JP2005278636A - Brassinosteroid biosynthesis gene d11 participating in semi-dwarfness of plant, and its utilization - Google Patents

Brassinosteroid biosynthesis gene d11 participating in semi-dwarfness of plant, and its utilization Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a d11 gene participating in the semi-dwarfness of a plant, to provide a method for dwarfing a plant with the gene as a target, and to provide a molecule used for the method. <P>SOLUTION: A single gene d11 causing a d11 mutation bringing the abnormality of semi-dwarfness on rice was identified and separated from a huge chromosome domain by a method of map base cloning. The base sequence of the isolated d11 gene was determined, and in order to specify a gene structurally related to the same, a data base was retrieved. Consequently, it was found that the d11 gene encods a d11 protein which is a new cytochrome P450 participating in a brassinosteroid biosynthesis route. It was found that a plant can be bwarfed by utilizing the d11 gene. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は,植物の半矮性化に関与するブラシノステロイド生合成遺伝子、並びに該遺伝子を標的とした植物の矮性化に関する。   The present invention relates to a brassinosteroid biosynthetic gene involved in plant semi-dwarfing and to dwarfing plants targeting the gene.

植物体を小型化することは、農業や園芸において様々な意義を有する。例えば、草丈またはかん長を小型化することで、新たな美的価値を有する観賞用植物を作出することが可能であり、また、野菜や果実を小型化することで一口サイズなどの新たな商品価値を有する作物を作ることもできる。また、このような産業上の利用以外でも、例えば、実験用植物の小型化は、その取り扱いやすさのみならず、植物の栽培空間の減少による実験空間の有効利用の観点から重要である。   Downsizing a plant body has various meanings in agriculture and horticulture. For example, it is possible to create ornamental plants with new aesthetic value by reducing the plant height or length, and new product value such as bite size by reducing the size of vegetables and fruits. You can also make crops that have In addition to such industrial use, for example, downsizing of experimental plants is important not only from the viewpoint of ease of handling but also from the viewpoint of effective use of experimental spaces due to a decrease in plant cultivation space.

植物の小型化において、特に植物の草丈あるいはかん長が野生型(正常型)より短くなる特性は矮性と呼ばれる。この特性を示すイネ品種や系統はγ-線や化学物質による突然変異誘起処理において数多く見い出されており、それらの遺伝解析も古くから進められてきた。これまでに60種類以上の遺伝子がこの矮性に関与することが知られている(非特許文献1)。しかしながら、なぜ矮性形質を表現するのかについての知見は少なく、少数の矮性変異体が、植物成長ホルモンであるブラシノステロイドの生合成に関与するタンパク質の遺伝子における変異によって生じていることが明らかになっているにすぎない(非特許文献2、3)。   In the miniaturization of a plant, the characteristic that the plant height or length of the plant is shorter than the wild type (normal type) is called fertility. Many rice varieties and lines exhibiting this characteristic have been found in the mutagenesis treatment with γ-rays and chemicals, and their genetic analysis has been advanced for a long time. Up to now, it is known that more than 60 genes are involved in this fertility (Non-patent Document 1). However, there is little knowledge about why fertility traits are expressed, and it has become clear that a small number of fertile mutants are caused by mutations in the genes of proteins involved in the biosynthesis of brassinosteroids, which are plant growth hormones. (Non-Patent Documents 2 and 3).

イネ矮性変異体のなかでもdwarf11(d11)は、特に第2節間の伸長を抑制し、その結果として草丈を正常型の半分以下にするばかりでなく、粒が小円型になる特徴があることが知られている(非特許文献4−6)。また、このd11は遺伝解析の結果、イネ第4染色体上の単一の劣性遺伝子d11によって支配されていることが明らかとなっている(非特許文献7)。   Among the rice dwarf mutants, dwarf11 (d11), in particular, suppresses elongation between the 2nd node, and as a result, it not only makes the plant height less than half that of the normal type, but also has the feature that the grains become small circles It is known (Non-Patent Documents 4-6). Further, as a result of genetic analysis, it has been revealed that this d11 is controlled by a single recessive gene d11 on the rice chromosome 4 (Non-patent Document 7).

d11遺伝子の変異体においては、植物ホルモンの一種であるブラシノステロイド情報伝達経路または生合成経路変異体が示す矮性、濃緑葉、直立葉、穂首の伸長などの表現型とよく似た表現型を示すことから、d11遺伝子は植物体内でのブラシノステロイド情報伝達経路または生合成経路に関与するタンパク質の遺伝子座であることが推定される。   In d11 gene mutants, phenotypes that are similar to the phenotypes such as fertility, dark green leaves, upright leaves, and head extension exhibited by mutants of the brassinosteroid signaling pathway or biosynthetic pathway, which is a plant hormone Thus, it is presumed that the d11 gene is a locus of a protein involved in the brassinosteroid signal transduction pathway or biosynthetic pathway in the plant body.

このため、d11遺伝子を単離し、その遺伝子産物の機能を明らかにすることは、植物における形態形成過程を明らかにする上で重要となるばかりでなく、その知見を利用して植物の大きさの人工的な制御をおこなう上で極めて重要であると考えられる。   Therefore, isolating the d11 gene and clarifying the function of the gene product is not only important for clarifying the morphogenesis process in plants, but also using the knowledge to determine the size of the plant. This is considered to be extremely important for artificial control.

Rice Genetic Newsletter Vol.12:30-32 (1995)Rice Genetic Newsletter Vol.12: 30-32 (1995) BRD1:The Plant Journal vol.32:495-508 (2002)BRD1: The Plant Journal vol.32: 495-508 (2002) D2:The Plant Cell vol.15: 2900-2910 (2003)D2: The Plant Cell vol.15: 2900-2910 (2003) 明峰正夫、日本学術会報告1巻: 108-314 (1925)Akimine Masao, JSPS Report Volume 1: 108-314 (1925) 中山 包、信州大文理学部紀要 4巻:1-31(1954)Nakayama Bao, Bulletin of Faculty of Humanities and Science, Shinshu Volume 4: 1-31 (1954) 高橋萬右衛門・武田和義、北大農邦文紀要7巻:32-43 (1969)Takahashi Soemon, Takeda Kazuyoshi, Hokkaido University Nobu Kunibun Bulletin 7: 32-43 (1969) Yoshimura et al., Plant. Mol. Biol., 35: 49-60 (1997)Yoshimura et al., Plant. Mol. Biol., 35: 49-60 (1997)

本発明は、植物の半矮性化に関与するd11遺伝子を同定し、単離することを課題とする。さらに本発明は、内因性のd11遺伝子の発現を制御することにより植物を矮性化する方法、および内因性のd11遺伝子の発現を制御するための分子を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to identify and isolate the d11 gene involved in plant semi-fertility. Another object of the present invention is to provide a method for dwarfing a plant by controlling the expression of an endogenous d11 gene, and a molecule for controlling the expression of the endogenous d11 gene.

イネ矮性遺伝子d11は、イネの矮性に関与するタンパク質をコードする遺伝子として、これまでイネ第4染色体という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていた。本発明者らは、d11遺伝子を広大な染色体の領域から単離するために、マップベースクローニングの手法を利用して鋭意研究を行い、d11遺伝子の存在領域を解明し、遂に所期の遺伝子を単離することに成功した。具体的には、まず、分子マーカーを用いた連鎖解析を行い、d11遺伝子が存在する染色体上の領域を特定の分子マーカーで挟まれる領域に絞り込んだ。次いで、絞り込んだ遺伝子周辺の領域につき、PACクローンの整列化による物理的地図の作成を行い、候補となる領域内の塩基列の解読を行った。d11変異体と正常なイネの塩基配列を比較することにより、1つのcDNAクローン(002-107-G06)をd11遺伝子として同定することに成功した。   The rice fertility gene d11 has been known as a gene encoding a protein involved in rice fertility so far as existing in one of the vast regions of rice chromosome 4. In order to isolate the d11 gene from a vast chromosomal region, the present inventors have conducted intensive research using a map-based cloning technique, elucidated the region where the d11 gene exists, and finally found the desired gene. Successfully isolated. Specifically, first, linkage analysis using a molecular marker was performed, and the region on the chromosome where the d11 gene was present was narrowed down to a region sandwiched between specific molecular markers. Next, a physical map was created by aligning the PAC clones for the region around the narrowed down gene, and the base sequence in the candidate region was decoded. By comparing the d11 mutant with the normal rice nucleotide sequence, one cDNA clone (002-107-G06) was successfully identified as the d11 gene.

