JP2008513100A - 多孔度生体材料−充填剤複合体およびその製法 - Google Patents

Abstract

コラーゲンのような生体材料を含み、リン酸カルシウム型充填剤材料を散在させた多孔度生体材料−充填剤複合体。該複合体の多孔度は、天然の骨のものと同様であり、２、３ナノメートルないし１００ミクロン以上の範囲の気孔サイズを特色とし得る。該生体材料−充填剤複合体から調製された足場は、吸収性骨置換材料に適当である。

Description

技術分野
本発明は、多孔度生体材料−充填剤複合体、その調製方法、およびその使用に関する。１つの特定の具体例において、本発明は、コラーゲン−無機足場に関する。

発明の背景
３０ないし３５％の骨は、（乾燥重量ベースで）有機物質でできている。この量のうち、約９５％はコラーゲンである。該残りの有機物質は、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸およびリン脂質である。６５ないし７０％の骨は、無機物質でできている。これらの無機物質のほとんど全ては、ヒドロキシアパタイトでできている。

大量の失われた骨が交換を要する時、これは、通常、種々の移植片または長持ちする合金移植片によって達成される。そのような移植および移植片は、活動的なライフスタイルを支持するのに十分な力または細胞結合および増殖を促進するのに十分な生物活性を有さないため、望ましくない時もある。また、使用される多くの移植片は、自然組織によって再吸収可能ではなく、それらの機械的特性または劣化速度に関して調節可能ではない。

コラーゲンは、低免疫原性を有し、生体吸収性であり、細胞が結合、相互作用および分解できる天然に生じる構造蛋白質である。コラーゲンスポンジおよびフォームは、止血剤として、組織修復のための足場としておよび細胞成長のための支持体として使用されている。しかしながら、現在まで、天然の骨と同じまたは同様の特性を有する移植片またはコラーゲンスポンジはなかった。

発明の目的
少なくとも好ましい具体例において、上記の不利点のうちの少なくとも１つを克服するまたは実質的に改善することが、本発明の目的である。

発明の概要
本発明の第１の態様によると、多孔度生体材料−充填剤複合体が提供され、ここに該複合体は、充填剤を散在させた生体材料を含み、ここに該複合体は天然の骨の多孔度に近い多孔度を有する。

本発明の第２の態様によると、多孔度生体材料−充填剤複合体が提供され、ここに該複合体は充填剤を散在させた生体材料を含み、ここに、該複合体は約１００ミクロン以上のサイズを有する気孔、約３０および約５０ミクロンの間のサイズを有する気孔およびナノメートルサイズの気孔を含む。

本発明の第３の態様によると、多孔度生体材料−充填剤複合体が提供され、ここに該複合体は充填剤を散在させた生体材料を含み、ここに生体材料対充填剤の乾燥重量比は１：３ないし２：１の範囲である。

１つの具体例において、該複合体は、乾燥重量で、２５ないし６５重量％の生体材料および３５ないし７５重量％の充填剤を含む。

本発明の第４の態様によると、多孔度生体材料−充填剤複合体が提供され、ここに該複合体は充填剤を散在させた生体材料を含み、ここに生体材料の量は少なくとも約２５重量％である。

第３または第４の態様の１つの具体例において、該複合体は骨の多孔度に近い多孔度を有し得る。

本発明の第５の態様によると、多孔度生体材料−充填剤複合体が提供され、ここに該複合体は、充填剤を散在させた生体材料を含み、ここに該複合体充填剤はゾルゲル法によって調製される。

本発明の第６の態様によると、
生体材料、液体および充填剤を合わせて混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、次いで
該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする、多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が提供される。

本発明の第７の態様によると、
生体材料および液体を合わせて混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、
充填剤を該スラリーに添加し；
さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が提供される。

本発明の第８の態様によると、
充填剤および液体を合わせて混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、
生体材料を該スラリーに添加し；
さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
該スラリーを凍結乾燥して多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする、多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が提供される。

１つの具体例において、該液体は水またはスラリーを形成することが可能ないずれかの他の液体である。１つの具体例において、該生体材料がコラーゲンである時、該液体は酸である。

本発明の第９の態様によると、
生体材料、液体および充填剤を合わせて混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、次いで
該スラリーを凍結乾燥して多孔度生体材料−充填剤複合体を形成し、ここに該液体は酸であり、該スラリー中の生体材料の量は、最大１０００ｍＭの酸の１００ｍｌ当たり、最大約１０ｇの生体材料の範囲であることを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が提供される。

本発明の第１０の態様によると、
生体材料および液体を合わせて、混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、
充填剤を該スラリーに添加し；
さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成し、ここに、該液体は酸であり、該スラリー中の生体材料の量は、最大１０００ｍＭの酸の１００ｍｌ当たり、最大約１０ｇの生体材料の範囲であることを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が提供される。

本発明の第１１の態様によると、
充填剤および液体を合わせて、混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、
生体材料を該スラリーに添加し；
さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
該スラリーを凍結乾燥して多孔度生体材料−充填剤複合体を形成し、ここに該液体は酸であり、該スラリー中の生体材料の量は、最大１０００ｍＭの酸の１００ｍｌ当たり、最大約１０ｇの生体材料の範囲であることを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が提供される。

第１２の態様によると、該第６、第７、第８、第９、第１０または第１１の態様に記載の方法によって調製された複合体が提供される。

定義
以下の定義は、一般的な定義として意図されたものであり、本発明の範囲をそれらの用語のみに制限するものでは全くないが、以下の記載のより良い理解のために記載するものである。

該内容が別に必要としないまたはそれとは反対に特に言及されない限り、単一の整数、工程または要素として本明細書中に列挙される本発明の整数、工程、または要素は、該列挙される整数、工程または要素の単一および複数の形態の両方を明白に網羅する。

この明細書を通して、該内容が別に必要としない限り、該単語「含む（comprise）」、または「含む（comprises）」または「含む（comprising）」のような変形は、言及された工程または要素または整数または工程または要素または整数の群の包含を示唆するが、いずれかの他の工程または要素または整数または要素または整数の群の排除を示唆しないと理解されるであろう。従って、この明細書の内容において、該用語「含む（comprising）」は、「基本的に含むが、唯一含む必要はない」と意味する。

当業者は、本明細書中に記載の本発明が、特記されるもの以外の変更および修飾が可能なことを理解するであろう。本発明が全てのそのような変更および修飾を含むことは理解されるべきである。また、本発明は、個々にまたは集合的に、この明細書中で言及されたまたは示された全ての該工程、特徴、組成物および化合物、およびいずれかおよび全ての組合せまたはいずれかの２以上の該工程または特徴を含む。

この明細書中で引用された全ての引用文献は、引用によって特異的に組み込まれ、それらの全文において本明細書中に組み込まれる。

この明細書の内容において、該用語「生体材料」は、ヒトを含む哺乳類のような生物への導入に適当ないずれかの物質を指す。該生体材料は、生体に導入された時、適切に無毒かつ生体吸収性であり、該生体材料のいずれかの劣化生成物もまた該生体に適切に無毒である。該生体材料は、生物由来でもよく、あるいは合成変種であってもよい。

好ましい具体例の詳細な記載
多孔度生体材料−充填剤複合体が本明細書中に提供され、ここに該複合体は充填剤を散在させた生体材料を含む。本発明は、１つの具体例において、生体材料相およびその中に散在させた無機充填剤を含む複合体を提供する。適切に、高分子相は、その中に散在させた無機充填剤を含む。該生体材料および該散在させた充填剤は、相互に化学的に結合し得る。

