）
免疫組織化学における抗Ｔｉｅ１抗体の反応性を評価するために、ヒト腎臓と肺の５μｍの凍結切片を、室温にて３０分間乾燥させ、冷アセトンで１０分間固定した。スライドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．０３％Ｈ２Ｏ２で１５分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させた。ＴＮＢ（室温にて３０分）を使用して、非特異的結合をブロックし、切片をＴｉｅ１抗体とともに１０μｇ／ｍｌの濃度で一晩＋４℃にてインキュベートした。ＰＢＳによる数回の洗浄後、ビオチニル化抗ヒト抗体（１：３００、Ｚｙｍｅｄ）を組織に加えた。シグナルを、ＴＳＡキットを使用することにより増幅し、ＡＥＣ染色で検出した。 (Immunostaining of human tissue)
In order to evaluate the reactivity of anti-Tie1 antibody in immunohistochemistry, 5 μm frozen sections of human kidney and lung were dried at room temperature for 30 minutes and fixed with cold acetone for 10 minutes. Slides were washed with PBS and treated with 0.03% H 2 O 2 in PBS for 15 minutes to reduce endogenous peroxidase activity. TNB (30 minutes at room temperature) was used to block non-specific binding and sections were incubated with Tie1 antibody at a concentration of 10 μg / ml overnight at + 4 ° C. After several washes with PBS, biotinylated anti-human antibody (1: 300, Zymed) was added to the tissue. The signal was amplified by using the TSA kit and detected by AEC staining.

（結果）
Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞のウェスタンブロッティング、免疫沈降および免疫蛍光（表１を参照）。 (result)
Western blotting, immunoprecipitation and immunofluorescence of cells transfected with Tie1 and primary human endothelial cells (see Table 1).

Figure 2008532476
２３種類の選択された抗Ｔｉｅ１抗体の結合能力を確かめるために、本発明者らはまずｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（Ｖ５タグ付き）をトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞、および主要内皮細胞を使用して、ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降を実施した。次に、抗Ｔｉｅ１抗体が生細胞内でＴｉｅ１を認識するかどうかを調べるために、これらの細胞を免疫蛍光染色により調査した。分析されたすべての抗体がトランスフェクトしたＴｉｅ１と内因性Ｔｉｅ１の両方を認識したが、表１に示されているように結合親和性の違いが検出された。
Figure 2008532476
 To confirm the binding ability of the 23 selected anti-Tie1 antibodies, we first used Western COS1 cells transfected with pcDNA3-Tie1-V5 (V5 tagged), and primary endothelial cells, and Western Western. Blotting and immunoprecipitation were performed. Next, to examine whether anti-Tie1 antibody recognizes Tie1 in living cells, these cells were examined by immunofluorescent staining. All antibodies analyzed recognized both transfected and endogenous Tie1 but differences in binding affinity were detected as shown in Table 1.

（Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲをトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞およびヒト主要内皮細胞におけるＴｉｅ１の刺激および阻害）
Ｔｉｅ１に対するリガンドは同定されなかったが、本発明者らはＴｉｅ１結合タンパク質の以下の効率的なスクリーニング法を使用した。インターロイキン−３依存前Ｂリンパ球（Ｂａ／Ｆ３）細胞に、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ融合タンパク質を発現する構築物をトランスフェクトした。ＢａＦ３細胞はＩＬ−３依存性であるために、それらはＩＬ−３が提供されないと死滅する。しかし、Ｔｉｅ−ＥｐｏＲレセプターを発現するＢａＦ３細胞は、培地が、天然リガンドかまたは人工的模倣物のいずれかであるＴｉｅ１結合タンパク質を含む場合、生存または増殖し得る。細胞生存は、例えばミトコンドリアの活性を測定する比色ＭＴＴアッセイにより定量し得る。 (Stimulation and inhibition of Tie1 in Ba / F3 cells and human primary endothelial cells transfected with Tie1-EpoR)
Although no ligand for Tie1 was identified, we used the following efficient screening method for Tie1 binding protein. Interleukin-3-dependent pre-B lymphocyte (Ba / F3) cells were transfected with a construct expressing the Tie1-EpoR fusion protein. Since BaF3 cells are IL-3 dependent, they die if IL-3 is not provided. However, BaF3 cells expressing the Tie-EpoR receptor can survive or proliferate if the medium contains a Tie1-binding protein that is either a natural ligand or an artificial mimetic. Cell survival can be quantified, for example, by a colorimetric MTT assay that measures mitochondrial activity.

ＢａＦ３細胞アッセイからの結果は、検査した２３種類の異なるモノクローナル抗体のうち、わずかにＥ３ ＩｇＧのみがＴｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存を促進し得たが、コントロールとして使用されたＥｐｏＲ ＢａＦ３細胞の生存度はＥ３ ＩｇＧによって影響されなかったことを示した。Ｅ３ ＦａｂフラグメントはＴｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存度に効果を有さなかったので、免疫グロブリン分子のＩｇＧ部分はＥ３ ＩｇＧの生存作用に必要ではなかった。５０ｎｇ／ｍｌのＥ３ ＩｇＧの濃度は、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞生存アッセイにおいてほぼ最大の生存度を与え、この生存度は、用量依存的であった。   The results from the BaF3 cell assay show that, among the 23 different monoclonal antibodies tested, only E3 IgG was able to promote the survival of Tie1-EpoR cells, but the viability of the EpoR BaF3 cells used as a control was It was shown that it was not affected by E3 IgG. Since the E3 Fab fragment had no effect on the viability of Tie1-EpoR cells, the IgG portion of the immunoglobulin molecule was not required for the survival action of E3 IgG. A concentration of 50 ng / ml E3 IgG gave almost maximal viability in the Tie1-EpoR cell viability assay, and this viability was dose dependent.

Ｔｉｅ１の細胞外ドメインに結合するＥ３ ＩｇＧがＴｉｅ１の自己リン酸化を誘導するかどうかを検査するために、Ｅ３ ＩｇＧ処理に応答するＴｉｅ１レセプターリン酸化レベルを一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞およびヒト主要内皮細胞において調査した。ＣＯＳ１細胞に、Ｖ５タグ付きの全長Ｔｉｅ１ ｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトし、血清欠乏後にこれらの細胞をＥ３ ＩｇＧ（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。細胞溶解物を幾つかの時間点で抽出し、Ｔｉｅ１を抗Ｖ５で免疫沈降させた後、抗ホスホチロシンおよび抗Ｔｉｅ１抗体を使用したウェスタンブロッティングを行った。その結果は、Ｔｉｅ１は１０〜３０分間のＥ３ ＩｇＧ刺激後にチロシンリン酸化されることを示した。Ｅ３ ＩｇＧが主要内皮細胞中のＴｉｅ１リン酸化を誘発するかどうかを決定するために、ＨＤＭＶＥＣ細胞を血清欠乏させ、幾つかの濃度のＥ３で６０分間刺激した。次いで、Ｔｉｅ１を細胞溶解物から免疫沈降させ、抗ホスホチロシンブロッティング分析に供したところ、５０〜２００ｎｇ／ｍｌでのＥ３ ＩｇＧ刺激に続き、レセプターリン酸化を示した。さらに高い濃度のＥ３（５００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）がＴｉｅ１リン酸化を誘発したが、その応答はより急速で、刺激の５分後に最も顕著であった。   To test whether E3 IgG binding to the extracellular domain of Tie1 induces Tie1 autophosphorylation, COS1 cells transiently transfected with Tie1 receptor phosphorylation levels in response to E3 IgG treatment and human major Investigated in endothelial cells. COS1 cells were transfected with an expression vector containing a full-length Tie1 cDNA with a V5 tag, and these cells were treated with E3 IgG (200 ng / ml) after serum deprivation. Cell lysates were extracted at several time points and Tie1 was immunoprecipitated with anti-V5 followed by Western blotting using anti-phosphotyrosine and anti-Tie1 antibodies. The results showed that Tie1 was tyrosine phosphorylated after 10-30 minutes of E3 IgG stimulation. To determine whether E3 IgG induces Tie1 phosphorylation in primary endothelial cells, HDMVEC cells were serum starved and stimulated with several concentrations of E3 for 60 minutes. Tie1 was then immunoprecipitated from cell lysates and subjected to anti-phosphotyrosine blotting analysis, which showed receptor phosphorylation following E3 IgG stimulation at 50-200 ng / ml. Even higher concentrations of E3 (500-1000 ng / ml) induced Tie1 phosphorylation, but the response was more rapid, most notable after 5 minutes of stimulation.

Ｅ３ ＩｇＧ誘発Ｔｉｅ１活性化の動態を調べるために、細胞をＥ３ ＩｇＧ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、リセプターリン酸化を様々な時間点で調査した。Ｔｉｅ１リン酸化はＥ３ ＩｇＧ処理の１５〜３０分後に最も激しかったが、リン酸化は１時間に及び持続した。   To investigate the kinetics of E3 IgG-induced Tie1 activation, cells were stimulated with E3 IgG (200 ng / ml) and receptor phosphorylation was investigated at various time points. Tie1 phosphorylation was most intense 15-30 minutes after E3 IgG treatment, but phosphorylation lasted for 1 hour.

調査された任意の他のモノクローナル抗体が、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ Ｂａ／Ｆ３アッセイにおいてＥ３ ＩｇＧの生存効果を阻害するかどうかを決定するために、抗体をＥ３ ＩｇＧと組み合わせて研究した。１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＥ３ ＩｇＧを、１００（１：１）または５００（１：５）ｎｇ／ｍｌの他の抗体とともに使用して、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存度を測定した。Ｅ３ ＩｇＧと試験抗体（１：１および１：５の比率にある）との両方の組合せからの結果は類似しており、２３抗体のうち２抗体（Ｂ２およびＤ１１）がＥ３ ＩｇＧの生存効果を完全にブロックしたことを示した。幾つかの抗体（Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３およびＰ−Ｃ６）は、Ｅ３ ＩｇＧの生存作用をある程度阻害し、抗体のうち２つ（Ｇ２およびＣ７）が、Ｅ３ ＩｇＧとの組合せにおいてＴｉｅ１／ＥｐｏＲ ＢａＦ３細胞の生存を促進した。   To determine if any other monoclonal antibody investigated would inhibit the survival effect of E3 IgG in the Tie1-EpoR Ba / F3 assay, the antibody was studied in combination with E3 IgG. The viability of Tie1-EpoR cells was measured using 100 ng / ml concentration of E3 IgG with 100 (1: 1) or 500 (1: 5) ng / ml of other antibodies. Results from both combinations of E3 IgG and test antibodies (in 1: 1 and 1: 5 ratio) are similar, with 2 out of 23 antibodies (B2 and D11) showing the survival effect of E3 IgG. Shows complete block. Some antibodies (A2, A10, P-B1, P-B3 and P-C6) inhibit E3 IgG to some extent, and two of the antibodies (G2 and C7) are combined with E3 IgG. Promoted the survival of Tie1 / EpoR BaF3 cells.

（ヒト組織の免疫染色）
抗Ｔｉｅ１抗体は、培養細胞中のヒトＴｉｅ１と反応する。ビオチニル化抗Ｔｉｅ１抗体を使用して、標識ストレプトアビジンまたはアビジンを使用して結合抗体を検出することにより、抗体が肺および腎臓ならびに腫瘍からのヒト組織サンプルを染色し得るかどうかを決定することもできる。 (Immunostaining of human tissue)
Anti-Tie1 antibody reacts with human Tie1 in cultured cells. Using biotinylated anti-Tie1 antibody to detect bound antibody using labeled streptavidin or avidin can also determine whether the antibody can stain human tissue samples from lung and kidney and tumors. it can.

（実施例３：例示的配列）
例示的な免疫グロブリン可変ドメインの配列を、図７〜３６に示す。 Example 3: Exemplary sequence
Exemplary immunoglobulin variable domain sequences are shown in FIGS.

（実施例４：抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−ＩｇＧを使用したＨＵＶＥＣ細胞による管形成の阻害
）
インビトロでの血管形成を阻害するＥ３の能力を明らかにするために、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による管形成を阻害する能力について精製Ｅを調査した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、新鮮なヒト臍帯静脈をトリプシン−ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃にて２０〜２５分間、処理することにより得た。これらの細胞を、接着因子（ＡＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で被覆したＴ−２５フラスコ中、１０％ＦＣＳ、０．４％ＢＢＥ、１％ １−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−ＥＤＴＡで分離して、二代または三代の継代でコンフルエントになったときに使用した。これらの細胞を１：２の分離比率で、単層の約６０〜８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。細胞を分離するために、ＨＵＶＥＣ単層をトリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で３７℃にて３分間処理した。トリプシン活性を、３体積分の完全ＲＰＭＩ培地を加えることにより停止した。これらの細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰返して分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。 Example 4: Inhibition of tube formation by HUVEC cells using anti-Tie1 E3-IgG
To elucidate the ability of E3 to inhibit angiogenesis in vitro, purified E was investigated for its ability to inhibit tube formation by human umbilical cord endothelial cells (HUVEC). Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were obtained by treating fresh human umbilical vein with trypsin-EDTA (1 ×) (Gibco / Invitrogen) at 37 ° C. for 20-25 minutes. These cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, 0.4% BBE, 1% 1-glutamine, 1% penicillin / streptomycin in T-25 flasks coated with adhesion factor (AF) (Cascade Biology). Cultured. Primary cultures were separated with warm trypsin-EDTA and used when confluent at the second or third passage. These cells were maintained in a proliferative state by culturing at an approximate density of about 60-80% of the monolayer at a separation ratio of 1: 2. To separate cells, HUVEC monolayers were treated with trypsin / EDTA (500 μl / dish) at 37 ° C. for 3 minutes. Trypsin activity was stopped by adding 3 volumes of complete RPMI medium. These cells were carefully scraped, separated by repeated pipetting, and finally washed with PBS.

二継代後、ＨＵＶＥＣを、７．５体積分の２ｍｇ／ｍｌコラーゲン（コラーゲンＲ；Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１体積分の１０×ＭＥＭ、１．５体積分のＮａＨＣＯ３（１５．６ｍｇ／ｍｌ）を混合することにより調製されたコラーゲンゲル（１．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩ ５０μｌ）上のそれらの培養培地（９６ウエルプレートで４０×１０３／５０μｌ／ウェル）にまき、約１体積分のＮａＯＨによりｐＨを７．４に調節した。次いで、１時間３０分後に培養培地を捨て、これらの細胞をコラーゲンの新しい層（１．５ｍｇ／ｍｌ、新しい調製物、５０μｌ／ウェル）で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、Ｅ３抗体（１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下に各ウェルに加えた。このアッセイを、コントロール（１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）として使用されるストレプトアビジン抗体を用いて実施した。培養表面上の管ネットワークの全長を、ＭＥＴＡＶＵＥ（商標）ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を、視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均管面積として示した。各アッセイを少なくとも３回実施した。 After two passages, HUVEC was added to 7.5 volumes of 2 mg / ml collagen (collagen R; Serva, Heidelberg, Germany), 1 volume of 10 × MEM, 1.5 volumes of NaHCO 3 (15.6 mg / ml). ml) were seeded in collagen gels prepared by mixing (1.5 mg / ml of collagen I 50 [mu] l) their culture medium (96-well plates at 40 × 10 3 / 50μl / well on), about 1 volume fraction The pH was adjusted to 7.4 with NaOH. The culture medium was then discarded after 1 hour 30 minutes and the cells were coated with a new layer of collagen (1.5 mg / ml, fresh preparation, 50 μl / well). After gel polymerization, culture medium was added to each well in the presence or absence of E3 antibody (1 ng / ml to 10 μg / ml). This assay was performed with a streptavidin antibody used as a control (1 ng / ml to 10 μg / ml). The total length of the tube network on the culture surface was quantified 40 × with METAVUE ™ software (Universal Imaging Corporation). Results from triplicate wells were expressed as mean tube area per field of view ± SEM (relative unit). Each assay was performed at least three times.

Ｅ３は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でさえもＨＵＶＥＣによる管形成の有力な阻害物質である。コントロール抗ストレプトアビジンは、ＨＵＶＥＣの管を形成する能力に対して効果を有さない。この結果は、Ｅ３が血管形成の少なくとも一局面を阻害し得ることを示している。   E3 is a potent inhibitor of tube formation by HUVEC even at a concentration of 10 ng / ml. Control anti-streptavidin has no effect on the ability to form tubes of HUVEC. This result indicates that E3 can inhibit at least one aspect of angiogenesis.

（実施例５：調和させた腫瘍および正常組織切片に結合するＥ３の免疫組織化学的分析）
主要な腫瘍および正常組織におけるＥ３のＴｉｅ１への結合を評価するために、抗体をＩｇＧとして生成し、ビオチン標識した。Ｅ３抗体ならびに二つの他の抗Ｔｉｅ１抗体Ｂ２およびＤ１１を全長ＩｇＧ分子として再フォーマットした。これらのＩｇＧをコードする核酸を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトした。一時的な細胞トランスフェクション用のプラスミド調製を、ＨＰ−ＧＥＮＥＬＵＴＥ（商標）ＭＩＤＩ調製キット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＮＡ０２００）を使用して実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．カタログ番号Ｑ４０１）をトランスフェクションの２４時間前にまいた；１０ｃｍ培養皿一枚あたり６×１０６細胞をプレートした。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８０１９）を製造者の指示に従って使用し、トランスフェクションを実施した。１０ｃｍ皿１枚あたり５マイクログラムのプラスミドＤＮＡを使用した。細胞を、１０％「超低ＩｇＧ」ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６２５００７８）を補ったＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１９６６０２１）中、３７℃にて５％ＣＯ２で、水飽和雰囲気下で培養した。馴化培地をトランスフェクションの７２時間および１４４時間後に集め、プールし、滅菌ろ過した。 Example 5: Immunohistochemical analysis of E3 binding to matched tumor and normal tissue sections
To assess E3 binding to Tie1 in major tumors and normal tissues, antibodies were generated as IgG and biotinylated. The E3 antibody and two other anti-Tie1 antibodies B2 and D11 were reformatted as full-length IgG molecules. Nucleic acids encoding these IgGs were transiently transfected into HEK293T cells. Plasmid preparation for transient cell transfection was performed using the HP-GENELUTE ™ MIDI preparation kit (Sigma, catalog number NA0200). HEK293T cells (GenHunter Corp. catalog number Q401) were seeded 24 hours prior to transfection; 6 × 10 6 cells were plated per 10 cm culture dish. Transfections were performed using LIPOFECTAMINE ™ 2000 reagent (Invitrogen, catalog number 11668019) according to the manufacturer's instructions. 5 micrograms of plasmid DNA was used per 10 cm dish. Cells were cultured in DMEM (Invitrogen, catalog number 31966021) supplemented with 10% “ultra-low IgG” fetal calf serum (Invitrogen, catalog number 16250078) at 37 ° C. with 5% CO 2 in a water saturated atmosphere. . Conditioned media was collected 72 hours and 144 hours after transfection, pooled and sterile filtered.

ＰＢＳで平衡化した１００μｌのプロテインＡビーズ（ｒプロテインＡセファロース４ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１７−１２７９−０１）を細胞培養上清に加え、これらを４℃にて一晩、例えば５０ｍｌチューブ中で回転させた。ビーズを遠心分離で集め、９６ウェルろ過プレート（ＵＮＩ−ＦＩＬＴＥＲ ８００ＧＦ／Ｂ、Ｗｈａｔｍａｎ、カタログ番号７７００−２８０３）に移し、真空マニホールド（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７６０６８１）を使用してＰＢＳで徹底的に洗浄した。抗体の溶出を、ビーズを４００μｌの１２．５ｍＭのクエン酸に再懸濁することにより達成した。３０〜６０秒のインキュベーション後、真空マニホールドを使用して、ビーズ溶出液を９６ウエルコレクションプレート（ＵＮＩＰＬＡＴＥ７５０、Ｗｈａｔｍａｎ、カタログ番号７７０１−５７５０）のウェルに集めた。コレクションプレートの各ウェルは、６０μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）緩衝液を含み、溶出分画を即座に中和した。溶出工程を抗体回収を最大化するために二回実施した。次いで、溶出サンプルを、透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ、ＭＷＣＯ１０，０００、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６６３８０）を使用して、ＰＢＳに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌ溶液が１．３５の吸光度を有すると想定して、タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸収から決定した。調製物の品質を、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。   100 μl of Protein A beads equilibrated with PBS (rProtein A Sepharose 4 Fast Flow, Amersham Biosciences, catalog number 17-1279-01) are added to the cell culture supernatant and these are overnight at 4 ° C., for example in a 50 ml tube. Rotated in. The beads are collected by centrifugation, transferred to a 96-well filtration plate (UNI-FILTER 800GF / B, Whatman, catalog number 7700-2803), and washed thoroughly with PBS using a vacuum manifold (Macheley Nagel, catalog number 760681). did. Antibody elution was achieved by resuspending the beads in 400 μl of 12.5 mM citric acid. After 30-60 seconds incubation, the bead eluate was collected into wells of a 96 well collection plate (UNIPLATE 750, Whatman, catalog number 7701-5750) using a vacuum manifold. Each well of the collection plate contained 60 μl of 1M HEPES (pH 7.5) buffer and immediately neutralized the eluted fraction. The elution step was performed twice to maximize antibody recovery. The eluted sample is then dialyzed against PBS using a dialysis cassette (Slide-A-Lyser Dialysis Cassettes, MWCO 10,000, Pierce, Cat. No. 66380) and the 1 mg / ml solution has an absorbance of 1.35. Protein concentration was determined from absorption at 280 nm. The quality of the preparation was analyzed by reducing and non-reducing SDS-PAGE.

Ｔｉｅ１抗体を、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ―ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ２１３３１）を使用してビオチニル化した。Ｔｉｅ−１／ＦｃおよびＴｉｅ−１−Ｈｉｓについては、反応を２時間、氷上で、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中、５倍モル過剰のビオチニル化剤の存在下で実施した。抗体については、反応を２時間、氷上でＰＢＳ中、１５倍モル過剰のＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンの存在下で実施した。この反応を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（５０ｍＭの最終濃度）の添加により停止し、続いて氷上で１時間インキュベートした。次いで、サンプルをＰＢＳに対して透析した。   The Tiel antibody was biotinylated using EZ-Linksulfo-NHS-SS-biotin (Pierce, catalog 21331). For Tie-1 / Fc and Tie-1-His, the reaction was performed for 2 hours on ice in 50 mM sodium carbonate buffer, pH 9.6, in the presence of a 5-fold molar excess of biotinylating agent. For antibodies, the reaction was performed for 2 hours on ice in PBS in the presence of a 15-fold molar excess of EZ-Linksulfo-NHS-SS-biotin. The reaction was stopped by the addition of Tris-HCl, pH 7.5 (final concentration of 50 mM) followed by 1 hour incubation on ice. The sample was then dialyzed against PBS.

種々の正常および腫瘍組織切片を、ビオチニル化抗体で染色した。マウスモノクローナル抗体抗Ｔｉｅ１抗体（７ｅ８）（Ａｌｉｔａｌｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）をポジティブコントロールとして使用した。一次抗体なしの切片を、ネガティブコントロールとした。すべてのサンプルは新鮮な凍結組織であり、染色をＴＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。アセトン固定（１０〜２０分、−２０℃）後、スライドを０．７３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を減少させ、続いてＴＮＢ緩衝液で３０分間ブロックした。切片（５〜１０ｍｍ厚）を、一次抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに、４℃にて一晩、インキュベートした。マウスモノクローナル抗ｔｉｅ１抗体（７ｅ８）を有する切片を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加える前にビオチニル化抗マウス抗体（ＶｅｃｔａＳｔａｉｎ）で処理した。シグナルを、ＴＳＡキットを使用して増幅し、ＡＥＣ（２３５ｍｌ ＮａＡｃ、１５ｍｌ ＡＥＣ（保存溶液：１６００ｍｇの３−アミノ−９−エチル−カルバゾールおよび４８０ｍｌのＮ−ジメチルホルムアミド）、２５０μｌのＨ２Ｏ２）により可視化した。 Various normal and tumor tissue sections were stained with biotinylated antibody. A mouse monoclonal antibody anti-Tie1 antibody (7e8) (Alital laboratory, University of Helsinki) was used as a positive control. A section without a primary antibody was used as a negative control. All samples were fresh frozen tissue and staining was performed using the TSA kit (Perkin-Elmer Life Sciences). After acetone fixation (10-20 min, −20 ° C.), slides were treated with 0.73% H 2 O 2 for 10 min to reduce endogenous peroxidase activity and subsequently blocked with TNB buffer for 30 min. Sections (5-10 mm thick) were incubated with primary antibody (10 μg / ml) at 4 ° C. overnight. Sections with mouse monoclonal anti-tie1 antibody (7e8) were treated with biotinylated anti-mouse antibody (VectaStain) before adding streptavidin-HRP. The signal was amplified using the TSA kit and AEC (235 ml NaAc, 15 ml AEC (stock solution: 1600 mg 3-amino-9-ethyl-carbazole and 480 ml N-dimethylformamide), 250 μl H 2 O 2 ). Visualized.

