JP2008202170A - Chitosan matrix, and substrate for cell culture, wound coating material and nerve regenerating material using the same - Google Patents

Chitosan matrix, and substrate for cell culture, wound coating material and nerve regenerating material using the same Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a chitosan matrix having excellent cell adhesiveness and readily proliferating cells. <P>SOLUTION: The chitosan matrix is composed of a fiber aggregate of chitosan fibers formed by electrospinning etc., and obtained by dipping at least the surface of the chitosan fibers in a solution containing a sulfonated chitosan and adsorbing the sulfonated chitosan or carrying out a sulfonating treatment of the chitosan fiber aggregate and thereby forming the sulfonated chitosan on the fiber surface. Furthermore, the chitosan matrix to which serum is added is included therein. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、キトサンマトリックスに関し、特に生体材料として好適なキトサンマトリックス並びにそれを用いた細胞培養基材、創傷被覆材及び神経再生材に関する。   The present invention relates to a chitosan matrix, and particularly to a chitosan matrix suitable as a biomaterial, and a cell culture substrate, a wound dressing material and a nerve regeneration material using the chitosan matrix.

近年、生体材料の需要は非常に高く、例えば、創傷被覆材、神経再生材等に好適なものが求められている。   In recent years, the demand for biomaterials is very high, and for example, materials suitable for wound dressings, nerve regeneration materials and the like are required.

創傷被覆材は、細胞増殖因子が生体外へ出ないように、創傷部位を閉鎖・密封するための材料であり、ベスキチンＷ（１１１度熱傷適応、ユニチカ製）、ベスキチンＷ−Ａ（皮下組織の損傷、ユニチカ製）、ベスキチンＦ（筋、骨に至る創傷、ユニチカ製）、ウレザックＣ（片倉チッカリン）などのキチン／キトサンを用いたものが提案されている（例えば、特許文献１又は２参照）。上述した創傷被覆材は、生体適合性に優れ、創面に分泌される浸出液に多量に含まれる細胞増殖因子を外に出ないようにすることができるため、皮膚外傷を早く治癒することができる。   The wound dressing is a material for closing and sealing the wound site so that the cell growth factor does not go out of the body. Besquitin W (111 degree burn adaptation, manufactured by Unitika), Besquitin WA (subcutaneous tissue The use of chitin / chitosan such as injury, manufactured by Unitika), vesquitin F (wound leading to muscles and bones, manufactured by Unitika), and Urezac C (Catakura Chikkarin) has been proposed (for example, see Patent Document 1 or 2). . The wound dressing described above is excellent in biocompatibility and can prevent the cell growth factor contained in a large amount in the exudate secreted to the wound surface from coming out, so that the skin trauma can be cured quickly.

いずれの生体材料も、生体適合性に優れるものであるが、さらに細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすいものが求められている。   Any of the biomaterials is excellent in biocompatibility, but is further required to have excellent cell adhesion and facilitate cell proliferation.

特公平５−２６４９８号公報（特許請求の範囲等）Japanese Patent Publication No. 5-26498 (claims, etc.) 特公昭６３−５９７０６号公報（特許請求の範囲等）Japanese Patent Publication No. 63-59706 (claims, etc.)

本発明はこのような事情に鑑み、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすいキトサンマトリックス並びにそれを用いた細胞培養基材、創傷被覆材及び神経再生材を提供することを課題とする。   In view of such circumstances, it is an object of the present invention to provide a chitosan matrix that is excellent in cell adhesion and easily proliferates, and a cell culture substrate, a wound dressing, and a nerve regeneration material using the chitosan matrix. .

上記課題を解決する本発明の第１の態様は、キトサン繊維の繊維集合体からなり、前記キトサン繊維の少なくとも表面にスルホン化キトサンが存在することを特徴とするキトサンマトリックスにある。   A first aspect of the present invention that solves the above-mentioned problems is a chitosan matrix comprising a fiber assembly of chitosan fibers, and sulfonated chitosan is present on at least the surface of the chitosan fibers.

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載のキトサンマトリックスにおいて、前記キトサン繊維の表面にスルホン化キトサンが吸着したものであることを特徴とするキトサンマトリックスにある。   According to a second aspect of the present invention, there is provided the chitosan matrix according to the first aspect, wherein sulfonated chitosan is adsorbed on the surface of the chitosan fiber.

本発明の第３の態様は、第２の態様に記載のキトサンマトリックスにおいて、スルホン化キトサンを含む溶液に前記繊維集合体を浸漬させることで形成されたものであることを特徴とするキトサンマトリックスにある。   According to a third aspect of the present invention, in the chitosan matrix according to the second aspect, the chitosan matrix is formed by immersing the fiber assembly in a solution containing sulfonated chitosan. is there.

本発明の第４の態様は、第１の態様に記載のキトサンマトリックスにおいて、前記キトサン繊維をスルホン化したものであることを特徴とするキトサンマトリックスにある。   According to a fourth aspect of the present invention, there is provided a chitosan matrix according to the first aspect, wherein the chitosan fibers are sulfonated.

本発明の第５の態様は、第１〜４の何れかの態様に記載のキトサンマトリックスにおいて、キトサン繊維がエレクトロスピニングにより形成されたものであることを特徴とするキトサンマトリックスにある。   According to a fifth aspect of the present invention, there is provided the chitosan matrix according to any one of the first to fourth aspects, wherein the chitosan fibers are formed by electrospinning.

本発明の第６の態様は、第１〜５の何れかの態様に記載のキトサンマトリックスにおいて、血清を付加したものであることを特徴とするキトサンマトリックスにある。   A sixth aspect of the present invention is a chitosan matrix characterized in that serum is added to the chitosan matrix according to any one of the first to fifth aspects.

