JP2008063244A - Treatment or prevention of saccharometabolism abnormality - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糖代謝異常を改善するための治療又は予防のための組成物、及び該組成物を用いた治療又は予防方法に関する。より詳細には、糖代謝の調節に関与するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするヌクレオチドなどを包含せしめた組成物、及び該組成物を用いた治療又は予防方法に関する。 The present invention relates to a composition for treatment or prevention for improving abnormal sugar metabolism, and a treatment or prevention method using the composition. More specifically, the present invention relates to a polypeptide involved in the regulation of sugar metabolism, a composition including a nucleotide encoding the polypeptide, and a treatment or prevention method using the composition.
糖代謝の異常に起因する疾患として、様々なものが知られているが、例えば、代表的な疾患として、糖代謝の低下によって生じる糖尿病を挙げることができる。糖代謝の異常は、糖尿病以外にも、肥満症に代表されるいわゆるメタボリックシンドロームとして知られる諸症状の原因にもなっている。また、逆に、糖代謝が異常に亢進すると低血糖状態、さらには症候性痩せ(るい痩)を引き起こす場合もある。従って、糖代謝の正常な状態に保つことは、身体機能の正常化を保つ上でも非常に重要なことである。
糖代謝異常と関連する疾患の中で、糖尿病は、その患者数の増大が著しく、有効な予防及び治療方法が切望される生活習慣病の１つである。糖尿病は、血液中に存在するグルコースを細胞内に正常に取り込み、代謝する機能が失われることにより、血糖値が高い状態で持続され、その結果、全身の血管壁に負担がかかり身体機能に様々な悪影響が生じる疾患である。そして、糖尿病を発症すると多くの合併症、例えば、網膜症、腎症、末梢神経障害の３大合併症以外にも、脳卒中、心筋梗塞、動脈硬化、泌尿器疾患などの深刻な病態を招く危険性を伴うものである。
糖尿病の治療方法としては、食事療法、運動療法などにより代謝機能の正常化を図る方法の他、グルコース代謝に必要とされるインスリンを注射により投与する方法が行われている。
Various diseases are known as diseases caused by abnormal sugar metabolism. For example, diabetes caused by a decrease in sugar metabolism can be mentioned as a typical disease. In addition to diabetes, abnormalities in glucose metabolism also cause various symptoms known as so-called metabolic syndrome represented by obesity. Conversely, abnormally increased sugar metabolism may cause a hypoglycemic condition and even symptomatic skinny. Therefore, maintaining a normal state of glucose metabolism is very important for maintaining normalization of body functions.
Among the diseases associated with abnormal glucose metabolism, diabetes is one of lifestyle-related diseases whose number of patients is remarkably increasing and an effective prevention and treatment method is eagerly desired. Diabetes is sustained in a high blood glucose level due to the loss of the function of normally taking up and metabolizing glucose present in the blood into the cells, resulting in a burden on the blood vessel walls of the whole body and various physical functions. It is a disease that causes adverse effects. And when diabetes develops, there are many complications such as retinopathy, nephropathy, peripheral neuropathy, and risk of serious pathological conditions such as stroke, myocardial infarction, arteriosclerosis, and urological diseases. It is accompanied by.
As a method for treating diabetes, in addition to a method of normalizing metabolic function by diet therapy, exercise therapy, etc., a method of administering insulin required for glucose metabolism by injection is performed.
近年、インスリンを直接投与する方法の他にも、インスリンの生成、インスリンの分泌などを促進することにより、血糖値の低下を実現させる方法などの研究も活発に行われている。しかしながら、インスリン非依存性の２型糖尿病に認められる、インスリン抵抗性の病態の改善においては、新たな作用機序を示す耐糖能改善薬の開発が望まれている。
In recent years, in addition to the method of directly administering insulin, researches such as a method for realizing a decrease in blood glucose level by promoting insulin production and insulin secretion have been actively conducted. However, in the improvement of the insulin resistance pathology observed in non-insulin-
ところで、ＣＧＲ１１遺伝子は、ｐ５３により発現が制御される遺伝子として、Ｍａｄｄｅｎ等により同定された遺伝子で（非特許文献１）、機能的ｐ５３遺伝子発現に伴い、その発現が上昇する（特許文献１及び２）。Ｍａｄｄｅｎ等によると、ＣＧＲ１１はｐ５３経路の下流において細胞増殖の抑制的制御に関与しているとのことであるが、その詳細については明らかにされていない。その他、胃ガンにおける遺伝子発現率が高いこと（特許文献３）、さらに最近では、ＣＧＲ１１遺伝子が痛みに関連することが示唆される遺伝子として同定されたことが報告されており（特許文献４）、ＣＧＲ１１の実際の機能については統一的見解が得られておらず、未だその機能を解明するには至っていない。さらには、ＣＧＲ１１によってコードされるタンパク質がどのような形態、すなわち、タンパク質に翻訳されたままで機能するのか、分泌タンパク質して機能しているのか、或いは、糖鎖などによる翻訳後修飾などが行われているかどうかなど、生体内における機能メカニズムを理解する上で重要な情報が不足している。
By the way, the CGR11 gene is a gene identified by Madden et al. As a gene whose expression is controlled by p53 (Non-patent Document 1), and its expression increases with functional p53 gene expression (
本発明者らは、上記事情に鑑み、インスリンとは異なる糖代謝を促進する因子の存否について鋭意研究を行った結果、ＣＧＲ１１遺伝子産物が細胞の糖代謝を促進することを明らかにした。
よって、本発明は、糖代謝異常を改善するための治療又は予防のための組成物、及び該組成物を用いた治療又は予防方法の提供を目的とする。
In view of the above circumstances, the present inventors have conducted intensive research on the presence or absence of a factor that promotes sugar metabolism different from that of insulin. As a result, it has been clarified that the CGR11 gene product promotes cell sugar metabolism.
Therefore, an object of the present invention is to provide a composition for treatment or prevention for improving abnormal sugar metabolism, and a treatment or prevention method using the composition.
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチド、又はそのアゴニスト、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、糖代謝異常に起因する疾患の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチド」である。
（２）本発明の第２の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、糖代謝異常に起因する疾患の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリヌクレオチド」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記疾患が、糖尿病又は肥満症である上記（１）又は（２）に記載の予防又は治療剤」である。
（４）本発明の第４の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対するアンタゴニスト、及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、糖代謝異常に起因する疾患の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチド」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記疾患が、低血糖症又は症候性痩せ（るい痩）である上記（４）に記載の予防又は治療剤」である。
（６）本発明の第６の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドに対する抗体を含んでなる、糖代謝異常に起因する疾患の発症の有無及び発症の予測のための診断用組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチド」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記抗体が配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合するものである上記（６）に記載の診断用組成物」である。
（８）本発明の第８の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを細胞に導入し、糖代謝活性が上昇した細胞を製造する方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリヌクレオチド」である。
（９）本発明の第９の態様は、「上記（８）に記載の方法により得られた細胞」である。
That is, the present invention relates to the following (1) to (9).
(1) The first aspect of the present invention is “because of abnormal glucose metabolism, comprising a polypeptide shown in the following (a) or (b), or an agonist thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier: Preventive or therapeutic agent for diseases.
(A) Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or insertions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and an activity of promoting cell sugar metabolism A polypeptide having ".
(2) A second aspect of the present invention provides a method for treating abnormal sugar metabolism, comprising a recombinant vector comprising a polynucleotide shown in the following (a) or (b), and a pharmaceutically acceptable carrier. A preventive or therapeutic agent for the disease caused.
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 (b) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 A polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, and a polypeptide encoded by the polynucleotide Is a polynucleotide having the activity of promoting cell sugar metabolism.
(3) The third aspect of the present invention is “the preventive or therapeutic agent according to (1) or (2) above, wherein the disease is diabetes or obesity”.
(4) The fourth aspect of the present invention is “a disease caused by abnormal sugar metabolism, comprising an antagonist to the polypeptide shown in the following (a) or (b) and a pharmaceutically acceptable carrier: Preventive or therapeutic agent.
(A) Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or insertions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and an activity of promoting cell sugar metabolism A polypeptide having ".
(5) The fifth aspect of the present invention is “the prophylactic or therapeutic agent according to (4) above, wherein the disease is hypoglycemia or symptomatic thinning”.
(6) The sixth aspect of the present invention is “the presence or absence of the onset of a disease caused by an abnormal sugar metabolism and the prediction of the onset, comprising an antibody against the polypeptide shown in the following (a) or (b): Diagnostic composition for.
(A) Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or insertions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and an activity of promoting cell sugar metabolism A polypeptide having ".
(7) The seventh aspect of the present invention is the diagnostic composition as described in (6) above, wherein the antibody specifically binds to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 14. Things ".
(8) The eighth aspect of the present invention is “a method for producing a cell having an increased sugar metabolic activity by introducing a recombinant vector containing a polynucleotide shown in (a) or (b) below into a cell.
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 (b) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 A polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, and a polypeptide encoded by the polynucleotide Is a polynucleotide having the activity of promoting cell sugar metabolism.
(9) The ninth aspect of the present invention is “a cell obtained by the method described in (8) above”.
本発明に係る組成物を用いることにより、糖代謝異常に起因する疾患の予防及び／又は治療に有効な医薬の開発が可能となる。
また、本発明に係る方法を用いることにより、糖代謝異常に起因する疾患の予防及び／又は治療を行うことが可能となる。
By using the composition according to the present invention, it is possible to develop a pharmaceutical effective for preventing and / or treating a disease caused by abnormal sugar metabolism.
Further, by using the method according to the present invention, it becomes possible to prevent and / or treat diseases caused by abnormal sugar metabolism.
１．ＣＧＲ１１ポリヌクレオチド
本発明の組成物の有効成分の１つであるＣＧＲ１１ポリヌクレオチドには、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表される塩基配列からなるＤＮＡのみならず、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡからなるものも含まれる。ここで、「細胞」とは、ＣＧＲ１１ポリペプチドが作用し得る細胞であればいかなる細胞であってもよく、例えば、動物細胞、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来の細胞である。
また、本発明のポリヌクレオチドには、本発明の「遺伝子」も含まれる。本発明の遺伝子とは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡも含まれ、該遺伝子のエクソン、イントロンのみならず、プロモーター、エンハンサーなどの転写調節領域も含まれる。本発明のポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡが含まれ、二本鎖であっても一本鎖であってもよい、二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドでもよい。
1. CGR11 polynucleotide CGR11 polynucleotide which is one of the active ingredients of the composition of the present invention includes not only DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 but also SEQ ID NO: The activity of hybridizing under high stringency conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by 1, 3, 5, 7, 9, or 11 and promoting cell sugar metabolism Those comprising a DNA encoding a polypeptide having the above are also included. Here, the “cell” may be any cell as long as the CGR11 polypeptide can act, for example, an animal cell, preferably a human, rat, mouse, bovine, horse, sheep, chicken, Cells derived from dogs, cats, etc.
