JP2008195656A

JP2008195656A - 人工酸素運搬体製剤

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Publication number: JP2008195656A
Application number: JP2007032978A
Authority: JP
Inventors: Toshiya Kai; 俊哉甲斐; Seiji Nishida; 誠司西田; Naohisa Katayama; 直久片山; Nobuaki Hori; 伸明堀; Yoshihisa Manabe; 宣久真鍋; Hiroko Suga; 裕子須賀
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2008-08-28
Also published as: US20080193516A1; ATE494305T1; EP1958963A1; CN101264320B; EP1958963B1; CN101264320A; DE602008004272D1; US20100145298A1

Abstract

【課題】メト化率の低い、言い換えれば保存安定性に優れた人工酸素運搬体を含有する製剤の提供。
【解決手段】人工酸素運搬体製剤は、生体内で酸素を可逆的に吸脱着する人工酸素運搬体と、還元剤とを含有する。また、バック製剤は、本発明の人工酸素運搬体製剤が充填され密封された内包装と、前記内包装を密封する外包装と、前記内包装と前記外包装との間に存在する脱酸素剤とを有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体内で酸素を可逆的に吸脱着する人工酸素運搬体を含有する人工酸素運搬体製剤に関する。この人工酸素運搬体製剤は、医療分野において、虚血部位や腫瘍組織への酸素供給用、大量出血患者の輸血用、臓器保存灌流液、体外循環液、細胞培養液として使用することができる。

人工酸素運搬体として用いられているヘモグロビンやポルフィン金属錯体は、酸素結合能を持たないメト化体の含有率、すなわちメト化率が低いことが望ましい。メト化率が上昇する大きな要因は製造工程中や保存中における酸化であるので、製造工程において不活性ガスにより酸素を除去する方法が提案されている（特許文献１、２等を参照）。

しかし、ヘモグロビン等は酸素と結合しやすいので、特許文献１、２に記載方法だけでは十分な効果が期待できず、製剤を容器やバックに充填する際の雰囲気中の酸素濃度も可及的に低減する必要がある。したがって、製造コストの上昇を招く結果となる。

特許第２７０９４１９号公報特許第３４６６５１６号公報

本発明の目的の１つは、メト化率の低い、言い換えれば保存安定性に優れた人工酸素運搬体を含有する製剤を提供することであり、本発明の他の目的は、このような製剤を製造する際のコスト上昇を抑えることである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、医薬品組成物として用いる際に毒性の低いシステイン（以下、Ｃｙｓと略記する）を含む還元剤を、本人工酸素運搬体製剤に含有させることにより、上記課題が解決されることを見いだし本発明に到達した。更に、本人工酸素運搬体製剤を内包装のバックに充填し、内包装と外包装の間に脱酸素剤を入れ、外包装することにより、保存安定性に優れたバック製剤が得られことを見いだした。

本発明の人工酸素運搬体含有製剤は、メト化率が低く、保存安定性に優れる。また、製剤をバックに充填する際の雰囲気中の酸素濃度を大気中の酸素濃度と同程度とすることができるので、製造コストの上昇を抑えることができる。

以下、本発明の実施形態を説明する。本発明の人工酸素運搬体製剤は、生体内で酸素を可逆的に吸脱着する人工酸素運搬体と、還元剤とを含有する。

（１）人工酸素運搬体
人工酸素運搬体は、生体内で酸素を可逆的に吸脱着する酸素運搬能を有するものであって、赤血球等の天然物由来のものをも含む。例えば、ヘモグロビン内包型リポソーム、ポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体、ポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」と表記する）化ポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体、ヘモグロビン、分子架橋型ヘモグロビン、ヘモグロビン重合体、ＰＥＧ化ヘモグロビン重合体が挙げられ、これらからなる群から選ばれる１種又は２種以上を用いることができる。

〔ヘモグロビン内包型リポソーム〕
ヘモグロビン内包リポソーム（以下「ＨｂＶ」とも表記する）とは、リポソーム内部にヘモグロビンを包含した化合物である。通常、「リポソーム」とは、膜状に集合した脂質および内部の水相から構成される閉塞小胞を意味するが、本発明においては、特に内水相を有しているか否かに関わらず、脂質が集合した微粒子全体を意味する。また、リポソームの構造も特に限定されず、多重層リポソームであってもよいし、一枚膜リポソームであってもよい。リポソームの大きさは特に限定されないが、体積平均粒子径が１０〜５０００ｎｍ程度、好ましくは３０〜５００ｎｍ程度である。リポソームの体積平均粒子径は、動的光散乱法等の原理に基づき求めることができる。

