JP2005295921A - Selective splicing variant of new bst1 and its use - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、膵臓癌に特異的である新規腫瘍マーカー物質に関する。また、本発明は、当該マーカーを使用した検査方法及び該検査のためのキットにも関する。さらにまた、本発明は前記癌を治療するための医薬組成物にも関する。 The present invention relates to a novel tumor marker substance that is specific for pancreatic cancer. The present invention also relates to an inspection method using the marker and a kit for the inspection. Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating the cancer.
最近の医療技術の進歩により、癌の治療技術も大幅に改善されており、ある種の癌については、死亡率の減少傾向を示すものもある。しかしながら、癌の発症を早期に発見することは、その治療効果に影響を与えるものであるため、癌の早期発見を可能にする方法の確立が望まれている。
癌の診断には、癌組織を超音波又はＸ線検査などにより視覚的にとらえる方法の他、患者から採取した組織を免疫組織学的手法により細胞形態等の異常を発見する方法、並びに、特定の癌の発症に伴い発現に変化が生じるタンパク質又は遺伝子などのいわゆる腫瘍マーカーの動態を検出する生化学的、免疫化学的方法などが知られている。
Recent advances in medical technology have greatly improved cancer treatment technology, and some cancers show a decreasing mortality rate. However, since early detection of the onset of cancer affects its therapeutic effect, establishment of a method that enables early detection of cancer is desired.
For cancer diagnosis, in addition to a method of visually capturing cancer tissue by ultrasound or X-ray examination, etc., a method of discovering abnormalities such as cell morphology of tissues collected from patients by immunohistological techniques, and identification Biochemical and immunochemical methods for detecting the dynamics of so-called tumor markers such as proteins or genes whose expression changes with the onset of cancer are known.
これらの方法において、組織を免疫組織学的手法によりその形態を観察する方法は、組織の標本化が必要であるため、癌の発症の有無の確認に時間を要し、また、観察された形態から癌の発症の有無を見極めるためにはかなりの熟練が必要となる。
従って、比較的簡便でかつ客観的に癌発症の有無を判断することができる腫瘍マーカーを用いる方法の適用が、しばしば行なわれるようになってきた。しかしながら、腫瘍マーカー
を検出する方法を適用する場合、特定の癌に対するマーカーの特異性が非常に重要となってくる。ヒトの癌の診断において使用される腫瘍マーカーの多くは、正常組織細胞にも、ある程度発現しており、そのため、該腫瘍マーカーの発現の変動を癌化の指標として用いなくてはならないことが多く、誤診断の可能性が常に存在している。また、現在使用されている腫瘍マーカー、例えば、ＣＥＡやＣＡ１９−９という腫瘍マーカーは、胃、大腸、膵臓、肺など多くの臓器の細胞でつくられるため、それらの血清レベルが高くてもそれだけでは上記のどの臓器に癌病巣があるのか決定することが困難であった。
従って、癌発症の有無を客観的により正確に検出するために、非癌細胞にはその存在が認められず、癌化した細胞だけが産生する物質を腫瘍マーカーとして用いることが望ましい。特に、膵臓癌については、有効なスクリーニング検査法がないため、癌症状が表れた時には手遅れになっていることが多く、膵臓癌の早期発見のためには膵臓癌特異的な腫瘍マーカーの使用が必要とされている。
In these methods, the method of observing the morphology of the tissue by an immunohistological technique requires time for confirmation of the onset of cancer because it requires sampling of the tissue, and the observed morphology Therefore, considerable skill is required to determine the onset of cancer.
Therefore, the application of a method using a tumor marker, which can be relatively simple and objectively determine the presence or absence of cancer, has often been applied. However, when applying a method for detecting a tumor marker, the specificity of the marker for a particular cancer becomes very important. Many tumor markers used in the diagnosis of human cancer are also expressed to some extent in normal tissue cells. Therefore, it is often necessary to use fluctuations in the expression of the tumor marker as an indicator of canceration. There is always the possibility of misdiagnosis. In addition, currently used tumor markers, such as CEA and CA19-9, are produced by cells of many organs such as stomach, large intestine, pancreas and lung. It was difficult to determine which of the above organs had a cancer lesion.
Therefore, in order to more accurately and objectively detect the presence or absence of the onset of cancer, it is desirable to use as a tumor marker a substance produced only by cancerous cells without the presence of non-cancerous cells. Especially for pancreatic cancer, there is no effective screening test, so it is often too late when cancer symptoms appear. For early detection of pancreatic cancer, the use of tumor markers specific to pancreatic cancer is necessary. is necessary.
ＢＳＴ１は、ＢＰ−３又はＣＤ１５７とも称され、慢性関節リウマチ（ＲＡ）由来の骨髄間質細胞株に高発現し、プレＢ細胞増殖支持能に関与するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合膜タンパク質としてクローニングされ（非特許文献１）、慢性関節リウマチの病態と密接な関連性を有すると考えられている。また、ＢＳＴ１は、ＡＤＰリボシルシクラーゼ活性、及びサイクリックＡＤＰリボース加水分解活性を有することも報告されている（Hirataら, 1994）。 BST1, also referred to as BP-3 or CD157, is highly expressed in bone marrow stromal cell lines derived from rheumatoid arthritis (RA) and cloned as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) -binding membrane protein involved in pre-B cell growth supportability (Non-patent Document 1), and is considered to be closely related to the pathology of rheumatoid arthritis. BST1 has also been reported to have ADP ribosyl cyclase activity and cyclic ADP ribose hydrolysis activity (Hirata et al., 1994).
マウスにおけるＢＳＴ１の発現は、Ｂ細胞においては、プロＢ細胞の分化段階に始まり成熟Ｂ細胞で低下し、また、Ｔ細胞においては、胎児期の胸腺細胞及び成体胸腺細胞のＴ前駆体細胞のうちＣＤ４４−ＣＤ２５＋とＣＤ４４−ＣＤ２５−の段階に限って認められた。従って、マウスＢＳＴ１はリンパ球の初期発生段階で生じるＩｇＨ鎖又はＴＣＲｂ鎖の再構成時において重要な役割を担っていることが考えられる（Ishiharaら, 1996）
また、ヒトの末梢血の顆粒球、単球においてもＢＳＴ１の発現が確認されている。これらの細胞中において、ＢＳＴ１が何らかの受容体としての役割を果たしていることも示唆されているが、詳細は明らかにされていない。
BST1 expression has also been confirmed in human peripheral blood granulocytes and monocytes. In these cells, it has also been suggested that BST1 plays a role as a receptor, but details have not been clarified.
そこで、本発明は、上記腫瘍マーカーに関する従来技術の問題点を解決するため、膵臓癌に特異性の高い、新規腫瘍マーカー
抗原を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は、当該腫瘍マーカーを用いた膵臓癌の検出方法を提供することも目的とする。
さらにまた、本発明は、前記検出方法に用いることができるキットを提供することも目的とする。
また、本発明は、上記腫瘍マーカーを標的とした腫瘍治療のための医薬を提供することも目的とする。
In view of the above, an object of the present invention is to provide a novel tumor marker antigen having high specificity for pancreatic cancer in order to solve the problems of the prior art relating to the tumor marker.
Furthermore, another object of the present invention is to provide a method for detecting pancreatic cancer using the tumor marker.
A further object of the present invention is to provide a kit that can be used in the detection method.
Another object of the present invention is to provide a medicament for tumor treatment targeting the tumor marker.
本発明者等は、上記事情に鑑み、膵臓癌に特異的な腫瘍マーカーとなり得る抗原を同定すべく、鋭意研究を行った結果、意外にも、新規のＢＳＴ１の選択的スプライシング変異体（以下、ＢＳＴ１＿ＡＳＶと記載する）タンパク質及び該遺伝子が膵臓癌由来細胞中で特異的に発現することを見出した。 In view of the above circumstances, the present inventors have conducted extensive research to identify an antigen that can be a tumor marker specific to pancreatic cancer. As a result, unexpectedly, a novel splicing variant of BST1 (hereinafter, referred to as “BST1”) was discovered. It was found that the protein (described as BST1_ASV) and the gene are specifically expressed in pancreatic cancer-derived cells.
すなわち、上記課題は以下の（１）〜（１２）によって解決される。
（１）本発明の第１の実施態様に係る発明は、「以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含むＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその塩。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示される配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓癌細胞に特異的に存在するポリペプチド」である。
ここで、「ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、膵臓癌細胞中に存在するポリペプチドのことである。さらに、これらのポリペプチドの部分ペプチド、断片も本発明の「ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド」に含まれる。
（２）本発明の第２の実施態様に係る発明は、「配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。」である。即ち、配列番号１からなる塩基配列によりコードされるポリペプチドのＮ末端又はＣ末端部に、当業者において周知のタグポリペプチド、例えば、Ｆｌａｇ、ｍｙｃ、ＨＡ、ＧＳＴなどを連結するために、配列番号１のポリヌクレオチド以外のポリペプチドを連結するポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。
（３）本発明の第３の実施態様に係る発明は、「前記ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドをコードする遺伝子。」である。
（４）本発明の第４の実施態様に係る発明は、「前記ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドを検出する段階を含むことを特徴とする膵臓癌細胞を検出する方法。」である。
ここで、「膵臓癌」とは、膵臓の癌全般を含む概念である（以下、同様）。また、膵臓癌細胞を検出する方法には、膵臓癌細胞の有無を検出する方法のほか、膵臓癌細胞の悪性度又は組織型などを併せて検出する方法も含む（以下、同様）。
（５）本発明の第５の実施態様に係る発明は、「前記ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドを検出する段階が、ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いたイムノアッセイ法を用いることを特徴とする上記（４）に記載の方法。」である。
ここで、上記「抗体」とは、本発明における「ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド」と特異的に結合し、公知のＢＳＴ１メジャーフォーム（スプライスバリアントではないＢＳＴ１ポリペプチド）および他のＢＳＴ１選択的スプライスバリアントには結合しない抗体を意味する。
また、上記（４）に記載の「前記ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドを検出する」方法には、抗体を用いたイムノアッセイのほか、当業者の通常の知識に基づいて行い得る全ての方法が含まれる。
（６）本発明の第６の実施態様に係る発明は、「膵臓癌の患者由来の血清又は病理組織切片を試料に用いることを特徴とする上記（５）に記載の方法。」である。
上記（４）又は（５）に記載の方法に用いられる試料は、上記（６）に記載の血清又は病理組織切片（膵臓癌組織切片など）の他、当業者における通常の技術常識に基づいて選択し得る試料であれば如何なるものも使用することができる。
（７）本発明の第７の実施態様に係る発明は、「上記（２）に記載のポリヌクレオチド又は上記（３）に記載の遺伝子を検出する段階を含むことを特徴とする膵臓癌細胞を検出する方法。」である。
（８）本発明の第８の実施態様に係る発明は、「前記ポリヌクレオチド又は前記遺伝子の発現の検出が、該ポリヌクレオチド又は該遺伝子の転写物若しくはその断片を特異的に増幅するプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により行われることを特徴とする上記（７）に記載の方法。」である。
上記（７）に記載の「前記ポリヌクレオチド又は前記遺伝子の発現」を検出する方法には、ＰＣＲを用いた方法のほか、当業者の通常の知識に基づいて行い得る全ての方法が含まれる。
（９）本発明の第９の実施態様に係る発明は、「膵臓癌の患者由来のバッフィーコートを試料に用いることを特徴する上記（８）に記載の方法。」である。
上記（７）又は（８）に記載の方法に用いられる試料は、上記（９）に記載のバッフィーコートのほか、病理組織切片（膵臓癌組織切片など）など、当業者における通常の技術常識に基づいて選択し得る試料であれば如何なるものも使用することができる。
（１０）本発明の第１０の実施態様に係る発明は、「上記（４）に記載の方法を実施するためのキットであって、該キットが上記（１）に記載のポリペプチドに対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を含むことを特徴とするキット。」である。
（１１）本発明の第１１の実施態様に係る発明は、「上記（８）に記載の方法を実施するためのキットであって、該キットが配列番号５乃至９の塩基配列を有する核酸から選択される少なくとも１つの核酸を含むことを特徴とするキット。」である。
（１２）本発明の第１２の実施態様に係る発明は、「前記ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドと特異的に結合する抗体に制癌化合物をコンジュゲートした該抗体を含む医薬組成物。」である。
ここで、「制癌化合物」とは、癌化又は腫瘍化した細胞を死滅させることにより、癌病巣を縮小又は消滅させる効果を示す物質であって、当業者に周知のいかなるものをも用いることができる。典型的に、制癌化合物は、タキソール、タキソテール、シスプラチン、アドリアマイシン、エピルビシン、サイクロファスファマイド、カンプトテシン、５−ＦＵ（ウルオロルラシル）、塩酸ゲムシタビン（ジェムザール（商品名））からなる群から選択される。特に、塩酸ゲムシタビンが好ましい。
That is, the said subject is solved by the following (1)-(12).
