JP2007526743A - A method for assessing the invasive potential of cells using chromatin analysis - Google Patents

Abstract

本発明の実施形態は、細胞のクロマチンの、特定の酵素または特定の物質による、分解または他の改変に対する感受性に従って、細胞の侵襲可能性を評価しまたは推定し、そしてそれにより、正常細胞および癌性細胞の間を区別するための方法に関連する。透過処理された、通常細胞内または非侵襲性細胞内のクロマチン（そこからクロマチン鎖を除く）は、侵襲性細胞由来のクロマチンよりも、エンドヌクレアーゼまたはタンパク質分解酵素による分解に対してより感受性である。Embodiments of the present invention assess or estimate the invasive potential of cells according to their sensitivity to degradation or other modifications by specific enzymes or specific substances, and thereby normal cells and cancers Related to methods for distinguishing between sex cells. Permeabilized normal or non-invasive chromatin (excluding the chromatin chain) is more sensitive to degradation by endonucleases or proteolytic enzymes than invasive cell-derived chromatin .

Description

（説明）
本出願は、米国仮特許出願第６０／４７６，５８０号（２００３年６月６日出願）；同第６０／５１１，５４３号（２００３年１０月１４日出願）；同第６０／５２６，７９２号（２００３年１２月４日出願）；および出願番号不明（２００４年５月２６日出願）に基づく優先権を主張する。これらの全体は本明細書中に参考として援用される。 (Explanation)
No. 60 / 476,580 (filed Jun. 6, 2003); 60 / 511,543 (filed Oct. 14, 2003); 60 / 526,792 Claims priority (filed December 4, 2003); and application number unknown (filed May 26, 2004). All of which are incorporated herein by reference.

政府は、アメリカ国立衛生研究所から付与された助成金番号ＲＯ１ ＥＹ１０４５７に従って、本発明における権利を所有し得る。   The government may have rights in this invention in accordance with grant number RO1 EY10457 awarded by the National Institutes of Health.

（発明の背景）
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、侵襲性哺乳動物細胞の検出および上記細胞の侵襲性の程度間で区別するための方法についての方法に関連する。特に、本発明は、特定のクロマチン調節因子（例えば、エンドヌクレアーゼＡＬＵおよび／またはプロテアーゼ プロテイナーゼＫの分解作用）に対するクロマチンの感受性を決定するための方法に関連し、ここでそのような因子に対するクロマチンの感受性は、細胞の癌性状態および／または細胞の侵襲可能性の指標である。 (Background of the Invention)
(I. Field of the Invention)
The present invention relates to a method for detecting invasive mammalian cells and a method for distinguishing between the degree of invasiveness of the cells. In particular, the present invention relates to a method for determining the sensitivity of chromatin to certain chromatin modulators (eg, the degradation effect of endonuclease ALU and / or protease proteinase K), wherein the chromatin of such agents is directed against such factors. Sensitivity is an indication of the cancerous state of the cell and / or the invasive potential of the cell.

（ＩＩ．関連技術の説明）
癌の検出について、多くの方法が考案されてきた。それらの範囲は、Ｘ線および光学技術による腫瘍塊の画像化から、生検を介して得られた組織試料中の細胞の評価を経る、癌性細胞の表面上に発現されるか、または癌性細胞によって体液（例えば、血液および尿）中に放出されるタンパク質および他の分子種の検出にわたる。一旦、癌細胞が検出され、そして限局された場合、型について上記癌を分類し、そして上記癌の特徴を決定して、適切な予後診断および処置計画に至ることが、必要である。上記癌細胞の侵襲性の推定は、この特徴付けの重要な局面である。 (II. Explanation of related technology)
Many methods have been devised for detecting cancer. Those ranges are expressed on the surface of cancerous cells, via imaging of tumor masses by X-ray and optical techniques, through evaluation of cells in tissue samples obtained via biopsy, or cancer It spans the detection of proteins and other molecular species released into body fluids (eg blood and urine) by sex cells. Once cancer cells are detected and localized, it is necessary to classify the cancer by type and characterize the cancer to arrive at an appropriate prognosis and treatment plan. The estimation of cancer cell invasiveness is an important aspect of this characterization.

上記癌の検出、診断、分類および特徴付けは、伝統的に、組織または細胞学的な検体を含む細胞の、形態学上の視覚的な顕微鏡的評価を通じて実施されてきた。より最近では、癌性細胞によって特異的または差次的に発現する、特定の細胞表面タンパク質（マーカー）の検出および定量化についての、免疫組織化学的方法および免疫細胞化学的方法の使用が増加してきた。まだ日常的な臨床使用には至っていないが、多故の一組のタンパク質の発現における変化を評価することによって、癌細胞を同定するプロテオミック技術が開発中である。   The detection, diagnosis, classification and characterization of such cancers has traditionally been performed through morphological visual microscopic evaluation of cells, including tissue or cytological specimens. More recently, there has been an increased use of immunohistochemical and immunocytochemical methods for the detection and quantification of specific cell surface proteins (markers) that are specifically or differentially expressed by cancerous cells. It was. Although not yet in routine clinical use, proteomic techniques are being developed to identify cancer cells by assessing changes in the expression of the most likely set of proteins.

上記細胞形態学上の評価は一般的に、癌の検出、分類および特徴付けについての最も決定的な方法とみなされる。形態学的評価は、細胞ごとに、差次的に染色された、細胞および組織プレパラートを試験する、特別に訓練され、高度に熟練した人員によって行われる。このことは、大変な労務であり、そして、一部、多数の微妙な形態学的特徴のいずれかの存在のために、非常に多くの個々の細胞を評価する必要性に起因してかなりの誤差率を有する、いささか主観的なマニュアルのプロセスである。これらの形態学的特徴およびそれらの解釈は、細胞の型の間で異なり得、および患者の病歴および患者の人口統計のような要素に影響され得る。さらに、通常の、修復可能でありかつ反応性の細胞プロセスは、しばしば、癌性細胞において観察される形態学的変化を模倣する。   The cell morphological assessment is generally regarded as the most critical method for cancer detection, classification and characterization. Morphological evaluation is performed by specially trained and highly skilled personnel who examine differentially stained, cell and tissue preparations from cell to cell. This is a daunting task and, due in part to the need to evaluate so many individual cells due to the presence of any of a number of subtle morphological features. A somewhat subjective manual process with an error rate. These morphological features and their interpretation can vary between cell types and can be influenced by factors such as patient history and patient demographics. Furthermore, normal, repairable and reactive cellular processes often mimic the morphological changes observed in cancerous cells.

一部臨床使用における、細胞形態の評価について自動画像解析システムは、５０年以上に渡り積極的に開発されてきた。上記癌細胞の検出、診断および特徴付けにおけるこれらのシステムの利用は、視覚的な形態学的評価を制限する要素と同じ要素、ならびに自動画像獲得、および分析システムに固有の上記画像取得デバイスのダイナミックレンジのような要素によって制限される。形態学上の評価が免疫化学的着色方法（例えば、後述と組み合わされた画像解析システムは、分析上のあいまいさを減らす手段として開発されているが、いまだ広範な臨床使用において、有効とされておらずそして認められていない。   Automated image analysis systems for the evaluation of cell morphology in some clinical uses have been actively developed for over 50 years. The use of these systems in the detection, diagnosis and characterization of the cancer cells is the same as the factors that limit visual morphological evaluation, as well as the dynamics of the image acquisition devices inherent in automatic image acquisition and analysis systems Limited by factors like range. Morphological evaluation is based on immunochemical staining methods (eg, image analysis systems combined with those described below have been developed as a means to reduce analytical ambiguity, but are still effective in a wide range of clinical uses. Not and not recognized.

免疫組織化学的方法および免疫細胞化学的方法は、癌性細胞が、その型の正常細胞中では見られないタンパク質を発現し得るか、または正常細胞中で見られる場合よりもより有意に高い濃度、または異なる局在で、正常細胞中で見られるタンパク質を発現し得るという知見に基づく。これらのタンパク質は、上記標的細胞に特異的に結合する抗体を利用する免疫学的試薬によって、定性的または定量的のいずれかで検出され得る。現在の手法において、これらの免疫学的方法は主として、異常である可能性のある細胞を検出するために使用され、その結果は、形態学的方法を使用して確認され、そして精緻化される。   Immunohistochemical and immunocytochemical methods can be used to express cancerous cells that can express proteins that are not found in normal cells of that type, or at significantly higher concentrations than are found in normal cells. Or based on the finding that it can express proteins found in normal cells at different locations. These proteins can be detected either qualitatively or quantitatively by immunological reagents that utilize antibodies that specifically bind to the target cells. In current approaches, these immunological methods are primarily used to detect cells that may be abnormal, and the results are confirmed and refined using morphological methods .

多くの要因は、癌の検出、分類および特徴付けにおける免疫学的方法の利用を制限する。多くの腫瘍は、その一部が癌性でありそして侵襲性の程度において顕著に異なるのみの細胞型の混合物からなる。従って、免疫学的試薬は、そのような混合物中の上記多様な細胞型の間を区別し得なくてはならない。上記免疫学的方法の開発における２つの重要な工程は、正常細胞および癌性細胞の間の区別を可能にするタンパク質マーカーの同定、ならびにこのマーカーに特異的に結合する抗体の産生である。同定された上記癌性状態に対して真に独特であるマーカータンパク質は、ほとんど無い。それどころか、公知でありかつ癌の検出のために代表的に利用される上記マーカータンパク質は、量、限局化および／または発現のタイミングが正常細胞および癌性細胞の間を区別ための、上記量、に関する正常細胞成分である。従って、マーカー発現の有無を基礎とする２元的様式で、正常細胞および癌性細胞の間を区別し得ることよりもむしろ、染色強度および局在に関連する半経験的な評価を基礎とした、正常細胞および癌性細胞の間の区別が必要である。現在、この目的で利用される多くの免疫学的着色手順の多くは、定量的ではなく、そして形態学上の評価における場合のように、それは、正常な増殖性細胞プロセス（例えば、修復）と関係がある細胞を模倣することは癌細胞における、多様なマーカーの発現パターンにとって珍しいことではない。さらに、これらの要素は、そのような免疫学的評価に対してさらなる多義性を導く。   Many factors limit the use of immunological methods in cancer detection, classification and characterization. Many tumors consist of a mixture of cell types, some of which are cancerous and only differ significantly in the degree of invasiveness. Thus, immunological reagents must be able to distinguish between the various cell types in such mixtures. Two important steps in the development of the immunological method are the identification of protein markers that allow differentiation between normal and cancerous cells and the production of antibodies that specifically bind to this marker. Few marker proteins are truly unique to the above identified cancerous conditions. On the contrary, the marker protein that is known and typically utilized for the detection of cancer is the amount, localization and / or timing of expression described above for distinguishing between normal and cancerous cells, Is a normal cellular component. Thus, rather than being able to distinguish between normal and cancerous cells in a binary manner based on the presence or absence of marker expression, it was based on a semi-empirical assessment related to staining intensity and localization. A distinction is needed between normal cells and cancerous cells. Currently, many of the many immunological staining procedures utilized for this purpose are not quantitative, and as is the case in morphological assessments, it is a normal proliferative cell process (eg, repair) and Mimicking related cells is not uncommon for the expression patterns of various markers in cancer cells. Furthermore, these factors lead to further ambiguity for such immunological evaluation.

抗体の、標的分析物に対するその特異性は、免疫学的方法の利用に関して深い関係を有する別の要素である。異なる腫瘍型は、異なる一組のマーカーを発現し、そして異なるマーカーの発現パターンを示し、従って目的の癌型の各々に対して所定の異なる免疫試薬の使用を必要とする。腫瘍が真にモノクローナルでない場合、それらは、その組成、構造および／または細胞の間での標的タンパク質マーカーの、提示において異質性である。極めて特異的な抗体は、この異質な混合物の部分集合のみを認識し得るが、より特異性が低い抗体は、上記標的マーカーの多くの形態だけではなく、その上、関連する他のマーカーの特徴をも認識し得る。さらに、抗体は、上記標的マーカーと関係ない細胞上の部位に、非特異的に結合し得る。標的マーカーはまた、いくつかの様式で遮蔽（ｍａｓｋ）され得、そしてそれ故、このマーカーが検出され得る前に、「回復」を必要とする。免疫学的方法の上記臨床利用を制限し得るこれらおよび多くの他の要素は、当業者に公知である。   The specificity of the antibody for the target analyte is another factor that has a deep connection with the use of immunological methods. Different tumor types express different sets of markers and exhibit different marker expression patterns, thus requiring the use of certain different immunological reagents for each of the cancer types of interest. If tumors are not truly monoclonal, they are heterogeneous in presentation of target protein markers between their composition, structure and / or cells. While highly specific antibodies can recognize only a subset of this heterogeneous mixture, less specific antibodies are not only a feature of many of the above target markers, but also the characteristics of other related markers Can also be recognized. Furthermore, the antibody can bind nonspecifically to a site on the cell that is unrelated to the target marker. Target markers can also be masked in several ways and therefore require “recovery” before this marker can be detected. These and many other factors that can limit the above clinical use of immunological methods are known to those skilled in the art.

さらに、予後診断計画および処置計画を確立し得るために、癌性細胞の侵襲可能性を、客観的かつ正確に評価し得る必要性が存在する。現在の形態学的方法および免疫学的方法は、特定の形態学的特徴および免疫学的特徴ならびに臨床結果の間で確立されている経験的相関関係および定性的相関関係に基づいた侵襲可能性の指標を提供する。これらのことおよび他の理由のためである、一般的に広い範囲の癌型に適用可能であり、臨床的に有用な結論に達するために必要とする解釈が最小限の解釈癌細胞の検出のための、客観的かつ明白な方法の必要性が存在する。   Furthermore, there is a need to be able to objectively and accurately assess the invasive potential of cancerous cells in order to be able to establish a prognostic and treatment plan. Current morphological and immunological methods include invasive potential based on established empirical and qualitative correlations between specific morphological and immunological characteristics and clinical outcomes. Provide indicators. For these and other reasons, it is generally applicable to a wide range of cancer types, and requires minimal interpretation to reach clinically useful conclusions. There is a need for an objective and obvious way to do this.

（発明の要旨）
上記で議論した理由により、一般的に広い範囲の癌型に適用可能であり、そして臨床的に有用な結論に達するために必要な解釈が最小限である、癌細胞の検出のための客観的でありかつ明白な方法の必要性が存在する。本発明は、哺乳動物細胞の、形態学的特徴および免疫学的特徴の両方の基礎をなす全ての哺乳動物細胞の基本的な特徴に注目して、この必要性に取り組んだ。 (Summary of the Invention)
For the reasons discussed above, an objective for the detection of cancer cells that is generally applicable to a wide range of cancer types and that requires minimal interpretation to reach clinically useful conclusions And there is a clear need for methods. The present invention addressed this need by focusing on the basic characteristics of all mammalian cells that underlie both morphological and immunological characteristics of mammalian cells.

さらに、予後診断計画および処置計画を確立し得るために、癌細胞の侵襲可能性を、客観的かつ正確に評価し得る必要がある。現在の形態学的方法および免疫学的方法は、特定の形態学的特徴および免疫学的特徴ならびに臨床結果の間で確立された経験的相関関係および定性的相関関係に基づく侵襲可能性の指標を提供する。本発明は、代表的に、癌細胞の侵襲可能性を推定する定量的方法を提供する。   Furthermore, in order to be able to establish a prognosis plan and a treatment plan, it is necessary to be able to objectively and accurately evaluate the invasive potential of cancer cells. Current morphological and immunological methods provide indicators of invasive potential based on established empirical and qualitative correlations between specific morphological and immunological characteristics and clinical outcomes. provide. The present invention typically provides a quantitative method for estimating the invasive potential of cancer cells.

本発明の実施形態は、特定の酵素または因子による細胞のクロマチンの分解または他の改変に対する感受性に従って細胞の侵襲可能性を、評価および測定するための方法、ならびにそのことにより、正常細胞および癌性細胞の間を区別するための方法に関連する。特に、透過処理された正常かつ非侵襲性の細胞内のクロマチン、およびそこから取り出されたクロマチン鎖は、侵襲性細胞由来のクロマチンよりも、クロマチン改変剤による改変（例えば、エンドヌクレアーゼＡＬＵまたはプロテアーゼ プロテイナーゼＫによる分解）に対してより感受性である。さらに透過処理された正常細胞内のクロマチンは、透過処理された侵襲性細胞内のクロマチンよりも、ＤＮＡａｓｅによる分解に対して、より感受性である。   Embodiments of the present invention provide methods for assessing and measuring the invasive potential of cells according to their sensitivity to cellular chromatin degradation or other modifications by specific enzymes or factors, and thereby normal cells and cancerous Related to methods for distinguishing between cells. In particular, permeabilized normal and non-invasive intracellular chromatin, and the chromatin chains extracted therefrom, are modified by chromatin modifying agents (eg, endonuclease ALU or protease proteinase) rather than invasive cell-derived chromatin. More sensitive to degradation by K). Furthermore, chromatin in permeabilized normal cells is more sensitive to degradation by DNAase than chromatin in permeabilized invasive cells.

本発明の特定の実施形態は、細胞の侵襲可能性を評価するための方法を包含し、この方法は、細胞のクロマチンと１つ以上のクロマチン改変剤とを接触させる工程およびクロマチン分解を評価することによってクロマチン安定性を評価する工程を包含する。上記方法は、上記クロマチンと１つ以上のクロマチン改変剤とを接触させる工程の前に、上記細胞から核を単離する工程を包含し得る。上記方法はさらに、上記クロマチンと１つ以上のクロマチン改変剤とを接触させる工程より前に、上記細胞の上記核からクロマチンを単離する工程を含み得る。特定の局面において、上記細胞、上記核膜、または上記細胞および上記核膜は、透過処理される。クロマチン改変剤は、プロテイナーゼＫのようなタンパク質分解酵素；ヌクレアーゼ；ＤＮＡａｓｅ；エンドヌクレアーゼ；またはこれらの組み合わせであり得る。好ましい実施形態において、上記ヌクレアーゼはＡＬＵまたはＭＳＰ１である。   Certain embodiments of the invention include a method for assessing the invasive potential of a cell, the method assessing the step of contacting a cell's chromatin with one or more chromatin modifying agents and chromatin degradation. Thereby assessing chromatin stability. The method can include isolating nuclei from the cells prior to contacting the chromatin with one or more chromatin modifying agents. The method can further include isolating chromatin from the nucleus of the cell prior to contacting the chromatin with one or more chromatin modifying agents. In certain aspects, the cells, the nuclear membrane, or the cells and the nuclear membrane are permeabilized. The chromatin modifying agent can be a proteolytic enzyme such as proteinase K; a nuclease; a DNAase; an endonuclease; or a combination thereof. In a preferred embodiment, the nuclease is ALU or MSP1.

他の局面において、上記クロマチンは、上記クロマチン改変剤と接触させる工程の後に再凝集され得る。好ましい実施形態において、クロマチン再凝集は、クロマチン安定性を評価する工程の前に、上記クロマチンと、ＤＮＡ結合色素、ポリアミン、ヒストン、トポイソメラーゼ、またはグルタルアルデヒドとを接触させる工程によって、クロマチンの再凝集が開始される。本発明のさらなる局面において、クロマチンの評価は、平面またはほぼ平面な表面上あるいは液体培地中の懸濁液中において行われる。なおさらなる局面において、上記クロマチン分解が、定性的または定量的に評価される。特定の局面において、クロマチン分解が、視覚的な顕微鏡法、画像解析、またはフローサイトメトリーによって評価される。評価の前に、上記クロマチンの光学的コントラストは、クロマチンをＤＮＡ結合色素と接触させることによって上昇し得る。上記ＤＮＡ結合色素は代表的に、クロマチン色素または蛍光色素を含む。上記蛍光色素は、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＹＯ−ＹＯ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＰＯ−ＰＲＯまたは当該分野で公知の類似の色素であり得る。   In other aspects, the chromatin may be reaggregated after the step of contacting with the chromatin modifying agent. In a preferred embodiment, chromatin reaggregation is carried out by contacting the chromatin with a DNA binding dye, polyamine, histone, topoisomerase, or glutaraldehyde prior to the step of assessing chromatin stability. Be started. In a further aspect of the invention, the assessment of chromatin is performed on a planar or nearly planar surface or in suspension in a liquid medium. In yet a further aspect, the chromatin degradation is assessed qualitatively or quantitatively. In certain aspects, chromatin degradation is assessed by visual microscopy, image analysis, or flow cytometry. Prior to evaluation, the optical contrast of the chromatin can be increased by contacting the chromatin with a DNA binding dye. The DNA binding dye typically includes a chromatin dye or a fluorescent dye. The fluorescent dye can be ethidium bromide, acridine orange, TO-PRO, YO-YO, YO-PRO, PO-PRO or similar dyes known in the art.

