JP2008228637A - Method for measuring amount of hydrogen peroxide by using fluorescence correlation spectrometry, and method for utilizing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、蛍光相関分光測定法を用いた過酸化水素量の測定方法に関する。本発明は、蛋白の定量法（例えばELISA、CLEIA）において、反応生成物である過酸化水素を定量することができる方法、特に、反応生成物である過酸化水素の量が微量であっても定量することができる高感度定量方法を提供するものである。本発明の過酸化水素の定量方法を用いることで、目的の蛋白の定量も可能となる。従って、本発明は、生化学研究分野、臨床検査分野、分子生物分野、分化・発生の基礎研究分野等で活用できる技術である。 The present invention relates to a method for measuring the amount of hydrogen peroxide using fluorescence correlation spectroscopy. The present invention is a method capable of quantifying hydrogen peroxide as a reaction product in a protein quantification method (for example, ELISA, CLEIA), and in particular, even if the amount of hydrogen peroxide as a reaction product is very small. The present invention provides a high-sensitivity quantitative method capable of quantitative determination. By using the method for quantifying hydrogen peroxide according to the present invention, the target protein can be quantified. Therefore, the present invention is a technique that can be utilized in the biochemical research field, the clinical laboratory field, the molecular biological field, the basic research field of differentiation and development, and the like.
蛋白の定量法として、例えばELISA、CLEIA等の酵素免疫測定法が汎用されている(非特許文献1、2)。これらの方法では、標的の蛋白質に対して特異的な酵素標識抗体を用い、これらを標的蛋白に特異的に結合させ、ELISAプレートへの非特異的な吸着物質を洗浄、除去した後、酵素反応を行うことで添加した基質と反応させ、産生される発色、発光を測定し、あるいは標的蛋白に対して特異的な蛍光標識抗体を用いELISAプレートへの非特異的な吸着物質を洗浄、除去した後、蛍光を測定している。これにより、標的の蛋白質の検出や定量をしている。この発色や発光反応には、多くの場合、標識酵素として西洋わさび（ホースラディッシュ）ペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはグルコースオキシダーゼ（GOD）を用い、これらの酵素を用いた反応で基質を分解定量する。発色反応において用いる基質は、反応前は無色または測定波長と違う波長に吸収を有する必要がある。一方、蛍光測定においては、非特異的に結合した蛍光やフリーに残存する蛍光を分離除去した後に、蛍光強度を測定する必要があった。
上記の酵素免疫測定法に関する従来技術では、高感度測定法としてラジオイムノアッセイ法が技術的に確立されている。しかし、現状の方法の感度は、10-16moles程度であり、これ以上の高感度化は、方法論としては技術的に不可能であると考えられ、検出装置の感度を上げることでさらなる高感度化が試みられている。しかし、検出装置の改良による高感度化では特別な施設が必要である。また、短寿命の核種を使用すれることでの高感度化もあり得るが、短寿命の核種を含む試薬は使用期限が極端に短く、時間の経過に伴って測定感度が急激に下がってしまう欠点があった。また、酵素免疫測定法は開発当初の比色法(10-13moles)から蛍光法、発光法へと高感度化(10-15moles)が進められ、専用測定装置も開発されているが、測定操作が簡便になっただけで、測定感度は限界がきている。 In the prior art relating to the enzyme immunoassay described above, a radioimmunoassay method is technically established as a highly sensitive measurement method. However, the sensitivity of the current method is about 10 -16 moles, and it is considered technically impossible to increase the sensitivity beyond this level. By increasing the sensitivity of the detection device, the sensitivity can be further increased. An attempt is being made. However, special facilities are required for high sensitivity by improving the detection device. In addition, high sensitivity can be achieved by using short-lived nuclides, but reagents containing short-lived nuclides have extremely short expiration dates, and the sensitivity of measurement decreases rapidly over time. There were drawbacks. In addition, the enzyme immunoassay has been improved from the original colorimetric method (10 -13 moles) to the fluorescence method and the luminescence method (10 -15 moles), and a dedicated measurement device has also been developed. The measurement sensitivity is limited only by the simple measurement operation.
また、上述の従来の免疫酵素測定法では、標的蛋白に特異的に結合した標識酵素である西洋わさび（ホースラディッシュ）ペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼやグルコースオキシダーゼ（GOD）活性を測定することで、標的蛋白を定量する。この方法では、抗原−抗体結合型と遊離型の分離（Ｂ／Ｆ分離）が必須である。また、蛍光を用いた検出法でも、抗原−抗体結合型と遊離型の分離（Ｂ／Ｆ分離）が必須である。 In addition, in the conventional immunoenzyme assay described above, the activity of horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, β-galactosidase, luciferase and glucose oxidase (GOD), which are labeled enzymes specifically bound to the target protein. By measuring, the target protein is quantified. In this method, separation between antigen-antibody binding type and free type (B / F separation) is essential. Further, even in the detection method using fluorescence, separation between antigen-antibody binding type and free type (B / F separation) is essential.
ところで、グルコースとＧＯＤ（グルコースオキシダーゼ）を用いた反応系において、過酸化水素が発生する。ペルオキシダーゼの存在下で、この過酸化水素とＡｍｐｌｅｘTM Ｒｅｄを反応させると、非蛍光のＡｍｐｌｅｘTM Ｒｅｄが強い蛍光をもつレゾルフィンに変換し、その蛍光量からグルコース量やＧＯＤの活性測定が可能と考えられる。しかし、ＡｍｐｌｅｘTM Ｒｅｄのように反応前には蛍光が無いかまたは蛍光が弱い基質は、多くは存在せず、多くの蛍光色素は反応前にも蛍光を発する場合が多い。非特許文献３に記載されているように、ＡｍｐｌｅｘTM Ｒｅｄ Ａｓｓａｙキットによる酵素免疫測定法はあったが、RIA法を凌駕する感度は得られていない。 By the way, hydrogen peroxide is generated in a reaction system using glucose and GOD (glucose oxidase). When this hydrogen peroxide is reacted with Amplex ™ Red in the presence of peroxidase, non-fluorescent Amplex ™ Red is converted to resorufin having strong fluorescence, and the amount of glucose and GOD activity can be measured from the amount of fluorescence. It is done. However, there are not many substrates such as Amplex ™ Red that have no fluorescence or weak fluorescence before the reaction, and many fluorescent dyes often fluoresce before the reaction. As described in Non-Patent Document 3, there was an enzyme immunoassay method using the Amplex ™ Red Assay kit, but the sensitivity exceeding the RIA method was not obtained.
尚、過酸化水素の定量方法としては、過酸化水素電極を用いる方法や過酸化水素をカタラーゼで酸素と水に分解し、生成する酸素を酸素電極で測定する方法などが知られている。（非特許文献４、特許文献１） As a method for determining hydrogen peroxide, a method using a hydrogen peroxide electrode, a method in which hydrogen peroxide is decomposed into oxygen and water by catalase, and the generated oxygen is measured by an oxygen electrode are known. (Non-patent document 4, Patent document 1)
しかし、いずれも微量の過酸化水素の定量には不向きであり、微量の過酸化水素の定量には上記Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔのような蛍光測定法が用いられている。しかし、蛍光として特殊なもの（反応前は無蛍光で、反応後にだけ蛍光を発する蛍光色素）しか使えないという欠点があった。 However, both are unsuitable for the determination of a trace amount of hydrogen peroxide, and a fluorescence measurement method such as the above Amplex (registered trademark) Red Assay Kit is used for the determination of a trace amount of hydrogen peroxide. However, there is a drawback that only a special fluorescent substance (fluorescent dye that is non-fluorescent before reaction and emits fluorescence only after reaction) can be used.
そこで本発明は、Ｂ／Ｆ分離の必要がなく、しかも、従来と同程度の感度を有する、あるいはそれ以上の高感度化も可能な、蛋白の測定法に利用できる過酸化水素の定量方法を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention provides a method for quantifying hydrogen peroxide that can be used in a protein measurement method that does not require B / F separation and that has the same level of sensitivity as that of the prior art or that can achieve higher sensitivity. The purpose is to provide.
