JP2008142038A - Sdr4 GENE CONTROLLING SEED DORMANCY OF PLANT AND UTILIZATION THEREOF - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物の種子休眠を制御するSdr4遺伝子およびその利用に関する。 The present invention relates to an Sdr4 gene that controls plant seed dormancy and use thereof.
植物の種子は、成熟にともないその発芽能力を獲得すると、適当な栽培環境(温度や光)が提供されるまで、みずから発芽を抑制する機能をもつ。一般に、この現象を種子休眠という。種子休眠は、作物が栽培化されるにしたがって、その程度が小さくなり、最近の品種・系統では、種子休眠性が弱くなったものが多い。種子休眠性が弱くなると、収穫前の種子でも、発芽に好ましい温度や水分が与えられることで、発芽がおこる(穂発芽性)。イネでは、穂発芽が生じることにより玄米品質の低下が生じることが問題となっている。また、乾燥した気候を好むムギ類の場合、降雨量の多い日本における栽培は穂発芽による品質の劣化が特に重要な問題となっている。このように穂発芽した種子は品質が大きく低下することから、農業上大きな問題となっており、穂発芽耐性の付与は穀類の育種上重要な目標となっている。 When the seeds of plants acquire their germination ability with maturity, they have a function of suppressing germination on their own until an appropriate cultivation environment (temperature and light) is provided. In general, this phenomenon is called seed dormancy. Seed dormancy has become smaller as crops are cultivated, and many recent varieties and lines have weakened seed dormancy. When seed dormancy is weakened, germination occurs even when the seeds are harvested by giving a temperature and moisture suitable for germination (ear germination). In rice, the problem is that brown rice quality deteriorates due to the occurrence of ear germination. In addition, in the case of wheat that prefers a dry climate, quality deterioration due to ear germination is a particularly important issue in Japan, where rainfall is high. The seeds that have been sprouted in this manner have a large problem in agriculture because the quality of the seeds is greatly reduced, and imparting resistance to sprout germination is an important target for breeding cereals.
種子休眠性(穂発芽性)の遺伝研究は、トウモロコシの易穂発芽変異体の解析により進展し、Vp1などの穂発芽変異体遺伝子が単離されてきた(非特許文献1)。植物ではアブシジン酸(ABA)により種子の発芽が抑制されることが知られており、これまでにシロイヌナズナのABA非感受性変異(abi)、発芽時にABA感受性が高まった変異(ahg)、ABA応答性の高まった変異(era)やABA合成異常(aba)の原因遺伝子が単離されてきた(非特許文献2)。またシロイヌナズナではジベレリン(GA)が発芽を促進することから、GAに対する感受性や生合成に関しても解析が進められ、関連する遺伝子が単離されてきた(非特許文献3)。これら変異体は種子休眠性以外にも変化が見られるが、より休眠性に特異的な変異体としてrdo1-4なども報告されている(非特許文献4)。近年は、休眠性の強いシロイヌナズナエコタイプであるCviからの休眠性関連遺伝子の同定が進み、休眠性に関わる14のQTL(DOG: Delay of Germination)の存在が報告されているが(非特許文献5)、さらに最近になりDOG1の遺伝子単離が報告された(非特許文献6)。DOG1は休眠性に関わる遺伝子であるが、Sdr4とは全く類似性を示さない遺伝子であった。 Genetic research on seed dormancy (ear germination) has progressed through the analysis of easy germination mutants of maize, and ear germination mutant genes such as Vp1 have been isolated (Non-patent Document 1). In plants, abscisic acid (ABA) is known to inhibit seed germination. So far, Arabidopsis ABA insensitive mutation (abi), ABA-sensitive mutation at germination (ahg), ABA responsiveness Genes causing increased mutation (era) and abnormal ABA synthesis (aba) have been isolated (Non-patent Document 2). Moreover, since gibberellin (GA) promotes germination in Arabidopsis thaliana, analysis on susceptibility to GA and biosynthesis have been advanced, and related genes have been isolated (Non-patent Document 3). Although these mutants show changes other than seed dormancy, rdo1-4 and the like have been reported as mutants more specific to dormancy (Non-patent Document 4). In recent years, the identification of dormancy-related genes from Cvi, an Arabidopsis thaliana ecotype with strong dormancy, has progressed, and the existence of 14 QTLs (DOG: Delay of Germination) related to dormancy has been reported (non-patent literature) 5) More recently, the isolation of DOG1 gene was reported (Non-patent Document 6). DOG1 is a gene related to dormancy but is not similar to Sdr4.
イネにおいても穂発芽耐性あるいは種子休眠性に関わる遺伝子同定の取り組みがなされ、易穂発芽突然変異を用いて関与遺伝子が単離されている。すなわちイネミュータントパネルから単離されたシロイヌナズナaba1変異体に相当するゼオキサンチンエポキシダーゼ(ZEP)の変異体である(非特許文献7)。また、自然変異を用いた穂発芽性の遺伝解析により、5つのQTL(量的形質遺伝子座)が報告されている(非特許文献8)。その他、ジャポニカに近縁の雑草イネとインディカの組み合わせ、あるいは近縁野生種を利用した遺伝解析により、複数のQTLが見いだされている(非特許文献9−11)。これらの背景のもと、イネの種子休眠性(穂発芽性)の理解を深め、さらには穂発芽耐性改良にむけた品種育成を効率化するためには、自然変異を用いた遺伝子単離とそれによる種子休眠性の分子レベルでの理解が不可欠となっている。 In rice, efforts have been made to identify genes involved in panicle germination tolerance or seed dormancy, and the genes involved have been isolated using easy germination mutations. That is, it is a mutant of zeoxanthin epoxidase (ZEP) corresponding to Arabidopsis aba1 mutant isolated from a rice mutant panel (Non-patent Document 7). In addition, five QTLs (quantitative trait loci) have been reported by genetic analysis of ear germination using natural mutation (Non-patent Document 8). In addition, a plurality of QTLs have been found by genetic analysis using a combination of weed rice and indica, which are closely related to japonica, or wild relatives (Non-patent Documents 9-11). Based on these backgrounds, in order to deepen the understanding of rice seed dormancy (ear germination) and to improve the efficiency of breeding for the improvement of ear germination tolerance, gene isolation using natural mutation and It is essential to understand the seed dormancy at the molecular level.
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の種子休眠を制御する新規な遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該遺伝子を利用して植物の種子休眠を制御する方法を提供することを目的とする。さらに、被検植物の穂発芽耐性を検出する方法を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of such a condition, The objective is to provide the novel gene which controls the seed dormancy of a plant. Another object of the present invention is to provide a method for controlling seed dormancy of a plant using the gene. Furthermore, it aims at providing the method of detecting the ear germination tolerance of a test plant.
Sdr4遺伝子座は日本晴を反復親としたインディカであるKasalathの戻し交雑後代系統を用いたQTL解析により、イネ第7染色体長腕に見いだされたQTLである(非特許文献12)。本発明者らは、穂発芽耐性遺伝子であるSdr4を広大な染色体の領域から単離するために、マップベースクローニング法を利用して鋭意研究を行い、その塩基配列を単離・同定することに成功した。 The Sdr4 locus is a QTL found in the long arm of rice chromosome 7 by QTL analysis using a backcross progeny of Kasalath, an indica with Nipponbare as the recurrent parent (Non-patent Document 12). In order to isolate Sdr4, a germination resistance gene, from a vast chromosomal region, the present inventors conducted extensive research using a map-based cloning method, and isolated and identified its base sequence. Successful.
具体的には、まず、日本晴とKasalathの戻し交雑後代からSdr4領域がヘテロ型となり、他のゲノム領域の大部分が日本晴に置換された個体を選抜した。選抜個体の自殖後代100個体(F2集団相当)とその後代検定による連鎖解析、次いでマップベースクローニングに不可欠な大規模分離集団2,515個体(F2集団相当)によるSdr4領域の連鎖解析を行なった。得られた28個体の後代系統(F3系統相当)の出穂後6週間での穂発芽性程度を調べた結果、Sdr4遺伝子は、マーカーSdr4-SNP24およびSdr4-SNP28で挟まれた8.7kbpの領域に絞り込まれた。さらにこの候補遺伝子領域の解析を行なった結果、穂での発現が見られる2つの候補遺伝子が得られ、相補試験、ノックダウン系統による機能解析、ミュータントの単離によりSdr4の本体が候補遺伝子2であること、日本晴のSdr4にも発芽抑制能があることが示された。 Specifically, individuals were selected from the backcross progenies of Nipponbare and Kasalath whose Sdr4 region was heterozygous and most of the other genomic regions were replaced with Nipponbare. Linkage analysis was performed by 100 self-propagating progenies (corresponding to F2 population) and progeny tests of selected individuals, followed by linkage analysis of the Sdr4 region by 2,515 large segregation populations (corresponding to F2 population) essential for map-based cloning. As a result of examining the germination level of the 28 progeny lines obtained (corresponding to the F3 line) at 6 weeks after heading, the Sdr4 gene was found in the 8.7 kbp region flanked by the markers Sdr4-SNP24 and Sdr4-SNP28. It was narrowed down. Furthermore, as a result of analysis of this candidate gene region, two candidate genes that are expressed in the ear were obtained. The complementation test, functional analysis using a knockdown line, and isolation of the mutant resulted in the Sdr4 body being candidate gene 2. In fact, Nipponbare's Sdr4 was also shown to have the ability to suppress germination.
また、イネSdr4遺伝子と相同性の高いシロイヌナズナの遺伝子を検索した結果、最も相同性の高いAtSdr4L1は、発芽を制御する機能を有することを見出した。
さらに、Kasalath由来のSdr4をもつNIL(Sdr4)はその反復親である日本晴よりも高い穂発芽耐性を示したことから、Kasalath由来のSdr4の方が発芽抑制能が高いことが判明した。栽培イネ60種には、Sdr4遺伝子のハプロタイプは日本晴型とKasalath型の2つと、ごく一部でキメラ型が見られるだけであることから、日本晴型とKasalath型のSdr4遺伝子を判別することで穂発芽性難の遺伝子を選べるDNAマーカーとして使用できることを見出した。
Moreover, as a result of searching for Arabidopsis genes having high homology with the rice Sdr4 gene, it was found that AtSdr4L1 having the highest homology has a function of controlling germination.
Furthermore, Kasalath-derived NIL with Sdr4 (Sdr4) showed higher ear germination resistance than its recurrent parent, Nihonbare, indicating that Kasalath-derived Sdr4 has a higher ability to suppress germination. There are only two haplotypes of Sdr4 gene, Nipponbare type and Kasalath type, and chimera type in 60 cultivated rice. The present inventors have found that it can be used as a DNA marker for selecting a germinating difficulty gene.
即ち、本発明者らは、穂発芽耐性遺伝子であるSdr4をマップベースクローニング法によりその塩基配列を単離・同定することに成功した。さらにイネの休眠性を容易に改変する手法を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。 That is, the present inventors succeeded in isolating and identifying the base sequence of Sdr4, which is a panicle germination resistance gene, by a map-based cloning method. Furthermore, the present inventors have succeeded in developing a method for easily modifying the dormancy of rice, thereby completing the present invention.
本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔27〕を提供するものである。
〔1〕 植物の種子休眠を制御する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)から(h)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(e)配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(f)配列番号:8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(g)配列番号:9に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(h)配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
〔2〕 植物が単子葉植物または双子葉植物である、〔1〕に記載のDNA。
〔3〕 下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNA。
(a)〔1〕または〔2〕に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA
(b)〔1〕または〔2〕に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
(c)植物細胞における発現時に、RNAi効果により、〔1〕または〔2〕に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
(d)植物細胞における発現時に、共抑制効果により、〔1〕または〔2〕に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
〔4〕 植物の種子休眠を制御するために用いる、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載のDNA。
〔5〕 〔1〕に記載のタンパク質の変異体であって、植物の種子休眠を制御する機能が欠損した植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)または(b)に記載のDNA。
(a)配列番号:7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:7に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
〔6〕 〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
〔7〕 〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAまたは〔6〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
〔8〕 〔7〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔9〕 〔8〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔10〕 〔8〕または〔9〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔11〕 〔8〕または〔9〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAまたは〔6〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔12〕 〔1〕(a)から(d)のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の発芽を抑制する方法。
〔13〕 植物の細胞内における、内因性の〔1〕(a)から(d)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の発芽を促進する方法。
〔14〕 〔3〕に記載のDNAを植物に導入することを特徴とする、〔13〕に記載の方法。
〔15〕 〔1〕(e)から(h)のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の発芽を促進する方法。
〔16〕 植物の細胞内における、内因性の〔1〕(e)から(h)のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の発芽を抑制する方法。
〔17〕 〔3〕に記載のDNAを植物に導入することを特徴とする、〔16〕に記載の方法。
〔18〕 被検植物について、〔1〕に記載のDNAに相当する部位における変異を検出することを特徴とする、被検植物の穂発芽耐性を検出する方法。
〔19〕 変異が、一塩基多型変異である、〔18〕に記載の方法。
〔20〕 以下の工程(a)および(b)を含む、被検植物について、穂発芽耐性を検出する方法。
(a)被検植物における〔1〕に記載のDNAに相当する部位における多型部位の塩基種を決定する工程
(b)(a)で決定された多型部位の塩基種において、配列番号:4または5と同型となる変異が検出された場合に、被検植物は穂発芽耐性を有すると判定する工程
〔21〕 多型部位が、配列番号:2に記載の塩基配列における、223位、297位、531位、1145位、1156-1157位、1411位、1624位、1945位、2027位、2182-2184位、2188位、2190位、2191位、2193位、2194位、2195位、2280位、2494位、3092位から選択される少なくとも一つの多型部位に相当する部位である、〔18〕から〔20〕のいずれかに記載の方法。
〔22〕 多型部位の塩基種の変異が、配列番号:2に記載の塩基配列における、223位の塩基種がGからA、297位の塩基種がAからG、530位と531位間への1塩基(A)の挿入、1145位の塩基種がAからG、1156-1157位の2塩基の欠失、1411位における4塩基(ACCC)の挿入、1624位の塩基種がCからG、1945位の塩基種がGからT、2027位の塩基種がAからG、2182-2184位の3塩基(CGG)の欠失、2188位の塩基種がCからG、2190位の塩基種がGからC、2191位の塩基種がCからA、2193位の塩基種がGからC、2194位の塩基種がGからT、2195位の塩基種がAからC、2280位の塩基種がCからT、2494位の塩基種がGからC、3092位の塩基種がCからT、から選択される少なくとも一つの変異である場合に、被検植物の穂発芽耐性がより高いと判定する、〔21〕に記載の方法。
〔23〕 〔1〕に記載のDNAとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、穂発芽耐性を検出するためのプライマー。
〔24〕 配列番号:11または12に記載の塩基配列からなる、〔23〕に記載のプライマー。
〔25〕 〔1〕に記載のDNAとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、穂発芽耐性を検出するためのプローブ。
〔26〕 〔21〕に記載の多型部位を含む領域に特異的にハイブリダイズすることを特徴とする、〔25〕に記載のプローブ。
〔27〕 以下の(a)および(b)に記載の工程を含む、種子休眠を制御する機能を有する植物を選抜する方法;
(a)穂発芽耐性を有する植物と任意の機能を有する植物とが交配された品種を作製する工程、
(b)〔18〕に記載の方法により、工程(a)で作製された植物の穂発芽耐性を検出する工程。
More specifically, the present invention provides the following [1] to [27].