本発明の第７の態様は、第１〜６の何れかの態様に記載のキトサンマトリックスからなることを特徴とする細胞培養基材にある。   A seventh aspect of the present invention is a cell culture substrate comprising the chitosan matrix described in any one of the first to sixth aspects.

本発明の第８の態様は、第１〜６の何れかの態様に記載のキトサンマトリックスからなることを特徴とする創傷被覆材にある。   According to an eighth aspect of the present invention, there is provided a wound dressing comprising the chitosan matrix according to any one of the first to sixth aspects.

本発明の第９の態様は、第１〜６の何れかの態様に記載のキトサンマトリックスからなることを特徴とする神経再生材にある。   A ninth aspect of the present invention is a nerve regeneration material comprising the chitosan matrix according to any one of the first to sixth aspects.

本発明によれば、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすいキトサンマトリックスとなる。このキトサンマトリックスは、製造が容易であり、低コストで製造できるものである。また、キトサンマトリックスを用いると、生体適合性に優れ、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養基材、創傷被覆材、神経再生材を実現できる。   According to the present invention, the chitosan matrix is excellent in cell adhesion and easily proliferates. This chitosan matrix is easy to manufacture and can be manufactured at low cost. In addition, when a chitosan matrix is used, a cell culture substrate, a wound dressing material, and a nerve regeneration material that are excellent in biocompatibility, excellent in cell adhesion, and easy to grow cells can be realized.

本発明にかかるキトサンマトリックスは、キトサン繊維の繊維集合体からなり、キトサン繊維の少なくとも表面にスルホン化キトサンが存在するものである。かかるキトサンマトリックスは、キトサン繊維の繊維集合体からなることにより、生体適合性に優れ、細胞が増殖しやすいものとなり、表面にスルホン化キトサンが存在することで、細胞が接着しやすいものとなる。なお、スルホン化キトサンは、繊維集合体の表面のみに存在すればよいが、勿論、繊維集合体の内部に存在してもよい。   The chitosan matrix according to the present invention comprises a fiber aggregate of chitosan fibers, and sulfonated chitosan is present on at least the surface of the chitosan fibers. Such a chitosan matrix is composed of a fiber aggregate of chitosan fibers, so that it is excellent in biocompatibility and easily proliferates, and the presence of sulfonated chitosan on the surface makes it easy for cells to adhere. The sulfonated chitosan may be present only on the surface of the fiber assembly, but of course, it may be present inside the fiber assembly.

スルホン化キトサンとは、キトサンがスルホン化されたものであり、キトサン（β−ポリ−Ｄ−グルコサミン）の有するアミノ基（２位）、水酸基（３、６位）のいずれか一つ以上にスルホ基が導入されたものを指す。本発明におけるスルホン化キトサンは、いずれの官能基にスルホ基が導入されたものであってもよい。   Sulfonated chitosan is obtained by sulfonation of chitosan, and is capable of sulfonating at least one of amino group (position 2) and hydroxyl group (positions 3 and 6) of chitosan (β-poly-D-glucosamine). Refers to a group introduced. The sulfonated chitosan in the present invention may have a sulfo group introduced into any functional group.

本発明のキトサンマトリックスは、例えば、キトサン繊維の繊維集合体の表面にスルホン化キトサンを吸着させることにより形成できる。かかるキトサンマトリックスは、例えば、スルホン化キトサンを含む溶液に繊維集合体を浸漬させることで形成される。これにより、繊維集合体を構成するキトサン繊維の表面がスルホン化キトサンでコーティングされ、少なくとも表面にスルホン化キトサンが存在する。スルホン化キトサンを含む溶液に繊維集合体を浸漬させる時間は特に限定されず、キトサン繊維の少なくとも表面にスルホン化キトサンが吸着すればよい。   The chitosan matrix of the present invention can be formed, for example, by adsorbing sulfonated chitosan on the surface of a fiber assembly of chitosan fibers. Such a chitosan matrix is formed, for example, by immersing the fiber assembly in a solution containing sulfonated chitosan. As a result, the surface of the chitosan fiber constituting the fiber assembly is coated with the sulfonated chitosan, and at least the surface of the sulfonated chitosan is present. The time for which the fiber assembly is immersed in the solution containing the sulfonated chitosan is not particularly limited, and the sulfonated chitosan may be adsorbed on at least the surface of the chitosan fiber.

スルホン化キトサンを含む溶液の製造方法は特に限定されないが、例えば、キトサンと、ＳＯ３−Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）ｃｏｍｐｌｅｘ溶液とを反応させ、得られた反応液を透析により精製し、蒸留水に溶解させることにより得られる。 A method for producing a solution containing sulfonated chitosan is not particularly limited. For example, chitosan is reacted with SO 3 -N, N-dimethylformamide (DMF) complex solution, and the resulting reaction solution is purified by dialysis. It is obtained by dissolving in distilled water.

また、キトサンマトリックスは、少なくとも一部のキトサン繊維がスルホン化したものであってもよい。すなわち、上述したようにスルホン化キトサンを吸着させるのではなく、キトサン繊維自身をスルホン化処理したものであってもよい。このキトサンマトリックスの製造方法としては、例えば、キトサン繊維をＳＯ３−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）ｃｏｍｐｌｅｘ溶液に浸漬し、繊維表面をスルホン化する方法がある。 Further, the chitosan matrix may be one in which at least a part of chitosan fibers is sulfonated. That is, instead of adsorbing the sulfonated chitosan as described above, the chitosan fiber itself may be sulfonated. As a method for producing this chitosan matrix, for example, there is a method in which chitosan fibers are immersed in a SO 3 -N, N-dimethylformamide (DMF) complex solution to sulfonate the fiber surface.

