JP2008275534A - Method for refining target polymer and method for detecting it - Google Patents
Method for refining target polymer and method for detecting it Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008275534A JP2008275534A JP2007121531A JP2007121531A JP2008275534A JP 2008275534 A JP2008275534 A JP 2008275534A JP 2007121531 A JP2007121531 A JP 2007121531A JP 2007121531 A JP2007121531 A JP 2007121531A JP 2008275534 A JP2008275534 A JP 2008275534A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- target polymer
- cell
- polymer
- target
- receptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、細胞中から、標的高分子を効率よく抽出して精製するための標的高分子の精製方法、該精製方法により精製された標的高分子の検出方法、該精製方法に用いられる高分子精製キット、及び、該検出方法に用いられる高分子検出キットに関する。 The present invention relates to a target polymer purification method for efficiently extracting and purifying a target polymer from cells, a method for detecting a target polymer purified by the purification method, and a polymer used in the purification method The present invention relates to a purification kit and a polymer detection kit used in the detection method.
体液、血液、外科的摘出、分泌物、スワブ、及び組織洗浄液等の、細胞を含有する生体試料の臨床検査方法には、主に、形態学的検査と成分分析的検査に分けることができる。形態学的検査とは、生体試料中に含有されている組織や細胞等の形態学的特徴から、病変の有無等の判断をする検査である。一方、成分分析的検査とは、生体試料中に含有されているタンパク質や核酸等の生体成分を、生化学的手法や免疫学的手法を用いて測定する検査である。
がんの診断や病状の経過観察においても、細胞を含有する生体試料の臨床検査は非常に有効である。例えば、形態学的検査として、喀痰を顕微鏡等で観察し、該喀痰中のがん細胞の有無を調べることにより、肺がんの発症の有無を判断することができる。また、成分分析的検査として、生体試料中の腫瘍マーカーの量を、該腫瘍マーカーに対する抗体等を用いて測定することにより、多種多様ながんの発症の有無を判断することができる。
The clinical examination methods for biological samples containing cells such as body fluids, blood, surgical excision, secretions, swabs, and tissue washing liquids can be mainly divided into morphological examination and component analysis examination. The morphological examination is an examination for determining the presence or absence of a lesion from the morphological characteristics of tissues and cells contained in a biological sample. On the other hand, the component analysis test is a test in which a biological component such as protein or nucleic acid contained in a biological sample is measured using a biochemical technique or an immunological technique.
Clinical examinations of biological samples containing cells are also very effective in cancer diagnosis and pathological observation. For example, as a morphological test, the presence or absence of lung cancer can be determined by observing sputum with a microscope or the like and examining the presence or absence of cancer cells in the sputum. In addition, as a component analysis test, by measuring the amount of a tumor marker in a biological sample using an antibody against the tumor marker or the like, it is possible to determine the presence or absence of various types of cancer.
形態学的検査は、直接病変の有無を確認することができるが、組織や細胞等の形態学的特徴の判断は、多くの場合、検査者の主観的解釈に基づいてなされるため、検査に熟練を要する。特に、視認した細胞が、正常細胞と異常細胞のいずれであるのか、あるいは、がんの進行度区分のいずれであるのか、というような、いわゆる境界部分に相当する場合には、検査者によって検査結果が異なる場合が多いという問題がある。また、検査に時間と手間がかかり、一定時間に一人の検査者が検査できる生体試料数は通常限られているため、多数の生体試料を検査することが困難であるという問題もある。 Morphological examination can directly confirm the presence or absence of lesions, but in many cases, the judgment of morphological features such as tissues and cells is based on the subjective interpretation of the examiner. Requires skill. In particular, if the visible cell corresponds to a so-called boundary part, such as whether it is a normal cell or an abnormal cell, or whether it is a cancer progression category, it is examined by the examiner. There is a problem that the results are often different. In addition, it takes time and labor to inspect, and the number of biological samples that can be inspected by a single inspector in a fixed time is usually limited, so that it is difficult to inspect a large number of biological samples.
これに対して、成分分析的検査は、検査結果が具体的な測定値として得られるため、形態学的検査に比べて、検査者間の判断のバラツキが小さく、より客観的で信頼性の高い検査結果を得ることができる。また、近年の技術進歩は目覚しく、血液自動分析装置等の、成分分析的検査に用いることができる自動分析装置が多く開発されており、非常に多くの生体試料の検査を迅速かつ簡便に行うことが可能である。このため、近年、健康診断等におけるがん診断のように、初期がんの検出や多数検体の処理が要求される場合には、主に成分分析的検査が行われている。 On the other hand, in the component analysis test, since the test result is obtained as a specific measurement value, the variation in judgment among the inspectors is smaller than that of the morphological test, and it is more objective and reliable. Inspection results can be obtained. In recent years, technological advances have been remarkable, and many automatic analyzers that can be used for component analysis tests such as blood autoanalyzers have been developed, so that many biological samples can be tested quickly and easily. Is possible. For this reason, component analysis tests are mainly performed in recent years when detection of initial cancer and processing of a large number of specimens are required as in cancer diagnosis in health checkups and the like.
通常、生体試料中における、がん細胞やがん細胞由来の生体成分等の含有量は、極微量であるため、がん診断のための成分分析的検査においては、特に、精度や感度が良好であることが非常に重要である。例えば、検出目的である標的生体成分が、細胞内に含有されている場合には、検出の精度や感度を向上させるために、細胞を溶解させ、標的生体成分を細胞から効率よく抽出することが必要である。 In general, the content of cancer cells and cancer cell-derived biological components, etc. in biological samples is extremely small, so accuracy and sensitivity are particularly good in component analytical tests for cancer diagnosis. It is very important that For example, when a target biological component that is the purpose of detection is contained in a cell, in order to improve detection accuracy and sensitivity, the cell can be lysed and the target biological component can be efficiently extracted from the cell. is necessary.
細胞を溶解し、細胞内の生体成分を効率よく抽出するために、例えば、生体試料に、カオトロピック剤や界面活性剤等の細胞溶解液を添加して、化学的に細胞を溶解させる方法がある。しかしながら、単に細胞溶解液を添加するだけでは、標的生体成分の抽出が不十分である場合が多い。さらに、検出方法によっては、細胞溶解液により検出反応が阻害されるため、検出反応開始前に、該細胞溶解液を除去する必要が生ずる場合がある。 In order to lyse cells and efficiently extract intracellular biological components, for example, there is a method of chemically lysing cells by adding a cell lysate such as a chaotropic agent or a surfactant to a biological sample. . However, extraction of target biological components is often insufficient by simply adding a cell lysate. Furthermore, depending on the detection method, since the detection reaction is inhibited by the cell lysate, it may be necessary to remove the cell lysate before the start of the detection reaction.
その他、細胞を物理的に溶解させる方法として、例えば、（１）回転翼を備え、かつ直径０．５〜１．５ｍｍのガラスビーズが８０〜９０％充填されたシリンダーに、単細胞藻類の藻体乾燥粉体または３０ｍｅｓｈ以下の褐藻類藻体海藻の藻体乾燥粉体が１０〜４０％混和された混合油を連続的に注入しつつ、７〜２０ｍ／ｓｅｃの回転翼で、ガラスビーズと混合油とを攪拌混合して、混合油中の藻体を破砕して成る藻体磨砕物含有食用油性懸濁液とその製造法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。また、（２）試料導入口が形成されていて、前記試料導入口を通じて試料、磁性ビーズ、及び固状支持体を収容する細胞溶解毛細管と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記細胞溶解毛細管内で前記試料、前記磁性ビーズ、及び前記固状支持体を含む混合物を混合する振動器と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、前記細胞溶解毛細管にレーザーを供給するレーザー発生部と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、磁性ビーズを前記細胞溶解毛細管の壁に固定させる磁気力発生部と、前記細胞溶解毛細管に装着されており、溶解液を排出する排水チャンバと、前記細胞溶解毛細管に装着されており、核酸が結合した固状支持体から核酸を溶出させる溶出バッファーチャンバと、前記細胞溶解毛細管に装着されており、溶出された核酸溶液を中和させる中和バッファーを供給する中和バッファーチャンバとを備える細胞またはウィルスの核酸精製装置に係る発明が開示されている（例えば特許文献２参照。）。
上記（１）の方法では、植物油を媒体とし、藻体乾燥粉体とガラスビーズの摩擦作用で藻体乾燥粉体が破砕されるものである。しかしながら、生体試料を油等の媒体に混合すると、溶解した細胞から目的の標的生体成分を抽出した後、該標的生体成分の検出のために、該媒体を除去する必要がある。このため、操作が煩雑となり、また、コンタミネーションの危険性が高くなるおそれがある。一方、上記（２）の方法は、核酸の抽出を目的とした細胞の溶解方法であり、レーザーによって加熱された磁性ビーズが、溶液の温度を上げ、細胞を直接破壊する。したがって、発生した熱により、生体試料中の成分が変性するため、タンパク質のような熱に影響を受け易い高分子の検出には、該方法は用いることができない。また、抽出工程と検出工程では別の反応容器を必要とするため、反応容器間移送に手間がかかり、さらにコンタミネーションの危険性も増大する。さらに、レーザーを用いるため、大掛かりな装置を必要とし、臨床の現場に即座に適用されることは難しい。 In the method (1), the algal body dry powder is crushed by the frictional action of the alga body dry powder and the glass beads using vegetable oil as a medium. However, when a biological sample is mixed with a medium such as oil, it is necessary to extract the target biological component from the dissolved cells and then remove the medium for detection of the target biological component. For this reason, operation becomes complicated and there is a possibility that the risk of contamination increases. On the other hand, the method (2) is a cell lysis method for the purpose of nucleic acid extraction, and magnetic beads heated by a laser raise the temperature of the solution and directly destroy the cells. Therefore, since the component in the biological sample is denatured by the generated heat, the method cannot be used for detecting a polymer that is easily affected by heat such as protein. In addition, since separate reaction vessels are required for the extraction step and the detection step, it takes time to transfer between reaction vessels, and the risk of contamination increases. Furthermore, since a laser is used, a large-scale apparatus is required, and it is difficult to be applied immediately to a clinical site.
