JP2008249433A - Method for measuring bonding affinity of probe to test material, and its utilization - Google Patents

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Shin Hasegawa
慎 長谷川
Takashi Kawabata
隆司 川畑
Chiaki Kawase
千晶 川瀬
Masae Ito
正恵 伊藤
Tamio Mizukami
民夫 水上
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Kansai Bunri Sogo Gakuen
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Kansai Bunri Sogo Gakuen
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To evaluate competitiveness of bonding of a plurality of probes to a test material simply and quickly with high sensitivity and high reproducibility. <P>SOLUTION: A method for measuring bonding affinity of a probe to the test material includes a sample preparation step of mixing a sample including the test material with a plurality of probes for detecting the test material, and a fluorescence detection step of detecting the intensity of fluorescence emitted from the plurality of probes by a fluorescence correlation spectroscopy. The plurality of probes have each different excitation wavelength or fluorescent wavelength, and the fluorescence correlation spectroscopy is performed by irradiating the sample with laser light having each different wavelength for detecting the plurality of probes. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法及びその利用に関するものである。   The present invention relates to a method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance and its use.

ヒトや家畜に対して病原性を示す細菌は、宿主細胞内に侵入するか、毒素を産生して宿主を攻撃し、各種の症状を引き起こす。中でも、コレラ毒素やボツリヌス毒素、百日咳毒素といった外毒素は、細胞に対する強い毒性作用を有する。これらの毒素は、細胞表面上に存在するガングリオシドの糖鎖構造を特異的に認識し、細胞内に侵入して様々な経路を経て毒性を発現させる。   Bacteria that are pathogenic to humans and livestock invade host cells or produce toxins that attack the host and cause various symptoms. Among them, exotoxins such as cholera toxin, botulinum toxin, and pertussis toxin have a strong toxic effect on cells. These toxins specifically recognize the sugar chain structure of ganglioside present on the cell surface, enter into the cell and cause toxicity through various pathways.

ガングリオシドには様々な種類がある。そして、毒素の種類によって、ガングリオシド毎の結合親和性が異なる。例えば、コレラ毒素は、ガングリオシドＧＭ１（以下、「ＧＭ１」と表記する）に対する結合親和性が高く、アシアロガングリオシドＧＭ１（以下、「Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１」と表記する）に対する結合親和性が低いことが知られている。この毒素の種類によってガングリオシドに対する結合親和性が異なることを利用すれば、生体試料中にどのような毒素が含まれているか等のタイピングが可能となる。   There are various types of gangliosides. And the binding affinity for every ganglioside changes with kinds of toxin. For example, cholera toxin is known to have a high binding affinity for ganglioside GM1 (hereinafter referred to as “GM1”) and a low binding affinity for asialoganglioside GM1 (hereinafter referred to as “Asialo GM1”). Yes. Using the fact that the binding affinity for ganglioside varies depending on the type of toxin, it is possible to type what kind of toxin is contained in the biological sample.

従来、毒素の、複数種のガングリオシドに対する結合親和性を測定する方法として、表面プラズモン共鳴法等が用いられてきた（非特許文献１）。   Conventionally, a surface plasmon resonance method or the like has been used as a method for measuring the binding affinity of a toxin to a plurality of types of gangliosides (Non-patent Document 1).

また、ヒトや家畜に対して病原性を示すウイルスの一部は、宿主細胞内に侵入する際に、細胞表面に存在する修飾糖鎖構造を特異的に認識し、結合することにより感染を成立させる。   In addition, some of the viruses that are pathogenic to humans and livestock are infected by specifically recognizing and binding to the modified sugar chain structure present on the cell surface when entering the host cell. Let

細胞表面の修飾糖鎖構造はガングリオシドである場合もあるし、タンパク質に結合した糖鎖の場合等もありうる。これらの修飾糖鎖構造には様々な種類がある。一部のウイルスは、その種類・型・亜型の違いによって、細胞表面の修飾糖鎖構造に対する結合親和性が異なる。例えば、ヒトに主に感染するインフルエンザウイルス（以下、「ヒトインフルエンザウイルス」と表記する）は、細胞表面の修飾糖鎖構造のうち末端に２−６結合型シアル酸を含むものに対する結合親和性が高く、一方、トリに主に感染するインフルエンザウイルス（以下、「トリインフルエンザウイルス」と表記する）は、細胞表面の修飾糖鎖構造のうち末端に２−３結合型シアル酸を含むものに対する結合親和性が高く、さらに両者ともシアル酸を含まない修飾糖鎖構造に対する結合親和性が低いことが知られている。このウイルスの種類によって細胞表面の修飾糖鎖構造に対する結合親和性が異なることを利用すれば、生体試料中にどのようなウイルスが含まれているか等のタイピングが可能となる。   The modified sugar chain structure on the cell surface may be a ganglioside or a sugar chain bound to a protein. There are various types of these modified sugar chain structures. Some viruses have different binding affinities for the modified sugar chain structure on the cell surface depending on the type, type, and subtype. For example, an influenza virus that mainly infects humans (hereinafter referred to as “human influenza virus”) has a binding affinity for those containing 2-6 linked sialic acid at the end of the modified sugar chain structure on the cell surface. On the other hand, influenza viruses that mainly infect birds (hereinafter referred to as “avian influenza viruses”) have binding affinities for modified sugar chain structures on the cell surface that contain 2-3 linked sialic acid at the ends. It is known that both have low binding affinity for modified sugar chain structures that do not contain sialic acid. By utilizing the fact that the binding affinity for the modified sugar chain structure on the cell surface varies depending on the type of virus, it is possible to type what kind of virus is contained in the biological sample.

一方、簡便で高感度かつ迅速に、試料中の分子を検出することができる方法として、蛍光相関分光法(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下「ＦＣＳ」と表記する)が知られている（非特許文献２）。ＦＣＳは、蛍光標識した分子のブラウン運動に由来する、蛍光強度のゆらぎを測定することで、当該分子の数、大きさ等を測定する方法である。ＦＣＳの応用例として、例えば非特許文献１では、互いに異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識した２種類の分子の、分子間相互作用を評価する方法も記載されている。これは、２種類のレーザ光を同時に照射して、２つの分子が、別々に動いているか同時に動いているかを解析するものである。   On the other hand, Fluorescence Correlation Spectroscopy (hereinafter referred to as “FCS”) is known as a simple, highly sensitive and rapid method for detecting molecules in a sample (Non-patent Document 2). ). FCS is a method for measuring the number, size, and the like of molecules by measuring fluctuations in fluorescence intensity derived from Brownian motion of fluorescently labeled molecules. As an application example of FCS, for example, Non-Patent Document 1 also describes a method for evaluating an intermolecular interaction between two types of molecules labeled with fluorescent substances having different fluorescence wavelengths. In this method, two types of laser beams are irradiated at the same time to analyze whether two molecules are moving separately or simultaneously.

また、ＦＣＳを利用したウイルスの検出方法も提案されている（特許文献１）。特許文献１では、ウイルス結合性物質を試料に混合してＦＣＳに供して、検出される分子の大きさによって試料中のウイルスの有無を判定する方法が開示されている。つまり、検出される分子の大きさによって、当該分子が、当該ウイルス結合性物質のみか当該ウイルス結合性物質とウイルスとが結合した分子かを判定することで、試料中のウイルスを検出する。
特開２００７−２０５６５（平成１９年２月１日公開） Kuziemko, G. M. et al., Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Ganglioside Determined by Surface Plasmon Resonance., Biochemistry., 1996, 35, 6375-6384 金城政孝，西村吾郎，「蛍光相関分光法」，蛍光分光とイメージングの手法，学会出版センター，２００６年，ｐ．１３３−１６０ A virus detection method using FCS has also been proposed (Patent Document 1). Patent Document 1 discloses a method in which a virus-binding substance is mixed with a sample, subjected to FCS, and the presence or absence of a virus in the sample is determined based on the size of the molecule to be detected. That is, the virus in the sample is detected by determining whether the molecule is only the virus-binding substance or a molecule in which the virus-binding substance and the virus are bound according to the size of the molecule to be detected.
JP2007-20565 (released on February 1, 2007) Kuziemko, GM et al., Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Ganglioside Determined by Surface Plasmon Resonance., Biochemistry., 1996, 35, 6375-6384 Masataka Kaneshiro, Goro Nishimura, “Fluorescence Correlation Spectroscopy”, Methods of Fluorescence Spectroscopy and Imaging, Academic Publishing Center, 2006, p. 133-160

細菌由来の毒素又はウイルスのタイピングを行なうためには、複数のガングリオシド又は糖鎖に対する当該毒素又はウイルスの結合親和性を測定して、当該毒素又はウイルスがどの種類のガングリオシド又は糖鎖に優先的に結合するか等を評価する必要がある。そのためには、毒素等の一つの被験物質に対する、ガングリオシド等の複数のプローブ結合親和性を測定する技術が必要である。しかし、従来、一つの被験物質に対する複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で測定する方法は存在しなかった。   In order to perform typing of bacteria-derived toxins or viruses, the binding affinity of the toxin or virus to a plurality of gangliosides or sugar chains is measured, and the toxin or virus preferentially determines which type of ganglioside or sugar chain. It is necessary to evaluate whether to combine. For this purpose, a technique for measuring a plurality of probe binding affinities such as ganglioside for a test substance such as a toxin is required. However, conventionally, there has been no method for measuring the binding affinity of a plurality of probes to one test substance with ease, speed, high sensitivity, and high reproducibility.

例えば非特許文献１に記載のＳＰＲ法では、被験物質を基板上に固定する必要があるため煩雑な前処理等を要し、測定にも長時間を要する。   For example, in the SPR method described in Non-Patent Document 1, since it is necessary to fix the test substance on the substrate, a complicated pretreatment is required, and the measurement also takes a long time.

一方、ＦＣＳでは、検査対象の試料にレーザ光を照射して蛍光を検出すればよいため、実時間で迅速に測定することができる。また、測定する領域の溶液は、数フェムトリットルであり極めて微量であるため、少量の試料で測定することができる。生体試料を直接供することも可能であり、生態環境に近い状態で検査を行なうことができる。さらにＦＣＳは個々の分子結合を検出できるため、ＳＰＲに比べて感度も高い。   On the other hand, in FCS, since it is only necessary to detect fluorescence by irradiating a sample to be inspected with laser light, it is possible to measure quickly in real time. Further, since the solution in the region to be measured is a few femtoliters and a very small amount, it can be measured with a small amount of sample. It is also possible to provide a biological sample directly, and the test can be performed in a state close to the ecological environment. Furthermore, since FCS can detect individual molecular bonds, it has higher sensitivity than SPR.

しかしながら、ＦＣＳは、一つの分子に対する、別の一つの分子の結合を測定するために用いられてきた方法である。例えば、非特許文献２及び特許文献１においても、二つの化合物間における相互作用や、一種類のウイルス結合性物質を用いたウイルスの検出等に用いられている。   However, FCS is a method that has been used to measure the binding of one molecule to another molecule. For example, Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 are also used for interaction between two compounds, detection of viruses using one kind of virus-binding substance, and the like.