リポソームを構成する脂質も特に限定されず、公知の脂質であってよい。脂質としては、例えば糖脂質、ステロール類、脂肪酸、リン脂質、両親媒性アルキルアミノ酸誘導体、ジアルキルジメチルアンモニウム、ポリグリセロールアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等（Liposome Technology, 2nd edition, vol.1, 141, 1993）、アルキルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、アルキルシュークロースエステル等（Liposome Technology, 2nd edition, vol.1, 141, 1993）、ポリオキシエチレン−ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体（特表平６―５０８８３１号公報）、長鎖アルキルアミン類（テトラデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ステアリルアミン等）、または長鎖脂肪酸ヒドラジド類（ミリスチン酸ヒドラジド、パルミチン酸ヒドラジドもしくはステアリン酸ヒドラジド等）などを挙げることができる。本発明においては、これらの脂質は単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。

リポソームは、特に、非リン脂質型の脂質とＰＥＧが結合した複合体から構成されるのが好ましい。ＰＥＧの含有量は、特に限定されないが、リポソームを構成する総脂質量に対して０．１〜３０モル％程度が好ましい。

糖脂質としては、例えばグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等が挙げられる。グリセロ糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド類（ジガラクトシルジラウロイルグリセリド、ジガラクトシルジミリストイルグリセリド、ジガラクトシルジパルミトイルグリセリドもしくはジガラクトシルジステアロイルグリセリド等）、またはガラクトシルジグリセリド類（ガラクトシルジラウロイルグリセリド、ガラクトシルジミリストイルグリセリド、ガラクトシルジパルミトイルグリセリドもしくはガラクトシルジステアロイルグリセリド等）が挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等が挙げられる。

ステロール類としては、例えば、コレステロール、コレステロールヘミサクシネート、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール、エルゴステロールまたはラノステロール等が挙げられる。

リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチンまたは水素添加リン脂質等の天然または合成のリン脂質等が挙げられる。

〔ポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体〕
ポルフィリン金属錯体とは、ポルフィリン環に中心金属が配位した金属錯体を指し、酸素との可逆的な結合能を有するもの全てを包含する。金属錯体の中心金属としては、鉄、コバルト、クロムなどが好ましく、さらに好ましくは鉄（II）、コバルト（II）である。具体的なポルフィリン金属錯体としては、テトラフェニルポルフィリン、プロトポルフィリン、オクタアルキルポルフィリン、およびそれらの誘導体等が挙げられるが、好ましくはプロトポルフィリン誘導体である。ポルフィリン金属錯体は、ＰＥＧで修飾されていても良い。ＰＥＧの分子量は、特に限定されないが、２００〜４００万程度、好ましくは1,000 〜50,000程度である。

ポルフィリン金属錯体と複合体を形成するアルブミンとしては、特に限定されず、ヒト血清アルブミン、動物由来血清アルブミン、遺伝子組換え型動物又はヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、およびそれらの多量体等のいずれも利用できる。感染防止等の観点から、特にｒＨＳＡが好ましい。

ポルフィリン金属錯体とアルブミンの複合体としては、一例として、テトラフェニルポルフィリン鉄誘導体である２−［８−｛Ｎ−（２−メチルイミダゾリル）｝オクタノイロキシメチル］−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバロイルアミノ）フェニルポルフィナト鉄（II）等をヒト由来アルブミンまたは組換えアルブミンの疎水ポケットに包接させた酸素輸液剤（E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chemistry, vol.8, 534-538, 1997）等が挙げられる。

〔ヘモグロビン〕
ヘモグロビンとしては、特に限定されず、種々の生体由来のヘモグロビンおよび／または遺伝子組み換え型のヘモグロビンのいずれも利用できるが、好ましくは遺伝子組み換え型のヘモグロビンである。

また、分子内又は分子間で架橋した分子架橋型ヘモグロビン、二量体などのヘモグロビン重合体、ＰＥＧで修飾されたＰＥＧ化ヘモロビン重合体などを用いることができる。具体的には、例えば、ヘモグロビン分子内をグルタールアルデヒドで架橋した分子架橋型ヘモグロビン、ヘモグロビン分子間をカルボジイミド若しくはＳＰＤＰ（N-Succinimidyl
3-(2-pyridyldithio)propionate）を利用したＳ−Ｓ交換反応で架橋した分子架橋型ヘモグロビン重合体、ヘモグロビンに対しＰＥＧマレイミドを利用したＳ−Ｓ交換反応で架橋したＰＥＧ化ヘモロビン、ヘモグロビン分子間をカルボジイミド若しくはＳＰＤＰを利用したＳ−Ｓ交換反応で架橋した分子架橋型ヘモグロビン重合体に対しＰＥＧマレイミドを利用したＳ−Ｓ交換反応で架橋したＰＥＧ化ヘモグロビン重合体等が挙げられる。