一般に、Ｔｉｅ−１発現は、調和する正常な組織を比較した場合、腫瘍組織中で上方調節された。しかし、腫瘍組織において、抗Ｔｉｅ１抗体は脈管に加えて他の構造物を染色した。さらに、あるエピトープの発現で若干の組織特異性が観察された。例えば、Ｅ３抗体は肺および腎臓中の脈管を染色したが皮膚では染色せず、一方、Ｂ２抗体は胸よりも他の正常な組織で血管を非常に弱く染色した。Ｔｉｅ−１の外部ドメインの腫瘍組織への放出は、観察された違いを説明し得る。   In general, Tie-1 expression was upregulated in tumor tissue when comparing harmonious normal tissues. However, in tumor tissue, anti-Tie1 antibody stained other structures in addition to the vessels. In addition, some tissue specificity was observed with the expression of certain epitopes. For example, the E3 antibody stained vessels in the lungs and kidneys but not the skin, while the B2 antibody stained blood vessels very weakly in normal tissues other than the breast. Release of Tie-1 ectodomain into tumor tissue may explain the observed differences.

皮膚組織において、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は、血管を非常に弱く染色したが、ネズミ７ｅ８コントロール抗体は正常な皮膚で明瞭な染色を与えた。メラノーマ組織において、７ｅ８抗体は脈管のみを染色したが、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体も他の周囲構造物を染色した。染色パターンは、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体３抗体すべてについて類似していた。   In skin tissue, E3, B2 and D11 antibodies stained blood vessels very weakly, whereas murine 7e8 control antibody gave clear staining in normal skin. In melanoma tissue, the 7e8 antibody stained only the vessels, while the E3, B2 and D11 antibodies also stained other surrounding structures. The staining pattern was similar for all E3, B2 and D11 antibodies.

肺組織において、本発明者らは、Ｅ３抗体が肺の大静脈を特に明瞭に染色することを観察したが、Ｄ１１および７ｅ８はわずかな染色を与えた。Ｂ２はこれらの同じ静脈を染色しなかった。Ｔｉｅ−１の発現は、肺癌腫を劇的に上方調節し、すべての抗体は、正常な肺からのサンプルよりも肺癌腫を有するサンプル中でより強く脈管を染色した。肺腫瘍において、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は、脈管以外の構造物を染色した。   In lung tissue, we observed that E3 antibody stained the lung vena cava particularly clearly, whereas D11 and 7e8 gave slight staining. B2 did not stain these same veins. Tie-1 expression dramatically upregulated lung carcinoma and all antibodies stained vessels more strongly in samples with lung carcinoma than samples from normal lung. In lung tumors, E3, B2 and D11 antibodies stained structures other than vessels.

腎臓において、Ｅ３およびＤ１１抗体は脈管に加えて腎臓細管を染色した。Ｂ２は細管または脈管の非常に弱い染色のみを与えたが、７ｅ８は血管のみを染色した。副腎腫組織において、Ｅ３抗体のみが明瞭な染色を与えた。   In the kidney, E3 and D11 antibodies stained kidney tubules in addition to vessels. B2 gave only very weak staining of tubules or vessels, whereas 7e8 stained only blood vessels. In adrenal tumor tissue, only E3 antibody gave clear staining.

胸において、Ｅ３は乳腺組織の静脈および毛細管で最も明るい染色を与え、Ｂ２および７ｅ８は類似の染色を与えたが、Ｄ１１はこれらの構造をかなり弱く染色した。乳癌腫において、Ｔｉｅ−１発現は実質的に上方調節され、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は脈管に加えて他の構造物も染色した。   In the breast, E3 gave the brightest staining in mammary tissue veins and capillaries, B2 and 7e8 gave similar staining, but D11 stained these structures rather weakly. In breast cancer, Tie-1 expression was substantially upregulated, and E3, B2 and D11 antibodies stained other structures in addition to the vessels.

（実施例６：フローサイトメトリーを使用した抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−ＩｇＧのマウス内皮細胞系への結合）
本発明者らは、Ｅ３がマウスＴｉｅ１とｉｎ ｓｉｔｕで交差反応するかどうかを評価し、よって、本発明者らがマウス腫瘍異種移植模型におけるＥ３活性を評価し得る場合は、マウス内皮細胞への結合を検査し、ヒト細胞系およびトランスフェクトした細胞系と比較した。 Example 6: Binding of anti-Tie1 E3-IgG to mouse endothelial cell line using flow cytometry
We evaluate whether E3 cross-reacts with mouse Tie1 in situ, and therefore if we can evaluate E3 activity in a mouse tumor xenograft model, Binding was examined and compared to human and transfected cell lines.

Ｔｉｅ−１抗体およびコントロールＭａｂのマウス内皮細胞への特異的な結合を、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳｓｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｅｐｉｃｓ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）により測定した。マウス内皮細胞系であるＭＳ１、Ｌｅ−２、Ｂｅｎｄ３、ＳＶＥＣ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）およびＴｉｅ−１をトランスフェクトしたＬｅ−２細胞を染色した。細胞染色は既存のプロトコルから改良された。約２００，０００細胞を各実験に使用した：トリプシン処理後、細胞をＰＢＳ中で一回洗浄し、ＰＢＳ、１０％熱不活化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）に再懸濁した。特異性を検査するために、抗体を異なる希釈で室温にて１時間インキュベートした。細胞を遠心分離により３分間６１１ｇで遠沈させた。インキュベーションとインキュベーションの間に細胞をＰＢＳで二回洗浄した。次いで、関連するビオチニル化抗体（ストレプトアビジンに対するＡ２、Ｔｉｅ−１に対するＥ３）を加え、室温にて１時間インキュベートした。軽鎖を生殖細胞系列化するＥ３ ＤＸ−２２１０抗体を、これらの調査に使用した。この後に、インキュベーション緩衝液中で、室温にて１時間、ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにインキュベートした。最終インキュベーション工程後、結合抗体を、ＦＡＣＳＣａｎおよびＥｐｉｃｓ Ａｌｔｒａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）によるフローサイトメトリーを用いることにより検出し、結果を分析した。   Specific binding of Tie-1 antibody and control Mab to mouse endothelial cells was measured by flow cytometric analysis (FACSscan, Becton Dickinson, Oxford, Epics, Coulter). The mouse endothelial cell lines MS1, Le-2, Bend3, SVEC (ATCC, Rockville) and Tie-1 transfected Le-2 cells were stained. Cell staining was improved from existing protocols. Approximately 200,000 cells were used for each experiment: after trypsinization, the cells were washed once in PBS and resuspended in PBS, 10% heat-inactivated human serum (incubation buffer). To test for specificity, antibodies were incubated at different dilutions for 1 hour at room temperature. Cells were spun down at 611 g for 3 minutes by centrifugation. Cells were washed twice with PBS between incubations. The relevant biotinylated antibodies (A2 for streptavidin, E3 for Tie-1) were then added and incubated for 1 hour at room temperature. The E3 DX-2210 antibody that germlined the light chain was used for these studies. This was followed by incubation with streptavidin-R-phycoerythrin (Dako, Glostrup, Denmark) in incubation buffer for 1 hour at room temperature. After the final incubation step, bound antibody was detected by using flow cytometry with FACSCan and Epis Altra (Becton Dickinson, Oxford, Coulter) and the results analyzed.

インキュベーション中０．１％の最終濃度でインキュベーション緩衝液にサポニンを加える以外は、細胞内Ｔｉｅ−１を上記のように測定した。抗Ｔｉｅ−１抗体Ｅ３は、ｉｎ ｓｉｔｕでＥ３のマウスおよびヒトＴｉｅ１との交差反応性を示すマウス内皮細胞系に結合する。フローサイトメトリーによって検出されるマウス細胞系中の結合パターンは、マウス細胞において、主要ヒト内皮細胞系と比較して高い細胞表面染色が存在する点において、ＨＵＶＥＣでの結合パターンとは異なる。ＤＸ−２２１０をマウス内皮細胞系ならびにＨＵＶＥＣコントロール細胞の両方を、明確に染色した。これらの細胞をサポニンで処理した際、蛍光シグナルが変化したが、このことは、隔離されたＴｉｅ１のかなりの細胞内プールを示している。   Intracellular Tie-1 was measured as described above except that saponin was added to the incubation buffer at a final concentration of 0.1% during the incubation. Anti-Tie-1 antibody E3 binds in situ to mouse endothelial cell lines showing cross-reactivity with E3 mouse and human Tie1. The binding pattern in mouse cell lines detected by flow cytometry differs from that in HUVEC in that mouse cells have higher cell surface staining compared to the primary human endothelial cell line. DX-2210 was clearly stained for both mouse endothelial cell lines as well as HUVEC control cells. When these cells were treated with saponin, the fluorescence signal changed, indicating a significant intracellular pool of sequestered Tie1.

（実施例７：フローサイトメトリーを使用するヒト血小板に結合する抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−ＩｇＧの決定）
Ｔｉｅ−１に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる結合実験は、以前の研究でヒト血小板への結合を示した（Ｔｓｉａｍｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３７：４３７−４２）。この研究からの結論は、血小板が、Ｔｉｅ１の発達の問題を示し得るＴｉｅ−１免疫反応の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体Ｅ３が血小板に結合するかどうかを決定するために、本発明者らは、活性化および非活性化の両方の血小板に対するフローサイトメトリー分析を実施し、染色パターンを精製抗Ｔｉｅ１ポリクローナル血清と比較した。 Example 7: Determination of anti-Tie1 E3-IgG binding to human platelets using flow cytometry
Binding experiments using purified polyclonal goat antiserum (R & D systems) against Tie-1 showed binding to human platelets in previous studies (Tsiamis et al., (2000) J. Vasc. Res. 37: 437-). 42). The conclusion from this study was that platelets represented as a therapeutic target a large pool of Tie-1 immune responses that could indicate Tie1 development problems. To determine whether antibody E3 binds to platelets, we performed flow cytometric analysis on both activated and inactivated platelets and compared the staining pattern with purified anti-Tie1 polyclonal serum. did.

血小板活性化を避けるために、血小板ＧｅｌＳｅｐキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）キットを製造者の指標に従って使用し、健康なドナーの血漿からヒト血小板を単離した。血小板を、トロンビンを０．８Ｕ／ｍｌの最終濃度に加えることにより活性化した。活性化血小板を非活性化血小板から区別するために、二重染色をＴｉｅ−１抗体／コントロール抗体および抗体ＣＤ４２（全血小板）またはＣＤ６２（活性化血小板）を用いて実施した。   To avoid platelet activation, the platelet GelSep kit (Biocytex, Marseille, France) kit was used according to manufacturer's indicators to isolate human platelets from healthy donor plasma. Platelets were activated by adding thrombin to a final concentration of 0.8 U / ml. To distinguish activated platelets from non-activated platelets, double staining was performed with Tie-1 antibody / control antibody and antibody CD42 (total platelets) or CD62 (activated platelets).

調製後、血小板をＧｅｌＳｅｐキット、１０％熱不活化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）の緩衝液２に再懸濁し、１時間インキュベートした。特異性を検査するために、ビオチニル化抗体であるヒト抗Ｔｉｅ１（Ｅ３）、ヒト抗ストレプトアビジン（Ａ２−ＳＶ、Ｔｉｅ１と結合しない抗体）、ヒト抗ＦＩＴＣおよびヤギ抗Ｔｉｅ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１検査あたり５０００００血小板とともに、異なる希釈（２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）で一時間、室温でインキュベートした。血小板を遠心分離により１０分間６１１ｇで遠沈させた。インキュベーションとインキュベーションの間に血小板をＧｅｌＳｅｐキットの緩衝液１で二回洗浄した。次いで、抗ＣＤ４２−ＰｅｒｃＰまたは抗ＣＤ６２−ＰｅｒｃＰとともにストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリンを室温にて３０分間、インキュベーション緩衝液中でインキュベートした。最後のインキュベーションおよび洗浄後に、結合タンパク質の検出をＦＡＣＳｓｃａｎおよびＥｐｉｃｓ Ａｌｔｒａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）によるフローサイトメトリーを用いて実施し、結果を分析した。細胞は、非活性化血小板を用いた場合、全血小板についてＳＳＣおよび抗ＣＤ４２−ＰｅｒｃＰ上でゲート（ｇａｔｅ）され、活性化血小板についてＳＳＣおよび抗ＣＤ６２−ＰｅｒｃＰ上でゲートされた。   After preparation, the platelets were resuspended in buffer 2 of GelSep kit, 10% heat inactivated human serum (incubation buffer) and incubated for 1 hour. To test for specificity, biotinylated antibodies human anti-Tie1 (E3), human anti-streptavidin (A2-SV, antibodies that do not bind to Tie1), human anti-FITC and goat anti-Tie (R & D systems) Incubated at room temperature for 1 hour at different dilutions (2 μg / ml, 10 μg / ml) with 500,000 platelets per test. Platelets were spun down at 611 g for 10 minutes by centrifugation. Platelets were washed twice with buffer 1 of the GelSep kit between incubations. Streptavidin-R-phycoerythrin was then incubated with anti-CD42-PercP or anti-CD62-PercP for 30 minutes at room temperature in incubation buffer. After the last incubation and wash, detection of bound protein was performed using flow cytometry with FACSscan and Epics Altra (Becton Dickinson, Oxford, Coulter) and the results analyzed. Cells were gated on SSC and anti-CD42-PercP for whole platelets and on SSC and anti-CD62-PercP for activated platelets when non-activated platelets were used.

ポリクローナルヤギ抗Ｔｉｅ−１抗体は、検査された条件下に血小板に実際に結合する。この結合は、血小板が活性化されている場合は少ない。コントロール的に、ヒト抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３は、全血小板に対しても、活性化血小板に対しても有意な結合を示さない（図１）。   The polyclonal goat anti-Tie-1 antibody actually binds to platelets under the conditions tested. This binding is less when platelets are activated. In control, the human anti-Tie1 antibody E3 shows no significant binding to either whole platelets or activated platelets (FIG. 1).

（実施例１０：抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−ＩｇＧによる免疫沈降を使用したヒト血小板におけるＴｉｅ１免疫反応性の評価）
Ｔｉｅ−１に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる以前の研究は、ヒト血小板への結合を示した（Ｔｓｉａｍｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。この研究からの結論は、血小板が、Ｔｉｅ１の発達の問題を示し得るＴｉｅ−１免疫反応性の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体Ｅ３が血小板に結合する可能性を排除するために、血小板およびＨＵＶＥＣから調製された溶解物の免疫沈降を実施した。活性化と不活性化の両方の血小板を調査した。 Example 10: Evaluation of Tie1 immunoreactivity in human platelets using immunoprecipitation with anti-Tie1 E3-IgG
Previous studies with purified polyclonal goat antiserum (R & D Systems) against Tie-1 have shown binding to human platelets (Tsiamis et al., 2000). The conclusion from this study was that platelets represented as a therapeutic target a large pool of Tie-1 immunoreactivity that could indicate Tie1 development problems. To eliminate the possibility of antibody E3 binding to platelets, immunoprecipitation of lysates prepared from platelets and HUVEC was performed. Both activated and inactivated platelets were investigated.

抗Ｔｉｅ−１抗体であるＢ２、Ｄ１１、Ｅ３、ヤギポリクローナル抗体ＡＦ６１９（Ｒ＆Ｄ）およびネガティブコントロール抗体抗ＦＩＴＣおよび抗ストレプトアビジンを使用した。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理により培養皿から回収し、血小板を血小板ＧｅｌＳｅｐキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の指針に従って用い、調製した。一回の免疫沈降実験につき、３〜５×１０６および３×１０８細胞血小板を、検査された各抗体のために使用した。血小板および細胞をＰＢＳで洗浄し、１４００ｒｐｍで４分間遠沈させ、上清を除去した。次いで、細胞を、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸（ＤＯＣ）および０．５％ＮＰ−４０を含む１ｍｌ細胞溶解緩衝液中で５分間、溶解させた。溶解した細胞を１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠沈させ、５μｇ／ｍｌ抗体を上清に加え、ローテータ上で４℃にてインキュベートした。１００μｌ／サンプルプロテインＡビーズ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を細胞溶解緩衝液で３回洗浄し（遠心速度：１５秒、２０００ｒｐｍ）、次いで抗体とともにインキュベートした細胞溶解物を、４℃にて３０分間加えた。次いで、ビーズを、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＤＯＣ、０．５％ＮＰ−４０を含む洗浄緩衝液で３回洗浄した。最後に、ビーズを遠沈させ、ペレットをサンプル緩衝液に等量で再懸濁させて、ＳＤＳ−ｐａｇｅおよびウェスタンブロッティングを実施した。ウェスタンブロッティングにおいて、Ｔｉｅ−１をポリクローナルヤギ抗Ｔｉｅ−１抗体で検出した。この研究の結論は、Ｅ３は、ＨＵＶＥＣにおいてＴｉｅ−１を免疫沈降し得るが、血小板においては免疫沈降し得ないということである。 Anti-Tie-1 antibodies B2, D11, E3, goat polyclonal antibody AF619 (R & D) and negative control antibodies anti-FITC and anti-streptavidin were used. HUVEC were collected from the culture dish by trypsinization and platelets were prepared using the platelet GelSep kit (Biocytex, Marseille, France) according to the manufacturer's guidelines. For a single immunoprecipitation experiment, 3-5 × 10 6 and 3 × 10 8 cell platelets were used for each antibody tested. Platelets and cells were washed with PBS, spun down at 1400 rpm for 4 minutes, and the supernatant was removed. The cells were then lysed for 5 minutes in 1 ml cell lysis buffer containing 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5% deoxycholic acid (DOC) and 0.5% NP-40. Lysed cells were spun down at 14,000 rpm for 10 minutes, 5 μg / ml antibody was added to the supernatant and incubated at 4 ° C. on a rotator. 100 μl / sample protein A beads (Uppsala, Sweden) were washed 3 times with cell lysis buffer (centrifugation speed: 15 seconds, 2000 rpm), then cell lysate incubated with antibody was added at 4 ° C. for 30 minutes. The beads were then washed 3 times with wash buffer containing 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 400 mM NaCl, 0.5% DOC, 0.5% NP-40. Finally, the beads were spun down and the pellet was resuspended in an equal volume in sample buffer and subjected to SDS-page and Western blotting. In Western blotting, Tie-1 was detected with a polyclonal goat anti-Tie-1 antibody. The conclusion of this study is that E3 can immunoprecipitate Tie-1 in HUVEC, but not platelets.

（実施例８：抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−ＩｇＧによる染色によって決定されたＨＵＶＥＣ細胞中のＴｉｅ１の分布）
本発明者らは、ＨＵＶＥＣ中のＥ３の染色パターンを、共焦点顕微鏡を使用して分析した。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、６００００細胞の密度でゼラチン被覆顕微鏡スライド上にスポットし、２４時間加湿インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。細胞を風乾し、４％パラホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定した。スライドを、ＰＢＳで洗浄した。これらのスライドを、１０％熱不活化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）とともにインキュベートした。 Example 8: Distribution of Tie1 in HUVEC cells determined by staining with anti-Tie1 E3-IgG
We analyzed the staining pattern of E3 in HUVEC using a confocal microscope. HUVECs were trypsinized, washed with PBS, spotted on gelatin-coated microscope slides at a density of 60000 cells and incubated at 37 ° C. in a humidified incubator for 24 hours. Cells were air dried and fixed with 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature. Slides were washed with PBS. These slides were incubated with 10% heat inactivated human serum (incubation buffer).

Ｔｉｅ−１への特異的な結合を測定するために、ビオチニル化抗体Ｅ３およびビオチニル化ネガティブコントロール抗体Ａ２を、１０μｇ／ｍｌの濃度で使用し、室温にて一時間インキュベートした。スライドを、ＰＢＳで二回洗浄した。次いで、ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、室温にて一時間インキュベートした。最後のインキュベーションおよび洗浄後、結合抗体の検出を、共焦点顕微鏡を用いて実施した。   To measure specific binding to Tie-1, biotinylated antibody E3 and biotinylated negative control antibody A2 were used at a concentration of 10 μg / ml and incubated for 1 hour at room temperature. Slides were washed twice with PBS. Streptavidin-R-phycoerythrin (Dako, Glostrup, Denmark) was then added and incubated for 1 hour at room temperature. After the last incubation and washing, detection of bound antibody was performed using a confocal microscope.

Ｅ３は、共焦点顕微鏡により検出されたように特異的にＨＵＶＥＣに結合する。染色は主に細胞内に位置し、細胞表面局在Ｔｉｅ１の小さいプールと比べてＴｉｅ１の大きな細胞内プールを示唆する。このＥ３の所在は、細胞骨格タンパク質とＴｉｅ１との共存と一致した。   E3 specifically binds to HUVEC as detected by confocal microscopy. Staining is mainly located intracellularly, suggesting a large intracellular pool of Tie1 compared to a small pool of cell surface localized Tie1. The location of E3 coincided with the coexistence of cytoskeletal protein and Tie1.

（実施例９：抗Ｔｉｅ１ Ｅ３のフレームワーク領域に置かれた体細胞変異の生殖細胞系列残基への変換）
ヒトにおけるＥ３の潜在的な免疫原性を減少させるために、ＬＣフレームワーク領域中のすべての非生殖細胞系列アミノ酸残基を訂正して生殖細胞系列に戻した。Ｅ３のＬＣを、すべてのκおよびλ軽鎖生殖細胞系列遺伝子を含むデータベースで調製した最初の分析を実施した。このＥ３のＬＣは、ＤＰＫ４に最も近い相同性を有することが示され、生殖細胞系列フレームワーク領域に対してＥ３中に三つの置換が同定された。 Example 9: Conversion of somatic mutations placed in the framework region of anti-Tie1 E3 to germline residues
In order to reduce the potential immunogenicity of E3 in humans, all non-germline amino acid residues in the LC framework region were corrected back to germline. An initial analysis was performed in which E3 LC was prepared on a database containing all kappa and lambda light chain germline genes. This E3 LC was shown to have the closest homology to DPK4, and three substitutions were identified in E3 relative to the germline framework region.

本発明者らは、ＤＰＫ４生殖細胞系列フレームワーク領域と同一の配列を含むようにＬＣフレームワーク領域を改変したＥ３の生殖細胞系列の変種を構築した。生殖細胞系列Ｅ３抗体は、所望の配列をコードする核酸を設計することにより構築した。Ｅ３ ＬＣ変異ドメインをコードする核酸に対する変更は、ＰＣＲおよび他の標準的な分子生物学的技術により行い、核酸配列決定により確かめた。   The present inventors constructed a germline variant of E3 in which the LC framework region was modified to include the same sequence as the DPK4 germline framework region. Germline E3 antibody was constructed by designing a nucleic acid encoding the desired sequence. Changes to the nucleic acid encoding the E3 LC mutation domain were made by PCR and other standard molecular biology techniques and verified by nucleic acid sequencing.

例示的な生殖細胞系列化軽鎖可変ドメインＥ３配列は以下のとおりである：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＨＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＨＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号１５９）。変更位置に下線が付けてある。 An exemplary germline light chain variable domain E3 sequence is as follows:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGHYLAWYQQKPGKVPKLLIYTASTLQSGVPPSGSGSGSGSDTFTTISSLQPEDVATYYCQQFNSYPHFTFGQGTLELEIK (sequence number 159). The change position is underlined.

本発明者らは、Ｅ３抗体の生殖細胞系列化変種を可溶性ＦａｂおよびＩｇＧの両方として生成した。ポジティブｓＦＡＢを発現するクローンのＦａｂカセットを、オリゴヌクレオチドでＰＣＲ増幅し、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域を含む哺乳動物の発現ベクター中に連結し、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細胞中にエレクトロポレートした。原核リボソーム結合配列および遺伝子の３リーダー配列を哺乳動物の内部リボソーム入口および重鎖リーダー配列によって置換した。再フォーマットした抗体クローンを配列決定してクローニング操作後に正確性を確かめた。無エンドトキシンＤＮＡを調製し、一時的トランスフェクションの研究に用いた。   We have generated germlined variants of the E3 antibody as both soluble Fab and IgG. A clone Fab cassette expressing positive sFAB was PCR amplified with oligonucleotides, ligated into a mammalian expression vector containing a human IgG4 Fc region, and electroporated into XL1 Blue MRF 'cells. The prokaryotic ribosome binding sequence and the 3 leader sequence of the gene were replaced by the mammalian internal ribosome entry and heavy chain leader sequences. The reformatted antibody clone was sequenced to confirm its accuracy after the cloning operation. Endotoxin-free DNA was prepared and used for transient transfection studies.

