JP2008195957A - カチオン化ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒアルロン酸などとポリイオンコンプレックスを形成し得る人体成分により近いカチオン性ポリマーを提供する。
【解決手段】ヒアルロン酸に、４級アンモニウムカチオン基と水酸基に対する反応性基とを有するカチオン化剤を反応させて、ヒアルロン酸の水酸基の水素原子の少なくとも一部が、４級アンモニウムカチオン基を有する基で置換されたカチオン化ヒアルロン酸を得る。カチオン化剤としてグリシジルトリアルキルアンモニウムハライドなどを用いることができる。得られたカチオン化ヒアルロン酸は、静電的相互作用により、ヒアルロン酸などのアニオン性素材とポリイオンコンプレックスゲルを形成する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ヒアルロン酸にカチオン性基が導入されたカチオン化ヒアルロン酸の製造方法に関する。

ヒアルロン酸は、下記一般式（Ｉ）で示されるように、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とが結合した構造を１ユニットとし、これが繰り返し結合した高分子化合物である。

ヒアルロン酸は、グルクロン酸に由来するカルボキシル基の存在により、ポリアニオンとしての性質を有する。このようなポリアニオン性を利用して、水中でポリカチオン性物質と混合することにより、水不溶性のポリイオンコンプレックスゲルを形成できることが知られている。
例えば、特許文献１には、ヒアルロン酸ゲル表面にカチオン性物質によるポリイオンコンプレックス膜を形成した薬剤内包ヒアルロン酸ゲルカプセルが記載されている。
また、特許文献２には、ヒアルロン酸とカチオン性ポリアクリル酸誘導体とのポリイオンコンプレックスを製剤用担体として用いた徐放性製剤が記載されている。
また、医療用接着材や固定材、癒着防止材など医療用材料への適用も報告されている（特許文献３〜５）。

ヒアルロン酸はヒトを初めとする生体の結合組織に広く分布するので生体安全性、生体適合性に優れるが、ポリイオンコンプレックスの形成におけるヒアルロン酸の相手となるカチオン性物質についても生体安全性、生体適合性に優れるものが望まれている。
生体素材由来のカチオン性ポリマーとしては、キチンの脱アセチル化物であるキトサンやアミノ化セルロースなどが知られているが、より人体成分に近いものが求められていた。
特開平６−２５４３８１号公報 特開平７−３３６８２号公報 特開２０００−５２９６号公報 特開２０００−１１６７６５号公報 特開２００２−６３８号公報

本発明は、前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ヒアルロン酸などのアニオン性生体適合性素材とポリイオンコンプレックスを形成し得る、人体成分により近いカチオン性ポリマーを提供することにある。

前記課題を解決するために、本発明者らはヒアルロン酸への４級アンモニウムカチオン基の導入を試み、カチオン化されたヒアルロン酸を得ることに成功した。そして、このカチオン化ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸と水存在下でポリイオンコンプレックスゲルを形成することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明にかかるカチオン化ヒアルロン酸の製造方法は、ヒアルロン酸に、４級アンモニウムカチオン基と水酸基に対する反応性基とを有するカチオン化剤を反応させて、ヒアルロン酸の水酸基の水素原子の少なくとも一部が、４級アンモニウムカチオン基を有する基で置換されたカチオン化ヒアルロン酸を得ることを特徴とする。
水酸基に対する反応性基の好適な例としてグリシジル基が挙げられる。
また、ヒアルロン酸１ユニット当たり０．１倍以上（モル比）のカチオン化剤を用いることが好適である。
また、ヒアルロン酸とカチオン化剤との反応を２０〜５０℃で行うことが好適である。
本発明のカチオン化ヒアルロン酸は、下記一般式（１）で示されることが好適である。

（式中、Ａは水素原子あるいは下記一般式（２）で示される置換基であり、前記置換基の平均置換度がヒアルロン酸１ユニット当たり０．１以上である。）

（Ｒ^１は水酸基を有していてもよい炭素数３〜５のアルキレン基、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ炭素数１〜３のアルキル基を示す。）

また、好適なカチオン化剤として、下記一般式（３）で示される化合物が挙げられる。

（式中、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。）

また、本発明にかかるポリイオンコンプレックスの製造方法は、前記何れかに記載の方法でカチオン化ヒアルロン酸を製造し、得られたカチオン化ヒアルロン酸とアニオン性生体適合性素材との静電的相互作用によりポリイオンコンプレックスを形成させることを特徴とする。好適なアニオン性生体適合性素材としてヒアルロン酸が挙げられる。

本発明のカチオン化ヒアルロン酸は、水存在下でヒアルロン酸などのアニオン性素材とポリイオンコンプレックスを形成することができ、従来ヒドロゲルが用いられている各種用途に応用が期待できる。例えば、ヒアルロン酸とのポリイオンコンプレックスは水不溶性のヒドロゲルであり、その主体は人体に存在するヒアルロン酸であるため、生体安全性、生体適合性が高く、医薬・医療・衛生・食品・化粧料分野等において好適である。