本発明者らは、蛍光相関分光法に注目し、蛍光相関分光法によって、B/F分離が不要で、過酸化水素を従来と同程度以上の高い感度で定量できる方法を提供すべく種々検討した。 The present inventors have paid attention to fluorescence correlation spectroscopy, and various studies have been conducted to provide a method capable of quantifying hydrogen peroxide with high sensitivity equal to or higher than that of the prior art without the need for B / F separation by fluorescence correlation spectroscopy. did.
蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy，以下FCS）は溶液中の蛍光分子のブラウン運動を利用して分子の数と分子の大きさ，または形といった物理量を測定する方法である。FCSの基本的な特徴は顕微鏡視野下の極微少領域における平均数個の蛍光分子のブラウン運動に由来する蛍光発光の「ゆらぎ」を通して，いわゆる均一溶液に含まれる蛍光分子の濃度や分子間相互作用を，物理的な分離過程を経ずに，しかもほぼ実時間でモニターできることである。そのため単一分子検出法の一つとして数えられている。このようにFCSは、単一分子検出法であり、特定の蛍光分子の濃度を測定することができる（非特許文献５）。 Fluorescence Correlation Spectroscopy (hereinafter FCS) is a method for measuring physical quantities such as the number of molecules and the size or shape of molecules using the Brownian motion of fluorescent molecules in a solution. The basic feature of FCS is the concentration of fluorescent molecules in the so-called homogeneous solution and the intermolecular interaction through “fluctuation” of fluorescence emission derived from the Brownian motion of an average of several fluorescent molecules in a very small region under the microscope field. Can be monitored in real time without going through a physical separation process. Therefore, it is counted as one of the single molecule detection methods. Thus, FCS is a single molecule detection method and can measure the concentration of a specific fluorescent molecule (Non-Patent Document 5).
このようなＢ／Ｆ分離を必要としないFCSを過酸化水素の定量に利用する方法として、生成する過酸化水素が触媒するチラミド転移反応によりキャリア高分子に蛍光色素を結合させ、その高分子に結合した蛍光色素の蛍光量を未反応のチラミド色素とB/F分離することなく測定することが可能であることを見いだし、さらには、産生された過酸化水素量、ひいては反応溶液中の目的の蛋白量の定量を可能であることを見いだして本発明を完成させた。 As a method of using FCS that does not require such B / F separation for the determination of hydrogen peroxide, a fluorescent dye is bound to a carrier polymer by a tyramide transfer reaction catalyzed by the generated hydrogen peroxide. We found that it was possible to measure the fluorescence amount of the bound fluorescent dye without B / F separation from the unreacted tyramide dye, and further, the amount of hydrogen peroxide produced and, consequently, the target in the reaction solution. The present invention was completed by finding that the amount of protein can be quantified.
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
［１］蛍光標識したチラミドとフェノール基を有するキャリア物質とを過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で反応させて、生成する蛍光標識を有する反応生成物の量を、蛍光相関分光測定法を用いて測定することにより、前記過酸化水素の量を測定する方法。
［２］蛍光標識物質は、Rhodamine Green、Alexa488、GFP (green fluorescent protein)、YOYO1、TAMRA（carboxytetramethylrhodamine）、TMR(tetramethylrhodamine)、EVOblueTM, またはAlexa647である［１］に記載の方法。
［３］キャリア物質は、分子量が1kDa〜400kDaの範囲の物質である［１］または［２］に記載の方法。
［４］キャリア物質は、分子量が10ｋDa〜100ｋDaの範囲の物質である［１］または［２］に記載の方法。
［５］キャリア物質は、チロシン残基を有する物質であって、キャリア物質が有するフェノール基は、前記チロシン残基に由来するものである［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］チロシン残基を有する物質は、チロシン残基を有するタンパク質またはペプチドである［５］に記載の方法。
［７］キャリア物質は、ウシ血清アルブミン（分子量約64kDa）である［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］過酸化水素は、酸化還元酵素によって生成されたものである［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］酸化還元酵素は、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アシルCoAオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グリセロール‐3‐リン酸オキシダーゼ、グリセリロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、NADHオキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である［８］に記載の方法。
［１０］ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、チトクロームP450、ミクロペルオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］過酸化水素は、ヒドロキシラジカル分子により非酵素反応的に生成されたものである［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［１２］蛍光標識を有する反応生成物を、未反応の蛍光標識したチラミドと分離すること無しに蛍光相関分光測定法により測定する［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］グルコースにグルコースオキシダーゼを作用させて生成した過酸化水素の量を、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法により測定することを含む、グルコース濃度の測定方法。
［１４］グルコースにグルコースオキシダーゼを作用させて生成した過酸化水素の量を、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法により測定することを含む、グルコースオキシダーゼの活性測定方法。
The present invention for solving the above problems is as follows.
[1] Fluorescently labeled tyramide and a carrier substance having a phenol group are reacted in the presence of hydrogen peroxide and peroxidase, and the amount of the reaction product having the fluorescent label to be generated is measured using fluorescence correlation spectroscopy. A method of measuring the amount of hydrogen peroxide by measuring.
[2] The method according to [1], wherein the fluorescent labeling substance is Rhodamine Green, Alexa488, GFP (green fluorescent protein), YOYO1, TAMRA (carboxytetramethylrhodamine), TMR (tetramethylrhodamine), EVOblue ™ , or Alexa647.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the carrier substance is a substance having a molecular weight in the range of 1 kDa to 400 kDa.
[4] The method according to [1] or [2], wherein the carrier substance is a substance having a molecular weight in the range of 10 kDa to 100 kDa.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the carrier substance is a substance having a tyrosine residue, and the phenol group that the carrier substance has is derived from the tyrosine residue.
[6] The method according to [5], wherein the substance having a tyrosine residue is a protein or peptide having a tyrosine residue.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the carrier substance is bovine serum albumin (molecular weight: about 64 kDa).
[8] The method according to any one of [1] to [7], wherein hydrogen peroxide is produced by an oxidoreductase.
[9] The oxidoreductase is glucose oxidase, cholesterol oxidase, alcohol oxidase, acyl CoA oxidase, amino acid oxidase, choline oxidase, lactate oxidase, pyruvate oxidase, glycerol-3-phosphate oxidase, glyceryl oxidase, sarcosine oxidase, The method according to [8], which is at least one enzyme selected from the group consisting of bilirubin oxidase, NADH oxidase, uricase, xanthine oxidase, tyramine oxidase, galactose oxidase, histamine oxidase, and superoxide dismutase.
[10] The method according to any one of [1] to [9], wherein the peroxidase is at least one enzyme selected from the group consisting of horseradish peroxidase (HRP), cytochrome P450, microperoxidase, and manganese peroxidase.
[11] The method according to any one of [1] to [7], wherein the hydrogen peroxide is generated non-enzymatically by hydroxy radical molecules.
[12] The method according to any one of [1] to [11], wherein the reaction product having a fluorescent label is measured by fluorescence correlation spectroscopy without separation from unreacted fluorescently labeled tyramide.
[13] A method for measuring glucose concentration, comprising measuring the amount of hydrogen peroxide produced by allowing glucose oxidase to act on glucose by the method according to any one of [1] to [12].
[14] A method for measuring glucose oxidase activity, comprising measuring the amount of hydrogen peroxide produced by allowing glucose oxidase to act on glucose by the method according to any one of [1] to [12].
本発明によれば、B/F分離の必要がなく、しかも、従来と同程度の感度を有する、あるいはそれ以上の高感度化も可能な、蛋白の測定法に利用できる過酸化水素の定量方法を提供することができる。 According to the present invention, there is no need for B / F separation, and the method for quantifying hydrogen peroxide that can be used in a protein measurement method that has the same level of sensitivity as that of the prior art or that can achieve higher sensitivity. Can be provided.