１つの具体例において、該複合体は、天然の骨の多孔度と非常に適合する多孔度を有する。本発明の該複合体が、いくつかの具体例において、構造的に、化学的におよび機械的に、できるだけ天然の骨と適合して、該複合体が移植される体が、天然の骨と同様の該複合体を認識し再構築できることが望ましい。

１つの具体例において、該複合体は、約１００ミクロン以上のサイズを有する気孔、約３０および５０ミクロンの間のサイズを有する気孔および小さなナノメートルサイズの気孔を有する。該小さなナノメートルサイズの気孔は、充填剤粒子の間の隙間によって形成され得る。そのような多孔度は、骨の実際の構造に非常に適合し得、ここに該大きな気孔は骨芽細胞移入を可能にし、該中程度の気孔は、血液／蛋白質／流体の輸送を可能にし、該小さな気孔はより良い細胞結合のためにトラクションを提供する。

１つの具体例において、該複合体は、少なくとも約２５重量％生体材料を含有する。該充填剤は、最大７５重量％であってよい。もう１つの具体例において、該複合体は、約２５ないし約５０重量％（乾燥重量）の生体材料を含有し、ここに充填剤の量は、約３５ないし約７５重量％（乾燥重量）の間である。使用される量および生体材料および充填剤は、天然の骨の組成に適合する有機：無機比を有するように調整され得る。例えば、３０ないし３５重量％のコラーゲンおよび６５ないし７０％のハイドロキシアパタイト。

１つの具体例において、該充填剤は、既に、ゾルゲル法によって調製されていてもよい。このように調製された充填剤の使用によって、ナノメートル多孔度の気孔を可能にし得る。

また、１つの具体例において、
生体材料、液体および充填剤を合わせて混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、次いで
該スラリーを凍結乾燥して多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が、本明細書中に提供される。

また、もう１つの具体例において、
生体材料および液体を合わせて混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、
充填剤を該スラリーに添加し；
さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
該スラリーを凍結乾燥して多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が、本明細書中に提供される。

また、もう１つの具体例において、
充填剤および液体を合わせて混合物を形成し、
該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、
生体材料を該スラリーに添加し；
さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
該スラリーを凍結乾燥して多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法が、本明細書中で提供される。

１つの具体例において、該複合体は少なくとも約２５重量％の生体材料を含有する。１つの具体例において、該液体は酸であり、該スラリー中の生体材料の量は、最大１０００ｍＭの酸の１００ｍｌ当たり、最大約１０ｇの生体材料の範囲である。例えば、リン酸のような５０ないし５００ｍＭの酸の１００ｍｌ当たり、コラーゲンのような０．６ないし６ｇの生体材料（６ｍｇ／ｍｌないし６０ｍｇ／ｍｌ）によって、異なる機械的特性および微細構造を有する複合体が得られる。

出発物質としてのいくつかの試料組成物の例は：
５０ｍＭのリン酸の１００ｍｌ＋２ｇのコラーゲン＋７．５ｇのＣＡＰ（炭酸アパタイト）
５０ｍＭのリン酸の１００ｍｌ＋２ｇのコラーゲン＋１２ｇのＨＡＰ（ヒドロキシアパタイト）
１００ｍＭのリン酸の１００ｍｌ＋２ｇのコラーゲン＋１０ｇのＣａＣＯ_３（炭酸カルシウム）
５０ｍＭのリン酸の１００ｍｌ＋４ｇのコラーゲン＋７．５ｇのＣＡＰ（炭酸アパタイト）
５０ｍＭのリン酸の１００ｍｌ＋４ｇのコラーゲン＋１２ｇのＨＡＰ（ヒドロキシアパタイト）
５００ｍＭのリン酸の１００ｍｌ＋４ｇのコラーゲン＋１０ｇのＣａＣＯ_３（炭酸カルシウム）
を含む。

１つの具体例において、該生体材料は、例えば、胎児組織、皮膚／真皮、筋肉または骨、腱、靱帯または軟骨を含む結合組織を含む生物学的組織から抽出された物質である。１つの具体例において、該生体材料は生体高分子である。生体高分子は、生物系または生物有機体中の適切に天然に生じる高分子物質である。また、生体高分子は、適切に、天然に生じる生体高分子の操作によって調製される人工高分子であり得る。

例えば、フィルムへと乾燥、溶解物から固化、ゲルへと架橋、フォームへと凍結乾燥されて、体温にて安定した固体構造へと形成され得るいずれかの生体高分子は、本発明で使用されてよい。

１つの具体例において、該生体材料は、１以上の蛋白質、ペプチド、多糖類または他の有機物質から選択される。例えば、該生体材料は、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン（tenascin）、エンタクチン（entactin）、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリレン（fibrillen）、メロシン、アンコリン（anchorin）、コンドロネクチン、リンク蛋白質、骨シアロ蛋白質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン（epinectin）、ヒアルロネクチン（hyaluronectin）、ウンドゥリン（undulin）、エピリグリン（epiligrin）およびカリニン（kalinin）のような細胞外マトリックス蛋白質、デコロン、デルマタン硫酸プロテログリカン、ケラチン、ケラチン硫酸プロテオグリカン、アグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、バイグリカン、シンデカン、パールカン、セルグリシン、へパリン硫酸のようなグリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、デルマチン硫酸、ケラチン硫酸またはヒアルロン酸、へパリン、デキストラン硫酸、キチン、アルギン酸、ペクチンまたはキシランのような多糖類、ポリビニルアルコール、サイトカイン、配糖体、糖蛋白質、ポリピロール、アルブミン、フィブリノゲン、またはリン脂質のうちの１以上から選択され得る。

１つの具体例において、該生体材料はコラーゲンである。１つのさらなる具体例において、該コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、またはその混合物よりなる群から選択される１以上である。１つの具体例において、該コラーゲンは、１型コラーゲンである。

該生体材料は、酸抽出、塩抽出、酵素／ペプシン抽出またはその組合せの手段によってまたは例えば粉砕によってのような機械的抽出のような何らかの他の手段によって、源から抽出され得る。該生体材料は、酸抽出、その後に塩化ナトリウムで（コラーゲンのような）該生体材料を沈殿させ、酸性のpHを有する媒体中で、（コラーゲンのような）該生体材料を再溶解することで調製され得る。

生体材料の源は、例えば、哺乳類、有袋類、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、トリ、ネコ、ブタまたはイヌといった陸上および海生脊椎動物および無脊椎動物の両方を含む。１つの具体例において、該生体材料は、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、シカ、ヤギ、ウマ、ロバ、野ウサギ、ラット、マウス、ウサギ、カンガルー、ワラビーまたはラクダのような哺乳類または有袋類から調達される。

１つの具体例において、該複合体は、フォーム、ゲルまたは線維を含む他の構築体へと形成され得る。１つの具体例において、該複合体は、多孔度フォームの形態である。該フォームは、マイクロコンパートメントを、それを通して組み入れられた生体材料分子および／または微細線維と伝達させるネットワークを含み得る。代替の具体例において、該複合体が、生体材料微細線維またはその中に組み入れられた無機充填剤を有する線維の形態であってよい。１つの具体例において、該複合体は、架橋スポンジ状フォームの形態である。もう１つの具体例において、該複合体は、堅いフォームの形態である。１つの具体例において、該複合体は足場の形態であってよい。足場は、固定細胞に使用され得る基層である。