本発明は、細胞中の標的高分子を精製する場合において、細胞を簡便に効率よく溶解させることにより、標的高分子を高精度に精製する方法、及び、該方法に用いるための精製用キットを提供することを目的とする。
また、本発明は、該精製方法により精製された標的高分子の検出方法、及び、該方法に用いるための検出用キットを提供することを目的とする。
The present invention provides a method for purifying a target polymer with high accuracy by simply and efficiently dissolving cells when purifying a target polymer in a cell, and a purification kit for use in the method. The purpose is to provide.
Another object of the present invention is to provide a method for detecting a target polymer purified by the purification method, and a detection kit for use in the method.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子を、生体試料に添加して混合すると、該磁性粒子により、該生体試料中の細胞の溶解が促進されることを見出した。該磁性粒子は、適度な硬度を有しており、さらに、受容体が結合することにより、粒子表面に適度な凹凸が生じるため、生体試料中で、該磁性粒子が細胞と衝突することにより、細胞溶解が促進されるためと推察された。さらに、検討した結果、該磁性粒子とは別の、細胞溶解促進性に特化した粒子によって、より効率よく細胞を溶解させることができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have added magnetic particles to which a receptor that specifically binds to a target polymer is bound to a biological sample, and when the magnetic particles are mixed, It has been found that lysis of cells in a biological sample is promoted. The magnetic particles have an appropriate hardness, and further, due to the binding of the receptor, moderate irregularities are generated on the particle surface, so that the magnetic particles collide with cells in a biological sample, It was assumed that cell lysis was promoted. Furthermore, as a result of investigations, it was found that the cells can be more efficiently lysed by using particles specialized for cell lysis promotion other than the magnetic particles, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、細胞中の標的高分子を精製する方法であって、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子と、細胞溶解促進用粒子を用いることを特徴とする、標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、細胞中の標的高分子を精製する方法であって、細胞を含有する試料に、細胞溶解液と、細胞溶解促進用粒子と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子を、添加して攪拌することを特徴とする標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記細胞溶解促進用粒子の平均粒子径が０．１〜１．５ｍｍであることを特徴とする標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記磁性粒子の平均粒子径が０．１〜１００μｍであることを特徴とする標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記細胞溶解促進用粒子が磁性粒子であることを特徴とする標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、細胞中の標的高分子を精製する方法であって、標的高分子を、前記標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子を用いて細胞を溶解して精製することを特徴とする、標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、細胞中の標的高分子を精製する方法であって、（ａ） 細胞を含有する試料に、細胞溶解液と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子を添加して攪拌することにより、前記標的高分子と前記磁性粒子の複合体を生成させる工程と、（ｂ） 磁場を用いて、工程（ａ）により生成された複合体を回収する工程と、を有することを特徴とする標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記磁性粒子の平均粒子径が１〜１，０００μｍであることを特徴とする標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記標的高分子が、１０ｋＤ以上のタンパク質、２０以上のアミノ酸からなるポリペプチド、２０以上の単糖類からなる多糖類、脂質、及び、それらを含有する複合体からなる群より選ばれる高分子であることを特徴とする、前記いずれか記載の標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記細胞が、ヒト、動物、植物、微生物、及びウィルスからなる群より選ばれる生物由来の細胞であることを特徴とする、前記いずれか記載の標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記細胞が、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、***、胆汁、及び大便からなる群より選ばれる生体試料由来の細胞であることを特徴とする、前記いずれか記載の標的高分子の精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の標的高分子の精製方法を用いて精製された標的高分子を検出することを特徴とする、標的高分子の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、細胞中の標的高分子を検出する方法であって、（ａ’） 細胞を含有する試料に、細胞溶解液と、細胞溶解促進用粒子と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子を添加して攪拌することにより、前記標的高分子と前記磁性粒子の複合体を生成させる工程と、（ｂ） 磁場を用いて、工程（ａ’）により生成された複合体を回収する工程と、（ｃ） 工程（ｂ）により回収された複合体と、前記標的高分子と特異的に結合する標識受容体を混合して、前記磁性粒子と前記標的高分子と前記標識受容体からなる複合体を生成する工程と、（ｄ） 磁場を用いて、工程（ｃ）により生成された複合体を回収する工程と、（ｅ） 工程（ｄ）により回収された複合体を、前記標識受容体の標識を用いて検出する工程と、を有することを特徴とする標的高分子の検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の標的高分子の精製方法に用いるためのキットであって、細胞溶解液と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子と、細胞溶解促進用粒子を有することを特徴とする高分子精製キットを提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の標的高分子の精製方法に用いるためのキットであって、細胞溶解液と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子を有することを特徴とする高分子精製キットを提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の標的高分子の精製方法を用いて精製された標的高分子の検出に用いるためのキットであって、細胞溶解液と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子と、細胞溶解促進用粒子と、前記標的高分子と特異的に結合する標識受容体と、前記標識受容体の標識を検出するための検出用物質を有することを特徴とする高分子検出キットを提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の標的高分子の精製方法を用いて精製された標的高分子の検出に用いるためのキットであって、細胞溶解液と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子と、前記標的高分子と特異的に結合する標識受容体と、前記標識受容体の標識を検出するための検出用物質を有することを特徴とする高分子検出キットを提供するものである。
That is, the present invention is a method for purifying a target polymer in cells, characterized by using magnetic particles bound with a receptor that specifically binds to the target polymer and particles for promoting cell lysis. The present invention provides a method for purifying a target polymer.
The present invention also relates to a method for purifying a target polymer in a cell, wherein a cell lysate, a cell lysis promoting particle, and a receptor that specifically binds to the target polymer are contained in a cell-containing sample. The present invention provides a method for purifying a target polymer, which comprises adding and stirring magnetic particles to which is bonded.
In addition, the present invention provides a method for purifying a target polymer, wherein the cell lysis promoting particles have an average particle size of 0.1 to 1.5 mm.
The present invention also provides a method for purifying a target polymer, wherein the magnetic particles have an average particle size of 0.1 to 100 μm.
The present invention also provides a method for purifying a target polymer, wherein the cell lysis promoting particles are magnetic particles.
The present invention also relates to a method for purifying a target polymer in a cell, wherein the target polymer is lysed using magnetic particles bound with a receptor that specifically binds to the target polymer. The present invention provides a method for purifying a target polymer characterized by purification.
The present invention also relates to a method for purifying a target polymer in a cell, comprising: (a) a magnetic sample in which a cell lysate and a receptor that specifically binds to the target polymer are bound to a sample containing cells. Adding a particle and stirring to produce a complex of the target polymer and the magnetic particle; and (b) recovering the complex produced by the step (a) using a magnetic field. The present invention provides a method for purifying a target polymer characterized by comprising:
The present invention also provides a method for purifying a target polymer, wherein the magnetic particles have an average particle diameter of 1 to 1,000 μm.
In the present invention, the target polymer may be a group consisting of a protein of 10 kD or more, a polypeptide of 20 or more amino acids, a polysaccharide of 20 or more monosaccharides, a lipid, and a complex containing them. The method for purifying a target polymer according to any one of the above, which is a polymer selected.
Further, the present invention provides the method for purifying a target polymer according to any one of the above, wherein the cells are cells derived from an organism selected from the group consisting of humans, animals, plants, microorganisms, and viruses. It is to provide.
In the present invention, the cells are blood, bone marrow fluid, lymph fluid, urine, sputum, ascites, exudate, amniotic fluid, intestinal lavage fluid, lung lavage fluid, bronchial lavage fluid, bladder lavage fluid, pancreatic juice, saliva, semen, bile, and The target polymer purification method according to any one of the above, characterized in that the cell is derived from a biological sample selected from the group consisting of stool.
The present invention also provides a method for detecting a target polymer, wherein the target polymer purified using any one of the above-described target polymer purification methods is detected.
The present invention also relates to a method for detecting a target macromolecule in a cell, wherein (a ′) a cell lysate, a cell lysis promoting particle, and a target macromolecule are specifically added to a cell-containing sample. A step of generating a complex of the target polymer and the magnetic particle by adding and stirring magnetic particles to which a binding receptor is bound; and (b) using a magnetic field, the step (a ′). (C) collecting the complex recovered in step (b) and a labeled receptor that specifically binds to the target polymer, and mixing the magnetic particles and the target height. A step of generating a complex composed of a molecule and the labeled receptor, (d) a step of recovering the complex generated by step (c) using a magnetic field, and (e) a step of recovering by the step (d). Detecting the complex using the label of the labeled receptor. The present invention provides a method for detecting a target polymer.
The present invention also provides a kit for use in any of the above-described methods for purifying a target polymer, comprising a cell lysate, magnetic particles bound with a receptor that specifically binds to the target polymer, and cells. The present invention provides a polymer purification kit having dissolution promoting particles.
