JP2008268198A - 分離チップおよび分離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】チップを、チップ外部の回転軸に対し、第1回転速度と前記第1回転速度よりも高速の第2回転速度とで順次回転させ、遠心力および重力により懸濁液から不溶成分を分離するためのチップであって、導入された懸濁液を蓄液すると共に、懸濁液から遠心力および重力により分離された不溶成分を保持する第1の貯液槽と、前記遠心力及び重力により分離された懸濁液中の不溶成分以外の成分を流出させるための分離流路とを有し、前記分離流路は、前記第1の貯液槽に接続され、該接続位置から上方に、かつ、第1の回転速度に於ける遠心力と重力の合力に垂直な方向より内周側に延伸していることを特徴とする分離チップ。
【選択図】図3
Description
特許文献3のチップでは、血球分離後に、外部接続の吸引ポンプを接続して血漿成分を回収しているが、外部接続のポンプを必要とするなど、簡便、迅速、安価な分析手段としては不十分であった。
本発明は、血液等の懸濁液から血球等の不溶成分を小型の装置で効率よく分離するための分離手段を提供することを目的とする。
〔1〕 チップを、チップ外部の回転軸に対し、第1回転速度と前記第1回転速度よりも高速の第2回転速度とで順次回転させ、遠心力および重力により懸濁液から不溶成分を分離するためのチップであって、導入された懸濁液を蓄液すると共に、懸濁液から遠心力および重力により分離された不溶成分を保持する第1の貯液槽と、前記遠心力及び重力により分離された懸濁液中の不溶成分以外の成分を流出させるための分離流路とを有し、前記分離流路は、前記第1の貯液槽に接続され、該接続位置から上方に、かつ、第1の回転速度に於ける遠心力と重力の合力に垂直な方向より内周側に延伸していることを特徴とする分離チップ。
〔2〕 前記第1の貯液槽は、前記分離流路の接続部よりもチップの回転軸に対し外周側に突出して形成される保持領域をその一部に備える、〔1〕に記載の分離チップ。
〔3〕 前記分離流路と前記第1の貯液槽の接続部は、前記第1の回転速度に於ける前記不溶成分と、不溶成分以外の成分との界面よりも内周側に位置する〔1〕または〔2〕に記載の分離チップ。
〔4〕 前記分離流路は、その一部が前記第1の回転速度における前記懸濁液の液面を含む平面よりも内周側に位置する〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の分離チップ。
〔5〕 前記分離流路は、前記第2の回転速度における前記懸濁液の液面よりも外周側まで延伸している〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載の分離チップ。
〔6〕 前記分離流路の回転軸に対する角度が、27°以下であることを特徴とする〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の分離チップ。
〔7〕 前記分離流路は、その途中に、該分離流路の外周側に突出したトラップを有する、〔1〕〜〔6〕のいずれか一項に記載の分離チップ。
〔8〕 不溶成分以外の懸濁液の成分を保持するための第2の貯液槽を有し、前記第2の貯液槽は、前記分離流路を介して第1の貯液槽と連通する、〔1〕〜〔7〕のいずれか一項に記載の分離チップ。
〔9〕 前記第2の貯液槽と前記分離流路とを接続する排液流路を有し、前記排液流路は、前記分離流路と接続する、〔8〕に記載の分離チップ。
〔10〕 前記懸濁液は、血液、尿、髄液、唾液、痰、細胞懸濁液、担体を含む酵素反応液、担体を含む抗原抗体反応液、および担体を含む試薬溶液から選ばれる、〔1〕〜〔9〕のいずれか一項に記載の分離チップ。
〔11〕 前記懸濁液は血液であり、不溶成分は血球である、〔1〕〜〔10〕のいずれか一項に記載の分離チップ。
〔12〕 前記懸濁液は担体を含む試薬であり、不溶成分は担体である、〔1〕〜〔10〕のいずれか一項に記載の分離チップ。