人工酸素運搬体は公知の方法により製造することができる。ヘモグロビン内包リポソームは、例えば逆相蒸発法、高圧押し出し法、マイクロフルイダイザー法などにより製造することができる。ヘモグロビン内包リポソームの調製は、ヘモグロビンの変性を防止するために、１０℃以下の低温で行うのが望ましい。

リポソームは、公知の手法に従って製造することができる。ＰＥＧと脂質の複合体を含むリポソームを製造する場合、ＰＥＧと脂質との結合は、通常、スペーサー分子を介して行われる。スペーサー分子はＰＥＧと脂質の両者に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、アミノ酸やコハク酸が挙げられる。アミノ酸としては、コア部に１つの反応性官能基を有し、２つの分岐末端にそれぞれ反応性官能基を有する三官能性アミノ酸が特に好ましい。その例を挙げると、リシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン等である。その中でも、コア部に第１の反応性官能基を、２つの分岐末端に同じ第２の官能基を有する三官能性アミノ酸がより好ましい。例えば、１つの末端カルボキシル基と２つの末端アミノ基を有するリシン、グルタミン、アスパラギン等、あるいは１つの末端アミノ基と２つの末端カルボキシル基を有するアスパラギン酸、グルタミン酸等である。

ポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体は、例えば、E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chemistry, vol.8, 534-538, 1997に記載されたアルブミン−ヘムの調製方法により製造することができる。

ヘモグロビンは、ヒト赤血球からストローマ（赤血球膜）を除去し、ヘモグロビン溶液のｐＨを７．０〜７．５に調整したものが望ましい。ヘモグロビン溶液のｐＨの調整には、水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムの水溶液などが用いられる。ヘモグロビン溶液に緩衝液を添加することによってｐＨの調整もできる。緩衝液として例えばＴｒｉｓ、ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、無機リン酸等の緩衝液が利用できる。遺伝子組み換え型のヘモグロビンも同様に製造することができる。

（２）還元剤
還元剤としては、どの様な還元剤でも適合するのではなく、酸素存在下で人工酸素運搬体のメト化を抑制しうる性能のあるものがふさわしい。

還元剤としては、例えば、含硫アミノ酸や還元性のイオウ酸素酸化合物が挙げられる。含硫アミノ酸としては、Ｃｙｓやメチオニン、シスチンが挙げられ、これらの誘導体（例えば、ホモシステイン、Ｎ−アセチルシステインなど）も含硫アミノ酸に包含される。還元性のイオウ酸素酸化合物は、硫黄及び酸素を含み、還元性を有する酸およびその塩（無機または有機塩基との塩）であり、例えば、亜ジチオン酸、亜ジチオン酸塩（亜ジチオン酸ナトリウムなど）、亜硫酸水素塩（亜硫酸水素ナトリウムなど）、亜硫酸塩（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、乾燥亜硫酸ナトリウムなど）、ピロ亜硫酸塩（ピロ亜硫酸ナトリウムなど）、重亜硫酸塩（重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸カリウムなど）、次亜硫酸塩（次亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸カリウムなど）、ロンガリット（ＣＨ_２ＯＨＳＯ_２Ｎａ）などが挙げられる。

また、エリソルビン酸またはその塩（エリソルビン酸ナトリウムなど）、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸塩（エデト酸ナトリウムなど）、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロイソシアヌール酸塩（ジクロルイソシアヌール酸カリウムなど）、チオグリコール酸塩（チオグリコール酸ナトリウムなど）、チオリンゴ酸塩（チオリンゴ酸ナトリウムなど）、１，３−ブチレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、ｄ−δ−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸（ＮＤＧＡ）、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸エステル、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル−テトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］２−メルカプトベンズイミダゾール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム２ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムが挙げられる。これらの還元剤の群から選ばれる１種の還元剤のみを用いてもよく、２種以上の還元剤を用いてもよい。これらの還元剤のうちＣｙｓが好ましく、さらにはＬ体であるＣｙｓ（以下、Ｌ−Ｃｙｓと略記する）が好ましい。

還元剤は、人工酸素運搬体との混合を容易にするために、注射用水、生理食塩水、緩衝液（例えばリン酸緩衝液）に溶解または分散させることが好ましい。還元剤の配合量は、製剤中０．００１〜２０ｍＭ、好ましくは０．０１〜６ｍＭである。