本発明のさらなる実施形態は、候補治療薬の効果を評価するための方法を包含し、この方法は、細胞を候補治療薬と接触させる工程；細胞のクロマチンと、本明細書中に記載されるような、クロマチン改変剤とを接触させる工程；本明細書中に記載されるように、クロマチン分解を評価することによってクロマチン安定性を評価する工程；候補治療薬を用いた細胞の処置によって生じるクロマチン分解と、治療薬を用いて処理してない細胞とを比較することによって上記候補治療薬の有効性を評価する工程を包含する。本発明のさらなる実施形態は、本発明のプロセスによって同定された治療薬に関する。   Further embodiments of the invention include a method for assessing the effect of a candidate therapeutic agent, the method comprising contacting a cell with a candidate therapeutic agent; cellular chromatin, and a method described herein. Contacting with a chromatin modifying agent; assessing chromatin stability by assessing chromatin degradation as described herein; chromatin resulting from treatment of cells with a candidate therapeutic agent Evaluating the effectiveness of the candidate therapeutic by comparing degradation and cells that have not been treated with the therapeutic. A further embodiment of the invention relates to therapeutic agents identified by the process of the invention.

本発明のなおさらなる実施形態において、上記方法は本明細書中に記載されるような、クロマチン改変剤、好ましくはヌクレアーゼによってクロマチンの分解の程度を評価することによって正常細胞と癌性細胞の間を区別する工程を包含する。   In yet a further embodiment of the invention, the method comprises as described herein between normal and cancerous cells by assessing the extent of chromatin degradation by a chromatin modifying agent, preferably a nuclease. Including the step of distinguishing.

本発明の実施形態はまた、クロマチンを差次的に分解し得る因子を検出するための方法を包含し、この方法は、上記クロマチンと上記評価された因子とを接触させる工程；本明細書に記載されるような、上記評価された因子により、クロマチンが分解される程度を評価する工程；侵襲性の程度が異なる細胞のクロマチンが、本明細書中に記載されるような上記因子によって分解される程度における違いを評価することによって、候補因子の効果を決定する工程を包含する。   Embodiments of the invention also include a method for detecting a factor capable of differentially degrading chromatin, the method comprising contacting the chromatin with the evaluated factor; Assessing the extent to which chromatin is degraded by the assessed factors as described; chromatin of cells with different degrees of invasiveness is degraded by the factors as described herein Determining the effect of the candidate factor by evaluating the difference in degree.

本明細書中に記載される上記方法または組成物は、本明細書に記載される他の方法または組成物に関して実施され得ることが企図される。   It is contemplated that the methods or compositions described herein can be practiced with respect to other methods or compositions described herein.

特許請求の範囲および／または本明細書において、用語「含む」と共に使用される場合の、語句「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたはそれ以上」の意味と一致する。   In the claims and / or herein, the use of the phrase “a” or “an” when used with the term “comprising” may mean “one”, but it also means “1”. It is consistent with the meaning of “one or more”, “at least one” and “one or more”.

本発明の他の目的、他の特徴および他の利点は、以下の詳細な説明により明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例（本発明の特定の実施形態を示す）は、例示としてのみ与えられる。なぜなら、本発明の精神および範囲内にある種々の変更および改変は、この詳細な説明によって当業者に明らかとなるからである。   Other objects, other features and other advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. However, the detailed description and specific examples (representing specific embodiments of the invention) are given by way of illustration only. This is because various changes and modifications within the spirit and scope of the present invention will become apparent to those skilled in the art from this detailed description.

（例示的な実施形態の説明）
クロマチン構造は、遺伝子の転写、複製および組み換えを含む細胞調節および細胞機能の多くの局面における重要な要素である。要求されるクロマチン高次構造および細胞周期間におけるその変化を制御する詳細な機構はまだ十分に理解されていないが、クロマチン構造の全局面は、細胞の状態と相関し得、正常細胞と癌細胞との間の形態学的区別における主要な要素として広く使用される。さらに、クロマチンを含む遺伝子の発現は、この目的のために使用される免疫学的特徴および他の形態学的特徴の発生を生じる。クロマチン構造、遺伝子発現、ならびに形態学的特徴および免疫学的特徴の間の上記関係は、積極的に研究されている領域である。 (Description of Exemplary Embodiments)
Chromatin structure is an important element in many aspects of cell regulation and function, including gene transcription, replication and recombination. Although the detailed mechanisms that control the required chromatin conformation and its changes during the cell cycle are not yet fully understood, all aspects of chromatin structure can be correlated with the state of the cell, normal and cancer cells. Widely used as the main element in the morphological distinction between Furthermore, the expression of genes including chromatin results in the development of immunological and other morphological features that are used for this purpose. The above relationship between chromatin structure, gene expression, and morphological and immunological characteristics is an area that has been actively studied.

クロマチンの、外部因子（例えば、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよびプロテアーゼ）による分解のような改変に対する感受性は、クロマチン構造に依存する。用語「外部因子」は、クロマチン構造の一部である核酸、ヒストンおよび他の物質以外の因子を表す。本明細書で使用される「クロマチン改変剤」は、正常細胞および癌性細胞に関連するクロマチンに対して差次的に影響する因子を表す。差次的な影響は、分解（例えば、ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、あるいはプロテアーゼによる）に対するクロマチンの感受性における違いとして明白であり得る。本発明は、特定のクロマチン改変剤（例えば、特異的なエンドヌクレアーゼ、特異的なヌクレアーゼ、特異的なプロテアーゼおよび他の化学物質または化合物）が、癌性状態の評価および／または細胞の侵襲可能性の評価に対する観察に有利に関連する、独特な様式のクロマチンの分解を生じ得るという観察に基づく。   The sensitivity of chromatin to modifications such as degradation by external factors (eg, nucleases, endonucleases and proteases) depends on the chromatin structure. The term “external factor” refers to factors other than nucleic acids, histones and other substances that are part of the chromatin structure. As used herein, “chromatin modifying agents” refers to factors that differentially affect chromatin associated with normal and cancerous cells. Differential effects may be manifested as differences in chromatin sensitivity to degradation (eg, by nucleases or endonucleases, or proteases). The present invention allows specific chromatin modifying agents (eg, specific endonucleases, specific nucleases, specific proteases and other chemicals or compounds) to be assessed for cancerous status and / or cellular invasiveness. Based on the observation that it can result in a unique manner of chromatin degradation that is favorably linked to observations on the evaluation of

本発明は、細胞の侵襲可能性を、推定または判定するためおよび／または、より一般的には癌性細胞と非癌性（正常）細胞との間を区別するための方法に関連する。   The present invention relates to a method for estimating or determining the invasive potential of a cell and / or more generally for distinguishing between cancerous and non-cancerous (normal) cells.

細胞の全ゲノムを含むクロマチンは、少なくとも部分的にタンパク質（例えば、遺伝子発現を調節するヒストン）に入れられる二重鎖ＤＮＡからなる。このＤＮＡの外部因子（例えば、転写因子およびエンドヌクレアーゼ）に対する露出は、その時々で発現されている遺伝子によって決定されるか、またはその遺伝子を決定する。結果として、正常細胞において、細胞のゲノムを含むＤＮＡの特定の部分だけが、外部因子に露出される。この露出のパターンは、細胞が癌性になるときに変化し、そしてさらに癌細胞の侵襲性の程度に依存して変化する。結果として、クロマチン改変剤によるクロマチン鎖の分解に対する感受性は、クロマチンを含む細胞が正常であるか癌性であるかに依存して、系統的様式で異なり、そして癌性の場合は上記癌の侵襲性の程度によって異なる。タンパク質分解による分解に対する、クロマチンＤＮＡを入れるタンパク質の感受性は同様に、細胞が正常であるか癌性であるかによって異なる。   Chromatin, which includes the entire genome of a cell, consists of double-stranded DNA that is at least partially placed in a protein (eg, a histone that regulates gene expression). The exposure of this DNA to external factors (eg, transcription factors and endonucleases) is determined by, or determines, the gene that is being expressed from time to time. As a result, in normal cells, only certain parts of the DNA containing the cell's genome are exposed to external factors. This pattern of exposure changes when the cells become cancerous and further changes depending on the degree of invasiveness of the cancer cells. As a result, the sensitivity of chromatin modifying agents to degradation of chromatin chains varies in a systematic manner, depending on whether the cells containing the chromatin are normal or cancerous, and in the case of cancer, the invasion of the cancer It depends on the degree of sex. The sensitivity of the protein containing the chromatin DNA to proteolytic degradation also depends on whether the cell is normal or cancerous.

従って、クロマチン改変剤（例えば、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼ）による分解に対する細胞のクロマチンの感受性の判定または評価は、細胞が正常であるか癌性であるかの判断を、そして癌性の場合は、上記癌の侵襲性の程度の判断を可能にする。そのような判定は、癌の検出および集結の目的についての、定性的様式、半定量的様式または定量的様式において実施され得る。本発明の実施形態は、細胞から取り除かれたクロマチン鎖を含む。   Thus, determining or assessing the sensitivity of a cell's chromatin to degradation by a chromatin modifying agent (eg, nuclease, endonuclease or protease) determines whether the cell is normal or cancerous, and if it is cancerous This makes it possible to determine the degree of invasiveness of the cancer. Such determination can be performed in a qualitative, semi-quantitative or quantitative manner for the purpose of cancer detection and aggregation. Embodiments of the invention include a chromatin chain that has been removed from a cell.

（Ｉ．クロマチン安定性アッセイに関する方法）
本発明の実施形態は、１つ以上の細胞の、前癌性（ｐｒｅ−ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）、癌性および／または侵襲特性を評価するために使用され得る。本方法に使用される適切な試料としては、培養細胞ならびに被験体または患者由来の腫瘍生検、他の組織、器官および細胞を含む体液から得られた細胞が挙げられるが、これに限られない。 (I. Method for chromatin stability assay)
Embodiments of the invention can be used to assess the pre-cancerous, cancerous and / or invasive properties of one or more cells. Suitable samples used in the method include, but are not limited to, cultured cells and cells obtained from body fluids including tumor biopsies from other subjects or patients, other tissues, organs and cells. .

正常な内皮細胞株およびメラノーマ細胞株（ＯＣＭ−１ａ（非侵襲性）、Ｍ６１９（侵襲性）、およびＭＵＭ−２Ｂ（転移性、高侵襲性）を含むが、これに限られない）は、本発明の実施に使用され得る任意の細胞型の代表である。これらおよび類似の細胞型は、本発明の特定の実施形態の実例において使用される。   Normal endothelial and melanoma cell lines (including but not limited to OCM-1a (non-invasive), M619 (invasive), and MUM-2B (metastatic, highly invasive)) It is representative of any cell type that can be used in the practice of the invention. These and similar cell types are used in the illustration of particular embodiments of the present invention.

（Ａ．単離されたクロマチンを利用する方法）
クロマチン安定性の判定は、正常細胞および／または癌性細胞から単離されるクロマチンを使用して行われ得る。細胞の全ゲノムを含むクロマチンは、細胞から顕微手術的に除去され得、そして公知技術に従って、単一のクロマチン鎖として外部から操作され得る。クロマチンが顕微手術的に除去されるべき細胞は、固体基材上にコンフルエンスに接近するように細胞を増殖することによって、最も都合よく調製される。このプロセスは、上記基材に強力な付着物を形成する細胞を生じ、そして細胞が、顕微手術手順の間に上記細胞に加わる機械的な力によって移動するのを防ぐ。この固体基材に対する細胞の固着は、操作上の便宜のためだけであり、そして本発明の実施のために必須なものではない。クロマチンの顕微手術抽出に適する付着細胞は、実施例１：材料および方法（後述）に記載されるような方法によって調製され得る。実施例１に記載される上記特定の方法は主に、内皮細胞、メラノーマ細胞、および内皮細胞に由来する他の細胞型に適用され得る。本方法は、当業者にとって公知の様式で増殖培地の組成および関連するパラメータを調節することによって、他の細胞型に適合され得る。 (A. Method of using isolated chromatin)
Determination of chromatin stability can be performed using chromatin isolated from normal and / or cancerous cells. Chromatin containing the entire genome of the cell can be microsurgically removed from the cell and manipulated externally as a single chromatin chain according to known techniques. The cells from which chromatin is to be removed microsurgically are most conveniently prepared by growing the cells close to confluence on a solid substrate. This process results in cells forming a strong attachment to the substrate and prevents the cells from migrating due to mechanical forces applied to the cells during a microsurgical procedure. This adherence of cells to the solid substrate is for operational convenience only and is not essential for the practice of the present invention. Adherent cells suitable for microsurgical extraction of chromatin can be prepared by methods as described in Example 1: Materials and Methods (described below). The specific method described in Example 1 can be applied primarily to endothelial cells, melanoma cells, and other cell types derived from endothelial cells. The method can be adapted to other cell types by adjusting the composition of the growth medium and related parameters in a manner known to those skilled in the art.

上記細胞性クロマチンの顕微手術抽出は、細胞周期の任意の段階にある細胞において行われ得るが、良好に集中されおよび良好に濃縮された有糸***板（ｍｉｔｏｔｉｃ ｐｌａｔｅ）を有する***中期の細胞において、非常に都合よく行われる。１ミクロン〜５ミクロンの範囲の先端径および０．５ミクロン未満の上記先端部の内径を有するガラスマイクロピペットは、上記細胞核膜を迅速に貫く（「刺す（ｈａｒｐｏｏｍ）」）ために使用され得る。上記マイクロピペットの先端部を上記クロマチンと接触させることにより、非共有結合性の力を介して上記クロマチンが上記マイクロピペットの先端部に接着する。弱い吸引は、上記マイクロピペットの先端部へのクロマチンの接着を、さらに向上させるために適用され得る。上記マイクロピペットを引き抜くことで、上記核からクロマチンを抽出する。この顕微手術抽出手順が、***終期にある有糸***細胞に適用される場合に、上記核から、ただ１組の娘クロマチンが除去される。間期にある細胞または***前期、***中期または***後期にある有糸***細胞へのこの手順の適用は、上記核からの全てのクロマチンの除去を生じる。あるいは、上記細胞は、マイクロピペットの先端部を使用して上記細胞の核および細胞膜を破裂させることによって、そのクロマチンを排出することを誘導され得る。その後、上記排出されたクロマチン鎖は、前述のように、マイクロピペットの先端部に固着され得る。   The microsurgical extraction of cellular chromatin can be performed on cells at any stage of the cell cycle, but in metaphase cells with a well-concentrated and well-concentrated mitotic plate. Done very conveniently. A glass micropipette with a tip diameter in the range of 1 micron to 5 microns and an inner diameter of the tip of less than 0.5 microns can be used to rapidly penetrate (“harpoom”) the cell nuclear membrane. By bringing the tip of the micropipette into contact with the chromatin, the chromatin adheres to the tip of the micropipette via a non-covalent force. Weak suction can be applied to further improve the adhesion of chromatin to the tip of the micropipette. By extracting the micropipette, chromatin is extracted from the nucleus. When this microsurgical extraction procedure is applied to mitotic cells at the end of mitosis, only one daughter chromatin is removed from the nucleus. Application of this procedure to cells in the interphase or mitotic cells in the early, middle or late division results in the removal of all chromatin from the nucleus. Alternatively, the cells can be induced to drain their chromatin by rupturing the cell's nucleus and cell membrane using a micropipette tip. Thereafter, the discharged chromatin chain can be fixed to the tip of the micropipette as described above.

上記マイクロピペットは、上記付着したクロマチン鎖を操作するために使用され得る。１つのそのような操作は、上記細胞が付着する基材以外の、ガラス基材またはプラスチック基材への、上記クロマチン鎖の移動、および後述されるような方法による評価のために調製する際に所望されるように上記鎖を該基材上で配置することからなる。上記クロマチンの空気への露出は、上記クロマチンに回復不能な損傷を引き起こし得るため、上記細胞が付着される上記基材、および上記クロマチンが移動される上記基材が、同じ液体培地のプールに存在することならびに全ての操作を、この培地の表面下で行うことが好ましい。１つの都合の良い実施とは、上記クロマチンの顕微手術抽出を行う前に、同じプラスチック培養皿中に、上記細胞が付着する上記基材および上記クロマチンが移動される上記基材を隣接して配置することである。代替的な実施は、上記クロマチン鎖が移動される上記基材として上記プラスチック培養皿の内面を使用することである。上記受容基材と接触するとすぐに、上記クロマチン鎖は、非共有結合性の力を介して該基材に付着する。同じ細胞型および／または異なる細胞型由来の複数のクロマチン鎖は、単一の基材上の、別々の位置に配置され得る。１つの好ましい構成は、いくつかの細胞型から、各々単離された複数のクロマチン鎖を、１つの基材上に配置する。この構成は、異なるクロマチン源由来の上記クロマチン鎖の間における、重複的な比較を促す。他の配置は、所望されるように、および／または適切に使用され得る。   The micropipette can be used to manipulate the attached chromatin chain. One such operation is in preparing the chromatin chain for transfer to a glass or plastic substrate other than the substrate to which the cells adhere, and for evaluation by methods as described below. Arranging the chains on the substrate as desired. Since exposure of the chromatin to the air can cause irreparable damage to the chromatin, the substrate to which the cells are attached and the substrate to which the chromatin is transferred are present in the same pool of liquid media It is preferred that all manipulations are performed under the surface of the medium. One convenient implementation is to place the substrate to which the cells adhere and the substrate to which the chromatin is moved adjacent to each other in the same plastic culture dish before performing the microsurgical extraction of the chromatin. It is to be. An alternative implementation is to use the inner surface of the plastic culture dish as the substrate on which the chromatin chains are transferred. As soon as it contacts the receiving substrate, the chromatin chain adheres to the substrate via non-covalent forces. Multiple chromatin chains from the same and / or different cell types can be placed at different locations on a single substrate. One preferred configuration places a plurality of chromatin chains, each isolated from several cell types, on a single substrate. This configuration facilitates a redundant comparison between the chromatin chains from different chromatin sources. Other arrangements can be used as desired and / or appropriate.

上記クロマチン鎖を受容する適切な基材としては、ガラス（例えば、カバーガラス）またはプラスチック（ポリスチレン）が挙げられるが、これに限られない。それらの基材は、必要ではないが、上記クロマチン鎖の上記基材への付着を促進するためにコートされ得るか、または処理され得る。いくつかの適切な付着促進コーティングとしては、ゼラチン、血清タンパク質、マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン）、ポリアミン（例えば、ポリ−リジン）、またはポリ−アミノシランが挙げられるが、これに限られない。プラスチック基材はまた、上記プラスチックの表面にオキシ官能性および／またはアミン官能性を導入するために、ガスプラズマ、コロナまたはグロー放電を使用して処理され得る。これらおよび他のそのような付着促進の方法は当業者にとって周知である。   Suitable substrates that receive the chromatin chains include, but are not limited to glass (eg, cover glass) or plastic (polystyrene). These substrates are not required, but can be coated or treated to promote attachment of the chromatin chains to the substrate. Some suitable adhesion promoting coatings include, but are not limited to, gelatin, serum proteins, matrix proteins (eg, fibronectin), polyamines (eg, poly-lysine), or poly-aminosilanes. Plastic substrates can also be treated using gas plasma, corona or glow discharge to introduce oxy and / or amine functionality on the surface of the plastic. These and other such methods of promoting adhesion are well known to those skilled in the art.

