JP2008518629A - Mdl−1の腫瘍との関連およびその方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、腫瘍を検出するための方法を提供する。本発明は、腫瘍を診断するための方法を提供する。本発明は、腫瘍を位置決定するための方法を提供する。本発明は、腫瘍を画像化するための方法を提供する。本発明はまた、癌を検出するための方法に関する。本発明は、癌を診断するための方法に関する。本発明は、癌を位置決定するための方法に関する。本発明は、癌を画像化するための方法に関する。本発明は、癌を処置するための方法に関する。
Description
(関連出願の引用)
本願は、2004年11月8日出願の米国仮特許出願第60/625,829号(その開示は、その全体が本明細書によって参考として援用される)に基づく優先権の利益を、米国特許法第119条(e)項の下で主張する。
本願は、2004年11月8日出願の米国仮特許出願第60/625,829号(その開示は、その全体が本明細書によって参考として援用される)に基づく優先権の利益を、米国特許法第119条(e)項の下で主張する。
(発明の分野)
本発明は、腫瘍(特に、固形腫瘍、皮膚の腫瘍(例えば、黒色腫)、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)を検出するための新規方法、腫瘍を診断するための新規方法、腫瘍を位置決定するための新規方法、および腫瘍を画像化するための新規方法に関する。本発明はまた、癌(特に、皮膚癌(例えば、黒色腫)、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌)を検出するための新規方法、癌を診断するための新規方法、癌を画像化するための新規方法、および癌を処置するための新規方法に関する。
本発明は、腫瘍(特に、固形腫瘍、皮膚の腫瘍(例えば、黒色腫)、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)を検出するための新規方法、腫瘍を診断するための新規方法、腫瘍を位置決定するための新規方法、および腫瘍を画像化するための新規方法に関する。本発明はまた、癌(特に、皮膚癌(例えば、黒色腫)、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌)を検出するための新規方法、癌を診断するための新規方法、癌を画像化するための新規方法、および癌を処置するための新規方法に関する。
(発明の背景)
単球の活性化および炎症反応において役割を果たす数種のレセプター複合体(非特許文献1)は、膜貫通アダプター糖タンパク質DAP12と、Igスーパーファミリーのレセプター(非特許文献2;非特許文献3)またはC型レクチンスーパーファミリーのレセプター(非特許文献4)との非共有結合によって形成される。これらの結合は、DAP12の膜貫通ドメインに位置する負に荷電したアミノ酸残基(アスパラギン酸)と、これらのレセプターの膜貫通ドメインに位置する正に荷電したアミノ酸残基(リジン)との相互作用によって形成される(非特許文献5)。
単球の活性化および炎症反応において役割を果たす数種のレセプター複合体(非特許文献1)は、膜貫通アダプター糖タンパク質DAP12と、Igスーパーファミリーのレセプター(非特許文献2;非特許文献3)またはC型レクチンスーパーファミリーのレセプター(非特許文献4)との非共有結合によって形成される。これらの結合は、DAP12の膜貫通ドメインに位置する負に荷電したアミノ酸残基(アスパラギン酸)と、これらのレセプターの膜貫通ドメインに位置する正に荷電したアミノ酸残基(リジン)との相互作用によって形成される(非特許文献5)。
DAP12は、ジスルフィド結合した、ホモダイマーのI型膜貫通糖タンパク質であり、DAP12は、その細胞内ドメインに位置する免疫レセプターベースチロシン活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine−based activation motif)(ITAM)を含む(非特許文献6;特許文献1;非特許文献7;非特許文献8)。DAP12の重要性は、ITAMドメインによるものである(非特許文献1)。DAP12と非共有結合する、上記Igスーパーファミリー(非特許文献2;非特許文献3)および上記C型レクチンスーパーファミリー(非特許文献4)のレセプターの細胞内ドメインは、他の分子との相互作用を可能にするには短すぎるので、そのDAP12の細胞質ドメインは、これらのレセプター複合体のシグナル伝達サブユニットを構成する。上記レセプターのリガンド結合サブユニットが係合すると、DAP12の細胞質ITAMは、Srcキナーゼによってリン酸化される。次いでDAP12のITAMは、Syk細胞質チロシンキナーゼと相互作用し、この相互作用は、活性化をもたらす事象のカスケードを開始する(非特許文献6;非特許文献7;非特許文献8)。
DAP12は、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、顆粒球、樹状細胞および肥満細胞において発現され、これらは、少なくとも8種の異なるレセプターにシグナル伝達機能を提供する(非特許文献1;非特許文献8)。DAP12に結合するC型レクチンスーパーファミリーの単球性レセプターは、骨髄性DAP12結合レクチン−1(MDL−1)(II型膜貫通タンパク質)である。MDL−1は、同定されかつクローニングされた最初のDAP12結合分子であった(非特許文献4)。MDL−1は、単球およびマクロファージにおいて独占的に発現される(非特許文献4)。DAP12の膜貫通ドメイン中の負に荷電した残基の存在は、MDL−1のようなパートナーのレセプター(これは、その膜貫通ドメイン中に正に荷電した残基を有する)の非存在下において、DAP12の細胞表面における発現を妨げる。しかし、DAP12は、単独では細胞表面におけるその発現および機能に関して十分ではない。したがって、DAP12結合分子(例えば、MDL−1)とDAP12との組み合わせは、DAP12を介する特定の生理学的シグナルの伝達に寄与し得る(非特許文献9)。
腫瘍浸潤性白血球(例えば、骨髄系列の細胞またはマクロファージ)は、血流を離れて腫瘍の中に移動した白血球細胞である。マクロファージは、腫瘍の白血球浸潤の主要な成分である。腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、それらと腫瘍性細胞との相互作用において、複雑な二重の機能を有し、そして証拠は、それらが腫瘍の進行を促進する炎症回路の一部であることを示唆する(非特許文献10;非特許文献11)。TAMは、分極したM2マクロファージ集団であると報告されている。分極したM2細胞の性質を発現することによって、TAMは、腫瘍の増殖および進行、適応免疫、支質形成ならびに新脈管形成を調節する回路に関与する。特に、TAMSは、腫瘍の進行および転移を促進する炎症の回路の構成成分である(Mantovaniら、前出)。
癌は、米国における2番目の死亡原因である(非特許文献12)。現在、米国における死亡の4分の1は、癌に起因する(非特許文献13)。癌は、それが局所期(regional stage)または遠隔期(distant stage)においてよりもむしろ限局期(localized stage)にて早期に診断される場合、より容易かつ上首尾に処置される(非特許文献13)。処置の選択肢としては、外科手術、化学療法、放射線治療および免疫療法が挙げられる。治療の主要な様式は、局所の癌および限局−局所(local−regional)の癌の両方に対しては外科手術または放射線治療のいずれかであるが、化学療法は、全身の部位に対して最適である。臨床上診断された多くの固形腫瘍において、外科手術よる除去は、主要な治療手段と見なされる。
現在利用可能な癌治療のための方法は、再発の予防において限定的な成功を納めているか、またはこれらの方法は、深刻でありかつ望ましくない副作用を生じているかのいずれかである。さらに、癌の迅速かつ正確な検出を可能にする方法の開発は、医学界(medical community)の課題であり続ける。多数の癌に関連した死亡、ならびに現在利用可能な検出方法および処置方法の不適切性に鑑みて、癌を検出および処置するためのさらに有効な化合物に対する必要性が、存在する。したがって、腫瘍を検出する方法に対する必要性、および癌を処置する必要性が、存在する。
国際公開第99/06557号パンフレット
Gingrasら、Mol.Immun.、2001年、第38巻、p.817−824
Bouchonら、J.Immunol.、2000年、第164巻、p.4991−4995
Dietrichら、J.Immunol.、2000年、第164巻、p.9−12
Bakkerら、PNAS U.S.A.、1999年、第96巻、p.9792−9796
Gingrasら、Mol.Immun.、2001年、第38巻、p.817−824
Lanierら、Nature、1998年、第391巻、p.703−707
CampbellおよびColonna、Int.J.Biochem.Cell Biol.、1999年、第31巻、p.631−636
LanierおよびBakker、Immunol.Today、2000年、第21巻、p.611−614
Nochiら、Am.J.of Pathology、2003年、第162巻、p.1191−1201
Mantovaniら、Immunol.Today、1992年、第13巻、p.265−270
Mantovaniら、TRENDS in Immunol.、2002年、第23巻、p.549−555
American Cancer Society Statistics、2004年
Jemalら、CA Cancer J.Clin、2004年、第54巻、p.8−29
(発明の要旨)
本発明は、皮膚癌(例えば、黒色腫)、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌を有する患者由来の腫瘍(特に、固形腫瘍)に関連するMDL−1発現の上昇したレベルを検出することにより、癌を検出するための方法、癌を診断するための方法、癌を位置決めするための方法、および癌を画像化するための方法を提供することによって、前述の必要性に取り組む。本発明はまた、腫瘍(特に、固形腫瘍、皮膚の腫瘍(例えば、黒色腫)、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)を検出するための方法、腫瘍を診断するための方法、腫瘍を位置決定するための方法、および腫瘍を画像化するための方法を提供することによって、これらの必要性に取り組む。さらに、本発明は、MDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、癌を診断するための方法、癌を位置決定するための方法、癌を画像化するための方法、および癌を処置するための方法を提供することによって、これらの必要性に取り組む。さらに、本発明は、可溶性MDL−1タンパク質またはそのフラグメントを使用して、癌(例えば、皮膚癌(例えば、黒色腫)、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌)を診断するための方法、癌を位置決定するための方法、癌を画像化するための方法、および癌を処置するための方法を提供することによって、これらの必要性に取り組む。
本発明は、皮膚癌(例えば、黒色腫)、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌を有する患者由来の腫瘍(特に、固形腫瘍)に関連するMDL−1発現の上昇したレベルを検出することにより、癌を検出するための方法、癌を診断するための方法、癌を位置決めするための方法、および癌を画像化するための方法を提供することによって、前述の必要性に取り組む。本発明はまた、腫瘍(特に、固形腫瘍、皮膚の腫瘍(例えば、黒色腫)、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)を検出するための方法、腫瘍を診断するための方法、腫瘍を位置決定するための方法、および腫瘍を画像化するための方法を提供することによって、これらの必要性に取り組む。さらに、本発明は、MDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して、癌を診断するための方法、癌を位置決定するための方法、癌を画像化するための方法、および癌を処置するための方法を提供することによって、これらの必要性に取り組む。さらに、本発明は、可溶性MDL−1タンパク質またはそのフラグメントを使用して、癌(例えば、皮膚癌(例えば、黒色腫)、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌)を診断するための方法、癌を位置決定するための方法、癌を画像化するための方法、および癌を処置するための方法を提供することによって、これらの必要性に取り組む。
本発明は、癌を診断するための方法であって、(a)細胞または組織における骨髄性DAP12結合レクチン−1(MDL−1)発現のレベルを測定する工程;および(b)測定されたMDL−1のレベルと、コントロール由来の細胞もしくは組織におけるMDL−1の発現レベルとを比較する工程であって、上記コントロールと比較した測定されたMDL−1発現のレベルの上昇は、癌に関連する、工程;を包含する方法を提供する。上記MDL−1が、ポリペプチドまたは核酸である上記方法もまた、提供される。上記MDL−1が、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するか、または上記MDL−1が、配列番号2のアミノ酸配列を含む上記方法;および上記MDL−1は、腫瘍内部の腫瘍浸潤性白血球に存在する上記方法もまた、提供される。上記癌が、黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌からなる群より選択される上記方法もまた、提供される。
本発明のなお別の実施形態は、腫瘍を検出するための方法であって、(a)細胞または組織におけるMDL−1発現のレベルを測定する工程;および(b)測定されたMDL−1のレベルと、コントロール由来の細胞もしくは組織におけるMDL−1の発現レベルとを比較する工程であって、上記コントロールと比較した測定されたMDL−1発現のレベルの上昇は、腫瘍の存在に関連する、工程;を包含する方法を提供する。上記MDL−1が、ポリペプチドまたは核酸である上記方法もまた、提供される。上記MDL−1が、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するか、または上記MDL−1が、配列番号2のアミノ酸配列を含む上記方法;および上記MDL−1は、腫瘍内部の腫瘍浸潤性白血球に存在する上記方法もまた、提供される。上記腫瘍が、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍からなる群より選択される上記方法もまた、提供される。
別の実施形態において、本発明は、患者において腫瘍を診断するための方法であって、(a)MDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを上記患者に投与する工程;(b)上記患者の細胞もしくは組織における上記抗体またはその抗原結合フラグメントの結合のレベルを測定する工程;および(c)上記測定された結合のレベルと、コントロールの細胞もしくは組織においてMDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの結合のレベルとを比較する工程であって、上記コントロールと比較した上記患者において測定された結合のレベルの上昇は、上記腫瘍の存在に関連する、工程;を包含する方法を提供する。上記MDL−1が、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するか、または上記MDL−1が、配列番号2のアミノ酸配列を含む上記方法;および上記MDL−1は、腫瘍内部の腫瘍浸潤性白血球に存在する上記方法もまた、提供される。上記腫瘍が、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍からなる群より選択される上記方法;ならびに上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、活性化抗体、抑制性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体(diabody)、単鎖抗体および融合タンパク質からなる群より選択される上記方法;または上記抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、F(ab)2フラグメント、およびFvフラグメントからなる群より選択される上記方法;または上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、標識に結合される上記方法;または上記標識が、放射標識、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識および酵素標識からなる群より選択される上記方法もまた、提供される。
別の実施形態において、本発明は、腫瘍を検出するための方法であって、(a)MDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に投与する工程;(b)上記患者の細胞もしくは組織における上記抗体またはその抗原結合フラグメントの結合のレベルを測定する工程;および(c)上記測定された結合のレベルと、コントロールの細胞もしくは組織におけるMDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの結合のレベルとを比較する工程であって、上記コントロールと比較した上記患者において測定された結合のレベルの上昇は、上記腫瘍の存在に関連する、工程;を包含する方法を提供する。上記MDL−1が、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するか、または上記MDL−1が、配列番号2のアミノ酸配列を含む上記方法;および上記MDL−1は、腫瘍内部の腫瘍浸潤性白血球に存在する上記方法もまた、提供される。上記腫瘍が、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍からなる群より選択される上記方法;または上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、活性化抗体、抑制性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体および融合タンパク質からなる群より選択される上記方法;または上記抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、F(ab)2フラグメント、およびFvフラグメントからなる群より選択される上記方法;または上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、標識に結合される上記方法;または上記標識が、放射標識、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識および酵素標識からなる群より選択される上記方法もまた、提供される。
別の実施形態において、本発明は、MDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を患者に投与する工程を包含する、癌を処置するための方法であって、上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性因子に結合される、方法を提供する。上記MDL−1が、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するか、または上記MDL−1が、配列番号2のアミノ酸配列を含む上記方法;および上記MDL−1は、腫瘍内部の腫瘍浸潤性白血球に存在する上記方法もまた、提供される。上記癌が、黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌からなる群より選択される上記方法;または上記抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、活性化抗体、抑制性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体および融合タンパク質からなる群より選択される上記方法;または上記抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、F(ab)2フラグメント、およびFvフラグメントからなる群より選択される上記方法もまた、提供される。上記細胞傷害性因子が、薬物、毒素、放射線を放射する化合物、植物起源の分子、真菌起源の分子、細菌起源の分子、生物学的タンパク質、およびそれらの混合物からなる群より選択される上記方法;または上記放射線を放射する化合物が、α線放射物質、β線放射物質またはγ線放射物質である上記方法;または上記組成物が、腫瘍細胞を消散させるか、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍の大きさを減少させる上記方法もまた、提供される。
別の実施形態において、本発明は、リガンドに結合する可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物を患者に投与する工程を包含する、癌を処置するための方法であって、上記ポリペプチドまたはそのフラグメントは、細胞傷害性因子に結合される、方法を提供する。上記可溶性MDL−1ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸残基26〜188を含むアミノ酸配列を有する上記方法もまた、提供される。上記癌が、黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌からなる群より選択される方法もまた、提供される。上記細胞傷害性因子が、薬物、毒素、放射線を放射する化合物、植物起源の分子、真菌起源の分子、細菌起源の分子、生物学的タンパク質、およびそれらの混合物からなる群より選択される上記方法;または上記放射線を放射する化合物が、α線放射物質、β線放射物質またはγ線放射物質である上記方法;または上記組成物が、腫瘍細胞を消散させるか、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍の大きさを減少させる上記方法もまた、提供される。
別の実施形態において、本発明は、腫瘍の存在を診断するための方法であって、(a)可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントを患者に投与する工程;(b)上記患者の細胞もしくは組織におけるリガンドに対する上記ポリペプチドまたはそのフラグメントの結合のレベルを測定する工程;および(c)上記測定された結合のレベルと、コントロールの細胞もしくは組織におけるリガンドに対する可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントの結合のレベルとを比較する工程であって、上記コントロールと比較した上記患者において測定された結合のレベルの上昇は、腫瘍の存在と関連する、工程;を包含する方法を提供する。上記可溶性MDL−1ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸残基26〜188を含むアミノ酸配列を有する上記方法もまた、提供される。上記腫瘍は、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍からなる群より選択される上記方法;または上記可溶性MDL−1ポリペプチドもしくはそのフラグメントが、標識に結合される上記方法;または上記標識が、放射標識、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識および酵素標識からなる群より選択される上記方法もまた、提供される。
別の実施形態において、本発明は、患者において腫瘍の存在を検出するための方法であって、(a)可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントを患者に投与する工程;(b)上記患者の細胞もしくは組織におけるリガンドに対する上記ポリペプチドまたはそのフラグメントの結合のレベルを測定する工程;および(c)上記測定された結合のレベルと、コントロールの細胞もしくは組織におけるリガンドに対する可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントの結合のレベルとを比較する工程であって、上記コントロールと比較した上記患者において測定された結合のレベルの上昇は、腫瘍の存在と関連する、工程;を包含する方法を提供する。上記可溶性MDL−1ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸残基26〜188を含むアミノ酸配列を有する上記方法もまた、提供される。上記腫瘍は、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍からなる群より選択される上記方法;または上記可溶性MDL−1ポリペプチドもしくはそのフラグメントが、標識に結合される上記方法;または上記標識が、放射標識、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識および酵素標識からなる群より選択される上記方法もまた、提供される。
(定義)
本明細書中で使用される場合、用語「癌」とは、細胞の正常な制御機構が失われ、したがって増殖を調節していない細胞の群(通常は、単一の細胞に由来する)をいう。癌性組織または悪性疾患としては、しばしば癌と称される、血液および血液を形成する組織の癌性組織または悪性疾患(例えば、白血病およびリンパ腫)ならびに固形腫瘍が挙げられる。このような癌は、癌腫または肉腫であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「癌」とは、細胞の正常な制御機構が失われ、したがって増殖を調節していない細胞の群(通常は、単一の細胞に由来する)をいう。癌性組織または悪性疾患としては、しばしば癌と称される、血液および血液を形成する組織の癌性組織または悪性疾患(例えば、白血病およびリンパ腫)ならびに固形腫瘍が挙げられる。このような癌は、癌腫または肉腫であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」とは、異常な増殖または異常な塊をいう。腫瘍は、良性または癌性(悪性)であり得る。良性腫瘍は、癌ではない。良性腫瘍は、身体から取り除かれ得、その後ほぼ繰り返して増殖することはない。良性腫瘍由来の細胞は、周囲の組織または身体の他の部分に拡散しない。