蛍光相関分光測定機による蛍光強度測定法を用い、チラミド化蛍光色素を組み合わせることに定量的に過酸化水素を簡便に定量することが可能となった。従来のELISAやCLEIAの測定法において西洋わさびペルオキシダーゼやグルコースオキシダーゼ活性を発色反応や発光反応で産生されたシグナルを測定して標的蛋白の検出をしていたが、本法では反応系で産生される過酸化水素を直接測定することにより標的蛋白の検出することができるようになった。 Using a fluorescence intensity measurement method with a fluorescence correlation spectrometer, hydrogen peroxide can be quantified simply and quantitatively by combining tyramided fluorescent dyes. In the conventional ELISA and CLEIA measurement methods, horseradish peroxidase and glucose oxidase activities were detected by measuring the signal produced by the color development reaction or luminescence reaction, and the target protein was detected. The target protein can be detected by directly measuring hydrogen peroxide.
本発明は、蛍光標識したチラミドとフェノール基を有するキャリア物質とを過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で反応させて、生成する蛍光を有する反応生成物の量を、蛍光相関分光測定法を用いて測定することにより、前記過酸化水素の量を測定する方法に関する。 In the present invention, fluorescence-labeled tyramide is reacted with a carrier substance having a phenol group in the presence of hydrogen peroxide and peroxidase, and the amount of the reaction product having fluorescence generated is measured using fluorescence correlation spectroscopy. The present invention relates to a method for measuring the amount of hydrogen peroxide by measuring.
[蛍光標識したチラミド]
本発明では蛍光標識したチラミドを用いる。蛍光標識は、蛍光相関分光測定法に用いることができ、チラミドに標識できる物質であれば、特に制限なく使用することができる。そのような蛍光標識物質としては、例えば、Rhodamine Green、 Alexa488、GFP (green fluorescent protein)、YOYO1 (dimer of oxazole yellow)、TAMRA（carboxytetramethylrhodamine）、TMR(methylrhodamine)、EVOblueTM、Alexa647 等を挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。
[Fluorescently labeled tyramide]
In the present invention, fluorescently labeled tyramide is used. The fluorescent label can be used for fluorescence correlation spectroscopy, and any substance that can label tyramide can be used without particular limitation. Examples of such fluorescent labeling substances include Rhodamine Green, Alexa488, GFP (green fluorescent protein), YOYO1 (dimer of oxazole yellow), TAMRA (carboxytetramethylrhodamine), TMR (methylrhodamine), EVOblue ™ , Alexa647, and the like. it can. However, it is not the intention limited to these.
蛍光標識物質のチラミドへの標識は、公知の方法により行うことができる。例えば、ＴＡＭＲＡをチラミドに標識する（TAMRAにチラミド結合させる）には、例えば、ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解したTAMRA NHSエステルとDMT−TEAに溶解したチラミドを反応させることによりTAMRA-チラミドを合成させることができる。 The labeling of the fluorescent labeling substance to tyramide can be performed by a known method. For example, to label TAMRA with tyramide (to bind TAMRA to tyramide), for example, TAMRA-tyramide is synthesized by reacting TAMRA NHS ester dissolved in dimethylformamide (DMF) with tyramide dissolved in DMT-TEA. be able to.
蛍光標識したチラミドは、市販品としても入手可能である。市販品の具体例としては以下のものを挙げることができる。
モレキュラープローブ社：
Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647
Fluorescently labeled tyramide is also available as a commercial product. Specific examples of commercially available products include the following.
Molecular Probe:
Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647
パーキンエルマー社：
NEL741 TSA Plus Fluorescein System
NEL742 TSA Plus TMR System
NEL744 TSA Plus Cyanine 3 System
NEL745 TSA Plus Cyanine 5 System
PerkinElmer:
NEL741 TSA Plus Fluorescein System
NEL742 TSA Plus TMR System
NEL744 TSA Plus Cyanine 3 System
NEL745 TSA Plus Cyanine 5 System
[フェノール基を有するキャリア物質]
本発明では、フェノール基を有するキャリア物質を用いる。本発明の方法で利用するペルオキシダーゼによる反応は、その一例を以下に示す通り、蛍光標識したチラミドとフェノール基を有するキャリア物質との反応である。この反応において、チラミドは、フェノール基と反応する。従って、キャリア物質は、フェノール基を有するものである。
[Carrier substance having phenol group]
In the present invention, a carrier substance having a phenol group is used. The reaction by peroxidase used in the method of the present invention is a reaction between a fluorescently labeled tyramide and a carrier substance having a phenol group, as shown in the following. In this reaction, tyramide reacts with a phenol group. Accordingly, the carrier material has a phenol group.
フェノール基は、パラ位にOH基を有し、OH基以外の置換基を有さないものであることが、チラミドとの反応を良好に実施するためには好ましい。 The phenol group preferably has an OH group at the para position and does not have a substituent other than the OH group in order to satisfactorily carry out the reaction with tyramide.
フェノール基を有するキャリア物質は、チロシン残基を有するタンパク質またはペプチドであることが、入手及び調製が容易であるという観点から好ましい。従って、この場合、キャリア物質が有するフェノール基は、チロシン残基に由来するものである。但し、タンパク質またはペプチド以外に由来するチロシン残基を有する物質を、フェノール基を有するキャリア物質として用いることを妨げる意図ではない。フェノール基を有するキャリア物質は、チロシン残基を有する物質であることができ、チロシン残基を有する物質は、タンパク質及びペプチドであっても、それ以外のチロシン残基を有する物質であってもよい。 The carrier substance having a phenol group is preferably a protein or peptide having a tyrosine residue from the viewpoint of easy availability and preparation. Therefore, in this case, the phenol group of the carrier substance is derived from a tyrosine residue. However, it is not intended to prevent the use of a substance having a tyrosine residue derived from other than a protein or peptide as a carrier substance having a phenol group. The carrier substance having a phenol group can be a substance having a tyrosine residue, and the substance having a tyrosine residue can be a protein and a peptide or a substance having another tyrosine residue. .
フェノール基を有するキャリア物質は、分子量が約1kDa〜400kDa、より好ましくは約10kDa〜100kDaの範囲の物質であることが適当である。本発明の方法では、後述のように、蛍光標識を有する反応生成物を、未反応の蛍光標識したチラミドと分離すること無しに蛍光相関分光測定法(FCS)により測定する。FCS特有の性質として、蛍光標識を有する反応生成物と蛍光標識したチラミドの分子量サイズに一定以上の相違があることで、蛍光標識を有する反応生成物のみを選択的に計測できる。そのため、蛍光標識を有する反応生成物は、蛍光標識したチラミドより、分子量サイズが、約8倍以上、より好ましくは約10倍以上大きいことが好ましい。 The carrier material having a phenol group is suitably a material having a molecular weight in the range of about 1 kDa to 400 kDa, more preferably about 10 kDa to 100 kDa. In the method of the present invention, as described later, a reaction product having a fluorescent label is measured by fluorescence correlation spectroscopy (FCS) without being separated from unreacted fluorescently labeled tyramide. As a property peculiar to FCS, since there is a certain difference in molecular weight size between the reaction product having a fluorescent label and the tyramide fluorescently labeled, only the reaction product having the fluorescent label can be selectively measured. Therefore, the reaction product having a fluorescent label preferably has a molecular weight size of about 8 times or more, more preferably about 10 times or more larger than that of fluorescently labeled tyramide.
蛍光標識したチラミドの分子量は、蛍光標識物質の分子量により変化するが、これらを総合的に勘案すると、フェノール基を有するキャリア物質の分子量は、上記のように約1kDa〜400kDaの範囲とすることが好ましい。より好ましくは約10kDa〜100kDaの範囲である。 The molecular weight of the fluorescently labeled tyramide varies depending on the molecular weight of the fluorescently labeled substance, but considering these comprehensively, the molecular weight of the carrier substance having a phenol group may be in the range of about 1 kDa to 400 kDa as described above. preferable. More preferably, it is in the range of about 10 kDa to 100 kDa.
チロシン残基を有する物質が、チロシン残基を有するタンパク質またはペプチドである場合、そのようなタンパク質及びペプチドの一例として、ウシ血清アルブミン(分子量約64ｋDa)を挙げることができる。ウシ血清アルブミンは市販品を入手可能であり、ウシ血清からの精製方法や精製度により、多くの種類の試薬として販売されている。また、ウシ血清アルブミン以外の、ヒト、ウサギ、マウス、ヤギ、ニワトリ、モルモット等由来の血清アルブミンもチロシン残基を有するタンパク質またはペプチドとして同様に使用することができる。 When the substance having a tyrosine residue is a protein or peptide having a tyrosine residue, an example of such a protein or peptide is bovine serum albumin (molecular weight of about 64 kDa). Bovine serum albumin is commercially available and is sold as many types of reagents depending on the purification method and degree of purification from bovine serum. In addition to bovine serum albumin, serum albumin derived from humans, rabbits, mice, goats, chickens, guinea pigs, and the like can be similarly used as a protein or peptide having a tyrosine residue.