(1) The invention according to the first embodiment of the present invention is “a BST1_ASV polypeptide or a salt thereof comprising the following polypeptide (a) or (b)”:
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(B) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the sequence represented by SEQ ID NO: 2 and specifically present in pancreatic cancer cells ”.
Here, the “BST1_ASV polypeptide” means that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has one, several amino acids deleted, substituted, inserted or added. A polypeptide consisting of an amino acid sequence and present in pancreatic cancer cells. Furthermore, partial peptides and fragments of these polypeptides are also included in the “BST1_ASV polypeptide” of the present invention.
(2) The invention according to the second embodiment of the present invention is “a polynucleotide comprising a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.” That is, in order to link a tag polypeptide known to those skilled in the art, for example, Flag, myc, HA, GST, etc., to the N-terminal or C-terminal part of the polypeptide encoded by the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1, Polypeptides that link polypeptides other than the polynucleotide of No. 1 are also included in the polypeptides of the present invention.
(3) The invention according to the third embodiment of the present invention is “a gene encoding the BST1_ASV polypeptide”.
(4) The invention according to the fourth embodiment of the present invention is “a method for detecting pancreatic cancer cells, comprising the step of detecting the BST1_ASV polypeptide”.
Here, “pancreatic cancer” is a concept including pancreatic cancer in general (the same applies hereinafter). The method for detecting pancreatic cancer cells includes not only a method for detecting the presence or absence of pancreatic cancer cells but also a method for detecting the malignancy or tissue type of pancreatic cancer cells (hereinafter the same).
(5) The invention according to a fifth embodiment of the present invention is described above, wherein the step of detecting the BST1_ASV polypeptide uses an immunoassay method using an antibody that specifically binds to the BST1_ASV polypeptide. The method described in (4). "
Here, the “antibody” specifically binds to “BST1_ASV polypeptide” in the present invention, and binds to a known BST1 major form (BST1 polypeptide that is not a splice variant) and other BST1 selective splice variants. Means no antibody.
The method for “detecting the BST1_ASV polypeptide” described in (4) above includes all methods that can be performed based on ordinary knowledge of those skilled in the art, in addition to immunoassays using antibodies.
(6) The invention according to the sixth embodiment of the present invention is “the method according to (5) above, wherein serum or a pathological tissue section derived from a patient with pancreatic cancer is used as a sample”.
Samples used in the method described in (4) or (5) above are based on normal technical common knowledge in the art, in addition to the serum or pathological tissue section (such as pancreatic cancer tissue section) described in (6) above. Any sample that can be selected can be used.
(7) The invention according to the seventh embodiment of the present invention provides a pancreatic cancer cell comprising the step of detecting the polynucleotide according to (2) above or the gene according to (3) above. How to detect. "
(8) The invention according to the eighth embodiment of the present invention is such that “detection of the expression of the polynucleotide or the gene uses a probe that specifically amplifies the polynucleotide or a transcript of the gene or a fragment thereof. The method according to (7) above, which is carried out by the RT-PCR method.
The method for detecting “expression of the polynucleotide or the gene” described in the above (7) includes not only a method using PCR but also all methods that can be performed based on ordinary knowledge of those skilled in the art.
(9) The invention according to the ninth embodiment of the present invention is “the method according to (8) above, wherein a buffy coat derived from a patient with pancreatic cancer is used as a sample”.
Samples used in the method described in (7) or (8) above are based on common technical common knowledge in the art, such as pathological tissue sections (such as pancreatic cancer tissue sections) in addition to the buffy coat described in (9) above. Any sample that can be selected on the basis of it can be used.
(10) The invention according to the tenth embodiment of the present invention is "a kit for carrying out the method according to (4) above, wherein the kit is a monoclonal antibody against the polypeptide according to (1) above" And / or a kit comprising a polyclonal antibody.
(11) The invention according to the eleventh embodiment of the present invention is “a kit for carrying out the method according to (8) above, wherein the kit has a nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 5 to 9”. A kit comprising at least one selected nucleic acid. "
(12) The invention according to the twelfth embodiment of the present invention is “a pharmaceutical composition comprising the antibody obtained by conjugating an anticancer compound to an antibody that specifically binds to the BST1_ASV polypeptide”.
Here, the “anticancer compound” is a substance that shows the effect of reducing or eliminating cancer foci by killing cancerous or tumorous cells, and any substance known to those skilled in the art can be used. Can do. Typically, the anticancer compound is selected from the group consisting of taxol, taxotere, cisplatin, adriamycin, epirubicin, cyclofasfamide, camptothecin, 5-FU (Ulorolacill), gemcitabine hydrochloride (Gemzar (trade name)). In particular, gemcitabine hydrochloride is preferable.
本発明により提供される方法を用いることにより、膵臓癌の確実かつ迅速な検出が可能となる。また、本発明の医薬組成物を用いることにより、膵臓癌の有効な治療が実現される。 By using the method provided by the present invention, pancreatic cancer can be reliably and rapidly detected. Moreover, effective treatment of pancreatic cancer is realized by using the pharmaceutical composition of the present invention.
１．腫瘍マーカー候補の探索
（１）ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析による腫瘍マーカー候補の探索
本発明において、腫瘍マーカーとして使用可能なＢＳＴ１＿ＡＳＶは、バイオインフォマティクスの分野における技術及び従来の分子生物学的技術に基づいて、探索及び同定可能である。
まず、血中に存在する腫瘍マーカー候補を探索するために、血中タンパク質の情報について記載されている既刊の論文の検討を行う。本発明を行なうにあたり必要とされる論文は、周知の方法により検索及び収集することが可能であるが、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for
Biotechnology Information）によるＰｕｂＭｅｄ（生物・医学文献データベース）を利用してもよい。
収集した論文から所望のものを参考にして、血中タンパク質のリストを作成してもよい。この場合には、リスト化された血中タンパク質の中から、ある基準、例えば、腫瘍マーカーとしての情報が少ないタンパク質であること、ＡＳＶの有無等の情報が少ないタンパク質であること、該タンパク質が分泌可能であること、などを指標にして幾つかのタンパク質を腫瘍マーカー候補として絞り込むことが可能となる。この方法により絞り込まれたタンパク質リストの中に、本発明に係るＢＳＴ１が含まれていた。
1. Search for tumor marker candidates (1) Search for tumor marker candidates by in silico analysis In the present invention, BST1_ASV that can be used as a tumor marker is a search and search based on techniques in the field of bioinformatics and conventional molecular biological techniques. Can be identified.
First, in order to search for tumor marker candidates present in the blood, a published paper describing information on blood proteins is examined. The articles required for carrying out the present invention can be searched and collected by a well-known method. For example, NCBI (National Center for
PubMed (Biological Information Database) by Biotechnology Information may be used.
A list of proteins in the blood may be created with reference to the desired one from the collected papers. In this case, among the listed blood proteins, there is a certain standard, for example, a protein with little information as a tumor marker, a protein with little information such as the presence or absence of ASV, and the protein is secreted. It is possible to narrow down some proteins as tumor marker candidates by using the possibility as an index. BST1 according to the present invention was included in the protein list narrowed down by this method.
上記方法の別法として、既存の腫瘍マーカーの情報を利用することも可能である。既存の腫瘍マーカーの特徴に基づき、限定はしないが、酵素タンパク質であること、及び糖タンパク質であることを特徴として備える因子の中から、所望の腫瘍マーカーの絞込みを行なうこともできる。例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースに対してＫｅｙｗｏｒｄ検索によりＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎを検索したのち、「_HUMAN」の表記があるタンパク質のみを抽出してリスト化を行なう。さらに、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース内のＥｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｄａｔａｂａｓｅに存在するタンパク質からヒトタンパク質のみを全て抽出しリスト化を行なう。上記２つのリスト中に重複して存在するタンパク質を腫瘍マーカー候補として絞り込むことができる。この方法により絞り込まれたタンパク質リストの中にも、本発明に係るＢＳＴ１が含まれていた。 As another method of the above method, it is also possible to use information of an existing tumor marker. Based on the characteristics of the existing tumor marker, although not limited, a desired tumor marker can be narrowed down from factors that are characterized by being an enzyme protein and a glycoprotein. For example, after searching Glycoprotein by Keyword search in the SWISS-PROT database, only proteins having the notation “_HUMAN” are extracted and listed. Furthermore, all the human proteins are extracted from the proteins existing in the Enzyme Nomenclature database in the SWISS-PROT database and listed. Proteins that overlap in the two lists can be narrowed down as tumor marker candidates. The BST1 according to the present invention was also included in the protein list narrowed down by this method.
