CN114755355B - 磷脂脱除剂及其在生物样品脱磷脂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物样品处理以及测定领域，具体涉及一种磷脂脱除剂，包含成分A和成分B；所述的成分A包含葡聚糖盐、碱化的胶体二氧化硅中的至少一种；所述的成分B包含镧源、锆源中的至少一种。本发明还提供利用所述的磷脂脱除剂进行生物样品脱磷脂以及测定方法。本发明研究表明，采用所述的成分A和成分B联合，能够实现协同，能够克服生物样品中磷脂识别脱除率低的问题，此外，对生物样品中的不同类别的磷脂具有普适性，可以有效脱除生物样品中的各类磷脂。

Description

磷脂脱除剂及其在生物样品脱磷脂中的应用
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及生物样本前处理领域。
技术背景
高效液相色谱-串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术是目前生物样品中药物及其代谢物分析的主流方法。但是，LC-MS/MS用于生物样品分析极易产生基质效应，基质效应的发生会导致待测组分的离子化效率发生变化，直接影响生物样品定量分析结果的可靠性，成为LC-MS/MS技术用于生物样品定量分析中最突出的问题之一。磷脂被证明是导致基质效应发生的主要成分，它能够严重抑制许多化合物的质谱响应，且通过传统的样本处理方法很难将其从生物样品中去除。磷脂作为细胞膜的主要成分，在各种类型的生物样品中(如血浆和组织等)都含量显著。比如，人血浆中磷脂总浓度高达1.6-3.0mg/mL。磷脂依其主链结构可分为甘油磷脂(Phosphoglyceride)和鞘磷脂(Sphingomyelin,SM，约占总磷脂的15％)。前者主要包括磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)、溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine,Lyso-PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)等，PC和Lyso-PC分别占总磷脂量的70％和10％。改善样品的前处理过程，尽可能地减少最终提取液中的磷脂，才能从根源上消除基质效应。
目前，LC-MS/MS生物分析中最常用的样品前处理方法主要包括：
1、蛋白沉淀法(PPT)：PPT是应用最早、耗时最少、被广泛应用于生物分析的样品前处理方法，具有简单、快速、经济的特点，是常用甚至首选的样品前处理方法。生物样品如血样在LC-MS/MS分析测定之前，必须首先进行去蛋白处理。通过加入蛋白沉淀剂(如甲醇和乙腈)，使蛋白质变性，然后再涡旋、离心，形成蛋白沉淀和上清液，分离的上清液可直接进样或经稀释后进样检测。
2、液液萃取法(LLE)：LLE是采用与水不相溶的有机溶剂(如乙酸乙酯)，将目标分析物从水相提取至有机相的方法。进行LLE处理包括加有机溶剂、涡旋混合、离心、吹干、复溶等基本步骤，操作时需要根据分析物的性质，考虑有机溶剂的特性、溶剂体积及pH对提取效果的影响，样品处理时宜选择对分析物溶解度大，沸点低，易浓缩，与水不相溶，无毒，稳定，不易乳化的有机溶剂。
3、固相萃取法(SPE)：SPE基于样品基质各种组分不同的分配系数，使目标分析物保留并洗脱下来，同时选择性地去除样品基质中的杂质(干扰物)。SPE利用萃取小柱或96-微孔板，填装不同类型的固相吸附填料，实现不同的分离模式(反相、正相和离子交换等)，选择性保留分析物而使干扰物流出，或者反之，从而达到净化样品的目的。
由于磷脂类化合物为两性分子，分子结构一端是碱取代基团构成的亲水头，另一端为脂肪酸链构成的疏水尾。传统的生物样品处理方法如蛋白质沉淀、液液萃取和固相萃取，都难以有效去除样品中的磷脂成分。PPT仅可去除蛋白质，不能去除磷脂，因此最容易产生明显的基质效应。LLE可去除样品中的部分磷脂，但仍有大量磷脂因其较强的疏水脂肪酸链而与分析物共提取，且LLE过程相对繁琐，对极性化合物提取回收率低。SPE虽可选择性地提取洗脱分析物，但依然无法高效去除磷脂成分，且SPE价格高昂、处理过程繁琐。
发明内容