１つの具体例において、該充填剤は、１以上の無機化合物を含む。１つの具体例において、該充填剤は、該複合体の圧縮率を改善するように選択される。１つの具体例において、該無機充填剤は、炭酸カルシウムまたはカルシウム含有塩を含む。もう１つの具体例において、該無機充填剤は、アパタイトまたは置換アパタイトのようなリン酸カルシウムを含む。さらなる具体例において、該充填剤は、炭酸カルシウムおよびアパタイトのようなリン酸カルシウムの組合せを含む。１つの具体例において、該リン酸カルシウムは、ブラッシュ石、リン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウムである。種々の具体例において、アパタイトは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）、フルオロアパタイト（ＦＡＰ）、炭酸アパタイト（ＣＡＰ）またはジルコニウムヒドロキシアパタイト（ＺｒＨＡＰ）から選択される。ドーパントおよび添加剤を含有するアパタイトまたは置換アパタイトも使用され得る。該充填剤は、適切に、粉末形態であってよい。１つの具体例において、該充填剤は、ゾルゲル法を用いて作成される。該ゾルゲル法は、相互参照によって本明細書中に含まれる"Nanostrucure Processing of Hydroxyapatite-based Bioceramics," ES Ahn, NJ Gleason, A. Nakahira, JY Ying Nano Letters 2001 1(3) p149-153に記載のようなものである。ゾルゲル法の使用による充填剤の生成によって、ナノメートルサイズの粒が形成され、ここに該最終複合体において、該アパタイト粒子の間の隙間から小さなナノメートルサイズの気孔を形成し得る。１つの具体例において、約８ないし約２０ｎｍの間の粒サイズ（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｎｍの粒）を有するゾルゲル法によって調製された炭酸アパタイトまたは約４０ないし約６０ｎｍの間の粒サイズ（例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０ｎｍ）を有するゾルゲル法によって調製されるヒドロキシアパタイトが使用され得る。該充填剤の粒サイズは、５ｍｍから最大でミクロン範囲のサイズの範囲であり得る。該充填剤がアパタイトである時、使用される該充填剤の粒サイズは５ないし１００ｎｍの範囲であり得る。

もう１つの具体例において、該充填剤は、脱灰骨、骨粉、骨形成蛋白質、硫酸カルシウム、自家骨、ワックスのビーズ、ゼラチンのビーズ、アガロースのビーズ、吸収性高分子またはその混合物である。これらは、単独でまたは一緒にのいずれかで使用され得、該アパタイトおよびカルシウム含有化合物に加えてまたはその代わりに使用され得る。

該複合体の調製のために、１つの具体例において、該液体は、いずれかの液体またはスラリーを形成することが可能な流体である。例えば、該液体は、水、有機溶媒、酸、塩基または界面活性剤であってよい。１つの具体例において、該液体は酸であり得る。該生体材料がコラーゲンである時、該液体は、該コラーゲンの適切な分散を可能にする酸であり得る。該液体は、塩または他の添加物を含み得る。さらなる具体例において、該液体は無機酸である。もう１つの具体例において、該液体は有機酸である。例えば、該液体はリン酸であってよい。使用され得る他の酸は、酢酸、乳酸、ギ酸、酒石酸、ソルビン酸、硫酸、塩酸、リン酸、アスコルビン酸、プロパン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸または他の酸を含む。該複合体は、炭酸カルシウムの組み込みを含み、炭酸カルシウムおよびリン酸以外の酸の間の反応が所望のリン酸カルシウムを生成し得ないため、リン酸を使用することが望ましい。

使用される酸は、例えば、約１ｍＭから最大約５００ｍＭといった、１０００ｍＭまでの濃度を有し得る。さらなる例として、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１０００ｍＭの酸。１つの具体例において、該酸は、最大で約１５０ｍＭの濃度を有する。もう１つの具体例において、該酸は、最大で約１００ｍＭまでの濃度を有する。該充填剤が炭酸カルシウムである場合、適当に約１ｍＭないし５００ｍＭ、例えば１００ｍＭのリン酸が使用される。該充填剤がアパタイトである場合、適当に約１ｍＭないし約５００ｍＭ、例えば５０ｍＭのリン酸が使用される。

１つの具体例において、該液体はリン酸であり、該充填剤は炭酸カルシウムである。この具体例において、該リン酸は、該炭酸カルシウムと反応して、該生体材料上に沈殿し得るリン酸カルシウムを形成し得る。

１つの具体例において、該液体が酸である時、該スラリーは、１００ｍｌの該酸当たり最大で約１０ｇの該生体材料、別法として、該１００ｍｌの該酸当たり最大で約９ｇ、最大で約８ｇ、最大で約７ｇ、最大で約６ｇ、最大で約５ｇ、最大で約４ｇ、最大で約３ｇ、最大で約２ｇ、最大で約１ｇまたは最大で約０．５ｇの生体材料を含み得る。１つの具体例において、該スラリーは、１００ｍｌの該酸当たり約０．６ｇの生体高分子を含む。もう１つの具体例において、該スラリーは、１００ｍｌの該液体当たり、約２ｇの生体高分子を含む。生体材料対液体の割合を制御することによって、該複合体の機械的特性および微細構造を修飾または制御することが可能である。

１つの具体例において、使用される充填剤の量は、生体材料：粉末の割合が、該複合体が挿入される該生体系に存在するものと同様であるように選択される。１つの具体例において、１００ｍｌの液体当たり、５ないし１５ｇの充填剤が使用される。別法として、約６ｇ、約７ｇ、約８ｇ、約９ｇ、約１０ｇ、約１１ｇ、約１２ｇ、約１３ｇ、約１４ｇの充填剤が、１００ｍｌの液体当たり使用される。１つの具体例において、１００ｍｌの液体、０．６ｇのコラーゲンおよび５ないし１５ｇの範囲の充填剤を含む第１の複合体／足場を調製して、より高い液体：固体比によるより高い多孔度を有する足場を得てもよい。もう１つの具体例において、１００ｍｌの液体、２ｇのコラーゲンおよび５ないし１５ｇの範囲の充填剤を含み、より低い多孔度を有するため骨の代替物としての挿入に有用であり得る第２の複合体／足場は、圧縮下であまり脆くなく、該第１の言及された足場より高い圧縮率を有する。

１つの具体例において、該混合物は、ミキサー中でホモゲナイズ／分散される。１つの具体例において、該ミキサーは、ボルテックスミキサーである。該混合物は、約１分間ないし約１０時間、ホモゲナイズ／分散されてよい。１つの具体例において、該混合物は、１０分間ないし約６時間、ホモゲナイズ／分散されてよい。例えば、該混合物は、約１時間、ホモゲナイズ／分散されてよい。さらなる例として、該混合物は、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０分間、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０時間、ホモゲナイズ／分散され得る。該スラリーは、１０００ないし６００００ｒｐｍにてホモゲナイズ／分散され得る。１つの具体例において、該混合物は、６０００ないし５００００ｒｐｍにて、例えば、約１４，０００ｒｐｍにてホモゲナイズ／分散されて、該スラリーを形成する。該ミキサーの速度の他の例は、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００ｒｐｍである。該混合物は、例えば、ホモゲナイゼーションの間氷漕中で、例えば４℃にて冷却されてもよい。冷却のための温度の他の例は、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃または３０℃を含む。１つの具体例において、該混合物は、さらに、超音波処理に付して、均質な分散を改善する。