（２）腫瘍マーカーとしての特異性等の検討
腫瘍マーカーとして使用可能であるためには、特定の腫瘍（癌）が発症している場合に、ある程度の特異性をもって発現され、その発現が確認される必要がある。該腫瘍マーカーの発現の確認は、当業者における通常の知識に基づいて容易に行なうことができるが、例えば、腫瘍が疑われる組織中にマーカー遺伝子が発現されていることを、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング法などで確認するか、又は、腫瘍マーカーが血液中に分泌されるタンパク質であれば、血液サンプルに対して、腫瘍マーカータンパク質特異的に反応する抗体を用いたイムノアッセイにより、血中への分泌を確認することができる。その他、特定の腫瘍（癌）が発症している場合に、所望の腫瘍マーカーが該腫瘍に特異的に発現していることを確認する方法であれば、いかなる方法であっても使用可能であり、特に、ＲＴ−ＰＣＲ法、イムノアッセイ法などが好ましい。
(2) Examination of specificity as a tumor marker In order to be usable as a tumor marker, when a specific tumor (cancer) has developed, it is expressed with a certain degree of specificity and its expression has been confirmed. It is necessary to Confirmation of the expression of the tumor marker can be easily performed based on ordinary knowledge of those skilled in the art. For example, RT-PCR, Northern Confirmation by blotting, etc., or if the tumor marker is a protein secreted into the blood, secretion into the blood by immunoassay using an antibody that reacts specifically with the tumor marker protein against the blood sample Can be confirmed. In addition, when a specific tumor (cancer) has developed, any method can be used as long as it confirms that a desired tumor marker is specifically expressed in the tumor. In particular, RT-PCR method, immunoassay method and the like are preferable.
２．新規腫瘍マーカーＢＳＴ１＿ＡＳＶの配列情報の取得
本発明におけるＢＳＴ１＿ＡＳＶ遺伝子は、公知のＢＳＴ１の配列情報に基づいて作製されたＰＣＲプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー等からクローニングすることができる。
ＰＣＲプライマーの設計は、OLIGO（Molecular Biology Insights. Inc）等のプライマー設計ソフトを用いて行うことができる。また、ＰＣＲプライマー合成は、標準的な合成技術、例えば、自動ＤＮＡ合成装置などを用いて行うことができるが、商業的に入手してもよい。ＰＣＲ反応によって増幅が予想される増幅産物の長さは、増幅効率及びその後のアガロースゲルによる分離能及び塩基配列解析が容易であるような長さが好ましい。作成したＰＣＲプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー等を鋳型にしてＰＣＲ反応を行い、増幅産物が目的の産物であることを、配列決定を行うなどして確認する。
2. Acquisition of Sequence Information of Novel Tumor Marker BST1_ASV The BST1_ASV gene in the present invention can be cloned from a cDNA library, a genomic DNA library or the like using PCR primers prepared based on the known sequence information of BST1.
PCR primer design can be performed using primer design software such as OLIGO (Molecular Biology Insights. Inc). PCR primer synthesis can be performed using standard synthesis techniques such as an automatic DNA synthesizer, but may be obtained commercially. The length of the amplification product expected to be amplified by the PCR reaction is preferably such that the amplification efficiency, the subsequent separation ability by agarose gel and the base sequence analysis are easy. Using the created PCR primer, a PCR reaction is performed using a cDNA library or the like as a template, and it is confirmed by sequencing or the like that the amplified product is the target product.
２．本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓癌細胞中に存在するポリペプチドのことである。
2. BST1_ASV polypeptide of the present invention The BST1_ASV polypeptide of the present invention is a polypeptide comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Here, the “polypeptide containing substantially the same amino acid sequence” means that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has one or several amino acids deleted, A polypeptide consisting of a substituted, inserted or added amino acid sequence and present in pancreatic cancer cells.
配列番号２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号２で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ならびに配列番号２で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドが含まれる。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって、改変することによって行うことができる。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（TAKARA社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（TAKARA社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法によって、塩基の置換を行うことによって達成することができる。 The polypeptide containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, more preferably 1 to 2 or more (preferably about 1 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids), the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Is an amino acid sequence to which about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids are added, and 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide containing an amino acid sequence in which about 1 to 10 amino acids (more preferably 1 to 5) are substituted with other amino acids is included. The amino acid deletion, addition and substitution can be performed by modifying a gene encoding BST1_ASV polypeptide by a technique known in the art. For example, the substitution of a specific amino acid residue is performed by using a commercially available kit (for example, Mutan ™ -G (TAKARA), Mutan ™ -K (TAKARA)) or the like, and a known method such as the Gappedduplex method or the Kunkel method. Alternatively, it can be achieved by performing base substitution by a method according to them.
また、本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド及びその部分ペプチドのＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドがＣ末端以外にもそのポリペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも、本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドのＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のポリペプチドに含まれる。 In addition, the C-terminal of the BST1_ASV polypeptide of the present invention and its partial peptide is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO − ), and the carboxyl group is an amide (—CONH 2 ) or ester ( -COOR) or the like. Here, as R in the ester, a C 1-6 alkyl group (for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl), a C 3-8 cycloalkyl group (for example, cyclopentyl, cyclohexyl), C 1-6 aryl group (for example, phenyl, α-naphthyl), phenyl-C 1-2 alkyl group (for example, benzyl, phenethyl), α-naphthyl-C 1-2 alkyl group (for example, α-naphthylmethyl) and the like Is mentioned. In addition, pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, can be used. When the BST1_ASV polypeptide of the present invention has a carboxyl group in the polypeptide chain in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the polypeptide of the present invention. Examples of the ester in this case include the above-mentioned esters. Similarly, the N-terminus of the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention is usually an amino group (—NH 2 ), but this amino group is chemically modified with a C 1-6 acyl group such as a formyl group or an acetyl group. It may be. In addition, a glutamyl group generated by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyroglutamine oxidized, or a substituent on an amino acid side chain in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group, Polypeptides of the present invention include those in which a guanidino group or the like) is chemically modified with an appropriate functional group (for example, formyl group, acetyl, etc.) or has a sugar chain attached thereto.
上記いずれかのＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の部分ペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一なアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を含むものである限り、いずれのものであってもよい。 Peptides (also referred to as partial peptides) containing partial amino acid sequences in any of the above BST1_ASV polypeptides are also included in the scope of the present invention. That is, the partial peptide of the present invention may be any peptide as long as it contains a partial amino acid sequence of the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのような塩としては、無機酸、限定はしないが、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの塩、有機酸、限定はしないが、例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの塩等が挙げられる。また、無機塩基、限定はしないが、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属などとの塩、有機塩基、限定はしないが、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどとの塩が挙げられる。
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその塩は、本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドを発現しているヒトや動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなど）の培養細胞又は組織から、当該分野における通常の技術により抽出・分離することができ、あるいは後述のように本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養することにより、該培養物から抽出・分離することによっても製造することができる。ヒトや動物の組織又は細胞から製造する場合、ヒトや動物の組織又は細胞をホモジナイズ後、酸等で抽出を行い、得られた抽出液を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。
The BST1_ASV polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof can be provided in the form of a salt, preferably in the form of a physiologically acceptable acid addition salt, if necessary. Such salts include, but are not limited to, inorganic acids, such as salts such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, organic acids, but not limited to, for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid. Examples thereof include salts such as acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid. In addition, inorganic bases, but not limited to, for example, salts with alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as calcium and magnesium, organic bases, but not limited to, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, Examples include salts with picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine and the like.
The BST1_ASV polypeptide of the present invention or a salt thereof is a human or animal (for example, mouse, rat, guinea pig, chicken, rabbit, pig, cow, monkey, sheep, dog, cat) expressing the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention. Or the like) by culturing a transformant containing a DNA encoding the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention as described later, or by culturing a transformant containing the DNA encoding the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention as described later. It can also be produced by extraction and separation from the culture. When producing from human or animal tissues or cells, homogenize human or animal tissues or cells, extract with acid, etc., and use the resulting extract for hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. It can be isolated and purified by combining various types of chromatography.
また、本発明の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチド合成法又は前記ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドを適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる（例えば、Bodanszkyら, 1996；Schroederら, 1965を参照のこと）。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
上記の方法で得られる新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができる、塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
The partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced by a known peptide synthesis method or by cleaving the BST1_ASV polypeptide with an appropriate peptidase (eg, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase). As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention and the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group. (See, eg, Bodanszky et al., 1996; Schroeder et al., 1965). After the synthesis reaction, the partial peptide of the present invention can be isolated and purified by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, high performance liquid chromatography, recrystallization and the like.
When the novel BST1_ASV polypeptide or its partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. When obtained by a salt, the free form is obtained by a known method. Can be converted to
３．本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記２のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードする塩基配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその相補鎖を含有するものであれば如何なるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられ、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドでもよい。
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前述のｃＤＮＡライブラリーから調製したもの、あるいは合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、所望の細胞又は組織から調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ画分を用いて直接、ＲＴ−ＰＣＲ法（Reverse Transcriptase Polymerase
Chain Reaction）によって増幅することもできる。具体的には、本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドと実質的に同質の活性を有するＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれのものであってもよい。
3. A polynucleotide encoding the BST1_ASV polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof The polynucleotide encoding the BST1_ASV polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof is the nucleotide sequence (DNA or DNA encoding the BST1_ASV polypeptide of the above 2 or a partial peptide thereof. (RNA) or any complementary strand thereof may be used. Examples of the polynucleotide include DNA encoding the BST1_ASV polypeptide of the present invention, RNA such as mRNA, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double strand DNA, a double strand RNA, or a hybrid of DNA and RNA.
The DNA encoding the BST1_ASV polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof may be any of genomic DNA, genomic DNA library, those prepared from the aforementioned cDNA library, or synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, the RT-PCR method (Reverse Transcriptase Polymerase) can be directly used using the total RNA or mRNA fraction prepared from a desired cell or tissue.
It can also be amplified by chain reaction. Specifically, the polynucleotide encoding the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention includes a polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and any of these polynucleotides and stringent conditions Any polynucleotide may be used as long as it is a polynucleotide encoding a BST1_ASV polypeptide that hybridizes underneath and has substantially the same activity as the BST1_ASV polypeptide of the present invention.