同定されたクローンの塩基配列(2031塩基対)はイネゲノム解析研究において解析されている。データベースに対して類似性検索を行なった結果、同定されたクローンの塩基配列は、アラビドピシスとイネのブラシノステロイド生合成に関与するサイトクロームP450(cytochromeP450)をコードする遺伝子に対し、相同性を有することが明らかとなった。これらのことから、本発明者らは、同定された遺伝子は新規サイトクロームP450遺伝子であることを見出した。   The base sequence (2031 base pairs) of the identified clone has been analyzed in a rice genome analysis study. As a result of similarity search on the database, the base sequence of the identified clone has homology to the gene encoding cytochrome P450 (cytochrome P450) involved in the biosynthesis of Arabidopsis and rice brassinosteroids It became clear. From these facts, the present inventors have found that the identified gene is a novel cytochrome P450 gene.

植物において、数多くのサイトクロームP450は、植物ホルモンであるオーキシン、ジベレリン、ブラシノステロイドの生合成に関与している。本発明により単離されたd11遺伝子は、ブラシノステロイド生合成経路に関与する新規なサイトクロームP450をコードする遺伝子である。このことから本発明者らは、d11遺伝子の発現を抑制することにより、幅広く植物の矮性化を行うことが可能であることを見出したものである。   In plants, many cytochrome P450s are involved in the biosynthesis of plant hormones auxin, gibberellin and brassinosteroids. The d11 gene isolated according to the present invention is a gene encoding a novel cytochrome P450 involved in the brassinosteroid biosynthesis pathway. Accordingly, the present inventors have found that it is possible to dwarf a wide range of plants by suppressing the expression of the d11 gene.

即ち、本発明は、植物の矮性に関与するd11遺伝子若しくはその相同遺伝子の発現を抑制することによる植物を矮性化する方法、およびこれら遺伝子の発現を抑制するために用いられる分子に関する。より具体的には、下記発明を提供するものである。
[1] 植物の矮性化のために用いる、以下(a)〜(c)のいずれかに記載のDNA
(a)植物の内因性のd11遺伝子の転写産物と相補的なRNAをコードするDNA
(b)植物の内因性のd11遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
(c)植物の内因性のd11遺伝子の発現を、共抑制効果により阻害するRNAをコードするDNA
[2] 植物のd11遺伝子がイネのd11遺伝子である、[1]に記載のDNA
[3] [1]または[2]に記載のDNAを含むベクター
[4] [1]または[2]に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換植物細胞
[5] 植物がイネである、[4]に記載の形質転換植物細胞
[6] [4]または[5]に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体
[7] [6]に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体
[8] 植物がイネである、[6]または[7]に記載の形質転換植物体
[9] 矮性化している、[6]または[7]に記載の形質転換植物体
[10] [6]〜[9]のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料
[11] [6]〜[9]のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、[1]または[2]に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法
[12] 植物体の細胞内における、内因性のd11遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、植物を矮性化させる方法
[13] [1]または[2]に記載のDNAを植物に導入することを特徴とする、[12]に記載の方法
[14] 植物がイネである、[11]〜[13]のいずれかに記載の方法
That is, the present invention relates to a method for dwarfing a plant by suppressing the expression of a d11 gene involved in plant dwarfism or a homologous gene thereof, and a molecule used for suppressing the expression of these genes. More specifically, the following invention is provided.
[1] The DNA according to any one of the following (a) to (c), which is used for dwarfing a plant
(A) DNA encoding an RNA complementary to a transcription product of a plant endogenous d11 gene
(B) DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves a transcription product of a plant endogenous d11 gene
(C) DNA encoding an RNA that inhibits the endogenous d11 gene expression in plants by a co-suppression effect
[2] The DNA according to [1], wherein the plant d11 gene is a rice d11 gene
[3] A vector comprising the DNA according to [1] or [2] [4] A transformed plant cell that holds the DNA according to [1] or [2] in an expressible manner [5] The plant is rice. Transformed plant cell according to [4] [6] Transformed plant body comprising transformed plant cell according to [4] or [5] [7] Offspring or clone of transformed plant body according to [6] The transformed plant body [8] The plant is rice, the transformed plant body according to [6] or [7] [9] The dwarfed transformation according to [6] or [7] Plant [10] Reproduction material of transformed plant according to any of [6] to [9] [11] A method for producing a transformed plant according to any of [6] to [9]. Then, the DNA according to [1] or [2] is introduced into a plant cell, and the plant body is regenerated from the plant cell. [12] A method for dwarfing a plant [13], characterized by suppressing the expression of an endogenous d11 gene in cells of the plant body [13] The DNA according to [1] or [2] [14] The method according to any one of [11] to [13], wherein the plant is rice.

本発明によって、植物のd11遺伝子および該遺伝子を標的とした植物の矮性化の方法、並びに植物の矮性化のための分子が提供された。植物のd11遺伝子の利用によって、有用農作物および鑑賞用植物等の植物の高収量化や矮性化による美的価値の付加、さらに、マーカー選抜による高収量化や矮性化した植物の効率的育種等が可能になるものと大いに期待される。   According to the present invention, a d11 gene of a plant, a method for dwarfing a plant targeting the gene, and a molecule for dwarfing a plant are provided. Utilization of d11 gene in plants enables high yields of plants such as useful crops and ornamental plants, addition of aesthetic value by dwarfing, and high yielding by marker selection and efficient breeding of dwarfed plants. It is highly expected to become.

本発明は、d11遺伝子の発現を抑制することによる植物を矮性化する方法、および該遺伝子の発現を抑制するために用いられる分子に関する。本発明者らにより矮性との関係が明らかにされた、イネのd11遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号:2に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号:3に、これら遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:1に示す。   The present invention relates to a method of dwarfing a plant by suppressing the expression of the d11 gene, and a molecule used for suppressing the expression of the gene. The base sequence of the cDNA of rice d11 gene, the base sequence of genomic DNA is shown in SEQ ID NO: 3, and the protein encoded by these genes whose relationship with fertility was clarified by the present inventors. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.

イネのd11遺伝子は、これまでイネに矮性の表現型を付与する遺伝子として、イネ第4染色体という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていた。本発明者らは、マップベースクローニングの手法を利用することにより、イネ第4染色体におけるd11遺伝子の存在領域の絞り込みを行い、遂に単一の遺伝子として同定することに成功した。   The rice d11 gene has been known as a gene that imparts a fertile phenotype to rice and exists in one of the vast regions of rice chromosome 4. The present inventors have narrowed down the region of the d11 gene in rice chromosome 4 by using a map-based cloning technique, and finally succeeded in identifying it as a single gene.