チロシン残基を有する物質は、チロシン残基を導入したタンパク質またはペプチドであることもできる。チロシン残基を導入したタンパク質としては、例えば、チロシン残基を導入したウシ血清アルブミンを挙げることができる。チロシン残基を導入したウシ血清アルブミンとしては、例えば、パラハイドロキシフェニルプロピオニル化ウシ血清アルブミンを挙げることができる。 The substance having a tyrosine residue can also be a protein or peptide into which a tyrosine residue is introduced. Examples of the protein into which a tyrosine residue has been introduced include bovine serum albumin into which a tyrosine residue has been introduced. Examples of bovine serum albumin into which a tyrosine residue has been introduced include parahydroxyphenylpropionylated bovine serum albumin.
パラハイドロキシフェニルプロピオニル化ウシ血清アルブミンは、ウシ血清アルブミンにさらに、パラハイドロキシフェニル基を導入する目的で、パラハイドロキシフェニルプロピオニル化したものである。パラハイドロキシフェニルプロピオニル化ウシ血清アルブミンは、ボルトンハンター試薬を使いBSAのアミノ基にパラハイドロキシフェニルプロピオニル基を導入することで調製できる。パラハイドロキシフェニル基の導入量は、パラハイドロキシフェニル基の導入によって、変化するチラミドとの反応性を考慮して適宜決定できる。パラハイドロキシフェニル基の導入量は、反応条件、特に、パラハイドロキシフェニルプロピオニル基の原料となるボルトンハンター試薬とウシ血清アルブミンとの比率を調整することで、変化させることができる。ボルトンハンター試薬によるパラハイドロキシフェニルプロピオニル基の導入は、ウシ血清アルブミンに限らず、アミノ基を有する物質であれば適用できる。 Parahydroxyphenylpropionylated bovine serum albumin is parahydroxyphenylpropionylated for the purpose of further introducing a parahydroxyphenyl group into bovine serum albumin. Parahydroxyphenylpropionylated bovine serum albumin can be prepared by introducing a parahydroxyphenylpropionyl group into the amino group of BSA using a Bolton Hunter reagent. The introduction amount of the parahydroxyphenyl group can be appropriately determined in consideration of the reactivity with tyramide that changes due to the introduction of the parahydroxyphenyl group. The amount of the parahydroxyphenyl group introduced can be changed by adjusting the reaction conditions, particularly the ratio of the Bolton Hunter reagent and bovine serum albumin, which are the raw materials for the parahydroxyphenylpropionyl group. The introduction of the parahydroxyphenylpropionyl group by the Bolton Hunter reagent is not limited to bovine serum albumin, and any substance having an amino group can be applied.
[過酸化水素]
本発明の方法は、前記化学式からも分かるように、反応系中に存在する過酸化水素の量を、蛍光標識を有する反応生成物の量を介して測定するものであり、過酸化水素の起源は、特に限定されない。但し、本発明の方法は、微量(例えば、約20ｎM〜200ｎM)の範囲の濃度の過酸化水素の定量に適している。但し、この範囲に限定される意図ではない。そのような観点から、グルコースオキシダーゼ等の酵素の反応により生成した微量の過酸化水素の定量に特に適している。酵素の反応により微量の過酸化水素が生成する系は、特に限定はされないが、例えば、過酸化水素が酸化還元酵素によって生成される系であることができる。さらに、上記酸化還元酵素は、例えば、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アシルCoAオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グリセロール−3−リン酸オキシダーゼ、グリセリロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、NADHオキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ヒスタミンオキシダーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素であることができる。さらに、過酸化水素は、ヒドロキシラジカル分子により非酵素反応的に生成されたものであることもできる。
[hydrogen peroxide]
As can be seen from the above chemical formula, the method of the present invention measures the amount of hydrogen peroxide present in the reaction system via the amount of reaction product having a fluorescent label. Is not particularly limited. However, the method of the present invention is suitable for the determination of hydrogen peroxide at a concentration in the range of a trace amount (for example, about 20 nM to 200 nM). However, it is not intended to be limited to this range. From such a viewpoint, it is particularly suitable for the determination of a trace amount of hydrogen peroxide generated by the reaction of an enzyme such as glucose oxidase. The system in which a trace amount of hydrogen peroxide is generated by the reaction of the enzyme is not particularly limited. For example, the system can be a system in which hydrogen peroxide is generated by an oxidoreductase. Further, the oxidoreductase includes, for example, glucose oxidase, cholesterol oxidase, alcohol oxidase, acyl CoA oxidase, amino acid oxidase, choline oxidase, lactate oxidase, pyruvate oxidase, glycerol-3-phosphate oxidase, glyceryl oxidase, sarcosine. It can be at least one enzyme selected from the group consisting of oxidase, bilirubin oxidase, NADH oxidase, uricase, xanthine oxidase, tyramine oxidase, galactose oxidase, histamine oxidase and superoxide dismutase. Furthermore, hydrogen peroxide can also be generated non-enzymatically by hydroxy radical molecules.
酵素の反応により微量の過酸化水素が生成する系としては、例えば、以下のものを挙げることができる。 Examples of the system in which a trace amount of hydrogen peroxide is generated by the enzyme reaction include the following.
１）
グルコース + O2 + H2O（グルコースオキシダーゼ）→ グルコン酸 + H2O2
1)
Glucose + O 2 + H 2 O (glucose oxidase) → Gluconic acid + H 2 O 2
２）
コレステロールエステル＋ H2O（コレストロールエステラーゼ）→ コレステロール ＋ 脂肪酸
2)
Cholesterol ester + H 2 O (cholesterol esterase) → Cholesterol + Fatty acid
コレストロール + O2（コレストロールエステラーゼ）→ Δ4−コレステノン ＋ H2O2 Cholesterol + O 2 (cholesterol esterase) → Δ4-cholestenone + H 2 O 2
３）
アルコール + O2 ＋ H2O（アルコールオキシダーゼ）→ HCHO + H2O2
3)
Alcohol + O 2 + H 2 O (alcohol oxidase) → HCHO + H 2 O 2
４）
Acyl-CoA + O2 (アシルCoAオキシダーゼ）→ enoyl-CoA + H2O2
4)
Acyl-CoA + O 2 (acyl CoA oxidase) → enoyl-CoA + H 2 O 2
5)
アミノ酸 + O2 +H2O (アミノ酸オキシダーゼ）→ 2オキソ酸 + NH3 + H2O2
Five)
Amino acid + O 2 + H 2 O (amino acid oxidase) → 2 oxo acid + NH 3 + H 2 O 2
６）
コリン + H2O + 2O2（コリンオキシダーゼ）→ ベタイン + 2H2O2
6)
Choline + H 2 O + 2O 2 (choline oxidase) → Betaine + 2H 2 O 2
７）
乳酸 +O2（乳酸オキシダーゼ）→ ピルビン酸 + H2O2
7)
Lactic acid + O 2 (lactate oxidase) → Pyruvate + H 2 O 2
８）
ピルビン酸+ Pi + O2（ピリビン酸オキシダーゼ）→ アセチルホスフェート + CO2 + H2O2
8)
Pyruvate + Pi + O 2 (pyruvate oxidase) → Acetyl phosphate + CO 2 + H 2 O 2
９）
グリセロール-3-リン酸 + O2（グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ）→ ジヒドロアセトン3リン酸 + H2O2
9)
Glycerol-3-phosphate + O 2 (glycerol-3-phosphate oxidase) → Dihydroacetone triphosphate + H 2 O 2
１０）