上記クロマチン鎖の顕微手術抽出および操作は、好ましくは、クロマチン緊密化および上記クロマチンとの関連において見られるタンパク質の保持を、最大限に維持するため低イオン強度（３０ｍＭ〜５５ｍＭ）でありかつ約２ｍＭのＭｇ^２＋イオン（例えば、後述のもの）を含む培地中で行われる。しかしながら、その後の上記クロマチン鎖の酵素的処理は、好ましくは、利用される酵素の活性を最適化するために、生理学的条件下のイオン強度または生理学的条件に近いイオン強度で実施される。従って、上記クロマチン鎖の受容基材への付着後に、ＮａＣｌの添加によって、約３０ｍＭ〜５５ｍＭから約０．１５Ｍへ培地のイオン強度を増加することが望ましい。 The microsurgical extraction and manipulation of the chromatin chain is preferably at a low ionic strength (30 mM-55 mM) and approximately 2 mM to maximize the retention of proteins found in the context of chromatin compaction and chromatin. In a medium containing Mg ²⁺ ions (for example, those described later). However, the subsequent enzymatic treatment of the chromatin chain is preferably carried out at ionic strength under or near physiological conditions in order to optimize the activity of the enzyme utilized. Therefore, it is desirable to increase the ionic strength of the medium from about 30 mM to 55 mM to about 0.15 M by adding NaCl after attachment of the chromatin chain to the receiving substrate.

上記記載された試料調製方法は、広く適用可能であるが、初代細胞または培養細胞の使用、同定される細胞培養条件、ならびに顕微手術技術などであるがこれらに限定されない局面は上記試料または特定の細胞型から調製される試料に適するように、選択されおよび改変され得る。そのような改変は、当業者にとって公知であり、そして本発明の範囲を限定しない。   Although the sample preparation methods described above are widely applicable, aspects such as, but not limited to, use of primary cells or cultured cells, identified cell culture conditions, and microsurgical techniques include the sample or specific It can be selected and modified to suit samples prepared from cell types. Such modifications are known to those skilled in the art and do not limit the scope of the invention.

（Ｂ．細胞中のクロマチン安定性アッセイ）
本発明の方法は、完全な細胞ならびに単離されたクロマチン鎖に適用され得る。例として、対象となる完全な細胞は、吸着した血清タンパク質でコートされた固体基材（例えば、カバーガラス片）上に位置決めされ得るか、配置決めされ得るか、または増殖し得、そして界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を用いる処理によって透過処理され得、残留する界面活性剤を除去するために洗浄され得、そして適切なクロマチン改変剤によって処理され得る。本発明の実施形態は、支持基材および培地中に懸濁されている生存しかつ保存された細胞に付着する、生存しかつ保存された細胞を使用して実施され得る。特定の実施形態において、上記対象となる細胞の核は、クロマチン安定性アッセイが行われる前に、単離され得る。定量的クロマチン安定性アッセイは、特定のエンドヌクレアーゼ、特定のヌクレアーゼおよび特定のプロテアーゼによる消化に対するクロマチンの感受性に基づき、ここでこの感受性は、上記クロマチンを含むかまたは提供する上記細胞の侵襲性の程度を反映する。 (B. Chromatin stability assay in cells)
The method of the invention can be applied to whole cells as well as isolated chromatin chains. By way of example, the complete cell of interest can be positioned, positioned or grown on a solid substrate (eg, a coverslip piece) coated with adsorbed serum protein and surface active Can be permeabilized by treatment with an agent (eg, Triton X-100), washed to remove residual surfactant, and treated with a suitable chromatin modifying agent. Embodiments of the invention can be practiced using living and stored cells that adhere to the supporting substrate and living and stored cells suspended in media. In certain embodiments, the nuclei of the cells of interest can be isolated before a chromatin stability assay is performed. Quantitative chromatin stability assays are based on the sensitivity of chromatin to digestion with specific endonucleases, specific nucleases and specific proteases, where this sensitivity is the degree of invasiveness of the cells that contain or provide the chromatin. Reflect.

本発明の特定の局面において、メチル化は概して、より侵襲的な細胞のゲノム全体にわたる高次クロマチン構造のレベルを増加し得る。代表的に、ＭＳＰ ＰＣＲを使用する特定の遺伝子のメチル化は、種々の会社（例えば、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、ＯｎｃｏＭｅｔｈｙｌｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓ．Ａ．（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）など）から入手可能な一定範囲の、分子「キット」よって検出される。例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）は、いくつかの特異的プロモーターについての、メチル化特異的ＰＣＲを利用するＭＳＰ ＰＣＲを開発した。これらのプロモーターによるメチル化特異的ＰＣＲは、ＤＮＡのＧＣリッチ領域におけるＤＮＡメチル化パターンのマッピングを可能にする。プロモーター領域の高メチル化は、しばしば、ヒトの癌における腫瘍抑制遺伝子の不活性化についての決定的要因であると考えられる。   In certain aspects of the invention, methylation may generally increase the level of higher order chromatin structure throughout the genome of a more invasive cell. Typically, methylation of specific genes using MSP PCR is a range available from various companies (eg, Serologicals Corporation (Norcross, GA), OncoMethylome Sciences SA (Durham, NC), etc.). Of the molecule "kit". For example, Qiagen (Valencia, CA) has developed MSP PCR that utilizes methylation specific PCR for several specific promoters. Methylation-specific PCR with these promoters allows mapping of DNA methylation patterns in the GC-rich region of DNA. Hypermethylation of the promoter region is often thought to be a decisive factor for inactivation of tumor suppressor genes in human cancers.

これらの困難性により、溶解細胞モデルにおいて、通常の生理的イオン条件下における細胞集団のクロマチン試験を利用するアッセイが本発明者らによって開発された。ここでこのアッセイは、フローサイトメトリー、およびパパコロニー塗抹標本に類似する塗抹標本を利用する。上記試験は、ヒストン８量体およびトポイソメラーゼのレベル（Ｍａｎｉｏｔｉｓら、１９９７；Ｂｏｊａｎｏｗｓｋｉら、１９９８）のレベルだけではなく、高次クロマチン構造のレベル（Ｇａｒｉｎｉｓら、２００２；Ｃｈｅｎら、２００３）でも制御される遺伝子的隔離および遺伝子的露出を有する、統合された機械的単位としての上記細胞に基づく。Ａｌｕ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｍｂｏ、Ｈｉｎｄ−１、ＰＳＴ−１、および他の特異的ヌクレアーゼおよび非特異的ヌクレアーゼならびに特異的プロテアーゼおよび非特異的プロテアーゼについての感受性を試験することによって、本発明者らは、ジスルフィドが豊富なタンパク質は、細胞がその侵襲的挙動を増すにつれて、Ａｌｕ配列を差次的に隔離することを確認した。   Because of these difficulties, an assay has been developed by the inventors that utilizes a chromatin test of cell populations under normal physiological ionic conditions in a lysed cell model. Here the assay utilizes flow cytometry and a smear similar to the daddy colony smear. The test is controlled not only at the level of histone octamer and topoisomerase (Maniotis et al., 1997; Bojanowski et al., 1998) but also at the level of higher order chromatin structure (Garinis et al., 2002; Chen et al., 2003). Based on the cell as an integrated mechanical unit with genetic sequestration and genetic exposure. By testing the sensitivity for Alu, Eco RI, Mbo, Hind-1, PST-1, and other specific and non-specific nucleases and specific and non-specific proteases, we have Disulfide-rich proteins have been confirmed to differentially sequester Alu sequences as cells increase their invasive behavior.

ＭＳＰ Ｉ消化感受性またはＭＳＰ Ｉ消化非感受性が、侵襲的悪性疾患的挙動を増す細胞内における核の全般的な特性として試験された。これらの研究の結果は、メチル化された部位の隔離および露出が、特定の推定癌遺伝子および推定癌遺伝子配列のレベルで生じるだけでなく、高次クロマチンフォールディングのレベルで起こることを示す。   MSP I digestion susceptibility or MSP I digestion insensitivity was tested as a general feature of the nucleus in the cell that increases invasive malignant behavior. The results of these studies indicate that sequestration and exposure of methylated sites occurs not only at the level of specific putative oncogenes and putative oncogene sequences, but also at the level of higher order chromatin folding.

（ＩＩ．組織からの細胞調製）
細胞は、当業者にとって公知な方法（概説について、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）を参照のこと）による腫瘍生検のような組織から単離され得る。そのような方法は概して、肝臓由来の細胞外マトリックスタンパク質の単離についてのそれらの記載に類似するが、但し、上記組織がタンパク質分解酵素（例えば、細胞間相互作用を分断するトリプシン）を含む培地とともにインキュベートされ得るか、またはこの培地中でホモジナイズされ得ること、および上記所望の細胞が、上記上清中ではなく上記細胞ペレット中に見られることを除く。 (II. Cell preparation from tissue)
Cells can be isolated from tissues such as tumor biopsies by methods known to those skilled in the art (for a review, see Freshney, (1987)). Such methods are generally similar to those described for the isolation of liver-derived extracellular matrix proteins, except that the tissue contains a proteolytic enzyme (eg, trypsin that disrupts cell-cell interactions). Except that it can be incubated with or homogenized in this medium and that the desired cells are found in the cell pellet rather than in the supernatant.

細胞培養は、当業者にとって公知の方法に従って行われ得る。ほとんどの場合、適切な増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、および、適切な場所には適切な濃度の細胞増殖因子（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、血管上皮増殖因子、インターロイキンおよび培養される特定の細胞型の適切な増殖に必要とされ得る他の物質であるが、これに限られない）からなる。特定の実施形態において、抗菌剤および抗真菌剤は、主要な細胞型の分化能力を妨げることが知られているので、本発明の実施における使用について、細胞の培養には使用されない。細胞培養は、約５％ＣＯ_２平衡空気からなる雰囲気下において、３７℃で行われる。 Cell culture can be performed according to methods known to those skilled in the art. In most cases, an appropriate growth medium is DMEM (Bio Whittaker, Walkersville, MD) supplemented with 10% fetal calf serum, and an appropriate concentration of cell growth factor (eg, basic fibroblasts) where appropriate. Growth factor, transforming growth factor β, vascular epidermal growth factor, interleukin, and other substances that may be required for proper growth of the particular cell type being cultured). In certain embodiments, antibacterial and antifungal agents are not used for culturing cells for use in the practice of the present invention, as they are known to interfere with the differentiation potential of major cell types. Cell culture is performed at 37 ° C. in an atmosphere consisting of approximately 5% CO ₂ balanced air.

（ＩＩＩ．データ獲得および解釈）
対象となる細胞における核酸染色は、視覚的にモニターされ得るか、かつ／または当業者にとって周知である顕微鏡画像化手段（一般的な方法としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２００１）；またはＭｕｒｐｈｙ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ（２００１）を参照のこと）によって、その後の定量的分析のために、電子的画像として獲得され得る。視覚的画像化および電子的画像獲得についての１つの適切な顕微鏡プラットフォームは、２０倍、４０倍、および６３倍の拡大率における、透過光、位相差、微分干渉ならびにエピ蛍光視覚的画像および電子的画像に対応したＬｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，ＩＬ）からなる。この顕微鏡プラットフォームはまた、長期間にわたる反応の時間経過のモニタリングを容易にするための、任意に所望される温度（最も一般的には約２５℃または約３７℃）において画像化される上記標本を維持する手段を備え得る。Ｌｅｉｃａ ｍｏｄｅｌ ＬＳまたはＬｅｉｃａ ｍｏｄｅｌ ＬＢ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，ＩＬ）のような同等の仕様の正立顕微鏡もまた、利用され得る。 (III. Data acquisition and interpretation)
Nucleic acid staining in the cells of interest can be monitored visually and / or microscopic imaging means well known to those skilled in the art (generally, Current Protocols in Cell Biology (2001); or Murphy, Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (2001)) can be acquired as an electronic image for subsequent quantitative analysis. One suitable microscope platform for visual imaging and electronic image acquisition is transmitted light, phase difference, differential interference and epifluorescence visual and electronic images at magnifications of 20, 40, and 63 times It consists of a Leica DM IRB inverted microscope (Leica, Wetzlar, Germany Microsystems Inc., Bannockburn, IL) corresponding to the image. The microscope platform also allows the specimen to be imaged at any desired temperature (most commonly about 25 ° C. or about 37 ° C.) to facilitate monitoring of the reaction time course over time. Means for maintaining may be provided. Equivalent upright microscopes such as Leica model LS or Leica model LB (Leica Systems Inc., Bannockburn, IL) may also be utilized.

上記標本の画像は、光増幅器を用いてかまたは用いずにＣＣＤビデオカメラ、または類似の装置によって、電子的に獲得され得、コンピュータメモリおよび／または磁気的情報記憶媒体もしくは光学的情報記憶媒体または他の情報記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭまたはビデオテープ）中に電子的に保存され得る。画像獲得および画像保存の他の手段もまた、利用され得る。電子的に獲得された画像は、当業者にとって周知の画像分析方法（一般的方法論について、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９９７）またはＤｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ＰＩＫＳ Ｉｎｓｉｄｅ（２００１）を参照のこと）を利用して評価され得る。例えば、クロマチンがＤＮＡｓｅによって消化されて蛍光染色された細胞と、クロマチンがＤＮＡｓｅによって消化されておらず細胞蛍光染色された細胞との間の区別は、上記画像を、閾値より上の画素強度示す領域（推定上の核）および閾値未満の画素強度を示す領域に分割する順応的な閾値方法を利用し、その後、上記閾値領域以上の大きさ、形および意味、または統合画素強度を決定することによって、達成され得る。１つの都合の良い画像解析方法は、それぞれの画素位置での画像シグナルレベルを時間の関数として決定および評価し、染色体に沿って、対象となる明確な領域内の平均画素シグナルレベルを計算する。   The image of the specimen can be acquired electronically with a CCD video camera, or similar device, with or without an optical amplifier, computer memory and / or magnetic or optical information storage medium or It can be stored electronically in other information storage media (eg, CD-ROM or videotape). Other means of image acquisition and image storage can also be utilized. Electronically acquired images are evaluated using image analysis methods well known to those skilled in the art (for general methodologies, see Current Protocols in Cytometry (1997) or Digital Image Processing: PIKS Inside (2001)) Can be done. For example, the distinction between a cell that has been chromatin-digested with DNAse and fluorescently stained and a cell that has not been chromatin-digested with DNAse and that has undergone cell-fluorescence staining is the region where the above image shows the pixel intensity above the threshold. By using an adaptive threshold method that divides into (inferred core) and regions that exhibit pixel intensities below the threshold, and then determining the size, shape and meaning above the threshold region, or integrated pixel intensities Can be achieved. One convenient image analysis method determines and evaluates the image signal level at each pixel location as a function of time, and calculates the average pixel signal level in a well-defined region of interest along the chromosome.

そのような方法の多くの可能な適切な実施形態における１つは、上記標本の画像を獲得するためのＤＡＧＥ ＭＴＩ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｉｔｙ，ＩＮ）またはＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）冷却式ＣＣＤカメラを利用する。自動画像焦点合わせは、ＶａｙＴｅｋ Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ画像逆重畳分析ソフトウェアパッケージ（ＶａｙＴｅｋ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＩＡ）に含まれる強制的反復性オートフォーカスアルゴリズムを使用して達成される。対象となる領域は、手動で確定され得、そしてこれらの領域内の上記平均画素シグナルレベルは、Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ ＩＰＬａｂ画像定量化ソフトウェア（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ）を使用して決定され得る。このソフトウェアはまた、フィールド平坦化、バックグラウンド補正および「ホットピクセル（ｈｏｔ ｐｉｘｅｌ）」補正、ならびに固定閾値決定および／または順応的な閾値決めを含むがこれらに限定されない慣用的な画像調製作業を行うために利用され得る。当業者に公知であるより洗練された方法（例えば、画素追跡、形態学的分析、パターン整合、相関アルゴリズム画像分析方法および類似アルゴリズム画像分析方法であるが、これらに限定されない）は、本発明における特定の適用に対して適切なように、有利に利用され得る。本発明の実施形態は、本明細書中に記載された上記方法の自動化を企図する。本明細書中に記載される方法および本プロセスにおける種々の工程は、当業者に公知である自動化に適用可能である。   One of many possible suitable embodiments of such a method utilizes a DAGE MTI (Michigan City, IN) or Photometrics (Tucson, AZ) cooled CCD camera to acquire an image of the specimen. Automatic image focusing is accomplished using a forced iterative autofocus algorithm included in the VayTek Microtome image deconvolution analysis software package (VayTek, Fairfield, IA). Regions of interest can be determined manually, and the average pixel signal level in these regions can be determined using Scanallytics IPLab image quantification software (Scanalytics, Fairfax, VA). The software also performs conventional image preparation tasks including, but not limited to, field flattening, background correction and “hot pixel” correction, and fixed threshold determination and / or adaptive thresholding. Can be used for. More sophisticated methods known to those skilled in the art (eg, but not limited to pixel tracking, morphological analysis, pattern matching, correlation algorithm image analysis methods and similar algorithm image analysis methods) It can be advantageously used as appropriate for the particular application. Embodiments of the present invention contemplate automation of the above-described method described herein. The methods described herein and the various steps in the process are applicable to automation known to those skilled in the art.

外因性物質（例えば、透過光顕微鏡技術、反射光顕微鏡技術および蛍光顕微鏡技術における細胞、細胞成分、細胞構造物、および単離されたクロマチンの視感度を亢進するために、一般的に利用される染色物質）の存在は、クロマチン単離、操作および消化を、潜在的に妨げ得る。この理由によって、特定の実施形態における細胞クロマチンの改変（例えば、消化）が完了する時間までに、位相差または、標本の可視化および／または画像化を促進するそのようなコントラスト増強剤の使用を必要としない他の類似の画像化様式を使用することが有利である。クロマチン改変が完了した後、上記標本は、ＤＮＡ結合色素、染色剤、および上記標本において、上記クロマチンと他の物質とのコントラストを選択的に増加する他の試薬によって処理され得る。例えば、蛍光ＤＮＡ結合色素であるエチジウムブロマイドが、本発明の好ましい実施形態の以下の説明において指定される。多くのさらなる適切な蛍光剤、吸着剤および他のコントラスト増強剤は、当業者にとって公知である（例えば、本明細書に参考として援用されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２００３年９月７日更新版，ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋを参照のこと）。これらのうち、ＤＮＡに特異的かつ化学量子論的に結合し、ＤＮＡに結合した際に蛍光が、顕著に増強する特定の蛍光ＤＮＡ結合色素（ＴＯ−ＰＲＯ類，ＹＯ−ＹＯ類，ＹＯ−ＰＲＯ類およびＰＯ−ＰＲＯ類の色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ．）が挙げられるが、これに限られない）は、本発明の特定の実施形態において特に有利であり、この実施形態において、存在するＤＮＡ量の定量化が所望される。蛍光ＤＮＡ結合色素は、存在するＤＮＡ量の定量化が所望される場合に好ましい。多くのＤＮＡ結合色素（上記の色素が挙げられるが、これらに限定されない）は、脱濃縮されたクロマチンを濃縮し、それによりその視感度を改善することが可能である。   Exogenous substances (eg, commonly used to enhance the visibility of cells, cellular components, cellular structures, and isolated chromatin in transmitted light microscopy, reflected light microscopy and fluorescence microscopy techniques The presence of (staining material) can potentially interfere with chromatin isolation, manipulation and digestion. For this reason, it is necessary to use phase contrast or the use of such contrast enhancing agents that facilitate specimen visualization and / or imaging by the time that cellular chromatin modification (eg, digestion) in certain embodiments is completed. It is advantageous to use other similar imaging modalities. After chromatin modification is complete, the specimen can be treated with DNA binding dyes, stains, and other reagents that selectively increase the contrast between the chromatin and other substances in the specimen. For example, ethidium bromide, a fluorescent DNA binding dye, is specified in the following description of a preferred embodiment of the present invention. Many additional suitable fluorescent agents, adsorbents, and other contrast enhancers are known to those skilled in the art (eg, Molecular Probes: Handbook, updated September 7, 2003, incorporated herein by reference, see probes.com/handbook). Among these, specific fluorescent DNA-binding dyes (TO-PROs, YO-YOs, YO-PROs) that specifically and chemically quantum-bond to DNA and whose fluorescence is remarkably enhanced when bound to DNA. And PO-PRO dyes (including but not limited to Molecular Probes, Eugene OR.) Are particularly advantageous in certain embodiments of the present invention, in which the DNA present Quantification of the amount is desired. Fluorescent DNA binding dyes are preferred when quantification of the amount of DNA present is desired. Many DNA binding dyes, including but not limited to the dyes described above, can concentrate de-concentrated chromatin and thereby improve its visibility.