针对现有生物样品磷脂脱除手段存在脱除普适性不理想、脱除率不高的问题，本发明的第一目的在于，提供一种磷脂脱除剂，旨在通过成分的协同，改善生物样品磷脂脱除普适性以及脱除率。
本发明第二目的在于，提供利用所述的磷脂脱除剂制备生物待测样品的方法。
本发明第三目的在于，提供一种生物样品的测定方法。
生物样品成分复杂，例如，大多数生物样品中均含有无机盐(如Na+、K+)、蛋白质(如纤维蛋白原、脂蛋白)、磷脂(如PC、SM)、维生素(如A、D、E、K)等物质，给生物样本中磷脂选择性脱除造成极大困难。另外，生物样品中的磷脂的类别种类繁多，且不同磷脂的脱除性能存在一定的差异，现有脱磷脂的手段对生物样品中的各类磷脂的普适性不理想，针对现有生物样品的磷脂脱除普适性不理想、脱除率不高等问题，本发明提供了以下改进方案：
一种磷脂脱除剂，包含成分A和成分B；
所述的成分A包含葡聚糖盐、碱化的胶体二氧化硅中的至少一种；
所述的成分B包含镧源、锆源中的至少一种。
本发明研究表明，采用所述的成分A和成分B联合，能够实现协同，能够克服生物样品中磷脂识别脱除率低的问题，此外，对生物样品中的不同类别的磷脂具有普适性，可以有效脱除生物样品中的各类磷脂。例如，本发明研究表明，所述的协同的脱除剂能够有效脱除生物样品如血液样品中普遍存在且难于脱除的溶血磷脂酰胆碱等磷脂成分。
本发明中，所述的成分A和成分B的联合是协同改善生物样品不同类别磷脂普适性脱除的关键。
本发明中，磷脂脱除剂，成分A包含葡聚糖盐且成分B包含镧源；或者，成分A包含葡聚糖盐且成分B包含锆源，或者成分A包含碱化的胶体二氧化硅且成分B包含锆源。优选地，所述的磷脂脱除剂中，成分A包含葡聚糖盐且成分B包含镧源。本发明优选的磷脂脱除剂的组合，能够进一步实现协同，进一步利于改善生物样品中的各磷脂成分的普适性以及脱除效果。
本发明中，所述的葡聚糖盐为水溶性葡聚糖盐，优选为葡聚糖硫酸盐、进一步优选为葡聚糖硫酸钠。
所述的碱化的胶态二氧化硅为溶解有氨/氢氧化铵的二氧化硅混悬液(w/v)。优选地，二氧化硅的含量为35～45％(w/v)。
优选地，所述的镧源、锆源为各自金属元素的氧化物、络合物、水溶性盐中的至少一种；进一步优选为各自金属元素的氯化盐、硫酸盐、硝酸盐、有机酸盐中的至少一种。
本发明研究表明，进一步控制成分A和成分B的比例，能够进一步提升协同性，能够进一步改善生物样品中的不同类型的磷脂的识别以及脱除效果。
作为优选，所述的成分A和成分B的摩尔比为0.01～25:0.01～10。
优选地，所述的成分A为葡聚糖盐，成分A和成分B的摩尔比为0.01～2:0.01～6.25；进一步优选，所述的成分A为葡聚糖盐，成分B为镧源，所述的成分A和成分B的摩尔比为0.17～2:0.01～5；优选为0.4～1.7:1～5，最优选为0.4～1.7:1～2.5。或者，成分A为葡聚糖盐，成分B为锆源，所述的成分A和成分B的摩尔比为0.02～2:0.5～6.25；优选为0.1～1.7:2.5～5。
优选地，所述的成分A为碱化的胶体二氧化硅，成分A和成分B的摩尔比为4～22:0.5～5；优选为10～22:1～5。
本发明中，成分A为葡聚糖盐下，可以获得更优的协同效果，不仅如此，在优选的比例下，能够进一步协同改善生物样品中的磷脂脱除率。
本发明所述的磷脂脱除剂，所述的成分A和成分B在使用前独立存在，或者以混合物形式存在；
优选地，所述的磷脂脱除剂以固体、溶液中的至少一种形式存在。所述的溶液形式可以为水溶液形式。
本发明中，所述的磷脂包含磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油中的至少一种；优选地，所述的磷脂至少包含溶血磷脂酰胆碱；进一步优选包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂中的至少一种。
本发明还提供了一种生物待测样品中的制备方法，将生物样品和本发明所述的磷脂脱除剂成分混合，随后固液分离，得到脱磷脂样品。
本发明中，创新地通过所述的磷脂脱除剂对生物样品进行处理，能够有效识别脱除生物样品中的各类磷脂，改善磷脂的脱除率，如此能够有效降低磷脂所致的基质效应。
本发明中，所述的生物样品为血液、尿液、唾液、细胞、脏器组织、乳汁、脑脊液、胆汁、粪便和胃液中的至少一种；
