JP6470535B2 - Rice or wheat in which expression or activity of the Sdr1 gene is suppressed - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
本発明はSdr1遺伝子の発現又は活性が抑制されたイネ又はコムギに関する。 The present invention relates to rice or wheat in which the expression or activity of the Sdr1 gene is suppressed.
本明細書に引用されたすべての刊行物の内容を、本明細書の一部として援用する。
植物の種子は、成熟に伴いその発芽能力を獲得すると、適当な栽培環境（温度や光）が提供されるまで、自ら発芽を抑制する機能をもつ。一般に、この現象を種子休眠という。種子休眠は、作物が栽培化されるにしたがって、その程度が小さくなり、最近の品種・系統では、種子休眠性が弱くなったものが多い。種子休眠性が弱くなると、収穫前の種子でも、発芽に好ましい温度や水分が与えられることで、発芽がおこる（穂発芽性）。イネでは、穂発芽が生じることにより玄米品質の低下が生じることが問題となっている。また特に、本来は乾燥した気候を好むコムギにとって、日本の湿潤な気候は穂発芽被害を発生しやすく、被害も大きい。このように穂発芽した種子は品質が大きく低下することから、農業上大きな問題となっており、穂発芽耐性の付与は穀類の育種上重要な目標となっている。
The contents of all publications cited herein are hereby incorporated by reference.
When the seeds of plants acquire their germination ability as they mature, they have the function of suppressing germination themselves until an appropriate cultivation environment (temperature and light) is provided. In general, this phenomenon is called seed dormancy. Seed dormancy has become smaller as crops are cultivated, and many recent varieties and lines have weakened seed dormancy. When seed dormancy is weakened, germination occurs even when the seeds are harvested by giving a temperature and moisture suitable for germination (ear germination). In rice, the problem is that brown rice quality deteriorates due to the occurrence of ear germination. In particular, for wheat, which prefers a dry climate, the wet climate in Japan is prone to sprouting damage and the damage is significant. The seeds that have been sprouted in this manner have a large problem in agriculture because the quality of the seeds is greatly reduced, and imparting resistance to sprout germination is an important target for breeding cereals.
これまでに種子休眠性又は穂発芽性に関わる遺伝子についての報告がなされており、本発明者らによっても、種子休眠を制御するSdr4遺伝子について報告されている（特許文献１）。しかし、種子休眠性は、複数の遺伝子の作用により決定される形質であり、種子休眠性に関与する新規遺伝子のさらなる同定と、穂発芽耐性が改良された新規イネ及びコムギの作出が求められている。 There have been reports on genes related to seed dormancy or ear germination, and the present inventors have also reported on the Sdr4 gene that controls seed dormancy (Patent Document 1). However, seed dormancy is a trait determined by the action of multiple genes. Further identification of new genes involved in seed dormancy and the creation of new rice and wheat with improved ear germination resistance are required. Yes.
Mitogen-acticated Protein Kinase（MAPK）カスケードが植物の成長や発生において重要な役割を有していることが知られている。MAPKカスケードは、細胞外の刺激と細胞内での応答をつなぐシグナル伝達系である。MAPKカスケードは動物、酵母及び植物において進化的に保存されている。MAPKカスケードは3種類のタンパク質リン酸化酵素、MAPKs、MAPK kinases（MAPKKs／MEKs）、及びMAPK kinase kinases（MAPKKKs／MEKKs）によって構成されている．MAPKsはMAPKKsによってリン酸化され、活性化する。MAPKKKsは細胞外刺激によって活性化され、MAPKKs中に存在するS/TXXXXX(S/T)配列中のセリン残基およびセリン又はトレオニン残基をリン酸化することにより、MAPKKsを活性化する。イネの全ゲノム塩基配列データに基づき、イネのMAPKKKsをコードすると考えられる75種類のイネMAPKKK遺伝子が同定されている（Rao K et al. In silico analysis reveals 75 members of mitogen-activated protein kinase kinae kinase gene family in rice. DNA Research 17:139-153. (2010)）。これらの遺伝子はその配列上の特徴に基づいて、Rafサブファミリー（43種類）、MEKKサブファミリー（22種類）、及びZIKサブファミリー（10種類）に分類される。 It is known that the Mitogen-acticated Protein Kinase (MAPK) cascade has an important role in plant growth and development. The MAPK cascade is a signal transduction system that connects extracellular stimuli and intracellular responses. The MAPK cascade is evolutionarily conserved in animals, yeast and plants. The MAPK cascade consists of three types of protein kinases, MAPKs, MAPK kinases (MAPKKs / MEKs), and MAPK kinase kinases (MAPKKKs / MEKKs). MAPKs are phosphorylated and activated by MAPKKs. MAPKKKs are activated by extracellular stimuli and activate MAPKKs by phosphorylating serine residues and serine or threonine residues in S / TXXXXX (S / T) sequences present in MAPKKs. Based on the whole genome sequence data of rice, 75 types of rice MAPKKK genes that are thought to encode rice MAPKKKs have been identified (Rao K et al. In silico analysis reveals 75 members of mitogen-activated protein kinase kinae kinase gene family in rice. DNA Research 17: 139-153. (2010)). These genes are classified into Raf subfamily (43 types), MEKK subfamily (22 types), and ZIK subfamily (10 types) based on their sequence characteristics.
MAPKKKsはタンパク質リン酸化酵素の１種である。これまでに数多くのタンパク質リン酸化酵素のアミノ酸配列が報告され、そのうちの20種以上の酵素の立体構造がＸ線結晶構造解析により明らかにされている（Hanks S and Quinn A. Proteon kinase catalytic domain sequence database: Identification of conserved features of primary structure and classification of family members. Methods in Enzymology 200, 38-62.(1991); Knighton D et al.Crystal structure of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. Science 253, 407-414.(1991); Taylor S and Radzio E. Three protein kinase structures define a common motif. Structure 2, 345-355.(1994); Nolen et al. Regulation of protein kinases: controlling activity through activation segment conformation. Molecular Cell 15, 661-675.(2004)）。その結果、タンパク質リン酸化酵素は、約250の連続したアミノ酸残基からなるキナーゼ触媒ドメイン（kinase catalytic domain）を有し、キナーゼ触媒ドメインにおけるアミノ酸配列がすべてのタンパク質リン酸化酵素においてよく保存されていることが知られており、当該ドメインに含まれるアミノ酸残基がタンパク質リン酸化酵素の酵素活性にとって重要であると考えられている。また、タンパク質リン酸化酵素の触媒部位（catalytic site）がキナーゼ触媒ドメインに含まれること、種々のタンパク質リン酸化酵素のキナーゼ触媒ドメインは互いによく似た立体構造を有すること、キナーゼ触媒ドメイン中の特定の８つのアミノ酸残基がすべてのタンパク質リン酸化酵素のアミノ酸配列において保存されていることが知られており、それらの保存されたアミノ酸残基がタンパク質リン酸化酵素の活性にとって必須であると考えられている。
すべてのキナーゼ触媒ドメインにおいて保存されているアミノ酸残基は以下のような機能を有している。保存されているアミノ酸残基の位置を、代表的なタンパク質リン酸化酵素であるヒトcAMP依存性タンパク質リン酸化酵素（human cAMP-dependent protein kinase、「human protein kinase A」とも呼ばれることがある。）における残基番号（Maldonaldo F and Hanks S, A cDNA clone encoding human cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit Calpha. Nucleic Acids Research 16, 8189-8190.(1988)）で示す。52番目のグリシン残基は酵素とリン酸化反応の基質であるアデノシンー5’―3リン酸のβリン酸基との結合に関与する。72番目のリジン残基はアデノシンー5’―3リン酸のα及びβリン酸基とイオン対（ion pair）を形成する。91番目のグルタミン酸残基は72番目のリジン残基とイオン対を形成する。166番目のアスパラギン酸残基はリン酸化反応の触媒部位である。171番目のアスパラギン残基及び184番目のアスパラギン酸残基はアデノシンー5’―3リン酸に配位するマグネシウムイオンに配位してリン酸化反応を促進する。208番目のグルタミン酸残基及び280番目のアルギニン残基はイオン対を形成して触媒部位付近のタンパク質の立体構造を安定化する。
従って、タンパク質リン酸化酵素においてこれら保存されているアミノ酸残基の少なくとも一つが欠失し又は他のアミノ酸残基に置換した場合には、そのような変異を有する酵素はタンパク質リン酸化酵素活性を大幅に低下させるか又は喪失すると考えられる。
MAPKKKs are a type of protein kinase. The amino acid sequences of a number of protein kinases have been reported so far, and the three-dimensional structures of more than 20 of them have been clarified by X-ray crystallographic analysis (Hanks S and Quinn A. Proteon kinase catalytic domain sequence). database: Identification of conserved features of primary structure and classification of family members.Methods in Enzymology 200, 38-62. (1991); Knighton D et al. Crystal structure of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. Science 253, 407 -414. (1991); Taylor S and Radzio E. Three protein kinase structures define a common motif.Structure 2, 345-355. (1994); Nolen et al. Regulation of protein kinases: controlling activity through activation segment conformation. Cell 15, 661-675. (2004)). As a result, protein kinase has a kinase catalytic domain consisting of about 250 consecutive amino acid residues, and the amino acid sequence in the kinase catalytic domain is well conserved in all protein kinases. It is known that amino acid residues contained in the domain are important for the enzyme activity of protein kinase. In addition, the catalytic site of protein kinase is included in the kinase catalytic domain, the kinase catalytic domains of various protein kinases have similar conformations, and specific kinase Eight amino acid residues are known to be conserved in the amino acid sequences of all protein kinases, and these conserved amino acid residues are considered essential for protein kinase activity. Yes.
The amino acid residues conserved in all kinase catalytic domains have the following functions. The position of the conserved amino acid residue in human cAMP-dependent protein kinase (also referred to as human cAMP-dependent protein kinase, sometimes referred to as “human protein kinase A”), which is a typical protein kinase. It is indicated by the residue number (Maldonaldo F and Hanks S, A cDNA clone encoding human cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit Calpha. Nucleic Acids Research 16, 8189-8190. (1988)). The 52nd glycine residue is involved in the binding of the enzyme to the β-phosphate group of adenosine-5'-3 phosphate, which is a substrate for phosphorylation. The 72nd lysine residue forms an ion pair with the α and β phosphate groups of adenosine-5′-3 phosphate. The 91st glutamic acid residue forms an ion pair with the 72nd lysine residue. The 166th aspartic acid residue is a catalytic site for phosphorylation. The 171st asparagine residue and the 184th aspartic acid residue are coordinated to a magnesium ion coordinated to adenosine-5′-3 phosphate to promote phosphorylation. The 208th glutamic acid residue and the 280th arginine residue form an ion pair and stabilize the three-dimensional structure of the protein near the catalytic site.
Therefore, when at least one of these conserved amino acid residues is deleted or substituted with another amino acid residue in protein kinase, an enzyme having such a mutation significantly increases protein kinase activity. It is thought to be reduced or lost.
インディカイネであるカサラス（Kasalath）は、ジャポニカイネである日本晴と比較して、種子休眠性が高く、穂発芽耐性が高い。日本晴を反復親としたカサラスの戻し交雑後代系統を用いたQTL解析により、イネの穂発芽耐性に関わる量的形質遺伝子座が複数見出されていた。本発明者らは、上記遺伝子座のなかでも穂発芽耐性に対して顕著な関与を示したSdr1遺伝子座に着目し、マップベースクローニング法によるSdr1遺伝子座の同定を試み、Sdr1遺伝子座がイネ第３染色体短腕に座位することを明らかにした（非特許文献１および非特許文献２）。
しかし、Sdr1遺伝子座が穂発芽耐性を制御する遺伝子座であることが示されはしたが、その原因遺伝子が何であるか、さらには、その原因遺伝子が発芽を促進する機能を有する遺伝子であるのか、発芽を抑制する機能を有する遺伝子であるのか等についてなどは不明である。
したがって、本発明は、Sdr1遺伝子座の原因遺伝子であり、穂発芽耐性に関わる新規遺伝子であるSdr1遺伝子を同定し、高い穂発芽耐性を有するイネ又はコムギを提供することを課題とする。
Kasalath, an indica rice, has higher seed dormancy and higher ear germination resistance than Nipponbare, a japonica rice. QTL analysis using Kasaras back-cross progeny with Nipponbare as the recurrent parent found multiple quantitative trait loci related to rice germination resistance. The present inventors focused on the Sdr1 locus that showed a significant involvement in ear germination resistance among the above-mentioned loci, tried to identify the Sdr1 locus by map-based cloning, and the Sdr1 locus was found in rice. It was clarified that it is located on the short arm of chromosome 3 (Non-patent Document 1 and Non-patent Document 2).
However, although it was shown that the Sdr1 locus is a locus that controls ear germination resistance, what is the causative gene, and whether the causative gene has a function of promoting germination? Whether the gene has a function of suppressing germination or the like is unknown.
Therefore, an object of the present invention is to identify a Sdr1 gene, which is a causative gene of the Sdr1 locus and is related to ear germination resistance, and to provide rice or wheat having high ear germination resistance.
本発明者らは、上記課題を解決すべくマップベースクローニング法を利用して鋭意研究を行った。マップベースクローニングにおいて指標とした穂発芽耐性は環境による影響を強く受けることから、解析系統数を多数扱い、かつ反復の数を大きくし、複数年次の評価が必要である。さらに、Sdr1遺伝子の機能の確認には隔離温室での穂発芽耐性の再現が必要であった。
2375個体の大規模集団（F2集団相当）による連鎖解析を行った結果、Sdr1遺伝子の候補領域を2528bpの範囲にまで絞り込み、穂発芽耐性に関わるSdr1遺伝子を同定することに成功した。さらに、イネのSdr1遺伝子がイネのOsMAPKKK73遺伝子（Rao K et al. In silico analysis reveals 75 members of mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family in rice. DNA Research 17:139-153. (2010)）と同一であることを見出した。OsMAPKKK73はMEKKサブファミリーに属するMAPKKKsの一つである。また、イネSdr１遺伝子の発現が種子による吸水直後に開始されることを見出した。さらに、日本晴に比較して高い穂発芽耐性を有するカサラスの場合、種子による吸水後におけるSdr1遺伝子の発現レベルが日本晴の種子の吸水後におけるSdr1遺伝子の発現レベルと比較して低いことを見出した。これらのことから、種子による吸水後に発現するSdr1遺伝子産物、すなわちOsMAPKKK73が、種子の発芽に関与する遺伝子の発現を活性化するシグナル伝達系の一つに関与していると考えられる。次いで、コムギのSdr1遺伝子を単離し、該遺伝子の発現が種子による吸水直後に開始されることを見出した。以上の結果に基づき、内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性を制御することによりイネ及びコムギの穂発芽耐性を制御できることを見出し、本発明を完成させた。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted extensive research using a map-based cloning method. Since the germination tolerance as an index in map-based cloning is strongly influenced by the environment, it is necessary to evaluate multiple years with a large number of analysis lines and a large number of repeats. Furthermore, to confirm the function of the Sdr1 gene, it was necessary to reproduce the ear germination resistance in an isolated greenhouse.
As a result of linkage analysis using a large-scale population of 2375 individuals (corresponding to the F2 population), the Sdr1 gene candidate region was narrowed down to the range of 2528 bp, and the Sdr1 gene involved in panicle germination resistance was successfully identified. Furthermore, the rice Sdr1 gene is identical to the rice OsMAPKKK73 gene (Rao K et al. In silico analysis reveals 75 members of mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family in rice. DNA Research 17: 139-153. (2010)) I found out. OsMAPKKK73 is one of the MAPKKKs belonging to the MEKK subfamily. Moreover, it discovered that the expression of rice Sdr1 gene was started immediately after water absorption by seeds. Furthermore, in the case of Kasalath having higher ear germination resistance compared to Nipponbare, it was found that the expression level of the Sdr1 gene after water absorption by the seed was lower than the expression level of the Sdr1 gene after water absorption by the Nipponbare seed. From these facts, it is considered that the Sdr1 gene product expressed after water absorption by seeds, that is, OsMAPKKK73, is involved in one of the signal transduction systems that activate the expression of genes involved in seed germination. Subsequently, the wheat Sdr1 gene was isolated, and it was found that expression of the gene was started immediately after water absorption by the seeds. Based on the above results, it was found that the germination tolerance of rice and wheat can be controlled by controlling the expression or activity of the endogenous Sdr1 gene, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するイネ又はコムギ、該イネ又はコムギの作出方法及びDNA配列を提供するものである。 That is, this invention provides the rice or wheat which has the following characteristics, the production method and DNA sequence of this rice or wheat.
（１）少なくとも一つの内在性Ｓｄｒ１遺伝子の発現又は活性が人為的に抑制されており、コントロールイネ又はコントロールコムギと比較して高い穂発芽耐性を有するイネ又はコムギ。
（２）前記内在性Ｓｄｒ１遺伝子の発現の人為的な抑制が、ＲＮＡｉ法又はＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法による発現の抑制である前記（１）に記載のイネ又はコムギ。
（３）前記内在性Ｓｄｒ１遺伝子の発現又は活性の人為的な抑制が、前記内在性Ｓｄｒ１遺伝子における変異導入による活性の抑制である前記（１）に記載のイネ又はコムギ。
（４）前記内在性Ｓｄｒ１遺伝子における前記変異導入が、前記Ｓｄｒ１遺伝子のタンパク質コード領域内における変異導入である前記（３）に記載のイネ又はコムギ。
（５）少なくとも一つの内在性Ｓｄｒ１遺伝子の発現又は活性を人為的に抑制する工程を含む、コントロールイネ又はコントロールコムギと比較して高い穂発芽耐性を有するイネ又はコムギの生産方法。
（６）前記（５）に記載のイネ又はコムギの生産方法により生産されたイネ又はコムギの子孫又はクローンであって、少なくとも一つの前記内在性Ｓｄｒ１遺伝子の発現又は活性が人為的に抑制されており、コントロールイネ又はコントロールコムギと比較して高い穂発芽耐性を有するイネ又はコムギ。
(1) Rice or wheat that has an artificially suppressed expression or activity of at least one endogenous Sdr1 gene and has higher ear germination resistance compared to control rice or control wheat.
(2) The rice or wheat according to (1), wherein the artificial suppression of the expression of the endogenous Sdr1 gene is suppression of expression by an RNAi method or an RNA-directed DNA methylation method.
(3) The rice or wheat according to the above (1), wherein the artificial suppression of the expression or activity of the endogenous Sdr1 gene is suppression of activity due to mutation introduction in the endogenous Sdr1 gene.
(4) The mutation in the endogenous Sdr1 gene, rice or wheat according to (3) is mutated in a protein coding region of the Sdr1 gene.
(5) A method for producing rice or wheat having higher ear germination resistance compared to control rice or control wheat , comprising a step of artificially suppressing the expression or activity of at least one endogenous Sdr1 gene.
(6) A rice or wheat progeny or clone produced by the rice or wheat production method according to (5) above, wherein the expression or activity of at least one endogenous Sdr1 gene is artificially suppressed. Rice or wheat having higher ear germination resistance compared to control rice or control wheat.
本発明によれば、高い穂発芽耐性を有する利用価値の高いイネ又はコムギを提供できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the rice or wheat with the high utility value which has high ear germination tolerance can be provided.
本発明の一態様は、少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性が抑制されているイネ及びコムギに関する。
本発明の一態様は、少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性が抑制されており、高い穂発芽耐性を有するイネ及びコムギに関する。本発明において、イネとは、Oryza sativaを意味し、コムギとは、Triticum urartu等の二倍体コムギ、Triticum durum等の四倍体コムギ、及び、Triticum aestivum等の六倍体コムギを意味する。
本発明において、内在性Sdr1遺伝子とは、イネやコムギの細胞核ゲノム上にもともと存在し、イネのSdr1遺伝子（OsMAPKKK73遺伝子）と相互にオーソログ（ortholog）の関係にある遺伝子を指す。従って、たとえば、コムギゲノム上に存在するイネSdr1遺伝子のオーソログを内在性コムギSdr1遺伝子と呼ぶ。
One embodiment of the present invention relates to rice and wheat in which the expression or activity of at least one endogenous Sdr1 gene is suppressed.
One embodiment of the present invention relates to rice and wheat having high ear germination resistance, in which the expression or activity of at least one endogenous Sdr1 gene is suppressed. In the present invention, rice means Oryza sativa, and wheat means diploid wheat such as Triticum urartu, tetraploid wheat such as Triticum durum, and hexaploid wheat such as Triticum aestivum.
In the present invention, the endogenous Sdr1 gene refers to a gene that originally exists in the nuclear genome of rice and wheat and is in an ortholog relationship with the rice Sdr1 gene (OsMAPKKK73 gene). Therefore, for example, an ortholog of the rice Sdr1 gene present on the wheat genome is referred to as an endogenous wheat Sdr1 gene.
内在性Sdr1遺伝子は、イネ及びコムギのハプロイド（haploid）当たり1コピー存在する。従って、二倍体細胞からなるイネの場合には、１つの内在性Sdr1遺伝子が存在し、それについて2つの対立遺伝子（アレル）が存在する。2つの対立遺伝子の塩基配列が互いに同一である場合には当該2つの対立遺伝子を有する細胞及び植物体は、Sdr1遺伝子についてホモ接合体（homozygote）と呼ばれる。2つの対立遺伝子の塩基配列が互いに異なっている場合には当該対立遺伝子を有する細胞及び植物体はヘテロ接合体（heterozygote）と呼ばれる。コムギには二倍体（diploid）コムギ、四倍体(tetraploid)コムギ及び六倍体（hexaploid）コムギがある。たとえば、六倍体コムギの細胞はコムギのAゲノム、Bゲノム及びDゲノム上にそれぞれ一つのSdr1遺伝子を有し、それぞれのSdr1遺伝子について2つの対立遺伝子が存在する。本発明において、「少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子」とは、例えば、六倍体コムギの場合においては、そのAゲノム、Bゲノム又はDゲノム上に存在する内在性Sdr1遺伝子のうちの少なくとも一つのSdr1遺伝子を意味する。
イネのSdr1遺伝子を同定しその塩基配列を決定した結果、イネSdr1遺伝子は、Raoら（Rao K et al. In silico analysis reveals 75 members of mitogen-activated protein kinase kinae kinase gene family in rice. DNA Research 17:139-153. (2010)）によって同定されているイネのMAPKKK73（OsMAPKKK73）遺伝子と同一の遺伝子であることが見出された。従って、たとえば、イネのSdr1遺伝子はイネのMAPKKK73タンパク質をコードする遺伝子であり、コムギSdr1遺伝子はイネのMAPKKK73に相当するコムギタンパク質をコードする遺伝子である。イネSdr1遺伝子の配列は、たとえば、配列番号６又は配列番号７に記載の塩基配列によって例示される。また、六倍体コムギの3つのSdr1遺伝子の配列は、それぞれ配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に記載の塩基配列によって例示される。本発明において、一つのSdr1遺伝子の2つの対立遺伝子を総称してSdr1遺伝子と呼ぶ場合があり、Sdr1遺伝子の一つの対立遺伝子の配列を「Sdr1遺伝子の配列」と呼ぶ場合がある。
There is one copy of the endogenous Sdr1 gene per rice and wheat haploid. Thus, in the case of rice consisting of diploid cells, there is one endogenous Sdr1 gene, for which there are two alleles. When the base sequences of two alleles are identical to each other, the cell and plant having the two alleles are called homozygote for the Sdr1 gene. When the base sequences of two alleles are different from each other, the cells and plants having the alleles are called heterozygotes. Wheat includes diploid wheat, tetraploid wheat and hexaploid wheat. For example, hexaploid wheat cells have one Sdr1 gene on each of the wheat A genome, B genome, and D genome, and there are two alleles for each Sdr1 gene. In the present invention, “at least one endogenous Sdr1 gene” means, for example, in the case of hexaploid wheat, at least one of the endogenous Sdr1 genes present on the A genome, B genome, or D genome. Means the Sdr1 gene.