顕微鏡画像、画像獲得および画像解析の他の適切な多くの方法が、当業者にとって公知である。本明細書中で同定された方法は、例示的な目的のためであり、決して、本発明の範囲を制限するものでも制約するものでもない。   Many other suitable methods for microscopic imaging, image acquisition and image analysis are known to those skilled in the art. The methods identified herein are for illustrative purposes and in no way limit or limit the scope of the invention.

細胞ＤＮＡの染色および判定を分析するための方法の１つは、フローサイトメトリーおよびレーザースキャニングサイトメトリーによるものである。さらに、より好ましい実施形態において、定量的ＤＡＮ染色剤によって染色された細胞は、フローサイトメトリーに供される。フローサイトメトリーは、当該分野で公知の蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）によって行われる。使用され得る例示的なＦＡＣＳ機械としては、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）およびＣｏｕｌｔｅｒフローサイトメーター（Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌａ．，ＵＳＡ）ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）が挙げられる。定量化は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．），ＷｉｎＬｉｓｔ（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．Ｔｏｐｓｈａｍ，Ｍｅ．），Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅソフトウェア（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）およびＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）ソフトウェアを使用して行われ得る。   One method for analyzing cellular DNA staining and determination is by flow cytometry and laser scanning cytometry. Furthermore, in a more preferred embodiment, cells stained with a quantitative DAN stain are subjected to flow cytometry. Flow cytometry is performed with a fluorescence activated cell sorter (FACS) known in the art. Exemplary FACS machines that can be used include the FACS-Calibur (Becton Dickinson; Mountain View, Calif.) And the Coulter flow cytometer (Hialeah, Fla., USA) EPICS Elite®. Quantification was performed using CellQuest (Becton Dickinson; Mountain View, Calif.), WinList (Verity Software House, Inc. Topsham, Me.), Multicycle Software (Phoenix FieS). (Mountain View, Calif.) Software.

フローサイトメーターは、それぞれの細胞に関連した発光物質の量を測定し、そして、例えば、ヒストグラム、ドットプロット、またはフラクション表の形態で出力する。それぞれの細胞に関連した１つの発光物質の量は、その細胞の他の特性（例えば、細胞集団が、露光される別の発光物質の量、大きさ、粒度、または固有の発光）と比較され得る。   The flow cytometer measures the amount of luminescent material associated with each cell and outputs it, for example, in the form of a histogram, dot plot, or fraction table. The amount of one luminescent material associated with each cell is compared to other characteristics of that cell (eg, the amount, size, granularity, or intrinsic luminescence of another luminescent material to which the cell population is exposed). obtain.

細胞を含む鞘流体（ｓｈｅａｔｈ ｆｌｕｉｄ）は上記レーザーを通過するとき、代表的に１つずつ、種々の波長の光に露出される。上記サイトメーターによって検出されたそれぞれの粒子は、「事象」と称される。事象が任意の入射光を伝達しまたは散乱する程度は、上記事象の特徴（例えば、関連した発光物質）の測定を提供する。例えば、上記事象は、それ自身が調和した光を発し得るか、または上記事象に伝わる蛍光物質により発生する蛍光を発し得る。その様な物質の例は、蛍光ＤＮＡ染色物質である。フルオロフォアは、例えば、上記サイトメーターの光電子倍増管（ＰＭＴ）によって検出される既知の周波数の光の発光による特定の周波数の入射光に応じる。上記発光または反射光の強度はサイトメーターによって、測定されおよび保存される。   When the sheath fluid containing cells passes through the laser, it is typically exposed to light of various wavelengths, one by one. Each particle detected by the cytometer is referred to as an “event”. The degree to which an event transmits or scatters any incident light provides a measure of the characteristics of the event (eg, associated luminescent material). For example, the event may emit a harmonious light itself, or may emit fluorescence generated by a fluorescent material that is transmitted to the event. An example of such a material is a fluorescent DNA staining material. The fluorophore responds to incident light of a specific frequency, for example, by light emission of a known frequency detected by the photomultiplier tube (PMT) of the cytometer. The intensity of the emitted or reflected light is measured and stored by a cytometer.

上記サイトメーターは、発光データをヒストグラムに編集する。上記ヒストグラムは、一元的な形態で報告され得る。あるいは、それは、他の入射波長から生じる発光のヒストグラムとの組み合わせであり得る。そのような組み合わせは、代表的に、「ドットプロット」として報告され、ここで事象は、格子上にプロットされ、格子の軸は測定される２つのパラメータに対応する。例えば、事象は、特定の波長の入射光に露光され、そして別の波長における前方光散乱および発光についてアッセイされ得る。   The cytometer edits light emission data into a histogram. The histogram can be reported in a centralized form. Alternatively, it can be a combination with emission histograms arising from other incident wavelengths. Such a combination is typically reported as a “dot plot” where events are plotted on a grid and the grid axes correspond to the two parameters measured. For example, an event can be exposed to a particular wavelength of incident light and assayed for forward light scattering and emission at another wavelength.

細胞集団は、それらのＤＮＡ含有量に基づいて分離され得る。ピークは、細胞の正常なＤＮＡ含有量に対応するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって生じる。ピークはまた、半数体数ｎのより高い倍数（おそらく、倍数体細胞または有糸***細胞に対応する）によって生じる。ピークまたはバックグラウンド上の平坦部は、半数体数ｎの倍数に対応しないＰＩ染色レベルで生じ得る。これらの事象は種々のＤＮＡ分解剤に対して感受性の細胞に対応し得る。ゲート（ｇａｔｅ）は、細胞を異なるＤＮＡ含有量を伴う細胞から種々の範囲のＤＮＡ含有量に入る細胞を区別するように形成され得る。   Cell populations can be separated based on their DNA content. The peak is caused by propidium iodide (PI) staining corresponding to the normal DNA content of the cell. The peak is also caused by a higher multiple of the haploid number n (perhaps corresponding to a polyploid cell or mitotic cell). Flats on the peak or background can occur at PI staining levels that do not correspond to multiples of n haploid numbers. These events may correspond to cells that are sensitive to various DNA degrading agents. Gates can be formed to distinguish cells that fall into a range of DNA content from cells with different DNA content.

細胞のＤＮＡ含有量を同定するための他の方法は、定量的ＤＮＡ染色および組織化学を使用する。これらの技術はまた、フローサイトメトリー分析と組み合わされ得る。例えば、特定の細胞は、フローサイトメトリーを介して他の細胞から分離され得る。その後、これらの細胞は、非フローサイトメトリー技術を使用して、ＤＮＡ含有量について分析され得る。   Other methods for identifying the DNA content of cells use quantitative DNA staining and histochemistry. These techniques can also be combined with flow cytometric analysis. For example, certain cells can be separated from other cells via flow cytometry. These cells can then be analyzed for DNA content using non-flow cytometry techniques.

クロマチン濃縮はまた、非染色試薬（例えば、ヒストンＨ１、トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩのようなトポイソメラーゼ、ポリアミン１１１７２およびポリアミン１１１５８のようなポリアミン、グルタルアルデヒドのようなＤＮＡ架橋試薬、ならびにイオン強度および上記クロマチンを取り巻く培地のイオン強度および組成物の変化を含むが、これに限られない）により達成される。   Chromatin enrichment can also be performed using non-staining reagents (eg, histone H1, topoisomerases such as topoisomerase I and topoisomerase II, polyamines such as polyamine 11172 and polyamine 11158, DNA cross-linking reagents such as glutaraldehyde, and ionic strength and chromatin. Including, but not limited to, ionic strength and compositional changes in the surrounding medium).

顕微鏡画像化、画像獲得および画像分析の他の適切な方法の多くは、当業者にとって公知である。特定の実施形態において、フローサイトメトリーは、当業者に公知の方法に従って処理された、細胞および／または核の評価に使用され得る。本明細書中で同定された方法は、例示的な目的のみを意図し、そして決して本発明の範囲を確定しまたは制約するものではない。   Many other suitable methods for microscopic imaging, image acquisition and image analysis are known to those skilled in the art. In certain embodiments, flow cytometry can be used to assess cells and / or nuclei that have been processed according to methods known to those skilled in the art. The methods identified herein are intended for illustrative purposes only and in no way establish or limit the scope of the invention.

（ＩＶ．クロマチン改変剤）
本発明の実施形態は、癌性細胞（特に、侵襲性表現型を伴う癌性細胞）のクロマチンに対する非侵襲性細胞（正常細胞）のクロマチンを、差次的に改変しまたはこのクロマチンに作用する特定のクロマチン改変剤を利用する。 (IV. Chromatin modifying agent)
Embodiments of the present invention differentially modify or act on chromatin of non-invasive cells (normal cells) relative to chromatin of cancerous cells (particularly cancerous cells with an invasive phenotype). Use specific chromatin modifying agents.

（Ａ．ヌクレアーゼ）
エンドヌクレアーゼは、特定の部位でのＤＮＡ鎖の開裂をその主な機能とする広い酵素の分類を含む。いくつかのエンドヌクレアーゼは、核酸配列およびＤＮＡコンホメーションに対する非常に特異的な組み合わせによって決められた部位においてのみＤＮＡ鎖を開裂するが、他のエンドヌクレアーゼは、開裂するＤＮＡの部位の特徴についてより厳しくない。しかし、いくつかの事例において、上記ＤＮＡは、開裂が起こるためには、上記エンドヌクレアーゼに接近可能であるべきである。クロマチンのＤＮＡ成分が外部因子にさらされるクロマチン鎖に沿った位置の数および同一性は、クロマチンが得られた細胞の状態によって判断される。エンドヌクレアーゼによるクロマチンの開裂は、それらの位置においてのみ起こり、この位置において、露出されたＤＮＡのセグメントの、核酸配列および物理的コンホメーションは、上記エンドヌクレアーゼの特異性に対応する。従って、クロマチン鎖が、いくつかの特定のエンドヌクレアーゼによって処理された場合に得られるＤＮＡ鎖開裂のパターンは、特定のクロマチン鎖の構造の代用となる。このパターンは、ゲル電気泳動のような公知の方法によって明確に評価され得るか、または本発明の方法によって絶対的に評価され得る。 (A. Nuclease)
Endonucleases include a broad class of enzymes whose main function is to cleave DNA strands at specific sites. Some endonucleases cleave DNA strands only at sites determined by a very specific combination of nucleic acid sequence and DNA conformation, while other endonucleases are more concerned with the characteristics of the site of the DNA being cleaved. Not strict. However, in some cases, the DNA should be accessible to the endonuclease for cleavage to occur. The number and identity of the positions along the chromatin chain where the chromatin DNA component is exposed to external factors is determined by the state of the cell from which the chromatin was obtained. Cleavage of chromatin by endonuclease occurs only at those positions, where the nucleic acid sequence and physical conformation of the exposed segment of DNA corresponds to the specificity of the endonuclease. Thus, the pattern of DNA strand cleavage obtained when a chromatin chain is treated with several specific endonucleases is a surrogate for the structure of a specific chromatin chain. This pattern can be clearly evaluated by known methods such as gel electrophoresis or can be absolutely evaluated by the method of the present invention.

クロマチンは、エンドヌクレアーゼ（ＡＬＵまたはＭＳＰ １）の作用あるいは、代替的に、ヌクレアーゼ（ＤＮＡａｓｅ）の作用に露出され、クロマチンは、クロマチンが生成された細胞の侵襲可能性に相関する様式および程度に分解される。ＨＩＮＤ ＩＩＩ、ＢＡＭ、ＥＭＢＯ、ＰＳＴ Ｉ、ＳＡＵ−Ｉ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｉまたは小球菌ヌクレアーゼによるクロマチンの分解は、クロマチンが得られた細胞の侵襲可能性に相関しない。しかし、異なるクロマチン開裂パターンを示す、他のヌクレアーゼおよび他のエンドヌクレアーゼは、本明細書中に記載される方法によって同定され得る。   Chromatin is exposed to the action of endonuclease (ALU or MSP 1) or alternatively to the action of nuclease (DNAase), which degrades in a manner and to a degree that correlates with the invasive potential of the cell from which the chromatin was produced. Is done. The degradation of chromatin by HIND III, BAM, EMBO, PST I, SAU-I, RNase A, RNase I, or micrococcal nuclease does not correlate with the invasive potential of the cells from which the chromatin was obtained. However, other nucleases and other endonucleases that exhibit different chromatin cleavage patterns can be identified by the methods described herein.

（Ｂ．プロテイナーゼ）
ヒストンＨ１のようなタンパク質は、クロマチン組織において重要な役割を果たすことが知られている。例えば、プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）またはヘパリン（５ｍｇ／ｍｌ）（両者ともクロマチンからタンパク質を除去することが知られている）のような物質による正常細胞由来クロマチンの処理は、拡散したＤＮＡ群への、迅速なクロマチンの脱濃縮を生じることが知られている。この脱濃縮は、周囲の培地における、イオン強度の増加または減少、あるいはＭｇ^２＋濃度の増加または減少によっては反転され得ないが、ヒストンＨ１の添加による元のクロマチン形態の再編成によって、本質的かつ完全に反転する。この再編成はまた、イオン強度およびＭｇ^２＋濃度の変化に応じて濃縮および／または再濃縮するクロマチンの能力を回復する。 (B. Proteinase)
Proteins such as histone H1 are known to play an important role in chromatin tissue. For example, treatment of normal cell-derived chromatin with substances such as proteinase K (50 μg / ml) or heparin (5 mg / ml) (both known to remove proteins from chromatin) can be applied to diffused DNA groups. It is known to result in rapid deconcentration of chromatin. This deconcentration cannot be reversed by an increase or decrease in ionic strength, or an increase or decrease in Mg ²⁺ concentration, in the surrounding medium, but by reorganization of the original chromatin form by the addition of histone H1, Invert completely. This rearrangement also restores the ability of chromatin to concentrate and / or reconcentrate in response to changes in ionic strength and Mg ²⁺ concentration.

本発明の１つの局面は、プロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）の使用によって、異常かつ侵襲性の細胞より得られたクロマチン鎖からタンパク質を除去することの効果は、正常細胞由来のクロマチン鎖をプロテイナーゼＫで処理した場合に観察される効果、ならびに正常細胞由来および異常細胞由来のクロマチン鎖を他の物質（プロテアーゼ（トリプシン）あるいはタンパク質結合修飾物質（例えば、ヘパリン、ドデシル硫酸ナトリウム、メルカプトエタノールおよび／またはジチオスレイトール）を含むが、これに限られない）で処理した場合に観察される効果に比べ、新規でありかつ有用な様式である点で異なるものである。   One aspect of the present invention is that the effect of removing a protein from a chromatin chain obtained from an abnormal and invasive cell by using a protease (proteinase K) is obtained by treating a normal cell-derived chromatin chain with proteinase K. Effects observed in the case of normal and abnormal cell-derived chromatin chains (proteases (trypsin) or protein binding modifiers (eg, heparin, sodium dodecyl sulfate, mercaptoethanol and / or dithiothreitol)) ), But is not limited to this, is different in that it is a new and useful mode.

（Ｖ．候補物質をスクリーニングする方法）
本発明に基づくアッセイは、侵襲性細胞と非侵襲性細胞を区別するため；細胞の侵襲性を修飾し得るか、または他に変更し得る物質を、検出および評価するため；およびクロマチンを、クロマチンが得られた細胞の侵襲性に依存する様式に従って差次的に分解し得る物質を、検出および評価するために使用され得る。 (V. Method for screening candidate substances)
The assay according to the present invention distinguishes between invasive and non-invasive cells; to detect and evaluate substances that can modify or otherwise alter the invasiveness of cells; and chromatin, chromatin Can be used to detect and evaluate substances that can be differentially degraded in a manner that depends on the invasiveness of the resulting cells.

侵襲性細胞および非侵襲性細胞または正常細胞の間を区別するアッセイは、予後診断計画および処置計画の開発の一環として、癌の特徴付けのような応用における有用性を見出す。そのような目的のためのアッセイは、以下のように構築され得る：癌性細胞を標準方法に従って、腫瘍または他の癌から単離する。類似の様式において、同一型または類似型の正常細胞または非癌性細胞は、対照として機能するために、同一の組織または関連した組織から得られる。類似型の培養された侵襲性細胞は、別の対照として使用され得る。上記クロマチンは、癌性細胞および対照細胞の両方から、節ＩＡに記載されるように単離され；節ＩＢに記載されるようにＡＬＵまたは別の物質で処理され；可視化を促進するためにＤＮＡ染色物質（例えば、エチジウムブロマイド）によって処理され；そして、その結果は、視覚的に評価されるか、または節ＩＩに記載される方法の使用によって評価される。上記癌から単離された細胞の侵襲性は、このアッセイにおいてクロマチンが分解される程度に反比例する。   Assays that differentiate between invasive and non-invasive or normal cells find utility in applications such as cancer characterization as part of the development of prognostic and treatment plans. An assay for such purposes can be constructed as follows: Cancerous cells are isolated from tumors or other cancers according to standard methods. In a similar manner, normal or non-cancerous cells of the same or similar type are obtained from the same tissue or related tissue to function as a control. Similar types of cultured invasive cells can be used as another control. The chromatin is isolated from both cancerous cells and control cells as described in Section IA; treated with ALU or another substance as described in Section IB; DNA to facilitate visualization Treated with a staining material (eg, ethidium bromide); and the results are assessed visually or by use of the methods described in Section II. The invasiveness of cells isolated from the cancer is inversely proportional to the extent to which chromatin is degraded in this assay.