The polynucleotide of the present invention also includes the “gene” of the present invention. The gene of the present invention includes cDNA and genomic DNA, and includes not only exons and introns of the gene but also transcription regulatory regions such as promoters and enhancers. The polynucleotide of the present invention includes DNA and RNA, which may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA and It may be a hybrid with RNA.
配列番号１、３、５、７、９又は１１で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。 Examples of DNA capable of hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, or 11 include SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, or 11. And preferably about 70% or more, more preferably about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, Examples thereof include DNA containing a nucleotide sequence having a polynucleotide sequence homology of 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, most preferably about 99%.
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
Here, stringent conditions are hybridization conditions that are easily determined by those skilled in the art, and are generally empirical calculations that depend on probe length, washing temperature, and salt concentration. In general, the longer the probe, the higher the temperature for proper annealing, and the shorter the probe, the lower the temperature. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when the complementary strand is present in an environment near its melting point but below it.
Specifically, for example, as a low stringency condition, in a filter washing step after hybridization, washing is performed in a 0.1 × SSC, 0.1% SDS solution at a temperature of 37 ° C. to 42 ° C. Can be raised. Examples of highly stringent conditions include washing in 65 ° C., 5 × SSC and 0.1% SDS in the washing step. By making the stringent conditions higher, a highly homologous polynucleotide can be obtained.
ＣＧＲ１１ポリヌクレオチドは、例えば、下垂体由来の細胞であってホルモン産生を行っている細胞から取得することができる。例えば、ホルモンを産生する細胞およびその対照としてホルモンを産生しない細胞中に存在する全タンパク質を抽出し、各々を二次元電気泳動などを行って、その泳動プロフィールを比較し、ホルモン産生細胞においてのみ確認されるタンパク質のスポットから、質量分析法などを用いてアミノ酸配列情報を取得する。次に、得られたアミノ酸配列情報に基づいて、適当なｃＤＮＡライブラリーなどから、ＣＧＲ１１ポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡを単離することができる。 The CGR11 polynucleotide can be obtained from, for example, a pituitary-derived cell that is producing hormone. For example, extract all proteins present in hormone-producing cells and non-hormone-producing cells as controls, and perform two-dimensional electrophoresis on each to compare their migration profiles, confirming only in hormone-producing cells The amino acid sequence information is obtained from the protein spot using mass spectrometry or the like. Next, based on the obtained amino acid sequence information, DNA having a CGR11 polynucleotide sequence can be isolated from an appropriate cDNA library or the like.
また、すでに公知となっているＣＧＲ１１遺伝子の配列情報をデータベースなどから取得し、その配列情報に基づいて、所望の組織または動物種由来のＣＧＲ１１遺伝子を得ることも可能である。ＣＧＲ１１遺伝子のクローニングは当該技術分野における通常の知識に基づいて行うことができる。該遺伝子は、該遺伝子を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを調製し、定法のスクリーニング方法により取得することができる。あるいは、該遺伝子が発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、該遺伝子配列に基づいてＰＣＲ用プライマーを調製してｃＤＮＡを増幅させることにより該ｃＤＮＡを取得してもよい。 It is also possible to obtain sequence information of the CGR11 gene already known from a database or the like and obtain a CGR11 gene derived from a desired tissue or animal species based on the sequence information. Cloning of the CGR11 gene can be performed based on ordinary knowledge in the art. The gene can be obtained by preparing a cDNA library from cells expressing the gene and using a conventional screening method. Alternatively, RNA is prepared from cells in which the gene is expressed, cDNA is synthesized by reverse transcriptase, PCR primers are prepared based on the gene sequence, and the cDNA is amplified to obtain the cDNA. May be.
本発明におけるＣＧＲ１１ポリヌクレオチドの取得に使用可能な細胞は、ＣＧＲ１１ポリペプチドのｍＲＮＡが発現している細胞であれば如何なる細胞も使用可能であるが、例えば、脳下垂体のホルモン産生細胞などが好ましい。また、前記細胞が由来する動物は、本発明の遺伝子を有するものであれば如何なる動物（例えば、ヒト、ラットなど）であってもよい。
ＣＧＲ１１ポリヌクレオチドを取得するためのｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの調製には、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Pharmasia社）、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業社）、などの市販のキットを用いてもよい。
As the cell that can be used for obtaining the CGR11 polynucleotide in the present invention, any cell can be used as long as the CGR11 polypeptide mRNA is expressed. For example, a pituitary hormone-producing cell is preferable. . The animal from which the cells are derived may be any animal (eg, human, rat, etc.) as long as it has the gene of the present invention.
Commercially available kits such as mRNA Purification Kit (Pharmasia), AMV Reverse Transformase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation), etc. are used for the preparation of mRNA and CDNA for obtaining CGR11 polynucleotide. Also good.
２．ＣＧＲ１１ポリペプチド及びその部分ペプチド
本発明におけるＣＧＲ１１ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチドである。ここで、「細胞」とは、ＣＧＲ１１ポリペプチドが作用し得る細胞であればいかなる細胞であってもよく、例えば、動物細胞、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来の細胞である。
なお、本明細書中において、特に断らない限り、「ポリペプチド」と「タンパク質」は同じ意味で用いるものとする。
2. CGR11 polypeptide and partial peptide thereof CGR11 polypeptide in the present invention is a polypeptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12. . Here, the “polypeptide comprising substantially the same amino acid sequence” means about 60% or more, preferably about 70% or more, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12. More preferably about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, most preferably a polypeptide comprising an amino acid sequence having about 99% amino acid identity and having an activity of promoting cell glucose metabolism. Here, the “cell” may be any cell as long as the CGR11 polypeptide can act, for example, an animal cell, preferably a human, rat, mouse, bovine, horse, sheep, chicken, Cells derived from dogs, cats, etc.
In the present specification, “polypeptide” and “protein” are used interchangeably unless otherwise specified.
あるいは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチドである。ここで、「細胞」とは、ＣＧＲ１１ポリペプチドが作用し得る細胞であればいかなる細胞であってもよく、例えば、動物細胞、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来の細胞である。
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、単離した天然ポリペプチドに存在していてもよく、また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものでもよい。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（TAKARA社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（TAKARA社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって達成することができる。
Alternatively, the polypeptide comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12 is represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12. From the amino acid sequence in which one or several (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids have been deleted, substituted or added And a polypeptide having an activity of promoting cell glucose metabolism. Here, the “cell” may be any cell as long as the CGR11 polypeptide can act, for example, an animal cell, preferably a human, rat, mouse, bovine, horse, sheep, chicken, Cells derived from dogs, cats, etc.
The amino acid deletions, additions and substitutions may be present in the isolated natural polypeptide, or by modifying the gene encoding the polypeptide of the present invention by a technique known in the art. It may be newly introduced. For example, the substitution of a specific amino acid residue is carried out using a commercially available kit (for example, MutanTM-G (TAKARA), MutanTM-K (TAKARA)) or the like, a known method such as the Gupdedduplex method or the Kunkel method, or the like. This can be achieved by substituting the base by a method according to the above.
また、本発明におけるＣＧＲ１１ポリペプチドのＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。本発明のポリペプチドがＣ末端以外にもそのポリペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明のポリペプチドのＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のポリペプチドに含まれる。 In addition, the C-terminal of the CGR11 polypeptide in the present invention is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—), and the carboxyl group is an amide (—CONH 2 ), an ester (—COOR) or the like. It may be chemically modified. Here, as R in the ester, a C 1-6 alkyl group (for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl), a C 3-8 cycloalkyl group (for example, cyclopentyl, cyclohexyl), C 1-6 aryl group (for example, phenyl, α-naphthyl), phenyl-C 1-2 alkyl group (for example, benzyl, phenethyl), α-naphthyl-C 1-2 alkyl group (for example, α-naphthylmethyl) and the like Is mentioned. In addition, pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, can be used. When the polypeptide of the present invention has a carboxyl group in the polypeptide chain other than the C-terminus, the polypeptide of the present invention includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. Examples of the ester in this case include the above-mentioned esters. Similarly, the N-terminus of the polypeptide of the present invention is usually an amino group (—NH 2 ), which is chemically modified with a C 1-6 acyl group such as a formyl group or an acetyl group. Also good. In addition, the glutamyl group produced by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyroglutamine oxidized, or a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group) , A guanidino group, etc.) that are chemically modified with an appropriate functional group (for example, formyl group, acetyl, etc.) and those that are linked to a sugar chain are also included in the polypeptide of the present invention.
本発明におけるＣＧＲ１１ポリペプチド中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の組成物に含まれてもよい。また、部分ペプチドは本発明における抗体を調製するための抗原にもなり得る。すなわち、本発明の部分ペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を含むものである限り、如何なるものであってもよい。
本発明の部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも１０個以上、好ましくは３０個以上、より好ましくは８０個以上である。通常、本発明の部分ペプチドのＣ末端はカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、Ｎ末端はアミノ基（−ＮＨ２）であるが、化学修飾されていてもよい。
A peptide containing a partial amino acid sequence in the CGR11 polypeptide of the present invention (also referred to as a partial peptide) may be included in the composition of the present invention. The partial peptide can also be an antigen for preparing the antibody of the present invention. That is, the partial peptide of the present invention is not limited as long as it includes a part of the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6. There may be.
The number of amino acids constituting the partial peptide of the present invention is at least 10 or more, preferably 30 or more, more preferably 80 or more. Usually, the C-terminus of the partial peptide of the present invention is a carboxyl group (—COOH) and the N-terminus is an amino group (—NH 2 ), but may be chemically modified.
本発明におけるＣＧＲ１１ポリペプチド又はその塩は、ＣＧＲ１１ポリペプチドを発現しているヒトや動物（例えば、ラット、マウスなど）由来の培養細胞又は組織から、当該分野における通常の技術により抽出・分離することができ、あるいは後述のように本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現可能な状態で含む形質転換体を培養することにより、該培養物から抽出・分離することによっても調製することができる。ヒトや動物の組織又は細胞から調製する場合、ヒトや動物の組織または細胞をホモジナイズ後、酸等で抽出を行ない、得られた抽出液を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。 The CGR11 polypeptide or a salt thereof in the present invention is extracted and separated from a cultured cell or tissue derived from a human or animal (for example, rat, mouse, etc.) expressing the CGR11 polypeptide by a conventional technique in the art. Alternatively, it can also be prepared by culturing a transformant containing a DNA encoding the polypeptide of the present invention in a state capable of being expressed as described later, and then extracting and separating from the culture. When preparing from human or animal tissues or cells, homogenize human or animal tissues or cells, extract with acid, etc., and use the resulting extract for hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. It can be isolated and purified by combining various types of chromatography.