（３）人工酸素運搬体製剤の製造
人工酸素運搬体と還元剤は、それぞれ不活性ガスにより十分に脱酸素化した後、酸素希薄な環境下で容器又はバック中に双方とも混合し無菌的に充填して密封される。例えば、ガラスバイアルやポリ塩化ビニリデン系、エチレン−ビニルアルコール共重合体系などの酸素透過性が極めて低い材質から成る容器を用いて、あるいはアルミニウム／ポリエチレン層状バック、ポリ塩化ビニリデン系、エチレン−ビニルアルコール共重合体系などの酸素透過性が極めて低い材質から成るバックを用いて、それらに充填して封入する。

また、人工酸素運搬体製剤を内包装に充填して密封し、さらに内包装を脱酸素剤とともに外包装で密封して、バック製剤としても良い。内包装として、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの酸素透過性材質から成るバック又は容器を用いることができ、外包装として、上述の酸素透過性が極めて低い材質から成るバック又は容器を用いることができる。脱酸素剤としては、鉄系や有機系（アスコルビン酸系や低分子フェノール系など）などのいずれの脱酸素剤も好適に使用できる。脱酸素剤の使用量は、内包装や外包装の容量などにより適宜設定することができるが、好ましくは、外包装と内包装の間の空間の酸素濃度を０．１％以下のレベルにまで下げることが可能となる条件に設定する。例えば、外包装の容量の１．５〜１０倍の容量の酸素を吸収する能力を有する脱酸素剤を用いることができる。このように二重包装とすることで、外包装と内包装の間に残存した酸素をほぼ完全に除去するとともに、外部からの酸素の侵入を防止することができる。

容器又はバック中に充填するに際しては、一般に、酸素の混入を極力さけるために、低酸素濃度雰囲気下で行われる。しかし、本発明の人工酸素運搬体製剤は還元剤を含有するので、酸素濃度がより高い雰囲気下で充填を行うことができる。具体的には、以下の実施例で示すように、例えば大気中の酸素濃度と同程度の酸素濃度雰囲気下で充填を行っても約１か月間の保存が可能となる。したがって、低酸素濃度雰囲気にするための設備が不要となり、製造コストの上昇を抑えることができる。

本発明の人工酸素運搬体製剤は、医薬的に許容される添加物をさらに含んでいても良い。本発明の人工酸素運搬体製剤は、−２０℃〜６０℃、好ましくは４〜２５℃で保存可能である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。以下の実施例では、人工酸素運搬体としてヘモグロビン内包型リポソームを、還元剤としてシステインをそれぞれ用いた場合について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。試験例の保存安定性は、下記の方法により測定したメト化率により評価を行った。

〔ヘモグロビン内包型リポソームのメト化率の測定方法〕
１．溶液の調製
リン酸緩衝液（ＰＢ液，ｐＨ７）を用いて、ＨｂＶ液（ヘモグロビン：５ｇ／ｄＬ）、ＮａＮＯ_２溶液（５ｇ／ｄＬ）、Ｌ−Ｃｙｓ溶液（１０ｇ／ｄＬ）を調製する。なお、Ｌ−Ｃｙｓ溶液はバイアル瓶にいれ、窒素バブルを行った後、嫌気的雰囲気に保つ。

２．標準スペクトル（メト化率０％，１００％）の測定
ａ．メトＨｂＶ：ＨｂＶ液１ｍＬにＮａＮＯ_２溶液５０μＬを添加混合し、室温で１時間放置する。首付きＵＶ測定用キュベットにＰＢ液５ｍＬを添加し、上記のＨｂＶ液１０μＬを添加する。さらに、ＰＢ液１５０μＬを添加し、３００〜５００ｎｍで測光する。
ｂ．デオキシＨｂＶ：ＨｂＶ液１ｍＬにＰＢ液５０μＬを添加する。首付きＵＶ測定用キュベットにＰＢ液５ｍＬを添加し、窒素バブル（１０分間）を行う。Ｌ−Ｃｙｓ溶液１５０μＬと上記のＨｂＶ液１０μＬを添加し、さらに窒素バブル（５分間）を行った後に、３００〜５００ｎｍで測光する。