本发明中，可以将生物样品和所述的磷脂脱除剂的混合物混合，或者将生物样品按任意顺序和磷脂脱除剂中的成分先后混合。例如，将生物样品预先和所述的磷脂脱除剂成分中的成分A或成分B混合，随后再和剩余组分混合，脱磷脂后再进行固液分离，得到脱磷脂样品。
优选地，固液分离的手段为离心。
本发明优选的制备方法，对脱磷脂样品进行脱蛋白处理，制得待测样品。
所述的脱蛋白处理可以是行业内惯用和公知的手段。
本发明还提供了一种生物样品的测定方法，采用本发明所述的方法得到待测样品，随后进行色谱和/或质谱测定。
本发明中，通过本发明所述的磷脂脱除剂，如此能够有效脱除生物样品中的磷脂，能够有效降低后续测定的基质效应，改善测定的效果。
本发明中，所述的色谱以及质谱测定方法可基于现有手段实现。
本发明更具体的测定方法，包括以下步骤：
1)将待测生物样本溶液(如血清或血浆样品)加入离心管中；
2)接着加入需要量的成分A溶液到待测生物样本溶液中，涡旋处理；再加入所需量的成分B溶液，涡旋处理；随后高速下(如10000хg)离心处理，去除生物样品中的磷脂；
3)吸取离心后上清液样本于离心管中，加入蛋白质沉淀剂(如乙腈)，涡旋处理后，高速下(如10000×g)离心，去除生物样品中的蛋白质；
4)吸取蛋白沉淀后的上清液于进样瓶中，用于高效液相色谱-串联质谱检测。
有益效果
本发明采用所述的成分A和成分B联合，能够实现协同，能够克服生物样品中磷脂识别脱除效率低的问题，此外，对生物样品中的不同类别的磷脂具有普适性，可以有效脱除生物样品中的各类磷脂。例如，本发明研究表明，本发明所述的协同的脱除剂，能够有效脱除生物样品如血液样品中普遍存在且难于脱除的溶血磷脂酰胆碱等磷脂成分。
本发明所述的磷脂脱除剂对生物样品中的磷脂具有优异的普适性脱除效果，磷脂脱除率可达到99％以上。此外，本发明所述的脱除剂稳定性好，试剂成本低廉，故该技术具有经济实惠的特点，具有良好的推广应用前景。
附图说明
图1为实施例一葡聚糖硫酸钠和镧离子磷脂去除效果图；
图2为实施例二葡聚糖硫酸钠和锆离子磷脂去除效果图；
图3为实施例三碱化的胶态二氧化硅和锆离子磷脂去除效果图；
图4为对比例一葡聚糖硫酸钠和锰离子磷脂去除效果图；
图5为对比例二碱化的胶态二氧化硅和锰离子磷脂去除效果图；
图6为对比例三仅经系列浓度的葡聚糖硫酸钠溶液处理的血浆样本产生的磷脂沉淀图；
图7为对比例四仅经系列浓度的胶态二氧化硅溶液处理的血浆样本产生的磷脂沉淀图；
图8为对比例五仅经系列浓度的氯化镧溶液处理的血浆样本产生的磷脂沉淀图；
图9为对比例六仅经系列浓度的氧氯化锆溶液处理的血浆样本产生的磷脂沉淀图；
图10为实施例四经“聚阴离子-金属离子”溶液处理的血浆样本产生的磷脂沉淀图。
图11为实施例四中各样本沉淀量粗略量化图。(因拍照以原图形式进行展示不够清晰，此处以复合物沉淀生成效率相对比的形式进行比较)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
除特别声明外，各案例中的血浆样品均属于相同样本。
实施例一
在空白离心管预先加入生物样本；随后加入成分A(葡聚糖硫酸钠)溶液，涡旋，再加入成分B(氯化镧)溶液，涡旋，即可形成磷脂不溶性复合物；高速离心后吸取适量的上清液置于空白离心管中，随后加入3倍体积的蛋白质沉淀剂乙腈，涡旋离心后将分离的上清液直接进样至LC-MS/MS***中分析。
具体步骤为：
1、系列浓度的葡聚糖硫酸钠离子和镧离子溶液配制
精密称定9.293g七水氯化镧溶于5mL的纯化水中，得到浓度为5mol/L氯化镧储备液，用纯化水稀释得到0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5mol/L系列浓度的氯化镧溶液。
精密称定1.234g葡聚糖硫酸钠溶于3mL的纯化水中，得到浓度为1.67mol/L葡聚糖硫酸钠储备液，用纯化水稀释得到0.017，0.042，0.084，0.167，0.413，0.835，1.67mol/L系列浓度的葡聚糖硫酸钠溶液。
2、“葡聚糖硫酸钠离子-镧离子”溶液体系组合处理血浆样本
用上述系列浓度的氯化镧溶液和系列浓度葡聚糖硫酸钠溶液行配比组合(共63组)。基于以上不同组合考察该溶液体系对血浆样本中磷脂的去除效率。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的葡聚糖硫酸钠聚阴离子溶液，涡旋；随后加入20μL镧离子溶液，再次涡旋，10000×g高速离心10min，分离磷脂沉淀。离心后的样本取100μL的上清液，加入300μL的乙腈去除样本中蛋白质，涡旋，10000×g高速离心10min，吸取上清液用于LC-MS/MS进样。