そのため、従来のＦＣＳによって被験物質に対する複数のプローブの結合親和性を測定する場合、被験物質に一つのプローブを混合した試料を用いてＦＣＳを行ない、別途、被験物質に異なるプローブを混合して作製した試料を用いてＦＣＳを行なった上で、両者の結果を比較する必要がある。   Therefore, when measuring the binding affinity of a plurality of probes to a test substance by conventional FCS, FCS is performed using a sample in which one probe is mixed with the test substance, and separately prepared by mixing different probes with the test substance. It is necessary to compare both results after performing FCS using the prepared sample.

しかし、これでは被験物質に対して複数のプローブのうちどのプローブが優先的に結合するかを評価することができない。また、上述のようにＦＣＳに供した試料の内、レーザ光が照射される領域は数フェムトリットルという極めて微小な領域である。微小な領域では、温度や、被験物質に吸着する可能性のある夾雑物の影響が大きい。そのため、別々の試料を用いると、ＦＣＳに供する試料毎の温度差や夾雑物濃度の差の影響を大きく受ける。測定時間がずれると外環境の温度の差による影響も大きくなる。そして、これらの影響により、測定結果の再現性も悪くなる。   However, this makes it impossible to evaluate which of the plurality of probes preferentially binds to the test substance. Further, among the samples subjected to FCS as described above, the region irradiated with laser light is a very small region of several femtoliters. In a minute region, the temperature and the influence of impurities that may be adsorbed to the test substance are large. For this reason, when different samples are used, they are greatly affected by the temperature difference and the contaminant concentration difference for each sample subjected to FCS. If the measurement time is shifted, the influence due to the difference in the temperature of the outside environment also increases. And the reproducibility of a measurement result also worsens by these influences.

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの結合の競争性を評価することが可能な、被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法及びそれに用いる蛍光相関分光装置を提供することにある。   The present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to evaluate the competitiveness of binding of a plurality of probes to a test substance with simple, rapid, high sensitivity and high reproducibility. Another object of the present invention is to provide a method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance and a fluorescence correlation spectroscopic device used therefor.

本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記課題を解決するために、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴としている。   The method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance according to the present invention includes a sample preparation step of mixing a sample containing a test substance and a plurality of probes for detecting the test substance in order to solve the above-mentioned problem And a fluorescence detection step of detecting fluorescence intensity emitted from the plurality of probes by fluorescence correlation spectroscopy, wherein the plurality of probes have different excitation wavelengths or fluorescence wavelengths, and the fluorescence correlation The spectroscopic method is characterized by irradiating a sample with laser beams having different wavelengths for detecting the plurality of probes.

本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記被験物質は、細菌由来の毒素またはウイルスであることがより好ましい。   In the method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance according to the present invention, the test substance is more preferably a bacterial toxin or virus.

本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記被験物質は、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素又はヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルスであることがより好ましい。   In the method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance according to the present invention, the test substance is cholera toxin, botulinum toxin, campylobacter toxin, welsh toxin, heat-labile enterotoxin, shiga toxin, tetanus toxin, verotoxin or Helicobacter More preferably, they are H. pylori toxin, influenza virus, parainfluenza virus, and adenovirus.

本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記蛍光検出工程によって検出したそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程をさらに含むことがより好ましい。   The method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance according to the present invention calculates an autocorrelation function of the fluorescence intensity from each fluorescence intensity detected by the fluorescence detection step, and calculates each autocorrelation function between More preferably, an analysis step to be compared is further included.

本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法は、試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴としている。   A method for detecting a test substance in a sample according to the present invention is emitted from the plurality of probes by a sample preparation step of mixing a sample and a plurality of probes for detecting the test substance, and fluorescence correlation spectroscopy A plurality of probes having different excitation wavelengths or fluorescence wavelengths, and the fluorescence correlation spectroscopy is different for detecting the plurality of probes. It is characterized by irradiating a sample with laser light having a wavelength.

本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記課題を解決するために、蛍光相関分光法を行なうための装置であって、試料を搭載するための試料搭載手段と、上記試料搭載手段に搭載された試料に対して、それぞれ異なる波長のレーザ光を試料に照射する複数のレーザ光照射手段と、上記複数のレーザ光照射手段のうち、上記試料搭載手段に搭載された試料に対してレーザを照射するために用いるレーザ光照射手段を切り替えるための切り替え手段と、を備えることを特徴としている。   In order to solve the above problems, a fluorescence correlation spectroscopy apparatus according to the present invention is an apparatus for performing fluorescence correlation spectroscopy, and is mounted on a sample mounting means for mounting a sample and the sample mounting means. A plurality of laser light irradiation means for irradiating the sample with laser beams having different wavelengths, and a sample mounted on the sample mounting means among the plurality of laser light irradiation means. And a switching means for switching the laser beam irradiation means used for the purpose.

本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記それぞれ異なる波長のレーザ光が上記試料に照射されることによって、検出されたそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析手段を備えてもよい。   The fluorescence correlation spectroscopic device according to the present invention calculates an autocorrelation function of the fluorescence intensity from each detected fluorescence intensity by irradiating the sample with laser beams having different wavelengths, An analyzing means for comparing the autocorrelation functions may be provided.

本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、以上のように、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なう。よって、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの結合の競争性を評価することができるという効果を奏する。   As described above, the method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance according to the present invention includes a sample preparation step of mixing a sample containing a test substance and a plurality of probes for detecting the test substance, and fluorescence. A fluorescence detection step of detecting fluorescence intensity emitted from the plurality of probes by correlation spectroscopy, wherein the plurality of probes have different excitation wavelengths or fluorescence wavelengths, and the fluorescence correlation spectroscopy is The sample is irradiated with laser beams having different wavelengths for detecting the plurality of probes. Therefore, it is possible to evaluate the competitiveness of binding of a plurality of probes to a test substance with simple, rapid, high sensitivity and high reproducibility.

本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。   An embodiment of the present invention will be described as follows, but the present invention is not limited to this.

＜１．本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法＞
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法（以下、「結合親和性測定方法」と表記する）は、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含めばよく、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。 <1. Method for Measuring Binding Affinity of Probe to Test Substance According to the Present Invention>
A method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance according to the present invention (hereinafter referred to as “binding affinity measurement method”) includes a sample containing a test substance and a plurality of probes for detecting the test substance And a fluorescence detection step of detecting fluorescence intensity emitted from the plurality of probes by fluorescence correlation spectroscopy, and the plurality of probes each have a different excitation wavelength or fluorescence wavelength. The fluorescence correlation spectroscopy may be performed by irradiating the sample with laser beams having different wavelengths for detecting the plurality of probes.

本発明によれば、複数のプローブを混合した状態で測定を行なえるため、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。例えば、被験物質として毒素を用いた場合、様々なガングリオシドのうち、どのガングリオシドに対して優先的に結合するかを測定することができる。つまり本発明は、複数のプローブの被験物質に対する結合親和性の競争性を測定可能な、競争的ＦＣＳとも呼べる全く新たな方法を提供するものである。以下、被験物質を検出するための、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有する複数のプローブを、試料に混合してＦＣＳを行なう方法を「競争的ＦＣＳ」と表記することもある。   According to the present invention, since measurement can be performed in a state where a plurality of probes are mixed, it is possible to evaluate the competitiveness of binding of the plurality of probes to the test substance. For example, when a toxin is used as the test substance, it is possible to determine which ganglioside binds preferentially among various gangliosides. That is, the present invention provides a completely new method that can be called competitive FCS, in which the competitiveness of the binding affinity of a plurality of probes to a test substance can be measured. Hereinafter, a method of performing FCS by mixing a plurality of probes each having a different excitation wavelength or fluorescence wavelength for detecting a test substance with a sample may be referred to as “competitive FCS”.

また、本発明に係る結合親和性測定方法では、一つの被験物質に対して、複数のプローブを混合した状態で、ＦＣＳによる測定を行なうことができる。つまり、複数のプローブを別々に混合させた試料を調製する必要がない。そのため、試料毎の温度や夾雑物濃度の差による影響を受けずにＦＣＳを行なうことができる。また、上記被験物質及び複数のプローブを混合した試料に対して、同時に又は速やかに、異なる波長のレーザ光を照射することができるため、外環境の温度差の影響を抑えることができる。よって、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。   Moreover, in the binding affinity measurement method according to the present invention, it is possible to perform measurement by FCS in a state where a plurality of probes are mixed with respect to one test substance. That is, it is not necessary to prepare a sample in which a plurality of probes are separately mixed. Therefore, FCS can be performed without being affected by the difference in temperature and contaminant concentration for each sample. In addition, since a sample in which the test substance and a plurality of probes are mixed can be irradiated with laser beams having different wavelengths simultaneously or quickly, the influence of a temperature difference in the external environment can be suppressed. Therefore, it is possible to evaluate the competitiveness of binding of a plurality of probes to a test substance with simple, rapid, high sensitivity and high reproducibility.

本発明に係る結合親和性測定方法で利用することができる被験物質とは、特に限定されるものではなく、タンパク質、ペプチド、糖、ウイルス、核酸、脂質や、その他に様々な低分子化学物質を例示することができる。特に、本発明では、被験物質として細菌由来の毒素やウイルスを用いるとよい。つまり、本発明は細菌由来の毒素やウイルスに対する複数のプローブの結合親和性を好適に測定することができる。   The test substance that can be used in the binding affinity measurement method according to the present invention is not particularly limited, and includes various proteins such as proteins, peptides, sugars, viruses, nucleic acids, lipids, and various other low molecular chemical substances. It can be illustrated. In particular, in the present invention, a toxin or virus derived from bacteria may be used as a test substance. That is, the present invention can suitably measure the binding affinity of a plurality of probes to bacterial toxins and viruses.

ここで、ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス、ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、ペストウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス）、脳脊髄炎ウイルス、***ウイルス、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、ロタウイルス、エボラウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス等を例示できる。中でも、本発明は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス又はアデノウイルスに対する複数のプローブの結合親和性を好適に測定することができる。   Here, examples of the virus include adenovirus, cytomegalovirus, EB virus, rhinovirus, coronavirus, SARS, (A, B, C, D, E) hepatitis virus, hand-foot-and-mouth disease virus, flavivirus ( Yellow fever virus, West Nile virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus), Toga virus, swine fever virus, bovine diarrhea virus, parainfluenza virus, Newcastle disease virus, RS virus, plague virus, measles virus, mumps virus, human influenza virus, Influenza viruses such as avian influenza virus, equine influenza virus, swine influenza virus, rhabdovirus (rabies virus, vesicular stomatitis virus), picornavirus (poliovirus, covirus) Sucky virus, echo virus, enterovirus), encephalomyelitis virus, foot-and-mouth disease virus, arena virus (lymphocytic choriomeningitis virus, Lhasa virus), retrovirus (HTLV: human adult leukemia virus, HIV: AIDS virus, feline leukemia) Sarcoma virus, bovine leukemia virus, rous sarcoma virus), rotavirus, Ebola virus, poxvirus (vaccinia virus, cowpox virus, smallpox virus), parvovirus, papilloma virus, polyoma virus, herpes simplex virus, cytomegalovirus, Examples are varicella-zoster virus, equine herpesvirus, feline herpesvirus and the like. Especially, this invention can measure suitably the binding affinity of the some probe with respect to influenza virus, parainfluenza virus, or adenovirus.