細胞の侵襲性を改変し得るか、または他に変更し得る物質の検出および評価についてのアッセイは、潜在的な抗癌治療剤を同定する目的のための新規化合物（ＮＣＥ）および他の物質のスクリーニングにおいて主に有用なアッセイである。そのようなアッセイはまた、治療レジメンを計画する工程または治療の効果を観察する工程において、特定の癌に対する特定の治療剤の有効性を決定する工程に使用されるアッセイであり得る。この同じアッセイ形式は、環境モニタリングのような目的において、癌の形成または癌の侵襲性を促進する物質を検出するために使用され得る。そのようなアッセイは、以下の様式に従って構築される：対象となる癌型および対応する型の正常対照細胞の、主細胞または培養細胞は、対象となる用途に適した細胞源より得られる。これらの細胞の１組は、適切なプロトコルに従った試験の下で、上記物質によって処理される。これらの細胞の第２の１組は、対照として機能するために、上記物質で処理されないまま置かれる。上記クロマチンは、癌性細胞および対照細胞の両方から、節ＩＡに記載されるように単離され；節ＩＢに記載されるようにＡＬＵまたは別の物質で処理され；可視化を促進するためにＤＮＡ染色物質（例えば、エチジウムブロマイド）によって処理され；そして、その結果は、視覚的に評価されるか、または節ＩＩに記載される方法の使用によって評価される。癌の侵襲性の減少または遮断における物質の有効性は、対応する対照細胞に対する試験下で、上記物質によって処理された細胞由来の、増加したクロマチンの分解によって証明される。このアッセイが侵襲性を促進する物質を検出するために行われる場合に、上記実験細胞は代表的に、正常細胞であるかまたは低い侵襲性の細胞であり、そしてこの促進物質の存在は、対応する対照に対するクロマチン分解の減少によって証明される。   Assays for the detection and evaluation of substances that can alter or otherwise alter the invasiveness of cells are based on novel compounds (NCE) and other substances for the purpose of identifying potential anti-cancer therapeutics. It is an assay that is mainly useful in screening. Such an assay can also be an assay used to determine the effectiveness of a particular therapeutic agent against a particular cancer in planning a treatment regimen or observing the effect of a treatment. This same assay format can be used to detect substances that promote cancer formation or cancer invasiveness for purposes such as environmental monitoring. Such an assay is constructed according to the following format: The main cancer cells or cultured cells of the subject cancer type and the corresponding type of normal control cells are obtained from a cell source suitable for the subject application. One set of these cells is treated with the material under tests according to the appropriate protocol. A second set of these cells is left untreated with the material to serve as a control. The chromatin is isolated from both cancerous cells and control cells as described in Section IA; treated with ALU or another substance as described in Section IB; DNA to facilitate visualization Treated with a staining material (eg, ethidium bromide); and the results are assessed visually or by use of the methods described in Section II. The effectiveness of a substance in reducing or blocking the invasiveness of cancer is evidenced by increased degradation of chromatin from cells treated with the substance under test against corresponding control cells. When this assay is performed to detect substances that promote invasiveness, the experimental cells are typically normal or less invasive cells, and the presence of this promoter is This is evidenced by a decrease in chromatin degradation relative to the control.

上記アッセイが、クロマチンが得られた細胞の侵襲性の程度に従って、クロマチンを差次的に分解する物質の検出を対象とする場合に、このアッセイに使用されるクロマチンは異なる公知の侵襲性の程度を有する細胞から得られる。上記クロマチンは、節ＩＡに記載されるこれらの細胞から単離され、そして２つの群に分割される。上記実験群は、試験下で、上記物質によって処理される一方で、１つの対照群は、ＡＬＵまたは節ＩＢに記載されるような別の公知の差次的作用物質によって処理され、そして第２の対照群は、処理されないまま置かれる。これらの群由来のクロマチンは、可視化を促進するためにＤＮＡ染色物質（例えば、エチジウムブロマイド）によって処理され；そして、その結果は、視覚的に評価されるか、または節ＩＩに記載される方法の使用によって評価される。差次的な分解は、上記実験群中の他の細胞のクロマチンよりも、より完全に分解されている、１以上の侵襲性のレベルの実験細胞に由来するクロマチンによって証明される。この型のアッセイは、ＡＬＵおよび他の公知の差次的作用物質よりも、より特異的でありおよび／またはより強力である差次的作用物質の、検出、同定および特徴付けにおいて有用なアッセイである。   When the above assay is directed to detecting substances that differentially degrade chromatin according to the degree of invasiveness of the cells from which the chromatin was obtained, the chromatin used in this assay differs from the known degree of invasiveness. Obtained from cells having The chromatin is isolated from these cells described in Section IA and divided into two groups. The experimental group is treated with the substance under test, while one control group is treated with another known differential agent as described in ALU or Section IB, and a second The control group is left untreated. Chromatin from these groups is treated with a DNA stain (eg, ethidium bromide) to facilitate visualization; and the results are evaluated visually or as described in Section II. Rated by use. Differential degradation is evidenced by chromatin from one or more invasive levels of experimental cells that are more completely degraded than the chromatin of other cells in the experimental group. This type of assay is an assay useful in the detection, identification and characterization of differential agents that are more specific and / or more powerful than ALU and other known differential agents. is there.

（実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の本実施例中に開示された技術は、本発明の実施において良好に機能することが、本発明者によって見出された技術を表し、そしてそれ故、その実施についての好ましい形態を構成すると考えられ得ることが、当業者によって十分理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの改変がされ得、そしてなお、本発明の精神および本発明の範囲から外れることなく、同様の結果または類似の結果を得ることを十分理解するべきである。 (Example)
The following examples are included to demonstrate preferred embodiments of the invention. The techniques disclosed in the following examples represent techniques found by the inventor to function well in the practice of the present invention, and therefore constitute a preferred form for that practice. It should be well understood by those skilled in the art that it can be considered. However, one of ordinary skill in the art appreciates that many modifications may be made in the particular embodiments disclosed in light of the present disclosure and that similar results or similar may be obtained without departing from the spirit and scope of the invention. You should fully understand that you will get results.

（実施例１：単離されたクロマチン鎖の調製）
本発明の特定の実施形態において、標本として利用される単離されたクロマチン鎖を、上述した一般的な方法および以下のような特定の方法によって調製し得る。 (Example 1: Preparation of isolated chromatin chain)
In certain embodiments of the invention, the isolated chromatin chain utilized as a specimen may be prepared by the general methods described above and specific methods as follows.

クロマチンを顕微手術的に除去した培養細胞を、固体基材上にコンフルエンスに接近するように細胞を増殖することによって、最も都合よく調製する。同様に、組織標本または他の細胞源から得られた初代細胞を、分散し得、そして標準的方法に従って適切な固体基材に対して付着させ得る。このプロセスは、上記基材に強力な付着物を形成する細胞を生じ、そして細胞が、顕微手術手順の間に上記細胞に加わる機械的な力によって移動するのを防ぐ。この固体基材に対する細胞の固着は操作上の便宜のためだけであり、そして本発明の実施のために必須なものではない。本実施例において、クロマチンの顕微手術抽出に適した、付着性のヒトメラノーマ細胞および付着性内皮細胞を、ＤＭＥＭ、１０％仔ウシ血清およびｐＨ７．４の２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液を含む完全培地において、ゼラチンコートされたカバーガラス上でコンフルエンスに接近するように細胞を培養する工程；細胞が付着したカバーガラスを、Ｈｅｐｅｓを用いてｐＨ７．４に緩衝化した約２ｍＬのＤＭＥＭを含みならびに約３０ｍＭ〜５５ｍＭのＮａＣｌおよび約２ｍＭのＭｇＣｌ_２（上記培地）を含む３５ｍｍプラスチック培養皿に移動する工程；そして顕微手術の前に、これらの調製物を、約１０％ ＣＯ_２／平衡空気の雰囲気中において、３７℃で平衡化させる工程によって調製し得る。 Cultured cells from which chromatin has been microsurgically removed are most conveniently prepared by growing the cells close to confluence on a solid substrate. Similarly, primary cells obtained from tissue specimens or other cell sources can be dispersed and attached to a suitable solid substrate according to standard methods. This process results in cells forming a strong attachment to the substrate and prevents the cells from migrating due to mechanical forces applied to the cells during a microsurgical procedure. This adherence of cells to the solid substrate is for operational convenience only and is not essential for the practice of the present invention. In this example, adherent human melanoma cells and adherent endothelial cells suitable for microsurgical extraction of chromatin were prepared in gelatin in complete medium containing DMEM, 10% calf serum and 25 mM Hepes buffer at pH 7.4. Culturing the cells close to confluence on a coated cover glass; the cover glass to which the cells are attached comprises about 2 mL of DMEM buffered to pH 7.4 with Hepes and about 30 mM to 55 mM Transfer to a 35 mm plastic culture dish containing NaCl and about 2 mM MgCl ₂ (medium above); and prior to microsurgery, these preparations are incubated at 37 ° C. in an atmosphere of about 10% CO ₂ / equilibrium air. Can be prepared by equilibrating with.

細胞クロマチンの顕微手術抽出を、細胞周期の任意の段階にある細胞において行われ得るが、良好に中央に集まり濃縮された有糸***板を有する***中期の細胞において、最も都合よく行う。１ミクロン〜５ミクロンの範囲の先端径および０．５ミクロン未満の上記先端部の内径を有するガラスマイクロピペットを、上記細胞核膜を迅速に貫く（「刺す」）ために使用し得る。上記マイクロピペットの先端部を上記クロマチンと接触させることにより、非共有結合性の力を介して上記クロマチンが上記マイクロピペットの先端部に接着する。弱い吸引を、上記マイクロピペットの先端部へのクロマチンの接着を、さらに向上させるために適用し得る。上記マイクロピペットを引き抜くことで、上記核からクロマチンを、単一鎖として抽出する。この顕微手術抽出手順を、***終期にある有糸***細胞に適用する場合に、上記核から、ただ１組の娘クロマチンを除去する。間期にある細胞、または***前期、***中期もしくは***後期にある有糸***細胞へのこの手順の適用は、上記核からの、単一鎖としての全てのクロマチンの除去を生じる。あるいは、上記細胞を、マイクロピペットの先端部を使用して上記細胞の核および細胞膜を破裂させることによって、そのクロマチンを排出することを誘導し得る。その後、上記排出されたクロマチン鎖を、前述のように、マイクロピペットの先端部に固着し得る。   Microsurgical extraction of cellular chromatin can be performed on cells at any stage of the cell cycle, but is most conveniently performed on metaphase cells with well-centered and concentrated mitotic plates. A glass micropipette having a tip diameter in the range of 1 micron to 5 microns and an inner diameter of the tip of less than 0.5 microns can be used to rapidly penetrate (“stick”) the cell nuclear membrane. By bringing the tip of the micropipette into contact with the chromatin, the chromatin adheres to the tip of the micropipette via a non-covalent force. Weak suction can be applied to further improve the adhesion of chromatin to the tip of the micropipette. By pulling out the micropipette, chromatin is extracted from the nucleus as a single chain. When this microsurgical extraction procedure is applied to mitotic cells at the end of division, only one set of daughter chromatin is removed from the nucleus. Application of this procedure to cells in interphase, or mitotic cells in early, middle or late division, results in the removal of all chromatin as a single chain from the nucleus. Alternatively, the cell can be induced to expel its chromatin by rupturing the cell's nucleus and cell membrane using a micropipette tip. Thereafter, the discharged chromatin chain can be fixed to the tip of the micropipette as described above.

（実施例２：ヌクレアーゼ感受性）
図１Ａは、上述のようにガラス基材に付着し、位相差において画像化された、ＯＣＭ−１ａメラノーマ細胞株、Ｍ６１９メラノーマ細胞株、およびＭＵＭ−２Ｂメラノーマ細胞株から単離されたクロマチン鎖を示す。ＯＣＭ−１ａ、Ｍ６１９およびＭＵＭ−２Ｂは、それぞれ、非侵襲性メラノーマ細胞株、侵襲性（原発性）、および高侵襲性（転移性）メラノーマ細胞株であることが独立した手段により知られている。図１Ｂは、５単位のエンドヌクレアーゼＡＵＬを、上記クロマチン鎖を取り囲む液体培地に添加した後３０分の位相差において表示される同一クロマチン鎖を示し、一方、図１Ｃは、ＡＬＵの添加およびその後のエチジウムブロマイドによるクロマチンの染色後６０分における、これらの同一クロマチン鎖の蛍光画像を示す。エチジウムブロマイドは、ＤＮＡに特異的に結合し、そして結合したＤＮＡを、濃縮および沈殿させる蛍光色素である。非侵襲性ＯＣＭ−１ａメラノーマ細胞株から得られたクロマチンは、ＡＬＵを用いた処理によって、本質的に完全に分解される一方で、侵襲性Ｍ６１９細胞株由来および高侵襲性ＭＵＭ−２Ｂ細胞株由来のクロマチンは、この処理によってはほとんど影響を受けない。 (Example 2: Nuclease sensitivity)
FIG. 1A shows chromatin chains isolated from OCM-1a melanoma cell line, M619 melanoma cell line, and MUM-2B melanoma cell line attached to a glass substrate and imaged in phase contrast as described above. Show. OCM-1a, M619 and MUM-2B are known by independent means to be non-invasive melanoma cell lines, invasive (primary), and highly invasive (metastatic) melanoma cell lines, respectively. . FIG. 1B shows the same chromatin chain displayed at a phase difference of 30 minutes after adding 5 units of endonuclease AUL to the liquid medium surrounding the chromatin chain, while FIG. 1C shows the addition of ALU followed by Shown are fluorescent images of these identical chromatin chains 60 minutes after staining of chromatin with ethidium bromide. Ethidium bromide is a fluorescent dye that specifically binds to DNA and concentrates and precipitates the bound DNA. Chromatin obtained from the non-invasive OCM-1a melanoma cell line is essentially completely degraded by treatment with ALU, while derived from the invasive M619 cell line and the highly invasive MUM-2B cell line Chromatin is hardly affected by this treatment.

それぞれのクロマチン鎖中に存在するＤＮＡの量を、上述した方法によって定量化し得る。それぞれのクロマチン鎖中に、最初に存在するＤＮＡの量に対して標準化した場合に、高侵襲性ＭＵＭ−Ｂ由来のクロマチンの１０％未満が、指示された条件下において、ＡＬＵを用いて６０分処理する間に分解される一方で、約３０％の侵襲性Ｍ６１９細胞由来のクロマチンおよび非侵襲性ＯＣＭ−１ａ由来のクロマチンの８５％以上が、同じ条件下で分解された。正常上皮細胞（図示せず）から単離されたクロマチン鎖は、同じ条件下で、本質的かつ完全に分解された。   The amount of DNA present in each chromatin chain can be quantified by the method described above. Less than 10% of the highly invasive MUM-B-derived chromatin is 60 minutes using ALU under the indicated conditions when normalized to the amount of DNA initially present in each chromatin chain. While degraded during processing, more than 85% of chromatin from invasive M619 cells and non-invasive OCM-1a was degraded under the same conditions. Chromatin chains isolated from normal epithelial cells (not shown) were essentially and completely degraded under the same conditions.

図１は、正常ヒト内皮細胞および非侵襲性ヒトメラノーマ細胞から単離された上記クロマチンが、侵襲性ヒトメラノーマ細胞型由来および高侵襲性ヒトメラノーマ細胞型由来の上記クロマチンよりも、ＡＬＵによってより広範に分解されることを例示する。侵襲性細胞から単離されたクロマチンが、正常細胞由来および非侵襲性細胞由来のクロマチンよりも、ＡＬＵによる分解に対してより抵抗性であるという挙動の同一パターンを、評価される全てのヒト細胞型および試験したあらゆる他の哺乳動物種由来の細胞型において常に観察した。さらに、１つの付加的遺伝子、２つの付加的遺伝子または３つの付加的遺伝子の挿入による正常細胞のトランスフェクションは、ＡＬＵによる消化に対する得られたクロマチンの抵抗性を徐々に増加させ、正常細胞由来のクロマチンは最も強力に分解され、３重トランスフェクト細胞由来のクロマチンは、最も分解が少なかった。   FIG. 1 shows that the chromatin isolated from normal human endothelial cells and non-invasive human melanoma cells is more extensive by ALU than the chromatin from invasive and highly invasive human melanoma cell types. It is illustrated that it is decomposed into All human cells evaluated with the same pattern of behavior that chromatin isolated from invasive cells is more resistant to degradation by ALU than chromatin from normal and non-invasive cells Always observed in type and cell type from any other mammalian species tested. Furthermore, transfection of normal cells by insertion of one additional gene, two additional genes or three additional genes gradually increases the resistance of the resulting chromatin to digestion with ALU, resulting in normal cell-derived Chromatin was most potently degraded, and chromatin from triple transfected cells was least degraded.

ＡＬＵによる消化に対するクロマチン鎖の感受性は、クロマチン鎖を抽出した細胞の倍数性に相関しない。例として、非侵襲性ＯＣＭ−１ａ細胞は、三倍体に近いことが周知であるのに対して、高侵襲性ＭＵＭ−２Ｂ細胞は、二倍体近くから多数体であることが周知である。しかし、全ての事例において、三倍体ＯＣＭ−１ａ細胞由来のクロマチンは、二倍体ＭＵＭ−２Ｂ細胞由来または多数体ＭＵＭ−２Ｂ細胞由来のクロマチンよりも、ＡＬＵによる消化に対してより感受性である。さらに、二倍体ＭＵＭ−２Ｂ細胞由来または多数体ＭＵＭ−２Ｂ細胞由来のクロマチン鎖は、ＡＬＵによる消化に対して等しく抵抗性である。   The sensitivity of the chromatin chain to digestion by ALU does not correlate with the ploidy of the cells from which the chromatin chain has been extracted. As an example, non-invasive OCM-1a cells are well known to be triploid, whereas highly invasive MUM-2B cells are well known to be multiploid from near diploid. . However, in all cases, chromatin from triploid OCM-1a cells is more sensitive to digestion by ALU than chromatin from diploid MUM-2B cells or from polyploid MUM-2B cells. . Furthermore, chromatin chains derived from diploid MUM-2B cells or from polyploid MUM-2B cells are equally resistant to digestion by ALU.

他のエンドヌクレアーゼ（ＨＩＮＤ ＩＩＩ、ＢＡＭ、ＥＭＢＯ、ＰＳＴ−１、ＳＡＵ−１、ＲＮａｓｅ Ａ ＲＮａｓｅ １、および小球菌ヌクレアーゼを含むが、これに限られない）によるクロマチン鎖の消化は、クロマチンを得た細胞の侵襲可能性に相関するクロマチン開裂パターンを示さない。   Digestion of the chromatin chain by other endonucleases (including but not limited to HIND III, BAM, EMBO, PST-1, SAU-1, RNase A RNase 1, and staphylococcal nuclease) gave chromatin. It does not show a chromatin cleavage pattern that correlates with the invasive potential of cells.

（実施例３：クロマチン濃縮およびクロマチン再凝集）
非侵襲性細胞型および侵襲性細胞型から単離されるクロマチンにおけるプロテイナーゼＫの効果を、図２に例示する。参照の目的で示される、図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、上述の様式における、正常ヒト微小血管内皮細胞由来および侵襲性ＨＴ１０８０線維肉腫細胞由来のクロマチン鎖のＡＬＵを用いる処理の効果を例示する。正常内皮細胞由来のクロマチンは、広範に分解される一方で、線維肉腫由来のクロマチンは、概ね完全な状態を維持する。 (Example 3: Chromatin concentration and chromatin reaggregation)
The effect of proteinase K on chromatin isolated from non-invasive and invasive cell types is illustrated in FIG. 2A, 2B and 2C, shown for reference purposes, illustrate the effect of treatment with ALU of chromatin chains derived from normal human microvascular endothelial cells and invasive HT1080 fibrosarcoma cells in the manner described above. . While normal endothelial cell-derived chromatin is extensively degraded, fibrosarcoma-derived chromatin remains largely intact.

図２Ｄおよび図２Ｅは、プロテイナーゼＫ（５ｍｇ／ｍｌ）をＡＬＵの代わりに用い、そしてインキュベーション時間を６０分間から５分間に短縮することを除き、上述の条件下における、正常ヒト微小血管内皮細胞由来および侵襲性ＨＴ１０８０線維肉腫細胞由来のクロマチン鎖のプロテイナーゼＫによる処理の効果を例示する。線維肉腫細胞由来のクロマチンは広く分散する一方で、正常内皮細胞由来のクロマチンは概ね完全な状態を維持した。さらに、図２Ｆに例示するように、プロテイナーゼＫ消化されたクロマチン鎖の、ポリアミン１１１７２（分散したクロマチンを再濃縮し得ることが知られている物質）による処理は、内皮細胞クロマチンを広く再濃縮する一方で、プロテアーゼ処理した線維肉腫クロマチンの任意の再濃縮はあったとしても、ほとんど起こらない。   FIGS. 2D and 2E show normal human microvascular endothelial cell origin under the conditions described above except that proteinase K (5 mg / ml) was used in place of ALU and the incubation time was reduced from 60 minutes to 5 minutes. And the effects of treatment with proteinase K on chromatin chains derived from invasive HT1080 fibrosarcoma cells. While chromatin from fibrosarcoma cells was widely dispersed, chromatin from normal endothelial cells remained largely intact. Further, as illustrated in FIG. 2F, treatment of proteinase K digested chromatin chains with polyamine 11172 (a substance known to be able to reconcentrate dispersed chromatin) broadly reconcentrates endothelial cell chromatin. On the other hand, little if any reconcentration of protease treated fibrosarcoma chromatin occurs.

