JP2003520774A - 透明なオーバーラップを用いたヘモグロビン代用血液の保存 - Google Patents

透明なオーバーラップを用いたヘモグロビン代用血液の保存

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hemoglobin
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ハウトチェンズ，ロバート，エイ．
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バイオピュア コーポレーション
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、実質的に酸素を含まない雰囲気下でヘモグロビン代用血液を維持することを含むヘモグロビン代用血液の安定性を保存する方法に関する。脱酸素化ヘモグロビン代用血液を保存する方法は、酸素バリアフィルムオーバーラップパッケージにおいて脱酸素化代用血液を維持することを含む。１つの実施態様において、パッケージは、酸素バリア層およびポリオレフィン層を含む透明なラミネート材料を含み、ここで、積層体は、約０．００１〜約０．０１インチ（すなわち約０．０２５４〜約０．２５４ミリメートル）の厚さ、および１気圧および室温（約２３℃）において２４時間で約０．０１立方センチメートル／１００平方インチ（すなわち、０．０１ｃｃ／６４５平方センチメートル）未満の酸素透過性を有する。酸素バリア層は、エチレンビニルアルコールを含む。さらに、脱酸素化ヘモグロビン代用血液および酸素バリアフィルムオーバーラップパッケージを含む保存用脱酸素化ヘモグロビン代用血液が提供される。該パッケージは、酸素バリア層およびポリオレフィン層を含む透明な積層材を含む。該酸素バリア層は、１気圧および約２７℃）において２４時間で約０．０１立方センチメートル／１００平方インチ（すなわち、約０．０１ｃｃ／６４５平方センチメートル）未満の酸素透過性を有し、ここで、脱酸素化ヘモグロビン代用血液は、オーバーラップパッケージ内にシールされる。１つの実施態様において、酸素バリア層はエチレンビニルアルコールを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 本出願は、同時係属中の米国特許出願第０９／３４8 ，８８１号（１９９９年
７月７日出願）の継続出願であり、前記特許出願は米国特許出願第０９／１７３
，１８９号（１９９８年１０月１４日出願）の一部継続出願であり、前記特許出
願は米国特許出願第０８／９７４，６５８号（１９９７年１１月１９日出願、現
在放棄）の一部継続出願であり、前記特許出願は米国特許出願第０８／４７１，
５８３号（１９９５年６月７日出願、現在特許第５，６９１，４５２号として発
行）の継続出願であり、前記特許出願は米国特許出願第０８／４５８，９１６号
（１９９５年６月２日出願、現在特許第５，８４０，５８２号として発行）の一
部継続出願であり、前記特許出願は米国特許出願第０８／４０９，３３７号（１
９９５年３月２３日出願、現在特許第５，８５４，２０９号として発行）の継続
出願である。
【０００２】 発明の背景 血液喪失（例えば、急性出血に由来する血液喪失、または手術時の血液喪失）
に起因する低酸素症、貧血（例えば、悪性貧血または鎌状赤血球貧血）に起因す
る低酸素症、またはショック（例えば、容量不足ショック、アナフィラキシーシ
ョック、敗血症ショックまたはアレルギーショック）に起因する低酸素症を処置
または防止するための代用血液が求められている。
【０００３】 血液および血液分画物をこれらの可能性において代用血液のように使用するこ
とには、様々な不都合なことが伴う。例えば、全血の使用は、患者の回復を困難
にし得るか、または患者の死亡をもたらし得る肝炎発症ウイルスおよびＡＩＤＳ
発症ウイルスを伝搬させる危険性を伴うことが多い。さらに、全血の使用は、免
疫血液学的な問題および供血者間の不適合性を避けるために血液型判定および交
差試験を必要とする。
【０００４】 代用血液としてのヒトヘモグロビンは、浸透圧活性、および酸素を輸送して転
移する能力を有するが、腎臓経路によって、そして血管壁を介して循環から迅速
に除かれるという欠点を有し、その結果、非常に短い半減期、従って典型的には
満足できない半減期をもたらす。さらに、ヒトヘモグロビンはまた、毒性レベル
のエンドトキシン、細菌および／またはウイルスでしばしば汚染されている。
【０００５】 非ヒトヘモグロビンは、ヒトヘモグロビンと同じ欠点に悩まされている。さら
に、非ヒト供給源に由来するヘモグロビンもまた、免疫系の応答を受血者におい
て生じさせ得る抗体などのタンパク質で典型的には汚染されている。
【０００６】 以前には、少なくとも４つの、他のタイプの代用血液が用いられている。これ
には、ペルフルオロ化学品、合成されたヘモグロビンアナログ、リポソームにカ
プセル化されたヘモグロビン、および化学修飾されたヘモグロビンが含まれる。
しかし、これらの代用血液の多くは、典型的には、血管内の保持時間が短く、異
物物質として循環系により除かれるか、あるいは肝臓、脾臓および他の組織に留
まる。また、これらの代用血液の多くは、生体系と生物学的に不適合性であった
。
【０００７】 従って、ヘモグロビンに基づく代用血液の調製における近年の進歩にも関わら
ず、代用血液の輸液から生じる免疫系の応答および何らかの毒学的作用を一般に
防止するために、エンドトキシン、細菌、ウイルス、リン脂質および非ヘモグロ
ビンタンパク質などの汚染物のレベルが十分に低い代用血液が求め続けられてい
る。さらに、代用血液はまた、十分な量の酸素を周囲の条件のもとで組織に輸送
して転移させることができなければならず、そして良好な血管内保持時間を有し
なければならない。
【０００８】 さらに、代用血液が、１）全血の膨張活性と一般には等しい膨張活性を有する
こと、２）交差試験または感受性試験を行うことなくほとんどの受血者に輸血で
きること、および３）最小量の冷蔵で長期間にわたって貯蔵できることは好まし
い。
【０００９】 代用血液は、大きなＯ2 バリア特性および水分バリア特性を有する金属ホイル
ラミネートオーバーラップで典型的にはパッケージされる。この金属ホイルラミ
ネートは、典型的には不透明であり、従って、製造物の目視検査を行うことがで
きず、またプライマリーパッケージの一体性を検査することができない。さらに
、不透明なオーバーラップは、別のラベルをオーバーラップの外側に使用しなけ
ればならない。
【００１０】 従来、大きな酸素バリア特性および水分バリア特性を有するラミネートを含有
する透明なシリコンは、材料に対する応力によりひび割れを生じさせたか、また
はそうでなければバリア特性が失われるために、自動化されたパッケージ装置で
は有用ではなかった。
【００１１】 発明の要旨 本発明は、パッケージされた脱酸素化ヘモグロビン代用血液を酸素バリアフィ
ルムオーバーラップパッケージ（oxygen barrier film overwrap package）にお
いて維持することを含む、脱酸素化されたヘモグロビン代用血液を保存するため
の方法に関する。この場合、オーバーラップパッケージは、酸素バリア層および
ポリオレフィン層を含む透明なラミネート材（laminate material ）を含み、こ
こで、ラミネートは約０．００１〜約０．０１インチ（すなわち約０．０２５４
〜約０．２５４ミリメートル）の厚さ、および１気圧および室温（約２３℃）に
おいて２４時間で約０．０１立方センチメートル／１００平方インチ（すなわち
、０．０１ｃｃ／６４５平方センチメートル）未満の酸素透過性を有する。ここ
で、酸素バリア層は、エチレンビニルアルコールを含む。１つの実施態様におい
て、この方法は、約０．０１〜約０．００５インチ（すなわち約０．２５４〜約
０．１２７ミリメートル）の厚さを有する透明なラミネート材を含む酸素バリア
フィルムオーバーラップ中に脱酸素化ヘモグロビン代用血液を維持することを含
む。
【００１２】 本発明はまた、パッケージされた脱酸素化ヘモグロビン代用血液および透明な
酸素バリアフィルムオーバーラップパッケージを含む、保存された脱酸素化ヘモ
グロビン代用血液に関する。１つの実施態様において、透明なラミネート材は、
酸素バリア層およびポリオレフィン層を含み、１気圧および室温（約２３℃）に
おいて２４時間で約０．０１立方センチメートル／１００平方インチ（すなわち
、約０．０１ｃｃ／６４５平方センチメートル）未満の酸素透過性を有し、ここ
で酸素バリア層はエチレンビニルアルコールを含む。パッケージされた脱酸素化
ヘモグロビン代用血液は前記酸素バリアフィルムオーバーラップの中でシールさ
れ、それによって、脱酸素化ヘモグロビン代用血液は、酸素が実質的に含まれな
い環境で保存される。
【００１３】 本発明の１つの実施態様において、透明なラミネート材は、自動化されたパッ
ケージ処理においてホイルラミネート材と組み合わせて使用される。１つの実施
態様において、Ｔｉｒｏｍａｔ（Ａｖｏｎ、ＭＡ）によって製造された自動パッ
ケージ処理機が使用されている。
【００１４】 本発明の利点は数多くある。１つの利点は、本発明の方法に従って貯蔵された
ヘモグロビンは、より大きな純度およびより長い貯蔵寿命を有するということで
ある。高バリアオーバーラップは、高バリアのプライマリーパッケージ処理が用
いられた場合でさえ、さらなるレベルの製品品質をもたらす。さらに、本発明の
透明な高バリアオーバーラップは、極めて大きな酸素バリア特性および水蒸気バ
リア特性をもたらしているが、サラン（ポリ塩化ビニリデン、ＰＶＤＣ）層を全
く有していない。ＰＶＤＣは、ポリ環状芳香族炭化水素および塩酸などの塩素化
生成物が焼却時に生成するために医療廃棄物問題をもたらしている。透明なオー
バーラップにより、プライマリーパッケージのラベルを見ることができる。従っ
て、典型的な場合には、別のラベルをオーバーラップに必要としない。さらに、
製品の品質検査およびプライマリーパッケージの一体性もまた評価することがで
きる。その上、本明細書中において初めて明らかにされているように、自動化装
置を、透明な酸素バリアラミネートとともに使用することができ、これにより、
ほとんど人手をかけず、そしてバリア特性を失うことなく、非常に大量のパッケ
ージ物を短い時間で製造することが可能になる。この代用血液は、室温で、２年
以上の期間にわたって安定であり続ける。これは、以前の方法を上回る著しい改
善である。
【００１５】 発明の詳細な説明 次に、本発明の特徴および他の細部をより詳しく記載する。これらは請求項に
示されている。本発明の特定の実施態様が本発明の例示として示され、本発明の
限定として示されていないことが理解される。本発明の原理的な特徴は、本発明
の範囲から逸脱することなく様々な実施態様において用いることができる。
【００１６】 本発明は、ヘモグロビン代用血液の安定性を保存するための方法に関する。こ
の方法は、酸素を実質的に含まない雰囲気においてヘモグロビン代用血液を維持
することを含む。この方法は、酸素バリアプライマリーパッケージ、酸素バリア
フィルムオーバーラップ（例えば、バッグ）、ガラス容器（例えば、バイアル）
またはスチール容器などの酸素不透過性容器において代用血液を維持することに
よって達成される。プライマリーパッケージが酸素バリアフィルムである場合、
容器は、ポリマーフィルム（例えば、本質的には酸素不透過性のポリエステル、
エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）またはナイロン）およびそのラミネート
を含む様々な材料から製造することができる。容器が酸素バリアオーバーラップ
を含む場合、オーバーラップは、ポリマーフィルム（例えば、本質的には酸素不
透過性のポリエステル、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）またはナイロン
）およびラミネート（透明なラミネート（例えば、酸化ケイ素含有ラミネートま
たはＥＶＯＨ含有ラミネート）等）、あるいは金属ホイルラミネート（例えば、
銀ホイルラミネートまたはアルミニウムホイルラミネート）を含む様々な材料か