[1] The DNA according to any one of (a) to (h) below, which encodes a plant-derived protein having a function of controlling plant seed dormancy.
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6
(B) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 6
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5
(E) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9
(F) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8
(G) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9
(H) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8
[2] The DNA according to [1], wherein the plant is a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
[3] The DNA according to any one of (a) to (d) below.
(A) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of DNA according to [1] or [2]
(B) DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the DNA of [1] or [2]
(C) DNA encoding an RNA that suppresses the expression of the DNA according to [1] or [2] due to an RNAi effect during expression in a plant cell
(D) DNA encoding an RNA that suppresses the expression of the DNA according to [1] or [2] due to a co-suppression effect during expression in plant cells
[4] The DNA according to any one of [1] to [3], which is used for controlling seed dormancy of a plant.
[5] The DNA according to (a) or (b) below, which is a mutant of the protein according to [1] and encodes a plant-derived protein lacking the function of controlling seed dormancy of the plant.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7
(B) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
[6] A vector comprising the DNA according to any one of [1] to [5].
[7] A transformed plant cell carrying the DNA according to any one of [1] to [5] or the vector according to [6].
[8] A transformed plant comprising the transformed plant cell according to [7].
[9] A transformed plant that is a descendant or clone of the transformed plant according to [8].
[10] A propagation material for the transformed plant according to [8] or [9].
[11] A method for producing a transformed plant according to [8] or [9], wherein the DNA according to any one of [1] to [5] or the vector according to [6] is applied to a plant cell. A method comprising introducing and regenerating a plant from the plant cell.
[12] [1] A method for suppressing germination of a plant, characterized in that the DNA according to any one of (a) to (d) is expressed in cells of the plant body.
[13] A method for promoting germination of a plant, comprising suppressing endogenous DNA expression according to any one of (a) to (d) in a plant cell.
[14] The method according to [13], wherein the DNA according to [3] is introduced into a plant.
[15] [1] A method for promoting plant germination, which comprises expressing the DNA according to any one of (e) to (h) in a cell of a plant body.
[16] A method for suppressing germination of a plant, comprising suppressing endogenous DNA expression according to any one of (1) to (h) in a plant cell.
[17] The method according to [16], wherein the DNA according to [3] is introduced into a plant.
[18] A method for detecting ear germination resistance of a test plant, comprising detecting a mutation at a site corresponding to the DNA of [1] for the test plant.
[19] The method according to [18], wherein the mutation is a single nucleotide polymorphism mutation.
[20] A method for detecting ear germination resistance of a test plant, comprising the following steps (a) and (b).
(A) Step of determining the base type of the polymorphic site in the site corresponding to the DNA according to [1] in the test plant (b) In the base type of the polymorphic site determined in (a), SEQ ID NO: The step of determining that the test plant is resistant to sprout germination when a mutation having the same type as 4 or 5 is detected [21], the polymorphic site is position 223 in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 297, 531, 1145, 1156-1157, 1411, 1624, 1945, 2027, 2182-2184, 2188, 2190, 2191, 2193, 2194, 2195, 2280 The method according to any one of [18] to [20], wherein the site is a site corresponding to at least one polymorphic site selected from position, 2494, and 3092.
[22] In the base sequence described in SEQ ID NO: 2, the variation of the base type at the polymorphic site is from G to A for the 223rd base, from A to G for the 297th base, between 530 and 531 1 base (A) insertion, 1145 position base species from A to G, 1156-1157 position 2 base deletion, 1411 position 4 base (ACCC) insertion, 1624 position base type from C G, 1945 position base species G to T, 2027 position base species A to G, 2182-2184 position 3 bases (CGG) deletion, 2188 position base species C to G, 2190 position base Species is G to C, 2191th base type is C to A, 2193rd base type is G to C, 2194th base type is G to T, 2195th base type is A to C, 2280th base When the species is at least one mutation selected from C to T, the base species at position 2494 is G to C, and the base species at position 3092 is C to T, The method according to [21], wherein the determination is performed.
[23] A primer for detecting ear germination resistance, which comprises an oligonucleotide that specifically hybridizes with the DNA of [1] under stringent conditions and has a chain length of at least 15 nucleotides.
[24] The primer according to [23], comprising the base sequence according to SEQ ID NO: 11 or 12.
[25] A probe for detecting ear germination resistance, comprising an oligonucleotide that specifically hybridizes with the DNA of [1] under stringent conditions and has a chain length of at least 15 nucleotides.
[26] The probe according to [25], which specifically hybridizes to a region containing the polymorphic site according to [21].
[27] A method for selecting a plant having a function of controlling seed dormancy, which comprises the steps of (a) and (b) below:
(A) a step of producing a variety in which a plant having an ear germination resistance and a plant having an arbitrary function are crossed,
(B) The process of detecting the ear germination tolerance of the plant produced at the process (a) by the method as described in [18].
本遺伝子の過剰発現あるいはKasalath型または日本晴型Sdr4の導入によりイネの穂発芽耐性を強くすることが可能である。形質転換に要する期間は交配による遺伝子移入に比較してきわめて短期間であり、他の形質の変化を伴わないままに穂発芽耐性の向上に資することが可能であり、イネ品種の育成に貢献出来る。 Over-expression of this gene or introduction of Kasalath type or Nipponbare type Sdr4 can enhance rice germination tolerance. The period required for transformation is extremely short compared to gene transfer by mating, which can contribute to the improvement of resistance to ear germination without changing other traits and contribute to the breeding of rice varieties. .
また、シロイヌナズナにおけるSdr4の同祖遺伝子AtSdr4L1も発芽制御に関わることが明らかになったことから、本発明で明らかとなったSdr4遺伝子は、単子葉植物から双子葉植物に至るまで植物全般において発芽の調節を行っている因子であるといえる。したがって、本遺伝子は、イネ科作物であるオオムギやコムギの穂発芽耐性を向上するためにも有用である。 In addition, since Sdr4 homologous gene AtSdr4L1 in Arabidopsis thaliana was also found to be involved in germination control, the Sdr4 gene revealed in the present invention is germinated in all plants from monocotyledonous plants to dicotyledonous plants. It can be said that it is a factor that regulates. Therefore, this gene is also useful for improving the germination resistance of barley and wheat, which are gramineous crops.
〔発明の実施の形態〕
本発明は、植物の種子休眠を制御する新規な遺伝子Sdr4、および該遺伝子を利用して植物の種子休眠を制御する方法に関する。本発明者らにより種子休眠との関係が明らかにされた、日本晴のSdr4遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号:1に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号:2に、これら遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:3に示す。KasalathのSdr4遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号:4に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号:5に、これら遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:6に示す。また、シロイヌナズナのAtSdr4L1遺伝子のゲノムDNAの塩基配列を配列番号:8に、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:9に示す。
[Embodiment of the Invention]
The present invention relates to a novel gene Sdr4 that controls plant seed dormancy, and a method for controlling plant seed dormancy using the gene. The present inventors have clarified the relationship with seed dormancy, the nucleotide sequence of cDNA of Nipponbare Sdr4 gene is SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of genomic DNA is SEQ ID NO: 2, and the proteins encoded by these genes Is shown in SEQ ID NO: 3. The nucleotide sequence of the Kasalath Sdr4 gene cDNA is shown in SEQ ID NO: 4, the nucleotide sequence of genomic DNA is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the protein encoded by these genes is shown in SEQ ID NO: 6. In addition, the base sequence of the genomic DNA of the AtSdr4L1 gene of Arabidopsis thaliana is shown in SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 9.
イネの量的形質遺伝子座(QTL)のSdr4は、これまでイネの種子休眠に関与する遺伝子座として、イネ第7染色体長腕という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていた。本発明者らは、マップベースクローニングの手法を利用することにより、イネ第7染色体におけるSdr4遺伝子の存在領域の絞り込みを行い、遂に単一の遺伝子として同定することに成功した。さらに、Sdr4遺伝子と相同性の高いシロイヌナズナのAtSdr4L1遺伝子が種子休眠に関与することを見出した。 The rice quantitative trait locus (QTL), Sdr4, has been known as a locus involved in rice seed dormancy, located in one of the vast regions of the long arm of rice chromosome 7. It was. The present inventors narrowed down the region where the Sdr4 gene is present in rice chromosome 7 by utilizing a map-based cloning technique, and finally succeeded in identifying it as a single gene. Furthermore, we found that the Arabidopsis AtSdr4L1 gene, which is highly homologous to the Sdr4 gene, is involved in seed dormancy.
本発明において「種子休眠」とは、植物の種子が適当な栽培環境が提供されるまで、自ら発芽を抑制する機能をいう。言い換えると、種子休眠を抑制することで発芽は促進される。適当な栽培環境として好ましくは、発芽に適した温度、光、水分の供給等が挙げられるが、これに限定されるものではない。 In the present invention, “seed dormancy” refers to a function of suppressing the germination of plant seeds until a suitable cultivation environment is provided. In other words, germination is promoted by suppressing seed dormancy. A suitable cultivation environment preferably includes, but is not limited to, temperature, light, and moisture supply suitable for germination.
本発明は、植物の種子休眠を制御する機能を有する植物由来のSdr4遺伝子およびAtSdr4L1遺伝子に関する。
本発明のSdr4遺伝子としては、具体的には、植物の種子休眠を促進する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAが含まれる。
(a)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
The present invention relates to a plant-derived Sdr4 gene and AtSdr4L1 gene having a function of controlling plant seed dormancy.
Specifically, the Sdr4 gene of the present invention includes a DNA described in any of (a) to (d) below, which encodes a plant-derived protein having a function of promoting plant seed dormancy.
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 6.
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5.
また、本発明のAtSdr4L1遺伝子としては、具体的には、植物の種子休眠を抑制する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記(e)から(h)のいずれかに記載のDNAが含まれる。
(e)配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(f)配列番号:8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(g)配列番号:9に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(h)配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
In addition, the AtSdr4L1 gene of the present invention specifically includes the DNA described in any of (e) to (h) below, which encodes a plant-derived protein having a function of suppressing plant seed dormancy. It is.
(E) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.
(F) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
(G) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
(H) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
本発明のSdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子を利用することにより、例えば、組み換えタンパク質の調製や発芽能が改変された形質転換植物体を作出することなどが可能となる。
本発明において、本発明の遺伝子が由来する植物としては、特に制限はないが、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。また例えば花卉植物としては、キク、バラ、カーネーション、シクラメン等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の遺伝子が由来する植物として、好ましくは単子葉植物または双子葉植物が挙げられ、より好ましくは、イネ、コムギ、シロイヌナズナを挙げることができる。
By using the Sdr4 gene or the AtSdr4L1 gene of the present invention, for example, it becomes possible to prepare a recombinant protein or to produce a transformed plant having a modified germination ability.
In the present invention, the plant from which the gene of the present invention is derived is not particularly limited.For example, rice, corn, wheat, barley, oat, pearl barley, Italian ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet, sugar cane, Examples thereof include monocotyledonous plants such as pearl millet and dicotyledonous plants such as rapeseed, soybean, cotton, tomato and potato. Examples of flowering plants include chrysanthemum, roses, carnations, and cyclamen, but are not limited thereto. The plant from which the gene of the present invention is derived is preferably a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant, and more preferably rice, wheat, and Arabidopsis thaliana.
本発明の「Sdr4遺伝子」、「AtSdr4L1遺伝子」はそれぞれ、「Sdr4タンパク質」、「AtSdr4L1タンパク質」をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、「Sdr4遺伝子」、「AtSdr4L1遺伝子」にはそれぞれ、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNAなども含まれる。また、Sdr4遺伝子はSdr4タンパク質を、AtSdr4L1遺伝子はAtSdr4L1タンパク質をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。 The `` Sdr4 gene '' and `` AtSdr4L1 gene '' of the present invention are not particularly limited in form as long as they can encode `` Sdr4 protein '' and `` AtSdr4L1 protein '', respectively, `` Sdr4 gene '', `` AtSdr4L1 gene '' In addition to cDNA, each includes genomic DNA, chemically synthesized DNA, and the like. In addition, as long as the Sdr4 gene encodes the Sdr4 protein and the AtSdr4L1 gene encodes the AtSdr4L1 protein, DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
本発明の遺伝子のコード領域は、例えば、配列番号:1に記載の塩基配列における69〜1100位、配列番号:2に記載の塩基配列における1675〜2706位、配列番号:4に記載の塩基配列における69〜1097位、配列番号:5の塩基配列における1678〜2706位、配列番号:8に記載の塩基配列における1930〜2994位の領域を挙げることができる。 The coding region of the gene of the present invention has, for example, positions 69 to 1100 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, positions 1675 to 2706 in the base sequence described in SEQ ID NO: 2, and the base sequence described in SEQ ID NO: 4. The region of positions 69 to 1097 in SEQ ID NO: 5, positions 1678 to 2706 in the base sequence of SEQ ID NO: 5, and positions 1930 to 2994 in the base sequence of SEQ ID NO: 8 can be exemplified.
ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる)を作成し、これを展開して、Sdr4遺伝子(例えば、配列番号:1、2、4または5のいずれかに記載のDNA)またはAtSdr4L1遺伝子(例えば、配列番号:8に記載のDNA)を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、植物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。 Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by those skilled in the art using conventional means. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from a plant, a genomic library (vectors such as plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used), expanded, and Sdr4 gene (for example, Colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared on the basis of the AtSdr4L1 gene (for example, the DNA described in SEQ ID NO: 8). It is possible to prepare by performing. It is also possible to prepare a primer specific for the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene and perform PCR using this primer. In addition, for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from a plant, inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library, developed, and colony hybridization in the same manner as described above. Alternatively, it can be prepared by performing plaque hybridization or by performing PCR.
さらに、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子は広く植物界に存在すると考えられるため、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子には、種々の植物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の植物において、イネまたはシロイヌナズナにおけるSdr4遺伝子産物またはAtSdr4L1遺伝子産物と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を指す。このようなタンパク質には、例えば、Sdr4タンパク質またはAtSdr4L1タンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、Sdr4タンパク質またはAtSdr4L1タンパク質の部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。 Furthermore, since the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene is considered to exist widely in the plant kingdom, the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene includes homologous genes present in various plants. Here, the “homologous gene” refers to a gene encoding a protein functionally equivalent to the Sdr4 gene product or the AtSdr4L1 gene product in rice or Arabidopsis thaliana in various plants. Examples of such proteins include mutants, alleles, variants, homologs of Sdr4 protein or AtSdr4L1 protein, partial peptides of Sdr4 protein or AtSdr4L1 protein, or fusion proteins with other proteins. It is not limited.