配列番号１で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。ここで、ここで、「ストリンジェントな条件」とは、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する技術分野において周知の技術常識により決定され（例えば、Sambrook等, 1989などを参照のこと）、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な条件である。例えば、ナトリウム濃度が約２０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０〜２５ｍＭ、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件などである。典型的には、「ストリンジェントな条件」とは、（１）低いイオン強度及び高い温度での洗浄を行なう条件（例えば、５０℃において、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム）；（２）ハイブリッド形成中に変性剤を用いる条件（例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ ウシ血清アルブミン、０．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン、５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５；７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウムを含む）などが選択可能である。さらに、典型的には、洗浄条件に関しても、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ***ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、及び１０％ デキストラン硫酸が含まれ、４２℃における０．２ｘ ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃でのホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘ ＳＳＣからなるストリンジェントな洗浄条件が選択され得る。
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上述の本発明の部分ペプチドをコードする核酸配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前述の細胞又は組織由来のｃＤＮＡ、前述の細胞又は組織由来のｃＤＮＡライブラリーより、当該技術分野において公知の方法により単離されたもの、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
The DNA capable of hybridizing under stringent conditions with the polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferably about 70% or more, more preferably about 80%, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, and most preferably, DNA containing a nucleotide sequence having a polynucleotide sequence homology of about 99%. Here, the “stringent conditions” are determined by common technical knowledge well-known in the technical field related to nucleic acid hybridization and cloning (see, for example, Sambrook et al., 1989), and are generally probe lengths. Empirical conditions, depending on the washing temperature and salt concentration. For example, the sodium concentration is about 20 to 40 mM, preferably about 20 to 25 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. Typically, “stringent conditions” refer to (1) conditions for washing at low ionic strength and high temperature (eg, 15 mM NaCl, 1.5 mM sodium citrate, 0.1% at 50 ° C. (2) Conditions using a denaturant during hybridization (eg, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Ficoll, 0.1 % Polyvinylpyrrolidone, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5; containing 750 mM NaCl, 75 mM sodium citrate), etc. In addition, typically with regard to washing conditions, 5 × SSC (0.75 M NaCl, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% Contains sodium lophosphate, 5x denhardt solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate, 0.2x SSC at 42 ° C (sodium chloride / sodium citrate) Stringent wash conditions consisting of 0.1x SSC with medium wash and formamide at 55 ° C followed by EDTA at 55 ° C can be selected.
The polynucleotide encoding the partial peptide of the present invention may be any as long as it contains the nucleic acid sequence encoding the partial peptide of the present invention described above. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the aforementioned cells or tissues, cDNA isolated from the aforementioned cells or tissues, or a synthetic DNA isolated by a method known in the art. Good.
４．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明を行なうにあたり使用される組換えベクターは、適当なベクターに本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分をコードするＤＮＡを連結することにより得ることができる。本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分をコードするＤＮＡ配列を挿入するためのベクターは、クローニング用に供される場合には、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。また、本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分を発現するためのベクターとしては、宿主中で複製可能なものであって、該ポリペプチド又はその部分をコードするＤＮＡ断片を発現させることができるプロモーターを有するものが使用可能である。
使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
4). Production of Recombinant Vector and Transformant (1) Production of Recombinant Vector The recombinant vector used in carrying out the present invention is linked to a DNA encoding the BST1_ASV polypeptide of the present invention or a portion thereof to an appropriate vector. Can be obtained. The vector for inserting the DNA sequence encoding the BST1_ASV polypeptide of the present invention or a portion thereof is not particularly limited as long as it can be replicated in a host when used for cloning. Further, the vector for expressing the BST1_ASV polypeptide of the present invention or a part thereof is a promoter capable of replicating in a host and capable of expressing a DNA fragment encoding the polypeptide or part thereof. What you have can be used.
Examples of vectors that can be used include plasmid DNA and phage DNA. Plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pCBD-C, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, YCp50, YIp30, etc.) and the like, and examples of the phage DNA include λ phage. Furthermore, animal viruses such as retroviruses and vaccinia viruses, and insect virus vectors such as baculoviruses and togaviruses can also be used.
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
The promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it is an appropriate promoter corresponding to the host used for gene expression.
For example, when animal cells are used as the host, SRα promoter, CMV promoter, SV40 promoter, LTR promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
When the host is an E. coli, trp promoter, lac promoter, recA promoter, .lambda.P L promoter, lpp promoter and the like, when the host is Bacillus subtilis, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter.
When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like can be mentioned. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
本発明に使用される組換えベクターには新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分のコード配列、プロモーター以外にも、エンハンサー、選択マーカー、ターミネーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ， Ｇ４１８）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分のＮ末端側に適当なシグナル配列を付加してもよい。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、ＯｍｐＡシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα−アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが利用可能である。
The recombinant vector used in the present invention includes a novel BST1_ASV polypeptide or a coding sequence thereof, a promoter, an enhancer, a selection marker, a terminator, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), An SV40 replication origin (SV40ori) or the like can be linked.
The selection markers include, but are not limited to, hygromycin resistance marker (Hyg r), dihydrofolate reductase gene (dhfr), the ampicillin resistance gene (Amp r), the kanamycin resistance gene (Kan r), neomycin resistant gene (Neo r , G418) can be used.
For the purpose of facilitating isolation and purification of the recombinant protein, an appropriate signal sequence may be added to the N-terminal side of the BST1_ASV polypeptide of the present invention or a portion thereof.
When the host is Escherichia coli, alkaline phosphatase signal, OmpA signal, etc. can be used. When the host is Bacillus subtilis, α-amylase signal sequence, subtilis signal sequence, etc. can be used. In some cases, α-factor signal sequence, invertase signal sequence, etc. can be used. When the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used. It is.
上述のベクターに対して本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶ遺伝子又はその断片を挿入するには、上記１においてクローニングされた新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡ又はその断片をそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分が宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
以上の方法により、本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを構築することができる。
In order to insert the novel BST1_ASV gene of the present invention or a fragment thereof into the vector described above, the DNA encoding the novel BST1_ASV polypeptide cloned in the above 1 or a fragment thereof is digested as it is or with a restriction enzyme if desired. , By adding a linker and inserting it into a restriction enzyme site or multicloning site of the vector DNA. The DNA to be ligated may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter. The DNA to be ligated needs to be incorporated into a vector so that the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention encoded in the DNA or a part thereof is expressed in the host cell.
By the above method, a vector containing a DNA sequence encoding the BST1_ASV polypeptide of the present invention can be constructed.
（２） 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換え発現ベクターを、目的遺伝子又はその断片を発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、ヒトＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
(2) Production of transformant The transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant expression vector of the present invention into a host so that the target gene or a fragment thereof can be expressed. Here, the host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention. For example, E. coli (Escherichia coli) belonging to the genus Escherichia, such as, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) the genus Bacillus such as, Pseudomonas, such as Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Rhizobium meliloti (Rhizobium meliloti) bacteria belonging to the genus Rhizobium such as, Saccharomyces cerevisiae ( Saccharomyces cerevisiae ), Schizosaccharomyces pombe ( Schizosaccharomyces pombe ), Pichia pastoris (Pichia pastoris), monkey cells COS-7, V cells Mouse AtT-20, human GH3, human FL cells, etc. Examples include animal cells or insect cells such as Sf9 and Sf21.
大腸菌への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法（Cohenら, 1972）、エレクトロポレーション法（Shigekawa及びDower, 1988）等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法（Beckerら, 1990）、スフェロプラスト法（Hinnenら, 1978）、酢酸リチウム法（Itohら,
1983）等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Chen及びOkayama,
1988）、カチオン性脂質による方法（Elroy-Stein及びMoss, 1990）等が挙げられる。
以上のようにして、本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドをコードＤＮＡが挿入された発現ベクターを含む形質転換体を得ることができる。
As a method for introducing a recombinant vector into Escherichia coli, a method using calcium ions (Cohen et al., 1972), an electroporation method (Shigekawa and Dower, 1988) and the like can be used. Methods for introducing recombinant vectors into yeast include electroporation (Becker et al., 1990), spheroplast method (Hinnen et al., 1978), lithium acetate method (Itoh et al.,
1983) can be used. As a method for introducing a recombinant vector into animal cells or animal cells, electroporation method, calcium phosphate method (Chen and Okayama,
1988), a method using a cationic lipid (Elroy-Stein and Moss, 1990) and the like.
As described above, a transformant containing an expression vector in which a DNA encoding the BST1_ASV polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof is inserted can be obtained.
５．本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドの製造
本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドは、上記４において得られる形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
5). Production of novel BST1_ASV polypeptide or partial peptide thereof of the present invention The novel BST1_ASV polypeptide or partial peptide of the present invention can be produced by culturing the transformant obtained in 4 above and collecting it from the culture. it can. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells or cultured cells, or disrupted cells or cells. The method for culturing the transformant of the present invention is carried out according to a usual method used for culturing a host.
As a medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used. As the nitrogen source, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor and the like are used. As the inorganic salts, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like are used.
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。
例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
酵母培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞膜等に本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドを生成させることができる。上記培養物から本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
Culturing is performed under conditions suitable for the host cell.
For example, as the medium for culturing Escherichia coli, LB medium, M9 medium and the like are preferable. Agents such as isopropyl-1-thio-β-D-galactoside, 3β-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently if desired. In the case of Escherichia coli, the culture is usually performed at about 15 to 37 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added. When the host is Bacillus subtilis, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
Examples of the medium for culturing yeast include SD medium and YPD medium. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary. When cultivating a transformant whose host is an insect cell or an insect, examples of the medium include a grace insect medium containing bovine serum. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an animal cell, for example, a MEM medium, DMEM medium, RPMI 1640 medium or the like containing about 5 to 20% fetal bovine serum is used as the medium. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary. As described above, the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof can be produced on the cell membrane or the like of the transformant. Separation and purification of the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof from the culture can be performed, for example, by the following method.
本発明の新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる新規ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド又はその部分ペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 When the novel BST1_ASV polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, A method of obtaining a crude extract of a novel BST1_ASV polypeptide by centrifuging or filtering after lysozyme and / or freeze-thawing and the like is appropriately used. The buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100. When the novel BST1_ASV polypeptide or a partial peptide thereof is secreted into the culture solution, the cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se after the completion of the culture, and the supernatant is collected. Purification of the novel BST1_ASV polypeptide or its partial peptide contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods. As these known separation and purification methods, methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation methods, dialysis methods, ultrafiltration methods, gel filtration methods, and mainly using differences in molecular weight such as SDS-PAGE. Method, method using differential charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, method using hydrophobic difference such as reversed phase high performance liquid chromatography, isoelectric point A method using the difference in isoelectric point such as electrophoresis is used.