ら製造することができる。
【００１７】 オーバーラップがポリエステルフィルムなどのフィルムである場合、フィルム
は、様々な好適な方法によって本質的に酸素不透過性にすることができる。１つ
の実施態様において、製造されたフィルムは本質的には酸素不透過性である。あ
るいは、ポリマー材が、所望する仕様を満たすために十分な酸素不透過性を有し
ない場合、フィルムを積層化して、あるいはそれ以外の方法で処理して、酸素透
過性を低下させることができ、または除去することができる。
【００１８】 好ましい実施態様において、透明なラミネートが、オーバーラップの少なくと
も１つの面に対して用いられる。１つの実施態様において、透明なラミネートの
少なくとも１つの層は酸化シリコンを含む。酸素バリア層は、好ましくは約０．
０００１〜約０．００１インチ（すなわち約２．５４×１０-3〜０．０２５ミリ
メートル）の厚さを有する。プライマリーパッケージおよびオーバーラップの両
方について、ラミネートは、典型的には１つまたは２つ以上のポリマー層を含む
。ポリマーは、例えば、ポリエステル層（例えば、４８ゲージポリエステル）、
ナイロンまたはポリオレフィン層（ポリエチレン、エチレンビニルアセテートま
たはポリプロピレンあるいはこれらのコポリマーなど）を含む様々なポリマー材
であり得る。
【００１９】 本発明のオーバーラップは、バイアル、シリンダー、ボックスなどを含む様々
な組み立て物であり得る。好ましい実施態様において、容器はバッグの形態であ
る。好適なバッグは、１つまたは２つ以上（例えば、２つ）のシートをその周囲
で（perimeter ）連続的に結合させて、充填可能な中心部を有する密閉された酸
素不透過性の組み立て物を作製することによって作製することができる。バッグ
の形状は、この分野において日常的に見かける形状にすることができる。線状低
密度、低密度、中密度または高密度のポリエチレンまたはポリプロピレンおよび
これらのコポリマーなどのポリオレフィンを含むラミネートの場合、バッグの周
辺部は、熱を利用して結合またはシールされる。密閉された酸素不透過性および
／または水分不透過性の組み立て物を得るために適切な温度を決定することは十
分に当業者の範囲内である。
【００２０】 容器は、好ましくは、酸素透過性が室温で約０．０１ｃｃ／１００平方インチ
（すなわち、約０．０１ｃｃ／６４５平方センチメートル）／２４時間／気圧よ
りも小さく、好ましくはこれらの条件で約０．００５ｃｃ／平方インチ（すなわ
ち、約０．００５ｃｃ／６．４５平方センチメートル）よりも小さい。
【００２１】 これらの基準を満たす容器の例には、例えば、ポリプロピレン、エチレンビニ
ルアルコールなどのポリオレフィンと線状低密度ポリエチレンなどの別のポリオ
レフィン層とから構成されたオーバーラップを有する高バリアラミネート容器な
どの、オーバーラップを有するプラスチック容器が含まれる。一態様では、該ラ
ミネートは、それぞれ、１．８ミル、１．２ミルおよび３．０ミル（あるいは、
それぞれ０．０４６、０．０３０および０．０７６ミリメートル）の厚みのポリ
プロピレン、ＥＶＯＨおよびポリプロピレンコポリマーを含んでなる。高バリア
ラミネートの酸素透過性は、１００平方インチあたり０．００１５３ｃｃ（ある
いは、１気圧あたり、１日あたり、２５℃あたり、１００％／５０％相対湿度（
ＲＨ）（内側／外側）で、６４５平方センチメートルあたり０．００１５ｃｃ）
であり、水蒸気透過は、１気圧あたり、１日（２５℃、１００％／５０％ＲＨ）
あたり、１００平方インチあたり約０．３５４ｍｇ（あるいは、６４５平方セン
チメートルあたり約０．３５４ｍｇ）である。これらの複合化フィルムでオーバ
ーラップされたプラスチックバッグは、Ｔｉｒｏｍａｔシーリング装置（エイボ
ン（Ａｖｏｎ）、マサチューセッツ州）を用いてシールする。一態様では、オー
バーラップは、透明なラミネート材の２枚のシートを含んでなる。別の態様では
、オーバーラップパッケージの一方のシートはホイルラミネート材を含んでなり
、他方のシートは透明なラミネート材を含んでなる。別の態様では、オーバーラ
ップパッケージの底面シートは、ホイルラミネートであり、少なくとも１個の皿
形の形状またはチャンバが該ホイルラミネート内に規定されるように形成される
。その後、ヘモグロビン代用血液が、プライマリーパッケージにおいて、ラベル
を上向きにして、ホイルのチャンバー内に入れられる。その後、プライマリーパ
ッケージにおけるホイルおよびヘモグロビン代用血液は窒素置換され、真空に引
かれる。その後、透明なラミネートはホイルラミネート底部層にヒートシールさ
れ、オーバーラップされたヘモグロビン代用血液が作製される。
【００２２】 好ましい実施態様において、代用血液は、酸素を実質的に含まない雰囲気のも
とでパッケージされる。好適な雰囲気の例には、窒素、アルゴンおよびヘリウム
が含まれる。
【００２３】 本明細書中において定義されているように、代用血液は、ヒト、哺乳動物およ
び他の脊椎動物において使用される、ヘモグロビンに基づく酸素運搬組成物であ
る。これは、少なくとも、生きた器官および組織に酸素を輸送して転移すること
ができ、そして十分な血管内膨張圧を維持することができる。脊椎動物は、慣行
に従って定義されている通りであり、ヒト、または酸素を組織に転移させる循環
系において血液を使用する任意の他の脊椎動物を含む。さらに、循環系の定義は
、慣行に従って定義されている通りであり、心臓、動脈、静脈、および毛細管な
どのより小さい血管構造体を含む微小循環からなる。
【００２４】 本発明の代用血液は好ましくは、著しい免疫系応答を生じさせず、かつ受血者
に対して毒性でないレベルのエンドトキシン、リン脂質、異物タンパク質および
他の汚染物を有する。好ましくは、代用血液は超純粋である。超純粋は、本明細
書中で定義される場合、０．５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシン、３．３ｎｍｏ
ｌ／ｍｌ未満のリン脂質、およびほとんど検出できないレベルの非ヘモグロビン
タンパク質（血清アルブミンまたは抗体など）を含有することを意味する。
【００２５】 用語「エンドトキシン」は、グラム陰性細菌細胞壁の外層の一部として産生さ
れる細胞結合型リポ多糖類をいう。これは、多くの状況下では毒性である。動物
に注入された場合、エンドトキシンは、発熱、下痢、出血性ショックおよび他の
組織損傷を引き起こし得る。エンドトキシンユニット（ＥＵ）は、０．１ナノグ
ラムの米国基準物質ロットＥＣ−５に含有される活性として米国薬局方協定（１
９８３年、３０１４頁）によって定義されている。１バイアルのＥＣ−５は１０
，０００ＥＵを含有する。代用血液中のエンドトキシン濃度を測定するための好
適な手段の例には、Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ（Ｗｏｏｄｓ
Ｈｏｌｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって開発された方法「速度論／
濁度測定法によるリムウス（Ｌｉｍｕｕｓ）遊走細胞溶解物 （ＬＡＬ）５００
０法」が含まれる。
【００２６】 本明細書中で定義されているように、安定なポリマー化ヘモグロビンは、２年
以上の期間、好ましくは低酸素環境で貯蔵された２年以上の期間にわたる好適な
貯蔵温度における貯蔵期間のときに分子量分布および／またはメトヘモグロビン
含有量の実質的な増大または低下をもたらさない、ヘモグロビンに基づく酸素運
搬組成物である。１年以上の貯蔵に好適な貯蔵温度は約０℃〜約４０℃の間であ
る。好ましい貯蔵温度範囲は約０℃〜約２５℃の間である。
【００２７】 好適な低酸素環境、または酸素を実質的に含まない環境は、代用血液において
約１５重量％未満のメトヘモグロビン濃度を生じさせる、少なくとも約２ヶ月（
好ましくは少なくとも約１年、より好ましくは少なくとも約２年）の貯蔵期間を
通じた代用血液と接触している酸素の累積量として定義される。酸素の累積量は
、代用血液パッケージ内への酸素の漏れ、ならびに代用血液およびパッケージの
最初の酸素含有量を含む。
【００２８】 この方法を通して、赤血球（ＲＢＣ）集団からヘモグロビンポリマー化、血液
溶液、ＲＢＣおよびヘモグロビンまで、約２０℃よりも低く、かつ０℃よりも高
い温度を維持することなどによって微生物の増殖または生物汚染を最小限にする
ために十分な条件のもとで維持される。好ましくは、温度は約１５℃以下の温度
で維持される。より好ましくは、温度は１０±２℃で維持される。
【００２９】 この方法において、安定なポリマー化ヘモグロビン代用血液を調製するための
プロセスに対する構成要素の各部分は、無菌の製品を製造するために十分に殺菌
される。無菌は、この分野において定義されている通りであり、詳細には、溶液
が、米国薬局方ＸＸＩＩ（第７１節、１４８３頁〜１４８８頁）に示されている
無菌性に対する米国薬局方基準を満たすことである。さらに、プロセス工程にさ
らされる構成要素の部分は、通常、プロセス工程と反応しないか、またはプロセ
ス工程を汚染しない材料で製造または被覆される。そのような材料には、ステン
レススチールおよび他のスチール合金（インコネルなど）が含まれ得る。
【００３０】 好適なＲＢＣ源には、ヒト血液、ウシ血液、ヒツジ血液、ブタ血液、他の脊椎
動物に由来する血液、および遺伝子組換え的に製造されたヘモグロビン（ＢＩＯ
／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、１２：５５〜５９（１９９４）に記載されている遺伝
子組換えＨｂなど）が含まれる。
【００３１】 血液は、生きているドナーまたは屠殺されたばかりのドナーから採取すること
ができる。ウシの全血を採取するための方法が、Ｒａｕｓｃｈ他に対して発行さ
れた米国特許第５，０８４，５５８号および同第５，２９６，４６５号に記載さ
れている。血液を無菌的な様式で採取することが好ましい。
【００３２】 採取時または採取後直ちに、血液は、血液の著しい凝固を防止するために少な
くとも１つの抗凝固と混合される。血液に対する好適な抗凝固剤は、この分野に
において慣行に従って知られている通りであり、これには、例えば、クエン酸ナ
トリウム、エチレンジアミン四酢酸およびヘパリンが含まれる。血液と混合され
るとき、抗凝固剤は、粉末などの固体形態であってもよく、または水溶液であっ
てもよい。
【００３３】 血液溶液の供給源は、新しく採取されたサンプルに由来し得るか、または血液
銀行からの期限が切れたヒト血液などの古いサンプルに由来し得ることが理解さ
れる。さらに、血液溶液は凍結状態および／または液体状態において以前に維持
され得る。血液溶液はこの方法で使用される前には凍結されないことが好ましい
。
【００３４】 別の実施態様において、血液溶液を抗凝固剤に導入する前に、ペニシリンなど
の血液溶液中の抗生物質レベルがアッセイされる。抗生物質レベルは、血液サン
プルのドナーが抗生物質で処置されていなかったことを確認することによって、
血液サンプルが感染性生物で汚染されていないという保証の程度を提供するため
に測定される。抗生物質に対する好適なアッセイの例には、「乳汁におけるペニ
シリンの迅速検出」と題された方法を用いるペニシリンアッセイキット（Ｄｉｆ
ｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）が含まれる。血液サンプルは約０．００８ユニッ
ト／ｍｌ以下のペニシリンレベルを含有することが好ましい。あるいは、家畜に
疾患がないことまたは家畜の抗生物質処置をモニターするための家畜管理プログ
ラムを使用することができる。
【００３５】 好ましくは、血液溶液は、大きな凝集物および粒子を除くために、例えば、ろ
過することによって、抗凝固剤処理工程の前または抗凝固剤処理工程のときにろ
過される。６００メッシュの篩いは、好適な濾過器の一例である。
【００３６】 その後、血液溶液中のＲＢＣは、ＲＢＣを細胞外の血漿タンパク質（血清アル
ブミンまたは抗体（例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧ））など）から分離するた
めに、好適な手段によって、例えば、透析ろ過によって、あるいは少なくとも１