キトサン繊維の繊維集合体とは、キトサン繊維が絡み合って形成されたものであり、好ましくはメッシュ状である。メッシュ状とは、所望の開口を有する網目状のことである。繊維が絡み合うことで、繊維と繊維の間の開口から細胞が侵入しやすく、また繊維が絡んで網目状となっている部分に細胞がひっかかりやすいため、より細胞が付着しやすく、接着した細胞を安定して保持することができる。   The fiber aggregate of chitosan fibers is formed by entanglement of chitosan fibers, and preferably has a mesh shape. The mesh shape is a mesh shape having a desired opening. Because the fibers are intertwined, cells easily invade from the opening between the fibers, and the cells are more likely to get caught in the meshed area where the fibers are intertwined. It can be held stably.

なお、キトサン繊維はエレクトロスピニングにより形成されたものであることが好ましい。エレクトロスピニング（静電紡糸）により形成されたキトサン繊維を用いることで、非常に小さく均一な繊維径の繊維からなる繊維集合体とすることができる。なお、繊維の繊維径は、好ましくは５μｍ以下であり、さらに好ましくは０．０１〜３．０μｍ、特に好ましくは０．１〜１．０μｍである。この範囲とすることで、繊維集合体は、細胞がひっかかる部分（繊維）や、繊維と繊維の間にできる細胞が入り込む開口が小さくなるため、細胞が付着しやすく、接着した細胞を安定して保持することができるものとなる。   The chitosan fiber is preferably formed by electrospinning. By using chitosan fibers formed by electrospinning (electrospinning), it is possible to obtain a fiber assembly composed of very small and uniform fibers. The fiber diameter of the fibers is preferably 5 μm or less, more preferably 0.01 to 3.0 μm, and particularly preferably 0.1 to 1.0 μm. By setting it within this range, the fiber assembly is small in the portion (fiber) where the cell gets caught and the opening where the cell formed between the fiber enters, so that the cell easily adheres, and the adhered cell is stabilized. It can be held.

また、キトサン繊維集合体は、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維集合体からなるものであってもよい。かかる繊維集合体は、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な繊維体である。ここでいう均質とは、厚さ方向及び平面方向に繊維が均一に存在している状態、すなわち繊維の密度が均一な状態を指す。このとき、繊維と繊維との隙間（開口）もほぼ均一な大きさで存在している。   The chitosan fiber assembly may be composed of a fiber assembly obtained by drying a slurry liquid obtained by homogenizing chitosan fibers formed by electrospinning and a solvent. Such a fiber assembly is a homogeneous fiber body in which fibers having a small and uniform fiber diameter are intertwined. The term “homogeneous” as used herein refers to a state where fibers are uniformly present in the thickness direction and the plane direction, that is, a state where the density of the fibers is uniform. At this time, the gaps (openings) between the fibers also exist in a substantially uniform size.

本発明にかかるキトサンマトリックスを構成するキトサン繊維は、キトサン類を主成分とする繊維である。すなわち、本発明における繊維体はキトサン類繊維からなるものである。このため、本発明のキトサンマトリックスは、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすいものとなる。   The chitosan fiber which comprises the chitosan matrix concerning this invention is a fiber which has chitosans as a main component. That is, the fiber body in the present invention is made of chitosan fibers. For this reason, the chitosan matrix of the present invention is excellent in cell adhesiveness and easily proliferates.

ここで、キトサン類とは、キチン(β−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン)を脱アセチル化した生成物又はこの誘導体をいい、キトサン（β−ポリ−Ｄ−グルコサミン）及びその誘導体の他、未反応のキチン及びその誘導体を含有するものをいう。本発明で用いることができるキトサン類は、特に限定されないが、脱アセチル化度が５０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは、キチンの脱アセチル化度が９０％以上である。なお、脱アセチル化度とは、キチン誘導体におけるキトサンの割合を示すものである。   Here, chitosan refers to a product obtained by deacetylating chitin (β-poly-N-acetyl-D-glucosamine) or a derivative thereof, and other than chitosan (β-poly-D-glucosamine) and derivatives thereof. , Which contains unreacted chitin and its derivatives. The chitosans that can be used in the present invention are not particularly limited, but the degree of deacetylation is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and particularly preferably the degree of deacetylation of chitin is 90%. That's it. The degree of deacetylation indicates the ratio of chitosan in the chitin derivative.

キトサンの脱アセチル化度を９０％以上とすることで、機械的強度が非常に高いキトサンマトリックスとすることができる。また、脱アセチル化度が９０％以上のキトサンを用いてエレクトロスピニングした場合、キトサン繊維の繊維径を小さいものとしやすくなる。径の細い繊維が密集することで、より繊維と繊維の間にできる細胞が入り込む開口が小さくなるため、細胞が付着しやすく、接着した細胞を安定して保持することができるものとなる。   By setting the degree of deacetylation of chitosan to 90% or more, a chitosan matrix having very high mechanical strength can be obtained. Moreover, when electrospinning is performed using chitosan having a degree of deacetylation of 90% or more, the fiber diameter of the chitosan fiber is easily reduced. By densely gathering the fibers having a small diameter, an opening through which the cells formed between the fibers become smaller becomes smaller, so that the cells are easily attached and the adhered cells can be stably held.