（実施例１０：ＥＬＩＳＡにおける組換えＴｉｅ１−Ｆｃへの結合のための生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−Ｆａｂの生成および検査）
Ｅ３フレームワークの任意の体細胞変異の生殖細胞系列残基への変換が、結合活性になんらかの効果を有するかどうかを評価するために、可溶性Ｆａｂを生成した。親Ｅ３ Ｆａｂを含む可溶性発現ベクターおよび生殖細胞系列化Ｅ３ Ｆａｂ構築物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含む２×ＴＹブロスで３０℃にて一晩生育し、この一晩の培養物の４ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．１％のグルコースを含む４００ｍｌの２×ＴＹブロスに接種した。細胞を３７℃で０．８〜１．０のＯＤ６００まで生育し、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３０℃で４時間維持した。培養物を４，０００ｒｐｍで４℃にて１５分間遠沈させた。上清を捨て、ペレットを、プロテアーゼ阻害物質（プロテアーゼ阻害物質反応混液錠剤［Ｒｏｃｈｅ］：１錠剤を１ｍｌの水に溶解し、ＴＥＳ緩衝液で５０倍に希釈する）を含む４．８ｍｌの氷冷ＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍトリス塩酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース、ｐＨ８．０）に再懸濁させた。５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、氷上に５〜１０分間置く。このインキュベーション中、遠心ボトルを、プロテアーゼ阻害物質を含む５．２５ｍｌのＴＥＳ：Ｈ２Ｏ（１：３）で洗浄し、これを細胞に加える。２０分間以上氷上でインキュベートする。３０００ｇで４℃にて１５分間回転させ、上清を新しい遠心チューブに移す。細胞ペレットを、１５ｍＭのＭｇＳＯ４およびプロテアーゼ阻害物質を含む６ｍｌのＴＥＳに再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートする。３０００ｇで１５分間、４℃にて遠心する。上清を遠心チューブに移し、８０００ｇで４℃にて２０分間回転させる。上清を集め、ＰＢＳに対して透析する。Ｆａｂを金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。透析したペリプラズム抽出物を１ｍｌのＴＡＬＯＮ（商標）金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともにインキュベートし、室温にて２時間回転させる。ビーズを空の重力カラム（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ７３１−１５５０）に移す。ビーズをＰＢＳ中の５ｍＭイミダゾールで洗浄し、ＦａｂをＰＢＳ中の１５０ｍＭイミダゾールにより溶出する。透析カセット（ＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＳＥＲ（商標）透析カセット、ＭＷＣＯ １０，０００、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６６３８０）を使用してＰＢＳに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌ溶液が０．８６の吸光度を有するとみなして２８０ｎｍでの吸光度からタンパク質濃度を決定する。調製物の品質を、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し得る。 Example 10: Generation and testing of germlined anti-Tie1 E3-Fab for binding to recombinant Tie1-Fc in ELISA
To assess whether the conversion of any somatic mutation of the E3 framework to germline residues had any effect on binding activity, soluble Fabs were generated. Soluble expression vectors containing the parental E3 Fab and germlined E3 Fab constructs were grown overnight at 30 ° C. in 2 × TY broth containing 100 μg / ml ampicillin and 2% glucose, and 4 ml of this overnight culture. Was used to inoculate 400 ml of 2 × TY broth containing 100 μg / ml ampicillin and 0.1% glucose. Cells were grown at 37 ° C. to an OD 600 of 0.8-1.0, 1 mM IPTG was added, and the culture was maintained at 30 ° C. for 4 hours. The culture was spun down at 4,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant is discarded, and the pellet is 4.8 ml ice-cold containing protease inhibitors (protease inhibitor reaction mixture tablets [Roche]: 1 tablet dissolved in 1 ml water and diluted 50-fold with TES buffer). Resuspended in TES buffer (0.2 M Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 M sucrose, pH 8.0). Transfer to a 50 ml Falcon tube and place on ice for 5-10 minutes. During this incubation, the centrifuge bottle is washed with 5.25 ml TES: H 2 O (1: 3) containing protease inhibitors and added to the cells. Incubate on ice for at least 20 minutes. Spin at 3000g for 15 minutes at 4 ° C and transfer the supernatant to a new centrifuge tube. The cell pellet is resuspended in 6 ml TES containing 15 mM MgSO 4 and protease inhibitors and incubated on ice for 15 minutes. Centrifuge at 3000g for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant is transferred to a centrifuge tube and spun at 8000 g for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant is collected and dialyzed against PBS. Fab was purified by metal chelate chromatography. The dialyzed periplasmic extract is incubated with 1 ml of TALON ™ metal affinity resin (Clontech) and rotated at room temperature for 2 hours. Transfer the beads to an empty gravity column (Poly-Prep chromatography column, Bio-Rad, catalog 731-1550). The beads are washed with 5 mM imidazole in PBS and the Fab is eluted with 150 mM imidazole in PBS. Dialyze against PBS using a dialysis cassette (SLIDE-A-LYSER ™ dialysis cassette, MWCO 10,000, Pierce, catalog number 66380) and assume that a 1 mg / ml solution has an absorbance of 0.86. Determine the protein concentration from the absorbance at 280 nm. The quality of the preparation can be analyzed by reducing and non-reducing SDS-PAGE.

０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１００マイクロリットルあたり、５００ｎｇまたは５０ｎｇの精製組換えヒトＴｉｅ１−Ｆｃ標的抗原でＩＭＭＵＬＯＮ（商標）２ＨＢプレートのウェルを一晩被覆した。親のＥ３、Ｅ３生殖細胞系列（Ｅ３ｇ）またはネガティブコントロール可溶性Ｆａｂを、ＰＢＳＴの１００マイクロリットルあたり５マイクログラムかまたは１マイクログラムでウェルに充填した。組換えヒトＴｉｅ１−Ｆｃ標的抗原を、適切な量の酢酸に溶解し、次に０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に１００マイクロリットルあたり５００ｎｇおよび５０ｎｇの最終濃度に希釈する。標的抗原をウェルに加えた後、マイクロタイタープレートを一晩４℃でインキュベートする。次に、このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、３７℃で２時間、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックする。このプレートを再び洗浄緩衝液でプレート回洗浄し、ＰＢＳＴおよびＰＢＳＴ１００マイクロリットルあたり５または１マイクログラムの精製Ｆａｂの１ウェルあたり１００マイクロリットルを加えた後、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで７回洗浄した後、ＰＢＳＴ中の抗ｓＦａｂ−ＨＲＰの１００マイクロリットルの１：５０００希釈物を加えた（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ＃３１４１４）。ウェルを７回洗浄した後、１００マイクロリットルのＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を各ウェルに加え、プレートをＥＬＩＳＡで６３０ｎｍにて読んだ。Ｅ３および生殖細胞系列化Ｅ３の両方が、このアッセイで組換えヒトＴｉｅ−１−Ｆｃ標的抗原に結合した。 Wells of IMMULON ™ 2HB plates were coated overnight with 500 ng or 50 ng of purified recombinant human Tie1-Fc target antigen per 100 microliter of 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 8.5). Parental E3, E3 germline (E3g) or negative control soluble Fab was loaded into wells at 5 or 1 microgram per 100 microliters of PBST. Recombinant human Tie1-Fc target antigen is dissolved in an appropriate amount of acetic acid and then diluted to a final concentration of 500 ng and 50 ng per 100 microliter in 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 9.6). After adding the target antigen to the wells, the microtiter plate is incubated overnight at 4 ° C. The plate is then washed 5 times with PBST and blocked with 1% BSA in PBS for 2 hours at 37 ° C. The plate was washed again with wash buffer and 100 microliters per well of PBST and 5 or 1 microgram of purified Fab per 100 microliters of PBST was added followed by incubation at room temperature for 1 hour. After the plate was washed 7 times with PBST, a 100 microliter 1: 5000 dilution of anti-sFab-HRP in PBST was added (Pierce Product # 31414). After washing the wells 7 times, 100 microliters of TMB-H 2 O 2 solution was added to each well and the plate was read by ELISA at 630 nm. Both E3 and germlined E3 bound to recombinant human Tie-1-Fc target antigen in this assay.

（実施例１１：ＢＩＡコアにおける組換えヒトＴｉｅ１への結合のための生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−Ｆａｂの生産および検査）
組換え精製ヒトＴｉｅ１ −Ｆｃ抗原（原液 ２．４５ｍｇ／ｍｌ）を、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ２１３３１）を使用してビオチニル化した。この反応を、２時間、氷上で、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中で、５倍モル過剰のビオチニル化剤の存在下で実施し、トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５（５０ｍＭ最終濃度）を加えて停止し、続いて氷上で１時間インキュベートした。次いで、サンプルをＰＢＳに対して透析した。次いで、抗原をＨＢＳ中で１／１００倍に希釈し、次いで、ストレプトアビジンチップ上に捕捉した。これを８３０ＲＵ（共鳴単位）の密度に被覆した。すべての分析を、ＨＢＳ緩衝液中で実施した。親Ｆａｂ Ｅ３および生殖細胞系列化Ｅ３ Ｆａｂを上記のように調製した。０．５８７ｍｇ／ｍｌ（１１７４０ｎＭ）の原液をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／５８７に希釈して、２０ｎＭの原液を得て、生殖細胞系列化Ｆａｂ Ｅ３ ０．０２５ｍｇ／ｍｌ（５００ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／２５に希釈して２０ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を各Ｆａｂ調製物から作製し、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭおよび１．２５ｎＭ溶液を得た。会合フェーズとして、サンプルを３０μｌ／分で４分間、注入（ｋｉｎｊｅｃｔ）プログラムを使用して注入した。１０分間の解離フェーズが続き、いずれの残っているサンプルも、１８秒間の５ｍＭ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌの一回の注入によりＴｉｅ−１ Ｆｃ表面から５０μｌ／分の流速で取り除いた。すべてのサンプルについて実施し、２部１式（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で分析した。 Example 11 Production and Testing of Germline Anti-Tie1 E3-Fab for Binding to Recombinant Human Tie1 in BIA Core
Recombinant purified human Tie1-Fc antigen (stock solution 2.45 mg / ml) was biotinylated using EZ-Linksulfo-NHS-SS-biotin (Pierce, catalog 21331). The reaction is performed for 2 hours on ice in 50 mM sodium carbonate buffer, pH 9.6, in the presence of a 5-fold molar excess of biotinylating agent, and Tris HCl, pH 7.5 (50 mM final concentration) is added. And then incubated for 1 hour on ice. The sample was then dialyzed against PBS. The antigen was then diluted 1/100 in HBS and then captured on a streptavidin chip. This was coated to a density of 830 RU (resonance units). All analyzes were performed in HBS buffer. Parental Fab E3 and germlined E3 Fab were prepared as described above. A stock solution of 0.587 mg / ml (11740 nM) was diluted 1/587 in HBS + BSA to obtain a 20 nM stock solution and 0.025 mg / ml (500 nM) of germlined Fab E3 in 1/25 in HBS + BSA. To obtain a 20 nM stock solution. Serial dilutions were made from each Fab preparation to obtain 10 nM, 5 nM, 2.5 nM and 1.25 nM solutions. As the association phase, the sample was injected at 30 μl / min for 4 minutes using the kinject program. A 10 minute dissociation phase followed, and any remaining sample was removed from the Tie-1 Fc surface at a flow rate of 50 μl / min by a single injection of 5 mM NaOH + 1 M NaCl for 18 seconds. All samples were run and analyzed in 2 part 1 in duplicate.

センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して分析した。分析から、Ｅ３抗体の生殖細胞系列化は抗体の結合活性に対して最少の効果を有したことがわかる。   Sensorgrams were analyzed using a simultaneous ka / kd fitting program using a 1: 1 model with BIAEVALUTION ™ software 3.1. Analysis reveals that germlined E3 antibody had minimal effect on antibody binding activity.

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例１２：ＢＩＡコアを使用した組換えヒトＴｉｅ１への結合についての生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−ＩｇＧと親抗Ｔｉｅ１ Ｅ３との親和性比較）
結合挙動が、体細胞変異の生殖細胞系列残基へ変換して戻すことにより影響を受けるかどうかを評価するために、生殖細胞系列化抗体を生成し、ＩｇＧとして検査した。生殖細胞系列化Ｅ３−ＩｇＧ構築物を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトし、この構築物を精製した。 Example 12: Affinity comparison of germlined anti-Tie1 E3-IgG and parental anti-Tie1 E3 for binding to recombinant human Tie1 using BIAcore
To assess whether the binding behavior is affected by converting back to somatic mutation germline residues, germlined antibodies were generated and tested as IgG. Germlined E3-IgG construct was used to transiently transfect HEK293T cells and this construct was purified.

生殖細胞系列化Ｅ３ ＩｇＧ１原液０．６３ｍｇ／ｍｌをｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈し、親Ｅ３ ＩｇＧ１原液０．５６ｍｇ／ｍｌ（２１４３−００１）をｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈した。ＩｇＧを直接的にＣＭ５チップに被覆した。チップの表面を０．０５Ｍ ＮＨＳ／０．２Ｍ ＥＤＣの７分間のパルスで活性化させ、７８０ＲＵ生殖細胞系列化Ｅ３−ＩｇＧおよび７２８非生殖細胞系列Ｅ３ ＩｇＧが表面に被覆されるまでＩｇＧを流した。すべてのフロー細胞を、続いて１Ｍ塩酸エタノールアミン、ｐＨ８．５の７分間のパルスで脱活性化した。すべての分析をＨＢＳ緩衝液中で実施した。精製組換えヒトＴｉｅ１ ＦｃをＨＢＳで１／２８．７に希釈して、４００ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を作製して、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭおよび２５ｎＭのＴｉｅ１ Ｆｃ原液を得た。会合フェーズの分析ために、サンプルは３０μｌ／分で８．３分間、注入（ｋｉｎｊｅｃｔ）プログラムを使用して注入した。この後に４０分間の解離フェーズが続いた。表面に会合して残っている任意の抗原を、３０秒間の１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の二回の注入によりＩｇＧ表面から５０μｌ／分の流速で剥ぎ取った。すべてのサンプルについて実施し、２部１式で分析した。   Germlined E3 IgG1 stock solution 0.63 mg / ml is diluted 1/50 with pH 4.5 buffer, and parent E3 IgG1 stock solution 0.56 mg / ml (2143-001) is diluted with pH 4.5 buffer 1 Diluted to 50/50. IgG was coated directly on a CM5 chip. The surface of the chip was activated with a 7 minute pulse of 0.05 M NHS / 0.2 M EDC, and IgG was flowed until the surface was coated with 780 RU germlined E3-IgG and 728 non-germline E3 IgG. . All flow cells were subsequently deactivated with a 7 minute pulse of 1M ethanolamine hydrochloride, pH 8.5. All analyzes were performed in HBS buffer. Purified recombinant human Tie1 Fc was diluted 1 / 28.7 with HBS to give a 400 nM stock solution. Serial dilutions were made to obtain 200 nM, 100 nM, 50 nM and 25 nM Tie1 Fc stock solutions. For analysis of the association phase, samples were injected at 30 μl / min for 8.3 minutes using the Kinject program. This was followed by a 40 minute dissociation phase. Any antigen remaining associated with the surface was stripped from the IgG surface at a flow rate of 50 μl / min by two injections of 10 mM glycine, pH 1.5 for 30 seconds. All samples were run and analyzed in two parts and one set.

センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して分析した。生殖細胞系列化はヒトＴｉｅ１
Ｆｃに関してＥ３ ＩｇＧの結合活性に対して最少の影響力を有した。 Sensorgrams were analyzed using a simultaneous ka / kd fitting program using a 1: 1 model with BIAEVALUTION ™ software 3.1. Germ lineage is human Tie1
Has minimal influence on the binding activity of E3 IgG with respect to Fc.

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例１３：ＢＩＡコア中の組換えマウスＴｉｅ１への結合のための生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−Ｆａｂの生産および試験）
マウスＴｉｅ１−Ｆｃ抗原（０．５ｍｇ／ｍｌ原液）を、確立された手順を使用してビオチニル化し、ＨＢＳで１／１００倍に希釈後、これをストレプトアビジンチップへの捕捉に使用した。これを７４０ＲＵの共鳴値に被覆した。すべての分析をＨＢＳ緩衝液中で実施した。親Ｆａｂ Ｅ３ ０．５８７ｍｇ／ｍｌ（１１７４０ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／５８７に希釈し、２０ｎＭの原液を得、生殖細胞系列化Ｆａｂ Ｅ３ ０．０２５ｍｇ／ｍｌ（５００ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／２５に希釈して２０ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を各Ｆａｂ調製物から作製し、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭおよび１．２５ｎＭを得た。会合フェーズのために、サンプルは３０μｌ／分で４分間、注入（ｋｉｎｊｅｃｔ）プログラムを用いて注入した。この後に１０分間の解離フェーズが続き、いずれの残っているサンプルも、１８秒間の５０ｍＭ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌの一回の注入によりＴｉｅ１ Ｆｃ表面から５０μｌ／分の流速で剥ぎ取った。すべてのサンプルについて実施し、２部１式で分析した。 Example 13 Production and Testing of Germline Anti-Tie1 E3-Fab for Binding to Recombinant Mouse Tie1 in BIA Core
Mouse Tie1-Fc antigen (0.5 mg / ml stock solution) was biotinylated using established procedures, diluted 1 / 100-fold with HBS, and then used for capture on streptavidin chips. This was coated to a resonance value of 740 RU. All analyzes were performed in HBS buffer. Parental Fab E3 0.587 mg / ml (11740 nM) was diluted 1/587 in HBS + BSA to obtain a 20 nM stock solution and germlined Fab E3 0.025 mg / ml (500 nM) was halved in HBS + BSA. Dilution yielded a 20 nM stock solution. Serial dilutions were made from each Fab preparation to obtain 10 nM, 5 nM, 2.5 nM and 1.25 nM. For the association phase, samples were injected using a kinject program at 30 μl / min for 4 minutes. This was followed by a 10 minute dissociation phase, and any remaining sample was stripped from the Tie1 Fc surface at a flow rate of 50 μl / min by a single injection of 50 mM NaOH + 1 M NaCl for 18 seconds. All samples were run and analyzed in two parts and one set.

センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して分析した。Ｅ３抗体の生殖細胞系列化は、抗体の結合活性に対して最少の効果を有した。   Sensorgrams were analyzed using a simultaneous ka / kd fitting program using a 1: 1 model with BIAEVALUTION ™ software 3.1. Germlineage of E3 antibody had minimal effect on antibody binding activity.

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例１４：ＢＩＡコアを使用した組換えマウスＴｉｅ１への結合に対する生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１ Ｅ３−ＩｇＧと親抗Ｔｉｅ１ Ｅ３との親和性比較）
結合挙動が、体細胞変異の生殖細胞系列へ変換して戻ることにより影響を受けるかどうかを評価するために、生殖細胞系列化抗体を生成し、ＩｇＧとして検査した。生殖細胞系列化Ｅ３を記載されるようにＩｇＧに再フォーマットした。次いで、これを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に確立された手順を使用して一時的にトランスフェクトした。ＩｇＧを、確立された手順を使用するプロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用して培養上清から精製し、次いで、得られたＩｇＧを、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡコア）を使用して結合活性について検査した。生殖細胞系列化Ｅ３ ＩｇＧ１原液０．６３ｍｇ／ｍｌ（２１４６−００２）を、ｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈し、親Ｅ３ ＩｇＧ１原液０．５６ｍｇ／ｍｌ（２１４３−００１）を、ｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈した。ＩｇＧを直接的にＣＭ５チップに被覆した。チップの表面を、０．０５Ｍ ＮＨＳ／０．２Ｍ ＥＤＣの７分間のパルスで活性化し、７８０ＲＵ生殖細胞系列Ｅ３−ＩｇＧおよび７２８非生殖細胞系列化Ｅ３ ＩｇＧが表面を被覆されるまでＩｇＧを流した。すべての流れる細胞を、次に１Ｍ 塩酸エタノールアミン、ｐＨ８．５の７分間のパルスで脱活性化した。すべての分析を、ＨＢＳ緩衝液中で実施した。精製した組換えマウスＴｉｅ１ ＦｃをＨＢＳで１／６．５に希釈して、４００ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を作製し、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭおよび２５ｎＭのＴｉｅ１ Ｆｃ原液を得た。会合フェーズの分析ために、サンプルを３０μｌ／分で８．３分間、注入（ｋｉｎｊｅｃｔ）プログラムを使用して注入した。この後に４０分間の解離フェーズが続いた。表面に会合して残っているいずれの抗原も、３０秒間の１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の二回の注入によりＩｇＧ表面から５０μｌ／分の流速で除去した。すべてのサンプルについて実施し、２部１式で分析した。 Example 14: Affinity comparison of germlined anti-Tie1 E3-IgG and parental anti-Tie1 E3 for binding to recombinant mouse Tie1 using BIAcore
To evaluate whether the binding behavior is affected by converting somatic mutations back to germline, germlined antibodies were generated and tested as IgG. Germlined E3 was reformatted into IgG as described. This was then used to transiently transfect HEK293T cells using established procedures. IgG was purified from the culture supernatant using protein A column chromatography using established procedures, and the resulting IgG was then tested for binding activity using surface plasmon resonance (BIA core). . Germlined E3 IgG1 stock solution 0.63 mg / ml (2146-002) was diluted 1/50 with pH 4.5 buffer and parent E3 IgG1 stock solution 0.56 mg / ml (2143-001) was diluted to pH 4 Diluted 1/50 with 5 buffer. IgG was coated directly on a CM5 chip. The surface of the chip was activated with a 7 minute pulse of 0.05 M NHS / 0.2 M EDC, and IgG was flowed until 780 RU germline E3-IgG and 728 non-germlined E3 IgG were coated on the surface. . All flowing cells were then deactivated with a 7 minute pulse of 1M ethanolamine hydrochloride, pH 8.5. All analyzes were performed in HBS buffer. Purified recombinant mouse Tie1 Fc was diluted 1 / 6.5 with HBS to obtain a 400 nM stock solution. Serial dilutions were made to obtain 200 nM, 100 nM, 50 nM and 25 nM Tie1 Fc stock solutions. For analysis of the association phase, samples were injected at 30 μl / min for 8.3 minutes using the kinject program. This was followed by a 40 minute dissociation phase. Any antigen remaining associated with the surface was removed from the IgG surface at a flow rate of 50 μl / min by two injections of 10 mM glycine, pH 1.5 for 30 seconds. All samples were run and analyzed in two parts and one set.

センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して分析した。生殖細胞系列化プロセスは、マウスＴｉｅ１ Ｆｃに関するＥ３ ＩｇＧの結合活性に対し、最少の影響力を有した。   Sensorgrams were analyzed using a simultaneous ka / kd fitting program using a 1: 1 model with BIAEVALUTION ™ software 3.1. The germline lineage process had minimal impact on the binding activity of E3 IgG on mouse Tie1 Fc.