正常ラット間葉幹細胞由来および侵襲性ヒト***中期Ｍ６１９メラノーマ細胞由来のクロマチン鎖のプロテイナーゼＫ処理、その後のグルタルアルデヒドによるＤＮＡの非特異的沈殿の効果は、図２Ｇ、図２Ｈおよび図２Ｉに示される。繰り返すが正常細胞由来のクロマチンは、侵襲性細胞由来のクロマチンよりも、より分散しない。   The effects of proteinase K treatment of chromatin chains from normal rat mesenchymal stem cells and invasive human metaphase M619 melanoma cells, followed by non-specific precipitation of DNA with glutaraldehyde are shown in FIGS. 2G, 2H and 2I. . Again, normal cell-derived chromatin is less dispersed than invasive cell-derived chromatin.

プロテイナーゼＫの差次的分散効果は、正常細胞および異常細胞の両方由来のクロマチンに対する評価される任意の他のタンパク質分解剤および任意の他のタンパク質結合修飾剤の効果が再濃縮剤（例えば、ポリアミン１１１７２またはポリアミン１１１５８、ヒストンＨ１、またはトポイソメラーゼＩＩａ、あるいはグルタルアルデヒドもしくは特定のＤＮＡ結合色素のようなＤＮＡ沈殿剤）の添加によって広く反転し得るという点で、これらの他の物質の効果においての効果とは異なる。本明細書に記載されるアッセイを、本明細書中に記載されるスクリーニングおよび診断方法における使用のために、クロマチン安定性における差次的効果を示す他のプロテアーゼを同定するために使用し得る。   The differential dispersion effect of proteinase K is similar to the effect of any other proteolytic agent and any other protein binding modifier evaluated on chromatin from both normal and abnormal cells. 11172 or polyamine 11158, histone H1, or topoisomerase IIa, or DNA precipitating agents such as glutaraldehyde or certain DNA binding dyes) can be widely reversed and Is different. The assays described herein can be used to identify other proteases that exhibit differential effects on chromatin stability for use in the screening and diagnostic methods described herein.

（実施例４：薬物候補のスクリーニング）
実施例２の方法は、癌細胞の侵襲性挙動を抑制または遮蔽する工程におけるポリアミン１１１５８およびポリアミン１１１７２のような抗癌剤の有効性を評価するために使用され得る。この有効性を、上記薬物を用いて癌細胞を処理する工程；前述のように細胞からクロマチンを除去する工程；ＤＭＥＭ中で５単位のＡＬＵまたは５単位のＤＮＡａｓｅで３０〜６０分間処理する工程；可視化を促進するために、エチジウムブロマイドまたは他のＤＮＡ結合色素を用いてサンプルを染色する工程；そして、クロマチン分解の程度を、薬物によって処理されていない癌細胞から単離されたクロマチンおよび同型の非癌性細胞から単離されたクロマチンの処理などによって得られたクロマチン分解の程度とを比較する工程によって評価し得る。侵襲性癌細胞のクロマチンは大部分は、この処理によって影響されないが、正常細胞のクロマチンおよび非侵襲性細胞のクロマチンは大部分分解される。薬物効果は、薬物で処理していない他の同一の細胞由来のクロマチンの分解に対する薬物処理された細胞由来のクロマチンの分解の増加によって証明される。同じ型の正常細胞由来のクロマチンは、本方法において対照の役目をする。 (Example 4: Screening of drug candidates)
The method of Example 2 can be used to evaluate the effectiveness of anticancer agents such as polyamine 11158 and polyamine 11172 in the process of inhibiting or masking the invasive behavior of cancer cells. Treating the efficacy of the cancer cells with the drug; removing chromatin from the cells as described above; treating the cells with 5 units of ALU or 5 units of DNAase in DMEM for 30-60 minutes; Staining the sample with ethidium bromide or other DNA binding dye to facilitate visualization; and the extent of chromatin degradation is determined by chromatin isolated from cancer cells not treated with the drug and isotype non- It can be evaluated by a step of comparing the degree of chromatin degradation obtained by treatment of chromatin isolated from cancerous cells. The chromatin of invasive cancer cells is largely unaffected by this treatment, but the chromatin of normal cells and non-invasive cells are largely degraded. The drug effect is evidenced by an increase in the degradation of chromatin from drug-treated cells relative to the degradation of chromatin from other identical cells not treated with the drug. Chromatin from normal cells of the same type serves as a control in this method.

（実施例５：クロマチン分解剤の同定）
本発明の方法は、正常細胞のクロマチンに対して癌性細胞のクロマチンを差次的に分解する薬物および他の化学物質ならびに生物学的存在を検出しおよび同定するために使用され得る。例として、そのような物質としては、ＡＬＵおよびＤＮＡａｓｅ以外のヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ、カスパーゼ、触媒ＲＮＡ、ならびに他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。同じ型の、正常細胞由来のクロマチン鎖および癌性細胞由来のクロマチン鎖を、事前に選択した期間、同一条件下で、評価される物質に露出し；可視化を促進するためにエチジウムブロマイドまたは他のＤＮＡ結合色素を用いて染色し；癌性細胞由来のクロマチンまたは正常細胞由来のクロマチンが優先的に分解されるか否かを決定するために比較した。 (Example 5: Identification of chromatin degrading agent)
The methods of the invention can be used to detect and identify drugs and other chemicals and biological entities that differentially degrade cancerous cell chromatin relative to normal cell chromatin. By way of example, such materials include, but are not limited to, nucleases and endonucleases other than ALU and DNAase, caspases, catalytic RNA, and other materials. The same type of normal and cancerous cell-derived chromatin chains are exposed to the substance to be evaluated under the same conditions for a preselected period; ethidium bromide or other to facilitate visualization Stained with a DNA binding dye; compared to determine whether chromatin from cancerous cells or from normal cells is preferentially degraded.

（実施例６：細胞を使用する方法）
上記実施形態の方法は、インタクトな細胞ならびに単離されたクロマチン鎖に適用され得る。例として、上述したゼラチンコートされたカバーガラス上で増殖したインタクトなメラノーマ細胞を、ＤＭＥＭ中の０．５％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で２分間処理することにより透過処理し；残りの界面活性剤を除去するためにＤＭＥＭで洗浄し；そして、ＤＭＥＭ中において１００単位のＡＬＵで１〜３時間処理し得る。この実施形態は、支持基材ならびに培地中に懸濁した生きた細胞および保存された細胞に付着した生きた細胞または保存された細胞、を使用して実施し得る。 (Example 6: Method of using cells)
The methods of the above embodiments can be applied to intact cells as well as isolated chromatin chains. As an example, intact melanoma cells grown on a gelatin-coated cover glass as described above were permeabilized by treatment with 0.5% detergent Triton X-100 solution in DMEM for 2 minutes; Wash with DMEM to remove the active agent; and treat with 100 units ALU in DMEM for 1-3 hours. This embodiment may be practiced using a support substrate and live or stored cells attached to live and stored cells suspended in media.

図３は、非侵襲性ＯＣＭ−１ａヒトメラノーマ細胞および高侵襲性ＭＵＭ−２Ｂヒトメラノーマ細胞に対するこの処理の効果を例示する。図３ａおよび図３ｂの左側の列における位相差画像は、それぞれ、培養された間期ＯＣＭ−１ａ細胞および培養された間期ＭＵＭ−２Ｂ細胞を示し、一方、これらの図の右側の列の蛍光画像は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００による透過処理；ＡＬＵによる消化；そしてエチジウムブロマイドによる染色後の同じ細胞を示す。   FIG. 3 illustrates the effect of this treatment on non-invasive OCM-1a human melanoma cells and highly invasive MUM-2B human melanoma cells. The phase contrast images in the left column of FIGS. 3a and 3b show cultured interphase OCM-1a cells and cultured interphase MUM-2B cells, respectively, while the fluorescence in the right column of these figures. Images show the same cells after permeabilization with Triton X100; digestion with ALU; and staining with ethidium bromide.

癌細胞の侵襲性の評価について有用であることに加えて、この実施形態はまた、正常細胞および癌性細胞によって示される、クロマチン分解パターン中の特有の相違に起因する癌細胞の存在についての標本のスクリーニングにおける有用性を見出す。本発明のこの適用の特定の利点は、本発明が侵襲性細胞と良性反応性を示す細胞のと間を本質的に選別すること、ならびに多くの場合形態学的試験および免疫学的試験における診断上の誤りを引き起こす変化を修復することである。   In addition to being useful for assessing the invasiveness of cancer cells, this embodiment also provides a specimen for the presence of cancer cells due to unique differences in chromatin degradation patterns exhibited by normal and cancerous cells. Finds utility in screening. A particular advantage of this application of the present invention is that the present invention essentially sorts between invasive cells and cells that are benign reactive, and often diagnostics in morphological and immunological tests. It is to repair the changes that cause the above errors.

前述した実施形態はエンドヌクレアーゼ ＡＬＵに対して特異的である。しかし、本実施形態および次に記載する侵襲性の程度が異なる細胞間を区別する能力における特異性のいくらかの喪失を伴う実施形態において、ＡＬＵをヌクレアーゼ ＤＮＡａｓｅで代用し得る。しかし、十分な特異性は正常細胞と癌性細胞との間の区別のためのこのヌクレアーゼの使用を許容し続ける。   The embodiments described above are specific for the endonuclease ALU. However, ALU can be substituted with nuclease DNAase in this embodiment and in the embodiment described below with some loss of specificity in the ability to distinguish between cells of different invasiveness. However, sufficient specificity continues to allow the use of this nuclease to distinguish between normal and cancerous cells.

（実施例７：核を使用する方法）
細胞は、上述のように調製した直径１２ｍｍのカバーガラスに付着する。細胞が付着したカバーガラスを、１０ｍｇ／ｍｌサイトカラシンＢを正常増殖培地中に５ｃｃ含有する５０ｃｃ円錐形遠心チューブ内に、細胞側を下にして配置し、その結果、カバーガラスの端は、チューブの円錐形の壁に対しておさまり（ｓｅａｔ）、そしてカバーガラスの平面は、チューブの長軸に対して垂直になる。遠心分離は、結果として細胞核が細胞膜を通過して移動し、そして遠心チューブの底にペレットとして回収される核を生じる。除核された細胞は、カバーガラスへの付着したままである。 (Example 7: Method of using a nucleus)
The cells adhere to a 12 mm diameter cover glass prepared as described above. The cover glass with the cells attached was placed in a 50 cc conical centrifuge tube containing 5 cc of 10 mg / ml cytochalasin B in normal growth medium, with the cell side facing down. And the plane of the cover glass is perpendicular to the long axis of the tube. Centrifugation results in nuclei that move through the cell membrane and are collected as pellets at the bottom of the centrifuge tube. Enucleated cells remain attached to the cover glass.

回収した細胞核を、ＤＭＥＭ中で洗浄し、そしてＡＬＵまたはＤＮＡａｓｅで処理する前に、ＤＭＥＭ中の０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で２分間処理することで透過処理した。上述のように、ＡＬＵは、正常細胞由来および非侵襲性細胞由来の核内のクロマチンを選択的に分解する。さらに、透過処理された核のＤＭＥＭ中１００単位のＤＮＡａｓｅでの３０〜６０分間の処理は、正常細胞由来および非侵襲性細胞由来の核のクロマチンを消化する一方で、ほぼインタクトな侵襲性細胞由来の核内のクロマチンは、そのままである。   Recovered cell nuclei were washed in DMEM and permeabilized by treatment with a 0.1% detergent Triton X-100 solution in DMEM for 2 minutes prior to treatment with ALU or DNAase. As mentioned above, ALU selectively degrades chromatin in nuclei from normal and non-invasive cells. Furthermore, treatment of permeabilized nuclei with 100 units of DNAase in DMEM for 30-60 minutes digests nuclear chromatin from normal and non-invasive cells, while derived from nearly intact invasive cells. The chromatin in the nucleus remains intact.

（実施例８：ＭＳＰ Ｉ消化）
（方法）
ヒト線維芽細胞、低侵襲性ヒトメラノーマ細胞（ＯＣＭ−１）、および高侵襲性ヒトメラノーマ細胞（ＭＵＭ−２Ｂ）を、それらのクロマチン構造がＥＧＴＡによってか、またはそれらのグリコカリスがトリプシンによって破壊されるのを避けるために、ラバーポリスマンを用いてプラスチック細胞培養フラスコの底から擦り取った。各細胞スラリーの２５μＬ滴を、スライドガラス上に配置し、そして細胞を含む液滴が完全に乾燥するまで、３０分〜１時間インキュベートした。その後、０．５μＬのＭＳＰ Ｉを、ＤＭＥＭの２５μＬ滴またはＰＢＳの２５μＬ滴に添加し、そしてその２５μＬ滴を乾燥した細胞ブロット（ｂｌｏｔ）上に滴下し、次いでそのスライドガラスを３７℃のインキュベーターの密封加湿チャンバー内に２４時間配置した。消化後、ＭＳＰ Ｉを除去し、そしてエチジウムブロマイドで置換し、エピ蛍光顕微鏡下で視覚化し、そしてそのブロットを撮影した。 (Example 8: MSP I digestion)
(Method)
Human fibroblasts, minimally invasive human melanoma cells (OCM-1), and highly invasive human melanoma cells (MUM-2B) are disrupted by EGTA in their chromatin structure or by trypsin in their glycocalices To avoid this, a rubber policeman was used to scrape the bottom of the plastic cell culture flask. A 25 μL drop of each cell slurry was placed on a glass slide and incubated for 30 minutes to 1 hour until the drop containing the cells was completely dry. Thereafter, 0.5 μL of MSP I is added to a 25 μL drop of DMEM or a 25 μL drop of PBS and the 25 μL drop is dropped onto a dry cell blot, and then the slide is placed in a 37 ° C. incubator. Placed in a sealed humidified chamber for 24 hours. After digestion, MSP I was removed and replaced with ethidium bromide, visualized under an epifluorescence microscope, and the blot photographed.

（結果）
ＭＳＰ Ｉ中で、１時間、２時間、４時間、５時間、６時間、および２４時間インキュベートしようが、ＭＳＰ Ｉによる消化からの隔離は、侵襲性細胞挙動が増加すると共に増加するようであった。正常間質細胞（例えば、線維芽細胞）は、低侵襲性細胞または高侵襲性細胞と比較して、より多く消化された。細胞は代表的に、機械的に得られる。なぜならトリプシン−ＥＧＡＴ溶液における細胞のトリプシン処理は、酵素に対して、非特異的感受性および時として完全な非感受性を生じるからである。例えば、トリプシンＥＧＴＡを利用した場合、細胞クロマチン（細胞型に関係なく）は、機械的に単離された細胞と比較して、あらゆる制限酵素による消化に対してよりいっそう安定であった。ほとんどの場合、細胞は、最も感受性である正常細胞、感受性が減少した低侵襲性細胞、そしてＭＳＰ Ｉならびに他の制限酵素による消化に対して完全に非感受性ではないとしても、最も非感受性である高侵襲性細胞をともなう感受性の漸次的変化を示した（図４Ａ〜図４Ｃ）。 (result)
Incubate in MSP I for 1, 2, 4, 5, 6, and 24 hours, but sequestration from digestion with MSP I appeared to increase with increasing invasive cell behavior . Normal stromal cells (eg, fibroblasts) were more digested compared to minimally invasive or highly invasive cells. Cells are typically obtained mechanically. This is because trypsinization of cells in trypsin-EGAT solution results in nonspecific sensitivity and sometimes complete insensitivity to the enzyme. For example, when trypsin EGTA was utilized, cellular chromatin (regardless of cell type) was much more stable to digestion with any restriction enzyme compared to mechanically isolated cells. In most cases, the cells are the most sensitive, if not the least sensitive, the less sensitive, the less invasive, and the MSP I and other restriction enzymes are not completely insensitive to digestion It showed a gradual change in sensitivity with highly invasive cells (FIGS. 4A-4C).

フラスコからの細胞の擦り出しは、フラスコ由来の細胞のＥＧＴＡ−トリプシン処理よりもむしろ、代表的に以下の２つの目的を果たす：１）翻訳配列に利用されるＭＳＰ Ｉ消化の予測（ａｎｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ）（トリプシンのようなプロテアーゼは通常は、ヒト患者由来細胞を得るために使用されず、そして使用され得ないため）、および２）組織または組織培養フラスコからの細胞の解離を加速するために一般的に利用される試薬（ＥＧＴＡ）の回避。さらに、ＥＧＴＡまたはＥＤＴＡによる必須のイオン（例えば、マグネシウム）の使用中止が、接着受容体を特異的に破壊するという仮説が、これらのキレート剤はクロマチン組織およびクロマチン構造に多大な影響を有するという事実（Ｍａｎｉｏｔｉｓら、１９９７）によって、単純化されすぎていることが示された。細胞単離の手段としてＥＧＴＡ−トリプシンを利用する実験は、異なる細胞型間の制限酵素に対する感受性が、消化に対して根本的により安定であることを示し、おそらくこれはＥＧＴＡの効果、およびトリプシンが誘導する凝集による細胞凝集の相違によるものである。従って、臨床利用の可能性を向上するため、およびクロマチン組織の変化を避けるために、ＭＳＰ Ｉを、プロテアーゼ消化またはＥＧＴＡの存在を伴わない代わりに、患者から細胞が除去される環境からの細胞の単純な機械的除去を利用した。   Scraping of cells from the flask typically serves two purposes, rather than EGTA-trypsin treatment of the cells from the flask: 1) Anticipation of MSP I digestion utilized for translation sequences ( Proteases such as trypsin are typically not used to obtain cells from human patients and cannot be used), and 2) generally to accelerate dissociation of cells from tissue or tissue culture flasks Avoiding the reagents used (EGTA). Furthermore, the hypothesis that the withdrawal of essential ions (eg, magnesium) by EGTA or EDTA specifically destroys adhesion receptors is the fact that these chelating agents have a profound effect on chromatin tissue and chromatin structure. (Maniotis et al., 1997) showed that it was oversimplified. Experiments utilizing EGTA-trypsin as a means of cell isolation show that sensitivity to restriction enzymes between different cell types is fundamentally more stable to digestion, probably this is due to the effects of EGTA and trypsin This is due to the difference in cell aggregation due to the induced aggregation. Therefore, in order to improve clinical availability and to avoid changes in chromatin tissue, MSP I can be used to remove cells from the environment where cells are removed from the patient instead of without the presence of protease digestion or EGTA. Simple mechanical removal was utilized.