〔13〕 以下の工程を含む、〔1〕〜〔12〕のいずれか一項に記載の分離チップを用いた懸濁液からの不溶成分の分離方法。
(A)懸濁液を、分離チップの第1の貯液槽に導入する工程
(B)前記分離チップを、チップ外部の回転軸に対し、第1回転速度で回転させて懸濁液から不溶成分を分離する工程
(C)前記分離チップを、チップ外部の回転軸に対し、前記第1回転速度よりも高速の第2回転速度で回転させて不溶成分以外の懸濁液成分を分離流路を介して第1の貯液槽から排出する工程
〔14〕 前記第1回転速度で得られる遠心力は、2G〜30Gである、〔13〕に記載の分離方法。
〔15〕 前記第1回転速度は、回転時の前記分離チップにおける前記第1の貯液槽内の液面の傾きが、前記回転軸に対して外周側に2〜27°の角度を有するような速度である、〔13〕または〔14〕に記載の分離方法。
〔16〕 前記第2回転速度で得られる遠心力は、第1回転速度で得られる遠心力よりも3倍以上大きい、〔13〕〜〔15〕のいずれか一項に記載の分離方法。
〔17〕 前記第2回転速度で得られる遠心力は、50G以上である、〔13〕〜〔16〕のいずれか一項に記載の分離方法。
〔18〕 前記第2回転速度は、回転時の分離チップにおける前記第1の貯液槽内の液面の傾きが、前記回転軸に対して外周側に0〜2°の角度を有するような速度である、〔13〕〜〔17〕のいずれか一項に記載の分離方法。
〔19〕 前記懸濁液は、血液、血球、尿、髄液、唾液、痰、細胞懸濁液、担体を含む酵素反応液、担体を含む抗原抗体反応液、および担体を含む試薬溶液から選ばれる、〔13〕〜〔18〕のいずれか一項に記載の分離方法。
〔20〕 前記懸濁液は血液であり、不溶成分は血球である、〔13〕〜〔19〕のいずれか一項に記載の分離方法。
〔21〕 前記懸濁液は担体を含む試薬溶液であり、不溶成分は担体である、〔13〕〜〔19〕のいずれか一項に記載の分離方法。
本発明の分離チップは、チップ外部の回転軸に対し、第1回転速度と第2回転速度とで順次回転させ、遠心力および重力により懸濁液から不溶成分を分離するチップである。
尚、流路に進入する液は、第1の回転速度による回転を開始してから間もない時点では懸濁液であるが、第1の回転速度による回転により不溶成分の分離が進むに従い、液中の不溶以外の成分の割合が徐々に増加し、場合によっては不溶成分以外の成分のみとなっていることもあり得る。
懸濁液から取り出される不溶成分以外の成分は、不溶成分以外の成分全量である必要はなく、その一部を取り出すことができればよい。
図1の分離チップA,図2の分離チップB、図3の分離チップCのそれぞれの分離流路20は、分離チップの回転軸(図の分離チップに対し鉛直方向)に対し、ごく僅かに外周に向かって延伸している。
例えば、図2の分離チップBでは、分離流路20の最終端に第2の貯液槽30が連結して設けられている。また、図6の分離チップFにおいても、分離流路20の終端部25が折れ曲がっておりその先に第2の貯液槽30が設けられており、図示しないが第2の貯液槽30の任意の部分に不溶成分以外の成分を回収するための開口部が設けられる。
例えば、図3の分離チップCでは、分離流路20の右上方末端に排液流路32が接続されている。排液流路32は、懸濁液流路13と略平行にチップの上方から下方へ延伸している。排液流路32の下方末端には、第2の貯液槽30が設けられており、上方末端には、開口部31が設けられている。
本発明の分離方法は、上述の分離チップを用いた懸濁液からの不溶成分の分離方法であり、以下の工程を含む。
(A)懸濁液を、分離チップの第1の貯液槽に導入する工程
(B)前記分離チップを、チップ外部の回転軸に対し、第1回転速度で回転させて懸濁液から不溶成分を分離する工程
(C)前記分離チップを、チップ外部の回転軸に対し、前記第1回転速度よりも高速の第2回転速度で回転させて不溶成分以外の懸濁液成分を分離流路を介して第1の貯液槽から排出する工程