また、本発明における部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチド合成法又はＣＧＲ１１ポリペプチドを適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
上記の方法で得られるＣＧＲ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができる、塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
In addition, the partial peptide or a salt thereof in the present invention can be produced by a known peptide synthesis method or by cleaving a CGR11 polypeptide with an appropriate peptidase (for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase). As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing the partial peptide or amino acid that can constitute the polypeptide of the present invention and the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group. After the synthesis reaction, the partial peptide of the present invention can be isolated and purified by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, high performance liquid chromatography, recrystallization and the like.
When the CGR11 polypeptide obtained by the above method or a partial peptide thereof is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. When obtained as a salt, it is converted to a free form by a known method. Can be converted.
３．ＣＧＲ１１組換えベクター
ＣＧＲ１１ポリヌクレオチド又はその一部を組み込んだ組換えベクターは、適切なベクターにＣＧＲ１１ポリヌクレオチド又はその一部を連結することにより得ることができる。該組換えベクターは、クローニング用に供される場合には、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。また、ＣＧＲ１１ポリペプチド又はその一部を発現するためのベクターとしては、宿主中で複製可能なものであって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現させることができるプロモーターなどを有するものが使用可能である。
3. CGR11 recombinant vector A recombinant vector incorporating a CGR11 polynucleotide or a part thereof can be obtained by linking the CGR11 polynucleotide or a part thereof to an appropriate vector. The recombinant vector is not particularly limited as long as it can be replicated in a host when used for cloning. Further, as a vector for expressing the CGR11 polypeptide or a part thereof, a vector that can replicate in a host and has a promoter that can express a DNA fragment encoding the polypeptide is used. Is possible.
使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。 Examples of vectors that can be used include plasmid DNA and phage DNA. Plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (for example, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pCBD-C, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (for example, pUB110, pTP5, pC194, etc.), yeast-derived plasmids (for example, YEp13, YEp24, YCp50, YIp30, etc.) and the like, and examples of the phage DNA include λ phage. Furthermore, animal viruses such as retroviruses and vaccinia viruses, and insect virus vectors such as baculoviruses and togaviruses can also be used.
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
The promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it is an appropriate promoter corresponding to the host used for gene expression.
For example, when animal cells are used as the host, SRα promoter, CMV promoter, SV40 promoter, LTR promoter, HSV-TK promoter, EF-1α promoter and the like can be mentioned.
When the host is Escherichia coli, tac promoter, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, etc. are mentioned. When the host is Bacillus subtilis, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. are mentioned. It is done.
When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like can be mentioned.
When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
本発明の組換えベクターにはＣＧＲ１１ポリペプチド又はその一部のコード化配列、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、本発明のポリペプチドのＮ末端側に適当なシグナル配列を付加してもよい。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、ＯｍｐＡシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα−アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが利用可能である。
The recombinant vector of the present invention includes a selection marker, a terminator, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), SV40, in addition to the coding sequence of CGR11 polypeptide or a part thereof and a promoter sequence. A replication origin (SV40ori) or the like can be linked.
The selection markers include, but are not limited to, hygromycin resistance marker (Hyg r), dihydrofolate reductase gene (DHF r), the ampicillin resistance gene (Amp r), the kanamycin resistance gene (Kan r), neomycin resistance gene (Neo r , G418) and the like can be used.
For the purpose of facilitating the isolation and purification of the recombinant protein, an appropriate signal sequence may be added to the N-terminal side of the polypeptide of the present invention.
When the host is Escherichia coli, alkaline phosphatase signal, OmpA signal, etc. can be used. When the host is Bacillus subtilis, α-amylase signal sequence, subtilis signal sequence, etc. can be used. In some cases, α-factor signal sequence, invertase signal sequence, etc. can be used. When the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used. It is.
上述のベクターに対してＣＧＲ１１ポリヌクレオチド又はその一部を挿入することは、クローニングされたＤＮＡをそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明のポリペプチドが宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
以上の方法により、ＣＧＲ１１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを構築することができる。
Inserting the CGR11 polynucleotide or a part thereof into the above-described vector means that the cloned DNA is digested with a restriction enzyme as it is or as desired, a linker is added, and a restriction enzyme site or multicloning of the vector DNA is added. This can be done by inserting it into the site. The DNA to be ligated may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter. The DNA to be ligated needs to be incorporated into a vector so that the polypeptide of the present invention encoded in the DNA is expressed in the host cell.
By the above method, a vector containing a DNA sequence encoding CGR11 polypeptide can be constructed.
４．形質転換体
ＣＧＲ１１の形質転換体は、本発明の組換え発現ベクターを、ＣＧＲ１１遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、ＣＧＲ１１遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリシア属、枯草菌（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
4). Transformant A transformant of CGR11 can be obtained by introducing the recombinant expression vector of the present invention into a host so that the CGR11 gene can be expressed. Here, the host is not particularly limited as long as it can express the CGR11 gene. For example, E. coli (Escherichia coli) Escherichia genus such as Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) the genus Bacillus such as, Pseudomonas, such as Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Rhizobium meliloti (Rhizobium meliloti) bacteria belonging to the genus Rhizobium such as, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe), Pichia pastoris (Pichia pastoris) yeast, such as monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), or Sf9, Sf21 Insect cells such as
大腸菌への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等が挙げられる。 As a method for introducing a recombinant vector into E. coli, a method using calcium ions, an electroporation method, or the like can be used. As a method for introducing a recombinant vector into yeast, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, or the like can be used. Examples of methods for introducing a recombinant vector into animal cells or animal cells include the DEAE dextran method, the electroporation method, the calcium phosphate method, and a method using a cationic lipid.
５．ＣＧＲ１１ポリペプチド及びその部分ペプチドの製造
本発明の組成物に含まれるＣＧＲ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドは、ＣＧＲ１１遺伝子又はその一部の発現ベクターを導入した形質転換体を培養し、ＣＧＲ１１ポリペプチド又はその一部を発現させ、培養物から該ポリペプチド又はその一部を単離することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
5. Production of CGR11 polypeptide and partial peptide thereof The CGR11 polypeptide or partial peptide thereof contained in the composition of the present invention is obtained by culturing a transformant into which the CGR11 gene or a partial expression vector thereof has been introduced, and the CGR11 polypeptide or the partial peptide thereof. It can be produced by expressing a portion and isolating the polypeptide or a portion thereof from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells or cultured cells, or disrupted cells or cells.
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。 As a medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used. As the nitrogen source, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor and the like are used. As the inorganic salts, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like are used.
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。 Culturing is performed under conditions suitable for the host cell. For example, as the medium for culturing Escherichia coli, LB medium, M9 medium and the like are preferable. Agents such as isopropyl-1-thio-β-D-galactoside, 3β-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently if desired. In the case of Escherichia coli, the culture is usually performed at about 15 to 37 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added. When the host is Bacillus subtilis, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and aeration and agitation can be added as necessary.
酵母を培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 Examples of the medium for culturing yeast include SD medium and YPD medium. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary. When culturing a transformant whose host is an insect cell or an insect, examples of the medium include a grace insect medium containing bovine serum. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。上記培養物からＣＧＲ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。 When cultivating a transformant whose host is an animal cell, for example, a MEM medium, DMEM medium, RPMI-1640 medium or the like containing about 5 to 20% fetal calf serum is used as the medium. The pH is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary. Separation and purification of CGR11 polypeptide or a partial peptide thereof from the culture can be performed, for example, by the following method.
ＣＧＲ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過によりＣＧＲ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＣＧＲ１１ポリペプチド又はその部分ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 When extracting CGR11 polypeptide or a partial peptide thereof from cultured cells or cells, the cells or cells are collected after culturing by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or For example, a method of obtaining a crude extract of CGR11 polypeptide or a partial peptide thereof by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by freeze-thawing or the like is appropriately used. The buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100. When CGR11 polypeptide or a partial peptide thereof is secreted into the culture solution, the cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se after the culture is completed, and the supernatant is collected. Purification of the polypeptide of the present invention contained in the culture supernatant or extract thus obtained can be performed by appropriately combining known separation and purification methods. As these known separation and purification methods, methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation methods, dialysis methods, ultrafiltration methods, gel filtration methods, and mainly using differences in molecular weight such as SDS-PAGE. Method, method utilizing the difference in charge such as ion exchange chromatography, method utilizing specific affinity such as affinity chromatography, method utilizing difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography, isoelectric point A method using the difference in isoelectric point such as electrophoresis is used.
６．ＣＧＲ１１ポリヌクレオチド（遺伝子を含む）の機能を阻害する核酸
ＣＧＲ１１遺伝子の機能を阻害する核酸は、ＣＧＲ１１遺伝子の機能を喪失させることができる。遺伝子の機能を阻害する核酸としては、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡなどの一本鎖核酸およびその誘導体、該遺伝子領域の一部と相補的配列を有する短い二本鎖ＲＮＡなどを挙げることができる。 アンチセンスは、ＲＮＡ又はＤＮＡ
、あるいは、それらの誘導体であってよく、ＣＧＲ１１遺伝子の発現に関する有効な阻害因子として作用する。アンチセンスＲＮＡは、例えば、インビボにおいてｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡからＣＧＲ１１ポリペプチドへの翻訳を阻害するようにデザインされる。また、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣＧＲ１１遺伝子の転写開始領域に対して相補的となるようにデザインされ、その結果、該遺伝子の発現を阻害する。
これらのアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがＣＧＲ１１遺伝子又はポリペプチドの発現を阻害するようにインビボにおいて機能し得るように細胞へ導入することができる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合には、例えば、標的遺伝子配列の約−１０と＋１０の間の位置に結合するオリゴヌクレオチドであることが望ましい。
また、ＣＧＲ１１遺伝子と相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡはＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）に用いることもできる。ＲＮＡｉは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＣＧＲ１１遺伝子のｍＲＮＡ）が、目的のｍＲＮＡと相補的な配列を持つ二本鎖ＲＮＡにより分解される現象のことである。この現象を利用して人工的に二本鎖ＲＮＡを導入することにより、目的の遺伝子の発現を抑制することができる。従って、上述のアンチセンス法とは異なる原理に基づくと考えられる。
6). Nucleic acids that inhibit the function of CGR11 polynucleotides (including genes) Nucleic acids that inhibit the function of CGR11 genes can cause loss of CGR11 gene function. Examples of nucleic acids that inhibit gene function include single-stranded nucleic acids such as antisense RNA and DNA and derivatives thereof, and short double-stranded RNAs having a sequence complementary to a part of the gene region. . Antisense is RNA or DNA
Alternatively, it may be a derivative thereof, which acts as an effective inhibitor for the expression of the CGR11 gene. Antisense RNA is designed, for example, to hybridize with mRNA in vivo and inhibit translation of mRNA into CGR11 polypeptide. The DNA oligonucleotide is designed to be complementary to the transcription initiation region of the CGR11 gene, for example, and as a result, inhibits the expression of the gene.