Rice Sdr1 gene was identified and its nucleotide sequence was determined. As a result, Rao et al. (Rao K et al. In silico analysis reveals 75 members of mitogen-activated protein kinase kinae kinase gene family in rice. DNA Research 17 : 139-153. (2010)) was found to be the same gene as the rice MAPKKK73 (OsMAPKKK73) gene. Thus, for example, the rice Sdr1 gene is a gene encoding a rice MAPKKK73 protein, and the wheat Sdr1 gene is a gene encoding a wheat protein corresponding to rice MAPKKK73. The sequence of the rice Sdr1 gene is exemplified by the base sequence described in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7, for example. In addition, the sequences of three Sdr1 genes of hexaploid wheat are exemplified by the base sequences described in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10, respectively. In the present invention, two alleles of one Sdr1 gene may be collectively referred to as an Sdr1 gene, and the sequence of one allele of the Sdr1 gene may be referred to as an “Sdr1 gene sequence”.
内在性Sdr1遺伝子の塩基配列又はそれにコードされるSdr1タンパク質のアミノ酸配列はイネ又はコムギの系統間又は個体間で異なっている場合がある。系統間又は個体間でのこのような配列上の違いは自然発生的な遺伝的多型（genetic polymorphism）又は自発的突然変異（spontaneous mutation）を表すものである。例えば、イネの１品種であるカサラス由来の内在性Sdr1遺伝子の塩基配列を示す配列番号６に記載の配列とイネのもう一つの品種である日本晴由来のSdr1遺伝子の塩基配列を示す配列番号７に記載の配列との間での比較的少数の塩基配列上の違いは自然発生的な遺伝的多型を表す。イネの内在性Sdr1遺伝子又はSdr1対立遺伝子には、配列番号６又は配列番号７に記載の配列を有するSdr1遺伝子又はSdr1対立遺伝子ばかりでなく、他のイネ系統における自然発生的な多型又は自発的突然変異を含むSdr1遺伝子又はSdr1対立遺伝子も含まれる。 The nucleotide sequence of the endogenous Sdr1 gene or the amino acid sequence of the Sdr1 protein encoded thereby may differ between rice or wheat strains or individuals. Such sequence differences between strains or individuals represent spontaneous genetic polymorphism or spontaneous mutation. For example, the sequence shown in SEQ ID NO: 6 showing the nucleotide sequence of the endogenous Sdr1 gene derived from Kasaras, one rice cultivar, and SEQ ID NO: 7 showing the nucleotide sequence of the Sdr1 gene derived from Nipponbare, another rice cultivar. A relatively small number of nucleotide sequence differences from the described sequence represents a naturally occurring genetic polymorphism. The endogenous Sdr1 gene or Sdr1 allele of rice includes not only the Sdr1 gene or Sdr1 allele having the sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 7 but also spontaneous polymorphism or spontaneous in other rice lines. Also included are Sdr1 genes or Sdr1 alleles containing mutations.
本発明において、オーソログとは、互いに異なった生物種における遺伝子であって、進化において共通の祖先遺伝子から派生した遺伝子をいう（Tatusov R L et al. A genomic perspective on protein families. Science 278, 631-637.(1997)）。オーソログは、通常、進化の過程において同一の機能を保持する。従って、第一の生物種における既知遺伝子に対する第二の生物種におけるオーソログを同定することは当該オーソログの機能を予測する上で重要である。第一の生物種における一つの遺伝子、及びそれに対する第二の生物種におけるオーソログがそれぞれタンパク質をコードしている場合には、当該第二の生物種におけるオーソログがコードするタンパク質を当該第一の生物種における一つの遺伝子がコードするタンパク質に対するオーソログと呼ぶ場合がある。また、第一の生物種における遺伝子Ｘが第二の生物種における遺伝子Ｙのオーソログである場合、遺伝子Ｘは遺伝子Ｙに対しオーソロガス（orthologous）であるという。 In the present invention, an ortholog is a gene derived from a common ancestor gene in evolution, which is a gene in different species (Tatusov RL et al. A genomic perspective on protein families. Science 278, 631-637). (1997)). Orthologs usually retain the same function during the evolution process. Therefore, identifying an ortholog in the second species relative to a known gene in the first species is important in predicting the function of the ortholog. When one gene in the first species and the ortholog in the second species respectively encode the protein, the protein encoded by the ortholog in the second species is assigned to the first organism. Sometimes referred to as an orthologue to the protein encoded by one gene in a species. Further, when the gene X in the first species is an ortholog of the gene Y in the second species, the gene X is said to be orthologous to the gene Y.
通常、第一の生物種が有する遺伝子のうち、第二の生物種が有する一つの遺伝子と最も高い塩基配列上の同一性（identity）を示す遺伝子は、当該第二の生物種が有する一つの遺伝子に対する当該第一の生物種が有するオーソログである。BLASTNは、複数の遺伝子の塩基配列間の同一性を検出するアルゴリズムとして当業者に広く知られている（Karlin S and Altschul S F Methods for assessing the statistical significance of the molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268. (1990); Altschul S F et al. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410. (1990)）。National Center for Biotechnology Information（NCBI）がインターネット上に公開しているサイト（http://www.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi）において、目的とする遺伝子の塩基配列をクエリーとして、BLASTNを用いて検索することにより、NCBIのデータベースに配列が登録されている遺伝子の中でクエリーに対して同一性の高い遺伝子を検索できる。BLASTN解析における配列間の同一性のレベルを示す指標は、Max score又Max segment scoreであり、より大きなMax scoreの値はより高い同一性レベルを表す。 Usually, among the genes possessed by the first species, the gene showing the highest identity on the base sequence with the one gene possessed by the second species is the one possessed by the second species. An ortholog of the first species for the gene. BLASTN is widely known to those skilled in the art as an algorithm for detecting identity between the base sequences of multiple genes (Karlin S and Altschul SF Methods for assessing the statistical significance of the molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268. (1990); Altschul SF et al. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410. (1990)). BLASTN is used with the base sequence of the target gene as a query at the website (http://www.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi) published on the Internet by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). By searching, a gene having a high identity to the query can be searched among the genes whose sequences are registered in the NCBI database. The index indicating the level of identity between sequences in BLASTN analysis is Max score or Max segment score, and a larger Max score value represents a higher level of identity.
一般に、例えば、第一の生物種が有する一つの遺伝子の塩基配列と最も高い同一性を有する第二の生物種における遺伝子が同定され、次いで当該第二の生物種における遺伝子の塩基配列をクエリーとしたBLASTNによる解析によって、前記第一の生物種の遺伝子がコードする遺伝子の中で、BLASTN解析の出発点とした前記第一の生物種が有する一つの遺伝子が最も高い同一性を示したときは、当該第二の生物種における遺伝子は前記第一の生物種が有する一つの遺伝子に対するオーソログであると考えられる（Huynen M A and Bork P. Measuring genome evolution. Proceedings of National Academy of Sciences, U.S.A. 95, 5849-5856.(1998)）。
NCBIが公開しているインタ−ネットサイトにおける記事（htt://www.ncbi.nlm.nih.gove/genomes/PLANTS/PlantList.html）によれば、これまでに、イネ（Oryza sativa）の全ゲノム塩基配列が決定されている。また、コムギＡゲノムを有する二倍体コムギであるウラルツコムギ（Triticum urartu）の全ゲノム塩基配列が発表されており（Ling H et al. Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticum urartu. Nature 496, 87-90.(2013)）、六倍体コムギについても、その全ゲノムの60%以上の塩基配列が発表されている（The International Wheat Genome Consortium A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science 345, 1251788-1-1251788-11. (2014)）。これらの塩基配列データのほとんどはNCBIのDNAデータベースであるGenBankに登録されており、そのデータを用いて、イネSdr1遺伝子のコムギオーソログを見出すことができた。
イネSdr1遺伝子に対するコムギにおけるオーソログとして、コムギのTaSdr1-1遺伝子（配列番号８）、TaSdr1-2遺伝子（配列番号９）、及びTaSdr1-3遺伝子（配列番号１０）が例示される。
In general, for example, a gene in the second species having the highest identity with the base sequence of one gene of the first species is identified, and then the base sequence of the gene in the second species is queried. When the BLASTN analysis shows that the gene of the first species that is the starting point of the BLASTN analysis shows the highest identity among the genes encoded by the gene of the first species The gene in the second species is considered to be an ortholog to one gene of the first species (Huynen MA and Bork P. Measuring genome evolution. Proceedings of National Academy of Sciences, USA 95, 5849 -5856. (1998)).
According to an article on the Internet site published by NCBI (htt: //www.ncbi.nlm.nih.gove/genomes/PLANTS/PlantList.html), all rice (Oryza sativa) Genomic base sequence has been determined. The whole genome sequence of Triticum urartu, a diploid wheat having the wheat A genome, has been published (Ling H et al. Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticum urartu. Nature 496, 87 -90. (2013)), the international Wheat Genome Consortium A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum ) genome. Science 345, 1251788-1-1251788-11. (2014)). Most of these nucleotide sequence data are registered in GenBank, the DNA database of NCBI, and we were able to find a wheat ortholog of the rice Sdr1 gene.
Examples of orthologs in wheat for the rice Sdr1 gene include wheat TaSdr1-1 gene (SEQ ID NO: 8), TaSdr1-2 gene (SEQ ID NO: 9), and TaSdr1-3 gene (SEQ ID NO: 10).
本発明において、内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性が抑制されているイネ又はコムギとは、内在性Sdr1遺伝子の発現が人為的に抑制されているイネ若しくはコムギ、内在性Sdr1遺伝子の活性が人為的に抑制されているイネ若しくはコムギ又は内在性Sdr1遺伝子の発現及び活性が人為的に抑制されているイネ若しくはコムギを意味する。内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性が抑制されているとは、内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性が完全に抑制され、Sdr1遺伝子の発現又は活性が喪失している場合も含まれる。
本発明において、Sdr1遺伝子の発現又は活性が「人為的に」抑制されているとは、イネ又はコムギに対する人為的操作の結果、内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性が抑制されていることを意味する。Sdr1遺伝子の発現を抑制するための人為的操作には、RNAi法及びRNA指令型DNAメチル化法が含まれるが、それらに限定されない。Sdr1遺伝子の活性を抑制するための人為的操作には、Sdr1遺伝子に対するランダム変異の導入、部位特異的変異の導入及びジーンターゲティング法による遺伝子改変が含まれるが、それらに限定されない。
In the present invention, rice or wheat in which the expression or activity of the endogenous Sdr1 gene is suppressed refers to rice or wheat in which the expression of the endogenous Sdr1 gene is artificially suppressed, and the activity of the endogenous Sdr1 gene is artificial. It means rice or wheat whose expression or activity has been artificially suppressed. The expression or activity of the endogenous Sdr1 gene being suppressed includes the case where the expression or activity of the endogenous Sdr1 gene is completely suppressed and the expression or activity of the Sdr1 gene is lost.
In the present invention, the expression or activity of the Sdr1 gene is “artificially” suppressed, which means that the expression or activity of the endogenous Sdr1 gene is suppressed as a result of the artificial manipulation of rice or wheat. . Artificial manipulations for suppressing the expression of the Sdr1 gene include, but are not limited to, the RNAi method and the RNA-directed DNA methylation method. Artificial manipulation for suppressing the activity of the Sdr1 gene includes, but is not limited to, introduction of random mutations, introduction of site-specific mutations, and gene modification by gene targeting methods to the Sdr1 gene.
本発明において、イネ又はコムギにおいて内在性Sdr1遺伝子の「発現」が人為的に抑制されているとは、イネ又はコムギに対する人為的操作の結果、イネ又はコムギにおけるSdr1遺伝子mRNAの量が、コントロールイネ又はコントロールコムギにおけるSdr1遺伝子mRNAの量と比較して有意に低いことを意味する。コントロールイネ又はコントロールコムギとは、Sdr1遺伝子の発現又は活性を抑制するための人為的操作（例えば、部位特異的変異の導入等の人為的な遺伝的改変）がされていないイネ又はコムギをいう。例えば、イネの一系統である日本晴に対して人為的に変異が導入された結果、高い穂発芽耐性を有する植物が作製された場合には、人為的に変異が導入されていない日本晴がコントロールイネに該当する。 In the present invention, “expression” of the endogenous Sdr1 gene is artificially suppressed in rice or wheat. As a result of artificial manipulation of rice or wheat, the amount of Sdr1 gene mRNA in rice or wheat is controlled rice. Or it means that it is significantly lower than the amount of Sdr1 gene mRNA in control wheat. Control rice or control wheat refers to rice or wheat that has not been subjected to artificial manipulation (for example, artificial genetic modification such as introduction of site-specific mutation) to suppress the expression or activity of the Sdr1 gene. For example, as a result of artificially introducing a mutation into Nihonbare, a line of rice, as a result of the creation of a plant having high resistance to germination, Nipponbare without artificially introduced mutation is controlled rice It corresponds to.
本発明の一態様に係る高い穂発芽耐性を有するイネ又はコムギにおけるSdr1遺伝子mRNAの量が、コントロールイネ又はコントロールコムギにおけるSdr1遺伝子mRNAの量と比較して有意に低いか否かは、前記イネ又はコムギ及び前記コントロールイネ又はコムギの種子の胚（embryo）におけるSdr1遺伝子mRNAの量をリアルタイムPCRにより定量することによって調べることができる。この際、当業者であれば、リアルタイムPCRに用いるために適切なプライマーを、イネ又はコムギにおける内在性Sdr1遺伝子の塩基配列に基づき適宜選択することができる。また、当業者であれば、Sdr1遺伝子mRNAの量をリアルタイムPCRで定量するためのPCRの条件を適宜選択することができる。 Whether the amount of Sdr1 gene mRNA in rice or wheat having high ear germination resistance according to one embodiment of the present invention is significantly lower than the amount of Sdr1 gene mRNA in control rice or control wheat, The amount of Sdr1 gene mRNA in wheat and the control rice or wheat seed embryo can be determined by quantification by real-time PCR. At this time, those skilled in the art can appropriately select an appropriate primer for use in real-time PCR based on the base sequence of the endogenous Sdr1 gene in rice or wheat. Furthermore, those skilled in the art can appropriately select PCR conditions for quantifying the amount of Sdr1 gene mRNA by real-time PCR.
例えば、イネSdr1遺伝子の発現がRNAi法等により抑制されていることが予測されるイネの場合には、該イネ及びコントロールイネをそれぞれ実質的に同じ環境下（温度、湿度、日照等）で栽培し、それらの出穂日から一定期間後（例えば、5週間後、6週間後又は７週間後）に種子を収穫する。それぞれのイネから採取された種子の一定数（例えば、30個、又は50個）を、種子を収穫した日と同日に、1.2mlの蒸留水で湿らせた直径33 mmの濾紙（たとえば、TOYO ＃2、東洋濾紙株式会社製）を敷いた６穴プラスティックプレート（Falcon社製）の１穴に入れ、種子の吸水を開始させる。該種子をプラスティックプレートのふたをした状態で、30℃、暗所に静置する。種子による吸水開始9時間後に上記種子の胚から全RNAを抽出し、これを鋳型としてcDNAを合成し、これを鋳型としたリアルタイムPCRを行うことにより、Sdr1遺伝子の発現がRNAi法等により抑制されていることが予測されるイネの種子の胚及びコントロールイネの種子の胚におけるSdr1遺伝子mRNAの量を定量し比較することができる。mRNAの定量においては、該定量に供する全RNAの量を標準化するために、細胞で定常的に発現する内在性遺伝子のmRNAを同様に定量し、該遺伝子mRNAの量に対するSdr1遺伝子mRNAの量の比率を求め、これをSdr1遺伝子mRNAの量の指標とすることが望ましい。細胞で定常的に発現する内在性遺伝子としてはアクチン遺伝子を例示できる。 For example, in the case of rice where the expression of rice Sdr1 gene is predicted to be suppressed by the RNAi method, etc., the rice and control rice are grown under substantially the same environment (temperature, humidity, sunshine, etc.). Then, seeds are harvested after a certain period from the date of heading (for example, after 5 weeks, 6 weeks or 7 weeks). A filter paper having a diameter of 33 mm (for example, TOYO) obtained by moistening a certain number of seeds collected from each rice (for example, 30 or 50) with 1.2 ml of distilled water on the same day as the seeds were harvested. Put # 2 in a hole in a 6-hole plastic plate (Falcon) with Toyo Filter Paper Co., Ltd.), and start seed absorption. The seeds are left in a dark place at 30 ° C. with a plastic plate covered. Extracting total RNA from the seed embryos 9 hours after the start of water absorption by the seed, synthesizing cDNA using this as a template, and performing real-time PCR using this as a template, Sdr1 gene expression is suppressed by the RNAi method, etc. The amount of Sdr1 gene mRNA in rice seed embryos and control rice seed embryos that are predicted to be quantified can be quantified and compared. In the quantification of mRNA, in order to standardize the amount of total RNA to be subjected to the quantification, the mRNA of an endogenous gene that is constantly expressed in cells is similarly quantified, and the amount of Sdr1 gene mRNA relative to the amount of the gene mRNA is determined. It is desirable to obtain a ratio and use this as an index of the amount of Sdr1 gene mRNA. An actin gene can be exemplified as an endogenous gene that is constantly expressed in cells.
本発明の一態様に係るイネ又はコムギにおけるSdr1遺伝子の発現が抑制されているというためには、該イネ又はコムギの種子の胚の吸水開始9時間後におけるSdr1遺伝子mRNAの量が、コントロールイネ又はコントロールコムギの種子の胚の吸水開始9時間後におけるSdr1遺伝子の量と比較して有意に低ければよい。該イネ又はコムギの種子の胚の吸水開始9時間後におけるSdr1遺伝子mRNAの量が、コントロールイネ又はコントロールコムギの種子の胚の吸水後９時間後におけるSdr1遺伝子mRNAの量の50%以下であることが好ましく、20%以下であることがより好ましく、該イネ又はコムギの種子の胚の吸水開始9時間後におけるSdr1遺伝子mRNAの量が実質的にゼロであることがさらにより好ましい。
本発明の一態様に係る高い穂発芽耐性を有するコムギの場合にも、上記の試験条件に従い内在性Sdr1遺伝子の発現が抑制されているか否かを調べることができる。六倍体コムギは、TaSdr1-1遺伝子、TaSdr1-2遺伝子及びTaSdr1-3遺伝子を有する。従って、これら遺伝子の塩基配列（配列番号８乃至１０）に基づき、例えば、TaSdr1-1遺伝子cDNAのみを増幅し、TaSdr1-2遺伝子cDNA又はTaSdr1-3遺伝子cDNAを増幅しない特異的PCRプライマーを設計し、それを用いてTaSdr1-1遺伝子mRNAの発現量を特異的に定量することも可能である。六倍体コムギにおけるSdr1遺伝子の発現が抑制されているとは、TaSdr1-1遺伝子、TaSdr1-2遺伝子又はTaSdr1-3遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されていることを意味する。
In order to suppress the expression of the Sdr1 gene in rice or wheat according to one embodiment of the present invention, the amount of Sdr1 gene mRNA after 9 hours from the start of water absorption of the rice or wheat seed embryo is The amount should be significantly lower than the amount of Sdr1 gene 9 hours after the start of water absorption in the seed of the control wheat seed. The amount of Sdr1 gene mRNA 9 hours after the start of water uptake of the rice or wheat seed embryo is 50% or less of the amount of Sdr1 gene mRNA 9 hours after water uptake of the control rice or control wheat seed embryo More preferably, it is 20% or less, and even more preferably, the amount of Sdr1 gene mRNA is substantially zero 9 hours after the start of water absorption of the rice or wheat seed embryo.
Also in the case of wheat having high ear germination resistance according to one embodiment of the present invention, it is possible to examine whether the expression of the endogenous Sdr1 gene is suppressed according to the above test conditions. Hexaploid wheat has a TaSdr1-1 gene, a TaSdr1-2 gene, and a TaSdr1-3 gene. Therefore, based on the base sequences of these genes (SEQ ID NOs: 8 to 10), for example, a specific PCR primer that amplifies only TaSdr1-1 gene cDNA and does not amplify TaSdr1-2 gene cDNA or TaSdr1-3 gene cDNA is designed. It is also possible to specifically quantify the expression level of TaSdr1-1 gene mRNA using it. Suppressed expression of Sdr1 gene in hexaploid wheat means that the expression of at least one of TaSdr1-1 gene, TaSdr1-2 gene or TaSdr1-3 gene is suppressed.
本発明の一態様に係るイネ及びコムギにおいて、内在性Sdr1遺伝子の「活性」が人為的に抑制されているとは、人為的操作の結果、変異が導入されたSdr1遺伝子がコードするタンパク質のタンパク質リン酸化酵素活性が、コントロールイネ又はコムギにおけるSdr1遺伝子がコードするタンパク質のタンパク質リン酸化酵素活性と比較して有意に低下していることを意味する。
本発明において変異とは、核酸の塩基配列の変化をいう。当該核酸には、イネ又はコムギの内在性ゲノムDNAが含まれるが、それに限定されない。核酸の塩基配列の変化は、当該塩基配列を有する核酸に対する１又は複数の核酸残基の挿入及び欠失、並びに、当該塩基配列を構成する核酸残基の異種の核酸残基による置換を含む。核酸残基の挿入、欠失又は置換が核酸上の2以上の位置で生じた場合も核酸の塩基配列が変異したという。また、上記核酸残基の挿入には、核酸の塩基配列中に外来性DNAの塩基配列が挿入されることが含まれる。上記核酸残基の欠失には、内在性Sdr1遺伝子全体を含む欠失も含まれる。さらに、内在性ゲノムDNAの変異には、ゲノムDNAの逆位（inversion）や他の染色体への転移（transfer）も含まれる。
In rice and wheat according to one embodiment of the present invention, the “activity” of the endogenous Sdr1 gene is artificially suppressed. A protein of a protein encoded by a Sdr1 gene into which a mutation has been introduced as a result of artificial manipulation It means that the phosphorylase activity is significantly reduced as compared with the protein kinase activity of the protein encoded by the Sdr1 gene in control rice or wheat.
In the present invention, mutation means a change in the base sequence of a nucleic acid. Such nucleic acids include, but are not limited to, rice or wheat endogenous genomic DNA. Changes in the base sequence of a nucleic acid include insertion and deletion of one or more nucleic acid residues from a nucleic acid having the base sequence, and substitution of nucleic acid residues constituting the base sequence with heterologous nucleic acid residues. A nucleic acid base sequence is also mutated when an insertion, deletion or substitution of a nucleic acid residue occurs at two or more positions on the nucleic acid. The insertion of the nucleic acid residue includes insertion of a foreign DNA base sequence into the nucleic acid base sequence. The deletion of the nucleic acid residue includes a deletion including the entire endogenous Sdr1 gene. Furthermore, endogenous genomic DNA mutations include inversion of genomic DNA and transfer to other chromosomes.