また、第1回転速度は、回転時の前記分離チップにおける前記第1の貯液槽内の液面の傾きが、チップの回転軸(鉛直軸)に対して外周側に通常は2〜27°、好ましくは2〜12°、より好ましくは5〜10°の角度を有するような速度である。この角度は、前記分離チップとして懸濁液流路を有するチップを用いる場合には、懸濁液流路内の液面の傾きが上記範囲になるように規定することも可能である。
第2回転速度として30Gを与える場合は、回転時の前記分離チップにおける前記第1の貯液槽内の液面の傾きは、チップの回転軸(鉛直軸)に対して外周側におよそ2°となる。また、第2回転速度として50Gを与える場合は、回転時の前記分離チップにおける前記第1の貯液槽内の液面の傾きは、チップの回転軸(鉛直軸)に対して外周側におよそ1°となる。
以下のようにして分離チップを製作した。本実施例において作製した分離チップは槽や流路が形成された下板と蓋板で構成されている。それぞれの作製方法は下記の通りである。
・蓋板:“コモグラス”厚さ1mmを下板と同寸法に切断し蓋板とした。
・蓋板と下板の接合:接合面が上向きになるように蓋板を置いた。メタノールをピペットにて100〜200μL塗り拡げ蓋板表面を浸漬させた。下板の槽や流路面(切削加工面)蓋板が合うように蓋板の上に重ね合わせ、蓋板側を60℃に予熱したホットプレス機にて3KNで3分間プレスして接合した。
実施例1により作製した分離チップの開口部(12)より100μLの血液を懸濁液流路(13)を通じて第1の貯液槽(10)へと導入した後、分離チップの第2の貯液槽30が遠心外周側になるように遠心機へ挿入した。分離チップを10Gの遠心力で20分間遠心し第1の貯液槽(10)内で血液を血漿成分と血球成分に分離し、更に100Gの遠心力で1分間遠心することで血漿成分のみを分離流路(20)を経由して第2の貯液槽(30)へと送液した。
担体表面における抗原抗体反応による免疫学的測定のため、担体としてのビーズと試薬抗体としての標識抗体などとを含む基質溶液の懸濁液を作製した。
製造例1で作製したビーズと基質溶液の懸濁液100μlを分離チップの開口部(12)より懸濁液流路(13)を通じて第1の貯液槽(10)へと導入した後、分離チップの第2の貯液槽(30)が遠心外周側になるように遠心機へ挿入した。10Gの遠心力で5分間遠心し第1の貯液槽内でポリスチレンビーズと反応液に分離し、更に100Gの遠心力で1分間遠心することで反応液のみを第2の貯液槽へと送液した。
製造例1で作製したビーズと基質溶液の懸濁液100μlを、分離チップを用いずに6分間静置した後、反応液内のレゾルフィンの量を蛍光顕微鏡IX−71(オリンパス社)を用いて測定した。各濃度でのhIL−6の蛍光強度の測定結果を図11に示す。(励起波長510−560nm、発光波長575−650nm、露光時間0.5秒)
10 第1の貯液槽
11 保持領域
12 開口部
13 懸濁液流路
14 懸濁液導入口
20 分離流路
21 第1の貯液槽への接続部
22 分離流路の開口部
23 トラップ
24 曲線部
25 分離流路の終端部
30 第2の貯液槽
31 排液流路の開口部
32 排液流路
Claims (21)
- チップを、チップ外部の回転軸に対し、第1回転速度と前記第1回転速度よりも高速の第2回転速度とで順次回転させ、遠心力および重力により懸濁液から不溶成分を分離するためのチップであって、
導入された懸濁液を蓄液すると共に、懸濁液から遠心力および重力により分離された不溶成分を保持する第1の貯液槽と、
前記遠心力及び重力により分離された懸濁液中の不溶成分以外の成分を流出させるための分離流路とを有し、
前記分離流路は、前記第1の貯液槽に接続され、該接続位置から上方に、かつ、第1の回転速度に於ける遠心力と重力の合力に垂直な方向より内周側に延伸していることを特徴とする分離チップ。 - 前記第1の貯液槽は、前記分離流路の接続部よりもチップの回転軸に対し外周側に突出して形成される保持領域をその一部に備える、
請求項1に記載の分離チップ。 - 前記分離流路と前記第1の貯液槽の接続部は、前記第1の回転速度に於ける前記不溶成分と、不溶成分以外の成分との界面よりも内周側に位置する請求項1または2に記載の分離チップ。