本発明の方法に従って、該スラリーを凍結乾燥する。凍結乾燥によって、多孔度が該複合体中に作り出される。多孔度は、細胞結合および運動性を促進し得、血管を補助して、浸透させ、該足場を介して流体輸送を可能にし得る。１つの具体例において、該気孔サイズおよび多孔度は、冷凍速度および／または凍結乾燥前の該ホモゲナイズされたスラリーの水分含有量を制御することによって制御され得る。もう１つの具体例において、気孔サイズおよび多孔度は、適当な出発物質および量の選択によって制御され得る。リン酸のような酸および炭酸カルシウムのような炭酸塩がそれぞれ、液体または充填剤として使用される具体例において、さらなる多孔度は、該酸および炭酸塩の間の反応の間、二酸化炭素泡の生成によって達成され得る。

１つの具体例において、該複合体は、２つの冷凍速度（−８０℃または−２０℃の冷蔵庫）に付される。該冷凍乾燥プロトコルは、例えば、気孔の数およびサイズといった気孔構造を制御するように最適化されてもよい。

１つの具体例において、４℃であり得る氷漕からの該スラリーを、トレイに注ぎ、０℃ないし−５０℃の範囲、例えば、−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−３５℃、−４０℃、−４５℃であり得る温度にて維持された冷凍庫に入れる。１つの具体例において、該スラリーをトレイに注ぎ、約−２０℃の冷凍庫に入れ、該混合物の量によって１ないし１２時間の間、冷凍させる。例えば、該スラリーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間、冷凍されてもよい。該冷凍された混合物は、乾燥多孔度固体形態が、以下の除去および加熱段階を用いて得られるまで、冷凍乾燥されてもよい：
除去段階：該濃縮機温度が適切に約０℃および約−１０５℃の間であるように、使用される冷凍乾燥機を設定してもよい。例えば、約−４０および約−７５℃の間。使用される該冷凍乾燥機中の真空は、約４．５８ないし約０．００５トール（約０．６１ｋＰａないし約０．０００６７ｋＰａ）の間であるまで、引かれてもよい。例えば、約０．１５ないし約０．０３５トール（約０．０１２ないし約０．００４７ｋＰａ）の間。
加熱段階：該冷凍された混合物を、冷凍温度、例えば−２０℃から、室温環境に持ってきて、その間、同時に上記の真空に付してもよい。これによって、氷晶を昇華させて、気孔を後に残すことができる。

１つの具体例において、該スラリーは、約０℃ないし約３０℃、例えば約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃の温度にて、０ないし約６０分間、例えば約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５分間維持される。次いで、該温度は、約＜１ないし約５０℃／分のランプ速度にて、例えば、約１°、約５°、約１０°、約１５°、約２０°、約２５°、約３０°、約３５°、約４０°、約４５°／分のランプ速度にて、約−５℃ないし約−８０℃の範囲、例えば約−１０、−１５、−２０、−２５、−３０、−３５、−４０、−５０、−６０、−７０℃の最終温度まで適切に減少される。この最終温度は、約５分から最大で約１２時間またはそれ以上の間、適当に維持される。１つの具体例において、該濃縮機温度が約−１０５℃ないし約０℃の間、例えば約−４０℃および約−７５℃の間であるように、該冷凍乾燥機を、適当に設定してもよい。真空は、約４．５８トール（０．６１ｋＰａ）および約０．００５トール（０．０００６７ｋＰａ）の間、例えば、約０．１５トール（０．１２ｋＰａ）および０．０３５トール（０．００４７ｋＰａ）の間であるまで引いてもよい。

１つの具体例において、該複合体は、実質的に全ての水が昇華されるまで冷凍乾燥される。

生成される該複合体は、さらに、天然の骨のものと同様の複合体の特性を作成するように、例えば被覆物質の添加によって処理されてもよい。例えば、該生体材料は重合されてもよく、あるいは該スラリーはリジルオキシダーゼのような酵素によって処理されてもよい。もう１つの具体例において、該生体材料は、エステル化、アシル化、脱アミノ化または遮断薬で遮断されてもよい。添加剤は、該スラリーに添加されてもよい。例えば、線維補強、ポリペプチド、糖蛋白不凍剤、医薬品、抗生物質、成長因子または骨形成蛋白質を、該スラリーに添加してもよい。

１つの具体例において、該複合体は、細胞で調製してもよい。適当な細胞は、ケラチノサイト、脂肪細胞、肝細胞、ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、有足細胞、哺乳類上皮細胞、島細胞のような上皮細胞、大動脈、毛細血管および静脈内皮細胞のような内皮細胞、および皮膚繊維細胞、中皮細胞、幹細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、靱帯線維芽細胞、腱線維芽細胞、軟骨細胞または線維芽細胞のような間葉細胞を含むが、これらに制限されるものではない。

１つの具体例において、該冷凍乾燥された複合体は架橋される。架橋は、該複合体の圧縮率を増加させ、劣化への耐性を改善し得る。架橋は、該複合体を、より物質的に安定させ、水性媒体中に不溶性にすることがある。１つの具体例において、該複合体／足場劣化速度は、Biomaterials 25 (3) (2004) p 473-482においてY.S. Pek et al.によって記載されるような該複合体における架橋の程度を変動させることによって制御することができる。例えば、該冷凍乾燥された複合体は、それが硬質フォームまたはスポンジ状フォームまたは硬質フォームおよびスポンジ状フォームの間の中間を形成するように、架橋されてもよい。

１つの具体例において、該冷凍乾燥された生成物は、架橋に付されてもよい。もう１つの具体例において、該スラリーは、冷凍乾燥の前に架橋されてもよい。架橋は、アミド架橋のような架橋方法によって実施され得る。実施例１は、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いるアミド架橋の１つの方法を記載する。

他の架橋方法または架橋剤を使用してもよい。例えば、架橋の物理的、化学的および酵素的方法を使用してもよい。架橋は、アクリルアミド、ジオン、グルタルアルデヒド、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒドまたはリボースで実施され得る。ＵＶまたはガンマ線照射、脱熱水法のような他の照射方法を使用してもよい。

市場の現在の足場と比較して、本発明の足場は、より良い機械的特性および天然の骨に対する微細構造および化学的適合を有し、より骨誘導性である。

本発明の複合体／足場は、荷重負担適用に対する十分な機械的強度および十分な生物活性を有して、結合および増殖を促進するという利点を有する。本発明の物質は、天然の組織によって吸収性であり、機械的特性および劣化速度に対して調節可能であり得る。本発明の物質は、ほぼ約１００ないし６００ミクロン、例えば＝２００ミクロンの微孔質を有し得る。該物質は生体適合性であり、組織によって吸収され置換されることが可能である。本発明の１つの具体例における該複合体／足場は、骨のものと同等の多孔度を有する。

本発明の該複合体は、該複合体の移植によって骨を置換または修復する方法において使用することができる。

該複合体／足場は、整形外科的または他の荷重負担適用に適当である。該足場は、骨誘導性荷重負担硬組織移植片として使用することができ、また他の組織工学適用に使用することもできる。該足場は、大きな骨折および骨喪失の治癒を助けるのに実質的な吸収性骨として使用することができる。該足場は、該宿主動物の日常的な活動を、回復の間、支持するのに十分な強度を有する。それらは、迅速な細胞結合にインビボで十分な生物学的利用能を示す。該足場は、インビボおよびインビトロでの細胞成長のための包帯のため、止血剤としてまたは支持体としての代替組織の再生を可能にする組織修復または再構築において使用され得る。また、該足場は、蛋白質を含有する担体または送達用の薬物として使用され得る。該足場は、研究のためのモデル系として、または損傷されたまたは病気の組織を置き換えるためのまたは細胞によって占有された時、機能性組織になるように作り直される足場を提供するための補綴または移植片として使用することができる。該足場には、細胞を播くことができ、該足場が修復、再構築または置換されるのに使用される組織のものと同種の細胞を播くことができる。また、該足場には、幹細胞を播くことができる。該足場は、補綴または移植片として使用され得、ならびに皮膚、神経組織、血管組織、心臓組織、心膜組織、筋肉組織、眼組織、歯周組織、骨、軟骨、腱または靱帯のような結合組織、臓器組織、肝組織、腺組織、***組織、副腎組織、泌尿器組織および消化組織を修復するのに使用され得る。該足場は、ヒトを含む哺乳類のような適当な受取人に導入または移植され得る移植片として使用することができる。また、該足場は、皮膚包帯のような包帯としてまたは薬物送達に使用することができる。