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例１５：ＨＵＶＥＣを用いる管形成アッセイにおける生殖細胞系列抗Ｔｉｅ１−Ｅ３および親抗Ｔｉｅ１−Ｅ３のＩＣ５０の比較）
生殖細胞系列化Ｅ３（ＤＸ−２２２０）とその親抗体（ＤＸ−２２００）を、コラーゲンタイプＩマトリックス中の管形成アッセイで評価した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（新しく単離したもの）を、ヒト臍帯静脈をトリプシン−ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃にて２０〜２５分間、処理することにより得た。次いで細胞を、接着因子（ＡＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で被覆したＴ−２５フラスコ中、１０％ＦＣＳ、０．４％ＢＢＥ、１％ １−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−ＥＤＴＡで分離し、二代または三代の継代でコンフルエントになったときに使用した。培養中これら細胞を１：２の分離比率で、単層の約６０〜８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。ＨＵＶＥＣ単層を、トリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で３７℃にて３分間処理した。トリプシン活性を、３体積分の完全ＲＰＭＩ培地を加えることにより停止した。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰り返すことにより分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。ＨＵＶＥＣ（継代２）を、７．５体積分の２ｍｇ／ｍｌコラーゲン（コラーゲンＲ；Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１体積分の１０×ＭＥＭ、１．５体積分のＮａＨＣＯ３（１５．６ｍｇ／ｍｌ）を混合することにより調製されたコラーゲンゲル（１．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩ ５０μｌ）上のそれらの培養培地（９６−ウエルプレートの４０×１０３／５０μｌ／ウェル）にまき、約１体積分のＮａＯＨによりｐＨを７．４に調節した。次いで、１時間３０分後、培養培地を捨て、細胞をコラーゲンの新しい層（１．５ｍｇ／ｍｌ、新しい調製物、５０μｌ／ウェル）で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、Ｅ３抗体（ＤＸ−２２００）または生殖細胞系列化Ｅ３抗体（ＤＸ−２２２０）（０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下に各ウェルに加えた。培養表面上の管ネットワークの全長を、ＭＥＴＡＶＵＥ（商標）ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均脈管面積として表した。各アッセイを少なくとも３回実施した。その結論は、３体細胞変異のＥ３中の生殖細胞系列アミノ酸への変換はＥ３の効力にほとんど効果を有さなかったということである。親Ｅ３（図２Ａおよび図２Ｂ）および生殖細胞系列Ｅ３（図２Ｃおよび図２Ｄ）の両方は、１０ｎｇ／ｍｌ未満、すなわち６６ｐＭのＩＣ５０を有してインビトロで管形成を阻害する。 Example 15: Comparison of IC50 of germline anti-Tie1-E3 and parental anti-Tie1-E3 in tube formation assay using HUVEC
Germlined E3 (DX-2220) and its parent antibody (DX-2200) were evaluated in a tube formation assay in a collagen type I matrix. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (freshly isolated) were obtained by treating human umbilical vein with trypsin-EDTA (1 ×) (Gibco / Invitrogen) at 37 ° C. for 20-25 minutes. The cells were then cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, 0.4% BBE, 1% 1-glutamine, 1% penicillin / streptomycin in T-25 flasks coated with adhesion factor (AF) (Cascade Biology). did. Primary cultures were separated with warm trypsin-EDTA and used when confluent at the second or third passage. During culture, these cells were maintained in a proliferative state by culturing them at an approximate density of about 60-80% of the monolayer at a separation ratio of 1: 2. HUVEC monolayers were treated with trypsin / EDTA (500 μl / dish) at 37 ° C. for 3 minutes. Trypsin activity was stopped by adding 3 volumes of complete RPMI medium. Cells were carefully scraped, separated by repeated pipetting, and finally washed with PBS. HUVEC (passage 2) was injected with 7.5 volumes of 2 mg / ml collagen (collagen R; Serva, Heidelberg, Germany), 1 volume of 10 × MEM, 1.5 volumes of NaHCO 3 (15.6 mg / ml). seeded collagen gels prepared by mixing ml) (1.5 mg / ml of collagen I 50 [mu] l) their culture medium (96-well plates 40 × 10 3 / 50μl / well on), about 1 volume The pH was adjusted to 7.4 with minutes of NaOH. After 1 hour 30 minutes, the culture medium was then discarded and the cells were coated with a new layer of collagen (1.5 mg / ml, fresh preparation, 50 μl / well). After gel polymerization, the culture medium is added to each well in the presence or absence of E3 antibody (DX-2200) or germlined E3 antibody (DX-2220) (0.1 ng / ml to 100 ng / ml). added. The total length of the tube network on the culture surface was quantified 40 × with METAVUE ™ software (Universal Imaging Corporation). Results from triplicate wells were expressed as mean vascular area per field of view ± SEM (relative units). Each assay was performed at least three times. The conclusion is that the conversion of the three somatic mutations to germline amino acids in E3 had little effect on E3 potency. Both parental E3 (FIGS. 2A and 2B) and germline E3 (FIGS. 2C and 2D) inhibit tube formation in vitro with an IC 50 of less than 10 ng / ml, ie 66 pM.

予備研究は、ＤＸ−２２４０ Ｆａｂの一価のＦａｂバージョンがＨＵＶＥＣにおける管形成を阻害し得ないことを示した。したがって、このアッセイにおいて、細胞ベースのアッセイでの効果を誘発するために二価性が必要である。   Preliminary studies have shown that the monovalent Fab version of DX-2240 Fab cannot inhibit tube formation in HUVEC. Thus, in this assay, bivalency is necessary to elicit effects in cell-based assays.

（実施例１６：マウス内皮細胞を用いた管形成アッセイにおける生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１−Ｅ３の分析）
マウスＴｉｅ１交差反応性およびマウスＴｉｅ１に対する生物活性を評価するために、Ｅ３および生殖細胞系列化Ｅ３の両方を、マウス内皮細胞系（ＬＥＩＩ）を使用してインビトロでの管形成を阻害する能力について評価した。 (Example 16: Analysis of germlined anti-Tie1-E3 in tube formation assay using mouse endothelial cells)
To assess mouse Tie1 cross-reactivity and biological activity against mouse Tie1, both E3 and germlined E3 were evaluated for their ability to inhibit tube formation in vitro using the mouse endothelial cell line (LEII). did.

ＬＥＩＩ肺マウス内皮細胞系（ＡＴＣＣ）を、Ｔ−２５フラスコで、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補ったＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を有するＭＥＭ培地中で培養した。培養中、細胞を１：５の分離比率で、単層の約８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。ＬＥＩＩ単層を、トリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で３７℃にて３分間処理した。トリプシン活性は３体積分の完全ＭＥＭ培地を加えることにより停止した。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰り返すことにより分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。ＬＥＩＩ細胞を、基底膜（ＢＩＯＣＯＡＴ（商標） Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のそれらの培養培地（９６ウエルプレートの２０〜４０×１０３／５０μｌ）にまいた。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（３７℃にて３０分間、５％ＣＯ２環境）の重合後、所望の分子（４．１０５細胞／ｍｌ；５０μｌ／ウエル）の存在下に完全培養培地に再懸濁させた内皮細胞懸濁液を各ウェルに加えた。次いで、血管形成アッセイプレートを３７℃にて１６〜１８時間、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートした。次いで、管ネットワークの全長を、ＭＥＴＡＶＵＥ（商標）ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を、視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均脈管面積として表した。各アッセイを少なくとも２回実施した。生殖細胞系列化Ｅ３はマウス内皮細胞における管形成の強力な阻害物質である。 LEII lung mouse endothelial cell line (ATCC) was cultured in MEM medium with GLUTAMAX ™ (Life Technology Ltd., Paisley, Scotland) supplemented with 10% FCS and 1% penicillin / streptomycin in T-25 flasks. did. During culture, cells were maintained in a proliferative state by culturing at an approximate density of about 80% of the monolayer at a separation ratio of 1: 5. LEII monolayers were treated with trypsin / EDTA (500 μl / dish) at 37 ° C. for 3 minutes. Trypsin activity was stopped by adding 3 volumes of complete MEM medium. Cells were carefully scraped, separated by repeated pipetting, and finally washed with PBS. The LEII cells, basement membrane (BIOCOAT (TM) Angiogenesis System; Becton Dickinson) was plated on (20~40 × 10 3 / 50μl of 96-well plates) their culture medium on. After polymerization of MATRIGEL ™ (30 minutes at 37 ° C., 5% CO 2 environment), resuspend in complete culture medium in the presence of the desired molecule (4.15 5 cells / ml; 50 μl / well). Endothelial cell suspension was added to each well. The angiogenesis assay plate was then incubated at 37 ° C. for 16-18 hours in a 5% CO 2 atmosphere. The total length of the tube network was then quantified at x40 times with METAVUE ™ software (Universal Imaging Corporation). Results from triplicate wells were expressed as mean vascular area per field of view ± SEM (relative unit). Each assay was performed at least twice. Germlined E3 is a potent inhibitor of tube formation in mouse endothelial cells.

（実施例１７：抗Ｔｉｅ１−Ｅ３ＩｇＧを使用したマウス腫瘍組織切片の免疫組織学的分析）
本発明者らは、抗体Ｅ３がマウス異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）におけるマウス内皮細胞に結合するかどうかを決定した。免疫組織化学は、ビオチニル化Ｅ３ ＩｇＧ１（ａ，ｚアロタイプ）抗体およびコントロール抗体である抗ＣＤ３１（内皮細胞特異的マーカー）および抗ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）を用いて実施した。ＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣ）を含むマウス異種移植片からのホルマリン固定腫瘍組織を、ヒト抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３の結合パターンについて検査した。パラフィン包埋組織の５μｍ切片を脱パラフィンし、再水和し、温かいクエン酸緩衝液（０．０１Ｍクエン酸ナトリウム、９５℃にてｐＨ６）で４５分間で前処理した。スライドを新しいクエン酸緩衝液で２０分間冷却し、蒸留水ですすいだ。スライドを過酸化水素処理し（ＰＢＳ中０．３％Ｈ２Ｏ２）、５％ＦＣＳ、５％熱不活性化ヒト血清（ＨＳ）を含むＰＢＳととともに１時間プレインキュベートした。抗体のインキュベーションとインキュベーションとの間に、スライドを３回５分間、ＰＢＳで洗浄した。ビオチニル化抗体Ｅ３とＡ２をＰＢＳ、１０％ＨＳで１０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、１時間室温でインキュベートした。次に、スライドをアビジン−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ）とともに３０分間、室温でインキュベートした。染色をＡＥＣ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）とＨ２Ｏ２により検出した。ペルオキシダーゼ反応を水を加えて停止し、スライドをヘマトキシリンで向流染色した。組織をそれらの結合反応性について評価した。染色パターンは、マウス内皮細胞Ｔｉｅ１の染色に一致し、Ｅ３によって発現されるＴｉｅ１はまた、マウス異種移植中のＳＷ４８０腫瘍細胞により発現されるＴｉｅ１に結合する。 (Example 17: Immunohistological analysis of mouse tumor tissue section using anti-Tie1-E3 IgG)
We determined whether antibody E3 binds to mouse endothelial cells in mouse xenografts. Immunohistochemistry was performed using biotinylated E3 IgG1 (a, z allotype) antibody and control antibodies anti-CD31 (endothelial cell specific marker) and anti-PCNA (proliferating cell nuclear antigen). Formalin-fixed tumor tissue from mouse xenografts containing SW480 cells (ATCC) was examined for the binding pattern of human anti-Tie1 antibody E3. 5 μm sections of paraffin-embedded tissue were deparaffinized, rehydrated and pretreated with warm citrate buffer (0.01 M sodium citrate, pH 6 at 95 ° C.) for 45 minutes. The slide was cooled with fresh citrate buffer for 20 minutes and rinsed with distilled water. Slides were treated with hydrogen peroxide (0.3% H 2 O 2 in PBS) and preincubated with PBS containing 5% FCS, 5% heat-inactivated human serum (HS) for 1 hour. Between antibody incubations, the slides were washed 3 times for 5 minutes with PBS. Biotinylated antibodies E3 and A2 were diluted with PBS, 10% HS to a concentration of 10 μg / ml and incubated for 1 hour at room temperature. The slides were then incubated with avidin-HRP (Dako) for 30 minutes at room temperature. Staining was detected with AEC (Vector Laboratories, Burlingame) and H 2 O 2 . The peroxidase reaction was stopped by adding water and the slide was countercurrently stained with hematoxylin. Tissues were evaluated for their binding reactivity. The staining pattern is consistent with the staining of mouse endothelial cells Tie1, Tie1 expressed by E3 also binds to Tie1 expressed by SW480 tumor cells in mouse xenografts.

（実施例１８：ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグ試験におけるＥ３活性）
Ｅ３ＩｇＧ抗体の生殖細胞系の変異体をＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグにおいてｂＦＧＦにより誘導された新脈管形成に関するインビボ試験において評価した。成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５４２３０）にｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３４−ＦＳＥ）を８０ｎｇ／ｍｌ添加した。Ａ２−ＳＶまたはＩｇＧ４Ｅ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳをＮＭＲＩｎｕ／ｎｕマウスの腹部領域に皮下注射した（マトリゲル１５０μｌ／プラグ）。 (Example 18: E3 activity in MATRIGEL® plug test)
Germline variants of the E3IgG antibody were evaluated in an in vivo study on angiogenesis induced by bFGF in a MATRIGEL® plug. 80 ng / ml of bFGF (R & D Systems, catalog number 234-FSE) was added to growth factor-reduced MATRIGEL® (BD Biosciences, catalog number 354230). A2-SV or IgG4E3 antibody (10 μg / ml) or PBS was injected subcutaneously into the abdominal region of NMRInu / nu mice (Matrigel 150 μl / plug).

第１の試験においては、ｂＦＧＦおよび可溶性ＶＥＧＦＲ−１（１０μｇ／ｍｌ）を添加したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をマウス２匹に注射し、新脈管形成阻害剤に関するポジティブコントロールとした。移植後７日においてマウスを麻酔し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を心臓を介して灌流した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグおよび肝臓の小片を摘出し、パラフィン包埋した。切片を切り出し、ヘマトキシリンエオシン染色した（Ｈ＆Ｅ）。   In the first study, two mice were injected with MATRIGEL® supplemented with bFGF and soluble VEGFR-1 (10 μg / ml) to serve as a positive control for angiogenesis inhibitors. Seven days after transplantation, mice were anesthetized and 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) was perfused through the heart. MATRIGEL® plugs and small pieces of liver were removed and embedded in paraffin. Sections were cut out and stained with hematoxylin and eosin (H & E).

染色によればＰＢＳおよびＡ２−ＳＶ抗体投与プラグにおいてＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）の修飾および血管様構造の形成が明らかになった。Ｅ３抗体および可溶性ＶＥＧＦＲ１添加プラグは単細胞を含有していたが、マトリックスの修飾や細胞の組織化の何れもこれ等のプラグには観察されなかった。この結果は生殖細胞系のＥ３抗体がインビボのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）において新脈管形成を阻害することを示している。   Staining revealed the modification of MATRIGEL® and the formation of blood vessel-like structures in PBS and A2-SV antibody dose plugs. E3 antibody and soluble VEGFR1-added plugs contained single cells, but neither matrix modification nor cell organization was observed in these plugs. This result indicates that germline E3 antibody inhibits angiogenesis in MATRIGEL® in vivo.

第２の試験においては、マウスに上記の通り投与し、次に移植後８日に麻酔し、フルオレセインコンジュゲートトマト（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｍｔｕｍ）レクチン（ＰＢＳ２００μｌ中１００μｇ；Ｖｅｃｔｏｒ、カタログ番号ＦＬ−１１７１）を尾静脈内に注射した。５分間循環させた後、ＰＢＳ１０ｍｌ、次いでＰＢＳ中４％ＰＦＡ１０ｍｌで心臓を介して灌流した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグおよび腎臓の小片を摘出し、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中に凍結した。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ）を含有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）マウント用培地を用いて切片上で核を可視化し、蛍光顕微鏡下に分析した。   In the second study, mice were administered as described above, then anesthetized 8 days after transplantation, and fluorescein conjugated tomato (lycopersicon esculetumum) lectin (100 μg in 200 μl PBS; Vector, catalog number FL-1171) was injected into the tail vein. Injected into. After being circulated for 5 minutes, it was perfused through the heart with 10 ml PBS followed by 10 ml 4% PFA in PBS. MATRIGEL® plugs and kidney pieces were removed and frozen in OCT (Tissue-Tek). Nuclei were visualized on sections using VECTASHIELD ™ mounting medium containing DAPI (Vector) and analyzed under a fluorescence microscope.

フルオレセインレクチンによるＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）の染色によれば、ＰＢＳおよびコントロール抗体（Ａ２−ＳＶ）を含有するプラグについては染色ポジティブ物質が判明したが、Ｅ３抗体含有プラグには染色は観察されなかった。コントロールとして同じマウス由来の腎臓および肝臓の血管はフルオレセインレクチンによる明確な染色を示していなかった。   Staining of MATRIGEL (registered trademark) with fluorescein lectin revealed staining positive substances for the plug containing PBS and control antibody (A2-SV), but no staining was observed for the E3 antibody-containing plug. As controls, kidney and liver blood vessels from the same mouse did not show clear staining with fluorescein lectin.

これ等２つの実験の結果は、抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３がｂＦＧＦ誘導新脈管形成をインビボで阻害できることを示唆している。   The results of these two experiments suggest that anti-Tie1 antibody E3 can inhibit bFGF-induced angiogenesis in vivo.

Ｅ３抗体の潜在的な抗新脈管形成活性を更に検討するために、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグにおけるｂＦＧＦ誘導内皮細胞管形成に対するＤＸ−２２１０（生殖細胞系軽鎖のＥ３抗体）の作用を調べる第３の試験を実施した。ＨＵＶＥＣ、ｂＦＧＦおよびＸＤ−２２１０、Ａ２−ＳＶ（ネガティブコントロールＩｇＧ）またはＰＢＳを添加した成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をＢａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕマウスの腹部領域に皮下注射した（１５０ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）μｌ／プラグ）。移植後８日においてマウスを麻酔し、フルオレセインコンジュゲートトマト（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｍｔｕｍ）レクチンを尾静脈内に注射した。５分間循環させた後、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグおよび肝臓と腎臓を摘出し、ＯＣＴ培地中に凍結した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグ中の血管の量を定量するために、切片を切り出し、抗ＣＤ３１抗体を用いて内皮細胞含有量に関して染色するか、または、蛍光顕微鏡下に分析することにより機能的血管の量を評価した（トマトレクチン染色）（データ示さず）。更に又、単位面積当たりの血管の量を定量した。これ等の結果はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）試験においてＤＸ−２２１０がｂＦＧＦ誘導新脈管形成を７０％阻害したことを示していた（図３）。   To further investigate the potential anti-angiogenic activity of E3 antibody, the effect of DX-2210 (germline light chain E3 antibody) on bFGF-induced endothelial cell tube formation in MATRIGEL® plugs is examined A third test was performed. Growth factor-reduced MATRIGEL® supplemented with HUVEC, bFGF and XD-2210, A2-SV (negative control IgG) or PBS was injected subcutaneously into the abdominal region of Balb / cnu / nu mice (150 MATRIGEL® μl). /plug). Mice were anesthetized 8 days after transplantation and fluorescein conjugated tomato (lycopersicon esculemum) lectin was injected into the tail vein. After circulating for 5 minutes, the MATRIGEL® plug and liver and kidney were removed and frozen in OCT medium. To quantify the amount of blood vessels in the MATRIGEL® plug, sections are cut out and stained for endothelial cell content with anti-CD31 antibody or analyzed under a fluorescence microscope for functional blood vessels. The amount was evaluated (tomato lectin staining) (data not shown). Furthermore, the amount of blood vessels per unit area was quantified. These results indicated that DX-2210 inhibited bFGF-induced angiogenesis by 70% in the MATRIGEL® test (FIG. 3).

（実施例１９：複合体形成に対するリガンドの作用の評価）
Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇを包含するヘテロマー複合体の形成を阻害することにより、または、ヘテロマー複合体が形成された後にそれを妨害することによりその形成に拮抗する能力について、複合体メンバー、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチンに結合する候補タンパク質（例えばＥ３またはＥ３ｂ抗体）を試験する。 Example 19: Evaluation of ligand action on complex formation
Complex members such as Tie1, for the ability to antagonize the formation of heteromeric complexes, including Tie1, Tie2, and Ang, or by blocking the formation of heteromeric complexes after they have been formed Candidate proteins (eg, E3 or E3b antibodies) that bind to Tie2 and angiopoietin are tested.

複合体形成を妨害する候補タンパク質の能力を試験するために、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２を発現する細胞に、Ｔｉｅ１および／またはＴｉｅ２へのＡｎｇの結合を可能とするために十分な時間、Ａｎｇを投与する。複合体が破壊されるために十分な時間、細胞を候補タンパク質と接触させる。細胞に膜非透過***差結合剤、例えばＤＴＳＳＰを投与することによりタンパク質を化学的に交差結合させる。細胞溶解物を調製し、複合体メンバーに特異的な抗体を用いて免疫沈降に付す。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、複合体メンバーに特異的な抗体を用いて免疫ブロッティングする。ポジティブコントロールの免疫沈降−免疫ブロッティングもまた実施し、その際、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２を発現する細胞にＡｎｇは投与するが候補タンパク質は投与しないとするか、または、非特異的タンパク質を投与する。候補タンパク質の投与により、ポジティブコントロールと比較して、免疫沈降メンバーと会合している免疫沈降メンバーが結合していない複合体メンバーの量が減少していれば、候補タンパク質は複合体形成の拮抗剤である。   In order to test the ability of candidate proteins to interfere with complex formation, Ang is administered to cells expressing Tie1 and Tie2 for a time sufficient to allow Ang to bind to Tie1 and / or Tie2. The cells are contacted with the candidate protein for a time sufficient for the complex to break. Proteins are chemically cross-linked by administering to the cells a membrane-impermeable cross-linking agent such as DTSSP. Cell lysates are prepared and subjected to immunoprecipitation using antibodies specific for the complex members. Immunoprecipitated proteins are separated by SDS-PAGE electrophoresis and immunoblotted with an antibody specific for the complex member. Positive control immunoprecipitation-immunoblotting is also performed, where Ang is administered but no candidate protein is administered to cells expressing Tie1 and Tie2, or a non-specific protein is administered. A candidate protein is an antagonist of complex formation if administration of the candidate protein reduces the amount of complex member that is not bound by the immunoprecipitated member associated with the immunoprecipitated member as compared to the positive control. It is.

候補タンパク質が複合体形成を阻害するかどうか調べるために、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２を発現する細胞に候補タンパク質を投与した後にＡｎｇを細胞に投与する以外は、同様の実験を実施する。細胞を候補タンパク質非存在下において複合体形成を可能にする十分な時間インキュベートする。上述した通り、細胞に候補タンパク質を投与しないか、または非特異的タンパク質を投与するポジティブコントロールを実施する。次に投与細胞を溶解し、そして免疫沈降および免疫ブロッティングを上述の通り実施する。   To examine whether the candidate protein inhibits complex formation, a similar experiment is performed except that Ang is administered to the cells after administering the candidate protein to cells expressing Tie1 and Tie2. The cells are incubated for a sufficient time to allow complex formation in the absence of the candidate protein. As described above, a positive control is performed in which no candidate protein is administered to the cells or a non-specific protein is administered. The administered cells are then lysed and immunoprecipitation and immunoblotting are performed as described above.

複合体形成を阻害するか、または複合体を破壊することにより複合体形成に拮抗する候補タンパク質は、次に、本明細書に記載する試験において新脈管形成に対するそれらの作用について試験する。   Candidate proteins that inhibit complex formation or antagonize complex formation by disrupting the complex are then tested for their effects on angiogenesis in the tests described herein.

（実施例２０：Ｔｉｅ２アミノ酸配列）
例示的なＴｉｅ２アミノ酸配列は、以下のとおりである： (Example 20: Tie2 amino acid sequence)
An exemplary Tie2 amino acid sequence is as follows:

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例２１：Ａｎｇ１アミノ酸配列）
例示的なＡｎｇ１アミノ酸配列は、以下のとおりである： (Example 21: Ang1 amino acid sequence)
An exemplary Ang1 amino acid sequence is as follows:

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例２２：生殖細胞系の残基への抗Ｔｉｅ１Ｅ３重鎖のフレームワーク３領域に位置する突然変異の変換）
患者への投与の後のＥ３抗体の潜在的免疫原性の危険性を制限するため、フレームワーク領域内の全非生殖細胞系突然変異を生殖細胞系のアミノ酸残基に戻るように補正した。抗Ｔｉｅ１Ｅ０３抗体をＤｙａｘＦａｂ２００ライブラリーから単離した。このライブラリーにおいて、ＨＣフレームワーク領域は独特であり、ＤＰ４７生殖細胞系セグメント（Ｖ３−３２）に相当する。合成ＨＣ−ＣＤＲ１−ＣＤＲ２サブライブラリの構築はオーバーラップするオリゴヌクレオチドの組立とその後の部分的ＰＣＲサイクルを通じて行ったため、突然変異はこれ等の２工程の一方により導入されている可能性がある。従って、Ｅ０３抗体のＨＣをＤＰ４７生殖細胞系遺伝子配列にアラインさせる分析を実施した。フレームワーク領域の３番に位置する１つの非生殖細胞系突然変異が発見され、ここではメチオニン残基がバリン残基により置き換えられていた。 Example 22: Conversion of a mutation located in the framework 3 region of the anti-Tie1E3 heavy chain to a germline residue
All non-germline mutations within the framework regions were corrected back to germline amino acid residues to limit the potential immunogenic risk of the E3 antibody after administration to the patient. Anti-Tie1E03 antibody was isolated from the DyaxFab200 library. In this library, the HC framework region is unique and corresponds to the DP47 germline segment (V3-32). Since the construction of the synthetic HC-CDR1-CDR2 sub-library was done through the assembly of overlapping oligonucleotides followed by a partial PCR cycle, the mutation may have been introduced by one of these two steps. Therefore, an analysis was performed to align the HC of the E03 antibody with the DP47 germline gene sequence. One non-germline mutation located at position 3 of the framework region was discovered, where the methionine residue was replaced by a valine residue.