内在性Sdr1遺伝子のエクソン領域、イントロン領域又は遺伝子発現調節領域内において塩基配列が変化した場合に、「Sdr1遺伝子が変異した」という。イネ及びコムギの内在性Sdr1遺伝子の配列は、配列番号：６乃至１０によって例示される。また、タンパク質コード領域内での塩基配列の変化の結果、該コード領域によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化が生じた場合には、「タンパク質が変異した」という場合がある。
イネSdr1遺伝子がコードするイネSdr1タンパク質（OsMAPKKK73）は、MAPKKKsの１種である。コムギSdr1遺伝子がコードするコムギSdr1タンパク質もMAPKKKsの一種である。イネ及びコムギのSdr1タンパク質は、基質であるMAPKKsをリン酸化する活性を有するが、イネ又はコムギのSdr1タンパク質によるリン酸化の基質となるMAPKKsは同定されていない。しかし、MAPKKKｓがインビトロで自己リン酸化活性（autophosphorylation activity）を示すことが知られている。自己リン酸化活性とは、タンパク質がそれと共存する同種のタンパク質をリン酸化する活性である。Sdr1タンパク質の自己リン酸化活性は、Sdr1タンパク質が有するタンパク質リン酸化活性の指標となる。
従って、変異が導入されたSdr1遺伝子がコードする変異Sdr1タンパク質のタンパク質リン酸化酵素活性が、コントロールイネ又はコントロールコムギにおけるSdr1遺伝子がコードするSdr1タンパク質のタンパク質リン酸化酵素活性と比較して有意に低下しているか否かは、Widmann et al.の方法（Widmann C. et al.In vitro activity of MEKK2 and MEKK3 in detergents is a function of a valine to serine difference in the catalytic domain. Biochimica et Biophysica Acta 1547, 167-173.(2001)）に従い、以下のように上記変異Sdr1タンパク質の自己リン酸化活性を測定することによって調べることができる。
When the nucleotide sequence is changed in the exon region, intron region or gene expression regulatory region of the endogenous Sdr1 gene, it is said that “Sdr1 gene has been mutated”. The sequences of the rice and wheat endogenous Sdr1 genes are exemplified by SEQ ID NOs: 6-10. Further, when a change occurs in the amino acid sequence of the protein encoded by the coding region as a result of a change in the base sequence in the protein coding region, it may be said that the protein has been mutated.
Rice Sdr1 protein (OsMAPKKK73) encoded by the rice Sdr1 gene is one of MAPKKKs. The wheat Sdr1 protein encoded by the wheat Sdr1 gene is also a kind of MAPKKKs. Rice and wheat Sdr1 proteins have the activity of phosphorylating MAPKKs, which are substrates, but no MAPKKs have been identified which are substrates for phosphorylation by rice or wheat Sdr1 proteins. However, it is known that MAPKKKs exhibit autophosphorylation activity in vitro. Autophosphorylation activity is activity in which a protein phosphorylates the same type of protein that coexists therewith. The autophosphorylation activity of the Sdr1 protein is an indicator of the protein phosphorylation activity of the Sdr1 protein.
Therefore, the protein phosphorylase activity of the mutant Sdr1 protein encoded by the Sdr1 gene into which the mutation has been introduced is significantly lower than the protein kinase activity of the Sdr1 protein encoded by the Sdr1 gene in control rice or control wheat. The method of Widmann et al. (Widmann C. et al. In vitro activity of MEKK2 and MEKK3 in detergents is a function of a valine to serine difference in the catalytic domain. Biochimica et Biophysica Acta 1547, 167- 173. (2001)), the autophosphorylation activity of the mutant Sdr1 protein can be measured as follows.
アミノ末端側から順に、メチオニン残基、ヘマグルチニンタグ配列（GYPYDVPDYAS）、及び変異Sdr1タンパク質の２番目のアミノ酸残基からカルボキシル末端までのアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするDNAを、Sdr1遺伝子DNAを鋳型としたPCRを行うことにより作製する。該DNAを哺乳動物細胞用発現ベクター、例えば、pCMV5（Andersson et al. Cloning, structure, and expression of the mitochondrial cytochrome P-450 sterol 26-hydroxylase, a bile acid biosynthetic enzyme. Journal of Biological Chemistry 264, 8222-8229.(1989)）に組み込み、変異型融合タンパク質を発現するベクターを作製する。これと同様に、コントロール植物が有するSdr1タンパク質のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を発現する発現ベクターを作製する。変異型融合タンパク質発現ベクター及びコントロール植物型融合タンパク質発現ベクター（5マイクログラム）をそれぞれ哺乳動物由来培養細胞、例えば、HEK293細胞（8 x 106細胞）にトランスフェクトする。トランスフェクションは、例えばLipofectAMINE（Life Technologies社）を用いて行うことができる。48時間後に、変異型融合タンパク質発現ベクター及びコントロール植物型融合タンパク質発現ベクターをトランスフェクトされたHEK293細胞をそれぞれ1% NP-40、10 mM potassium phosphate (ph7.4)、10 mM MgCl2，20 mM beta-glycerophosphate、0.5 mM sodium vanadate、2 mM dithiothreitol、1 mM EDTA、5 mM EGTA、5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride，20 microgram/ml aprotinin，5 microgram/ml leupeptinを含む溶解バッファーで溶解する。溶解物を15000ｇ、３分遠心して細胞核を除去し、上清を得る。上清の一定量を、抗ヘマグルチニンタグモノクローナル抗体、例えば、12CA5抗体（Berkeley Antibody Co.）、およびプロテインＡセファロース（GE Healthcare）と混合し、変異型融合タンパク質およびコントロール植物型融合タンパク質をそれぞれ免疫沈降する（Qian et al. Epitope-tagged Gq alpha subunits: Expression of GTPase-deficient alpha subunits persistently stimulates phosphatidylinositol-soecific phospholipase C but not mitogen-activated protein kinase activity regulated by the M1 muscarinic acetylcholine receptor. Proceedings of Nationa Academy of Sciences, USA 90, 4077-4081）(1993)）。免疫沈降物を上記溶解バッファーで２度洗浄した後に、さらに10 mM PIPES (pH 7.0)、100 mM NaCl、20 microgram/ml aprotininからなる反応バッファーで２度洗浄する。免疫沈降物を、例えば、10マイクロリットルの反応バッファーに懸濁する。これに適当量、例えば、20 microCiの[γ-32P]ATPを加え反応させる。反応温度は20℃から25℃の範囲内であることが好ましい。当業者であれば、自己リン酸化活性を定量するために適切な反応温度を適宜決めることができる。反応開始から、例えば、15分後、30分後、1時間後、2時間後に、反応液に３倍濃度のLaemmli sample buffer（３マイクロリットル）を加え5分間煮沸する。これを10% SDSポリアクリルアミドゲルにアプライし電気泳動する（Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.(1970)）。ゲル上の変異型融合タンパク質およびコントロール植物型融合タンパク質に相当するバンドを切り取り、バンド内の放射活性を測定する。この放射活性の測定値は、反応開始から15分後、30分後、1時間後、2時間後までに自己リン酸化された変異型融合タンパク質およびコントロール植物型融合タンパク質の量を反映している。変異型融合タンパク質およびコントロール植物型融合タンパク質に取り込まれた放射活性の量をそれぞれ反応時間に対してプロットすることにより、変異型融合タンパク質およびコントロール植物型融合タンパク質による自己リン酸化反応の速度、すなわち、自己リン酸化活性を求めることができる。 In order from the amino-terminal side, DNA encoding a fusion protein having a methionine residue, a hemagglutinin tag sequence (GYPYDVPDYAS), and the amino acid sequence from the second amino acid residue to the carboxyl terminus of the mutant Sdr1 protein is used as a template. It is prepared by performing PCR. The DNA is expressed in mammalian cell expression vectors such as pCMV5 (Andersson et al. Cloning, structure, and expression of the mitochondrial cytochrome P-450 sterol 26-hydroxylase, a bile acid biosynthetic enzyme. Journal of Biological Chemistry 264, 8222- 8229. (1989)) to produce a vector that expresses the mutant fusion protein. In the same manner, an expression vector that expresses a fusion protein having the amino acid sequence of the Sdr1 protein of the control plant is prepared. A mutant fusion protein expression vector and a control plant fusion protein expression vector (5 micrograms) are each transfected into cultured mammalian cells, for example, HEK293 cells (8 × 10 6 cells). Transfection can be performed using, for example, LipofectAMINE (Life Technologies). After 48 hours, HEK293 cells transfected with the mutant fusion protein expression vector and the control plant fusion protein expression vector were respectively 1% NP-40, 10 mM potassium phosphate (ph7.4), 10 mM MgCl 2 , 20 mM. Dissolve in a lysis buffer containing beta-glycerophosphate, 0.5 mM sodium vanadate, 2 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20 microgram / ml aprotinin, 5 microgram / ml leupeptin. The lysate is centrifuged at 15000 g for 3 minutes to remove cell nuclei and obtain a supernatant. A certain amount of the supernatant is mixed with an anti-hemagglutinin tag monoclonal antibody, for example, 12CA5 antibody (Berkeley Antibody Co.) and protein A sepharose (GE Healthcare), and the mutant fusion protein and the control plant fusion protein are immunoprecipitated, respectively. Qian et al. Epitope-tagged Gq alpha subunits: Expression of GTPase-deficient alpha subunits persistently stimulates phosphatidylinositol-soecific phospholipase C but not mitogen-activated protein kinase activity regulated by the M1 muscarinic acetylcholine receptor.Proceedings of Nationa Academy of Sciences, USA 90, 4077-4081) (1993)). The immunoprecipitate is washed twice with the lysis buffer, and further washed twice with a reaction buffer consisting of 10 mM PIPES (pH 7.0), 100 mM NaCl, and 20 microgram / ml aprotinin. The immunoprecipitate is suspended, for example, in 10 microliters of reaction buffer. An appropriate amount, for example, 20 microCi of [γ- 32 P] ATP is added to this and reacted. The reaction temperature is preferably in the range of 20 ° C to 25 ° C. A person skilled in the art can appropriately determine an appropriate reaction temperature for quantifying the autophosphorylation activity. For example, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, and 2 hours after the start of the reaction, add 3 times the concentration of Laemmli sample buffer (3 microliters) to the reaction solution and boil for 5 minutes. This is applied to 10% SDS polyacrylamide gel and electrophoresed (Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685. (1970)). A band corresponding to the mutant fusion protein and the control plant fusion protein on the gel is cut out, and the radioactivity in the band is measured. This measurement of radioactivity reflects the amount of mutant and control plant fusion proteins that were autophosphorylated 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, and 2 hours after the start of the reaction. . By plotting the amount of radioactivity incorporated into the mutant fusion protein and the control plant fusion protein, respectively, against the reaction time, the rate of autophosphorylation by the mutant fusion protein and the control plant fusion protein, ie, Autophosphorylation activity can be determined.
このように測定された変異型融合タンパク質による自己リン酸化活性が、コントロール植物型融合タンパク質の自己リン酸化活性に比較して有意に低い場合に、変異が導入されたSdr1遺伝子がコードする変異Sdr1タンパク質のタンパク質リン酸化酵素活性が、コントロール植物におけるSdr1遺伝子がコードするSdr1タンパク質のタンパク質リン酸化酵素活性と比較して有意に低下しているという。変異型融合タンパク質による自己リン酸化活性が、コントロール植物型融合タンパク質の自己リン酸化活性に比較して50%以下であることが好ましく、20%以下であることがより好ましく、変異型融合タンパク質による自己リン酸化活性が実質的にゼロであることがさらにより好ましい。 A mutant Sdr1 protein encoded by a mutation-introduced Sdr1 gene when the autophosphorylation activity of the mutant fusion protein thus measured is significantly lower than that of the control plant fusion protein It is said that the protein kinase activity of is significantly reduced compared to the protein kinase activity of the Sdr1 protein encoded by the Sdr1 gene in control plants. The autophosphorylation activity by the mutant fusion protein is preferably 50% or less, more preferably 20% or less, compared to the autophosphorylation activity of the control plant fusion protein. Even more preferably, the phosphorylation activity is substantially zero.
本発明の一態様において、高い穂発芽耐性を有するイネ及びコムギとは、イネ又はコムギに対する人為的操作の結果、コントロール植物（コントロールイネ又はコントロールコムギ）の穂発芽耐性と比較して有意に高い穂発芽耐性を有するイネ及びコムギを意味する。
例えば、本発明の一態様に係る植物がイネである場合には、該イネがコントロールイネと比較してより高い穂発芽耐性を有するか否かを次に示す発芽試験により調べることができる。前記イネ及びコントロールイネを実質的に同一の環境下で栽培する。前記イネ及びコントロールイネの各個体の出穂日を記録し、出穂日から、例えば、4週後、5週後、6週後、7週後又は8週後に各10個体のイネの穂を切り取り、切り取った穂を、それぞれ、水で湿らせたペーパーハンドタオル（商品名：クレシアEFハンドタオルソフトタイプ、日本製紙クレシア株式会社製）でくるんでタッパウエアーに入れ、密封して30℃、暗所に１週間静置する。次いで、穂をタッパウエアーから取り出し、穂についている種子数に対する発芽している種子数の割合を出穂日からそれぞれの期間後における発芽率とする。出穂日から5週後、6週後、7週後又は8週後に切り取られた前記イネの穂に稔った種子の発芽率が、出穂日から同様の期間後に切り取られたコントロールイネの穂に稔った種子の発芽率よりも有意に低いときに、前記イネはより高い穂発芽耐性を有するという。一般に、イネ及びコムギの種子の発芽率は、出穂期からの時間の経過に従って上昇する。従って、コントロールイネ又はコントロールコムギの種子の発芽率が比較的低い場合には、上記発芽試験を比較的後期（例えば、出穂から7週後または8週後）に行うことが好ましく、コントロールイネ又はコムギの発芽率が比較的高い場合には、上記発芽試験を比較的早期（例えば、出穂から5週後又は6週後）に行うことが望ましい。
In one embodiment of the present invention, the rice and wheat having high ear germination resistance are significantly higher ears compared to the ear germination resistance of a control plant (control rice or control wheat) as a result of artificial manipulation of rice or wheat. It means rice and wheat having germination resistance.
For example, when the plant according to one embodiment of the present invention is rice, whether or not the rice has higher ear germination resistance compared to control rice can be examined by a germination test described below. The rice and control rice are cultivated under substantially the same environment. Record the heading date of each individual of the rice and control rice, from the heading date, for example, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 7 weeks or 8 weeks later, cut 10 ears of rice, Each cut ear is wrapped in a paper hand towel (product name: Crecia EF hand towel soft type, manufactured by Nippon Paper Crecia Co., Ltd.) moistened with water, put into tapper wear, sealed and kept at 30 ° C in the dark. Let stand for 1 week. Next, the ears are taken out from the tappa wear, and the ratio of the number of germinated seeds to the number of seeds on the ear is taken as the germination rate after each period from the heading date. The germination rate of the seeds seeded on the rice ears cut out after 5 weeks, 6 weeks, 7 weeks or 8 weeks after the heading date is the same as the control rice ears cut after the same period from the heading date. The rice is said to have higher ear germination resistance when significantly less than the germination rate of the sowing seed. In general, the germination rate of rice and wheat seeds increases with the passage of time from the heading stage. Therefore, when the germination rate of control rice or control wheat seeds is relatively low, the germination test is preferably performed at a relatively late stage (for example, 7 weeks or 8 weeks after heading). When the germination rate is relatively high, it is desirable to perform the germination test relatively early (for example, 5 weeks or 6 weeks after heading).
本発明の一態様は、内在性Sdr1遺伝子の発現がRNAi法又はRNA指令型DNAメチル化法により抑制されており、高い穂発芽耐性を有するイネ又はコムギに関する。本発明において、RNAi法とは、RNAi誘導性核酸を人為的に植物細胞内で発現させることにより内在性遺伝子の発現を抑制する方法をいう。RNAi誘導性核酸とは、植物細胞内で発現することにより、RNA干渉を誘導し得る核酸を意味する。RNA干渉とは、mRNA（又はその部分配列）とハイブリダイズし得る塩基配列を含むRNAが、当該mRNAの分解を促進する効果をいう。その結果、細胞内のmRNA量は減少する。
上記RNAi誘導性核酸が形成する二重鎖RNAは、必ずしも完全に相補的な配列同士からなるものでなくともよく、標的とする遺伝子の転写産物のRNA配列に対して90%以上の同一性を有していることが好ましく、95%以上の同一性を有していることがより好ましい。
RNAi誘導性核酸が標的とするmRNAの配列は、タンパク質コード領域内の配列であっても、非翻訳領域領域内の配列であってもよく、Sdr1遺伝子タンパク質コード領域の配列の少なくとも一部を標的とすることが好ましい。前記RNAi誘導性核酸としては、例えばsiRNA、miRNA（microRNA）などが挙げられるが、siRNAが好ましい。植物細胞内に導入され、siRNA と同様にRNA干渉を引き起こすベクターとしては、shRNA（short hairpin RNA／small hairpin RNA）発現ベクターが挙げられる。
RNAi誘導性核酸がsiRNAである場合、Sdr1遺伝子の発現を抑制することができる限り、Sdr1遺伝子mRNAの任意の部分を標的とするものであってよい。siRNAの長さは、例えば19〜27塩基長、好ましくは21〜25塩基長であり、さらに好ましくは21〜23塩基長である。
RNAi誘導性核酸の設計方法は、当業者に公知であり、様々な設計ソフトウエア又はアルゴリズムを用いて、Sdr1遺伝子の塩基配列から適切なRNAi誘導性核酸の塩基配列を選択することができる。
前記siRNAは、Sdr1遺伝子のDNA塩基配列中の19〜27塩基からなる塩基配列に基づいて設計されるsiRNAであることが好ましく、例えば、イネのSdr1遺伝子の発現を抑制するためには、二重鎖RNA部分が配列番号13で表される塩基配列の部分配列を含むsiRNAであることがより好ましい。
One embodiment of the present invention relates to a rice or wheat plant in which expression of the endogenous Sdr1 gene is suppressed by an RNAi method or an RNA-directed DNA methylation method and has high ear germination resistance. In the present invention, the RNAi method refers to a method of suppressing the expression of an endogenous gene by artificially expressing an RNAi-inducible nucleic acid in a plant cell. An RNAi-inducible nucleic acid means a nucleic acid that can induce RNA interference by being expressed in a plant cell. RNA interference refers to the effect that RNA containing a base sequence capable of hybridizing with mRNA (or a partial sequence thereof) promotes degradation of the mRNA. As a result, the amount of intracellular mRNA decreases.
The double-stranded RNA formed by the RNAi-inducible nucleic acid does not necessarily have to be completely complementary sequences, and has 90% or more identity to the RNA sequence of the target gene transcript. Preferably, it has 95% or more identity.
The mRNA sequence targeted by the RNAi-inducible nucleic acid may be a sequence within the protein coding region or a sequence within the untranslated region, and targets at least a part of the sequence of the Sdr1 gene protein coding region. It is preferable that Examples of the RNAi-inducing nucleic acid include siRNA and miRNA (microRNA), and siRNA is preferable. Examples of vectors that are introduced into plant cells and cause RNA interference similar to siRNA include shRNA (short hairpin RNA / small hairpin RNA) expression vectors.
When the RNAi-inducible nucleic acid is siRNA, any part of the Sdr1 gene mRNA may be targeted as long as the expression of the Sdr1 gene can be suppressed. The length of the siRNA is, for example, 19 to 27 bases, preferably 21 to 25 bases, and more preferably 21 to 23 bases.
Methods for designing RNAi-inducible nucleic acids are known to those skilled in the art, and an appropriate RNAi-inducible nucleic acid base sequence can be selected from the base sequence of the Sdr1 gene using various design software or algorithms.
The siRNA is preferably an siRNA designed based on a base sequence consisting of 19 to 27 bases in the DNA base sequence of the Sdr1 gene. For example, in order to suppress the expression of the rice Sdr1 gene, More preferably, the strand RNA portion is an siRNA containing a partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13.
RNAi誘導性核酸を植物細胞内で発現させる方法としては、RNAi誘導性核酸を発現するための発現ベクターを形質転換法により植物細胞を導入することが例示できる。、「RNAi誘導性核酸を発現するための発現ベクターを形質転換法により植物細胞を導入する」とは、Sdr1遺伝子の発現を抑制が達成されるのであれば、ベクター配列全体を植物細胞に導入すること、及び、ベクター配列の一部を植物細胞に導入することを含む。
RNAi誘導性核酸を発現するための発現ベクターは、RNAi誘導性核酸を植物細胞内で発現しSdr1遺伝子の吸水後の種子の胚における発現を抑制し得るものであれば、特に制限されず、任意のプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリA付加シグナル、3’-UTR配列、5’-UTR配列、レポーター遺伝子、選抜マーカー遺伝子等を有するベクターとすることができる。選抜マーカー遺伝子を利用することによって、本発明のベクターが形質転換された植物と形質転換されていない植物との選抜を容易に行うことができる。このような選抜マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、除草剤ビスピリパック耐性遺伝子等が挙げられる。
当業者であれば、RNAi誘導性核酸を吸水直後の種子の胚で発現するためのプロモーターを宿主となる植物に応じて適宜選択することができる。該プロモーターは、構成的プロモーターでも器官特異的プロモーターでも誘導的プロモーターでもよい。構成的プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）由来の35Sプロモーターや、トウモロコシのユビキチンプロモーター等を挙げることができる。
An example of a method for expressing an RNAi-inducible nucleic acid in a plant cell is to introduce a plant cell by an transformation method using an expression vector for expressing the RNAi-inducible nucleic acid. , "Introducing a plant cell by an transformation method using an expression vector for expressing an RNAi-inducible nucleic acid" means that if suppression of Sdr1 gene expression is achieved, the entire vector sequence is introduced into the plant cell. And introducing part of the vector sequence into the plant cell.
The expression vector for expressing the RNAi-inducible nucleic acid is not particularly limited as long as it can express the RNAi-inducible nucleic acid in plant cells and suppress the expression in the seed embryo after water absorption of the Sdr1 gene. A vector having a promoter, an enhancer, an intron, a poly A addition signal, a 3′-UTR sequence, a 5′-UTR sequence, a reporter gene, a selection marker gene, and the like. By using a selection marker gene, it is possible to easily select between a plant transformed with the vector of the present invention and a plant not transformed. Examples of such selection marker genes include a hygromycin resistance gene, a neomycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a herbicide bispyripack resistance gene, and the like.
A person skilled in the art can appropriately select a promoter for expressing an RNAi-inducible nucleic acid in a seed embryo immediately after water absorption according to a plant as a host. The promoter may be a constitutive promoter, an organ-specific promoter or an inducible promoter. Examples of the constitutive promoter include 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus (CaMV), corn ubiquitin promoter, and the like.
RNAi誘導性核酸を発現するための発現ベクターを植物細胞に導入する方法は特に限定されず、当業者に公知の形質転換法を用いることができる。例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト融合法、ウイスカー超音波法等を用いることができる（田部井編「形質転換プロトコール［植物編］」、化学同人、（2012））。 A method for introducing an expression vector for expressing an RNAi-inducible nucleic acid into plant cells is not particularly limited, and a transformation method known to those skilled in the art can be used. For example, the Agrobacterium method, particle gun method, microinjection method, electroporation method, polyethylene glycol method, protoplast fusion method, whisker ultrasound method, etc. can be used (Tabei edition “Transformation protocol [plant edition]” Chemistry Doujin (2012)).
RNAi誘導性核酸を発現するためのベクターの導入対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物器官や植物組織を用いてもよく、植物培養細胞を用いてもよい。形質転換材料として植物組織等を用いる場合は、例えば、これらを周知のカルス形成用培地中で培養することにより脱分化したカルスを形成させ、該カルスにRNAi発現ベクターを導入し、その後該カルスを再分化誘導用の培地に移しかえて得られる不定胚、不定芽等から形質転換された植物体を得る方法が採用できる。 The plant material to which the vector for expressing the RNAi-inducible nucleic acid is introduced may be a plant organ or plant tissue such as stem, leaf, seed, embryo, ovule, ovary, shoot apex, cocoon, pollen, etc. Well, plant culture cells may be used. When using plant tissue or the like as a transformation material, for example, these are cultured in a well-known callus-forming medium to form dedifferentiated callus, an RNAi expression vector is introduced into the callus, and then the callus is used. A method of obtaining a transformed plant body from an adventitious embryo, adventitious bud or the like obtained by transferring to a medium for inducing redifferentiation can be employed.