本明細書において「d11遺伝子」とは、ブラシノステロイド生合成経路において、後期C6-オキシデーション経路の3-デハイドロ-6-デオキソテァステロンから6-デハイドロテファステロールへのステップと早期C6-オキシデーション経路の3-デハイドロテァステロンからテファステロールへのステップを触媒する、サイトクロームP450であるd11タンパク質をコードする遺伝子を意味する。   In the present specification, the “d11 gene” refers to a step from 3-dehydro-6-deoxotearone to 6-dehydrotefasterol in the late C6-oxidation pathway and early C6-oxygen in the brassinosteroid biosynthesis pathway. It refers to the gene encoding the d11 protein, a cytochrome P450, that catalyzes the step of 3-dehydrotesterone to tefasterol in the foundation pathway.

d11タンパク質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、「d11遺伝子」には、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNAなども含まれる。また、d11タンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。特に「内因性のd11遺伝子」という場合には、植物細胞内に天然の状態で存在するゲノムDNAを意味する。   The form is not particularly limited as long as it can encode d11 protein, and “d11 gene” includes genomic DNA, chemically synthesized DNA, etc. in addition to cDNA. In addition, DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it can encode d11 protein. In particular, the term “endogenous d11 gene” means genomic DNA that exists naturally in plant cells.

ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる)を作成し、これを展開して、d11遺伝子(例えば、配列番号:2)を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、d11遺伝子(例えば、配列番号:2)に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、植物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。   Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by those skilled in the art using conventional means. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from a plant, a genomic library (a plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as a vector) is developed and expanded, and a d11 gene (for example, It is possible to prepare by conducting colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on SEQ ID NO: 2). It is also possible to prepare by preparing a primer specific to the d11 gene (for example, SEQ ID NO: 2) and performing PCR using this primer. In addition, for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from a plant, inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library, developed, and colony hybridization in the same manner as described above. Alternatively, it can be prepared by performing plaque hybridization or by performing PCR.

「d11遺伝子」には、イネのd11遺伝子のみならず、そのホモログが含まれ、また、それらの変異体やバリアントも含まれる。   The “d11 gene” includes not only the rice d11 gene but also homologs thereof, and also includes mutants and variants thereof.

さらに、d11遺伝子は広く植物界に存在すると考えられるため、「d11遺伝子」には、イネのみならず、種々の植物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の植物において、イネにおけるd11遺伝子産物と同様の生理機能を有するタンパク質をコードする遺伝子をさす。   Furthermore, since the d11 gene is considered to exist widely in the plant kingdom, the “d11 gene” includes not only rice but also homologous genes existing in various plants. Here, the “homologous gene” refers to a gene encoding a protein having physiological functions similar to those of the d11 gene product in rice in various plants.

相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術(Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975)やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術(Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988)が挙げられる。即ち、当業者にとっては、イネd11遺伝子の塩基配列(例えば、配列番号:2)もしくはその一部をプローブとして、またd11遺伝子(例えば、配列番号:2)に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物からd11遺伝子の相同遺伝子を単離することは通常行いうることである。   Methods well known to those skilled in the art for isolating homologous genes include hybridization techniques (Southern, EM, Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki). , RK, et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, vol. 239, 487-491, 1988). That is, for those skilled in the art, oligonucleotides that specifically hybridize to the d11 gene (eg, SEQ ID NO: 2) using the nucleotide sequence of the rice d11 gene (eg, SEQ ID NO: 2) or a part thereof as a probe. As a primer, it is usually possible to isolate a homologous gene of d11 gene from various plants.

このような相同遺伝子をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M 尿素、0.4%SDS、0.5 x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4%SDS、0.1 x SSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離したDNAの配列の決定は、公知の方法で行うことができる。単離されたDNAの相同性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上)の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN(核酸レベル)やBLASTX(アミノ酸レベル)のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength =12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら(Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。   In order to isolate DNA encoding such a homologous gene, a hybridization reaction is usually carried out under stringent conditions. Examples of stringent hybridization conditions include 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 × SSC, or equivalent stringency hybridization conditions. Isolation of DNA with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, for example, conditions of 6M urea, 0.4% SDS, and 0.1 × SSC. The sequence of the isolated DNA can be determined by a known method. The homology of the isolated DNA is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) in the entire amino acid sequence. And the like). Sequence homology can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993). Yes. When analyzing a base sequence by BLASTN, parameters are set to score = 100 and wordlength = 12, for example. Further, when the amino acid sequence is analyzed by BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known.

単離されたDNAが、d11タンパク質をコードするDNAであるか否かは、配列の相同性の高さ、および、単離されたd11遺伝子に対応する内因性遺伝子の発現を抑制することによる植物の矮性化、により評価することができる。   Whether or not the isolated DNA is a DNA encoding the d11 protein depends on whether the sequence homology is high and the expression of an endogenous gene corresponding to the isolated d11 gene is suppressed. It can be evaluated by dwarfing.

本発明のd11遺伝子には、より具体的には、(a)配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、(b)配列番号:2または3に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、(c)配列番号:2または3に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、(d)配列番号:2または3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、が含まれる。   More specifically, the d11 gene of the present invention includes (a) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and (b) the base sequence code set forth in SEQ ID NO: 2 or 3. DNA containing a region, (c) DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3. d) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 3 is included.

本明細書において「矮性化」とは、野生型植物と比較して草丈あるいはかん長が短くなることを意味する。本発明において、内因性のd11遺伝子の発現を抑制して矮性化形質を導入する植物には特に制限はなく、矮性化させたい所望の植物を用いることができるが、産業的な観点からは農作物や鑑賞用植物が好適である。有用農作物としては、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ等の単子葉植物や、ナタネ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。また、観賞用植物としては、例えばキク、バラ、カーネーション、シクラメン等の花卉植物が挙げられる。d11遺伝子は広く植物界に存在すると考えられるため(図3,4参照)、d11遺伝子を標的として幅広い植物を矮性化することが可能である。   In the present specification, “dwarfing” means that the plant height or culm length is shorter than that of a wild-type plant. In the present invention, there is no particular limitation on the plant into which the dwarfing trait is introduced by suppressing the expression of the endogenous d11 gene, and a desired plant to be dwarfed can be used. Or ornamental plants are preferred. Examples of useful agricultural products include monocotyledonous plants such as rice, corn, wheat and barley, and dicotyledonous plants such as rapeseed, soybean, cotton, tomato and potato. Examples of ornamental plants include flower plants such as chrysanthemum, roses, carnations, and cyclamen. Since the d11 gene is thought to exist widely in the plant kingdom (see FIGS. 3 and 4), it is possible to dwarf a wide range of plants by targeting the d11 gene.

本発明の方法において矮性化した植物を作製する場合には、d11遺伝子の発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。該DNAおよびベクターは、植物を矮性化するための薬剤となる。   When producing a dwarfed plant in the method of the present invention, a DNA for suppressing the expression of the d11 gene is inserted into an appropriate vector, introduced into a plant cell, and the resulting transformation Regenerate plant cells. The DNA and vector become agents for dwarfing plants.

本明細書における「d11遺伝子の発現を抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。   In the present specification, “suppression of d11 gene expression” includes suppression of gene transcription and suppression of protein translation. Also included is a decrease in expression as well as complete cessation of DNA expression.

植物における特定の内在性遺伝子の発現の抑制は、例えば、内因性のd11遺伝子の転写産物と相補的なRNAをコードするDNAを利用して行なうことができる。   Suppression of the expression of a specific endogenous gene in a plant can be performed using, for example, DNA encoding an RNA complementary to a transcription product of the endogenous d11 gene.