本発明で用いるキトサン類の主成分は特に限定されず、例えば、キトサン、Ｎ−アリルキトサン、Ｎ−アルキルキトサン、ｏ−アリルキトサン、ｏ−アルキルキトサン、硫酸化キトサン、ニトロ化キトサン、カルボキシメチル化キトサン等が挙げられるが、キトサン、カルボキシメチル化キトサンが好ましい。   The main components of the chitosans used in the present invention are not particularly limited. For example, chitosan, N-allyl chitosan, N-alkyl chitosan, o-allyl chitosan, o-alkyl chitosan, sulfated chitosan, nitrated chitosan, carboxymethylated Although chitosan etc. are mentioned, chitosan and carboxymethylated chitosan are preferable.

本発明のキトサンマトリックスを構成するキトサン繊維は、キトサン類を含有するものであればよく、生体適合性に優れた他の成分を含んでいてもよい。   The chitosan fiber which comprises the chitosan matrix of this invention should just contain chitosans, and may contain the other component excellent in biocompatibility.

また、本発明にかかるキトサンマトリックスは、板状であってもよいが、チューブ形状であってもよい。チューブ形状の場合、神経再生材として好適なものとなる。なお、チューブの厚さは、特に限定されないが、例えば１００〜５００μｍであることが好ましい。この範囲であれば機械的強度を十分に保つことができ、また神経再生に好適なものとなるからである。   Further, the chitosan matrix according to the present invention may be plate-shaped but may be tube-shaped. In the case of a tube shape, it is suitable as a nerve regeneration material. In addition, although the thickness of a tube is not specifically limited, For example, it is preferable that it is 100-500 micrometers. This is because the mechanical strength can be sufficiently maintained within this range, and it is suitable for nerve regeneration.

上述したキトサンマトリックスは、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすいものであり、細胞培養基材や、創傷被覆材、神経再生材として用いて好適なものである。   The chitosan matrix described above is excellent in cell adhesion and proliferating cells, and is suitable for use as a cell culture substrate, a wound dressing material, or a nerve regeneration material.

本発明にかかるキトサンマトリックスは、血清を付加したものであることが好ましい。
図１は、血清を付加したキトサンマトリックスの細胞接着性を説明する概略図である。繊維集合体に血清を付加すると、図１に示すように、キトサンマトリックス１０のスルホン化キトサン１１に、血清中に含まれる塩基性接着蛋白質１５（フィブロネクチン、ビトリネクチンなど）又は塩基性細胞増殖因子１６が付加し、この塩基性接着蛋白質１５及び塩基性細胞増殖因子１６と、細胞レセプター２０ａとが相互作用することで、細胞２０が非常に接着しやすくなる。 The chitosan matrix according to the present invention is preferably a serum-added one.
FIG. 1 is a schematic diagram illustrating cell adhesion of a chitosan matrix to which serum has been added. When serum is added to the fiber assembly, as shown in FIG. 1, the basic adhesion protein 15 (fibronectin, vitrinectin, etc.) or basic cell growth factor 16 contained in the serum is added to the sulfonated chitosan 11 of the chitosan matrix 10. In addition, when the basic adhesion protein 15 and the basic cell growth factor 16 interact with the cell receptor 20a, the cell 20 becomes very easy to adhere.

このキトサンマトリックスは、繊維集合体を血清に浸漬させて、乾燥させることにより製造することができる。血清は特に限定されないが、牛胎児由来、馬由来、ヒト由来等が挙げられる。   This chitosan matrix can be produced by immersing the fiber assembly in serum and drying it. Serum is not particularly limited, and examples include bovine fetal origin, equine origin, and human origin.

なお、勿論、キトサンマトリックスを血清存在下で使用しても同様の効果が得られる。   Of course, the same effect can be obtained even when chitosan matrix is used in the presence of serum.

ここで、キトサンマトリックスの製造方法の一実施形態を示す。   Here, one Embodiment of the manufacturing method of a chitosan matrix is shown.

まず、キトサン類をトリフルオロ酢酸等の溶媒に溶解させて、適宜ろ過等を行うことでキトサン溶液を調製する。このとき、キトサン溶液には生体適合性に優れた他の成分を溶解させてもよい。次に、キトサン溶液をエレクトロスピニング（静電紡糸）することにより繊維化することで繊維集合体を形成する。   First, a chitosan solution is prepared by dissolving chitosans in a solvent such as trifluoroacetic acid and appropriately performing filtration or the like. At this time, other components having excellent biocompatibility may be dissolved in the chitosan solution. Next, the chitosan solution is fiberized by electrospinning (electrospinning) to form a fiber assembly.

一方、キトサン、ＳＯ３−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）ｃｏｍｐｌｅｘ溶液を反応させることによりスルホン化キトサンを得る。得られたスルホン化キトサンを透析等により精製し、純水に溶解することで、スルホン化キトサン溶液を得た。 On the other hand, sulfonated chitosan is obtained by reacting a chitosan, SO 3 -N, N-dimethylformamide (DMF) complex solution. The obtained sulfonated chitosan was purified by dialysis or the like and dissolved in pure water to obtain a sulfonated chitosan solution.

スルホン化キトサン溶液に、キトサン繊維集合体を一定時間浸漬させることで、キトサン繊維集合体にスルホン化キトサンを吸着・固定させる。   By immersing the chitosan fiber assembly in the sulfonated chitosan solution for a certain time, the sulfonated chitosan is adsorbed and fixed on the chitosan fiber assembly.

最後に、得られたキトサンマトリックスにＵＶを照射、又はエタノール等の溶媒に浸漬させることにより、滅菌する。   Finally, the obtained chitosan matrix is sterilized by irradiating with UV or immersing in a solvent such as ethanol.