また、本発明では、細菌由来の毒素に対する複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速かつ高感度に測定することができる。従来、細菌由来の毒素に対する、複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速かつ高感度に測定可能な方法は報告されていなかった。しかし、本発明によれば、試料から当該毒素を抽出したり、ＳＰＲのように当該毒素を基板に固定したりする必要がないため、簡便かつ迅速に行なうことができる。また、上述のように外環境の温度差や、試料毎の温度及び夾雑物濃度の差による影響を防ぎ、高感度に測定することができる。従って、本発明は毒素に対するプローブの結合親和性を測定する方法として好適に用いることができる。複数のガングリオシドの、毒素に対する結合親和性の差や競争性を測定して網羅しておけば、保有するガングリオシドの種類や量等によるヒトの体質によって当該毒素の影響を受けやすいか否かを判定することも可能となる。   Moreover, in this invention, the binding affinity of the some probe with respect to the toxin derived from bacteria can be measured simply, rapidly, and with high sensitivity. Conventionally, no method has been reported that can measure the binding affinity of a plurality of probes to a toxin derived from bacteria in a simple, rapid and sensitive manner. However, according to the present invention, it is not necessary to extract the toxin from the sample or to fix the toxin on the substrate as in SPR, so that it can be carried out simply and quickly. Further, as described above, it is possible to prevent the influence due to the temperature difference in the external environment and the difference in the temperature and the concentration of impurities for each sample, and to measure with high sensitivity. Therefore, the present invention can be suitably used as a method for measuring the binding affinity of a probe to a toxin. By measuring the difference in binding affinity and competitiveness of multiple gangliosides against the toxin, it is possible to determine whether the toxin is susceptible to the toxin depending on the type and amount of the ganglioside that is possessed. It is also possible to do.

なお、毒素には活性を失いやすいものもあり、素早く、少ない回数で、簡便に測定することが必要となる。しかし、本発明によれば、複数のガングリオシドに対する結合親和性を一度に測定できるため、このような毒素に対しても好適に用いることができる。従来のＦＣＳでは、個々のガングリオシドを用いて測定する必要があるため、素早く、少ない回数で、簡便に、複数のガングリオシドに対する生体親和性を測定することは困難であった。また、生体からの採取試料（鼻汁、胃液、粘膜拭い液、分泌・***物、血液等）は、雑多な成分を含むことから非特異的なシグナルが得られやすい。つまり従来のＦＣＳでは、非特異的なシグナルの影響を受けるが、本発明によればこのような非特異的シグナルの影響を抑制して測定することが可能である。   In addition, some toxins easily lose their activity, and it is necessary to measure easily and quickly with a small number of times. However, according to the present invention, since the binding affinity for a plurality of gangliosides can be measured at a time, it can be suitably used for such toxins. In the conventional FCS, since it is necessary to measure using individual gangliosides, it is difficult to measure biocompatibility to a plurality of gangliosides quickly and easily in a small number of times. In addition, samples collected from living bodies (nasal discharge, gastric fluid, mucous membrane wiping fluid, secretion / excretion, blood, etc.) contain miscellaneous components, and thus non-specific signals are likely to be obtained. In other words, the conventional FCS is affected by non-specific signals, but according to the present invention, measurement can be performed while suppressing the influence of such non-specific signals.

なお、本明細書において「毒素」とは、細菌の代謝産物あるいは構成成分の一つであり、微量でヒト生体に不利な反応を引き起こす物質を意図する。   In the present specification, the “toxin” is one of bacterial metabolites or constituents, and intends a substance that causes an adverse reaction to the human living body in a trace amount.

本発明に係る被験物質として利用可能な毒素としては、特に限定されるものではない。毒素の多くは細胞表面の糖脂質に結合するものであるので、糖脂質結合性毒素を用いてもよい。糖脂質結合性毒素としては、例えば、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素及びヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素を例示できる。   The toxin that can be used as the test substance according to the present invention is not particularly limited. Since many toxins bind to cell surface glycolipids, glycolipid-binding toxins may be used. Examples of the glycolipid-binding toxin include cholera toxin, botulinum toxin, campylobacter toxin, welsh toxin, heat-labile enterotoxin, shiga toxin, tetanus toxin, verotoxin and Helicobacter pylori vacuolated toxin.

〔１−１．試料調製工程〕
本発明に係る結合親和性測定方法の試料調整工程は、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合すればよい。つまり、本発明には、上記試料及び上記複数のプローブを混合したものをそのまま用いることができる。なお、これらを混合した後に、ろ過等によって夾雑物等を取り除いてもよい。 [1-1. (Sample preparation process)
In the sample preparation step of the binding affinity measurement method according to the present invention, a sample containing a test substance and a plurality of probes for detecting the test substance may be mixed. That is, in the present invention, a mixture of the sample and the plurality of probes can be used as it is. In addition, after mixing these, you may remove impurities etc. by filtration etc.

上記プローブとしては、被験物質に対する結合親和性を評価する目的の物質を用いればよく、限定されるものではない。例えば、被験物質の種類に応じて、タンパク質、ペプチド、糖、ウイルス、核酸、脂質や、その他に様々な低分子化学物質を、蛍光物質で標識したものをプローブとして使用することができる。中でも特異的抗体、ガングリオシド又は糖鎖をプローブとすることが好ましい。   As the probe, a target substance for evaluating the binding affinity for the test substance may be used, and the probe is not limited. For example, proteins, peptides, sugars, viruses, nucleic acids, lipids, and various other low-molecular chemical substances labeled with fluorescent substances can be used as probes according to the type of test substance. Among them, it is preferable to use a specific antibody, ganglioside or sugar chain as a probe.

より具体的には、細菌由来の毒素を検出するためのプローブとしては、当該毒素に特異的に結合するものであれば特に限定されないが、ガングリオシドが好ましい。   More specifically, the probe for detecting a toxin derived from bacteria is not particularly limited as long as it specifically binds to the toxin, but ganglioside is preferable.

また、ウイルスを検出するためのプローブとしては、ウイルスに特異的に結合するものであれば特に限定されず、糖、抗体、タンパク質（糖蛋白を含む）、ペプチド、核酸、糖脂質等の脂質、低分子化学物質などが広く例示される。中でも、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス又はアデノウイルスを検出するためのプローブとしては、これらのウイルスそれぞれに特異的に結合しうる糖鎖構造を含むもの、例えばフェツイン等のタンパク質、ガングリオシドＬｙｓｏＧＭ３等の糖脂質が挙げられる。   In addition, the probe for detecting the virus is not particularly limited as long as it specifically binds to the virus, and sugars, antibodies, proteins (including glycoproteins), peptides, nucleic acids, lipids such as glycolipids, Low molecular chemical substances are widely exemplified. Among them, probes for detecting influenza virus, parainfluenza virus or adenovirus include those containing a sugar chain structure that can specifically bind to each of these viruses, for example, proteins such as fetuin, glycolipids such as ganglioside LysoGM3, etc. Is mentioned.

なお、蛍光物質による標識が無くても蛍光を発する物質を、そのままプローブとする場合、蛍光物質による標識の手間を省くことができる。   In addition, when a substance that emits fluorescence without using a label with a fluorescent substance is used as a probe as it is, the labor of labeling with the fluorescent substance can be saved.

また、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであればよい。励起波長又は蛍光波長は、特に限定されるものではないが、例えば、３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の蛍光物質により標識されたものを好適に用いることができる。なお、上記蛍光物質の分子量は特に限定されるものではないが、２００００以下が好ましく、さらに好ましくは１２０以上８０００以下である。   In addition, the plurality of probes may have different excitation wavelengths or fluorescence wavelengths. The excitation wavelength or the fluorescence wavelength is not particularly limited, but for example, a label labeled with a fluorescent substance of 350 nm or more and 800 nm or less can be suitably used. In addition, although the molecular weight of the said fluorescent substance is not specifically limited, 20000 or less is preferable, More preferably, it is 120 or more and 8000 or less.

混合するプローブの種類は、複数種であれば特に限定されるものではない。例えば、被験物質に対する、３種類のプローブの結合親和性を比較する場合は、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有する蛍光物質で標識した３種類のプローブを用いればよい。本発明者らは、後述する実施例において、２種類のガングリオシド間でのコレラ毒素に対する結合親和性を比較した。   The types of probes to be mixed are not particularly limited as long as they are plural types. For example, when comparing the binding affinity of three kinds of probes to a test substance, three kinds of probes labeled with fluorescent substances having different excitation wavelengths or fluorescence wavelengths may be used. The present inventors compared the binding affinity for cholera toxin between two types of gangliosides in Examples described later.

〔１−２．蛍光検出工程〕
本発明に係る結合親和性測定方法の蛍光検出工程は、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出すればよい。また、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。各波長の蛍光強度のゆらぎを検出することで、上記複数のプローブのうち、いずれのプローブが被験物質に結合したかを評価することができる。 [1-2. (Fluorescence detection process)
In the fluorescence detection step of the binding affinity measurement method according to the present invention, the fluorescence emitted from the plurality of probes may be detected by fluorescence correlation spectroscopy. The fluorescence correlation spectroscopy may be performed by irradiating the sample with laser beams having different wavelengths for detecting the plurality of probes. By detecting fluctuations in fluorescence intensity at each wavelength, it is possible to evaluate which of the plurality of probes is bound to the test substance.

本発明に係る結合親和性測定方法の蛍光検出工程では、それぞれ異なる波長のレーザ光を照射する以外は、従来公知の蛍光相関分光法（例えば非特許文献１を参照）に従って行なえばよい。   The fluorescence detection step of the binding affinity measurement method according to the present invention may be performed according to conventionally known fluorescence correlation spectroscopy (see, for example, Non-Patent Document 1), except that laser beams having different wavelengths are irradiated.

蛍光相関分光法において、それぞれ異なる波長のレーザ光を照射する方法は、特に限定されるものではない。複数のレーザ光は、試料に同時に照射してもよく、それぞれのレーザ光を順次照射してもよい。例えば、従来公知の蛍光相関分光装置であって、発するレーザ光の波長が異なる複数種類の装置を用意して、上記試料調製工程で得た試料をそれぞれの装置に分注して、測定を行なえばよい。また、後述の本発明に係る蛍光相関分光装置を用いて複数種類のレーザ光を順次照射してもよい。いずれの場合においても、複数のプローブを混合した試料を用いることができるため、試料毎の温度のズレや夾雑物濃度によるプローブの非特異的吸着の影響を抑制して結合親和性の測定を行なうことができる。   In fluorescence correlation spectroscopy, the method of irradiating laser beams having different wavelengths is not particularly limited. A plurality of laser beams may be irradiated to the sample simultaneously, or each laser beam may be irradiated sequentially. For example, it is a conventionally known fluorescence correlation spectroscopic device that prepares a plurality of types of devices having different wavelengths of emitted laser light, dispenses the sample obtained in the sample preparation step to each device, and performs measurement. That's fine. Further, a plurality of types of laser beams may be sequentially irradiated using a fluorescence correlation spectroscopy apparatus according to the present invention described later. In any case, a sample in which a plurality of probes are mixed can be used, so the binding affinity is measured while suppressing the influence of non-specific adsorption of the probe due to temperature deviation and contaminant concentration for each sample. be able to.