つの溶液（等張性溶液など）を用いた別個の希釈工程と濃縮工程との組合せによ
って洗浄される。ＲＢＣは回分様式または連続供給様式で洗浄され得ることが理
解される。
【００３７】 受容可能な等張性溶液は、この分野において知られている通りであり、これに
は、ＲＢＣの細胞膜を破壊せず、全血の血漿タンパク質を追い出すｐＨおよび浸
透圧モル濃度を有する溶液（クエン酸塩／生理食塩水溶液など）が含まれる。好
ましい等張性溶液は、中性ｐＨを有し、約２８５ｍＯｓｍ〜３１５ｍＯｓｍの浸
透圧モル濃度を有する。好ましい実施態様において、等張性溶液は、クエン酸ナ
トリウム二水和物（６．０ｇ／ｌ）および塩化ナトリウム（８．０ｇ／ｌ）の水
溶液から構成される。
【００３８】 本発明の方法において使用され得る水には、蒸留水、脱イオン水、注射用水（
ＷＦＩ）および／または低パイロジェン水（ＬＰＷ）が含まれる。ＷＦＩは、好
ましいものであり、注射用水に関する米国薬理学基準（Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）を満たす脱イオン化蒸留
水である。ＷＦＩはさらに、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ、１１、１５〜２３頁（１９９１）に記載されている。ＬＰＷは、好まし
いものであり、０．００２ＥＵ／ｍｌ未満を含有する脱イオン水である。
【００３９】 等張性溶液は、血液溶液に加えられる前にろ過されることが好ましい。好適な
フィルターの例には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の１０，０００ダルトン限外ろ過膜
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ＃ＣＤＵＦ ０５０ Ｇ１フィルターなど）また
はＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の中空ファイバー（１０，０００ダルトン、
カタログ＃ＵＦＰ−１０−Ｃ−８５）が含まれる。
【００４０】 好ましい実施態様では、血液溶液中のＲＢＣを透析濾過によって洗う。適当な
ダイアフィルターは、０．１μｍ‐０．５μｍフィルターのような（例えば０．
２μｍ中空ファイバーフィルター、Ｍｉｃｒｏｇｏｎ Ｋｒｏｓｆｌｏ ＩＩ精
密濾過カートリッジ）、ＲＢＣを実質的により小さな血液溶液成分から分離する
孔サイズのミクロ細孔膜を含む。同時に、ダイアフィルターを通して失われた濾
液の割合（又は容量）に等しい割合で相殺として、濾過した等張液を継続的に（
又はバッチで）加える。ＲＢＣ洗浄の間、直径がＲＢＣよりも有意に小さいか、
又は血漿のような液体の血液溶液成分はダイアフィルターの壁を通過して濾液中
に入る。ＲＢＣ、血小板及び白血球のような希釈血液溶液のより大きな物質は保
持され、それらを、継続的に又はバッチで添加した等張液と混合して、透析血液
溶液を生成する。
【００４１】 より好ましい実施態様では、一定量の濾過した等張液を透析濾過タンクに加え
て、透析濾過タンク内の血液溶液の容量を最初に希釈する。好ましくは、加える
等張液の容量は血液溶液の最初の容量とほぼ等しい。
【００４２】 代替的実施態様では、血液溶液に少なくとも１つの等張液を加えて希釈し、フ
ィルターを通して濃縮する、一連の連続（又は逆連続）希釈と濃縮の段階を通し
てＲＢＣを洗い、それによって透析血液溶液を生成する。
【００４３】 ＲＢＣを汚染する血漿蛋白のレベルが実質的に低下したとき（典型的には少な
くとも約９０％）、ＲＢＣの洗浄が完了する。典型的には、ダイアフィルター３
４から流出した濾液の容量が、血液溶液を濾過等張液で希釈する前に透析濾過タ
ンクに入っていた血液溶液の容量の約３００％又はそれ以上に等しいとき、ＲＢ
Ｃ洗浄は完了する。追加的なＲＢＣ洗浄によってＲＢＣから細胞外血漿蛋白をさ
らに分離してもよい。例えば、６容の等張液による透析濾過は、血液溶液から少
なくとも約９９％のＩｇＧを除去することができる。
【００４４】 次に透析した血液溶液を、遠心分離のような、透析血液溶液中のＲＢＣを白血
球及び血小板から分離するための手段に供する。
【００４５】 ＲＢＣを他の血液成分から分離するための当該技術において一般的に知られる
他の方法が使用できることは明白である。例えば沈降法であり、この分離方法は
、ＲＢＣを他の血液成分から分離する前に、有意の量のＲＢＣの細胞膜を破壊せ
ず、ＲＢＣの約３０％未満の破壊にとどめる。
【００４６】 ＲＢＣの分離後、ＲＢＣ溶解のための手段を用いてＲＢＣを溶解し、ＲＢＣか
らヘモグロビンを遊離させて、ヘモグロビン含有溶液を生成する。溶解手段は、
機械的溶解、化学的溶解、低張性溶解、又はヘモグロビンが酸素を運搬し、遊離
させる能力を有意に損なうことなくＨｂを遊離させる他の既知の溶解方法のよう
な、様々な溶解方法が使用できる。
【００４７】 さらにもう１つの実施態様では、Ｎａｔｕｒｅ，３５６：２５８‐２６０（１
９９２）に述べられている組換えによって作製されたヘモグロビンのような、組
換えによって作製されるヘモグロビンをＲＢＣの代わりに本発明の方法において
処理することができる。ヘモグロビンを含む細菌細胞を上述したように洗って夾
雑物から分離する。次にこれらの細菌細胞をボールミルのような当該技術で既知
の手段によって機械的に破壊し、細胞からヘモグロビンを遊離させて溶解細胞相
を形成する。その後この溶解細胞相を溶解ＲＢＣ相と同様に処理する。
【００４８】 溶解に続き、溶解ＲＢＣ相を限外濾過して、分子量が約１００，０００ダルト
ンを超える蛋白質のような大きな細胞デブリを除去する。一般に細胞デブリは、
Ｈｂ、小さな細胞蛋白、電解質、補酵素及び有機代謝中間体を除くすべての全体
及び断片細胞成分を含む。許容される限外濾過器は、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ
製（Ｃａｔ＃ ＣＤＵＦ ０５０ Ｈ１）及びＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製
（Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ．；Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．ＵＦＰ１００Ｅ５５）の１００
，０００ダルトンフィルターを含む。
【００４９】 重合に使用できるヘモグロビンの収量を最大にするため、溶解ＲＢＣ相におけ
るＨｂの濃度が８グラム／リットル（ｇ／ｌ）未満になるまで限外濾過を続ける
ことが好ましい。沈降、遠心分離又は精密濾過を含めて、溶解ＲＢＣ相からＨｂ
を分離するための他の方法も使用できる。次にＨｂ限外濾液を限外濾過して、電
解質、補酵素、代謝中間体及び分子量約３０，０００ダルトン未満の蛋白質のよ
うな小さな細胞デブリと水をＨｂ限外濾液から除去することができる。適当な限
外濾過器は３０，０００ダルトン限外濾過器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ＃
ＣＤＵＦ ０５０ Ｔ１及び／又はＡｒｍｉｃｏｎ、＃５４０ ４３０）を含む
。
【００５０】 その後濃縮Ｈｂ溶液を１つ又はそれ以上の平行クロマトグラフィーカラムに供
して、高速液体クロマトグラフィーにより、抗体、内毒素、リン脂質及び酵素及
びウイルスのような他の夾雑物からヘモグロビンをさらに分離することができる
。適当な媒体の例は、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体、疎水的相互作用媒
体及びアフィニティー媒体を含む。好ましい実施態様では、クロマトグラフィー
カラムは、Ｈｂを非ヘモグロビン蛋白質から分離するのに適した陰イオン交換媒
体を含む。適当な陰イオン交換媒体は、例えば、シリカ、アルミナ、チタニアゲ
ル、架橋デキストラン、アガロース、又はジエチルアミノエチル又は第四級アミ
ノエチル基のような陽イオン化学官能基で誘導体化された、ポリアクリルアミド
、ポリヒドロキシエチル‐メタクリレート又はスチレンジビニルベンゼンのよう
な誘導体化部分を含む。溶解ＲＢＣ相に存在する可能性がある他の蛋白質及び夾
雑物と比較して、Ｈｂの選択的吸収と脱着のための適当な陰イオン交換媒体及び
対応する溶出剤は、当業者が容易に決定できる。
【００５１】 より好ましい実施態様では、シリカゲルから陰イオン交換媒体を形成するため
の方法を使用し、それを水熱処理して孔サイズを高め、γ‐グリシドキシプロピ
ルシランに接触させて活性エポキシド基を形成し、次にＣ3 Ｈ7 （ＣＨ3 ）ＮＣ
ｌに接触させて第四級アンモニウム陰イオン交換媒体を形成する。この方法は、
その全体が参照してここに組み込まれる、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ，１２０：３２１〜３３３頁（１９７６）に述べられている。
【００５２】 最初に、Ｈｂ結合を促進する第一溶出剤を流してクロマトグラフィーカラムを
前処理する。次に濃縮Ｈｂ溶液をカラム中の媒体に注入する。濃縮Ｈｂ溶液の注
入後、種々の溶出剤で順次クロマトグラフィーカラムを洗い、別々の精製Ｈｂ溶
出液を生成する。
【００５３】 好ましい実施態様では、カルボニックアンヒドラーゼ酵素、リン脂質、抗体及
び内毒素のような蛋白夾雑物をＨｂから分離するためにクロマトグラフィーカラ
ムにおいてｐＨ勾配を使用する。異なるｐＨ値を持つ一連の緩衝液をそれぞれ連
続的に適用して、クロマトグラフィーカラムの媒体内でｐＨ勾配を創造する。緩
衝液を１０，０００ダルトンの発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）
膜などで濾過することが好ましい。Ｈｂを分離するために使用する緩衝液は、Ｈ
ｂと非ヘモグロビン夾雑物の溶出が一般にｐＨに依存し、イオン強度に有意に依
存しないような低いイオン強度を持つべきである。典型的には、約５０ｍＭ又は
それより小さいイオン濃度の緩衝液が適当な低いイオン強度を持つ。
【００５４】 最初の緩衝液は、クロマトグラフィーカラムの媒体中に濃縮Ｈｂ溶液を運搬し
、媒体へのＨｂの結合を促進する。次に第二緩衝液は、媒体に結合したＨｂを保
持しながら、夾雑非ヘモグロビン成分を溶出するためにカラム内のｐＨを調整す
る。そして第三緩衝液がＨｂを溶出する。その後Ｈｂ溶出液を採集する。Ｈｂ溶
出液を滅菌フィルターに適用することが好ましい。適当な滅菌フィルターは、Ｓ
ａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｃａｔ＃５２３２５０７ Ｇ１ＰＨフ
ィルターのような０．２２μｍフィルターを含む。
【００５５】 好ましい実施態様では、Ｈｂ溶出液の純度を保証するためにＨｂ溶出液の最初
の３％〜４％及びＨｂ溶出液の最後の３％〜４％を廃棄する。
【００５６】 クロマトグラフィーカラムを再使用する場合には、カラムに残っている夾雑非
ヘモグロビン蛋白と内毒素を第四緩衝液によって溶出する。
【００５７】 非ヘモグロビン夾雑物からＨｂを分離するためのｐＨ勾配の使用は、参照して
ここに組み込まれる、１９９５年６月７日発行の米国特許第５，６９１，４５２
号に詳述されている。
【００５８】 好ましい実施態様では、第一緩衝液はトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン
（Ｔｒｉｓ）溶液（濃度約２０ｍＭ、ｐＨ約８．４〜約９．４）である。第二緩
衝液は、第一緩衝液と第三緩衝液の混合物であり、第二緩衝液は約８．２〜約８
．６のｐＨを持つ。第三緩衝液はＴｒｉｓ溶液（濃度約５０ｍＭ、ｐＨ約６．５
〜約７．５）である。第四緩衝液はＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ溶液（濃度約１．０Ｍ
ＮａＣｌ及び約２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ約８．４〜約９．４、好ましくは約８
．９〜９．１）である。第二緩衝液のｐＨが約８．２〜約８．４であることが特
に好ましい。