このように本発明にかかるキトサンマトリックスは、容易に製造することができ、上述したように細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすいものである。   As described above, the chitosan matrix according to the present invention can be easily produced, has excellent cell adhesiveness, and easily proliferates cells as described above.

以下、本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described based on examples. However, the present invention is not limited to this.

（実施例１）
＜キトサン繊維集合体の製造＞
脱アセチル化度（ＤＡｃ）９３％のキトサン（北海道曹達株式会社製）１．６ｇを、トリフルオロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）２０ｍｌに５０℃で１２時間かけて溶解し、塩化メチレン５ｍｌを加え、ガラスフィルターでろ過してキトサントリフルオロ酢酸液を得た。 (Example 1)
<Manufacture of chitosan fiber assembly>
1.6 g of chitosan having a degree of deacetylation (DAc) of 93% (produced by Hokkaido Soda Co., Ltd.) was dissolved in 20 ml of trifluoroacetic acid (produced by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 50 ° C. for 12 hours, and 5 ml of methylene chloride. And filtered through a glass filter to obtain a chitosan trifluoroacetic acid solution.

得られたキトサントリフルオロ酢酸液を注射器（テルモシリンジＳＳ−３０ＥＳＺ；テルモ株式会社製）に入れて内径φ０．７ｍｍの針（シェアフィールドＳＶセット２２Ｇ；テルモ株式会社製）につなぎ、インフュージョンポンプ（１１Ｐｌｕｓ；ＨＡＲＶＡＲＤ ＡＰＰＲＡＴＵＳ製）にセットした。針先に高電圧直流電圧電源（ＨＳＰ−３０ｋ−２；日本スタビライザー株式会社製）の陽極を接続した。   The obtained chitosan trifluoroacetic acid solution was put into a syringe (Terumo syringe SS-30ESZ; manufactured by Terumo Corporation) and connected to a needle having an inner diameter of 0.7 mm (Sharefield SV set 22G; manufactured by Terumo Corporation), and an infusion pump ( 11 Plus; made by HARVARD APPRATUS). An anode of a high voltage DC voltage power source (HSP-30k-2; manufactured by Nippon Stabilizer Co., Ltd.) was connected to the needle tip.

そして、ステンレス製電極板（５．５ｃｍ×５．５ｃｍ、厚さ１ｍｍ）を針の向きに対して垂直になるように設置し、高電圧直流電圧電源の陰極を接続した。針と電極板との距離を１２ｃｍとし、２５ｋｖの電圧をかけて、１時間かけて針から電極板へトリフルオロ酢酸液を噴出することで、電極板上にキトサン繊維を得た。   Then, a stainless steel electrode plate (5.5 cm × 5.5 cm, thickness 1 mm) was installed so as to be perpendicular to the direction of the needle, and the cathode of the high voltage DC voltage power source was connected. The distance between the needle and the electrode plate was 12 cm, a voltage of 25 kv was applied, and a trifluoroacetic acid solution was ejected from the needle to the electrode plate over 1 hour to obtain chitosan fibers on the electrode plate.

得られたキトサン繊維を電極板からはがして、所定の寸法（５ｃｍ×５ｃｍ）に成形し、２８重量％のアンモニア水（和光純薬工業株式会社製）に室温で１時間浸漬させた後、蒸留水を室温で２時間連続的に供給して洗浄した。   The obtained chitosan fiber was peeled off from the electrode plate, formed into a predetermined size (5 cm × 5 cm), immersed in 28 wt% ammonia water (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature for 1 hour, and then distilled. Water was continuously fed at room temperature for 2 hours for washing.

次いでキトサン繊維をエタノールに３分間浸漬させた後、２枚のテフロン（登録商標）板（６ｃｍ×６ｃｍ、厚さ３ｍｍ）に挟んでから全体がずれないようにクリップ等で固定する。これを室温下で１６時間減圧乾燥することにより、キトサン繊維集合体を得た。   Next, the chitosan fibers are immersed in ethanol for 3 minutes, and then sandwiched between two Teflon (registered trademark) plates (6 cm × 6 cm, thickness 3 mm), and then fixed with clips or the like so as not to be displaced. This was dried under reduced pressure at room temperature for 16 hours to obtain a chitosan fiber assembly.

＜スルホン化キトサン溶液の調製＞
脱アセチル化度９０％のキトサン（和光純薬工業社製）２ｇと、３０ｍｌのＳＯ３−ＤＭＦ ｃｏｍｐｌｅｘ／ＤＭＦ（２．５Ｍ）溶液とを反応させ、得られた反応液を透析により精製し、蒸留水に溶解させることでスルホン化キトサン溶液を得た。 <Preparation of sulfonated chitosan solution>
2 g of chitosan having a deacetylation degree of 90% (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 30 ml of a SO 3 -DMF complex / DMF (2.5 M) solution were reacted, and the resulting reaction solution was purified by dialysis, A sulfonated chitosan solution was obtained by dissolving in distilled water.

＜キトサンマトリックスの製造方法＞
得られたスルホン化キトサン溶液に、キトサン繊維集合体を２４時間浸漬させて、取り出した後、５００μｌの蒸留水で３回洗浄した。洗浄したキトサン繊維集合体を７０％のエタノールで滅菌し、乾燥させることで実施例１のキトサンマトリックスを得た。 <Production method of chitosan matrix>
The chitosan fiber assembly was immersed in the obtained sulfonated chitosan solution for 24 hours, taken out, and then washed with 500 μl of distilled water three times. The washed chitosan fiber assembly was sterilized with 70% ethanol and dried to obtain the chitosan matrix of Example 1.