本発明におけるSdr4タンパク質またはAtSdr4L1タンパク質の変異体としては、配列番号:3、6または9に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号:3、6または9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号:1、2、4、5または8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号:1、2、4、5または8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、Sdr4タンパク質またはAtSdr4L1タンパク質の変異体として挙げることができる。 The mutant of Sdr4 protein or AtSdr4L1 protein in the present invention consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 6 or 9. Mention may be made of naturally occurring proteins that are functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 6 or 9. A protein encoded by a naturally-occurring DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 or 8, comprising SEQ ID NO: 1, A protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence described in 2, 4, 5 or 8 can also be mentioned as a variant of Sdr4 protein or AtSdr4L1 protein.
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内(例えば、3アミノ酸以内)であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)を挙げることができる(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。 In the present invention, the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids). The amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved. For example, amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids having amino acids (C, M), amino acids having carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids having base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains The amino acids (H, F, Y, W) that can be used can be listed (the parentheses indicate the single letter of the amino acid). It is already known that a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence maintains its biological activity. Yes.
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、Sdr4タンパク質またはAtSdr4L1タンパク質と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、Sdr4タンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、例えば種子休眠性、AtSdr4L1タンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、例えば種子発芽性を挙げることができる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。 In the present invention, “functionally equivalent” means that the target protein has a biological function or biochemical function equivalent to that of the Sdr4 protein or AtSdr4L1 protein. In the present invention, examples of the biological function and biochemical function of the Sdr4 protein include seed dormancy, and examples of the biological function and biochemical function of the AtSdr4L1 protein include seed germination. Biological properties include the specificity of the site to be expressed and the expression level.
相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術(Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975)やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術(Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988)が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Sdr4遺伝子の塩基配列(例えば、配列番号:1、2、4または5のいずれかに記載のDNA)またはAtSdr4L1遺伝子の塩基配列(例えば、配列番号:8に記載のDNA)もしくはその一部をプローブとして、またSdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物からSdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の相同遺伝子を単離することは通常行いうることである。 Methods well known to those skilled in the art for isolating homologous genes include hybridization techniques (Southern, EM, Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki). , RK, et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, vol. 239, 487-491, 1988). That is, for those skilled in the art, the nucleotide sequence of the Sdr4 gene (for example, the DNA described in any of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, or 5) or the nucleotide sequence of the AtSdr4L1 gene (for example, the DNA of SEQ ID NO: 8). It is usually possible to isolate homologous genes of Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene from various plants using a part of them as probes and oligonucleotides that specifically hybridize to Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene as primers. It is.
このような相同遺伝子をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25%ホルムアミド、より厳しい条件では50%ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ***DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素(例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 In order to isolate DNA encoding such a homologous gene, a hybridization reaction is usually carried out under stringent conditions. Those skilled in the art can appropriately select stringent hybridization conditions. An example is 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 × SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 × Denhardt's solution, 20 μg / ml denatured in a hybridization solution containing denatured salmon sperm DNA at 42 ° C. After overnight prehybridization, a labeled probe is added and hybridization is performed by incubating overnight at 42 ° C. The cleaning solution and temperature conditions for the subsequent cleaning are about 1xSSC, 0.1% SDS, 37 ° C, more severe conditions are about 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C, and more severe conditions are about 0.2xSSC. , 0.1% SDS, about 65 ° C. ”. Thus, isolation of DNA having high homology with the probe sequence can be expected as the conditions for washing hybridization are more severe. However, combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (eg, probe concentration, probe length, hybridization reaction). It is possible to achieve the same stringency as above by appropriately combining the time and the like.
単離されたDNAの相同性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN(核酸レベル)やBLASTX(アミノ酸レベル)のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength =12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら(Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。 The homology of the isolated DNA is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) in the entire amino acid sequence. And the like). Sequence homology can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993). Yes. When analyzing a base sequence by BLASTN, parameters are set to score = 100 and wordlength = 12, for example. Further, when the amino acid sequence is analyzed by BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known.
また、本発明は植物の種子休眠を制御するために用いるDNAであって下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAを提供する。
(a)Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
(b)Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
(c)植物細胞における発現時に、RNAi効果により、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の発現を抑制するRNAをコードするDNA。
(d)植物細胞における発現時に、共抑制効果により、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子発現を抑制するRNAをコードするDNA。
The present invention also provides a DNA described in any one of (a) to (d) below for use in controlling seed dormancy of a plant.
(A) DNA encoding an antisense RNA complementary to a transcript of the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene.
(B) DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves a transcript of the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene.
(C) DNA encoding RNA that suppresses the expression of the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene due to the RNAi effect during expression in plant cells.
(D) DNA encoding RNA that suppresses Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene expression due to a co-suppression effect during expression in plant cells.
本発明において、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の発現を抑制する植物には特に制限はなく、植物の種子休眠を制御させたい所望の植物を用いることができるが、産業的な観点からは農作物が好適である。有用農作物としては、特に制限はないが、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。 In the present invention, the plant that suppresses the expression of the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene is not particularly limited, and a desired plant for controlling the seed dormancy of the plant can be used. is there. There are no particular restrictions on useful crops, but examples include monocotyledonous plants such as rice, corn, wheat, barley, oat, pearl barley, Italian ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet, sugarcane, pearl millet, and rapeseed. And dicotyledonous plants such as soybean, cotton, tomato and potato.
本明細書における「Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の発現を抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。 In the present specification, “suppression of Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene expression” includes suppression of gene transcription and suppression of protein translation. Also included is a decrease in expression as well as complete cessation of DNA expression.
「Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の発現を抑制するために用いるDNA」の一つの態様は、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNAである。植物細胞におけるアンチセンス効果は、一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することにより、初めて実証された(Ecker and Davis, Proc. Natl. Acad. USA, 83: 5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(Krol et. al., Nature 333: 866, 1988)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。 One embodiment of “DNA used to suppress expression of Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene” is DNA encoding an antisense RNA complementary to the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene. The antisense effect in plant cells was demonstrated for the first time by the antisense RNA introduced by electroporation using a transient gene expression method to exert an antisense effect in plants (Ecker and Davis, Proc. Natl Acad. USA, 83: 5372, 1986). Subsequently, tobacco and petunia have been reported to decrease the expression of target genes by expressing antisense RNA (Krol et. Al., Nature 333: 866, 1988), and currently suppress gene expression in plants. Established as a means to
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993)。 There are several factors as described below for the action of an antisense nucleic acid to suppress the expression of a target gene. That is, transcription initiation inhibition by triplex formation, transcription inhibition by hybridization with a site where an open loop structure is locally created by RNA polymerase, transcription inhibition by hybridization with RNA that is undergoing synthesis, intron and exon Of splicing by hybrid formation at the junction with the protein, suppression of splicing by hybridization with the spliceosome formation site, suppression of transition from the nucleus to the cytoplasm by hybridization with mRNA, hybridization with capping sites and poly (A) addition sites Splicing suppression by formation, translation initiation suppression by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation suppression by hybridization with the ribosome binding site near the initiation codon, peptization by hybridization with the mRNA translation region and polysome binding site For example, inhibition of gene chain elongation is prevented, and hybridization between nucleic acid and protein interaction sites is performed. They inhibit transcription, splicing, or translation processes and suppress target gene expression (Hirashima and Inoue, "Neurochemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid IV Gene Replication and Expression", edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin , pp.319-347, 1993).
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 The antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above. In one embodiment, if an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of the gene is designed, it will be effective for inhibiting translation of the gene. However, sequences complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. As described above, a DNA containing an antisense sequence of a non-translated region as well as a translated region of a gene is also included in the antisense DNA used in the present invention. The antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
アンチセンスDNAは、例えば、配列番号:1、2、4、5または8に記載のDNAの配列情報を基にホスホロチオネート法(Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988)などにより調製することが可能である。調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内因性遺伝子の転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。 Antisense DNA is, for example, a phosphorothioate method (Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988) based on the sequence information of DNA set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 or 8. Or the like. The prepared DNA can be transformed into a desired plant by a known method. The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the transcription product of the endogenous gene of the plant to be transformed, but may not be completely complementary as long as the gene expression can be effectively inhibited. . The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) to the transcript of the target gene. In order to effectively inhibit the expression of the target gene using the antisense sequence, the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. is there. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
内因性のSdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の発現の抑制は、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素, 35: 2191, 1990)。 Suppression of endogenous Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene expression can also be carried out using DNA encoding a ribozyme. A ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Although some ribozymes have various activities, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for site-specific cleavage of RNA. Some ribozymes have a group I intron type or a size of 400 nucleotides or more like M1RNA contained in RNaseP, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type ( Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191, 1990).
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi et. al., FEBS Lett. 228: 225, 1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(Koizumi et. al., FEBS Lett. 239: 285,1988、小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素,35: 2191, 1990、Koizumi et. al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989)。 For example, the self-cleaving domain of hammerhead ribozyme cleaves on the 3 ′ side of C15 of G13U14C15, but it is important for U14 to form a base pair with A at position 9, and the base at position 15 is In addition to C, it has been shown to be cleaved by A or U (Koizumi et. Al., FEBS Lett. 228: 225, 1988). If the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence near the target site, it is possible to create a restriction enzyme-like RNA-cleaving ribozyme that recognizes the UC, UU, or UA sequence in the target RNA. (Koizumi et. Al., FEBS Lett. 239: 285, 1988, Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 35: 2191, 1990, Koizumi et. Al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989).
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, Nature 323: 349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, 及び菊池洋,化学と生物 30: 112, 1992)。 Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (Buzayan, Nature 323: 349, 1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, and Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology 30: 112, 1992).
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である (Taira et. al., Protein Eng. 3: 733, 1990、Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989、Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19: 3875, 1991、Taira et. al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991)。 A ribozyme designed to cleave the target is linked to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells. However, at that time, if an extra sequence is added to the 5 ′ end or 3 ′ end of the transcribed RNA, the ribozyme activity may be lost. In such a case, in order to accurately cut out only the ribozyme part from the RNA containing the transcribed ribozyme, another trimming ribozyme that acts in cis for trimming is placed on the 5 'side or 3' side of the ribozyme part. (Taira et.al., Protein Eng. 3: 733, 1990, Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989, Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19 : 3875, 1991, Taira et. Al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991).
また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。 In addition, such structural units can be arranged in tandem so that multiple sites in the target gene can be cleaved, thereby further enhancing the effect (Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271 , 1992). Such a ribozyme can be used to specifically cleave the transcription product of the target gene in the present invention, thereby suppressing the expression of the gene.
内在性遺伝子の発現の抑制はさらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる「共抑制」によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7: R793, 1997、Curr. Biol. 6: 810, 1996)。 Suppression of endogenous gene expression can also be achieved by “co-suppression” resulting from transformation of DNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence. “Co-suppression” refers to a phenomenon in which the expression of both a foreign gene and a target endogenous gene to be introduced is suppressed when a gene having the same or similar sequence as that of the target endogenous gene is introduced into a plant by transformation. Say. Details of the mechanism of co-suppression are not clear, but are often observed in plants (Curr. Biol. 7: R793, 1997, Curr. Biol. 6: 810, 1996).
例えば、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からSdr4変異体またはAtSdr4L1変異体の形質を有する植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の配列の同一性を有する。 For example, in order to obtain a plant body in which the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene is co-suppressed, the vector DNA prepared so that the Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene or a DNA having a similar sequence can be expressed is transformed into the target plant. Then, a plant having an Sdr4 mutant or AtSdr4L1 mutant trait may be selected from the obtained plant body. The gene used for co-suppression need not be completely the same as the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% or more).
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。 Furthermore, suppression of the expression of the endogenous gene in the present invention can also be achieved by transforming a gene having a dominant negative trait of the target gene into a plant. A gene having a dominant negative trait refers to a gene having a function of eliminating or reducing the activity of an endogenous wild-type gene inherent in a plant by expressing the gene.
「Sdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の発現を抑制するために用いるDNA」の他の一つの態様は、内因性のSdr4遺伝子またはAtSdr4L1遺伝子の転写産物と相補的なdsRNAをコードするDNAである。RNAiは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA(以下dsRNA)を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3’末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA(short interference RNA)を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体(RISC:RNA-induced silencing complex)が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。 Another embodiment of “DNA used to suppress the expression of Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene” is DNA encoding a dsRNA complementary to a transcription product of endogenous Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene. RNAi is a phenomenon in which, when a double-stranded RNA (hereinafter referred to as dsRNA) having the same or similar sequence as a target gene sequence is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. When dsRNA of about 40 to several hundred base pairs is introduced into a cell, a RNaseIII-like nuclease called Dicer with a helicase domain is present in the presence of ATP, and dsRNA is about 21 to 23 base pairs from the 3 ′ end. Cut out and produce siRNA (short interference RNA). A protein specific to this siRNA binds to form a nuclease complex (RISC: RNA-induced silencing complex). This complex recognizes and binds to the same sequence as siRNA, and cleaves the mRNA of the target gene at the center of siRNA by RNaseIII-like enzyme activity. In addition to this pathway, the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA. There is also a possibility that this dsRNA becomes Dicer's substrate again to generate new siRNA and amplify the action.
本発明のRNAは、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。 The RNA of the present invention can be expressed from an antisense coding DNA that encodes an antisense RNA to any region of the target gene mRNA and a sense code DNA that encodes a sense RNA of any region of the target gene mRNA. . Moreover, dsRNA can also be produced from these antisense RNA and sense RNA.
本発明のdsRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA(siRNAコードDNA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモーターを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖(アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖)の3'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A(アデニン)塩基を4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類を異ならせることが好ましい。 When the dsRNA expression system of the present invention is retained in a vector or the like, the antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector, and the antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors, respectively. There is. For example, antisense RNA and sense RNA can be expressed from the same vector as an antisense RNA in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of the antisense code DNA and the sense code DNA. It can be constructed by constructing an expression cassette and a sense RNA expression cassette, respectively, and inserting these cassettes into the vector in the same direction or in the opposite direction. It is also possible to construct an expression system in which the antisense code DNA and the sense code DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands. In this configuration, one double-stranded DNA (siRNA-encoding DNA) in which an antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired is provided, and antisense RNA and sense RNA from each strand are provided on both sides thereof. A promoter is provided oppositely so that it can be expressed. In this case, in order to avoid adding extra sequences downstream of the sense RNA and antisense RNA, a terminator is added to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand). It is preferable to provide. As this terminator, a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used. Moreover, in this palindromic style expression system, it is preferable that the types of the two promoters are different.
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。 In addition, as a configuration for expressing antisense RNA and sense RNA from different vectors, for example, antisense coding DNA and an antisense in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of sense coding DNA. An RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette can be constructed, and these cassettes can be held in different vectors.