癌性細胞が、成長し、そして増殖する場合、その癌性細胞は、腫瘍である癌性組織の塊を形成し、癌性組織は、隣接正常組織を侵し、そして破壊する。悪性腫瘍は、癌である。悪性腫瘍は、通常、取り除かれ得るが、悪性腫瘍は、繰り返して増殖し得る。悪性腫瘍由来の細胞は、近傍の組織および近傍の器官を侵し、そしてそれらに損傷を与え得る。また、癌細胞は、悪性腫瘍から離れて、血流またはリンパ系に進入し得、このことは、癌細胞が原発性腫瘍(すなわち、最初の癌)から拡散して、他の器官において新しい腫瘍を形成する手段である。身体における癌の拡散は、転移と称される(What You Need to Know About Cancer−an Overview,NIH Publication No.00−1566;2000年9月26日掲載、2002年9月16日更新(2002))。
本明細書中で使用される場合、用語「固形腫瘍」とは、組織の異常な増殖または塊をいい、それは、通常、嚢胞領域も液体領域も含まない。固形腫瘍は、良性(癌性ではない)または悪性(癌性)であり得る。種々の型の固形腫瘍が、それらを形成する細胞の型にちなんで称される。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫である。白血病(血液の癌)は、一般的に、固形腫瘍を形成しない(National Cancer Institute、Dictionary of Cancer Terms)。
本明細書中で使用される場合、用語「原発性癌」とは、最初の腫瘍または第1の腫瘍をいう。癌は、身体のあらゆる器官または組織において起こり得る。癌は、通常、それが発生する身体の部分または細胞の型にちなんで称される(Metastatic Cancer:Questions and Answers,Cancer Facts 6.20,National Cancer Institute(2004年9月1日に再考された)(2004))。
本明細書中で使用される場合、用語「インサイチュの癌種」とは、癌性細胞が増殖し始めた組織内になおも含まれ、未だ身体の他の部分に侵入も拡散もしていない癌性細胞をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「癌腫」とは、身体の表面を覆い、ホルモンを産生し、そして腺を構成する細胞である上皮細胞の癌をいう。癌腫の例は、皮膚の癌、肺の癌、結腸の癌、胃の癌、***の癌、前立腺の癌および甲状腺の癌である。
本明細書中で使用される場合、用語「白血球(white blood cell)」とは、ヘモグロビンを含まない血球をいう。白血球(white blood cell)はまた、白血球(leukocyte)と称される。白血球としては、リンパ球、好中球、好酸球、マクロファージおよび肥満細胞が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍浸潤性白血球」(例えば、骨髄系列の細胞またはマクロファージ)とは、血流から離れ、そして腫瘍に移動した白血球をいう。したがって、腫瘍浸潤性白血球は、腫瘍特異性を有し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「発現状態」は、遺伝子およびその産物(例えば、mRNA発現のレベル)の発現、機能および調節、発現した遺伝子産物(例えば、核酸配列およびアミノ酸配列)の完全性、ならびにこれらの分子に対する転写改変および翻訳改変に関与する、種々の因子を広くいうために使用される。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体分子」とは、抗体全体(例えば、IgG(好ましくは、IgG1またはIgG4)およびそのフラグメント(好ましくは、抗原結合フラグメント)をいう。抗体フラグメントとしては、Fab抗体フラグメント、F(ab)2抗体フラグメント、Fv抗体フラグメント、単鎖Fv抗体フラグメントおよびdsFv抗体フラグメントが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」もしくは「患者」または「宿主」とは、あらゆる生物体(好ましくは、動物、より好ましくは、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、イヌ、ネコ、ウシ、チンパンジー、ゴリラ)、そして最も好ましくは、ヒト)をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「コントロール」は、癌を有さない患者、腫瘍を有さない患者、癌を有さない患者由来のサンプル、腫瘍を有さない患者由来のサンプル、癌を有する患者由来の非癌性サンプル、腫瘍を有する患者由来の非腫瘍サンプルを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「投与」および「処置」とは、それが動物、ヒト、実験の被験体、細胞、組織、器官、または生物学的流体に適用される場合、外因性の薬学的因子、治療因子、診断因子、化合物、もしくは組成物の、動物、ヒト、被験体、細胞、組織、器官、または生物学的流体への接触をいう。「投与」および「処置」はまた、インビトロの処置、インビボの処置およびエキソビボの処置を意味する。
本明細書中で使用される場合、治療因子の用語「治療有効量」は、意味深い患者の利益を示す(すなわち、処置される状態の症状の減少、予防、または改善を生じる)のに十分である、薬学的処方物の各活性成分の量として定義される。薬学的処方物が、診断因子を含む場合、「治療有効量」は、シグナル、画像、または他の診断パラメータをもたらすのに十分である量として定義される。薬学的処方物の有効量は、個体の感受性の程度、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体の特異体質性の反応などの因子によって変動する。例えば、米国特許第5,888,530号を参照のこと。
本明細書中で使用される場合、用語「外因性の」とは、文脈に依存して、生物体外、細胞外、またはヒトの身体外で生成される物質をいう。本明細書中で使用される場合、用語「内因性の」とは、文脈に依存して、細胞内、生物体内、またはヒトの身体内で生成される物質をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「組換え」とは、天然で隣接せず、互いに融合されている、2以上の核酸または2以上のタンパク質をいう。この用語はまた、ヒトの介入によって変更された(例えば、翻訳後に修飾されたか、または翻訳後に変異させられた)、核酸またはタンパク質を指す。例えば、野生型コドンは、同時に核酸配列認識部位を導入または除去しながら、同じアミノ酸残基をコードする縮重(redundant)コドンによって置換され得るか、または同時に核酸配列認識部位を導入または除去しながらの保存的置換であり得る。同様に、所望の機能をコードする核酸セグメントは、天然において一緒に見出されない機能の所望される組み合わせをコードする単一の遺伝的実体を産生するために融合され得る。制限酵素認識部位は、しばしば、このような人工的な操作の標的であるが、他の部位特異的な標的(例えば、プロモーター、DNA複製部位、調節配列、コントロール配列、または他の有用な特徴)が、設計によって組み込まれ得る。以下に記載されるような、検出または精製のためのエピトープタグをコードする配列もまた、組み込まれ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」とは、一本鎖形態、二本鎖形態もしくはその他の、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン)のリン酸エステルポリマー形態(「RNA分子」)のリン酸エステルポリマー形態もしくはデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジンのリン酸エステルポリマー形態(「DNA分子」)、またはその任意のホスホエステルアナログ(例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル)のリン酸エステルポリマー形態をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とは、核酸(例えば、DNAまたはRNA)における一連のヌクレオチド塩基(「ヌクレオチド」ともいわれる)をいい、そしてこれらの用語は、2以上のヌクレオチドのあらゆる鎖を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「コード配列」または発現産物(例えば、RNA、ポリペプチド、タンパク質、または酵素)を「コードする」配列は、発現された場合にその産物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」とは、リボヌクレオチドもしくはアミノ酸の特定の配列(これは、RNA分子、タンパク質または酵素の全てまたは1つ以上の部分を含む)をコードするか、またはこれらの配列に対応し、かつ調節DNA配列(プロモーター配列)を含んでも、含まなくてもよいDNA配列を意味し、その調節DNA配列は、例えば、遺伝子が発現される条件を決定する。遺伝子は、DNAから、アミノ酸配列に翻訳され得るRNA、またはアミノ酸配列に翻訳されない可能性があるRNAへと転写され得る。
本明細書中で使用される場合、DNAの用語「増幅」とは、DNA配列の混合物内の特定のDNA配列の濃度を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用をいう。PCRの記載については、Saikiら、Science、(1988)、239:487を参照のこと。
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、目的とするゲノムDNA分子、cDNA分子、または遺伝子をコードするmRNA分子、mRNA、cDNA、もしくは他の核酸にハイブリダイズし得る、一般的には少なくとも10ヌクレオチド(例えば、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチドまたは14ヌクレオチド)、好ましくは少なくとも15ヌクレオチド(例えば、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチドまたは19ヌクレオチド)、そしてより好ましくは少なくとも20ヌクレオチド(例えば、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチドまたは30ヌクレオチド)、好ましくは100ヌクレオチド以下(例えば、40ヌクレオチド、50ヌクレオチド、60ヌクレオチド、70ヌクレオチド、80ヌクレオチドまたは90ヌクレオチド))からなる、核酸をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、32P−ヌクレオチド、3H−ヌクレオチド、14C−ヌクレオチド、35S−ヌクレオチド、または標識(例えば、ビオチン)が共有結合されているヌクレオチドを組み込むことによって、標識され得る。1つの実施形態において、標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド(その一方または両方が標識され得る)は、遺伝子の全長または遺伝子のフラグメントをクローニングすること、または核酸の存在を検出することのいずれかのために、PCRプライマーとして使用され得る。一般に、オリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸合成機にて、調製される。
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、細胞中でRNAポリメラーゼに(例えば、直接にか、または他のプロモーター結合タンパク質もしくはプロモーター結合物質を介して)結合可能であり、かつコード配列の転写を開始する、DNA調節領域を指す。プロモーター配列は、一般に、転写開始部位によってその3’末端で境界を接し、そして上流(5’方向)に延びて、任意のレベルで転写を開始するために必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。このプロモーター配列内には、転写開始部位(簡便には、例えば、ヌクレアーゼS1を用いるマッピングによって規定される)、ならびにRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が、見出され得る。このプロモーターは、他の発現制御配列(エンハンサー配列およびリプレッサー配列を含む)、または本発明の核酸と、作動可能に結合され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、RNA配列もしくはDNA配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと(例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること)を意味する。DNA配列は、細胞中でかまたは細胞によって、「発現産物」(例えば、RNA(例えば、mRNA)またはタンパク質(例えば、抗体またはそのフラグメント))を形成するように発現される。その発現産物自体はまた、その細胞によって「発現される」といわれ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、そして必要に応じて、導入された配列の、発現および/または複製を促進するように、DNA配列またはRNA配列が宿主細胞中に導入され得るビヒクル(例えば、プラスミド)を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」または「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と称され得る。その導入されるDNAまたはRNAを受容する宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるDNAまたはRNAは、任意の供給源由来であり得、これらの供給源は、宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、細胞による物質の生産(例えば、細胞による遺伝子、DNA配列もしくはRNA配列、タンパク質または酵素の、発現または複製)のために、選択されるか、改変されるか、トランスフェクトされるか、形質転換されるか、増殖させられるか、または任意の方法で使用されるか、もしくは操作される、任意の生物体の任意の細胞を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「発現系」は、ベクターによって運ばれそして宿主細胞に導入されるタンパク質または核酸を、適切な条件下で発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、E.coli宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。適切な細胞としては、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞、HeLa細胞ならびにNIH 3T3細胞およびNSO細胞(Ig非生産性のマウス骨髄腫細胞株)が挙げられる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸は、米国特許第4,952,496号;同第5,693,489号および同第5,869,320号ならびにDavanlooら、(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81、2035−2039;Studierら、(1986)J.Mol.Biol.189:113−130;Rosenbergら、(1987)Gene 56:125−135;およびDunnら、(1988)Gene 68:259(これらは、本明細書中に参考として援用される)に開示されるようなE.coli/T7発現系において、高レベルで発現され得る。
本明細書中で使用される場合、用語 ポリヌクレオチド配列の「配列保存的改変体」とは、所定のコドンの1つ以上のヌクレオチドの変化が、その位置においてコードされるアミノ酸の変化をもたらさない、改変体をいう。本発明の抗体の機能保存的改変体もまた、本発明によって企図される。本明細書中で使用される場合、用語「機能保存的改変体」とは、タンパク質または酵素中の1つ以上のアミノ酸残基が、そのポリペプチドの全体的な立体配座および機能を変えることなく変化された、改変体をいい、アミノ酸を同様の特性を有するアミノ酸で置換することを包含するが、これには、決して限定されない。同様の特性を有するアミノ酸は、当該分野で周知である。例えば、交換可能であり得る極性/親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられる;交換可能であり得る非極性/疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる;交換可能であり得る酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、交換可能であり得る塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「単離された核酸」または「単離されたポリペプチド」とは、細胞中において通常は見出される他の成分から部分的にかまたは完全に分離されているか、または組換えDNA発現系中にある、それぞれ、核酸(例えば、RNA分子もしくはDNA分子、または混合ポリマー)またはポリペプチドをいい得る。これらの成分としては、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分、および隣接ゲノム配列が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、この用語は、その天然に存在する環境から分離されている核酸を含み、そして組換えDNA単離物またはクローニングされたDNA単離物、および化学的に合成されたアナログまたは異種の系によって生物学的に合成されたアナログを含み得る。単離された核酸または単離されたポリペプチドは、好ましくは、本質的に均質な分子組成であるが、いくらかの不均質性を含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、全てのこのような改変(特に、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現することによって合成されるポリペプチドに存在するもの)を包含する。
本明細書中で使用される場合、用語「アンチセンス」とは、特定のDNA配列またはRNA配列と相補的であるヌクレオチド配列を有する任意の組成物をいう。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖と相補的である核酸鎖についての言及に使用される。アンチセンス分子は、ペプチド核酸を含み、そしてそのアンチセンス分子は、合成または転写を含む任意の方法によって産生され得る。一旦細胞に導入されると、相補ヌクレオチドは、その細胞によって産生される天然の配列と組み合わさって二重鎖を形成し、そして転写または翻訳のいずれかをブロックする。呼称「ネガティブ」は、ときに、アンチセンス鎖についての言及に使用され、そして「ポジティブ」は、ときに、センス鎖についての言及に使用される。
本明細書中で使用される場合、用語「抗原決定基」とは、特定の抗体との接触を行なう分子のフラグメント(すなわち、エピトープ)をいう。タンパク質またはタンパク質のフラグメントは、宿主動物を免疫化するために使用され、そのタンパク質の多くの領域は、そのタンパク質の所定の領域または三次元構造に対して特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る;これらの領域または構造は、抗原決定基と称される。抗原決定基は、抗体に対する結合に関して、インタクトな抗原(すなわち、免疫応答を誘発するために使用される免疫原)と競合し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体分子」は、抗体およびそのフラグメント(好ましくは、抗原結合フラグメント)を包含するが、これらに限定されない。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Fab抗体フラグメント、F(ab)2抗体フラグメント、Fv抗体フラグメント(例えば、VHまたはVL)、単鎖Fv抗体(scFv)フラグメント、およびdsFv抗体フラグメントを包含する。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、またはキメラ抗体であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「Koff」とは、抗体/抗原複合体からのその抗体の解離についての解離速度定数(off−rate constant)をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「Kon」とは、抗体が抗体と結合する速度をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「Kd」とは、特定の抗体/抗原相互作用の解離定数をいう。Kd=Koff/Kon。
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体(すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に存在する可能性がる変異を除いて同一である)をいう。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物(本質的に、他の免疫グロブリンによって汚染されていない)によって合成され得るという点で、有利である。修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られたものとしてのその抗体の特徴を示し、そしてその修飾語は、任意の特定の方法によるその抗体の産生を必要とするものとしては、解釈されるべきではない。上述されるように、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohlerら、(1975)Nature 256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって生成され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリクローナル抗体」とは、他の1つ以上の同一でない抗体とともに産生されたか、またはそのような抗体の存在下で産生された抗体をいう。一般に、ポリクローナル抗体は、Bリンパ球から、同一でない抗体を産生した他の数種のBリンパ球の存在下で産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化された動物から直接得られる。
本明細書中で使用される場合、用語「二重特異的抗体(bispecific antibody)または二機能性抗体」とは、2つの異なる重鎖/軽鎖の対および2つの異なる結合部位を有する、人工的なハイブリッド抗体をいう。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの連結を含む、種々の方法によって産生され得る。例えば、Songsivilaiら、(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315−321、Kostelnyら、(1992)J Immunol.148:1547−1553を参照のこと。さらに、二重特異的抗体は、「二重特異性抗体(diabody)」(Holligerら、(1993)PNAS USA 90:6444−6448)、または「Janusins」(Trauneckerら、(1991)EMBO J.10:3655−3659およびTrauneckerら、(1992)Int.J.Cancer 第7補遺:51−52)として形成され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「抗イディオタイプ抗体」または「抗イディオタイプ」とは、別の抗体分子の抗原結合領域または可変領域(イディオタイプと称される)に対する抗体をいう。Jerneら(Jerne,N.K.,(1974)Ann.Immunol.(Paris)125c:373およびJerne,N.K.ら、(1982)EMBO 1:234)により開示されるように、所定の抗原(例えば、MDL−1ペプチド)に対するパラト−プ(抗原結合部位)を発現する抗体分子による免疫化は、一群の抗抗体を生成し、その抗抗体のいくつかは、その抗原と、そのパラト−プに対する相補的構造を共有する。その抗イディオタイプ抗体の部分集団による免疫化は、その後、最初の抗原に対して反応性である、抗体の部分集団または免疫細胞部分集団を産生する。
本明細書中で使用される場合、用語「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体をいう。完全ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生される場合、マウス糖質鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。
「ヒト化」抗MDL−1ペプチド抗体もまた、本発明の範囲内にある。本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化」または「完全ヒト化」とは、ヒト抗体フレームワークに移植された、親抗体(例えば、マウス抗体)の6個の相補性決定領域(CDR)に由来するアミノ酸配列を含む抗体をいう。非ヒト(例えば、マウスまたはニワトリ)抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリンであり、これは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。大部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)(例えば、マウス、ニワトリ、ラット、またはウサギ)の相補性決定領域由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの場合において、そのヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基もまた、対応する非ヒト残基によって置換される。
本明細書中で使用される場合、用語「部分的ヒト化」抗体または「キメラ」抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結される、例えば、マウス起源の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体を意味する。