（実施例２）
キトサン繊維集合体の製造において脱アセチル化度７８％のキトサンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例２のキトサンマトリックスを得た。 (Example 2)
A chitosan matrix of Example 2 was obtained in the same manner as in Example 1 except that chitosan having a deacetylation degree of 78% was used in the production of the chitosan fiber assembly.

（比較例１）
蒸留水にキトサン繊維集合体を浸漬させた以外は実施例１と同様にして比較例１のキトサンマトリックスを得た。 (Comparative Example 1)
A chitosan matrix of Comparative Example 1 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the chitosan fiber aggregate was immersed in distilled water.

（比較例２）
キトサン繊維集合体の製造において脱アセチル化度７８％のキトサンを用いた以外は比較例１と同様にして比較例２のキトサンマトリックスを得た。 (Comparative Example 2)
A chitosan matrix of Comparative Example 2 was obtained in the same manner as Comparative Example 1 except that chitosan having a deacetylation degree of 78% was used in the production of the chitosan fiber assembly.

（比較例３）
ヘパリン（和光純薬工業社製）０．１ｇを１０ｍｌの超純水に溶解することによりヘパリン溶液を得た。このヘパリン溶液にキトサン繊維集合体を浸漬させた以外は実施例１と同様にして比較例３のキトサンマトリックスを得た。 (Comparative Example 3)
A heparin solution was obtained by dissolving 0.1 g of heparin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 10 ml of ultrapure water. A chitosan matrix of Comparative Example 3 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the chitosan fiber assembly was immersed in this heparin solution.

（比較例４）
キトサン繊維集合体の製造において脱アセチル化度７８％のキトサンを用いた以外は、比較例３と同様にして比較例４のキトサンマトリックスを得た。 (Comparative Example 4)
A chitosan matrix of Comparative Example 4 was obtained in the same manner as Comparative Example 3 except that chitosan having a deacetylation degree of 78% was used in the production of the chitosan fiber assembly.

（比較例５）
キトアクア（サクシニルカルボキシメチルキトサン）０．１％５００μｌにキトサン繊維集合体を浸漬させた以外は実施例１と同様にして比較例５のキトサンマトリックスを得た。 (Comparative Example 5)
A chitosan matrix of Comparative Example 5 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the chitosan fiber assembly was immersed in 500 μl of chitoaqua (succinylcarboxymethyl chitosan).

（比較例６）
キトサン繊維集合体の製造において脱アセチル化度７８％のキトサンを用いた以外は、比較例５と同様にして比較例６のキトサンマトリックスを得た。 (Comparative Example 6)
A chitosan matrix of Comparative Example 6 was obtained in the same manner as Comparative Example 5 except that chitosan having a deacetylation degree of 78% was used in the production of the chitosan fiber assembly.

（予備試験１）
実施例１及び２のキトサンマトリックスを、各濃度のＮａＣｌ溶液５００μｌに２４時間浸漬させ、ＮａＣｌ溶液に溶出したスルホン化キトサンの量を測定し、キトサン繊維１ｇあたりのスルホン化キトサンの溶出量を求めた。結果を図２に示す。 (Preliminary test 1)
The chitosan matrix of Examples 1 and 2 was immersed in 500 μl of NaCl solution of each concentration for 24 hours, the amount of sulfonated chitosan eluted in the NaCl solution was measured, and the elution amount of sulfonated chitosan per 1 g of chitosan fiber was determined. . The results are shown in FIG.

図２に示すように実施例１及び実施例２のキトサンマトリックスにおいてスルホン化キトサンの溶出量は、ＮａＣｌ溶液が１Ｍ（ｍｏｌ／ｌ）以上ではほとんど変化がなかった。これより、吸着しているスルホン化キトサンの大半が１Ｍ以上のＮａＣｌ溶液に浸漬させることにより脱離してＮａＣｌ溶液に溶出することがわかった。   As shown in FIG. 2, the elution amount of sulfonated chitosan in the chitosan matrices of Examples 1 and 2 hardly changed when the NaCl solution was 1 M (mol / l) or more. From this, it was found that most of the adsorbed sulfonated chitosan was desorbed by being immersed in a NaCl solution of 1M or more and eluted into the NaCl solution.

（予備試験２）
実施例１及び２のキトサンマトリックスを、１ＭのＮａＣｌ溶液５００μｌに浸漬させて、時間経過によるＮａＣｌ溶液に溶出したスルホン化キトサンの量を測定し、キトサン繊維１ｇあたりのスルホン化キトサンの溶出量を求めた。結果を図３に示す。 (Preliminary test 2)
The chitosan matrix of Examples 1 and 2 was immersed in 500 μl of 1M NaCl solution, and the amount of sulfonated chitosan eluted in the NaCl solution over time was measured to determine the amount of sulfonated chitosan dissolved per gram of chitosan fiber. It was. The results are shown in FIG.

図３に示すように実施例１及び実施例２のキトサンマトリックスにおいてスルホン化キトサンの溶出量は、２４時間以上ではほとんど変化がなかった。これより、吸着しているスルホン化キトサンの大半が２４時間、１ＭのＮａＣｌ溶液に浸漬させることにより脱離してＮａＣｌ溶液に溶出することがわかった。   As shown in FIG. 3, the elution amount of sulfonated chitosan in the chitosan matrices of Examples 1 and 2 hardly changed after 24 hours or more. From this, it was found that most of the adsorbed sulfonated chitosan was desorbed by being immersed in a 1M NaCl solution for 24 hours and eluted into the NaCl solution.