「本発明のタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なRNAをコードするDNA」の一つの態様は、本発明のタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNAである。植物細胞におけるアンチセンス効果は、一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することにより、初めて実証された(Ecker and Davis, Proc. Natl. Acad. USA, 83: 5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(Krol et. al., Nature 333: 866, 1988)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。   One embodiment of “DNA encoding RNA complementary to the transcription product of DNA encoding the protein of the present invention” is DNA encoding antisense RNA complementary to the transcription product of DNA encoding the protein of the present invention. It is. The antisense effect in plant cells was demonstrated for the first time by the antisense RNA introduced by electroporation using a transient gene expression method to exert an antisense effect in plants (Ecker and Davis, Proc. Natl Acad. USA, 83: 5372, 1986). Subsequently, tobacco and petunia have been reported to decrease the expression of target genes by expressing antisense RNA (Krol et. Al., Nature 333: 866, 1988), and currently suppress gene expression in plants. Established as a means to

アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993)。   There are several factors as described below for the action of an antisense nucleic acid to suppress the expression of a target gene. That is, transcription initiation inhibition by triplex formation, transcription inhibition by hybridization with a site where an open loop structure is locally created by RNA polymerase, transcription inhibition by hybridization with RNA that is undergoing synthesis, intron and exon Of splicing by hybrid formation at the junction with the protein, suppression of splicing by hybridization with the spliceosome formation site, suppression of transition from the nucleus to the cytoplasm by hybridization with mRNA, hybridization with capping sites and poly (A) addition sites Splicing suppression by formation, translation initiation suppression by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation suppression by hybridization with the ribosome binding site near the initiation codon, peptization by hybridization with the mRNA translation region and polysome binding site For example, inhibition of gene chain elongation is prevented, and hybridization between nucleic acid and protein interaction sites is performed. They inhibit transcription, splicing, or translation processes and suppress target gene expression (Hirashima and Inoue, "Neurochemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid IV Gene Replication and Expression", edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin , pp.319-347, 1993).

本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。   The antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above. In one embodiment, if an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of the gene is designed, it will be effective for inhibiting translation of the gene. However, sequences complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. As described above, a DNA containing an antisense sequence of a non-translated region as well as a translated region of a gene is also included in the antisense DNA used in the present invention. The antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.

アンチセンスDNAは、例えば、配列番号:2に記載のDNAの配列情報を基にホスホロチオネート法(Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988)などにより調製することが可能である。調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内因性遺伝子の転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上(例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上)の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。   Antisense DNA can be prepared, for example, by the phosphorothioate method (Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988) based on the sequence information of DNA set forth in SEQ ID NO: 2. is there. The prepared DNA can be transformed into a desired plant by a known method. The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the transcription product of the endogenous gene of the plant to be transformed, but may not be completely complementary as long as the gene expression can be effectively inhibited. . The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) to the transcript of the target gene. In order to effectively inhibit the expression of the target gene using the antisense sequence, the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. is there. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.

「本発明のタンパク質をコードするDNAの転写産物と相補的なRNAをコードするDNA」の他の一つの態様は、内因性のd11遺伝子の転写産物と相補的なdsRNA(二重鎖RNA)をコードするDNAである。標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するdsRNAを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、RNAi(RNA干渉、RNA interference)と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3'末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA(short interference RNA)を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体(RISC: RNA-induced silencing complex)が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子の転写産物(mRNA)を切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。   Another embodiment of the “DNA encoding RNA complementary to the transcript of the DNA encoding the protein of the present invention” is a dsRNA (double stranded RNA) complementary to the transcript of the endogenous d11 gene. It is DNA to encode. A phenomenon called RNAi (RNA interference), in which the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene is both suppressed by introducing dsRNA having the same or similar sequence to the target gene into the cell. Can cause. When dsRNA of about 40 to several hundred base pairs is introduced into a cell, a RNaseIII-like nuclease called Dicer with a helicase domain is present in the presence of ATP, and dsRNA is about 21 to 23 base pairs from the 3 ′ end. Cut out and produce siRNA (short interference RNA). A protein specific to this siRNA binds to form a nuclease complex (RISC: RNA-induced silencing complex). This complex recognizes and binds to the same sequence as siRNA, and cleaves the transcript (mRNA) of the target gene at the center of the siRNA by RNaseIII-like enzyme activity. In addition to this pathway, the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA. There is also a possibility that this dsRNA becomes Dicer's substrate again to generate new siRNA and amplify the action.

RNAiは当初、線虫において発見されたが(Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, 1998)、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている(Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001)、Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001))。これら生物では、実際に外来よりdsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。   RNAi was first discovered in nematodes (Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, 1998), but now only nematodes It has been observed in various organisms such as plants, linear animals, Drosophila and protozoa (Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999), Sharp, PA RNA interference 2001 Genes Dev. 15, 485-490 (2001), Hammond, SM, Caudy, AA & Hannon, GJ Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA.Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001), Zamore , PD RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)). In these organisms, it has been confirmed that the expression of the target gene is suppressed by actually introducing dsRNA from a foreign body, and is also being used as a method for creating knockout individuals.

RNAiの登場当初は、dsRNAはある程度の長さ(40塩基)以上でなければ効果がないと考えられていたが、米ロックフェラー大のTuschlらは21塩基対前後の単鎖dsRNA(siRNA)を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞においてもPKRによる抗ウイルス反応を起こさず、RNAiの効果があることを報告し(Tuschl, Nature, 411, 494-498 (2001))、RNAiは分化したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めることになった。   At the beginning of RNAi, dsRNA was thought to be ineffective unless it was longer than a certain length (40 bases), but US Rockefeller University Tuschl et al. Used a single-stranded dsRNA (siRNA) of around 21 base pairs. When introduced into cells, it has been reported that the antiviral response by PKR does not occur in mammalian cells and RNAi is effective (Tuschl, Nature, 411, 494-498 (2001)). As a technology that can be applied to mammalian cells, it has attracted a great deal of attention.

本発明のDNAは、標的遺伝子の転写産物(mRNA)のいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAを含み、前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAより前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAを発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。   The DNA of the present invention comprises an antisense code DNA encoding an antisense RNA for any region of a target gene transcription product (mRNA) and a sense code DNA encoding a sense RNA of any region of the mRNA. The antisense RNA and the sense RNA can be expressed from the antisense code DNA and the sense code DNA. Moreover, dsRNA can also be produced from these antisense RNA and sense RNA.

本発明のdsRNAの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。   In the case where the dsRNA expression system of the present invention is retained in a vector or the like, there are a case where antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector, and a case where antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors, respectively. is there. For example, antisense RNA and sense RNA can be expressed from the same vector as antisense RNA in which an antisense coding DNA and a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII are linked upstream of the sense coding DNA. It can be constructed by constructing an expression cassette and a sense RNA expression cassette, respectively, and inserting these cassettes into the vector in the same direction or in the opposite direction.

また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA(siRNAコードDNA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖(アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖)の3'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A(アデニン)塩基を4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類は異なっていることが好ましい。   It is also possible to construct an expression system in which antisense code DNA and sense code DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands. In this configuration, one double-stranded DNA (siRNA-encoding DNA) in which an antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired is provided, and antisense RNA and sense RNA from each strand are provided on both sides thereof. A promoter is provided oppositely so that it can be expressed. In this case, in order to avoid adding extra sequences downstream of the sense RNA and antisense RNA, a terminator is added to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand). It is preferable to provide. As this terminator, a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used. In this palindromic style expression system, the two promoter types are preferably different.

また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。   In addition, as a configuration for expressing antisense RNA and sense RNA from different vectors, for example, antisense coding DNA and an antisense in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of the sense coding DNA. An RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette can be constructed, and these cassettes can be held in different vectors.

RNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、Tuschlら(前掲)により報告された全長21〜23塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。   In RNAi, siRNA may be used as dsRNA. “SiRNA” means a double-stranded RNA consisting of short strands in a range that does not show toxicity in cells, and is not limited to the total length of 21 to 23 base pairs reported by Tuschl et al. The length is not particularly limited as long as the length is not shown. For example, the length can be 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 to 30 base pairs. Alternatively, the siRNA to be expressed is transcribed and the length of the final double-stranded RNA portion is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, more preferably 21 to 30 base pairs. be able to.