本発明の一態様に係る、内在性Sdr1遺伝子の発現がRNAi法により抑制されている植物には、RNAi誘導性核酸発現ベクターが導入された植物細胞、植物体、若しくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。 The plant in which the expression of the endogenous Sdr1 gene according to one embodiment of the present invention is suppressed by the RNAi method is a plant cell into which an RNAi-inducible nucleic acid expression vector has been introduced, a plant body, or the same plant body. Included are progeny of the plant having properties, or tissues derived therefrom.
RNAi誘導性核酸発現ベクターが宿主へ導入されたか否かを確かめる方法としては、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行ってもよく、前述の選抜マーカー遺伝子を用いて行ってもよい。選抜マーカー遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合は植物体におけるレポーター遺伝子の発現を指標とすることができ、また、選抜マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いた場合は当該薬剤への耐性を指標として形質転換体の選抜を行うことができる。 As a method for confirming whether or not an RNAi-inducible nucleic acid expression vector has been introduced into a host, it may be performed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like, or may be performed using the above-described selective marker gene. Good. When a reporter gene is used as a selection marker gene, expression of the reporter gene in the plant body can be used as an index, and when a drug resistance gene is used as a selection marker gene, transformation using the resistance to the drug as an index The body can be selected.
本発明において、RNA指令型DNAメチル化法（RdDM法）とは、遺伝子の発現を活性化する機能を有するプロモーター配列若しくはエンハンサー配列又はそれらの一部の配列と相補的な配列を有する２本鎖RNA又はヘアピンRNAを細胞内に導入することにより、該プロモーター配列若しくはエンハンサー配列におけるDNAのメチル化を誘導し、その結果該プロモーター配列若しくはエンハンサー配列に特異的に結合し得る転写活性化タンパク質（transcriptional activator protein）の該配列への結合を抑制することによって遺伝子の発現を抑制する方法である（Mette M. F. et al. Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-staranded RNA. EMBO Journal 19, 5194-5201. (2000); Matzke M. and Birchle J. RNAi-mediated pathways in the nucleus/ Nature Reviews Genetics 6, 24-35.(2005)）。プロモーター配列又はエンハンサー配列にDNAメチル化を導入する方法としては、それらの塩基配列又はその一部の塩基配列（通常、約200〜300塩基の長さの配列）に相補的な配列を含む逆反復配列（通常、プロモーター等の一部の塩基配列の相補的な配列とそれに相補的な配列との間に数百塩基のスペーサー塩基配列を含む）を有するRNAを発現させるベクターを用いて形質転換体を作製する、又は上記RNAを植物細胞内で一過的に発現させる方法が例示される。 In the present invention, the RNA-directed DNA methylation method (RdDM method) is a double strand having a promoter sequence or an enhancer sequence having a function of activating gene expression or a partial sequence thereof. A transcriptional activator (transcriptional activator) that induces DNA methylation in the promoter sequence or enhancer sequence by introducing RNA or hairpin RNA into the cell, and as a result, can specifically bind to the promoter sequence or enhancer sequence. (Mette MF et al. Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-staranded RNA. EMBO Journal 19, 5194-5201. (2000 Matzke M. and Birchle J. RNAi-mediated pathways in the nucleus / Nature Reviews Genetics 6, 24-35. (2005)). As a method for introducing DNA methylation into a promoter sequence or an enhancer sequence, an inverted repeat including a sequence complementary to the base sequence or a part of the base sequence (usually a sequence having a length of about 200 to 300 bases) is used. Transformant using a vector that expresses RNA having a sequence (usually a spacer base sequence of several hundred bases between a complementary sequence of a part of the base sequence such as a promoter and a sequence complementary thereto) Or a method for transiently expressing the RNA in plant cells.
通常、内在性遺伝子のタンパク質コード領域の5’端からその上流約1000塩基までの領域にプロモーター活性を有する塩基配列が含まれている。従って、一例として、RdDM法によりイネSdr1遺伝子の上記プロモーター領域におけるDNAメチル化を誘導しSdr1遺伝子の発現を抑制する方法としては、当該遺伝子のタンパク質コード領域の5’端からその上流約1000塩基までの配列（例えば、配列番号６の８４９５〜９４９４番目及び配列番号７の８４４６〜９４４５番目の塩基配列）又はその一部の配列を含む逆反復RNAを細胞内に導入する方法が挙げられる。前記逆反復RNAを細胞内で発現させるためのベクターは、RNAi誘導性核酸ベクターの場合と同様の方法で作製することができる。コムギSdr1遺伝子の塩基配列は、本明細書に開示されている（配列番号８、配列番号９及び配列番号１０）。従って、当業者であれば当業者に良く知られた方法を用いて、それらの配列又はその一部の配列をプローブとしてコムギゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすること、あるいは上記オーソログの塩基配列を元にして作製したPCRプライマーを用いてゲノムDNAを鋳型としたインバースPCRを行うことによりコムギSdr1遺伝子のタンパク質コード領域の5’末端から約1000塩基上流までの当該遺伝子プロモーターの塩基配列を取得できる。このプロモーター塩基配列を用いて、上記のイネSdr1遺伝子の場合と同様に、コムギSdr1遺伝子の発現をRdDM法により抑制することができる。 Usually, a base sequence having promoter activity is contained in the region from the 5 'end of the protein coding region of the endogenous gene to about 1000 bases upstream thereof. Therefore, as an example, a method for suppressing the expression of the Sdr1 gene by inducing DNA methylation in the promoter region of the rice Sdr1 gene by the RdDM method is from the 5 'end of the protein coding region of the gene to about 1000 bases upstream thereof. (For example, the 8495-9494th sequence of SEQ ID NO: 6 and the 8446-9445th sequence of SEQ ID NO: 7) or a reverse repeat RNA containing a partial sequence thereof is introduced into cells. A vector for expressing the inverted repeat RNA in a cell can be prepared by the same method as that for the RNAi-inducible nucleic acid vector. The nucleotide sequence of the wheat Sdr1 gene is disclosed herein (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10). Accordingly, those skilled in the art can use a method well known to those skilled in the art to screen a wheat genomic DNA library using those sequences or a part of the sequence as a probe, or based on the base sequence of the above ortholog. By performing inverse PCR using genomic DNA as a template using the prepared PCR primer, the base sequence of the gene promoter from the 5 ′ end of the protein coding region of the wheat Sdr1 gene to about 1000 bases upstream can be obtained. Using this promoter base sequence, the expression of the wheat Sdr1 gene can be suppressed by the RdDM method as in the case of the rice Sdr1 gene.
RdDM法により誘導されたDNAメチル化は、DNAメチル化を誘導する２本鎖RNA又はそれを発現する２本鎖RNA発現ベクターが植物体に存在しなくとも維持され後代の植物体に伝達する（Mette, M.F.ら Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO Journal 19, 5194-5201.(2000); Matzke, M. & Birchler, J. RNAi-mediated pathway in the nucleus. Nature Reviews Genetics 6, 24-35.(2005)）。従ってRdDM法によりSdr1遺伝子の発現が抑制された植物体を野生型の植物体と交配させ、RdDM法にSdr1遺伝子の発現が抑制された植物体由来のSdr1遺伝子を有し、RdDM法に用いた逆反復RNAを細胞内で発現させるためのベクターをゲノム内に含まない植物体を得ることにより、Sdr1遺伝子の発現は抑制されているが、外来性遺伝子（exogenous genes）を含まない植物体を得ることもできる。 DNA methylation induced by the RdDM method is maintained even when a double-stranded RNA that induces DNA methylation or a double-stranded RNA expression vector that expresses it is not present in the plant body, and is transmitted to a progeny plant body ( Mette, MF et al. Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA.EMBO Journal 19, 5194-5201. (2000); Matzke, M. & Birchler, J. RNAi-mediated pathway in the nucleus.Nature Reviews Genetics 6, 24-35. (2005)). Therefore, a plant whose Sdr1 gene expression was suppressed by the RdDM method was crossed with a wild-type plant, and the RdDM method had a plant-derived Sdr1 gene whose Sdr1 gene expression was suppressed, and was used for the RdDM method. By obtaining a plant that does not contain the vector for expressing the inverted repeat RNA in the cell in the genome, the Sdr1 gene expression is suppressed, but a plant that does not contain exogenous genes is obtained. You can also.
DNAメチル化を誘導するためのRNAを発現する発現ベクターは、RNAi誘導性核酸を発現する発現ベクターを作製する条件に準じて作製することができる。また、RNAi誘導性核酸を発現するための発現ベクターを植物細胞に導入する方法に準じてDNAメチル化を誘導するためのRNAを発現する発現ベクターを植物細胞に導入することができる。 An expression vector that expresses RNA for inducing DNA methylation can be prepared according to the conditions for preparing an expression vector that expresses an RNAi-inducible nucleic acid. In addition, an expression vector that expresses RNA for inducing DNA methylation can be introduced into a plant cell according to a method for introducing an expression vector for expressing an RNAi-inducible nucleic acid into a plant cell.
本発明の一態様は、少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の活性が内在性Sdr1遺伝子における変異によって抑制されており、高い穂発芽耐性を有するイネ及びコムギに関する。また、本発明の別の一態様は、少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の活性が内在性Sdr1遺伝子のタンパク質コード領域における変異によって抑制されており、高い穂発芽耐性を有するイネ及びコムギに関する。本発明において、内在性Sdr1遺伝子における変異とは、Sdr1遺伝子のタンパク質コード領域、3’-UTR領域、5’-UTR領域、イントロン領域、及びプロモーター領域その他の発現調節領域における変異を意味する。イネの内在性Sdr1遺伝子は、配列番号：６及び７に記載の塩基配列によって例示される。コムギの内在性Sdr1遺伝子は、配列番号：８乃至１０に記載の塩基配列によって例示される。 One embodiment of the present invention relates to rice and wheat, wherein the activity of at least one endogenous Sdr1 gene is suppressed by a mutation in the endogenous Sdr1 gene and has high ear germination resistance. Another embodiment of the present invention relates to rice and wheat having high ear germination resistance, wherein the activity of at least one endogenous Sdr1 gene is suppressed by a mutation in the protein coding region of the endogenous Sdr1 gene. In the present invention, the mutation in the endogenous Sdr1 gene means a mutation in the protein coding region, 3'-UTR region, 5'-UTR region, intron region, promoter region and other expression regulatory regions of the Sdr1 gene. The endogenous Sdr1 gene of rice is exemplified by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 6 and 7. The endogenous Sdr1 gene of wheat is exemplified by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 10.
一つの内在性Sdr1遺伝子に対して2つの対立遺伝子がある。本発明において、少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の活性が内在性Sdr1遺伝子における変異によって抑制されているイネ又はコムギとは、少なくとも一つのSdr1遺伝子の2つの対立遺伝子のうちの少なくとも一つの対立遺伝子における変異によって該対立遺伝子の活性が抑制されているイネ又はコムギを意味する。少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の活性が内在性Sdr1遺伝子における変異によって抑制されているイネ又はコムギには、内在性Sdr1遺伝子の2つの対立遺伝子の双方における変異の結果、双方の対立遺伝子の活性がそれぞれ抑制されているイネ又はコムギも含まれる。これまでに自然界において、活性が抑制されたイネ又はコムギ変異Sdr1遺伝子の例は報告されていない。Sdr1遺伝子の活性を抑制するために導入される変異は、自然界に存在しない変異であることが望ましい。少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の活性が内在性Sdr1遺伝子における変異によって抑制されているイネ又はコムギのうち、その子孫の形質が安定する点で、変異の結果活性が抑制されているSdr1対立遺伝子についてホモ接合体である（homozygous）イネ又はコムギが好ましい。 There are two alleles for one endogenous Sdr1 gene. In the present invention, rice or wheat in which the activity of at least one endogenous Sdr1 gene is suppressed by a mutation in the endogenous Sdr1 gene refers to at least one allele of two alleles of at least one Sdr1 gene. It means rice or wheat in which the activity of the allele is suppressed by mutation. Rice or wheat in which the activity of at least one endogenous Sdr1 gene is suppressed by a mutation in the endogenous Sdr1 gene results in mutations in both two alleles of the endogenous Sdr1 gene resulting in activity of both alleles. Also included are rice or wheat that are each suppressed. So far, no example of rice or wheat mutant Sdr1 gene whose activity is suppressed has been reported in nature. It is desirable that the mutation introduced to suppress the activity of the Sdr1 gene is a mutation that does not exist in nature. About rice or wheat whose activity of at least one endogenous Sdr1 gene is suppressed by mutations in the endogenous Sdr1 gene Rice or wheat that is homozygous is preferred.
内在性Sdr1遺伝子への変異導入とは、Sdr1遺伝子を構成する核酸に上記変異を人為的に導入することをいう。塩基の挿入、欠失、置換等の導入方法としては、、Transcription activator-like effector nuclease（TALEN）（特表2012-514976号公報、特表2013-513389号公報）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（特許第4350907号公報、特許第4555292号公報）やCRISPR/Cas9（Jinek et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821.(2012)）に例示される部位特異的DNA分解酵素を用いて部位特異的に変異を導入する方法、相同組換え（homologous recombination）による方法、及びトランスポゾンの導入による方法が例示されるがこれらには限定されない。また、塩基の挿入、欠失、置換等の導入方法として、植物体又は植物を高エネルギーの電磁波（放射線、紫外線等）照射や変異原性化学物質（ニトロソ化合物（例えば、ニトロソグアニジン）、塩基類似化合物（例えば、ブロモデオキシウリジン）、アルキル化剤（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ENU）、メタンスルホン酸エチル（EMS）、多環芳香族炭化水素（例えば、ベンゾピレン、クリセン）、DNAインターカレーター（例えば、臭化エチジウム）、DNA架橋剤（例えば、シスプラチン、マイトマイシンC）、活性酸素により処理することにより植物体又は植物細胞のゲノムDNAにランダム変異を導入して得られた変異体系統のライブラリーを自ら作製し又は他者から得て、当該変異体ライブラリーから目的とする変異体を有する変異体を選抜することが含まれる。これらの方法のうちで、部位特異的DNA分解酵素を用いた部位特異的変異導入法、ジーンターゲティング法又はランダム変異体の選抜による方法が好ましい。 The introduction of mutation into the endogenous Sdr1 gene means that the mutation is artificially introduced into the nucleic acid constituting the Sdr1 gene. Examples of methods for introducing base insertion, deletion, substitution, etc. include Transcription activator-like effector nuclease (TALEN) (JP 2012-514976, JP 2013-513389), zinc finger nuclease (Patent No. 4350907) And CRISPR / Cas9 (Jinek et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821. (2012)) Examples include, but are not limited to, a method of introducing mutations site-specifically using a DNA-degrading enzyme, a method of homologous recombination, and a method of introducing a transposon. In addition, as methods for introducing base insertion, deletion, substitution, etc., plants or plants are irradiated with high-energy electromagnetic waves (radiation, ultraviolet rays, etc.), mutagenic chemical substances (nitroso compounds (eg, nitrosoguanidine), base similarity Compound (eg, bromodeoxyuridine), alkylating agent (eg, N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), ethyl methanesulfonate (EMS), polycyclic aromatic hydrocarbon (eg, benzopyrene, chrysene), DNA Mutant strains obtained by introducing random mutations into the genomic DNA of plants or plant cells by treatment with intercalators (eg ethidium bromide), DNA cross-linking agents (eg cisplatin, mitomycin C), active oxygen Mutations that have the desired mutant from the mutant library, either by creating a library of Among these methods, a site-directed mutagenesis method using a site-specific DNA degrading enzyme, a gene targeting method, or a method by selection of a random mutant is preferable.
部位特異的突然変異導入法において、変異の種類（たとえば、核酸残基の挿入、欠失、又は置換）及び変異が導入される部位は、変異導入後にSdr1遺伝子がコードするタンパク質のタンパク質リン酸酵素活性が抑制される部位であればよく、変異導入後にSdr1遺伝子がコードするタンパク質のタンパク質リン酸化酵素活性が実質的に消失する部位であることがより好ましい。 In the site-directed mutagenesis method, the type of mutation (for example, insertion, deletion, or substitution of a nucleic acid residue) and the site where the mutation is introduced are the protein phosphate enzymes of the protein encoded by the Sdr1 gene after mutagenesis The site may be any site where the activity is suppressed, and more preferably a site where the protein phosphorylase activity of the protein encoded by the Sdr1 gene substantially disappears after mutagenesis.
タンパク質リン酸化酵素の1種であるイネ又はコムギのSdr1タンパク質においては、タンパク質リン酸化酵素に共通に存在するキナーゼ触媒ドメインが存在しており、キナーゼ触媒ドメインがタンパク質のリン酸化酵素活性にとって重要であると考えられている。キナーゼ触媒ドメインは、イネ又はコムギのSdr1タンパク質において保存されている。たとえば、カサラスSdr1タンパク質のキナーゼ触媒ドメインは、3番目のアミノ酸残基から264番目のアミノ酸残基までの領域である（図８）。 The rice or wheat Sdr1 protein, one of the protein kinases, has a kinase catalytic domain that is common to protein kinases, and the kinase catalytic domain is important for protein kinase activity It is believed that. The kinase catalytic domain is conserved in rice or wheat Sdr1 proteins. For example, the kinase catalytic domain of the Kasalath Sdr1 protein is the region from the 3rd amino acid residue to the 264th amino acid residue (FIG. 8).
また、イネ又はコムギのSdr1タンパク質のキナーゼ触媒ドメインには、すべてのタンパク質リン酸化酵素において完全に保存されている８つのアミノ酸残基（Hanks S and Quinn A. Proteon kinase catalytic domain sequence database: Identification of conserved features of primary structure and classification of family members. Methods in Enzymology 200, 38-62.(1991)）がすべて保存されている。それらのアミノ酸残基は、カサラスSdr1タンパク質を例にとれば、カサラスSdr1タンパク質のアミノ酸配列中の12番目のグリシン残基、32番目のリジン残基、51番目のグルタミン酸残基、127番目のアスパラギン酸残基、132番目のアスパラギン残基、148番目のアスパラギン酸残基、174番目のグルタミン酸残基、及び、247番目のアルギニン残基である（図８）。すでに記載したように、これらのアミノ酸残基はタンパク質リン酸化酵素の活性にとって必須であり、これらのアミノ酸残基のいずれかが他のアミノ酸残基に置換され、あるいは欠失した場合には、リン酸化酵素の活性は大幅に低下するかあるいは消失すると考えられる。
イネ又はコムギのSdr1遺伝子に変異を導入することによってSdr1遺伝子の活性が抑制された植物を作製するためには、Sdr1タンパク質に存在するキナーゼ触媒ドメイン中のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する、又は、欠失させる変異を導入することが好ましい。この場合、キナーゼ触媒ドメイン中の複数のアミノ酸残基をそれぞれ他のアミノ酸残基に置換し、又は複数のアミノ酸残基を欠失させてもよい。キナーゼ触媒ドメイン中のいずれかのアミノ酸残基を欠失させる変異を導入することには、Sdr1遺伝子の翻訳開始コドンからキナーゼ触媒ドメインのＣ末端に該当するアミノ酸残基をコードするコドンまでのコード領域にナンセンス変異又はフレームシフト変異を導入すること、Sdr1遺伝子の開始コドン（ATG）又はその一部の塩基を置換又は欠失させること、及びキナーゼ触媒ドメインを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列中の３つ以上の核酸塩基を欠失させることも含まれる。しかし、内在性Sdr1遺伝子に変異を導入することによって内在性Sdr1遺伝子の活性が抑制された植物を作製するための方法はこれらに限定されない。
後に述べるように、発明者らは、ガンマー線照射されたイネ集団から、内在性イネSdr1遺伝子のキナーゼ触媒ドメインを構成するアミノ酸残基の一部を欠失したSdr1タンパク質をコードするSdr1遺伝子を有し、高い穂発芽耐性を有するイネを見出している。
イネ又はコムギのSdr1遺伝子に変異を導入することによってSdr1遺伝子の活性が抑制された植物を作製するためには、Sdr1タンパク質のキナーゼ触媒ドメインにおける、すべてのタンパク質リン酸化酵素において保存されているアミノ酸残基のいずれかを他のアミノ酸残基で置換する、又は、欠失させる変異を導入することがより好ましい。この場合、キナーゼ触媒ドメイン中の、上記すべてのタンパク質リン酸化酵素において保存されているアミノ酸残基の2つ以上をそれぞれ他のアミノ酸残基により置換し、又は欠失させてもよい。このような変異を導入することにより、Sdr1遺伝子の活性を大幅に低下させあるいは消失させることができる。
In addition, the kinase catalytic domain of rice or wheat Sdr1 protein contains 8 amino acid residues that are completely conserved among all protein phosphatases (Hanks S and Quinn A. Proteon kinase catalytic domain sequence database: Identification of conserved). Features in primary structure and classification of family members. Methods in Enzymology 200, 38-62. (1991)) are all preserved. These amino acid residues are, for example, the 12th glycine residue, the 32nd lysine residue, the 51st glutamic acid residue, and the 127th aspartic acid in the amino acid sequence of the Kasalath Sdr1 protein. These are the residue, the 132nd asparagine residue, the 148th aspartic acid residue, the 174th glutamic acid residue, and the 247th arginine residue (FIG. 8). As already mentioned, these amino acid residues are essential for the activity of protein kinases, and if any of these amino acid residues are replaced or deleted by other amino acid residues, It is thought that the activity of oxidase is greatly reduced or disappears.
In order to produce a plant in which the activity of the Sdr1 gene is suppressed by introducing a mutation into the rice or wheat Sdr1 gene, one of the amino acid residues in the kinase catalytic domain present in the Sdr1 protein is replaced with the other amino acid residues. It is preferable to introduce a mutation that is substituted or deleted with a group. In this case, a plurality of amino acid residues in the kinase catalytic domain may be substituted with other amino acid residues, or a plurality of amino acid residues may be deleted. To introduce a mutation that deletes any amino acid residue in the kinase catalytic domain, the coding region from the translation initiation codon of the Sdr1 gene to the codon encoding the amino acid residue corresponding to the C-terminus of the kinase catalytic domain 3 of the nucleotide sequence encoding an amino acid sequence containing a kinase catalytic domain, introducing a nonsense mutation or a frameshift mutation into the DNA, substituting or deleting the initiation codon (ATG) of the Sdr1 gene or a part of the base thereof, and Also included is the deletion of one or more nucleobases. However, the method for producing a plant in which the activity of the endogenous Sdr1 gene is suppressed by introducing a mutation into the endogenous Sdr1 gene is not limited thereto.
As described later, the inventors have an Sdr1 gene encoding an Sdr1 protein from which a part of the amino acid residues constituting the kinase catalytic domain of the endogenous rice Sdr1 gene has been deleted from a gamma-irradiated rice population. In addition, they have found rice having a high resistance to germination.
In order to produce plants in which the activity of the Sdr1 gene is suppressed by introducing mutations into the rice or wheat Sdr1 gene, the amino acid residues conserved in all protein kinases in the kinase catalytic domain of the Sdr1 protein are used. It is more preferable to introduce a mutation that substitutes or deletes any of the groups with other amino acid residues. In this case, two or more of the amino acid residues conserved in all of the above protein kinases in the kinase catalytic domain may be substituted with or deleted from each other amino acid residue. By introducing such a mutation, the activity of the Sdr1 gene can be greatly reduced or eliminated.