本発明の複合体／足場は、局所、皮下、腹腔内または筋肉内投与され得る。

さて、本発明は、以下の具体的な実施例への言及をもって、より詳細に記載されるであろうが、本発明の範囲を制限するものとしては決して解釈されるべきではない。

実施例Ａ
以下の実施例は、本発明において使用され得るヒドロキシアパタイトの製法の記載である。この方法におけるヒドロキシアパタイトは、ゾルゲル法によって調製される。

以下の出発物質を使用した：
Ｃａ（ＮＯ_３）_２．４Ｈ_２Ｏ ｍｗ＝２３６．１５
（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ｍｗ＝１３２．０６

ｄＨ_２Ｏ（重水）中に０．０５Ｍないし０．５Ｍの硝酸カルシウムＣａ（ＮＯ_３）_２．４Ｈ_２Ｏを含有する第１の溶液を調製した。別個に、ｄＨ_２Ｏ中に０．０５Ｍないし０．５Ｍのリン酸アンモニウム（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４を含有する第２の溶液を調製し、それに適当な量のアンモニア溶液ＮＨ_４ＯＨを添加して、溶液の該ｐＨを約１０に調整した。次いで、該第１の溶液を、第２の溶液に滴下した。次いで、該溶液を、室温にて、１００時間、熟成させ、次いで、沈殿物を、遠心分離によって収集した。次いで該沈殿物を、アンモニア溶液ＮＨ_４ＯＨおよびｄＨ_２Ｏの減少する濃度の３つの部分で洗浄し、その後、二度、エタノールで洗浄した。

該得られたゲルを、時計皿上で、２４時間、空気乾燥し、さらに、１２時間、１２０℃にてオーブン乾燥した。該粉末を挽いて、次いで、該得られた挽かれた粉末を、ホットプレート上で乾燥し、所望により５００℃以上で、５時間、か焼した。微細構造を決定するために、この方法によって生成された乾燥ヒドロキシアパタイトの走査電子顕微鏡写真を撮影し、該結果を、ｘ１２０およびｘ２．３の解像度で、図３に示す。該粒は、（ＸＲＤ Ｘ線回折によると）約２５ｎｍであり、集まって、塊を形成した。

実施例Ｂ
以下の実施例は、本発明において使用され得る炭酸アパタイトの製法の記載である。この方法における該炭酸アパタイトは、以下のように、ゾルゲル法によって調製される。

以下の出発物質を使用した：
Ｃａ（ＮＯ_３）_２．４Ｈ_２Ｏ ｍｗ＝２３６．１５
（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ｍｗ＝１３２．０６
（ＮＨ_４）ＨＣＯ_３ ｍｗ＝７９．０６

ｄＨ_２Ｏ（重水）中に０．０５Ｍないし０．５Ｍの硝酸カルシウムＣａ（ＮＯ_３）_２．４Ｈ_２Ｏを含有する第１の溶液を調製した。別個に、ｄＨ_２Ｏ中に０．０５Ｍないし０．５Ｍのリン酸アンモニウム（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、０．０５Ｍないし０．５Ｍの炭酸アンモニウム（ＮＨ_４）ＨＣＯ_３および適当な界面活性剤を含有する第２の溶液を調製した。適量のアンモニア溶液ＮＨ_４ＯＨを添加して、該溶液のｐＨを約１０に調整した。次いで、該第１の溶液を、該第２の溶液に滴下した。次いで、該溶液を、１００時間、室温にて熟成させた。次いで、沈殿物を遠心分離によって収集した。次いで、該沈殿物を、アンモニア溶液ＮＨ_４ＯＨおよびｄＨ_２Ｏの減少する濃度の３つの部分で洗浄し、引き続いて、二回、エタノールで洗浄した。

該得られたゲルを、２４時間、時計皿上で空気乾燥させ、さらに、１２時間、１２０℃にてオーブン乾燥した。該粉末を挽いて、次いで、該得られた挽かれた粉末を、ホットプレート上で乾燥させた。

実施例１
図１は、本発明の１つの具体例に従って、足場を生成するための概略図を示す。この具体例において、１型コラーゲンを、図２に示すように使用する。図２は、本発明での使用に適当な乾燥コラーゲンの、ｘ１２０およびｘ２．３の解像度での走査電子顕微鏡写真である。該微細構造は、薄いフィルム状シートと混合した、直径が約１．５ないし２μｍの原線維を示す。

図１に示されるように、１型コラーゲンおよびリン酸を、スラリーへと組合せ、ホモゲナイズし、炭酸カルシウムおよび／またはアパタイト（ＨＡＰ、ＦＡＰ、ＣＡＰ、またはＺｒＣＡＰのようなもの）のいずれかを該スラリーに添加する。次いで、該スラリーをホモゲナイズし、それにより、リン酸カルシウムおよび／またはアパタイトを、該コラーゲン線維上に、散在させ、沈殿させる。

次いで、該スラリーを冷凍乾燥し、その後架橋して、スポンジ状フォームを形成する。該冷凍乾燥された生成物は、以下のプロトコルによって架橋され得る：
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド （ＥＤＣ／ＮＨＳ）架橋プロトコル − Olde Damink et al., Biomaterials 17 (1996) 765-773のプロトコルから修飾。
ＥＤＣは、１９７ｇ／ｍｏｌの分子量を有するため、例えば、０．２７６ｇが１００ｍｌ当たり使用される。ＮＨＳは１１５ｇ／ｍｏｌの分子量を有するため、例えば、０．０６４ｇが１００ｍｌ当たり使用される。

（１）本発明の該空気乾燥したマトリックスを、最終容量の脱イオン水の半分で水和する（例えば、冷凍乾燥した生成物の１００ｍｌ最終容量につき、５０ｍｌの滅菌脱イオン水中で水和）。
（２）この後、最終容量の脱イオン水の半分の中に、ＥＤＣおよびＮＨＳを溶解する（例えば、１００ｍｌの最終容量につき、５０ｍｌの滅菌脱イオン水中で溶解）。この溶液は、適当に、各使用につき、新たに作成される。該最終濃度は、０．０１４Ｍ ＥＤＣおよび０．００５Ｍ ＮＨＳである；
（３）該ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を、０．２ｍｍフィルターを介して、滅菌容器へと（または該水和マトリックスを含有する容器へと直接的に）滅菌ろ過する。適当に、６ｍｍｏｌ ＥＤＣ／ｇコラーゲンを、５：２のＥＤＣ：ＮＨＳ比で使用する；
（４）室温にて、約２時間、架橋する；
（５）溶液を、有害廃棄物として捨てる；
（６）滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で、マトリックスを濯ぎ、新しい、滅菌ＰＢＳに変え、約２時間インキュベートする；
（７）約２ｘ１０分間、滅菌脱イオン水中で二回注ぎ、次いで
（８）使用の前に、１週間まで、４℃で保存する。