本発明のDNAとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列(イントロン配列が望ましい)を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドRNA(self-complementary 'hairpin' RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト(Smith, N.A., et al. Nature, 407: 319, 2000、Wesley, S. V. et al. Plant J. 27: 581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001)を用いることもできる。   As the DNA of the present invention, an appropriate sequence (preferably an intron sequence) is inserted between inverted repeats of a target sequence to produce a double-stranded RNA having a hairpin structure (self-complementary 'hairpin' RNA (hpRNA)). Such constructs (Smith, NA, et al. Nature, 407: 319, 2000, Wesley, SV et al. Plant J. 27: 581, 2001, Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29: E55, 2001 ) Can also be used.

RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上)の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。   The DNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% or more). The sequence identity can be determined by the method described above.

dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ(対応する塩基が相補的でない)、バルジ(一方の鎖に対応する塩基がない)などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。   The part of the double-stranded RNA in which the RNAs in dsRNA are paired is not limited to a perfect pair, but mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (no base corresponding to one strand) ) Or the like may include an unpaired portion. In the present invention, both bulges and mismatches may be included in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair with each other.

内因性のd11遺伝子の発現の抑制は、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素, 35: 2191, 1990)。   Suppression of endogenous d11 gene expression can also be carried out using a DNA encoding a ribozyme. A ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Some ribozymes have a variety of activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for site-specific cleavage of RNA. Some ribozymes have a group I intron type or a size of 400 nucleotides or more like M1RNA contained in RNaseP, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type ( Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191, 1990).

例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi et. al., FEBS Lett. 228: 225, 1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(Koizumi et. al., FEBS Lett. 239: 285,1988、小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素,35: 2191, 1990、Koizumi et. al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989)。   For example, the self-cleaving domain of hammerhead ribozyme cleaves on the 3 ′ side of C15 of G13U14C15, but it is important for U14 to form a base pair with A at position 9, and the base at position 15 is In addition to C, it has been shown to be cleaved by A or U (Koizumi et. Al., FEBS Lett. 228: 225, 1988). If the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence near the target site, it is possible to create a restriction enzyme-like RNA-cleaving ribozyme that recognizes the UC, UU, or UA sequence in the target RNA. (Koizumi et.al., FEBS Lett. 239: 285, 1988, Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 35: 2191, 1990, Koizumi et. Al., Nucleic. Acids. Res. 1989).

また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, Nature 323: 349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, 及び菊池洋,化学と生物 30: 112, 1992)。   Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (Buzayan, Nature 323: 349, 1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, and Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology 30: 112, 1992).

標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である (Taira et. al., Protein Eng. 3: 733, 1990、Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989、Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19: 3875, 1991、Taira et. al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991)。   A ribozyme designed to cleave the target is linked to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells. However, at that time, if an extra sequence is added to the 5 ′ end or 3 ′ end of the transcribed RNA, the ribozyme activity may be lost. In such a case, in order to accurately cut out only the ribozyme part from the RNA containing the transcribed ribozyme, another trimming ribozyme that acts in cis for trimming is placed on the 5 'side or 3' side of the ribozyme part. (Taira et.al., Protein Eng. 3: 733, 1990, Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989, Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19 : 3875, 1991, Taira et. Al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991).

また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。   In addition, such structural units can be arranged in tandem so that multiple sites in the target gene can be cleaved, thereby further enhancing the effect (Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271 , 1992). Such a ribozyme can be used to specifically cleave the transcription product of the target gene in the present invention, thereby suppressing the expression of the gene.

内在性遺伝子の発現の抑制はさらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる「共抑制」によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7: R793, 1997、Curr. Biol. 6: 810, 1996)。   Suppression of endogenous gene expression can also be achieved by “co-suppression” resulting from transformation of DNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence. “Co-suppression” refers to a phenomenon in which the expression of both a foreign gene and a target endogenous gene to be introduced is suppressed when a gene having the same or similar sequence as that of the target endogenous gene is introduced into a plant by transformation. Say. Details of the mechanism of co-suppression are not clear, but are often observed in plants (Curr. Biol. 7: R793, 1997, Curr. Biol. 6: 810, 1996).

例えば、d11遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、d11遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からd11変異体の形質を有する植物、即ち矮性化した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上)の配列の同一性を有する。   For example, in order to obtain a plant body in which the d11 gene is co-suppressed, a vector DNA prepared so that the d11 gene or a DNA having a sequence similar thereto can be expressed is transformed into the target plant, and the resulting plant is obtained. A plant having a d11 mutant trait, that is, a dwarfed plant may be selected from the body. The gene used for co-suppression need not be completely identical to the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% or more).

さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。   Furthermore, suppression of the expression of the endogenous gene in the present invention can also be achieved by transforming a gene having a dominant negative trait of the target gene into a plant. A gene having a dominant negative trait refers to a gene having a function of eliminating or reducing the activity of an endogenous wild-type gene inherent in a plant by expressing the gene.

また本発明は、上記の内在性遺伝子の発現の抑制に用いるDNAを含むベクター、該DNAを発現可能に保持する形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。   The present invention also provides a vector containing a DNA used to suppress the expression of the endogenous gene, a transformed plant cell that retains the DNA so that it can be expressed, a transformed plant containing the transformed plant cell, and the transformed plant. Provided is a transformed plant body that is a progeny or clone of the body, and a propagation material for the transformed plant body.

さらに、本発明は、上記の形質転換植物体の製造方法であって、内在性遺伝子の発現の抑制に用いるDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法に関する。   Furthermore, the present invention relates to a method for producing the above-mentioned transformed plant, which comprises a step of introducing a DNA used for suppressing the expression of an endogenous gene into a plant cell and regenerating the plant from the plant cell. .

本発明のDNAの植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法(エレクトロポーレーション法)、パーティクルガン法により実施することができる。   Those skilled in the art can introduce the DNA of the present invention into plant cells by a known method such as the Agrobacterium method, electroporation method (electroporation method), or particle gun method.

上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばNagelらの方法(Microbiol. Lett. 67: 325, 1990)が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のDNAが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のDNAが位置し、さらに該DNAの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35S、トウモロコシのユビキチンプロモーター(特開平2-79983号公報)等を挙げることができる。   When the Agrobacterium method is used, for example, the method of Nagel et al. (Microbiol. Lett. 67: 325, 1990) is used. According to this method, the recombinant vector is transformed into Agrobacterium bacteria, and then the transformed Agrobacterium is introduced into plant cells by a known method such as a leaf disk method. The vector contains an expression promoter so that the DNA of the present invention is expressed in a plant after being introduced into the plant, for example. In general, the DNA of the present invention is located downstream of the promoter, and a terminator is located downstream of the DNA. The recombinant vector used for this purpose is appropriately selected by those skilled in the art depending on the method of introduction into the plant or the type of plant. Examples of the promoter include CaMV35S derived from cauliflower mosaic virus, corn ubiquitin promoter (Japanese Patent Laid-Open No. 2-79983), and the like.

また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。   Examples of the terminator include a terminator derived from cauliflower mosaic virus or a terminator derived from a nopaline synthase gene. However, the terminator is not limited to these as long as it is a promoter or terminator that functions in a plant body.

また、本発明のDNAを導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物の細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。   Moreover, the plant into which the DNA of the present invention is introduced may be explants, and cultured cells may be prepared from these plants and introduced into the obtained cultured cells. Examples of the “plant cell” of the present invention include plant cells such as scutellum in leaves, roots, stems, flowers and seeds, callus, suspension culture cells and the like.