These antisense RNAs or DNAs can be introduced into cells such that they can function in vivo to inhibit expression of the CGR11 gene or polypeptide. When antisense DNA is used, for example, an oligonucleotide that binds to a position between about -10 and +10 of the target gene sequence is desirable.
Moreover, double-stranded RNA having a sequence complementary to the CGR11 gene can also be used for RNAi (RNA interference). RNAi is a phenomenon in which target mRNA (for example, mRNA of CGR11 gene) is degraded by double-stranded RNA having a sequence complementary to the target mRNA. By using this phenomenon to artificially introduce double-stranded RNA, expression of the target gene can be suppressed. Therefore, it is considered to be based on a principle different from the above-described antisense method.
７．ＣＧＲ１１ポリペプチドに対する抗体
ＣＧＲ１１ポリペプチドに対する抗体は、ＣＧＲ１１ポリヌクレオチドの活性を喪失させることができる。さらに、例えば、ＣＧＲ１１ポリペプチドの過剰発現による糖代謝の異常の有無などの判断をＣＧＲ１１ポリペプチドに対する抗体を用いて行うことができる。
ＣＧＲ１１に対する抗体には、ＣＧＲ１１ポリペプチドと特異的に結合する抗体、及びそのＦａｂ又はＦ(ａｂ’)２などの抗体断片が含まれる。
本発明における「抗体」（本発明のポリペプチドの活性を促進する抗体、本発明のポリペプチドの活性を阻害する抗体の両方を含む）には、ＣＧＲ１１ポリペプチドに対するモノエピトープ特異抗体、ポリエピトープ特異抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
7). Antibodies against CGR11 polypeptides Antibodies against CGR11 polypeptides can cause the activity of CGR11 polynucleotides to be lost. Furthermore, for example, the presence or absence of abnormalities in sugar metabolism due to overexpression of CGR11 polypeptide can be determined using an antibody against CGR11 polypeptide.
Antibodies to CGR11 include antibodies that specifically bind to CGR11 polypeptide and antibody fragments such as Fab or F (ab ′) 2 thereof.
The “antibody” in the present invention (including both an antibody that promotes the activity of the polypeptide of the present invention and an antibody that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) includes a monoepitope specific antibody and polyepitope specific to the CGR11 polypeptide. Antibodies, single chain antibodies, and fragments thereof are included. These antibodies include, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, humanized antibodies and the like.
７−１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原には本発明のポリペプチド及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片が含まれる。例えば、配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、非常に優れた免疫原となる。
アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。特に、本発明のポリペプチドの部分ペプチドを免疫原とする場合は、免疫応答を増強するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターなどの免疫原性を有するタンパク質と該免疫原とを結合させたのち、インジェクトしてもよい。
あるいは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリを用いて調製してもよい。
7-1. Polyclonal antibodies Polyclonal antibodies can be prepared, for example, by injecting a mixture of immunogen and adjuvant into a mammalian host animal. Usually, the immunogen and / or adjuvant is injected multiple times subcutaneously or intraperitoneally into the host animal. Immunogens include polypeptides of the invention and fusions with heterologous polypeptides or fragments thereof. For example, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 14 is a very excellent immunogen.
Examples of adjuvants include complete Freud and monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicorynomycolate (MPL-TDM). In particular, when a partial peptide of the polypeptide of the present invention is used as an immunogen, immunogenicity such as keyhole limpet hemocyanin (KLH), serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor is used to enhance the immune response. The protein may be injected after the protein is bound to the immunogen.
Alternatively, it may be prepared using chickens that produce IgY molecules.
７−２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物または、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。或いは、免疫動物から取得したリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。免疫原には、ＣＧＲ１１ポリペプチド及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片も含まれる。免疫原としては、例えば、配列番号１３又は１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、非常に優れた免疫原となる。
7-2. Monoclonal antibodies Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method.
This method includes the following four steps: (i) immunizing a host animal or lymphocytes from the host animal, (ii) monoclonal antibody secreting (or potentially secreting) lymphocytes Harvest, (iii) fuse lymphocytes to immortalized cells, (iv) select cells that secrete the desired monoclonal antibody.
A mouse, rat, guinea pig, hamster, or other suitable host animal is selected as the immunized animal and the immunogen is injected. Alternatively, lymphocytes obtained from immunized animals may be immunized in vitro. If human cells are desired, peripheral blood lymphocytes (PBLs) are generally used. However, spleen cells or lymphocytes from other mammals are more common and preferred. Immunogens also include CGR11 polypeptides and fusions with heterologous polypeptides or fragments thereof. As an immunogen, for example, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 14 is a very excellent immunogen.
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合される。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化されたげっ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。 After immunization, lymphocytes obtained from the host animal are fused with an immortal cell line using a fusing agent such as polyethylene glycol to establish hybridoma cells. As fusion cells, rodent, bovine, or human myeloma cells immortalized by transformation are used, or rat or mouse myeloma cell lines are used. After cell fusion, the cells are grown in a suitable medium containing one or more substrates that inhibit the growth or survival of unfused lymphocytes and immortalized cell lines. Conventional techniques use parent cells that lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT). In this case, hypoxanthine, aminopterin and thymidine are added to a medium (HAT medium) that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
モノクローナル抗体の調製にあたり、好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas, VA）より入手可能である。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、目的のモノクローナル抗体の産生の有無を培養液を用いて確認することができる。産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫沈降又はインビトロでの結合アッセイにより評価することができる。
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ細胞は、限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離することができる。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、場合によっては、タンパク質を含まない培地若しくは無血清培地などが含まれる。また、ハイブリドーマ細胞は、適切な宿主動物の腹水中で増殖させてもよい。
For the preparation of monoclonal antibodies, the preferred immortal cell line is the mouse myeloma line available from the American Type Culture Collection (Manassas, VA).
Since hybridoma cells secrete antibodies outside the cells, the presence or absence of production of the desired monoclonal antibody can be confirmed using a culture solution. The binding specificity of the monoclonal antibody produced can be assessed by immunoprecipitation such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or in vitro binding assays.
Monoclonal antibody-secreting hybridoma cells can be isolated as single clones by limiting dilution and subculture. Suitable media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium, RPMI-1640, and in some cases, protein-free or serum-free media. Hybridoma cells may also be grown in the ascites of a suitable host animal.
モノクローナル抗体は、培地又は腹水からプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィーなどの当業者にとって周知の方法によって単離、精製される。
また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術によっても作製することができる。目的の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株から目的のモノクローナル抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を同定するのに、例えば、マウスの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。その結果、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が取得された場合は、その遺伝子の配列を決定することにより目的の抗体遺伝子を同定することができる。単離されたＤＮＡ断片は、モノクローナル抗体を発現させるために、適当な発現ベクターに抗体遺伝子を導入し、該ベクターを他の免疫グロブリンタンパク質を生産しないｓｉｍｉａｎ ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などのホスト細胞中へトランスフェクトする。単離されたＤＮＡ断片は、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード化配列を相同なマウス配列と置換することにより、又は非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全て又は一部と免疫グロブリンコード化配列を融合することにより、修飾することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を調製するために、抗体の定常ドメインと置換することが可能であり、又は一抗原結合部位の定常ドメインと置換することができる。
The monoclonal antibody is isolated and purified from the medium or ascites by methods well known to those skilled in the art, such as protein A sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, ammonium sulfate precipitation, or affinity chromatography.
Monoclonal antibodies can also be produced by gene recombination techniques. To identify the gene encoding the monoclonal antibody polypeptide of interest from a hybridoma cell line secreting the antibody of interest, for example, using oligonucleotide probes that specifically bind to mouse heavy and light chain antibody genes Good. As a result, when antibody heavy chain and light chain genes are obtained, the target antibody gene can be identified by determining the sequence of the genes. In order to express a monoclonal antibody, the isolated DNA fragment introduces an antibody gene into an appropriate expression vector, and the vector does not produce any other immunoglobulin protein, such as simin COS-7 cells, Chinese hamster ovary (CHO). Transfect into cells or host cells such as myeloma cells. An isolated DNA fragment can be immunized, for example, by replacing coding sequences for human heavy and light chain constant domains with homologous mouse sequences or with all or part of a sequence encoding a non-immunoglobulin polypeptide. Modifications can be made by fusing the globulin coding sequence. Such non-immunoglobulin polypeptides can replace the constant domain of the antibody or can be replaced with the constant domain of one antigen binding site to prepare a chimeric bivalent antibody.
７―３．ヒト化及びヒト抗体
ＣＧＲ１１ポリペプチド抗体には、ヒト化又はヒト抗体が含まれる。非ヒト抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗体の抗原結合領域など）である。
一般に、ヒト化抗体は非ヒト由来の免疫グロブリンから導入された一又は複数のアミノ酸残基を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、可変ドメインから選ばれる。ヒト化抗体は、例えばマウスのＣＤＲｓ又はＣＤＲ（相補性決定領域）配列と対応するヒト抗体配列とを置換することにより作製することができる。つまり、ヒト化抗体とは、ヒト由来の特定のＣＤＲ中のある残基と、該残基に相当するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ中の残基と置換されているヒト抗体のことである。また、非ヒト由来の残基によって、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が置換される場合もある。
7-3. Humanized and human antibodies CGR11 polypeptide antibodies include humanized or human antibodies. Humanized forms of non-human antibodies are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 ) or other antibody antigen binding that contain minimal sequences derived from non-human immunoglobulin. Area).
In general, humanized antibodies have one or more amino acid residues introduced from non-human-derived immunoglobulin. These non-human amino acid residues are often selected from variable domains. Humanized antibodies can be produced, for example, by replacing mouse CDRs or CDR (complementarity determining region) sequences with corresponding human antibody sequences. That is, a humanized antibody is a human antibody in which a certain residue in a specific CDR derived from human and a residue in a CDR of a non-human species such as mouse, rat or rabbit corresponding to the residue are substituted. That's it. In addition, Fv framework residues of human immunoglobulins may be replaced by residues derived from non-human.