ヒト化の代わりとなるものは、ファージ上に提示されるヒト抗体ライブラリーまたはトランスジェニックマウスに含まれるヒト抗体ライブラリーを使用することである。例えば、Vaughanら、(1996)Nat.Biotechnol.14:309−314;Barbas、(1995)Nature Med.1:837−839;de Haardら、(1999)J.Biol.Chem.274:18218−18230;McCaffertyら、(1990)Nature 348:552−554;Clacksonら、(1991)Nature 352:624−628;Marksら、(1991)J.Mol.Biol.222:581−597;Mendezら、(1997)Nature Genet.15:146−156;HoogenboomおよびChames、(2000)Immunol.Today 21:371−377;Barbasら、(2001)Phage Display:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York;Kayら、(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA;de Bruinら、(1999)Nat.Biotechnol.17:397−399を参照のこと。
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト」とは、100%ヒト起源であるアミノ酸配列を含む抗体をいい、その抗体は、例えば、ヒト宿主、動物宿主、昆虫宿主、真菌宿主、植物宿主、細菌宿主、またはウイルス宿主において発現され得る(Bacaら、(1997)J.Biol.Chem.272:10678−10684;Clark、(2000)Immunol.Today 21:397−402)。
本発明は、別の、非ヒト種(例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ)由来の抗体領域(例えば、定常領域)と融合またはそれらとキメラ化される本発明の可変領域を含む抗体を意味する「キメラ抗体」を包含する。これらの抗体は、上記非ヒト種においてMDL−1の発現または活性を調節するために使用され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト/マウスキメラ抗体」とは、ヒト定常領域に融合されたマウス可変領域(VHおよおびVL)を含む抗体をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「単鎖Fv」抗体フラグメントまたは「sFv」抗体フラグメントは、抗体のVHドメインおよびVLドメインを有する抗体フラグメントを意味し、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、上記sFvポリペプチドは、このVHドメインとVLドメインとの間に、そのsFvが抗原結合のために望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーを、さらに含む。単鎖抗体の産生について記載された技術(米国特許第5,476,786号;同第5,132,405号および同第4,946,778号)は、抗MDL−1特異的単鎖抗体を産生するために適合され得る。sFvの概説について、Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113巻,Rosenburg and Moore編,Springer−Verlag,N.Y.,pp.269−315(1994)を参照のこと。
単鎖抗体、単一ドメイン抗体、および二重特異的抗体は、記載される(例えば、Maleckiら、(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213−218;Conrathら、(2001)J.Biol.Chem.276:7346−7350;Desmyterら、(2001)J.Biol.Chem.276:26285−26290、Kostelneyら、(1992)J.Immunol.148:1547−1553;米国特許第5,932,448号;同第5,532,210号;同第6,129,914号;同第6,133,426号;同第4,946,778号を参照のこと)。
本明細書中で使用される場合、用語「ジスルフィド安定化Fvフラグメント」および「dsFv」とは、ジスルフィド架橋によって連結された可変重鎖(VH)および/または可変軽鎖(VL)を有する抗体分子をいう。
本発明の組成物の「有効量」は、MDL−1レセプターもしくはその機能的フラグメントによって引き起こされるかまたは媒介される医学的状態を特徴付ける周知のパラメータのうちの、1つ以上を改善する量であり得る。「有効量」によって、外科的除去のための腫瘍縮小または腫瘍の消失をもたらすために、腫瘍の浸潤性白血球上に発現される標的抗原(例えば、MDL−1)に結合するのに必要とされる抗体の量または濃度もまた、意味される。
(発明の詳細な説明)
本発明は、細胞または組織におけるMDL−1発現のレベルと、コントロールにおけるMDL−1発現レベルとを比較することによって、腫瘍(特に、固形腫瘍、皮膚の腫瘍(例えば、黒色腫)、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)を検出するための方法、腫瘍を診断するための方法、腫瘍を位置決定するための方法、および腫瘍を画像化するための方法に関し、これらの方法は、定量的および定性的の両方である。
本発明は、細胞または組織におけるMDL−1発現のレベルと、コントロールにおけるMDL−1発現レベルとを比較することによって、腫瘍(特に、固形腫瘍、皮膚の腫瘍(例えば、黒色腫)、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)を検出するための方法、腫瘍を診断するための方法、腫瘍を位置決定するための方法、および腫瘍を画像化するための方法に関し、これらの方法は、定量的および定性的の両方である。
本発明はまた、細胞または組織におけるMDL−1発現のレベルと、コントロールにおけるMDL−1発現のレベルとを比較することによって、癌を検出するための診断アッセイおよび診断方法、癌を診断するための診断アッセイおよび診断方法、癌を位置決定するための診断アッセイおよび診断方法、ならびに癌を画像化するための診断アッセイおよび診断方法に関し、これらの診断アッセイおよび診断方法は、定量的および定性的の両方である。
本発明は、腫瘍(特に、固形腫瘍(例えば、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍))に関連するMDL−1発現の上昇したレベルを検出することによって、癌を検出するための診断アッセイおよび診断方法、癌を診断するための診断アッセイおよび診断方法、癌を位置決定するための診断アッセイおよび診断方法、ならびに癌を画像化するための診断アッセイおよび診断方法に関し、これらの診断アッセイおよび診断方法は、定量的および定性的の両方である。
本発明は、正常なコントロールに対する、皮膚癌(例えば、黒色腫)、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌におけるMDL−1の高い発現の検出に関する。MDL−1の発現は、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍に由来する腫瘍組織において、著しく増大または上昇する。
第I期、第II期、または第III期/第IV期の黒色腫を有する患者;第I期、第II期、または第III期/第IV期の卵巣癌を有する患者;第I期、第II期、または第III期/第IV期の乳癌を有する患者;第I期、第II期、または第III期/第IV期の結腸直腸の癌を有する患者;第I期/第II期および第III期/第IV期の腎臓癌を有する患者;ならびに第I期、第II期、第III期または第IV期の胃癌を有する患者に由来する、対応した正常/腫瘍サンプルにおけるMDL−1の発現は、腫瘍組織における高レベルのRNA発現を示し、このことは、MDL−1が、皮膚癌(例えば、黒色腫)、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓癌(例えば、腎臓の癌)および胃癌の検出のための有用なマーカーであることを示唆する。
腫瘍または腫瘍組織において同定されたMDL−1発現の上昇したレベルは、その腫瘍内部に存在する腫瘍浸潤性白血球(例えば、それらは、骨髄系列の細胞またはマクロファージである)上のMDL−1の発現に起因すると考えられる。MDL−1ポジティブな白血球の大多数はまた、マクロファージ/単球マーカーのCD68、CD11bおよびCD206を発現し得る。
用語「MDL−1」、「骨髄性DAP12結合レクチン−1」、「骨髄性DAP12結合型レクチン−1(Myeloid DAP12−associated レクチン−1)」、「DAP−12」、「DAP12」、「DNAX活性化タンパク質,12kD」は、当該分野において周知である。上記ヒトおよびマウスのDAP12ならびにMDL−1のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、WO 99/06557に開示される。上記ヒトMDL−1ヌクレオチド配列および上記ヒトMDL−1アミノ酸配列は、それぞれ、WO 99/06557の配列番号11および配列番号12によって規定される。ヒトMDL−1核酸配列(AR217548)ならびにマウスMDL−1核酸配列およびマウスMDL−1アミノ酸配列(それぞれ、AR217549およびAAN21593)のGenBank(登録商標)寄託物もまた、利用可能である。下の表1は、適切な配列識別子を提供する。
MDL−1の可溶性形態もまた、本発明の範囲内である。MDL−1タンパク質の構造的特徴は、その細胞外ドメインであり、その細胞外ドメインは、配列番号2のヒトMDL−1タンパク質のアミノ酸残基26〜188、および配列番号4のマウスMDL−1タンパク質のアミノ酸残基26〜190によって規定される。MDL−1の可溶性形態(すなわち、可溶性MDL−1ポリペプチドまたは可溶性MDL−1タンパク質)は、上記細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む。可溶性MDL−1ポリペプチドは、MDL−1抗体の使用もしくはその抗原結合フラグメントの使用に類似する治療剤または診断剤として使用され得る。
癌についてのスクリーニング、腫瘍または癌の検出、および癌の診断は、スクリーニング、試験および身体検査を包含し得る。癌の診断および腫瘍の検出は、臨床手順および外科的手順の両方を含み得る。癌についてのスクリーニング、腫瘍の検出および癌の診断は、スキャン(例えば、骨スキャン)、またはその癌またはその腫瘍を検出する他の画像試験(例えば、コンピュータ連動断層撮影(CT)または磁気共鳴画像法(MRI))を使用し得る。超音波スキャニング法は、内部器官の構造を示す音波を使用し、そしてその超音波スキャニング法は、特に、腎臓、肝臓、骨盤、および前立腺の特定の癌または腫瘍を同定してそのの大きさを決定するために有用である。CTスキャニング法は、身体の多くの部分において癌または腫瘍を検出するために使用され得る。このような検出は、癌を診断および病期分類するのに有用である。MRIは、CTに代わるものである。この手順に関して、非常に強力な磁場が、鮮明で詳細な解剖学的画像をもたらす。陽電子断層撮影法(PET)もまた、癌の診断を補助するためか、または腫瘍を検出するために使用され得る。PETスキャンは、癌内部の生化学的プロセスを測定することによって癌を画像化する。生検がまた、画像試験において発見された異常が癌または腫瘍であることを確認するために行われ得る。
患者において症状が存在する前の癌についてのスクリーニングは、重要であり得る。なぜならそのスクリーニングは、医師が、癌を早期に見出してそれを処置するのを補助し得るからである。初期の癌は、通常、患者に疼痛をもたらさない。癌の処置は、癌が早期(すなわち、初期;局在期)に検出される場合、より有効であるようである。
病期分類は、最初の腫瘍(原発性腫瘍)の広がりおよび身体における拡散の程度に基づく、個体の癌の広がりまたは重症度を記載する。病期分類は、癌が発症する様式の知識に基づく。癌細胞は制御も命令もなく***および成長して、増殖(growth)または腫瘍と称される組織の塊を形成する。腫瘍が増殖する場合、その腫瘍は、近傍の器官および近傍の組織を侵し得る。癌細胞はまた、腫瘍から離れて、血流およびリンパ系に進入し得、このことは、癌細胞が原発部位から拡散して、他の器官において新しい腫瘍を形成することを可能にする。上記癌の拡散は、転移と称される(National Cancer Institute、Staging:Questions and Answers,Fact Sheet 5.32(2004年1月6日に再考された)(2004))。
ほとんどの病期において考慮される共通の要素は、原発性腫瘍の位置、腫瘍の大きさおよび腫瘍の数、リンパ節浸潤、細胞型および腫瘍のグレード、ならびに転移の有無である。TNMシステム(最も一般的に使用される病期分類システムの1つ)は、腫瘍の広がり(T)、リンパ節への拡散の程度(N)、および転移の存在(M)に基づく。数が、腫瘍の大きさまたは広がり、および拡散の程度を示すために加えられる(National Cancer Institute、Staging:Questions and Answers、Fact Sheet 5.32(2004年1月6日に再考された)(2004))。
多くの癌登録機関(例えば、National Cancer Institutes Surveillance,Epidemiology,and End Results Program(SEER))は、要約分類(summary staging)を使用する。このシステムは、全ての型の癌について使用され、そしてそのシステムは、癌症例を5つの主要なカテゴリーに分類し、それらのカテゴリーは、以下である:(a)上皮内(in situ)(これは、癌が起こった細胞の層にのみ存在する早期の癌である)、(b)限局(localized)(これは、癌が起こった器官に限定され、拡散の形跡を伴わない癌である)、(c)局所(regional)(これは、最初の部位(原発部位)を越えて近傍の節または器官および組織に拡散した癌である)(d)遠隔(distant)(これは、原発部位から遠隔器官または遠隔リンパ節に拡散した癌である)、および(e)不明(これは、病期を割り当てるための十分な情報が存在しない癌を記載するために使用される)(National Cancer Institute,Staging:Questions and Answers、Fact Sheet 5.32(2004年1月6日に再考された)(2004))。
病期分類のための試験の型は、癌の型に依存する。スクリーニング試験および検出試験は、以下を含み得る:(a)身体検査(これは、癌についての情報を収集するために使用される)、(b)画像研究(これは、身体の内側の領域の画像をもたらすために使用され、そしてX線、コンピュータ連動断層撮影(CT)スキャン、磁気共鳴(MRI)スキャン、および陽電子断層撮影(PET)スキャンなどの手順を含み、それらの手順は、癌の位置、腫瘍の大きさ、および癌が拡散しているか否かを示し得る)、(c)身体から取得した血液、尿、他の流体および組織の検査室検査、(d)病理報告(これは、腫瘍の大きさ、腫瘍の増殖、癌細胞の型、および腫瘍のグレード(その癌細胞が正常組織にどの程度近く似ているのか)についての情報を含み得、生検(顕微鏡下における検査のための細胞または組織の除去)は、病理報告に情報を提供するために行われ得る)、および(e)腫瘍の大きさおよび外観の説明のような外科手術の間に見出されるものを記載する外科的報告(National Cancer Institute、Staging:Questions and Answers,Fact Sheet 5.32(2004年1月6日に再考された)(2004))。
癌組織は、当該分野で周知の方法を使用して、診断されそして病期分類され得る。例えば、Greeneら(編)、(2002)AJCC Cancer Staging Manual,Springer−Verlag,New York,NYを参照のこと。
癌の処置または治療に対する固形腫瘍の応答は、Theraseeら(Therasseら、(2000)J.of the National Cancer Institute 92:205−216)によって記載された指針に従い、当業者によって評価され得る。
個体におけるMDL−1遺伝子の発現レベルまたはMDL−1遺伝子産物の発現レベルを評価するアッセイは、患者由来の生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成能に関する情報を提供する。例えば、MDL−1 mRNAは、黒色腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸の癌、腎臓癌および胃癌において高度に発現され、かつ対応した正常組織においては高度に発現されないので、生物学的サンプル中のMDL−1 mRNA転写物の相対レベルまたはMDL−1タンパク質の相対レベルを評価するアッセイが、MDL−1の増加した発現に関連する疾患(例えば、癌)を診断するために使用され得、そしてそのアッセイは、適切な治療選択肢を定義するのに有用な予後判定情報を提供し得る。
MDL−1 mRNAが、癌において高度に発現され、かつ対応した正常組織においては高度に発現されないという知見は、この遺伝子が、腫瘍または癌性細胞の増殖に関連するという証拠を提供し、したがってその知見は、この遺伝子およびその産物を、当業者が、MDL−1の増加した発現に関連した疾患を有すると疑われる個体由来の生物学的サンプルを評価するために使用し得る、標的として同定する。
MDL−1の発現レベルは、特定の疾患状態(例えば、進行および/または腫瘍の攻撃性)に対する感受性を予測するために有用な情報を提供し得る。本発明は、MDL−1発現レベルを決定するため、およびMDL−1を発現する癌(例えば、皮膚癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌)を診断するための、方法ならびにアッセイを提供する。患者サンプルにおけるMDL−1発現レベルは、当該分野において周知である多くの手段によって分析され得、その手段としては、免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションしたサンプルに対するRT−PCR分析、臨床サンプルおよび細胞株のウェスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本発明は、個体において癌の存在を決定するのに有用なアッセイを提供し、そのアッセイは、試験細胞サンプルもしくは試験組織サンプルにおけるMDL−1 mRNA発現またはMDL−1タンパク質発現の、対応するコントロール細胞またはコントロール組織における発現レベルに対する増加を検出することを包含する。MDL−1 mRNAの存在は、例えば、組織サンプルにおいて評価され得、その組織サンプルとしては、皮膚、***、結腸、直腸、卵巣、腎臓および胃が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組織のうちのいずれかにおける高いMDL−1発現の存在は、これらの癌の出現、存在および局在を示すのに有用である。なぜなら、対応する正常組織は、より低いレベルにてMDL−1 mRNAを発現するからである。
別の実施形態において、MDL−1発現レベルは、核酸レベルにおいてよりもむしろ、タンパク質レベルにおいて決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現されたMDL−1タンパク質のレベルを決定すること、およびそうして決定されたレベルを、対応するコントロールサンプルにおいて発現されたMDL−1のレベルと比較することを包含する。1つの実施形態において、MDL−1タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学的方法を使用して評価される。MDL−1抗体、またはMDL−1タンパク質発現を検出し得る結合パートナーが、この目的のために、当該分野において周知である種々のアッセイ形式で使用され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「MDL−1発現のレベル」、「測定されたMDL−1発現のレベル」、「MDL−1発現のレベルの測定」は、細胞もしくは組織において発現されるMDL−1核酸のレベルまたはMDL−1ポリペプチドのレベルを意味する。例えば、配列番号1および配列番号3の任意のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によって発現されるポリペプチド。あるいは、この用語は、例えば、配列番号1および配列番号3のうちのいずれかのポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のうちのいずれかによってコードされるネイティブmRNAのレベル、または例えば、配列番号1および配列番号3のポリヌクレオチド配列のうちのいずれかを含む遺伝子のレベルを意味し得る。このようなレベルは、好ましくは、患者に由来する以下のうちの少なくとも1つにおける正常レベルおよび異常レベルの決定を含んで測定される:細胞、組織、および/または体液。したがって、例えば、コントロールの正常体液サンプル、コントロールの正常細胞サンプル、もしくはコントロールの正常組織サンプルと比較してMDL−1発現のレベルまたはMDL−1タンパク質のレベルの変化を測定するための、本発明に従う診断アッセイは、癌の存在を診断するために使用され得、その癌としては、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌、胃癌および悪性黒色腫が挙げられる。さらに、コントロールの正常体液サンプル、コントロールの正常細胞サンプル、もしくはコントロールの正常組織サンプルと比較してMDL−1発現のレベルまたはMDL−1タンパク質のレベルの変化を測定するための、本発明に従う診断アッセイは、腫瘍の存在を診断するために使用され得、その腫瘍としては、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍、および胃の腫瘍が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、上記腫瘍は、固形腫瘍である。
「変化」によって、MDL−1発現のレベルの上昇が意味される。例えば、コントロールと比較した場合のレベルの上昇は、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌、胃癌および黒色腫に関連する。例えば、コントロールと比較した場合のレベルの上昇は、腫瘍の存在、腫瘍の増殖に関連し、その腫瘍としては、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍、胃の腫瘍が挙げられる。好ましい実施形態において、上記腫瘍は、固形腫瘍である。
「〜倍の増加(増加倍数)(fold increase)」によって、一般的に、メジアンの発現値が、コントロールより2倍以上(3倍、または4倍を含む)高いか、コントロールの値より5倍以上(6倍、7倍、8倍、または9倍を含む)高いか、より好ましくはコントロールより10倍以上(11倍、12倍、13倍、または14倍を含む)高いか、コントロールより15倍以上(16倍、17倍、18倍、または19倍を含む)高いか、コントロールより20倍以上(21倍、22倍、23倍、または24倍を含む)高いか;またはコントロールより25倍以上高いことが意味される。
MDL−1発現のレベルの上昇は、一般的に、コントロールの2倍〜5倍以上の範囲にあるか;コントロールの5倍〜10倍以上の範囲にあるか;コントロールの15倍〜20倍以上の範囲にあるか;またはコントロールの20倍〜25倍以上の範囲にある。
MDL−1 mRNAまたはMDL−1タンパク質の発現を検出するための方法およびMDL−1 mRNAまたはMDL−1タンパク質の発現を定量化するための方法は、本明細書中に記載され、そしてそれらの方法は、当該分野において周知である、標準的な核酸検出技術およびタンパク質検出技術ならびに定量化技術を使用する。MDL−1 mRNAの検出および定量化のための標準的な方法としては、標識されたMDL−1リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、MDL−1ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連技術、MDL−1に特異的なプライマーを使用するRT−PCR分析、および例えば、分岐DNA、SISBA、TMAなどのような他の増幅型検出方法が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的RT−PCRが、以下の実施例において記載されるように、MDL−1 mRNA発現を、検出および定量化するために使用され得る。MDl−1を増幅し得る任意の数のプライマーが、この目的のために使用され得、そのプライマーとしては、本明細書中に具体的に記載される種々のプライマーセットが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の検出および定量化のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の実施形態において、野生型MDL−1タンパク質と特異的に反応性であるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。
細胞表面におけるMDL−1の発現は、この分子が、抗体ベースの治療ストラテジーのための魅力的な標的であることを示す。MDL−1の細胞外ドメインと特異的に反応性である抗体は、毒素もしくは治療因子との結合体、または細胞の増殖もしくは機能を阻害し得るそのまま(naked)の抗体のいずれかとして、腫瘍に存在するMDL−1ポジティブな細胞を処置するために有用であり得る。上記細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含むレセプターの可溶性形態は、毒素もしくは治療因子との結合体、または上記リガンドの結合に関して競合するかもしくは上記MDL−1/DAP12レセプター複合体の形成と競合することによって細胞間のシグナル伝達を阻害し得るそのまま(naked)の可溶性タンパク質のいずれかとして、腫瘍に存在するMDL−1ポジティブな細胞を処置するために有用であり得る。
MDL−1抗体は、患者に対して導入され得、その結果、上記抗体は、上記腫瘍に存在する上記癌細胞浸潤性白血球上のMDL−1もしくは上記腫瘍浸潤性白血球上のMDL−1に結合して、その細胞およびその腫瘍の破壊を媒介し、そして/またはその細胞もしくはその腫瘍の増殖を阻害する。このような抗体が治療効果を発揮する機構は、補体媒介性の細胞溶解、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、MDL−1の生理学的機能の調節、リガンド結合の阻害もしくはシグナル伝達経路の阻害、腫瘍細胞の分化の調節、腫瘍新脈管形成因子のプロフィールの変化を含み得、そして/またはその機構は、アポトーシスの誘導により得る。MDL−1抗体は、毒性因子または治療因子と結合体化され得、そしてその抗体は、上記腫瘍に関連するMDL−1を有する腫瘍細胞もしくはMDL−1を有する細胞に対して、その毒性因子または治療因子を直接送達するために使用され得る。毒性因子の例としては、カルケミシン(calchemicin)、マイタンシノイド(maytansinoid)、および放射性同位体が挙げられるが、これらに限定されない。