3、LC-MS/MS的血浆磷脂检测条件
取200μL空白血浆中加入600μL的乙腈，进行蛋白质沉淀，涡旋，离心分离，得到空白对照样本。使用空白对照样本摸索LC-MS/MS的血浆磷脂检测条件。使用Agilent1290InfinityⅡ-6470LC/TQ三重四极杆串联质谱***进行分析，采用WatersACQUITYUPLCBEH C18色谱柱(1.7μm，2.1mm×50mm)进行磷脂化合物的分离，以0.1％甲酸水溶液(含5mM甲酸铵)和甲醇分别作为流动相水相(A)和有机相(B)。磷脂化合物的分离条件为色谱梯度洗脱，具体如表1中所示。单个样品的分析运行时间为6.5min，柱温为40℃，进样体积为1μL。Agilent 1290InfinityⅡ-6470LC/TQ三重四极杆串联质谱***采用多重反应监测模式(如表2所示)，监测血浆中代表性磷脂(磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、鞘磷脂SM、溶血磷脂酰胆碱Lyso-PC),离子源为电喷雾电离离子源(ESI，正离子模式)。毛细管电压3.5kV，雾化器压力45psi，喷嘴电压0.5kV，干燥气温度300℃，干燥气流速5l/min，鞘气温度250℃，鞘气流速11l/min，干燥气和鞘气为纯度99.9％的氮气；碰撞气为氮气，其纯度99.999％。
表1人空白血浆中磷脂分析的UPLC梯度条件
Figure BDA0003654773970000071
Figure BDA0003654773970000081
表2人空白血浆中磷脂的多重反应监测参数和磷脂保留时间
Figure BDA0003654773970000082
实施例二
和实施例一相比，区别仅在于，脱磷脂剂为葡聚糖硫酸钠-锆离子：步骤例如为：
在空白离心管预先加入生物样本；随后加入成分A(葡聚糖硫酸钠)溶液，涡旋，再加入成分B(氧氯化锆)溶液，涡旋，即可形成磷脂不溶性复合物；高速离心后吸取适量的上清液置于空白离心管中，随后加入3倍体积的蛋白质沉淀剂乙腈，涡旋离心后将分离的上清液直接进样至LC-MS/MS***中分析。
具体步骤中：
1、系列浓度的葡聚糖硫酸钠离子和锆离子溶液配制
精密称定8.209g八水合氧氯化锆溶于4mL的纯化水中，得到浓度为6.25mol/L氧氯化锆储备液，用纯化水稀释得到0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5，5.25，6.25mol/L系列不同浓度的氧氯化锆溶液。
葡聚糖硫酸钠的配制同实施例一。
2、“葡聚糖硫酸钠离子-锆离子”溶液体系组合处理血浆样本
用上述系列浓度的氧氯化锆溶液锆离子分别和系列浓度葡聚糖硫酸钠溶液进行配比组合(共77组)。基于以上不同组合考察该溶液体系对血浆样本中磷脂的去除效率。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的葡聚糖硫酸钠聚阴离子溶液，涡旋；随后加入20μL锆金属离子溶液，再次涡旋，10000×g高速离心10min，分离磷脂沉淀。离心后的样本取100μL的上清液，加入300μL的乙腈去除样本中蛋白质，涡旋，10000×g高速离心10min，吸取上清液用于LC-MS/MS进样。
3、LC-MS/MS的血浆磷脂检测条件
步骤3与实施例一相同。
实施例三
和实施例一相比，区别仅在于，脱磷脂剂为碱化的胶态二氧化硅-锆离子：步骤例如为：
在空白离心管预先加入生物样本；随后加入成分A(碱化的胶态二氧化硅)溶液，涡旋，再加入成分B(氧氯化锆)溶液，涡旋，即可形成磷脂不溶性复合物；高速离心后吸取适量的上清液置于空白离心管中，随后加入3倍体积的蛋白质沉淀剂乙腈，涡旋离心后将分离的上清液直接进样至LC-MS/MS***中分析。
具体步骤中：
1、系列浓度的碱化的胶态二氧化硅离子和锆离子溶液配制
精密称定8.210g八水合氧氯化锆溶于5mL的纯化水中，得到浓度为5mol/L氧氯化锆储备液，用纯化水稀释得到0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5mol/L系列不同浓度的氧氯化锆溶液。