グリセロール + O2（グリセロールオキシダーゼ）→ ジヒドロアセトン + H2O2
10)
Glycerol + O 2 (glycerol oxidase) → Dihydroacetone + H 2 O 2
１１）
ザルコシン + H2O + 2O2（ザルコシンオキシダーゼ）→ グリシン+ホルムアルデヒド + H2O2
11)
Sarcosine + H 2 O + 2O 2 (sarcosine oxidase) → glycine + formaldehyde + H 2 O 2
1２）
2ビリルビン + O2（ビリルビンオキシダーゼ）→ 2ビリベルジン + H2O2
12)
2 bilirubin + O 2 (bilirubin oxidase) → 2 biliverdin + H 2 O 2
１３）（NADHオキシダーゼ）
2NADH + H2 + 2O2（NADHオキシダーゼ）→ 2NAD + 2H2O2
13) (NADH oxidase)
2NADH + H 2 + 2O 2 (NADH oxidase) → 2NAD + 2H 2 O 2
１４）
尿酸 + H2O + O2（ウリカーゼ）→ アラントイン + CO2 + H2O2
14)
Uric acid + H 2 O + O 2 (uricase) → Allantoin + CO 2 + H 2 O 2
1５）
キサンチン + H2O + O2（キサンチンオキシダーゼ）→ 尿酸 + H2O2
15)
Xanthine + H 2 O + O 2 (xanthine oxidase) → uric acid + H 2 O 2
１６）
RCH2NH2 + H2O + O2（チラミンオキシダーゼ）→ RCHO + NH3 + H2O2
16)
RCH 2 NH 2 + H 2 O + O 2 (tyramine oxidase) → RCHO + NH 3 + H 2 O 2
１７）
ガラクトース +H2O + O2（ガラクトースオキシダーゼ）→ ガラクトヘキソジアルドース + H2O2
17)
Galactose + H 2 O + O 2 (galactose oxidase) → Galactohexodialdose + H 2 O 2
１８）
ヒスタミン + H2O + O2（ヒスタミンオキシダーゼ）→ イミダゾールアセトアルデヒド + NH3 + H2O2
18)
Histamine + H 2 O + O 2 (histamine oxidase) → Imidazoleacetaldehyde + NH 3 + H 2 O 2
１９）
・O2 - + ・O2 - +２H+（スーパーオキシドジスムターゼ）→ O2 + H2O2
19)
・ O 2 − + ・ O 2 − + 2H + (superoxide dismutase) → O 2 + H 2 O 2
２０）
・OH ＋ ・OH → H2O2
20)
・ OH + ・ OH → H 2 O 2
グルコースオキシダーゼにより過酸化水素が生成する系の利用例としては、上記１）に示す、グルコースにグルコースオキシダーゼを作用させて生成した過酸化水素の量を、本発明の方法により測定することを含む、グルコース濃度の測定方法を挙げることができる。 Examples of the use of a system in which hydrogen peroxide is generated by glucose oxidase include measuring the amount of hydrogen peroxide generated by allowing glucose oxidase to act on glucose by the method of the present invention as shown in 1) above. A measuring method of glucose concentration can be mentioned.
また、グルコースオキシダーゼにより過酸化水素が生成する系の別の利用例としては、上記１）に示す、グルコースにグルコースオキシダーゼを作用させて生成した過酸化水素の量を、本発明の方法により測定することを含む、グルコースオキシダーゼの活性測定方法を挙げることができる。 Further, as another example of a system in which hydrogen peroxide is generated by glucose oxidase, the amount of hydrogen peroxide generated by allowing glucose oxidase to act on glucose as shown in 1) above is measured by the method of the present invention. And the method for measuring the activity of glucose oxidase.
さらに、過酸化水素が生成する系の利用例としては、上記反応により基質と酵素を組み合わせて生成した過酸化水素の量を、本発明の方法により測定することを含む、基質濃度の測定またはその酵素活性の測定法に利用できる。例えば、従来のELISA法の検出方法における、過酸化水素を測定する系（例えば、グルコースオキシダーゼ系またはビオチンラベルしたグルコースオキシダーゼの発色またはルシフェラーゼの化学発光の系）にも、本発明の方法は利用できる。即ち、標識酵素としてグルコースオキシダーゼを使用するELISA法において、前記反応系１）で示す反応により、生成する過酸化水素を本発明の方法を用いて測定することができる。このELISA法における測定対象は特に制限はないが、標識酵素で標識した抗体によって特異的に認識される物質であり、例えば、タンパク質等の抗原性物質を挙げることができる。抗原性物質としては、タンパク質以外に例えば、ダイオキシン、ＰＣＮＢ、農薬、糖鎖等を挙げることができる。尚、ELISA法に用いる過酸化水素を生成する酵素は、グルコースオキシダーゼに限らず、過酸化水素を生成する前述した種々の酵素であることができる。 Furthermore, as an application example of a system in which hydrogen peroxide is generated, measurement of the substrate concentration or measurement thereof including measuring the amount of hydrogen peroxide generated by combining the substrate and the enzyme by the above reaction by the method of the present invention. It can be used for measuring enzyme activity. For example, the method of the present invention can also be used in a system for measuring hydrogen peroxide (for example, a glucose oxidase system or a biotin-labeled glucose oxidase color development or luciferase chemiluminescence system) in a conventional ELISA detection method. . That is, in an ELISA method using glucose oxidase as a labeling enzyme, hydrogen peroxide produced by the reaction shown in the reaction system 1) can be measured using the method of the present invention. The measurement target in this ELISA method is not particularly limited, but is a substance that is specifically recognized by an antibody labeled with a labeling enzyme, and examples thereof include antigenic substances such as proteins. Examples of antigenic substances include dioxins, PCNB, agricultural chemicals, sugar chains and the like in addition to proteins. In addition, the enzyme which produces | generates hydrogen peroxide used for ELISA method can be not only glucose oxidase but various enzymes mentioned above which produce | generate hydrogen peroxide.
また、過酸化水素が生成する系の利用例としては、過酸化水素を測定することを利用した核酸の定量方法を挙げることもできる。この方法は、例えば、グルコースオキシダーゼを固定化した核酸またはグルコースオキシダーゼを固定化した核酸プローブとハイブリダイズした核酸配列の存在量を、固定化されたグルコースオキシダーゼによる過酸化水素の生成を測定することで、定量するものである。グルコースオキシダーゼの核酸または核酸プローブへの固定化は、公知の手段を適宜用いることができるが、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン−ビオチンの系を用いて行うことができる。アビジンまたはストレプトアビジン−ビオチンの系を用いる場合は、例えば、ビオチン化ｄＵＴＰを用いてビオチン化した核酸または核酸プローブを調製し、アビジンまたはストレプトアビジン化したグルコースオキシダーゼを調製し、これらを混合することができる。固定化する酵素としては、グルコースオキシダーゼに限らず、過酸化水素を生成する前述した種々の酵素を用いることができる。 Examples of the use of a system in which hydrogen peroxide is generated include a nucleic acid quantification method using measurement of hydrogen peroxide. In this method, for example, the abundance of a nucleic acid sequence hybridized with a nucleic acid immobilized with glucose oxidase or a nucleic acid probe immobilized with glucose oxidase is measured by measuring the production of hydrogen peroxide by the immobilized glucose oxidase. Quantify. For immobilization of glucose oxidase on a nucleic acid or nucleic acid probe, known means can be used as appropriate. For example, avidin or streptavidin-biotin system can be used. When using avidin or streptavidin-biotin system, for example, biotinylated nucleic acid or nucleic acid probe is prepared using biotinylated dUTP, avidin or streptavidinated glucose oxidase is prepared and mixed. it can. The enzyme to be immobilized is not limited to glucose oxidase, and various enzymes described above that generate hydrogen peroxide can be used.