本発明のRNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の配列の相同性を有する。本発明のsiRNAとして、具体的には、配列番号:10に記載のsiRNAを挙げることができる。 In the RNAi of the present invention, siRNA may be used as dsRNA. “SiRNA” means a double-stranded RNA consisting of short strands that are not toxic in cells, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 Can be ~ 30 base pairs. Alternatively, the siRNA to be expressed is transcribed and the length of the final double-stranded RNA portion is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, more preferably 21 to 30 base pairs. be able to. The DNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but has at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more sequence homology. . Specific examples of the siRNA of the present invention include the siRNA described in SEQ ID NO: 10.
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ(対応する塩基が相補的でない)、バルジ(一方の鎖に対応する塩基がない)などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。 The part of the double-stranded RNA in which the RNAs in dsRNA are paired is not limited to a perfect pair, but mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (no base corresponding to one strand) ) Or the like may include an unpaired portion. In the present invention, both bulges and mismatches may be included in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair with each other.
本発明は、植物の種子休眠を制御する機能が欠損したSdr4変異体またはAtSdr4L1変異体を含む。
Sdr4変異体またはAtSdr4L1変異体は、それぞれSdr4タンパク質またはAtSdr4L1タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。具体的には、Sdr4タンパク質またはAtSdr4L1タンパク質のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56 )を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、Sdr4タンパク質またはAtSdr4L1タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるPCR法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、Sdr4変異体またはAtSdr4L1変異体をそれぞれコードする遺伝子が得られる。
The present invention includes Sdr4 mutants or AtSdr4L1 mutants that are deficient in the function of controlling plant seed dormancy.
Sdr4 mutants or AtSdr4L1 mutants are produced by introducing mutations by substituting amino acid residues in the amino acid sequence of Sdr4 protein or AtSdr4L1 protein, respectively. Specifically, the secondary structure of the amino acid sequence of the Sdr4 protein or AtSdr4L1 protein is determined using a known molecular modeling program such as WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56). And evaluating the influence on the total number of amino acid residues to be substituted. After determining the appropriate substitution amino acid residue, Sdr4 mutation is introduced by introducing a mutation using a vector containing a nucleotide sequence encoding Sdr4 protein or AtSdr4L1 protein as a template so that the amino acid is substituted by a conventional PCR method. Or genes encoding the AtSdr4L1 mutant, respectively.
本発明のSdr4変異体として、より具体的には、植物の種子休眠を制御する機能が欠損したSdr4変異体であって、植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)または(b)に記載のDNAを挙げることができる。
(a)配列番号:7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:7に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
該Sdr4変異体は、発芽率の低い品種の発芽力を向上させるために使用することができる。言い換えれば、該変異体により休眠性の強い品種の発芽力を向上させることができる。
More specifically, the Sdr4 mutant of the present invention is an Sdr4 mutant lacking a function of controlling seed dormancy of a plant, which encodes a plant-derived protein, as described in (a) or (b) below: Can be mentioned.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
(B) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
The Sdr4 mutant can be used to improve the germination ability of cultivars with low germination rates. In other words, the germinating ability of a variety having strong dormancy can be improved by the mutant.
なお、本発明者らにより、該Sdr4変異体は、配列番号:3に記載のアミノ酸配列における309〜315位、または配列番号:6に記載のアミノ酸配列における308〜314位に相当する7アミノ酸を欠失していることが判明した。従って、本発明のSdr4タンパク質は該7アミノ酸を有していることが好ましい。 According to the present inventors, the Sdr4 mutant has 7 amino acids corresponding to positions 309 to 315 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or positions 308 to 314 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. It was found to be deleted. Therefore, the Sdr4 protein of the present invention preferably has the 7 amino acids.
また本発明は、Sdr4遺伝子、AtSdr4L1遺伝子、またはSdr4遺伝子もしくはAtSdr4L1遺伝子の発現を抑制するDNAを含むベクターならびに形質転換植物細胞を提供する。 The present invention also provides a vector comprising Sdr4 gene, AtSdr4L1 gene, or DNA that suppresses expression of Sdr4 gene or AtSdr4L1 gene, and transformed plant cells.
本発明のベクターには、上述のRNAiを誘導するために構築されたベクターが含まれる。本発明のベクターは、本発明のDNAが含まれるため、細胞に導入された場合には該細胞において転写によって形成される一本鎖RNAが分子内で対合してdsRNAを形成する。このようなRNAiを誘導するために構築されたベクターは、結果として内在性遺伝子の転写活性化を誘導することができる。 The vector of the present invention includes a vector constructed for inducing the above-mentioned RNAi. Since the vector of the present invention contains the DNA of the present invention, when introduced into a cell, single-stranded RNA formed by transcription in the cell paired within the molecule to form dsRNA. A vector constructed for inducing such RNAi can consequently induce transcriptional activation of the endogenous gene.
本発明のベクターとしては、内在性遺伝子の転写活性化に用いられる上記ベクターの他、形質転換体作製のために細胞内で本発明のDNAを発現させるベクター、例えば形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明のDNAを発現させるためのベクターも含まれる。植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えばプラスミド、ファージ、またはコスミドなどを例示することができる。
また上記「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。
As the vector of the present invention, in addition to the above-mentioned vector used for the transcriptional activation of the endogenous gene, a vector for expressing the DNA of the present invention in a cell for preparing a transformant, for example, for preparing a transformed plant body Also included are vectors for expressing the DNA of the present invention in plant cells. The vector used for the transformation of plant cells is not particularly limited as long as the inserted gene can be expressed in the cells. For example, a plasmid, a phage, or a cosmid can be exemplified.
The “plant cell” includes various forms of plant cells such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus and the like.
本発明のベクターは、本発明のDNAを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有してもよい。
当業者においては、所望のDNAを有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々のベクターを利用することができる。
本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持したり、発現させるためにも有用である。
The vector of the present invention may contain a promoter for constitutively or inducibly expressing the DNA of the present invention.
Those skilled in the art can appropriately prepare a vector having a desired DNA by a general genetic engineering technique. Usually, various commercially available vectors can be used.
The vector of the present invention is also useful for retaining or expressing the DNA of the present invention in a host cell.
本発明におけるDNAは、通常、適当なベクターへ担持(挿入)され、宿主細胞へ導入される。即ち本発明は、本発明のDNAまたはベクターを保持する宿主細胞を提供する。該ベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のDNAを内在性遺伝子を有する細胞内に導入および発現させる目的としてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でDNAを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター(プロメガ社製)、大腸菌であればpETベクター(Invitrogen社製)、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター(GenBank Accession No. AB009864)、生物個体であればpME18Sベクター(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))、植物個体であればpBINPLUSベクター(van Engelen, F.A. et al., (1995). pBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290.)などを例示することができる。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法(Molecular Cloning, 5.61-5.63)により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。 The DNA in the present invention is usually carried (inserted) into an appropriate vector and introduced into a host cell. That is, the present invention provides a host cell carrying the DNA or vector of the present invention. The vector is not particularly limited as long as it can stably hold the inserted DNA. For example, if Escherichia coli is used as a host, a pBluescript vector (Stratagene) is preferred as a cloning vector, but commercially available. Various vectors can be used. An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of introducing and expressing the DNA of the present invention into a cell having an endogenous gene. The expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses DNA in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism. For example, pBEST vector (manufactured by Promega) or E. coli is used in in vitro expression. PET vector (manufactured by Invitrogen) if present, pME18S-FL3 vector (GenBank Accession No. AB009864) for cultured cells, pME18S vector (Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)) for individual organisms, plants If it is an individual, a pBINPLUS vector (van Engelen, FA et al., (1995). PBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290.) May be exemplified. The DNA of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63), for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site.
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。本発明のDNAを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞(例:ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌)、昆虫細胞(例:ドロソフィラS2、スポドプテラSF9)、動物細胞(例:CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞)および植物細胞を例示することができる。 There is no restriction | limiting in particular as said host cell, According to the objective, various host cells are used. Examples of the cells for expressing the DNA of the present invention include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), insect cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells ( Examples: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
また、生体内で本発明のDNAを発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法(エレクトロポーレーション)(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9)、リポフェクション法(GIBCO-BRL社製)、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの当業者に公知の方法により生体内に導入する方法などが挙げられる。
植物体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
In addition, as a method for expressing the DNA of the present invention in vivo, the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, polyethylene glycol method, electroporation method, Agrobacterium method, liposome method, cationic liposome method. , Calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (electroporation) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipofection method (GIBCO-BRL) ), A method of introducing into a living body by a method known to those skilled in the art such as a microinjection method and a particle gun method.
Administration into a plant may be an ex vivo method or an in vivo method.
また、植物体内へ本発明のDNAを導入する場合、DNAは、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法等を用いて、植物細胞に直接導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能のあるウイルスあるいは細菌を介して、間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウイルスとしては、例えば代表的なウイルスとして、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルス等が挙げられ、細菌としては、アグロバクテリウム等が挙げられる。アグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合には、市販のプラスミドを用いることができる。このようなベクターを用いて、植物体内へ本発明のDNAを導入する場合の方法としては、好ましくは、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入するリーフディスク法(Jorgensen, R.A. et al., (1996). Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol. Biol. 31, 957-973.)が挙げられる。
なおこれら上述の形質転換方法は、宿主となる植物などの種類(例えば単子葉植物、双子葉植物)に応じて適宜選択することが好ましい。
In addition, when the DNA of the present invention is introduced into a plant body, the DNA can be directly introduced into a plant cell using a microinjection method, an electroporation method, a polyethylene glycol method, etc. It can also be introduced into a plant cell indirectly via a virus or bacterium capable of infecting a plant as a vector. Examples of such viruses include cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus, gemini virus and the like as typical viruses, and Agrobacterium and the like as bacteria. When introducing a gene into a plant by the Agrobacterium method, a commercially available plasmid can be used. As a method for introducing the DNA of the present invention into a plant body using such a vector, the leaf disk method (Jorgensen, RA et al., (1996), preferably introducing a gene via Agrobacterium. ). Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol. Biol. 31, 957-973.).
These transformation methods described above are preferably selected as appropriate depending on the type of plant or the like that serves as the host (for example, monocotyledonous plants or dicotyledonous plants).
本発明において「植物」とは、特に制限されないが、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。花卉植物としては、キク、バラ、カーネーション、シクラメン等を挙げることができる。 In the present invention, the “plant” is not particularly limited, but monocotyledonous plants such as rice, corn, wheat, barley, oat, pearl barley, Italian ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet, sugarcane, pearl millet, etc. And dicotyledonous plants such as rapeseed, soybean, cotton, tomato and potato. Examples of flower plants include chrysanthemum, roses, carnations, and cyclamen.
また、本発明は、本発明のDNAまたは本発明のベクターを保持する植物細胞を提供する。さらに本発明は、本発明の植物細胞を含む形質転換植物体を提供する。本発明のDNAまたは本発明のベクターが導入される細胞には、形質転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はない。
本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
The present invention also provides a plant cell carrying the DNA of the present invention or the vector of the present invention. Furthermore, this invention provides the transformed plant body containing the plant cell of this invention. The cells into which the DNA of the present invention or the vector of the present invention is introduced include plant cells for producing transformed plants. There is no restriction | limiting in particular as a plant cell.
The plant cells of the present invention include cultured cells as well as cells in the plant body. Also included are protoplasts, shoot primordia, multi-buds, and hairy roots.
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法などを挙げることができるが、特に制限されるものではない。いくつかの技術については既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。 Regeneration of plant bodies from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells. For example, with regard to the technique for producing a transformed plant body, a method for regenerating a plant body by introducing a gene into protoplasts using polyethylene glycol, a method for regenerating a plant body by introducing a gene into protoplasts using an electric pulse, or a gene for cells by a particle gun method Can be mentioned, and a method for regenerating a plant body and a method for regenerating a plant body by introducing a gene via Agrobacterium are not particularly limited. Some techniques have already been established and are widely used in the technical field of the present invention. In the present invention, these methods can be suitably used.
本発明のDNAを含むベクターの導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入することが好ましい。この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
In order to efficiently select plant cells transformed by introduction of a vector containing the DNA of the present invention, the above recombinant vector contains an appropriate selection marker gene or is introduced into a plant cell together with a plasmid vector containing a selection marker gene. It is preferable to do. Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the neomycin phosphotransferase gene that is resistant to the antibiotics kanamycin or gentamicin, the hygromycin phosphotransferase gene that is resistant to hygromycin, and the acetyl that is resistant to the herbicide phosphinothricin. Examples include transferase genes.
Plant cells into which the recombinant vector has been introduced are placed on a known selection medium containing a suitable selection agent according to the type of the introduced selection marker gene and cultured. As a result, transformed plant cultured cells can be obtained.
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら(Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995))の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら(Bio/Technology 7:581 (1989))の方法やGorden-Kammら(Plant Cell 2:603(1990))が挙げられ、ジャガイモであればVisserら(Theor.Appl.Genet 78:594 (1989))の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe(Planta 99:12(1971))の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればAkamaら(Plant Cell Reports 12:7-11 (1992))の方法が挙げられ、ユーカリであれば土肥ら(特開平8-89113号公報)の方法が挙げられる。 Transformed plant cells can regenerate plant bodies by redifferentiation. The method of redifferentiation varies depending on the type of plant cell. For example, Fujimura et al. (Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)) can be used for rice, and Shillito et al. (Bio / Technology 7) for maize. : 581 (1989)) and Gorden-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603 (1990)), and for potatoes, Visser et al. (Theor. Appl. Genet 78: 594 (1989)). In the case of tobacco, the method of Nagata and Takebe (Planta 99:12 (1971)) can be cited, and in the case of Arabidopsis, the method of Akama et al. (Plant Cell Reports 12: 7-11 (1992)) can be cited as eucalyptus. Then, the method of Toi et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 8-89113) can be mentioned.
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAの存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。
この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法(Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に準じて実施することができる。
In addition, the presence of introduced foreign DNA in a transformed plant that has been regenerated and cultivated in this way can be analyzed by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the base sequence of the DNA in the plant body. Can be confirmed.
In this case, extraction of DNA from the transformed plant body can be performed according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
再生させた植物体中に存在する本発明のDNAよりなる外来遺伝子を、PCR法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したDNAを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のDNA、あるいは本発明により改変されたDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。 When the foreign gene comprising the DNA of the present invention present in the regenerated plant body is analyzed using the PCR method, the amplification reaction is performed using the DNA extracted from the regenerated plant body as a template as described above. In addition, an amplification reaction is carried out in a reaction mixture in which the DNA of the present invention or a synthesized oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of the DNA modified according to the present invention is used as a primer. You can also In the amplification reaction, DNA denaturation, annealing, and extension reactions are repeated several tens of times to obtain an amplification product of a DNA fragment containing the DNA sequence of the present invention. When the reaction solution containing the amplification product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, it is possible to confirm that the amplified DNA fragments are fractionated and the DNA fragments correspond to the DNA of the present invention.