この突然変異を修復するための方策を設計した。生殖細胞系残基の導入はＣＤＲのフレームワークにフランキングする領域における内部制限部位の存在により容易なものとした。実際、ＦＡＢ３１０ライブラリー内に存在するＨＣ−ＣＤＲ１−ＣＤＲ２サブライブラリの設計は、各ＣＤＲの夾雑化がフレームワークフランキング領域内の独特の制限部位の存在により可能となるような方法で行った。補正すべきバリン残基はＸｂａＩ部位の３’側近傍のＦＲ３領域に位置するため、ＸｂａＩ配列および補正されたメチオニン生殖細胞系残基の両方を含有するプライマーを設計した。変化はＣＨ１領域においてアニーリングする３’リバースプライマー（ＣＪ−リフトＮｈｅＲＥＶ）と組み合わせたＴｏｐＸｂａＩ−Ｍフォワードプライマーを用いたＰＣＲにより導入した。次に約１８０ｂｐのＰＣＲフラグメントを形成した。生殖細胞系ＰＣＲプライマーは以下の通りである：   A strategy was designed to repair this mutation. Germline residue introduction was facilitated by the presence of internal restriction sites in the region flanking the CDR framework. In fact, the design of the HC-CDR1-CDR2 sublibrary present in the FAB310 library was performed in such a way that each CDR could be contaminated by the presence of unique restriction sites within the framework flanking region. Primers containing both the XbaI sequence and the corrected methionine germline residue were designed because the valine residue to be corrected is located in the FR3 region near the 3 'side of the XbaI site. Changes were introduced by PCR using a TopXbaI-M forward primer combined with a 3 'reverse primer (CJ-lift NheREV) that anneals in the CH1 region. An approximately 180 bp PCR fragment was then formed. Germline PCR primers are as follows:

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例２３：生殖細胞系重鎖Ｔｉｅ１Ｅ３のクローニング）
Ｅ３重鎖に導入された生殖細胞系の残基が抗体の生物学的活性に影響するかどうか調べるために、生殖細胞系Ｅ３抗体（「Ｅ３ｂ」またはＤＥ−２２２０と称する）を含有する可溶性Ｆａｂ発現ベクターを構築した。実施例２２のＰＣＲフラグメント一夜５０Ｕ／μｇＸｂａＩ制限酵素で消化した後、５時間２５Ｕ／μｇＢｓｔＥＩＩで消化した。切断されたＰＣＲ産物を次に１％ＴＡＥアガロース分取用ゲル上で精製した。Ｔｉｅ１Ｅ３生殖細胞系軽鎖配列を含有する同様に消化されたファージミド発現ベクター（ｐＭＩＤＩ）のライゲーションを室温で３時間実施した。５ナノグラムの新しくライゲーションした物質をＴＧ１菌体内にエレクトロポレーションにより導入した。突然変異の補正の確認は２０個の無作為に選択した単離体の重鎖の配列決定により行った。得られたコーディングコンストラクトはＦａｂフォーマットにおける生殖細胞系ＨＣおよび生殖細胞系ＬＣ配列をコードしている配列を含有していた。（ＦａｂＥ３ｂと称する）。 Example 23: Cloning of germline heavy chain Tie1E3
To examine whether germline residues introduced into the E3 heavy chain affect the biological activity of the antibody, a soluble Fab containing a germline E3 antibody (designated "E3b" or DE-2220) An expression vector was constructed. The PCR fragment of Example 22 was digested overnight with 50 U / μg XbaI restriction enzyme and then with 25 U / μg BstEII for 5 hours. The cleaved PCR product was then purified on a 1% TAE agarose preparative gel. Ligation of a similarly digested phagemid expression vector (pMIDI) containing the Tie1E3 germline light chain sequence was performed at room temperature for 3 hours. 5 nanograms of newly ligated material was introduced into TG1 cells by electroporation. Confirmation of mutation correction was performed by sequencing the heavy chain of 20 randomly selected isolates. The resulting coding construct contained sequences encoding germline HC and germline LC sequences in Fab format. (Referred to as FabE3b).

（実施例２４：Ｅ３ｂ（ＤＸ−２２２０）の製造および精製）
Ｅ３ｂＦａｂ抗体をヒトＩｇＧ１に再フォーマットした。次にこのコンストラクトをＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトするために使用した。一過性細胞トランスフェクションのためのプラスミド調製物はＱｉａｇｅｎフィルタープラスミドマキシキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２２６３）を用いて得た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，カタログ番号Ｑ４０１）をトランスフェクション前２４時間播種し；ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（商標）（ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（商標）−１０チャンバー、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３２７１）培養容器当たり２２０×１０６個の細胞をプレーティングした。トランスフェクションはＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（商標）試薬（ＶＷＲ、カタログ番号ｎｏｖｇ７０９６７−３）を用いながら製造元の説明書に従って実施した。プラスミドＤＮＡ６５０マイクログラムをＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（商標）当たり使用した。細胞は１０％「超低濃度ＩｇＧ」ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６２５００７８）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１９６６０２１）中、３７℃、５％ＣＯ２、水分飽和雰囲気下に培養した。トランスフェクション後７２、１４４および２１６時間後にコンディショニングした培地を採取し、プールし、そして濾過滅菌した。 (Example 24: Production and purification of E3b (DX-2220))
The E3b Fab antibody was reformatted to human IgG1. This construct was then used to transiently transfect HEK293T cells. Plasmid preparations for transient cell transfection were obtained using the Qiagen filter plasmid maxi kit (Qiagen, catalog number 12263). HEK293T cells (GenHunter Corp., catalog number Q401) were seeded 24 hours prior to transfection; CELLSTACK ™ (CellSTACK ™ -10 chamber, Corning, catalog number 3271) 220 × 10 6 cells per culture vessel. Plated. Transfection was performed according to the manufacturer's instructions using GeneJuice ™ reagent (VWR, catalog number novg70967-3). 650 micrograms of plasmid DNA was used per CELLSTACK ™. The cells were cultured in DMEM (Invitrogen, catalog number 31966021) supplemented with 10% “ultra-low IgG” fetal calf serum (Invitrogen, catalog number 16250078) at 37 ° C., 5% CO 2 , in a water saturated atmosphere. Conditioned media was collected 72, 144 and 216 hours after transfection, pooled and filter sterilized.

細胞培養上澄みを０．５ＭＮａＣｌ含有ＰＢＳに対して平衡化させた２５ｍｌのｒプロテインＡＦＦカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１２７９−０２）にロードした。カラムを０．５ＭＮａＣｌ含有ＰＢＳ、次に０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．０で洗浄してウシＩｇＧを除去し、抗体を１２．５ｍＭクエン酸で溶出させた。抗体を含有する画分（５ｍｌ）を１５０μｌの１Ｍトリス塩酸ｐＨ９．０を添加することにより中和した。   The cell culture supernatant was loaded onto a 25 ml rProtein AFF column (GE Healthcare, catalog number 17-1279-02) equilibrated against PBS containing 0.5 M NaCl. The column was washed with PBS containing 0.5M NaCl and then with 0.1M sodium acetate pH 5.0 to remove bovine IgG and the antibody was eluted with 12.5 mM citric acid. The antibody-containing fraction (5 ml) was neutralized by adding 150 μl of 1M Tris-HCl pH 9.0.

Ｅ３ｂ抗体はカチオン交換により更に精製した。抗体を５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０に対して透析し、そして同じ緩衝液で平衡化したＨｉＬｏａｄ２６／１０ＳＰセファロースＨＰカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１１３８−０１）上にロードした。抗体を１ＭＮａＣ含有５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０で溶出させた（１０カラム容量で一次勾配）。抗体含有画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。抗体濃度は１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が１．３６の吸光度を有するものと仮定して２８０ｎｍにおける吸光度から計算した。   The E3b antibody was further purified by cation exchange. The antibody was dialyzed against 50 mM sodium citrate, pH 5.0 and loaded onto a HiLoad 26 / 10SP Sepharose HP column (GE Healthcare, catalog number 17-1138-01) equilibrated with the same buffer. The antibody was eluted with 50 mM sodium citrate pH 5.0 containing 1M NaC (primary gradient with 10 column volumes). Antibody containing fractions were pooled and dialyzed against PBS. The antibody concentration was calculated from the absorbance at 280 nm, assuming that a protein concentration of 1 mg / ml has an absorbance of 1.36.

（実施例２５：ＢＩＡｃｏｒｅにおけるＴｉｅ１／ＦｃへのＥ３ｂ−ＩｇＧ１の結合試験）
生殖細胞系Ｅ３ｂＩｇＧ１保存溶液（０．５６ｍｇ／ｍｌ）および親Ｅ３ＩｇＧ１保存溶液（０．４１ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５で５０倍希釈した。ＩｇＧ類は直接ＣＭ５チップ上にコーティングした。チップの表面を０．０５ＭＮＨＳ／０．２ＭＥＤＣの７分パルスで活性化し、生殖細胞系Ｅ３ｂの８２３ＲＵおよび親Ｅ３の７８８ＲＵが表面上にコーティングされるまで、チップ上にＩｇＧを流した。全ての流動細胞はその後、１Ｍ塩酸エタノールアミンｐＨ８．５の７分パルスにより脱活性化した。その後の全ての実験はＨＢＳ緩衝液中で実施した。 (Example 25: Binding test of E3b-IgG1 to Tie1 / Fc in BIAcore)
Germline E3b IgG1 stock solution (0.56 mg / ml) and parent E3IgG1 stock solution (0.41 mg / ml) were diluted 50-fold with 10 mM sodium acetate pH 4.5. IgGs were coated directly on CM5 chips. The surface of the chip was activated with a 7 min pulse of 0.05 MNHS / 0.2 MEDC and IgG was flowed onto the chip until germline E3b 823RU and parent E3 788RU were coated on the surface. All flow cells were then deactivated by a 7 minute pulse of 1M ethanolamine hydrochloride pH 8.5. All subsequent experiments were performed in HBS buffer.

精製した組換えヒトＴｉｅ１／ＦｃをＨＢＳ中終濃度２００、１００、５０、２５および１２．５ｎＭに希釈した。サンプルをｋｉｎｊｅｃｔプログラムを用いながら８．３分間、３０μｌ／分で注射した。その後５０分の解離相を設けた。残存する抗原は全て、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３０秒インジェクション２回により表面から除去した。   Purified recombinant human Tie1 / Fc was diluted to final concentrations of 200, 100, 50, 25 and 12.5 nM in HBS. Samples were injected at 30 μl / min for 8.3 minutes using the kinject program. A 50 minute dissociation phase was then provided. Any remaining antigen was removed from the surface by two 30 second injections of 10 mM glycine pH 1.5.

この方法を用いて得られたセンサーグラムを以下に示す。目視による分析によれば、解離（ｋｏｆｆ）は極めて緩徐であり（長い解離時間にも関わらず極めて少量の画分のＴｉｅ１／Ｆｃが解離した）、これは極めて堅固な相互作用を示唆している。興味深いことにここで測定したＩｇＧの解離速度は相当するＦａｂ類（後述する実施例２９参照）のものよりも遥かに緩徐であり、１価のＦａｂから２価のＩｇＧへの移行に際して親和性（アビディティ）が有意に増大することを示していた。 Sensorgrams obtained using this method are shown below. According to visual analysis, the dissociation (k off ) is very slow (a very small fraction of Tie1 / Fc dissociated despite the long dissociation time), suggesting a very tight interaction. Yes. Interestingly, the IgG dissociation rate measured here is much slower than that of the corresponding Fabs (see Example 29 described below), and has an affinity for the transition from monovalent Fab to divalent IgG ( Avidity) increased significantly.

（実施例２６：：ＢＩＡｃｏｒｅにおけるＴｉｅ１／ＦｃへのＥ３ｂ−Ｆａｖの結合試験）
生殖細胞系残基への体性の復帰突然変異の変換により結合挙動が何らかの影響を受けないかどうかを調べるために、親および生殖細胞系のＥ３ｂ抗体を作成してＦａｂフラグメントとしてＢｉａｃｏｒｅにおいて試験した。ここではＩｇＧ類に対して行ったこと（実施例２８参照）とは対称的に、そして、１価の相互作用を測定するために、表面上に直接コーティングした抗原上にＦａｂ類を流した。 (Example 26 :: Binding test of E3b-Fav to Tie1 / Fc in BIAcore)
To investigate whether binding behavior is not affected in any way by conversion of somatic backmutation to germline residues, parental and germline E3b antibodies were generated and tested in Biacore as Fab fragments. . In contrast to what was done here for IgGs (see Example 28), and to measure monovalent interactions, Fabs were flowed over antigen coated directly on the surface.

組換えヒトＴｉｅ１／ＦｃをＣＭ５チップ上にコーティングした。チップの表面をまず０．０５ＭＮＨＳ／０．２ＭＥＤＣの７分パルスで活性化し、次に７５０ＲＵが表面上にコーティングされるまでチップ表面上にＴｉｅ１／Ｆｃ（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中２μｇ／ｍｌ）を流した。全ての流動細胞はその後、１Ｍ塩酸エタノールアミンｐＨ８．５の７分パルスにより脱活性化した。その後の全ての実験はＨＢＳ緩衝液中で実施した。   Recombinant human Tie1 / Fc was coated on a CM5 chip. The chip surface is first activated with a 7 min pulse of 0.05 MNHS / 0.2 MEDC and then Tie1 / Fc (2 μg / ml in 10 mM sodium acetate pH 4.0) on the chip surface until 750RU is coated on the surface. Shed. All flow cells were then deactivated by a 7 minute pulse of 1M ethanolamine hydrochloride pH 8.5. All subsequent experiments were performed in HBS buffer.

親および生殖細胞系のＥ３ｂＦａｂを調製した。連続希釈（５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２５ｎＭ）をＨＢＳ緩衝液中に調製した。ＫＩＮＪＥＣＴ（登録商標）プログラムを用いながら５．３分間、３０μｌ／分でサンプルを注射した。その後１０分の解離相を設け、残存するＦａｂは５０ｍＭＮａＯＨ／１ＭＮａＣｌの単回１８秒インジェクションにより表面から除去した。   Parental and germline E3b Fabs were prepared. Serial dilutions (50, 25, 12.5, 6.25 and 3.125 nM) were prepared in HBS buffer. Samples were injected at 30 μl / min for 5.3 minutes using the KINJECT® program. Thereafter, a 10-minute dissociation phase was provided, and the remaining Fab was removed from the surface by a single 18 second injection of 50 mM NaOH / 1 M NaCl.

１：１モデルと仮定しながらＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（登録商標）ソフトウエア３．１の同時ｋａ／ｋｄフィッティングプログラムを用いてセンサーグラムを分析した。この分析により、Ｅ３抗体の生殖細胞系はＴｉｅ１／Ｆｃに対向した親和性に与える影響は僅かまたは皆無であることが証明された。   Sensorgrams were analyzed using the simultaneous ka / kd fitting program of BIAEVALUATION® software 3.1 assuming a 1: 1 model. This analysis demonstrated that the germline of the E3 antibody had little or no effect on the affinity for Tie1 / Fc.

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例２７：管形成試験における生物学的活性に関するＥ３ｂ−ＩｇＧの試験）
本試験の目的は、親Ｅ３内の生殖細胞系に戻るようにＨＣ突然変異を補正することが生物学的活性に対して何らかの作用を有するかどうか調べることであった。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（新しく単離）は３７℃で２０〜２５分間トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でヒト臍帯静脈を処理することにより得た。次に細胞を１０％ＦＣＳ、０．４％ＢＢＥ、１％ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシを添加したＲＰＭ１６４０培地中結合因子（ＡＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）をコーティングしたＴ−２５フラスコ中で培養した。一次培養物を温トリプシン−ＥＤＴＡで脱着させ、第２または第３継代においてコンフルエントとなった時点で使用した。培養中は約６０〜８０％の単層の概ねの密度においてスプリット比１：２で細胞を培養することによりこれ等を増殖状態に維持した。ＨＵＶＥＣ単層を３分間３７℃においてトリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で処理した。トリプシンの作用は完全ＲＰＭＩ培地３容量を添加することにより停止させた。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを反復して分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。ＨＵＶＥＣ（第３継代）は、７．５容量の２ｍｇ／ｍｌコラーゲン（ＣｏｌｌａｇｅｎＲ；Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１容量の１０ＸＭＥＭ、１．５容量のＮａＨＣＯ３（１５．６ｍｇ／ｍｌ）およびｐＨを７．４に調節するための〜１容量のＮａＯＨを混合することにより調製したコラーゲンゲル（コラーゲンＩ１．５ｍｇ／ｍｌを５０μｌ）上でその培地（４０×１０３／５０μｌ／９６穴プレートウェル）中に播種した。１時間３０分後、今度は培地を廃棄し、細胞を新しいコラーゲン層（１．５ｍｇ／ｍｌ、新しく調製、５０μｌ／ウェル）で被覆した。ゲル重合後、Ｅ３ｂ−ＩｇＧ１または親Ｅ３抗体（１ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、各ウェルに培地を添加した。内皮管形成は倒立顕微鏡を用いて評価した。低倍率（×４０）における各ウェルの中央の顕微鏡写真を画像キャプチャーソフトウエアと共にＮｉｋｏｎカメラを用いて撮った。顕微鏡写真における管形成はＭＥＴＡＶＵＥ（商標）ソフトウエアを用いて定量的（総管長）に分析した（データ示さず）。完全内皮細胞生育培地中の未投与ＨＵＶＥＣによる管形成をコントロールとして使用した。３連のウェルから得られた結果は、視野当たりの平均管面積±ＳＥＭ（相対的単位）として表示した（図４）。結論として、Ｅ３ｂ−ＩｇＧ１は管形成を阻害する。ＨＣ突然変異の補正は生物学的活性に対して有意な作用を有さなかった。 Example 27: E3b-IgG test for biological activity in tube formation test
The purpose of this study was to determine whether correcting HC mutations to return to the germline within parent E3 had any effect on biological activity. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (freshly isolated) were obtained by treating human umbilical vein with trypsin-EDTA (1 ×) (Gibco / Invitrogen) at 37 ° C. for 20-25 minutes. Cells were then cultured in T-25 flasks coated with binding factor (AF) (Cascade Biology) in RPM1640 medium supplemented with 10% FCS, 0.4% BBE, 1% 1-glutamine, 1% penicillin / streptomyces. did. Primary cultures were desorbed with warm trypsin-EDTA and used when they became confluent at the second or third passage. During culture, they were maintained in a proliferative state by culturing the cells at a split ratio of 1: 2 at an approximate density of about 60-80% monolayer. HUVEC monolayers were treated with trypsin / EDTA (500 μl / dish) for 3 minutes at 37 ° C. The action of trypsin was stopped by adding 3 volumes of complete RPMI medium. Cells were carefully scraped, separated by repeated pipetting, and finally washed with PBS. HUVEC (3rd passage) was performed with 7.5 volumes of 2 mg / ml collagen (Collagen®; Serva, Heidelberg, Germany), 1 volume of 10XMEM, 1.5 volumes of NaHCO 3 (15.6 mg / ml) and pH. (collagen I1.5mg / ml 50μl) collagen gel prepared by mixing the ~ 1 volume of NaOH to adjust to 7.4 on at the medium (40 × 10 3 / 50μl / 96 well plate well) in Sowing. After 1 hour 30 minutes, the medium was discarded and the cells were coated with a new collagen layer (1.5 mg / ml, freshly prepared, 50 μl / well). After gel polymerization, media was added to each well in the presence or absence of E3b-IgG1 or parent E3 antibody (1 pg / ml to 10 ng / ml). Endothelial tube formation was evaluated using an inverted microscope. A photomicrograph of the center of each well at low magnification (x40) was taken using a Nikon camera with image capture software. Tube formation in the micrograph was analyzed quantitatively (total tube length) using METAVUE ™ software (data not shown). Tube formation with untreated HUVEC in complete endothelial cell growth medium was used as a control. Results obtained from triplicate wells were expressed as mean tube area per field ± SEM (relative unit) (FIG. 4). In conclusion, E3b-IgG1 inhibits tube formation. Correction of the HC mutation had no significant effect on biological activity.

（実施例２８：例示されるＴｉｅ１結合配列）
以下に示すものは免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインの例示される配列である： (Example 28: Tie1 binding sequence exemplified)
The following are exemplary sequences of immunoglobulin light and heavy chain variable domains:

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例２９：例示されるＴｉｅ１抗体）
表５（図３７）および６（図３８）は本明細書に記載した例示される軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲ領域を示す。図３９（表９）は例示される抗体の一部の特性を示す。 (Example 29: Tie1 antibody exemplified)
Tables 5 (FIG. 37) and 6 (FIG. 38) show the CDR regions of the exemplified light and heavy chain variable regions described herein. FIG. 39 (Table 9) shows some properties of the exemplified antibodies.

本明細書に記載した一部の抗体は関連する可変ドメインを包含する。同じ可変ドメインは異なるパートナーの可変ドメインと共に機能できる。例えば、Ｍ００４４−Ｇ０６およびＭ００４４−Ｂ０５はＨＣ可変ドメインを共有しているが異なるＬＣ可変ドメインを有し、これはＭ００４４−Ｇ０７とＭ００４４−Ｂ０５の場合と同様である。同じＨＣ可変ドメインを有する他の抗体は、ＨＣ５４（Ｍ００５３−Ｄ１２）と１９（Ｍ００４４−Ｈ０５）；ＨＣ５９（Ｍ００５３−Ｆ０５）と１９（Ｍ００４４−Ｈ０５）；ＨＣ７２（Ｍ００５４−Ｈ１０）と２５（Ｍ００４５−Ｂ０３）；およびＨＣ９８（Ｍ００５６−Ｆ１１）と５７（Ｍ００５３−Ｅ０８）を包含する。同じＬＣ可変ドメインを有する一部の抗体は、ＬＣ１１４（Ｍ００５９−Ａ０６）と１０５（Ｍ００５７−Ｈ０７）：ＬＣ１３０（Ｍ００６２−Ｅ１１）と１０６（Ｍ００５７−Ｈ０７）：およびＬＣ１１５（Ｍ００５７−Ｂ０２）と１２（Ｍ００４４−Ｆ０３）を包含する。一部の抗体は同じＣＤＲ３を有する。例えばＣＤＲ３配列ＱＧＧＧＧＲＡＦＤＩはＭ００５６−Ｃ０４およびＭ００５６−Ｆ０２に存在する。ＣＤＲ３配列ＩＡＧＧＡＹＨＬＤＹはＭ００５６−Ｅ０８およびＭ００６１−Ｃ０５に存在する。   Some antibodies described herein include an associated variable domain. The same variable domain can function with variable domains of different partners. For example, M0044-G06 and M0044-B05 share an HC variable domain but have different LC variable domains, which is similar to M0044-G07 and M0044-B05. Other antibodies with the same HC variable domain are HC54 (M0053-D12) and 19 (M0044-H05); HC59 (M0053-F05) and 19 (M0044-H05); HC72 (M0054-H10) and 25 (M0045- B03); and HC98 (M0056-F11) and 57 (M0053-E08). Some antibodies with the same LC variable domain are LC114 (M0059-A06) and 105 (M0057-H07): LC130 (M0062-E11) and 106 (M0057-H07): and LC115 (M0057-B02) and 12 ( M0044-F03). Some antibodies have the same CDR3. For example, the CDR3 sequence QGGGGRAFDI is present in M0056-C04 and M0056-F02. The CDR3 sequence IAGGAYHLDY is present in M0056-E08 and M0061-C05.

一部の場合においては、抗体は非生殖細胞系の残基を包含する。このような非生殖細胞系の残基の１つ以上は例えば生殖細胞系の残基を回復するために修飾することができる。例示される非生殖細胞系残基はＬ４５Ｆ（例えばＭ００５３−Ｄ０６参照）；Ｖ４８Ｆ（例えばＭ００６２−Ｃ０８参照）；デルタＳ５３（例えばＭ００４５−Ｂ０１；Ｍ００４７−Ｄ０３；Ｍ００５５−Ｄ１２；Ｍ００６１−Ａ０３参照）；デルタＧ５４（例えばＭ００５３−Ａ０３参照）；Ｔ５７Ｉ（例えばＭ００４６−Ｂ１０参照）；Ｅ８５Ｄ（例えばＭ００５６−Ｈ１２参照）；Ｔ８７Ｍ（例えばＭ００５３−Ｆ０６；Ｍ００５５−Ｅ１２；Ｍ００５６−Ｂ０８参照）；Ｖ８９Ｌ（例えばＭ００４４−Ｂ０８；Ｍ００４７−Ｄ０１；Ｍ００６０−Ｂ０２；Ｍ００６２−Ｈ０１参照）；Ｖ８９Ｍ（例えばＭ００４４−Ｂ１０；Ｍ００４５−Ｃ１２；Ｍ００４５−Ｄ０７；Ｍ００５３−Ｂ１１；Ｍ００５５−Ｂ１２；Ｍ００５５−Ｅ０６；Ｍ００５６−Ａ０１；Ｍ００５６−Ｇ１２；Ｍ００５８−Ｇ０３；Ｍ００５９−Ａ０６；Ｍ００６０−Ｈ０１；Ｍ００６１−Ｆ０７参照）；Ｖ８９Ｔ（例えばＭ００４４−Ｈ０７；Ｍ００４６−Ａ１１；Ｍ００４６−Ｂ１０；Ｍ００４７−Ｄ０３；Ｍ００５５−Ｃ０７；Ｍ００５５−Ｄ０３；Ｍ００５５−Ｇ０２参照）；Ａ９３Ｔ（例えばＭ００４５−Ａ０２；Ｍ００５３−Ｆ０８；Ｍ００５６−Ｈ１２；Ｍ００５８−Ｅ０９；Ｍ００５９−Ａ０２；Ｍ００６１−Ｃ０６；Ｍ００６２−Ｇ０６参照）；およびＴ１０７Ｋ（例えばＭ００４５−Ｂ０３参照）を包含する。   In some cases, the antibody includes non-germline residues. One or more of such non-germline residues can be modified, for example, to restore germline residues. Exemplary non-germline residues are L45F (see eg M0053-D06); V48F (see eg M0062-C08); Delta S53 (eg see M0045-B01; M0047-D03; M0055-D12; M0061-A03); Delta G54 (see eg M0053-A03); T57I (see eg M0046-B10); E85D (see eg M0056-H12); T87M (eg M0053-F06; M0055-E12; see M0056-B08); V89L (eg M0044- B08; M0047-D01; M0060-B02; see M0062-H01); V89M (eg M0044-B10; M0045-C12; M0045-D07; M0053-B11; M0055-B12; M0055-E06) M0056-A01; M0056-G12; M0058-G03; M0059-A06; M0060-H01; M0061-F07); V89T (eg M0044-H07; M0046-A11; M0046-B10; M0047-D03; -D03; see M0055-G02); A93T (see, for example, M0045-A02; M0053-F08; M0056-H12; M0058-E09; M0059-A02; M0061-C06; M0062-G06); and T107K (see, for example, M0045-B03) ).