また、本発明のDNAの導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。   Further, in order to efficiently select plant cells transformed by introduction of the DNA of the present invention, the above recombinant vector is introduced into plant cells together with a suitable selection marker gene or a plasmid vector containing a selection marker gene. Is preferred. Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene that is resistant to the antibiotic hygromycin, the neomycin phosphotransferase that is resistant to kanamycin or gentamicin, and the acetyltransferase that is resistant to the herbicide phosphinothricin. Genes and the like.

組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。   Plant cells into which the recombinant vector has been introduced are placed on a known selection medium containing a suitable selection agent according to the type of the introduced selection marker gene and cultured. As a result, transformed plant cultured cells can be obtained.

次いで、本発明のDNAを導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である(Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1995)。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体(インド型イネ品種が適している)を再生させる方法(Datta et. al., In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74, 1995)、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体(日本型イネ品種が適している)を再生させる方法(Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992)、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法(Christou et. al., Bio/technology, 9: 957-962, 1991)およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法(Hiei et. al., Plant J. 6: 271-282, 1994)など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。   Next, the plant body is regenerated from the transformed cell introduced with the DNA of the present invention. Plant regeneration can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells (Toki et. Al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1995). For example, in rice, a method for producing a transformed plant is to introduce a gene into protoplasts using polyethylene glycol and regenerate the plant (indian rice varieties are suitable) (Datta et. Al., In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) Pp66-74, 1995). Gene transfer to protoplasts by electric pulses to regenerate plants (Japanese rice varieties are suitable) (Toki et. Al. , Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992), a method of regenerating plants by directly introducing genes into cells by the particle gun method (Christou et. Al., Bio / technology, 9: 957-962, 1991) And several techniques have already been established, such as a method for introducing a gene via Agrobacterium and regenerating a plant (Hiei et. Al., Plant J. 6: 271-282, 1994). Widely used in the technical fieldIn the present invention, these methods can be suitably used.

形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、矮性化した植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。   The plant body regenerated from the transformed cells is then cultured in an acclimation medium. Thereafter, when the acclimatized regenerated plant body is cultivated under normal cultivation conditions, a dwarfed plant body can be obtained, and matured and fruited to obtain seeds.

なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAの存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。   In addition, the presence of introduced foreign DNA in a transformed plant that has been regenerated and cultivated in this way can be analyzed by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the base sequence of the DNA in the plant body. Can be confirmed.

この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法(Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に準じて実施することができる。   In this case, extraction of DNA from the transformed plant body can be performed according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

再生させた植物体中に存在する本発明のDNAよりなる外来遺伝子を、PCR法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したDNAを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のDNA、あるいは本発明により改変されたDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。   When the foreign gene comprising the DNA of the present invention present in the regenerated plant body is analyzed using the PCR method, the amplification reaction is performed using the DNA extracted from the regenerated plant body as a template as described above. In addition, an amplification reaction is carried out in a reaction mixture in which the DNA of the present invention or a synthesized oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of the DNA modified according to the present invention is used as a primer. You can also. In the amplification reaction, DNA denaturation, annealing, and extension reactions are repeated several tens of times to obtain an amplification product of a DNA fragment containing the DNA sequence of the present invention. When the reaction solution containing the amplification product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, it is possible to confirm that the amplified DNA fragments are fractionated and the DNA fragments correspond to the DNA of the present invention.

一旦、染色体内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。   Once a transformed plant into which the DNA of the present invention has been introduced into the chromosome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them. Is possible. The present invention includes a plant cell into which the DNA of the present invention has been introduced, a plant containing the cell, progeny and clones of the plant, and propagation material of the plant, its progeny and clones.

本発明においては、上記の如く、植物のd11遺伝子の発現を抑制することで、植物を矮性化することができる。本発明の方法で作製した植物は、例えば有用農作物では高い収量が安定的に得られ、鑑賞用植物では新たな美的価値が付加されることが大いに期待される。   In the present invention, as described above, a plant can be dwarfed by suppressing the expression of the plant d11 gene. The plant produced by the method of the present invention is highly expected that, for example, a high yield can be stably obtained for useful crops, and a new aesthetic value is added to ornamental plants.

さらに、外来性のd11遺伝子を植物に導入することにより、植物の生長の促進、特に、茎葉伸長の上昇を図ることが考えられる。外来性のd11遺伝子が導入された植物の形質転換体の作製は、上記した方法により行うことができる。即ち、植物細胞内で機能するベクターに該遺伝子を挿入し、該ベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させることにより、目的の形質転換植物体を作出することができる。   Furthermore, by introducing an exogenous d11 gene into a plant, it is conceivable to promote the growth of the plant, particularly to increase the foliage elongation. Production of a transformant of a plant into which an exogenous d11 gene has been introduced can be performed by the method described above. That is, a target transformed plant can be produced by inserting the gene into a vector that functions in a plant cell, introducing the vector into the plant cell, and regenerating the plant from the plant cell.

さらに、d11遺伝子の配列情報を基に、植物の内因性のd11遺伝子の発現を抑制するために用いる、アンチセンスRNAをコードするDNA、dsRNAをコードするDNA、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、さらに共抑制効果を有するRNAをコードするDNA等を作製することも可能である。作製されたDNAは、植物を矮性化させるために使用できる。   Furthermore, DNA encoding antisense RNA, DNA encoding dsRNA, and DNA encoding ribozyme activity are used to suppress the expression of endogenous d11 gene in plants based on the sequence information of d11 gene. Furthermore, it is possible to prepare DNA encoding RNA having a co-suppression effect. The produced DNA can be used to dwarf plants.

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。   EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these examples.

[実施例1]
イネインド型品種カサラス(Kasalath)に、d11遺伝子をもつ日本型遺伝子系統HO556を交配したF2集団450個体を育成し、各個体毎にDNAを抽出した。d11遺伝子は第4染色体に座乗することが明らかにされていたことから、d11遺伝子と第4染色体に座乗するRFLPマーカーとの連鎖解析を行い、連鎖地図を作成した。その結果、d11遺伝子はRFLPマーカーW390、L353と組換え頻度約1.8%で連鎖していることが明らかとなった。これらの連鎖地図より高密度連鎖地図を作成するために4種類のCAPSマーカー(S10628、R1721、R278、C377)を設計した。
[Example 1]
450 F2 populations were bred with the rice type cultivar Kasalath and the Japanese gene line HO556 carrying the d11 gene, and DNA was extracted for each individual. Since the d11 gene was found to sit on the 4th chromosome, linkage analysis between the d11 gene and the RFLP marker seated on the 4th chromosome was performed to create a linkage map. As a result, it was revealed that the d11 gene was linked to RFLP markers W390 and L353 at a recombination frequency of about 1.8%. Four types of CAPS markers (S10628, R1721, R278, C377) were designed to create a high-density linkage map from these linkage maps.

[実施例2]
矮性遺伝子d11の高精度連鎖地図の作成を行った。DNAマーカーの多型を確実に得るために、分離集団の親系統にSL14を選定した。この系統は水稲品種日本晴の遺伝的背景(12種類の染色体)のうち、第4染色体のみをインド型品種カサラス(Kasalath)の染色体に置換した系統である。SL14とHO556を交配して得られたF2種子約15000個を播種した後、幼苗期に3020個の矮性個体(劣性ホモ型)からCAPSマーカーを用いて選抜して圃場に移植した。葉のサンプリングを行い、330個の植物体からDNAを抽出し、RFLP分析に供した。その結果、d11遺伝子は、第4染色体のd11座近傍に位置づけられたRFLPマーカーG7008またはC559、W390またはL353に挟まれた領域(0.02cM)に位置づけられた(図2)。
[Example 2]
A high-precision linkage map of the fertile gene d11 was made. In order to reliably obtain DNA marker polymorphism, SL14 was selected as the parental line of the segregating population. This strain is a strain in which only the fourth chromosome of the genetic background (12 types of chromosomes) of the rice cultivar Nipponbare is replaced with the chromosome of the Indian variety Kasalath. After seeding about 15000 F2 seeds obtained by crossing SL14 and HO556, 3020 fertile individuals (recessive homozygous) were selected from the seedling stage using the CAPS marker and transplanted to the field. Leaf sampling was performed, DNA was extracted from 330 plants, and subjected to RFLP analysis. As a result, the d11 gene was located in a region (0.02 cM) sandwiched between RFLP markers G7008 or C559, W390, or L353 located near the d11 locus of chromosome 4 (FIG. 2).