試験例１及び２より、キトサンマトリックスを１ＭのＮａＣｌ溶液５００μｌに２４時間浸漬させることで、吸着したスルホン化キトサン量を測定することができることがわかった。   From Test Examples 1 and 2, it was found that the amount of adsorbed sulfonated chitosan can be measured by immersing the chitosan matrix in 500 μl of 1M NaCl solution for 24 hours.

（試験例１）：吸着試験
実施例１〜２及び比較例３〜６のキトサンマトリックスを１ＭのＮａＣｌ溶液５００μｌに２４時間浸漬させることで、ＮａＣｌ溶液に溶出したＧＡＧ（多糖）の量を測定し、キトサン繊維１ｇあたりのＧＡＧ（多糖）の溶出量を測定した。結果を図４に示す。 (Test Example 1): Adsorption test The chitosan matrices of Examples 1-2 and Comparative Examples 3-6 were immersed in 500 μl of 1M NaCl solution for 24 hours to measure the amount of GAG (polysaccharide) eluted in the NaCl solution. The elution amount of GAG (polysaccharide) per 1 g of chitosan fiber was measured. The results are shown in FIG.

図４より、実施例１及び２のキトサンマトリックスは、比較例３〜６のいずれよりも多く、多糖を吸着していることがわかった。すなわち、キトサン繊維集合体には、ヘパリン（比較例３及び４）や、キトアクア（比較例５及び６）よりもスルホン化キトサンが非常に吸着しやすいことがわかった。   From FIG. 4, it was found that the chitosan matrices of Examples 1 and 2 were adsorbing polysaccharides more than any of Comparative Examples 3-6. That is, it was found that sulfonated chitosan is much more easily adsorbed to the chitosan fiber assembly than heparin (Comparative Examples 3 and 4) and chitoaqua (Comparative Examples 5 and 6).

（試験例２）：細胞培養試験１
実施例２及び比較例２、４、６のキトサンマトリックスに以下に示す培養条件１及び培養条件２で細胞を培養し、培養から１日後のキトサンマトリックスの状態を走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ）により観察した。結果を図５及び図６に示す。 (Test Example 2): Cell culture test 1
Cells were cultured on the chitosan matrix of Example 2 and Comparative Examples 2, 4, and 6 under the following culture conditions 1 and 2, and the state of the chitosan matrix one day after the culture was observed with a scanning electron microscope (SEM). did. The results are shown in FIGS.

＜培養条件１＞
培地：Ｇｉｂｃｏ ａｌｐｈａ−ＭＥＭ （１０％ＦＢＳ）
播種細胞：Ｌ９２９ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ （マウス繊維芽細胞）
細胞数：５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ （５００μｌ ｍｅｄｉｕｍ）
培養環境：３７℃、５％ＣＯ２、１−７ｄａｙｓ
ＦＢＳ（牛胎児血清）：なし <Culture conditions 1>
Medium: Gibco alpha-MEM (10% FBS)
Seeded cells: L929 fibroblast (mouse fibroblasts)
Number of cells: 5 × 10 4 cells / well (500 μl medium)
Culture environment: 37 ° C., 5% CO 2 , 1-7 days
FBS (fetal bovine serum): None

＜培養条件２＞
培地：Ｇｉｂｃｏ ａｌｐｈａ−ＭＥＭ （１０％ＦＢＳ）
播種細胞：Ｌ９２９ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ （マウス繊維芽細胞）
細胞数：５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ （５００μｌ ｍｅｄｉｕｍ）
培養環境：３７℃、５％ＣＯ２、１−７ｄａｙｓ
ＦＢＳ（牛胎児血清）：あり <Culture condition 2>
Medium: Gibco alpha-MEM (10% FBS)
Seeded cells: L929 fibroblast (mouse fibroblasts)
Number of cells: 5 × 10 4 cells / well (500 μl medium)
Culture environment: 37 ° C., 5% CO 2 , 1-7 days
FBS (fetal bovine serum): Yes

（結果のまとめ）
図５に示すように、ＦＢＳのない状態で細胞を培養した場合、スルホン化キトサンを吸着させた実施例２のキトサンマトリックスは、比較例２、４、６のキトサンマトリックスに比べて比較的細胞が接着しているが、大きな差は見られなかった。 (Summary of results)
As shown in FIG. 5, when the cells were cultured in the absence of FBS, the chitosan matrix of Example 2 in which sulfonated chitosan was adsorbed had relatively cells compared to the chitosan matrices of Comparative Examples 2, 4, and 6. Although they were bonded, no significant difference was observed.

しかしながら、図６に示すようにＦＢＳのある状態で細胞を培養した場合、スルホン化キトサンを吸着させた実施例２のキトサンマトリックスは、比較例２、４、６のキトサンマトリックスに比べて、著しく多量の細胞が接着していた。すなわち、スルホン化キトサンが表面に存在するキトサンマトリックスは、血清存在下における細胞接着性が非常に高いことがわかった。これは、血清中に含まれる塩基性接着蛋白質（フィブロネクチン、ビトリネクチンなど）又は塩基性細胞増殖因子が吸着し、リガンドと細胞レセプター間とが相互作用するためと考えられる。   However, when cells were cultured in the presence of FBS as shown in FIG. 6, the chitosan matrix of Example 2 adsorbed with sulfonated chitosan was significantly larger than the chitosan matrices of Comparative Examples 2, 4, and 6. Cells were attached. That is, it was found that the chitosan matrix having sulfonated chitosan on the surface has very high cell adhesion in the presence of serum. This is presumably because the basic adhesion protein (fibronectin, vitrinectin, etc.) or basic cell growth factor contained in the serum is adsorbed and the ligand interacts with the cell receptor.