[ペルオキシダーゼ]
本発明では、ペルオキシダーゼを用いる。このペルオキシダーゼは、蛍光標識したチラミドとフェノール基を有するキャリア物質とを過酸化水素の存在下で反応させることができるものであれば、特に制限はない。ペルオキシダーゼは、ヘム酵素群であり、例えば、以下のものを挙げることができる。ペルオキシダーゼとしては、動物・植物・微生物界に広く分布する酵素の一種で、西洋ワサビ・酵母・甲状腺・唾液・牛乳・小腸粘膜・白血球・赤血球などの中に存在するものが挙げられる。ペルオキシダーゼは、具体的には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、チトクロームP450、ミクロペルオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素であることができる。本発明では特に植物にしか存在しない西洋ワサビペルオキシダーゼを用いることが好ましい。
[Peroxidase]
In the present invention, peroxidase is used. The peroxidase is not particularly limited as long as it can react a fluorescently labeled tyramide with a carrier substance having a phenol group in the presence of hydrogen peroxide. Peroxidase is a heme enzyme group, and examples thereof include the following. Peroxidase is a kind of enzyme widely distributed in animals, plants, and microorganisms, and includes those present in horseradish, yeast, thyroid, saliva, milk, small intestinal mucosa, leukocytes, erythrocytes and the like. Specifically, the peroxidase can be at least one enzyme selected from the group consisting of horseradish peroxidase (HRP), cytochrome P450, microperoxidase, and manganese peroxidase. In the present invention, it is particularly preferable to use horseradish peroxidase that exists only in plants.
[反応]
本発明におけるペルオキシダーゼにより触媒される反応は、下記に示すように、蛍光標識したチラミドとフェノール基を有するキャリア物質とを過酸化水素の存在下で反応させて、蛍光標識を有する反応生成物を生成するものである。
In the reaction catalyzed by peroxidase in the present invention, as shown below, a fluorescently labeled tyramide and a carrier substance having a phenol group are reacted in the presence of hydrogen peroxide to produce a reaction product having a fluorescent label. To do.
この反応は、使用する蛍光標識したチラミド、フェノール基を有するキャリア物質、ペルオキシダーゼの種類やこれらの物質の濃度及び過酸化水素の濃度に応じて、その条件は適宜決定できる。反応温度は、室温(例えば、約10〜30℃、好ましくは約15〜25℃)とすることが適当である。但し、ペルオキシダーゼが有する至適温度によっては、より低温またはより高温で実施することもできる。蛍光標識したチラミド、フェノール基を有するキャリア物質、及びペルオキシダーゼの使用量(濃度)は、例えば、以下のようにすることができる。但し、これらの範囲は例示であって、反応条件等を考慮して、適宜変更可能である。
蛍光標識したチラミド: 1nM〜10nM
フェノール基を有するキャリア物質: 1ug/ml〜1mg/ml
ペルオキシダーゼ: 0.1U/ml〜10U/ml
The conditions of this reaction can be determined as appropriate depending on the fluorescently labeled tyramide used, the carrier substance having a phenol group, the type of peroxidase, the concentration of these substances, and the concentration of hydrogen peroxide. The reaction temperature is suitably room temperature (for example, about 10 to 30 ° C., preferably about 15 to 25 ° C.). However, depending on the optimum temperature of the peroxidase, it can be carried out at a lower temperature or a higher temperature. The usage amount (concentration) of fluorescently labeled tyramide, a carrier substance having a phenol group, and peroxidase can be set as follows, for example. However, these ranges are merely examples, and can be appropriately changed in consideration of reaction conditions and the like.
Fluorescently labeled tyramide: 1 nM to 10 nM
Carrier material with phenolic group: 1ug / ml to 1mg / ml
Peroxidase: 0.1 U / ml to 10 U / ml
[蛍光相関分光測定法による測定]
上記ペルオキシダーゼによる反応で生成した蛍光標識を有する反応生成物の濃度を、蛍光相関分光測定法を用いて測定する。まず、蛍光相関分光測定法について説明する。
[Measurement by fluorescence correlation spectroscopy]
The concentration of the reaction product having a fluorescent label produced by the reaction with the peroxidase is measured using fluorescence correlation spectroscopy. First, the fluorescence correlation spectroscopy method will be described.
蛍光相関分光測定法は、焦点レーザー顕微鏡を用いた測定であり、基本は１フェムトリットル以下になる共焦点体積を、ブラウン運動により出入りする蛍光色素や蛍光ラベルした分子の拡散係数を求める計測方法である。通常の操作による希釈で、この共焦点体積に存在する分子を１０個程度にすることが出来るために、連続光による励起でも、蛍光強度が分子の出入りに対応してマイクロ秒時間領域での蛍光揺らぎが観測できる。揺らぎの速さを時間相関関数として解析すると蛍光する分子の拡散係数と分子の個数を求めることが出来る。 Fluorescence correlation spectroscopy is a measurement method that uses a focused laser microscope, and basically uses a confocal volume of 1 femtoliter or less to determine the diffusion coefficient of fluorescent dyes and fluorescently labeled molecules that enter and exit by Brownian motion. is there. Since the number of molecules present in this confocal volume can be reduced to about 10 by dilution by normal operation, the fluorescence intensity in the microsecond time domain corresponds to the entry and exit of molecules even when excited by continuous light. Fluctuation can be observed. When the fluctuation speed is analyzed as a time correlation function, the diffusion coefficient of the fluorescent molecule and the number of molecules can be obtained.
蛍光相関分光測定法は、より具体的には以下の通りである。
使用した蛍光相関分光装置のダイヤグラムを図1a に示す。基本的な構成はレーザー光励起の共焦点蛍光顕微鏡を試料測定部とし，そこでの蛍光発光を検出器でとらえた後、デジタル相関器でデータの記録と解析を行うようになっている。試料測定部を模式的に図2b に示した。励起光であるレーザー光は試料溶液のほんの一点に集中され、かつ共焦点光学系の特性からその一点からの蛍光発光を検出系でとらえることになる。実際の溶液中の測定領域は理想的な点ではなく図1c に示すような円柱状の領域となり、その大きさは直径が約400 nm、軸長が約2 mm、容積としてフェムトリットル（10−15 L）の領域になる。この大きさがFCS が対象としている領域であり容積となる。
More specifically, the fluorescence correlation spectroscopy is as follows.
A diagram of the fluorescence correlation spectrometer used is shown in Fig. 1a. The basic structure is that a laser beam-excited confocal fluorescence microscope is used as a sample measurement unit, and after the fluorescence emission is detected by a detector, data is recorded and analyzed by a digital correlator. The sample measurement section is shown schematically in Fig. 2b. Laser light, which is excitation light, is concentrated at only one point of the sample solution, and the fluorescence emission from that point is captured by the detection system due to the characteristics of the confocal optical system. The actual measurement area in the solution is not an ideal point but a cylindrical area as shown in Fig. 1c. The size is about 400 nm in diameter, the axis length is about 2 mm, and the volume is femtoliter (10- 15 L). This size is the area targeted by FCS and is the volume.
1 M 濃度で1 L の溶液には約6×1023個の分子が存在しているが、フェムトリットル領域には6×108個の分子が存在し、実際の実験でもよく使われる10 nM（10−8 M）程度の濃度になるとその領域には平均5、6 個の分子が存在することになる。ここでFCS の測定領域は溶液中であり、各蛍光分子はブラウン運動を行っている。一定の測定領域における分子の数は常に一定ではなくある値を中心に変動し「数ゆらぎ」が起きている。さらにこの数ゆらぎに起因して、測定される蛍光の強度に「強度ゆらぎが」発生することになる。この蛍光強度のゆらぎを解析することで拡散速度に関する情報と分子の数に関する情報を得ることができる。 There are about 6 × 10 23 molecules in a 1 L solution at 1 M concentration, but there are 6 × 10 8 molecules in the femtoliter region, which is often used in actual experiments. When the concentration is about (10-8 M), there will be an average of 5 or 6 molecules in that region. Here, the measurement area of FCS is in solution, and each fluorescent molecule performs Brownian motion. The number of molecules in a certain measurement region is not always constant but fluctuates around a certain value, and “number fluctuation” occurs. Furthermore, due to this number fluctuation, “intensity fluctuation” occurs in the intensity of fluorescence to be measured. By analyzing the fluctuation of the fluorescence intensity, information on the diffusion rate and information on the number of molecules can be obtained.