- 前記分離流路は、その一部が前記第1の回転速度における前記懸濁液の液面を含む平面よりも内周側に位置する請求項1〜3のいずれか一項に記載の分離チップ。
- 前記分離流路は、前記第2の回転速度における前記懸濁液の液面よりも外周側まで延伸している請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離チップ。
- 前記分離流路の回転軸に対する角度が、27°以下であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離チップ。
- 前記分離流路は、その途中に、該分離流路の外周側に突出したトラップを有する、
請求項1〜6のいずれか一項に記載の分離チップ。 - 不溶成分以外の懸濁液の成分を保持するための第2の貯液槽を有し、
前記第2の貯液槽は、前記分離流路を介して第1の貯液槽と連通する、
請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離チップ。 - 前記第2の貯液槽と前記分離流路とを接続する排液流路を有し、
前記排液流路は、前記分離流路と接続する、
請求項8に記載の分離チップ。 - 前記懸濁液は、血液、尿、髄液、唾液、痰、細胞懸濁液、担体を含む酵素反応液、担体を含む抗原抗体反応液、および担体を含む試薬溶液から選ばれる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の分離チップ。
- 前記懸濁液は血液であり、不溶成分は血球である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の分離チップ。
- 前記懸濁液は担体を含む試薬であり、不溶成分は担体である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の分離チップ。
- 以下の工程を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の分離チップを用いた懸濁液からの不溶成分の分離方法。
(A)懸濁液を、分離チップの第1の貯液槽に導入する工程
(B)前記分離チップを、チップ外部の回転軸に対し、第1回転速度で回転させて懸濁液から不溶成分を分離する工程
(C)前記分離チップを、チップ外部の回転軸に対し、前記第1回転速度よりも高速の第2回転速度で回転させて不溶成分以外の懸濁液成分を分離流路を介して第1の貯液槽から排出する工程 - 前記第1回転速度で得られる遠心力は、2G〜30Gである、請求項13に記載の分離方法。
- 前記第1回転速度は、回転時の前記分離チップにおける前記第1の貯液槽内の液面の傾きが、前記回転軸に対して外周側に2〜27°の角度を有するような速度である、請求項13または14に記載の分離方法。
- 前記第2回転速度で得られる遠心力は、第1回転速度で得られる遠心力よりも3倍以上大きい、請求項13〜15のいずれか一項に記載の分離方法。
- 前記第2回転速度で得られる遠心力は、50G以上である、請求項13〜16のいずれか一項に記載の分離方法。
- 前記第2回転速度は、回転時の分離チップにおける前記第1の貯液槽内の液面の傾きが、前記回転軸に対して外周側に0〜2°の角度を有するような速度である、請求項13〜17のいずれか一項に記載の分離方法。
- 前記懸濁液は、血液、血球、尿、髄液、唾液、痰、細胞懸濁液、担体を含む酵素反応液、担体を含む抗原抗体反応液、および担体を含む試薬溶液から選ばれる、請求項13〜18のいずれか一項に記載の分離方法。
- 前記懸濁液は血液であり、不溶成分は血球である、請求項13〜19のいずれか一項に記載の分離方法。
- 前記懸濁液は担体を含む試薬であり、不溶成分は担体である、請求項13〜19のいずれか一項に記載の分離方法。
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