３．検量線の作製法
メトＨｂＶとデオキシＨｂＶのスペクトルを重ねて表記する。３６０ｎｍ付近と４６０ｎｍ付近に生じる等吸収点を直線で結び、ベースラインとする。デオキシＨｂＶのスペクトルにおいて、４０５ｎｍでのベースラインからの吸光度をａ、４３０ｎｍでのベースラインからの吸光度をｃとする。同様に、メトＨｂＶのスペクトルにおいて、４０５ｎｍでのベースラインからの吸光度をｂ、４３０ｎｍでのベースラインからの吸光度をｄとする。このとき、４０５ｎｍにおけるベースラインからの吸光度（Ａ405）および４３０ｎｍにおけるベースラインからの吸光度（Ａ430）は、メト化率（Ｍet）（％）を用いて、次の通りに表される。

Ａ405＝（ｂ−ａ）×Ｍet／１００＋ａ
Ａ430＝−（ｃ−ｄ）×Ｍet／１００＋ｃ

また、Ｑ＝Ａ405／Ａ430とすると、メト化率（Ｍet）は次の通りに表される。
メト化率（Ｍet）（％）＝｛１００（ａ−Ｑｃ）｝／｛ａ−ｂ−Ｑ（ｃ−ｄ）｝

４．検体のメト化率の測定法
首付きＵＶ測定用キュベットにＰＢ液５ｍＬを添加し、検体のＨｂＶ液を添加する。添加量は、ヘモグロビン濃度が５ｇ／ｄＬ程度になるように決定する。窒素バブル（１５分間）を行った後に、３００〜５００ｎｍで測光する。３６０ｎｍ付近と４６０ｎｍ付近に生じる等吸収点を直線で結び、ベースラインとする。４０５ｎｍにおけるベースラインからの吸光度（Ａ405）と４３０ｎｍにおけるベースラインからの吸光度（Ａ430）を計測し、Ｑ＝Ａ405／Ａ430を算出する。上記の計算式に数値を代入して、メト化率を算出する。

（ヘモグロビン内包型リポソーム分散液の調製）
ヘモグロビン（以下、Ｈｂと略す）溶液（［Ｈｂ］：４０ｇ／ｄＬ）に、Ｈｂ濃度の３倍モル量のピリドキサール５’リン酸（以下、ＰＬＰと略す）溶液（溶媒：ＮａＯＨ水溶液）及びホモシステイン（以下、Ｈｃｙと略す）を添加した。ｐＨ７．４に調節し、４℃で終夜撹拌した後、０．２２μｍフィルターでろ過した（終濃度：Ｈｂ；５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＬＰ；１７．３ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｈｃｙ；５ｍｍｏｌ／Ｌ）。この液を脱気及びＣＯガスフローを３回繰り返すことによって、液中のＨｂを一酸化炭素化（以下、ＣＯ化と略す）し、ＣＯ化Ｈｂ溶液を得た。

一方、ジパルミトイルホスファチジルコリン（以下、ＤＰＰＣと略す）／コレステロール／１，５−ジパルミトイル−Ｌ−グルタメート−Ｎ−コハク酸＝１０／１０／２（モル比率）の混合物を計２０ｇ秤量して、ベンゼン１Ｌに溶解させた。

ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）がジステアリルグルタリルエステルに結合した複合体（以下、ＰＥＧ−ＤＳＧＥと略す）１ｇを生理食塩水１Ｌに溶解させ、上記ベンゼンに溶解した混合物に全脂質量に対してＰＥＧ−ＤＳＧＥ濃度比率が０．３ｍｏｌ％となるように混合して混合液を得た。その後、混合液を凍結乾燥し、均一に分散した脂質混合粉末を得た。

この脂質混合粉末をＣＯ化Ｈｂ溶液に少量ずつ添加し、温度４℃で水和し、強制攪拌機を用いて終夜撹拌した。その後、エクストルーダー（LIPEXBIOMEMBRANES，ＩＮＣ製）で平均粒子径約２２０ｎｍに粒径調整し、ヘモグロビン溶液の濃度が約１０ｇ／ｄＬ、脂質濃度が６ｇ／ｄＬのヘモグロビン内包型リポソーム分散液を得た。

〔Ｌ−Ｃｙｓ含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液の調製〕
得られたヘモグロビン内包型リポソーム分散液５０ｍＬを１００ｍＬのバイアル中で５〜６時間窒素通気し、完全に脱酸素化する。脱酸素化した本試料溶液を用いて、Ｌ−Ｃｙｓ濃度の異なる４種の試料溶液を調製した。具体的には、脱酸素化した本試料溶液４０ｍＬに、脱酸素化したＬ−Ｃｙｓ含有生理食塩水（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝２８ｍＭ）１０ｍＬを添加し、試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝５．６ｍＭ）とした。また、本試料溶液４５ｍＬに、脱酸素化したＬ−Ｃｙｓ含有生理食塩水（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝２８ｍＭ）５ｍＬを添加し、試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝２．８ｍＭ）とした。さらに、本試料溶液４７ｍＬに、脱酸素化したＬ−Ｃｙｓ含有生理食塩水（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝２８ｍＭ）２．５ｍＬを添加し、試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝１．４ｍＭ）とした。また、本試料溶液４８．７５ｍＬに、脱酸素化したＬ−Ｃｙｓ含有生理食塩水（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝２８ｍＭ）１．２５ｍＬを添加し、試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝０．７ｍＭ）とした。