〔１−３．解析工程〕
上記蛍光検出工程で検出した蛍光強度から、それぞれのプローブの被験物質に対する結合親和性を評価する方法は、特に限定されるものではないが、検出したそれぞれの蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程を行なうことが好ましい。 [1-3. Analysis process)
The method for evaluating the binding affinity of each probe to the test substance from the fluorescence intensity detected in the fluorescence detection step is not particularly limited, but the autocorrelation function of each detected fluorescence intensity is calculated. It is preferable to perform an analysis step of comparing the autocorrelation functions with each other.

例えば、自己相関関数によって描かれる曲線を比較することで、いずれのプローブが優先して被験物質に結合したかを簡便に把握することができる。また、自己相関関数からは並進拡散時間を算出することができるので、複数のプローブの被験物質に対する結合親和性を定量的に測定することができる。さらに、被験物質の濃度と並進拡散時間との関係から解離定数を算出することも可能である。   For example, by comparing curves drawn by an autocorrelation function, it is possible to easily grasp which probe has preferentially bound to the test substance. Further, since the translational diffusion time can be calculated from the autocorrelation function, the binding affinity of a plurality of probes to the test substance can be quantitatively measured. Further, the dissociation constant can be calculated from the relationship between the concentration of the test substance and the translational diffusion time.

なお、上記解析工程によらず、例えば、計測時間と蛍光強度との関係から、それぞれの蛍光強度のゆらぎを比較して、結合親和性の大小を定性的に評価してもよい。   Regardless of the analysis step, for example, the magnitude of the binding affinity may be qualitatively evaluated by comparing fluctuations of the respective fluorescence intensities from the relationship between the measurement time and the fluorescence intensity.

〔１−４．２種類のプローブを用いた本発明に係る結合親和性測定方法の例〕
以下に、本発明に係る結合親和性測定方法の一実施形態を、図１に基づいて説明する。図１は、本実施の形態に係る結合親和性測定方法の原理を模式的に示した図であり、被験物質としてコレラ毒素を用い、プローブとして、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘで標識したＧＭ１及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いた場合について示している（図１では、それぞれ単に「ＧＭ１」及び「ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１」と示している）。また、図１（１）及び（２）に示す、ＧＭ１が嵌合している物質がコレラ毒素を示している。 [Examples of the binding affinity measurement method according to the present invention using 1-4 types of probes]
Below, one Embodiment of the binding affinity measuring method which concerns on this invention is described based on FIG. FIG. 1 is a diagram schematically showing the principle of the binding affinity measurement method according to the present embodiment, in which cholera toxin is used as a test substance, and GM1 and Alexa Fluor 488 labeled with Rhodamine Red-X as probes. The case where asialo-GM1 labeled with is used is shown (in FIG. 1, they are simply indicated as “GM1” and “asialo-GM1”, respectively). Moreover, the substance which GM1 has shown in FIG. 1 (1) and (2) has shown the cholera toxin.

図１（１）及び（２）に示すように、ＧＭ１は、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１より優先してコレラ毒素に結合する。よって、図１（１）に示すように、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘの励起波長である５３２ｎｍのレーザ光を照射すると、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘに由来する蛍光強度が検出される。そして、当該蛍光強度の自己相関関数Ｇ（τ）を算出すると図１（３）に示すグラフを作成することができる。   As shown in FIGS. 1 (1) and (2), GM1 binds to cholera toxin in preference to asialo-GM1. Therefore, as shown in FIG. 1 (1), when 532 nm laser light, which is the excitation wavelength of Rhodamine Red-X, is irradiated, fluorescence intensity derived from Rhodamine Red-X is detected. When the autocorrelation function G (τ) of the fluorescence intensity is calculated, the graph shown in FIG. 1 (3) can be created.

ここで、自己相関関数とは、任意の時間ｔにおける蛍光強度Ｉ（ｔ）を基準として、（τ）時間後の蛍光強度Ｉ（ｔ＋τ）の相関を次式（１）で表したものである。
Ｇ（τ）＝｛Ｉ（ｔ）・Ｉ（ｔ＋τ）｝／｛Ｉ（ｔ）｝２・・・（１）
図１（３）に示すように、τが特定の値になるとＧ（τ）は急激に低下する。本明細書では、Ｇ（τ）が低下し始めるτをτ２、低下し終わるτをτ３とする。そして、（τ２＋τ３）／２であるτ１を並進拡散時間として定義する。並進拡散時間が大きいほど、検出した蛍光強度の蛍光を発した分子が大きいことを意味する。 Here, the autocorrelation function represents the correlation of the fluorescence intensity I (t + τ) after (τ) time with the following expression (1) with reference to the fluorescence intensity I (t) at an arbitrary time t. .
G (τ) = {I (t) · I (t + τ)} / {I (t)} 2 (1)
As shown in FIG. 1 (3), when τ reaches a specific value, G (τ) rapidly decreases. In this specification, τ where G (τ) starts to decrease is τ 2 , and τ where G (τ) ends decreasing is τ 3 . Then, τ 1 which is (τ 2 + τ 3 ) / 2 is defined as the translational diffusion time. It means that the larger the translational diffusion time, the larger the molecule emitting fluorescence with the detected fluorescence intensity.

同様に、図１（２）に示すように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の励起波長である４７３ｎｍのレーザ光を照射すると、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に由来する蛍光強度が検出される。当該蛍光強度の自己相関関数Ｇ（τ）を算出すると図１（４）に示すグラフを作成することができる。図１（３）と同様に、図１（４）に示すＧ（τ）もτ２’からτ３’までの間で低下しているので、並進拡散時間τ１’は（τ２’＋τ３’）／２である。 Similarly, as shown in FIG. 1 (2), when laser light having a wavelength of 473 nm, which is the excitation wavelength of Alexa Fluor 488, is irradiated, fluorescence intensity derived from Alexa Fluor 488 is detected. When the autocorrelation function G (τ) of the fluorescence intensity is calculated, a graph shown in FIG. 1 (4) can be created. Similarly to FIG. 1 (3), G (τ) shown in FIG. 1 (4) also decreases between τ 2 ′ and τ 3 ′, so that the translational diffusion time τ 1 ′ is (τ 2 ′ + τ 3 ′) / 2.

図１（５）に示すように、それぞれの自己相関関数を比較すると、τ１はτ１’より大きいことが分かる。これは、ＧＭ１がコレラ毒素に結合して大きな分子を形成してこれが検出されたことを示し、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１はコレラ毒素に結合しなかったため、小さい分子として検出されたことを示す。この結果から、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１よりＧＭ１の方が、コレラ毒素に対する結合親和性に優れていることが確認できる。このように、本発明によれば、複数のプローブの被験物質に対する結合の競争性を測定することができる。
＜２．本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法＞
本発明に係る結合親和性測定方法を利用すれば、試料中の被験物質を検出することも可能である。即ち、本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法（以下、「被験物質検出方法」という）は、試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有し、上記被験物質に対する結合親和性が既知のものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。なお、本実施の形態では、上記本発明に係る結合親和性測定方法と同様の構成については説明を省き、主に、上記本発明に係る結合親和性測定方法との相違点について説明する。 As shown in FIG. 1 (5), comparing the autocorrelation functions, it can be seen that τ1 is larger than τ1 ′. This indicates that GM1 bound to cholera toxin to form a large molecule that was detected, and asialo-GM1 was detected as a small molecule because it did not bind to cholera toxin. From this result, it can be confirmed that GM1 is superior in binding affinity to cholera toxin than asialo-GM1. Thus, according to the present invention, the competitiveness of binding of a plurality of probes to a test substance can be measured.
<2. Method for Detecting Test Substance in Sample According to the Present Invention>
By using the binding affinity measurement method according to the present invention, it is possible to detect a test substance in a sample. That is, a method for detecting a test substance in a sample according to the present invention (hereinafter referred to as “test substance detection method”) includes a sample preparation step of mixing a sample and a plurality of probes for detecting the test substance, A fluorescence detection step of detecting fluorescence emitted from the plurality of probes by fluorescence correlation spectroscopy, wherein each of the plurality of probes has a different excitation wavelength or fluorescence wavelength and has a binding affinity for the test substance. It is known and the fluorescence correlation spectroscopy may be performed by irradiating the sample with laser beams having different wavelengths for detecting the plurality of probes. In the present embodiment, the description of the same configuration as the above-described binding affinity measurement method according to the present invention is omitted, and differences from the above-described binding affinity measurement method according to the present invention are mainly described.

本発明に係る被験物質検出方法では、予め、被験物質に対する結合親和性が既知の複数のプローブを用いる。そして、上述の本発明に係る結合親和性測定方法と同様の操作を行なえば、実際に得られた当該プローブの結合親和性と既知の結合親和性とを比較することで、試料中の被験物質を定性的に又は定量的に検出することができる。本発明者らは、後の実施例で述べるように、インフルエンザウイルスに対して結合性を有するフェツインと、結合性を有さないグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と表記する）とを用いて、試料中のインフルエンザウイルスを検出した。   In the test substance detection method according to the present invention, a plurality of probes having a known binding affinity for the test substance are used in advance. Then, if the same operation as the above-described binding affinity measurement method according to the present invention is performed, the test substance in the sample is compared by comparing the binding affinity of the probe actually obtained with the known binding affinity. Can be detected qualitatively or quantitatively. As will be described later in the Examples, the present inventors include fetuin having a binding property to influenza virus and a glutathione-S-transferase having no binding property (hereinafter referred to as “GST”). Used to detect influenza virus in the sample.

ここで、結合親和性が既知のプローブとは、必ずしも解離定数等の具体的な数値が既知のプローブのみを意図しているものではない。目的とする検出精度に応じて、使用するプローブの結合親和性の被験物質に対する結合親和性が予測できるものを用いればよい。また、上記本発明に係る結合親和性測定方法や、従来公知の結合親和性の測定方法によって、予め被験物質と複数のプローブとの結合親和性を測定する工程を行ない、その後に、本発明に係る被験物質検出方法の試料調製工程や蛍光検出工程を行なってもよい。   Here, a probe with a known binding affinity does not necessarily mean only a probe with a known specific numerical value such as a dissociation constant. According to the target detection accuracy, a probe that can predict the binding affinity of the probe to be used for the test substance may be used. In addition, the step of measuring the binding affinity between a test substance and a plurality of probes in advance by the above-described binding affinity measuring method according to the present invention or a conventionally known binding affinity measuring method is performed, and then the present invention is applied. You may perform the sample preparation process and fluorescence detection process of the test substance detection method which concerns.

本発明に係る被験物質検出方法によれば、複数のプローブを用いて検出することができるので、信頼性が高い検出結果を得ることができる。また、結合親和性が既知であるプローブを複数用いて、当該複数のプローブによる蛍光強度を比較して検出を行なうため、別途ネガティブコントロール等と比較する作業を行なわなくてもよい。そのため従来のＦＣＳで問題となっていた温度条件や夾雑物濃度のズレが除かれた結果を得ることができる。   According to the test substance detection method of the present invention, detection can be performed using a plurality of probes, so that a highly reliable detection result can be obtained. In addition, since a plurality of probes having known binding affinities are used for detection by comparing the fluorescence intensities of the plurality of probes, it is not necessary to perform a separate comparison with a negative control or the like. Therefore, it is possible to obtain a result in which the temperature condition and the deviation of the contaminant concentration, which are problems in the conventional FCS, are removed.