６．抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶ抗体
本発明に係るＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドを検出する方法には、抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶ抗体を使用することができる。
本発明において使用される「抗体」には、ＢＳＴ１＿ＡＳＶに対するモノエピトープ特異的抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶ抗体、ポリエピトープ特異的抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶ抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化又はヒト抗体などが含まれる。特に、ヒト化又はヒト抗体は、制癌化合物をコンジュゲートして、標的癌病巣に該制癌化合物を送達する場合に、好ましい。
（１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原にはＢＳＴ１＿ＡＳＶ及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片が含まれる。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレオート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫応答を増強するために、免疫原は、キーホールインペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターなどの免疫原性を有するタンパク質に結合させたのち、インジェクトしてもよい。
免疫後、免疫動物から試験的に採取した抗血清を用いて力価をモニターしながら、所望の力価を示した段階で抗血清の採取を開始する。採取した抗血清から、定法に従って、目的の抗体を精製することができる。
あるいは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリを用いて調製してもよい（Schadeら,
1996）。
抗体産生方法の詳細は、例えば、Ausubelら, 1987又はHarlow及びLane, 1988を参照されたし。
6). Anti-BST1_ASV Antibody An anti-BST1_ASV antibody can be used in the method for detecting a BST1_ASV polypeptide according to the present invention.
“Antibodies” used in the present invention include monoepitope specific anti-BST1_ASV antibodies against BST1_ASV, polyepitope specific anti-BST1_ASV antibodies, single chain antibodies, and fragments thereof. These antibodies include, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, humanized or human antibodies. In particular, humanized or human antibodies are preferred when the anticancer compound is conjugated to deliver the anticancer compound to the target cancer lesion.
(1) Polyclonal antibody A polyclonal antibody can be prepared, for example, by injecting a mixture of an immunogen and an adjuvant into a mammalian host animal. Usually, the immunogen and / or adjuvant is injected multiple times subcutaneously or intraperitoneally into the host animal. Immunogens include fusions with BST1_ASV and its heterologous polypeptide or fragments thereof. Examples of adjuvants include complete Freud and monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicorynocolle auto (MPL-TDM). In order to enhance the immune response, the immunogen can be injected after binding to immunogenic proteins such as keyhole impet hemocyanin (KLH), serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. Good.
After immunization, antiserum collection is started at the stage where the desired titer is exhibited while monitoring the titer using antiserum collected experimentally from the immunized animal. The target antibody can be purified from the collected antiserum according to a conventional method.
Alternatively, it may be prepared using chickens that produce IgY molecules (Schade et al.,
1996).
For details of antibody production methods, see, for example, Ausubel et al., 1987 or Harlow and Lane, 1988.
（２）モノクローナル抗体
抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製される（Milstein及びCuello, 1983）。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物又は、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体（抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶ）を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。或いは、免疫動物から取得したリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。免疫原は典型的にはＢＳＴ１＿ＡＳＶ及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片を含まれる。
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合される（Goding, 1996）。トランスフォーメーションによって不死化された齧歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。
(2) Monoclonal antibodies Anti-BST1_ASV monoclonal antibodies are prepared using the hybridoma method (Milstein and Cuello, 1983).
This method includes the following four steps: (i) immunizing a host animal or lymphocytes from the host animal, (ii) monoclonal antibody-secreting (or potentially secreting) lymphocytes Collect (iii) fuse lymphocytes to immortalized cells; (iv) select cells that secrete the desired monoclonal antibody (anti-BST1_ASV).
A mouse, rat, guinea pig, hamster, or other suitable host animal is selected as the immunized animal and the immunogen is injected. Alternatively, lymphocytes obtained from immunized animals may be immunized in vitro. If human cells are desired, peripheral blood lymphocytes (PBLs) are generally used. However, spleen cells or lymphocytes from other mammals are more common and preferred. The immunogen typically includes a fusion of BST1_ASV and its heterologous polypeptide or fragments thereof.
After immunization, lymphocytes obtained from the host animal are fused with an immortal cell line using a fusing agent such as polyethylene glycol to establish hybridoma cells (Goding, 1996). Rodent, bovine, or human myeloma cells immortalized by transformation are used, or rat or mouse myeloma cell lines are used. After cell fusion, the cells are grown in a suitable medium containing one or more substrates that inhibit the growth or survival of unfused lymphocytes and immortalized cell lines. Conventional techniques use parent cells that lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT). In this case, hypoxanthine, aminopterin and thymidine are added to a medium (HAT medium) that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
モノクローナル抗体の調製にあたり、好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas, VA）より入手可能である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株による、ヒトモノクローナル抗体産生に関しては、Kozborら, 1984；Schook, 1987を参照のこと。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、ＢＳＴ１＿ＡＳＶに対するモノクローナル抗体の産生の有無を培養液を用いて確認することができる。産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫沈降又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合アッセイにより評価することができる（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）。
抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶモノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ細胞は、限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離され得る（Goding, 1996）。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、場合によっては、タンパク質を含まない培地若しくは無血清培地などが含まれる（例えば、Ｕｌｔｒａ ＤＯＭＡ ＰＦ 又はＨＬ−１；Biowhittaker, Walkersville, MD）。あるいは、イブリドーマ細胞は、適切な宿主動物の腹水中で増殖させてもよい。
For the preparation of monoclonal antibodies, the preferred immortal cell line is the mouse myeloma line available from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). For production of human monoclonal antibodies by human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines, see Kozbor et al., 1984; Schook, 1987.
Since hybridoma cells secrete antibodies outside the cells, the presence or absence of production of monoclonal antibodies against BST1_ASV can be confirmed using a culture solution. The binding specificity of the monoclonal antibody produced can be assessed by immunoprecipitation or in vitro binding assays such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Harlow and Lane, 1988; Harlow and Lane, 1999).
Anti-BST1_ASV monoclonal antibody-secreting hybridoma cells can be isolated as single clones by limiting dilution and subculture (Goding, 1996). Suitable media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium, RPMI-1640, and optionally protein-free medium or serum-free medium (eg, Ultra DOMA PF or HL-1; Biowhittaker, Walkersville, MD). Alternatively, the hybridoma cells may be grown in the ascites of a suitable host animal.
モノクローナル抗体は、培地又は腹水からプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）などの当業者にとって周知の方法によって単離及び精製される。
また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術によっても作製することができる（米国特許第4166452号）。抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶ抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株から目的のモノクローム抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を同定するに、例えば、マウスの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。その結果、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が取得された場合は、その遺伝子の配列を決定することにより目的の抗体遺伝子を同定することができる。単離されたＤＮＡ断片は、モノクローナル抗体を発現させるために、適当な発現ベクターの抗体遺伝子を導入し、該ベクターを他のＩｇタンパク質を生産しないｓｉｍｉａｎ ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などのホスト細胞中へトランスフェクトさする。単離されたＤＮＡ断片は、例えば、ヒト重及び軽鎖定常ドメインに対するコード化配列を相同なマウス配列の代わりに置換することにより（米国特許第4816567号；Morrisonら, 1987）、又は非Ｉｇポリペプチドをコードする配列の全て又は一部に対するＩｇコード化配列を融合することにより、修飾することができる。そのような非Ｉｇポリペプチドは、キメラ二価抗体を創作するために、抗体の定常ドメインと置換することが可能であり、又は一抗原結合部位の定常ドメインと置換することができる。
Monoclonal antibodies are well known to those skilled in the art, such as protein A sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, ammonium sulfate precipitation or affinity chromatography (Harlow and Lane, 1988; Harlow and Lane, 1999) from medium or ascites. Isolated and purified by
Monoclonal antibodies can also be produced by gene recombination techniques (US Pat. No. 4,166,552). In order to identify a gene encoding a desired monoclonal antibody polypeptide from a hybridoma cell line that secretes anti-BST1_ASV antibody, for example, an oligonucleotide probe that specifically binds to a mouse heavy chain and light chain antibody gene may be used. . As a result, when antibody heavy chain and light chain genes are obtained, the target antibody gene can be identified by determining the sequence of the genes. In order to express a monoclonal antibody, the isolated DNA fragment is introduced with an antibody gene of an appropriate expression vector, and the vector does not produce any other Ig protein, such as simin COS-7 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells. Or transfected into a host cell, such as a myeloma cell. Isolated DNA fragments can be obtained, for example, by replacing coding sequences for human heavy and light chain constant domains in place of homologous mouse sequences (US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., 1987) or non-Ig poly Modifications can be made by fusing Ig coding sequences to all or part of the peptide coding sequence. Such non-Ig polypeptides can replace the constant domain of the antibody or create a constant domain of one antigen binding site to create a chimeric bivalent antibody.
（３）ヒト化及びヒト抗体
抗ＢＳＴ１＿ＡＳＶ抗体には、ヒト化又はヒト抗体が含まれる。非ヒト抗体のヒト化型は、非ヒトＩｇ由来の最小配列を含むキメラＩｇｓ、Ｉｇ鎖又は断片（Ｆｖ，Ｆａｂ’，Ｆ(ａｂ’)２又は他の抗体の抗原結合領域など）である。
一般に、ヒト化抗体は、非ヒト由来のＩｇから導入された一又は複数のアミノ酸残基を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、可変ドメインから選ばれる。ヒト化抗体は、例えばマウスのＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列と対応するヒト抗体配列とを置換することにより作製することができる（Jonesら, 1986；Riechmannら, 1988；Verhoeyenら, 1988）。つまり、ヒト化抗体とは、典型的には、特定のＣＤＲ残基がマウス由来の抗体中の相当部位由来の残基と置換されているヒト抗体のことである。ヒト化抗体には、マウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲであって、抗原に対する所望の特異的親和性を持つ残基により、レシピエント（ヒトＩｇ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が置換されるヒトＩｇｓ（レシピエント抗体）が含まれる。また、非ヒト由来の残基によって、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基が置換される場合もある（Jonesら, 1986；Presta, 1992；Riechmannら, 1988）。
(3) Humanized and human antibodies Anti-BST1_ASV antibodies include humanized or human antibodies. Humanized forms of non-human antibodies are chimeric Igs, Ig chains or fragments (such as Fv, Fab ′, F (ab ′) 2 or antigen binding regions of other antibodies) that contain minimal sequences derived from non-human Ig.
In general, humanized antibodies have one or more amino acid residues introduced from non-human-derived Ig. These non-human amino acid residues are often selected from variable domains. Humanized antibodies can be produced, for example, by replacing the mouse CDRs or CDR sequences with the corresponding human antibody sequences (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988). That is, a humanized antibody is typically a human antibody in which a specific CDR residue is substituted with a residue from a corresponding site in a mouse-derived antibody. Humanized antibodies include CDRs of non-human species, such as mice, rats or rabbits, that have the complementarity determining region (CDR) of the recipient (human Ig) depending on the residues with the desired specific affinity for the antigen. Human Igs (recipient antibodies) in which the residues from are substituted are included. In addition, nonhuman-derived residues may replace Fv framework residues of human Ig (Jones et al., 1986; Presta, 1992; Riechmann et al., 1988).