８．ＣＧＲ１１ポリペプチドに対するアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明における「アゴニスト」とは、ＣＧＲ１１ポリペプチド、そのレセプター、又は相互作用因子（結合パートナー）に特異的に結合して、本発明のポリペプチドの生物学的活性を促進するものを意味し、上述の抗体の一部も「アゴニスト」に含まれる。抗体以外のアゴストとしては、限定はしないが、ポリペプチドまたはその断片、核酸、その他低分子化合物などを挙げることができる。また、本発明における「アンタゴニスト」とは、ＣＧＲ１１ポリペプチドまたはそのレセプター、相互作用因子（結合パートナー）に特異的に結合して、本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制するものを意味し、上述の抗体の一部も「アンタゴニスト」に含まれる。
8). Agonists and antagonists for CGR11 polypeptide "Agonist" in the present invention specifically binds to CGR11 polypeptide, its receptor, or interacting factor (binding partner), and increases the biological activity of the polypeptide of the present invention. It means what promotes, and some of the above-mentioned antibodies are also included in the “agonist”. Examples of the agonist other than the antibody include, but are not limited to, a polypeptide or a fragment thereof, a nucleic acid, and other low molecular weight compounds. The “antagonist” in the present invention means a substance that specifically binds to the CGR11 polypeptide, its receptor, or an interaction factor (binding partner) and suppresses the biological activity of the polypeptide of the present invention. Some of the above-mentioned antibodies are also included in “antagonists”.
９．ＣＧＲ１１ポリペプチドに対するアプタマー
アプタマーは標的タンパク質と特異的に結合する能力を持った核酸分子又はペプチドで、標的タンパク質の活性を阻害することができる。また、活性阻害ができないものでも、標的タンパク質と結合することができるため、該タンパク質の有無を調べるために使用することができる。
「アプタマー」が核酸の場合、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、これらのＲＮＡまたはＤＮＡがＣＧＲ１１ポリペプチドに特異的に結合するものである限り特に限定はしないが、好ましくはＤＮＡである。また、「アプタマー」には、リン酸骨格において修飾を加え、生体内における安定性を増大させたものも含み、特に限定はしないが、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホラミドチオエート結合、ホスホラミデート結合、ホスホルジアミデート結合、メチルホスホネート結合を含むリン酸骨格が好ましい。
9. Aptamers to CGR11 polypeptides Aptamers are nucleic acid molecules or peptides that have the ability to specifically bind to a target protein and can inhibit the activity of the target protein. In addition, even if the activity cannot be inhibited, it can bind to the target protein and can be used to examine the presence or absence of the protein.
When the “aptamer” is a nucleic acid, it may be RNA or DNA, and is not particularly limited as long as these RNA or DNA specifically binds to the CGR11 polypeptide, but is preferably DNA. . “Aptamers” include those that have been modified in the phosphate skeleton to increase in vivo stability, including, but not limited to, phosphorothioate bonds, phosphorodithioate bonds, phosphoramidothioate bonds, A phosphate skeleton containing a phosphoramidate bond, a phosphordiamidate bond, or a methylphosphonate bond is preferred.
１０．ＣＧＲ１１ポリペプチドと相互作用する因子の決定方法
ＣＧＲ１１ポリペプチドと相互作用する因子は、ＣＧＲ１１ポリペプチドによる細胞の糖代謝を促進する活性の増強又は抑制効果をもたらすことが期待される。従って、該因子を本発明の組成物にさらに含有せしめることで、目的に応じた効果を実現することが可能となる。ここで「相互作用する因子」には、タンパク質、ペプチド、小分子化合物など、当業者の想定し得るものが含まれる。例えば、タンパク質としては、ＣＧＲ１１ポリペプチドに対するレセプターが含まれる。ＣＧＲ１１ポリペプチドと相互作用する因子を決定する場合、限定はしないが、ＣＧＲ１１ポリペプチドもしくはその一部と候補因子（例えば、レセプターなど）又は候補因子をその表面に提示する細胞（例えば、候補レセプタータンパク質をその表面に発現させた細胞など）とを接触させた場合における、ＣＧＲ１１ポリペプチドもしくはその一部と候補因子との結合量、あるいは、細胞などを使用した場合には、該細胞内における生物学的な変化を検出することにより相互作用の有無を決定することができる。
具体的には、ＣＧＲ１１ポリペプチドもしくはその一部、又は候補因子を標識（例えば、蛍光標識、放射標識）し、両者を接触させた後、標識から得られるシグナル（例えば、蛍光、放射活性など）の強度を指標にし、定法及び技術常識に基づいて、両者の結合量を検出し、その結果、両者が強く結合しているとの評価が可能である場合には、候補因子を相互作用因子であると決定することができる。あるいは、レセプターを決定する場合には、候補レセプターを発現させている細胞と、ＣＧＲ１１ポリペプチドもしくはその一部とを接触させ、レセプターを介した細胞特有の細胞内シグナル（例えば、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化など）における変動が検出されたときは、候補レセプターが実際にレセプターとして機能しているとの予測をすることが可能となる。
10. Method for Determining Factors that Interact with CGR11 Polypeptide Factors that interact with CGR11 polypeptide are expected to have an effect of enhancing or suppressing the activity of promoting cell glucose metabolism by CGR11 polypeptide. Therefore, the effect according to the objective can be realized by further incorporating the factor into the composition of the present invention. Here, the “interacting factors” include those that can be assumed by those skilled in the art, such as proteins, peptides, and small molecule compounds. For example, proteins include receptors for CGR11 polypeptides. When determining a factor that interacts with a CGR11 polypeptide, but not limited to, a CGR11 polypeptide or a portion thereof and a candidate factor (eg, a receptor) or a cell that displays a candidate factor on its surface (eg, a candidate receptor protein) The amount of CGR11 polypeptide or a part thereof bound to a candidate factor, or the use of a cell or the like in the case of contact with a cell expressed on the surface thereof) The presence or absence of an interaction can be determined by detecting a general change.
Specifically, a signal (for example, fluorescence, radioactivity, etc.) obtained from the label after labeling the CGR11 polypeptide or a part thereof, or a candidate factor (for example, fluorescent label, radiolabel) and bringing them into contact with each other If the amount of binding between the two is detected based on the standard method and common technical knowledge, and as a result, it is possible to evaluate that both are strongly bound, the candidate factor should be It can be determined that there is. Alternatively, when determining a receptor, a cell expressing a candidate receptor is contacted with a CGR11 polypeptide or a part thereof, and a cell-specific intracellular signal (for example, intracellular Ca 2+ release) via the receptor is determined. When changes in intracellular cAMP production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, etc.) are detected, it is possible to predict that the candidate receptor actually functions as a receptor.
１１．組成物
ＣＧＲ１１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、該ポリペプチドに対するアゴニストなどを含んでなる組成物は、細胞の糖代謝の促進を目的として使用することができ、また、該ポリヌクレオチドの活性阻害核酸又は該ポリペプチドに対する抗体、アンタゴニストなどを含んでなる組成物は、細胞の糖代謝の抑制を目的として使用することができる。本組成物は、培養細胞などへの使用のためにインビトロにおいても使用することができる。本組成物には、ＣＧＲ１１ポリヌクレオチドなどの有効成分の他に、細胞の等張性を保つための物質、あるいは該有効成分の細胞内への移行を促進するための物質、バッファーなどの補助物質が含まれる。これらの補助物質は当業者が利用可能なものであれば全て利用することができる。
11. Composition A composition comprising a CGR11 polynucleotide, a polypeptide, an agonist for the polypeptide, and the like can be used for the purpose of promoting cell sugar metabolism. A composition comprising an antibody against a peptide, an antagonist, and the like can be used for the purpose of inhibiting cell glucose metabolism. The composition can also be used in vitro for use in cultured cells and the like. In addition to active ingredients such as CGR11 polynucleotide, the present composition includes substances for maintaining isotonicity of cells, substances for promoting the transfer of the active ingredients into cells, and auxiliary substances such as buffers Is included. These auxiliary substances can be used as long as they are available to those skilled in the art.
１２．医薬組成物
ＣＧＲ１１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、該ポリペプチドに対するアゴニストなどを含んでなる組成物は、細胞の糖代謝の促進を目的として使用することができ、また、該ポリヌクレオチドの活性阻害核酸又は該ポリペプチドに対する抗体、アンタゴニストなどを含んでなる組成物は、細胞の糖代謝の抑制を目的として使用することができることから医薬組成物としても利用可能である。従って、例えば、インスリン耐性を示す糖尿病などの治療等に有効に利用することができる。
ここで、「糖代謝の異常に起因する疾患」とは、細胞による糖代謝が正常値よりも過剰又は過少なことが原因となる疾患のことで、例えば、糖尿病、低血糖症、グリコーゲン病(糖原病)、先天性糖代謝異常症、肥満症など、当業者の技術常識の範囲に含まれる全ての疾患のことである。
12 Pharmaceutical Composition A composition comprising a CGR11 polynucleotide, a polypeptide, an agonist for the polypeptide, etc. can be used for the purpose of promoting the sugar metabolism of cells, and the activity-inhibiting nucleic acid of the polynucleotide or the A composition comprising an antibody against a polypeptide, an antagonist and the like can be used as a pharmaceutical composition since it can be used for the purpose of inhibiting the glucose metabolism of cells. Therefore, for example, it can be effectively used for the treatment of diabetes and the like showing insulin resistance.
Here, `` disease caused by abnormal sugar metabolism '' refers to a disease caused by excessive or insufficient sugar metabolism by cells, for example, diabetes, hypoglycemia, glycogen disease ( All diseases that fall within the scope of common technical knowledge of those skilled in the art, such as glycogenosis), congenital glucose metabolism disorders, and obesity.
上記ＣＧＲ１１ポリヌクレオチドなどは、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で治療薬として使用することができる。通常、そのような組成物には、核酸分子、タンパク質又は抗体などの他、薬剤的に受容可能な担体が含まれる。
「薬剤的に受容可能な担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、及びヒト血清アルブミンなどが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、上記ＣＧＲ１１ポリヌクレオチドなどの活性を保護又は促進するような特定の化合物が、該組成物中に包含されていてもよい。
The CGR11 polynucleotide and the like can be used as a therapeutic agent in the form of a pharmaceutical composition that does not adversely affect the living body. Such compositions typically include a pharmaceutically acceptable carrier, as well as a nucleic acid molecule, protein or antibody.