架橋足場を、記載のとおり生成させた。

該最終生成物に対する以下の合成パラメーターの効果を比較した：
（ｉ）微細構造（例えば、気孔特徴）および機械的特性（例えば、圧縮率）に対する冷凍速度の効果；
（ｉｉ）微細構造（例えば、気孔特徴）および機械的特性（例えば、圧縮率）および化学的組成物および結晶相上の無機粉末：スラリー比に対する効果；
（ｉｉｉ）微細構造（例えば、気孔特徴）および機械的特性（例えば、圧縮率）に対するＥＤＣ／ＮＨＳの効果。

多くのコラーゲン−無機足場を、種々の冷凍速度、粉末：スラリー比および任意の架橋を用いて、調製した。比較テストを、整形外科および歯科用材料のために、工業規格６０３９：１９８１に従って、３７℃にて、模擬体液（ＳＢＦ）において実施した。各圧密点を、８つの試料の平均から得た。最初の圧縮率を、気孔の圧縮から得、最終圧縮率を、該気孔が壊れた後の該バルク材料の圧縮から得た。該圧縮テストの結果を、図４Ａないし４Ｂにおいて示す。図４Ａは、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸、４ｇのコラーゲンおよび１０ｇのヒドロキシアパタイトを用いて生成された足場に対する圧縮曲線である。図４Ｂは、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸、２ｇのコラーゲンおよび５ｇの炭酸アパタイトを用いて生成された足場に対する圧縮曲線である。図４Ｃは、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸、２ｇのコラーゲンおよび５ｇのヒドロキシアパタイトを用いて生成された足場に対する圧縮曲線である。図４Ｄは、１００ｍｌの１００ｍＭリン酸、２ｇのコラーゲンおよび５ｇの炭酸カルシウムを用いて生成された足場である。該足場は、−２０℃にて冷凍された。

圧縮テストは、より冷たい最終冷凍温度への遅い冷凍速度が、冷凍乾燥後により大きい気孔になるより大きい氷晶を生じることを示す。しかしながら、冷凍の速度は、多孔度に対して明かな効果を有さない。圧縮テストは、−８０℃の最終冷凍温度は、−２０℃と比較して、全試料に対してずっと低い圧縮率を招くことを示す。従って、該冷凍乾燥温度は−５０℃を下回らないことが推奨される。他の者は、−８０ないし−５０℃で、該コラーゲン構造への損傷を報告しており−Fois et al., J. Polym. Sci. Part B−Polym. Physics, 38 (7) (2000) 987-992、これは、より低い最終圧縮率を説明し得る。

該最終圧縮率（１００−３００ＭＰａ）は、該粉末：スラリー比を変動させることによって調整し得ることが分かっている。高い粉末：スラリー比は、高い初期圧縮率を生じる：しかしながら、もしこの比が高すぎると、該コラーゲンマトリックスは、全粉末を保持することができず、過剰な粉末は、圧縮の間、浸出して、該最終圧縮率において有意な改善を見せないかあるいは減少さえ見せない。適当に、粉末：スラリーの重量比は、最大５ないし１５ｇの粉末：最大１０ｇのコラーゲン／１００ｍｌの液体溶液である。

該架橋が、より高い圧縮率を生じることが分かっている。

実施例２
本発明によって作成されるコラーゲン−無機足場の種々の顕微鏡写真を入手し、骨梁のものと比較した。

図５に示されるように、種々の解像度での骨梁の顕微鏡写真は、濃密であるように見え、〜３００ないし４００μｍのいくつかの大きい気孔ならびに〜３０ないし５０μｍのより小さい気孔ならびにナノメートルサイズの気孔を有する。

図６は、１００ｍｌの５０ｍＭのリン酸、４ｇのコラーゲンおよび７．５ｇのＣＡＰ（炭酸アパタイト粉末）から作成されたＣＰＣＡＰ足場に対する種々の解像度での顕微鏡写真を示す。

この物質は、ＣＡＰ粒子の間の隙間からの〜２００ないし３００μｍの大きな気孔、ならびに〜２０ないし３０μｍのより小さい気孔およびナノメートルサイズの気孔をもって、微細構造において骨と最も近い適合を有することが、図６から分かる。

図７は、実施例１に記載のように、同一の足場製造方法を用いて、１００ｍｌの５０ｍＭの液体、４ｇのコラーゲンおよび１２ｇのＨＡＰ（ヒドロキシアパタイト）粉末から作成されたＣＰＨＡＰ足場に対する種々の解像度での顕微鏡写真を示す。この物質は骨のようであるが、ＨＡＰ粒子の間の隙間からの〜３００μｍのさらなる大きな気孔（該冷凍速度を最適化することによって入手可能）、〜２０ないし３０μｍの多くの気孔ならびにナノメートルサイズの気孔を必要とする。

図８は、実施例１に記載の方法を用いて、１００ｍｌの１００ｍＭリン酸、４ｇのコラーゲンおよび１０ｇの炭酸カルシウム粉末から作成されたＣＰＣ足場に対する、種々の解像度およびＥＤＸ（エネルギー分散Ｘ線）スペクトルでの顕微鏡写真を示す。この物質は骨のように見えるが、〜３００μｍのより大きい気孔（該冷凍速度を最適化することによって入手可能）を必要とする。該ＥＤＸスペクトルは、該粒子が、酸性炭酸塩反応から得られるリン酸カルシウムの何らかの形態であることを示す。

実施例３
足場生成物のＸＲＤおよびＦＴＩＲ研究を行った。図９は、実施例１に記載の方法を用いて作成された種々のコラーゲン−炭酸アパタイト（ＣＰＣＡＰ）およびコラーゲン−ヒドロキシアパタイト（ＣＰＨＡＰ）足場および天然の骨のものに対するＸＲＤパターンを示す。天然の骨との最良の適合は、該同一足場における最適な比率で、ＣＡＰおよびＨＡＰ粉末を合わせることによって得ることができると予測される。図１０は、コラーゲン−炭酸カルシウム足場に対する種々のＸＲＤパターンを示し、ここに該スラリー濃度は、実施例１に記載の一般的な方法を用いて、１００ｍｌの１００ｍＭのリン酸当たり０．６ｇのコラーゲンであった。また、ブラッシュ石および炭酸カルシウムに対するＸＲＤパターンが示される。該ＸＲＤパターンは、粉末：スラリー比によって変動することが分かる。

図１１は、出発物質および実施例１の方法によって作成された足場のフーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴＩＲ）および天然の骨のものを示す。本発明の足場は、化学構造において、天然の骨と近似に適合することが分かる。

実施例４
ＭＣ３Ｔ３骨芽細胞によるインビトロ研究は、優れた細胞結合および本発明の物質上の増殖を示す。この実施例において、ＭＣ３Ｔ３（マウス骨芽）細胞は、１週間、本発明の足場上で、１００ｍｌの５０ｍＭのリン酸、０．６ｇのコラーゲンおよび１ｇのヒドロキシアパタイトから作成された足場を用いて培養した。結果を図１２に示す。細胞が、該足場に結合し、その中の気孔部位を占有することが分かる。