（試験例３）：細胞培養試験２
また、各実施例及び各比較例のキトサンマトリックスに上述した培養条件２で細胞を培養し、培養後３日後、７日後のキトサンマトリックスの状態を倍率５００倍でＳＥＭにより観察した。結果を図７〜１４に示す。 (Test Example 3): Cell culture test 2
In addition, the cells were cultured on the chitosan matrix of each Example and each Comparative Example under the above-described culture condition 2, and the state of the chitosan matrix after 3 days and 7 days after the culture was observed by SEM at a magnification of 500 times. The results are shown in FIGS.

図７〜１４に示すように、各実施例及び各比較例のキトサンマトリックスは、時間経過とともに細胞の増殖が観察された。実施例１及び２のキトサンマトリックスは、比較例１〜６のキトサンマトリックスよりも、３日経過後にすでに細胞が多量に増殖していることが確認できた。これは、細胞の接着量が多く、且つ接着した細胞が増殖しやすいためであると考えられる。   As shown in FIGS. 7 to 14, in the chitosan matrix of each Example and each Comparative Example, cell proliferation was observed with time. It was confirmed that the chitosan matrices of Examples 1 and 2 were already proliferating in a larger amount after 3 days than the chitosan matrices of Comparative Examples 1-6. This is presumably because the amount of cell adhesion is large and the adhered cells tend to proliferate.

以上より、本発明のキトサンマトリックスは細胞培養基材として好適に用いることができるものであることがわかった。また、血清存在下において、特に細胞の接着性に優れることがわかった。   From the above, it was found that the chitosan matrix of the present invention can be suitably used as a cell culture substrate. In addition, it was found that cell adhesion was particularly excellent in the presence of serum.

本発明にかかるキトサンマトリックスの細胞接着性を説明する概略図である。It is the schematic explaining the cell adhesiveness of the chitosan matrix concerning this invention. 予備試験１の結果を示すグラフである。3 is a graph showing the results of preliminary test 1. 予備試験２の結果を示すグラフである。6 is a graph showing the results of preliminary test 2. 試験例１の結果を示すグラフである。6 is a graph showing the results of Test Example 1. 試験例２の培養から１日後のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。2 is a SEM image of a chitosan matrix one day after the cultivation of Test Example 2. 試験例２の培養から１日後のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。2 is a SEM image of a chitosan matrix one day after the cultivation of Test Example 2. 実施例１のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。2 is a SEM image of the chitosan matrix of Example 1. 実施例２のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。2 is a SEM image of the chitosan matrix of Example 2. 比較例１のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。3 is a SEM image of the chitosan matrix of Comparative Example 1. 比較例２のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。3 is a SEM image of a chitosan matrix of Comparative Example 2. 比較例３のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。4 is an SEM image of a chitosan matrix of Comparative Example 3. 比較例４のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。6 is an SEM image of a chitosan matrix of Comparative Example 4. 比較例５のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。6 is a SEM image of a chitosan matrix of Comparative Example 5. 比較例６のキトサンマトリックスのＳＥＭ画像である。10 is a SEM image of a chitosan matrix of Comparative Example 6.

Claims (9)

キトサン繊維の繊維集合体からなり、前記キトサン繊維の少なくとも表面にスルホン化キトサンが存在することを特徴とするキトサンマトリックス。 A chitosan matrix comprising a fiber assembly of chitosan fibers, wherein sulfonated chitosan is present on at least the surface of the chitosan fibers. 請求項１に記載のキトサンマトリックスにおいて、前記キトサン繊維の表面にスルホン化キトサンが吸着したものであることを特徴とするキトサンマトリックス。 The chitosan matrix according to claim 1, wherein sulfonated chitosan is adsorbed on the surface of the chitosan fiber. 請求項２に記載のキトサンマトリックスにおいて、スルホン化キトサンを含む溶液に前記繊維集合体を浸漬させることで形成されたものであることを特徴とするキトサンマトリックス。 3. The chitosan matrix according to claim 2, wherein the chitosan matrix is formed by immersing the fiber assembly in a solution containing sulfonated chitosan. 請求項１に記載のキトサンマトリックスにおいて、前記キトサン繊維をスルホン化したものであることを特徴とするキトサンマトリックス。 The chitosan matrix according to claim 1, wherein the chitosan fiber is sulfonated. 請求項１〜４の何れかに記載のキトサンマトリックスにおいて、キトサン繊維がエレクトロスピニングにより形成されたものであることを特徴とするキトサンマトリックス。 The chitosan matrix according to any one of claims 1 to 4, wherein the chitosan fibers are formed by electrospinning. 請求項１〜５の何れかに記載のキトサンマトリックスにおいて、血清を付加したものであることを特徴とするキトサンマトリックス。 The chitosan matrix according to any one of claims 1 to 5, wherein serum is added thereto. 請求項１〜６の何れかに記載のキトサンマトリックスからなることを特徴とする細胞培養基材。 A cell culture substrate comprising the chitosan matrix according to any one of claims 1 to 6. 請求項１〜６の何れかに記載のキトサンマトリックスからなることを特徴とする創傷被覆材。 A wound dressing comprising the chitosan matrix according to any one of claims 1 to 6. 請求項１〜６の何れかに記載のキトサンマトリックスからなることを特徴とする神経再生材。 A nerve regeneration material comprising the chitosan matrix according to any one of claims 1 to 6.
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