Sdr1酵素遺伝子の目的とする部位における変異は、例えば、Transcripition activator-like effector nuclease (TALEN)（特表2012-514976号公報、特表2013-513389号公報）、Clusters of regularly spaced short palindromic repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9)（Jinek et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Sciene 337, 816-821 (2012); Mali et al. RNA-guided human genome engeneering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（zinc finger nuclease）（特許第4350907号公報、特許第4555292号公報）等で例示される部位特異的DNA分解酵素を植物細胞内に導入し、それらの部位特異的DNA分解酵素によってSdr1遺伝子内の目的とする位置にDNAの二重鎖切断を起こさせることによって導入することができる。該二重鎖切断が修復される過程において、比較的高い確率で該切断部位又はその近傍で塩基置換、塩基の欠失又は塩基の挿入が起こるからである。 Mutations in the target site of the Sdr1 enzyme gene include, for example, Transcripition activator-like effector nuclease (TALEN) (Special Table 2012-514976, Special Table 2013-513389), Clusters of regularly spaced short palindromic repeats / Cas9 (CRISPR / Cas9) (Jinek et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Sciene 337, 816-821 (2012); Mali et al. RNA-guided human genome engeneering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)), zinc finger nuclease (Patent No. 4350907, Patent No. 4552292) and the like, introduced site-specific DNA-degrading enzymes into plant cells, It can be introduced by causing double-strand breakage of DNA at a target position in the Sdr1 gene by a site-specific DNA degrading enzyme. This is because in the process of repairing the double-strand break, base substitution, base deletion, or base insertion occurs at or near the cleavage site with a relatively high probability.
TALENは、アミノ末端側から核移行シグナル配列、通常14から20塩基の長さの塩基配列を有するDNAに配列特異的に結合するTranscription activator-like effector repeats（TALEリピート）と呼ばれる領域、及び制限酵素Fok1に由来するDNA分解酵素領域を含むタンパク質である。通常、変異を導入しようとする目的部位の両側のゲノム配列中に第一の認識配列及び第二の認識配列を設定する。第一の認識配列及び第二の認識配列の長さは通常それぞれ14塩基から20塩基である。また第一の認識配列と第二の認識配列との間の距離は通常14から18塩基である。第一の認識配列及び第二の認識配列にそれぞれ特異的に結合する活性を有する第一及び第二のTALENをともに植物細胞内に導入することにより、第一のTALEN及び第二のTALENがそれぞれ第一の認識配列及び第二の認識配列に特異的に結合し、その結果第一の認識配列と第二の認識配列の間でDNAの二重鎖切断が起こる。これにより前記部位に塩基置換、塩基の欠失又は挿入を導入することができる（特表2012-514976号公報；特表2013-513389号公報；Wei et al. TALEN or Cas9 - rapid, efficient and specific choices for genome modifications. Journal of Genetics and Genomics 40,281-289(2013); Zhang et al. Transcription activator-like effector nucleases enable efficient plant genome engineering. Plant Physiology 161、20-27(2013)）。第一及び第二の認識配列は基本的に配列上の制限なく設定することができるので、TALENによってゲノムDNA上の任意の位置でDNAの部位特異的二重鎖切断を起こすことが可能である。通常、TALENによるDNA切断は、TALENが有する高い配列特異性のためゲノムDNA中の一カ所のみで起こる。また、設定された第一又は第二の認識配列に特異的に結合する活性を有するTALEリピートは公知の方法（特表2012-514976号公報；特表2013-513389号公報）に基づいて設計することができ、当業者であれば当該設計されたTALEリピートを有するTALENを発現するベクターを当業者によく知られた技術を用いて作製することができる。現在、日本においては和光純薬工業株式会社やライフテクノロジーズジャパン株式会社その他がTALENの製造受託サービスを提供しており、これらの企業に第一及び第二の認識配列にそれぞれ特異的に結合する第一及び第二のTALENの作製を委託することもできる。 TALEN is a region called Transcription activator-like effector repeats (TALE repeats) that binds specifically to DNA having a nuclear translocation signal sequence from the amino-terminal side, usually 14 to 20 bases in length, and a restriction enzyme It is a protein containing a DNA-degrading enzyme region derived from Fok1. Usually, the first recognition sequence and the second recognition sequence are set in the genome sequence on both sides of the target site to be introduced with the mutation. The lengths of the first recognition sequence and the second recognition sequence are usually 14 to 20 bases, respectively. The distance between the first recognition sequence and the second recognition sequence is usually 14 to 18 bases. By introducing the first and second TALENs having the activity of specifically binding to the first recognition sequence and the second recognition sequence, respectively, into the plant cell, the first TALEN and the second TALEN are respectively obtained. Specifically binds to the first recognition sequence and the second recognition sequence, resulting in double-strand breaks in DNA between the first recognition sequence and the second recognition sequence. Thereby, base substitution, base deletion or insertion can be introduced into the above site (JP 2012-514976 gazette; JP 2013-513389 gazette; Wei et al. TALEN or Cas9-rapid, efficient and specific Journal of Genetics and Genomics 40,281-289 (2013); Zhang et al. Transcription activator-like effector nucleases enable efficient plant genome engineering. Plant Physiology 161, 20-27 (2013)). Since the first and second recognition sequences can be set basically without any sequence restriction, it is possible to cause site-specific double-strand breaks of DNA at any position on genomic DNA by TALEN. . Usually, DNA cleavage by TALEN occurs only at one place in the genomic DNA due to the high sequence specificity of TALEN. In addition, a TALE repeat having an activity of specifically binding to the set first or second recognition sequence is designed based on a known method (JP 2012-514976 gazette; JP 2013-513389 gazette). A person skilled in the art can produce a vector expressing TALEN having the designed TALE repeat using techniques well known to those skilled in the art. Currently, in Japan, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Life Technologies Japan Co., Ltd., etc. provide contract manufacturing services for TALEN, and these companies bind to the first and second recognition sequences, respectively. The production of the first and second TALENs can also be outsourced.
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、TALENと同様に特定の配列を有するDNAに特異的に結合する活性を有するジンクフィンガー領域と呼ばれる領域及び制限酵素FokIに由来するDNA分解酵素領域を含むタンパク質である（特許第4350907号公報、特許第4555292号公報）。TALENの場合と同様に、通常は第一の認識配列に特異的に結合する第一のジンクフィンガーヌクレアーゼ及び第二の認識配列に特異的に結合する活性を有する第二のジンクフィンガーヌクレアーゼをともに植物細胞に導入することによってゲノムDNA上の目的とする部位に変異を導入することができる。 Zinc finger nuclease is a protein comprising a region called a zinc finger region having an activity of specifically binding to DNA having a specific sequence as in TALEN and a DNA degrading enzyme region derived from the restriction enzyme FokI (Patent No. 4350907). No., Japanese Patent No. 4555292). As in the case of TALEN, both the first zinc finger nuclease that specifically binds specifically to the first recognition sequence and the second zinc finger nuclease that specifically binds to the second recognition sequence are planted together. By introducing it into a cell, a mutation can be introduced into the target site on the genomic DNA.
TALEN又はジンクフィンガーを植物細胞に導入するための方法としては、通常はこれらのタンパク質を植物細胞内で発現する発現ベクターで植物細胞を形質転換する方法が用いられるが、これらタンパク質をコードするDNA若しくはメッセンジャーRNA又はこれらタンパク質自体を細胞に注入することにより、TALEN又はジンクフィンガーを植物細胞に導入することも可能である。 As a method for introducing TALEN or zinc finger into plant cells, a method of transforming plant cells with an expression vector that expresses these proteins in plant cells is usually used. It is also possible to introduce TALEN or zinc fingers into plant cells by injecting messenger RNA or these proteins themselves into the cells.
CRISPER/Cas9を用いる方法とは、通常、ゲノムDNA上の変異を導入しようとする位置を含む20塩基の長さの認識配列を設定し、この配列に相補的な配列を含むガイドRNAを発現する発現ベクター及びバクテリア由来のDNA分解酵素であるCas9に核移行シグナルを付加したタンパク質を発現する発現ベクターをともに植物細胞内に導入することによって、ガイドRNAとCas9との複合体を上記認識配列に特異的に結合させることにより、上記認識配列の３’端付近にDNA二重鎖切断を起こさせる方法である（Jinek et al.、A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Sciene 337, 816-821(2012); Mali et al., RNA-guided human genome engeneering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)）。この方法によりTALENを用いた場合と同様にゲノムDNAの切断部位付近に変異が導入される。 The CRISPER / Cas9 method is usually used to set a 20-base recognition sequence that includes the position to introduce a mutation on genomic DNA, and to express a guide RNA containing a sequence complementary to this sequence. By introducing an expression vector and an expression vector that expresses a protein with a nuclear translocation signal added to Cas9, a bacterial DNA-degrading enzyme, into the plant cell, the complex of guide RNA and Cas9 is made specific to the above recognition sequence. This is a method of causing DNA double strand breaks in the vicinity of the 3 ′ end of the above-mentioned recognition sequence by linking them together (Jinek et al., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Sciene 337, 816-821 (2012); Mali et al., RNA-guided human genome engeneering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)). By this method, mutation is introduced near the cleavage site of genomic DNA as in the case of using TALEN.
従って、例えば、TALEN等の部位特異的ＤＮＡ分解酵素を用いて内在性Sdr1遺伝子に対して、該遺伝子のタンパク質コード領域内における変異であって、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ末端からキナーゼ触媒ドメインまでのアミノ酸配列をコードする領域におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異を導入するためには、内在性Sdr1遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ末端からキナーゼ触媒ドメインまでのアミノ酸配列をコードする領域内でDNAが部位特異的に切断されるように設計されたTALENを植物細胞又は植物体に導入した後に、DNA切断の修復の際に生じた切断部位又はその近傍での塩基置換、塩基の欠失又は挿入の結果であるナンセンス変異又はフレームシフト変異を有する植物細胞又は植物体を選抜すればよい。 Thus, for example, with respect to the endogenous Sdr1 gene using a site-specific DNA degrading enzyme such as TALEN, a mutation in the protein coding region of the gene, which is kinase-catalyzed from the amino terminus of the protein encoded by the gene In order to introduce nonsense mutation or frameshift mutation in the region encoding the amino acid sequence up to the domain, DNA in the region encoding the amino acid sequence from the amino terminus of the protein encoded by the endogenous Sdr1 gene to the kinase catalytic domain After introducing TALEN designed for site-specific cleavage into plant cells or plants, base substitution, base deletion or insertion at or near the cleavage site that occurred during repair of DNA cleavage Select plant cells or plants with nonsense mutations or frameshift mutations as a result of Good.
これまでに、シロイヌナズナ、タバコ、イネ、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）についてTALENを用いた内在性遺伝子の改変が報告されている（Chen K.et al. TALENs: Custamizable molecular DNA scissors for genome engineering of plants.Journal of Genetics and Genomics 40, 271-279.(2013)）。これまでに、シロイヌナズナ、ダイズ、タバコ、トウモロコシについてジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた内在性遺伝子の改変が報告されている。（シロイヌナズナ及びダイズについては、Sander J.ra,Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly(CoDA). Nature Methods 8, 67-69.(2011)；タバコについては,Maeder M. et al, Rapid “open-source” engineering of customized zinc-finger nuclease for highly efficient gene modification. Molecular Cell 31、294-301.(2008)；トウモロコシについては、Shukla,V.ra,Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nuclease.Nature 459, 437-441.(2009)）。従って、本発明においてTALENを利用する場合、これらの文献に記載の条件を適用してもよい。 So far, modification of endogenous genes using TALEN has been reported for Arabidopsis, tobacco, rice, and Brachypodium distachyon (Chen K. et al. TALENs: Custamizable molecular DNA scissors for genome engineering of plants. Journal of Genetics and Genomics 40, 271-279. (2013)). So far, modification of endogenous genes using zinc finger nuclease has been reported for Arabidopsis, soybean, tobacco, and corn. (For Arabidopsis and soybean, Sander J.ra, Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA). Nature Methods 8, 67-69. (2011); For tobacco, Maeder M. et al. al, Rapid “open-source” engineering of customized zinc-finger nuclease for highly efficient gene modification. Molecular Cell 31, 294-301. (2008); For maize, Shukla, V.ra, Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nuclease. Nature 459, 437-441. (2009)). Therefore, when TALEN is used in the present invention, the conditions described in these documents may be applied.
TALEN又はジンクフィンガーヌクレアーゼを植物細胞に導入するための方法としては、通常、これらのタンパク質を植物細胞内で発現する発現ベクターで植物細胞を形質転換する方法が用いられるが、これらタンパク質をコードするDNA若しくはメッセンジャーRNA又はこれらタンパク質自体を細胞に注入することにより、TALEN又はジンクフィンガーを植物細胞に導入することも可能である。CRISPR/Cas9を用いる場合にも、これと同様に、ガイドRNAを発現するベクター及びCas9を発現するベクターで植物細胞を形質転換すること、又は、ガイドRNA及びCas9を植物細胞に注入することによってこれらを植物細胞に導入することができる。 As a method for introducing TALEN or zinc finger nuclease into plant cells, a method of transforming plant cells with an expression vector that expresses these proteins in plant cells is usually used. DNA encoding these proteins Alternatively, TALEN or zinc finger can be introduced into plant cells by injecting messenger RNA or these proteins themselves into cells. Similarly, when using CRISPR / Cas9, transform plant cells with a guide RNA-expressing vector and a Cas9-expressing vector, or injecting guide RNA and Cas9 into the plant cells. Can be introduced into plant cells.
TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ等を発現するベクターは、RNAi誘導性核酸発現ベクターを作製する場合に準じて作製できる。また、それらベクターによる植物細胞の形質転換、形質転換された植物細胞からの植物体の再生等は、RNAi誘導性核酸発現ベクターによる形質転換の場合と類似の条件で行うことができる。
さらに、ゲノム上の特定の部位に変異を有する植物を得る方法として、ジーンターゲティング法がある。ジーンターゲティング法とは、内在性遺伝子の改変に相同組換え（homologous recombination）を用いる方法である。典型的には、順に、第一のゲノム領域の配列と同一又は高い同一性を有する第一のDNA、ハイグロマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子及び第二のゲノム領域の配列と同一又は高い同一性を有する第二のDNAを含むベクターを植物細胞に導入し、第一のゲノム領域と第一のDNAとの間の相同組換え（homologous recombination）及び第二のゲノム領域と第二のDNAとの間の相同組換えを惹起することにより、ゲノム上の上記第一のゲノム配列と上記第二のゲノム配列との間に上記ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挿入されたゲノムを有する植物を得ることができる。
ジーンターゲティング法により、内在性Sdr1遺伝子に変異を導入するためには、例えば、順に、内在性Sdr1遺伝子又はその近傍の第一のゲノム配列と同一又は高い同一性を有する第一のDNA、ハイグロマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子及び内在性Sdr1遺伝子又はその近傍の第二のゲノム配列と同一又は高い同一性を有する第二のDNAを含むベクターで植物を形質転換し、形質転換体をハイグロマイシン等で選抜することにより、上記内在性Sdr1遺伝子又はその近傍の第一のゲノム配列と上記内在性Sdr1遺伝子又はその近傍の第二のゲノム配列の間にマーカー遺伝子が挿入されたゲノムを有する植物を得ることができる。
A vector that expresses TALEN, zinc finger nuclease and the like can be prepared according to the preparation of an RNAi-inducible nucleic acid expression vector. Also, transformation of plant cells with these vectors, regeneration of plant bodies from transformed plant cells, and the like can be performed under the same conditions as in the case of transformation with RNAi-inducible nucleic acid expression vectors.
Furthermore, there is a gene targeting method as a method for obtaining a plant having a mutation at a specific site on the genome. The gene targeting method is a method using homologous recombination for modification of an endogenous gene. Typically, in sequence, the first DNA having the same or higher identity with the sequence of the first genomic region, a marker gene such as a hygromycin resistance gene, and the second genomic region with the same or higher identity. A vector comprising a second DNA having a plant cell and introducing a homologous recombination between the first genomic region and the first DNA and between the second genomic region and the second DNA; By inducing homologous recombination, a plant having a genome in which the hygromycin resistance gene or the like is inserted between the first genomic sequence and the second genomic sequence on the genome can be obtained.
In order to introduce a mutation into the endogenous Sdr1 gene by the gene targeting method, for example, in order, the first DNA having the same or high identity as the endogenous Sdr1 gene or the first genomic sequence in the vicinity thereof, hygromycin A plant is transformed with a vector comprising a marker gene such as a resistance gene and a second DNA having the same or high identity as the endogenous Sdr1 gene or a second genomic sequence in the vicinity thereof, and the transformant is transformed with hygromycin or the like. By selecting, a plant having a genome in which a marker gene is inserted between the endogenous Sdr1 gene or the first genomic sequence in the vicinity thereof and the endogenous Sdr1 gene or the second genomic sequence in the vicinity thereof is obtained. Can do.
ジーンターゲティング法に用いるベクターの作製及び植物細胞へのベクターの導入は、RNAi誘導性核酸を発現するためのベクターの作製法及び当該ベクターの植物細胞への導入のための方法に準じて行うことができる。
また、ゲノム上の特定の部位、例えば、Sdr1遺伝子内の特定の部位、に変異を有する植物を得る方法として、高エネルギー電磁波の照射や変異原性物質処理によりゲノムDNAにランダム変異が導入された植物個体ライブラリーから当該特定の部位に変異を有する植物個体を選抜する方法が挙げられる。当該特定の部位に変異を有する植物個体を選抜するためには、まず、突然変異誘起処理を受けた複数の植物個体から当業者によく知られた方法に従ってそれぞれのゲノムDNAを抽出し、それを鋳型として当該特定の部位の配列を含むDNAをPCRで増幅する。PCRで増幅されたDNAにおける変異の有無は、例えば、それら増幅されたDNAの塩基配列を決定することによって調べることができる。あるいは、セロリ由来のCelIヌクレアーゼを用いたTILLING法（特許第4213214号公報）によって変異を迅速に検出することができる。
Preparation of a vector for gene targeting and introduction of the vector into a plant cell can be performed according to a method for preparing a vector for expressing an RNAi-inducible nucleic acid and a method for introduction of the vector into a plant cell. it can.
In addition, as a method for obtaining a plant having a mutation at a specific site on the genome, for example, a specific site within the Sdr1 gene, random mutation was introduced into the genomic DNA by irradiation with high-energy electromagnetic waves or treatment with a mutagenic substance. There is a method of selecting a plant individual having a mutation at the specific site from the plant individual library. In order to select a plant individual having a mutation at the specific site, first, genomic DNA is extracted from a plurality of plant individuals subjected to the mutagenesis treatment according to a method well known to those skilled in the art. DNA containing the sequence of the specific site as a template is amplified by PCR. The presence or absence of a mutation in DNA amplified by PCR can be examined, for example, by determining the base sequence of the amplified DNA. Alternatively, the mutation can be rapidly detected by the TILLING method (Patent No. 4213214) using CelI nuclease derived from celery.
これまでに、シロイヌナズナ、エンバク（Avena sativa）、カンラン（Brassica oleracea）、ナタネ（Brassica rapa）、メロン、ダイズ、オオムギ、ミヤコグサ（Lotus japonicus）、イネ、トマト、ソルガム、コムギ等において、ランダム変異を導入された植物体集団の作製及びそれらについてのTILLING法を用いた変異体選抜が行われており、その結果内在性遺伝子に変異を有する多くの変異体植物が得られている（Kurowaka et al.,TILLING-a shortcut in functional genomics.Journal of Applied Genetics 52, 371-390(2011)）。 So far, random mutations have been introduced in Arabidopsis, Avena sativa, Brassica oleracea, Brassica rapa, Melon, Soybean, Barley, Lotus japonicus, Rice, Tomato, Sorghum, Wheat, etc. Plant populations and selection of mutants using the TILLING method have been carried out, and as a result, many mutant plants having mutations in endogenous genes have been obtained (Kurowaka et al., TILLING-a shortcut in functional genomics. Journal of Applied Genetics 52, 371-390 (2011)).
このようにして得られたSdr1遺伝子に変異を有する植物と野生型植物と交配して、その子孫であってSdr1遺伝子に変異を有する植物を選抜しそれをさらに野生型植物と交配することを繰り返すことによって、Sdr1遺伝子に変異を有するがそれ以外のゲノム領域のDNA配列が野生型植物由来である植物を作製することもできる。
本発明の一態様である、少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性を抑制する工程を含む、高い穂発芽耐性を有するイネ又はコムギの生産方法には、上述したRNAi法又はRdDM法によりSdr1遺伝子の発現を抑制する方法、及び部位特異的DNA分解酵素を用いる方法、ジーンターゲティング法又はランダム変異が導入された植物体ライブラリーから特定の部位に変異を有する植物体を選抜することによりSdr1遺伝子の活性を抑制する方法が含まれるが、これらに限定されない。ランダム変異が導入された植物体ライブラリーから特定の部位に変異を有する植物体を選抜する方法を行う場合には、「少なくとも一つの内在性Sdr1遺伝子の発現又は活性を抑制する工程」とは、ランダム変異が導入された植物体ライブラリーを自ら作製し又は当該植物体ライブラリーを他者から得て、これから特定の部位に変異を有し、内在性Ｓｄｒ１遺伝子の発現又は活性が抑制されている植物体を選抜することを意味する。
Crossing a plant having a mutation in the Sdr1 gene thus obtained with a wild-type plant, selecting a descendant plant having the mutation in the Sdr1 gene and further mating it with a wild-type plant is repeated. Thus, it is possible to produce a plant having a mutation in the Sdr1 gene, but the DNA sequence of the other genomic region is derived from a wild type plant.
In the method for producing rice or wheat having high ear germination resistance, which includes the step of suppressing the expression or activity of at least one endogenous Sdr1 gene, which is one embodiment of the present invention, Sdr1 is obtained by the RNAi method or the RdDM method described above. Sdr1 gene by selecting a plant having a mutation at a specific site from a method of suppressing gene expression, a method using a site-specific DNA degrading enzyme, a gene targeting method or a plant library into which a random mutation has been introduced Although the method of suppressing activity of this is included, it is not limited to these. When performing a method of selecting a plant having a mutation at a specific site from a plant library into which a random mutation has been introduced, the "step of suppressing the expression or activity of at least one endogenous Sdr1 gene" A plant library into which a random mutation has been introduced is prepared by itself or obtained from another person, and has a mutation at a specific site, and the expression or activity of the endogenous Sdr1 gene is suppressed. It means selecting plants.
これまでに、穂発芽耐性を制御する遺伝子としてイネのSdr4遺伝子及びシロイヌナズナのDOG1遺伝子が同定されているが、それらはどちらも本来穂発芽を抑制する活性を有する遺伝子である。Sdr4遺伝子やDOG1遺伝子等の本来穂発芽を抑制する活性を有する遺伝子を破壊又はその活性を抑制することによっては植物に穂発芽耐性を付与することはできない。突然変異による改変方法では、遺伝子の発現量の抑制、機能の低下、機能の欠失などの遺伝子の破壊が生じる頻度が高いと考えられるため、突然変異によって、Sdr4遺伝子やDOG1遺伝子等の破壊を生じさせ、穂発芽耐性を付与することは困難である。一方、Sdr1タンパク質は発芽促進機能を有する因子であり、該遺伝子の破壊により穂発芽耐性が付与できるという優れた点がある。遺伝子組換えのみならず、変異系統を人為的に生産したり突然変異系統を選抜することによる非組換体での穂発芽耐性付与は大きな利点となる。 So far, the rice Sdr4 gene and the Arabidopsis DOG1 gene have been identified as genes that control panicle germination resistance, both of which are genes originally having an activity of suppressing panicle germination. It is not possible to confer resistance to germination of plants by destroying or suppressing genes that originally have the activity of suppressing ear germination, such as the Sdr4 gene and the DOG1 gene. In the modification method by mutation, it is thought that gene destruction such as suppression of gene expression level, reduction of function, loss of function, etc. is likely to occur, so mutations can disrupt the Sdr4 gene, DOG1 gene, etc. It is difficult to produce and impart panicle germination resistance. On the other hand, Sdr1 protein is a factor having a germination promoting function, and has an excellent point that resistance to ear germination can be imparted by disruption of the gene. In addition to gene recombination, imparting ear germination resistance in non-recombinants by artificially producing mutant strains or selecting mutant strains is a great advantage.