抗MDL−1抗体を使用する癌免疫療法は、他の型の癌の処置に首尾よく利用されている種々のアプローチからもたらされる教示に従い得、他の型の癌としては、結腸癌(Arlenら、1998、Crit.Rev.Immunol.18:133−138)、多発性骨髄腫(Ozakiら、1997、Blood 90:3179−3186;Tsunenariら、1997、Blood 90:2437−2444)、胃の癌(Kasprzykら、1992、Cancer Res.52:2771−2776)、結腸直腸の癌(Mounら、1994、Cancer Res.54:6160−6166;Veldersら、1995、Cancer Res.55:4398−4403)、および乳癌(Shepardら、1991、J.Clin.Immunol.11:117−127)が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的なMDL−1の画像化、またはMDL−1発現の存在および程度を容易に示し得る他の技術を使用して、MDL−1発現の存在およびレベルについて評価されることが、ある癌患者に対しては望まれ得る。腫瘍生検または外科的検体の免疫組織化学的分析が、この目的に関して好まれ得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野において周知である。
本発明はまた、MDL−1を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用、および特定の癌性の固形腫瘍(例えば、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)に関連するMDL−1タンパク質の可溶性形態または可溶性MDL−1タンパク質の使用に関する。これらの抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは可溶性MDL−1タンパク質は、標識され得、そして癌性組織(特に、固形腫瘍に由来する癌性組織または浸潤性白血球を含む癌性組織(これらは、MDL−1を発現する))の検出に使用され得る。上記標識された抗体、または標識された可溶性MDL−1タンパク質は、腫瘍(特に、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍、または浸潤性白血球を含む腫瘍(これらは、MDL−1を発現する))を、検出し、診断し、位置決めし、そして画像化するために使用され得る。
上記標識された抗体、または標識された可溶性MDL−1タンパク質は、癌性の固形腫瘍の存在を検出するために使用され得る。それらはまた、癌に対する治療としてインビトロおよびインビボの両方で、細胞の増殖を阻害するか、または細胞(好ましくは、腫瘍に関連する細胞)を消散させるかもしくは殺すのに有効な物質に結合されて、使用され得る。本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、腫瘍に存在する腫瘍浸潤性白血球上のMDL−1を標的すると考えられる。本発明の可溶性MDL−1タンパク質はまた、腫瘍に存在する腫瘍浸潤性白血球中のMDL−1リガンドを標的すると考えられる。
(診断アッセイ)
本発明は、好ましくはコントロール由来の同じ型の細胞、組織または体液におけるMDL−1レベルと比較して、試験細胞、試験組織または試験体液におけるMDL−1の発現レベルを分析することによって癌の存在を診断するための方法を、提供する。本明細書中に示されるように、コントロールに対する患者におけるMDL−1(例えば、配列番号2)発現のレベルの上昇は、癌の存在に関連する。好ましい実施形態において、上記癌は、(上記腫瘍が局在して増殖する)固形腫瘍(例えば、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)に関連する。
本発明は、好ましくはコントロール由来の同じ型の細胞、組織または体液におけるMDL−1レベルと比較して、試験細胞、試験組織または試験体液におけるMDL−1の発現レベルを分析することによって癌の存在を診断するための方法を、提供する。本明細書中に示されるように、コントロールに対する患者におけるMDL−1(例えば、配列番号2)発現のレベルの上昇は、癌の存在に関連する。好ましい実施形態において、上記癌は、(上記腫瘍が局在して増殖する)固形腫瘍(例えば、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)に関連する。
代表的に、定量的診断アッセイに関して、癌を有する試験された患者を示すポジティブな結果は、その細胞、組織、または体液が、少なくとも2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍高いMDL−1発現レベルを有する患者であることである。
宿主に由来するサンプル中において本発明のMDL−1のような遺伝子の発現のレベルを決定するために使用され得るアッセイ技術は、当業者にとって周知である。このようなアッセイ方法としては、放射免疫アッセイ、逆転写酵素PCR(RT−PCR)アッセイ、定量的リアルタイムPCRアッセイ、免疫組織化学アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、ELISAアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ(例えば、腫瘍関連マクロファージのMl表現型分析(phenotyping)に対するM2表現型分析についての二色FACS分析(Mantovaniら、(2002)TRENDS in Immunology 23:549−555))が挙げられる。
ELISAアッセイは、最初に、MDL−1に特異的な抗体(好ましくは、モノクローナル抗体)を調製することを包含する。さらに、MDL−1と特異的に結合するレポーター抗体が、一般的には調製される。上記レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または酵素試薬(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ)のような検出可能な試薬に結合される。
上記ELISAを実施するために、MDL−1に特異的な抗体が、その抗体を結合する固体支持体(例えば、ポリスチレンディッシュ)上でインキュベートされる。次いでディッシュ上のあらゆる空いている(free)タンパク質結合部位は、非特異的タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)と一緒にインキュベートすることによって覆われる。次に、分析されるべきサンプルが、上記ディッシュにおいてインキュベートされる。その間に、ポリスチレンディッシュに結合された特異的抗体にMDL−1が結合する。結合されていないサンプルは、緩衝液によって洗い落とされる。MDL−1を特異的に指向しかつ西洋ワサビペルオキシダーゼに連結されたレポーター抗体が、上記ディッシュに配置され、MDL−1に結合されたあらゆるモノクローナル抗体に対するレポーター抗体の結合を生じる。次いで結合されていない抗体は、洗い落とされる。次いで、発色基質(calorimetric substrate)を含むペルオキシダーゼ活性に対する試薬が、上記ディッシュに添加される。MDL−1抗体に連結され固定化されたペルオキシダーゼは、有色の反応生成物を生成する。所定の時間内に発生した色の量は、サンプルに存在するMDL−1タンパク質の量と比例する。定量的な結果は、代表的に、標準曲線を参照することによって得られる。
競合アッセイが、利用され得、そのアッセイにおいて、MDL−1に特異的な抗体が、固体支持体に結合され、標識されたMDL−1、および宿主に由来するサンプルが、その固体支持体上を通され、そしてその固体支持体に結合された検出された標識の量は、そのサンプル中のMDL−1の量に相関し得る。
ハイブリダイゼーションプローブとして本発明のMDL−1の核酸配列の全てまたは一部を使用して、核酸の方法もまた、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍、および胃の腫瘍を含む腫瘍のマーカーとして、MDL−1 mRNAのレベルを検出するために使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および他の核酸の方法(例えば、リガーゼ連鎖反応(LCR)および核酸配列ベースの増幅(nucleic acid sequence based amplification)(NASBA))が、種々の悪性疾患の診断およびモニタリングのために細胞を検出するために使用され得る。例えば、特定のmRNA集団の存在を多くの他のmRNA種の複雑な混合物において検出するために使用され得る逆転写酵素PCR(RT−PCR)は、強力な技術である。RT−PCRにおいて、mRNA種は、最初に、酵素である逆転写酵素の使用によって相補DNA(cDNA)に逆転写される;次いでそのcDNAは、標準的なPCR反応においてのように増幅される。したがって、RT−PCRは、増幅によって、単一のmRNA種の存在を示す。したがって、上記mRNAがそれを産生する細胞について高度に特異的である場合、RT−PCRは、特定の型の細胞の存在および/または非存在を同定するために使用され得る。
固体支持体上に配列(すなわち、グリッディング(gridding))されたクローンまたはオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、その発現の検出、およびその遺伝子の発現レベルの定量化の両方のために使用され得る。このアプローチにおいて、MDL−1をコードするcDNAの全部または一部が、基材に固定される。上記基材は、任意の適切な型であり得、その型としては、ガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックが挙げられるが、これらに限定されない。MDL−1をコードするDNAの少なくとも一部は、上記基材に結合され、次いで目的の組織から単離されたRNAのRNAコピーまたは相補DNA(cDNA)コピーであり得る分析物と一緒にインキュベートされる。基材に結合されたDNAと上記分析物との間のハイブリダイゼーションは、数種の手段によって検出および定量化され得、その手段としては、その分析物の放射標識化もしくは蛍光標識化、または上記ハイブリッドを検出するように設計された二次的分子が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子発現のレベルの定量化は、比較される分析物からのシグナル強度と、既知の標準物から決定されるシグナル強度との比較によって行われ得る。上記標準物は、標的遺伝子のインビトロ転写を行い、その収量を定量化し、次いで標準曲線を作成するためにその材料を使用することによって、得られ得る。
上記試験は、種々の細胞、体液および/または組織抽出物(例えば、患者から得られたホモジネートまたは可溶化した組織)に由来するサンプルに対して実施され得る。組織抽出物は、組織生検および剖検材料から慣習的に得られる。本発明において有用な体液としては、血液、尿、唾液もしくは任意の他の身体の分泌物またはそれらの誘導体が挙げられる。用語「血液」は、全血、血漿、血清または血液の任意の誘導体を含むことを意味する。
(MDL−1のインビボにおける標的化/癌治療)
MDL−1の固形腫瘍との関係の同定もまた、癌、および特に、固形腫瘍に関連する癌(例えば、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌、胃癌および皮膚癌(例えば、黒色腫))を画像化する新規治療、およびその癌を処置する新規治療の合理的な設計に有用である。
MDL−1の固形腫瘍との関係の同定もまた、癌、および特に、固形腫瘍に関連する癌(例えば、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌、胃癌および皮膚癌(例えば、黒色腫))を画像化する新規治療、およびその癌を処置する新規治療の合理的な設計に有用である。
本発明はまた、ヒトMDL−1(例えば、配列番号2)のようなMDL−1を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関し、そのMDL−1は、特定の固形腫瘍(例えば、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍)に関連する。これらの抗体またはその抗原結合フラグメントは、標識され得、そして癌性組織(特に、固形腫瘍に由来する癌性組織または浸潤性白血球を含む癌性組織(これらは、MDL−1を発現する))の検出のために使用され得る。上記標識された抗体は、固形腫瘍の存在を検出するために使用され得る。それらはまた、癌に対する治療として、このような細胞を消散させるかまたは殺すのに有効な物質に結合されて、使用され得る。
例えば、1つの実施形態において、MDL−1に結合する抗体が、惹起され得、そしてその抗体は、癌を罹患すると疑われる患者において、インビボで使用され得る。MDL−1を結合する抗体は、診断目的および/または治療目的のために、癌を有すると疑われる患者に対して注射され得る。したがって、本発明の別の局面は、癌の処置を必要とするヒト患者において、その患者に抗体の有効量を投与することによって癌を処置するための方法を提供する。
インビボでの診断および処置のための抗体の調製ならびに使用は、当該分野において周知である。例えば、インジウム−111によって標識された抗体−キレート剤が、腫瘍を表す癌胎児抗原の放射免疫シントグラフィーによる画像化における使用について記載されている(Sumerdonら、Nucl.Med.Biol.1990 17:247−254)。特に、これらの抗体−キレート剤は、再発性の結腸直腸の癌を有すると疑われる患者において腫瘍を検出するのに使用されている(Griffinら、J.Clin.One.1991 9:631−640)。磁気共鳴画像法において使用するための標識として常磁性イオンを有する抗体がまた、記載されている(Lauffer、R.B.Magnetic Resonance in Medicine 1991 22:339−342)。MDL−1に対する抗体は、類似の様式で使用され得る。MDL−1を結合する標識された抗体は、癌を有すると疑われる患者に対して、患者の疾患状態を診断する目的のために注射され得る。使用される標識は、使用されるべき画像化様式によって選択される。例えば、放射標識(例えば、インジウム−111、テクネチウム−99mまたはヨウ素−131)は、平面スキャン(planar scan)またはシングルフォトンエミッションコンピュータ連動断層撮影(SPECT)のために使用され得る。陽電子放出性の標識(例えば、フッ素−19)は、陽電子断層撮影法において使用され得る。常磁性イオン(例えば、ガドリニウム(III)またはマンガン(II))は、磁気共鳴画像法(MRI)において使用され得る。上記標識の存在は、正常組織の画像化と比較した場合、癌の拡散の決定を許容する。器官内または組織内の標識の量はまた、その器官もしくは組織における癌の有無の決定を可能にする。
(遺伝子治療)
本発明は、遺伝子治療の公知の技術を使用してMDL−1ポリペプチドの可溶性形態またはそのフラグメントを産生する、手段を提供する。可溶性MDL−1ポリペプチドは、MDL−1ポリペプチドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む。方法は、MDL−1の可溶性ポリペプチドもしくはMDL−1の可溶性タンパク質フラグメント、または可溶性MDL−1をコードする核酸分子、および可溶性MDL−1ポリペプチドを発現して適切に提供することが可能な組換えベクターを利用することによって、容易に実施され得る。
本発明は、遺伝子治療の公知の技術を使用してMDL−1ポリペプチドの可溶性形態またはそのフラグメントを産生する、手段を提供する。可溶性MDL−1ポリペプチドは、MDL−1ポリペプチドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む。方法は、MDL−1の可溶性ポリペプチドもしくはMDL−1の可溶性タンパク質フラグメント、または可溶性MDL−1をコードする核酸分子、および可溶性MDL−1ポリペプチドを発現して適切に提供することが可能な組換えベクターを利用することによって、容易に実施され得る。
(キット)
上に記載される診断適用および治療適用において使用するために、キットもまた、本発明によって提供される。このようなキットは、緊密に(close confinement)1以上の容器手段(例えば、バイアル、チューブなど)を受容する仕切られたキャリア手段を備え得、その容器手段の各々は、上記方法において使用されるべき別個のエレメントのうちの1つを備える。例えば、上記容器手段のうちの1つは、検出可能に標識されたプローブを備えても、検出可能に標識され得るプローブを備えてもよい。このようなプローブは、抗体またはポリヌクレオチドであり得、それらは、それぞれ、MDL−1タンパク質またはMDL−1遺伝子もしくはMDL−1メッセージに特異的であり得る。上記キットが、標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、そのキットはまた、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを備える容器、および/またはレポーター分子(例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識)に結合されたレポーター手段(例えば、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質)を備える、容器を有し得る。
上に記載される診断適用および治療適用において使用するために、キットもまた、本発明によって提供される。このようなキットは、緊密に(close confinement)1以上の容器手段(例えば、バイアル、チューブなど)を受容する仕切られたキャリア手段を備え得、その容器手段の各々は、上記方法において使用されるべき別個のエレメントのうちの1つを備える。例えば、上記容器手段のうちの1つは、検出可能に標識されたプローブを備えても、検出可能に標識され得るプローブを備えてもよい。このようなプローブは、抗体またはポリヌクレオチドであり得、それらは、それぞれ、MDL−1タンパク質またはMDL−1遺伝子もしくはMDL−1メッセージに特異的であり得る。上記キットが、標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、そのキットはまた、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを備える容器、および/またはレポーター分子(例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識)に結合されたレポーター手段(例えば、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質)を備える、容器を有し得る。
本発明のキットは、代表的に、上に記載される容器、ならびに商業的見地および使用者の見地から所望される材料(緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための指示書を備えるパッケージ挿入物が挙げられる)を備える1以上の他の容器を備える。ラベルは、上記組成物が特定の治療または非治療用途に使用されることを示すために、容器上に存在し得、そしてそのラベルはまた、上に記載されるようなインビボまたはインビトロのいずれかでの使用法を示し得る。
(分子生物学)
本発明に従って、当業者の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術が使用され得る。そのような技術は、文献中に完全に説明される。例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本明細書中では「Sambrookら、1989」);DNA Cloning:A Practical Approach,第I巻および第II巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984.;Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1985));Transcription And Translation(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney編(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,(1986));B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubelら(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(1994)を参照のこと。
本発明に従って、当業者の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術が使用され得る。そのような技術は、文献中に完全に説明される。例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本明細書中では「Sambrookら、1989」);DNA Cloning:A Practical Approach,第I巻および第II巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984.;Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1985));Transcription And Translation(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney編(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,(1986));B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubelら(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(1994)を参照のこと。
本発明は、本発明のMDL−1抗体の組換えバージョンまたは本発明の抗原結合フラグメントの組換えバージョンを包含する。
特定の実施形態において、本発明は、MDL−1をコードする核酸、可溶性MDL−1をコードする核酸、抗MDL−1抗体をコードする核酸、抗MDL−1抗体重鎖もしくは抗MDL−1抗体軽鎖をコードする核酸、抗MDL−1抗体重鎖可変領域もしくは抗MDL−1軽鎖可変領域をコードする核酸、抗MDL−1抗体重鎖定常領域もしくは抗MDL−1抗体軽鎖定常領域をコードする核酸、または抗MDL−1抗体CDR(例えば、CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3、CDR−H1、CDR−H2またはCDR−H3)をコードする核酸を包含し、その核酸は、PCRによって増幅され得る。
任意の核酸(例えば、MDL−1遺伝子をコードする核酸、あるいは抗MDL−1抗体またはそのフラグメントもしくは部分をコードする核酸)の配列は、当該分野で公知の任意の方法(例えば、化学的配列決定または酵素的配列決定)によって、配列決定され得る。DNAの「化学的配列決定」は、MaxamおよびGilbert、(1977)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:560)の方法などを意味し得、この方法では、DNAは、個々の塩基特異的な反応を使用してランダムに切断される。DNAの「酵素的配列決定」は、Sanger(Sangerら、(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)の方法など意味し得る。
本明細書中の核酸は、天然の調節(発現制御)配列により隣接され得るか、または異種配列(プロモーター、内部リボソーム侵入部位(IRES)、および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5’非コード領域および3’非コード領域などを含む)に結合され得る。
遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第5,385,839号および同第5,168,062号)、SV40初期プロモーター領域(Benoistら、(1981)Nature 290:304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら、(1980)Cell 22:787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441−1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、(1982)Nature 296:39−42);原核生物発現ベクター(例えば、β−ラクタマーゼプロモーター(Villa−Komaroffら、(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727−3731)またはtacプロモーター(DeBoerら、(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25))(「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American(1980)242:74−94もまた参照のこと);ならびに酵母もしくは他の真菌由来のプロモーターエレメント(例えば、Gal4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーターまたはアルカリホスファターゼプロモーター)が挙げられるが、これらに限定されない。
コード配列は、細胞中の転写制御配列および翻訳制御配列がそのコード配列からRNA(好ましくは、mRNA)へのRNAポリメラーゼ媒介性転写を指向し、そのRNAが、その後、(イントロンを含む場合には)トランス−RNAスプライシングされ得、必要に応じて、そのコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳され得る場合に、それらの転写制御配列および翻訳制御配列「の制御下にある」か、それら「と機能的に結合している」か、またはそれら「と作動可能に結合している」。
本発明は、タンパク質(例えば、本発明のMDL−1)に対応するアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列に対する改変(特に、影響が少ない任意の改変または些細な任意の改変)を企図する。具体的には、本発明は、本発明のヒトMDL−1をコードする核酸の配列保存的改変体、および本発明のマウスMDL−1をコードする核酸の配列保存的改変体を、企図する。
本発明は、表1に記載されるような核酸およびその核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされる、MDL−1を包含する。好ましくは、上記核酸は、低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェシー条件下で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズし、そしてその核酸は、好ましくは、MDL−1活性を示す。