The present invention also provides a kit for use in any of the above-described methods for purifying a target polymer, comprising a cell lysate and magnetic particles bound to a receptor that specifically binds to the target polymer. A polymer purification kit characterized by the above is provided.
The present invention also provides a kit for use in detection of a target polymer purified using any one of the above-described target polymer purification methods, wherein the cell lysate and the target polymer are specifically bound. A magnetic particle to which a receptor is bound, a particle for promoting cell lysis, a labeled receptor that specifically binds to the target polymer, and a detection substance for detecting the label of the labeled receptor. A feature of the polymer detection kit is provided.
The present invention also provides a kit for use in detection of a target polymer purified using any one of the above-described target polymer purification methods, wherein the cell lysate and the target polymer are specifically bound. A polymer detection kit comprising: a magnetic particle to which a receptor to be bound is bound; a labeled receptor that specifically binds to the target polymer; and a detection substance for detecting the label of the labeled receptor. Is to provide.
本発明の標的高分子の精製方法を用いることにより、細胞を簡便かつ効果的に溶解させることができるため、細胞中から、効率よく標的高分子を精製することができる。該標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した粒子は、磁性粒子であるため、磁場を利用することにより、該磁性粒子、及び該磁性粒子と結合する標的高分子等以外の物質を、反応容器内から簡便に除去することができ、精度よく標的高分子を精製することができる。
また、本発明の標的高分子の検出方法、すなわち、該精製方法を用いて精製された標的高分子を検出する方法では、精製度の高い標的高分子に対して検出反応を行うため、該標的高分子を非常に高感度に検出することができる。また、精製反応に用いた反応容器と同一の反応容器内において、検出反応を行うことができるため、検出時間が短縮され、コンタミネーションの危険性も低減することができる。また、一般的に臨床検査等で使用されている既存の分析装置で、標的高分子の精製から検出までの一連の操作を自動化し、多数の生体試料を処理することができる。大掛かりな装置を導入する必要もないため、経済的にも好ましい。該標的高分子の検出結果は、客観的な測定値として得られるため、検査者間によるバラツキが抑えられ、的確な診断が期待できる。
さらに、本発明の高分子精製キット及び高分子検出キットを用いることにより、簡便に効率よく、生体試料から標的高分子を精製し、検出することができる。
By using the target polymer purification method of the present invention, cells can be lysed easily and effectively, so that the target polymer can be efficiently purified from the cells. Since the particles bound to the receptor that specifically binds to the target polymer are magnetic particles, a substance other than the magnetic particles and the target polymer that binds to the magnetic particles can be obtained by using a magnetic field. It can be easily removed from the reaction vessel, and the target polymer can be purified with high accuracy.
In addition, in the method for detecting a target polymer of the present invention, that is, the method for detecting a target polymer purified using the purification method, a detection reaction is performed on a target polymer having a high degree of purification. Macromolecules can be detected with very high sensitivity. Further, since the detection reaction can be carried out in the same reaction vessel as that used for the purification reaction, the detection time can be shortened and the risk of contamination can be reduced. In addition, with an existing analyzer generally used in clinical tests, a series of operations from purification to detection of a target polymer can be automated, and a large number of biological samples can be processed. Since it is not necessary to introduce a large-scale device, it is economically preferable. Since the detection result of the target polymer is obtained as an objective measurement value, variation among examiners can be suppressed, and accurate diagnosis can be expected.
Furthermore, by using the polymer purification kit and the polymer detection kit of the present invention, the target polymer can be purified and detected from a biological sample simply and efficiently.
本発明における標的高分子とは、検出及び定量の標的である高分子を意味する。本発明において高分子とは、細胞内に含有されている生体高分子であれば、特に限定されるものではない。該高分子として、例えば、タンパク質、ポリペプチド、糖、脂質、核酸等がある。また、該高分子は、単一の分子であってもよく、複合体であってもよい。１０ｋＤ以上のタンパク質、２０以上のアミノ酸からなるポリペプチド、２０以上の単糖類からなる多糖類、脂質、及び、それらを含有する複合体からなる群より選ばれる高分子であることが好ましい。本発明の精製方法では、生体試料に過剰な熱が発生し難いため、熱の影響を受け易い高分子の精製により適しているためである。なお、該１０ｋＤ以上のタンパク質は、アミノ酸のみからなるタンパク質であってもよく、糖や脂質と結合したタンパク質であってもよい。 The target polymer in the present invention means a polymer that is a target for detection and quantification. In the present invention, the polymer is not particularly limited as long as it is a biopolymer contained in cells. Examples of the polymer include proteins, polypeptides, sugars, lipids, and nucleic acids. The polymer may be a single molecule or a complex. It is preferably a polymer selected from the group consisting of a protein of 10 kD or more, a polypeptide of 20 or more amino acids, a polysaccharide of 20 or more monosaccharides, a lipid, and a complex containing them. This is because the purification method of the present invention is more suitable for the purification of polymers that are susceptible to heat because excessive heat is unlikely to be generated in a biological sample. In addition, the protein of 10 kD or more may be a protein consisting only of amino acids, or may be a protein combined with sugar or lipid.
本発明における細胞、すなわち、本発明において用いられる標的高分子を含む細胞は、いずれの生物種由来の細胞であってもよく、ウィルスも含まれる。該生物種として、例えば、ヒト、動物、植物、微生物、及びウィルス等がある。また、生体から直接採取された細胞であってもよく、培養細胞であってもよい。 The cell in the present invention, that is, the cell containing the target polymer used in the present invention may be a cell derived from any biological species, and also includes a virus. Examples of the biological species include humans, animals, plants, microorganisms, and viruses. Moreover, the cell directly extract | collected from the biological body may be sufficient, and a cultured cell may be sufficient.
本発明における細胞を含有する試料は、生体試料であってもよく、培養細胞を調製した試料であってもよい。特に、ヒトの疾患に関連する高分子が標的高分子である場合には、生体試料であることが好ましい。該生体試料として、例えば、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、***、胆汁、又は大便等がある。また、該生体試料は、生物から採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該生体試料中に含有されている細胞を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料に対してなされている調製方法を行うことができる。該調製方法として、例えば、粘液等の洗浄除去や、生理食塩水等を用いた希釈、細胞性構成要素の分離又は濃縮等がある。腹水や腸管洗浄液等のように、生体試料中に含有されている細胞が少量である場合には、予め、該生体試料を適当な孔径のフィルターを用いて濾過処理等をすることにより、細胞が濃縮された調製試料を得ることが好ましい。標的高分子の精製効率や検出感度を向上させることができるためである。 The sample containing cells in the present invention may be a biological sample or a sample prepared from cultured cells. In particular, when a polymer related to human disease is a target polymer, it is preferably a biological sample. Examples of the biological sample include blood, bone marrow fluid, lymph fluid, urine, sputum, ascites, exudate, amniotic fluid, intestinal lavage fluid, lung lavage fluid, bronchial lavage fluid, bladder lavage fluid, pancreatic juice, saliva, semen, bile, and stool. is there. The biological sample may be a sample collected from a living organism or may be a prepared sample. The preparation method is not particularly limited as long as it does not damage the cells contained in the biological sample, and a preparation method usually performed on the biological sample can be performed. Examples of the preparation method include washing and removing mucus, dilution with physiological saline, separation or concentration of cellular components, and the like. When the amount of cells contained in a biological sample is small, such as ascites or intestinal lavage fluid, the cells are removed by filtering the biological sample using a filter having an appropriate pore size in advance. It is preferred to obtain a concentrated preparation sample. This is because the purification efficiency and detection sensitivity of the target polymer can be improved.
本発明における標的高分子と特異的に結合する受容体は、標的高分子と特異的に結合する物質を意味する。但し、本発明において、特異的に結合するとは、標的高分子の検出や精製等に通常用いることができる程度に特異的に結合し得ることを意味し、他の物質等と交差するものであってもよい。該受容体として、例えば、該標的高分子の抗体や該標的高分子に親和性の高い化合物等がある。該標的高分子の抗体は、血清等の未精製の抗体や、ポリクローナル抗体であってもよいが、該標的高分子の精製及び検出の精度の点から、精製したモノクローナル抗体であることが好ましい。該抗体として、例えば、ＨＢｓ抗体、カンジダ抗体、抗アルブミン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プロスタグランジン抗体 抗アルブミン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗体，抗ＩｇＤ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プロスタグランジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイドホルモン抗体等がある。 The receptor that specifically binds to the target polymer in the present invention means a substance that specifically binds to the target polymer. However, in the present invention, specifically binding means that it can be specifically bound to such an extent that it can be normally used for detection and purification of the target polymer, and crosses with other substances. May be. Examples of the receptor include an antibody of the target polymer and a compound having high affinity for the target polymer. The target polymer antibody may be an unpurified antibody such as serum or a polyclonal antibody, but is preferably a purified monoclonal antibody from the viewpoint of the accuracy of purification and detection of the target polymer. Examples of the antibody include HBs antibody, Candida antibody, anti-albumin antibody, anti-HCG antibody, anti-IgG antibody, anti-IgA antibody, anti-IgM antibody, anti-IgE antibody, anti-IgD antibody, anti-AFP antibody, anti-DNT antibody, anti-prosta Glandin antibody anti-albumin antibody, anti-HCG antibody, anti-IgG antibody, anti-IgA antibody, anti-IgM antibody, anti-IgE antibody, anti-IgD antibody, anti-AFP antibody, anti-DNT antibody, anti-prostaglandin antibody, anti-human coagulation factor antibody , Anti-CRP antibodies, anti-HBs antibodies, anti-human growth hormone antibodies, anti-steroid hormone antibodies, and the like.