次に、本発明において、生成した蛍光標識を有する反応生成物の濃度を、蛍光相関分光測定法を用いて測定する方法を具体的に説明する。使用できる蛍光相関分光測定機は、レーザービームを開口数の大きい対物レンズ（水浸対物レンズ：NA1.0以上）で回折限界まで絞込み、レーザービームの焦点の蛍光だけを検出するために、レーザービームの結像位置にピンホールを置く共焦点光学系からなる測定機器である。蛍光分子を励起するため、レーザーは、チラミドの標識に使用する蛍光分子の種類に応じて適宜決定できるが、例えば、488nm、532nm、または633nmの波長を有するレーザー光を用いることが望ましい。検出器は、暗電流が小さく、光電変換効率が高い、アバランシュフォトダイオードで構成されることが適当である。但し、光電変換効率が十分に高いならば、光電子倍増管を検出器として使用することもできる。 Next, in the present invention, a method for measuring the concentration of the produced reaction product having a fluorescent label using the fluorescence correlation spectroscopy will be specifically described. Fluorescence correlation spectrometers can be used to narrow the laser beam to the diffraction limit with an objective lens with a large numerical aperture (water immersion objective: NA1.0 or higher), and to detect only the fluorescence at the focal point of the laser beam. This is a measuring instrument comprising a confocal optical system in which a pinhole is placed at the imaging position. In order to excite the fluorescent molecule, the laser can be appropriately determined according to the type of fluorescent molecule used for tyramide labeling. For example, it is desirable to use laser light having a wavelength of 488 nm, 532 nm, or 633 nm. The detector is suitably composed of an avalanche photodiode having a small dark current and a high photoelectric conversion efficiency. However, if the photoelectric conversion efficiency is sufficiently high, a photomultiplier tube can be used as a detector.
さらに、この蛍光相関分光測定機を用いて以下のように、生成した蛍光標識を有する反応生成物の濃度を測定することができる。
（１）FCS専用ガラスボトムプレートを用意する。
（２）FCS測定用標準色素試薬をDyeウェルに分注する。
（３）チラミド反応後のサンプル80μLを各ウェルに分注する。
（４）プレート用遠心機により遠心し（100 g, １分以下）気泡を除去する。
（５）FCS測定装置をセットし、測定する（過酸化水素を添加していないサンプルをネガティブコントロールとし、過酸化水素を十分量添加したサンプルをポジティブコントロールとする）
（６）FCS測定は１ウェル当たり、３〜５秒測定を３回〜５回行う。
（７）FCS測定後は、ネガティブコントロールから得られる第１成分（蛍光色素）の拡散時間DF1を基準に、ポジティブコントロールから得られる第２成分（チラミド反応の結果蛍光標識されたキャリアタンパク質）の拡散時間DF2を決定する。
（８）各サンプルは、（７）で決定したDF1,DF2を元にカーブフィッティングを行い、過酸化水素濃度を定量する。
Furthermore, the concentration of the reaction product having the generated fluorescent label can be measured using this fluorescence correlation spectrometer as follows.
(1) Prepare a glass bottom plate for FCS.
(2) Dispense standard dye reagent for FCS measurement into dye wells.
(3) Dispense 80 μL of sample after tyramide reaction to each well.
(4) Centrifuge in a plate centrifuge (100 g, 1 min or less) to remove bubbles.
(5) Set the FCS measuring device and measure (sample without added hydrogen peroxide as negative control, sample with sufficient amount of hydrogen peroxide added as positive control)
(6) The FCS measurement is performed 3 to 5 seconds 3 to 5 seconds per well.
(7) After FCS measurement, diffusion of the second component (carrier protein that is fluorescently labeled as a result of the tyramide reaction) obtained from the positive control based on the diffusion time DF1 of the first component (fluorescent dye) obtained from the negative control Determine the time DF2.
(8) For each sample, curve fitting is performed based on DF1 and DF2 determined in (7) to quantify the hydrogen peroxide concentration.
蛍光相関分光測定法（FCS）は、B/F分離が不必要な測定法であり、反応によって蛍光物質が分子量の大きなキャリア物質に結合した場合、フリーの低分子蛍光物質が共存していてもキャリア物質に結合した蛍光物質の割合を求めることが可能である。本発明では、蛍光物質をキャリア物質に結合する方法としてチラミド転移反応を利用した。このチラミド転移反応では、ペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で、蛍光物質を結合したチラミド分子を、チロシン残基を持ったキャリア物質（蛋白、ペプチド、チロシンリッチ合成ペプチド、さらに詳しくは牛血清アルブミンやチロシン残基を多くもった蛋白や組換え蛋白等）に転移できる。この反応液にはフリーの蛍光分子が結合したチラミド分子とキャリア物質に結合した蛍光分子が共存するが、FCS法で測定することによりこの反応をB/F分離なしで迅速に感度良く測定が可能となった。 Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a measurement method that does not require B / F separation. When a fluorescent substance is bound to a carrier substance with a large molecular weight by a reaction, a free low-molecular fluorescent substance can coexist. It is possible to determine the proportion of fluorescent material bound to the carrier material. In the present invention, a tyramide transfer reaction is used as a method for binding a fluorescent substance to a carrier substance. In this tyramide transfer reaction, a tyramide molecule bound with a fluorescent substance in the presence of peroxidase and hydrogen peroxide is converted into a carrier substance having a tyrosine residue (protein, peptide, tyrosine-rich synthetic peptide, more specifically bovine serum albumin or It can be transferred to proteins with many tyrosine residues and recombinant proteins. In this reaction solution, a tyramide molecule bound to a free fluorescent molecule and a fluorescent molecule bound to a carrier substance coexist. By measuring by the FCS method, this reaction can be measured quickly and with high sensitivity without B / F separation. It became.
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
実施例１
FCSによる低分子蛍光色素と高分子化蛍光色素混在状態における検量曲線1
高分子蛍光色素を作るために以下の操作を行い調製した。TAMRAが結合したチラミド試薬を用い（大過剰のペルオキシダーゼ（POD）と過酸化水素を含む）、チラミド転移反応によりBSA（ウシ血清アルブミン(分子量約64ｋDa)）をTAMRAで標識した（100mM Tris、170μM BSA、1μMチラミド、10u/ml POD、1mM H2O2、室温30分間反応）。フリーのチラミド色素を取り除くために、ゲルろ過カラムにアプライし、高分子画分（TAMRA標識BSA）を精製した（Sephadex-G25、10cm）。精製したTAMRA標識BSAと低分子TAMRAを終濃度７ｎMになるように一定の割合で混ぜた終濃度500μg/ml BSAを含む100ｍMTris-HCl(pH 7.5)に分取し、FCS測定装置にて高分子画分の割合（F2%）を求めた。結果を図２に示す。
Example 1
Calibration curve for low molecular fluorescent dye and polymerized fluorescent dye mixed by FCS 1
In order to make a polymeric fluorescent dye, the following operation was carried out. TAMRA-conjugated tyramide reagent (containing a large excess of peroxidase (POD) and hydrogen peroxide) was used to label BSA (bovine serum albumin (molecular weight about 64 kDa)) with TAMRA (100 mM Tris, 170 μM BSA). 1 μM tyramide, 10 u / ml POD, 1 mM H 2 O 2 , reaction at room temperature for 30 minutes). In order to remove the free tyramide dye, it was applied to a gel filtration column and the polymer fraction (TAMRA-labeled BSA) was purified (Sephadex-G25, 10 cm). The purified TAMRA-labeled BSA and low molecular weight TAMRA were mixed at a constant ratio of 7 nM to a final concentration of 500 μg / ml BSA containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5). The fraction (F2%) was determined. The results are shown in FIG.
蛍光色素（TAMRA）とTAMRAをチラミド転移反応でBSAに結合させた高分子体（TAMRA標識BSA）を一定の割合で加えたとき、その混合割合に応じてFCSで測定可能であった。従ってFCS解析により、フリーの蛍光色素が混在している状態でも、高分子に結合した蛍光分子（TAMRA標識BSA）の割合を求めることができることがわかった。 When a polymer (TAMRA-labeled BSA) in which a fluorescent dye (TAMRA) and TAMRA were bonded to BSA by a tyramide transfer reaction was added at a certain ratio, it could be measured by FCS according to the mixing ratio. Therefore, it was found by FCS analysis that the ratio of fluorescent molecules (TAMRA-labeled BSA) bound to the polymer can be obtained even in the presence of free fluorescent dyes.