核酸分子は、その核酸分子の一本鎖形態が、適切な温度条件および溶液イオン強度条件(例えば、Sambrookら(前出)を参照のこと)下で別の核酸分子にアニールし得る場合に、その別の核酸分子(例えば、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA)に対して「ハイブリダイズ可能である」。上記温度条件およびイオン強度条件が、そのハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。代表的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、55℃、5×SSC、0.1% SDS、0.25%ミルク、ホルムアミドなし;または30%ホルムアミド、5×SSC、0.5% SDSである。代表的な中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、そのハイブリダイゼーションが40%ホルムアミド中で5×SSCもしくは6×SSCを用いて実施されることを除いて、低ストリンジェンシー条件と同様である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、そのハイブリダイゼーション条件が50%ホルムアミド、5×SSCもしくは6×SSC中で(必要に応じて、より高温(例えば、57℃,59℃、60℃、62℃、63℃、65℃、または68℃)で)実施されることを除いて、低ストリンジェンシー条件と同様である。一般に、SSCは、0.15M NaC1および0.015Mクエン酸Naである。ハイブリダイゼーションには、その2つの核酸が、相補配列を含むことが必要とされるが、そのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当該分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きい程、それらの核酸がハイブリダイズし得るストリンジェンシーが高くなる。100ヌクレオチド長より長いハイブリッドについて、その融解温度を計算するための式が、誘導されている(Sambrookら(前出)9.50〜9.51を参照のこと)。より短い核酸(すなわち、オリゴヌクレオチド)とのハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置が、より重要になり、そのオリゴヌクレオチドの長さは、その特異性を決定する(Sambrookら(前出)11.7−11.8を参照のこと)。
本発明にまた含まれるのは、BLASTアルゴリズムによって比較を行なった場合に、表1の参照ヌクレオチド配列および参照アミノ酸配列に対して、少なくとも70%同一であり、少なくとも80%同一であり、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%)同一であり、そして少なくとも95%(例えば、95%、96%、97%、98%、99%、100%)同一である、ヌクレオチド配列を含む核酸、ならびにそのようなアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、そのアルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の長さ全体にわたってそれぞれの配列間で最大の一致を与えるように選択される。BLASTアルゴリズムによって比較が行なわれる場合に、表1の参照アミノ酸配列(例えば、配列番号2および配列番号4)に対して、少なくとも70%類似し、少なくとも80%類似し、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%)類似し、そして少なくとも95%(例えば、95%、96%、97%、98%、99%、100%)類似する、アミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、本発明に包含され、そのアルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の長さ全体にわたってそれぞれの配列間で最大の一致を与えるように選択される。
配列同一性とは、比較されている2つの配列のヌクレオチドの間またはアミノ酸の間における正確な一致をいう。配列類似性とは、比較されている2つのポリペプチドのアミノ酸の間における正確な一致、および同一でない生化学的に関連するアミノ酸の間における一致の両方をいう。類似する特性を共有し、かつ交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸は、上で考察されている。
BLASTアルゴリズムに関する以下の参考文献は、本明細書中で参考として援用される:BLASTアルゴリズム:Altschulら、(1990)J.Mol.Biol.215:403−410;Gishら、(1993)Nature Genet.3:266−272;Maddenら、(1996)Meth.Enzymol.266:131−141;Altschulら、(1997)Nucleic Acids Res.25:3389−3402;Zhangら、(1997)Genome Res.7:649−656;Woottonら、(1993)Comput.Chem.17:149−163;Hancockら、(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67−70;アライメントスコアリングシステム:Dayhoffら、「A model of evolutionary change in proteins.」、Atlas of Protein Sequence and Structure(1978)、第5巻、補遺3、M.O.Dayhoff(編)、pp.345〜352,Natl.Biomed.Res.Found.、Washington,DC;Schwartzら、「Matrices for detecting distant relationships.」、Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5巻,補遺3.、M.O.Dayhoff(編),pp.353−358,Natl.Biomed.Res.Found.、Washington,DC;Altschul、(1991)J.Mol.Biol.219:555−565;Statesら、(1991)Methods 3:66−70;Henikoffら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915−10919;Altschulら、(1993)J.Mol.Evol.36:290−300;アライメント統計学:Karlinら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268;Karlinら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877;Demboら、(1994)Ann.Prob.22.2022−2039;およびAltschul,S.F.「Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments.」、Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai編),(1997)pp.1−14,Plenum,New York。
本発明はまた、MDL−1の可溶性形態の組換えバージョンまたはそのフラグメントの組換えバージョンを包含する。可溶性MDL−1タンパク質は、MDL−1の細胞外ドメインを含む。さらに、細胞外ドメインのフラグメントはまた、MDL−1タンパク質の可溶性形態を提供する。フラグメントは、細胞外領域の所望の部分を単離する公知の技術を使用して調製され得る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドと、「タグ」と呼ばれ得る第2のポリペプチド部分もしくは第2のポリヌクレオチド部分とを含む、融合物を包含する。本発明の融合物は、表1に示されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのいずれか、またはそれらの任意の部分配列もしくはフラグメント(上記に考察される)を含み得る。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、上に記載されるような発現ベクター中に挿入することによって、簡便に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易するタグを含み得る。このようなタグとしては、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、ヘキサヒスチジン(His6)タグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグ、赤血球凝集素(HA)タグ、セルロース結合タンパク質(CBP)タグ、およびmycタグが挙げられる。検出可能な標識またはタグ(例えば、32P、35S、14C、3H、99mTc、111In、68Ga、18F、125I、131I、113mIn、76Br、67Ga、99mTc、123I、111Inおよび68Ga)もまた、本発明のポリペプチドを標識するために使用され得る。このような融合物を構築および使用するための方法は、非常に従来的であり、当該分野で周知である。
ポリペプチドにおいて生じる改変(例えば、翻訳後修飾)は、しばしば、それがなされる方法の関数である。例えば、宿主においてクローニングした遺伝子を発現することによって作製されるポリペプチドについて、その改変の性質および程度は、大部分は、宿主細胞の翻訳後修飾能力、およびそのポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルによって、決定される。例えば、周知であるように、グリコシル化は、しばしば、細菌宿主(例えば、E.coli)において生じない。従って、グリコシル化が望ましい場合、ポリペプチドは、グリコシル化する宿主(一般的には、真核生物細胞)において発現され得る。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同様に翻訳後グリコシル化を行う。この理由のために、昆虫細胞発現系は、グリコシル化のネイティブパターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現するために開発されている。あるいは、脱グリコシル化酵素が、真核生物発現系における生成の間に結合した糖質を除去するために、使用され得る。
本発明のMDL−1ペプチドのアナログは、化学合成によってか、または部位特異的変異誘発(Gillmanら、(1979)Gene 8:81;Robertsら、(1987)Nature、328:731またはInnis(編)、1990、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Academic Press、New York、NY)を使用することによって、もしくはDaughertyら、(1991)(Nucleic Acids Res.19:2471)によって例示されるようなポリメラーゼ連鎖反応法である、そのペプチドをコードする核酸を改変するPCR(Saikiら、(1988)Science 239:487)を使用することによって、調製され得る。組換え産物の精製または検出のためにエピトープタグを付加することが、想定される。
さらに他のアナログは、反応性側鎖を介したタンパク質の架橋形成における有用性について当該分野で公知である、薬剤の使用によって調製される。架橋剤による好ましい誘導体化の部位は、遊離アミノ基または遊離カルボキシ基、遊離糖質部分および遊離システイン残基である。
(タンパク質精製)
代表的に、本発明のペプチドは、培養(例えば、Luriaブロスのなどの液体培養)において増殖される宿主細胞中で、上記ポリペプチドをコードする核酸を発現することによって産生され得る。例えば、上記核酸は、上記宿主細胞に存在するベクター(例えば、プラスミド)の一部であり得る。発現後、本発明のペプチドは、培養された細胞から単離され得る。本発明のペプチドは、標準的な方法(塩沈もしくはアルコール沈殿、アフィニティクロマトグラフィ(例えば、上で考察されるようなタグ化ペプチドの精製と組み合わせて使用される)、調製用ディスクゲル電気泳動、等電集束法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLC、ゲル濾過、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィー、および分配クロマトグラフィー、および向流分配が挙げられるが、これらに限定されない)によって、精製され得る。このような精製方法は、当該分野で周知であり、例えば、「Guide to Protein Purification」、Methods in Enzymology、第182巻,M.Deutscher編、1990、Academic Press、New York、NYに開示される。
代表的に、本発明のペプチドは、培養(例えば、Luriaブロスのなどの液体培養)において増殖される宿主細胞中で、上記ポリペプチドをコードする核酸を発現することによって産生され得る。例えば、上記核酸は、上記宿主細胞に存在するベクター(例えば、プラスミド)の一部であり得る。発現後、本発明のペプチドは、培養された細胞から単離され得る。本発明のペプチドは、標準的な方法(塩沈もしくはアルコール沈殿、アフィニティクロマトグラフィ(例えば、上で考察されるようなタグ化ペプチドの精製と組み合わせて使用される)、調製用ディスクゲル電気泳動、等電集束法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLC、ゲル濾過、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィー、および分配クロマトグラフィー、および向流分配が挙げられるが、これらに限定されない)によって、精製され得る。このような精製方法は、当該分野で周知であり、例えば、「Guide to Protein Purification」、Methods in Enzymology、第182巻,M.Deutscher編、1990、Academic Press、New York、NYに開示される。
(抗体構造)
一般に、基本的な抗体構造の単位は、四量体を構成することが公知である。各四量体は、同一のポリペプチド鎖対を2つ含み、各対は、1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約100〜110アミノ酸以上の可変領域を含み得る。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定し得る。代表的に、ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、代表的に、μ、δ、γ、α、またはυとして分類され、そしてそれらは、それぞれ、抗体のアイソタイプを、IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEとして規定する。軽鎖内および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約12アミノ酸以上の「J」領域によって結合され、重鎖はまた、約10アミノ酸以上の「D」領域を含む。一般に、Fundamental Immunology、第7章(Paul,W.編、第2版、Raven Press、N.Y.(1989))(全ての目的のためにその全体が参考として援用される)を参照のこと。
一般に、基本的な抗体構造の単位は、四量体を構成することが公知である。各四量体は、同一のポリペプチド鎖対を2つ含み、各対は、1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約100〜110アミノ酸以上の可変領域を含み得る。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定し得る。代表的に、ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、代表的に、μ、δ、γ、α、またはυとして分類され、そしてそれらは、それぞれ、抗体のアイソタイプを、IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEとして規定する。軽鎖内および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約12アミノ酸以上の「J」領域によって結合され、重鎖はまた、約10アミノ酸以上の「D」領域を含む。一般に、Fundamental Immunology、第7章(Paul,W.編、第2版、Raven Press、N.Y.(1989))(全ての目的のためにその全体が参考として援用される)を参照のこと。
軽鎖/重鎖対の各々の可変領域は、抗体結合部位を形成し得る。したがって、一般に、インタクトなIgG抗体は、2つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異的抗体を除いて、上記2つの結合部位は、一般に、同じである。
通常、上記鎖の全ては、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の同じ一般構造を示し、そのフレームワーク領域は、3個の超可変領域(相補性決定領域またはCDRとも称される)によって結合される。各対の2つの鎖由来のCDRは、通常、上記フレームワーク領域によって整列されて、特異的なエピトープに対する結合を可能にする。一般に、N末端からC末端までに、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、一般に、Sequences of Proteins of Immunological Interest、Kabatら;National Institutes of Health、Bethesda、Md.;第5版;NIH Publ.No.91−3242(1991);Kabat、(1978)Adv.Prot.Chem.32:1−75;Kabatら、(1977)J.Biol.Chem.252:6609−6616;Chothiaら、(1987)J Mol.Biol.196:901−917またはChothiaら、(1989)Nature 342:878−883に従う。
(抗体分子)
本発明の抗MDL−1抗体分子は、好ましくは、ヒトMDL−1を認識する。例えば、配列番号1のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によって発現されるポリペプチド。例えば、配列番号2のヒトMDL−1タンパク質のアミノ酸残基26〜188によって規定される可溶性MDL−1ポリペプチド。しかし、本発明は、マウスMDL−1、および他の種(好ましくは、哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツジまたはイヌ))由来のMDL−1を認識する、抗体分子を包含する。例えば、配列番号3のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によって発現されるポリペプチド。例えば、配列番号4のマウスMDL−1タンパク質のアミノ酸残基26〜190によって規定される可溶性MDL−1ポリペプチド。本発明はまた、MDL−1もしくはその任意のフラグメントと複合体形成された、抗MDL−1抗体またはそのフラグメント;あるいは細胞表面上にMDL−1またはその任意の部分もしくはフラグメントを発現している任意の細胞と複合体形成された、抗MDL−1抗体またはそのフラグメントを含む。このような複合体は、上記抗体または抗体フラグメントと、MDL−1または上記MDL−1フラグメントとを接触させることによって作製され得る。
本発明の抗MDL−1抗体分子は、好ましくは、ヒトMDL−1を認識する。例えば、配列番号1のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によって発現されるポリペプチド。例えば、配列番号2のヒトMDL−1タンパク質のアミノ酸残基26〜188によって規定される可溶性MDL−1ポリペプチド。しかし、本発明は、マウスMDL−1、および他の種(好ましくは、哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツジまたはイヌ))由来のMDL−1を認識する、抗体分子を包含する。例えば、配列番号3のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によって発現されるポリペプチド。例えば、配列番号4のマウスMDL−1タンパク質のアミノ酸残基26〜190によって規定される可溶性MDL−1ポリペプチド。本発明はまた、MDL−1もしくはその任意のフラグメントと複合体形成された、抗MDL−1抗体またはそのフラグメント;あるいは細胞表面上にMDL−1またはその任意の部分もしくはフラグメントを発現している任意の細胞と複合体形成された、抗MDL−1抗体またはそのフラグメントを含む。このような複合体は、上記抗体または抗体フラグメントと、MDL−1または上記MDL−1フラグメントとを接触させることによって作製され得る。
1つの実施形態において、MDL−1に対する完全ヒトモノクローナル抗体が、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を保有するトランスジェニックマウスを使用して、産生される。本明細書中で「HuMAb」マウスと称され得るこれらのトランスジェニックマウスは、再配列されていないヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小型遺伝子座(miniloci)を、内因性のμ鎖およびκ鎖の遺伝子座を不活化する標的化変異と一緒に含む(Lonberg,N.ら、(1994)Nature 368(6474):856−859)。したがって、そのマウスは、マウスIgMまたはマウスIgκの減少した発現を示し、そして免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンは、高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体を産生するクラススイッチおよび体細胞変異を起こす(Lonberg,N.ら、(1994)、前出;Lonberg,N.、(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49−101において概説される;Lonbergら、(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65−93、およびHardingら、(1995)Ann.N.Y Acad.Sci 764:536−546)。HuMabマウスの作製は、当該分野において一般的に公知であり、そしてそれは、例えば、Taylorら、(1992)Nucleic Acids Research 20:6287−6295;Chenら、(1993)International Immunology 5:647−656;Tuaillonら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:3720−3724;Choiら、(1993)Nature Genetics 4:117−123;Chenら、(1993)EMBO J.12:821−830;Tuaillonら、(1994)J Immunol.152:2912−2920;Lonbergら、(1994)Nature 368(6474):856−859;Lonberg,N.、(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49−101;Taylorら、(1994)International Immunology 6:579−591;Lonbergら、(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65−93;Hardingら、(1995)Ann.N.Y Acad.Sci 764:536−546;Fishwildら、(1996)Nature Biotechnology 14:845−851およびHardingら、(1995)Annals NY Acad.Sci.764:536−546(これらの全ての内容は、その全体が本明細書により参考として援用される)に記載される。さらに、米国特許第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,789,650号;同第5,877,397号;同第5,661,016号;同第5,814,318号;同第5,874,299号;同第5,770,429号および同第5,545,807号;ならびに国際特許出願公開第WO 98/24884号;同第WO 94/25585号;同第WO 93/12227号;同第WO 92/22645号および同第WO 92/03918号(これらの全ての開示は、その全体が本明細書により参考として援用される)を参照のこと。
MDL−1に対するヒトの完全なモノクローナル抗体を産生するために、HuMabマウスが、Lonbergら、(1994)Nature 368(6474):856−859;Fishwildら、(1996)Nature Biotechnology 14:845−851およびWO 98/24884によって記載されるような、抗原性MDL−1ポリペプチドによって免疫化され得る。好ましくは、そのマウスは、最初の免疫化の際に、6〜16週齢である。例えば、MDL−1の精製された調製物が、上記HuMabマウスを免疫化するために、腹腔内に使用され得る。上記マウスはまた、MDL−1遺伝子によって安定に形質転換またはトランスフェクトされた細胞全体を用いて、免疫化され得る。
一般に、HuMAbトランスジェニックマウスは、まず、完全フロイントアジュバント中の抗原によって腹腔内(IP)で免疫化され、次いで不完全フロイントアジュバント中の抗原によって1週間おきにIP免疫化(通常は、合計で6回まで)が行われる場合に、良好に応答する。マウスは、最初に、MDL−1を発現する細胞によって免疫化され得、次いでMDL−1の可溶性フラグメントによって免疫化され得、そしてそれら2つの抗原による交互の免疫化を継続的に受け得る。上記免疫応答は、免疫化プロトコルプロセスの間中、眼窩後方からの採血(retroorbital bleed)によって得られる血漿サンプルを用いてモニタリングされ得る。その血漿は、例えば、ELISAによって抗MDL−1抗体の存在についてスクリーニングされ得る。そして十分な力価の免疫グロブリンを有するマウスは、融合のために使用され得る。マウスは、屠殺してその脾臓を取り出す3日前に、抗原によって静脈内でブーストされ得る。各抗原について2〜3回の融合が行われる必要があり得ることが、予期される。数匹のマウスが、各抗原について免疫化され得る。例えば、合計で12匹のHC07系統およびHC012系統のHuMAbマウスが、免疫化され得る。