７．腫瘍マーカーの検出
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶ遺伝子又はポリペプチドなどを腫瘍マーカーとして検出する方法としは、当業者の通常の技術常識に基づいて実施し得る方法であれば、如何なる方法でもよいが、例えば、ＢＳＴ１＿ＡＳＶ遺伝子の転写産物を検出するＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、又はＢＳＴ１＿ＡＳＶ遺伝子産物を検出するイムノアッセイ法などが使用可能である。
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法
ＲＴ−ＰＣＲ法は、当業者において周知の技術を用いて容易に行なうことができる。
具体的には、検査対象試料中のＢＳＴ１＿ＡＳＶ遺伝子の転写産物であるＢＳＴ１＿ＡＳＶ ｍＲＮＡ又はその断片に対して相補的な一本鎖ＤＮＡを合成し、該ＤＮＡ又はその断片を特異的に増幅することができるプライマーにより該ＤＮＡ又はその断片をＰＣＲ増幅した後、増幅産物を電気泳動などで検出する。ＲＴ−ＰＣＲ法については、例えば、Ishikawaら, J.
Clin. Oncol., 28:723-728, 1998などを参照して行なうこともできる。本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶを検出するために使用可能なプライマーセットとしては、配列番号５乃至配列番号９に記載されるヌクレオチド配列からなるプライマーを適切に組合わせを挙げることができる。これらのプライマーは、例えば、ホスホアミダイド法などにより容易に合成することができる。
7). Detection of Tumor Marker Any method can be used as a method for detecting the BST1_ASV gene or polypeptide of the present invention as a tumor marker as long as it can be performed based on the common general technical knowledge of those skilled in the art. For example, BST1_ASV An RT-PCR method, a FISH method, or an immunoassay method for detecting a BST1_ASV gene product, which detects a gene transcription product, can be used.
(1) RT-PCR method and FISH method The RT-PCR method can be easily performed using techniques well known to those skilled in the art.
Specifically, single-stranded DNA complementary to BST1_ASV mRNA or a fragment thereof, which is a transcription product of BST1_ASV gene in the sample to be examined, can be synthesized, and the DNA or the fragment thereof can be specifically amplified. After PCR amplification of the DNA or a fragment thereof with a primer, the amplified product is detected by electrophoresis or the like. For the RT-PCR method, see, for example, Ishikawa et al., J.
Clin. Oncol., 28: 723-728, 1998. Examples of the primer set that can be used for detecting BST1_ASV of the present invention include appropriate combinations of primers comprising nucleotide sequences described in SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 9. These primers can be easily synthesized by, for example, the phosphoramidide method.
ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により、本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶの転写状態を検出してもよい。ＦＩＳＨ法に用いることのできるプローブは、ＢＳＴ１＿ＡＳＶを特異的に認識する核酸プローブであれば使用可能である。例えば、配列番号７又は８に示す配列からなる核酸およびその相補鎖が使用可能である。 You may detect the transcription | transfer state of BST1_ASV of this invention by FISH (Fluorescent in situ hybridization) method. The probe that can be used in the FISH method can be any nucleic acid probe that specifically recognizes BST1_ASV. For example, a nucleic acid consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 and its complementary strand can be used.
ＲＴ−ＰＣＲ法またはＦＩＳＨ法によりＢＳＴ１＿ＡＳＶ遺伝子の転写産物を検出する方法に供される試料としては、バッフィーコートが好適に使用可能である。バフィーコートは、検査対象の患者由来の血液を遠心分離した場合、遠心チューブの最下層の赤血球層と最上層の血清層との間に位置する層のことで、主として白血球を含むが、この層には血液中に存在する腫瘍細胞も含まれる。従って、ＲＴ−ＰＣＲまたはＦＩＳＨ法による検査において、好適に使用することができる。 A buffy coat can be preferably used as a sample to be subjected to a method for detecting a transcription product of the BST1_ASV gene by RT-PCR or FISH. The buffy coat is a layer located between the lowermost red blood cell layer and the uppermost serum layer of the centrifuge tube when blood from the patient to be examined is centrifuged, and mainly contains white blood cells. Includes tumor cells present in the blood. Therefore, it can be suitably used in the inspection by RT-PCR or FISH method.
（３）イムノアッセイ法
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶ遺伝子の発現は、ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドの存在を上述のＢＳＴ１＿ＡＳＶに特異的な抗体または抗血清で検出することによっても確認することが可能であり、この検出にはイムノアッセイを用いることができる。具体的には、検査対象試料、例えば、膵臓癌患者由来の血清を試料としたサンドイッチアッセイ、競合アッセイ、あるいは、病理切片を試料とした免疫組織染色などが利用可能である。イムノアッセイ法で使用される抗体は免疫組織染色、サンドイッチアッセイのために標識されてもよい。標識物質としては、放射性物質、金コロイドなどの着色粒子、蛍光式、化学発光物質、または酵素などを用いることができる。抗体の標識方法としては、当業者によって周知の技術であれば、いかなる方法を採用することも可能である。
(3) Immunoassay method The expression of the BST1_ASV gene of the present invention can also be confirmed by detecting the presence of the BST1_ASV polypeptide with the aforementioned BST1_ASV-specific antibody or antiserum. Can be used. Specifically, a sandwich assay, a competitive assay using a sample to be examined, for example, serum derived from a patient with pancreatic cancer, a competitive assay, or immunohistological staining using a pathological section as a sample can be used. The antibody used in the immunoassay method may be labeled for immunohistochemical staining or sandwich assay. As the labeling substance, radioactive substances, colored particles such as gold colloid, fluorescent type, chemiluminescent substance, or enzyme can be used. As a method for labeling an antibody, any method can be adopted as long as it is a technique well known by those skilled in the art.
サンドイッチアッセイなどにおいては、本アッセイに使用する抗体又は抗血清を個体支持体に固相化することが望ましく、例えば、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に抗体などを溶解したのち、この溶解溶液をマイクロタイタープレートのウェル中に添加し、所定の時間インキュベートすることで、固相化することができる。イムノアッセイによる測定は、抗体又は抗血清とＢＳＴ１＿ＡＳＶとの免疫複合体を検出することで行なわれる。病理組織切片などの免疫染色においては、ＢＳＴ１＿ＡＳＶ特異的な抗体をパラフィン包埋切片と接触させ、得られた免疫複合体を、ＣＳＡシステム（Wako社）により、該製品に添付される指示書に従って検出することができる。患者の結成を検査対象試料として用いた場合には、ＢＳＴ１＿ＡＳＶ特異的な抗体がウェルに固相化され、キャプチャー側抗体を提供し、他方の抗体が放射性物質、着色粒子又は酵素で標識されて、検出抗体として使用される。 In a sandwich assay or the like, it is desirable to immobilize the antibody or antiserum used in this assay on an individual support. For example, after dissolving an antibody or the like in a carbonate buffer (pH 9.6), It can be immobilized by adding it to the well of a microtiter plate and incubating for a predetermined time. The measurement by immunoassay is performed by detecting an immune complex of an antibody or antiserum and BST1_ASV. In immunostaining of a pathological tissue section or the like, a BST1_ASV-specific antibody is brought into contact with a paraffin-embedded section, and the resulting immune complex is detected by a CSA system (Wako) according to the instructions attached to the product. can do. When patient formation is used as a test sample, a BST1_ASV-specific antibody is immobilized on a well to provide a capture-side antibody, and the other antibody is labeled with a radioactive substance, colored particles, or enzyme, Used as detection antibody.
キャプチャー側抗体が固相化されたウェル内に適切に希釈された試料を添加し、所定時間インキュベートした後、試料液をウェルから除去し、適切なバッファーで各ウェルを洗浄後、検出抗体が添加される。所定のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、免疫複合体を検出する。検出は、検出側抗体に標識された標識物質の性質に依存し、放射線量、発光色、球高度、などを検出する。標識物質が酵素標識であれば、さらに、適当な基質をウェルに添加して、所定のインキュベーション後の吸光度を検出することができる（ＥＬＩＺＡ法）。ＥＬＩＺＡ法で用いられる酵素は、本方法に使用可能なものであれば、いかなる酵素でも使用可能であり、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンなどがその基質として利用可能である。アルカリホスファターゼで標識する場合には、ｐ−ニトロフェニルホスフェートが基質として利用可能である。 Add the appropriately diluted sample to the well on which the capture antibody is immobilized, incubate for a predetermined time, remove the sample solution from the well, wash each well with an appropriate buffer, and add the detection antibody. Is done. After a predetermined incubation, the wells are washed and immune complexes are detected. Detection depends on the property of the labeling substance labeled on the detection side antibody, and detects the radiation dose, luminescent color, sphere altitude, and the like. If the labeling substance is an enzyme label, an appropriate substrate can be further added to the well, and the absorbance after a predetermined incubation can be detected (ELISA method). As the enzyme used in the ELIZA method, any enzyme can be used as long as it can be used in the present method. For example, in the case of labeling with horseradish peroxidase, 3,3 ′, 5,5′-tetra Methylbenzidine and the like can be used as the substrate. When labeling with alkaline phosphatase, p-nitrophenyl phosphate can be used as a substrate.
８．医薬組成物
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドは、膵臓癌細胞に特異的に発現していることが予想される。従って、膵臓癌特異的な腫瘍マーカーであるＢＳＴ１＿ＡＳＶを標的分子とした、膵臓癌治療のための医薬を提供することも可能となる。例えば、ＢＳＴ１＿ＡＳＶ特異的結合する因子（小分子、ペプチドなど）、又はＢＳＴ１＿ＡＳＶ特異的な抗体などに、制癌作用を有する化合物又は細胞毒素をコンジュゲートした物質などを含む組成物は、膵臓癌治療のための医薬組成物として使用することができる。該組成物は薬学的に受容可能な担体と共に、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で治療剤として使用され得る。
「薬学的に受容可能な坦体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである（Gennaroら, 2000）。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。
8). Pharmaceutical Composition It is expected that the BST1_ASV polypeptide of the present invention is specifically expressed in pancreatic cancer cells. Therefore, it is also possible to provide a medicament for treating pancreatic cancer using BST1_ASV, which is a pancreatic cancer-specific tumor marker, as a target molecule. For example, a composition containing an agent that binds specifically to BST1_ASV (such as a small molecule or a peptide) or a BST1_ASV-specific antibody or a compound that has an anticancer activity or a substance conjugated with a cytotoxin is used for treating pancreatic cancer. Can be used as a pharmaceutical composition. The composition can be used as a therapeutic agent together with a pharmaceutically acceptable carrier in the form of a pharmaceutical composition that does not adversely affect the living body.
“Pharmaceutically acceptable carrier” refers to those suitable for pharmaceutical administration, including solvents, dispersion media, coating agents, antibacterial and antifungal agents, agents that act isotonically to delay adsorption and the like. Yes (Gennaro et al., 2000). Examples of the carrier and preferred for diluting the carrier include, but are not limited to, water, saline, finger solution, dextrose solution, and 5% human serum albumin. Non-aqueous media such as liposomes and non-volatile oils are also used.