なお、インフルエンザウイルスの検出を行なう場合に用いるプローブとしては、特に限定されるものではない。インフルエンザウイルスに対する抗体を用いれば、感度が向上するため好ましい。また、後述の実施例のように、フェツインのようなインフルエンザウイルスに結合するタンパク質を用いれば、検出を安価に行なうことができるため好ましい。
＜３．本発明に係る蛍光相関分光装置＞
本発明に係る蛍光相関分光装置の一実施形態について図２を用いて説明する。図２は本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１の概略構成を示す図である。 In addition, it does not specifically limit as a probe used when detecting influenza virus. Use of an antibody against influenza virus is preferable because sensitivity is improved. In addition, as in Examples described later, it is preferable to use a protein that binds to influenza virus such as fetuin because detection can be performed at low cost.
<3. Fluorescence correlation spectrometer according to the present invention>
An embodiment of the fluorescence correlation spectroscopy apparatus according to the present invention will be described with reference to FIG. FIG. 2 is a diagram showing a schematic configuration of the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 1 according to the present embodiment.

まず、蛍光相関分光装置１の構成について説明する。蛍光相関分光装置１は、試料搭載部２（試料搭載手段）、対物レンズ３、５３２ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）４、４７３ｎｍレーザ５（レーザ光照射手段）、切り替えミラー６（切り替え手段）、ピンホール７、光検出器８、デジタル相関器１２（解析手段）を備えている。なお図１には、蛍光相関分光装置１に供する試料１０、試料１０中に形成される共焦点領域１１をも示している。   First, the configuration of the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 1 will be described. The fluorescence correlation spectroscopic apparatus 1 includes a sample mounting portion 2 (sample mounting means), an objective lens 3, a 532 nm laser (laser light irradiation means) 4, a 473 nm laser 5 (laser light irradiation means), a switching mirror 6 (switching means), and a pin. A hole 7, a photodetector 8, and a digital correlator 12 (analysis means) are provided. FIG. 1 also shows a sample 10 used for the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 1 and a confocal region 11 formed in the sample 10.

試料搭載部２は、試料１０を搭載するための試料搭載手段である。具体的には、レーザ光を通過させることが可能な貫通孔を設けた台座である。試料搭載部２には、スライドガラス等をセットして、当該スライドガラスの上に試料１０を滴下すればよい。   The sample mounting portion 2 is a sample mounting means for mounting the sample 10. Specifically, it is a pedestal provided with a through hole through which laser light can pass. A slide glass or the like may be set on the sample mounting portion 2 and the sample 10 may be dropped on the slide glass.

試料１０としては、例えば、上述の本発明に係る結合親和性測定方法や被験物質検出方法で説明した試料に、それぞれ励起波長又は蛍光波長が異なる複数のプローブを混合したものを用いることができる。本実施の形態では、試料１０には、波長が５３２ｎｍのレーザ光で励起されるプローブと波長が４７３ｎｍのレーザ光で励起されるプローブとの、２種類のプローブが混合されているものとして説明する。   As the sample 10, for example, a sample obtained by mixing a plurality of probes having different excitation wavelengths or fluorescence wavelengths with the sample described in the above-described binding affinity measurement method or test substance detection method according to the present invention can be used. In this embodiment, the sample 10 is described as a mixture of two types of probes, a probe excited by a laser beam having a wavelength of 532 nm and a probe excited by a laser beam having a wavelength of 473 nm. .

対物レンズ３は、後述する５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５から照射されたレーザの焦点を絞って、試料１０中に共焦点領域１１を形成するものである。   The objective lens 3 forms a confocal region 11 in the sample 10 by focusing the laser beams emitted from the 532 nm laser 4 and the 473 nm laser 5 described later.

５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５は、レーザ光照射手段として機能するものであり、それぞれ５３２ｎｍ、４７３ｎｍの波長のレーザ光を照射する。レーザの光源としては特に限定されるものではない。例えば、５３２ｎｍのレーザ光の光源、及び４７３ｎｍのレーザ光の光源としてともに半導体励起固体レーザを用いればよい。   The 532 nm laser 4 and the 473 nm laser 5 function as laser beam irradiation means, and irradiate laser beams having wavelengths of 532 nm and 473 nm, respectively. The light source of the laser is not particularly limited. For example, a semiconductor-excited solid-state laser may be used as both a light source for 532 nm laser light and a light source for 473 nm laser light.

切り替えミラー６は、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５のうち、試料１０に照射するレーザ光を選択するための切り替え手段である。切り替えミラー６としては、従来公知のダイクロイックミラー等を用いればよい。また、切り替えミラー６は、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５のいずれかから照射されたレーザ光が試料１０に導かれるように、図２に示す矢印方向に回動する。図２に示す実線で示した箇所に切り替えミラー６が位置するときは、５３２ｎｍレーザ４によるレーザ光が試料１０に導かれ、破線の箇所に切り替えミラー６が位置するときは、４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光が試料１０に導かれる。   The switching mirror 6 is switching means for selecting a laser beam to be irradiated on the sample 10 out of the 532 nm laser 4 and the 473 nm laser 5. As the switching mirror 6, a conventionally known dichroic mirror or the like may be used. Further, the switching mirror 6 rotates in the direction of the arrow shown in FIG. 2 so that the laser light emitted from either the 532 nm laser 4 or the 473 nm laser 5 is guided to the sample 10. When the switching mirror 6 is located at the position shown by the solid line in FIG. 2, the laser beam from the 532 nm laser 4 is guided to the sample 10, and when the switching mirror 6 is located at the broken line, the laser by the 473 nm laser 5 is used. Light is guided to the sample 10.

ピンホール７は、試料１０から発せられた蛍光を光検出器８に導くためのものである。また、光検出器８は当該蛍光を検出するためのものである。   The pinhole 7 is for guiding the fluorescence emitted from the sample 10 to the photodetector 8. The photodetector 8 is for detecting the fluorescence.

デジタル相関器１２は、試料１０から発せられた、それぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析手段である。なお、デジタル相関器１２は、検出された蛍光強度から自己相関関数を算出することが可能なコンピュータ等を外付けして用いてもよい。つまり、本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記解析手段を備えることが好ましいが、これに限定されるものではない。   The digital correlator 12 is an analysis unit that calculates an autocorrelation function of the fluorescence intensity from each fluorescence intensity emitted from the sample 10 and compares the autocorrelation functions with each other. The digital correlator 12 may be used with an external computer or the like capable of calculating an autocorrelation function from the detected fluorescence intensity. That is, the fluorescence correlation spectroscopic device according to the present invention preferably includes the above-described analyzing means, but is not limited thereto.

次に、蛍光相関分光装置１の動作について説明する。   Next, the operation of the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 1 will be described.

試料搭載部２に試料１０を滴下した後、使用者の設定に応じて、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５から発せられたレーザ光が試料１０に、順次照射される。ここでは説明の便宜のため、まず、試料１０に対して５３２ｎｍレーザ４によりレーザ光を照射して、次に４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光を照射する場合について説明する。   After dropping the sample 10 onto the sample mounting portion 2, laser light emitted from the 532nm laser 4 and the 473nm laser 5 is sequentially irradiated onto the sample 10 according to the setting of the user. Here, for convenience of explanation, a case where the sample 10 is irradiated with laser light from the 532 nm laser 4 and then irradiated with laser light from the 473 nm laser 5 will be described.

５３２ｎｍレーザ４から発せられたレーザ光は、切り替えミラー６によって試料１０の方向に導かれる。そして当該レーザ光は対物レンズ６によって絞られ、試料中に共焦点領域１１が形成される。共焦点領域１１は、図２に示すように略円柱状の領域となる。なお、共焦点領域１１の容積は、１×１０−１６リットル以上１×１０−１０リットル以下が好ましく使用され、さらに好ましくは１×１０−１６リットル以上１×１０−１３リットル以下である。つまり、蛍光相関分光装置１は、この範囲の共焦点領域を形成可能な対物レンズを備えることが好ましい。 Laser light emitted from the 532 nm laser 4 is guided in the direction of the sample 10 by the switching mirror 6. Then, the laser light is focused by the objective lens 6, and a confocal region 11 is formed in the sample. The confocal region 11 is a substantially cylindrical region as shown in FIG. The volume of the confocal region 11 is preferably 1 × 10 −16 liter or more and 1 × 10 −10 liter or less, more preferably 1 × 10 −16 liter or more and 1 × 10 −13 liter or less. That is, the fluorescence correlation spectroscopic device 1 preferably includes an objective lens capable of forming a confocal region in this range.

試料中の分子はブラウン運動により動き回っており、共焦点領域１１内を通過した分子が観察の対象となる。つまり、共焦点領域１１内に、波長５３２ｎｍのレーザ光で励起する蛍光物質により標識されたプローブが存在すれば、当該蛍光物質から蛍光が発せられる。そして、当該蛍光はピンホール７を通過して光検出器８によって検出される。   Molecules in the sample are moving around due to Brownian motion, and molecules that have passed through the confocal region 11 are objects of observation. That is, if there is a probe labeled with a fluorescent material excited by laser light having a wavelength of 532 nm in the confocal region 11, fluorescence is emitted from the fluorescent material. Then, the fluorescence passes through the pinhole 7 and is detected by the photodetector 8.

５３２ｎｍレーザ４による検出が終わった後は、切り替えミラー６が回動して、図２に示す破線の箇所に位置する。そして、４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光が発せられ、試料１０に導かれる。ここで、共焦点領域１１内に、波長４７３ｎｍのレーザ光で励起される蛍光物質で標識されたプローブが存在すれば、当該蛍光物質から蛍光が光検出器８によって検出される。   After the detection by the 532 nm laser 4 is finished, the switching mirror 6 rotates and is positioned at the broken line position shown in FIG. Then, laser light from the 473 nm laser 5 is emitted and guided to the sample 10. Here, if there is a probe labeled with a fluorescent material excited by a laser beam having a wavelength of 473 nm in the confocal region 11, fluorescence is detected from the fluorescent material by the photodetector 8.

光検出器８によって検出されたそれぞれの蛍光強度に基づいて、デジタル相関器１２によって自己相関関数が算出される。それぞれの自己相関関数を比較することによって、試料中の被験物質に対する上記２種類のプローブの結合親和性を測定したり、試料中の被験物質の検出を行なったりすることができる。   An autocorrelation function is calculated by the digital correlator 12 based on the respective fluorescence intensities detected by the photodetector 8. By comparing the autocorrelation functions, the binding affinity of the two kinds of probes to the test substance in the sample can be measured, or the test substance in the sample can be detected.