碱化的胶态二氧化硅
Figure BDA0003654773970000091
购买于西格玛公司。/>
Figure BDA0003654773970000092
是一种二氧化硅混悬液(质量百分比为40％)，存在于含氨/氢氧化铵的水中作为储备液，用纯化水稀释得到0.2155，0.431，1.077，2.155，4.31，10.77，21.55mol/L(所述的摩尔量以其中的SiO2计)系列浓度的/>
Figure BDA0003654773970000093
工作溶液。
2、“碱化的胶态二氧化硅离子-锰离子”溶液体系组合处理血浆样本
用上述系列浓度的氧氯化锆溶液锆离子分别和系列浓度碱化的胶态二氧化硅进行配比组合(共63组)。基于以上不同组合考察该溶液体系对血浆样本中磷脂的去除效率。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的碱化的胶态二氧化硅聚阴离子溶液，涡旋；随后加入20μL锆金属离子溶液，再次涡旋，10000×g高速离心10min，分离磷脂沉淀。离心后的样本取100μL的上清液，加入300μL的乙腈去除样本中蛋白质，涡旋，10000×g高速离心10min，吸取上清液用于LC-MS/MS进样。
3、LC-MS/MS的血浆磷脂检测条件
步骤3与实施例一相同。
对比例一
和实施例一相比，区别在于，脱磷脂剂为葡聚糖硫酸钠-Mn，步骤例如为：
在空白离心管预先加入生物样本；随后加入成分A(葡聚糖硫酸钠)溶液，涡旋，再加入成分B(氯化锰)溶液，涡旋，即可形成磷脂不溶性复合物；高速离心后吸取适量的上清液置于空白离心管中，随后加入3倍体积的蛋白质沉淀剂乙腈，涡旋离心后将分离的上清液直接进样至LC-MS/MS***中分析。
具体步骤中：
1、系列浓度的葡聚糖硫酸钠离子和锰离子溶液配制
精密称定5.063g四水氯化锰溶于5mL的纯化水中，得到浓度为5mol/L氯化锰储备液，用纯化水稀释得到0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5mol/L系列浓度的氯化锰溶液。
葡聚糖硫酸钠的配制同实施例一。
2、“葡聚糖硫酸钠离子-锰离子”溶液体系组合处理血浆样本
用上述系列浓度的锰离子和系列浓度葡聚糖硫酸钠溶液进行配比组合(共63组)。基于以上不同组合考察该溶液体系对血浆样本中磷脂的去除效率。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的葡聚糖硫酸钠离子溶液，涡旋；随后加入20μL锰离子溶液，再次涡旋，10000×g高速离心10min，分离磷脂沉淀。离心后的样本取100μL的上清液，加入300μL的乙腈去除样本中蛋白质，涡旋，10000×g高速离心10min，吸取上清液用于LC-MS/MS进样。
3、LC-MS/MS的血浆磷脂检测条件
步骤3与实施例一相同。
对比例二
和实施例一相比，区别在于，脱磷脂剂为碱化的胶态二氧化硅-Mn，步骤例如为：
在空白离心管预先加入生物样本；随后加入成分A(碱化的胶态二氧化硅)溶液，涡旋，再加入成分B(氯化锰)溶液，涡旋，即可形成磷脂不溶性复合物；高速离心后吸取适量的上清液置于空白离心管中，随后加入3倍体积的蛋白质沉淀剂乙腈，涡旋离心后将分离的上清液直接进样至LC-MS/MS***中分析。
具体步骤中：
1、系列浓度的碱化的胶态二氧化硅离子和锰离子溶液配制
氯化锰溶液的配制同对比例一。
碱化的胶态二氧化硅溶液的配制同实施例三。
2、“碱化的胶态二氧化硅离子-锰离子”溶液体系组合处理血浆样本
用上述系列浓度的锰离子和系列浓度碱化的胶态二氧化硅溶液进行配比组合(共63组)。基于以上不同组合考察该溶液体系对血浆样本中磷脂的去除效率。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的碱化的胶态二氧化硅离子溶液，涡旋；随后加入20μL锰离子溶液，再次涡旋，10000×g高速离心10min，分离磷脂沉淀。离心后的样本取100μL的上清液，加入300μL的乙腈去除样本中蛋白质，涡旋，10000×g高速离心10min，吸取上清液用于LC-MS/MS进样。
3、LC-MS/MS的血浆磷脂检测条件