種子の休眠性が弱い場合、収穫前や貯蔵中に種子が発芽してしまい、作物の価値を低下させる恐れがある。そのため不要な発芽を低減できる意味は非常に大きい。このことは、種子の状態で利用される植物において特に問題である。また特に、作物の穂発芽耐性が低い場合、長雨などの不可避の条件によって種子が発芽してしまうことがあり、重大な問題である。Sdr1遺伝子の発現または機能が上記のように改変された本発明に係る植物は高い穂発芽性耐性が付与されているので、不要な発芽を大幅に低減でき、植物の利用価値が格段に高められている。 If seed dormancy is weak, seeds may germinate before harvesting or during storage, which may reduce the value of the crop. Therefore, the meaning which can reduce unnecessary germination is very large. This is a particular problem in plants that are utilized in the seed state. In particular, when the crop germination tolerance is low, seeds may germinate under inevitable conditions such as long rain, which is a serious problem. Since the plant according to the present invention in which the expression or function of the Sdr1 gene is modified as described above is imparted with high ear germination tolerance, unnecessary germination can be greatly reduced, and the utility value of the plant is greatly enhanced. ing.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
［Sdr1遺伝子座］
穂発芽耐性を支配する遺伝子座Sdr1の効果を明らかにするために、準同質遺伝子系統、NIL[Sdr1]を用いて出穂後一定期間の後に吸水による発芽試験を行った。NIL[Sdr1]は日本晴を背景親とし、カサラスに対して戻し交雑を繰り返すことにより作成され、RFLPマーカーのR10942-C1452の領域がカサラス由来の染色体断片に置換されたものである（図１A）（非特許文献１）。背景親である日本晴（○）と比較してNIL[Sdr1]（●）は出穂日から穂を切り取った日までの期間にかかわらず低い発芽率を示し、高い穂発芽耐性を持つことが示された（図１B）。
発芽試験は、以下のように行った。各系統の各イネ個体の出穂日を記録し、出穂日から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後及び１０週間後のイネ個体各１０個体の穂を切り取り、切り取った穂を、それぞれ、水で湿らせたペーパーハンドタオル（商品名：クレシアEFハンドタオルソフトタイプ、日本製紙クレシア株式会社製）でくるんでタッパウエアーに入れ、密封して３０℃、暗所に１週間静置した。次いで、穂をタッパウエアーから取り出し、穂についている種子数に対する発芽している種子数の割合を出穂日からそれぞれの期間後における発芽率とした。同一の系統に属する１０個体のイネ個体の発芽率の平均を各系統の発芽率とした。
[Sdr1 locus]
In order to elucidate the effect of the locus Sdr1, which controls panicle germination resistance, a germination test by water absorption was performed after a certain period after heading using a near-isogenic line, NIL [Sdr1]. NIL [Sdr1] was created by repeating backcrossing against Kasalath with Nipponbare as the background parent, and the RFLP marker R10942-C1452 region was replaced with a Kasalath-derived chromosome fragment (FIG. 1A). Non-patent document 1). NIL [Sdr1] (●) shows low germination rate regardless of the period from the heading date to the date of cutting the ears, compared to the background parent, Nipponbare (○). (FIG. 1B).
The germination test was performed as follows. The heading date of each rice individual of each line is recorded, and 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 7 weeks, 8 weeks, 9 weeks and 10 weeks after each heading date, Cut the ears and wrap each cut ear with a paper hand towel (trade name: Crecia EF hand towel soft type, made by Nippon Paper Crecia Co., Ltd.) moistened with water. And left in the dark for 1 week. Next, the ears were taken out from Tappaware, and the ratio of the number of germinated seeds to the number of seeds on the ear was taken as the germination rate after each period from the date of heading. The average germination rate of 10 rice individuals belonging to the same line was defined as the germination rate of each line.
［高精度連鎖解析による穂発芽耐性遺伝子Sdr1のマッピング］
日本晴とカサラスの戻し交雑後代系統世代であり、Sdr1遺伝子座候補領域を含むR2778マーカーからC1452マーカーの間の領域がカサラス由来の染色体に置換されている系統であるNIL[Sdr1/Hd8] に（図１Ａ参照）（非特許文献１のFig.5参照）、日本晴を戻し交配して得られたF2種子2,375から、C706-R216間で組み換えを起こした89系統を、連鎖解析用の集団として取得し、後代固定系統の発芽率の分布を調べた。更にRFLPマーカーのR134, C12534, E20204, R3955, E61452, R10942, P411F11-GM69, R2849, P411F11-GM13, P411F11-GM24, C1488, E50236, P411F11-A30, C2045, C606を用いたタイピングを行った（図１C参照）。前記F2世代の発芽率に関する形質の評価は以下のように行った。
形質の評価方法を、図１Dを参照して説明する。F3世代の発芽率の分布を調べた結果、01F3-61の様に発芽率が高い系統と低い系統に分離した場合は、その親系統（F2世代）に当たる00RS1-6のSdr1遺伝子座候補領域がヘテロ（H）であることが示される。同様に、00RS1-8の場合は後代の集団である01F3-62は発芽率が高く、すなわち日本晴型（A）に、00RS1-117の場合は後代の集団である01F3-75は発芽率が低く、カサラス型（B）にホモ化されていることが示される。
遺伝子型と発芽率の比較により、C1488-R2849間にSdr1遺伝子座候補領域が座乗することが示された（図１C）。さらに、後述のように、PCRスクリーニングにより取得したSdr1遺伝子座候補領域を含むカサラスゲノム配列BAC（KBM103F11）からSdr1遺伝子座候補領域周辺のHindIII-HindIII断片をクローン化し、その配列を決定した。この情報を元にマーカー作成とタイピングを進めた結果、Sdr1の候補領域はP411F11-92453-4UL（プライマー5'- TCG CAA TAG TAG TGC ACA GCT -3'（配列番号：１５））およびP411F11-95547-1ULプライマー5'- AGT AGG ATT CTT ATT GGT TGG C -3'（配列番号：１６））の間に位置づけられたP411F11-92453-4ULとP411F11-95547-1UL間となった（図２）。
マッピングのための各イネ個体の発芽試験は以下のように行った。イネ個体の穂を当該イネ個体の出穂日から６週間後に切り取り、切り取った穂を、それぞれ、水で湿らせたペーパーハンドタオル（商品名：クレシアEFハンドタオルソフトタイプ、日本製紙クレシア株式会社製）でくるんでタッパウエアーに入れ、密封して30℃、暗所に１週間静置した。次いで、穂をタッパウエアーから取り出し、穂についている種子数に対する発芽している種子数の割合をイネ個体の発芽率とした。
[Mapping of panicle germination resistance gene Sdr1 by high-precision linkage analysis]
NIL [Sdr1 / Hd8], a generation of backcross lines of Nipponbare and Kasaras, in which the region between the R2778 marker and the C1452 marker, including the Sdr1 locus candidate region, has been replaced with a Kasaras-derived chromosome (Fig. (See Fig. 1A) (See Fig. 5 of Non-Patent Document 1). From the F2 seed 2,375 obtained by backcrossing Nipponbare, 89 lines that had undergone recombination between C706-R216 were acquired as a group for linkage analysis. Then, the germination rate distribution of progeny fixed lines was examined. In addition, typing using RFLP markers R134, C12534, E20204, R3955, E61452, R10942, P411F11-GM69, R2849, P411F11-GM13, P411F11-GM24, C1488, E50236, P411F11-A30, C2045, C606 (Fig. 1C). The traits for germination rate of the F2 generation were evaluated as follows.
The method for evaluating the character will be described with reference to FIG. 1D. As a result of examining the distribution of the germination rate of the F3 generation, when it was separated into a high germination rate line such as 01F3-61 and a low germination line, the Sdr1 locus candidate region of 00RS1-6 corresponding to its parental line (F2 generation) Shown to be hetero (H). Similarly, in the case of 00RS1-8, the progeny group 01F3-62 has a high germination rate, that is, Nipponbare type (A), and in the case of 00RS1-117, the progeny group 01F3-75 has a low germination rate. , Is shown to be homogenized to the Casalras type (B).
Comparison of the genotype and germination rate indicated that the Sdr1 locus candidate region sits between C1488-R2849 (FIG. 1C). Furthermore, as described later, a HindIII-HindIII fragment around the Sdr1 locus candidate region was cloned from the Kasaras genomic sequence BAC (KBM103F11) containing the Sdr1 locus candidate region obtained by PCR screening, and its sequence was determined. As a result of proceeding with marker creation and typing based on this information, Sdr1 candidate regions were P411F11-92453-4UL (primer 5'-TCG CAA TAG TAG TGC ACA GCT-3 '(SEQ ID NO: 15)) and P411F11-95547 -1UL primer 5′-AGT AGG ATT CTT ATT GGT TGG C -3 ′ (SEQ ID NO: 16)) was positioned between P411F11-92453-4UL and P411F11-95547-1UL (FIG. 2).
The germination test of each rice individual for mapping was performed as follows. Paper hand towels obtained by cutting the ears of rice individuals 6 weeks after the date of heading of the rice individual and moistening the cut ears with water (trade name: Crecia EF hand towel soft type, manufactured by Nippon Paper Crecia Co., Ltd.) Wrapped in tupperware, sealed and left at 30 ° C. in a dark place for 1 week. Next, the ears were taken out from Tappaware, and the ratio of the number of germinated seeds to the number of seeds on the ears was taken as the germination rate of the rice individuals.
［Sdr1遺伝子座候補領域の配列解読］
そこで、前記Sdr1遺伝子座候補領域を含み、PCRスクリーニングにより取得したカサラスゲノム配列BACクローン（KBM103F11）からHindIII-HindIII断片（Sdr1候補領域を含む11-kb、図2(A)）をpBluescriptSK-II(+)のEcoRVサイトにサブクローニングし、Sdr1遺伝子座候補領域の配列を決定した。その結果、候補領域内には8個の１塩基多型と1つの1塩基欠失が存在していることが判明し、Sdr1遺伝子座候補領域は2528bpまで縮小された（図２(B),(C)）。上記2528bpのSdr1遺伝子座候補領域（カサラスゲノム配列）を配列番号１１に示し、2528bpのSdr1遺伝子座候補領域（日本晴ゲノム配列）を配列番号１２に示す。
[Sequencing of the Sdr1 locus candidate region]
Therefore, a HindIII-HindIII fragment (11-kb containing the Sdr1 candidate region, FIG. 2 (A)) from the Kasaras genomic sequence BAC clone (KBM103F11) obtained by PCR screening, containing the Sdr1 locus candidate region, was converted into pBluescriptSK-II (+ ) Was subcloned into the EcoRV site and the sequence of the Sdr1 locus candidate region was determined. As a result, eight single nucleotide polymorphisms and one single nucleotide deletion were found in the candidate region, and the Sdr1 locus candidate region was reduced to 2528 bp (FIG. 2 (B), (C)). The 2528 bp Sdr1 locus candidate region (casalas genome sequence) is shown in SEQ ID NO: 11, and the 2528 bp Sdr1 locus candidate region (Nipponbare genome sequence) is shown in SEQ ID NO: 12.
［Sdr1遺伝子の特定のための相補試験］
Sdr1遺伝子座の責任遺伝子であるSdr1遺伝子を同定するために相補性試験を行った。以下に説明する相補試験に用いた配列の、NruI-NruI断片とSalI-HindIII断片とを合わせた配列であるNruI-NruI-HindIIIについて、カサラス由来Sdr1対立遺伝子の配列を配列表の配列番号６に、日本晴由来Sdr1対立遺伝子の配列を配列表の配列番号７にそれぞれ示す。
[Complementary test for identification of Sdr1 gene]
Complementation tests were performed to identify the Sdr1 gene, which is responsible for the Sdr1 locus. Regarding the NruI-NruI-HindIII sequence, which is a combination of the NruI-NruI fragment and the SalI-HindIII fragment, used in the complementary test described below, the sequence of the Sdr1 allele from Kasalath is shown in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing. The sequences of Nipponbare-derived Sdr1 alleles are shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, respectively.
（カサラス由来NruI-NruI断片を用いた相補性試験）
前述の配列解読の際にも用いたカサラス由来のNruI-NruI断片（図３A）をpBluescriptSK-II(+)SmaIサイトにサブクローニングしたプラスミドからNotI-KpnI処理により切りだし、Klenow fragmentによりNotIサイトをfill inにより平滑末端化した後pPZP2HlacのSmaI-KpnIサイトに挿入した。これをpPZP-Sdr1-Knとし、これを用いてリゾビウムラジオバクター（アグロバクテリウム）EHA101株をエレクトロポレーション法により形質転換し、アグロバクテリウム法により日本晴を形質転換した。サザンハイブリダイゼーション法によりシングルコピーが導入された系統を選び、後代固定系統を用いて発芽試験を行った。しかし、NruI-NruI断片が導入された日本晴系統（図３B：N29、N32、N51、N63、N68、N89、N117）とベクターコントロールが導入された日本晴系統（図３B：V7、V12、V22）との間で発芽率に差は見られなかった。
NruI-NruI断片が導入された日本晴系統およびベクターコントロールが導入された日本晴系統に属するイネ個体の発芽試験は以下のとおりに行った。各系統に属するイネ個体の穂を出穂日から５週間後に切り取り種子を収穫した。種子を収穫した日と同日に、イネ個体１個体あたり30粒の種子を、1.2mlの蒸留水で湿らせた直径33 mmの濾紙（ＴＯＹＯ＃２，東洋濾紙株式会社製）を敷いた６穴プラスティックプレート（Falcon社製）の１穴に入れ、種子の吸水を開始させた。プラスティックプレートのふたをした状態で、30℃、暗所に静置し、発芽している種子の数を毎日数えた。はじめに６穴プレートに入れられた種子の数に対する発芽している種子の数の割合をイネ個体の発芽率とした。
(Complementarity test using Casalus-derived NruI-NruI fragment)
The Nsal-derived NruI-NruI fragment (Fig. 3A), which was also used for the above sequence decoding, was cut out from the plasmid subcloned into the pBluescriptSK-II (+) SmaI site by NotI-KpnI treatment, and the NotI site was filled with Klenow fragment. After blunting with in, it was inserted into the SmaI-KpnI site of pPZP2Hlac. This was designated as pPZP-Sdr1-Kn. Using this, Rhizobium radiobacter (Agrobacterium) EHA101 strain was transformed by electroporation, and Nipponbare was transformed by Agrobacterium. A line in which a single copy was introduced was selected by Southern hybridization, and a germination test was performed using a progeny fixed line. However, the Nipponbare system (FIG. 3B: N29, N32, N51, N63, N68, N89, N117) into which the NruI-NruI fragment was introduced and the Nipponbare system (FIG. 3B: V7, V12, V22) into which vector control was introduced There was no difference in germination rate between.
Germination tests were conducted as follows for rice individuals belonging to the Nipponbare line into which the NruI-NruI fragment was introduced and the Nipponbare line into which vector control was introduced. Rice seeds belonging to each line were harvested 5 weeks after the heading date to harvest seeds. 6 holes covered with 33 mm diameter filter paper (TOYO # 2, manufactured by Toyo Filter Paper Co., Ltd.) 30 seeds per rice plant moistened with 1.2 ml distilled water on the same day as the day of harvesting the seeds It was put into one hole of a plastic plate (manufactured by Falcon) to start water absorption of seeds. With the plastic plate covered, it was allowed to stand in the dark at 30 ° C., and the number of germinated seeds was counted every day. First, the ratio of the number of germinating seeds to the number of seeds placed in the 6-well plate was taken as the germination rate of the rice individuals.
（カサラス由来SalI-HindIII断片を用いた相補性試験）
そこで、Sdr1遺伝子座候補領域がプロモーターである可能性を考慮し、前記候補領域2528bpおよびその下流に位置するOs03g0292700遺伝子のタンパク質コード領域を含むSalI-HindIII断片（図３A）による相補性試験に取り組んだ。なお、Os03g0292700とは、The Rice Genome Annotation Project Database (http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse_details/irgsp1?name=Os03g0292700)における遺伝子のIDである。カサラス由来DNAのBACクローン（KBM103F11）からBamHI-BamHI断片(7.5-kb)を切り出し、pBluescriptSK-II(+)のBamHIサイトにサブクローニングした。さらに前出のNruI-NruI断片をサブクローニングしたベクターからSalI-BamHI断片(2.4-kb)とBamHI-BamHI断片をサブクローニングしたベクターからBamHI-HindIII断片(5.1-kb)を切り出し、pPZP2HlacのHindIII-SalIサイトに挿入し、これをpPZP-Sdr1-KShとした（図３A、KSh）。これを用いてリゾビウムラジオバクター（アグロバクテリウム）EHA101株をエレクトロポレーション法により形質転換した。アグロバクテリウム法により日本晴を形質転換した。サザンハイブリダイゼーション法によりシングルコピーが導入された系統を選び、後代固定系統を用いて発芽試験を行った。その結果、前記SalI−HindIII断片を導入した日本晴系統（図３C：KSh4、KSh13、Ksh15）は、ベクターコントロールを導入した日本晴系統（図３C：V7、V12、V22）と比較して高い発芽率を示した。
上記後代固定系統に属するイネ個体の発芽試験は以下のとおりに行った。各系統に属するイネ個体の穂を出穂日から５週間後に切り取り種子を収穫した。種子を収穫した日と同日に、イネ個体１個体あたり30粒の種子を、1.2mlの蒸留水で湿らせた直径33 mmの濾紙（ＴＯＹＯ＃２，東洋濾紙株式会社製）を敷いた６穴プラスティックプレート（Falcon社製）の１穴に入れ、種子の吸水を開始させた。プラスティックプレートのふたをした状態で、30℃、暗所に静置し、発芽している種子の数を毎日数えた。はじめに６穴プレートに入れられた種子の数に対する発芽している種子の数の割合を、発芽している種子の数を数えた日におけるイネ個体の発芽率とした。
(Complementarity test using Kasalath-derived SalI-HindIII fragment)
Therefore, considering the possibility that the Sdr1 locus candidate region is a promoter, a complementation test using the SalI-HindIII fragment (FIG. 3A) containing the protein coding region of the candidate region 2528bp and the Os03g0292700 gene located downstream thereof was tackled. . Os03g0292700 is a gene ID in The Rice Genome Annotation Project Database (http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse_details/irgsp1?name=Os03g0292700). A BamHI-BamHI fragment (7.5-kb) was excised from a BAC clone (KBM103F11) of Kasalath-derived DNA and subcloned into the BamHI site of pBluescriptSK-II (+). Furthermore, the BamHI-HindIII fragment (5.1-kb) was excised from the vector obtained by subcloning the SalI-BamHI fragment (2.4-kb) and the BamHI-BamHI fragment from the vector obtained by subcloning the NruI-NruI fragment, and the HindIII-SalI site of pPZP2Hlac. This was used as pPZP-Sdr1-KSh (FIG. 3A, KSh). Using this, Rhizobium radiobacter (Agrobacterium) EHA101 strain was transformed by electroporation. Nipponbare was transformed by the Agrobacterium method. A line in which a single copy was introduced was selected by Southern hybridization, and a germination test was performed using a progeny fixed line. As a result, the Nipponbare line (FIG. 3C: KSh4, KSh13, Ksh15) into which the SalI-HindIII fragment was introduced had a higher germination rate compared with the Nipponbare line (FIG. 3C: V7, V12, V22) into which vector control was introduced. Indicated.
The germination test of rice individuals belonging to the above-mentioned progeny fixed lines was performed as follows. Rice seeds belonging to each line were harvested 5 weeks after the heading date to harvest seeds. 6 holes covered with 33 mm diameter filter paper (TOYO # 2, manufactured by Toyo Filter Paper Co., Ltd.) 30 seeds per rice plant moistened with 1.2 ml distilled water on the same day as the day of harvesting the seeds It was put into one hole of a plastic plate (manufactured by Falcon) to start water absorption of seeds. With the plastic plate covered, it was allowed to stand in the dark at 30 ° C., and the number of germinated seeds was counted every day. First, the ratio of the number of germinating seeds to the number of seeds placed in the 6-well plate was taken as the germination rate of rice individuals on the day when the number of germinating seeds was counted.
（日本晴由来SalI-HindIII断片を用いた相補性試験）
さらに、穂発芽耐性を示すNIL[Sdr1]に、Os03g0292700遺伝子のタンパク質コード領域を含む日本晴由来のSalI-HindIII断片（図３A）を導入して相補性試験を行った。
日本晴ゲノムDNAからTakara PrimeSTAR-GXLポリメラーゼとSdr1C7NSh-F1 (5'-TTCTCGTTGTTCATGCTTGC-3'（配列番号１７）) プライマーとSdr1C7NSh-R1a (5'-TACTGCTGCAACCTGCAAAG-3'（配列番号１８）)プライマーによりSalI-HindIII断片(7.5-kb)を含む断片を増幅し、pCR-blunt-II TOPOクローニングベクターにクローン化した。PCRによる塩基置換がないことを確認した後、SalI-BamHI断片(2.4-kb)とBamHI-HindIII断片(5.1-kb)に分割して切り出し、pPZP2HlacのHindIII-SalIサイトに挿入し、これをpPZP-Sdr1-NShとした。これを用いてリゾビウムラジオバクター（アグロバクテリウム）EHA101株をエレクトロポレーション方により形質転換した。アグロバクテリウム法により日本晴NIL[Sdr1]を形質転換した。HPTを増幅するプライマーセット（HPT-F2: 5'-gatgtaggagggcgtggata-3'（配列番号１９）、HPT-R2: 5'-ataggtcaggctctcgctga-3'（配列番号２０））を用いたリアルタイムPCR法によりシングルコピーが導入された系統を選び、後代固定系統を用いて発芽試験を行った結果、日本晴由来のSalI-HindIII断片を導入した系統（図３D：NSh3、NSh5、NSh9）はベクターコントロール系統（図３D：S1V7、S1V8、S1V9）と比較して高い発芽率を示した。
以上の結果から、Os03g029700遺伝子は、Sdr1遺伝子座の責任遺伝子である内在性Sdr1遺伝子であり、Sdr1遺伝子のタンパク質コード領域より上流側の領域がSdr1遺伝子のプロモーター領域であることが推測された。また、野生型のSdr1遺伝子は発芽を促進する機能を有していること、および、日本晴にカサラスゲノムを導入した系統、NIL[Sdr1]に日本晴ゲノム断片を導入した系統ともに高い発芽率を示し、内在性のカサラス型Sdr1遺伝子に外来の日本晴型Sdr1遺伝子が加わる、あるいは、その逆の場合も同様に発芽率が上昇したことから、相加的な効果で発芽が促進されていることが推察された。
上記後代固定系統に属するイネ個体の発芽試験は以下のとおりに行った。各系統に属するイネ個体の穂を出穂日から５週間後に切り取り種子を収穫した。種子を収穫した日と同日に、イネ個体１個体あたり30粒の種子を、1.2mlの蒸留水で湿らせた直径33 mmの濾紙（ＴＯＹＯ＃２，東洋濾紙株式会社製）を敷いた６穴プラスティックプレート（Falcon社製）の１穴に入れ、種子の吸水を開始させた。プラスティックプレートのふたをした状態で、30℃、暗所に静置し、発芽している種子の数を毎日数えた。はじめに６穴プレートに入れられた種子の数に対する発芽している種子の数の割合を、発芽している種子の数を数えた日におけるイネ個体の発芽率とした。
(Complementarity test using Sali-HindIII fragment derived from Nipponbare)
Furthermore, a Nal [Sdr1] exhibiting panicle germination resistance was introduced with a Nippon Ibare-derived SalI-HindIII fragment (FIG. 3A) containing the protein coding region of the Os03g0292700 gene, and a complementation test was performed.