〔実施例１：蛍光標識ガングリオシドを用いた競争的ＦＣＳ〕
（装置）
本実施例では、二台の蛍光相関分析装置（ＦＣＳ‐１０１（５３２ｎｍ ｌａｓｅｒ）、ＦＣＳ‐１０１Ｂ（４７３ｎｍ ｌａｓｅｒ）、いずれも東洋紡社製）の一台のコンピュータにつなぎ、同時に測定を行なった。得られた結果を、ＦＣＳ‐１０１に添付のＦＣＳ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。 [Example 1: Competitive FCS using fluorescently labeled ganglioside]
(apparatus)
In this example, two fluorescence correlation analyzers (FCS-101 (532 nm laser) and FCS-101B (473 nm laser), both manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were connected to one computer and measured simultaneously. The obtained result was analyzed using FCS control software attached to FCS-101.

また、ＦＣＳ‐１０１及びＦＣＳ‐１０１Ｂのセットアップは、付属のマニュアルに従って行なった。具体的には、超純水を用いてステージ位置を調整して、１０ｎＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇで機器の状態を確認した。また、ＦＣＳ‐１０１では１０ｎＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅで標識されたＧＭ１を用いて、ＦＣＳ‐１０１ＢではＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたＧＭ１を用いてＦＣＳ相関を測定して、プローブの状態を確認した。なお、上記超純水とは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社製）を用いて精製した超純水であり、以下「Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水」と表記する。   The FCS-101 and FCS-101B were set up according to the attached manual. Specifically, the stage position was adjusted using ultrapure water, and the state of the device was confirmed with 10 nM Rhodamine 6G. In addition, the FCS-101 was used to measure the FCS correlation using GM1 labeled with 10 nM Rhodamine, and the FCS-101B using Alexa Fluor 488-labeled GM1 to confirm the probe state. In addition, the said ultrapure water is the ultrapure water refine | purified using the Milli-Q system (made by Millipore), and is hereafter described as "Milli-Q water".

（コレラ毒素）
コレラ毒素としては、Ｌｉｓｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ.より凍結乾燥されたものを購入して用いた。これを、２０ｍＭ ＣＴになるように調製して、２０ｍｌずつ分注して−２０℃で保存した。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって、夾雑蛋白質が存在しないことを確認した。凍結保存したコレラ毒素は、実験ごとに必要に応じて解凍して、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水で３．７倍希釈して、５．４ｍＭの濃度で使用した。 (Cholera toxin)
As cholera toxin, a product freeze-dried from List biologic laboratories, Inc. was purchased and used. This was prepared to 20 mM CT, dispensed in 20 ml portions, and stored at −20 ° C. In addition, it was confirmed by SDS-PAGE and silver staining that no contaminating protein was present. The cryopreserved cholera toxin was thawed as necessary for each experiment, diluted 3.7-fold with Milli-Q water, and used at a concentration of 5.4 mM.

（ガングリオシド）
本実施例では、ガングリオシドとして、上述したＧＭ１、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の他に、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ１ａ（以下、それぞれ、「ＧＭ２」、「ＧＭ３」、「ＧＤ１ａ」と表記する）を用いた。ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１はＳＩＧＭＡ‐ＡＬＤＲＩＣＨ社より、残りのガングリオシドはｌｙｓｏ体をＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．より購入した。ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１のｌｙｓｏ体化は次のようにして行なった。４０ｎｍｏｌのａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ(ｐＨ６．０)、４％ ＴＤＣ、１Ｕ／ｍＬ ＳＣＤａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ(ＳＩＧＭＡ社)に混合して、超純水を用いて全量を４０ｍｌとした。さらに、４００ｍｌのｎ‐ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅを重層した。そして、３７℃で２４時間インキュベートした後、ｎ‐ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅを除去した。 (Ganglioside)
In this example, in addition to GM1 and asialo-GM1 described above, ganglioside GM2, ganglioside GM3, ganglioside GD1a (hereinafter referred to as “GM2”, “GM3”, and “GD1a”, respectively) were used. . Asialo-GM1 was obtained from SIGMA-ALDRICH, and the remaining ganglioside was lyso-modified from TAKARA BIO Inc. We purchased more. Asialo-GM1 lyso-formation was performed as follows. 40 nmol of asialo-GM1 was mixed with 50 mM sodium acetate (pH 6.0), 4% TDC, 1 U / mL SCDase from Pseudomonas (SIGMA), and the total volume was adjusted to 40 ml using ultrapure water. Furthermore, 400 ml of n-heptadecane was overlaid. And after incubating at 37 degreeC for 24 hours, n-heptadecane was removed.

（蛍光標識ガングリオシド）
ガングリオシドを標識する蛍光物質として、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を用いた。標識は次のようにして行なった。 (Fluorescently labeled ganglioside)
Rhodamine Red-X and Alexa Fluor 488 were used as fluorescent substances for labeling gangliosides. The labeling was performed as follows.

ｌｙｓｏ体ガングリオシドのＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａを、それぞれ、１０ｍＭのＤＭＦ溶液に溶解した。次に、１０ｍＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）、又は１０ｍＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を等量加えた。次に、１％ＴＥＡのＤＭＦ溶液を終濃度０．１％となるように加え、室温、遮光下で２４時間振盪して、蛍光標識体を得た。   Lyso gangliosides GM1, GM2, GM3, and GD1a were each dissolved in a 10 mM DMF solution. Next, 10 mM Rhodamine Red-X succinimidyl ester (manufactured by Invitrogen Molecular Probes), or 10 mM Alexa Fluor 488 carboxylic acid acid, succinimilyl ester (manufactured by Invitrogen, etc.). Next, a DMF solution of 1% TEA was added to a final concentration of 0.1%, and the mixture was shaken for 24 hours at room temperature and protected from light to obtain a fluorescent label.

ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１では、まず、上述の方法で得たｌｙｓｏ体ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の溶液に、ＤＭＦを等量加えた後、１％ＴＥＡを終濃度０．１％となるように加えた。次に、ＤＭＦに溶解した５ｍＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘ， ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ又は５ｍＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ， ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒを３２μｌ（１６０ｎｍｏｌのａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１に対して４等量）加えて室温、遮光下で２４時間振盪した。これにより、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の蛍光標識体を得た。   In asialo-GM1, first, an equal amount of DMF was added to the lyso asialo-GM1 solution obtained by the above method, and then 1% TEA was added to a final concentration of 0.1%. Next, 5 mM Rhodamine Red-X, succinimidyl ester or 5 mM Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester dissolved in DMF was added in 32 μl (160 nmol asialo-GM1 at room temperature for 4 hours) did. Thereby, a fluorescent label of asialo-GM1 was obtained.

次に、得られた蛍光標識体を、ＲＰ‐ＨＰＬＣで精製した。測定系には、ＧＩＬＳＯＮ社製のポンプとＵＶ／ＶＩＳ‐１５１検出器を用いた。次に、４．６×１５０‐ｍｍ ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＯＤＳ ＡＲ‐IIを用いて、室温で、蛍光標識ガングリオシドを分離した。なお、移動相の溶液Ａとして０．０５％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉ‐Ｑ水を用い、溶液Ｂとして０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識したガングリオシドは、イニシャル条件５０％溶液Ｂから１％／ｍｉｎで３０分間、終濃度８０％までグラジエントをかけて、５７０ｎｍの吸収強度を観測することで分離した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したガングリオシドは、イニシャル条件１０％溶液Ａから１．３％／ｍｉｎで４０分間、終濃度９０％までグラジエントをかけて、４９５ｎｍの吸収強度を観測することで分離した。   Next, the obtained fluorescent label was purified by RP-HPLC. For the measurement system, a pump manufactured by GILSON and a UV / VIS-151 detector were used. Next, the fluorescently labeled ganglioside was separated using a 4.6 × 150-mm COSMOSIL ODS AR-II at room temperature. Note that Milli-Q water containing 0.05% TFA was used as the solution A of the mobile phase, and acetonitrile containing 0.05% TFA was used as the solution B. The ganglioside labeled with Rhodamine Red-X was separated by observing an absorption intensity of 570 nm by applying a gradient from initial solution 50% solution B at 1% / min for 30 minutes to a final concentration of 80%. Gangliosides labeled with Alexa Fluor 488 were separated by observing the absorption intensity at 495 nm from a 10% solution A in the initial condition at a gradient of 1.3% / min for 40 minutes to a final concentration of 90%.

なお、以下、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘで標識したＧＭ１等のガングリオシドを、「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１」や「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ガングリオシド」等と表記し、同様にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したＧＭ１等のガングリオシドを、「Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ１」や「Ａｌｅｘａ４８８‐ガングリオシド」等と表記する。
（コレラ毒素と蛍光標識ガングリオシドによる競争的ＦＣＳ）
各蛍光標識ガングリオシドとコレラ毒素との混合は、次にようにして行なった。まず、４μＭのＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ガングリオシドと４μＭのＡｌｅｘａ４８８‐ガングリオシドとを等量混合した。次に、凝集体を除くためにＵｌｔｒａｆｒｅｅ‐ＭＣ ０．１ｍｍｐｏｒｅ Ｄｕｒａｐｏｒｅ（ミリポア社製）を用いて、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心して濾過を行なった。遠心にはＣＦ‐１５ＲＸＩＩＩ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いた。次に、各蛍光標識ガングリオシドが２０ｎＭとなるように希釈した。次に、５．４μＭ〜５．３ｎＭの範囲で二倍段階希釈した各濃度のコレラ毒素と各蛍光標識ガングリオシドとを等量ずつ混合した。次に、３７℃、遮光条件下で１時間インキュベーションしてＦＣＳ用サンプルとした。 Hereinafter, gangliosides such as GM1 labeled with Rhodamine Red-X are referred to as “Rhodamine-GM1” and “Rhodamine-ganglioside”, and gangliosides such as GM1 labeled with Alexa Fluor 488 are referred to as “Alexa 488”. -GM1 "or" Alexa488-ganglioside ".
(Competitive FCS with cholera toxin and fluorescently labeled ganglioside)
Each fluorescently labeled ganglioside and cholera toxin were mixed as follows. First, 4 μM Rhodamine-ganglioside and 4 μM Alexa488-ganglioside were mixed in equal amounts. Next, in order to remove aggregates, ultrafree-MC 0.1 mmpore Durapore (Millipore) was used for centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes for filtration. For centrifugation, CF-15RXIII (manufactured by HITACHI) was used. Next, each fluorescently labeled ganglioside was diluted to 20 nM. Next, each concentration of cholera toxin and serially diluted two-fold in the range of 5.4 μM to 5.3 nM and each fluorescently labeled ganglioside were mixed in equal amounts. Next, a sample for FCS was obtained by incubation for 1 hour at 37 ° C. under light-shielding conditions.

後述するそれぞれの２種類の蛍光標識ガングリオシドによる競争的ＦＣＳは、ＦＣＳ‐１０１、ＦＣＳ‐１０１Ｂに、各サンプルを３０μｌずつアプライして、同時に測定することで行なった。測定時のレーザ強度は、ＦＣＳ‐１０１では１ｍＷ、ＦＣＳ‐１０１Ｂでは０．１００〜０．２７６ｍＷとした。   Competitive FCS with each of the two types of fluorescently labeled ganglioside described below was performed by applying 30 μl of each sample to FCS-101 and FCS-101B and measuring them simultaneously. The laser intensity during measurement was 1 mW for FCS-101 and 0.100 to 0.276 mW for FCS-101B.