（１）医薬組成物の調製
本発明の医薬組成物は、静脈内、経口への投与、胃への直接投与を含む、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。静脈内への投与、又は胃への直接投与に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非径口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
(1) Preparation of pharmaceutical composition The pharmaceutical composition of the present invention is formulated to be compatible with a therapeutically appropriate route of administration, including intravenous, oral administration, and direct administration to the stomach. Solutions or suspensions used for intravenous administration or direct administration to the stomach include, but are not limited to, sterile diluents such as water for injection, saline solutions, non-volatile oils, polyethylene glycols , Glycerin, propylene glycol, or other synthetic solvents, preservatives such as benzyl alcohol or other methylparabens, antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite, soothing agents such as benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, ethylenediaminetetra Chelating agents such as acetic acid (EDTA), buffers such as acetate, citrate, or phosphate, and agents for osmotic pressure adjustment such as sodium chloride or dextrose.
The pH can be adjusted with acids or bases such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. Non-caliber preparations are contained in ampoules, glass or plastic disposable syringes or multidose vials.
（２）注射可能な製剤
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒であって、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダー（凍結乾燥されたタンパク質、核酸などを含む）が含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬＴＭ（BASF, Parsippany, N.J.）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションなどが生じてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションを防ぐために使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
(2) Injectable preparations Pharmaceutical compositions suitable for injection include sterile injectable solutions or dispersion media that are sterile aqueous solutions (water soluble) or dispersion media to be prepared at the time of use and are sterilized. Powders (including lyophilized proteins, nucleic acids, etc.) are included. For intravenous administration, suitable carriers include physiological saline, bacteriostatic water, CREMOPHOR EL ™ (BASF, Parsippany, NJ), or phosphate buffered saline (PBS). When used as an injection, the composition must be sterile and must be fluid enough to be administered with a syringe. The composition must be stable to chemical changes, corrosion, and the like during preparation and storage, and should not cause contamination from microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures. For example, using a coating agent such as lectin, maintaining a required particle size in the dispersion medium, and maintaining a proper fluidity by using a surfactant. Various antibacterial and antifungal agents, such as parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, and thimerosal can be used to prevent microbial contamination. In addition, polyalcohols such as sugar, mannitol, sorbitol, and agents that maintain isotonicity such as sodium chloride may be included in the composition. Compositions that can delay adsorption include agents such as aluminum monostearate and gelatin.
Sterile injectable solutions are prepared by adding the required ingredients alone or in combination with other ingredients, then adding the required amount of active compound in a suitable solvent and sterilizing. Generally, a dispersion medium is prepared by incorporating the active compound into a sterile medium that contains a basic dispersion medium and the other necessary ingredients described above. Sterile powder preparation methods for the preparation of sterile injectable solutions include vacuum drying and lyophilization to prepare a powder containing the active ingredient and any desired ingredients derived from the sterile solution. It is.
（３）経口組成物
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトース、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリシル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
(3) Oral composition Usually, the oral composition contains an inert diluent or a carrier that does not cause harm when taken into the body. Oral compositions are, for example, contained in gelatin capsules or compressed into tablets. For oral treatment, the active compound is incorporated with excipients and used in the form of tablets, troches, or capsules. Oral compositions can also be prepared using a flowable carrier, and the composition in the flowable carrier is applied orally. In addition, pharmaceutically compatible binding agents, and / or adjuvant materials may be included.
Tablets, pills, capsules, troches and the like may contain any of the following ingredients or compounds with similar properties: excipients such as microcrystalline cellulose, gum arabic, tragacanth or gelatin Binders such as starch or lactose, alginic acid, PRIMOGEL, or corn starch; lubricants such as magnesium stearate or STRROTES; lubricants such as colloidal silicon dioxide; sweeteners such as sucrose or saccharin; or peppermint, methyl salicylic acid Or a fragrance additive such as orange flavor.
（５）全身投与
また、全身投与は経粘膜的又は経皮的に行なうことができる。経粘膜的又は経皮的投与について、標的のバリアーを透過することができる浸透剤が選択される。経粘膜浸透剤は界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経鼻スプレー又は坐薬は経粘膜的な投与に対して使用することができる。経粘膜的投与に対して、活性化合物はオイントメント、軟膏、ジェル又はクリーム中に製剤化される。
また、化合物は、直腸への送達に対して、坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの基剤と共に）又は滞留性の浣腸の形態で調製することもできる。
（６）担体
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド、その部分ポリペプチド、又はそれらの発現ベクターは、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの制御放出製剤として、体内から即時に除去されことを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリエチレングリコール、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Mountain View, CA）及びＮＯＶＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．（Lake Elsinore, CA）から入手することが可能で、また、当該技術分野の専門家によって容易に調製することもできる。また、リポソームの懸濁液も薬学的に受容可能な坦体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。例えば、抗体のＦａｂ’断片などは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合させてもよい（Martin及びPapahadjopoulos, 1982）。詳細な調製方法は、例えば、Eppsteinら, 1985；Hwangら, 1980中の記載を参照のこと。
(5) Systemic administration Systemic administration can be performed transmucosally or transdermally. For transmucosal or transdermal administration, penetrants that can penetrate the target barrier are selected. Transmucosal penetrants include surfactants, bile salts, and fusidic acid derivatives. Nasal sprays or suppositories can be used for transmucosal administration. For transmucosal administration, the active compounds are formulated in ointments, ointments, gels or creams.
The compounds can also be prepared in the form of suppositories (eg, with bases such as cocoa butter and other glycerides) or retention enemas for rectal delivery.
(6) Carrier The BST1_ASV polypeptide of the present invention, a partial polypeptide thereof, or an expression vector thereof can be immediately removed from the body as a controlled release formulation such as a delivery system encapsulated in implantable tablets and microcapsules. It can be prepared using a preventable carrier. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyethylene glycol, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Such materials are available from ALZA Corporation (Mountain View, CA) and NOVA Pharmaceuticals, Inc. (Lake Elsinore, CA) and can also be readily prepared by experts in the field. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. Useful liposomes are prepared as a lipid composition comprising, but not limited to, phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanol (PEG-PE) through a filter of appropriate pore size to obtain a size suitable for use, and reverse phase. Purified by evaporation. For example, Fab ′ fragments of antibodies and the like may be bound to liposomes via a disulfide exchange reaction (Martin and Papahadjopoulos, 1982). For detailed preparation methods, see for example Eppstein et al., 1985; Hwang et al., 1980.
（７）投与量
本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチド、その部分ポリペプチド、又はそれらの発現ベクター等による特定の疾患の治療又は予防において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。例えば、タキソールを制癌化合物として抗体にコンジュゲートして投与する場合には、患者の体表面積１ｍ２１０５〜１３５ｍｇの１日投与量が適切である。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは治療されるべき患者に対する投与量に含まれる有効活性成分は、１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０， ６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は１日に１〜４回の投与計画で、好ましくは１日に１回又は２回投与される。
(7) Dosage In the treatment or prevention of a specific disease using the BST1_ASV polypeptide of the present invention, a partial polypeptide thereof, or an expression vector thereof, an appropriate dosage level is the condition of the patient to be administered, the administration method, etc. However, it can be easily optimized by those skilled in the art.
In the case of injection administration, for example, it is preferable to administer about 0.1 μg / kg to 500 mg / kg per day of the patient's body weight, and it will generally be possible to administer once or in several divided doses. Preferably, the dosage level is about 0.1 μg / kg to about 250 mg / kg per day, more preferably about 0.5 to about 100 mg / kg per day. For example, when administered conjugated to an antibody to taxol as an anticancer compound, the daily dosage of the patient's body surface area 1m 2 105~135mg is appropriate.
For oral administration, the composition is preferably provided in the form of a tablet containing 1.0 to 1000 mg of active ingredient, preferably the active ingredient contained in the dosage for the patient to be treated is 1.0 , 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400 0.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0 and 1000.0 mg. The compounds are administered on a regimen of 1 to 4 times daily, preferably once or twice daily.
（８）単位投与量
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量とは、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬学的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物（例えば、ＢＳＴ１＿ＡＳＶポリペプチドなど）の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。
(8) Unit dosage A pharmaceutical composition or formulation must be composed of uniform unit dosages to ensure a certain dosage. A unit dose is a unit formulated with a pharmaceutically acceptable carrier, including a single dose effective for treating a patient. In determining the unit dosage of the present invention, the physical and chemical characteristics of the compound to be formulated (eg, BST1_ASV polypeptide), the expected therapeutic effect, and the formulation specific to the compound It is affected by matters to be noted in
９．検出用キット
本発明の腫瘍マーカーを検出するためのキットには、ＲＴ−ＰＣＲを行なうために必要なプライマー（例えば、配列番号５乃至９の適切なプライマーセット）のほか、ＲＮａｓｅＨ阻害剤、逆転写酵素、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどが含まれてもよい。また、本発明の腫瘍マーカーを検出するためのキットには、イムノアッセイを行うために必要な、本発明のＢＳＴ１＿ＡＳＶと特異的に結合するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体のほか、イムノアッセイに必要なバッファー、ブロッキング剤（ＢＳＡ、スキムミルクパウダーなど）、検出用標識（蛍光色素、化学発光物質、金コロイド、酵素など）がコンジュゲートされた二次抗体などが含まれてもよい。さらに、イムノアッセイの中でも、ＥＬＩＺＡ法の使用のためのキットには、キャプチャー抗体、酵素標識化した検出用抗体、適切な酵素基質などが含まれてもよい。これらの試薬は適切な容器に収容し、使用説明書と共にキット中に含めることができる。
（１）容器
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。
（２）使用説明書
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェッブサイトに掲載されていてもよい。
9. Detection Kit The kit for detecting a tumor marker of the present invention includes primers necessary for performing RT-PCR (for example, an appropriate primer set of SEQ ID NOs: 5 to 9), an RNase H inhibitor, and reverse transcription. Enzymes, Taq DNA polymerase, etc. may be included. In addition to the monoclonal antibody and / or polyclonal antibody that specifically binds to the BST1_ASV of the present invention necessary for immunoassay, the kit for detecting the tumor marker of the present invention includes a buffer necessary for immunoassay, Blocking agents (BSA, skim milk powder, etc.), secondary labels conjugated with detection labels (fluorescent dyes, chemiluminescent substances, gold colloids, enzymes, etc.) may be included. Further, among immunoassays, a kit for use of the ELIZA method may include a capture antibody, an enzyme-labeled detection antibody, an appropriate enzyme substrate, and the like. These reagents can be contained in a suitable container and included in the kit along with instructions for use.