その他、該標的高分子に親和性の高い化合物として、例えば、該標的高分子が多糖類である場合にはレクチン等の糖結合性タンパク質、該標的高分子がビオチンである場合にはストレプトアビジンやアビジン、該標的高分子が６以上のヒスチジンからなるポリペプチドや該ポリペプチドを含有するタンパク質である場合には、ニッケル等がある。 In addition, as a compound having high affinity for the target polymer, for example, when the target polymer is a polysaccharide, a sugar-binding protein such as lectin, and when the target polymer is biotin, streptavidin or In the case where avidin, the target polymer is a polypeptide composed of 6 or more histidines or a protein containing the polypeptide, there are nickel and the like.
該受容体を磁性粒子へ結合させる方法は、特に限定されるものではなく、物理的に吸着させてもよく、粒子表面の官能基に化学的に結合させてもよい。化学的に結合させる場合には、各官能基に適した方法により受容体を結合させることができる。例えば、水溶性カルボジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させるＥＤＡＣ（１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル) −カルボジイミド塩酸塩）法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる方法、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する方法、活性化したアルデヒド基やトシル基と受容体中の官能基を結合する方法等がある。粒子表面に官能基を有さない磁性粒子の場合には、粒子表面を官能基で被覆してもよい。 The method for binding the receptor to the magnetic particle is not particularly limited, and it may be physically adsorbed or chemically bonded to a functional group on the particle surface. In the case of chemical bonding, the receptor can be bonded by a method suitable for each functional group. For example, EDAC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride) method in which carboxylic acid and amino group are bonded with water-soluble carbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide A method in which hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) are mixed in advance to bond a carboxylic acid and an amino group, a method in which amino groups are cross-linked using a bipolar linker, an activated aldehyde And a method of bonding a functional group in a receptor with a group or tosyl group. In the case of magnetic particles having no functional group on the particle surface, the particle surface may be coated with a functional group.
本発明における磁性粒子は、磁性を帯びている粒子であれば、特に限定されるものではない。該磁性粒子として、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2 Ｏ3 ）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属からなる粒子や、あるいはコバルト、ニッケル、マンガン等を含む合金からなる粒子等がある。また、該磁性粒子は、磁性体のみからなる粒子であってもよく、非磁性体粒子の内部に磁性体の微粒子を含有させた粒子であってもよい。該非磁性体粒子として、例えば、疎水性重合体からなるラテックス粒子や、架橋した親水性重合体からなるラテックス粒子等がある。２〜４種類程度のモノマーの共重合体からなるラテックス粒子であってもよい。該疎水性重合体として、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレート等がある。また、該架橋した親水性重合体として、例えば、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレート等がある。その他、ラテックス粒子等の非磁性体粒子の表面に磁性体の微粒子を固定させた粒子であってもよい。該磁性粒子は、適度な硬度を有しており、また、受容体が結合することにより、粒子表面に適度な凹凸が生じている。 The magnetic particles in the present invention are not particularly limited as long as they are magnetic particles. Examples of the magnetic particles include particles made of a metal such as triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ), iron sesquioxide (γ-Fe 2 O 3 ), various ferrites, iron, manganese, nickel, cobalt, and chromium, Alternatively, there are particles made of an alloy containing cobalt, nickel, manganese, and the like. Further, the magnetic particles may be particles composed of only a magnetic material, or may be particles in which fine particles of a magnetic material are contained inside non-magnetic particles. Examples of the nonmagnetic particles include latex particles made of a hydrophobic polymer and latex particles made of a crosslinked hydrophilic polymer. Latex particles made of a copolymer of about 2 to 4 types of monomers may be used. Examples of the hydrophobic polymer include polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacrylonitrile, polymethyl methacrylate, polycoupleramide, and polyethylene terephthalate. Examples of the crosslinked hydrophilic polymer include polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, poly (2-oxyethyl acrylate), poly (2-oxyethyl methacrylate), poly (2,3- Dioxypropyl acrylate), poly (2,3-dioxypropyl methacrylate), polyethylene glycol methacrylate and the like. In addition, the particles may be particles in which magnetic fine particles are fixed on the surface of non-magnetic particles such as latex particles. The magnetic particles have an appropriate hardness, and appropriate irregularities are generated on the particle surface due to the binding of the receptor.
本発明の標的高分子の精製方法は、細胞中の標的高分子を精製する方法であって、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子と、細胞溶解促進用粒子を用いる方法である。細胞溶解促進用粒子を用いて、細胞の溶解を促進することにより、細胞内に含有される標的高分子をより効率よく精製し得る。具体的には、反応容器に、細胞を含有する試料、細胞溶解液、細胞溶解促進用粒子、及び標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子（以降、受容体結合磁性粒子という。）を、添加して攪拌する。従来、細胞溶解液のみでは、細胞の溶解が不十分であり、標的高分子を十分に回収することはできなかった。細胞溶解促進用粒子を添加して攪拌することにより、試料溶液中で、該細胞溶解促進用粒子が細胞と衝突し、その衝撃で細胞の溶解が促進される。このため、非常に効率よく、標的高分子を精製することが可能となる。なお、該反応容器への添加の順番は特に限定されるものではなく、２種以上を混合した状態で添加してもよい。例えば、予め、細胞を含有する試料と細胞溶解液を混合した状態で添加してもよい。 The method for purifying a target polymer of the present invention is a method for purifying a target polymer in a cell, and uses magnetic particles bound with a receptor that specifically binds to the target polymer, and particles for promoting cell lysis. Is the method. By promoting the lysis of cells using the particles for promoting cell lysis, the target polymer contained in the cells can be purified more efficiently. Specifically, a sample containing cells, a cell lysate, a cell lysis promoting particle, and a magnetic particle in which a receptor that specifically binds to a target polymer is bound to a reaction vessel (hereinafter, receptor-bound magnetic particle). Is added and stirred. Conventionally, the cell lysis solution alone is insufficient to lyse cells, and the target polymer cannot be sufficiently recovered. By adding and agitating the cell lysis promoting particles, the cell lysis promoting particles collide with the cells in the sample solution, and the lysis of the cells is promoted by the impact. For this reason, it becomes possible to purify the target polymer very efficiently. In addition, the order of addition to this reaction container is not specifically limited, You may add in the state which mixed 2 or more types. For example, a sample containing cells and a cell lysate may be added in advance.
細胞の溶解により、細胞内から試料溶液中に放出された標的高分子は、該標的高分子と特異的に結合する受容体を介して、該受容体結合磁性粒子と複合体を形成する。その後、磁場を用いて該複合体を回収することにより、標的高分子を精製することができる。例えば、該反応容器に磁石を接近させ、該反応容器の該磁石に最も近接する面に、該複合体を収束させた後、残りの試料溶液を除去することにより、該複合体のみを該反応容器中に回収することができる。 The target polymer released from the cells into the sample solution by lysis of the cells forms a complex with the receptor-bound magnetic particles via a receptor that specifically binds to the target polymer. Thereafter, the target polymer can be purified by recovering the complex using a magnetic field. For example, a magnet is brought close to the reaction container, the complex is converged on the surface of the reaction container closest to the magnet, and then the remaining sample solution is removed, so that only the complex is reacted. It can be recovered in a container.
本発明における細胞溶解促進用粒子は、細胞と衝突することにより、細胞を溶解させることができる硬度や比重を有する粒子であれば、特に限定されるものではなく、磁性粒子であってもよく、非磁性粒子であってもよい。また、該細胞溶解促進用粒子は、１種類の材質からなる粒子であってもよく、２種類以上の材質からなる粒子であってもよい。非磁性粒子として、例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、ラテックス等からなる粒子がある。その他、アルミニウム、ニッケル、アルミナ、チタニア、ジルコニア等の磁性を帯びていない金属粒子であってもよい。 The particle for promoting cell lysis in the present invention is not particularly limited as long as it has a hardness and specific gravity capable of lysing the cell by colliding with the cell, and may be a magnetic particle, Non-magnetic particles may be used. The cell lysis promoting particles may be particles made of one kind of material or particles made of two or more kinds of materials. Nonmagnetic particles include, for example, particles made of glass, ceramics, plastic, latex, and the like. In addition, non-magnetic metal particles such as aluminum, nickel, alumina, titania, and zirconia may be used.
該細胞溶解促進用粒子の平均粒子径は、特に限定されるものではなく、該細胞溶解促進用粒子の材質や、該細胞溶解促進用粒子を添加した後の攪拌速度、溶解する細胞の性質等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、該平均粒子径は０．１〜１．５ｍｍであることが好ましい。細胞溶解促進作用が充分に発揮できることに加え、細胞溶解液中における混合効率も良好であるためである。 The average particle size of the cell lysis promoting particles is not particularly limited, and the material of the cell lysis promoting particles, the stirring speed after adding the cell lysis promoting particles, the nature of the cells to be lysed, etc. Can be determined as appropriate. For example, the average particle diameter is preferably 0.1 to 1.5 mm. This is because the cell lysis promoting effect can be sufficiently exerted and the mixing efficiency in the cell lysate is also good.