“Pharmaceutically acceptable carrier” refers to those suitable for pharmaceutical administration, including solvents, dispersion media, coating agents, antibacterial and antifungal agents, agents that act isotonically to delay adsorption and the like. . Examples of such carriers and those preferred for diluting the carriers include, but are not limited to, water, saline, finger solutions, dextrose solutions, and human serum albumin. Non-aqueous media such as liposomes and non-volatile oils are also used. Furthermore, specific compounds that protect or promote the activity of the CGR11 polynucleotide and the like may be included in the composition.
本発明に係る医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入なども含む）、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製することができる。非経口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
The pharmaceutical composition according to the present invention includes intravenous, intradermal, subcutaneous, oral (including inhalation, etc.), transdermal and transmucosal administration, and is formulated to be suitable for a therapeutically appropriate route of administration. It becomes. Solutions or suspensions used for parenteral, intradermal, or subcutaneous application include, but are not limited to, sterile diluents such as water for injection, saline solutions, non-volatile oils, polyethylene glycols, Glycerin, propylene glycol, or other synthetic solvents, benzyl alcohol or other preservatives such as methylparaben, antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite, soothing agents such as benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, ethylenediaminetetraacetic acid Chelating agents such as (EDTA), buffering agents such as acetate, citrate, or phosphate, and agents for osmotic pressure adjustment such as sodium chloride or dextrose.
The pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. Parenteral preparations are contained in ampoules, glass or plastic disposable syringes or multiple dose vials.
１２−１．注射可能な製剤
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒を、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬＴＭ（BASF, Parsippany, N.J.）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションを防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションの防止に対して使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
12-1. Injectable Formulations Pharmaceutical compositions suitable for injection include sterile injectable solutions or dispersion media in sterile aqueous (water soluble) or dispersion media and sterile powders for preparation at the time of use. For intravenous administration, suitable carriers include physiological saline, bacteriostatic water, CREMOPHOR ELTM (BASF, Parsippany, NJ), or phosphate buffered saline (PBS). When used as an injection, the composition must be sterile and must be fluid enough to be administered with a syringe. The composition must be stable to chemical changes, corrosion, and the like during formulation and storage, and must prevent contamination from microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures. For example, using a coating agent such as lectin, maintaining a required particle size in the dispersion medium, and maintaining a proper fluidity by using a surfactant. Various antibacterial and antifungal agents, such as parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, and thimerosal can be used to prevent microbial contamination. In addition, polyalcohols such as sugar, mannitol, sorbitol, and agents that maintain isotonicity such as sodium chloride may be included in the composition. Compositions that can delay adsorption include agents such as aluminum monostearate and gelatin.
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で、又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。 Sterile injectable solutions are prepared by adding the required ingredients alone or in combination with other ingredients to the required amount of the active compound in a suitable solvent and sterilizing. Generally, a dispersion medium is prepared by incorporating the active compound into a sterile medium that contains a basic dispersion medium and the other necessary ingredients described above. Sterile powder preparation methods for the preparation of sterile injectable solutions include vacuum drying and lyophilization to prepare a powder containing the active ingredient and any desired ingredients derived from the sterile solution. It is.
１２−２．経口組成物
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリチル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
12-2. Oral Compositions Oral compositions usually include an inert diluent or a carrier that does not harm when incorporated into the body. Oral compositions are, for example, contained in gelatin capsules or compressed into tablets. For oral treatment, the active compound is incorporated with excipients and used in the form of tablets, troches, or capsules. Oral compositions can also be prepared using a flowable carrier, and the composition in the flowable carrier is applied orally. In addition, pharmaceutically compatible binding agents, and / or adjuvant materials may be included.
Tablets, pills, capsules, troches and the like may contain any of the following components or compounds with similar properties: excipients such as microcrystalline cellulose, binding such as gum arabic, tragacanth or gelatin Agents; swelling agents such as alginic acid, PRIMOGEL, or corn starch such as starch or lactose; lubricants such as magnesium stearate or STRROTES; lubricants such as colloidal silicon dioxide; sweeteners such as sucrose or saccharin; or peppermint, methyl A fragrance additive such as salicylic acid or orange flavor.
１２−３．担体
上記ＣＧＲ１１ポリヌクレオチドなどは、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、ALZA Corporation（Mountain View, CA）及びNOVA Pharmaceuticals, Inc.（Lake Elsinore, CA）などから入手することが可能で、また、当業者によって容易に調製することもできる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な坦体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。例えば、抗体のＦａｂ’断片などは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合させてもよい。
12-3. Carriers The CGR11 polynucleotide and the like can be prepared as a sustained release preparation such as a delivery system encapsulated in implantable tablets and microcapsules using a carrier that can prevent immediate removal from the body. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Such materials can be obtained from ALZA Corporation (Mountain View, CA) and NOVA Pharmaceuticals, Inc. (Lake Elsinore, CA), etc., and can also be easily prepared by those skilled in the art. Liposome suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. Useful liposomes are prepared as a lipid composition comprising, but not limited to, phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanol (PEG-PE) through a filter of appropriate pore size so as to be of a size suitable for use. Purified by evaporation. For example, an antibody Fab ′ fragment or the like may be bound to a liposome via a disulfide exchange reaction.
１２−４．投与量
上記ＣＧＲ１１ポリペプチドの又は該ポリペプチドをコードする遺伝子等による特定の疾患の治療又は予防において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。
12-4. Dosage In the treatment or prevention of a specific disease with the above-mentioned CGR11 polypeptide or a gene encoding the polypeptide, etc., the appropriate dosage level depends on the condition of the patient to be administered, the administration method, etc. If so, it can be easily optimized.
In the case of injection administration, for example, it is preferable to administer about 0.1 μg / kg to about 500 mg / kg of the patient's body weight per day, and it will generally be possible to administer a single dose or divided into multiple doses. Preferably, the dosage level is about 0.1 μg / kg to about 250 mg / kg per day, more preferably about 0.5 to about 100 mg / kg per day.
For oral administration, the composition is preferably provided in the form of a tablet containing 1.0 to 1000 mg of active ingredient, preferably 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750. 0, 800.0, 900.0 and 1000.0 mg. The compounds are administered on a regimen of 1 to 4 times daily, preferably once or twice daily.
１２−５．単位投与量
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。
12-5. Unit Dosage A pharmaceutical composition or formulation must be composed of uniform unit dosages to ensure a certain dosage. A unit dose is a unit formulated with a pharmaceutically acceptable carrier, including a single dose effective for treating a patient. The unit dosage of the present invention is determined by the physical and chemical characteristics of the compound to be formulated, the expected therapeutic effect, and the formulation considerations specific to the compound. .
１２−６．遺伝子治療組成物
本発明において開示される核酸分子（例えば、ＣＧＲ１１ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが挿入されたベクター、ＣＧＲ１１ポリヌクレオチドに対するアンチセンス核酸も含む）を患者の細胞に導入する方法には、主としてインビボ又はエキソビボの２つの方法がある。インビボ送達においては、治療が必要とされる患者の部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の治療が意図される部位の細胞を単離し、単離された細胞に製剤化した核酸分子を導入し、導入された細胞を患者に直接又は、例えば、患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与することができる。核酸分子を生細胞に導入するために利用可能な技術は、培養細胞等にインビトロで導入されるか、又は患者にインビボで導入するかに依存して選択される。哺乳動物細胞にインビトロで核酸分子を導入するのに適した技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスフェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム沈降法などが挙げられる。トランスフェクションには、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸分子の細胞への導入が含まれる。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
12-6. Gene therapy composition A method for introducing a nucleic acid molecule disclosed in the present invention (for example, a CGR11 polynucleotide, a vector into which the polynucleotide is inserted, and an antisense nucleic acid against the CGR11 polynucleotide) into a patient's cells is mainly used. There are two methods, in vivo or ex vivo. For in vivo delivery, it is injected directly into the site of the patient in need of treatment. In ex vivo treatment, a cell at a site intended for treatment of a patient is isolated, a formulated nucleic acid molecule is introduced into the isolated cell, and the introduced cell is directly inserted into the patient or, for example, porous that is implanted in the patient. Can be administered in an encapsulated form. The technique available for introducing a nucleic acid molecule into a living cell is selected depending on whether it is introduced into a cultured cell or the like in vitro or introduced into a patient in vivo. Suitable techniques for introducing nucleic acid molecules into mammalian cells in vitro include liposomes, electroporation, microinjection, transfection, cell fusion, the DEAE-dextran method, and the calcium phosphate precipitation method. Transfection involves the binding of a recombinant viral (preferably retroviral) particle to a cellular receptor, followed by introduction of the nucleic acid molecule contained in the particle into the cell. A commonly used vector for ex vivo delivery of genes is a retrovirus.
現在、インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））、及びカチオン性脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏ１である；例えば、Tonkinson等, Cancer Investigation, 14(1):54-65 (1996) 参照）を利用した系が含まれる。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルスでありその中でも、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は位置決定因子などが含まれる。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、例えば、ナルコレプシー関連遺伝子を含んだ状態で転写される場合、該コード化遺伝子の翻訳を可能とするシスエレメント、即ち翻訳開始配列として機能する核酸配列を含む。このようなベクター構築物は、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部を含む。さらに、これらのベクターには、通常、該ベクターを含む宿主細胞から発現ポリペプチドを分泌させるシグナル配列が含まれる。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列である。場合によっては、ベクター構築物は、ポリアデニル化並びに翻訳終結配列も含む。例えば、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、ＤＮＡ合成の開始点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルス性の他のベクターは、例えばカチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマーを用いることもできる。
場合によっては、治療に用いる核酸を目的の細胞にターゲティングする試薬、例えば、細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、又は標的細胞上のレセプターのリガンドなどと共に提供するのが望ましい。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)などを参照のこと。
Currently preferred in vivo nucleic acid transfer techniques are viral or non-viral vectors (adenovirus, lentivirus, herpes simplex I virus, or adeno-associated virus (AAV)), and cationic lipid-based systems (lipid mediated transfer of genes). Useful lipids include, for example, DOTMA, DOPE, and DC-Cho1; see, for example, Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996)). The most preferred vector for use in gene therapy is a virus, of which adenovirus, AAV, lentivirus or retrovirus is most preferred. Viral vectors, such as retroviral vectors, include at least one transcription promoter / enhancer or locator. Furthermore, a viral vector such as a retroviral vector contains a cis element that enables translation of the encoded gene, that is, a nucleic acid sequence that functions as a translation initiation sequence when transcribed in a state including a narcolepsy-related gene. . Such vector constructs contain a packaging signal, a terminal repeat (LTR) or part thereof suitable for the virus used. In addition, these vectors usually contain a signal sequence that causes the expressed polypeptide to be secreted from the host cell containing the vector. Preferably, the signal sequence for this purpose is a mammalian signal sequence. In some cases, the vector construct also includes polyadenylation as well as translation termination sequences. For example, it includes a 5 ′ LTR, a tRNA binding site, a packaging signal, an initiation point for DNA synthesis, and a 3 ′ LTR or a portion thereof. Other non-viral vectors can use, for example, cationic lipids, polylysine, and dendrimers.