〔５ｍＭ亜硫酸水素ナトリウム含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液の調製〕
得られたヘモグロビン内包型リポソーム分散液５０ｍＬを１００ｍＬのバイアル中で５〜６時間窒素通気し、完全に脱酸素化する。本試料溶液４０ｍＬに、脱酸素化した亜硫酸水素ナトリウム（以下、ＮａＨＳＯ_３と略記する）含有生理食塩水（[ＮａＨＳＯ_３]＝５０ｍＭ）１０ｍＬを添加し、試料溶液（[ＮａＨＳＯ_３]＝５ｍＭ）とした。

〔Ｌ−Ｃｙｓ無添加ヘモグロビン内包型リポソーム分散液の調製〕
得られたヘモグロビン内包型リポソーム分散液５０ｍＬを１００ｍＬのバイアル中で５〜６時間窒素通気し、完全に脱酸素化する。本試料溶液４５ｍＬに、脱酸素化した生理食塩水５ｍＬを添加し、対照溶液とした。

〔５ｍＭアスコルビン酸含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液の調製〕
得られたヘモグロビン内包型リポソーム分散液５０ｍＬを１００ｍＬのバイアル中で５〜６時間窒素通気し、完全に脱酸素化する。本試料溶液４０ｍＬに、脱酸素化したアスコルビン酸（以下、ＡｓｃＡと略記する）含有生理食塩水（[ＡｓｃＡ]＝５０ｍＭ）１０ｍＬを添加し、試料溶液（[ＡｓｃＡ]＝５ｍＭ）とした。

（試験例１）
Ｌ−Ｃｙｓ含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバイアル製剤中の安定性（バイアル充填作業雰囲気：[Ｏ_２]＜０．１％）
各Ｌ−Ｃｙｓ濃度の試料溶液１０ｍＬをガラス製バイアル（胴径２４mm、高さ４６mm、口内径１２．５mm／１０ｍＬ用／マルエム社製）に分注し、ゴム栓（マルエム社製）とアルミキャップ（マルエム社製）を締めた。なお、本試料調製時の充填作業雰囲気は酸素濃度０．１％以下であった。本試料について、メト化率を指標として、温度２５℃での保存安定性試験を実施した。測定結果を表１に示す。

酸素濃度０．１％以下の充填作業雰囲気で調製した試料は、温度２５℃、６箇月間保存でメト化率の上昇が認められなかった。

（試験例２）
Ｌ−Ｃｙｓ含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバック製剤中の安定性（バック充填作業雰囲気：[Ｏ_２］＜０．３％）
試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝２．８ｍＭ）５ｍＬをポリプロピレン製バック（縦×横：８×１０(cm)、ＨＦＢシート、ニプロ（株）製）内に充填し、外包装にはテックバリア（登録商標、三菱樹脂（株）製）を用い、内包装と外包装の間に酸素吸収剤（エージレス（登録商標）、三菱ガス化学（株）製）を封入した。なお、本試料調製時の充填作業雰囲気は酸素濃度０．３%以下であった。本試料について、メト化率を指標として、温度４０℃、湿度７５％および温度２５℃、湿度６０％での保存安定性試験を実施した。測定結果を表２に示す。

本試料は、温度４０℃、湿度７５％にて１箇月間、及び温度２５℃、湿度６０％にて１２箇月間の保存でメト化率の上昇が認められなかった。

（試験例３）
Ｌ−Ｃｙｓ含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバック製剤中の安定性（バック充填作業雰囲気：[Ｏ_２］＝３％）
試験例２と同様に試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝２．８ｍＭ）５ｍＬをポリプロピレン製バック（縦×横：８×１０(cm)、ＨＦＢシート、ニプロ（株）製）内に充填し、外包装にはテックバリア（登録商標、三菱樹脂（株）製）を用い、内包装と外包装の間に酸素吸収剤（エージレス（登録商標）、三菱ガス化学（株）製）を封入した。なお、充填作業雰囲気を酸素濃度３％で行った。本試料について、メト化率を指標として、温度４０℃、湿度７５％および温度２５℃、湿度６０％での保存安定性試験を実施した。測定結果を表３に示す。