（実施例３０：ＤＸ−２２２０抗体の配列）
ＤＸ−２２２０は完全長のＩｇＧ１生殖細胞系ヒト抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３ｂである。ＤＸ−２２２０の配列は以下の通りである： (Example 30: Sequence of DX-2220 antibody)
DX-2220 is a full-length IgG1 germline human anti-Tie1 antibody E3b. The sequence of DX-2220 is as follows:

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例３１：ＤＸ−２２２０はヌードマウスにおける結腸直腸癌異種移植腫瘍の進行を緩徐化させる）
マウス（ｎｕ／ｎｕ）に５×１０６個のＳＷ−４８０（結腸直腸癌）細胞を皮下移植した。１２日後、腫瘍が約１００〜２００ｍｇに達した時点で、マウスを５群に分割し、以下の薬剤を投与（または未投与のまま）した。
１−未投与
２−ベヒクル（ＰＢＳ）
３−シスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ／ＩＶ、ｑ２ｄ×５回）
４−Ａ２−ＳＶ（ネガティブコントロール抗体、１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ｑ２ｄ×１４回）
５−ＤＸ−２２２０（抗Ｔｉｅ１抗体、１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ｑ２ｄ×１４回）
試験全体を通じて、発生した何れの腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）もカリブレーションされたｖｅｒｎｉｅｒカリパスを用いてミリメートル単位で測定し、Ｌは２つの寸法のより長いほうとした。適宜、長球楕円に関する数式：Ｍ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて腫瘍重量（Ｍ）をミリグラム単位で計算した。表７は群の各々に関する腫瘍の平均重量（ｍｇ）を示す。Ａ２−ＳＶはストレプトアビジンに結合するアイソタイプマッチ（ＩｇＧ１）のネガティブコントロール抗体である。 Example 31 DX-2220 slows progression of colorectal cancer xenograft tumors in nude mice
Mice (nu / nu) were transplanted subcutaneously with 5 × 10 6 SW-480 (colorectal cancer) cells. After 12 days, when the tumor reached about 100-200 mg, the mice were divided into 5 groups and the following drugs were administered (or left untreated).
1-untreated 2-vehicle (PBS)
3-cisplatin (4 mg / kg / IV, q2d × 5 times)
4-A2-SV (negative control antibody, 10 mg / kg, IP, q2d × 14 times)
5-DX-2220 (anti-Tie1 antibody, 10 mg / kg, IP, q2d × 14 times)
Throughout the study, the length (L) and width (W) of any tumor that developed was measured in millimeters using a calibrated vernier caliper, where L was the longer of the two dimensions. Where appropriate, tumor weight (M) was calculated in milligrams using the formula for the ellipsoidal ellipse: M = (L × W 2 ) / 2. Table 7 shows the average tumor weight (mg) for each of the groups. A2-SV is an isotype match (IgG1) negative control antibody that binds to streptavidin.

Figure 2008532476
表７に示す動物実験の結果を図５にグラフで示す。ＤＸ−２２２０はベヒクル（ＰＢＳ）投与コントロール動物と比較した場合に腫瘍の進行を４４％緩徐化させた。更に又ＤＸ−２２２０は化学療法剤コントロール（シスプラチン）と同様に有効であった。
Figure 2008532476
 The results of animal experiments shown in Table 7 are shown graphically in FIG. DX-2220 slowed tumor progression 44% when compared to vehicle (PBS) -treated control animals. Furthermore, DX-2220 was as effective as the chemotherapeutic control (cisplatin).

（実施例３２：ＢＩＡＣｏｒｅにおけるヒトおよびマウスＴｉｅ１への結合のための生殖細胞系抗Ｔｉｅ１Ｅ３ＦａｂおよびＩｇＧの製造および試験）
発現および精製。Ｆａｂ類はペリプラズム内への分泌のためのＰｅｌＢリーダー配列を含有する発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株ＴＧ１内で生産した。誘導のために使用した条件下において（１ｍＭＩＰＴＧ存在下３０℃一夜インキュベート）、分泌されたＦａｂの大部分はペリプラズムよりも培地中に局在した。分泌されたＦａｂは清澄化された培地にプロテインＡ樹脂を添加することにより回収した。次にこのプロテインＡ樹脂をカラムに充填することによりＰＢＳ洗浄および５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ２．５による溶離を容易にした。１ＭＨＥＰＥＳの半容量を添加することによりｐＨをほぼ中性とした後に緩衝液をＰＢＳに交換した。精製された生殖細胞系Ｅ３（ＤＸ−２２２０）Ｆａｂの濃度はＯＤ２８０１．４＝１．０ｍｇ／ｍｌを用いて求めた。 Example 32: Production and testing of germline anti-Tie1E3 Fab and IgG for binding to human and mouse Tie1 in BIACore
Expression and purification. Fabs are expressed in E. coli using an expression vector containing a PelB leader sequence for secretion into the periplasm. produced in E. coli strain TG1. Under the conditions used for induction (incubation at 30 ° C. overnight in the presence of 1 mM IPTG), most of the secreted Fab was localized in the medium rather than in the periplasm. Secreted Fab was recovered by adding protein A resin to the clarified medium. The column was then filled with this protein A resin to facilitate elution with PBS wash and 50 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl pH 2.5. The buffer was exchanged for PBS after the pH was nearly neutral by adding half volume of 1MHEPES. The concentration of purified germline E3 (DX-2220) Fab was determined using OD 280 1.4 = 1.0 mg / ml.

トランスフェクション剤としてＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００またはＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（登録商標）の何れかを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で一時的にＩｇＧを生産した。抗体はトランスフェクション後７２、１４４および２１６時間に採取した細胞から生産された。コンディショニングされた培地から得られたＩｇＧの精製は本質的にはＦａｂの精製に関して上記したプロトコルと同様に行った。精製されたＩｇＧの濃度はＯＤ２８０１．４＝１．０ｍｇ／ｍｌを用いて求めた。 IgG was transiently produced in HEK293T cells using either LIPOFECTAMINE® 2000 or GENEJUICE® as a transfection agent. Antibodies were produced from cells harvested 72, 144 and 216 hours after transfection. Purification of IgG obtained from conditioned medium was performed essentially as described above for the purification of Fab. The concentration of purified IgG was determined using OD 280 1.4 = 1.0 mg / ml.

前臨床の動物実験については、ＩｇＧは２段階の精製操作、即ちまずプロテインＡクロマトグラフィー、次いでイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）を用いて精製した。精製されたＩｇＧは内毒素濃度、浸出プロテインＡ、ＤＮＡ含有量および宿主細胞タンパク質を試験するために生化学的分析に付した。   For preclinical animal experiments, IgG was purified using a two-step purification procedure, first protein A chromatography followed by ion exchange chromatography (IEX). The purified IgG was subjected to biochemical analysis to test for endotoxin concentration, leached protein A, DNA content and host cell protein.

生化学的分析
ＦａｂおよびＩｇＧのアフィニティー分析はＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器を用いて表面プラズモン共鳴により実施した。この分析のためには、Ｔｉｅ１の細胞外ドメインの２量体（Ｔｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質）および単量体（Ｔｉｅ１−ＨＩＳ）の型の両方を使用した。これらの実験に使用したセンサーチップはＣＭ５（デキストランコーティング）であり、これは標準的なアミンカップリング化学を介したチップへのタンパク質の固定を可能にする。流動抗体の濃度は表面プラズモン共鳴に基づいた方法を用いて測定した。高密度プロテインＡセンサーチップを用いた場合、質量輸送制限条件下において、応答シグナルは被験サンプル中の抗体の濃度にのみ依存する。この方法はＫＤの正確な測定のために重要なパラメーターである抗体濃度の厳密な測定を可能にする。 Biochemical analysis Fab and IgG affinity analysis was performed by surface plasmon resonance using a BIAcore 3000 instrument. For this analysis, both the dimer of the extracellular domain of Tie1 (Tie1-Fc fusion protein) and the monomer (Tie1-HIS) type were used. The sensor chip used in these experiments is CM5 (Dextran coating), which allows protein immobilization to the chip via standard amine coupling chemistry. The concentration of the flowing antibody was measured using a method based on surface plasmon resonance. When using a high density protein A sensor chip, under mass transport restricted conditions, the response signal depends only on the concentration of antibody in the test sample. This method allows for precise measurement of antibody concentration is an important parameter for the accurate measurement of K D.

Ｔｉｅ１ＨＩＳタンパク質４７０ＲＵをＣＭ５センサーチップ上にコーティングし、５、２０、１００および５００ｎＭのＦａｂを、系が質量輸送制限されない速度である４段階の異なる流量（１０、３０，５０および８０μｌ／ｓ）においてチップ上に流動させた。速度論的データは、典型的には、被分析物の濃度の範囲と３つの異なるチップ被覆密度を用いて測定された。良好なシグナルを与えた最低コーティング密度から得られたデータを典型的に選択したところ、これは５０〜１００ＲＵの範囲内にある場合が多かった。このような低いコーティング密度を用いることにより、２価の分析被験体（ＩｇＧまたはＴｉｅ１Ｆｃ融合タンパク質）を用いる場合でさえも頻繁に、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（登録商標）３．０ソフトウエアを用いてセンサー曲線を１．１モデルにフィットさせることが可能となる。２価の分析被験体について１：１にフィットさせるモデルは不可能である場合には、曲線は２：１モデルを用いてフィットさせた。発生したデータは表８に示す通りである。   Tie1 HIS protein 470RU is coated on a CM5 sensor chip and 5, 20, 100 and 500 nM Fab are chipped at 4 different flow rates (10, 30, 50 and 80 μl / s) at a rate that the system is not mass transport limited. Fluidized above. Kinetic data was typically measured using a range of analyte concentrations and three different chip coating densities. The data obtained from the lowest coating density that gave a good signal was typically selected and was often in the range of 50-100 RU. By using such a low coating density, even when using bivalent analytical subjects (IgG or Tie1Fc fusion protein), the sensor curve is often generated using BIAEVALUTION® 3.0 software. It is possible to fit one model. If a model that fits 1: 1 for bivalent analytical subjects is not possible, the curve was fitted using a 2: 1 model. The generated data is as shown in Table 8.

Figure 2008532476
本明細書に記載した抗Ｔｉｅ１抗体はヒトおよびマウスのＴｉｅ１分子の両方に結合する。抗Ｔｉｅ１ＦａｂのマウスＴｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質への結合を抗Ｔｉｅ１ＦａｂのヒトＴｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質への結合と比較した。これらの実験の両方においてＴｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質はセンサーチップ上に固定し、そして抗Ｔｉｅ１Ｆａｂを分析被験体として使用した。これらの実験条件下において抗Ｔｉｅ１ＦａｂはヒトおよびマウスのＴｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質の両方について極めて近似したＫＤ（〜３ｎＭ）値を有している（表９）。動物薬効実験で使用したもの、即ちＣＭ５センサーチップに固定化したＴｉｅ１−Ｆｃおよび分析被験体として用いた抗Ｔｉｅ１を模倣した条件下において、測定されたＫＤ値は０．２ｎＭであった。この１０倍超の親和性の増大は、多価表面（固定化Ｔｉｅ１−Ｆｃ）への２価分子（抗Ｔｉｅ１）の結合から生じるアビディティの作用を示している。
Figure 2008532476
 The anti-Tie1 antibodies described herein bind to both human and mouse Tie1 molecules. Binding of anti-Tie1 Fab to mouse Tie1-Fc fusion protein was compared to binding of anti-Tie1 Fab to human Tie1-Fc fusion protein. In both of these experiments, the Tie1-Fc fusion protein was immobilized on a sensor chip and anti-Tie1 Fab was used as the analytical subject. Anti Tie1Fab In these experimental conditions has a K D (~3nM) value very similar for both Tie1-Fc fusion protein of human and mouse (Table 9). Those used in animal efficacy experiment, i.e. under conditions that mimic the anti-Tie1 used as Tie1-Fc and analysis subjects immobilized on CM5 sensor chip, measured K D values were 0.2 nM. This greater than 10-fold increase in affinity indicates an avidity effect resulting from the binding of a divalent molecule (anti-Tie1) to a multivalent surface (immobilized Tie1-Fc).

（実施例３３：ＤＸ−２２４０の配列：生殖細胞系列化ＦアロトタイプＥ３抗体の配列）   (Example 33: Sequence of DX-2240: Sequence of germlined F allotype E3 antibody)

Figure 2008532476
軽鎖は場合により更に以下のシグナル配列：軽鎖シグナル配列：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号７２９）を包含することができる。重鎖は場合により更に以下のシグナル配列：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳ（配列番号７３０）を包含することができる。
Figure 2008532476
 The light chain can optionally further comprise the following signal sequence: light chain signal sequence: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 729). The heavy chain can optionally further include the following signal sequence: MGWSCIILFLVATATGAHS (SEQ ID NO: 730).

（実施例３４：ＧＳ−ＣＨＯ細胞系統由来のＤＸ−２２４０の特性化）
抗Ｔｉｅ１抗体ＤＸ−２２４０（軽鎖および重鎖の生殖細胞系およびｆ−アロタイプ）抗体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で生産した。ＤＸ−２２４０を発現する安定なＣＨＯ細胞系統を作成した。標準的な分子生物学のクローニング技術を用いて、ＤＸ−２２４０由来の軽鎖および重鎖をＬｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．ＣＨから入手可能なグルタミンシンターゼ（ＧＳ）ベクター系に挿入した（例えばＣｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２（４）：４８−５２；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．８１（６）：５３１−６３９参照）。次に軽鎖および重鎖をそれぞれ含有する一重ベクターコンストラクトを組み合わせて単一の二重遺伝子ベクターを作成した。次にこのＤＮＡコンストラクトを用いてＭＳＸ選択圧力下に生育する安定なＣＨＯ細胞系統を作成した。次にこれ等のクローンの１つを増殖させ、単一の４０Ｌの攪拌バイオリアクターに播種し、１２日間の過程に亘って運転した。この運転の終了後、清澄化ＣＨＯ培養上澄み３６リットルを２００ｍｌプロテインＡＸＫ５０カラムにロードした。カラムをまずＰＢＳｐＨ７．４で洗浄し、次いで、ＰＢＳ＋０．４ＭＮａＣｌｐＨ７．４で洗浄、次いで、ＰＢＳｐＨ７．４で最終洗浄した後に低ｐＨ溶出を行った。ＤＸ−２２４０ＩｇＧ１をまず０．１Ｍクエン酸ＮａｐＨ３．５で、次に同じ緩衝液のｐＨ３．０を用いて溶出した。ｐＨ３．０においてシャープなタンパク質ピークが溶出した。ｐＨ３．０溶出物はＤＸ−２２４０を示す優勢なピークとその直ぐ後に溶出する低濃度の夾雑物を含有していた。高水準の純度（＞９５％）のＤＸ−２２４０が得られた。 Example 34: Characterization of DX-2240 from GS-CHO cell line
Anti-Tie1 antibody DX-2240 (light and heavy chain germline and f-allotype) antibody was produced in HEK293T cells. A stable CHO cell line expressing DX-2240 was created. Using standard molecular biology cloning techniques, the light and heavy chains from DX-2240 were ligated to Lonza Group Ltd. Inserted into a glutamine synthase (GS) vector system available from CH (eg Clark et al. (2004) BioProcess International 2 (4): 48-52; Barnes et al. (2002) Biotech Bioeng. 81 (6): 531-639). A single vector construct was then made by combining single vector constructs containing light and heavy chains respectively. This DNA construct was then used to create a stable CHO cell line that grows under MSX selection pressure. One of these clones was then grown and inoculated into a single 40 L stirred bioreactor and operated over a 12 day process. At the end of this run, 36 liters of clarified CHO culture supernatant was loaded onto a 200 ml protein AXK50 column. The column was first washed with PBS pH 7.4, then with PBS + 0.4M NaCl pH 7.4, and then finally washed with PBS pH 7.4 before low pH elution. DX-2240IgG1 was eluted first with 0.1 M Na citrate pH 3.5 and then with the same buffer pH 3.0. A sharp protein peak eluted at pH 3.0. The pH 3.0 eluate contained a dominant peak indicating DX-2240 and a low concentration of contaminants eluting shortly thereafter. DX-2240 with a high level of purity (> 95%) was obtained.

（実施例３５：ＤＸ−２２４０抗体をコードする核酸の配列最適化）
ＣＨＯ細胞内でのＤＸ−２２４０の発現を向上させるために、旨適化されたコドンおよび配列を有する合成遺伝子を組み立てた。操作に含まれるものはコドンの旨適化、ＣｐＧアイランドおよびスプライス部位の分析である。旨適化ＤＸ−２２４０配列を合成し、そしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）ベクター系内に再フォーマットした。例示されるコドン旨適化配列は以下の通りである。 (Example 35: Sequence optimization of nucleic acid encoding DX-2240 antibody)
In order to improve the expression of DX-2240 in CHO cells, a synthetic gene with codon and sequence optimized was assembled. Included in the manipulation are codon optimization, CpG island and splice site analysis. The umami optimized DX-2240 sequence was synthesized and reformatted into a glutamine synthase (GS) vector system. Exemplary codon effect optimization sequences are as follows:

Figure 2008532476
Figure 2008532476

Figure 2008532476
。
Figure 2008532476
 .

（実施例３６：マウスにおける薬物動態および生体分布試験）
ＤＸ−２２４０（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で生産）のインビボ薬物動態および安定性は、使用可能なチロシン残基上でタンパク質をヨウ素化すること、および、単回静脈内投与後のマウスにおける血漿クリアランスおよび安定性を測定することにより調べた。サンプルはＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）試薬を用いた間接的方法により放射性ヨウ素化した（Ｐｉｅｒｃｅの方法、Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１５４８；（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３１１７の記載参照）。サンプルを１２５Ｉ−ＮａＩ溶液と共に９分間インキュベートし、その時点においてチロシン（１０ｍｇ／ｍｌ、飽和溶液）を添加することにより反応をクエンチングした。約１５分後、５μｌ分を計数のための標準として採取した。各標識反応につき、１２５Ｉ標識物質（約０．６ｍｌ）を単一の５ｍｌＤ塩１８００ポリアクリルアミドカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製した。カラムを２．５％ＨＳＡ含有２５ｍＭＴｒｉｓ、０．４ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄することにより非特異的部位を、そして次にＨＳＡを含有しない同じ緩衝液で広範にブロッキングした。サンプルを適用し、カラムを０．３ｍｌずつのシリーズで溶出した。全タンパク質画分中の適用放射能の回収は＞７５％であり、適用放射能の総回収量は＞９０％であった。標識タンパク質のピーク濃度を含有する画分を動物注射用にプールした。注射液を調製するために、プール物をトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、１００μｌの注射容量が約１０μｇの標識物質を含有するようにした。 (Example 36: Pharmacokinetics and biodistribution test in mice)
The in vivo pharmacokinetics and stability of DX-2240 (produced in HEK293T cells) iodinate proteins on available tyrosine residues and plasma clearance and stability in mice after a single intravenous administration It was investigated by measuring. Samples were radioiodinated by an indirect method using IODO-GEN® reagent (Pierce's method, Chizzonite et al., (1991) J. Immunol. 147: 1548; (1992) J. Immunol. 148). : Refer to description of 3117). Samples were incubated with 125 I-NaI solution for 9 minutes, at which time the reaction was quenched by adding tyrosine (10 mg / ml, saturated solution). Approximately 15 minutes later, 5 μl was taken as a standard for counting. For each labeling reaction, 125 I-labeled material (approximately 0.6 ml) was purified using a single 5 ml D-salt 1800 polyacrylamide column (Pierce). Non-specific sites were extensively blocked by washing the column with 25 mM Tris, 0.4 M NaCl, pH 7.5 containing 2.5% HSA, and then with the same buffer without HSA. Samples were applied and the column was eluted in series of 0.3 ml. The recovery of applied radioactivity in the total protein fraction was> 75% and the total recovery of applied radioactivity was> 90%. Fractions containing the peak concentration of labeled protein were pooled for animal injection. To prepare the injection solution, the pool was diluted with Tris buffer (pH 7.5) so that an injection volume of 100 μl contained approximately 10 μg of labeling substance.

放射標識化合物を含有する溶液を尾静脈注射により全マウスに投与した。投与後の所定時間において、動物を屠殺し、血液サンプルを採取して分析に付した。放射標識化合物の注射後の試験の時点は注射後約０、７、１５、３０、９０分、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間および７２時間とした。各時点において４匹を屠殺した。屠殺時に０．５ｍｌ分の血液を抗凝固剤（０．０２ｍｌＥＤＴＡ）管中に採取した。遠心分離によりにより血球から血漿を分離し、血漿画分を２区分に分割し、１つを凍結し、１つは即時分析用に４℃保存した。   A solution containing the radiolabeled compound was administered to all mice by tail vein injection. At predetermined times after dosing, animals were sacrificed and blood samples were collected for analysis. The time points for testing after injection of the radiolabeled compound were approximately 0, 7, 15, 30, 90 minutes, 4 hours, 8 hours, 16 hours, 24 hours, 48 hours and 72 hours after injection. Four animals were sacrificed at each time point. At the time of sacrifice, 0.5 ml of blood was collected in an anticoagulant (0.02 ml EDTA) tube. Plasma was separated from blood cells by centrifugation, the plasma fraction was divided into two sections, one frozen and one stored at 4 ° C. for immediate analysis.

分析では全サンプルのガンマカウンター計数を行った。この単回用量ｉｖ試験において、ＤＸ−２２４０は５時間未満の比較的短いマウス半減期を示した。これ等のマウスにおけるＤＸ−２２４０の生体分布の分析によれば、肺（１２．８５％ＩＤ／ｇ）、脾臓（７．４４％ＩＤ／ｇ）、腎臓（８．３４％ＩＤ／ｇ）、肝臓（５．４２％ＩＤ／ｇ）および心臓（４．０４％ＩＤ／ｇ）において３０分後にこの抗体の一部の蓄積が判明した。ＤＸ−２２４０は内皮細胞の表面上のＴｉｅ１とのその相互作用により、肺のような高度な脈管形成領域に蓄積すると考えられる。従って、ＤＸ−２２４０の複数の投与がマウス血清中のこの抗体の有効定常状態濃度を達成するためには必要となる場合がある。ＤＸ−２２２０を投与した腫瘍担持マウスから採集した３日毎の投薬後の眼血液並びに末梢血液のサンプルについてＥＬＩＳＡを実施した。各場合において、血清中ＤＸ−２２２０濃度は平均５００μｇ／ｍｌであり、マウス中の短い血清中半減期にもかかわらず、この抗体の有効定常状態濃度がＤＸ−２２２０の僅か３回の投与の後に達成できる。   In the analysis, gamma counter counting of all samples was performed. In this single dose iv study, DX-2240 showed a relatively short mouse half-life of less than 5 hours. According to the analysis of the biodistribution of DX-2240 in these mice, lung (12.85% ID / g), spleen (7.44% ID / g), kidney (8.34% ID / g), Some accumulation of this antibody was found after 30 minutes in the liver (5.42% ID / g) and heart (4.04% ID / g). DX-2240 is thought to accumulate in advanced angiogenic regions such as the lung due to its interaction with Tie1 on the surface of endothelial cells. Thus, multiple administrations of DX-2240 may be required to achieve an effective steady state concentration of this antibody in mouse serum. ELISA was performed on samples of ocular blood and peripheral blood after dosing every 3 days collected from tumor-bearing mice that received DX-2220. In each case, the serum DX-2220 concentration averages 500 μg / ml, and despite the short serum half-life in mice, the effective steady state concentration of this antibody is only after 3 doses of DX-2220. Can be achieved.