【００５９】 典型的には、使用する緩衝液は約０℃〜約５０℃である。好ましくは、使用の
間、緩衝液の温度は約１２．４±１．０℃である。さらに、緩衝液は典型的には
約９℃〜約１１℃の温度で保存する。
【００６０】 次にＨｂ溶出液を、好ましくは重合の前に脱酸素化し、酸化ヘモグロビン（ｍ
ｅｔＨｂ）形成という変性から生じうるような、Ｈｂ溶出液中のＨｂの酸素を運
搬および遊離する能力の有意な低下を伴わずに実質的にＨｂを脱酸素化させる手
段によって脱酸素化Ｈｂ溶液（以下デオキシ‐Ｈｂと称する）を生成する。
【００６１】 １つの実施態様では、相の膜を越えた不活性気体のガス移動によってＨｂ溶出
液を脱酸素化する。そのような不活性気体は、例えば窒素、アルゴン及びヘリウ
ムを含む。ヘモグロビンの溶液を脱酸素化するための当該技術において既知の他
の手段も、Ｈｂ溶出液を脱酸素化するために使用できることは明白である。その
ような他の手段は、例えばＨｂ溶出液の窒素スパージング、Ｎ‐アセチル‐Ｌ‐
システイン（ＮＡＣ）、システイン、亜ジチオン酸又はアスコルビン酸ナトリウ
ムのような還元剤による化学的排除、又は光による光分解を含みうる。
【００６２】 クロマトグラフィーカラムからの溶出後、好ましくはＨｂ溶出液を濃縮して処
理の効率を改善する。Ｈｂ溶出液を限外濾過器を通して再循環させ、Ｈｂ溶出液
を濃縮して濃縮Ｈｂ溶出液を生成する。適当な限外濾過器は、例えば３０，００
０ダルトン又はそれより小さい限外濾過器（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌ
ｉｃｏｎ，Ｃａｔ＃ ＣＤＵＦ０５０Ｇ１又はＡｍｉｃｏｎ Ｃａｔ ＃５４０
４３０）を含む。典型的には、Ｈｂ溶出液の濃縮は、Ｈｂの濃度が約１００〜約
１２０ｇ／ｌであるときに完了する。Ｈｂ溶出液を濃縮するとき、好ましくはＨ
ｂ溶出液の温度を約８〜１２℃に保持する。
【００６３】 次に、好ましくは濃縮されたＨｂ溶液に緩衝液を適用し、Ｈｂの脱酸素化を促
進するためにＨｂ溶液のイオン強度を調整する。Ｈｂ溶液中のＨｂの酸素親和性
を低下させるために、イオン強度を約１５０ｍｅｑ／ｌ〜約２００ｍｅｑ／ｌに
調整することが好ましい。適当な緩衝液は、Ｈｂ蛋白の有意の変性をもたらさな
いが、Ｈｂの脱酸素化を促進するのに十分な高さのイオン強度を持つｐＨの緩衝
液を含む。適当な緩衝液の例は、約６．５〜約８．９のｐＨ範囲を有する生理食
塩水を含む。好ましい緩衝液は、約８．９のｐＨを持つ、水性１．０Ｍ ＮａＣ
ｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液である。
【００６４】 好ましくは、得られた緩衝Ｈｂ溶液を限外濾過器を通して再循環させ、再びＨ
ｂ溶液を濃縮して、処理の効率を改善する。好ましい実施態様では、Ｈｂの濃度
が約１００ｇ／ｌ〜約１２０ｇ／ｌであるときに濃縮は完了する。
【００６５】 脱酸素化の間、適当な相間移動膜を通してＨｂ溶液を循環させる。適当な相間
移動膜は、例えば０．０５μｍポリプロピレン中空ファイバーマイクロフィルタ
ー（例えばＨｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ Ｃａｔ＃５ＰＣＭ−１０７）を
含む。同時に、不活性気体の向流を相間移動膜を通過させる。適当な不活性気体
は、例えば窒素、アルゴン及びヘリウムを含む。それにより相間移動膜を介する
ガス交換がＨｂ溶液から酸素を除去する。
【００６６】 Ｈｂ溶液のｐＯ2 が、Ｈｂ溶液中の酸化Ｈｂ（オキシヘモグロビン又はＨｂＯ 2 ）含量が約２０％又はそれより小さくなるレベルに低下するまで脱酸素化を続
ける。好ましい実施態様では、Ｈｂ溶液中のＨｂＯ2 含量は約１０％又はそれよ
り小さい。
【００６７】 脱酸素化の間、Ｈｂ溶液の温度は、典型的にはメトヘモグロビン形成の速度と
脱酸素化の速度が釣り合うレベルに保持する。メトヘモグロビン含量を２０％未
満に制限するように温度を保持する。至適温度は、Ｈｂ溶液を脱酸素化しながら
、約５％未満のメトヘモグロビン含量、好ましくは約２．５％未満のメトヘモグ
ロビン含量をもたらす。典型的には、脱酸素化の間、Ｈｂ溶液の温度を約１９℃
〜約３１℃に保持する。
【００６８】 脱酸素化の間、及びその後本発明の方法の残りの工程を通じて、Ｈｂによる酸
素吸収を最小限に抑え、約２０％未満、好ましくは約１０％未満のＨｂＯ2 含量
を保持するために、Ｈｂを低酸素環境に保持する。
【００６９】 次に脱酸素化したＨｂを、好ましくはスルフヒドリル化合物を含む低酸素含量
保存緩衝液で平衡化させ、酸化に対して安定なデオキシ‐Ｈｂを生成する。適当
なスルフヒドリル化合物は、Ｎ‐アセチル‐Ｌ‐システイン（ＮＡＣ）、Ｄ，Ｌ
‐システイン、γ‐グルタミル‐システイン、グルタチオン、２，３‐ジメルカ
プト‐１‐プロパノール、１，４‐ブタンジチオール、チオグリコレート、及び
他の生物学的に適合性のスルフヒドリル化合物などの非毒性還元剤を含む。低酸
素含量保存緩衝液の酸素含量は、緩衝液中のスルフヒドリル化合物の濃度を有意
に低下させず、酸化に対して安定なデオキシ‐Ｈｂ中のオキシヘモグロビン含量
を約２０％以下、好ましくは約１０％未満に抑えるのに十分な低さでなければな
らない。典型的には、保存緩衝液は約５０トール未満のｐＯ2 を持つ。
【００７０】 好ましい実施態様では、保存緩衝液は、Ｈｂ重合とメトヘモグロビン形成を釣
り合わせるのに適したｐＨ、典型的には約７．６〜約７．９のｐＨを有していな
ければならない。
【００７１】 デオキシ‐Ｈｂと混合するスルフヒドリル化合物の量は、重合の際にＨｂの分
子内架橋を高めるのに十分多く、且つ高いイオン強度のためにＨｂ分子の分子間
架橋を有意に低下させすることがない十分少ない量である。典型的には、約０．
２５モル〜約５モルのデオキシ‐Ｈｂを酸化に対して安定化するために約１モル
のスルフヒドリル官能基（‐ＳＨ）が必要である。
【００７２】 好ましい態様において、保存緩衝液は、約２５〜３５ｍＭのリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ ７．７〜７．８）を含み、且つ酸化安定化デオキシ−Ｈｂ中のＮ
ＡＣ濃度が約０．００３重量％〜約０．３重量％であるような量のＮＡＣを含む
。より好ましくは、酸化安定化デオキシ−Ｈｂ中のＮＡＣ濃度は、約０．０５重
量％〜約０．２重量％である。
【００７３】 好ましくは、保存緩衝液を、デオキシ−Ｈｂと混合する前に１０，０００ダル
トンの限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ Ｃａｔ＃ＣＤＵＦ０
５０Ｇ１又はＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｘｃｅｌｌ Ｃａｔ＃ＵＦＰ
−１０−Ｃ−７５）などを通して濾過する。
【００７４】 １つの態様において、ついで、酸化安定化デオキシ−Ｈｂを任意のフィルター
に通す。適切なフィルターとしては、０．２μｍポリプロピレンプレフィルター
および０．５μｍ滅菌マイクロフィルター（Ｐａｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＩＩ，
Ｃａｔ＃ＡＢＩＹ００５Ｚ７またはＧｅｌｍａｎ Ｓｕｐｏｒ）が挙げられる。
デオキシ−Ｈｂは、実質的に酸素を含まない大気下に維持される。これは、例え
ば、酸素安定化デオキシ−Ｈｂの充填前および充填後に、窒素などの不活性ガス
で処理装置をパージし、かつ一面におおう（ｂｌａｎｋｅｔｔｉｎｇ）ことによ
って実現できる。
【００７５】 任意に、酸化安定化デオキシ−Ｈｂを重合に移す前に、適切な量の水を重合反
応器に添加する。１つの態様において、水の適切な量は、酸化安定化デオキシ−
Ｈｂを重合反応器に添加したとき約１０〜約１００ｇ／ｌ Ｈｂの濃度の溶液を
生じる量である。好ましくは、水は、酸素を低減（ｏｘｙｇｅｎ−ｄｅｐｌｅｔ
ｅｄ）されている。
【００７６】 重合ステップにおいて、水のｐＯ2 を、ＨｂＯ2 含量を約２０％に制限するの
に十分なレベル、典型的には、約５０トール未満に低下させた後、重合反応器を
窒素のような不活性ガスで一面におおう。ついで、酸化安定化デオキシ−Ｈｂを
、重合反応器に移し、同時に該反応器を不活性ガスの適切な供給（ｆｌｏｗ）で
一面におおう。
【００７７】 重合反応器における酸化安定化デオキシ−Ｈｂ溶液の温度を、架橋剤と接触し
たとき酸化安定化デオキシ−Ｈｂの重合を至適化する温度まで上昇させる。典型
的には、酸化安定化デオキシ−Ｈｂ溶液の温度は、重合の間を通じて約２５℃〜
約４５℃、好ましくは、約４１℃〜約４３℃である。重合反応器を加熱するため
の許容される熱伝達手段の例は、ジャケットを通して熱エチレングリコールを適
用することによって加熱する、ジャケット型加熱システム（ｊａｃｋｅｔｅｄ
ｈｅａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）である。
【００７８】 ついで、酸化安定化デオキシ−Ｈｂを、酸化安定化デオキシ−Ｈｂを重合する
のに十分な温度で適切な架橋剤に曝し、約２時間から約６時間かけて重合ヘモグ
ロビン（ｐｏｌｙ（Ｈｂ））の溶液を生成する。
【００７９】 適切な架橋剤の例としては、中でも、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデ
ヒド、活性型のポリオキシエチレンおよびデキストラン、グリコールアルデヒド
などのα−ヒドロキシアルデヒド、Ｎ−マレイミド−６−アミノカプロイル−（
２’−ニトロ，４’−スルホン酸）−フェニルエステル、ｍ−マレイミド安息香
酸−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシニミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシニミドエステル、Ｎ−スクシニミジル（４−
ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スルホスクシニミジル（４−ヨードアセ
チル）アミノベンゾエート、スクシニミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチレート、スルホスクシニミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
ト、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド、Ｎ
，Ｎ’−フェニレンジマレイミド、およびビス−イミデートクラス、二アジ化ア
シルクラスまたは二ハロゲン化アリールクラスに属する化合物などのＨｂタンパ
ク質を架橋する多官能性作用物質が挙げられる。
【００８０】 架橋剤の適切な量は、分子内架橋がＨｂを安定化し、かつ分子間架橋が、Ｈｂ
の重合体を形成し、それにより血管内保持を可能にする量である。典型的には、
架橋剤の適切な量は、架橋剤対Ｈｂのモル比が約２：１を超える量である。好ま
しくは、架橋剤対Ｈｂのモル比は、約２０：１から４０：１である。
【００８１】 好ましくは、重合は、約３５ミリモルまたはそれ以下の塩化物濃度を有する、
約７．６〜約７．９のｐＨの緩衝液中で行なわれる。
【００８２】 好ましい態様において、適切な量の架橋剤を、酸化安定化デオキシ−Ｈｂに添
加し、その後、低い剪断（ｓｈｅａｒ）で混合するための手段によって混合する
。適切な低剪断混合手段としては、スタティクミキサーが挙げられる。適切なス
タティクミキサーは、例えば、Ｃｈｅｍｉｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．から入手される「
Ｋｅｎｉｃｓ」スタティクミキサーである。
【００８３】 １つの態様において、スタティクミキサーを通して、酸化安定化デオキシ−Ｈ
ｂと架橋剤との再循環は、一般に、酸化安定化デオキシ−Ｈｂと架橋剤との均質
な混合を伴う乱流条件を引き起こし、それによって高濃度の架橋剤を含むデオキ
シ−Ｈｂのポケットが形成される可能性を低下させる。一般に、架橋剤とデオキ
シ−Ｈｂとの均質な混合は、高分子量のＨｂポリマー、すなわち、５００，００
０ダルトンを超える分子量のポリマーの形成を低下させ、また、重合の際に、架