In some cases, it may be desirable to provide a nucleic acid for treatment with a reagent that targets the cell of interest, for example, an antibody specific for a cell surface membrane protein, or a ligand for a receptor on a target cell. For review of currently known gene labeling and gene therapy protocols, see Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992).
１３．医薬組成物に関するキット
医薬組成物はキット、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る医薬組成物がキットとして供給される場合、該医薬組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
１３−１．容器
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。
13. Kits for pharmaceutical compositions The pharmaceutical compositions can be included in the kit, container or pack with instructions for administration. When the pharmaceutical composition according to the present invention is supplied as a kit, different constituents of the pharmaceutical composition are packaged in separate containers and mixed immediately before use. The reason why the components are packaged separately in this way is to enable long-term storage without losing the function of the active component.
13-1. The reagent contained in the container kit is supplied in any kind of container in which the constituents maintain the activity effectively for a long period of time, are not adsorbed by the material of the container, and are not altered. For example, a sealed glass ampoule includes a buffer packaged under a neutral and non-reactive gas such as nitrogen gas. Ampoules are composed of glass, polycarbonate, organic polymers such as polystyrene, ceramics, metals, or any other suitable material commonly used to hold reagents. Examples of other suitable containers include simple bottles made from similar materials such as ampoules, and packaging materials that are internally lined with foil such as aluminum or an alloy. Other containers include test tubes, vials, flasks, bottles, syringes, or the like. The container has a sterile access port such as a bottle having a stopper that can be penetrated by a hypodermic needle.
１３−２．使用説明書
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
13-2. Instructions for use The instructions for use are also attached to the kit. Instructions for using the kit comprising the pharmaceutical composition are printed on paper or other material and / or floppy disk, CD-ROM, DVD-ROM, Zip disk, video tape, audio tape, etc. It may be supplied as an electrically or electromagnetically readable medium. Detailed instructions for use may be actually attached to the kit, or may be posted on a website designated by the manufacturer or distributor of the kit or notified by e-mail or the like.
１４．診断
ある細胞内において、ＣＧＲ１１ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現、及び／又は活性に異常が認められる場合には、該細胞の糖代謝活性に異常を来している危険性が高いものと判断することができる。この場合、ＣＧＲ１１遺伝子（エクソン領域のみならずイントロン領域、およびプロモーター領域も含む）又はＣＧＲ１１ポリペプチドの変異（例えば、点突然変異、欠失など）、該遺伝子の発現制御領域の変異の有無を調べることによって、上記異常の発症およびその発症の危険性を予測することができる。
14 Diagnosis When abnormality is observed in the expression and / or activity of CGR11 polynucleotide or polypeptide in a cell, it is judged that there is a high risk of abnormality in the sugar metabolic activity of the cell. Can do. In this case, the presence or absence of mutations in the CGR11 gene (including not only exon regions but also intron regions and promoter regions) or CGR11 polypeptide mutations (eg, point mutations, deletions, etc.) and expression control regions of the genes are examined. Thus, the onset of the abnormality and the risk of the onset can be predicted.
ＣＧＲ１１ポリペプチドの発現量を調べるには、該ポリペプチドに特異的な抗体を利用することができる。例えば、特定の細胞の糖代謝に異常を来していることが疑われる患者から被検試料を取得し、該被検試料に前記抗体を接触させ、該被検試料と該抗体との結合の有無を検出することで、該細胞の糖代謝異常の発症または発症の可能性を調べることができる。被検試料と抗体との結合の有無は、抗体を用いた免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、免役組織化学法、ＥＬＩＳＡ法などにより確認することができる。確認の結果、本発明のポリペプチドが全く検出されないか、または著しく少ない生体内存在量であると判断される場合には、上記異常の発症が疑われる。 In order to examine the expression level of CGR11 polypeptide, an antibody specific for the polypeptide can be used. For example, a test sample is obtained from a patient suspected of having an abnormality in sugar metabolism of a specific cell, the antibody is brought into contact with the test sample, and the binding between the test sample and the antibody By detecting the presence or absence, it is possible to examine the onset or possibility of onset of abnormal sugar metabolism in the cells. The presence or absence of binding between the test sample and the antibody can be confirmed by immunoprecipitation using an antibody, Western blotting, immunohistochemistry, ELISA, or the like. As a result of the confirmation, when the polypeptide of the present invention is not detected at all or it is determined that the amount of the polypeptide of the present invention is extremely small, the onset of the abnormality is suspected.
ＣＧＲ１１遺伝子の異常を確認するには、該遺伝子のｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列（転写制御領域、イントロン領域なども含む）またはこれらの相補鎖とアニールすることができるプライマー、プローブなどを利用することができる。利用可能なプライマーとしては、一般に、１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは、１７ｂｐ〜３０ｂｐの長さを有し、本発明の遺伝子のコード領域、非コード領域（転写制御領域、イントロン領域などを含む）の少なくとも部分領域を増幅することができるものであれば如何なるものであっても利用可能である。 In order to confirm abnormality of the CGR11 gene, a cDNA sequence, genomic DNA sequence (including transcription control region, intron region, etc.) of the gene or a primer, probe, etc. that can anneal with a complementary strand thereof can be used. it can. The primer that can be used is generally 15 bp to 100 bp, and preferably has a length of 17 bp to 30 bp. The coding region and non-coding region of the gene of the present invention (including transcription control region, intron region, etc.) Any material can be used as long as it can amplify at least a partial region.
利用可能なプローブとしては、一般に、１５ｂｐ以上の長さを有し、本発明の遺伝子のコード領域、非コード領域（転写制御領域、イントロン領域などを含む）の少なくとも部分領域とハイブリダイズすることができるものであれば如何なるものであっても利用可能である。また、プローブが目的のＤＮＡ領域にハイブリダイズすることを確認するために、該プローブは蛍光色素、放射標識などにより検出可能な状態で利用することができる。 The available probe generally has a length of 15 bp or more and can hybridize with at least a partial region of the coding region and non-coding region (including transcription control region, intron region, etc.) of the gene of the present invention. Anything that can be used can be used. Further, in order to confirm that the probe hybridizes to the target DNA region, the probe can be used in a state where it can be detected by a fluorescent dye, a radiolabel, or the like.
ＣＧＲ１１遺伝子の機能異常を確認する他の方法には、例えば、被検者から被検試料を取得し、該被検試料から調製したＣＧＲ１１遺伝子のｍＲＮＡ、または該ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡなどに前記プローブ、プライマーなどを接触させ、本発明の遺伝子のコード領域、非コード領域（転写制御領域、イントロン領域などを含む）の少なくとも部分領域との結合を検出する工程、または該部分領域を増幅する工程が含まれる。検出の結果、本発明の遺伝子の発現量等を健常者由来の試料と比較して異常が認められる場合には、ＣＧＲ１１遺伝子の機能異常の発症又はその危険性を予測することができる。
ここで、診断の対象となるのはヒトのみならず「哺乳動物」全般である。「哺乳動物」とは、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
Other methods for confirming CGR11 gene dysfunction include, for example, obtaining a test sample from a subject and applying the probe to mRNA of the CGR11 gene prepared from the test sample or cDNA prepared from the mRNA. A step of contacting a primer or the like to detect the binding of at least a partial region of the coding region or non-coding region (including transcription control region, intron region, etc.) of the gene of the present invention, or amplifying the partial region included. As a result of detection, when an abnormality is observed in the expression level of the gene of the present invention compared to a sample derived from a healthy subject, the onset of the functional abnormality of the CGR11 gene or its risk can be predicted.
Here, not only humans but also “mammals” in general are targeted for diagnosis. “Mammal” means any animal classified as a mammal, and is not particularly limited. For example, in addition to humans, pet animals such as dogs and cats, and domestic animals such as cows, pigs, sheep, and horses. And so on. Particularly preferred “mammals” are humans.
１５．治療
本発明には、疾患に罹患した、又は罹患する危険性のある哺乳動物の該疾患に関する予防又は治療方法が含まれる。
ここで、「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行を阻止又は緩和することを意味し、治療的処置のみならず予防的処置をも含む広い意味として使用される。また、「疾患」には、ＣＧＲ１１遺伝子又はポリペプチドの存否又は量的変動によって引き起こされる糖代謝異常の病態の全てが含まれ、例えば、低血糖症、グリコーゲン病(糖原病)、先天性糖代謝異常症、肥満症などが含まれる。
ここで、治療の対象となるのはヒトのみならず「哺乳動物」全般である。「哺乳動物」とは、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
15. Treatment The present invention includes a method for the prevention or treatment of a diseased or affected mammal of the mammal.
Here, “treatment” means to prevent or alleviate the progression of the pathology of the disease in a mammal that is likely to suffer from or suffers from the disease. It is used as a broad meaning including. In addition, the “disease” includes all the pathological conditions of abnormal sugar metabolism caused by the presence or absence of quantitative changes in the CGR11 gene or polypeptide, such as hypoglycemia, glycogen disease (glycogen disease), congenital sugar Metabolic disorders and obesity are included.
Here, not only humans but also “mammals” in general are targeted for treatment. “Mammal” means any animal classified as a mammal, and is not particularly limited. For example, in addition to humans, pet animals such as dogs and cats, and domestic animals such as cows, pigs, sheep, and horses. And so on. Particularly preferred “mammals” are humans.
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。 Examples are shown below, but the present invention is not limited thereto.