From Nipponbare Genomic DNA, SalI-STAR-GXL polymerase and Sdr1C7NSh-F1 (5'-TTCTCGTTGTTCATGCTTGC-3 '(SEQ ID NO: 17)) primer and Sdr1C7NSh-R1a (5'-TACTGCTGCAACCTGCAAAG-3' (SEQ ID NO: 18)) primer A fragment containing the HindIII fragment (7.5-kb) was amplified and cloned into the pCR-blunt-II TOPO cloning vector. After confirming that there was no base substitution by PCR, cut into SalI-BamHI fragment (2.4-kb) and BamHI-HindIII fragment (5.1-kb), cut it out and inserted it into the HindIII-SalI site of pPZP2Hlac. -Sdr1-NSh. Using this, Rhizobium radiobacter (Agrobacterium) EHA101 strain was transformed by electroporation. Nipponbare NIL [Sdr1] was transformed by Agrobacterium method. Single copy by real-time PCR using HPT-amplifying primer set (HPT-F2: 5'-gatgtaggagggcgtggata-3 '(SEQ ID NO: 19), HPT-R2: 5'-ataggtcaggctctcgctga-3' (SEQ ID NO: 20)) As a result of selecting a line in which S. is introduced and performing a germination test using a progeny-fixed line, a line into which the Nipponbare-derived SalI-HindIII fragment was introduced (FIG. 3D: NSh3, NSh5, NSh9) is a vector control line (FIG. 3D: S1V7, S1V8, S1V9) showed higher germination rate.
From the above results, it was speculated that the Os03g029700 gene is an endogenous Sdr1 gene that is a responsible gene of the Sdr1 locus, and the region upstream of the protein coding region of the Sdr1 gene is the promoter region of the Sdr1 gene. In addition, the wild-type Sdr1 gene has a function of promoting germination, and a high germination rate was exhibited in both lines in which the Kasara genome was introduced into Nipponbare and the line in which the Nipponbare genome fragment was introduced into NIL [Sdr1]. Since the exogenous Nipponbare-type Sdr1 gene was added to the sexual Kasalath type Sdr1 gene, or vice versa, the germination rate increased in the same way, suggesting that germination was promoted by an additive effect. .
The germination test of rice individuals belonging to the above-mentioned progeny fixed lines was performed as follows. Rice seeds belonging to each line were harvested 5 weeks after the heading date to harvest seeds. 6 holes covered with 33 mm diameter filter paper (TOYO # 2, manufactured by Toyo Filter Paper Co., Ltd.) 30 seeds per rice plant moistened with 1.2 ml distilled water on the same day as the day of harvesting the seeds It was put into one hole of a plastic plate (manufactured by Falcon) to start water absorption of seeds. With the plastic plate covered, it was allowed to stand in the dark at 30 ° C., and the number of germinated seeds was counted every day. First, the ratio of the number of germinating seeds to the number of seeds placed in the 6-well plate was taken as the germination rate of rice individuals on the day when the number of germinating seeds was counted.
［RNAiによるイネSdr1遺伝子ノックダウン系統の作出］
RNAi法によりSdr1遺伝子のノックダウン系統を作成した。まず、Sdr1遺伝子のタンパク質コード領域のアンチセンス方向の部分断片の増幅とその前後にHindIIIサイトとXbaIサイトを生成するためにcDNAクローンをテンプレートとしてフォワードプライマー（SdrIC7-HindIII-F: 5'-ACCGGGAAGCttCCGTGGTCAG-3'（配列番号２１））及びリバースプライマー（SdrIC7-XbaI-R: 5'-GTTTGACGCCAtCTaGACGAGCCTTC-3'（配列番号２２））を用いたPCRを行い、HindIIIおよびXbaIにより切断し、アンチセンス方向の断片を精製した。次に、Sdr1遺伝子のタンパク質コード領域のセンス方向の部分断片の増幅とその前後にEcoRIサイトとSalIサイトを生成するためにcDNAクローンをテンプレートとしてフォワードプライマー（SdrIC7-EcoRI-F: 5'-TCACCGGGAAttcGCCGTGGTCAG-3'（配列番号２３））及びリバースプライマー（SdrIC7-SalI-R: 5'-GTTTGACGCCAAgTCGACGAGCC-3'（配列番号２４））を用いたPCRを行い、EcoRIおよびSalIにより切断し、センス方向の断片を精製した。最後に、両部分断片のスペーサーとしてβ-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）のHindIIIおよびEcoRIサイトを持つ部分断片をGUSi-F-Hd (5'-CCGGGTGAAGCTTATCTCTATG-3'（配列番号２５）)およびGUSI-R-ER (5'-GCTTCGAAACGAATTCCTAAAGAGAG-3'（配列番号２６）)プライマーにより増幅、HindIIIおよびEcoRIにより切断した断片を精製した。これら３つの断片をpPZP2Ha3(+)のXbaI-SalIサイトに挿入し、pPZP-Sdr1C7iを作成した。このベクターは、二重鎖ＲＮＡ部分が配列番号１３で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１４で表される塩基配列のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡを誘導可能なベクターである。このベクターを用いてEHA101株をエレクトロポレーション法により形質転換した。アグロバクテリウム法により日本晴を形質転換した。HPTを増幅するプライマーセット（HPT-F2: 5'-gatgtaggagggcgtggata-3'（配列番号１９）、HPT-R2: 5'-ataggtcaggctctcgctga-3'（配列番号２０））を用いたリアルタイムPCR法によりシングルコピーが導入された系統を選び、後代固定系統を用いて発芽試験を行った。その結果、pPZP-Sdr1C7iを導入した系統（図４A：KD3A、KD6、KD23）は、ベクターコントロール系統（図４A：V7、V12、V22）と比較して低い発芽率を示し、高い穂発芽耐性が獲得されていた。これによりイネSdr1遺伝子の翻訳産物が発芽促進因子である事が示された。
上記後代固定系統に属するイネ個体の発芽試験は以下のとおりに行った。各系統に属するイネ個体の穂を出穂日から７週間後に切り取り種子を収穫した。種子を収穫した日と同日に、イネ個体１個体あたり30粒の種子を、1.2mlの蒸留水で湿らせた直径33 mmの濾紙（ＴＯＹＯ＃２，東洋濾紙株式会社製）を敷いた６穴プラスティックプレート（Falcon社製）の１穴に入れ、種子の吸水を開始させた。プラスティックプレートのふたをした状態で、30℃、暗所に静置し、発芽している種子の数を毎日数えた。はじめに６穴プレートに入れられた種子の数に対する発芽している種子の数の割合を、発芽している種子の数を数えた日におけるイネ個体の発芽率とした。
[Generation of rice Sdr1 gene knockdown lines by RNAi]
A knockdown strain of Sdr1 gene was prepared by RNAi method. First, amplification of a partial fragment in the antisense direction of the protein coding region of the Sdr1 gene and a forward primer (SdrIC7-HindIII-F: 5'-ACCGGGAAGCttCCGTGGTCAG-) using a cDNA clone as a template to generate HindIII and XbaI sites before and after that Perform PCR using 3 '(SEQ ID NO: 21)) and reverse primer (SdrIC7-XbaI-R: 5'-GTTTGACGCCAtCTaGACGAGCCTTC-3' (SEQ ID NO: 22)), cleave with HindIII and XbaI, and fragments in the antisense direction Was purified. Next, amplification of a partial fragment in the sense direction of the protein coding region of the Sdr1 gene and a forward primer (SdrIC7-EcoRI-F: 5'-TCACCGGGAAttcGCCGTGGTCAG-) using a cDNA clone as a template to generate EcoRI and SalI sites before and after that PCR using 3 ′ (SEQ ID NO: 23)) and reverse primer (SdrIC7-SalI-R: 5′-GTTTGACGCCAAgTCGACGAGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 24)), cleaved with EcoRI and SalI, and fragments in the sense direction were Purified. Finally, partial fragments having HindIII and EcoRI sites of β-glucuronidase gene (GUS) as spacers of both partial fragments were designated as GUSi-F-Hd (5′-CCGGGTGAAGCTTATCTCTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 25)) and GUSI-R- Amplified with ER (5′-GCTTCGAAACGAATTCCTAAAGAGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 26)) primer, the fragment cleaved with HindIII and EcoRI was purified. These three fragments were inserted into the XbaI-SalI site of pPZP2Ha3 (+) to create pPZP-Sdr1C7i. This vector is a vector capable of inducing an siRNA having a sense strand having a double-stranded RNA portion consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and an antisense strand having a base sequence represented by SEQ ID NO: 14. Using this vector, EHA101 strain was transformed by electroporation. Nipponbare was transformed by the Agrobacterium method. Single copy by real-time PCR using HPT-amplifying primer set (HPT-F2: 5'-gatgtaggagggcgtggata-3 '(SEQ ID NO: 19), HPT-R2: 5'-ataggtcaggctctcgctga-3' (SEQ ID NO: 20)) A line in which was introduced was selected, and a germination test was performed using a progeny fixed line. As a result, the lines in which pPZP-Sdr1C7i was introduced (FIG. 4A: KD3A, KD6, KD23) showed a low germination rate and high ear germination resistance compared to vector control lines (FIG. 4A: V7, V12, V22). Had been earned. This showed that the translation product of rice Sdr1 gene is a germination promoting factor.
The germination test of rice individuals belonging to the above-mentioned progeny fixed lines was performed as follows. Rice seeds belonging to each line were harvested 7 weeks after the heading date to harvest seeds. 6 holes covered with 33 mm diameter filter paper (TOYO # 2, manufactured by Toyo Filter Paper Co., Ltd.) 30 seeds per rice plant moistened with 1.2 ml distilled water on the same day as the day of harvesting the seeds It was put into one hole of a plastic plate (manufactured by Falcon) to start water absorption of seeds. With the plastic plate covered, it was allowed to stand in the dark at 30 ° C., and the number of germinated seeds was counted every day. First, the ratio of the number of germinating seeds to the number of seeds placed in the 6-well plate was taken as the germination rate of rice individuals on the day when the number of germinating seeds was counted.
［イネSdr1遺伝子過剰発現系統の作出］
これまでの結果を踏まえ、Sdr1遺伝子座候補領域はSdr1遺伝子のプロモーター領域であること、Sdr1遺伝子が相加的に発現されることにより発芽が促進されることが推察された。そこで、Sdr1遺伝子を過剰発現する系統を作出することとした。
はじめにpCMVFL3ベクターにSdr1遺伝子を完全に含むDNAが挿入されているプラスミド（クローン名：002-137-011）を独立行政法人農業生物資源研究所ゲノムリソースセンターから入手し、このプラスミドをマルチクローニングサイト内のEcoRIサイトで切断した後Klenowポリメラーゼによりfill inを行い、平滑末端化した。さらに、挿入配列の反対側に位置するマルチクローニングサイト内のXbaIで切断し、完全長クローン断片を精製した。次に、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター配列を有するpPZP2Ha3(+)のマルチクローニングサイト内のBamHIで切断した後Klenowポリメラーゼによりfill inを行い、平滑末端化した。さらに、マルチクローニングサイト内のXbaIで切断し、ベクター断片を精製した。両断片をT4リガーゼにより結合し、pPZP-35S-Sdr1C7を作製した。これを用いてリゾビウムラジオバクター（アグロバクテリウム）EHA101株をエレクトロポレーション方により形質転換した。アグロバクテリウム法により日本晴を形質転換した。HPTを増幅するプライマーセット（HPT-F2: 5'-gat gta gga ggg cgt gga ta-3'（配列番号１９）、HPT-R2:ata 5'-ggt cag gct ctc gct ga-3'（配列番号２０））を用いたリアルタイムPCR法によりシングルコピーが導入された系統を選び、後代固定系統を用いて発芽試験を行った。その結果、pPZP-35S-Sdr1C7を導入した系統（図４B：OX5）はベクターコントロール系統（図４B：V7、V12、V22）と比較して高い発芽率を示すことが明らかとなった。これによりSdr1遺伝子翻訳産物が発芽促進因子である事が確認された。
上記後代固定系統に属するイネ個体の発芽試験は以下のとおりに行った。各系統に属するイネ個体の穂を出穂日から５週間後に切り取り種子を収穫した。種子を収穫した日と同日に、イネ個体１個体あたり30粒の種子を、1.2mlの蒸留水で湿らせた直径33 mmの濾紙（ＴＯＹＯ＃２，東洋濾紙株式会社製）を敷いた６穴プラスティックプレート（Falcon社製）の１穴に入れ、種子の吸水を開始させた。プラスティックプレートのふたをした状態で、30℃、暗所に静置し、発芽している種子の数を毎日数えた。はじめに６穴プレートに入れられた種子の数に対する発芽している種子の数の割合を、発芽している種子の数を数えた日におけるイネ個体の発芽率とした。
[Creation of rice Sdr1 gene overexpression lines]
Based on the results thus far, it was speculated that the Sdr1 locus candidate region is the promoter region of the Sdr1 gene and that germination is promoted by the additive expression of the Sdr1 gene. Therefore, it was decided to create a strain that overexpresses the Sdr1 gene.
First, a plasmid (clone name: 002-137-011) in which the DNA containing the Sdr1 gene is completely inserted into the pCMVFL3 vector was obtained from the National Institute of Agrobiological Sciences, Genomic Resource Center. After cutting at the EcoRI site, it was filled in with Klenow polymerase to make blunt ends. Further, the full-length clone fragment was purified by cutting with XbaI in the multiple cloning site located on the opposite side of the inserted sequence. Next, after cutting with BamHI in the multiple cloning site of pPZP2Ha3 (+) having the cauliflower mosaic virus 35S promoter sequence, it was filled in with Klenow polymerase to make blunt ends. Further, the vector fragment was purified by cutting with XbaI in the multicloning site. Both fragments were ligated with T4 ligase to prepare pPZP-35S-Sdr1C7. Using this, Rhizobium radiobacter (Agrobacterium) EHA101 strain was transformed by electroporation. Nipponbare was transformed by the Agrobacterium method. Primer set for amplifying HPT (HPT-F2: 5'-gat gta gga ggg cgt gga ta-3 '(SEQ ID NO: 19), HPT-R2: ata 5'-ggt cag gct ctc gct ga-3' (SEQ ID NO: 19 20)) was selected by a real-time PCR method, and a germination test was performed using a progeny fixed line. As a result, it was clarified that the line in which pPZP-35S-Sdr1C7 was introduced (FIG. 4B: OX5) showed a higher germination rate than the vector control line (FIG. 4B: V7, V12, V22). This confirmed that the Sdr1 gene translation product was a germination promoting factor.
The germination test of rice individuals belonging to the above-mentioned progeny fixed lines was performed as follows. Rice seeds belonging to each line were harvested 5 weeks after the heading date to harvest seeds. 6 holes covered with 33 mm diameter filter paper (TOYO # 2, manufactured by Toyo Filter Paper Co., Ltd.) 30 seeds per rice plant moistened with 1.2 ml distilled water on the same day as the day of harvesting the seeds It was put into one hole of a plastic plate (manufactured by Falcon) to start water absorption of seeds. With the plastic plate covered, it was allowed to stand in the dark at 30 ° C., and the number of germinated seeds was counted every day. First, the ratio of the number of germinating seeds to the number of seeds placed in the 6-well plate was taken as the germination rate of rice individuals on the day when the number of germinating seeds was counted.
［イネSdr1遺伝子の発現解析］
前記Sdr1候補領域2528bpは、Sdr1遺伝子のコード領域外であることから、Sdr1遺伝子の発現レベルの差が穂発芽耐性につながっていると考えられた。そこで、日本晴およびNIL(Sdr1)における、Sdr1遺伝子の発現レベルを解析した。
イネSdr1遺伝子の発現解析は以下のように行った。出穂後一定期間を経た種子または吸水後一定時間を経た種子を採取し、胚を切り出し、キアゲン社のRNeasy Plant mini KitによりRNAを抽出した。東洋紡のRevar Tra Ace αにより逆転写した後、同社の定量PCRキットであるThunderbirdにより定量PCRを行った。Sdr1-Rt-F (5'-CAC ACC TTC TGC TCC TCT CC-3'（配列番号２７）)とSdr1-Rt-R1（5'-AGA GCA GAG CAC GAC GAG A-3'（配列番号２８））を標的の発現量を取得するためのプライマーとして用い、Act1-FとAct1-Rプライマーにより得られた発現量をコントロールとして、その相対値を算出し、発現量の指標とした（縦軸：Sdr1/Act-1比率）。
圃場において日本晴およびNIL(Sdr1)を生育させ、開花後（出穂後）１〜８週目経過時点での各段階の種子の胚からｍRNAを抽出し、上記の方法によりSdr1遺伝子の発現解析を行った。種子の成熟過程での日本晴型のSdr1遺伝子の発現（○）はカサラス型（●）に比較して高いレベルであった（図５A）。
また、出穂後6週目の種子を用いた吸水試験では、収穫した種子における発現レベルと比較して吸水後9時間で70倍に上昇した（図５B）。その際、日本晴型の方が強く誘導されることが示された。
これまでの結果から、Sdr1遺伝子のコードするタンパク質は発芽を促進するものであることが示されてきた。また、発現解析の結果を踏まえると、カサラス型Sdr1遺伝子の登熟過程、あるいは、吸水による発現誘導のレベルが日本晴型に比べて弱いことが穂発芽耐性の付与の重要な役割を果たしていることが示された。
[イネSdr1遺伝子とイネMAPKKK73遺伝子との比較]
Rao et al.が報告しているイネMAPKKK73遺伝子の塩基配列（TIGR/MSU ID: LOC_Os03g18170）を、Rice Genome Project Funded by the NSFのインターネットホームページ（http://rice.plantbiology.msu.edu/）から取得し、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号：２に記載の日本晴由来Sdr1タンパク質のアミノ酸配列と比較した結果、両者は同一であった。従って、イネSdr1遺伝子がイネMAPKKK73遺伝子と同一の遺伝子であることが示された。
[Expression analysis of rice Sdr1 gene]
Since the Sdr1 candidate region 2528 bp is outside the coding region of the Sdr1 gene, it was considered that the difference in the expression level of the Sdr1 gene led to the resistance to ear germination. Therefore, the expression level of Sdr1 gene in Nipponbare and NIL (Sdr1) was analyzed.
Rice Sdr1 gene expression analysis was performed as follows. Seeds that had passed a certain period after heading or seeds that had passed a certain amount of time after water absorption were harvested, the embryos were cut out, and RNA was extracted using RNeasy Plant mini Kit from Qiagen. After reverse transcription with Toyobo's Revar Tra Ace α, quantitative PCR was performed with Thunderbird, the company's quantitative PCR kit. Sdr1-Rt-F (5'-CAC ACC TTC TGC TCC TCT CC-3 '(SEQ ID NO: 27)) and Sdr1-Rt-R1 (5'-AGA GCA GAG CAC GAC GAG A-3' (SEQ ID NO: 28) ) As a primer for obtaining the target expression level, and using the expression levels obtained with Act1-F and Act1-R primers as controls, the relative value was calculated and used as an index of expression level (vertical axis: Sdr1 / Act-1 ratio).
Growing Nipponbare and NIL (Sdr1) in the field, extracting mRNA from seed embryos at each stage after flowering (after heading) 1-8 weeks, and analyzing the expression of Sdr1 gene by the above method It was. The expression (◯) of the Nipponbare type Sdr1 gene during seed maturation was at a higher level than that of the Kasalath type (●) (FIG. 5A).
Further, in the water absorption test using seeds 6 weeks after heading, the level increased 70 times 9 hours after water absorption compared to the expression level in harvested seeds (FIG. 5B). At that time, it was shown that Nipponbare type is more strongly induced.
From the results so far, it has been shown that the protein encoded by the Sdr1 gene promotes germination. In addition, based on the results of the expression analysis, the ripening process of the Casalas-type Sdr1 gene, or that the level of expression induction by water absorption is weaker than that of Nipponbare type, plays an important role in conferring ear germination resistance. Indicated.
[Comparison between rice Sdr1 gene and rice MAPKKK73 gene]
Rao et al. Reported the rice MAPKKK73 gene base sequence (TIGR / MSU ID: LOC_Os03g18170) from Rice Genome Project Funded by the NSF website (http://rice.plantbiology.msu.edu/) As a result of obtaining and comparing the amino acid sequence deduced from the base sequence with the amino acid sequence of the Nipponbare-derived Sdr1 protein described in SEQ ID NO: 2, both were identical. Therefore, it was shown that the rice Sdr1 gene is the same gene as the rice MAPKKK73 gene.
［イネSdr1遺伝子変異体］
コシヒカリはジャポニカイネの１系統である。コシヒカリが有するSdr1遺伝子のタンパク質コード領域の塩基配列は、日本晴のSdr1遺伝子のタンパク質コード領域の塩基配列（配列番号：７を参照のこと）と同一である。
複数のコシヒカリ個体に発芽後４月にガンマー線を生体照射（160-Gy）し、その後それらの個体から種子を採取した。稔った種子を栽培し、各個体から1粒のM2種子を収穫、栽培し、それぞれからゲノムDNAを抽出した。当突然変異イネ系統2300系統から抽出・精製したDNAを鋳型とし、プライマーSdr1C7-TILF1: 5'-TTG CAA GTA AAT GCC ATC CA-3'（配列番号２９）及びプライマーSdr1C7-TILR2: 5'-TAC GGT TAG GCT TCG CTC TC-3'（配列番号３０）を用いたPCRを行って、Sdr1遺伝子のタンパク質コード領域を増幅し、タンパク質コード領域に変異を有する変異系統をTILLING法により選抜した結果、当該コード領域に変異を有するイネ系統（sdr1-1系統）を得た。sdr1-1系統が有するSdr1遺伝子の塩基配列を決定してsdr1-1系統に導入された変異を確認した。sdr1-1系統において、内在性Sdr1遺伝子の配列のうち配列番号：７に示す配列の塩基番号10,235から10,240に相当する塩基が欠失していた。従って、sdr1-1系統の内在性Sdr1遺伝子は、コシヒカリ型Sdr1タンパク質の264番目のロイシン残基及び265番目のセリン残基を欠失した変異Sdr1タンパク質がコードしている。このうち、264番目のロイシン残基はキナーゼ触媒ドメイン（3-264番目のアミノ酸残基）内のアミノ酸残基であり、この変異タンパク質のリン酸化酵素活性がコシヒカリ型酵素の活性に比べて低下していることが推測される。コシヒカリ及びsdr1-1系統の個体の出穂後7週目の発芽率を調べた結果、コシヒカリ（Ksh)と比較して、変異体（sdr1-1）は発芽率が低下していた（図６）。この結果から、Sdr1遺伝子に変異を導入することで、イネに穂発芽耐性が付与できる事が示された。
[Rice Sdr1 gene mutant]
Koshihikari is a strain of Japonica rice. The base sequence of the protein coding region of Sdr1 gene possessed by Koshihikari is the same as the base sequence of the protein coding region of Sdr1 gene of Nipponbare (see SEQ ID NO: 7).