酸素濃度３％以下の充填作業雰囲気におけるバック試料は、温度４０℃、湿度７５％にて１箇月間、及び温度２５℃、湿度６０％にて１２箇月間の保存でメト化率の上昇が認められなかった。

（試験例４）
Ｌ−Ｃｙｓ含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバック製剤中の安定性（充填作業雰囲気：[Ｏ_２］＝２１％）
試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝２．８ｍＭ）１０ｍＬをポリプロピレン製バック（縦×横：１２×１５(cm)、ＨＦＢシート、ニプロ（株）製）内に充填し、外包装にはテックバリア（登録商標、三菱樹脂（株）製）を用い、内包装と外包装の間に酸素吸収剤（エージレス（登録商標）、三菱ガス化学（株）製）を封入した。なお、本試料調製時の充填作業雰囲気を酸素濃度２１％（大気中) であった。本試料について、メト化率を指標として、温度２５℃、湿度６０％での保存安定性試験を実施した。測定結果を表４に示す。

酸素濃度２１％の充填作業雰囲気におけるバック試料は、温度２５℃、湿度６０％にて２８日間保存でメト化率の上昇が認められなかった。

（比較例１）
Ｌ−Ｃｙｓ無添加ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバイアル製剤の安定性（バイアル充填作業雰囲気：[Ｏ_２］＜０．１％）
対象溶液１０ｍＬをガラス製バイアル（胴径２４mm、高さ４６mm、口内径１２．５mm／１０ｍＬ用／マルエム社製）に分注し、ゴム栓（マルエム社製）とアルミキャップ（マルエム社製）を締めた。なお、本試料調製時の充填作業雰囲気は酸素濃度０．１%以下であった。本試料について、メト化率を指標として、温度２５℃、湿度６０％での保存安定性試験を実施した。測定結果を表５に示す。

Ｌ−Ｃｙｓ無添加ヘモグロビン内包型リポソーム分散液（充填作業雰囲気：[Ｏ_２］＜０．１％）のメト化率は上昇を示した。

（比較例２）
Ｌ−Ｃｙｓ無添加ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバック製剤中の安定性（バック充填作業雰囲気：[Ｏ_２］＝２１％）
対象溶液１０ｍＬをポリプロピレン製バック（縦×横：１２×１５(cm)、ＨＦＢシート、ニプロ（株）製）内に充填し、外包装にはテックバリア（登録商標、三菱樹脂（株）製）を用い、内包装と外包装の間に酸素吸収剤（エージレス（登録商標）、三菱ガス化学（株）製）を封入した。なお、充填作業は酸素濃度２１％（大気中) 雰囲気で行った。本試料について、メト化率を指標として、温度２５℃、湿度６０％での保存安定性試験を実施した。測定結果を表６に示す。

酸素濃度２１％の充填作業雰囲気における対照試料は、温度２５℃、湿度６０％保存にてメト化率の上昇を示した。

（試験例５）
Ｌ−Ｃｙｓ又はＮａＨＳＯ_３含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバイアル製剤中の安定性（バイアル充填作業雰囲気：[Ｏ_２]＜１％）
試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝５．６ｍＭ、又は [ＮａＨＳＯ_３]＝５ｍＭ）それぞれ１０ｍＬをそれぞれのガラス製バイアル（胴径２４mm、高さ４６mm、口内径１２．５mm／１０ｍＬ用／マルエム社製）に分注し、ゴム栓（マルエム社製）とアルミキャップ（マルエム社製）を締めた。なお、本試料調製時の充填作業雰囲気は酸素濃度１％以下であった。本試料について、メト化率を指標として、温度４０℃での保存安定性試験を実施した。測定結果を表７に示す。

（試験例６）
ＡｓｃＡ含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバイアル製剤中の安定性
（バイアル充填作業雰囲気：[Ｏ_２]＜１％）
試料溶液（[ＡｓｃＡ]＝５ｍＭ）１０ｍＬをそれぞれのガラス製バイアル（胴径２４mm、高さ４６mm、口内径１２．５mm／１０ｍＬ用／マルエム社製）に分注し、ゴム栓（マルエム社製）とアルミキャップ（マルエム社製）を締めた。なお、本試料調製時の充填作業雰囲気は酸素濃度１％以下であった。本試料について、メト化率を指標として、温度４０℃での保存安定性試験を実施した。測定結果を表７に示す。