該受容体結合磁性粒子の平均粒子径は、特に限定されるものではないが、０．１〜１００μｍであることが好ましい。該平均粒子径が０．１μｍ未満である場合には、試料溶液中における混合効率が低下するおそれや、磁場による回収効率が低下するおそれがある。また、該平均粒子径が１００μｍ超である場合には、該受容体結合磁性粒子の比表面積が充分ではなく、標的高分子との複合体の形成効率が低下するおそれがある。 The average particle size of the receptor-bound magnetic particles is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 100 μm. When the average particle size is less than 0.1 μm, the mixing efficiency in the sample solution may be reduced, or the recovery efficiency due to the magnetic field may be reduced. On the other hand, when the average particle diameter is more than 100 μm, the specific surface area of the receptor-bound magnetic particles is not sufficient, and the formation efficiency of the complex with the target polymer may be reduced.
試料溶液中で細胞溶解促進用粒子を攪拌する場合の該攪拌の方法は、該細胞溶解促進用粒子を細胞と衝突させることができる攪拌方法であれば、特に限定されるものではない。該攪拌方法として、例えば、ボルテックスミキサー等の市販の振動攪拌機を用いて攪拌する方法等がある。また、該細胞溶解促進用粒子が磁性粒子である場合には、特開２００６−２４７５３５号公報に記載されているような回転磁場等を利用した攪拌方法を用いることができる。その他、磁場を利用した攪拌方法として、例えば、反応容器の左右に電磁石を配置し、磁場の発生と解消を繰り返すことにより、該細胞溶解促進用粒子を磁場に添って移動させて、攪拌することができる。 The stirring method when stirring the cell lysis promoting particles in the sample solution is not particularly limited as long as the stirring method can collide the cell lysis promoting particles with the cells. Examples of the stirring method include a method of stirring using a commercially available vibration stirrer such as a vortex mixer. In addition, when the cell lysis promoting particles are magnetic particles, a stirring method using a rotating magnetic field as described in JP-A-2006-247535 can be used. In addition, as an agitation method using a magnetic field, for example, by arranging electromagnets on the left and right sides of the reaction vessel and repeating the generation and elimination of the magnetic field, the cell lysis promoting particles are moved along the magnetic field and agitated. Can do.
受容体結合磁性粒子は、磁性粒子であり、適度な硬度を有しており、かつ、受容体が結合しているため、粒子表面に適度な凹凸がある。このため、適当な平均粒子径を有する受容体結合磁性粒子と衝突した細胞と衝突することにより、該細胞を効率的に溶解させることができる。つまり、受容体結合磁性粒子の平均粒子径を適宜調整することにより、細胞溶解促進用粒子が果たす細胞溶解促進作用を、該受容体結合磁性粒子に担わせることができる。具体的には、細胞を含有する試料に、細胞溶解液と、適当な平均粒子径の受容体結合磁性粒子を添加して攪拌することにより、衝突した細胞を効率的に溶解させて、標的高分子と該受容体結合磁性粒子の複合体を生成させた後、磁場を用いて、該複合体を回収することにより、標的高分子を精製することができる。 The receptor-bound magnetic particles are magnetic particles, have an appropriate hardness, and have an appropriate unevenness on the particle surface because the receptor is bound. For this reason, by colliding with the cell which collided with the receptor coupling | bonding magnetic particle which has a suitable average particle diameter, this cell can be melt | dissolved efficiently. That is, by appropriately adjusting the average particle size of the receptor-bound magnetic particles, the cell-lysis promoting action performed by the cell lysis-promoting particles can be caused to be exerted on the receptor-bound magnetic particles. Specifically, a cell lysate and receptor-bound magnetic particles having an appropriate average particle size are added to a sample containing cells and stirred to efficiently lyse the colliding cells, thereby increasing the target height. The target polymer can be purified by generating a complex of the molecule and the receptor-bound magnetic particles and then recovering the complex using a magnetic field.
受容体結合磁性粒子に細胞溶解促進作用を持たせる場合には、該受容体結合磁性粒子の平均粒子径は、１〜１，０００μｍであることが好ましい。該平均粒子径が１μｍ未満である場合には、細胞溶解促進作用が不十分となるおそれがある。また、該平均粒子径が１，０００μｍ超である場合には、標的高分子との複合体の形成効率が低下するおそれがある。 When the receptor-bound magnetic particles have a cell lysis promoting effect, the average particle size of the receptor-bound magnetic particles is preferably 1 to 1,000 μm. When the average particle size is less than 1 μm, the cell lysis promoting action may be insufficient. Moreover, when the average particle diameter is more than 1,000 μm, the formation efficiency of the complex with the target polymer may be lowered.
細胞を含有する試料に添加する細胞溶解促進用粒子や受容体結合磁性粒子の量は、該試料の量や、該試料中に含有される細胞の量等を考慮して、適宜決定することができる。また、該受容体結合磁性粒子を回収するための磁場の強度等は、該受容体結合磁性粒子の量を考慮して、適宜決定することができる。なお、細胞溶解促進用粒子として磁性粒子を用いた場合には、該細胞溶解促進用粒子も該受容体結合磁性粒子と共に回収されるため、該細胞溶解促進用粒子の量も考慮して、磁場の強度を決定すべきである。 The amount of cell lysis-promoting particles and receptor-bound magnetic particles added to a sample containing cells can be appropriately determined in consideration of the amount of the sample and the amount of cells contained in the sample. it can. Further, the strength of the magnetic field for recovering the receptor-bound magnetic particles can be appropriately determined in consideration of the amount of the receptor-bound magnetic particles. When magnetic particles are used as the cell lysis promoting particles, the cell lysis promoting particles are also collected together with the receptor-bound magnetic particles. The strength of the should be determined.
本発明において細胞溶解液は、細胞、特に細胞膜や細胞小器官を可溶化するために通常用いられる溶液であれば、特に限定されるものではない。該細胞溶解液の種類は、標的高分子の性質や、該標的高分子が含まれている細胞の種類等を考慮して、適宜決定することができる。該細胞溶解液として、例えば、カオトロピック剤、陰イオン洗浄剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及びアルカリ水酸化物溶液等がある。該細胞溶解液は、１種類の溶液であってもよく、２種類以上の混合溶液として用いてもよい。該カオトロピック剤として、例えば、尿素、チオシアン酸グアニジン、ホルムアミド等がある。該陰イオン洗浄剤として、例えば、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、Ｎ−ラウリル・サルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、アルキル・アリール・スルホン酸塩、長鎖（脂肪）アルコール硫酸塩、オレフィン硫酸塩及びスルホン酸塩、アルファ・オレフィン硫酸塩及びスルホン酸塩、硫酸化モノグリセリド、硫酸化エーテル、スルホコハク酸塩、アルカン・スルホン酸塩、リン酸塩エステル、アルキル・イセチオン酸塩、並びにショ糖エステル等がある。該陽イオン性界面活性剤として、例えば、セチル・トリメチルアンモニウム塩等がある。該非イオン性界面活性剤として、例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＮＰ−４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、Ｎ−オクチル・グルコシド等がある。該両性界面活性剤として、例えば、ＣＨＡＰＳ、３−ドデシル−ジメチルアンモニオ−プロパン−１−スルホネート、ラウリルジメチルアミン・オキシド等がある。該アルカリ水酸化物溶液として、例えば、水酸化ナトリウム溶液や水酸化カリウム溶液等がある。また、細胞を含有する試料に添加する細胞溶解液の量は、該試料の量や、該試料中に含有される細胞の量等を考慮して、適宜決定することができる。
In the present invention, the cell lysate is not particularly limited as long as it is a solution usually used for solubilizing cells, particularly cell membranes and organelles. The type of the cell lysate can be appropriately determined in consideration of the properties of the target polymer, the types of cells containing the target polymer, and the like. Examples of the cell lysate include chaotropic agents, anionic detergents, cationic surfactants, nonionic surfactants, amphoteric surfactants, and alkali hydroxide solutions. The cell lysate may be one type of solution or may be used as a mixture of two or more types. Examples of the chaotropic agent include urea, guanidine thiocyanate, formamide, and the like. Examples of the anionic detergent include SDS (sodium lauryl sulfate), N-lauryl sarcosine, sodium deoxycholate, alkyl aryl sulfonate, long chain (fatty) alcohol sulfate, olefin sulfate and sulfonic acid. Salts, alpha olefin sulfates and sulfonates, sulfated monoglycerides, sulfated ethers, sulfosuccinates, alkane sulfonates, phosphate esters, alkyl isethionates, and sucrose esters. Examples of the cationic surfactant include cetyl trimethyl ammonium salt. Examples of the nonionic surfactant include
本発明の精製方法により精製された標的高分子は、通常高分子を検出する方法を用いて、検出することができる。例えば、該標的高分子と特異的に結合する標識受容体を用いることにより、該標的高分子を検出することができる。具体的には、本発明の精製方法により精製された標的高分子と受容体結合磁性粒子とからなる複合体と、該標的高分子と特異的に結合する標識受容体を混合して、該受容体結合磁性粒子と該標的高分子と該標識受容体からなる複合体を生成させた後、磁場を用いて、該複合体を回収する。その後、回収された複合体を、該標識受容体の標識を用いて検出することにより、該標的高分子を検出することができる。 The target polymer purified by the purification method of the present invention can usually be detected using a method for detecting a polymer. For example, the target polymer can be detected by using a labeled receptor that specifically binds to the target polymer. Specifically, a complex composed of a target polymer and receptor-bound magnetic particles purified by the purification method of the present invention and a labeled receptor that specifically binds to the target polymer are mixed together to obtain the receptor. A complex composed of body-bound magnetic particles, the target polymer, and the labeled receptor is generated, and then the complex is recovered using a magnetic field. Thereafter, the target polymer can be detected by detecting the recovered complex using the label of the labeled receptor.