１．ＣＧＲ１１ポリペプチド
ＣＧＲ１１ポリペプチドは分泌タンパク質であり、分泌された当該タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、ＬＤＰＥＡＱＱ（配列番号１５）で始まることが明らかとなっている。従って、当該タンパク質のシグナル配列切断部位は従来から知られている切断部位とは異なるものである。また、切断部位にアルギニンが存在することから、シグナル配列切断前の前駆体タンパク質が、細胞外に分泌された後、セリンプロテアーゼによって切断されると考えられる。図１に、セリンプロテアーゼによる予測切断部位を示す。図に示すように、ＥＦ−ｈａｎｄ ｄｏｍａｉｎを含むペプチドは種間で最も保存性が高い。
1. CGR11 polypeptide CGR11 polypeptide is a secreted protein and the N-terminal amino acid sequence of the secreted protein has been shown to begin with LDPEAQQ (SEQ ID NO: 15). Therefore, the signal sequence cleavage site of the protein is different from the conventionally known cleavage sites. In addition, since arginine is present at the cleavage site, the precursor protein before cleavage of the signal sequence is considered to be cleaved by serine protease after being secreted outside the cell. FIG. 1 shows a predicted cleavage site by serine protease. As shown in the figure, a peptide containing EF-hand domain has the highest conservation among species.
２．糖代謝及び乳酸値の変動に対するＣＧＲ１１遺伝子産物の影響
ＣＧＲ１１遺伝子産物の糖代謝への影響を調べるために、ＰＣ１２細胞にＣＧＲ１１遺伝子を導入した。ラットのＣＧＲ１１遺伝子（配列番号３）を、定法に従い、フレーム（読み枠）が合うように、ＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクター（BD Biosciences社）にクローニングし、ＰＣ１２細胞内にトランスフェクトした。コントロールとして、ＣＧＲ１１遺伝子を組み込んでいないベクターをトランスフェクトした細胞を用いた。ベクターをトランスフェクトした細胞を３日間培養し、１度培養液を交換した後、培養５日後に培養液中の糖濃度及び乳酸値を測定した（ＤＭＥＭ（Invitrogen社）、１０％ＦＢＳ（Biological Industries社）中、３７℃、５％ＣＯ２）。糖濃度の測定は、Ｆ−キット グルコース(J.K. インターナショナル)社を使用し、グルコースに特異的な測定法を使用した。また、乳酸値の測定は、Ｆ−キットＬ−乳酸（J.K.インターナショナル社）を使用して行った。
糖濃度の測定結果から培養プレート１ウェルあたりのグルコース消費量を算出した（図２）。この結果から、ＣＧＲ１１遺伝子を発現させた細胞（図２中、ＰＣ１２ ＩＲＥＳ ｓｏｍａｔｏｇｅｎｉｎ ｃｌｏｎｅＤ）の方が、ＣＧＲ１１遺伝子を発現させていない細胞（図２中、ＰＣ１２ ＩＲＥＳ ｖｅ）よりもグルコース消費量が多いことが明らかとなった。また、図３には、培養プレート１ウェルあたりの乳酸濃度の測定結果が示されており、この結果から、ＣＧＲ１１遺伝子を発現させた細胞（図２中、ＰＣ１２ ＩＲＥＳ ｓｏ）の方が、ＣＧＲ１１遺伝子を発現させていない細胞（図２中、ＰＣ１２ ＩＲＥＳ ｖｅ）よりも培養液中の乳酸濃度が高いことが明らかとなった。
以上のことから、ＣＧＲ１１遺伝子産物は糖の代謝を促進することが分かった。
2. Effect of CGR11 gene product on changes in glucose metabolism and lactic acid level In order to examine the effect of CGR11 gene product on glucose metabolism, CGR11 gene was introduced into PC12 cells. The rat CGR11 gene (SEQ ID NO: 3) was cloned into an IRES bicistronic expression vector (BD Biosciences) in a frame (reading frame) according to a standard method, and transfected into PC12 cells. As a control, cells transfected with a vector not incorporating the CGR11 gene were used. The cells transfected with the vector were cultured for 3 days, and after changing the culture solution once, the sugar concentration and the lactic acid value in the culture solution were measured after 5 days of culture (DMEM (Invitrogen), 10% FBS (Biological Industries). Company), 37 ° C., 5% CO 2 ). For the measurement of sugar concentration, F-kit Glucose (JK International) was used, and a measurement method specific to glucose was used. The lactic acid level was measured using F-kit L-lactic acid (JK International).
The glucose consumption per well of the culture plate was calculated from the measurement result of the sugar concentration (FIG. 2). From this result, the amount of glucose consumed in the cells in which the CGR11 gene was expressed (PC12 IRES somatogenin clone D in FIG. 2) was higher than in the cells in which the CGR11 gene was not expressed (PC12 IRES ve in FIG. 2). Became clear. In addition, FIG. 3 shows the measurement result of the lactic acid concentration per well of the culture plate. From this result, the cell in which the CGR11 gene was expressed (PC12 IRES so in FIG. 2) was more CGR11 gene. It was clarified that the concentration of lactic acid in the culture solution was higher than that of cells not expressing the cells (PC12 IRESve in FIG. 2).
From the above, it was found that the CGR11 gene product promotes sugar metabolism.
前述したように、ＣＧＲ１１遺伝子産物は、セリンプロテアーゼによって切断される可能性のある部位を有しており、ＣＧＲ１１遺伝子産物が分泌タンパク質であることを考え合わせると、細胞外においてＣＧＲ１１遺伝子産物が分泌型セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、プラスミンなど）によって切断され、生じたペプチドが機能している可能性も考えられる。これらのペプチドとしては、例えば、ヒト由来の配列番号１６、配列番号１７などで表されるペプチド、あるいは、図１で示されるセリンプロテアーゼ切断部位によって切断されて生じるペプチドなどが考えられる。
そこで、ＣＧＲ１１遺伝子産物をセリンプロテアーゼで切断し、得られたペプチドの糖代謝促進活性について検討した。
As described above, the CGR11 gene product has a portion that can be cleaved by a serine protease, and considering that the CGR11 gene product is a secreted protein, the CGR11 gene product is secreted outside the cell. There is a possibility that the peptide cleaved by a serine protease (for example, trypsin, plasmin, etc.) functions. As these peptides, for example, peptides derived from human-derived SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 or the like, or peptides generated by cleavage at the serine protease cleavage site shown in FIG.
Therefore, the CGR11 gene product was cleaved with serine protease, and the sugar metabolism promoting activity of the obtained peptide was examined.
ＣＧＲ１１遺伝子を発現させた細胞の培養上清から、ＤＥＡＥカラムを用いて部分精製したＣＧＲ１１遺伝子産物を、トリプシンで消化した後、５分間加熱処理（１００℃でボイル）した。５×１０４細胞／ｍｌで播いたＰＣ１２細胞は、２日間培養し、熱処理したサンプルを添加した培地に交換した後、さらに１週間培養し、培地中の糖濃度を測定した。図４は、熱処理したサンプルと熱処理していないサンプルを培地中に１％とになるように添加し、糖濃度の測定を行った結果を示す。コントロールとしては、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに同様の処理を施したものを用いた。図４より、熱処理したサンプルを加えた場合に、コントロールとの間で糖代謝量に有意な差が認められた。このことから、トリプシンによって分解されたペプチドが糖代謝促進活性を持つことが明らかとなった。 The CGR11 gene product partially purified using a DEAE column from the culture supernatant of cells expressing the CGR11 gene was digested with trypsin and then heat-treated (boiled at 100 ° C.) for 5 minutes. PC12 cells seeded at 5 × 10 4 cells / ml were cultured for 2 days, replaced with a medium to which a heat-treated sample was added, then cultured for another week, and the sugar concentration in the medium was measured. FIG. 4 shows the results of measuring the sugar concentration by adding a heat-treated sample and a non-heat-treated sample to the medium so as to be 1%. As a control, 0.1% BSA / PBS treated in the same manner was used. From FIG. 4, when the heat-treated sample was added, a significant difference was observed in the amount of glucose metabolism with respect to the control. From this, it became clear that the peptide decomposed | disassembled by trypsin has sugar metabolism promotion activity.
３．ＣＧＲ１１遺伝子トランスジェニックマウス
ＣＧＲ１１遺伝子及びその遺伝子産物の代謝活性に対する影響を調べるために、ＣＧＲ１１遺伝子トランスジェニックマウスを作成し、その体重変化をモニターした。
トランスジェニックマウスは、ｐＣＡＧＧＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ（フナコシ社）を使用し、マウスＣＧＲ１１遺伝子を組み込んだコンストラクトをマウス胚に導入した。トランスジェニックマウスの体重は野生型と比較すると、体重の増加率が有意に低いことが明らかとなった（図５）。この結果から、トランスジェニックマウスの代謝活性は、野生型と比較して高くなっていることが示唆された。
3. CGR11 gene transgenic mouse In order to examine the influence of the CGR11 gene and its gene product on the metabolic activity, a CGR11 gene transgenic mouse was prepared and its weight change was monitored.
The transgenic mouse used was pCAGGS expression vector (Funakoshi Co., Ltd.), and a construct incorporating the mouse CGR11 gene was introduced into a mouse embryo. It was revealed that the rate of increase in body weight of the transgenic mice was significantly lower than that of the wild type (FIG. 5). From these results, it was suggested that the metabolic activity of the transgenic mice was higher than that of the wild type.
本発明は、糖代謝異常に起因する疾患の治療又は予防の用途に適用することができる。 The present invention can be applied to the use of treatment or prevention of diseases caused by abnormal sugar metabolism.
Claims (9)
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチド A preventive or therapeutic agent for a disease caused by abnormal sugar metabolism, comprising a polypeptide shown in the following (a) or (b), or an agonist thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
(A) Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or insertions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and an activity of promoting cell sugar metabolism Polypeptide having
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリヌクレオチド A preventive or therapeutic agent for a disease caused by abnormal sugar metabolism, comprising a recombinant vector comprising the polynucleotide shown in (a) or (b) below and a pharmaceutically acceptable carrier.
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 (b) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 A polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, and a polypeptide encoded by the polynucleotide Having the activity of promoting cell glucose metabolism
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチド A preventive or therapeutic agent for a disease caused by abnormal sugar metabolism, comprising an antagonist for the polypeptide shown in (a) or (b) below and a pharmaceutically acceptable carrier.
(A) Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or insertions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and an activity of promoting cell sugar metabolism Polypeptide having
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリペプチド The diagnostic composition for the presence or absence of the onset of the disease resulting from abnormal sugar metabolism, and the prediction of onset which comprises the antibody with respect to the polypeptide shown by the following (a) or (b).
(A) Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or insertions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and an activity of promoting cell sugar metabolism Polypeptide having
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが細胞の糖代謝を促進する活性を有するポリヌクレオチド A method for producing a cell having an increased sugar metabolic activity by introducing a recombinant vector containing a polynucleotide shown in the following (a) or (b) into the cell.
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 (b) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 A polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, and a polypeptide encoded by the polynucleotide Having the activity of promoting cell glucose metabolism
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