実施例2
FCSによる添加過酸化水素の定量曲線
Tris-HCl(pH 7.5)緩衝液に10nMチラミド試薬、10u/mlペルオキシダーゼ及び500μg/ml BSA（ウシ血清アルブミン(分子量約64ｋDa)）を加え、この溶液に過酸化水素を0-5μM（終濃度はそれぞれ1/25）添加し、室温で30分反応させてTAMRA標識BSAを生成させた。添加した過酸化水素の各濃度に対して、FCS測定装置にて高分子画分の割合（F2%）を求めた。結果を図３に示す。
Example 2
Quantitative curve of added hydrogen peroxide by FCS
Add 10 nM tyramide reagent, 10 u / ml peroxidase and 500 μg / ml BSA (bovine serum albumin (molecular weight about 64 kDa)) to Tris-HCl (pH 7.5) buffer, and add hydrogen peroxide to 0-5 μM (final concentration: 1/25) of each was added and reacted at room temperature for 30 minutes to produce TAMRA-labeled BSA. For each concentration of hydrogen peroxide added, the ratio of polymer fraction (F2%) was determined with an FCS measuring device. The results are shown in FIG.
チラミド反応で生成されるTAMRA標識BSAをFCSで測定することにより、反応系に添加した過酸化水素量を濃度依存的に定量できることがわかった。過酸化水素濃度は20-200ｎMの範囲で直線的に測定できた。 It was found that the amount of hydrogen peroxide added to the reaction system can be quantified in a concentration-dependent manner by measuring TAMRA-labeled BSA produced by the tyramide reaction with FCS. The hydrogen peroxide concentration could be measured linearly in the range of 20-200 nM.
実施例3
FCSによるグルコースの定量
グルコースにグルコースオキシダーゼを反応させて産生される発生期の過酸化水素を測定することにより、グルコース量の定量を試みた。グルコースオキシダーゼ（GOD）の反応は以下のとおりである。
Quantification of glucose by FCS We attempted to quantify the amount of glucose by measuring the nascent hydrogen peroxide produced by reacting glucose with glucose oxidase. The reaction of glucose oxidase (GOD) is as follows.
10u/mlGOD、10nMチラミド、10u/mlペルオキシダーゼ、500 μg/ml BSA（ウシ血清アルブミン(分子量約64ｋDa)）及び0-30μMグルコース（終濃度0-1.2μM）を含むTris-HCl(pH 7.5)緩衝液を混和し、室温にて30分反応させ、TAMRA標識BSAを生成させた。添加したグルコース量に対して、FCS測定装置にて高分子画分の割合（F2%）を求めた。結果を図４に示す。 Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 10 u / ml GOD, 10 nM tyramide, 10 u / ml peroxidase, 500 μg / ml BSA (bovine serum albumin (molecular weight about 64 kDa)) and 0-30 μM glucose (final concentration 0-1.2 μM) The solutions were mixed and reacted at room temperature for 30 minutes to produce TAMRA-labeled BSA. The proportion of the polymer fraction (F2%) was determined with respect to the amount of glucose added using an FCS measuring device. The results are shown in FIG.
添加したグルコース量に依存して終濃度0.8μMまでのグルコース量を測定することができた。従って、添加グルコース量に依存して発生する過酸化水素を、チラミド試薬とFCS測定の組み合わせによって定量することができた。本測定法は、糖尿病患者の血清グルコース量（糖尿病患者の血清グルコース量約200mg/dl）の測定に使用できる系であることがわかった。 Depending on the amount of glucose added, the amount of glucose up to a final concentration of 0.8 μM could be measured. Therefore, hydrogen peroxide generated depending on the amount of added glucose could be quantified by a combination of tyramide reagent and FCS measurement. This measurement method was found to be a system that can be used to measure the serum glucose level of diabetic patients (the serum glucose level of diabetic patients is approximately 200 mg / dl).
実施例4
FCSによる発生過酸化水素を測定することによるグルコースオキシダーゼ活性の測定
グルコースにグルコースオキシダーゼを反応させて産生される発生期の過酸化水素により、チラミド反応で生成されるTAMRA標識BSA量をFCSで測定した。グルコースオキシダーゼ（GOD）の反応は以下のとおりである。
Measurement of glucose oxidase activity by measuring hydrogen peroxide generated by FCS The amount of TAMRA-labeled BSA produced by tyramide reaction was measured by FCS using hydrogen peroxide in the nascent stage produced by reacting glucose with glucose oxidase. . The reaction of glucose oxidase (GOD) is as follows.
20mM グルコース、10nMチラミド、10u/mlペルオキシダーゼ、500 μg/ml BSA
及びGOD（原液2.5u/mlとその1000倍までの希釈液）を含むTris-HCl(pH 7.5 )緩衝液を混和し、室温にて60分まで反応させ、TAMRA標識BSAを生成させた。添加したグルコースオキシダーゼの各希釈液に対して、経時的にFCS測定装置にて高分子画分の割合（F2%）を求めた。結果を図５に示す。
20 mM glucose, 10 nM tyramide, 10 u / ml peroxidase, 500 μg / ml BSA
And Tris-HCl (pH 7.5) buffer solution containing GOD (stock solution 2.5 u / ml and its diluted solution up to 1000 times) were mixed and reacted at room temperature for 60 minutes to produce TAMRA-labeled BSA. With respect to each diluted solution of glucose oxidase, the ratio (F2%) of the polymer fraction was obtained over time with an FCS measuring device. The results are shown in FIG.
3倍希釈GODを添加した系のみで、経時的に高分子画分の割合（F2%）が増加した。一方GODをそれ以上希釈した場合には、F2%の上昇は認められなかった。この結果は、3倍希釈GOD(終濃度0.83u/ml) 以上の濃度の酵素添加により、本反応系で検出できる過酸化水素が産生し、TAMRA標識BSAが生成されたものと考えられる。従って、グルコースとGODの反応で産生される過酸化水素を、チラミド転移反応とFCS装置の組み合わせでF2%を測定することにより、GODの活性が測定できることがわかった。 Only in the system to which 3-fold diluted GOD was added, the proportion of the polymer fraction (F2%) increased over time. On the other hand, when GOD was further diluted, no increase in F2% was observed. This result is considered that hydrogen peroxide that can be detected in this reaction system was produced by addition of enzyme at a concentration of 3 times or more diluted GOD (final concentration 0.83 u / ml), and TAMRA-labeled BSA was produced. Therefore, it was found that the activity of GOD can be measured by measuring hydrogen peroxide produced by the reaction of glucose and GOD, and measuring F2% by a combination of tyramide transfer reaction and FCS apparatus.
本発明を応用した測定法を利用することにより、現在汎用されているELISAやCLEIA測定法を簡便な高感度測定法に変えることができる。本発明を利用できる検査法としては、BSE検査や血液製剤のウイルス検査における検出感度不足による汚染食品や輸血製剤による感染防御に極めて有効な方法になりうる。また、末梢血からの超早期がん診断が可能になる。 By using the measurement method to which the present invention is applied, the currently widely used ELISA and CLEIA measurement methods can be changed to a simple high-sensitivity measurement method. As a test method that can use the present invention, it can be an extremely effective method for the prevention of infection by contaminated foods or transfusion products due to lack of detection sensitivity in BSE tests or virus tests of blood products. In addition, ultra-early cancer diagnosis from peripheral blood becomes possible.
その他、今後急速に市場が拡大する分野では、遺伝子組換え医薬品・抗体医薬・再生医療・組織工学から由来する製品の厳密で高感度な品質保証のための超高感度残留タンパク質（異種由来タンパク質）の検出系にも汎用的に利用することが可能と思われる。
また一般研究用試薬、環境計測、バイオセンサー等への直接的な利用も見込まれる。
In other fields where the market will rapidly expand in the future, ultra-sensitive residual proteins (heterogeneous proteins) for strict and sensitive quality assurance of products derived from genetically modified drugs, antibody drugs, regenerative medicine, and tissue engineering It seems that it can be used for a general purpose detection system.
It is also expected to be used directly for general research reagents, environmental measurements, biosensors, etc.
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