なお、本発明において標識受容体とは、検出用標識物質を結合した受容体を意味する。該検出用標識物質は、通常、高分子を検出する場合に用いられる標識物質であれば、特に限定されるものではない。該検出用標識物質として、例えば、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素、蛍光発色物質、化学発光物質、アイソトープ等がある。例えば、該検出用標識物質が酵素の場合には、酵素活性の測定により、該標的高分子を検出することができる。該検出用標識物質が蛍光発色物質の場合には、蛍光光度法により検出することができ、化学発光物質の場合には酵素を用いた化学発光法により検出することができる。また、アイソトープの場合には放射線測定装置を用いることにより検出することができる。具体的には、該検出用標識物質がアルカリフォスファターゼである場合にはｐ−ニトロフェニルホスフェートを、該検出用標識物質がペルオキシダーゼである場合には２’−アジノ−ビ−３’−エチルベンジルチアゾリンスルホン酸を、それぞれ基質として、回収された複合体に添加し、一定時間反応させた後、生成された生成物の吸収波長の吸光度を測定することにより、該標的高分子を検出することができる。 In the present invention, the labeled receptor means a receptor bound with a detection labeling substance. The labeling substance for detection is not particularly limited as long as it is a labeling substance usually used for detecting a polymer. Examples of the labeling substance for detection include enzymes such as alkaline phosphatase and peroxidase, fluorescent coloring substances, chemiluminescent substances, and isotopes. For example, when the detection labeling substance is an enzyme, the target polymer can be detected by measuring enzyme activity. When the labeling substance for detection is a fluorescent coloring substance, it can be detected by a fluorometric method, and when it is a chemiluminescent substance, it can be detected by a chemiluminescent method using an enzyme. In the case of an isotope, it can be detected by using a radiation measuring device. Specifically, p-nitrophenyl phosphate is used when the detection labeling substance is alkaline phosphatase, and 2′-azino-bi-3′-ethylbenzylthiazoline when the detection labeling substance is peroxidase. The target polymer can be detected by adding sulfonic acid as a substrate to the recovered complex, reacting for a certain period of time, and measuring the absorbance at the absorption wavelength of the produced product. .
図１は、本発明の標的高分子の検出方法の概略図である。まず、工程（ａ’）において、反応容器１に、細胞を含有する試料、細胞溶解液、細胞溶解促進用粒子、及び受容体結合磁性粒子を添加して攪拌し、標的高分子と該受容体結合磁性粒子の複合体２を生成する。その後、工程（ｂ）において、磁石３を反応容器１に近接させて、磁場により複合体２を収束させた後、残りの試料溶液を全て反応容器１から除去して、該複合体２を回収する。該細胞溶解促進用粒子が非磁性粒子である場合には、該工程（ｂ）において、該細胞溶解促進用粒子も除去することができる。さらに、工程（ｃ）において、磁石３を反応容器１から離した後、反応容器１に、該標的高分子と特異的に結合する標識受容体を添加して、該受容体結合磁性粒子と該標的高分子と該標識受容体からなる複合体４を生成し、工程（ｄ）において、再び磁石２を反応容器１に近接させて、磁場により該複合体４を収束させた後、残りの試料溶液を全て反応容器１から除去する。工程（ｅ）において、磁石２を反応容器１から離した後、反応容器１内において、該標識受容体の標識を用いた検出反応を行う。
FIG. 1 is a schematic view of the target polymer detection method of the present invention. First, in the step (a ′), a sample containing cells, a cell lysate, cell lysis promoting particles, and receptor-bound magnetic particles are added to the reaction vessel 1 and stirred, and the target polymer and the receptor are added. A
図１に示すように、本発明の検出方法においては、磁石３等の磁場を用いることにより、標的高分子の精製から検出までの全工程を、同一の反応容器で行うことができる。このため、迅速に、効率よく、かつコンタミネーションを防止しつつ、標的高分子を精製し検出することができる。また、本発明の検出方法は、現在の臨床検査で広く用いられている血液分析装置のように、反応工程ラインに沿って移動する反応容器中に、試薬等の分注や試料溶液の除去等を行うことができる構造の装置に対して、磁石３等の磁場発生装置を追加するだけで、簡便に適用することができるため、導入コストを抑えることも可能である。 As shown in FIG. 1, in the detection method of the present invention, by using a magnetic field such as a magnet 3, all steps from purification to detection of the target polymer can be performed in the same reaction vessel. Therefore, the target polymer can be purified and detected quickly, efficiently and while preventing contamination. In addition, the detection method of the present invention, such as a blood analyzer widely used in current clinical tests, dispenses reagents, removes sample solution, etc. in a reaction container that moves along a reaction process line. Since it can be applied simply by adding a magnetic field generator such as the magnet 3 to an apparatus having a structure capable of performing the above-mentioned, the introduction cost can be suppressed.
本発明の標的高分子の精製方法や検出方法は、感度と精度に優れているため、腫瘍マーカーを標的高分子とし、特にがん診断等に用いられることが好ましい。ここで、腫瘍マーカーとは、がんの発症の指標となる物質を意味し、がんの発生により新たに生じた物質や増加した物質、がん遺伝子等がある。また、直接がん細胞により産生される物質以外の物質であっても、炎症により増加した物質等の、がんの診断や経過観察に役立つ物質も含まれる。該腫瘍マーカーとして、例えば、ＰＳＡ（前立腺特異抗原、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ)は、前立腺から分泌される***中に含まれている生体物質であり、前立腺癌のとき血清中の含有量が上昇するため、腫瘍マーカーとして用いられる。その他、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡ１２５（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ１２５）、及びＣＡ１９−９（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ１９−９）等がある。 Since the purification method and detection method of the target polymer of the present invention are excellent in sensitivity and accuracy, it is preferable to use the tumor marker as a target polymer and to be used particularly for cancer diagnosis. Here, the tumor marker means a substance that serves as an index of the onset of cancer, and includes a substance that is newly generated due to the occurrence of cancer, an increased substance, an oncogene, and the like. In addition, even substances other than those directly produced by cancer cells include substances useful for cancer diagnosis and follow-up, such as substances increased by inflammation. As the tumor marker, for example, PSA (prostate specific antigen, prostate specific antigen) is a biological substance contained in semen secreted from the prostate, and since the content in serum increases in prostate cancer, Used as a tumor marker. In addition, there are AFP (α-fetoprotein), CEA (carcinoembryonic antigen), CA125 (carbohydrate antigen 125), and CA19-9 (carbohydrate antigen 19-9).
細胞溶解液と、受容体結合磁性粒子と、細胞溶解促進用粒子を有することを特徴とする高分子精製キットを用いることにより、細胞を含有する試料に、該高分子精製キットに添付の粒子等を適宜添加して攪拌して、簡便に標的高分子を精製することができる。また、該高分子精製キットに、さらに該標的高分子と特異的に結合する標識受容体と、該標識受容体の標識を検出するための検出用物質を加えた高分子検出キットを用いることにより、簡便に標的高分子を検出することができる。 By using a polymer purification kit characterized by having a cell lysate, receptor-bound magnetic particles, and particles for promoting cell lysis, particles attached to the polymer purification kit, etc. Can be appropriately added and stirred to easily purify the target polymer. In addition, by using a polymer detection kit in which a labeled receptor that specifically binds to the target polymer and a detection substance for detecting the label of the labeled receptor are added to the polymer purification kit The target polymer can be easily detected.
さらに、キットに添付の受容体結合磁性粒子の平均粒子径を適宜調整することにより、細胞溶解促進用粒子を有さないキット、すなわち、細胞溶解液と、受容体結合磁性粒子を有することを特徴とする高分子精製キットや、細胞溶解液と、受容体結合磁性粒子と、該標的高分子と特異的に結合する標識受容体と、該標識受容体の標識を検出するための検出用物質を有することを特徴とする高分子検出キットを用いることによっても、簡便に標的高分子を精製し検出することができる。 Furthermore, by appropriately adjusting the average particle size of the receptor-bound magnetic particles attached to the kit, the kit does not have a cell lysis promoting particle, that is, has a cell lysate and receptor-bound magnetic particles. A polymer purification kit, a cell lysate, a receptor-bound magnetic particle, a labeled receptor that specifically binds to the target polymer, and a detection substance for detecting the label of the labeled receptor The target polymer can also be easily purified and detected by using a polymer detection kit characterized by having it.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
ヒト肝がん細胞由来の培養細胞であるＨｅｐ Ｇ２細胞中に含有されているＡＦＰタンパク質を精製し、検出した。なお、ＡＦＰは肝がんの患者で高い値を示す物質であり、肝がんの腫瘍マーカーである。さらに、本実施例で使用しているＨｅｐ Ｇ２細胞においても、ＡＦＰタンパク質は高発現している。
細胞溶解促進用粒子として、平均粒子径がそれぞれ、１０、１００、５００、１，０００、１，５００、及び２，０００μｍである６種類の磁性粒子を、受容体結合磁性粒子として、平均粒子径が１μｍである抗ＡＦＰ抗体が結合した磁性粒子（抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子）を、それぞれ用いた。なお、Ｈｅｐ Ｇ２細胞は常法にしたがって培養した。
AFP protein contained in Hep G2 cells, which are cultured cells derived from human hepatoma cells, was purified and detected. AFP is a substance that shows a high value in patients with liver cancer, and is a tumor marker for liver cancer. Furthermore, the AFP protein is also highly expressed in the Hep G2 cells used in this example.