結果を図３〜７に示す。図３は、Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ２を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図４は、Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図５は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１及びＡｌｅｘａ４８８‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図６は、Ａｌｅｘａ４８８−ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いて競争的ＦＣＳ行なった結果を示す図である。図７は、Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ２及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。なお、図３〜７において、横軸はコレラ毒素濃度を示し、縦軸は並進拡散時間を示し、丸印はＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘにより標識したガングリオシドの結果を示し、四角印はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８により標識したガングリオシドの結果を示す。   The results are shown in FIGS. FIG. 3 is a diagram showing the results of competitive FCS using Alexa488-GM1 and Rhodamine-GM2. FIG. 4 is a diagram showing the results of competitive FCS using Alexa488-GM1 and Rhodamine-GM3. FIG. 5 is a diagram showing the results of competitive FCS using Rhodamine-GM1 and Alexa488-GM3. FIG. 6 is a diagram showing the results of competitive FCS performed using Alexa488-GM1 and Rhodamine-asialo-GM1. FIG. 7 shows the results of competitive FCS using Alexa 488-GM2 and Rhodamine-GM3. 3 to 7, the horizontal axis represents the cholera toxin concentration, the vertical axis represents the translational diffusion time, the circle represents the result of ganglioside labeled with Rhodamine Red-X, and the square represents the label with Alexa Fluor 488. The results for the treated gangliosides are shown.

また、図３〜７で示した結果から、それぞれの図に示した２種のガングリオシドの、並進拡散時間の差をグラフにしたものを図８に示す。図８は２種類の蛍光標識ガングリオシにおける並進拡散時間の差を示す図であり、（ａ）はＧＭ１とＧＭ２との差（丸印）、ＧＭ１とＧＭ３との差（四角印）、ＧＭ１とａｓｉａｌｏ−ＧＭ１（三角印）との差を示し、（ｂ）はＧＭ２とＧＭ３との差を示す。   Moreover, what plotted the difference of the translational diffusion time of 2 types of ganglioside shown to each figure from the result shown in FIGS. 3-7 is shown in FIG. FIG. 8 is a diagram showing the difference in translational diffusion time between two types of fluorescently labeled gangliosi, where (a) is the difference between GM1 and GM2 (circle), the difference between GM1 and GM3 (square), and GM1 and asialo. -Shows the difference from GM1 (triangle mark), and (b) shows the difference between GM2 and GM3.

図８（ａ）に示すように、コレラ毒素とＧＭ１との結合に対する阻害の強さは、ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１＞ＧＭ２＞ＧＭ３であることが示された。図８（ｂ）に示すように、ＧＭ２及びＧＭ３の、コレラ毒素に対する結合親和性は同程度であることが示された。   As shown in FIG. 8 (a), it was shown that the strength of inhibition of the binding between cholera toxin and GM1 was asialo-GM1> GM2> GM3. As shown in FIG. 8 (b), it was shown that the binding affinity of GM2 and GM3 to cholera toxin is comparable.

以上の結果から、蛍光標識ガングリオシド及びコレラ毒素を用いた競争的ＦＣＳによって、ガングリオシド間のコレラ毒素に対する相対的な結合親和性の差を求めることができた。このように、競争的ＦＣＳを用いることによって、コレラ毒素に対するガングリオシドタイピングが可能であることが示された。また、以上の結果は、ガングリオシドを蛍光標識することで、ＦＣＳにより毒素を検出するためのプローブとして用いることが可能であることや、蛍光標識ガングリオシドを用いたＦＣＳにより毒素を検出することの妥当性も示したといえる。
〔実施例２：２種類の蛍光プローブを用いたウイルスの検出〕
（ウイルス）
本実施例では、インフルエンザウイルスＡ／Ｈｙｏｇｏ／７３／２００２株（兵庫県立健康環境科学研究センター山岡正興氏より分与された。以下、「Ｈｙｏｇｏ株」と表記する）を用いた。Ｈｙｏｇｏ株は、血清を加えていないＤＭＥＭ培地で培養して用いた。 From the above results, it was possible to determine the difference in relative binding affinity for cholera toxin between gangliosides by competitive FCS using fluorescently labeled ganglioside and cholera toxin. Thus, it was shown that ganglioside typing for cholera toxin is possible by using competitive FCS. In addition, the above results indicate that ganglioside can be used as a probe for detecting toxins by FCS by fluorescently labeling, and the validity of detecting toxins by FCS using fluorescently labeled gangliosides. It can be said that it also showed.
[Example 2: Detection of virus using two types of fluorescent probes]
(Virus)
In this example, influenza virus A / Hyogo / 73/2002 strain (provided by Mr. Masahiko Yamaoka, Hyogo Prefectural Institute for Health and Environmental Sciences, hereinafter referred to as “Hyogo strain”) was used. The Hygo strain was used after being cultured in a DMEM medium without serum.

（蛍光プローブの作成）
インフルエンザウイルスには、シアル酸が結合することが知られている。そこで、シアル酸を有するタンパク質であるフェツイン（ＳＩＧＭＡ社製）と、シアル酸を有さないタンパク質であるＧＳＴとを蛍光標識した。フェツインはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識して、ＧＳＴはＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識した。なお、ＧＳＴは大腸菌破砕液から精製した。 (Create fluorescent probe)
It is known that sialic acid binds to influenza virus. Therefore, fetuin (manufactured by SIGMA), which is a protein having sialic acid, and GST, which is a protein not having sialic acid, were fluorescently labeled. Fetuin was labeled with Alexa Fluor 488 and GST was labeled with Rhodamine Red-X. GST was purified from the E. coli disruption solution.

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８によるフェツインの標識では、まず、３．７×１０−５Ｍ フェツイン、７４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ＤＭＳＯに溶解した１．９×１０−４Ｍ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を混合した。 For labeling fetuin with Alexa Fluor 488, first, 3.7 × 10 −5 M fetuin, 74 mM sodium bicarbonate, 1.9 × 10 −4 M AlexaFluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester (Invitrogen Probetic Molecule Co., Ltd.) was dissolved in DMSO. Made).

ＧＳＴの標識では、まず、１．６×１０−５Ｍ ＧＳＴ、４６ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、ＤＭＳＯに溶解した９．０×１０−５Ｍ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を混合した。 For labeling GST, first, 1.6 × 10 −5 M GST, 46 mM sodium bicarbonate, 9.0 × 10 −5 M Rhodamine Red-X succinimide ester (manufactured by Invitrogen Molecular Probes) dissolved in DMSO were mixed. .

次に、それぞれの混合物を遮光、攪拌しながら室温で１時間反応させた。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたゲルろ過スピンカラムを用いて未反応蛍光物質の分離を行なった。当該ゲルろ過スピンカラムでは、３０，０００ＭＷ以下の分子を排除することが可能である。次に、遠心式ろ過ユニット（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ−３、Ａｍｉｃｏｎ社製、分画分子量 ３，０００Ｄａ ＮＭＷＬ）を用いて濃縮した。   Next, each mixture was allowed to react at room temperature for 1 hour with light shielding and stirring. Thereafter, unreacted fluorescent substances were separated using a gel filtration spin column equilibrated with phosphate buffered saline (PBS). The gel filtration spin column can exclude molecules of 30,000 MW or less. Next, it concentrated using the centrifugal filtration unit (Centricon YM-3, the product made by Amicon, the molecular weight cut off 3,000 Da NMWL).

濃縮後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分離した後、フルオロ・イメージアナライザー（フジフィルム株式会社製、ＦＬＡ−３０００）を用いて蛍光標識を確認した。以下、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたフェツインを「Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツイン」と表記し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識されたＧＳＴを「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ」と表記する。   After concentration, the product was separated by SDS-PAGE (10% gel), and then the fluorescent label was confirmed using a fluoro image analyzer (manufactured by Fujifilm Corporation, FLA-3000). Hereinafter, fetuin labeled with Alexa Fluor 488 is referred to as “Alexa 488-fetuin”, and GST labeled with Rhodamine Red-X is referred to as “Rhodamine-GST”.

（競争的ＦＣＳ）
血清が含まれていないＤＭＥＭ培地で希釈した１×１０６ＣＩＵ／ｍｌ Ｈｙｏｇｏ株と、ＰＢＳ（−）で希釈して１．４ＭとしたＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴと、上述の方法で得たＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインをＰＢＳ（−）で５０倍希釈した溶液とを、容積比２：１：１で混合して、室温で１０分間インキュベーションした。次に、実施例１で用いた２つのＦＣＳ装置（ＦＣＳ‐１０１及びＦＣＳ‐１０１Ｂ）を用いて、同時に測定を行なった。なお、比較のため、ネガティブコントロールとして、血清が含まれていないＤＭＥＭ培地であって、インフルエンザウイルスが含まれていないＤＭＥＭ培地を用いて同様に測定を行なった。ＦＣＳの測定では、ＦＣＳ‐１０１に付属のソフトウェア（浜松ホトニクス社製、ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．３．００）を用いた。測定条件は、計測回数を２０回、計測時間３．５秒とした。この結果を図９に示す。図９はＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ及びＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインを用いたＦＣＳの結果から作成した相関曲線を示す図であり、（ａ）はＨｙｏｇｏ株が含まれるＤＭＥＭ培地を供した結果を示し、（ｂ）はＨｙｏｇｏ株が含まれないＤＭＥＭ培地を供した結果を示す。また、実線はＡｌｅｘａ ４８８‐フェツイン由来の蛍光を検出した結果を示し、破線はＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ由来の蛍光を検出した結果を示す。 (Competitive FCS)
1 × 10 6 CIU / ml Hygo strain diluted with DMEM medium without serum, Rhodamine-GST diluted to 1.4 M with PBS (−), and Alexa 488-fetuin obtained by the above method Was mixed at a volume ratio of 2: 1: 1 and incubated at room temperature for 10 minutes. Next, measurement was performed simultaneously using the two FCS apparatuses (FCS-101 and FCS-101B) used in Example 1. For comparison, the same measurement was performed using a DMEM medium containing no serum and a DMEM medium containing no influenza virus as a negative control. In the FCS measurement, software attached to FCS-101 (manufactured by Hamamatsu Photonics, control software ver. 3.00) was used. The measurement conditions were 20 measurements and 3.5 seconds measurement time. The result is shown in FIG. FIG. 9 is a diagram showing a correlation curve created from the results of FCS using Rhodamine-GST and Alexa 488-fetuin, (a) shows the results of using a DMEM medium containing a Hygo strain, (b) The result of having used the DMEM culture medium which does not contain a Hygo strain | stump | stock is shown. The solid line shows the result of detecting the fluorescence derived from Alexa 488-fetuin, and the broken line shows the result of detecting the fluorescence derived from Rhodamine-GST.