[実施例3]
矮性遺伝子d11を含むPACクローンの選定とそれらの物理地図の作成、さらにd11座を含むゲノミッククローンの同定を行うために、G7008、L353を用いてPACライブラリーをスクリーニングした。その結果、G7008、L353の塩基配列を含むPACクローンをそれぞれ6および4種類選定することができた。またカセット-PCR法を用いて調製した各PACクローンの末端DNA断片を用いて、PACクローンの重複の確認と染色体歩行を行うとともに連鎖地図上へのマッピングを行った。しかしながら、これらのPACクローンではd11遺伝子をカバーできないことが判明したため、さらなるPACクローンのスクリーニングを行った。上記記載の方法により同様にPACクローンを整列化した。その結果、d11遺伝子は、2つのPACクローン(P424E6、及びP471B10)の間に位置づけられることが判明した。
[Example 3]
PAC libraries were screened using G7008 and L353 to select PAC clones containing the fertility gene d11, create their physical maps, and identify genomic clones containing the d11 locus. As a result, 6 and 4 types of PAC clones containing G7008 and L353 nucleotide sequences could be selected, respectively. In addition, using the terminal DNA fragment of each PAC clone prepared using the cassette-PCR method, we confirmed the duplication of PAC clones, performed chromosome walking, and mapped them onto a linkage map. However, since it was found that these PAC clones could not cover the d11 gene, further PAC clones were screened. PAC clones were similarly aligned by the method described above. As a result, the d11 gene was found to be located between two PAC clones (P424E6 and P471B10).

[実施例4]
実施例3より、矮性遺伝子d11遺伝子は2つのPACクローン(P424E6、及びP471B10)の間に位置づけられた。さらにSTSマーカーやアンプリコンマーカーを用いることにより、d11遺伝子の候補領域を98kbにまで狭めることに成功した。遺伝子予測により、この98kbの候補領域内には18個の遺伝子の存在が予測された。d11変異体のゲノミックDNAを用いて98kbの候補領域をPCRで増幅し、塩基配列を解読した。この領域について、野生型とd11変異体の塩基配列を比較し、変異部位を探索した(図2)ところ、3個の候補遺伝子に変異が見られることが明らかとなった。
[Example 4]
From Example 3, the fertile gene d11 gene was located between two PAC clones (P424E6 and P471B10). Furthermore, by using STS markers and amplicon markers, we succeeded in narrowing the d11 gene candidate region to 98 kb. Gene prediction predicted the presence of 18 genes in this 98 kb candidate region. Using the genomic DNA of the d11 mutant, a 98 kb candidate region was amplified by PCR, and the nucleotide sequence was decoded. In this region, the nucleotide sequences of the wild type and d11 mutant were compared and searched for mutation sites (FIG. 2), and it was revealed that mutations were found in the three candidate genes.

さらに詳細な変異部位を調べるために、イネ完全鎖長cDNAデータベースをサーチし、これら3個の候補遺伝子に対応するcDNAの塩基配列を得た。これらの塩基配列の情報を元に作成したプライマーを用いてRT-PCRを行い、PCR産物を得た。得られたPCR産物の塩基配列の比較を行い、詳細な変異部位を探索した。その結果、サイトクロームP450をコードすると思われるcDNA内にすべてのd11アレルにおいて変異が見られた(図3)。このことより、d11遺伝子はサイトクロームP450をコードすることが明らかとなった。   In order to investigate more detailed mutation sites, rice full-length cDNA databases were searched to obtain cDNA base sequences corresponding to these three candidate genes. RT-PCR was performed using primers prepared based on these nucleotide sequence information to obtain PCR products. The nucleotide sequences of the obtained PCR products were compared to search for detailed mutation sites. As a result, mutations were found in all d11 alleles within the cDNA that appears to encode cytochrome P450 (FIG. 3). This revealed that the d11 gene encodes cytochrome P450.

タンパク質コード領域推定プログラムにより、98kbの候補領域内のゲノムDNAには、18種類のタンパク質をコードする領域が示された。この18種類の候補タンパク質の塩基配列を野生型(日本晴)と変異体(d11変異体)で比較した。本発明者らは8種類のd11変異体を収集し、これらd11変異体は、アレリズムテストにより、すべてアレルであることを検証していた。初めに、5種類のd11アレルをランダムに選別し、野生型と同一な塩基配列が得られた候補タンパク質を消去する手法で、塩基配列の解析を行った所、5種類のアレルに共通して、1個のタンパク質候補領域(d11遺伝子)に変異が検出された。さらに、残りの4種類のd11アレルにも、この領域に変異が観察された。最後に、これら8種類のアレルのcDNAを用いてこの候補遺伝子の塩基配列を比較したところ、すべて野生型との塩基配列に違いが確認された(図3)。   By the protein coding region estimation program, regions encoding 18 kinds of proteins were shown in the genomic DNA in the 98 kb candidate region. The base sequences of these 18 kinds of candidate proteins were compared between the wild type (Nipponbare) and the mutant (d11 mutant). The present inventors collected eight types of d11 mutants, and verified that these d11 mutants were alleles by an allelism test. First, we randomly selected 5 types of d11 alleles and deleted candidate proteins that had the same base sequence as the wild type. A mutation was detected in one protein candidate region (d11 gene). Furthermore, mutations were also observed in this region in the remaining four d11 alleles. Finally, when the nucleotide sequences of these candidate genes were compared using the cDNAs of these eight types of alleles, differences in the nucleotide sequences from the wild type were confirmed (FIG. 3).

8種類のd11変異体の変異原因遺伝子の変異は、以下のように、グループ1〜4として分類された。
グループ1(HO556とT65d11):第2エキソンに1塩基の欠失が生じたことによる変異。
グループ2(Tos3220):第3エキソンに5塩基の欠失が生じたことによる変異。
グループ3(TCM2410、TCM268、及びTCM269):第4エキソンに1塩基置換によるアミノ酸変換による変異。この領域はP450の活性中心の1つ(ドメインA領域)である。
グループ4(Id11とN28d11):第7エキソン内に1塩基挿入が生じたことによる変異。
グループ1、2、及び4はいずれも、フレーム枠のずれを生じてストップコドンを生じる変異である。このように、これらd11変異体において、正確な翻訳産物が翻訳されない、または活性中心のドメイン構造を形成するための必須配列が形成できないといった変異の原因が明らかにされた。
Mutations in the causative genes of the eight types of d11 mutants were classified as groups 1 to 4 as follows.
Group 1 (HO556 and T65d11): Mutation due to the deletion of one base in the second exon.
Group 2 (Tos3220): Mutation due to a 5 base deletion in the third exon.
Group 3 (TCM2410, TCM268, and TCM269): Mutation due to amino acid conversion by substitution of one base in the fourth exon. This region is one of the active centers of P450 (domain A region).
Group 4 (Id11 and N28d11): Mutation caused by the insertion of a single base in the seventh exon.
Groups 1, 2, and 4 are all mutations that cause a frame shift and generate a stop codon. Thus, in these d11 mutants, the cause of the mutation was found such that an accurate translation product was not translated or an essential sequence for forming the domain structure of the active center could not be formed.

d11変異体における発現解析では、節間,開花前の組織において高い発現が確認されたことは、d11変異体が示す矮性,短粒の表現型と一致する(図1)。   In the expression analysis of d11 mutant, the high expression in internode and pre-flowering tissues is consistent with the dwarf, short grain phenotype of d11 mutant (Fig. 1).