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAまたはベクターが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。これらの植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫およびクローンの繁殖材料は、植物の種子休眠を制御する方法に使用することが可能である。 Once a transformed plant into which the DNA of the present invention is introduced into the genome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them. Is possible. The present invention includes plant cells into which the DNA or vector of the present invention has been introduced, plant bodies containing the cells, progeny and clones of the plant bodies, and propagation materials for the plant bodies, their progeny, and clones. These plant cells, plants containing the cells, progeny and clones of the plants, and propagation materials of the plants, progeny and clones thereof can be used in a method for controlling seed dormancy of plants. .
本発明においては、植物のSdr4遺伝子の発現を促進することで、植物の発芽を抑制することができる。本発明の方法で作製した植物は、例えば有用農作物において穂発芽耐性を強くすることが可能である。
さらに、外来性のSdr4遺伝子を植物に導入することにより、植物の発芽抑制を図ることが考えられる。外来性のSdr4遺伝子が導入された植物の形質転換体の作製は、上記した方法により行うことができる。即ち、植物細胞内で機能するベクターに該遺伝子を挿入し、該ベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させることにより、目的の形質転換植物体を作出することができる。
In the present invention, plant germination can be suppressed by promoting the expression of the plant Sdr4 gene. The plant produced by the method of the present invention can increase the resistance to sprout germination in useful crops, for example.
Furthermore, it is conceivable to suppress plant germination by introducing an exogenous Sdr4 gene into the plant. Production of a transformant of a plant introduced with an exogenous Sdr4 gene can be performed by the method described above. That is, a target transformed plant can be produced by inserting the gene into a vector that functions in a plant cell, introducing the vector into the plant cell, and regenerating the plant from the plant cell.
さらに、Sdr4遺伝子の配列情報を基に、植物の内因性のSdr4遺伝子の発現を抑制するために用いる、アンチセンスRNAをコードするDNA、dsRNAをコードするDNA、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、さらに共抑制効果を有するRNAをコードするDNA等を作製することも可能である。作製されたDNAは、植物の発芽を促進させるために使用できる。 Furthermore, DNA encoding antisense RNA, DNA encoding dsRNA, and DNA encoding ribozyme activity are used to suppress the expression of endogenous Sdr4 gene in plants based on the sequence information of Sdr4 gene. Furthermore, it is possible to prepare DNA encoding RNA having a co-suppression effect. The produced DNA can be used to promote germination of plants.
一方、本発明においては、植物のAtSdr4L1遺伝子の発現を促進することで、植物の発芽を促進することができる。本発明の方法で作製した植物は、例えば有用農作物、鑑賞用植物において発芽の促進を図ることができる。 On the other hand, in the present invention, the germination of a plant can be promoted by promoting the expression of the plant AtSdr4L1 gene. Plants produced by the method of the present invention can promote germination in useful crops and ornamental plants, for example.
さらに、外来性のAtSdr4L1遺伝子を植物に導入することにより、植物の発芽促進を図ることが考えられる。外来性のAtSdr4L1遺伝子が導入された植物の形質転換体の作製は、上記した方法により行うことができる。即ち、植物細胞内で機能するベクターに該遺伝子を挿入し、該ベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させることにより、目的の形質転換植物体を作出することができる。該方法により、穂発芽耐性の高い形質転換植物体を得ることができる。 Furthermore, it may be possible to promote germination of plants by introducing an exogenous AtSdr4L1 gene into plants. Production of a transformant of a plant into which an exogenous AtSdr4L1 gene has been introduced can be performed by the method described above. That is, a target transformed plant can be produced by inserting the gene into a vector that functions in a plant cell, introducing the vector into the plant cell, and regenerating the plant from the plant cell. By this method, a transformed plant body having high ear germination resistance can be obtained.
さらに、AtSdr4L1遺伝子の配列情報を基に、植物の内因性のAtSdr4L1遺伝子の発現を抑制するために用いる、アンチセンスRNAをコードするDNA、dsRNAをコードするDNA、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、さらに共抑制効果を有するRNAをコードするDNA等を作製することも可能である。作製されたDNAは、植物の発芽を抑制させるために使用できる。 Furthermore, DNA encoding antisense RNA, DNA encoding dsRNA, and DNA encoding ribozyme activity are used to suppress the expression of endogenous plant AtSdr4L1 gene based on the sequence information of AtSdr4L1 gene. Furthermore, it is possible to prepare DNA encoding RNA having a co-suppression effect. The produced DNA can be used to suppress germination of plants.
本発明者らは、Kasalath由来のSdr4遺伝子をもつNIL(Sdr4)はその反復親である日本晴よりも高い穂発芽耐性を示したことから、Kasalath由来のSdr4タンパク質の方が、発芽抑制能が高いことを見出した。従って、日本晴型とKasalath型のSdr4遺伝子を判別することで穂発芽性難の遺伝子を選択することができる。 The inventors of the present invention showed that NIL (Sdr4) having Sdr4 gene derived from Kasalath showed higher ear germination resistance than its recurrent parent, Nipponbare. Therefore, Sdr4 protein derived from Kasalath has higher germination suppression ability. I found out. Therefore, it is possible to select a gene having difficulty in germinating spikes by discriminating the Nipponbare type and Kasalath type Sdr4 genes.
上記の知見に基づき本発明は、被検植物について、植物の種子休眠を制御する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)から(h)のいずれかに記載のDNAに相当する部位における変異を検出することを特徴とする、被検植物の穂発芽耐性を検出する方法を提供する。
(a)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(e)配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(f)配列番号:8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(g)配列番号:9に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(h)配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
Based on the above findings, the present invention corresponds to the DNA according to any one of (a) to (h) below, which encodes a plant-derived protein having a function of controlling plant seed dormancy for the test plant. Provided is a method for detecting panicle germination resistance of a test plant, which comprises detecting a mutation at a site.
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 6.
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5.
(E) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.
(F) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
(G) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
(H) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
なお、本発明において「いずれかに記載の塩基配列」とは、上記DNAのいずれか少なくとも1以上の塩基配列を意味する。即ち、上記DNAの複数の塩基配列もしくはそれら各遺伝子の近傍DNA領域における変異を検出することによって、穂発芽耐性を検出する場合も、本発明に含まれる。 In the present invention, the “base sequence described in any one” means at least one or more base sequences of the above DNA. That is, the present invention also includes a case where the germination resistance is detected by detecting mutations in the plurality of base sequences of the DNA or in the vicinity of the respective DNA regions.
また、上記(a)から(h)のいずれかに記載のDNAに「相当する部位」とは、種々の植物において、当該植物に存在する上記遺伝子の相同遺伝子における対応する部位をいう。 In addition, the “corresponding site” of the DNA described in any of (a) to (h) above refers to a corresponding site in a homologous gene of the gene present in the plant in various plants.
本発明において「穂発芽耐性の検出」とは、穂発芽耐性が高いか低いかを判定するための検査が含まれる。本発明の方法においては、上記配列番号:4または5の遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域において、配列番号:4または5と同型の変異が検出された場合には、穂発芽耐性がより高いと判定される。一方、上記配列番号:1または2の遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域において、配列番号:1または2と同型の変異が検出された場合には、穂発芽耐性が低いと判定される。 In the present invention, “detection of ear germination resistance” includes a test for determining whether ear germination resistance is high or low. In the method of the present invention, when a mutation of the same type as SEQ ID NO: 4 or 5 is detected in the gene of SEQ ID NO: 4 or 5 or a DNA region in the vicinity of the gene, Determined. On the other hand, when a mutation of the same type as SEQ ID NO: 1 or 2 is detected in the gene of SEQ ID NO: 1 or 2 or a DNA region in the vicinity of the gene, it is determined that the germination resistance is low.
本発明において、穂発芽耐性が高いか否かは、公知の方法により判定することが可能である。一例としては、植物の種子の発芽率を測定する方法が挙げられる。イネ品種における穂発芽性難(穂発芽耐性が高い)の基準となる品種であるコシヒカリは、成熟後9日、すなわち出穂後50日における発芽率が47%であるのに対し、穂発芽性やや易であるキヌヒカリは97%であった(文献:藤田ら、香川県における水稲品種の穂発芽性とその発生要因。香川県農試研報44:1−11)。これに対して出穂後49日目の日本晴(穂発芽性やや易)が89%±0.8%の発芽率を示し、日本晴を背景としSdr4を持つNIL(Sdr4)が15.5%±2.3%と低い値、すなわち、コシヒカリ以上に強い穂発芽耐性を示した。 In the present invention, whether or not the ear germination resistance is high can be determined by a known method. An example is a method of measuring the germination rate of plant seeds. Koshihikari, which is the standard for rice germination difficulty (high germination tolerance), has a germination rate of 47% 9 days after maturation, that is, 50 days after heading. Kinuhikari, which is easy, was 97% (Reference: Fujita et al., Ear germination of rice varieties in Kagawa Prefecture and the factors behind them. Kagawa Prefectural Agricultural Research Report 44: 1-11). On the other hand, Nipponbare (early germinating somewhat easy) 49 days after heading showed a germination rate of 89% ± 0.8%, and NIL (Sdr4) with Sdr4 against Nihonbare in the background was 15.5% ± 2. The value was as low as 3%, that is, the ear germination resistance was stronger than Koshihikari.
本発明の方法により、被検植物における変異を検出することで、実際に穂発芽耐性を観察しなくても、被検植物の穂発芽耐性が高いか否かを判定することができる。
本発明における「遺伝子の近傍DNA領域」とは、通常、該遺伝子の近傍の染色体上の領域を指す。近傍とは、特に制限されるものではないが、通常、本発明の多型部位を含むDNA領域である。
By detecting the mutation in the test plant by the method of the present invention, it is possible to determine whether the test plant has high ear germination resistance without actually observing the ear germination resistance.
In the present invention, the “near DNA region of a gene” usually refers to a region on a chromosome in the vicinity of the gene. The vicinity is not particularly limited, but is usually a DNA region containing the polymorphic site of the present invention.
上記本発明の検出方法における「変異」の位置は、予め規定することは困難であるが、通常、上記遺伝子のORF中、あるいは上記遺伝子の発現を制御する領域(例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域等)中に存在するが、これらに限定されるものではない。また、この「変異」とは、上記遺伝子の発現量を変化させる、mRNAの安定性等の性質を変化させる、あるいは上記遺伝子によってコードされるタンパク質の有する活性を変化させるような変異であることが多いが、特に制限されない。本発明の変異としては、例えば、塩基の付加、欠失、置換、挿入変異等を挙げることができる。 The position of the “mutation” in the detection method of the present invention is difficult to pre-define, but is usually in the ORF of the gene or a region that controls the expression of the gene (eg, promoter region, enhancer region, etc.) ), But is not limited thereto. In addition, the “mutation” is a mutation that changes the expression level of the gene, changes properties such as mRNA stability, or changes the activity of the protein encoded by the gene. Many, but not particularly limited. Examples of the mutation of the present invention include base addition, deletion, substitution, insertion mutation and the like.
本発明者らは、被検植物における、植物の種子休眠を制御する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)から(h)のいずれかに記載のDNA領域において、穂発芽耐性に対して有意に関連する多型変異を見出すことに成功した。
(a)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(e)配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(f)配列番号:8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(g)配列番号:9に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(h)配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
従って、上記のいずれかに記載の塩基配列もしくは該遺伝子の近傍DNA領域上の多型部位について変異の有無を指標とする(塩基種を決定する)ことにより、穂発芽耐性を検出することが可能である。
In the DNA region according to any one of (a) to (h) below, which encodes a plant-derived protein having a function of controlling plant seed dormancy in the test plant, Succeeded in finding polymorphic mutations significantly related to.
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 6.
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5.
(E) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.
(F) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
(G) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
(H) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
Therefore, it is possible to detect panicle germination resistance by using the presence or absence of mutation as an index (determining the base type) for any of the above-described base sequences or polymorphic sites in the DNA region near the gene. It is.
なお、上記の「遺伝子の近傍DNA領域」とは、通常該遺伝子の近傍の染色体上の領域を指す。近傍とは特に制限されるものではないが、通常、本発明の多型部位を含むDNA領域であり、好ましくは多型部位または多型部位を含むLDブロック(連鎖不平衡ブロック)の末端部位から10kb以内の領域を指す。 The “near DNA region of the gene” mentioned above usually refers to a region on the chromosome in the vicinity of the gene. Although the neighborhood is not particularly limited, it is usually a DNA region containing the polymorphic site of the present invention, preferably from the polymorphic site or the end site of the LD block (linkage disequilibrium block) containing the polymorphic site. Refers to a region within 10 kb.
前後10kbすなわち20kb以内の範囲にある多型は、Gabrielらの報告の通り、連鎖している可能性が高い(Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science 296, 2225-9. 2002)。 As reported by Gabriel et al., Polymorphisms in the range of 10 kb before and after, that is, within 20 kb are likely to be linked (Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science 296, 2225-9. 2002).
多型とは、遺伝学的には、1%以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されない。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基(時には数千塩基)が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられる。さらに、多型部位の数も、1個に限定されず、複数個の多型であってもよい。 A polymorphism is generally defined genetically as a base change in one gene that is present at a frequency of 1% or more. However, the “polymorphism” in the present invention is limited to this definition. Not. Examples of the polymorphism in the present invention include a single nucleotide polymorphism and a polymorphism in which one to several tens of bases (sometimes several thousand bases) are deleted or inserted. Furthermore, the number of polymorphic sites is not limited to one, and may be a plurality of polymorphs.
また本発明は、被検者について、植物の種子休眠を制御する機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)から(h)のいずれかに記載のDNA領域に相当する塩基配列もしくは該塩基配列の近傍DNA領域における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、穂発芽耐性を検出する方法を提供する。
(a)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(e)配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(f)配列番号:8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(g)配列番号:9に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA。
(h)配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
The present invention also relates to a nucleotide sequence corresponding to a DNA region according to any one of the following (a) to (h), which encodes a plant-derived protein having a function of controlling plant seed dormancy for a subject. Provided is a method for detecting panicle germination resistance, which comprises determining a base type of a polymorphic site in a DNA region in the vicinity of the base sequence.
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 6.
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5.
(E) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.
(F) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
(G) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
(H) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
本発明の穂発芽耐性を検出する方法における「多型部位」は、上記DNAのいずれかに記載の塩基配列もしくは該塩基配列の近傍DNA領域に存在する多型であれば、特に制限されない。具体的には、本発明の穂発芽耐性を検出する方法に利用可能な多型部位として、配列番号:2に記載の塩基配列における、223位、297位、531位、1145位、1156-1157位、1411位、1624位、1945位、2027位、2182-2184位、2188位、2190位、2191位、2193位、2194位、2195位、2280位、2494位、3092位から選択される少なくとも一つの多型部位に相当する多型部位を挙げることができる。(なお、本明細書においては、これらの多型部位を単に『本発明の多型部位』と記載する場合がある)。 The “polymorphic site” in the method for detecting panicle germination resistance of the present invention is not particularly limited as long as it is a polymorphism present in the base sequence described in any of the above DNAs or a DNA region in the vicinity of the base sequence. Specifically, as a polymorphic site that can be used in the method for detecting panicle germination resistance of the present invention, positions 223, 297, 531, 1145, 1156-1157 in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 are used. Rank, 1411, 1624, 1945, 2027, 2182-2184, 2188, 2190, 2191, 2193, 2194, 2195, 2195, 2280, 2494, 3092 A polymorphic site corresponding to one polymorphic site can be mentioned. (In the present specification, these polymorphic sites may be simply referred to as “polymorphic sites of the present invention”).