本発明のカチオン化ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸の水酸基の水素原子の少なくとも一部が、４級アンモニウムカチオン基を有する基で置換されたものである。
本発明のカチオン化ヒアルロン酸の好適な例として、前記一般式（１）で示される構造を有するものが挙げられる。

一般式（１）において、Ａは水素原子あるいは前記一般式（２）で示される置換基である。一般式（２）で示される置換基の平均置換度は、ヒアルロン酸１ユニット当たり０．１以上であることが好ましく、さらには１以上であることが好ましい。
一般式（２）において、Ｒ^１は炭素数３〜５のアルキレン基であるが、水酸基を有していてもよく、好適な例としては−ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−が挙げられる。
Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ炭素数１〜３のアルキル基を示す。
ｎは重合度を示す正の整数である。ヒアルロン酸の分子量は特に制限されないが、通常は１０〜３００万程度のものが使用される。

本発明のカチオン化ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸にカチオン化剤を反応させることにより合成することができる。
原料となるヒアルロン酸の製造方法は特に制限されない。ヒアルロン酸は、例えば、鶏冠のトサカなどの生体組織からの抽出、あるいは微生物を用いた培養などにより工業的に生産されており、その塩（ナトリウム塩など）も市販されている。本発明においては、ヒアルロン酸あるいはその塩を用いることができる。

カチオン化剤としては、４級アンモニウムカチオン基と、ヒアルロン酸の水酸基に対する反応基とを有する化合物であれば特に制限されない。また、カチオン化剤の量は、所望の置換度に応じて適宜設定することができる。通常ヒアルロン酸１ユニット当たり０．１倍以上（モル比）、さらには１倍以上（モル比）用いることが好ましい。

好適なカチオン剤としては、前記一般式（３）で示されるグリシジルトリアルキルアンモニウムハライドが挙げられる。
一般式（３）において、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ炭素数１〜３のアルキル基である。Ｘはハロゲン原子であり、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなどが挙げられるが、好ましくはＣｌである。具体例としては、グリシジルトリメチルアンモニウムクロライド、グリシジルトリエチルアンモニウムクロライド、グリシジルトリプロピルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。

グリシジルトリアルキルアンモニウムハライドをカチオン化剤として用いる場合、反応はアルカリ存在下に行うことが好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属、エチレンジアミン、トリアチルアミントリメチルアミン等の有機アミンが挙げられるが、好ましくは水酸化ナトリウムである。

溶媒としては、通常水が好適に用いられるが、特に反応に支障がない限り、その他の溶媒を用いてもよい。
反応温度は、原料や目的とする置換度に応じて適宜設定されるが、通常２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃である。高温ではヒアルロン酸の加水分解が進行して低分子化することがあるので、低分子化を望まない場合には注意を要する。

反応終了後は、反応液にアルコールやアセトンなどカチオン化ヒアルロン酸の貧溶媒を添加し、カチオン化ヒアルロン酸を沈殿させる。さらに、必要に応じて洗浄、乾燥を行って、本発明のカチオン化ヒアルロン酸を得ることができる。

カチオン化ヒアルロン酸はポリカチオン、通常のヒアルロン酸はポリアニオンとしての性質を有する。よって、両者を水中で共存させると両者の静電的相互作用によってポリイオンコンプレックスを形成し、水不溶性のゲルが沈殿する。このゲルは、目的に応じて粒状、薄膜状、塊状など種々の形状に成形可能であり、また、ヒドロゲルのままで、あるいは乾燥して使用してもよい。
カチオン化ヒアルロン酸とヒアルロン酸の混合比は、ポリイオンコンプレックスを形成する範囲であれば特に制限されず、目的に応じて適宜決定することができる。

また、両者を水中で共存させた際に、水中に薬剤を溶解あるいは分散しておくことにより、ゲル内に薬剤を内包させることができる。あるいは、特許文献１に記載の方法に準じて、水溶性薬剤を溶解したヒアルロン酸水溶液をカチオン化ヒアルロン酸水溶液中に滴下する方法、油溶性薬剤を含む油相がヒアルロン酸水溶液中に乳化分散されたエマルジョンをカチオン化ヒアルロン酸水溶液に滴下する方法により、薬剤を内包させることもできる。

本発明のポリイオンコンプレックスはその主体がヒアルロン酸であるため、生体安全性や生体適合性が高く、例えば、製剤担体などとして利用できる。また、その他医療用、衛生用、食品用、化粧料用材料などとしての利用も可能である。
また、目的や用途によっては、本発明のカチオン化ヒアルロン酸を他のアニオン性物質とのポリイオンコンプレックス形成に用いることも可能である。他のアニオン性物質としては分子内に複数のアニオン性基（例えば、カルボキシル基、硫酸基など）を有し、カチオン化ヒアルロン酸と水存在下でポリイオンコンプレックスを形成するものであれば制限されない。