橋剤とデオキシ−Ｈｂとのより速やかな混合を可能にする。さらに、スルフヒド
リル化合物、好ましくは、ＮＡＣの存在により、Ｈｂ重合の際に有意のＨｂ分子
内架橋が生じるであろう。スルフヒドリル化合物とグルタルアルデヒドおよび／
またはＨｂとの相互作用の正確な機構は不明であるが、スルフヒドリル化合物が
、少なくとも部分的に高分子量Ｈｂポリマーの形成を阻害し、安定化された四量
体Ｈｂを優先的に形成するように、Ｈｂ／架橋剤化学結合に作用すると考えられ
る。
【００８４】 ポリ（Ｈｂ）は、ポリ（Ｈｂ）においてＨｂ分子の実質的な部分（例えば、少
なくとも約５０％）が化学結合しており、約１５％未満などの少量だけが高分子
量の重合ヘモグロビン鎖内に含まれる場合、顕著な分子内架橋を有すると定義さ
れる。高分子量ポリ（Ｈｂ）分子は、例えば、約５００，０００ダルトンを超え
る分子量の分子である。
【００８５】 好ましい態様において、グルタルアルデヒドを架橋剤として使用する。典型的
には、酸化安定化デオキシ−Ｈｂ １ｋｇあたり約１０−約７０グラムのグルタ
ルアルデヒドを使用する。より好ましくは、酸化安定化デオキシ−Ｈｂ各１ｋｇ
につき約２９−３１グラムのグルタルアルデヒドが添加されるまで５時間にわた
ってグルタルアルデヒドを添加する。
【００８６】 重合後、重合反応器中のポリ（Ｈｂ）溶液の温度を、典型的には、約１５℃〜
約２５℃に低下させる。
【００８７】 架橋剤がアルデヒドではない場合、形成されたポリ（Ｈｂ）は、一般的に安定
なポリ（Ｈｂ）である。使用された架橋剤がアルデヒドである場合、形成された
ポリ（Ｈｂ）は、適切な還元剤と混合し、ポリ（Ｈｂ）中の安定でない結合を還
元し、より安定な結合を形成するまで、一般に安定ではない。適切な還元剤の例
は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン酸ナ
トリウム、トリメチルアミン、ｔ−ブチルアミン、モルホリンボランおよびピリ
ジンボランを含む。還元剤を添加する前に、ポリ（Ｈｂ）溶液の濃度が約７５〜
約８５ｇ／ｌに上昇するまで、限外濾過により、任意に、ポリ（Ｈｂ）溶液を濃
縮する。適切な限外濾過器の例は、３０，０００ダルトンフィルター（例えば、
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ，Ｃａｔ＃ ＣＤＵＦ０５０ＬＴおよびＡ
ｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ＃５４０４３０）である。
【００８８】 ついで、ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨを、還元剤を保ち、つづく還元の際にＨｂを
変性させうる水素ガスの発生を妨げるアルカリ性ｐＨ範囲に調整する。１つの態
様において、ｐＨを１０を超えるように調整する。ｐＨは、重合の間または重合
後、ポリ（Ｈｂ）溶液に緩衝液を添加することによって調整されうる。典型的に
は、ポリ（Ｈｂ）を精製して、非重合ヘモグロビンを除去する。これは、ダイア
フィルトレーション（ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）またはヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィーによって実施できる（例えば、参照により本明細書に取
り込まれる米国特許第５，６９１，４５３号明細書を参照のこと）。
【００８９】 ｐＨの調整後、典型的には、脱酸素化ループを通して、少なくとも１つの還元
剤、好ましくは、水素化ホウ素ナトリウムを重合段階に添加する。典型的には、
ポリ（Ｈｂ）内のＨｂ四量体１モルあたり（６４，０００ダルトンのＨｂあたり
）約５〜約１８モルの還元剤を添加する。好ましい態様において、重合サブシス
テム９８においてポリ（Ｈｂ）溶液９リットルあたり、０．２５Ｍ水素化ホウ素
ナトリウム１リットルを０．１〜０．１２ ｌｐｍの速度で添加する。
【００９０】 ついで、安定なポリ（Ｈｂ）を適切なｐＨと生理的電解質レベルとを有するダ
イアフィルトレーション溶液を用いダイアフィルトレートすることにより、安定
なポリ（Ｈｂ）のｐＨと電解質を生理的レベルに回復させて、安定な重合ヘモグ
ロビン代用血液を生成することができる。好ましくは、ダイアフィルトレーショ
ン溶液は、緩衝液である。
【００９１】 ポリ（Ｈｂ）を還元剤で還元した場合、ダイアフィルトレーション溶液は、好
ましくは、約４〜約６の酸性ｐＨを有する。
【００９２】 また、酸素スカベンジャーとして、無毒性スルフヒドリル化合物を安定ポリ（
Ｈｂ）溶液に添加して、最終的な重合ヘモグロビン代用血液の安定性を高めるこ
ともできる。スルフヒドリル化合物は、ダイアフィルトレーション溶液の一部と
して添加することおよび／または別途に添加することができる。保存期間にわた
ってメトヘモグロビン含量を約１５％未満に保持するように酸素を捕捉するスル
フヒドリル濃度を確立するために、一定量のスルフヒドリル化合物を添加する。
好ましくは、スルフヒドリル化合物は、ＮＡＣである。典型的には、添加するス
ルフヒドリル化合物の量は、約０．０５重量％〜約０．２重量％のスルフヒドリ
ル濃度を確立するのに十分な量である。
【００９３】 好ましい態様において、重合反応器および残りの運搬装置において、不活性で
あり、実質的に酸素を含まない大気で圧を維持しながら、無菌的取り扱い条件下
で代用血液を包装する。
【００９４】 本発明の方法によって生成される適切な安定重合ヘモグロビン代用血液につい
ての規格を表Ｉに示す。
【００９５】
【００９６】 ついで、安定代用血液を、各々が上記で説明したような低酸素濃度環境を有す
る短期保管容器または無菌保管容器内に保管する。保管容器は、さらに、保管期
間を通して蒸発による代用血液の著しい濃縮を防止するために水蒸気の通過に対
して十分に不透過性でなければならない。代用血液の著しい濃縮は、代用血液の
１種以上のパラメーターが仕様から外れて高くなることをもたらす濃縮である。
【００９７】 本発明の方法により生成される安定重合ヘモグロビン代用血液の合成は、米国
特許第５，２９６，４６５号明細書に詳細に記載されている。
【００９８】 本発明の方法により形成される代用血液を受けることのできる脊椎動物として
は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ラット、ウマまたはヒツジなどの哺乳動
物が挙げられる。さらに、前記代用血液を受けることのできる脊椎動物としては
、胎児（出生前脊椎動物）、出生後脊椎動物、または出生時脊椎動物などがあま
れる。
【００９９】 本発明の代用血液は、代用血液を１種以上の注射方法によって脊椎動物の循環
系内に直接的および／または間接的に注射することによって循環系内に投与され
うる。直接注射方法の例としては、例えば、静脈内および動脈内注射などの血管
内注射と心臓内注射とが含まれる。間接的注射方法の例には、腹腔内注射、代用
血液がリンパ系によって循環系に輸送される皮下注射、またはトロカールもしく
はカテーテルによる骨髄内への注射が挙げられる。好ましくは、代用血液は、静
脈内投与する。
【０１００】 治療される脊椎動物は、代用血液の注入前、注入中、および／または注入後に
正常血液量、血液量過多または血液量過少であってよい。代用血液は、例えば、
トップローディングのような方法および交換法によって循環系内に差し向けるこ
とができる。
【０１０１】 代用血液は、循環系の一部分または全体を通してのＲＢＣ流量低下、貧血およ
び脳卒中を含む多数の様々な原因の結果として生じる脊椎動物内の低酸素組織を
治療するために治療的に投与されうる。さらに、代用血液は、脊椎動物の組織へ
のＲＢＣ流量または循環系の全体へのＲＢＣ流量における可能性のある、または
予想される減少の結果として生じうる脊椎動物内の組織の酸素欠乏を防止するた
めに予防的に投与されうる。さらに、部分的動脈閉塞または微小循環における部
分的遮断から生じた低酸素症を治療的または予防的に治療するためのヘモグロビ
ンの投与、およびその場合に使用する用量についての考察は、その全体が参照に
より本明細書に取り込まれる同時係属出願の１９９５年３月２３日に提出された
米国特許出願第０８／４０９，３３７号明細書に提供されている。
【０１０２】 典型的には、代用血液の適切な用量、または用量の組み合わせは、血漿内に含
まれたときに脊椎動物の血液中で約０．１〜約１０ｇ Ｈｂ／ｄｌ以上の総ヘモ
グロビン濃度をもたらす量、または大量の失血を補うために必要とされる量であ
る。
【０１０３】 以下、本発明を下記実施例によって、より詳細に説明する。
【０１０４】 実施例１ 安定重合Ｈｂ含有代用血液の合成 米国特許第５、２９６，４６５号明細書に記載されるように、ウシ全血のサン
プルを採取し、クエン酸ナトリウム抗凝固剤と混合して血液溶液を生成した。
【０１０５】 各血液溶液サンプルを、採取後に約２℃の温度で維持し、ついで、大きな凝集
塊および粒子を除去するために６００番メッシュスクリーンを用いて濾した。
【０１０６】 プールする前に、血液溶液中のペニシリン量が＜０．００８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ
であることを保証するために“Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｎ ｉｎ Ｍｉｌｋ（牛乳中のペニシリンの迅速検出）”と題する
方法を使用してＤｉｆｃｏ社、デトロイト、ミシガン州から購入したアッセイキ
ットを用いて各血液溶液サンプル中のペニシリン量を検定した。
【０１０７】 その後血液溶液サンプルをプールし、発熱物質を除去した（ｄｅｐｙｒｏｇｅ
ｎａｔｅｄ）クエン酸ナトリウム水溶液と混合してウシ全血中の重量で０．２％
のクエン酸ナトリウム溶液を生成した（以後、“０．２％クエン酸ナトリウム血
液溶液”と呼ぶ）。
【０１０８】 ついで、８００μｍおよび５０μｍポリプロピレンフィルターに連続的に０．
２％クエン酸ナトリウム血液溶液サンプルを通過させ、径がおよそ５０μｍ以上
の大きな血液溶液デブリスを除去した。
【０１０９】 ついで、ＲＢＣｓを洗浄し、ＢＳＡまたはＩｇＧなどの細胞外血漿タンパク質
をＲＢＣｓから分離した。血液溶液中に含まれているＲＢＣｓを洗浄するために
、ダイアフィルトレーションタンクへ同等容積の濾過等張溶液を添加することに
よって最初にダイアフィルトレーションタンク内の容積の血液溶液を希釈した。
等張溶液は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（製品番号＃：ＣＤＵＦ ０５０ Ｇ１）１０
，０００ダルトン限外濾過膜を用いて濾過した。等張溶液は、注射用蒸留水（Ｗ
ＦＩ）に溶解した６．０ｇ／ｌのクエン酸ナトリウムニ水化物と８．０ｇ／ｌの
塩化ナトリウムとから構成された。
【０１１０】 ついで、希釈血液溶液は、０．２μｍ中空糸（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ Ｋｒｏｓｆ
ｌｏ ＩＩ精密濾過カートリッジ）ダイアフィルターを介するダイアフィルトレ
ーションによって原体積へ濃縮した。同時に、濾過した等張溶液を０．２μｍダ
イアフィルターを通しての濾液消失速度と同等の速度で補給物として連続的に添
加した。ダイアフィルトレーション中に、径がＲＢＣｓより有意に小さい、また
は血漿などの体液である希釈血液溶液のコンポーネントを濾液と一緒に０．２μ
ｍダイアフィルターの壁を通過させた。ＲＢＣｓ、血小板および、例えば、白血
球などの、希釈血液溶液より大きな塊は、透析血液溶液を形成するために連続的
に添加された等張溶液と一緒に保持した。
【０１１１】 ＲＢＣ洗浄中には、希釈血液溶液は処理加工効率を向上させるためにダイアフ
ィルターの入口での約２５ｐｓｉ〜約３０ｐｓｉの液圧とともに約１０〜２５℃
の温度で維持した。
【０１１２】 ＲＢＣ洗浄は、ダイアフィルターから流出した濾液の容積が濾過等張溶液を用
いた希釈前の血液溶液の容積の約６００％に等しくなった時点で完了した。
【０１１３】 透析した血液溶液はその後、約４ｌｐｍの速度で＃２８リングダムを装備した