上記モノクローナル抗MDL−1抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、当該分野において一般的に公知である方法によって産生され得る。これらの方法としては、最初にKohlerら、(1975)(Nature 256:495−497)によって開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術(Heringら、(1988)Biomed.Biochim.Acta.47:211−216およびHagiwaraら、(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4:15)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、(1983)Immunology Today 4:72およびCoteら、(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80:2026−2030)、およびEBV−ハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、pp.77−96、1985)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、マウス脾細胞が単離され、そしてそのマウス脾細胞は、標準的なプロトコルに基づき、PEGを用いてマウス骨髄腫細胞株に融合される。次いで得られたハイブリドーマは、抗原特異的抗体の産生のためにスクリーニングされ得る。例えば、免疫化されたマウス由来の脾リンパ球の単一細胞懸濁物は、50% PEGを用いて、6分の1の数のP3X63−Ag8.653非分泌性マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL 1580)に融合され得る。細胞は、1mLあたり約2×105個の細胞で平底マイクロタイタープレートにプレートされ得、次いで20%胎仔クローン血清、18%「653」順化培地(conditioned media)、5% origen(IGEN)、4mM L−グルタミン、1mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2−メルカプトエタノール、50単位/mlペニシリン、50mg/mlストレプトマイシン、50mg/mlゲンタマイシンおよび1×HAT(Sigma;HATは、融合の24時間後に添加される)を含む選択培地において2週間インキュベートされ得る。2週間後、細胞は、上記HATがHTで置換される培地中で培養され得る。次いで個々のウェルは、ELISAによって、ヒト抗MDL−1モノクローナルIgG抗体についてスクリーニングされ得る。一旦大規模なハイブリドーマの増殖が起きると、培地は、通常、10〜14日後に観察され得る。抗体分泌性ハイブリドーマは、再度プレートされ、再びスクリーニングされ得、そしてヒトIgG(抗MDL−1モノクローナル抗体)についてなおもポジティブな場合、そのハイブリドーマは、限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングされ得る。次いで安定なサブクローンは、特徴付けのための組織培養培地中で、少量の抗体をもたらすためにインビトロで培養され得る。
本発明の抗MDL−1抗体分子はまた、(例えば、上で考察されるようなE.coli/T7発現系において)組換えで産生され得る。この実施形態において、本発明の抗体分子(例えば、VHまたはVL)をコードする核酸は、pETベースのプラスミドに挿入され得、そしてその核酸は、E.coli/T7系において発現され得る。組換え抗体を産生するための数種の方法が存在し、それらの方法は、当該分野において公知である。抗体の組換え産生のための方法の1つの例は、米国特許第4,816,567号(これは、本明細書中に参考として援用される)に開示される。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法により得る。異種のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該分野において周知であり、そしてそれらの方法としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、核内へのDNAのバイオリスティック(biolistic)インジェクションおよび直接マイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入され得る。細胞を形質転換する方法は、当該分野において周知である。例えば、米国特許第4,399,216号;同第4,912,040号;同第4,740,461号および同第4,959,455号を参照のこと。
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野において周知であり、そしてその細胞株としては、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。これらとしては、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、ラット乳児腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、および多くの他の細胞株が挙げられる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒトの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、イヌの細胞、サルの細胞、ブタの細胞、ヤギの細胞、ウシの細胞、ウマの細胞およびハムスターの細胞が挙げられる。特に好ましい細胞株は、細胞株が高い発現レベルを有することの決定によって選択される。使用され得る他の細胞は、昆虫細胞株(例えば、Sf9細胞)、両生生物細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合フラグメント、軽鎖および/またはその抗原結合フラグメントをコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、上記抗体は、宿主細胞におけるその抗体の発現を可能にするのに十分な時間、その宿主細胞を培養することによってか、またはより好ましくは宿主細胞が増殖する培養培地中にその抗体を5回の分泌することによって、産生される。
抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収され得る。さらに、産生細胞株由来の本発明の抗体(またはそれに由来する他の部分)の発現は、多くの公知の技術を使用して増強され得る。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系(GS系)は、特定の条件下において発現を増強するための一般的なアプローチである。GS系は、全体的または部分的に、欧州特許第0 216 846号、同第0 256 055号、および同第0 323 997号ならびに欧州特許出願第89303964.4号に関連して考察される。
異なる細胞株によって発現されるかまたは異なるトランスジェニック動物において発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化を有する可能性がある。しかし、本明細書中に提供される核酸分子によってコードされる全ての抗体、または本明細書中に提供されるアミノ酸配列を含む全ての抗体は、それらの抗体のグリコシル化にかかわらず、本発明の一部である。
本発明の範囲内に含まれる抗体フラグメント(好ましくは、抗原結合性抗体フラグメント)はまた、例えば、ペプシンによるIgGの酵素的切断によって産生され得るF(ab)2フラグメントを含む。Fabフラグメントは、例えば、ジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンを用いたF(ab)2の還元によって産生され得る。Fabフラグメントは、ジスルフィド架橋によってVH−CH1鎖に付加されたVL−CL鎖である。F(ab)2フラグメントは、2つのFabフラグメントであり、次に、それらのFabフラグメントは、2つのジスルフィド架橋によって付加される。F(ab)2分子のFab部分は、ジスルフィド架橋が配置されるFc領域の部分を含む。
周知である通り、Fv(完全な抗原認識部位および完全な抗原結合部位を含む、最小の抗体フラグメント)は、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインとの非共有結合による二量体(VH−VL)からなる。ネイティブな抗体において見出される配置に対応するこの配置において、各可変ドメインの3個の相補性決定領域(CDR)は、上記VH−VL二量体の表面上に抗原結合部位を規定するように相互作用する。まとめると、6個のCDRは、抗体に抗原結合特異性を付与する。上記CDRに隣接するフレームワーク(FR)は、本質的に、異なる種のネイティブな免疫グロブリンにおいて保存される三次構造を有し、この三次構造の違いは、ヒトとマウスとにおける違いと同程度である。これらのFRは、CDRをその適切な方向で保持するように機能する。定常ドメインは、結合機能に必要とされないが、VH−VL相互作用の安定化を補助し得る。単一の可変ドメイン(または抗原に対して特異的な3個のCDRのみを含むFvの半分)が、抗原を認識し、そして抗原に結合する能力を有するとしても、それは、通常、完全な結合部位よりも低い親和性である(Painter、Biochem.11(1972)、1327−1337)。したがって、本発明において定義されそして記載されるような抗体構築物の結合部位のこのドメインは、異なる免疫グロブリンのVH−VLドメイン、VH−VHドメインまたはVL−VLドメインからなる対であり得る。ポリペプチド鎖内のVHドメインとVLドメインとの順序は、本発明に関して決定的ではなく、上記で与えられるドメインの順序は、通常、あらゆる機能の損失を伴わずに反転され得る。しかし、上記VHドメインおよびVLドメインは、抗原結合部位が適切に折り畳まれ得るように配置されることが、重要である。FVフラグメントは、VL領域またはVH領域である。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、種々のクラスへと割当てられ得る。免疫グロブリンについて、少なくとも5つの主要なクラスが存在する:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM。これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG−1、IgG−2、IgG−3、およびIgG−4;IgA−1およびIgA−2)へとさらに分割され得る。
本発明の抗MDL−1抗体分子またはMDL−1の可溶性タンパク質はまた、化学物質部分に結合体化され得る。この化学物質部分は、とりわけ、ポリマー、放射性核種または細胞傷害性因子であり得る。好ましくは、その化学物質部分は、被験体の身体におけるその抗体分子の半減期を増加するポリマーである。適切なポリマーとしては、ポリエチレングリコール(PEG)(例えば、分子量2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa、または40kDaを有するPEG)、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)が挙げられるが、これらに限定されない。Leeら、(1999)(Bioconj.Chem.10:973−981)は、PEG結合体化単鎖抗体を開示する。Wenら、(2001)(Bioconj.Chem.12:545−553)は、放射性金属キレート剤(ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA))に結合されたPEGと抗体とを結合体化することを開示する。
本発明の抗体および抗体フラグメント、またはMDL−1の可溶性タンパク質もしくはそのフラグメントはまた、標識(例えば、99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th、40K、157Gd、55Mn、52Trおよび56Fe)と結合体化され得る。
本発明の抗体および抗体フラグメント、またはMDL−1の可溶性タンパク質もしくはそのフラグメントはまた、蛍光標識または化学発光標識(発蛍光団(例えば、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド、フルオレスカミン(fluorescamine)、152Eu、ダンシル、ウンベリフェロン(umbelliferone)、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン(aequorin)標識、2,3−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン/アビジン、スピン(spin)標識、および安定なフリーラジカルを包含する)と結合体化され得る。
上記抗体分子または可溶性MDL−1タンパク質はまた、細胞傷害性因子(例えば、ジフテリア毒素、Pseudomonas aeruginosa内毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、α−サルシン、Aleurites fordiiのタンパク質および化合物(例えば、脂肪酸)、ジアンシン(dianthin)タンパク質、Phytoiacca americanaタンパク質PAPI、PAPIIおよびPAP−S、momordica charantiaインヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、saponaria officinalisインヒビター、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシンおよびエノマイシン)に結合体化され得る。
本発明の抗体分子またはタンパク質分子を種々の部分に結合体化するために、当該分野において公知である任意の方法が、使用され得、その方法としては、Hunterら、(1962)Nature 144:945;Davidら、(1974)Biochemistry 13:1014;Painら、(1981)J.Immunol.Meth.40:219;およびNygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30:407によって記載される方法が挙げられる。抗体およびタンパク質を結合体化するための方法は、慣習的であり、当該分野において非常に周知である。
本発明のMDL−1ペプチドの抗原性(すなわち、免疫原性)フラグメントは、本発明の範囲内である。抗原性フラグメントは、免疫原として使用されるように、他の物質(例えば、融合したポリペプチドまたは共有結合したポリペプチド)に結合され得る。上記抗原性ペプチドは、MDL−1またはその任意のフラグメントを認識する抗体分子を調製するために有用であり得る。抗原およびそのフラグメントは、種々の免疫原(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミンまたはオボアルブミン)に融合されても、共有結合されてもよい(Coliganら、(1994)Current Protocols in Immunol.、第2巻、9.3−9.4、John Wiley and Sons、New York、NY)。適切な抗原性のペプチドは、アルゴリズムを使用してポリペプチド標的から選択され得る(例えば、Parkerら、(1986)Biochemistry 25:5425−5432;JamesonおよびWolf、(1988)Cabios 4:181−186;HoppおよびWoods(1983)Mol.Immunol.20:483−489を参照のこと)。
常に必要であるわけではないが、MDL−1ペプチドが、免疫学的に適格な宿主において抗体産生を誘発するための抗原として使用される場合、より小さい抗原性フラグメントが、好ましくは、最初に、架橋形成もしくはコンカテマー形成によってか、または免疫原性キャリア分子(すなわち、宿主動物において免疫学的応答を独立して誘発する特性を有する高分子(例えば、ジフテリア毒素または破傷風毒素))にカップリングすることによって、より免疫原性にされる。架橋形成またはキャリア分子への結合体化が、必要とされ得る。なぜなら、小さいポリペプチドフラグメントは、ときとして、ハプテン(抗体に特異的に結合し得るが抗体産生を誘発する能力はない分子(すなわち、それらの分子は、免疫原性ではない))として作用するからである。免疫原性キャリア分子へのこのようなフラグメントの結合体化は、そのようなフラグメントを、「キャリア効果」として一般的に公知であるものを介して、より免疫原性にする。
キャリア分子としては、例えば、タンパク質、および天然ポリマー化合物または合成ポリマー化合物(例えば、ポリペプチド、多糖、リポ多糖など)が挙げられる。タンパク質キャリア分子が、特に好ましく、それとしては、キーホールリンペットヘモシアニンおよび哺乳動物血清タンパク質(例えば、ヒトγグロブリンもしくはウシγグロブリン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、もしくはウサギ血清アルブミン、またはこのようなタンパク質のメチル化誘導体もしくは他の誘導体)が挙げられるが、これらに限定されない。他のタンパク質キャリアは、当業者にとって明らかである。好ましくは、このタンパク質キャリアは、そのフラグメントに対する抗体が誘発される宿主動物に対して、外来である。
このキャリア分子に対する共有結合は、当該分野において周知である方法を使用して達成され得;その正確な選択は、使用されるキャリア分子の性質によって示される。その免疫原性キャリア分子がタンパク質である場合、本発明のフラグメントは、例えば、水溶性カルボジイミド(例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒド)を使用して、結合され得る。
これらのようなカップリング剤はまた、別のキャリア分子を使用することなく、そのフラグメントをそのカップリング剤自体に架橋するために使用され得る。凝集物へのそのような架橋形成はまた、免疫原性を増加し得る。免疫原性はまた、公知のアジュバントを単独でかまたはカップリングもしくは凝集と組み合わせて使用することによって、増加され得る。
動物のワクチン接種のためのアジュバントとしては、アジュバント65(落花生油、モノオレイン酸マンノイド(mannide)、モノステアリン酸アルミニウムを含む);フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント;ミネラルゲル(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびミョウバン);界面活性剤(例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、N,N−ジオクタデシル−N’,N’−ビス(2−ヒドロキシメチル)プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック(pluronic)ポリオール;ポリアニオン(例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリIC、ポリアクリル酸、およびカルボポール);ペプチド(例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン(tuftsin);ならびに油乳剤が挙げられるが、これらに限定されない。このポリペプチドはまた、リポソームまたは他のマイクロキャリア中に組み込まれた後に、投与され得る。
アジュバントおよび種々の局面の免疫アッセイに関する情報は、例えば、P.Tijssen,Practice and Theoly of Enzyme Immunoassays,第3版,1987,Elsevier,New Yorkによるシリーズ中に開示される。ポリクローナル抗血清を調製するための方法を網羅する他の有用な参考文献としては、Microbiology,1969,Hoeber Medical Division,HarperおよびRow;Landsteiner,Specificity of Serological Reactions,1962,Dover Publications,New York,ならびにWilliamsら、Methods in Immunology and lmmunochemisLry,第1巻,1967,Academic Press,New Yorkが挙げられる。
本発明の抗MDL−1「抗体分子」としては、抗MDL−1抗体(例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異的抗体および抗イディオタイプ抗体)およびフラグメント(好ましくは、その抗原結合フラグメント(例えば、Fab抗体フラグメント、F(ab)2抗体フラグメント、Fv抗体フラグメント(例えば、VHまたはVL)、単鎖Fv抗体フラグメントおよびdsFv抗体フラグメント))が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト/マウスキメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
本発明の抗MDL−1抗体分子は、好ましくは、本発明のヒトMDL−1ペプチドまたは本発明のマウスMDL−1ペプチドを認識する;しかし、本発明は、異なる種(好ましくは、哺乳動物(例えば、ブタ、ラット、ウサギ、ヒツジまたはイヌ))に由来するMDL−1ペプチドを認識する抗体分子を包含する。
本発明はまた、本発明のMDL−1ペプチドと1つ以上の抗体分子とを含む複合体を包含する。このような複合体は、上記抗体分子とその同種(cognate)のペプチドとを単純に接触させることによって作製され得る。
種々の方法が、本発明の抗体分子を作製するために使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、米国特許第5,625,126号;同第5,877,397号;同第6,255,458号;同第6,023,010号および同第5,874,299号と同様の方法によって産生される。次いでモノクローナルの完全ヒト抗MDL−1ペプチド抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、当該分野において一般的に公知である方法によって産生され得る。これらの方法としては、Kohlerら、(1975)(Nature 256:495−497)によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術(Heringら、(1988)Biomed.Biochim.Acta.47:211−216およびHagiwaraら、(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4:15)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、(1983)Immunology Today 4:72およびCoteら、(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80:2026−2030)、およびEBV−ハイブリドーマ技術(Coleら、in Monoclonal Antibodies and Cancer Theraqp ,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96,1985)が挙げられるが、これらに限定されない。再び、ELISAは、ハイブリドーマ細胞が抗MDL−1ペプチド抗体を発現しているか否かを決定するために使用され得る。
抗原の精製は、抗体の産生に必要ではない。免疫化は、DNAベクターによる免疫化によって行われ得る(例えば、Wangら、(1997)Virology 228:278−284を参照のこと)。あるいは、動物は、目的の抗原を有する細胞を用いて免疫化され得る。次いで脾細胞が、免疫化された動物から単離され得、そしてその脾細胞は、ハイブリドーマを産生するために骨髄腫細胞株に融合され得る(Meyaardら、(1997)Immunity 7:283−290;Wrightら、(2000)Immunity 13:233−242;Prestonら、(1997)Eur.J.Immunol.27:1911−1918)。得られたハイブリドーマは、機能的アッセイまたは生物学的アッセイ(すなわち、精製された抗原の所有に依存しないアッセイ)によって所望の抗体の産生についてスクリーニングされ得る。細胞を用いた免疫化は、精製された抗原を用いた免疫化より抗体産生に優れていることを証明し得る(Kaithamanaら、(1999)J.Immunol.163:5157−5164)。
抗原に対する抗体の結合特性およびレセプターに対するリガンドの結合特性は、例えば、表面プラスモン共鳴(Karlssonら、(1991)J.Immunol.Methods 145:229−240;Neriら、(1997)Nat.Biotechnol.15:1271−1275;Jonssonら、(1991)Biotechniques 11:620−627)、または競合ELISA(Friguetら、(1985)J.Immunol.Methods 77:305−319;Hubble、(1997)Immunol.Today 18:305−306)によって測定され得る。抗体は、その抗体の標的抗原および関連する結合型タンパク質を単離するアフィニティー精製のために使用され得る(例えば、Wilchekら、(1984)Meth.Enzymol.104:3−55を参照のこと)。
MDL−1の改変体に特異的に結合する抗体は、その改変体が、本明細書中に列挙されるものと実質的に同じ核酸およびアミノ酸配列を有するがその核酸またはアミノ酸配列の機能的側面には実質的に影響しない置換を保有する場合、企図された方法の定義の範囲内である。これらの核酸およびポリペプチドの生物学的機能を実質的に変えない領域の切断、欠失、付加、および置換を有する改変体は、企図された方法の定義の範囲内である。
(抗体結合アッセイ)
本発明の抗体は、当該分野において公知である任意の方法によって、免疫特異的結合(immunospecific binding)についてアッセイされ得る。使用され得るイムノアッセイとしては、いくつか挙げるならばウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの技術を使用する、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、慣習的であり、当該分野において周知である(例えば、Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons,Inc.、New York(これは、その全体が本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。例示的なイムノアッセイは、下で簡単に記載される(しかし、それは、限定として意図されない)。