步骤3与实施例一相同。
对比例三
和实施例一相比，区别仅在于，采用单独的葡聚糖硫酸钠作为脱磷脂剂，步骤为：
1、系列葡聚糖硫酸钠溶液的配制
葡聚糖硫酸钠溶液配制同实施例一
2、经葡聚糖硫酸钠溶液处理的血浆样本
在空白离心管预先加入生物样本，仅加入上述系列浓度葡聚糖硫酸钠溶液(共7个样本)，涡旋混匀，静置，然后离心分离，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的葡聚糖硫酸钠离子溶液，混匀30s，静置5min，然后10000×g高速离心10min，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
对比例四
和实施例3相比，区别仅在于，采用单独的胶态二氧化硅作为脱磷脂剂，步骤为：
1、系列碱化的胶态二氧化硅溶液的配制
碱化的胶态二氧化硅溶液配制同实施例三
2、经碱化的胶态二氧化硅处理的血浆样本
在空白离心管预先加入生物样本，仅加入上述系列浓度碱化的胶态二氧化硅溶液(共7个样本)，涡旋混匀，静置，然后离心分离，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的碱化的胶态二氧化硅溶液，混匀30s，静置5min，然后10000×g高速离心10min，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
对比例五
和实施例一相比，区别仅在于，采用单独的氯化镧作为脱磷脂剂，步骤为：
1、系列氯化镧溶液的配制
氯化镧溶液配制同实施例一
2、经氯化镧溶液处理的血浆样本
在空白离心管预先加入生物样本，仅加入上述系列浓度氯化镧溶液(共9个样本)，涡旋混匀，静置，然后离心分离，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的氯化镧离子溶液，混匀30s，静置5min，然后10000×g高速离心10min，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
对比例六
和实施例一相比，区别仅在于，采用单独的氧氯化锆作为脱磷脂剂，步骤为：
1、系列氧氯化锆溶液的配制
氧氯化锆溶液配制同实施例三
2、经氧氯化锆溶液处理的血浆样本
在空白离心管预先加入生物样本，仅加入上述系列浓度氧氯化锆溶液(共9个样本)，涡旋混匀，静置，然后离心分离，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的氧氯化锆离子溶液，混匀30s，静置5min，然后10000×g高速离心10min，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
实施例四
1、系列工作溶液的配制
氯化镧溶液配制同实施例一
葡聚糖硫酸钠溶液配制同实施例一
氧氯化锆溶液配制同实施例三
碱化的胶态二氧化硅溶液配制同实施例三
2、经“聚阴离子-金属离子”溶液处理的血浆样本
在空白离心管预先加入生物样本，加入合适浓度的聚阴离子溶液，涡旋混匀，再加入合适浓度的金属离子溶液，涡旋混匀，然后离心分离，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。处理血浆样本的“聚阴离子-金属离子”组合为葡聚糖硫酸钠和镧离子；或者，葡聚糖硫酸钠和锆离子，或者碱化的胶体二氧化硅和锆离子。
样本处理具体操作步骤如下：吸取200μL的空白血浆样本于离心管中，加入20μL的聚子离子溶液，混匀30s，静置5min，再加入20μL的金属离子溶液，混匀30s，然后10000×g高速离心10min，观察磷脂复合物沉淀的生成情况。
磷脂去除效果说明
磷脂去除效率百分比按以下方法计算：以经“聚阴离子-金属离子”溶液体系和蛋白质沉淀处理的血浆样品中磷脂的质谱响应(峰面积，用字母A表示)比上只经蛋白质沉淀处理的血浆样品(即对照样品)中磷脂的质谱响应(峰面积，用字母B表示)。用数值1减去该比值分数，然后乘以100，即得磷脂的去除效率百分比(如公式1所示)。
Figure BDA0003654773970000141
实施例一