Ｓｈａｒｐｌｅｓ Ｓｕｐｅｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｍｏｄｅｌ＃ＡＳ−１
６）へ連続的にポンプで輸送した。遠心機は、白血球および血小板からＲＢＣｓ
を分離するために透析血液溶液が連続的に供給されている間は作動していた。作
動中、遠心機は、その間に同様に白血球（ＷＢＣｓ）および血小板の実質的な部
分を軽いＷＢＣ相内へ分離しながらＲＢＣｓを重いＲＢＣ相内へ分離するために
十分な速度で、詳細には約１５，０００ｒｐｍで回転させた。ＲＢＣ相およびＷ
ＢＣ層の画分は、作動中に個別かつ連続的に遠心分離機から排出された。
【０１１４】 ＲＢＣｓの分離後、ヘモグロビン含有溶液を生成するためにＲＢＣｓを溶解さ
せた。遠心分離機からＲＢＣｓを排出する間に、実質的部分のＲＢＣｓを機械的
に溶解させた。ＲＢＣｓの細胞膜は、遠心分離機から流出するＲＢＣ相へある角
度でＲＢＣ相流出ラインの壁に衝撃を与えると破裂し、それによってＲＢＣｓか
らヘモグロビン（Ｈｂ）がＲＢＣ相内へ遊離した。
【０１１５】 溶解されたＲＢＣ相をその後ＲＢＣ相流出ラインを通ってスタティックミキサ
ー（６エレメントを備えたＫｅｎｉｃｓ １／２インチ、Ｃｈｅｍｉｎｅｅｒ，
Ｉｎｃ．製）内に流動させた。スタティックミキサーへのＲＢＣ相の輸送と同時
に、等量のＷＦＩもまたスタティックミキサーに注入したが、このときＷＦＩは
ＲＢＣ相と混合された。ＲＢＣ相およびＷＦＩのスタティックミキサー内への流
速は各々約０．２５ｌｐｍであった。
【０１１６】 スタティックミキサー内でのＲＢＣ相とＷＦＩとの混合は、溶解したＲＢＣコ
ロイドを産生した。溶解したＲＢＣコロイドはその後スタティックミキサーから
、非ヘモグロビンＲＢＣコンポーネントからＨｂを分離するために適切であるＳ
ｈａｒｐｌｅｓ Ｓｕｐｅｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｍｏｄｅｌ＃ＡＳ−１６
、 Ｓｈａｒｐｌｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ Ｓｅ
ｐａｒａｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．製）内に輸送された。この遠心機は、溶解したＲ
ＢＣコロイドを軽いＨｂ相と重い相とに分離させるのに十分な速度で回転させた
。軽い相はＨｂから構成されており、さらにＨｂの密度とほぼ同等以下の密度を
有する非ヘモグロビンコンポーネントも含有していた。
【０１１７】 Ｈｂ相は、０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｃａｓｓ
ｅｔｔｅ（Ｃａｔ＃ＨＶＬＰ ０００ Ｃ５）マイクロフィルターを通して遠心
機からＨｂ精製の準備のために貯蔵タンク内に連続的に流出させた。細胞基質は
その後、濃縮水と一緒にマイクロフィルターから貯蔵タンク内に戻した。精密濾
過中、貯蔵タンク内の温度は１０℃以下で維持した。効率を改善するために、マ
イクロフィルター入口での液圧を約１０ｐｓｉの初期圧から約２５ｐｓｉへ上昇
させると、精密濾過が完了した。Ｈｂ精密濾過液はその後マイクロフィルターか
ら精密濾液タンク内へ移した。
【０１１８】 引き続いて、１００，０００ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃａｔ＃ＣＤＵＦ ０５
０ Ｈ１）限外濾過装置を通してＨｂ精密濾液をポンプで送り出した。Ｈｂ精密
濾液中に含まれているＨｂの実質的部分および水は１００，０００ダルトン限外
濾過機を通過してＨｂ限外濾過液を生成したが、他方約１００，０００ダルトン
を超える分子量を有するタンパク質のような大きな細胞挫滅片は保持され、精密
濾液タンク内へ再循環させられた。同時に、限外濾液中で失われた水に対する補
給物としてＷＦＩを精密濾液タンクに連続的に添加した。一般に、細胞挫滅片に
はＨｂ、小さな細胞タンパク質、電解質、補酵素および有機代謝中間物を除くす
べての全および断片化細胞コンポーネントが含まれている。限界濾過は、精密濾
液タンク内のＨｂ濃度が８グラム／リットル（ｇ／ｌ）未満になるまで継続した
。Ｈｂの限外濾過を実施している間は、精密濾液タンクの庫内温度は約１０℃で
維持した。
【０１１９】 Ｈｂ限外濾液は限外濾液タンク内に輸送されたが、このときＨｂ限外濾液は３
０，０００ダルトンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃａｔ＃ＣＤＵＦ ０５０ Ｔ１）
限外濾過装置を通して再循環させられ、例えば電解質、補酵素、代謝中間物およ
びタンパク質のような分子量が約３０，０００ダルトン未満の小さな細胞コンポ
ーネントおよびＨｂ限外濾液からの水が除去され、それによって約１００ｇ Ｈ
ｂ／ｌを含有する濃縮Ｈｂ溶液が生成された。
【０１２０】 その後高速液体クロマトグラフィーによってＨｂを分離するために、濃縮Ｈｂ
溶液を限外濾液タンクから平行クロマトグラフィーカラム（長さ２フィート、内
径８インチ）に含有されている溶媒上に方向付けた。クロマトグラフィーカラム
は非ヘモグロビンタンパク質からＨｂを分離するために適切な陰イオン交換溶媒
を含有していた。陰イオン交換溶媒はシリカゲルから形成された。活性エポキシ
ド基を形成するためにシリカゲルをγ−グリシドキシプロピルシランへ暴露させ
、その後第４級アンモニウム陰イオン交換溶媒を形成するためにＣ3 Ｈ7 （ＣＨ 3 ）ＮＣｌへ暴露させた。シリカゲルを処理するこの方法は、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， １２０：３２１〜３３３（１９７６）
に記載されている。
【０１２１】 各カラムは、Ｈｂ結合を促進する第１緩衝液を用いてクロマトグラフィーカラ
ムをフラッシュすることによって前処理した。次に４．５２リットルの濃縮Ｈｂ
溶液を各クロマトグラフィーカラム内に注入した。濃縮Ｈｂ溶液を注入した後、
次いでカラム内でｐH 勾配を作り出すことによってＨｂ溶出液を産生するために
クロマトグラフィーカラムを通して３種の緩衝液を連続的に注ぐことによってク
ロマトグラフィーカラムを洗浄した。使用中の各緩衝液の温度は約１２．４℃で
あった。緩衝液は、クロマトグラフィーカラム上に注入する前に１０，０００ダ
ルトン限外濾過膜を通して前濾過した。
【０１２２】 第１緩衝液の２０ｍＭトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）（
ｐＨ：約８．４〜約９．４）は、クロマトグラフィーカラムの溶媒内に濃縮Ｈｂ
溶液を輸送し、Ｈｂを結合させた。第１緩衝液と第３緩衝液の混合液である約８
．３のｐＨを有する第２緩衝液は、その後Ｈｂを保持しながらクロマトグラフィ
ーカラムから汚染している非ヘモグロビンコンポーネントを溶出させるためにク
ロマトグラフィーカラム内のｐＨを調整した。第２緩衝液を用いての平衡は、１
カラム当たり約３．５６ｌｐｍの流速で約３０分間持続した。第２緩衝液からの
溶離液は廃棄するために処分した。その後第３緩衝液の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ：約６．５〜約７．５）はクロマトグラフィーカラムからＨｂを溶出した。
【０１２３】 その後、無菌０．２２μ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（Ｃａｔ＃５２３２５０７）Ｇ
１ＰＨフィルターを通してＨｂ溶離液が収集されるタンク内にＨｂ溶離液を向か
わせた。Ｈｂ溶離液の最初の３〜４％およびＨｂ溶離液の最後の３〜４％は廃棄
するように方向付けた。
【０１２４】 Ｈｂ溶離液は、溶離液が０．０５ＥＵ／ｍｌ未満の内毒素および３．３ｎｍｏ
ｌｅｓ／ｍｌ未満のリン脂質を含有している場合にはさらに使用した。１００ｇ
Ｈｂ／ｌの濃度を有する超高純度溶離液６０リットルへ９ｌの１．０Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．９）緩衝液を添加し、それによってＨｂ溶
液中のＨｂの酸素親和性を低下させるために１６０ｍＭのイオン強度を有するＨ
ｂ溶液が生成された。Ｈｂ溶液はその後、限外濾過装置、詳細には１０，０００
ダルトンＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ（Ｃａｔ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１）
フィルターを通してＨｂ濃度が１１０ｇ／ｌとなるまで再循環させることによっ
て１０℃で濃縮した。
【０１２５】 Ｈｂ溶液はその後、脱酸素Ｈｂ溶液（以後、“脱酸素−Ｈｂ”と呼ぶ）を生成
するために、ＨｂＯ2 含量が約１０％であるレベルへＨｂ溶液のｐＯ2 が低下す
るまで１２ｌｐｍで０．０５μｍヘキスト・セラニーズ・コーポレーション（Ｈ
ｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製（Ｃａｔ＃Ｇ２
４０／４０）ポリプロピレン製マイクロフィルター相転位膜を通して酸素除去し
た。同時に、窒素ガスの６０ｌｐｍの流れを相転位膜の反対側を通して再循環さ
せることにより方向付けた。脱酸素中、Ｈｂ溶液の温度は約１９℃〜約３１℃で
維持した。
【０１２６】 さらに脱酸素中、および引き続いての全プロセス中、Ｈｂによる酸素吸収を最
小限に抑えるため、および脱酸素−Ｈｂ中の酸化Ｈｂ（オキシヘモグロビンまた
はＨｂＯ2 ）含量を約１０％未満に維持するためにＨｂを低酸素環境で維持した
。
【０１２７】 その後酸化安定化脱酸素−Ｈｂを生成するために０．２ｗｔ％ Ｎ−アセチル
システイン、５０トル未満のｐＯ2 を有する３３ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７．８）を含有する１８０ｌの貯蔵用緩衝液と一緒に限外濾過装置を通して
脱酸素−Ｈｂ（６０リットル）をダイアフィルトレーションした。脱酸素Ｈｂと
混合する前に、１０，０００ダルトンＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｅｌｉｃｏｎ（Ｃ
ａｔ＃ＣＤＵＦ０５０Ｇ１）発熱物質除去フィルターを用いて貯蔵用緩衝液から
発熱物質を除去した。
【０１２８】 限外濾過装置を越えた液体損失にほぼ等価の流速で貯蔵用緩衝液を連続的に添
加した。ダイアフィルトレーションは、限外濾過装置を越えてのダイアフィルト
レーションを通して失われた液体容積が脱酸素−Ｈｂの初期量の約３倍となるま
で継続した。
【０１２９】 酸化安定化脱酸素−Ｈｂを重合装置内へ輸送する前に、酸化安定化脱酸素−Ｈ
ｂの酸化を防止する目的で重合装置の酸素をパージするために酸素欠乏ＷＦＩを
重合反応装置へ添加した。重合装置へ添加したＷＦＩの量は、酸化安定化脱酸素
−Ｈｂを重合反応装置へ添加したときに、約４０ｇ Ｈｂ／ｌの濃度を有するＨ
ｂ溶液を生じさせる量であった。ＷＦＩはその後、加圧窒素の向流に対して０．
０５μｍポリプロピレン製マイクロフィルター相転位膜（ヘキスト・セラニーズ
・コーポレーション製、Ｃａｔ＃５ＰＣＭ−１０８、８０平方フィート）を通し
た流れによってＷＦＩを脱酸素するために、重合装置を通して再循環させた。相
転位膜を通してのＷＦＩおよび窒素ガスの流速は、各々１８〜２０ｌｐｍおよび
４０〜６０ｌｐｍであった。
【０１３０】 重合装置内のＷＦＩのｐＯ2 が約２トルｐＯ2 未満に低下した後、重合反応装
置のヘッドスペース内への約２０ｌｐｍの窒素の流れによって窒素を用いて重合
反応装置をガスシールした。酸化安定化脱酸素−Ｈｂをその後重合反応装置内へ
運んだ。
【０１３１】 重合は、約３５ｍモル以下の塩化物濃度を有するｐＨが７．８である１２ｍＭ
リン酸緩衝液中で実施した。
【０１３２】 酸化安定化脱酸素−ＨｂおよびＮ−アセチルシステインは引き続いて、重合化
Ｈｂ（ポリ（Ｈｂ））溶液を生成するために、４０℃で加熱して６エレメントを
備えたＫｅｎｉｃｓ １−１／インチのスタティックミキサー（Ｃｈｅｍｉｎｅ
ｅｒ， Ｉｎｃ．）を通してＨｂ溶液を再循環させながら、架橋結合剤であるグ