As particles for promoting cell lysis, six kinds of magnetic particles having average particle sizes of 10, 100, 500, 1,000, 1,500, and 2,000 μm, respectively, are used as receptor-bound magnetic particles. Magnetic particles (anti-AFP antibody-coupled magnetic particles) having an anti-AFP antibody having a diameter of 1 μm were used. Hep G2 cells were cultured according to a conventional method.
まず、各反応容器に、１ｍＬの細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＩＧＥＰＡＬＲ ＣＡ−６３０（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）、１×１０６ｃｅｌｌのＨｅｐ Ｇ２細胞、細胞溶解促進用粒子、及び抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子を添加した。該反応容器の左右に電磁石を配置し、ＯＮ−ＯＦＦを１秒ごとに１０分間繰り返すことにより、磁場を用いて攪拌しながら、３７℃でインキュベートした。該攪拌により、Ｈｅｐ Ｇ２細胞を溶解させ、抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子とＡＦＰの複合体を形成した。その後、磁石を該反応容器に接近させ、該磁石により該複合体を回収し、回収されなかった残りの溶液を除去した後、該複合体を、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて３回洗浄した。 First, each of the reaction vessels, cell lysate 1mL (50mM Tris-HCl, made pH8,150mM NaCl, 1% IGEPAL R CA -630 (sigma-aldrich Company), 0.5% sodium deoxycholate, 0.1 % SDS), 1 × 10 6 cells of Hep G2 cells, particles for promoting cell lysis, and anti-AFP antibody-bound magnetic particles were added. Electromagnets were placed on the left and right sides of the reaction vessel, and ON-OFF was repeated every second for 10 minutes to incubate at 37 ° C. while stirring using a magnetic field. By this stirring, Hep G2 cells were lysed to form a complex of anti-AFP antibody-bound magnetic particles and AFP. Thereafter, the magnet is brought close to the reaction vessel, the complex is collected by the magnet, and the remaining solution that has not been collected is removed. Then, the complex is washed with a washing solution (0.05% Tween 20). Washed twice.
洗浄後、該反応容器にアルカリフォスファターゼ標識抗ＡＦＰ抗体を添加した後、ボルテックスミキサーを用いて該反応容器内の溶液を攪拌した後、５０分間、３７℃でインキュベートした。該インキュベートにより、抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子とＡＦＰとアルカリフォスファターゼ標識抗ＡＦＰ抗体の複合体を形成した。さらに、磁石を該反応容器に接近させ、該磁石により該複合体を回収し、回収されなかった残りの溶液を除去した後、該複合体を、該洗浄液を用いて３回洗浄した。
さらに、該反応容器にアルカリフォスファターゼの基質としてＡＭＰＰＤ（３−（２'−ｓｐｉｒｏ−ａｄａｍａｎｔａｎｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３” −ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ）を添加した後、ボルテックスミキサーを用いて該反応容器内の溶液を攪拌した後、３０分間、３７℃でインキュベートした。さらに、ルミノメータにより発光輝度を測定することにより、ＡＦＰタンパク質を検出した。
After washing, an alkaline phosphatase-labeled anti-AFP antibody was added to the reaction vessel, and the solution in the reaction vessel was stirred using a vortex mixer and then incubated at 37 ° C. for 50 minutes. By the incubation, a complex of anti-AFP antibody-bound magnetic particles, AFP, and alkaline phosphatase-labeled anti-AFP antibody was formed. Further, the magnet was brought close to the reaction vessel, and the complex was collected by the magnet. After the remaining solution that was not collected was removed, the complex was washed three times with the washing solution.
Further, AMPPD (3- (2′-spiro-adamantane) -4-methyl-4- (3 ″ -phosphoroxy) phenyl-1,2-dioxetane) was added to the reaction vessel as a substrate for alkaline phosphatase, and then vortexed. The solution in the reaction vessel was stirred using a mixer and then incubated for 30 minutes at 37 ° C. Further, the AFP protein was detected by measuring the luminescence brightness with a luminometer.
各平均粒子径の細胞溶解促進用粒子につき、独立した３回の測定を行った。図２は、縦軸を発光輝度、横軸を細胞溶解促進用粒子の平均粒子径として、各平均粒子径の細胞溶解促進用粒子を用いた場合の、発光輝度の測定結果を表した図である。図２より明らかであるように、細胞溶解促進用粒子を用いることにより、感度よくＡＦＰタンパク質を検出することができる。特に、平均粒子径１００μｍ〜１，５００μｍの細胞溶解促進用粒子を用いた場合に、ＡＦＰタンパク質は効率よく検出された。すなわち、細胞溶解促進用粒子は平均粒子径が１００μｍ〜１，５００μｍであることが好ましい。但し、攪拌時の回転磁場の強度を調整することにより、平均粒子径が１００μｍ未満や１，５００μｍ超の細胞溶解促進用粒子を用いた場合であっても、ＡＦＰタンパク質を良好に検出し得ると考えられる。 Three independent measurements were performed for the cell lysis promoting particles of each average particle size. FIG. 2 is a graph showing the results of measurement of emission luminance when the vertical axis is the emission luminance and the horizontal axis is the average particle size of the cell lysis promoting particles, and the cell lysis promotion particles of each average particle size are used. is there. As is clear from FIG. 2, the AFP protein can be detected with high sensitivity by using the cell lysis promoting particles. In particular, AFP protein was detected efficiently when particles for promoting cell lysis having an average particle size of 100 μm to 1,500 μm were used. That is, the cell lysis promoting particles preferably have an average particle size of 100 μm to 1,500 μm. However, by adjusting the strength of the rotating magnetic field during stirring, the AFP protein can be detected satisfactorily even when particles for promoting cell lysis having an average particle size of less than 100 μm or more than 1,500 μm are used. Conceivable.
（試験例１）
ヒト前立腺がん細胞由来の培養細胞であるＬＮＣａｐ細胞及びヒト白血病細胞由来の培養細胞であるＫ５６２細胞の、それぞれの細胞中に含有されているＰＳＡタンパク質を精製し、検出した。なお、ＰＳＡは、高い分化型の前立腺がん細胞であるＬＮＣａｐ細胞では高発現するが、Ｋ５６２細胞では発現が見られないことがわかっている。
受容体結合磁性粒子として、平均粒子径が１μｍである抗ＰＳＡ抗体が結合した磁性粒子（抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子）を用いた。なお、ＬＮＣａｐ細胞及びＫ５６２細胞は、常法にしたがって培養した。
(Test Example 1)
PSA protein contained in each of LNCap cells, which are cultured cells derived from human prostate cancer cells, and K562 cells, which are cultured cells derived from human leukemia cells, was purified and detected. It is known that PSA is highly expressed in LNCap cells, which are highly differentiated prostate cancer cells, but is not expressed in K562 cells.
As the receptor-bound magnetic particles, magnetic particles (anti-PSA antibody-bound magnetic particles) bound with an anti-PSA antibody having an average particle diameter of 1 μm were used. LNCap cells and K562 cells were cultured according to a conventional method.
まず、各反応容器に、１ｍＬの細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＩＧＥＰＡＬＲ ＣＡ−６３０（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）、１×１０６ｃｅｌｌのＬＮＣａｐ細胞又はＫ５６２細胞、及び抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子を添加した。ボルテックスミキサーを用いて該反応容器内の溶液を攪拌した後、１０分間、３７℃でインキュベートした。該攪拌により、各細胞を溶解させ、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子とＰＳＡの複合体を形成した。その後、磁石を該反応容器に接近させ、該磁石により該複合体を回収し、回収されなかった残りの溶液を除去した後、該複合体を、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて３回洗浄した。 First, each of the reaction vessels, cell lysate 1mL (50mM Tris-HCl, made pH8,150mM NaCl, 1% IGEPAL R CA -630 (sigma-aldrich Company), 0.5% sodium deoxycholate, 0.1 % SDS), 1 × 10 6 cells of LNCap cells or K562 cells, and anti-PSA antibody-bound magnetic particles were added. The solution in the reaction vessel was stirred using a vortex mixer and then incubated at 37 ° C. for 10 minutes. By the stirring, each cell was lysed to form a complex of anti-PSA antibody-bound magnetic particles and PSA. Thereafter, the magnet is brought close to the reaction vessel, the complex is collected by the magnet, and the remaining solution that has not been collected is removed. Then, the complex is washed with a washing solution (0.05% Tween 20). Washed twice.
洗浄後、該反応容器にアルカリフォスファターゼ標識抗ＰＳＡ抗体を添加した後、ボルテックスミキサーを用いて該反応容器内の溶液を攪拌した後、５０分間、３７℃でインキュベートした。該インキュベートにより、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子とＰＳＡとアルカリフォスファターゼ標識抗ＰＳＡ抗体の複合体を形成した。さらに、磁石を該反応容器に接近させ、該磁石により該複合体を回収し、回収されなかった残りの溶液を除去した後、該複合体を、該洗浄液を用いて３回洗浄した。
さらに、該反応容器にアルカリフォスファターゼの基質としてＡＭＰＰＤ（３−（２'−ｓｐｉｒｏ−ａｄａｍａｎｔａｎｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３” −ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ）を添加した後、ボルテックスミキサーを用いて該反応容器内の溶液を攪拌した後、３０分間、３７℃でインキュベートした。さらに、ルミノメータにより発光輝度を測定することにより、ＰＳＡタンパク質を検出した。
After washing, an alkaline phosphatase-labeled anti-PSA antibody was added to the reaction vessel, and the solution in the reaction vessel was stirred using a vortex mixer and then incubated at 37 ° C. for 50 minutes. By the incubation, a complex of anti-PSA antibody-bound magnetic particles, PSA, and alkaline phosphatase-labeled anti-PSA antibody was formed. Further, the magnet was brought close to the reaction vessel, and the complex was collected by the magnet. After the remaining solution that was not collected was removed, the complex was washed three times with the washing solution.