本発明の抗体は、当該分野において公知である任意の方法によって、免疫特異的結合(immunospecific binding)についてアッセイされ得る。使用され得るイムノアッセイとしては、いくつか挙げるならばウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの技術を使用する、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、慣習的であり、当該分野において周知である(例えば、Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons,Inc.、New York(これは、その全体が本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。例示的なイムノアッセイは、下で簡単に記載される(しかし、それは、限定として意図されない)。
免疫沈降プロトコルは、一般に、溶解緩衝液(例えば、プロテインホスファターゼおよび/またはプロテアーゼインヒビター(例えば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)を補充したRIPA緩衝液(1% NP−40またはTriton X−100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム(pH7.2)、1% Trasylol))において細胞の集団を溶解すること、その細胞溶解物に目的の抗体を添加すること、4℃にてしばらくの間(例えば、1〜4時間)インキュベートすること、その細胞溶解物にプロテインAセファロースビーズおよび/またはプロテインGセファロースビーズを添加すること、4℃にて約1時間以上インキュベートすること、溶解緩衝液中でそのビーズを洗浄すること、ならびにSDS/サンプル緩衝液中にそのビーズを再懸濁することを包含する。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。当業者は、抗原に対する抗体の結合を増大させバックグラウンドを減少させるために改変され得る、パラメータ(例えば、セファロースビーズによって上記細胞溶解物を前洗浄すること)に精通している。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons,Inc.、New York、10.16.1を参照のこと。
ウェスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製すること、ポリアクリルアミドゲル(例えば、抗原の分子量に依存する8%〜20% SDS−PAGE)におけるタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプルをそのポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、PVDFまたはナイロンなどのメンブレンに転写すること、ブロッキング溶液(例えば、3% BSAまたは無脂肪乳を含むPBS)中でそのメンブレンをブロッキングすること、洗浄緩衝液(例えば、PBS−Tween 20)中でそのメンブレンを洗浄すること、ブロッキング緩衝液中に希釈された一次抗体(目的の抗体)を用いてそのメンブレンをブロッキングすること、洗浄緩衝液中でそのメンブレンを洗浄すること、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)または放射性分子(例えば、32Pまたは125I)と結合体化されブロッキング緩衝液中に希釈された二次抗体(これは、一次抗体を認識する(例えば、抗ヒト抗体))を用いてそのメンブレンをブロッキングすること、洗浄緩衝液中でそのメンブレンを洗浄すること、およびその抗原の存在を検出することを包含する。当業者は、検出されるシグナルを増強するため、およびバックグラウンドノイズを低下させるために改変され得るパラメータに精通している。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons,Inc.、New York、10.8.1を参照のこと。
ELISAは、抗原を調製すること、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原によってコーティングすること、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物と結合体化された目的の抗体をそのウェルに添加してしばらくの間インキュベートすること、およびその抗原の存在を検出することを包含する。ELISAにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物と結合体化される必要はない;代わりに、検出可能な化合物と結合体化された第2の抗体(これは、目的の抗体を認識する)が、上記ウェルに添加され得る。さらに、上記抗原によって上記ウェルをコーティングすることの代わりに、上記抗体を、そのウェルにコーティングし得る。この場合において、そのコーティングされたウェルに対する目的の抗原の添加後に、検出可能な化合物と結合体化された第2の抗体が、添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増強するために改変され得るパラメータおよび当該分野において公知であるELISAの他のバリエーションに精通している。ELISAに関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons,Inc.、New York、11.2.1を参照のこと。
抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用の解離速度は、競合結合アッセイによって決定され得る。競合結合アッセイの1つの例は、放射免疫アッセイであり、それは、漸増量の標識されていない抗原の存在下における標識された抗原(例えば、3Hまたは125I)と目的の抗体とのインキュベーション、およびその標識された抗原に結合されたその抗体の検出を包含する。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性およびその結合の解離速度は、そのデータからスキャッチャードプロット分析によって決定され得る。第2の抗体との競合もまた、放射免疫アッセイを使用して決定され得る。この場合において、上記抗原は、漸増量の標識されていない第2の抗体の存在下で、標識化合物(例えば、3Hまたは125I)に結合体化された目的の抗体と一緒にインキュベートされる。
抗体が、ある抗原を、別の抗原と比較して優先的かつ特異的に結合する能力は、当該分野において公知である任意の方法を使用して決定され得る。非限定的な例として、抗体は、その抗体が、第1の抗原を第2の抗原に対するその抗体の解離定数(KD)より低いKDで結合する場合、優先的にその第1の抗原を結合すると見なされ得る。別の非限定的な実施形態において、抗体は、その抗体が、第1の抗原を第2の抗原に対するその抗体の解離定数(KD)より少なくとも1桁低い親和性(すなわち、KD)で結合する場合、優先的にその第1の抗原を結合すると見なされ得る。別の非限定的な実施形態において、抗体は、その抗体が、第1の抗原を第2の抗原に対するその抗体の解離定数(KD)より少なくとも2桁低い親和性(すなわち、KD)で結合する場合、優先的にその第1の抗原を結合すると見なされ得る。
別の非限定的な実施形態において、抗体は、その抗体が、第1の抗原を第2の抗原に対するその抗体の解離速度(Koff)より低いKoffで結合する場合、優先的にその第1の抗原を結合すると見なされ得る。別の非限定的な実施形態において、抗体は、その抗体が、第1の抗原を第2の抗原に対するその抗体のKoffより少なくとも1桁低いKoffで結合する場合、優先的にその第1の抗原を結合すると見なされ得る。別の非限定的な実施形態において、抗体は、その抗体が、第1の抗原を第2の抗原に対するその抗体のKoffより少なくとも2桁低いKoffで結合する場合、優先的にその第1の抗原を結合すると見なされ得る。
本発明の抗体はまた、その抗体の交差反応性(cross−reactivity)に関して記載され得るか、または特定され得る。本発明のポリペプチドのいかなる他のアナログも、オルソログもホモログも結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも100%、少なくとも99%、少なくとも98%、少なくとも97%、少なくとも96%、少なくとも95%、少なくとも94%、少なくとも93%、少なくとも92%、少なくとも91%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、および少なくとも50%の(当該分野において公知である方法および本明細書中に記載される方法を使用して算出されるような)同一性を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に包含される。
本発明のポリペプチドに対して100%未満、99%未満、98%未満、97%未満、96%未満、95%未満、94%未満、93%未満、92%未満、91%未満、90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、および50%未満の(当該分野において公知である方法および本明細書中に記載される方法を使用して算出されるような)同一性を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に包含される。本発明は、(本明細書中に記載されるような)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを結合する抗体を、さらに包含する。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するその抗体の結合親和性に関して記載され得るか、または特定され得る。
(治療的使用および診断的使用)
本発明は、増殖性障害(例えば、癌)の診断のための方法、および増殖性障害(例えば、癌)の処置のための方法を提供する。本発明は、増殖性障害(癌(例えば、腫瘍))の診断のための方法、および増殖性障害(癌(例えば、腫瘍))の処置のための方法を提供する。本発明はまた、固形腫瘍の診断のための方法および固形腫瘍の処置のための方法を提供する。上記方法は、MDL−1のポリペプチドまたは核酸に対して特異的な結合組成物(例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または可溶性MDL−1タンパク質または核酸プローブまたはプライマー)の使用を包含し得る。コントロール結合組成物(例えば、コントロール抗体(例えば、Laceyら、(2003)Arthritis Rheum.48:103−109;ChoyおよびPanayi、(2001)New Engl.J.Med.344:907−916;GreavesおよびWeinstein、(1995)New Engl.J.Med.332:581−588;RobertおよびKupper、(1999)New Engl.J.Med.341:1817−1828;Lebwohl、(2003)Lancet 361:1197−1204を参照のこと))もまた、提供される。
本発明は、増殖性障害(例えば、癌)の診断のための方法、および増殖性障害(例えば、癌)の処置のための方法を提供する。本発明は、増殖性障害(癌(例えば、腫瘍))の診断のための方法、および増殖性障害(癌(例えば、腫瘍))の処置のための方法を提供する。本発明はまた、固形腫瘍の診断のための方法および固形腫瘍の処置のための方法を提供する。上記方法は、MDL−1のポリペプチドまたは核酸に対して特異的な結合組成物(例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または可溶性MDL−1タンパク質または核酸プローブまたはプライマー)の使用を包含し得る。コントロール結合組成物(例えば、コントロール抗体(例えば、Laceyら、(2003)Arthritis Rheum.48:103−109;ChoyおよびPanayi、(2001)New Engl.J.Med.344:907−916;GreavesおよびWeinstein、(1995)New Engl.J.Med.332:581−588;RobertおよびKupper、(1999)New Engl.J.Med.341:1817−1828;Lebwohl、(2003)Lancet 361:1197−1204を参照のこと))もまた、提供される。
第2の治療因子(例えば、サイトカイン、化学療法剤、抗生物質、または放射線)を用いた、同時投与または処置のための方法は、当該分野において周知である(Hardmanら(編)、(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics、第10版、McGraw−Hill、New York、NY;PooleおよびPeterson(編)、(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach、Lippincott、WilliamsおよびWilkins、Phila.、PA;ChabnerおよびLongo(編)、(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy、Lippincott、WilliamsおよびWilkins、Phila.、PA)。治療上の有効量は、症状を、代表的には少なくとも10%減少させ、通常は少なくとも20%減少させ、好ましくは少なくとも30%減少させ、より好ましくは少なくとも40%減少させ、そして最も好ましくは少なくとも50%減少させる。
治療因子の処方物および診断因子の処方物は、保存のために、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁物の形態で調製され得る(例えば、Hardmanら、(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics、McGraw−Hill、New York、NY;Gennaro、(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott、Williams、およびWilkins、New York、NY;Avisら(編)、(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications、Marcel Dekker、NY;Liebermanら(編)、(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets、Marcel Dekker、NY;Liebermanら(編)、(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems、Marcel Dekker、NY;WeinerおよびKotkoskie、(2000)Excipient Toxicity and Safety、Marcel Dekker,Inc.、New York、NYを参照のこと)。
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響することが当該分野において公知であるか、もしくはそれが疑われるか、または処置に影響すると予想される、パラメータあるいは因子を使用して、臨床家によって行われる。一般に、上記用量は、適量よりやや低い量で始まり、その後、その用量は、あらゆるネガティブな副作用と比較して、所望の効果または最適な効果が達成されるまで、少量の増分で増加される。重要な診断基準としては、例えば、炎症の症状の診断基準、または産生される炎症性サイトカインのレベルの診断基準が挙げられる。好ましくは、使用される生物学的製剤は、処置のための標的とされる動物と同じ種に由来し、それによってその試薬に対する体液性の応答を最小化する。
特定の患者に対する有効量は、処置される状態、その患者の全身の健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重症度などの要因に依存して、変動し得る。組み合わせの場合、有効量は、成分の組み合わせに対する比であり、そしてその効果は、個々の成分単独に限られない。処置方法および診断方法についての手引きは、利用可能である(Maynardら、(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice、Interpharm Press、Boca Raton、FL;Dent、(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice、Urch Publ.、London、UK)。
本発明はまた、細胞および区画を備えるキット、細胞および試薬を備えるキット、細胞および使用ついての指示書または廃棄についての指示書を備えるキット、ならびに細胞、区画、および試薬を備えるキットを提供する。
(薬学的組成物)
本発明の抗体分子または可溶性MDL−1タンパク質は、好ましくは治療目的のために、好ましくは薬学的組成物中にて被験体に投与され得る。好ましくは、薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。上記抗体分子は、MDL−1レセプターを標的とするため、そしてそれによってそのレセプターによって引き起こされるかまたは媒介される任意の医学的状態を処置するために、(例えば、薬学的組成物中にて)治療的に使用され得る。上記可溶性MDL−1タンパク質は、MDL−1レセプターリガンドを標的とし、それによってそのレセプターによって引き起こされるか、または媒介される任意の医学的状態を処置するために、(例えば、薬学的組成物中にて)治療的に使用され得る。
本発明の抗体分子または可溶性MDL−1タンパク質は、好ましくは治療目的のために、好ましくは薬学的組成物中にて被験体に投与され得る。好ましくは、薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。上記抗体分子は、MDL−1レセプターを標的とするため、そしてそれによってそのレセプターによって引き起こされるかまたは媒介される任意の医学的状態を処置するために、(例えば、薬学的組成物中にて)治療的に使用され得る。上記可溶性MDL−1タンパク質は、MDL−1レセプターリガンドを標的とし、それによってそのレセプターによって引き起こされるか、または媒介される任意の医学的状態を処置するために、(例えば、薬学的組成物中にて)治療的に使用され得る。
薬学的に受容可能なキャリアは、慣習的であり、当該分野において非常に周知である。例としては、水性キャリアおよび非水性キャリア、安定剤、抗酸化剤、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、緩衝剤、血清タンパク質、等張化剤および吸収遅延剤(absorption delaying agent)など(これらは、生理学的に適合性である)が挙げられる。好ましくは、上記キャリアは、被験体の身体への注射に適する。一般に、このような薬物の非経口投与に有用である組成物は、周知である;例えば、Remington’s Pharmaceutical Science、第17版(Mack Publishing Company、Easton、PA、1990)。
本発明の薬学的組成物に利用され得る適切な水性キャリアおよび非水性キャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール類(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物、植物油(例えば、オリーブ油)、ならびに注射可能な有機エステル類(例えば、オレイン酸エチル)が挙げられる。適切な流動性が、例えば、コーティング材料(例えば、レシチン)の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。
本発明の薬学的組成物は、第2の薬学的組成物または第2の薬学的物質と組み合わせて投与され得る。併用療法が使用される場合、両方の組成物は、同時送達のために単一の組成物へと処方されても、2以上の組成物へと別々に処方されてもよい(例えば、キット)。
鎮痛薬としては、アスピリン、アセトアミノフェン(acetominophen)、コデイン、モルヒネ、アポモルヒネ(aponorphine)、ノルモルヒネ、エトルフィン、ブプレノルフィン、ヒドロコドン、ラセモルファン、レボファノール、ブトルファンド(butorphand)、メタドン、デメロール(demerol)、イブプロフェンまたはオキシコドンが挙げられ得る。
本発明の薬学的組成物はまた、他の型の物質を含み得、その物質としては、本明細書中に記載されるアッセイを使用して同定され得る有機低分子および抑制性リガンドアナログが挙げられる。
上記処方物は、単位投薬形態にて簡便に与えられ得、そして薬学の分野において周知である任意の方法によって調製され得る。例えば、Gilmanら(編)、(1990),The Pharmacological Bases of Therapeutics,第8版,Pergamon Press;およびRemington’s Pharmaceutical Sciences(前出),Easton,Penn.;Avisら(編)、(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,New York;Liebermanら、(編)、(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker,New York;ならびにLiebermanら(編)、(1990),Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker,New Yorkを参照のこと。
治療適用に関与する投薬レジメンは、治療物質の作用を改変し得る種々の要因(例えば、患者の状態、体重、性別および食事、なんらかの感染の重症度、投与回数、および他の臨床因子)を考慮して、医師によって決定され得る。
しばしば、処置投薬量は、低レベルから上向きに用量決定されて、安全性および効力が最適にされる。投薬量は、より小さい分子サイズおよびおそらく減少する投与後の半減期(クリアランス時間)を計上するように調整され得る。
このような物質の治療的投与のための代表的なプロトコルは、当該分野において周知である。本発明の薬学的組成物は、例えば、腸管外経路(例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腫瘍内注射または注入)または非腸管外経路(例えば、経口投与、肺投与または局所投与)によって、投与され得る。
組成物が、当該分野において公知である医療デバイスを用いて、投与され得る。例えば、好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、皮下針を用いる注射によって、投与され得る。
本発明の薬学的組成物はまた、針なし皮下注射デバイス(例えば、米国特許第5,399,163号;同第5,383,851号;同第5,312,335号;同第5,064,413号;同第4,941,880号;同第4,790,824号;または同第4,596,556号に開示されるデバイス)を用いて、投与され得る。
本発明において有用である周知のインプラントおよびモジュールの例としては、以下が挙げられる:制御された速度で薬剤を分配するための移植可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号;正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号;継続的な薬物送達のための移植可能な可変流量の注入装置を開示する米国特許第4,447,224号;複数チャンバーの区画を有する浸透圧性薬物送達システムを開示する米国特許第4,439,196号。
(アンチセンス分子)
本発明はまた、本発明のMDL−1ペプチドをコードする核酸(例えば、ゲノムDNAまたはmRNA)に特異的にハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含し、好ましくは、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その核酸の発現を妨げるために配列番号2もしくは配列番号4またはその配列のいずれかによって規定されるアミノ酸配列を有する。
本発明はまた、本発明のMDL−1ペプチドをコードする核酸(例えば、ゲノムDNAまたはmRNA)に特異的にハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含し、好ましくは、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その核酸の発現を妨げるために配列番号2もしくは配列番号4またはその配列のいずれかによって規定されるアミノ酸配列を有する。
本発明はさらに、(a)細胞膜を通過し、そしてその細胞中で本発明のMDL−1ペプチドをコードするmRNAと特異的に結合してその翻訳を妨げることによって、MDL−1レセプターの活性を調節するのに有効な量のオリゴヌクレオチドと、(b)細胞膜を通過し得る薬学的受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物を提供する。1つの実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、mRNAを不活化する物質(例えば、リボザイム)に結合されている。
以下の実施例は、本発明を例示する。この実施例は、本発明の幅広い範囲を限定するとは解釈されるべきではない。
(I.MDL−1のmRNA発現)
種々のヒト腫瘍サンプルにおけるMDL−1(a.k.a.CLECSF5、C型レクチンスーパーファミリー5;例えば、Ebnerら、(2003)Proteins 53:44−55;およびDrickamer、(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9:585−590を参照のこと)の発現レベルを、決定した。腫瘍組織を、それぞれの場合について収集し、そして可能な場合、対応する隣接正常組織もまた、収集した。すべての組織を病理学者によって自前でスクリーニングして、病期分類の診断を確認した。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。ゲノムDNAの混入がないことを、CD4プロモーターのゲノム領域を認識するプライマーを使用して確認した。ユビキチンのレベルを、別個の反応において測定し、そしてΔ−Δ Ct法によってそのデータを正規化するために使用した。例えば、User Bulletin #2、(1997)Applied Biosystems、Foster City、CAを参照のこと(ユビキチンおよび各サンプルのMDL−1についての平均サイクの閾値を使用して、式1.8e(Ctユビキチン−Ct MDL−1)×104を使用して、正規化した値を得た)。Kruskal−Wallisノンパラメトリック統計分析を、対数に変換したデータに対して行なった(メジアン法)。例えば、HollanderおよびWolfe、(1973)Nonparametric Statistical Interference、John Wiley and Sons、New York、NY、pp.115−120を参照のこと。これらの方法を、下の癌パネルにおいて使用した。