図９（ａ）と（ｂ）との比較によって示されるように、インフルエンザウイルスはフェツインと結合するため、Ａｌｅｘａ４８８を検出することが可能な４７３ｎｍのレーザを用いた場合、シグナルは大きく変動する。つまり、Ｈｙｏｇｏ株を含むＤＭＥＭ培地を供した場合、Ｈｙｏｇｏ株を含まないＤＭＥＭ培地を供した結果に比べて、拡散時間が増加する。これは、Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツインとＨｙｏｇｏ株とが結合することで分子量が増加して、溶液中での並進拡散速度が低下するからである。   As shown by the comparison between FIGS. 9A and 9B, since the influenza virus binds to fetuin, the signal varies greatly when using a 473 nm laser capable of detecting Alexa488. That is, when the DMEM medium containing the Hygo strain is used, the diffusion time increases compared to the result of using the DMEM medium containing no Hygo strain. This is because Alexa 488-fetuin and the Hygo strain bind to increase the molecular weight and decrease the translational diffusion rate in the solution.

一方、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴを検出可能な５３２ｎｍのレーザを用いた場合では、Ｈｙｏｇｏ株を含むＤＭＥＭ培地の測定を行なってもシグナルはほとんど変化しない。つまり、Ｈｙｏｇｏ株を含まないＤＭＥＭ培地の測定により算出される拡散時間を示す曲線と同じ曲線が得られる。   On the other hand, when a 532 nm laser capable of detecting Rhodamine-GST is used, the signal hardly changes even when a DMEM medium containing a Hyogyo strain is measured. That is, the same curve as the curve indicating the diffusion time calculated by measurement of the DMEM medium not containing the Hygo strain is obtained.

つまり、Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツイン及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴを用いて競争的ＦＣＳを行ない、それぞれの蛍光から得られる拡散時間を示す曲線の差を測定することで、測定条件のブレや非特異的結合を除いた、インフルエンザウイルスの存在を検出することが可能であることが示された。なお、本実施例では説明の便宜のため、ネガティブコントロールを用いて比較を行なったが、ＧＳＴ又はフェツインのインフルエンザウイルスに対する結合性は既知であるため、当該比較を行なわなくても、図９（ａ）に示す結果のみから試料中にインフルエンザウイルスが存在していたことが確認できる。   In other words, competitive FCS was performed using Alexa 488-fetuine and Rhodamine-GST, and the difference in the curves indicating the diffusion times obtained from the respective fluorescence was measured, thereby eliminating blurring of measurement conditions and non-specific binding. It was shown that it is possible to detect the presence of influenza virus. In this example, for convenience of explanation, a comparison was made using a negative control. However, since the binding of GST or fetuin to influenza virus is known, FIG. 9 (a From the results shown in (1), it can be confirmed that influenza virus was present in the sample.

本発明によれば、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。特に、種々のガングリオシドに対する結合親和性を測定することで、細菌由来の毒素のタイピングを簡便、迅速かつ高感度に行なうことができるため、細菌による感染症の医薬品開発等に利用可能である。   According to the present invention, the competitiveness of binding of a plurality of probes to a test substance can be evaluated. In particular, by measuring the binding affinity for various gangliosides, the typing of bacteria-derived toxins can be carried out simply, rapidly and with high sensitivity, so that it can be used for the development of pharmaceuticals for infectious diseases caused by bacteria.

本発明の一実施形態に係る結合親和性測定方法の原理を模式的に示した図である。It is the figure which showed typically the principle of the binding affinity measuring method which concerns on one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態に係る蛍光相関分光装置の概略構成を示す図である。It is a figure which shows schematic structure of the fluorescence correlation spectroscopy apparatus which concerns on one Embodiment of this invention. Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ２を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having performed competitive FCS using Alexa488-GM1 and Rhodamine-GM2. Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having performed competitive FCS using Alexa488-GM1 and Rhodamine-GM3. Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１及びＡｌｅｘａ４８８‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having performed competitive FCS using Rhodamine-GM1 and Alexa488-GM3. Ａｌｅｘａ４８８−ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いて競争的ＦＣＳ行なった結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having performed competitive FCS using Alexa488-GM1 and Rhodamine-asialo-GM1. Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ２及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having performed competitive FCS using Alexa 488-GM2 and Rhodamine-GM3. ２種類の蛍光標識ガングリオシにおける並進拡散時間の差を示す図である。It is a figure which shows the difference of the translational diffusion time in two types of fluorescent labeling ganglios. Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ及びＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインを用いたＦＣＳの結果から作成した相関曲線を示す図である。It is a figure which shows the correlation curve created from the result of FCS using Rhodamine-GST and Alexa 488-fetuin.

符号の説明Explanation of symbols

１ 蛍光相関分光装置
２ 試料搭載部（試料搭載手段）
４ ５３２ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）
５ ４７３ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）
６ 切り替えミラー（切り替え手段）
１０ 試料 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Fluorescence correlation spectroscopy apparatus 2 Sample mounting part (sample mounting means)
4 532nm laser (laser beam irradiation means)
5 473nm laser (laser beam irradiation means)
6 Switching mirror (switching means)
10 samples

Claims (6)

被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法であって、
被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、
蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、
上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、
上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴とする方法。 A method for measuring the binding affinity of a probe to a test substance,
A sample preparation step of mixing a sample containing a test substance and a plurality of probes for detecting the test substance;
A fluorescence detection step of detecting fluorescence intensity emitted from the plurality of probes by fluorescence correlation spectroscopy,
The plurality of probes have different excitation wavelengths or fluorescence wavelengths,
The fluorescence correlation spectroscopy is performed by irradiating a sample with laser beams having different wavelengths for detecting the plurality of probes. 上記被験物質は、細菌由来の毒素またはウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the test substance is a toxin or virus derived from bacteria. 上記被験物質は、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素、ヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、又はアデノウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。   The test substance is cholera toxin, botulinum toxin, campylobacter toxin, welsh toxin, heat-labile enterotoxin, shiga toxin, tetanus toxin, verotoxin, Helicobacter pylori vacuolated toxin, influenza virus, parainfluenza virus, or adenovirus The method of claim 1, wherein: 上記蛍光検出工程によって検出したそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。   2. The method according to claim 1, further comprising an analysis step of calculating an autocorrelation function of the fluorescence intensity from each fluorescence intensity detected by the fluorescence detection step and comparing the autocorrelation functions with each other. Method. 試料中の被験物質を検出する方法であって、
試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、
蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、
上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有し、上記被験物質に対する結合親和性が既知のものであり、
上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴とする方法。 A method for detecting a test substance in a sample, comprising:
A sample preparation step of mixing a sample and a plurality of probes for detecting the test substance;
A fluorescence detection step of detecting fluorescence emitted from the plurality of probes by fluorescence correlation spectroscopy,
The plurality of probes have different excitation wavelengths or fluorescence wavelengths, and have a known binding affinity for the test substance,
The fluorescence correlation spectroscopy is performed by irradiating a sample with laser beams having different wavelengths for detecting the plurality of probes. 蛍光相関分光法を行なうための装置であって、
試料を搭載するための試料搭載手段と、
上記試料搭載手段に搭載された試料に対して、それぞれ異なる波長のレーザ光を試料に照射する複数のレーザ光照射手段と、
上記複数のレーザ光照射手段のうち、上記試料搭載手段に搭載された試料に対してレーザを照射するために用いるレーザ光照射手段を切り替えるための切り替え手段と、を備えることを特徴とする蛍光相関分光装置。 An apparatus for performing fluorescence correlation spectroscopy,
Sample loading means for loading the sample;
A plurality of laser beam irradiating means for irradiating the sample with laser beams of different wavelengths with respect to the sample mounted on the sample mounting means;
A fluorescence correlation comprising: a switching means for switching a laser light irradiation means used for irradiating a laser to a sample mounted on the sample mounting means among the plurality of laser light irradiation means. Spectrometer.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011169834A (en) * 2010-02-19 2011-09-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen Method and system for detecting lipid vesicle derived from pathogenic gram-negative bacterium
CN102253023A (en) * 2011-06-03 2011-11-23 深圳市疾病预防控制中心 Sodium fluorescence probe detection method of ciguatoxin
CN103837676A (en) * 2014-03-20 2014-06-04 苏州纳达生物科技有限公司 Metal nano island carrier and preparation method thereof as well as application of metal nano island carrier in immunodetection
US9696307B2 (en) 2009-02-05 2017-07-04 Biogen Ma Inc. Methods for the detection of JC polyoma virus

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001505997A (en) * 1996-11-29 2001-05-08 ドイチェス・クレープスフォルシュングスツェントルム・シュティフトゥング・デス・エフェントリッヒェン・レヒツ Fluorescence correlation spectroscopy module for microscope
JP2002071567A (en) * 2000-07-21 2002-03-08 Iss (Usa) Inc Rapid high-throughput spectrometer and method
JP2003279566A (en) * 2002-03-20 2003-10-02 Olympus Optical Co Ltd Method for screening agent capable of bonding to receptor
JP2004361087A (en) * 2003-05-30 2004-12-24 Olympus Corp Biomolecule analyzer
JP2005283264A (en) * 2004-03-29 2005-10-13 Olympus Corp Fluorescent spectroscopic analyzer
JP2005538377A (en) * 2002-09-11 2005-12-15 シナメム コーポレイション Membrane-based assay
JP2006071611A (en) * 2004-09-06 2006-03-16 Hamamatsu Photonics Kk Fluorescence microscope, and fluorescence correlated spectroscopic analyzer
WO2006070941A1 (en) * 2004-12-28 2006-07-06 Tokyo University Of Science Novel screening method for substance using fluorescent molecular probe

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001505997A (en) * 1996-11-29 2001-05-08 ドイチェス・クレープスフォルシュングスツェントルム・シュティフトゥング・デス・エフェントリッヒェン・レヒツ Fluorescence correlation spectroscopy module for microscope
JP2002071567A (en) * 2000-07-21 2002-03-08 Iss (Usa) Inc Rapid high-throughput spectrometer and method
JP2003279566A (en) * 2002-03-20 2003-10-02 Olympus Optical Co Ltd Method for screening agent capable of bonding to receptor
JP2005538377A (en) * 2002-09-11 2005-12-15 シナメム コーポレイション Membrane-based assay
JP2004361087A (en) * 2003-05-30 2004-12-24 Olympus Corp Biomolecule analyzer
JP2005283264A (en) * 2004-03-29 2005-10-13 Olympus Corp Fluorescent spectroscopic analyzer
JP2006071611A (en) * 2004-09-06 2006-03-16 Hamamatsu Photonics Kk Fluorescence microscope, and fluorescence correlated spectroscopic analyzer
WO2006070941A1 (en) * 2004-12-28 2006-07-06 Tokyo University Of Science Novel screening method for substance using fluorescent molecular probe

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9696307B2 (en) 2009-02-05 2017-07-04 Biogen Ma Inc. Methods for the detection of JC polyoma virus
JP2011169834A (en) * 2010-02-19 2011-09-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen Method and system for detecting lipid vesicle derived from pathogenic gram-negative bacterium
CN102253023A (en) * 2011-06-03 2011-11-23 深圳市疾病预防控制中心 Sodium fluorescence probe detection method of ciguatoxin
CN103837676A (en) * 2014-03-20 2014-06-04 苏州纳达生物科技有限公司 Metal nano island carrier and preparation method thereof as well as application of metal nano island carrier in immunodetection
CN103837676B (en) * 2014-03-20 2016-08-17 苏州纳达生物科技有限公司 A kind of metal nano island carrier and preparation method thereof and the application in immune detection

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