“镧离子-葡聚糖硫酸钠”溶液配比组合去除血浆中各种磷脂的效率如图1所示。当血浆中存在“镧离子-葡聚糖硫酸钠“溶液体系，在任何浓度配比的条件下，血浆中代表性的8种磷脂在一定程度上均有所去除(去除效率最低约为20％)。血浆中各种磷脂的去除效率随着葡聚糖硫酸钠溶液浓度增加而增加，葡聚糖硫酸钠溶液浓度达到最大值时，各磷脂去除效果最佳(约50-99％)。在葡聚糖硫酸钠保持最大浓度时，当镧离子在低浓度(小于1mol/L)时，血浆磷脂去除效果约75％以下；镧离子浓度超过1mol/L时，血浆中各种磷脂的去除效率随着镧离子浓度的增加而增加；当其浓度为2.5mol/L时，各磷脂去除效率最佳约99.5％，若继续增加镧离子浓度，磷脂去除效率会略微下降。当葡聚糖硫酸钠和镧离子的浓度比为0.17～1.67：0.01～5时；血浆中各类磷脂均能实现部分去除，去除效率在60％以上；优选为0.4～1.67：1～5，特别是0.4～1.7:1～2.5下，血浆中各类磷脂的去除效率达99％。
实施例二
“锆离子-葡聚糖硫酸钠”溶液配比组合去除血浆中各种磷脂的效率如图2所示。该体系去除磷脂的效率受葡聚糖硫酸钠溶液浓度的影响较小，但受锆离子浓度的影响显著。即使在葡聚糖硫酸钠溶液浓度达到最大值时，其对血浆中各种磷脂的去除效率仍不理想。只有在锆离子存在的情况下，血浆磷脂中磷脂的去除效率才会明显提升，当浓度为5mol/L时各磷脂去除效率最佳达99％以上，继续增加锆离子浓度，磷脂去除效率维持不变。具体而言，当葡聚糖硫酸钠和锆离子的浓度比为0.02～1.67：0.5～6.25时；血浆中各类磷脂均能实现部分去除，去除效率在75％以上；优选为0.1～1.7:2.5～5，血浆中各类磷脂的去除效率达99％。
实施例三
“锆离子-碱化的胶态二氧化硅”溶液配比组合去除血浆中各种磷脂的效率如图3所示。当碱化胶态二氧化硅溶液浓度较高的情况下各种磷脂去除效率良好，但其中溶血磷脂酰胆碱的去除稍逊，最低去除效率60％左右。在此基础上体系引入锆离子，即使锆离子浓度很低(0.01mol/L)，该体系对大部分磷脂去除效率可取得较好效果，达90％以上。此外，随着锆离子浓度增加，磷脂去除效率不断提高，当浓度大于1mol/L时，磷脂去除效率均大于99％。继续增加锆离子浓度，同时磷脂去除效率基本保持不变。当碱化的胶态二氧化硅和锆离子的浓度比为4.3～21.6：0.5～5时；血浆中各类磷脂均能实现部分去除，去除效率在80％以上；优选为10.8～21.6：1～5，血浆中各类磷脂的去除效率达99％。
对比例一
“锰离子-葡聚糖硫酸钠”溶液配比组合去除血浆中各种磷脂的效率如图4所示。与上述实施例相比，锰离子体系去除磷脂的效率较差，尽管葡聚糖酸钠溶液和锰离子溶液在高浓度范围内，磷脂去除最佳效果达不到90％，尤其对于溶血磷脂酰胆碱而言，只去除50％左右。
对比例二
“锰离子-碱性胶态二氧化硅”溶液配比组合去除血浆中各种磷脂的效率如图5所示。与上述实施例相比，随着碱化的胶态二氧化硅溶液浓度的不断增加，达10.7mol/L以上,血浆中大部分磷脂呈现良好的去除态势，去除效率高达85％左右。然而，该体系对溶血磷脂酰胆碱的去除效果极其不理想，去除效率大约仅30％～50％左右。
对比例三
仅经系列浓度的葡聚糖硫酸钠处理的血浆样本产生的磷脂沉淀如图6所示(从左至右，浓度分别为0.017，0.042，0.084，0.167，0.413，0.835，1.67mol/L的结果)。当血浆样本中仅存在葡聚糖硫酸钠时，几乎不能形成肉眼可见的沉淀，只能在血浆样本液面上产生一层液膜。
对比例四
仅经系列浓度的胶态二氧化硅处理的血浆样本产生的磷脂沉淀如图7所示(从左至右，依次为浓度为0.2155，0.431，1.077，2.155，4.31，10.77，21.55mol/L的结果)。当血浆样本中仅存在胶态二氧化硅时，在低浓度范围内几乎不能形成肉眼可见的沉淀，但血浆样本变成浊液；浓度增加，可见血浆样本底部产生少量沉淀。
对比例五
仅经系列浓度的氯化镧处理的血浆样本产生的磷脂沉淀如图8所示(从左至右，依次为0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5mol/L的结果)。当血浆样本中仅存在氯化镧时，在低浓度范围内不能形成沉淀，但产生一层液膜漂浮；随浓度增加在适当范围内，可见血浆样本底部产生沉淀；浓度继续增加至最大值时，血浆样本中形成的磷脂沉淀反而减少。
对比例六