上記表中に示した多型部位の塩基種は配列表に示した配列に対して相補鎖側にある塩基種を示している場合があるが、本明細書において記載された前後配列を用いれば異同を確認することは当業者にとって容易であり、検出を行うにあたってはプラス鎖とマイナス鎖のどちらを調べても必然的にもう一方の結果を決定することができる。 The base type of the polymorphic site shown in the above table may indicate a base type on the complementary strand side with respect to the sequence shown in the sequence table, but if the sequence before and after described in this specification is used, It is easy for those skilled in the art to confirm the difference, and when performing detection, the other result can be determined inevitably by examining either the plus strand or the minus strand.
本発明の好ましい態様においては、上述した多型部位における塩基種の変異が、配列番号:2に記載の塩基配列における、223位の塩基種がGからA、297位の塩基種がAからG、530位と531位間への1塩基(A)の挿入、1145位の塩基種がAからG、1156-1157位の2塩基の欠失、1411位における4塩基(ACCC)の挿入、1624位の塩基種がCからG、1945位の塩基種がGからT、2027位の塩基種がAからG、2182-2184位の3塩基(CGG)の欠失、2188位の塩基種がCからG、2190位の塩基種がGからC、2191位の塩基種がCからA、2193位の塩基種がGからC、2194位の塩基種がGからT、2195位の塩基種がAからC、2280位の塩基種がCからT、2494位の塩基種がGからC、3092位の塩基種がCからT、である場合に、穂発芽耐性を有する、または穂発芽体制が高いと判定される。 In a preferred embodiment of the present invention, the base type mutation at the polymorphic site described above is such that the base type at position 223 is G to A and the base type at position 297 is A to G in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. , Insertion of 1 base (A) between positions 530 and 531, base type 1145 at position A to G, deletion of 2 bases at positions 1156-1157, insertion of 4 bases (ACCC) at position 1411, 1624 The base type at position C is G, the base type at position 1945 is G through T, the base type at position 2027 is A through G, the 3 bases at positions 2182-2184 (CGG) are deleted, the base type at position 2188 is C To G, 2190th base type is G to C, 2191st base type is C to A, 2193rd base type is G to C, 2194th base type is G to T, 2195th base type is A To C, 2280-position base species is C to T, 2494-position base species is G to C, and 3092-position base species is C to T. It is determined.
以上のように、本発明により、穂発芽耐性に関連する遺伝子上の領域が明らかになったことにより、当業者に過度の負担を強いることなく、被検植物の穂発芽耐性の検出を行うことができる。
本発明の多型部位における塩基種の決定は、当業者においては種々の方法によって行うことができる。一例を示せば、本発明の多型部位を含むDNAの塩基配列を直接決定することによって行うことができる。
As described above, according to the present invention, the region on the gene related to ear germination resistance has been clarified, so that detection of ear germination resistance of a test plant can be performed without imposing an excessive burden on those skilled in the art. Can do.
A person skilled in the art can determine the base species in the polymorphic site of the present invention by various methods. For example, it can be performed by directly determining the base sequence of DNA containing the polymorphic site of the present invention.
本発明の検出方法に供する「被検植物」としては、特に制限されないが、好ましくはイネ、さらに好ましくはイネの日本晴品種、Kasalath品種が挙げられる。
本発明の検出方法に供する被検試料は、通常、予め被検植物から取得された生体試料であることが好ましい。生体試料としては、例えばDNA試料を挙げることができる。本発明におけるDNA試料は、例えば被検植物の組織または細胞等から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。
即ち本発明は、通常、被検者由来の生体試料(予め被検植物から取得された生体試料)を被検試料として検査に供する方法である。
当業者においては、公知の技術を用いて、適宜、生体試料の調製を行うことができる。例えば、DNA試料は、本発明の多型部位を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって調製することができる。
The “test plant” to be subjected to the detection method of the present invention is not particularly limited, but preferably includes rice, more preferably Japanese fine varieties of rice and Kasalath varieties.
In general, the test sample used in the detection method of the present invention is preferably a biological sample obtained in advance from a test plant. Examples of the biological sample include a DNA sample. The DNA sample in the present invention can be prepared based on, for example, chromosomal DNA or RNA extracted from a tissue or cell of a test plant.
That is, the present invention is a method in which a biological sample derived from a subject (a biological sample obtained in advance from a test plant) is used as a test sample.
A person skilled in the art can appropriately prepare a biological sample using a known technique. For example, a DNA sample can be prepared by PCR using a primer that hybridizes to DNA containing the polymorphic site of the present invention and chromosomal DNA or RNA as a template.
本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者においては、DNAシークエンサー等を用いて容易に実施することができる。
予め塩基のバリエーションが明らかにされている多型部位について、その塩基種を決定するための様々な方法が公知である。本発明の塩基種の決定方法は、特に限定されない。例えば、PCR法を応用した解析方法として、TaqMan PCR法、AcycloPrime法、およびMALDI-TOF/MS法等が実用化されている。またPCRに依存しない塩基種の決定法としてInvader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる。ここに述べた方法は、いずれも本発明における多型部位の塩基種の決定に応用できる。
In this method, the base sequence of the isolated DNA is then determined. Those skilled in the art can easily determine the base sequence of the isolated DNA using a DNA sequencer or the like.
Various methods for determining the base type of a polymorphic site whose base variation has been clarified in advance are known. The method for determining the base species of the present invention is not particularly limited. For example, TaqMan PCR method, AcycloPrime method, MALDI-TOF / MS method and the like have been put to practical use as analysis methods applying the PCR method. Invader and RCA methods are known as methods for determining base types that do not depend on PCR. Furthermore, the base species can be determined using a DNA array. Any of the methods described herein can be applied to the determination of the base type of the polymorphic site in the present invention.
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、通常、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らない塩基種決定法も古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。 All of these methods have been developed for genotyping a large amount of samples at high speed. With the exception of MALDI-TOF / MS, it is usually necessary to prepare a labeled probe or the like in any way for either method. On the other hand, a method for determining a base type that does not rely on a labeled probe has been performed for a long time. As one of such methods, for example, a method using restriction fragment length polymorphism (RFLP), a PCR-RFLP method and the like can be mentioned.
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。
また、CAPS (Cleaved Amplifeid Polymorphic Sequence)マーカーあるいはプライマーに変異を導入し、制限酵素サイトを作り出すdCAPS (derived CAPS)マーカーを使用することもできる。dCAPSマーカーは、PCRのプライマーにテンプレートのDNAとミスマッチを起こして、PCR産物上に制限酵素サイトを作り出すという手法である(特開2003-259898)。
RFLP utilizes the fact that a restriction enzyme recognition site mutation or a base insertion or deletion in a DNA fragment caused by restriction enzyme treatment can be detected as a change in the size of the fragment produced after the restriction enzyme treatment. If there is a restriction enzyme that recognizes the base sequence containing the polymorphism to be detected, the base of the polymorphic site can be known by the principle of RFLP.
Alternatively, a CAPS (Cleaved Amplifeid Polymorphic Sequence) marker or a primer can be used to introduce a mutation and a dCAPS (derived CAPS) marker that creates a restriction enzyme site. The dCAPS marker is a technique of creating a restriction enzyme site on a PCR product by causing a mismatch between a PCR primer and DNA of a template (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-259898).
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、1本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。PCR-SSCP法は、PCR産物を1本鎖DNAに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、1本鎖DNAの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。 As a method that does not require a labeled probe, a method for detecting a difference in base using a change in the secondary structure of DNA as an index is also known. PCR-SSCP utilizes the fact that the secondary structure of single-stranded DNA reflects the difference in its nucleotide sequence (Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146., Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6 (8): 1313- 1318., Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling., PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-282.). The PCR-SSCP method is performed by dissociating the PCR product into single-stranded DNA and separating it on a non-denaturing gel. Since the mobility on the gel varies depending on the secondary structure of the single-stranded DNA, if there is a difference in base at the polymorphic site, it can be detected as a difference in mobility.
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル(denaturant gradient gel electrophoresis: DGGE法)等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に1本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。 Other examples of methods that do not require a labeled probe include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE method). The DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel having a concentration gradient of a denaturing agent, and the DNA fragments are separated depending on the instability of each. When a mismatched unstable DNA fragment migrates to a certain denaturant concentration in the gel, the DNA sequence around the mismatch is partially dissociated into single strands due to its instability. The mobility of a partially dissociated DNA fragment becomes very slow and can be separated from the mobility of a complete double-stranded DNA without a dissociated portion.
更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる(細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一)。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA(あるいはRNA)をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、例えば、多数の多型部位について同時に解析するには、DNAアレイは有用である。 In addition, the DNA species can be used to determine the base species (Cell engineering separate volume “DNA microarray and the latest PCR method”, Shujunsha, published 2000.4 / 20, pp97-103 “SNP analysis using oligo DNA chip”, Sabae. Shinichi). In the DNA array, sample DNA (or RNA) is hybridized to a large number of probes arranged on the same plane, and the hybridization to each probe is detected by scanning the plane. Since responses to many probes can be observed simultaneously, for example, a DNA array is useful for analyzing a large number of polymorphic sites simultaneously.
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アリル特異的オリゴヌクレオチド(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダイゼーション法が利用できる。アリル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき多型部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によって多型部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。 In addition to the above method, an allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method can be used to detect a base at a specific site. An allyl-specific oligonucleotide (ASO) is composed of a base sequence that hybridizes to a region where a polymorphic site to be detected is present. When ASO is hybridized to sample DNA, the hybridization efficiency decreases if a mismatch occurs at the polymorphic site due to the polymorphism. Mismatches can be detected by Southern blotting or a method that uses the property of quenching by intercalating a special fluorescent reagent into the hybrid gap. Mismatches can also be detected by the ribonuclease A mismatch cleavage method.
上記オリゴヌクレオチドのうち、配列番号:2に記載の塩基配列における、223位、297位、531位、1145位、1156-1157位、1411位、1624位、1945位、2027位、2182-2184位、2188位、2190位、2191位、2193位、2194位、2195位、2280位、2494位、3092位から選択される少なくとも一つの多型部位に相当する多型部位のいずれかに記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、穂発芽耐性を検出するための試薬(検査薬)として利用できる。これは遺伝子発現を指標とする検査、または遺伝子多型を指標とする検査に使用される。 Among the above-mentioned oligonucleotides, positions 223, 297, 531, 1145, 1156-1157, 146-1157, 1411, 1624, 1945, 2027, 2182-2184 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 , 2188 position, 2190 position, 2191 position, 2193 position, 2194 position, 2195 position, 2280 position, 2494 position, 3092 position at least one polymorphic site corresponding to at least one polymorphic site Oligonucleotides that hybridize to DNA containing the type site and have a chain length of at least 15 nucleotides can be used as reagents (test agents) for detecting panicle germination resistance. This is used for a test using gene expression as an index or a test using gene polymorphism as an index.
該オリゴヌクレオチドは、本発明の上記多型部位のいずれかの多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第2版1989に記載の条件)において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出する遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域における、上記植物の種子休眠を制御する機能を有する植物由来のタンパク質をコードするDNA塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。 The oligonucleotide specifically hybridizes to DNA containing any one of the polymorphic sites of the present invention. Here, “specifically hybridize” means normal hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions (for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, In the condition described in the second edition 1989), it means that cross-hybridization does not occur significantly with DNA encoding other proteins. If the specific hybridization is possible, the oligonucleotide is added to a DNA base sequence encoding a plant-derived protein having a function of controlling seed dormancy of the plant in a gene to be detected or a DNA region in the vicinity of the gene. On the other hand, it need not be completely complementary.
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明の上記配列番号:2に記載の塩基配列における、223位、297位、531位、1145位、1156-1157位、1411位、1624位、1945位、2027位、2182-2184位、2188位、2190位、2191位、2193位、2194位、2195位、2280位、2494位、3092位から選択される少なくとも一つの多型部位に相当する多型部位のうち、いずれかの多型部位を含むDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。 The oligonucleotide can be used as a probe or primer in the test method of the present invention. When the oligonucleotide is used as a primer, the length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp. Primers are the positions 223, 297, 531, 1145, 1156-1157, 146-1157, 1411, 1624, 1945, 2027, 2182-2184 in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 of the present invention. Position, 2188, 2190, 2191, 2193, 2194, 2194, 2195, 2280, 2494, 3092, any one of the polymorphic sites corresponding to at least one polymorphic site There is no particular limitation as long as it can amplify at least part of the DNA containing the polymorphic site.
本発明は、本発明の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー、および多型部位を含むDNA領域にハイブリダイズするプローブを提供する。 The present invention provides a primer for amplifying a region containing the polymorphic site of the present invention, and a probe that hybridizes to a DNA region containing the polymorphic site.
本発明において、多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーには、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーも含まれる。該プライマーは、多型部位を含むDNAにおける、多型部位の3'側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。たとえば、DNAチップによる解析のためのプライマーであれば、多型部位を含む領域として、20〜500、通常50〜200塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。当業者においては、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。 In the present invention, the primer for amplifying a region containing a polymorphic site also includes a primer that can initiate complementary strand synthesis toward the polymorphic site using DNA containing the polymorphic site as a template. The primer can also be expressed as a primer for providing a replication origin on the 3 ′ side of the polymorphic site in DNA containing the polymorphic site. The interval between the region where the primer hybridizes and the polymorphic site is arbitrary. For the interval between the two, a suitable number of bases can be selected according to the analysis method of the base at the polymorphic site. For example, in the case of a primer for analysis using a DNA chip, the primer can be designed so as to obtain an amplification product having a length of 20 to 500, usually 50 to 200 bases, as a region containing a polymorphic site. A person skilled in the art can design a primer according to the analysis method based on the base sequence information about the surrounding DNA region including the polymorphic site. The base sequence constituting the primer of the present invention can be appropriately modified as well as a base sequence completely complementary to the genomic base sequence.
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種のジェノタイピング方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。
本発明のプライマーの具体的な例としては、配列番号:11または12に記載のプライマーが挙げられるが、本発明のプライマーはこれに限定されるものではない。
本発明は、上記プライマーを有効成分として含有する、本発明の多型部位の検査薬またはキットも提供する。
In addition to the base sequence complementary to the genomic base sequence, an arbitrary base sequence can be added to the primer of the present invention. For example, in a primer for a polymorphism analysis method using a type IIs restriction enzyme, a primer to which a recognition sequence for a type IIs restriction enzyme is added is used. Such a primer with a modified base sequence is included in the primer of the present invention. Furthermore, the primer of the present invention can be modified. For example, a fluorescent substance or a primer labeled with a binding affinity substance such as biotin or digoxin is used in various genotyping methods. Primers having these modifications are also included in the present invention.