更に又、ＤＸ−２２４０のインビボの安定性を試験するための血漿サンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を実施した。マウスにおけるＤＸ−２２４０の不安定性は血清からのこの化合物の急速なクリアランスに寄与している可能性がある。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は０分、３０分、９０分、２４時間および７２時間において２血漿サンプルに対して実施した。放射標識ＤＸ−２２４０の分析はこの化合物が分解および血漿中の成分との相互作用の両方に対してインビボで安定であることを示していた。従って、マウスにおけるＤＸ−２２４０の比較的急速な半減期はこの化合物の分解によるものではない。   In addition, SEC-HPLC analysis of plasma samples was performed to test the in vivo stability of DX-2240. DX-2240 instability in mice may contribute to the rapid clearance of this compound from serum. SEC-HPLC analysis was performed on 2 plasma samples at 0 minutes, 30 minutes, 90 minutes, 24 hours and 72 hours. Analysis of radiolabeled DX-2240 showed that this compound was stable in vivo against both degradation and interaction with components in plasma. Thus, the relatively rapid half-life of DX-2240 in mice is not due to degradation of this compound.

（実施例３７：ＤＸ−２２２０はヌードマウスにおける肺癌異種移植腫瘍の進行を緩徐化する）
ヒトＬＮＭ３５肺癌異種移植片を担持するマウスにおける腫瘍生育に対するＤＸ−２２２０の作用を試験した。これ等の試験では、ＬＭＮ３５細胞は無胸腺ヌードマウスの胸部側面に皮下注射した。腫瘍細胞移植４日後、１週間３回２０ｍｇ／ｋｇの用量でＤＸ−２２２０またはＡ２−ＳＶ（ネガティブコントロール抗体）の投与を開始した。腫瘍サイズは抗体投与後６、８および１０日目に測定した。 (Example 37: DX-2220 slows the progression of lung cancer xenograft tumors in nude mice)
The effect of DX-2220 on tumor growth in mice bearing human LNM35 lung cancer xenografts was tested. In these studies, LMN35 cells were injected subcutaneously on the thoracic side of athymic nude mice. Four days after tumor cell transplantation, administration of DX-2220 or A2-SV (negative control antibody) was started at a dose of 20 mg / kg three times a week. Tumor size was measured on days 6, 8, and 10 after antibody administration.

図６に示す通り、ＤＸ−２２２０はこのマウス異種移植片モデルにおいて腫瘍の進行を有意（ｐ＝０．０３７）に緩徐化（〜６０％）した。更に又、ＤＸ−２２２０を投与したマウスは体重の有意な減少を示さなかった。これ等のデータを合わせれば、ＤＸ−２２２０はインビボにおいて有意な腫瘍生育阻害活性を有している。   As shown in FIG. 6, DX-2220 significantly slowed (˜60%) tumor progression in this mouse xenograft model (p = 0.037). Furthermore, mice administered DX-2220 did not show a significant decrease in body weight. When these data are combined, DX-2220 has significant tumor growth inhibitory activity in vivo.

（実施例３８：ＤＸ−２２２０はヌードマウスにおける腫瘍の進行を緩徐化する）
上記したインビボの試験のほかに、４種の別のマウス異種移植試験を実施した。これ等の試験はＳＷ−４８０またはＬＮＭ３５試験において使用した何れかのプロトコルに従って実施した。これ等の試験の結果を以下に示す。 (Example 38: DX-2220 slows tumor progression in nude mice)
In addition to the in vivo studies described above, four other mouse xenograft studies were performed. These tests were performed according to either protocol used in the SW-480 or LNM35 test. The results of these tests are shown below.

ＬＬＣ（マウス肺癌腫） 投与開始後１４日目に２０％阻害
ＰＣ−３（ヒト前立腺癌） 投与開始後２８日目に２４％阻害
ＬＮＭ３５＃３（ヒト肺癌腫） 投与開始後２１日目に３０％阻害
Ｃｏｌｏ２０５（ヒト結腸直腸癌） 作用無し
これ等の結果はＥ３抗Ｔｉｅ１抗体が種々の腫瘍型に対して作用を有することを示唆し、このことは広範な治療用途を示している。 LLC (mouse lung carcinoma) 20% inhibition on day 14 after initiation of administration PC-3 (human prostate cancer) 24% inhibition on day 28 after initiation of administration LNM35 # 3 (human lung carcinoma) 30 on day 21 after initiation of administration % Inhibition Colo205 (human colorectal cancer) No effect These results suggest that the E3 anti-Tie1 antibody has an effect on various tumor types, indicating a wide range of therapeutic applications.

（実施例３９：正常組織の免疫組織化学分析）
Ｅ３抗Ｔｉｅ１抗体の免疫反応性の潜在的領域を評価するための一連の非悪性の正常ヒト組織に対する一連の免疫組織化学分析を実施した。最小限のバックグラウンドおよびシグナル最大検出をもたらすような、好ましい組織保存条件並びに旨適抗体濃度を調べるために、ビオチニル化ＤＸ−２２２０およびＩｇＧアイソタイプコントロール抗体を用いて選択された正常ヒト組織の低温およびパラホルムアルデヒド固定切片の両方に対して抗体滴定実験を実施した。一次抗体として使用するビオチニル化ＤＸ−２２２０およびビオチニル化ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体、および、発色原としてのＤＡＢと共にストレプトアビジンＨＲＰよりなる基本的検出系を用いた試験のための一次抗体については、２０μｇ／ｍｌの濃度を選択した。組織は又、ポジティブコントロール抗体（抗ＣＤ３１抗ビメンチン）で染色することにより、組織抗原を温存し、そして免疫組織化学分析に供することができるようにする。ＣＤ３１およびビメンチン染色がポジティブである組織のみを残りの試験のために選択した。ネガティブコントロールは一次抗体に非存在下の隣接切片に対する全免疫組織化学的操作法を実施することよりなるものとした。スライドはＮｉｋｏｎ顕微鏡に連結したＤＶＣ１３１０Ｃデジタルカメラを用いて画像化した。 (Example 39: Immunohistochemical analysis of normal tissue)
A series of immunohistochemical analyzes were performed on a series of non-malignant normal human tissues to assess the potential area of immunoreactivity of the E3 anti-Tiel antibody. In order to determine the preferred tissue storage conditions and optimal antibody concentrations that would result in minimal background and signal maximal detection, the low temperature and normal human tissue selected using biotinylated DX-2220 and IgG isotype control antibodies and Antibody titration experiments were performed on both paraformaldehyde fixed sections. 20 μg / ml for biotinylated DX-2220 and biotinylated IgG isotype control antibodies used as primary antibodies and primary antibodies for testing with a basic detection system consisting of streptavidin HRP with DAB as chromogen The concentration of was selected. The tissue is also stained with a positive control antibody (anti-CD31 anti-vimentin) so that tissue antigens can be preserved and subjected to immunohistochemical analysis. Only tissues that were positive for CD31 and vimentin staining were selected for the remaining studies. Negative control consisted of performing a whole immunohistochemical procedure on adjacent sections in the absence of primary antibody. The slides were imaged using a DVC1310C digital camera connected to a Nikon microscope.

ネガティブコントロール（または一次抗体）のスライドは腎尿細管上皮内および場合により顆粒球に散発する弱いバックグラウンド染色をしばしば示したが、全ての他の細胞型は、ポジティブコントロール細胞系統（ＨＭＥＣ、ヒト微小血管内皮細胞）およびポジティブコントロール結腸癌を含めて、均一にネガティブであった。ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体は顆粒球、マクロファージ、副腎皮質、腎尿細管上皮、ファロピアン管上皮、肝細胞、ライディヒ細胞および甲状腺の弱いバックグラウンド染色を示した。ポジティブコントロールの細胞系統（ＨＭＥＣ）およびポジティブコントロールの結腸癌は無染色またはバックグラウンド染色を示した。   Negative control (or primary antibody) slides often showed weak background staining sporadic within the renal tubular epithelium and possibly granulocytes, but all other cell types were positive control cell lines (HMEC, human micro Vascular endothelial cells) and positive control colon cancer were uniformly negative. The IgG isotype control antibody showed weak background staining of granulocytes, macrophages, adrenal cortex, renal tubular epithelium, faropian duct epithelium, hepatocytes, Leydig cells and thyroid. The positive control cell line (HMEC) and the positive control colon cancer showed no staining or background staining.

ＤＸ−２２２０はＨＭＥＣ細胞系統内の中等度の膜染色、および、マクロファージ、一部の癌細胞および結腸癌ポジティブコントロールサンプル内の内皮細胞の染色を示した。正常組織内においては、抗体はマクロファージ、脳の小グリア細胞、頚部の扁平上皮の弱い乃至は中等度の染色、骨格筋、ランゲルハンス島および胎盤内皮の弱い染色を示した。これらの観察結果は、以前の報告から推測されるとおり、一部の内皮、造血および上皮の組織におけるＴｉｅ１の低水準発現と合致している。ランゲルハンス島の染色は予想外であり、今後検討しなければならない。他の弱い染色の大部分はＩｇＧアイソタイプコントロールで観察されたものと同様であった。ＩｇＧアイソタイプコントロールのバックグラウンドをＤＸ−２２２０の分析結果から差し引けば、副腎、膀胱、血液、骨髄、ニューロン、***、結腸、内皮、眼、ファロピアン管、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ球、卵巣、膵臓外分泌腺、下垂体、前立腺、皮膚、脊髄、脾臓、精巣の精上皮、胸腺リンパ球、尿管および子宮を含めて、組織の大部分はネガティブであった。   DX-2220 showed moderate membrane staining within the HMEC cell line and staining of endothelial cells within macrophages, some cancer cells and colon cancer positive control samples. In normal tissues, the antibody showed weak or moderate staining of macrophages, brain microglia, cervical squamous epithelium, and weak staining of skeletal muscle, islets of Langerhans, and placental endothelium. These observations are consistent with the low level expression of Tie1 in some endothelial, hematopoietic and epithelial tissues, as inferred from previous reports. The staining of the islets of Langerhans is unexpected and should be considered in the future. Most of the other weak staining was similar to that observed with the IgG isotype control. If the background of the IgG isotype control is subtracted from the analysis results of DX-2220, the adrenal gland, bladder, blood, bone marrow, neurons, breast, colon, endothelium, eye, faropian tube, heart, kidney, liver, lung, lymphocyte, Most of the tissues were negative, including the ovary, pancreatic exocrine gland, pituitary, prostate, skin, spinal cord, spleen, testicular seminiferous, thymic lymphocytes, ureter and uterus.

（実施例４０：血小板試験）
Ｔｉｅ１は血小板上に発現されるという報告があった（Ｔｓｉａｍｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３７（６）：４３７）。Ｅ３抗Ｔｉｅ１抗体との血小板免疫反応性の可能性はＦＡＣＳ分析および免疫沈降試験により調べた。ＤＸ−２２２０は血小板への有意な結合を示さず、そして血小板抽出物からＴｉｅ１を免疫沈降させなかった。更に又血小板の集塊化および凝集に対するＤＸ−２２００およびＤＸ−２２１０の作用も調べた。リストセチン、即ち血小板膜糖タンパク質ＧＰＩｂ（ＣＤ４２）へのフォン・ビルブランド因子（ｖＷＦ）の結合を媒介することにより血小板の集塊化を誘導するコファクターを血小板集塊化のポジティブコントロールとして使用した。トロンビン（比較コントロール）のような生理学的アゴニストに匹敵する動態および程度をもって血小板を活性化し、血小板凝集を誘導するためにポジティブコントロールとしてＣＤ９に対する抗体を使用した。ＤＸ−２２００およびその軽鎖生殖細胞系変異体ＤＸ−２２１０の何れも血小板の集塊化または凝集を誘導しなかった。 (Example 40: Platelet test)
There has been a report that Tie1 is expressed on platelets (Tsiamis et al. (2000) J. Vasc. Res. 37 (6): 437). The possibility of platelet immunoreactivity with E3 anti-Tie1 antibody was examined by FACS analysis and immunoprecipitation test. DX-2220 did not show significant binding to platelets and did not immunoprecipitate Tiel from platelet extracts. Furthermore, the effects of DX-2200 and DX-2210 on platelet agglomeration and aggregation were also examined. Ristocetin, a cofactor that induces platelet aggregation by mediating the binding of von Willebrand factor (vWF) to the platelet membrane glycoprotein GPIb (CD42), was used as a positive control for platelet aggregation. Antibodies against CD9 were used as a positive control to activate platelets with kinetics and extent comparable to physiological agonists such as thrombin (comparative control) and induce platelet aggregation. Neither DX-2200 nor its light chain germline variant DX-2210 induced platelet agglomeration or aggregation.

（実施例４１：臍帯血幹細胞試験）
血液先祖細胞（幹細胞）への結合特性を評価するために、Ｇ−ＣＳＦ可動化末梢血液細胞上の抗Ｔｉｅ１抗体（または適切なネガティブコントロール抗体）および骨髄細胞を用いたＦＡＣＳ分析を実施した。慨すれば細胞を１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清／２％マウス血清でブロックした。結合はビオチニル化ＥＤＸ−２２２０またはビオチニル化Ａ２ネガティブコントロール抗体を用いて開始した。細胞を洗浄後、一次抗体をＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを用いて検出した。更に３０分のインキュベーション時間の後、残存する赤血球を溶解し、そして遠心分離後に得られた細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁した後にＦＡＣＳ分析に付した。データの取得はＦａｃｓＤｉｖａ（登録商標）ソフトウエアを用いてＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で実施した。ＳＳＣ／ＣＤ４５上の活動ゲーティングを使用した。先祖細胞をＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋細胞上でゲーティングし、そして少なくとも１００，０００ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋計数値で自動的に獲得した。 (Example 41: Cord blood stem cell test)
To evaluate the binding properties to blood progenitor cells (stem cells), FACS analysis using anti-Tiel antibody (or appropriate negative control antibody) and bone marrow cells on G-CSF mobilized peripheral blood cells was performed. In other words, cells were blocked with 10% heat-inactivated human AB serum / 2% mouse serum. Binding was initiated using biotinylated EDX-2220 or biotinylated A2 negative control antibody. After washing the cells, the primary antibody was detected using FITC-labeled streptavidin. After an additional 30 minute incubation period, the remaining red blood cells were lysed and the cell pellet obtained after centrifugation was resuspended in PBS and subjected to FACS analysis. Data acquisition was performed on a FACSCanto® (Becton-Dickinson) using FacsDiva® software. Activity gating on SSC / CD45 was used. Progenitor cells were gated on CD45 + , CD34 + cells and automatically acquired with at least 100,000 CD45 + CD34 + counts.

Ｔｉｅ１の発現は特定の造血系悪性疾患において報告されているが、本実験はネガティブコントロールのＩｇＧＡ０２およびＥ３抗Ｔｉｅ１抗体ＤＸ−２２２０は何れも、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋血液先祖細胞の染色はポジティブではなかったことを示している。この所見は特定の化学療法剤とは異なり、Ｅ３でＴｉｅ１をターゲティングすることは幹細胞に対して悪影響を与えないという仮説を裏付けている。 Although expression of Tie1 has been reported in certain hematopoietic malignancies, the negative controls IgGA02 and E3 anti-Tie1 antibody DX-2220 were neither positive for staining of CD45 + CD34 + blood progenitor cells It is shown that. This finding, unlike certain chemotherapeutic agents, supports the hypothesis that targeting Tie1 with E3 does not adversely affect stem cells.

（実施例４２：インビトロ造血試験）
ヒト骨髄様および赤血球様の先祖細胞に対する抗Ｔｉｅ１抗体（ＤＸ−２２２０およびＤＸ−２２４０）の作用をメチルセルロース系インビトロコロニー試験を用いて評価し、そして巨核球先祖細胞はコラーゲン系インビトロ試験に付した。ＤＸ−２２２０およびＤＸ−２２４０の何れも１００μｇ／ｍｌまでの濃度ではこのインビトロ試験の特定の条件においてはコロニー形成を阻害しなかった。 (Example 42: In vitro hematopoietic test)
The effects of anti-Tie1 antibodies (DX-2220 and DX-2240) on human myeloid and erythroid progenitor cells were evaluated using the methylcellulose-based in vitro colony test, and megakaryocyte progenitor cells were subjected to a collagen-based in vitro test. Neither DX-2220 nor DX-2240 inhibited colony formation under the specific conditions of this in vitro test at concentrations up to 100 μg / ml.

インビボの骨髄剥離モデルを用いたマウス造血系の回復に対するＥ３抗Ｔｉｅ１抗体ＤＸ−２２４０の作用を評価した。マウスに第０日に５−ＦＵを注射し、次にＤＸ−２２４０またはネガティブコントロール抗体の何れかを投与した。注射後の種々の時点（第２、４、６、８、１０、１２および１４日）において、コントロール群および投与群からマウス４匹を屠殺し、末梢血および大腿骨を採取した。末梢血および大腿骨細胞を分析して以下を測定した。
・大腿骨当たりの総核化細胞
・骨髄様および赤血球様の先祖細胞の両方に関する骨髄コロニー形成細胞の頻度
・大腿骨当たりの総造血系ＣＦＣ
・大腿骨当たりの総巨核球系ＣＦＣ
・成熟細胞の総白血球数および分画分析
ＤＸ−２２４０は５−ＦＵ投与後のマウス造血系の回復に対する作用を有していなかった。このことはこれ等の試験条件下においてＤＸ−２２４０が血液学的毒性を有さないというインビトロの所見を裏付けている。即ち、それは赤血球とリンパ球の生産を維持するために必要な正常な造血機能を妨害しないことから、治療薬として特に有用である。 The effect of E3 anti-Tie1 antibody DX-2240 on recovery of the mouse hematopoietic system using an in vivo bone marrow ablation model was evaluated. Mice were injected with 5-FU on day 0 and then administered either DX-2240 or negative control antibody. At various time points after injection (Days 2, 4, 6, 8, 10, 12, and 14), 4 mice from the control and treatment groups were sacrificed and peripheral blood and femurs were collected. Peripheral blood and femur cells were analyzed to determine:
• Total nucleated cells per femur • Frequency of bone marrow colony forming cells for both myeloid and erythroid progenitor cells • Total hematopoietic CFC per femur
・ Total megakaryocyte CFC per femur
-Total leukocyte count and fractional analysis of mature cells DX-2240 had no effect on recovery of mouse hematopoietic system after 5-FU administration. This supports the in vitro observation that DX-2240 has no hematologic toxicity under these test conditions. That is, it is particularly useful as a therapeutic agent because it does not interfere with the normal hematopoietic function necessary to maintain red blood cell and lymphocyte production.

抗Ｔｉｅ１抗体は又、移植腫瘍に対するその作用について評価した。腫瘍細胞をマウスの腹部領域に皮下注射した（Ｂａｌｂ／Ｃｎｕ／ｎｕ雌性マウス、５〜６週齢）。以下の腫瘍細胞、即ち肺癌腫（マウス同系Ｌｅｗｉｓ肺癌腫（ＬＬＣ））；ヒト肺癌腫ＬＮＭ３５；攻撃的ヒト結腸癌腫クローン（ＳＷ４８０Ｒ）を試験した。抗Ｔｉｅ１抗体の投与は移植後４〜６日に開始した。抗Ｔｉｅ１抗体またはコントロール抗体（Ａ２抗ストレプトアビジン抗体）を２日毎に２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。腫瘍容量は２日毎に測定し、０．５×高さ×幅×深さで計算した。   Anti-Tie1 antibody was also evaluated for its effect on transplanted tumors. Tumor cells were injected subcutaneously into the abdominal region of mice (Balb / Cnu / nu female mice, 5-6 weeks old). The following tumor cells were tested: lung carcinoma (mouse syngeneic Lewis lung carcinoma (LLC)); human lung carcinoma LNM35; aggressive human colon carcinoma clone (SW480R). Administration of anti-Tie1 antibody was started 4-6 days after transplantation. Anti-Tie1 antibody or control antibody (A2 anti-streptavidin antibody) was administered intraperitoneally at 20 mg / kg every 2 days. Tumor volume was measured every 2 days and calculated as 0.5 × height × width × depth.

Ｅ３抗Ｔｉｅ１抗体（別名ＤＸ−２２４０）はＬＬＣ（約２０％の作用、ｐ＝０．０７８；ＡＮＯＶＡ、単一ファクター試験）およびＬＮＭ３５の原発腫瘍生育を阻害する。１つの試験において、この抗Ｔｉｅ１抗体は原発腫瘍生育を６０％阻害している（最大応答）。（２日毎ではなく一週間に僅か２回の投薬で抗体の用量を倍増しても原発腫瘍生育に対しては中等度の作用しかもたらされなかった。）このＳＷ４８０Ｒ腫瘍はこれ等の条件下では抗体投与に応答しなかった。実施例３４に記載した通り、抗体はＳＷ４８０細胞の腫瘍成育の阻害について（即ち誘導体ＳＷ４８０Ｒ細胞よりも）有効であった。   E3 anti-Tie1 antibody (also known as DX-2240) inhibits primary tumor growth of LLC (approximately 20% effect, p = 0.078; ANOVA, single factor test) and LNM35. In one study, this anti-Tie1 antibody inhibits primary tumor growth by 60% (maximum response). (Duplicating the antibody dose with only two doses per week rather than every two days had only a modest effect on primary tumor growth.) The SW480R tumors under these conditions It did not respond to antibody administration. As described in Example 34, the antibody was more effective in inhibiting tumor growth of SW480 cells (ie, more than derivative SW480R cells).

６０％阻害が観察された実験から得た腫瘍切片の組織学的分析によれば、抗Ｔｉｅ１抗体投与腫瘍中の血管は、血管密度は改変されていなかったものの、異なる形態特徴を有していた。抗Ｔｉｅ１抗体投与腫瘍においては、血管は腫瘍細胞の小葉間に隔壁様の構造を形成していた。これ等の腫瘍は又、コントロール抗体投与腫瘍よりも高い壊死性を示していた。平滑筋の分布（抗平滑筋アクチン抗体染色により検出）も又改変されていた。抗Ｔｉｅ１抗体投与腫瘍におけるリンパ管もまたより散在しており、ある程度拡張しており、そして数例においては隣接する管腔が集合して糸状になっていた。これ等の観察結果は、この抗Ｔｉｅ抗体が、腫瘍の壊死および腫瘍内の血管の組織化に対して特有の作用を有していることを示している。   Histological analysis of tumor sections obtained from experiments in which 60% inhibition was observed showed that blood vessels in anti-Tie1 antibody-treated tumors had different morphological characteristics, although the blood vessel density was not altered . In tumors administered with anti-Tie1 antibody, blood vessels formed a septum-like structure between the leaflets of tumor cells. These tumors also showed higher necrosis than the control antibody administered tumors. Smooth muscle distribution (detected by anti-smooth muscle actin antibody staining) was also altered. Lymphatic vessels in anti-Tie1 antibody-treated tumors were also more scattered, somewhat dilated, and in some cases, adjacent lumens gathered into a filament. These observations indicate that this anti-Tie antibody has a unique effect on tumor necrosis and organization of blood vessels within the tumor.

（実施例４３：併用療法の評価）
動物モデルを使用して併用療法を評価することができる。例えば複合物（腹腔内）がＨＴ２９、ＣＯＬＯ２０５またはＰＣ３の異種移植片を有する雌性ＮＣｒｎｕ／ｎｕマウスにおける腫瘍生育を調節する能力について試験することができる。一部の例示される試験法を以下に示す。 (Example 43: Evaluation of combination therapy)
Animal models can be used to evaluate combination therapy. For example, the ability of the composite (intraperitoneal) to modulate tumor growth in female NCrnu / nu mice bearing HT29, COLO205 or PC3 xenografts can be tested. Some exemplary test methods are shown below.

Figure 2008532476
別のレジメンは以下のとおりである：
Figure 2008532476
 Another regimen is as follows:

Figure 2008532476
Ａ２−ＳＶはコントロールの抗ストレプトアビジン抗体である。各群１２匹を使用できる。臨床兆候、群平均体重を毎日評価する。個体別体重および腫瘍負荷は一週間に２回評価する。試験の終了時に、組織サンプルを腫瘍、肝臓、肺、脾臓、心臓、軸性結節、腎臓および子宮から採取することができる。
Figure 2008532476
 A2-SV is a control anti-streptavidin antibody. Twelve animals can be used for each group. Clinical signs and group mean body weight are assessed daily. Individual body weight and tumor burden are assessed twice a week. At the end of the study, tissue samples can be taken from the tumor, liver, lung, spleen, heart, axial nodule, kidney and uterus.

他の実施形態は添付の特許請求の範囲に包含される。   Other embodiments are within the scope of the appended claims.