ルタルアルデヒドと、詳細には５時間に渡ってＨｂ各１ｋｇ当たり２９．４ｇの
グルタルアルデヒドと緩徐に混合した。
【０１３３】 スタティックミキサーを通して酸化安定化脱酸素−Ｈｂおよびグルタルアルデ
ヒドを再循環させると、グルタルアルデヒドと酸化安定化脱酸素−Ｈｂの概して
一様な混合を伴う乱流状態が引き起こされ、それによって高濃度のグルタルアル
デヒドを含有する脱酸素−Ｈｂのポケットを生成する可能性が低下した。グルタ
ルアルデヒドと脱酸素−Ｈｂの概して一様な混合は、高分子量ポリ（Ｈｂ）（５
００，０００ダルトンを越える分子量を有する）の生成を減少させ、さらに重合
中のグルタルアルデヒドと脱酸素−Ｈｂの迅速な混合も許容した。
【０１３４】 さらに、Ｈｂの重合にＮ−アセチルシステインの存在が及ぼす作用の結果とし
てＨｂ重合中に有意なＨｂ分子内架橋結合が生じた。
【０１３５】 重合後、重合反応装置内のポリ（Ｈｂ）溶液の温度を約１５℃〜約２５℃の温
度へ低下させた。
【０１３６】 次にポリ（Ｈｂ）の濃度が約８５ｇ／ｌへ上昇するまで限外濾過装置を通して
ポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させることによってポリ（Ｈｂ）溶液を濃縮した。適
切な限外濾過装置は３０，０００ダルトンフィルター（例、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
Ｈｅｌｉｃｏｎ（製品番号ＣＤＵＦ０５０ＬＴ）である。
【０１３７】 引き続いて、ポリ（Ｈｂ）溶液を６６．７５ｇの水酸化ホウ素ナトリウムと混
合し、再びスタティックミキサーを通して再循環させた。詳細には、ポリ（Ｈｂ
）溶液９リットルにつき１リットルの０．２５Ｍ水酸化ホウ素ナトリウム溶液を
０．１〜０．１２ｌｐｍの速度で添加した。
【０１３８】 ポリ（Ｈｂ）溶液へ水酸化ホウ素ナトリウムを添加する前に、水酸化ホウ素ナ
トリウムを保存して水素ガス発生を防止するためにｐＨを約１０のｐＨへ調整す
ることによってポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨを塩基性化した。ポリ（Ｈｂ）溶液のｐ
Ｈは、約１０．４〜約１０．６のｐＨを有する発熱物質除去かつ脱酸素化された
１２ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液約２１５ｌを用いてポリ（Ｈｂ）溶液をダイア
フィルトレーションすることによって調整した。重合反応装置から３０ｋＤ限外
濾過装置を通してポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させることによってポリ（Ｈｂ）溶
液をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションから限外濾過装
置を越える液体損失速度にほぼ同等の速度でホウ酸ナトリウム緩衝液をポリ（Ｈ
ｂ）溶液に添加した。ダイアフィルトレーションは、ダイアフィルトレーション
から限外濾過装置を越えた液体損失量が重合反応装置内のポリ（Ｈｂ）溶液の初
期量の約３倍になるまで継続した。
【０１３９】 ｐＨ調整後、結合剤へのポリ（Ｈｂ）溶液内の結合を低下させるために、およ
び溶液内で安定ポリ（Ｈｂ）を生成するために水酸化ホウ素ナトリウム溶液を重
合反応装置へ添加した。水酸化ホウ素ナトリウムの添加中に、溶存酸素および水
素を除去するためにスタティックミキサーおよび０．０５μｍポリプロピレン製
マイクロフィルター相転移膜を通して重合反応装置内のポリ（Ｈｂ）溶液を連続
的に再循環させた。スタティックミキサーを通しての流れは、さらに水酸化ホウ
素ナトリウムとポリ（Ｈｂ）溶液とを迅速かつ効果的に混合する乱流水酸化ホウ
素ナトリウム流動状態も生じさせた。０．０５μｍ相転移膜を通してのポリ（Ｈ
ｂ）溶液と窒素ガスの流速は、各々約２．０〜４．０ｌｐｍから約１２〜１８ｌ
ｐｍの間であった。水酸化ホウ素ナトリウムの添加の完了後に、内臓された攪拌
装置が約７５回転／分で回転している間、重合反応装置内で還元が継続した。
【０１４０】 水酸化ホウ素ナトリウムの添加の約１時間後、安定ポリ（Ｈｂ）溶液濃度が１
１０ｇ／ｌとなるまで重合反応装置から３０，０００ダルトン限外濾過装置内を
通して安定ポリ（Ｈｂ）溶液を再循環させた。濃縮後、安定重合Ｈｂ代用血液を
生成するために、ＷＦＩ（ｐＨ５．０）中に２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ
ＮＡＣ、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、および１．３６ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 を含有する濾過かつ脱酸素化した低ｐＨ緩衝液（ｐＨ５．０）と一緒に３
０，０００ダルトン限外濾過装置を通して安定ポリ（Ｈｂ）溶液をダイアフィル
トレーションすることによって安定ポリ（Ｈｂ）溶液のｐＨおよび電解質を生理
的濃度へ復元させた。ダイアフィルトレーションは、限外濾過装置を越えてのダ
イアフィルトレーションを通しての液体損失量が濃縮Ｈｂ生成物のダイアフィル
トレーション前の量の約６倍になるまで継続した。
【０１４１】 ｐＨおよび電解質を生理的レベルへ復元させた後、重合反応装置へ濾過かつ脱
酸素化した低ｐＨ緩衝液を添加することによって、安定重合Ｈｂ代用血液をその
後５．０ｇ／ｄｌの濃度へ希釈した。希釈した代用血液は、その後ＷＦＩ（ｐＨ
７．８）中に２７ｍＭ乳酸ナトリウム、１２ｍＭ ＮＡＣ、１１５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、および１．３６ｍＭ ＣａＣｌ2 を含有する濾過かつ脱酸
素化された緩衝液に対してスタティックミキサーおよび１００，０００ダルトン
精製フィルターを通して重合反応装置から再循環させることによってダイアフィ
ルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、解離条件下で行ったときに
代用血液がＧＰＣによって約１０％以下の修飾四量体種および未修飾四量体種を
含有するまで継続した。
【０１４２】 精製フィルターは限定透過ラインを備えた低い膜透過圧の条件下で操作した。
実質的な量の修飾四量体Ｈｂおよび未修飾四量体Ｈｂが除去された後、３０，０
００ダルトン限外濾過装置を通しての代用血液の再循環は代用血液の濃度が約１
３０ｇ／ｌになるまで継続した。
【０１４３】 その後低酸素環境および低酸素漏出を有する適切な容器に安定代用血液を保管
した。
【０１４４】 実施例２ ヘモグロビン代用血液の保管：ホイルオーバーラップ ６００ｍＬ入りＳｔｅｒｉｃｏｎ包装に包装した実施例１で調製したヘモグロ
ビン代用血液を、ラミネートホイル包装（ＫＡＰＡＫ５０３０３、以後“ホイル
”と呼ぶ）であるＣｒｙｏｖａｃ ＢＹＶ２００またはＣｒｙｏｖａｃ Ｐ６４
０Ｂ包装内にオーバーラップした。ＫＡＰＡＫ５０３０３は、ホイル層がアルミ
ホイルであるラミネートホイル容器である。Ｃｒｙｏｖａｃ ＢＹＶ２００は両
側がサラン（Ｓａｒａｎ）コーティングされている厚さ０．０００６インチ（も
しくは０．０１５ｍｍ）のポリビニルアルコール層を含有するラミネートである
。これら２種のラミネートの酸素透過性は７２°Ｆ（もしくは２２℃）および湿
度０％で１ａｔｍ当たり２４時間当たり１００平方インチ当たり０．２２ｃｃ（
もしくは６４５平方ｃｍ当たり０．０２ｃｃ）未満である。Ｃｒｙｏｖａｃ Ｐ
６４０Ｂは、０．０００６インチ（もしくは０．０１５ｍｍ）のサランコーティ
ングされた２軸配向ナイロン層、接着剤および線状低密度ポリエチレンシーラン
ト層を備えるラミネート材料である。この材料の酸素透過性は、７２°Ｆ（もし
くは２２℃）および湿度０％で１ａｔｍ当たり２４時間当たり１００平方インチ
当たり約８〜１５ｃｃ（もしくは６４５平方ｃｍ当たり約８〜１５ｃｃ）である
。包装された代用血液を、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、ビス−Ｎ
−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ2 ）、総Ｈｂ（ＴＨｂ）、酸化ヘモグロビ
ン（ＨｂＯ2 ）およびメトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）の濃度および／またはレ
ベルを定期的にサンプリングしながら約４１８日間室温で保持した。結果は表Ｉ
Ｉに記載されている。
【０１４５】
【０１４６】 ヘモグロビン代用血液をラミネートホイル包装（ＫＡＰＡＫ５０３０３）内に
オーバーラップして、上記の実験を実質的に繰り返した。包装した代用血液は、
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、ビス−Ｎ−アセチル−Ｌ−システイ
ン（ＮＡＣ2 ）、総Ｈｂ（ＴＨｂ）、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ2 ）およびメト
ヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）の濃度および／またはレベルを定期的にサンプリン
グしながら約２４ヵ月間室温で保持した。結果は表ＩＩＩに記載されている。
【０１４７】
【０１４８】 実施例３ ヘモグロビン代用血液の保管：プライマリーパッケージ 実施例１で調製されたヘモグロビン代用血液を酸素バリアプライマリーパッケ
ージ（Ｅ−１３１３５およびＥ１３２４２、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃａｎ製）内に包装した。プライマリーパッケージの構造については上記で
詳細に考察されている。プライマリーパッケージは、中密度ポリエチレン層、エ
チレンビニルアルコール／ナイロン層、および線状低密度ポリエチレンシーラン
ト層を備えるラミネート材料である。
【０１４９】 実施例４ ヘモグロビン代用血液の保管：透明オーバーラップ 適切なプライマリーパッケージ内に包装した実施例１で調製したヘモグロビン
代用血液を、ポリプロピレン層，エチレンビニルアルコール層およびポリプロピ
レン層から構成された透明なラミネート包装内にオーバーラップした。自動包装
機（ティロマット（Ｔｉｒｏｍａｔ））を使用してオーバーラップを作製した。
この材料の酸素透過性は、１日（２５℃および１００％／５０％ＲＨ）当たり１
ａｔｍ当たり１００平方インチ当たり約０．００１５３ｃｃ（もしくは６４５平
方ｃｍ当たり０．００１５３ｃｃ）である。包装した代用血液は４０℃および１
００％／６０％ＲＨで約１２ヵ月間維持し、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ
ＡＣ）、ビス−Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ2 ）、総Ｈｂ（ＴＨｂ）
、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ2 ）およびメトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）の濃度
および／またはレベルを測定した。結果は表ＩＶに記載されている。１２ヵ月間
に渡る４０℃の高温でのサンプルの維持は２３℃での２４ヵ月間に渡る保管の効
果を有する。
【０１５０】
【０１５１】 実施例５ 重合ヘモグロビン分析 ヘモグロビン製剤中の内毒素濃度は、アソシエイツ・オブ・ケープコッド（Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ）（ウッズホール、マサチューセ
ッツ州）、Ｊ． Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ．
Ｍｅｄ．， ７５：９０３−９１１（１９７０）によって開発された方法“Ｋｉ
ｎｅｔｉｃ／Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ＬＡＬ５０００ Ｍｅｔｈｏｄｏｌ