（比較例３）
Ｌ−Ｃｙｓ無添加ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバイアル製剤の安定性（バイアル充填作業雰囲気：[Ｏ_２］＜１％）
試料調製を充填作業雰囲気における酸素濃度１％以下で行った以外、対象溶液の調製を比較例１と同様に行った。本試料について、メト化率を指標として、温度４０℃での保存安定性試験を実施した。測定結果を表７に示す。

酸素濃度１％の充填作業雰囲気における試料溶液において、温度４０℃、２日間保存でのメト化率の上昇は試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝５．６ｍＭ）で認められず、試料溶液（[ＮａＨＳＯ_３]＝５ｍＭ）で充分に抑制されることが認められた。それに対し、試料溶液（[ＡｓｃＡ]＝５ｍＭ）においてメト化率は上昇を示した。

（試験例７）
Ｌ−Ｃｙｓ又はＮａＨＳＯ_３含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバイアル製剤中の安定性（バイアル充填作業雰囲気：[Ｏ_２]＜３％）
本試料調製を充填作業雰囲気における酸素濃度３％以下で行った以外、試料溶液の調製を試験例５と同様に行った。本試料について、メト化率を指標として、温度４０℃での保存安定性試験を実施した。測定結果を表８に示す。

（試験例８）
ＡｓｃＡ含有ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバイアル製剤中の安定性
（バイアル充填作業雰囲気：[Ｏ_２]＜３％）
本試料調製を充填作業雰囲気における酸素濃度３％以下で行った以外、試料溶液の調製を試験例６と同様に行った。本試料について、メト化率を指標として、温度４０℃での保存安定性試験を実施した。測定結果を表８に示す。

（比較例４）
Ｌ−Ｃｙｓ無添加ヘモグロビン内包型リポソーム分散液のバイアル製剤の安定性（バイアル充填作業雰囲気：[Ｏ_２］＜３％）
試料調製を充填作業雰囲気における酸素濃度３％以下で行った以外、対象溶液の調製を比較例１と同様に行った。本試料について、メト化率を指標として、温度４０℃での保存安定性試験を実施した。測定結果を表８に示す。

酸素濃度３％の充填作業雰囲気における試料溶液において、温度４０℃、２日間保存でのメト化率の上昇は試料溶液（[Ｌ−Ｃｙｓ]＝５．６ｍＭ）及び試料溶液（[ＮａＨＳＯ_３]＝５ｍＭ）で充分に抑制されることが認められた。それに対し、試料溶液（[ＡｓｃＡ]＝５ｍＭ）においてメト化率は上昇を示した。

本発明の人工酸素運搬体製剤は、輸血用血液の代替物のほか、術前血液希釈液、人工心肺等の体外循環回路の補充液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液、慢性貧血治療剤、液体換気の灌流液、癌治療用増感剤、再生組織細胞の培養液としての利用が期待され、また希少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用も期待される。

Claims

生体内で酸素を可逆的に吸脱着する人工酸素運搬体と、還元剤とを含有する人工酸素運搬体製剤。
還元剤が、システイン、メチオニン、シスチン、亜ジチオン酸、亜ジチオン酸塩、亜硫酸水素塩、亜硫酸塩、ピロ亜硫酸塩、重亜硫酸塩、次亜硫酸塩、ロンガリット、エリソルビン酸またはその塩、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸塩、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロイソシアヌール酸塩、チオグリコール酸塩、チオリンゴ酸塩、１，３−ブチレングリコール、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、ｄ−δ−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル−テトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］２−メルカプトベンズイミダゾール、エチレンジアミン四酢酸カルシウム２ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸２ナトリウムからなる群から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１記載の人工酸素運搬体製剤。
還元剤が、含硫アミノ酸および／または還元性のイオウ酸素酸化合物である、請求項１記載の人工酸素運搬体製剤。
還元剤がシステインである、請求項１記載の人工酸素運搬体製剤。
人工酸素運搬体が、ヘモグロビン内包型リポソーム、ポルフィリン金属錯体−アルブミン複合体、ＰＥＧ化アルブミン−ポルフィリン金属錯体複合体、ヘモグロビン、分子架橋型ヘモグロビン、ヘモグロビン重合体及びＰＥＧ化ヘモグロビン重合体からなる群から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１記載の人工酸素運搬体製剤。
人工酸素運搬体がヘモグロビン内包型リポソームである、請求項１記載の人工酸素運搬体製剤。
請求項１記載の人工酸素運搬体製剤が充填され密封された内包装と、前記内包装を密封する外包装と、前記内包装と前記外包装との間に存在する脱酸素剤とを有するバック製剤。