仅经系列浓度的氧氯化锆处理的血浆样本产生的磷脂沉淀如图9所示(从左至右，依次为0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5mol/L的结果)。当血浆样本中仅存在氧氯化锆时，在低浓度范围内不能形成沉淀，同样有液膜漂浮；随浓度适当增加，可见血浆样本底部产生沉淀；继续增加浓度至最大值时，血浆样本不能形成磷脂沉淀。
实施例四
经“聚阴离子-金属离子”溶液处理的血浆样本(胶态二氧化硅-氧氯化锆；葡聚糖硫酸钠-氯化镧；葡聚糖硫酸钠-氧氯化锆”)。当血浆样本中，结果见图10，从左到右依次为仅经过0.835mol/L的葡聚糖硫酸钠处理的样本(1)；仅经过21.55mol/L的胶态二氧化硅处理的样本(2)；仅经过1mol/L镧离子处理的样本(3)；仅经过1mol/L锆离子处理的样本(4)；经过21.55mol/L胶态二氧化硅和1mol/L锆离子处理的样本(5)；经过0.835mol/L葡聚糖硫酸钠和1mol/L镧离子处理的样本(6)；经过0.835mol/L葡聚糖硫酸钠和1mol/L锆离子处理的样本(7)。同时存在聚阴离子和金属离子时，在聚阴离子和金属离子协同作用下生成大量血浆磷脂沉淀，其沉淀量，肉眼可见明显多于仅加入单一的聚阴离子或金属离子。各种案例的结果见图11，可以知道，采用本发明所述的脱磷脂材料，能够带来协同效果，能够获得更优的磷脂脱除效果。
综上所述，对于血浆磷脂的去除，仅加入单一的金属离子或聚阴离子，磷脂复合物沉淀生成不完全，甚至不会产生沉淀，证明了磷脂的去除是在金属离子和聚阴离子协同作用下实现的。锰离子联合葡聚糖硫酸钠或碱化的胶态二氧化硅对血浆磷脂的去除效果不理想，对于大部分类型的磷脂去除效率为80％-90％，尤其对溶血磷脂酰胆碱的去除能力更微弱，仅达到50％左右。聚阴离子-金属离子”溶液体系去除磷脂的重量比为0.017～21.55：0.01～6.25。葡聚糖硫酸钠和金属离子的浓度比为0.017～1.67：0.01～6.25，血浆中大部分磷脂都有一定程度去除；优选为0.17～1.67：0.01～6.25，血浆中各类磷脂均能实现部分去除，去除效率在60％以上；最优选为0.418～1.67：1～5，血浆中各类磷脂的去除效率达99％。而碱化的胶态二氧化硅和金属离子的浓度比为0.216～21.55：0.01～6.25，大部分磷脂都能在一定程度上去除；优选为4.3～21.6：0.5～5，血浆中各类磷脂去除效率在80％以上；最优选为10.77～21.55：1～5，血浆中各类磷脂的去除效率达99％。

Claims (9)

1.一种磷脂脱除剂，其特征在于，由成分A和成分B组成；
成分A为葡聚糖盐，成分B为锆源，所述的成分A和成分B的摩尔比为0.1~1.7:2.5~5；
所述的葡聚糖盐为葡聚糖硫酸盐，
所述的锆源为氧氯化锆；
所述的磷脂至少包含溶血磷脂酰胆碱。
2.如权利要求1所述的磷脂脱除剂，其特征在于，所述的成分A和成分B在使用前独立存在，或者以混合物形式存在。
3.如权利要求1所述的磷脂脱除剂，其特征在于，所述的磷脂脱除剂以固体、溶液中的至少一种形式存在。
4.如权利要求1~3任一项所述的磷脂脱除剂，其特征在于，所述的磷脂还包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂中的至少一种。
5.一种生物待测样品的制备方法，其特征在于，将待测的生物样品和权利要求1~4任一项所述的磷脂脱除剂成分混合，随后固液分离，得到脱磷脂样品；
所述的生物样品为血液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将生物样品预先和所述的磷脂脱除剂成分中的成分A或成分B混合，随后再和剩余组分混合，脱磷脂后再进行固液分离，得到脱磷脂样品。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，固液分离的手段为离心。
8.如权利要求5~7任一项所述的制备方法，其特征在于，对脱磷脂样品进行脱蛋白处理，制得待测样品。
9.一种生物样品的测定方法，其特征在于，采用权利要求5~8任一项所述的制备方法得到的脱磷脂样品或待测样品，随后进行色谱和/或质谱测定。
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