ｏｇｙ（運動／濁度ＬＡＬ５０００法）”によって測定する。微量の間質を試験
するためには、当業者にはよく知られている特異的細胞膜タンパク質または糖脂
質に対する例えば沈降検定法、免疫ブロット法、および酵素結合免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）のような様々な方法を使用した。
【０１５２】 粒子数は、“注射用液中の微粒子物質：単回注射のための大用量注射”、Ｕ．
Ｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（米国薬局方） ２２：１５９６，１９９０の方
法によって測定した。
【０１５３】 グルタルアルデヒド濃度を測定するために、ジニトロフェニルヒドラジンを用
いてヘモグロビン製剤の代表的サンプル４００μｌを誘導化し、その後誘導溶液
のアリコート１００μｌを１つの勾配に加えて１ｍｌ／ｍｉｎの速度で２７℃の
ＹＭＣ ＡＱ−３０３ ＯＤＳカラム上に注入した。勾配は０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液および０．０８％ＴＦＡアセトニトリル溶液の２種の移
動相から構成された。勾配流は、６．０分間は一定の６０％の０．０８％ＴＦＡ
アセトニトリル溶液、１２分間に渡る８５％の０．０８％ＴＦＡアセトニトリル
溶液への線形勾配、４分間に渡る１００％の０．０８％ＴＦＡアセトニトリル溶
液への線形勾配から構成され、２分間は１００％の０．０８％ＴＦＡアセトニト
リル溶液で保持され、さらに４５％の０．１％ＴＦＡ水溶液で再平衡化させられ
た。紫外線検出は３６０ｎｍで測定された。
【０１５４】 ＮＡＣ濃度を測定するために、ヘモグロビン製剤のアリコートを脱ガスリン酸
ナトリウム水溶液を用いて１：１００に希釈し、５０μｌを１つの勾配を備えた
ＹＭＣ ＡＱ−３０３ ＯＤＳカラムに注入した。勾配緩衝液は、リン酸ナトリ
ウム水溶液と８０％アセトニトリル水溶液および０．０５％ＴＦＡの混合液とか
ら構成された。勾配流は、１５分間は１００％リン酸ナトリウム水溶液、その後
は５分間に渡る８０％アセトニトリルと０．０５％ＴＦＡとの１００％混合液へ
の線形勾配、および５分間の保持から構成された。この系をその後２０分間に渡
り１００％リン酸ナトリウムで再平衡化させた。
【０１５５】 リン脂質解析は下記の２つの論文に含まれている手順に基づく方法によって実
施した：Ｋｏｌａｒｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， “Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ
ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｓｏｕｒｃｅｓ（生物学的起源からのリン脂質を分離するための抽出方法の比
較）”，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １５６：２４４−２５０， １９８
６およびＤｕｃｋ−Ｃｈｏｎｇ， Ｃ． Ｇ．，“Ａ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｎｓｉ
ｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｐｈｏｓｐｈｏｌ
ｉｐｉｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｗｉｔｈ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｎｉｔｒａｔｅ（硝酸マグネシウムを用いた消
化を含むリン脂質のリンを測定するための迅速な高感受性方法）”， Ｌｉｐｉ
ｄｓ，１４：４９２〜４９７，１９７９．
【０１５６】 浸透圧はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｒｙｏｍａｔｉｃ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（浸透
圧計）（型番号３Ｃ２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．
、 ニーダム、マサチューセッツ州）上での分析により測定した。
【０１５７】 総ヘモグロビン、メトヘモグロビンおよびオキシヘモグロビン濃度はインスツ
ルメンテーション・ラボラトリー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）（レキシントン、マサチューセッツ州）からのＣｏ−Ｏｘｉｍｅ
ｔｅｒ（＃４８２）上で測定した。
【０１５８】 Ｎａ+ 、Ｋ+ 、Ｃｌ- 、Ｃａ++、ｐＯ2 濃度は、Ｎｏｖａｓｔａｔ Ｐｒｏｆ
ｉｌｅ ４（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、ウ
ォルサム、マサチューセッツ州）によって測定した。
【０１５９】 酸素結合定数であるＰ50は、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ製、サウスハンプトン、ペンシルバニア州）によって測定した
。
【０１６０】 温度およびｐＨは当業者によく知られている標準方法で測定した。
【０１６１】 分子量（Ｍ．Ｗ．）は解離条件下でヘモグロビン製剤についてゲル透過クロマ
トグラフィー（ＧＰＣ）を実施することによって測定した。ヘモグロビン製剤の
代表的サンプルを分子量分布について解析した。ヘモグロビン製剤は５０ｍＭ
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、および０．１ｍＭ
ＥＤＴＡの移動相内で４ｍｇ／ｍｌへ希釈した。この緩衝液は、Ｈｂ四量体を
ポリ（Ｈｂ）から分子内または分子間架橋を通して他のＨｂ二量体へ架橋されて
いない二量体へ解離させるために役立つ。希釈サンプルをＴｏｓｏＨａａｓ Ｇ
３０００ＳＷカラム上に注入した。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎ．で、紫外線検出
は２８０ｎｍで記録した。
【０１６２】 本発明の方法に従って生成された獣医学（ＯＸＹＧＬＯＢＩＮ（登録商標））
およびヒトＨｂ代用血液に対する上記の試験の結果は各々表ＶおよびＶＩに要約
されている。
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】 当業者であれば、本明細書に記載した本発明の特定の実施態様に対する多数の
均等物を認識し、または単なる日常的な実験を使用して確認することができるで
あろう。これらおよびその他すべてのそのような均等物は下記の請求の範囲によ
って包含されることが意図されている。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月２６日（２００１．７．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/18 Ａ６１Ｐ 7/06 Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/14 7/06 Ａ６１Ｊ 1/00 ３３１Ａ ３３１Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ライト，ウィリアム，アール． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01760 ナティック，モヒーガン トレイ ル ３ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA44 CA26 MA01 NA03 NA06 ZA522 4C087 AA03 BB36 DA10 MA01 NA03 NA06 NA07 ZA52 ZA55 4H011 CA01 CB07 CC01 CC02 CD13

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 パッケージされた脱酸素化ヘモグロビン代用血液を酸素バリ
    アフィルムオーバーラップパッケージ中に維持する工程を含む、パッケージされ
    た脱酸素化ヘモグロビン代用血液の保存方法であって、該パッケージが酸素バリ
    ア層およびポリオレフィン層を含有する透明なラミネート材を含み、該ラミネー
    トが約０．０２５４〜０．２５４ミリメートルの厚さ、および２４時間にわたり
    １気圧、約２３℃で６４５平方センチメートル当たり約０．０１立方センチメー
    トル未満の酸素透過性を有し、酸素バリア層がエチレンビニルアルコールを含む
    、パッケージされた脱酸素化ヘモグロビン代用血液の保存方法。
  2. 【請求項２】 ポリオレフィン層および酸素バリア層が共押し出しされてい
    る、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 酸素バリアフィルムオーバーラップパッケージが、少なくと
    も２つのラミネート材のシートを含み、オーバーラップパッケージの少なくとも
    １つのシートが透明なラミネート材を含み、オーバーラップパッケージの少なく
    とも１つの他のシートがホイルラミネート材を含む、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 オーバーラップパッケージが、 ａ）少なくとも１つのチャンバーを規定するホイルラミネートを形成する工程、 ｂ）脱酸素化ヘモグロビン代用血液を該チャンバーに配置する工程；および ｃ）透明なラミネートをホイルラミネートに熱シーリングする工程、それにより
    該酸素バリアフィルムオーバーラップが形成され、それによりヘモグロビン代用
    血液をオーバーラップ内に含ませる、 により製造される、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 ヘモグロビン代用血液を、窒素、アルゴンまたはヘリウム雰
    囲気下で維持する、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 ａ）パッケージされた脱酸素化ヘモグロビン代用血液；およ
    び ｂ）酸素バリア層およびポリオレフィン層を含有してなる透明なラミネート材を
    含有してなる酸素バリアフィルムオーバーラップパッケージを含有してなる保存
    用脱酸素化ヘモグロビン代用血液であって、ラミネートが２４時間にわたり１気
    圧、約２３℃で６４５平方センチメートル当たり約０．０１立方センチメートル
    未満の酸素透過性を有し、パッケージされた脱酸素化ヘモグロビン代用血液がオ
    ーバーラップパッケージ内にシールされてなり、酸素バリア層がエチレンビニル
    アルコールを含んでなる、保存用脱酸素化ヘモグロビン代用血液。
  7. 【請求項７】 第１のポリオレフィン層および酸素バリア層が共押し出しさ
    れている、請求項６記載の保存用脱酸素化代用血液。
  8. 【請求項８】 酸素バリアフィルムオーバーラップパッケージが、少なくと
    も２つのラミネート材のシートを含んでなり、オーバーラップパッケージの少な
    くとも１つのシートが透明なラミネート材を含んでなり、該オーバーラップの少
    なくとも１つの他のシートがホイルラミネート材を含んでなる、請求項６記載の
    保存用脱酸素化代用血液。
  9. 【請求項９】 オーバーラップパッケージが、 ａ）少なくとも１つのチャンバーを規定するホイルラミネートを形成する工程； ｂ）パッケージされた脱酸素化ヘモグロビン代用血液を該チャンバーに配置する
    工程；および ｃ）透明なラミネートをホイルラミネートに熱シーリングする工程、それにより
    該酸素バリアフィルムオーバーラップが形成され、それによりパッケージされた
    ヘモグロビン代用血液を該オーバーラップ内に含ませる、 により製造されてなる、請求項８記載の保存用脱酸素化代用血液。
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