例えば、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ペクチンなどのアニオン性天然多糖類；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキトサン、硫酸化セルロース、硫酸化デキストランなどのアニオン性合成多糖類；ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、グルタミン酸アスパラギン酸共重合体などの酸性アミノ酸重合体；ポリヌクレオチド；血清アルブミン、ペプシン、ウレアーゼ、フェチュインなどの酸性タンパク質；ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマーなどのアニオン性ポリマー；これらの誘導体や塩などが挙げられる。また、その他ホスホリルコリン基を含有するアニオン性生体適合性ポリマーも挙げられる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

製造例１ カチオン化ヒアルロン酸の製造
グリシジルトリメチルアンモニウムクロライド１０．４ｍＬ（０．０７８ｍｏｌ）を水１１．２５ｍＬと混合し、ヒアルロン酸（商品名：バイオヒアロ９、（株）資生堂製）５ｇ（二糖ユニットとして０．０１３ｍｏｌ）、及び２M水酸化ナトリウム水溶液１．２５ｍLを加えて溶解した。
この混合液を、室温で３日間反応させた。反応後、メタノールを加えて反応物を沈殿させ、アセトンで十分に洗浄し、白色粉末４．２ｇを得た。
得られた粉末について、ＧＰＣで低分子化合物（未反応試薬）が除去されていることを確認した。
また、^１Ｈ−ＮＭＲ（図１参照）で構造確認したところ、トリメチルアンモニウムのプロトンに由来するシグナルが検出され、２−ヒドロキシ−３−トリメチルアンモニウムプロピル基が導入されていることを確認した。
また、平均置換度は、^１Ｈ−ＮＭＲの積分値から、ヒアルロン酸１ユニット当たり約１．４であった。

試験例１ ポリイオンコンプレックスの形成
製造例１で得られたカチオン化ヒアルロン酸の１％（ｗ／ｗ）水溶液を調製した。別に、ヒアルロン酸（商品名：バイオヒアロ１２、（株）資生堂製）の１％（ｗ／ｗ）水溶液を調製した。
両水溶液は何れも透明の液体であったが、これらを等量混合したところ、ゲル状の沈殿を生じた。このゲルは、カチオン化ヒアルロン酸のカチオン基と、ヒアルロン酸のアニオン基とがイオン対を形成したポリイオンコンプレックスであると考えられる。

試験例２ ポリイオンコンプレックスの形成
製造例１で得られたカチオン化ヒアルロン酸の１％（ｗ／ｗ）水溶液を調製した。別に、カルボキシビニルポリマーの０．１％（ｗ／ｗ）水溶液を調製した。
両水溶液は何れも透明の液体であったが、これらを等量混合したところ、ゲル状の沈殿を生じた。このゲルは、カチオン化ヒアルロン酸のカチオン基と、カルボキシビニルポリマーのアニオン基とがイオン対を形成したポリイオンコンプレックスであると考えられる。

図１は、本発明にかかるカチオン化ヒアルロン酸（製造例１）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

Claims (8)

1. ヒアルロン酸に、４級アンモニウムカチオン基と水酸基に対する反応性基とを有するカチオン化剤を反応させて、ヒアルロン酸の水酸基の水素原子の少なくとも一部が、４級アンモニウムカチオン基を有する基で置換されたカチオン化ヒアルロン酸を得ることを特徴とするカチオン化ヒアルロン酸の製造方法。
2. 請求項１記載の方法において、水酸基に対する反応性基がグリシジル基であることを特徴とするカチオン化ヒアルロン酸の製造方法。
3. 請求項１又は２記載の方法において、ヒアルロン酸１ユニット当たり０．１倍以上（モル比）のカチオン化剤を用いることを特徴とするカチオン化ヒアルロン酸の製造方法。
4. 請求項１〜３の何れかに記載の方法において、ヒアルロン酸とカチオン化剤との反応を２０〜５０℃で行うことを特徴とするカチオン化ヒアルロン酸の製造方法。
5. 請求項１〜４の何れかに記載の方法において、得られたカチオン化ヒアルロン酸が、下記一般式（１）で示されることを特徴とするカチオン化ヒアルロン酸の製造方法。
   

   

   （式中、Ａは水素原子あるいは下記一般式（２）で示される置換基であり、前記置換基の平均置換度がヒアルロン酸１ユニット当たり０．１以上である。）
   

   

   （Ｒ^１は水酸基を有していてもよい炭素数３〜５のアルキレン基、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ炭素数１〜３のアルキル基を示す。）
6. 請求項１〜５の何れかに記載の方法において、カチオン化剤が、下記一般式（３）で示される化合物であることを特徴とするカチオン化ヒアルロン酸の製造方法。
   

   

   （式中、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。）
7. 請求項１〜６の何れかに記載の方法でカチオン化ヒアルロン酸を製造し、得られたカチオン化ヒアルロン酸とアニオン性生体適合性素材との静電的相互作用によりポリイオンコンプレックスを形成させることを特徴とするポリイオンコンプレックスの製造方法。
8. 請求項７記載の方法において、アニオン性生体適合性素材がヒアルロン酸であることを特徴とするポリイオンコンプレックスの製造方法。

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