ＭＳＰ Ｉ消化が、正常細胞、低侵襲性細胞および高侵襲性細胞に属する細胞の核の間を区別し得るという事実は、高次構造のメチル化が重要であり、そして細胞の癌性状態または非癌性状態、ならびに細胞のメチル化のパターンの調節において重要な因子であり得ることを示唆する。なぜなら、消化は、遺伝子型に特異的であるというよりはむしろ細胞型に特異的であり、上記アッセイは潜在的に、散発的性の腫瘍（９９％）（連鎖群が知られておらず、そして家族性の連鎖が証明していない）、ならびに家族性腫瘍（１％）（擬似オンコジーン（ｐ５３、ｐ２１、網膜芽細胞腫（ｒｂ）など）が、いくつかの原因となる役割を果たしていると考えられる）に由来する、正常細胞、低侵襲性細胞および高侵襲性細胞の間を区別し得るからである。   The fact that MSP I digestion can distinguish between the nuclei of cells belonging to normal, minimally invasive and highly invasive cells is important for conformational methylation and the cancerous state of the cell or It suggests that it may be an important factor in the regulation of the non-cancerous state as well as the pattern of cellular methylation. Because digestion is cell type specific rather than genotype specific, the assay is potentially sporadic tumor (99%) (linkage group unknown, And familial linkages have not been proven), as well as familial tumors (1%) (pseudo-oncogenes (p53, p21, retinoblastoma (rb), etc.) play several causative roles This is because a distinction can be made between normal cells, minimally invasive cells and highly invasive cells.

（実施例９：フローサイトメトリーによる侵襲性細胞の検出）
本発明の上記実施例に記載された侵襲性細胞の検出のための方法は、クロマチン分解剤による細胞の処理の前に、細胞が基材（代表的には、吸着されたタンパク質の層）と接触することを必要とする。この工程は、臨床設定において不都合であり得る。血液学的な癌の細胞は代表的に、液体培地（例えば、血液またはリンパ液）において、細胞の懸濁液として収集される。同様に、固形腫瘍からの標本の初期収集のために一般に臨床使用される特定の方法（例えば、微細針吸引（ＦＮＡ））は、液体培地において、収集された細胞の懸濁液の形成を生じる。さらに、液体培地中への細胞の分散は、顕微鏡スライド上に単層調製物を調製するプロセス、ならびに組織培養および類似の方法による、評価のための標本調製において本質的な要素である。この理由により、細胞を最初に固体基材（例えば、カバーガラス）に移動させることを求めるのではなく、懸濁液中の標本細胞を直接利用する様式で本発明を実施し得ることは好都合である。この方法に直接的に類似する様式での本発明の実施における懸濁された細胞の利用は、上で記載した。 (Example 9: Detection of invasive cells by flow cytometry)
The method for the detection of invasive cells described in the above examples of the present invention comprises a method wherein cells are treated with a substrate (typically an adsorbed protein layer) prior to treatment of the cells with a chromatin degrading agent. Need to touch. This process can be inconvenient in a clinical setting. Hematological cancer cells are typically collected as a suspension of cells in a liquid medium (eg, blood or lymph). Similarly, certain methods commonly used clinically for the initial collection of specimens from solid tumors (eg, fine needle aspiration (FNA)) result in the formation of a suspension of the collected cells in liquid medium. . Furthermore, the dispersion of cells in liquid media is an essential element in the process of preparing monolayer preparations on microscope slides, as well as specimen preparation for evaluation by tissue culture and similar methods. For this reason, it is advantageous that the present invention can be practiced in a manner that directly utilizes specimen cells in suspension, rather than requiring the cells to be first transferred to a solid substrate (eg, a coverslip). is there. The use of suspended cells in the practice of the invention in a manner directly analogous to this method has been described above.

侵襲性の程度の異なる培養細胞が、本実施例における例示的な目的のために利用される。患者標本に由来する細胞の懸濁液が、同様に利用され得る。本実施例において利用した培養細胞株は：ＷＩ−３８線維芽細胞（正常細胞）；ＯＣＭ１（低侵襲性初期ブドウ膜メラノーマ）；Ｍ６１９（高侵襲性初期ブドウ膜メラノーマ）；およびＭＵＭ２Ｂ（高侵襲性の転移性ブドウ膜メラノーマ）である。全ての細胞を、周知な標準的方法に従って単層培養で増殖し；ＤＭＥＭ培地に機械的に収集し、そして卓上遠心分離機において１４００ＲＰＭで５分間遠心分離することでペレットにした。   Cultured cells with different degrees of invasiveness are utilized for exemplary purposes in this example. Cell suspensions derived from patient specimens can be utilized as well. The cultured cell lines utilized in this example are: WI-38 fibroblasts (normal cells); OCM1 (minimally invasive early uveal melanoma); M619 (highly invasive early uveal melanoma); and MUM2B (highly invasive) Metastatic uveal melanoma). All cells were grown in monolayer culture according to well-known standard methods; mechanically collected in DMEM medium and pelleted by centrifuging at 1400 RPM for 5 minutes in a tabletop centrifuge.

細胞ペレットを０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に再懸濁し；室温で１分間インキュベートし；再び１４００ｒｐｍで５分間遠沈し；そしてＤＭＥＭ中に再懸濁した。ヨウ化プロピジウム（１０μｌ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を、この懸濁液のアリコートに添加した。０．５μｌのＡｌｕ Ｉ制限酵素を含む４０μｌのＤＭＥＭを、残りの細胞懸濁液に添加し、そしてその調製物を３７℃でインキュベートした。この混合物のアリコートを、ＡＬＵ添加の、０時間後（ベースライン）、１時間後、３時間後、および５時間後において評価した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；１０μｌ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を、これらの消化された各サンプルに添加した。結果生じる消化され、染色された細胞懸濁液を、４８８ｎｍレーザー励起、前方散乱および側方散乱用の検出器、ならびに蛍光シグナル用の５２０ｎｍ、５７５ｎｍおよび６７５ｎｍの検出器を備えたＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用する標準的方法に従って分析した。１０，０００個の細胞を計測し、そしてその結果をＦＡＣＳドットプロットおよびＦＡＣＳヒストグラムを用いて分析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、統計学的分析に使用した。   The cell pellet was resuspended in 0.1% Triton X-100; incubated for 1 minute at room temperature; spun down again at 1400 rpm for 5 minutes; and resuspended in DMEM. Propidium iodide (10 μl / ml; Molecular Probes, Eugene, OR) was added to an aliquot of this suspension. 40 μl of DMEM containing 0.5 μl of Alu I restriction enzyme was added to the remaining cell suspension and the preparation was incubated at 37 ° C. Aliquots of this mixture were evaluated at 0 hours (baseline), 1 hour, 3 hours, and 5 hours after ALU addition. Propidium iodide (PI; 10 μl / ml; Molecular Probes, Eugene, OR) was added to each of these digested samples. The resulting digested and stained cell suspension was subjected to FACS Calibur flow cytometer equipped with 488 nm laser excitation, detectors for forward and side scatter, and detectors for 520 nm, 575 nm and 675 nm for fluorescence signal. Analysis was performed according to standard methods using (BD Bioscience, San Jose, CA). 10,000 cells were counted and the results were analyzed using FACS dot plots and FACS histograms. CellQuest software (BD Bioscience) was used for statistical analysis.

ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、化学量子論的なＤＮＡ蛍光染色剤であり、それ故、評価される細胞のＤＮＡ含有成分を、フローサイトメトリーによって測定される蛍光シグナル強度から決定することを可能にする。透過処理後に、ＰＩによって処理したがＡＬＵによって消化されなかった細胞懸濁液のアリコートを、処理開始前の細胞調製物の各々に存在するＤＮＡの量に対する参照として供給する。図５は、１時間、３時間および、５時間のＡｌｕ Ｉ制限酵素への露出後にＰＩで染色した各細胞株について測定したフローサイトメーター蛍光強度ヒストグラムプロットを示す。   Propidium iodide (PI) is a chemical quantum DNA fluorescent stain, thus allowing the DNA-containing component of the cell to be evaluated to be determined from the fluorescence signal intensity measured by flow cytometry To do. After permeabilization, an aliquot of the cell suspension treated with PI but not digested with ALU is provided as a reference for the amount of DNA present in each of the cell preparations prior to the start of treatment. FIG. 5 shows flow cytometer fluorescence intensity histogram plots measured for each cell line stained with PI after exposure to Alu I restriction enzyme for 1 hour, 3 hours and 5 hours.

非消化対照に対するＷＩ−３８線維芽細胞についてのＰＩシグナルの減少が、１時間で検出され、さらなる減少が３時間および５時間で検出された。５時間までに、ベースラインシグナルの有意な成分は、機器の検出限界の制限を下回って減少した（図５、最上段）。これは、正常線維芽細胞におけるＤＮＡの顕著な分解を示す。低侵襲性ＯＣＭ１ａメラノーマ細胞は、Ａｌｕ Ｉ酵素消化１時間後のＰＩシグナルにおいて同様の減少を示したが、その後、シグナル強度は有意に減少しなかった（図５、第２段目）。   A decrease in PI signal for WI-38 fibroblasts relative to the undigested control was detected at 1 hour, and further decreases were detected at 3 and 5 hours. By 5 hours, the significant component of the baseline signal decreased below the limit of instrument detection (Figure 5, top). This indicates a significant degradation of DNA in normal fibroblasts. Minimally invasive OCM1a melanoma cells showed a similar decrease in PI signal 1 hour after Alu I enzyme digestion, but the signal intensity was not significantly decreased thereafter (FIG. 5, second row).

ＷＩ−３８線維芽細胞および低侵襲性ＯＣＭ１ａメラノーマ細胞とは異なり、高侵襲性Ｍ６１９メラノーマ細胞または高侵襲性ＭＵＭ２Ｂメラノーマ細胞は、１時間のＡｌｕ Ｉ酵素消化では、ＰＩシグナルの有意な減少を示さなかった（図５、下２段）。しかし、高侵襲性初期Ｍ６１９メラノーマ細胞由来のＰＩシグナルは、３時間までに減少し、一方で高侵襲性転移性ＭＵＭ２Ｂメラノーマ細胞におけるシグナルは、５時間でさえ、ベースラインシグナルと有意に異ならなかった。従って、透過処理された細胞の異を様々な期間の間Ａｌｕ Ｉ制限酵素に対して露出した後のＰＩシグナルの測定に基づいて、４つの細胞株の各々の間の区別が可能であり、そしてそれ故、侵襲性細胞の、検出および分類のためにフローサイトメトリーの利用が可能である。   Unlike WI-38 fibroblasts and minimally invasive OCM1a melanoma cells, highly invasive M619 melanoma cells or highly invasive MUM2B melanoma cells do not show a significant decrease in PI signal upon 1 hour Alu I enzyme digestion (FIG. 5, bottom 2). However, PI signals from highly invasive early M619 melanoma cells decreased by 3 hours, while signals in highly invasive metastatic MUM2B melanoma cells were not significantly different from baseline signals even at 5 hours. . Thus, it is possible to distinguish between each of the four cell lines based on the measurement of the PI signal after exposing the permeabilized cell differences to Alu I restriction enzyme for various periods of time, and Therefore, flow cytometry can be used for detection and classification of invasive cells.

また、前方散乱（細胞の大きさを表す）、および側方散乱（細胞内部の複雑性を表す）を、４つの細胞株の各々について、Ａｌｕ Ｉに対する露出前および消化１時間後、消化３時間後、および消化５時間後（図６）に測定した。前方散乱および側方散乱における有意な変化を、Ａｌｕ Ｉに対する露出後にＷＩ−３８線維芽細胞において検出した（図６、最上段）。消化１時間で、前方散乱は劇的に減少したが、側方散乱は増加した。細胞の大きさおよび細胞内部の複雑性におけるこれらの変化は、３時間および５時間を通じて進行した。５時間までに、検出可能な細胞の数は有意に減少し、これはＤＮＡの大規模な消化を示す。３時間および５時間でのこれらのパラメータにおける有意な付加的変化を伴わない、前方散乱における緩やかな減少および側方散乱における緩やかな増加を、ＯＣＭ１ａ細胞およびＭＵＭ２Ｂ細胞において１時間で検出した。対照的に、ＭＵＭ２Ｂ細胞については、Ａｌｕ Ｉ制限酵素に対する露出後のいかなる時点でも、前方散乱または側方散乱のどちらにも、検出される有意な変化はなかった。従って、５時間のＡｌｕ Ｉ制限酵素消化にわたる非消化のベースライン参照サンプルに対する、ＰＩシグナル、前方散乱、および側方散乱の変化は、本発明に従うフローサイトメトリーによってＷＩ−３８正常線維芽細胞、ＯＣＭ１ａ低侵襲性初期メラノーマ細胞、Ｍ６１９高侵襲性初期メラノーマ細胞、およびＭＵＭ２Ｂ高侵襲性転移性メラノーマ細胞を、客観的に分類し得ることを示す。   Also, forward scatter (representing cell size) and side scatter (representing cell internal complexity) were determined for each of the four cell lines before exposure to Alu I and 1 hour after digestion, 3 hours digestion. Measurements were made after and 5 hours after digestion (FIG. 6). Significant changes in forward and side scatter were detected in WI-38 fibroblasts after exposure to Alu I (FIG. 6, top row). At 1 hour of digestion, forward scatter decreased dramatically, but side scatter increased. These changes in cell size and intracellular complexity proceeded through 3 and 5 hours. By 5 hours, the number of detectable cells is significantly reduced, indicating extensive digestion of DNA. A gradual decrease in forward scatter and a gradual increase in side scatter without significant additional changes in these parameters at 3 and 5 hours were detected at 1 hour in OCM1a and MUM2B cells. In contrast, for MUM2B cells, there was no significant change detected in either forward or side scatter at any time after exposure to Alu I restriction enzyme. Thus, changes in the PI signal, forward scatter, and side scatter relative to the undigested baseline reference sample over 5 hours of Alu I restriction enzyme digestion were determined by flow cytometry according to the present invention by WI-38 normal fibroblasts, OCM1a. We show that minimally invasive early melanoma cells, M619 highly invasive early melanoma cells, and MUM2B highly invasive metastatic melanoma cells can be objectively classified.

（実施例１０：核を使用する薬物評価）
直径１２ｍｍのカバーガラスに付着した細胞を、本明細書中に記載されるように調製した。細胞が付着したカバーガラスを、標準的な増殖培地中の１０ｍｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（５ｃｃ）を含む５０ｃｃの円錐形遠心チューブ内に、カバーガラスの端が、チューブの円錐形の壁におさまり（ｓｅａｔ）、そしてカバーガラスの平面が、チューブの長軸に対して垂直になるように細胞を下にして置いた。１４００ＲＰＭで５分間の遠心分離は、細胞膜を通過して移動し、そして遠心チューブの底にペレットとして集まる細胞核を生じる。 (Example 10: Drug evaluation using nucleus)
Cells attached to 12 mm diameter coverslips were prepared as described herein. Place the coverslip with the cells in a 50 cc conical centrifuge tube containing 10 mg / ml cytochalasin B (5 cc) in standard growth medium, with the end of the cover slip on the conical wall of the tube ( seat), and the cells were placed so that the cover glass plane was perpendicular to the long axis of the tube. Centrifugation at 1400 RPM for 5 minutes produces cell nuclei that migrate through the cell membrane and collect as a pellet at the bottom of the centrifuge tube.

集めた細胞核を、ＤＭＥＭ中で洗浄し、そしてＡＬＵまたはＤＮＡａｓｅで処理する前に、ＤＭＥＭ中の界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の０．１％溶液で２分間処理することで透過処理した。上述のように、ＡＬＵは、正常細胞由来および非侵襲性細胞由来の核内のクロマチンを選択的に分解する。さらに、透過化された核の１００単位のＤＮＡａｓｅを用いたＤＭＥＭ中での３０〜６０分間の処理は、正常細胞由来および非侵襲性細胞由来の核のクロマチンを消化する一方で、概ねインタクトな侵襲性細胞由来の核内のクロマチンには作用しない。実施例１５に示した散乱データは、細胞核内のクロマチンの分解は、数分から１時間の期間にわたって起こる細胞の細胞質構造における変化に相関し、そしておそらくそれが原因として関連していることを示唆する。実施例１３に関連する他のデータは、本明細書中には記載されないが、光散乱によって検出可能であり得る細胞骨格の変化は、細胞核中のクロマチンの状態に影響し得ることを示唆する。本発明の方法によって生じる細胞膜を通過する核の移動は、交絡する相互作用効果の有意なレベルを伴わずに核要素と細胞質要素との間の区別を可能にすることに関して、十分に迅速であるようである。   The collected cell nuclei were washed in DMEM and permeabilized by treatment with a 0.1% solution of the detergent Triton X-100 in DMEM for 2 minutes prior to treatment with ALU or DNAase. As mentioned above, ALU selectively degrades chromatin in nuclei from normal and non-invasive cells. In addition, treatment for 30-60 minutes in DMEM with 100 units of DNAase of permeabilized nuclei digests normal and non-invasive cell-derived nuclear chromatin, while generally intact invasion. It does not act on chromatin in the nucleus derived from sex cells. Scattering data presented in Example 15 suggests that chromatin degradation in the cell nucleus correlates with, and possibly is related to, changes in the cytoplasmic structure of cells that occur over a period of minutes to 1 hour. . Other data related to Example 13 is not described herein, but suggests that changes in the cytoskeleton that may be detectable by light scattering can affect the state of chromatin in the cell nucleus. The movement of the nucleus through the cell membrane caused by the method of the invention is sufficiently rapid with respect to allowing a distinction between nuclear and cytoplasmic elements without significant levels of confounding interaction effects It seems.

上述の特定の実施形態の記載は、本発明の例示であることを意図し、本発明を限定することを意図しない。本発明のさらなる実施形態は、特許請求の範囲の範囲内でありかつ精神の内にある。   The descriptions of specific embodiments described above are intended to be illustrative of the invention and are not intended to limit the invention. Further embodiments of the invention are within the scope and spirit of the claims.

本明細書中で開示されかつ特許請求された全ての組成物および／または方法は、本開示に照らして過度の実験を伴わずに作製され得そして実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の用語に記載されるが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法の工程または一連の工程における組成物および／または方法に変更が加えられることは、当業者にとって明白である。より具体的には、本明細書中に記載される物質を、化学的および物理的の両方に関連した特定の物質置換し得ることは明白であり、同一または類似の結果が達成される。当業者にとって明白なそのような同様の置換および改変の全ては、添付の特許請求の範囲よって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。   All of the compositions and / or methods disclosed and claimed herein can be made and executed without undue experimentation in light of the present disclosure. While the compositions and methods of the present invention are described in the terms of the preferred embodiments, the method steps or series of steps described herein without departing from the concept, spirit, and scope of the present invention. It will be apparent to those skilled in the art that changes may be made to the compositions and / or methods in FIG. More specifically, it is clear that the substances described herein can be substituted with certain substances both chemically and physically related, and the same or similar results are achieved. All such similar substitutes and modifications apparent to those skilled in the art are deemed to be within the spirit, scope and concept of the invention as defined by the appended claims.

（参考文献）
以下の参考文献は、それらが提供する模範的手順または本明細書中に示される他の補足的な詳説の範囲で、本明細書中に参考として具体的に援用される。 (References)
The following references are specifically incorporated herein by reference within the scope of exemplary procedures they provide or other supplementary details provided herein.

以下の参考文献は、それらが提供する模範的手順または本明細書中に示される他の補足的な詳説の範囲で、本明細書中に参考として具体的に援用される。   The following references are specifically incorporated herein by reference within the scope of exemplary procedures they provide or other supplementary details provided herein.