Specific examples of the primer of the present invention include the primer set forth in SEQ ID NO: 11 or 12, but the primer of the present invention is not limited thereto.
The present invention also provides a test agent or kit for the polymorphic site of the present invention, which contains the above primer as an active ingredient.
一方本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。 On the other hand, in the present invention, a probe that hybridizes to a region containing a polymorphic site refers to a probe that can hybridize to a polynucleotide having a base sequence of a region containing a polymorphic site. More specifically, a probe containing a polymorphic site in the base sequence of the probe is preferable as the probe of the present invention. Alternatively, depending on the base analysis method at the polymorphic site, the probe may be designed so that the end of the probe corresponds to a base adjacent to the polymorphic site. Therefore, although the polymorphic site is not included in the base sequence of the probe itself, a probe including a base sequence complementary to the region adjacent to the polymorphic site can also be shown as a desirable probe in the present invention.
言いかえれば、ゲノムDNA上の本発明の多型部位、または多型部位に隣接する部位にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の多型部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。 In other words, a probe capable of hybridizing to the polymorphic site of the present invention on genomic DNA or a site adjacent to the polymorphic site is preferred as the probe of the present invention. In the probe of the present invention, modification of the base sequence, addition of the base sequence, or modification is allowed in the same manner as the primer. For example, a probe used for the Invader method is added with a base sequence unrelated to the genome constituting the flap. Such a probe is also included in the probe of the present invention as long as it hybridizes to a region containing a polymorphic site. The base sequence constituting the probe of the present invention can be designed according to the analysis method based on the base sequence of the DNA region surrounding the polymorphic site of the present invention in the genome.
本発明のプライマーまたはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムDNAに相補的な塩基配列の長さは、通常15〜100、一般に15〜50、通常15〜30である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。 The primer or probe of the present invention can be synthesized by any method based on the base sequence constituting it. The length of the base sequence complementary to the genomic DNA of the primer or probe of the present invention is usually 15 to 100, generally 15 to 50, usually 15 to 30. A technique for synthesizing an oligonucleotide having the base sequence based on the given base sequence is known. Furthermore, in the synthesis of the oligonucleotide, any modification can be introduced into the oligonucleotide using a nucleotide derivative modified with a fluorescent dye or biotin. Alternatively, a method of binding a fluorescent dye or the like to a synthesized oligonucleotide is also known.
本発明のプローブの具体的な例としては、それぞれ配列番号:2に記載の塩基配列における、223位の塩基種がGからA、297位の塩基種がAからG、530位と531位間への1塩基(A)の挿入、1145位の塩基種がAからG、1156-1157位の2塩基の欠失、1411位における4塩基(ACCC)の挿入、1624位の塩基種がCからG、1945位の塩基種がGからT、2027位の塩基種がAからG、2182-2184位の3塩基(CGG)の欠失、2188位の塩基種がCからG、2190位の塩基種がGからC、2191位の塩基種がCからA、2193位の塩基種がGからC、2194位の塩基種がGからT、2195位の塩基種がAからC、2280位の塩基種がCからT、2494位の塩基種がGからC、3092位の塩基種がCからT、のいずれかの多型部位に相当する多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブであって、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するプローブが挙げられる。 As specific examples of the probe of the present invention, the base species at position 223 is G to A, the base species at position 297 is A to G, and the position between positions 530 and 531 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, respectively. 1 base (A) insertion, 1145 position base species from A to G, 1156-1157 position 2 base deletion, 1411 position 4 base (ACCC) insertion, 1624 position base type from C G, 1945 position base species G to T, 2027 position base species A to G, 2182-2184 position 3 bases (CGG) deletion, 2188 position base species C to G, 2190 position base Species is G to C, 2191th base type is C to A, 2193rd base type is G to C, 2194th base type is G to T, 2195th base type is A to C, 2280th base A probe that hybridizes to a region containing a polymorphic site corresponding to any of the polymorphic sites of species C to T, base species 2494 at the position G to C, and base 3030 at the position C to T. And probes having a chain length of at least 15 nucleotides. .
本発明はまた、本発明の穂発芽耐性を検出する方法に使用するための試薬(検査薬)を提供する。本発明の試薬は、前記本発明のプライマーおよび/またはプローブを含む。穂発芽耐性の検出においては上記、本発明の多型部位のいずれかに記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーおよび/またはプローブを用いる。 The present invention also provides a reagent (test agent) for use in the method of detecting panicle germination resistance of the present invention. The reagent of the present invention includes the primer and / or probe of the present invention. In the detection of panicle germination resistance, a primer and / or probe for amplifying DNA containing the polymorphic site described in any of the polymorphic sites of the present invention is used.
本発明の試薬には、塩基種の決定方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを組み合わせることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の塩基種決定方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、例えば、相補鎖合成用の基質等が用いられる。
さらに、本発明における試薬の別の態様は、本発明の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、穂発芽耐性を検出するための試薬である。
これらは本発明の多型部位を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、当業者に公知の方法で行なうことができる。
Various reagents, enzyme substrates, buffers and the like can be combined with the reagent of the present invention depending on the method for determining the base species. Examples of the enzyme include enzymes necessary for various analysis methods exemplified as the above-described base species determination method, such as DNA polymerase, DNA ligase, or IIs restriction enzyme. As the buffer solution, a buffer solution suitable for maintaining the activity of the enzyme used for these analyzes is appropriately selected. Furthermore, as the enzyme substrate, for example, a substrate for complementary strand synthesis is used.
Furthermore, another embodiment of the reagent in the present invention is a reagent for detecting panicle germination resistance, which comprises a solid phase on which a nucleotide probe that hybridizes with the DNA containing the polymorphic site of the present invention is immobilized.
These are used for examinations using the polymorphic site of the present invention as an index. These preparation methods can be carried out by methods known to those skilled in the art.
本発明は、以下の(a)および(b)に記載の工程を含む、種子休眠を制御する機能を有する植物を選抜する方法を提供する。
(a)穂発芽耐性を有する植物と任意の機能を有する植物とが交配された品種を作製する工程
(b)上述の方法により、工程(a)で作製された植物の穂発芽耐性を検出する工程
上記方法により、高い穂発芽耐性を有する植物を選抜することができる。
The present invention provides a method for selecting a plant having a function of controlling seed dormancy, comprising the steps described in the following (a) and (b).
(A) A step of producing a variety in which a plant having an ear germination resistance and a plant having an arbitrary function are crossed (b) The ear germination resistance of the plant produced in the step (a) is detected by the above-described method. Process By the said method, the plant which has high ear germination tolerance can be selected.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例1〕 Sdr4遺伝子座について
量的形質遺伝子座(QTL)のSdr4は第7染色体上、RFLPマーカーであるR1245近傍に見いだされた(Lin et al. TAG 96:997-1003, 1998)。生理実験の実験材料として用いた準同質遺伝子系統は以下の通り作成した。日本晴/KasalathのF1に日本晴を4回戻し交雑し、1回の自殖を行ったBC4F2系統の中から 第7染色体83.0〜94.5cMの領域のみがヘテロ型になっている個体(98F2-23-140)を選抜した。次に98F2-23-140の自殖種子を99F2-50(n=50)を展開し、第7染色体83.0〜94.5cMの領域のみがホモ型になっている個体(99F2-50-14)を選抜し、これを準同質遺伝子系統[NIL (Sdr4)]として用いた。準同質遺伝子系統[NIL(Sdr4)]と日本晴、そして、Kasalathの発芽率の変化を経時的に比較したところ、日本晴あるいはKasalathに比べてNIL(Sdr4)は5週目から8週目に至るまで発芽を強く抑制し、深い休眠性を付与する効果が認められた(図1)。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Sdr4 locus Sdr4 of the quantitative trait locus (QTL) was found in the vicinity of R1245, an RFLP marker, on chromosome 7 (Lin et al. TAG 96: 997-1003, 1998). Near-isogenic lines used as experimental materials for physiological experiments were prepared as follows. Nipponbare / Kasalath F1 backbred four times, and only one region of chromosome 73.0-94.5cM was heterozygous from the BC4F2 line that had self-bred (98F2-23- 140) was selected. Next, 99F2-50 (n = 50) of 98F2-23-140 self-propagating seeds were expanded, and an individual (99F2-50-14) in which only the region of chromosome 7 83.0-94.5cM was homozygous This was selected and used as a near-isogenic line [NIL (Sdr4)]. Comparison of changes in germination rates of near-isogenic lines [NIL (Sdr4)], Nipponbare, and Kasalath over time revealed that NIL (Sdr4) is from 5th to 8th week compared to Nipponbare or Kasalath. The effect which suppressed germination strongly and gave deep dormancy was recognized (FIG. 1).
〔実施例2〕 高精度連鎖解析
連鎖解析用の集団は日本晴とKasalathの戻し交雑後代系統世代を用いた。戻し交雑後代からSdr4領域がヘテロ型となり、他のゲノム領域の大部分が日本晴に置換された個体を選抜した。はじめに選抜個体の自殖後代100個体(F2集団相当)とその後代検定による連鎖解析を行った結果、Sdr4領域は、InDelマーカーであるSdr4-IND3(プライマー5'- TTTGTTTTCCCCGTGAGGTT -3'(配列番号:13)およびプライマー5'- GTCATAATTAAGCAGCCTATGGGTC -3'(配列番号:14))とSdr4-IND8(プライマー5'- ACACACCATTGTTCCAAGCA -3'(配列番号:15)およびプライマー5'- GGTCACAACTGATAGGCCAAC -3'(配列番号:16))の間に位置づけられた(図2B)。次にマップベースクローニングに不可欠な大規模分離集団によるSdr4領域の連鎖解析を行った。Sdr4の分離集団2,515個体(F2集団相当)から、Sdr4を挟むマーカーであるRM3753とRM6042を用いてSdr4近傍に生じた組換え染色体を持つ60個体を選抜した。Sdr4の候補ゲノム領域内での組換え個体を同定するために、選抜した60個体についてSdr4-IND3とSdr4-IND8によるタイピングを行い、マッピングに利用できる個体をさらに28個体に絞り込んだ。これら28個体の後代系統(F3系統相当)を圃場に展開し、組み換え染色体ならびに非組み換え染色体がホモ化した個体をそれぞれ選抜した。遺伝子領域を狭めるために、日本晴ゲノム塩基配列とホールゲノムショットガン法により読まれたインディカ93-11の塩基配列を比較し、日本晴/Kasalath間で多型が出ることが予想される断片が増幅出来るプライマーを合成し、マッピングを行った。これによりRM3753とRM6042の間に19個のPCRマーカーを作成した。これらの固定系統(F4系統相当)を圃場で栽培し、出穂後6週間での穂発芽性程度を調べた結果、Sdr4の候補領域はCAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)マーカーであるSdr4-SNP24(プライマー5'- GCCTTCTTAACCCCACCAC -3'(配列番号:17)およびプライマー5'- CTGAACCTCGCCATGATCTC -3'(配列番号:18)、制限酵素 AluI )とSNPマーカーであるSdr4-SNP28(プライマー5'- AACAAGCAACAGCTGACGTG -3'(配列番号:19)およびプライマー5'- TAATGCACCGCAACTATCCA -3'(配列番号:20)、SNP用プライマー 5'- GGAAATCATGCACAACCCTAAAAT -3'(配列番号:21))で挟まれた8.7kbpの領域に絞り込まれた(図2C)。
[Example 2] High-accuracy linkage analysis The population for linkage analysis used the generation of backcross progenies of Nipponbare and Kasalath. From the backcross progeny, individuals were selected in which the Sdr4 region was heterozygous and most of the other genomic regions were replaced with Nipponbare. First, as a result of conducting linkage analysis by 100 progeny progenies of the selected individuals (corresponding to F2 population) and their progeny test, the Sdr4-IND3 (primer 5'-TTTGTTTTCCCCGTGAGGTT -3 '(SEQ ID NO: 13) and primer 5′-GTCATAATTAAGCAGCCTATGGGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)) and Sdr4-IND8 (primer 5′-ACACACCATTGTTCCAAGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 15) and primer 5′-GGTCACAACTGATAGGCCAAC-3 ′ (SEQ ID NO :) 16)) (Fig. 2B). Next, linkage analysis of the Sdr4 region was performed using a large-scale segregation population essential for map-based cloning. From 2,515 individuals of Sdr4 segregated population (corresponding to F2 population), 60 individuals having recombinant chromosomes generated in the vicinity of Sdr4 were selected using RM3753 and RM6042 which are markers sandwiching Sdr4. In order to identify recombinant individuals within the candidate genomic region of Sdr4, the selected 60 individuals were typed with Sdr4-IND3 and Sdr4-IND8, further narrowing down to 28 individuals that could be used for mapping. These 28 progeny lines (corresponding to the F3 line) were developed in the field, and individuals with homologous recombinant chromosomes and non-recombinant chromosomes were selected. To narrow the gene region, compare the Nipponbare genome sequence with the base sequence of Indica 93-11 read by the whole genome shotgun method, and amplify the fragment that is expected to show polymorphism between Nipponbare / Kasalath Primers were synthesized and mapped. This produced 19 PCR markers between RM3753 and RM6042. As a result of cultivating these fixed lines (corresponding to F4 line) in the field and examining the degree of ear germination at 6 weeks after heading, the candidate region of Sdr4 is the Sdr4-SNP24 (primer) that is a CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) marker. 5'- GCCTTCTTAACCCCACCAC-3 '(SEQ ID NO: 17) and primer 5'- CTGAACCTCGCCATGATCTC-3' (SEQ ID NO: 18), restriction enzyme AluI) and Sdr4-SNP28 (primer 5'- AACAAGCAACAGCTGACGTG -3 ' (SEQ ID NO: 19) and primer 5'-TAATGCACCGCAACTATCCA-3 '(SEQ ID NO: 20), SNP primer 5'- GGAAATCATGCACAACCCTAAAAT-3' (SEQ ID NO: 21)). (FIG. 2C).