実施例５
ＳＣＩＤマウスへの足場の６０日間の子宮外着床のインビボ研究を、１００ｍｌの５０ｍＭのリン酸、２ｇのコラーゲンおよび５ｇのヒドロキシアパタイトから作成された足場を用いて実施した。全ての動物は、実験の完全な二ヶ月の間、生存し、有害な副作用は観察されなかった。結果を図１３に示す。この研究は、ＳＣＩＤマウスに対する該子宮外インビボ着床を示し、これは、本発明の足場材料における骨、組織および血管形成の証拠を示す。結果は、該足場は生体適合性であり、成長、血管新生、骨単位形成および骨ミネラル化において組織に対して十分な支持を有することを示す。これは、図１４ないし１７において示された組織学的結果によって確認される。

図１４および１５は、８日および３０日後のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。リン酸カルシウムを含有し得る組織カプセルおよび空間が、認識できることが、図から分かる。加えて、カプセル形成、新たな骨単位、劣化足場、血管形成、フィブリンネットワーク、新たなコラーゲンマトリックスおよび皮膚組織が見える。

図１６および１７は、８および３０日後のＶｏｎ Ｋｏｓｓａ染色を示す。図から、カルシウム塩および組織が見えることが分かる。該足場は、新たな組織、新たな骨単位、新たな骨マトリックス、新たな骨物質および統合された骨ミネラルおよび足場によって置き換えられる。該研究は、Ｗｉｓｔａｒ／ＳＤラット大腿上の重大なサイズの欠陥における本発明の足場材料のインビボ移植によって、外部の支持ギブスの必要なしで、該欠陥領域の首尾良い治癒および機能を得たことを示す。該周囲の宿主組織と該足場の首尾良い統合があった。

実施例６
本発明の多孔度コラーゲン系骨移植片のインビボ荷重負担可能性を決定した。多孔度骨移植片を、骨置き換え目的のために、コラーゲンおよびリン酸カルシウムから合成した。

Ｗｉｓｔａｒ／ＳＤラットを、この種が、同様の性質のインビボ研究に最も一般的に使用されるもののうちの１つであるため、選択した。平均重量が１８０ないし２２０ｇの３０の雌の動物を使用した。使用した該ラットを、手術前１週間、観察した。手術の直前、該ラットを、＜０．１ｍｌ／１００ｇの動物重量を用いて、ＩＰ（腹腔内）によって、ネンブタール注射溶液で麻酔をかけた。疼痛反射のためのつま先ピンチテストを用いることによって、該動物が適切に麻酔をかけられたことを確証した。手術は、各動物につき、１大腿に対して行うのみであった。該手術領域を剃って、過剰な表面の毛を除去し、その後、７０％のエタノールで異所滅菌した。

動物の皮膚を切り、筋肉を剥離して、該大腿を暴露した。該大腿骨幹中部を暴露するためのプロトコルは以下の通りであった：
１．大腿骨骨幹軸の丁度頭方にある曲がった切開；
２．もし切開が該軸の直接上であれば、大腿二頭筋（ＢＦ）に当たる；
３．ＢＦを切開しない；
４．ＢＦの頭方にある大腿筋膜を切開する；
５．頭方に外側広筋を縮める；
６．ＢＦを尾方に縮める；次いで
７．大腿を切断する；

３ｍｍの長さの骨を、外科用のこぎり（または必要に応じて同様のツール）を用いて、該大腿の中央部から除去して、該大腿を貫通して切断した。

適切なサイズの足場を、該骨の除去によって作り出されたギャップへの圧縮されたかみ合いで挿入した。足場を、ステンレス鋼（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ）ピンおよび／またはワイヤを用いて、位置に固定した。

手順は以下のとおりであった：
１．ピンを、逆行様式で挿入して、転子窩を介して近くに出す；
２．動物の腰を拡張し、大腿を、転子切痕を介して、押しピン上に内転して、坐骨神経を避け、足場を挿入する；次いで
３．８の字形ワイヤ固定を、さらなる支持体に使用する。

外傷部位の筋肉および皮膚を、絹縫合（Ｎｏ．４）を用いて、縫合して閉じた。

手術後、該動物を、２２℃にて、休憩室に保持して、回復させ、必要に応じて、食物および飲み物を消費させた。

該動物を、少なくとも１週間、順応させた（つまり、術前管理）。必要に応じて、ブプレノルフィンを、術後疼痛に対して、皮下投与した。該動物を、約３週間、術後、毎日検査した。

該動物を、吸引による二酸化炭素の過剰摂取を用いて安楽死させた。

２ヶ月間移植された足場から得られた予備Ｘ線は、取り外し可能な固定ピンによる何らかの骨治癒を示した。

図１８は、上記の方法によって、Ｗｉｓｔａｒラット大腿（荷重負荷）に移植された本発明による足場の６ヶ月間の移植を示す。該結果は、該足場が、適当な吸収性骨置換物質であって、大きな骨折および骨喪失の治癒を助けることを示す。本発明の足場は、該宿主動物の日々の活動を、回復の間、支持するのに十分な力を有する。加えて、それらは、迅速な結合および増殖に十分なインビボ生物学的利用能を示す。

一部のラットを、移植後５ヶ月で屠殺し、大腿をＸ線のために除去した。図１９において示されるように、Ｘ線は、図１９Ａの本発明による足場（ＹＳＰ−ＩＢＮと印されたコラーゲン−ヒドロキシアパタイト）が、空の対照図１９Ｃと比較して、商業用足場（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のものより首尾良い足場であったことを示す。

産業上の利用性
本発明の複合体は、多くの歯科用、整形外科用、医薬用、医学用、獣医学用の適用で使用することができ、なかでも、止血剤、組織修復用足場または細胞成長のための支持体として使用することができる。

開示された特異的な具体例に示されるように、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、広範に記載されるように、数多くの修飾および／または変更を、本発明になすことができることが、当業者によって理解されるであろう。従って、本明細書中に開示された特異的な具体例は、あらゆる点で、説明としてのものであり、限定的なものではないと考えられるべきである。

さて、本発明の好ましい形態は、添付の図面への言及をもって、一例として記載されるであろう。

図１は、本発明の複合体材料（骨足場）を調製する適当な方法の模式図である。 図２は、本発明での使用に適当なコラーゲンの一組の走査電子顕微鏡写真である。 図３は、本発明での使用に適当なヒドロキシアパタイトの一組の走査電子顕微鏡写真である。 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、本発明による種々の多孔度足場の下部に関するストレスのグラフである。 図５は、種々の解像度での骨梁の一組の走査電子顕微鏡写真である。 図６は、種々の解像度での本発明の１つの具体例によるコラーゲン−無機足場の一組の走査電子顕微鏡写真である。 図７は、種々の解像度での本発明のもう１つの具体例によるコラーゲン−無機足場の一組の走査電子顕微鏡写真である。 図８は、本発明のもう１つの具体例によるコラーゲン−無機足場の種々の解像度およびＸＲＤスペクトルでの一組の走査電子顕微鏡写真である。 図９は、天然の骨および炭酸ヒドロキシアパタイトのものと比較した、本発明による２つのコラーゲン−無機足場に対するＸＲＤパターンを示すグラフである。 図１０は、炭酸カルシウムおよびブラッシュ石のものと比較した、本発明による４つのコラーゲン−無機足場に対するＸＲＤパターンを示すグラフである。 図１１は、種々の出発物質、本発明の１つの具体例によるコラーゲン−無機足場および天然の骨梁の該ＦＴＩＲスペクトルである。 図１２は、本発明の１つの具体例による足場上で一週間培養したＭＣ３Ｔ３（マウス骨芽細胞）の一組の走査電子顕微鏡写真である。 図１３は、ＳＣＩＤマウスへの本発明による足場の６０日間の子宮外着床の写真である。 図１４は、８日後にヘマトキシリンおよびエオシンによって染色された本発明による移植された足場組織の顕微鏡写真である。 図１５は、３０日後にヘマトキシリンおよびエオシンによって染色された本発明による移植された足場組織の顕微鏡写真である。 図１６は、８日後にｖｏｎ Ｋｏｓｓａによって染色された本発明による移植された足場組織の顕微鏡写真である。 図１７は、３０日後にｖｏｎ Ｋｏｓｓａによって染色された本発明による移植された足場組織の顕微鏡写真である。 図１８は、６ヶ月間移植された本発明による足場を有するＷｉｓｔａｒラット大腿の一組の写真である。 図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、移植後５ヶ月での本発明による足場を有するＷｉｓｔａｒラット大腿のＸ線（図１９Ａ）および商業用足場を有するＷｉｓｔａｒラット大腿のもの（図１９Ｂ）または全く足場を有さないＷｉｓｔａｒラット大腿のもの（図１９Ｃ）である。