[実施例5]
d11遺伝子のcDNA塩基配列より予測したアミノ酸配列と、アラビドピシス、及びイネにおいて既知のサイトクロームP450のアミノ酸配列との比較を行い、どの植物ホルモンの生合成経路に関与するかを調べた。その結果、ブラシノステロイド生合成経路を触媒すると思われるサイトクロームP450と同じファミリーに属することが明らかとなった。さらに既知のサイトクロームP450と同じアミノ酸配列ではなかったことから、d11遺伝子がコードするサイトクロームP450はブラシノステロイド生合成経路に関与する新規遺伝子であることを示している(図4)。
[Example 5]
The amino acid sequence predicted from the cDNA base sequence of the d11 gene was compared with the amino acid sequence of cytochrome P450 known in Arabidopsis and rice to examine which plant hormone biosynthetic pathway is involved. As a result, it became clear that it belongs to the same family as cytochrome P450 which seems to catalyze the brassinosteroid biosynthesis pathway. Furthermore, since the amino acid sequence was not the same as that of known cytochrome P450, it was shown that cytochrome P450 encoded by the d11 gene is a novel gene involved in the brassinosteroid biosynthesis pathway (FIG. 4).

[実施例6]
PACクローン(P424E6)を制限酵素XbaIとEcoRIで処理することにより、約2Kbのプロモーター領域を含む全鎖長d11遺伝子6.2Kb断片を得た。この6.2Kbp断片を、バイナリーベクターpPZP2H-lacのクローニングサイト(XbaIとEcoRI)に連結した。このベクターをアグロバクテリアEHE101に導入し、定法に従い、イネカルスを形質転換した。形質転換体(Transformant-D11)は、穂が伸長して垂れるとともに、種子型も野生型と同様の表現型を示した(図5)。したがって、d11遺伝子を含む6.2Kbの遺伝子断片が、d11変異を相補することが明らかとなった。
[Example 6]
The PAC clone (P424E6) was treated with restriction enzymes XbaI and EcoRI to obtain a 6.2 Kb fragment of the full-length d11 gene containing a promoter region of about 2 Kb. This 6.2 Kbp fragment was ligated to the cloning site (XbaI and EcoRI) of the binary vector pPZP2H-lac. This vector was introduced into Agrobacterium EHE101, and rice callus was transformed according to a conventional method. The transformant (Transformant-D11) showed a phenotype similar to that of the wild type, while the ears were elongated and drooped (FIG. 5). Therefore, it was revealed that a 6.2 Kb gene fragment containing the d11 gene complements the d11 mutation.

野生型およびd11変異体の表現型を示す写真である。A; 出穂期のイネを示す。B; 各変異体および野生型の第2節間を示す。C; 各変異体および野生型の登熟種子を示す。It is a photograph which shows the phenotype of a wild type and d11 mutant. A; Shows rice at heading time. B; Shown between each mutant and wild type second section. C; Each mutant and wild type matured seed is shown. (A)高密度連鎖解析によるd11座の推定領域と物理地図を示す図である。(B)d11遺伝子がコードするサイトクロームP450の構造とd11アレルにおける変異部位を示す図である。(A) It is a figure which shows the estimation area | region and physical map of d11 locus by a high-density linkage analysis. (B) shows the structure of cytochrome P450 encoded by the d11 gene and the mutation site in the d11 allele. d11遺伝子のアミノ酸配列と相同性があった他のサイトクロームP450のアミノ酸配列を示す図である。各種d11アレルで見いだされた変異部位を併記した。It is a figure which shows the amino acid sequence of the other cytochrome P450 which had homology with the amino acid sequence of d11 gene. Mutation sites found in various d11 alleles are also shown. d11遺伝子がコードするサイトクロームP450と既知のアラビドピシスおよびイネのサイトクロームP450の系統樹を示す図である。It is a figure which shows the phylogenetic tree of cytochrome P450 which d11 gene codes, and known Arabidopsis and rice cytochrome P450. 野生型d11遺伝子の導入により、d11変異が相補されることを示す写真である。A; 出穂期のイネを示す。B; 野生型および変異体の登熟種子を示す。左:野生型イネ(WT、T65)を示す。中央:d11変異体にd11遺伝子を導入した形質転換体(Transformant-D11)を示す。右:d11変異体にバイナリーベクターpPZP2H-lacを導入した形質転換体 (Transformant-control vector) を示す。It is a photograph which shows that d11 mutation is complemented by introduction | transduction of a wild-type d11 gene. A; Shows rice at heading time. B; shows wild-type and mutant ripening seeds. Left: Wild type rice (WT, T65) is shown. Center: shows a transformant (Transformant-D11) in which the d11 gene is introduced into the d11 mutant. Right: A transformant (Transformant-control vector) in which the binary vector pPZP2H-lac is introduced into the d11 mutant.

Claims (14)

植物の矮性化のために用いる、以下(a)〜(c)のいずれかに記載のDNA。
(a)植物の内因性のd11遺伝子の転写産物と相補的なRNAをコードするDNA
(b)植物の内因性のd11遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
(c)植物の内因性のd11遺伝子の発現を共抑制効果により阻害するRNAをコードするDNA
The DNA according to any one of the following (a) to (c), which is used for dwarfing a plant.
(A) DNA encoding an RNA complementary to a transcription product of a plant endogenous d11 gene
(B) DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves a transcription product of a plant endogenous d11 gene
(C) DNA encoding RNA that inhibits the endogenous d11 gene expression in plants by co-suppression effect
植物のd11遺伝子がイネのd11遺伝子である、請求項1に記載のDNA。   The DNA according to claim 1, wherein the plant d11 gene is a rice d11 gene. 請求項1または2に記載のDNAを含むベクター。   A vector comprising the DNA according to claim 1 or 2. 請求項1または2に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換植物細胞。   A transformed plant cell that retains the DNA of claim 1 or 2 in an expressible manner. 植物がイネである、請求項4に記載の形質転換植物細胞。   The transformed plant cell according to claim 4, wherein the plant is rice. 請求項4または5に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。   A transformed plant comprising the transformed plant cell according to claim 4 or 5. 請求項6に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。   A transformed plant which is a descendant or clone of the transformed plant according to claim 6. 植物がイネである、請求項6または7に記載の形質転換植物体。   The transformed plant according to claim 6 or 7, wherein the plant is rice. 矮性化している、請求項6または7に記載の形質転換植物体。   The transformed plant according to claim 6 or 7, which is dwarfed. 請求項6〜9のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。   The propagation material of the transformed plant body in any one of Claims 6-9. 請求項6〜9のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項1または2に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。   A method for producing a transformed plant according to any one of claims 6 to 9, comprising a step of introducing the DNA according to claim 1 or 2 into a plant cell and regenerating the plant from the plant cell. Method. 植物体の細胞内における、内因性のd11遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、植物を矮性化させる方法。   A method for dwarfing a plant, comprising suppressing the expression of an endogenous d11 gene in cells of the plant body. 請求項1または2に記載のDNAを植物に導入することを特徴とする、請求項12に記載の方法。   The method according to claim 12, wherein the DNA according to claim 1 or 2 is introduced into a plant. 植物がイネである、請求項11〜13のいずれかに記載の方法。   The method according to any one of claims 11 to 13, wherein the plant is rice.
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