〔実施例3〕 候補遺伝子領域の解析
KasalathのBACライブラリーからSdr4の候補領域を含むBACをPCRによりスクリーニングし、Sdr4の候補領域8.7kbpを含むNruI断片11.6kbpをクローン化するとともに塩基配列を決定した。日本晴とKasalathの間の一塩基多型は72箇所で、挿入欠失は4箇所で見られた。この候補領域を含むゲノム塩基配列をRiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)により解析した結果、3つの予測遺伝子が存在した(図3A)。3つの候補遺伝子を対象とし、ノーザンブロットあるいはRT-PCRによる発現の解析を行った結果、候補遺伝子1(Sdr4C1)と候補遺伝子2(Sdr4C2)は穂での発現が見られた(図4)。両候補遺伝子ともに、日本晴とKasalathの間でアミノ酸置換を伴う一塩基多型は認められるものの、機能の喪失が容易に予測されるような塩基多型は見出すことができなかった。
[Example 3] Analysis of candidate gene region
A BAC containing the Sdr4 candidate region was screened by PCR from the Kasalath BAC library, and the NruI fragment 11.6 kbp containing the Sdr4 candidate region 8.7 kbp was cloned and the nucleotide sequence was determined. There were 72 single nucleotide polymorphisms between Nipponbare and Kasalath, and insertion deletions were found at 4 sites. As a result of analyzing the genomic base sequence containing this candidate region by RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/), there were three predicted genes (FIG. 3A). As a result of analyzing the expression by Northern blot or RT-PCR for three candidate genes, candidate gene 1 (Sdr4C1) and candidate gene 2 (Sdr4C2) were expressed in ears (FIG. 4). In both candidate genes, single nucleotide polymorphisms with amino acid substitutions were observed between Nipponbare and Kasalath, but no nucleotide polymorphisms that could easily be predicted to lose function could not be found.
〔実施例4〕 Sdr4遺伝子の特定のための相補試験
Sdr4候補領域8.7kbpとその前後を含むKasalath由来のNruI断片11.6kbpと候補遺伝子1の転写開始点と第一エキソンを含む0.4kbpの領域を欠失した断片をpPZP2H-lac(Fuse et al. Plant Biotechnology 18:219-222, 2001)に組込み、アグロバクテリウムを介して日本晴に導入した。形質転換体の後代(T1)のDNAを抽出しサザンハイブリダイゼーションにより導入遺伝子をホモに持つ固定系統を選抜した。固定系統の種子の発芽試験を行った結果、11.6kbpのKasalath断片を導入した系統では発芽率が低下した(図3B)。また、候補遺伝子1の欠失変異体を導入した系統でも発芽率の低下が見られた。この結果から、Sdr4は11.6kbp断片上に存在するが、候補遺伝子1ではないことが明らかとなった。つぎに、候補遺伝子2を持つKasalath由来の3.3kbpの断片を用いた相補試験を行った。形質転換当代(T0)の種子(T1)を用い、発芽試験を行った結果、ベクターコントロールに比べ発芽率が低下していた(図3C)。この結果から、Sdr4の本体は候補遺伝子2であることが明らかとなった。オリゴキャップ法による5'RACEおよび3'RACEにより完全長cDNAを得た。アミノ酸配列は予測遺伝子と同じものであった(図5)。
[Example 4] Complementary test for identification of Sdr4 gene
An Ndr fragment of 11.6 kbp derived from Kasalath including 8.7 kbp of Sdr4 candidate region and its surrounding region, and a fragment of 0.4 kbp region including the transcription start point of candidate gene 1 and the first exon were deleted from pPZP2H-lac (Fuse et al. Plant Biotechnology 18: 219-222, 2001) and introduced into Nipponbare via Agrobacterium. The progeny (T1) DNA of the transformant was extracted, and a fixed line having the transgene homozygous was selected by Southern hybridization. As a result of the germination test of the seeds of the fixed line, the germination rate decreased in the line into which the 11.6 kbp Kasalath fragment was introduced (FIG. 3B). In addition, the germination rate was reduced even in the lines into which the deletion mutant of candidate gene 1 was introduced. From this result, it was clarified that Sdr4 is present on the 11.6 kbp fragment but not candidate gene 1. Next, a complementation test was performed using a 3.3 kbp fragment derived from Kasalath having candidate gene 2. As a result of the germination test using the seed (T1) of the current generation (T0), the germination rate was reduced compared to the vector control (FIG. 3C). From this result, it was revealed that the main body of Sdr4 is candidate gene 2. Full-length cDNA was obtained by 5'RACE and 3'RACE by the oligo cap method. The amino acid sequence was the same as the predicted gene (FIG. 5).
〔実施例5〕 Sdr4遺伝子のノックダウン系統による機能解析
候補遺伝子2がSdr4本体であることを証明するとともに日本晴およびKasalathのSdr4遺伝子の機能を比較するために、RNAiによるSdr4遺伝子のノックダウン系統を作成した。T1個体に実った種子について、出穂後5週間での発芽率を調べた結果、ベクターコントロールに比べて発芽率が上昇していた。この発芽率の増加は、日本晴のノックダウン系統ならびにNIL(Sdr4)のノックダウン系統ともに観察されたことから、日本晴、およびKasalathいずれのSdr4遺伝子も発芽抑制の機能を持つことが示された(図6)。Kasalath由来のSdr4をもつNIL(Sdr4)はその反復親である日本晴よりも高い穂発芽耐性を示したことから、Kasalath由来のSdr4の方が発芽抑制能が高いことが推測される。本実施例で使用したsiRNAの配列を配列番号:10に示す。
[Example 5] Functional analysis by knockdown strain of Sdr4 gene In order to prove that candidate gene 2 is the main body of Sdr4 and to compare the functions of Sdr4 gene of Nipponbare and Kasalath, a knockdown strain of Sdr4 gene by RNAi was selected. Created. As a result of examining the germination rate of seeds grown in T1 individuals at 5 weeks after heading, the germination rate was higher than that of the vector control. This increase in germination rate was observed in both the Nipponbare knockdown line and the NIL (Sdr4) knockdown line, indicating that both the Nipponbare and Kasalath Sdr4 genes have germination-inhibiting functions (Fig. 6). Since NIL (Sdr4) having Sdr4 derived from Kasalath showed higher ear germination resistance than its recurrent parent, Nipponbare, it is speculated that Sdr4 derived from Kasalath has higher germination-inhibiting ability. The sequence of the siRNA used in this example is shown in SEQ ID NO: 10.
〔実施例6〕 易穂発芽系統からのSdr4ミュータントの単離
ミュータントパネルから選抜した12種類の易穂発芽変異系統のDNAを鋳型としてSdr4遺伝子のコード領域の塩基配列を決定した。その結果、3つの系統においてSdr4遺伝子上に同じ21塩基の欠失変異が見いだされた(図5、M25)。見出されたそれぞれの系統のうち、欠失変異をヘテロにもつ個体に実った種子を、圃場で栽培し、出穂後5週間目の種子の発芽率を調べた結果、分離した野生型Sdr4を持つ系統では2〜5%の発芽率を示すのに対して、欠失変異をヘテロに持った変異系統に実った種子の発芽率は31〜33%であった(図7)。さらに、日本晴が1.9%の発芽率を示すのに対し、分離した変異をホモに持つ系統の自殖種子の発芽率はM25系統で100%、M100系統で99.3%もの発芽率を示した。これらの結果からも、Sdr4の本体が候補遺伝子2であること、日本晴のSdr4にも発芽抑制能があることが示された。
[Example 6] Isolation of Sdr4 mutant from easy-to-sproute germinating line The nucleotide sequence of the coding region of the Sdr4 gene was determined using as a template the DNA of 12 kinds of easy-to-sproute mutant lines selected from the mutant panel. As a result, the same 21-base deletion mutation was found on the Sdr4 gene in the three strains (FIG. 5, M25). Of the lines found, seeds that were born to individuals with heterozygous deletion mutations were cultivated in the field, and the germination rate of seeds 5 weeks after heading was examined. The germination rate of 2 to 5% was shown in the lines having the seeds, while the germination rate of seeds in the mutant lines having the deletion mutation in heterogeneity was 31 to 33% (FIG. 7). Furthermore, Nipponbare showed a germination rate of 1.9%, while the germination rate of the self-propagating seeds of the line having the isolated mutation was 100% for the M25 line and 99.3% for the M100 line. From these results, it was shown that the main body of Sdr4 is candidate gene 2 and that Sdr4 from Nipponbare also has the ability to suppress germination.
〔実施例7〕 シロイヌナズナ同祖体遺伝子の解析
Sdr4のアミノ酸配列をクエリーとしてシロイヌナズナの類似の遺伝子を検索した結果、7つの類似の遺伝子が見いだされた(図8A)。もっとも類似性の高い、遺伝子名が記載されていないため、AtSdr4L1と命名した(図8B)。AtSdr4L1のT-DNAタグラインを得て、挿入変異をヘテロにもつ系統、ホモに持つ系統をPCRにより選抜し、それぞれの遺伝子型毎の発芽率を調べた結果、分離した野生型では平均95%の発芽率を示すのに対してT-DNAの挿入によりAtSdr4L1が破壊された系統は発芽率が14%に低下することが示された。また、変異をヘテロに持つ系統は80%の発芽率を示した(図8C)。イネのSdr4は発芽を抑制しているが、シロイヌナズナでもっとも類似性の高い遺伝子、AtSdr4L1は逆の機能を有することが示された。
[Example 7] Analysis of Arabidopsis homozygous gene
As a result of searching for similar genes in Arabidopsis using the amino acid sequence of Sdr4 as a query, seven similar genes were found (FIG. 8A). Since the most similar gene name was not described, it was named AtSdr4L1 (FIG. 8B). We obtained the AtSdr4L1 T-DNA tag line, selected the lines with heterozygous insertion mutations and lines with homozygous mutations by PCR, and examined the germination rate for each genotype. The germination rate was reduced to 14% in the strain in which AtSdr4L1 was destroyed by T-DNA insertion. In addition, the line heterozygously showed a germination rate of 80% (FIG. 8C). Rice Sdr4 suppressed germination, but the most similar gene in Arabidopsis, AtSdr4L1, was shown to have the opposite function.
〔実施例8〕 日本晴型Sdr4とKasalath型Sdr4を判別するマーカー
日本晴型Sdr4(配列番号:2)の2280番目のシトシン(C)はKasalath型ではチミン(T)となる一塩基多形が存在する。当該部位を含む領域は、2280番目の塩基がTの場合には、PstIの制限酵素認識部位(CTGCAG)となる(図9)。そこで、当該領域をプライマー2229F:5' CCACGTCGAGTCAGTCCAC 3'(配列番号:11)および2622R:5' CGAAGACGTAGTCCCTCGAC 3'(配列番号:12)を用いてPCRにより増幅した後、PstI処理を行なった。
その結果、カサラース型のSdr4を持つイネのPCR増幅断片はPstIにより切断され、360 bpとなったが、日本晴型Sdr4を持つイネは切断されず、413 bpのPCR産物が検出された(図9)。以上より、日本晴型Sdr4(配列番号:2)の2280番目のシトシンが、日本晴型Sdr4とKasalath型Sdr4を判別するマーカーとして使用できることが明らかとなった。
[Example 8] Marker for discriminating Nipponbare type Sdr4 and Kasalath type Sdr4 The 2280th cytosine (C) of Nipponbare type Sdr4 (SEQ ID NO: 2) has a single nucleotide polymorphism that becomes thymine (T) in Kasalath type. . When the 2280th base is T, the region containing the site is a restriction enzyme recognition site (CTGCAG) of PstI (FIG. 9). Therefore, the region was amplified by PCR using primers 2229F: 5 ′ CCACGTCGAGTCAGTCCAC 3 ′ (SEQ ID NO: 11) and 2622R: 5 ′ CGAAGACGTAGTCCCTCGAC 3 ′ (SEQ ID NO: 12), and then treated with PstI.
As a result, the PCR-amplified fragment of rice with Kasaras-type Sdr4 was cleaved with PstI to 360 bp, but rice with Nipponbare-type Sdr4 was not cleaved, and a 413 bp PCR product was detected (FIG. 9). ). From the above, it has been clarified that the 2280th cytosine of Nipponbare-type Sdr4 (SEQ ID NO: 2) can be used as a marker for discriminating between Nipponbare-type Sdr4 and Kasalath-type Sdr4.
Claims (27)
(a)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:3または6に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1、2、4または5に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(e)配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(f)配列番号:8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(g)配列番号:9に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(h)配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA The DNA according to any one of (a) to (h) below, which encodes a plant-derived protein having a function of controlling plant seed dormancy.
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 6
(B) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 6
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5
(E) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9
(F) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8
(G) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9
(H) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8
(a)請求項1または2に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA
(b)請求項1または2に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
(c)植物細胞における発現時に、RNAi効果により、請求項1または2に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
(d)植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項1または2に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA The DNA according to any one of (a) to (d) below.
(A) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA according to claim 1 or 2
(B) DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the DNA of claim 1 or 2
(C) DNA encoding RNA that suppresses the expression of DNA according to claim 1 or 2 due to RNAi effect during expression in plant cells
(D) DNA encoding an RNA that suppresses the expression of the DNA according to claim 1 or 2 due to a co-suppression effect during expression in plant cells
(a)配列番号:7に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:7に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA The DNA according to (a) or (b) below, which is a mutant of the protein according to claim 1 and encodes a plant-derived protein lacking the function of controlling seed dormancy of the plant.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7
(B) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
(a)被検植物における請求項1に記載のDNAに相当する部位における多型部位の塩基種を決定する工程
(b)(a)で決定された多型部位の塩基種において、配列番号:4または5と同型となる変異が検出された場合に、被検植物は穂発芽耐性を有すると判定する工程 A method for detecting ear germination resistance of a test plant, comprising the following steps (a) and (b).
(A) Step of determining the base type of the polymorphic site in the site corresponding to the DNA of claim 1 in the test plant (b) In the base type of the polymorphic site determined in (a), SEQ ID NO: A step of determining that the test plant has ear germination resistance when a mutation that is the same type as 4 or 5 is detected
(a)穂発芽耐性を有する植物と任意の機能を有する植物とが交配された品種を作製する工程、
(b)請求項18に記載の方法により、工程(a)で作製された植物の穂発芽耐性を検出する工程。 A method for selecting a plant having a function of controlling seed dormancy, comprising the steps of (a) and (b) below:
(A) a step of producing a variety in which a plant having an ear germination resistance and a plant having an arbitrary function are crossed,
(B) The process of detecting the ear germination tolerance of the plant produced at the process (a) by the method of Claim 18.
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040123343A1 (en) * | 2000-04-19 | 2004-06-24 | La Rosa Thomas J. | Rice nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
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---|---|---|---|---|
US20040123343A1 (en) * | 2000-04-19 | 2004-06-24 | La Rosa Thomas J. | Rice nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6012010088; Rosa T.J.L. et al.: 'PAT_MRT4530_15659C.1' Publication Site for Issued and Published Sequences (PSIPS)[online] , 20040624, SEQ ID No.9222 & 111705, United States Patent and Trademark Office * |
JPN6012010092; 中村義一 編: 遺伝子医学MOOK RNAと創薬 p.132-137,143-151,158-164, 20060131, 株式会社 メディカル ドゥ * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101622942B1 (en) | 2011-06-21 | 2016-05-20 | 서울대학교산학협력단 | Genes involved in controlling seed germination and chromatin structure and uses thereof |
CN110511271A (en) * | 2019-07-30 | 2019-11-29 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | Arabidopsis seed dormancy regulatory factor SUR1 gene and its application |
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