以下の図は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに明示することを含む。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明との組み合わせにおいて、これらの図の１つ以上を参照することによって、より理解され得る。
図１Ａは、ＯＭＣ−１ａメラノーマ細胞、Ｍ６１９メラノーマ細胞およびＭＵＭ−２Ｂメラノーマ細胞からとりだされたクロマチン鎖の位相差画像を示す。図１Ｂは、ＡＬＵによる処理の３０分後における同一クロマチン鎖の位相差画像を示す。図１Ｃは、ＡＬＵによる６０分間の処理、続くエチジウムブロマイドでの染色後の同一クロマチン鎖の蛍光画像を示す。 図２Ａは、正常ヒト微小血管内皮細胞およびＨＴ１０８０線維肉腫細胞からとりだされたクロマチン鎖の位相差画像を示す。図２Ｂは、ＡＬＵによる処理の１．２５時間後における図２Ａに示されるクロマチン鎖と同じクロマチン鎖の位相差画像を示す。図２Ｃは、ＡＬＵによる処理の２．２５時間後における図２Ａに示されるクロマチン鎖と同じクロマチン鎖の位相差画像を示す。図２Ｄは、正常ヒト微小血管内皮細胞およびＨＴ１０８０線維肉腫細胞からとりだされたクロマチン鎖の位相差画像を示す。図２Ｅは、プロテイナーゼＫによる処理の５分後における、図２Ｄに示されるクロマチン鎖の位相差画像を示す。図２Ｆは、プロテイナーゼＫによる５分間の処理、続くＤＮＡ凝集剤ポリアミン１１１７２による処理後における図２Ｄに示されるクロマチン鎖の位相差画像を示す。図２Ｇは、間葉系幹細胞およびＨＴ１０８０線維肉腫細胞から単離されたクロマチン鎖の位相差画像を示す。図２Ｈは、プロテイナーゼＫによる処理の５分後、間葉系幹細胞およびＨＴ１０８０線維肉腫細胞から単離されたクロマチン鎖の位相差画像を示す。図２Ｉは、プロテイナーゼＫによる５分間の処理およびグルタルアルデヒドによるＤＮＡの濃縮後における、間葉系幹細胞およびＨＴ１０８０線維肉腫細胞から単離されたクロマチン鎖の位相差画像を示す。 図３Ａは、低侵襲性ＯＣＭ−１ａヒトメラノーマ細胞の位相差画像を示す。図３Ｂは、透過処理、ＡＬＵによる処理、およびエチジウムブロマイドによる染色後における、図３Ａに示される細胞と同じ細胞の蛍光画像を示す。図３Ｃは、高侵襲性ＭＵＭ−２Ｂヒトメラノーマ細胞の位相差画像を示す。図３Ｄは、透過処理、ＡＬＵによる処理、およびエチジウムブロマイドによる染色後における、図３Ｃに示される細胞と同じ細胞の蛍光画像を示す。 ２４時間のＭＳＰ Ｉとのインキュベーション後に、線維芽細胞の感受性（図４Ａ）、ＯＣＭ １ａ（低侵襲性メラノーマ）の感受性（図４Ｂ）、およびＭＵＭ ２Ｂ（高侵襲性メラノーマ）の感受性（図４Ｃ）を示す研究。注釈として、線維芽細胞核は、２４時間で完全に消化される。ＯＣＭ １ａ核は、いくつかの焦点となる残存染色を示したが、ＭＵＭ ２Ｂ核は、メチル化特異的酵素からの、完全な安定性および完全な隔離を示した。 図５は、Ａｌｕ Ｉ制限酵素に対する１時間、３時間および５時間の露出後、続くＰＩによる染色の際、ＷＩ−３８線維芽細胞（正常細胞）；ＯＣＭ１（低侵襲性原発性ブドウ膜メラノーマ）；Ｍ６１９（高侵襲性原発性ブドウ膜メラノーマ）；およびＭＵＭ２Ｂ（高侵襲性転移性ブドウ膜メラノーマ）のそれぞれについて測定した、フローサイトメーター蛍光強度ヒストグラムプロットを示す。 図６は、ＷＩ−３８線維芽細胞（正常細胞）；ＯＣＭ１（低侵襲性原発性ブドウ膜メラノーマ）；Ｍ６１９（高侵襲性原発性ブドウ膜メラノーマ）；およびＭＵＭ２Ｂ（高侵襲性転移性ブドウ膜メラノーマ）の４つの細胞株のそれぞれについての、Ａｌｕ Ｉに対する露出前ならびに１時間、３時間および５時間の消化後における前方散乱（細胞の大きさを表す）、および側方散乱（細胞内部の複雑性を表す）を示す。 The following figures form part of the present specification and include further clarification of certain aspects of the invention. The invention may be better understood by reference to one or more of these figures in combination with the detailed description of specific embodiments presented herein.
FIG. 1A shows phase contrast images of chromatin chains taken from OMC-1a melanoma cells, M619 melanoma cells and MUM-2B melanoma cells. FIG. 1B shows a phase contrast image of the same chromatin chain 30 minutes after treatment with ALU. FIG. 1C shows a fluorescence image of the same chromatin chain after treatment with ALU for 60 minutes followed by staining with ethidium bromide. FIG. 2A shows phase contrast images of chromatin chains taken from normal human microvascular endothelial cells and HT1080 fibrosarcoma cells. FIG. 2B shows a phase contrast image of the same chromatin chain as that shown in FIG. 2A after 1.25 hours of treatment with ALU. FIG. 2C shows a phase contrast image of the same chromatin chain as the chromatin chain shown in FIG. 2A after 2.25 hours of treatment with ALU. FIG. 2D shows phase contrast images of chromatin chains taken from normal human microvascular endothelial cells and HT1080 fibrosarcoma cells. FIG. 2E shows a phase contrast image of the chromatin chain shown in FIG. 2D after 5 minutes of treatment with proteinase K. FIG. 2F shows the phase contrast image of the chromatin chain shown in FIG. 2D after 5 minutes treatment with proteinase K followed by treatment with the DNA flocculant polyamine 11172. FIG. 2G shows phase contrast images of chromatin chains isolated from mesenchymal stem cells and HT1080 fibrosarcoma cells. FIG. 2H shows phase contrast images of chromatin chains isolated from mesenchymal stem cells and HT1080 fibrosarcoma cells after 5 minutes of treatment with proteinase K. FIG. 2I shows phase contrast images of chromatin chains isolated from mesenchymal stem cells and HT1080 fibrosarcoma cells after 5 minutes of treatment with proteinase K and concentration of DNA with glutaraldehyde. FIG. 3A shows a phase contrast image of minimally invasive OCM-1a human melanoma cells. FIG. 3B shows a fluorescence image of the same cells as those shown in FIG. 3A after permeabilization, treatment with ALU, and staining with ethidium bromide. FIG. 3C shows a phase contrast image of highly invasive MUM-2B human melanoma cells. FIG. 3D shows a fluorescence image of the same cells as those shown in FIG. 3C after permeabilization, treatment with ALU, and staining with ethidium bromide. Following incubation with MSP I for 24 hours, fibroblast sensitivity (FIG. 4A), OCM 1a (minimally invasive melanoma) sensitivity (FIG. 4B), and MUM 2B (highly invasive melanoma) sensitivity (FIG. 4C). Research showing. As an annotation, fibroblast nuclei are completely digested in 24 hours. The OCM 1a nucleus showed some focal residual staining, while the MUM 2B nucleus showed complete stability and complete sequestration from the methylation specific enzyme. FIG. 5 shows WI-38 fibroblasts (normal cells); OCM1 (minimally invasive primary uveal melanoma) after 1 hour, 3 hours and 5 hours exposure to Alu I restriction enzyme and subsequent staining with PI. Shows flow cytometer fluorescence intensity histogram plots measured for each of M619 (highly invasive primary uveal melanoma); and MUM2B (highly invasive metastatic uveal melanoma). FIG. 6 shows WI-38 fibroblasts (normal cells); OCM1 (minimally invasive primary uveal melanoma); M619 (highly invasive primary uveal melanoma); and MUM2B (highly invasive metastatic uveal melanoma) ) Forward scatter (representing cell size) and side scatter (internal cell complexity) before exposure to Alu I and after 1 hour, 3 hours and 5 hours of digestion for each of the four cell lines Represents).

Claims (67)

細胞の侵襲可能性を評価するための方法であって、以下の工程：
ａ）細胞のクロマチンを１つ以上のクロマチン改変剤と接触させる工程；および
ｂ）クロマチン分解を評価することによってクロマチン安定性を評価する工程
を包含する、方法。 A method for assessing the invasive potential of a cell comprising the following steps:
a) contacting the cellular chromatin with one or more chromatin modifying agents; and b) assessing chromatin stability by assessing chromatin degradation. 前記クロマチンを１つ以上のクロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞から核を単離する工程をさらに包含、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, further comprising isolating nuclei from the cells prior to contacting the chromatin with one or more chromatin modifying agents. クロマチンを１つ以上のクロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞からクロマチンを単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, further comprising isolating chromatin from the cell prior to contacting the chromatin with one or more chromatin modifying agents. 前記細胞および核膜が透過処理される、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the cell and nuclear membrane are permeabilized. 核膜が透過処理される、請求項２に記載の方法。 The method of claim 2, wherein the nuclear membrane is permeabilized. 前記クロマチン改変剤がタンパク質分解酵素である、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the chromatin modifying agent is a proteolytic enzyme. 前記タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫである、請求項６に記載の方法。 The method according to claim 6, wherein the proteolytic enzyme is proteinase K. クロマチンが、前記クロマチン改変剤との接触後に再凝集される、請求項６に記載の方法。 The method of claim 6, wherein chromatin is reaggregated after contact with the chromatin modifying agent. 前記クロマチン安定性を評価する工程の前に、前記クロマチンを、ＤＮＡ結合色素、ポリアミン、ヒストン、トポイソメラーゼ、またはグルタルアルデヒドとが接触する工程によって、クロマチン再凝集が開始される、請求項８に記載の方法。 9. The chromatin reaggregation is initiated by the step of contacting the chromatin with a DNA binding dye, polyamine, histone, topoisomerase, or glutaraldehyde prior to the step of assessing chromatin stability. Method. 前記クロマチン改変剤がヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the chromatin modifying agent is a nuclease. 前記ヌクレアーゼがＤＮＡａｓｅである、請求項１０に記載の方法。 The method according to claim 10, wherein the nuclease is a DNAase. 前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。 The method according to claim 10, wherein the nuclease is an endonuclease. 前記エンドヌクレアーゼが、ＡＬＵまたはＭＳＰ １である、請求項１２に記載の方法。 13. The method of claim 12, wherein the endonuclease is ALU or MSP1. 前記クロマチンの評価が、平面またはほぼ平面の表面上で行われる、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the chromatin assessment is performed on a planar or substantially planar surface. 前記クロマチンの評価が、液体培地中の懸濁液において行われる、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the chromatin assessment is performed in suspension in a liquid medium. 前記評価がフローサイトメトリーによって行われる、請求項１５に記載の方法。 The method of claim 15, wherein the assessment is performed by flow cytometry. クロマチン分解が定性的に評価される、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein chromatin degradation is assessed qualitatively. 前記クロマチン分解が定量的に評価される、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the chromatin degradation is assessed quantitatively. クロマチン分解が、視覚的な顕微鏡法、画像解析、またはフローサイトメトリーによって評価される、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein chromatin degradation is assessed by visual microscopy, image analysis, or flow cytometry. クロマチンの光学的コントラストが、評価の前に、クロマチンとＤＮＡ結合色素と接触させることによって上昇する、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the optical contrast of the chromatin is increased by contacting the chromatin with a DNA binding dye prior to evaluation. 前記ＤＮＡ結合色素がクロマチン色素を含有する、請求項２０に記載の方法。 21. The method of claim 20, wherein the DNA binding dye comprises a chromatin dye. 前記ＤＮＡ結合色素が蛍光色素を含有する、請求項２０に記載の方法。 21. The method of claim 20, wherein the DNA binding dye contains a fluorescent dye. 前記蛍光色素が、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＹＯ−ＹＯ、ＹＯ−ＰＲＯまたはＰＯ−ＰＲＯである、請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the fluorescent dye is ethidium bromide, acridine orange, TO-PRO, YO-YO, YO-PRO or PO-PRO. 候補治療薬の有効性を評価するための方法であって、以下の工程：
ａ）細胞を該候補治療薬と接触させる工程；
ｂ）該細胞のクロマチンをクロマチン改変剤と接触させる工程；
ｃ）クロマチン分解を評価することによって染色体の安定性を評価する工程；および
ｄ）該候補治療薬を用いた該細胞の処置によって生じるクロマチン分解と、該治療薬を用いて処理してない細胞とを比較することによって該候補治療薬の有効性を評価する工程
を包含する、方法。 A method for assessing the efficacy of a candidate therapeutic, comprising the following steps:
a) contacting a cell with the candidate therapeutic;
b) contacting the cellular chromatin with a chromatin modifying agent;
c) assessing chromosome stability by assessing chromatin degradation; and d) chromatin degradation resulting from treatment of the cells with the candidate therapeutic agent; and cells not treated with the therapeutic agent; Evaluating the effectiveness of the candidate therapeutic by comparing. クロマチンを前記クロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞からクロマチンを単離する工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, further comprising isolating chromatin from the cells prior to contacting chromatin with the chromatin modifying agent. 前記細胞が高増殖性細胞である、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the cell is a highly proliferative cell. 前記高増殖性細胞が癌細胞である、請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the highly proliferative cell is a cancer cell. クロマチンをクロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞から核を単離する工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, further comprising isolating nuclei from the cells prior to contacting the chromatin with a chromatin modifying agent. 前記細胞の前記核からクロマチンを単離する工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, further comprising isolating chromatin from the nucleus of the cell. 前記細胞および核膜が透過処理される、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the cell and nuclear membrane are permeabilized. 前記クロマチン改変剤がタンパク質分解酵素である、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the chromatin modifying agent is a proteolytic enzyme. 前記タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫである、請求項３１に記載の方法。 32. The method of claim 31, wherein the proteolytic enzyme is proteinase K. クロマチン安定性を評価する工程の前に、クロマチンが再凝集される、請求項３１に記載の方法。 32. The method of claim 31, wherein the chromatin is reaggregated prior to the step of assessing chromatin stability. クロマチン安定性の評価の前に、クロマチンを、ＤＮＡ結合色素、ポリアミン、ヒストン、トポイソメラーゼ、またはグルタルアルデヒドと接触させる工程によって、クロマチン再凝集が開始される、請求項３３に記載の方法。 34. The method of claim 33, wherein chromatin reaggregation is initiated by contacting the chromatin with a DNA binding dye, polyamine, histone, topoisomerase, or glutaraldehyde prior to assessing chromatin stability. 前記クロマチン改変剤がヌクレアーゼである、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the chromatin modifying agent is a nuclease. 前記ヌクレアーゼがＤＮＡａｓｅである、請求項３５に記載の方法。 36. The method of claim 35, wherein the nuclease is a DNAase. 前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項３５に記載の方法。 36. The method of claim 35, wherein the nuclease is an endonuclease. 前記ヌクレアーゼが、ＡＬＵまたはＭＳＰ １である、請求項３７に記載の方法。 38. The method of claim 37, wherein the nuclease is ALU or MSP1. クロマチン安定性の評価が、平面またはほぼ平面の表面上で行われる、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the assessment of chromatin stability is performed on a planar or substantially planar surface. クロマチン安定性の評価が、液体培地中の細胞懸濁液として行われる、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the assessment of chromatin stability is performed as a cell suspension in a liquid medium. 前記評価がフローサイトメトリーによって行われる、請求項４０に記載の方法。 41. The method of claim 40, wherein the assessment is performed by flow cytometry. 前記クロマチン分解が定性的に評価される、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the chromatin degradation is assessed qualitatively. 前記クロマチン分解が定量的に評価される、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the chromatin degradation is assessed quantitatively. クロマチン分解が、視覚的な顕微鏡法、画像解析、フローサイトメトリーによって評価される、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein chromatin degradation is assessed by visual microscopy, image analysis, flow cytometry. クロマチンの光学的コントラストが、評価の前に、クロマチンをＤＮＡ結合色素と接触させることによって上昇する、請求項２４に記載の方法。 25. The method of claim 24, wherein the optical contrast of the chromatin is increased by contacting the chromatin with a DNA binding dye prior to evaluation. 前記ＤＮＡ結合色素がクロマチン色素を含有する、請求項４５に記載の方法。 46. The method of claim 45, wherein the DNA binding dye comprises a chromatin dye. 前記ＤＮＡ結合色素が蛍光色素を含有する、請求項４５に記載の方法。 46. The method of claim 45, wherein the DNA binding dye comprises a fluorescent dye. 前記蛍光色素が、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＹＯ−ＹＯ、ＹＯ−ＰＲＯまたはＰＯ−ＰＲＯである、請求項４７に記載の方法。 48. The method of claim 47, wherein the fluorescent dye is ethidium bromide, acridine orange, TO-PRO, YO-YO, YO-PRO or PO-PRO. ヌクレアーゼによるクロマチン分解の程度を評価することによって、正常細胞と侵襲性癌細胞との間を区別する工程を包含する、方法。 Distinguishing between normal cells and invasive cancer cells by assessing the extent of chromatin degradation by nucleases. 前記ヌクレアーゼがＤＮＡａｓｅである、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein the nuclease is a DNAase. 前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein the nuclease is an endonuclease. 前記エンドヌクレアーゼが、ＡＬＵまたはＭＳＰ １である、請求項５１に記載の方法。 52. The method of claim 51, wherein the endonuclease is ALU or MSP1. 前記クロマチンを１つ以上のクロマチン改変剤とが接触させる工程の前に、前記細胞から核を単離する工程をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, further comprising isolating nuclei from the cells prior to contacting the chromatin with one or more chromatin modifying agents. 前記クロマチンを１つ以上のクロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞の前記核からクロマチンを単離する工程をさらに包含する、請求項５３に記載の方法。 54. The method of claim 53, further comprising isolating chromatin from the nucleus of the cell prior to contacting the chromatin with one or more chromatin modifying agents. 前記細胞および核膜が透過処理される、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein the cell and nuclear membrane are permeabilized. クロマチン分解を評価する工程の前に、クロマチンが再凝集される、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein the chromatin is reaggregated prior to the step of assessing chromatin degradation. 前記クロマチン安定性を評価する工程の前に、クロマチンを、ＤＮＡ結合色素、ポリアミン、ヒストン、トポイソメラーゼ、またはグルタルアルデヒドと接触する工程によって、クロマチン再凝集が開始される、請求項５６に記載の方法。 57. The method of claim 56, wherein chromatin reaggregation is initiated by contacting the chromatin with a DNA binding dye, polyamine, histone, topoisomerase, or glutaraldehyde prior to the step of assessing chromatin stability. 前記クロマチンの評価が、平面またはほぼ平面の表面上で行われる、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein the chromatin assessment is performed on a planar or substantially planar surface. 前記クロマチンの評価が、液体培地中の懸濁液として行われる、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein the chromatin assessment is performed as a suspension in a liquid medium. 前記評価がフローサイトメトリーによって行われる、請求項５９に記載の方法。 60. The method of claim 59, wherein the assessment is performed by flow cytometry. クロマチン分解が定性的に評価される、請求項４９に記載の方法 50. The method of claim 49, wherein chromatin degradation is assessed qualitatively. 前記クロマチン分解が定量的に評価される、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein the chromatin degradation is assessed quantitatively. クロマチン分解が、視覚的な顕微鏡法、画像解析、またはフローサイトメトリーによって評価される、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein chromatin degradation is assessed by visual microscopy, image analysis, or flow cytometry. クロマチンの光学的コントラストが、評価の前に、クロマチンをＤＮＡ結合色素と接触させることによって上昇する、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein the optical contrast of the chromatin is increased by contacting the chromatin with a DNA binding dye prior to evaluation. 前記ＤＮＡ結合色素がクロマチン色素を含有する、請求項６４に記載の方法。 65. The method of claim 64, wherein the DNA binding dye comprises a chromatin dye. 前記ＤＮＡ結合色素が蛍光色素を含有する、請求項６４に記載の方法。 65. The method of claim 64, wherein the DNA binding dye contains a fluorescent dye. 前記蛍光色素が、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＹＯ−ＹＯ、ＹＯ−ＰＲＯまたはＰＯ−ＰＲＯである、請求項６６に記載の方法。 68. The method of claim 66, wherein the fluorescent dye is ethidium bromide, acridine orange, TO-PRO, YO-YO, YO-PRO or PO-PRO.

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