種々のヒト腫瘍サンプルにおけるMDL−1(a.k.a.CLECSF5、C型レクチンスーパーファミリー5;例えば、Ebnerら、(2003)Proteins 53:44−55;およびDrickamer、(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9:585−590を参照のこと)の発現レベルを、決定した。腫瘍組織を、それぞれの場合について収集し、そして可能な場合、対応する隣接正常組織もまた、収集した。すべての組織を病理学者によって自前でスクリーニングして、病期分類の診断を確認した。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。ゲノムDNAの混入がないことを、CD4プロモーターのゲノム領域を認識するプライマーを使用して確認した。ユビキチンのレベルを、別個の反応において測定し、そしてΔ−Δ Ct法によってそのデータを正規化するために使用した。例えば、User Bulletin #2、(1997)Applied Biosystems、Foster City、CAを参照のこと(ユビキチンおよび各サンプルのMDL−1についての平均サイクの閾値を使用して、式1.8e(Ctユビキチン−Ct MDL−1)×104を使用して、正規化した値を得た)。Kruskal−Wallisノンパラメトリック統計分析を、対数に変換したデータに対して行なった(メジアン法)。例えば、HollanderおよびWolfe、(1973)Nonparametric Statistical Interference、John Wiley and Sons、New York、NY、pp.115−120を参照のこと。これらの方法を、下の癌パネルにおいて使用した。
(IA.ヒトにおける黒色腫のパネル)
黒色腫のパネルは、15のコントロール正常皮膚サンプル;腫瘍の症例と対応した86の隣接正常組織;およびパネル上の病期によって定められる87の黒色腫の症例を含んだ。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。
黒色腫のパネルは、15のコントロール正常皮膚サンプル;腫瘍の症例と対応した86の隣接正常組織;およびパネル上の病期によって定められる87の黒色腫の症例を含んだ。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。
上記コントロール組織(n=15)は、メジアンMDL−1発現値3.66を有し、一方で、第I期の黒色腫サンプル、第II期SSの黒色腫サンプル、第II期NMの黒色腫サンプル、第II期黒色腫(全身)の黒色腫サンプルおよび第III期/第IV期の黒色腫サンプルは、それぞれ、18.83(5.1倍)、8.79(2.4倍)、9.75(2.6倍)、10.81(2.9倍)、および11.66(3.1倍)のメジアンMDL−1発現値を有した(表2)。対数に変換したデータに対するKruskal−Wallisメジアン分析は、正常サンプルと比較して、第I期の黒色腫サンプル(P<0.001)、第II期の結節の黒色腫サンプル(P<0.01)および第III期/第IV期の黒色腫サンプル(P<0.01)において、統計学的に有意な評価を示した。
(表2.ヒトにおける黒色腫のパネル:ユビキチンと比較し、そして対数に変換した、定量的リアルタイムPCR分析によるMDL−1の発現)
卵巣のパネルは、20のコントロール卵巣組織;腫瘍の症例と対応した35の隣接正常組織;およびパネル上の病期/分化によって定められる36の乳頭状漿液性嚢胞腺癌組織を含んだ。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。
上記コントロール組織(n=20)は、メジアンMDL−1発現値2.95を有し、一方で、第I期の卵巣腫瘍サンプル、第II期の卵巣腫瘍サンプル、および第III期/第IV期の卵巣腫瘍サンプルは、それぞれ、46.37(15.7倍)、40.55(13.7倍)、および13.35(4.5倍)のメジアンMDL−1発現値を有した(表3)。対数に変換したデータに対するKruskal−Wallisメジアン分析は、正常コントロール組織と比較して、3つ全ての病期群において、統計学的に有意な評価を示した(全てについて0.001未満のP値を有する)。
(表3.ヒトにおける卵巣癌のパネル:ユビキチンと比較し、そして対数に変換した、定量的リアルタイムPCR分析によるMDL−1の発現)
***の腫瘍のパネルは、18のコントロール***組織;腫瘍の症例と対応した79の隣接正常組織(入手可能な場合);およびパネル上の病期/分化によって定められる91の***の腫瘍の症例(6の上皮内腺管癌組織、64の浸潤性腺管癌(IDC)組織、4の粘液性IDC組織、2の混合型IDC組織、13の浸潤性小葉癌組織および2の髄様癌組織)を含んだ。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。
上記コントロール組織(n=18)は、メジアンMDL−1発現値1.03を有し、一方で、第I期の***のIDC腫瘍サンプル、第II期の***のIDC腫瘍サンプル、および第III期/第IV期の***のIDC腫瘍サンプルならびに小葉癌(全ての病期)は、それぞれ、7.37(7.1倍)、7.12(6.9倍)、10.39(10倍)、および3.71(3.6倍)のメジアンMDL−1発現値を有した(表4)。小さい「n」を有する群(粘液性IDC、混合型IDCおよび髄様癌)からのデータを、統計分析から除外した。対数に変換したデータに対するKruskal−Wallisメジアン分析は、隣接正常組織を加えた正常コントロール組織(n=97)と比較して、IDCの3つ全ての病期群において、統計学的に有意な評価を示し(全てについて0.001未満のP値を有する)、そして小葉癌における有意性(P<0.01)を示した。
(表4.ヒトにおける乳癌のパネル:ユビキチンと比較し、そして対数に変換した、定量的リアルタイムPCR分析によるMDL−1の発現)
結腸直腸の腫瘍のパネルは、11のコントロール結腸組織;腫瘍の症例と対応した40の隣接正常組織;およびパネル上の病期/分化によって定められる40の結腸直腸腺腫(colorectal adenocarcinoma)組織を含んだ。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。
上記コントロール組織(n=11)は、メジアンMDL−1発現値1.75を有し、一方で、第I期の結腸直腸の腫瘍サンプル、第II期の結腸直腸の腫瘍サンプル、および第III期/第IV期の結腸直腸の腫瘍サンプルは、それぞれ、8.05(4.6倍)、36.59(20.9倍)、および14.16(8倍)のメジアンMDL−1発現値を有した(表5)。対数に変換したデータに対するKruskal−Wallisメジアン分析は、隣接正常組織を加えた正常コントロール組織(n=51)と比較して、第II期の群および第III期/第IV期の群において、統計学的に有意な評価を示した(両方について0.001未満のP値を有する)。
(表5.ヒトにおける結腸直腸の癌のパネル:ユビキチンと比較し、そして対数に変換した、定量的リアルタイムPCR分析によるMDL−1の発現)
腎臓の腫瘍のパネルは、12のコントロール腎臓組織;腫瘍の症例と対応した30の隣接正常組織;およびパネル上の病期/分化によって定められる31の腎淡明細胞癌組織を含んだ。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。
上記コントロール組織(n=12)は、メジアンMDL−1発現値1.73を有し、一方で、第I期/第II期の腎臓の腫瘍および第III期/第IV期の腎臓の腫瘍は、それぞれ、5.09(2.9倍)および9.35(5.4倍)のメジアンのMDL−1発現値を有した(表6)。サンプルの低い「n」が原因で、第I期由来のサンプルおよび第II期由来のサンプルを1つの群にまとめ、そして第III期および第IV期からのサンプルを1つの群にまとめた。対数に変換したデータに対するKruskal−Wallisメジアン分析は、隣接正常組織を加えた正常コントロール組織(n=42)と比較して、第I期/第II期の群(P<0.01)および第III期/第IV期の群(P<0.001)の両方において統計学的に有意な評価を示した。
(表6.ヒトにおける腎臓の癌のパネル:ユビキチンと比較し、そして対数に変換した、定量的リアルタイムPCR分析によるMDL−1の発現)
胃の腫瘍のパネルは、12のコントロール胃組織;腫瘍の症例と対応した64の隣接正常組織(入手可能な場合);およびパネル上の病期/分化によって定められる75の胃の腺癌組織を含んだ。全RNAを、標準的な方法論によって組織から調製し、そしてその全RNAを逆転写した。リアルタイムの定量的PCRを、標準的な方法論によって行なった。
上記コントロール組織(n=12)は、メジアンMDL−1発現値0.39を有し、一方で、第I期の胃の腫瘍サンプル、第II期の胃の腫瘍サンプル、第IIIA期の胃の腫瘍サンプル、第IIIB期の胃の腫瘍サンプルおよび第IV期の胃の腫瘍サンプルは、それぞれ、4.42(11.3倍)、4.14(10.6倍)、9.77(25倍)、8.98(23倍)および7.03(18倍)のメジアンMDL−1発現値を有した(表7)。対数に変換したデータに対するKruskal−Wallisメジアン分析は、隣接正常組織を加えた正常コントロール組織(n=76)と比較して、第II期の群(P<0.05)、第IIIA期の群および第IIIB期の群(両方ともP<0.001)ならびに第IV期の群(P<0.01)において統計学的に有意な評価を示した(添付の図表を参照のこと)。
(表7.ヒトにおける胃癌のパネル:ユビキチンと比較し、そして対数に変換した、定量的リアルタイムPCR分析によるMDL−1の発現)
上記発現レベル(ユビキチンに対して正規化し、そして対数に変換した値)は、上記組織サンプルにおいて発現されるMDL−1の量に対応し、その結果、その発現レベルが高くなるほど、その組織サンプルにおいて発現されたMDL−1の量が大きかった。上記の実験結果は、MDL−1発現が、コントロールと比較して黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌において有意に上昇したことを示す。
(II.抗体産生)
(ヒトMDL−1およびマウスMDL−1を特異的に結合する抗体の産生)
ヒトMDL−1(huMDL−1)またはマウスMDL−1(muMDL−1)を特異的に結合する抗体を、ヒト免疫グロブリンのFcドメインに融合したマウスMDL−1の細胞外ドメイン(配列番号4のアミノ酸残基26〜190)(MuMDL−1−huIg)を含む免疫原性融合タンパク質を用いてラットを免疫化することによって産生した。免疫化を数ヶ月間継続し、その時点で、その動物を屠殺し、そしてその脾臓細胞を、標準的なハイブリドーマプロトコルによって、マウス骨髄腫細胞に融合させた。抗ヒトMDL−1モノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリンのFcドメインに融合したhuMDL−1の細胞外ドメイン(配列番号2のアミノ酸残基26〜188)(huMDL−1−huIg)を含む免疫原性融合タンパク質を用いてBalb/Cマウスを免疫化することによって、産生した。ハイブリドーマの産生のために、上に記載した手順と同様の手順を、使用した。
(ヒトMDL−1およびマウスMDL−1を特異的に結合する抗体の産生)
ヒトMDL−1(huMDL−1)またはマウスMDL−1(muMDL−1)を特異的に結合する抗体を、ヒト免疫グロブリンのFcドメインに融合したマウスMDL−1の細胞外ドメイン(配列番号4のアミノ酸残基26〜190)(MuMDL−1−huIg)を含む免疫原性融合タンパク質を用いてラットを免疫化することによって産生した。免疫化を数ヶ月間継続し、その時点で、その動物を屠殺し、そしてその脾臓細胞を、標準的なハイブリドーマプロトコルによって、マウス骨髄腫細胞に融合させた。抗ヒトMDL−1モノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリンのFcドメインに融合したhuMDL−1の細胞外ドメイン(配列番号2のアミノ酸残基26〜188)(huMDL−1−huIg)を含む免疫原性融合タンパク質を用いてBalb/Cマウスを免疫化することによって、産生した。ハイブリドーマの産生のために、上に記載した手順と同様の手順を、使用した。
(IIB.MDL−1に特異的に結合する抗体についてのスクリーニング)
muMDL−1を特異的に結合する抗体を、融合したハイブリドーマ由来の上清を使用し、かつその上清を示差的ELISA(differential ELISA)技術に供して、スクリーニングした。抗muMDL−1モノクローナル抗体を、muMDL−1細胞株のFACS分析、およびmuMDL−1を発現する細胞に由来するMDL−1/DAP12複合体の免疫沈降によって、特異性についてさらに試験した。ヒトMDL−1に特異的なモノクローナル抗体を、免疫化した脾臓/骨髄腫融合ハイブリッドから産生し、そして細胞株によって発現されるMDL−1のFACSおよび免疫沈降によって、特異性について確かめた。
muMDL−1を特異的に結合する抗体を、融合したハイブリドーマ由来の上清を使用し、かつその上清を示差的ELISA(differential ELISA)技術に供して、スクリーニングした。抗muMDL−1モノクローナル抗体を、muMDL−1細胞株のFACS分析、およびmuMDL−1を発現する細胞に由来するMDL−1/DAP12複合体の免疫沈降によって、特異性についてさらに試験した。ヒトMDL−1に特異的なモノクローナル抗体を、免疫化した脾臓/骨髄腫融合ハイブリッドから産生し、そして細胞株によって発現されるMDL−1のFACSおよび免疫沈降によって、特異性について確かめた。
(III.免疫組織化学(IHC))
ヒト腫瘍生検および隣接正常組織を、腫瘍切除手術を受ける患者から得て、それらを直ちに、液体窒素中で急速冷凍した。冷凍した組織断片(1〜3mm)を、OCT中に包埋し、そしてさらに液体窒素によるフローテーション(liquid nitrogen flotation)によって冷凍した。次いで全ての冷凍した組織を、−80℃に保存した。クライオスタット切片(5〜8um)を、冷たい80%アセトンおよび20%メタノール中に固定し、風乾し、次いで15%正常ヤギ血清によって室温で30分間ブロックした。次いで切片を、一次抗体(3μg/ml)において室温にて2時間インキュベートし、PBS中で大範囲に洗浄し、そしてさらに、ビオチンに結合体化したヤギ抗ラットIgGまたはビオチンに結合体化したヤギ抗マウスIgG(Vector Lab、Burlingame、CA)において1時間インキュベートした。次いで切片を、Vectastain ABC試薬(Vector Labs、Burlingame、CA)中で30分間インキュベートし、PBS中で3回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ基質において5〜10分間インキュベートした。切片を、ヘマトキシリンによって対比染色し、退色しないように顕微鏡標本を作製し、そしてNikon E800顕微鏡下で検査した。免疫染色はまた、パラフィン包埋した組織に対して行われ得る。
ヒト腫瘍生検および隣接正常組織を、腫瘍切除手術を受ける患者から得て、それらを直ちに、液体窒素中で急速冷凍した。冷凍した組織断片(1〜3mm)を、OCT中に包埋し、そしてさらに液体窒素によるフローテーション(liquid nitrogen flotation)によって冷凍した。次いで全ての冷凍した組織を、−80℃に保存した。クライオスタット切片(5〜8um)を、冷たい80%アセトンおよび20%メタノール中に固定し、風乾し、次いで15%正常ヤギ血清によって室温で30分間ブロックした。次いで切片を、一次抗体(3μg/ml)において室温にて2時間インキュベートし、PBS中で大範囲に洗浄し、そしてさらに、ビオチンに結合体化したヤギ抗ラットIgGまたはビオチンに結合体化したヤギ抗マウスIgG(Vector Lab、Burlingame、CA)において1時間インキュベートした。次いで切片を、Vectastain ABC試薬(Vector Labs、Burlingame、CA)中で30分間インキュベートし、PBS中で3回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ基質において5〜10分間インキュベートした。切片を、ヘマトキシリンによって対比染色し、退色しないように顕微鏡標本を作製し、そしてNikon E800顕微鏡下で検査した。免疫染色はまた、パラフィン包埋した組織に対して行われ得る。
上記mRNA発現分析と一致して、MDL−1は、黒色腫、卵巣の腺癌、***の浸潤性腺管癌、結腸直腸腺腫、胃の腺癌および腎淡明細胞癌における多数の浸潤性白血球上に、強力に発現された。MDL−1は、これらの癌腫における腫瘍細胞によっては発現されなかったが、多数の腫瘍浸潤性白血球(主に骨髄系/マクロファージ系統である)によって、広く発現された。
(IV.浸潤性のMDL−1ポジティブな白血球の表現型分析)
MDL−1ポジティブな白血球は、ヒト腫瘍生検から得られ得る。その白血球の表現型分析を、Mantovaniら((2002)TRENDS in Immunol.23:549−555)によって記載されるように行い得る。分極したM1マクロファージおよび分極したM2マクロファージに対するマーカーを使用する二色FACS分析は、MDL−1ポジティブな白血球がM2表現型の白血球であることを示し得る。多数のMDL−1ポジティブな白血球は、マクロファージ/単球のマーカー(CD68、CD11b、およびCD206)を同時に発現し得る。
MDL−1ポジティブな白血球は、ヒト腫瘍生検から得られ得る。その白血球の表現型分析を、Mantovaniら((2002)TRENDS in Immunol.23:549−555)によって記載されるように行い得る。分極したM1マクロファージおよび分極したM2マクロファージに対するマーカーを使用する二色FACS分析は、MDL−1ポジティブな白血球がM2表現型の白血球であることを示し得る。多数のMDL−1ポジティブな白血球は、マクロファージ/単球のマーカー(CD68、CD11b、およびCD206)を同時に発現し得る。
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際に、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、上述の記載から当業者にとって明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコルが、本願全体を通して記載され、それらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
Claims (37)
- 癌を診断するためまたは腫瘍を検出するための方法であって、
(a)細胞または組織における骨髄性DAP12結合レクチン−1(MDL−1)発現のレベルを測定する工程;および
(b)測定されたMDL−1のレベルと、コントロール由来の細胞もしくは組織におけるMDL−1の発現レベルとを比較する工程であって、該コントロールと比較した測定されたMDL−1発現のレベルの上昇は、癌、または腫瘍の存在に関連する、工程;
を包含する、方法。 - 前記MDL−1は、ポリペプチドまたは核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記MDL−1は、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記MDL−1は、配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MDL−1は、腫瘍内部の腫瘍浸潤性白血球に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記癌は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍は、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 患者において腫瘍を診断または検出するための方法であって、
(a)MDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを該患者に投与する工程;
(b)該患者の細胞もしくは組織における該抗体またはその抗原結合フラグメントの結合のレベルを測定する工程;および
(c)該測定された結合のレベルと、コントロールの細胞もしくは組織におけるMDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの結合のレベルとを比較する工程であって、該コントロールと比較した該患者において測定された結合のレベルの上昇は、該腫瘍の存在に関連する、工程;
を包含する、方法。 - 前記MDL−1は、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記MDL−1は、配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記MDL−1は、腫瘍内部の腫瘍浸潤性白血球に存在する、請求項8に記載の方法。
- 前記腫瘍は、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、活性化抗体、抑制性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体および融合タンパク質からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記抗原結合フラグメントは、Fabフラグメント、F(ab)2フラグメントおよびFvフラグメントからなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、標識に結合される、請求項8に記載の方法。
- 前記標識は、放射標識、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識および酵素標識からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 癌を処置するための方法であって、該方法は、
MDL−1を結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を患者に投与する工程;
を包含し、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性因子に結合される、
方法。 - 前記MDL−1は、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項17に記載の方法。
- 前記MDL−1は、配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記MDL−1は、腫瘍内部の腫瘍浸潤性白血球に存在する、請求項17に記載の方法。
- 前記癌は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、活性化抗体、抑制性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体および融合タンパク質からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記抗原結合フラグメントは、Fabフラグメント、F(ab)2フラグメントおよびFvフラグメントからなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞傷害性因子は、薬物、毒素、放射線を放射する化合物、植物起源の分子、真菌起源の分子、細菌起源の分子、生物学的タンパク質、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記放射線を放射する化合物は、α線放射物質、β線放射物質またはγ線放射物質である、請求項24に記載の方法。
- 前記組成物は、腫瘍細胞を消散させるか、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍の大きさを減少させる、請求項17に記載の方法。
- 患者において腫瘍の存在を診断または検出するための方法であって、
(a)可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントを患者に投与する工程;
(b)該患者の細胞もしくは組織におけるリガンドに対する該ポリペプチドまたはそのフラグメントの結合のレベルを測定する工程;および
(c)該測定された結合のレベルと、コントロールの細胞もしくは組織におけるリガンドに対する可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントの結合のレベルとを比較する工程であって、該コントロールと比較した該患者において測定された結合のレベルの上昇は、腫瘍の存在と関連する、工程;
を包含する、方法。 - 前記可溶性MDL−1ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸残基26〜188を含むアミノ酸配列を有する、請求項27に記載の方法。
- 前記腫瘍は、固形腫瘍、黒色腫、卵巣の腫瘍、***の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、腎臓の腫瘍および胃の腫瘍からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントは、標識に結合される、請求項27に記載の方法。
- 前記標識は、放射標識、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識および酵素標識からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 癌を処置するための方法であって、該方法は、
リガンドに結合する可溶性MDL−1ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物を患者に投与する工程;
を包含し、該ポリペプチドまたはそのフラグメントは、細胞傷害性因子に結合される、
方法。 - 前記可溶性MDL−1ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸残基26〜188を含むアミノ酸配列を有する、請求項32に記載の方法。
- 前記癌は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸直腸の癌、腎臓の癌および胃癌からなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞傷害性因子は、薬物、毒素、放射線を放射する化合物、植物起源の分子、真菌起源の分子、細菌起源の分子、生物学的タンパク質、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記放射線を放射する化合物は、α線放射物質、β線放射物質またはγ線放射物質である、請求項35に記載の方法。
- 前記組成物は、腫瘍細胞を消散させるか、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍の大きさを減少させる、請求項32に記載の方法。
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