Further, AMPPD (3- (2′-spiro-adamantane) -4-methyl-4- (3 ″ -phosphoroxy) phenyl-1,2-dioxetane) was added to the reaction vessel as a substrate for alkaline phosphatase, and then vortexed. The solution in the reaction vessel was stirred using a mixer and then incubated for 30 minutes at 37 ° C. Further, PSA protein was detected by measuring luminescence luminance with a luminometer.
各細胞につき、独立した３回の測定を行った。図３は、各細胞を用いてＰＳＡタンパク質検出を行った場合の、発光輝度の測定結果を表したものである。図３より明らかであるように、ＬＮＣａｐ細胞からはＰＳＡタンパク質が検出されたが、Ｋ５６２細胞からはＰＳＡタンパク質は検出されなかった。すなわち、本発明の標的高分子の検出方法を用いることにより、感度よくＰＳＡタンパク質を検出できる。 Three independent measurements were performed for each cell. FIG. 3 shows measurement results of luminescence luminance when PSA protein detection is performed using each cell. As is clear from FIG. 3, PSA protein was detected from LNCap cells, but PSA protein was not detected from K562 cells. That is, the PSA protein can be detected with high sensitivity by using the target polymer detection method of the present invention.
本発明の標的高分子の精製方法及び検出方法を用いることにより、細胞内の標的高分子を、非常に簡便に、高精度かつ迅速に精製して検出することができるため、極めて高い正確性を要求される臨床検査等の分野で利用が可能である。 By using the purification method and detection method of the target polymer of the present invention, the intracellular target polymer can be purified and detected very easily, with high accuracy and speed. It can be used in fields such as required clinical tests.
１…反応容器、２…標的高分子と受容体結合磁性粒子の複合体、３…磁石、４…受容体結合磁性粒子と標的高分子と標識受容体からなる複合体 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Reaction container, 2 ... Complex of target polymer and receptor binding magnetic particle, 3 ... Magnet, 4 ... Complex of receptor binding magnetic particle, target polymer and labeled receptor
Claims (17)
（ａ） 細胞を含有する試料に、細胞溶解液と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子を添加して攪拌することにより、前記標的高分子と前記磁性粒子の複合体を生成させる工程と、
（ｂ） 磁場を用いて、工程（ａ）により生成された複合体を回収する工程と、
を有することを特徴とする標的高分子の精製方法。 A method for purifying a target macromolecule in a cell, comprising:
(A) A composite of the target polymer and the magnetic particles is prepared by adding a cell lysate and magnetic particles bound with a receptor that specifically binds to the target polymer to a sample containing cells, and stirring the mixture. Producing a body;
(B) using a magnetic field to recover the complex produced by step (a);
A method for purifying a target polymer, comprising:
（ａ’） 細胞を含有する試料に、細胞溶解液と、細胞溶解促進用粒子と、標的高分子と特異的に結合する受容体が結合した磁性粒子を添加して攪拌することにより、前記標的高分子と前記磁性粒子の複合体を生成させる工程と、
（ｂ） 磁場を用いて、工程（ａ’）により生成された複合体を回収する工程と、
（ｃ） 工程（ｂ）により回収された複合体と、前記標的高分子と特異的に結合する標識受容体を混合して、前記磁性粒子と前記標的高分子と前記標識受容体からなる複合体を生成する工程と、
（ｄ） 磁場を用いて、工程（ｃ）により生成された複合体を回収する工程と、
（ｅ） 工程（ｄ）により回収された複合体を、前記標識受容体の標識を用いて検出する工程と、
を有することを特徴とする標的高分子の検出方法。 A method for detecting a target macromolecule in a cell, comprising:
(A ′) A cell lysate, a cell lysis promoting particle, and a magnetic particle bound with a receptor that specifically binds to a target polymer are added to a sample containing cells and stirred, whereby the target Forming a composite of a polymer and the magnetic particles;
(B) using a magnetic field to recover the complex produced by step (a ′);
(C) A complex composed of the magnetic particles, the target polymer, and the labeled receptor obtained by mixing the complex recovered in step (b) with a labeled receptor that specifically binds to the target polymer. Generating
(D) recovering the complex produced by step (c) using a magnetic field;
(E) detecting the complex recovered in step (d) using the label of the labeled receptor;
A method for detecting a target polymer, comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007121531A JP2008275534A (en) | 2007-05-02 | 2007-05-02 | Method for refining target polymer and method for detecting it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007121531A JP2008275534A (en) | 2007-05-02 | 2007-05-02 | Method for refining target polymer and method for detecting it |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008275534A true JP2008275534A (en) | 2008-11-13 |
Family
ID=40053649
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007121531A Withdrawn JP2008275534A (en) | 2007-05-02 | 2007-05-02 | Method for refining target polymer and method for detecting it |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2008275534A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011059076A1 (en) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | Magnetic reagent, magnetic reagent kit, method for treating magnetic carriers and treatment device therefor |
| KR101448911B1 (en) | 2012-01-12 | 2014-10-13 | 강릉원주대학교산학협력단 | Apparatus for Pretreating Analytes Using Magnetic Particles, Apparatus and Method for Detecting Analytes Using the Same |
| JP2014533832A (en) * | 2011-11-16 | 2014-12-15 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | Particle repulsion to enhance surface contact in magnetic particle immunoassays |
| JP2016090570A (en) * | 2014-11-04 | 2016-05-23 | 三洋化成工業株式会社 | Method for separation of object material by using magnetic silica particles |
| JPWO2014122973A1 (en) * | 2013-02-06 | 2017-01-26 | 富士レビオ株式会社 | Target substance measurement method |
-
2007
- 2007-05-02 JP JP2007121531A patent/JP2008275534A/en not_active Withdrawn
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011059076A1 (en) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | Magnetic reagent, magnetic reagent kit, method for treating magnetic carriers and treatment device therefor |
| JP5752042B2 (en) * | 2009-11-13 | 2015-07-22 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | Magnetic reagent, magnetic reagent kit, magnetic carrier processing method and processing apparatus thereof |
| US9694368B2 (en) | 2009-11-13 | 2017-07-04 | Universal Bio Research Co., Ltd. | Magnetic reagent, magnetic reagent kit, method for treating magnetic carriers, and treatment device therefor |
| JP2014533832A (en) * | 2011-11-16 | 2014-12-15 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | Particle repulsion to enhance surface contact in magnetic particle immunoassays |
| KR101448911B1 (en) | 2012-01-12 | 2014-10-13 | 강릉원주대학교산학협력단 | Apparatus for Pretreating Analytes Using Magnetic Particles, Apparatus and Method for Detecting Analytes Using the Same |
| JPWO2014122973A1 (en) * | 2013-02-06 | 2017-01-26 | 富士レビオ株式会社 | Target substance measurement method |
| JP2016090570A (en) * | 2014-11-04 | 2016-05-23 | 三洋化成工業株式会社 | Method for separation of object material by using magnetic silica particles |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kang et al. | High-purity capture and release of circulating exosomes using an exosome-specific dual-patterned immunofiltration (ExoDIF) device | |
| US20100047766A1 (en) | Analyte manipulation and detection | |
| Winter et al. | Isolation of circulating fetal trophoblasts using inertial microfluidics for noninvasive prenatal testing | |
| WO2021170009A1 (en) | Fetal cell capture module and microfluidic chip for fetal cell capture and methods for using the same | |
| CN103592432B (en) | Method for separating sperm in sperm and epithelial cell mixed stain by using immunological magnetic beads | |
| ES2751454T3 (en) | Release and collection of particles | |
| US20100233675A1 (en) | Analyte manipulation and detection | |
| CN1454313A (en) | Increased separation efficiency via controlled aggregation of magnetic nanoparticles | |
| JP2008275534A (en) | Method for refining target polymer and method for detecting it | |
| JP2016521353A (en) | Method, apparatus and system for sample analysis | |
| CN105651995A (en) | Method for detecting EVs (extracellular vesicles) released by ECs (endothelial cells) and EPCs (endothelial progenitor cells) in blood | |
| JP7376021B2 (en) | Method for separating and analyzing microvesicles from human blood | |
| JP7444386B2 (en) | Method for isolating and analyzing microvesicles from human urine | |
| JP6617516B2 (en) | Method for detecting target cells contained in blood sample | |
| JP2011519022A (en) | Methods and kits for detecting tumor-specific fusion proteins | |
| KR101416344B1 (en) | Membrane Assay Method | |
| KR101704828B1 (en) | Method for diagnosing inflammatory diseases through analysis of protein or gene of extracellular vesicle in a body fluid | |
| WO2006020936A2 (en) | A method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells | |
| KR20140008608A (en) | Particle complex and method for separating target cell | |
| JP2008058285A (en) | Method for detecting biological substance | |
| JP4677254B2 (en) | Cell separation method, cell identification method and cell inspection method | |
| JP2007526743A (en) | A method for assessing the invasive potential of cells using chromatin analysis | |
| CN113358874A (en) | Detection method for systemic lupus erythematosus autoantibodies | |
| EP2619588B1 (en) | Methods and reagents for signal amplification | |
| CN113960313B (en) | Exosome ALK fusion protein magnetic immunochemiluminescence detection kit |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20100706 |