Claims (33)

1. 充填剤を散在させた生体材料を含み、天然の骨の多孔度に近い多孔度を有する多孔度生体材料−充填剤複合体。
2. 該複合体が、約１００ミクロンを超えるサイズを有する気孔を有し、ここに気孔が約３０および５０ミクロンの間のサイズおよび小さなナノメートルサイズの気孔を有する請求項１記載の複合体。
3. 該複合体が少なくとも約２５重量％生体材料を含有する請求項１記載の複合体。
4. 該複合体が、約２５％ないし約５０重量％（乾燥重量）の生体材料を含有し、ここに充填剤の量が約３５ないし約７５重量％（乾燥重量）の間である請求項１記載の複合体。
5. 該複合体が、３０ないし３５重量％のコラーゲンおよび６５ないし７０％のヒドロキシアパタイトを含有する請求項１記載の複合体。
6. 該充填剤が、既に、ゾルゲル法によって調製されている請求項１記載の複合体。
7. 該生体材料が、１以上の胎児組織、皮膚／真皮、筋肉または結合組織から選択される生体組織から抽出された物質である請求項１記載の複合体。
8. 該生体材料が生体高分子である請求項１記載の複合体。
9. 該生体材料が、１以上の蛋白質、ペプチド、多糖または他の有機物質から選択される請求項１記載の複合体。
10. 該生体材料が、１以上の細胞外マトリックス蛋白質、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、リンク蛋白質、骨シアロ蛋白質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、アンデュリン、エピリグリン、カリニン、プロテオグリカン、デコリン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ケラチン、ケラチン硫酸プロテオグリカン、アグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、へパリン硫酸プロテオグリカン、バイグリカン、シンデカン、パールカン、セルグリシン、グリコサミノグリカン、へパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、多糖類、へパリン、デキストラン硫酸、キチン、アルギン酸、ペクチン、キシラン、ポリビニルアルコール、サイトカイン、配糖体、糖蛋白質、ポリピロール、アルブミン、フィブリノゲン、またはリン脂質から選択される請求項１記載の複合体。
11. 該生体材料がコラーゲンである請求項１記載の複合体。
12. 該コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、またはその混合物よりなる群から選択される１以上である請求項１１記載の複合体。
13. 該コラーゲンが1型コラーゲンである請求項１２記載の複合体。
14. フォーム、ゲル、架橋スポンジ状フォーム、硬質フォームまたは繊維を含む他の構築体の形態である請求項１記載の複合体。
15. 足場の形態である請求項１記載の複合体。
16. 該充填剤が、１以上の無機化合物を含む請求項１記載の複合体。
17. 該充填剤が：
    （ｉ）炭酸カルシウムまたはカルシウム含有塩；
    （ｉｉ）リン酸カルシウム；または
    （ｉｉｉ）炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウムの組合せを含む請求項１６記載の複合体。
18. 該リン酸カルシウムが、ブラッシュ石、リン酸三カルシウムまたはリン酸オクタカルシウムである請求項１７記載の複合体。
19. 該アパタイトが、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）、フルオロアパタイト（ＦＡＰ）、炭酸アパタイト（ＣＡＰ）またはジルコニウムヒドロキシアパタイト（ＺｒＨＡＰ）から選択される請求項１７記載の複合体。
20. 該充填剤が、該ゾルゲル法によって調製された、約８ないし約２０ｎｍの間の粒子サイズを有する炭酸アパタイトまたは該ゾルゲル法によって調製された、約４０ないし約６０ｎｍの間の粒子サイズを有するヒドロキシアパタイトである請求項１記載の複合体。
21. 該充填剤が、脱灰骨、骨粉、骨形成蛋白質、硫酸カルシウム、自家骨、ワックスのビーズ、ゼラチンのビーズ、アガロースのビーズ、吸収性高分子またはその混合物である請求項１記載の複合体。
22. 該複合体が、充填剤を散在させた生体材料を含み、該複合体が約１００ミクロン以上のサイズを有する気孔、約３０および約５０ミクロンの間のサイズを有する気孔およびナノメートルサイズの気孔を含む多孔度生体材料−充填剤複合体。
23. 該複合体が、充填剤を散在させた生体材料を含み、生体材料対充填剤の該乾燥重量比が１：３ないし２：１の範囲である多孔度生体材料−充填剤複合体。
24. 該複合体が、乾燥重量が２５ないし６５重量％の生体材料および３５ないし７５重量％充填剤を含む請求項２３記載の複合体。
25. 該複合体が、充填剤を散在させた生体材料を含み、ここに、生体材料の量が、少なくとも約２５重量％である多孔度生体材料−充填剤複合体。
26. 該複合体が、充填剤を散在させた生体材料を含み、ここに、該複合体充填剤が、ゾルゲル法によって調製されている多孔度生体材料−充填剤複合体。
27. 生体材料、液体および充填剤を合わせて、混合物を形成し、該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、次いで、該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法。
28. 生体材料および液体を合わせて混合物を形成し、
    該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、
    充填剤を該スラリーに添加し；
    さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
    該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法。
29. 充填剤を液体と合わせて、混合物を形成し、
    該混合物をホモゲナイズして、スラリーを形成し、
    生体材料を該スラリーに添加し；
    さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
    該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成することを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法。
30. 生体材料、液体および充填剤を合わせて、混合物を形成し、
    該混合物をホモゲナイズして、スラリーを形成し、次いで
    該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成し、ここに該液体は酸であり、該スラリー中の生体材料の量は、最大１０００ｍＭの酸の１００ｍｌ当たり最大約１０ｇの生体材料の範囲であることを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法。
31. 生体材料および液体を合わせて、混合物を形成し、
    該混合物をホモゲナイズしてスラリーを形成し、
    充填剤を該スラリーに添加し；
    さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
    該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成し、ここに、該液体は酸であり、該スラリー中の生体材料の量は、最大１０００ｍＭの酸の１００ｍｌ当たり最大約１０ｇの生体材料の範囲であることを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法。
32. 充填剤および液体を合わせて、混合物を形成し、
    該混合物をホモゲナイズして、スラリーを形成し、
    生体材料を該スラリーに添加し；
    さらに該スラリーをホモゲナイズし；次いで
    該スラリーを凍結乾燥して、多孔度生体材料−充填剤複合体を形成し、ここに該液体は酸であり、該スラリー中の生体材料の量は、最大１０００ｍＭの酸の１００ｍｌ当たり最大約１０ｇの生体材料の範囲であることを特徴とする多孔度生体材料−充填剤複合体の製法。
33. 請求項２７、２８、２９、３０、３１または３２記載の方法によって調製された複合体。

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