図１はＴｉｅ１を有する血小板特異的マーカーＣＤ４３による標識およびＥ３抗体による標識を示す２バリアントＦＡＣＳプロットを示す。僅かにバックグラウンド数のＣＤ４２ポジティブ細胞がＥ３抗体により標識されている。FIG. 1 shows a two variant FACS plot showing labeling with platelet-specific marker CD43 with Tie1 and labeling with E3 antibody. A slight background number of CD42 positive cells are labeled with the E3 antibody. 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは生殖細胞系Ｅ３（２Ｃおよび２Ｄ）を親Ｅ３（２Ａおよび２Ｂ）と比較した場合の分岐点数ｖｓ抗体濃度のプロットである。Figures 2A, 2B, 2C and 2D are plots of the number of branch points versus antibody concentration when germline E3 (2C and 2D) is compared to parent E3 (2A and 2B). 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは生殖細胞系Ｅ３（２Ｃおよび２Ｄ）を親Ｅ３（２Ａおよび２Ｂ）と比較した場合の分岐点数ｖｓ抗体濃度のプロットである。Figures 2A, 2B, 2C and 2D are plots of the number of branch points versus antibody concentration when germline E3 (2C and 2D) is compared to parent E3 (2A and 2B). 図３はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を用い、そして生殖細胞系Ｅ３抗体を評価したインビボ試験から得られたフルオレセイン−レクチンで染色されたマトリゲルにおける血管密度のグラフである。FIG. 3 is a graph of blood vessel density in Matrigel stained with fluorescein-lectin obtained from an in vivo study using MATRIGEL® and evaluating germline E3 antibodies. 図４は親Ｅ３およびＥ３ｂ（生殖細胞系）タンパク質を用いたＨＵＶＥＣにおける管形成の結果を示す。FIG. 4 shows the results of tube formation in HUVEC using parental E3 and E3b (germline) proteins. 図５はｎｕ／ｎｕマウスにＳＷ−４８０結腸直腸癌細胞を移植し、ＤＸ−２２２０（１０ｍｇ／ｋｇ）、シスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ）またはコントロールを投与した動物試験の結果をグラフで示したものである。コントロール条件は、未投与、ＰＢＳベヒクルのみ、または非特異的アイソタイプマッチＩｇＧ１抗体（Ａ２−ＳＶ）（１０ｍｇ／ｋｇ）とした。腫瘍重量はｙ軸にプロットし、腫瘍細胞注射後の日数はｘ軸にプロットした。FIG. 5 is a graph showing the results of an animal test in which SW-480 colorectal cancer cells were transplanted into nu / nu mice and DX-2220 (10 mg / kg), cisplatin (4 mg / kg) or control was administered. is there. Control conditions were unadministered, PBS vehicle alone, or non-specific isotype matched IgG1 antibody (A2-SV) (10 mg / kg). Tumor weight was plotted on the y-axis and days after tumor cell injection was plotted on the x-axis. 図６はｎｕ／ｎｕマウスにＬＮＭ３５肺癌細胞を移植し、ＤＸ−２２２０（２０ｍｇ／ｋｇ）または非特異的アイソタイプマッチＩｇＧ１抗体（Ａ２−ＳＶ）（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した動物試験の結果をグラフで示したものである。腫瘍体積（ｍｍ３）はｙ軸にプロットし；腫瘍細胞注射後の日数はｘ軸にプロットした。FIG. 6 is a graph showing the results of an animal test in which LNM35 lung cancer cells were transplanted into nu / nu mice and DX-2220 (20 mg / kg) or non-specific isotype-matched IgG1 antibody (A2-SV) (20 mg / kg) was administered. It is shown by. Tumor volume (mm 3 ) was plotted on the y-axis; days after tumor cell injection was plotted on the x-axis. 図７Ａおよび７Ｂはそれぞれクローンｐ−Ａ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。7A and 7B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-A1, respectively. 図８Ａおよび８Ｂはそれぞれクローンｐ−Ａ５の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 8A and 8B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-A5, respectively. 図９Ａおよび９Ｂはそれぞれクローンｐ−Ａ６の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 9A and 9B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-A6, respectively. 図１０Ａおよび１０Ｂはそれぞれクローンｐ−Ａ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 10A and 10B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-A10, respectively. 図１１Ａおよび１１Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｂ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 11A and 11B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-B1, respectively. 図１２Ａおよび１２Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｂ３の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 12A and 12B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-B3, respectively. 図１３Ａおよび１３Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｃ６の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 13A and 13B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-C6, respectively. 図１４Ａおよび１４Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｄ６の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 14A and 14B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-D6, respectively. 図１５Ａおよび１５Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｄ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 15A and 15B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-D10, respectively. 図１６Ａおよび１６Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｄ１２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 16A and 16B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-D12, respectively. 図１７Ａおよび１７Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｆ３の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 17A and 17B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-F3, respectively. 図１８Ａおよび１８Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｆ４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 18A and 18B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-F4, respectively. 図１９Ａおよび１９Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｇ３の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 19A and 19B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-G3, respectively. 図２０Ａおよび２０Ｂはそれぞれクローンｓ−Ａ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 20A and 20B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-A2, respectively. 図２１Ａおよび２１Ｂはそれぞれクローンｓ−Ａ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 21A and 21B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-A10, respectively. 図２２Ａおよび２２Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｂ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 22A and 22B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-B2, respectively. 図２３Ａおよび２３Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｂ９の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 23A and 23B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-B9, respectively. 図２４Ａおよび２４Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｃ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 24A and 24B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-C2, respectively. 図２５Ａおよび２５Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｃ７の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 25A and 25B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-C7, respectively. 図２６Ａおよび２６Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｃ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 26A and 26B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-C10, respectively. 図２７Ａおよび２７Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｄ１１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 27A and 27B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-D11, respectively. 図２８Ａおよび２８Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｅ１１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 28A and 28B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-E11, respectively. 図２９Ａおよび２９Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｇ４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 29A and 29B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-G4, respectively. 図３０はクローンｓ−Ｇ９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。FIG. 30 shows the amino acid sequence of the light chain variable domain of clone s-G9. 図３１Ａおよび３１Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｇ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。FIGS. 31A and 31B show the amino acid sequences of the heavy chain variable domain and light chain variable domain of clone s-G10, respectively. 図３２Ａおよび３２Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｈ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 32A and 32B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-H1, respectively. 図３３Ａおよび３３Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｈ４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 33A and 33B show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone s-H4, respectively. 図３４Ａおよび３４ＢはそれぞれクローンＧ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 34A and 34B show the amino acid sequences of the heavy chain variable domain and the light chain variable domain of clone G2, respectively. 図３４Ａおよび３４ＢはそれぞれクローンＧ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 34A and 34B show the amino acid sequences of the heavy chain variable domain and the light chain variable domain of clone G2, respectively. 図３５および３６はそれぞれクローンｐ−Ａ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 35 and 36 show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-A1, respectively. 図３５および３６はそれぞれクローンｐ−Ａ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Figures 35 and 36 show the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of clone p-A1, respectively. 図３７は表５であり、重鎖配列の概要である。FIG. 37 is Table 5 and is a summary of the heavy chain sequence. 図３７は表５であり、重鎖配列の概要である。FIG. 37 is Table 5 and is a summary of the heavy chain sequence. 図３７は表５であり、重鎖配列の概要である。FIG. 37 is Table 5 and is a summary of the heavy chain sequence. 図３７は表５であり、重鎖配列の概要である。FIG. 37 is Table 5 and is a summary of the heavy chain sequence. 図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。FIG. 38 is Table 6 and is a summary of the light chain sequence. 図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。FIG. 38 is Table 6 and is a summary of the light chain sequence. 図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。FIG. 38 is Table 6 and is a summary of the light chain sequence. 図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。FIG. 38 is Table 6 and is a summary of the light chain sequence. 図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。FIG. 38 is Table 6 and is a summary of the light chain sequence. 図３９は表９であり、一部の例示されるＴｉｅ１結合抗体の特性を示す。FIG. 39 is Table 9 and shows properties of some exemplary Tie1 binding antibodies.

Claims (28)

重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで該タンパク質がＴｉｅ１エクトドメインに結合し、そして、
（Ａ）該重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性：
ｉ）（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）を包含するＨＣ ＣＤＲ１；
ｉｉ）（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）を包含するＨＣ ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）を包含するＨＣ ＣＤＲ３；
の１つ以上を含み；
および／または、
（Ｂ）該軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性：
ｉ）Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）を包含するＬＣ ＣＤＲ１であって、ここでＸ１はセリンであるか非存在であり得る、ＬＣ ＣＤＲ１；
ｉｉ）Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）を包含するＬＣ ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）を包含するＬＣ ＣＤＲ３；
の１つ以上を含む、タンパク質。 An isolated protein comprising a heavy chain immunoglobulin variable domain sequence and a light chain immunoglobulin variable domain sequence, wherein the protein binds to a Tie1 ectodomain, and
(A) The heavy chain immunoglobulin variable domain sequence has the following properties:
i) HC CDR1 comprising (AGSIMRH) -Y- (GVMK) -M- (GSVMMFH) (SEQ ID NO: 118);
ii) HC CDR2 comprising (GSV) -I- (SY) -PSGGG- (WNQ) -T- (GY) (SEQ ID NO: 160); and
iii) HC CDR3 comprising APRGYYSYYGYYYY (SEQ ID NO: 727);
Including one or more of
And / or
(B) The light chain immunoglobulin variable domain sequence has the following characteristics:
i) LC including R-AS- (REQ)-(GSTRN)-(IV)-(GSTIRN)-(STIRH) -X1- (SYWNH)-(LV)-(ASN) (SEQ ID NO: 132) LC CDR1, wherein X1 can be serine or absent, LC CDR1;
ii) LC CDR2 comprising QQ- (SYFR)-(GSYN) -S- (STYW)-(RP)-(LWRH)-(TIY) (SEQ ID NO: 161); and
iii) LC CDR3 comprising QQF-N-S-Y-P-H (SEQ ID NO: 728);
A protein comprising one or more of: 前記重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が下記：
ｉ）（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）を包含するＨＣ ＣＤＲ１；
ｉｉ）（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）を包含するＨＣ ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）を包含するＨＣ ＣＤＲ３；
を含む、請求項１に記載のタンパク質。 The heavy chain immunoglobulin variable domain sequence is:
i) HC CDR1 comprising (AGSIMRH) -Y- (GVMK) -M- (GSVMMFH) (SEQ ID NO: 118);
ii) HC CDR2 comprising (GSV) -I- (SY) -PSGGG- (WNQ) -T- (GY) (SEQ ID NO: 160); and
iii) HC CDR3 comprising APRGYYSYYGYYYY (SEQ ID NO: 727);
The protein according to claim 1, comprising: 前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が下記：
ｉ）Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）を包含するＬＣ ＣＤＲ１であって、ここでＸ１はセリンであるか非存在であり得る、ＬＣ ＣＤＲ１；
ｉｉ）Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）を包含するＬＣ ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）を包含するＬＣ ＣＤＲ３；
を含む、請求項１に記載のタンパク質。 The light chain immunoglobulin variable domain sequence is:
i) LC including R-AS- (REQ)-(GSTRN)-(IV)-(GSTIRN)-(STIRH) -X1- (SYWNH)-(LV)-(ASN) (SEQ ID NO: 132) LC CDR1, wherein X1 can be serine or absent, LC CDR1;
ii) LC CDR2 comprising QQ- (SYFR)-(GSYN) -S- (STYW)-(RP)-(LWRH)-(TIY) (SEQ ID NO: 161); and
iii) LC CDR3 comprising QQF-N-S-Y-P-H (SEQ ID NO: 728);
The protein according to claim 1, comprising: 前記ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列がＥ３クローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、そして前記ＬＣ可変ドメイン配列がＥ３クローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。 2. The protein of claim 1, wherein the amino acid sequence of the HC variable domain sequence comprises CDR1, CDR2 and CDR3 sequences from an E3 clone and the LC variable domain sequence comprises CDR1, CDR2 and CDR3 sequences from an E3 clone. （ｉ）Ｅ３抗体のＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、（ｉｉ）それぞれＥ３抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であるＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列、あるいは（ｉｉｉ）それぞれＥ３のＨＣまたはＬＣ可変ドメインをコードする核酸に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によりコードされるＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。 (I) the HC and / or LC immunoglobulin variable domain of the E3 antibody, (ii) an HC and / or LC immunoglobulin variable domain sequence that is at least 85% identical to the HC and LC immunoglobulin variable domains of the E3 antibody, respectively, or ( 2. The protein of claim 1 comprising HC and / or LC immunoglobulin variable domain sequences encoded by nucleic acids that hybridize with high stringency to nucleic acids encoding HC or LC variable domains of E3, respectively. インビトロでＨＵＶＥＣ細胞による管形成を阻害する、請求項１〜５の何れかに記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 5, which inhibits tube formation by HUVEC cells in vitro. 前記タンパク質がＦａｂである、請求項１〜６の何れかに記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 6, wherein the protein is Fab. 前記タンパク質がＩｇＧである、請求項１〜７の何れかに記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 1 to 7, wherein the protein is IgG. 重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで該タンパク質がＴｉｅ１エクトドメインに結合し、そしてＴｉｅ１への結合についてＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４と競合するか、あるいは、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するか、あるいは、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４により認識されるエピトープと共通の少なくとも１、２または３つの残基を有するエピトープに結合する、タンパク質。 An isolated protein comprising a heavy chain immunoglobulin variable domain sequence and a light chain immunoglobulin variable domain sequence, wherein the protein binds to a Tie1 ectodomain and binds to Tie1 with E3, G2, p- A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, competing with s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11, s-G10 or s-H4, or E3, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p-D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s- C10, s-C2, s-C7, s-D11, s-E11 binds to an epitope that overlaps with the epitope recognized by s-G10 or s-H4, or E3, G2, p-A1, p-A10, p-B1, p-B3, p-C6, p- D12, p-F3, p-F4, p-G3, s-A10, s-H1, s-A2, s-B2, s-B9, s-C10, s-C2, s-C7, s-D11, A protein that binds to an epitope having at least 1, 2, or 3 residues in common with an epitope recognized by s-E11, s-G10 or s-H4. 請求項１〜９の何れかに記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。 A pharmaceutical composition comprising the protein according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 被験体における脈管発生を阻害する方法であって、該方法が下記工程：
請求項１〜９の何れかに記載のＴｉｅ１結合タンパク質を脈管発生の阻害が必要な障害を有するか、その危険性を有する被験体に投与する工程
を包含する、方法。 A method of inhibiting angiogenesis in a subject comprising the steps of:
A method comprising administering the Tie1-binding protein according to any one of claims 1 to 9 to a subject having or at risk of having a disorder requiring inhibition of angiogenesis. 前記Ｔｉｅ１結合タンパク質が下記の特性：
（１）Ｅ３抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含む可変ドメイン配列のうちの少なくとも１つ；
（２）Ｅ３抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含む可変ドメイン配列のうちの少なくとも１つ；
（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であること；
（４）タンパク質がＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合すること、および、
（５）タンパク質がＥ３またはＥ３ｂのＨＣまたはＬＣ可変ドメインをコードする核酸に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によりコードされるドメインを含むこと；
の１つ以上を含む、請求項１１に記載の方法。 The Tie1 binding protein has the following properties:
(1) at least one of variable domain sequences comprising at least two CDRs of the E3 antibody;
(2) at least one of the variable domain sequences comprising CDR sequences that are at least 85% identical in total to the CDRs of the corresponding variable domain of the E3 antibody;
(3) at least one of the variable domains is at least 85% identical to the corresponding immunoglobulin variable domain of the E3 antibody;
(4) the protein competes with E3 for binding to Tie1, or binds to an epitope that overlaps with the epitope bound by E3 on Tie1, and
(5) the protein comprises a domain encoded by a nucleic acid that hybridizes with high stringency to a nucleic acid encoding an E3 or E3b HC or LC variable domain;
The method of claim 11, comprising one or more of: 前記抗体がＥ３の可変ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。 12. The method of claim 11, wherein the antibody comprises an E3 variable domain. 前記薬剤が被験体における脈管発生を低減するために有効な量および／または時間で投与される、請求項１１〜１３の何れかに記載の方法。 14. The method of any of claims 11-13, wherein the agent is administered in an amount and / or time effective to reduce vascularization in a subject. 前記被験体が脈管構造依存性の癌または腫瘍を有する、請求項１１〜１４の何れかに記載の方法。 The method according to any of claims 11 to 14, wherein the subject has a vasculature-dependent cancer or tumor. 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１５に記載の方法。 The method of claim 15, wherein the tumor is a solid tumor. 抗癌療法である第２の療法を提供する工程を更に包含する、請求項１１〜１６の何れかに記載の方法。 17. The method according to any of claims 11 to 16, further comprising providing a second therapy that is an anti-cancer therapy. 前記第２の療法が化学療法である、請求項１７に記載の方法。 The method of claim 17, wherein the second therapy is chemotherapy. 前記第２の療法が、ＶＥＧＦ経路を介したシグナリングを拮抗する薬剤を投与する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。 18. The method of claim 17, wherein the second therapy comprises administering an agent that antagonizes signaling through the VEGF pathway. 前記第２の療法が、ベバシズマブを投与する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。 18. The method of claim 17, wherein the second therapy comprises administering bevacizumab. 前記第２の療法が、５−ＦＵ、ロイコボリンおよび／またはイリノテカンを投与する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。 18. The method of claim 17, wherein the second therapy comprises administering 5-FU, leucovorin and / or irinotecan. 術後のアジュバント療法を提供する方法であって、該方法が、腫瘍を除去するための手術を受けている被験体に請求項１に記載のＴｉｅ１結合タンパク質を投与する工程を包含する、方法。 2. A method of providing post-surgical adjuvant therapy, the method comprising administering a Tie1-binding protein according to claim 1 to a subject undergoing surgery to remove a tumor. 前記Ｔｉｅ１結合タンパク質が、（ａ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインに少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン配列およびＥ３抗体の軽鎖可変ドメインに少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン配列；
（ｂ）Ｔｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列；
または、
（ｃ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲのうちの１、２または３つ、および、Ｅ３抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲのうちの１、２または３つ；
を含む、請求項２２に記載の方法。 A light chain variable domain sequence wherein the Tiel binding protein is (a) a heavy chain variable domain sequence that is at least 90% identical to the heavy chain variable domain of the E3 antibody and a light chain variable domain of the E3 antibody;
(B) a heavy and light chain variable domain sequence that forms an antigen binding site that competes with E3 for binding to Tie1;
Or
(C) 1, 2 or 3 of the CDRs of the heavy chain variable domain of the E3 antibody and 1, 2 or 3 of the CDRs of the light chain variable domain of the E3 antibody;
23. The method of claim 22, comprising: 手術の４８時間以内に前記Ｔｉｅ１結合タンパク質が投与される、請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the Tiel binding protein is administered within 48 hours of surgery. 手術の前後に前記Ｔｉｅ１結合タンパク質が投与される、請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the Tiel binding protein is administered before and after surgery. 配列番号７２３および配列番号７２４を含む単離されたタンパク質。 An isolated protein comprising SEQ ID NO: 723 and SEQ ID NO: 724. 各々がＴｉｅ１に結合する２つの抗原結合部位を含む、請求項２６に記載のタンパク質。 27. The protein of claim 26, comprising two antigen binding sites, each binding to Tie1. 請求項１に記載のタンパク質の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列をコードする、単離された核酸。 2. An isolated nucleic acid encoding a heavy or light chain immunoglobulin variable domain sequence of the protein of claim 1.
JP2007525760A 2004-08-12 2005-08-09 Complex binding protein Withdrawn JP2008532476A (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2004/026116 WO2005019267A2 (en) 2003-08-12 2004-08-12 Tie1-binding ligands
US10/916,840 US7348001B2 (en) 2003-08-12 2004-08-12 Tie1-binding ligands
US11/049,536 US7871610B2 (en) 2003-08-12 2005-02-02 Antibodies to Tie1 ectodomain
PCT/US2005/028413 WO2006020706A2 (en) 2004-08-12 2005-08-09 Tie complex binding proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2008532476A true JP2008532476A (en) 2008-08-21
JP2008532476A5 JP2008532476A5 (en) 2008-10-02

Family

ID=35908119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007525760A Withdrawn JP2008532476A (en) 2004-08-12 2005-08-09 Complex binding protein

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1789451A4 (en)
JP (1) JP2008532476A (en)
AU (1) AU2005272848A1 (en)
CA (1) CA2576886A1 (en)
WO (1) WO2006020706A2 (en)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7871610B2 (en) 2003-08-12 2011-01-18 Dyax Corp. Antibodies to Tie1 ectodomain
AR045563A1 (en) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co ANTIBODIES DIRECTED TO M-CSF
AU2006227536B9 (en) * 2005-03-25 2011-08-18 National Research Council Of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
WO2006122822A2 (en) 2005-05-20 2006-11-23 Lonza Biologics Plc. High-level expression of recombinant antibody in a mammalian host cell
EP1981538B1 (en) 2005-12-30 2014-09-17 Dyax Corporation Metalloproteinase binding proteins
US7910703B2 (en) 2006-03-10 2011-03-22 Zymogenetics, Inc. Antagonists to IL-17A, IL-17F, and IL-23P19 and methods of use
WO2007126876A2 (en) * 2006-03-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-ir antibodies and uses thereof
MX2009004070A (en) * 2006-10-17 2009-04-27 Dyax Corp Sequential combination therapy.
EP2129396B1 (en) * 2007-02-16 2013-08-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against erbb3 and uses thereof
EP2036980A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-18 Gruber, Jens Down regulation of gene expression using virus-like particles charged with nucleic acid
SG10201605629VA (en) 2008-01-03 2016-08-30 Scripps Research Inst Antibody targeting through a modular recognition domain
AU2009262199B2 (en) 2008-06-27 2012-08-09 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
PE20120015A1 (en) 2008-08-15 2012-01-26 Merrimack Pharmaceuticals Inc METHODS AND SYSTEMS FOR PREDICTING THE RESPONSE OF TUMOR CELLS TO A THERAPEUTIC AGENT
CA2748158A1 (en) * 2008-12-23 2010-07-01 Astrazeneca Ab Targeted binding agents directed to .alpha.5.beta.1 and uses thereof
PL2544680T3 (en) 2010-03-11 2015-08-31 Merrimack Pharmaceuticals Inc Use of erbb3 inhibitors in the treatment of triple negative breast cancer
DK2714738T3 (en) 2011-05-24 2019-01-28 Zyngenia Inc MULTIVALENT AND MONOVALENT MULTISPECIFIC COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS
AR087567A1 (en) * 2011-08-19 2014-04-03 Regeneron Pharma ANTI-TIE2 ANTIBODIES AND USES OF THE SAME
US10316105B2 (en) 2011-08-19 2019-06-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-TIE2 antibodies and uses thereof
EP2968541A4 (en) 2013-03-15 2017-02-08 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
WO2015100459A2 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarker profiles for predicting outcomes of cancer therapy with erbb3 inhibitors and/or chemotherapies
EP3081575A1 (en) * 2015-04-12 2016-10-19 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Anti-plasmodium parasite antibodies
US10184006B2 (en) 2015-06-04 2019-01-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for predicting outcomes of cancer therapy with ErbB3 inhibitors
WO2022199603A1 (en) * 2021-03-25 2022-09-29 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Antibody fusion proteins and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5955291A (en) * 1992-01-09 1999-09-21 Alitalo; Kari Antibodies recognizing tie receptor tyrosine kinase and uses thereof
US6365154B1 (en) * 1998-09-28 2002-04-02 Smithkline Beecham Corporation Tie2 agonist antibodies
US7348001B2 (en) * 2003-08-12 2008-03-25 Dyax Corp. Tie1-binding ligands

Also Published As

Publication number Publication date
EP1789451A4 (en) 2009-12-02
EP1789451A2 (en) 2007-05-30
AU2005272848A1 (en) 2006-02-23
AU2005272848A2 (en) 2006-02-23
WO2006020706A2 (en) 2006-02-23
WO2006020706A3 (en) 2006-10-12
CA2576886A1 (en) 2006-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7485297B2 (en) Method of inhibition of vascular development using an antibody
JP2008532476A (en) Complex binding protein
US7871610B2 (en) Antibodies to Tie1 ectodomain
JP6779944B2 (en) Plasma kallikrein binding protein
JP5898649B2 (en) Matrix metalloproteinase binding protein
US20220185897A1 (en) Anti-axl antibodies
JP2011125338A (en) Tie1-binding ligand
KR101608544B1 (en) An antigen associated with rheumatoid arthritis
JP2014506257A (en) Plasma kallikrein binding protein
US20040110933A1 (en) CD44-binding ligands
CN108064243B (en) Binding proteins specific for LOX1 and uses thereof
JP2007528720A5 (en)
JP2007528721A (en) Endotheliase-2 ligand
JP2018528759A (en) Anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) antibody
JP2012505900A (en) Use of an IGF-II / IGF-IIE binding protein for the treatment and prevention of pulmonary fibrosis associated with systemic scleroderma
JP2008502589A (en) Anti-IGF-I receptor antibody
Putelli Human antibody phage technology-isolation and characterization of monoclonal antibodies for the targeting of cancer and rheumatoid arthritis

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080807

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080807

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20110615