A plurality of Koshihikari individuals were irradiated with gamma rays in vivo (160-Gy) in April after germination, and then seeds were collected from these individuals. Cultivated seeds were cultivated, one M2 seed was harvested and cultivated from each individual, and genomic DNA was extracted from each. Using DNA extracted and purified from this mutant rice line 2300 as a template, primer Sdr1C7-TILF1: 5'-TTG CAA GTA AAT GCC ATC CA-3 '(SEQ ID NO: 29) and primer Sdr1C7-TILR2: 5'-TAC As a result of performing PCR using GGT TAG GCT TCG CTC TC-3 ′ (SEQ ID NO: 30), amplifying the protein coding region of the Sdr1 gene, and selecting a mutant strain having a mutation in the protein coding region by the TILLING method. A rice line (sdr1-1 line) having a mutation in the coding region was obtained. The nucleotide sequence of the Sdr1 gene possessed by the sdr1-1 strain was determined to confirm the mutation introduced into the sdr1-1 strain. In the sdr1-1 strain, bases corresponding to base numbers 10,235 to 10,240 of the sequence shown in SEQ ID NO: 7 were deleted from the sequence of the endogenous Sdr1 gene. Therefore, the endogenous Sdr1 gene of the sdr1-1 strain is encoded by a mutant Sdr1 protein lacking the 264th leucine residue and the 265th serine residue of the Koshihikari type Sdr1 protein. Among these, the 264th leucine residue is an amino acid residue in the kinase catalytic domain (3-264th amino acid residue), and the phosphorylase activity of this mutant protein is lower than that of the Koshihikari type enzyme. I guess that. As a result of examining the germination rate at 7 weeks after heading of individuals of Koshihikari and sdr1-1 strain, the mutant (sdr1-1) had a reduced germination rate compared to Koshihikari (Ksh) (FIG. 6). . From these results, it was shown that the introduction of mutations into the Sdr1 gene can confer panicle germination resistance to rice.
［コムギSdr1オーソログの取得］
イネSdr1遺伝子のコムギにおけるオーソログを単離した。
National Center for Biotechnology Informationがインターネット上で提供するBlast検索ページ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて、日本晴Sdr1遺伝子のコード領域（配列番号：７の配列の9446番目〜10819番目までの塩基配列）をクエリーとして、これと高い同一性を示す塩基配列を有するDNAを検索した。検索は、Nucleotide blast (optimized for somewhat similar sequences)(以下、「blastn」という。)により行い、検索のパラメーターは以下のとおりである。 Expected threshould: 10、Word size: 11、Max Matches in a query range: 0、Matches/Mismatches: 2,-3、Gap costs: Existence:5,Extension:2、 Filter: low complexity regions、Mask: Mask for lookup table only。
検索の結果、コムギ由来の塩基配列のうちクエリー配列と最も高い同一性を有する塩基配列（GenBank Accession No. AK334899.1）が見出された。当該配列とクエリー配列との間のMax scoreは958、Total scoreは1005、Query coverは80%、E valueは0.0、Identity(同一性)は80%であった。２番目に高いMax scoreを示すコムギ由来の塩基配列（GenBank Accession No.AK330734.1）とクエリー配列との間のMax scoreは102、Total scoreは102、Query coverは16%、E valueは1e-17、Identity(同一性)は70%であった。ついで、AK334899.1配列をクエリーとして上記と同様の条件でblastn検索を行った。その結果、AK334899.1配列に対してイネ塩基配列の中で最も高い同一性を示すイネ塩基配列が３つ（GenBank Accession No. NM_001186447.1、AC137634.3およびAC137072.2）が見出された。これらの塩基配列におけるタンパク質コード領域の配列は、日本晴Sdr1遺伝子の塩基配列（配列番号７）におけるタンパク質コード領域の塩基配列（塩基番号9446から10819）と同一であった。これらの結果から、AK334899.1の配列がイネSdr1遺伝子のコムギにおけるオーソログ、すなわち、コムギSdr1遺伝子に由来する配列であることが推測された。AK334899.1配列中のタンパク質コード領域内の配列の一部を有するプライマー（TaSdr1-RFL-F1: 5'-GTG CCT CGA GAG CGA GAT AA-3'（配列番号３１）、TaSdr1-RFL-R1: 5'-AAA AAC GAA CCA GAA ACT G-3'（配列番号３２））を用い、六倍体コムギきたほなみのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅されたDNA断片をクローン化し、複数のクローンの塩基配列を決定した結果、３種類の配列（以下「Ta-1」、「Ta-2」、[Ta-3]と呼ぶ。）が見出された。Ta-1の配列は、AK334899.1配列と同一であり、Ta-2及びTa-3の配列はAK334899.1と高い同一性を有していた。これら３つの配列は、それぞれ、６倍体コムギゲノム中の3つの内在性Sdr1遺伝子に相当すると考えられた。
[Obtain wheat Sdr1 ortholog]
An ortholog in wheat of rice Sdr1 gene was isolated.
Using the Blast search page (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) provided by the National Center for Biotechnology Information on the Internet, the coding region of the Nipponbare Sdr1 gene (SEQ ID NO: 7 sequence) (Base sequence from 9446th to 10819th) was used as a query, and DNA having a base sequence showing high identity with this was searched. The search is performed by Nucleotide blast (optimized for somewhat similar sequences) (hereinafter referred to as “blastn”), and the search parameters are as follows. Expected threshould: 10, Word size: 11, Max Matches in a query range: 0, Matches / Mismatches: 2, -3, Gap costs: Existence: 5, Extension: 2, Filter: low complexity regions, Mask: Mask for lookup table only.
As a result of the search, a base sequence (GenBank Accession No. AK334899.1) having the highest identity with the query sequence among the base sequences derived from wheat was found. The Max score between the sequence and the query sequence was 958, Total score was 1005, Query cover was 80%, E value was 0.0, and Identity (identity) was 80%. The maximum score between the base sequence derived from wheat (GenBank Accession No. AK330734.1) showing the second highest Max score and the query sequence is 102, Total score is 102, Query cover is 16%, E value is 1e- 17, Identity was 70%. Subsequently, a blastn search was performed using the AK334899.1 sequence as a query under the same conditions as described above. As a result, three rice base sequences (GenBank Accession No. NM_001186447.1, AC137634.3 and AC137072.2) showing the highest identity among the rice base sequences to the AK334899.1 sequence were found. . The sequence of the protein coding region in these base sequences was identical to the base sequence (base numbers 9446 to 10819) of the protein coding region in the base sequence of the Nipponbare Sdr1 gene (SEQ ID NO: 7). From these results, it was speculated that the sequence of AK334899.1 is an orthologue of wheat of the rice Sdr1 gene, that is, a sequence derived from the wheat Sdr1 gene. Primer (TaSdr1-RFL-F1: 5'-GTG CCT CGA GAG CGA GAT AA-3 '(SEQ ID NO: 31), TaSdr1-RFL-R1: having a part of the sequence within the protein coding region in the AK334899.1 sequence Using 5'-AAA AAC GAA CCA GAA ACT G-3 '(SEQ ID NO: 32)), PCR was performed using the genomic DNA of hexaploid wheat kitahonami as a template, and the amplified DNA fragments were cloned into multiple clones. As a result of determining the base sequence, three types of sequences (hereinafter referred to as “Ta-1”, “Ta-2”, and [Ta-3]) were found. The sequence of Ta-1 was identical to the sequence of AK334899.1, and the sequences of Ta-2 and Ta-3 were highly identical to AK334899.1. These three sequences were each thought to correspond to three endogenous Sdr1 genes in the hexaploid wheat genome.
（コムギオーソログTaSdr1-1の取得）
上記3つのコムギ由来配列を元に、AK334899.1配列に特異的プライマーを設計、合成し、インバースPCR法に用いた。六倍体コムギであるきたほなみのゲノムDNA（0.1ug）を制限酵素HindIII、SpeI、XbaI、BamHI、BglII、EcoRIで切断し、フェノール・クロロフォルム抽出、クロロフォルム抽出の後エタノール沈殿を行い、精製した。これらを20uLの反応系によりT4リガーゼで環化反応を行った。フェノール・クロロフォルム抽出、クロロフォルム抽出の後エタノール沈殿を行った。これをテンプレートとして20uLの反応系によりPrimeSTAR-GXL（Takara）とTaSdr1-1-IPCR-F1: 5'-GCG AGC TGC TGC TCC ACA TC-3'（配列番号３３）およびTaSdr1-1-IPCR-R1: 5'-CCG TCG CCG CCG ACG AGC ACG-3'（配列番号３４）のプライマーセットにより1stPCR反応を行った。1/1000容量の1stPCR反応液をテンプレートとしてTaSdr1-1-IPCR-F2: 5'-GCG TGC CTC TCC GAC TCC TGC-3'（配列番号３５） とTaSdr1-1-IPCR-R2: 5'-CCC TTC ACG TCC CCG TGC AC-3'（配列番号３６）を用いたPCRを行い、配列を決定し、部分配列データを連結した。最後に連結が正しいこと確認するためにTaSdr1_RFL_105F: 5'-atc gct gcc aaa agt aaa cc-3'（配列番号３７）とTaSdr1_RFL_2160R: 5'-ACG CGA TGC ACA TCT GTT TA-3'（配列番号３８）を用いて遺伝子全長（配列番号８）を増幅し、インバースPCRで得られた配列を確認した。こうして得られた遺伝子をTaSdr1-1遺伝子と呼ぶ。TaSdr1-1遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示す。この結果、AK334899.1配列は、配列番号８に記載の配列の208番目から1703番目までの配列を含むものであることが示された。
(Acquisition of wheat ortholog TaSdr1-1)
Based on the above three wheat-derived sequences, primers specific to the AK334899.1 sequence were designed and synthesized, and used for inverse PCR. Genomic DNA (0.1 ug) of Kitahonami, a hexaploid wheat, was digested with restriction enzymes HindIII, SpeI, XbaI, BamHI, BglII, and EcoRI, extracted with phenol / chloroform, extracted with chloroform, and purified by ethanol precipitation. These were cyclized with T4 ligase in a 20 uL reaction system. After phenol / chloroform extraction and chloroform extraction, ethanol precipitation was performed. Using this as a template, PrimeSTAR-GXL (Takara) and TaSdr1-1-IPCR-F1: 5'-GCG AGC TGC TGC TCC ACA TC-3 '(SEQ ID NO: 33) and TaSdr1-1-IPCR-R1 : 5'-CCG TCG CCG CCG ACG AGC ACG-3 '(SEQ ID NO: 34) was used to perform a 1st PCR reaction. TaSdr1-1-IPCR-F2: 5'-GCG TGC CTC TCC GAC TCC TGC-3 '(SEQ ID NO: 35) and TaSdr1-1-IPCR-R2: 5'-CCC PCR was performed using TTC ACG TCC CCG TGC AC-3 ′ (SEQ ID NO: 36), the sequence was determined, and the partial sequence data were ligated. Finally, TaSdr1_RFL_105F: 5'-atc gct gcc aaa agt aaa cc-3 '(SEQ ID NO: 37) and TaSdr1_RFL_2160R: 5'-ACG CGA TGC ACA TCT GTT TA-3' (SEQ ID NO: 38) ) Was used to amplify the full length of the gene (SEQ ID NO: 8), and the sequence obtained by inverse PCR was confirmed. The gene thus obtained is called TaSdr1-1 gene. The amino acid sequence of the protein encoded by the TaSdr1-1 gene is shown in SEQ ID NO: 3. As a result, it was shown that the AK334899.1 sequence includes the sequence from the 208th to the 1703th sequence of the sequence described in SEQ ID NO: 8.
（コムギオーソログTaSdr1-2の取得）
きたほなみゲノムDNAの断片を環化したテンプレートを用いたインバースPCRを行った。上記Ta-2配列に特異的な配列をプライマーとして用い（TaSdr1-2-IPCR-F1: 5'-TCA ACC TGG CTT TGC TCG CCA-3'（配列番号３９）とTaSdr1-2-IPCR-R1: 5'-GCC GTG GCG TCA TCG CCG AT-3'（配列番号４０））、2ndPCRにはTaSdr1-2-IPCR-F2: 5'-GGC GAT TTG CTG AAG TCT AA-3'（配列番号４１）とTaSdr1-2-IPCR-R2: 5'-GAC GTA CGG AGA GCA CAG CC-3'（配列番号４２）を用いた。PCR産物のダイレクトシーケンスにより配列を決定し部分配列データを連結した。最後に連結が正しいこと確認するためにTaSdr1-2-37F: 5'-tgt act gta ccc ggt gct ca-3'（配列番号４３）、TaSdr1-2-3331R: 5'-caa atc gcc atc agg gta gt-3'（配列番号４４）により遺伝子全長（配列番号９）を増幅し、配列を確認した。こうして得られた遺伝子をTaSdr1-2遺伝子と呼ぶ。TaSdr1-2遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
(Acquisition of wheat ortholog TaSdr1-2)
Inverse PCR was performed using a template obtained by circularizing fragments of Kitahonami genomic DNA. A sequence specific to the above Ta-2 sequence was used as a primer (TaSdr1-2-IPCR-F1: 5'-TCA ACC TGG CTT TGC TCG CCA-3 '(SEQ ID NO: 39) and TaSdr1-2-IPCR-R1: 5'-GCC GTG GCG TCA TCG CCG AT-3 '(SEQ ID NO: 40)), 2S PCR includes TaSdr1-2-IPCR-F2: 5'-GGC GAT TTG CTG AAG TCT AA-3' (SEQ ID NO: 41) TaSdr1-2-IPCR-R2: 5′-GAC GTA CGG AGA GCA CAG CC-3 ′ (SEQ ID NO: 42) was used. Sequences were determined by direct sequencing of PCR products and partial sequence data were ligated. Finally, TaSdr1-2-37F: 5'-tgt act gta ccc ggt gct ca-3 '(SEQ ID NO: 43), TaSdr1-2-3331R: 5'-caa atc gcc atc agg gta The full length of the gene (SEQ ID NO: 9) was amplified with gt-3 ′ (SEQ ID NO: 44), and the sequence was confirmed. The gene thus obtained is called TaSdr1-2 gene. The amino acid sequence of the protein encoded by the TaSdr1-2 gene is shown in SEQ ID NO: 4.
（コムギオーソログTaSdr1-3の取得）
Ta-3配列に対応する遺伝子を単離するために、上記と同様に、きたほなみゲノムDNAの断片を環化したテンプレートを用いたインバースPCRを行った。1stPCRにはTaSdr1-3-IPCR-F2: 5'-GTC GGA ATC GGC GGC GCC TC-3'（配列番号４５）とTaSdr1-3-IPCR-R2: 5'-GGT AGT GCA GGG CGG CGG CA-3'（配列番号４６）を用い、2ndPCRにはTaSdr1-3-IPCR-F3: 5'-GCT GGC GAG CGG TGG AGC TG-3'（配列番号４７）とTaSdr1-3-IPCR-R3: 5'-CCG CCG CAG GAC GCA CCG CG-3'（配列番号４８）を用い、PCR産物のダイレクトシーケンスにより配列を決定した。最後にTaSdr1-3-F2：5’-TCC TCA CAC CAT CTC CCT TT-3’（配列番号４９）とTaSdr1-3-R1：5’-GAG TCG CTC ACC CAA CTA GC-3’（配列番号５０）により遺伝子全長（配列番号１０）を増幅し、配列を確認した。こうして得られた遺伝子をTaSdr1-3遺伝子と呼ぶ。TaSdr1-3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
得られたTaSdr1-1遺伝子、TaSdr1-2遺伝子及びTaSdr1-3遺伝子のタンパク質コード領域の配列比較を図７に示す。タンパク質コード領域の塩基配列を比較した結果、これら3つの遺伝子のタンパク質コード領域の配列は互いに極めて高い同一性を示した（図８）。
また、これらこれら3つの遺伝子のタンパク質コード領域の配列のそれぞれをクエリーとして上記と同様の条件でblastn検索を行った。その結果、これら3つの配列それぞれに対して最も高いMax scoreを示すイネ由来配列は、GenBamk Accession No. NM_001186447.1、GenBank Accession No. AC137634.3及びGenBank Accession No. AC137072.2の配列であった。これら3つの配列はそれぞれ日本晴由来Sdr1遺伝子コード領域の配列（配列番号７）に対し99%の同一性を有しており、これら3つの配列はイネSdr1遺伝子の配列であると考えられる。、このことから、TaSdr1-1遺伝子、TaSdr1-2遺伝子及びTaSdr1-3遺伝子がコムギAゲノム、Bゲノム、Dゲノム由来のイネSdr1遺伝子オーソログであると考えられる。従って、これら3つのコムギ由来遺伝子のそれぞれをコムギSdr1-1遺伝子、コムギSdr1-2遺伝子及びコムギSdr1-3遺伝子と呼び、それらを総称してコムギSdr1遺伝子と呼ぶ。
(Acquisition of wheat ortholog TaSdr1-3)
In order to isolate the gene corresponding to the Ta-3 sequence, inverse PCR using a template obtained by circularizing a fragment of Kitahonami genomic DNA was performed as described above. For 1st PCR, TaSdr1-3-IPCR-F2: 5'-GTC GGA ATC GGC GGC GCC TC-3 '(SEQ ID NO: 45) and TaSdr1-3-IPCR-R2: 5'-GGT AGT GCA GGG CGG CGG CA-3 '(SEQ ID NO: 46) was used, and for 2nd PCR, TaSdr1-3-IPCR-F3: 5'-GCT GGC GAG CGG TGG AGC TG-3' (SEQ ID NO: 47) and TaSdr1-3-IPCR-R3: 5'- Using CCG CCG CAG GAC GCA CCG CG-3 ′ (SEQ ID NO: 48), the sequence was determined by direct sequencing of the PCR product. Finally, TaSdr1-3-F2: 5'-TCC TCA CAC CAT CTC CCT TT-3 '(SEQ ID NO: 49) and TaSdr1-3-R1: 5'-GAG TCG CTC ACC CAA CTA GC-3' (SEQ ID NO: 50) ) Was used to amplify the full length gene (SEQ ID NO: 10), and the sequence was confirmed. The gene thus obtained is called TaSdr1-3 gene. The amino acid sequence of the protein encoded by the TaSdr1-3 gene is shown in SEQ ID NO: 5.
FIG. 7 shows a sequence comparison of the protein coding regions of the obtained TaSdr1-1 gene, TaSdr1-2 gene and TaSdr1-3 gene. As a result of comparing the base sequences of the protein coding regions, the protein coding region sequences of these three genes showed extremely high identity to each other (FIG. 8).
In addition, blastn search was performed under the same conditions as above using each of the sequences of the protein coding regions of these three genes as a query. As a result, the rice-derived sequences showing the highest Max score for each of these three sequences were those of GenBamk Accession No. NM_001186447.1, GenBank Accession No. AC137634.3 and GenBank Accession No. AC137072.2. . These three sequences have 99% identity with the sequence of the Sdr1 gene coding region derived from Nipponbare (SEQ ID NO: 7), and these three sequences are considered to be the sequences of the rice Sdr1 gene. From this, it is considered that TaSdr1-1 gene, TaSdr1-2 gene and TaSdr1-3 gene are rice Sdr1 gene orthologs derived from wheat A genome, B genome and D genome. Therefore, each of these three wheat-derived genes is called wheat Sdr1-1 gene, wheat Sdr1-2 gene and wheat Sdr1-3 gene, and they are collectively called wheat Sdr1 gene.
[イネ及びコムギSdr1遺伝子の配列比較]
イネ（カサラス及び日本晴）及びコムギのSdr1タンパク質のアミノ酸配列を比較した。アミノ酸配列は、Clustal Wを用いてアラインした（図８）。
その結果、すべてのSdr1タンパク質においてキナーゼ触媒ドメインが同定され、また、タンパク質リン酸化酵素で完全に保存されているアミノ酸残基がすべて保存されていることが示された。この結果は、イネ及びコムギのSdr1タンパク質がタンパク質リン酸化酵素活性を有することを示唆している。
[Sequence comparison of rice and wheat Sdr1 genes]
The amino acid sequences of Sdr1 protein of rice (Kasala and Nipponbare) and wheat were compared. Amino acid sequences were aligned using Clustal W (FIG. 8).
As a result, the kinase catalytic domain was identified in all Sdr1 proteins, and all amino acid residues that were completely conserved by protein kinases were conserved. This result suggests that rice and wheat Sdr1 proteins have protein kinase activity.
[コムギSdr1遺伝子の発現解析]
六倍体コムギ系統であるきたほなみの開花後28日目（出穂後約３０日）の種子を採取し、採取された種子30個を、種子を収穫した日と同日に、1.2mlの蒸留水で湿らせた直径33 mmの濾紙（TOYO ＃2、東洋濾紙株式会社製）を敷いた６穴プラスティックプレート（Falcon社製）の１穴に入れ、種子の吸水を開始させた。該種子をプラスティックプレートのふたをした状態で、30℃、暗所に静置した。種子による吸水開始3時間後、9時間後及び24時間後に、それぞれ30個の種子の胚から全RNAを抽出し、その一部を鋳型としてcDNAを合成した。cDNAの一部を鋳型としてコムギSdr1遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、TaSdr1遺伝子mRNAの定量を行った。前記cDNAの一部を鋳型として、コムギアクチン遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、コムギアクチン遺伝子mRNAの定量を行った。コムギSdr1遺伝子特異的プライマー（TaSdr1ABD-F1及びTaSdr1ABD-R2）の配列は、5’-GCGAGCGGTTCTTGACTGGG-3’及び5’-TGTGGCAGCGTCGGATGGC-3’である。コムギアクチン遺伝子特異的プライマー（QRT-Actin-F及びQRT-Actin-R）の配列は、5’-CTATGTTCCCGGGTATTGCT-3’及び5’-AAGGGAGGCAAGAATCGAC-3’である。コムギSdr1遺伝子の発現量を標準化するため、コムギSdr1遺伝子mRNAの量をコムギアクチンmRNAの量で除したものを、コムギSdr1遺伝子発現量の指標とした。コムギSdr1遺伝子mRNAの発現量は、イネSdr1遺伝子mRNAの発現量と同様に、種子の吸水開始9時間後に顕著に増加した(図９)。
[Expression analysis of wheat Sdr1 gene]
Seeds on the 28th day after flowering of Kitahonami, a hexaploid wheat line (about 30 days after heading), were collected on the same day that the seeds were harvested. Water absorption of the seeds was started by placing them in one hole of a 6-hole plastic plate (manufactured by Falcon) laid with 33 mm diameter filter paper (TOYO # 2, manufactured by Toyo Filter Paper Co., Ltd.). The seeds were allowed to stand in the dark at 30 ° C. with the plastic plate covered. Total RNA was extracted from 30 seed embryos 3 hours, 9 hours and 24 hours after the start of water absorption by the seeds, and cDNA was synthesized using a part of the RNA as a template. Real-time PCR was performed using a part of the cDNA as a template and a wheat Sdr1 gene-specific primer to quantify TaSdr1 gene mRNA. Using a part of the cDNA as a template, real-time PCR was performed using a wheat germin gene-specific primer to quantify wheat germin gene mRNA. The sequences of wheat Sdr1 gene specific primers (TaSdr1ABD-F1 and TaSdr1ABD-R2) are 5′-GCGAGCGGTTCTTGACTGGG-3 ′ and 5′-TGTGGCAGCGTCGGATGGC-3 ′. The sequences of the wheat gear actin gene specific primers (QRT-Actin-F and QRT-Actin-R) are 5′-CTATGTTCCCGGGTATTGCT-3 ′ and 5′-AAGGGAGGCAAGAATCGAC-3 ′. In order to standardize the expression level of the wheat Sdr1 gene, a value obtained by dividing the amount of the wheat Sdr1 gene mRNA by the amount of the wheat gearctin mRNA was used as an index of the expression level of the wheat Sdr1 gene. The expression level of wheat Sdr1 gene mRNA, like the expression level of rice Sdr1 gene mRNA, increased significantly 9 hours after the start of seed water absorption (FIG. 9).
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。 The configurations and combinations thereof in the embodiments described above are examples, and the addition, omission, replacement, and other modifications of the configurations can be made without departing from the spirit of the present invention. Further, the present invention is not limited by each embodiment, and is limited only by the scope of the claims.
穂発芽耐性が付与された本発明に係るイネ及びコムギによれば、穂発芽による深刻な被害を回避可能であるため、本発明の利用価値は非常に高い。 According to the rice and wheat according to the present invention to which panicle germination resistance is imparted, serious damage caused by panicle germination can be avoided, so that the utility value of the present invention is very high.
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