(1) Container Reagents contained in the kit are supplied in any kind of container in which the constituents maintain the activity effectively for a long period of time, are not adsorbed by the material of the container, and do not undergo alteration. For example, a sealed glass ampoule includes a buffer packaged under a neutral and non-reactive gas such as nitrogen gas. Ampoules are composed of glass, polycarbonate, organic polymers such as polystyrene, ceramics, metals, or any other suitable material commonly used to hold reagents. Examples of other suitable containers include simple bottles made from similar materials such as ampoules, and packaging materials that are internally lined with foil such as aluminum or an alloy. Other containers include test tubes, vials, flasks, bottles, syringes, or the like. The container has a sterile access port such as a bottle having a stopper that can be penetrated by a hypodermic needle.
(2) Instructions for use The instructions for use are also attached to the kit. Instructions for using the kit comprising the pharmaceutical composition are printed on paper or other material and / or floppy disk, CD-ROM, DVD-ROM, Zip disk, video tape, audio tape, etc. It may be supplied as an electrically or electromagnetically readable medium. Detailed instructions for use may be actually attached to the kit, or may be posted on a website designated by the manufacturer or distributor of the kit or notified by e-mail or the like.
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。 Examples are shown below, but the present invention is not limited thereto.
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析による腫瘍マーカーの絞り込み
血中腫瘍マーカー候補となる遺伝子及びタンパク質の候補をｉｎ ｓｉｌｉｃｏにおける解析により絞り込みを行なった。血液中に分泌されているタンパク質の中からマーカーの候補となる可能性のあるタンパク質を選択するために、ＮＣＢＩ（National Center for
Biotechnology Information）が運営する統合データベース内に存在するＰｕｂＭｅｄ（生物・医学文献データベース）を利用し、血液中に存在するタンパク質を実験的に立証した論文を収集した。血中タンパク質につき、網羅的に記載された論文（非特許文献２、非特許文献３）から以下の方法で、腫瘍マーカー候補タンパク質を抜き出し、リスト化を行なった。
非特許文献２および３中に記載される全てのタンパク質名を抽出して、それぞれの文献についてリスト化を行った。ここで作成したリストについて、ＧｅｎＢａｎｋ（National Institutes of
Healthが作成する核酸データベース）、ＰＩＲ（Georgetown University Medical Centerが運営するアミノ酸配列データベース）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（Swiss Institute of Bioinformaticsが提供するアミノ酸・タンパク質データベース）、ＰＤＢ（Research Collaboratory for Structural Bioinformaticsの運営するタンパク質立体構造データベース）、ＲｅｆＳｅｑ（NCBIの提供するレファレンス配列データベース）のＩＤ、および、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔのPrimary accession number及びEntry name、LocusLink（ＮＣＢＩの提供する統合データベース）のLocusID、Ｕｎｉｇｅｎｅ（ＮＣＢＩの提供するクラスタリングデータベース）のクラスターＩＤを追加するプログラムを作成した。文献２または３に基づいて作成した腫瘍マーカー候補タンパク質のリストを比較して、重複部分を削除し、最終的な腫瘍マーカー候補タンパク質となり得る、血中分泌タンパク質のリストを作成した。
The in silico genes and proteins of the candidate having the narrowing blood tumor marker candidate tumor markers by analysis was performed Refine by analysis in in silico. In order to select a protein that may be a candidate marker from among proteins secreted in blood, NCBI (National Center for
Using PubMed (biological and medical literature database) existing in an integrated database operated by Biotechnology Information), papers that experimentally proved proteins present in blood were collected. Regarding blood proteins, tumor marker candidate proteins were extracted from papers (Non-patent Document 2 and Non-patent Document 3) described exhaustively by the following method and listed.
All protein names described in Non-Patent Documents 2 and 3 were extracted, and each document was listed. For the list created here, GenBank (National Institutes of
Nucleic acid database created by Health), PIR (amino acid sequence database operated by Georgetown University Medical Center), SwissProt (amino acid and protein database provided by Swiss Institute of Bioinformatics), PDB (research collaboratory for structural bioinformatics) Database), RefSeq (reference sequence database provided by NCBI), SwissProt's Primary accession number and Entry name, LocusLink (integrated database provided by NCBI), LocusID, Unigene (clustered database provided by NCBI) A program for adding an ID was created. The list of tumor marker candidate proteins prepared based on literature 2 or 3 was compared, and a list of secretory proteins in the blood that could be used as final tumor marker candidate proteins was created by eliminating the overlapping portion.
血中分泌タンパク質リストに記述された各遺伝子及びタンパク質にＳｗｉｓｓＰｒｏｔのProtein name、Synonym、Gene nameを追加し、それらを一つずつＰｕｂＭｅｄで検索したのち、検索可能なものを論理和条件によりつなげてクエリを作成した。作成したクエリを用いてＰｕｂＭｅｄによる文献検索を行い、各遺伝子及びタンパク質ごとに検索結果数を血中分泌タンパク質リストに追加した。クエリの作成からＰｕｂＭｅｄによるクエリの検索結果数追加までの一連の作業はプログラムを作成し自動的に行った。また、このプログラムを応用し、作成したクエリと以下の語句を組み合わせてＰｕｂＭｅｄ検索を行い、組み合わせ語句を用いた検索結果数の追加を行い（表１）、最終的なリストを作成した。以下に組み合わせに用いた語句を示す：tumor, tumor marker, Alternative Splicing, Alternative Splicing AND
tumor, Alternative Splicing AND tumor marker, plasma, plasma AND tumor, plasma
AND tumor marker, plasma AND Alternative Splicing
Add SwissProt's Protein name, Synonym, and Gene name to each gene and protein described in the blood secretory protein list, search them with PubMed one by one, and then connect the searchable items with the logical sum condition to query It was created. Literature search by PubMed was performed using the created query, and the number of search results for each gene and protein was added to the blood secretory protein list. A series of operations from the creation of a query to the addition of the number of query search results by PubMed was automatically performed by creating a program. In addition, by applying this program, a PubMed search was performed by combining the created query and the following words and phrases, the number of search results using the combination words was added (Table 1), and a final list was created. The following words are used in combination: tumor, tumor marker, Alternative Splicing, Alternative Splicing AND
tumor, Alternative Splicing AND tumor marker, plasma, plasma AND tumor, plasma
AND tumor marker, plasma AND Alternative Splicing
表１：上記組み合わせた語句を用いた検索に使用したプログラム
Table 1: Programs used for searches using the above combined words
作成したリストを元に以下のようなデーターマイニングを行なった。
ＰｕｂＭｅｄのAbstractから各遺伝子及びタンパク質の総論文ヒット数に対してそれぞれの組み合わせた用語（前記９種類）のヒット数の割合を計算した（ＰｕｂＭｅｄのAbstractに対する各遺伝子及びタンパク質の総論文ヒット数をＡとし、前記９種類の用語をそれぞれ加えた論文ヒット数をＮとする。Ｎ／Ａとすることにより割合が計算できる）。Ｎ／Ａの値が０となるタンパク質をすべて候補からはずし、残りのタンパク質について、検索された論文の内容から血中分泌タンパク質か否かを判断した。即ち、腫瘍マーカーとして探索されつくされていない遺伝子及びタンパク質を選び出すため、総論文数が少ないがん関連因子を候補上位にランクし、マーカーとして既に登録があるか、若しくは登録の可能性のあるものは候補下位へランクした。さらにＡＳＶが探索されている遺伝子及びタンパク質は候補下位にランクした。
また、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析における生物情報学的解析手法に用いることにより、ＡＳＶが実際に発現した場合に、該ＡＳＶタンパク質が血中に分泌されるかどうかを立体構造から予測することが可能であるため、ＰＤＢ（Protein Data Bank）に立体構造が登録されているものを優先的に候補上位にランクした。
以上の方法に基づき、１００の腫瘍マーカー候補を絞り込んだ（表２）。この候補の中には、ＢＳＴ１遺伝子（配列番号３）及びタンパク質（配列番号４）が含まれていた。
The following data mining was performed based on the created list.
From the PubMed Abstract, the ratio of the number of hits of each combined term (the above 9 types) to the total number of paper hits for each gene and protein was calculated (the total number of paper hits for each gene and protein for the PubMed Abstract was A And the number of paper hits to which each of the nine types of terms is added is N. The ratio can be calculated by setting N / A). All proteins with a N / A value of 0 were excluded from the candidates, and the remaining proteins were judged from the contents of the retrieved papers as to whether they were blood secreted proteins. In other words, in order to select genes and proteins that have not been searched for as tumor markers, cancer-related factors with a small total number of papers are ranked in the top of the candidate list, and those that have already been registered or may be registered as markers Ranked in the candidate lower rank. Furthermore, genes and proteins for which ASV is being searched were ranked as candidates.
Moreover, since it is possible to predict from the three-dimensional structure whether or not the ASV protein is secreted into the blood when ASV is actually expressed by using it in a bioinformatic analysis method in in silico analysis. Those whose three-dimensional structures are registered in PDB (Protein Data Bank) were preferentially ranked as candidates.
Based on the above method, 100 tumor marker candidates were narrowed down (Table 2). Among these candidates, the BST1 gene (SEQ ID NO: 3) and protein (SEQ ID NO: 4) were included.
〔表２〕
[Table 2]
ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析による腫瘍マーカーの絞り込み
実施例１に絞り込まれた１００の腫瘍マーカー候補の中から、臓器特異的な腫瘍マーカーの候補を絞り込むために、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、幾つかの癌細胞および正常細胞由来のサンプルについて検討を行なった。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、上記１００の遺伝子のメジャーフォームとそのＡＳＶを同時に検出できるように、メージャーフォームの５’側および３’側双方の両端のエクソン領域に対して上記１００遺伝子のＰＣＲ用プライマー（サワデー・テクノロジー社）をデザインした。
本発明において使用した癌細胞株由来の全ＲＮＡはがんセンターからご供与頂き（図２の図面の簡単な説明の部分を参照のこと）、正常細胞由来の全ＲＮＡは、Human Rapid Scan（Ori-gene社）から購入した（図１の図面の簡単な説明の部分を参照のこと）。また、ＲＴ−ＰＣＲ法を行うにあたって、ポジティブコントロールとして正常細胞およびがん細胞由来のｃＤＮＡの全ての混合物を調製したが（図２、ＰＣ）、この混合物の調製に用いた正常細胞組織（骨髄、脳・小脳、胎児脳、胎児肝臓、心臓、腎臓、肺、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、脾臓、精巣、甲状腺、気管、子宮、大腸（粘膜内面）、小腸、脊髄、胃、卵巣、皮膚、胆嚢、脂肪組織）のｃＤＮＡはクロンテックから購入した。
Narrowing down tumor markers by in vitro analysis Among the 100 tumor marker candidates narrowed down in Example 1, in order to narrow down organ-specific tumor marker candidates, RT-PCR was used to select several cancer cells. In addition, the samples derived from normal cells were examined. In the RT-PCR method, the 100 gene PCR primer for the exon regions at both the 5 ′ side and the 3 ′ side of the major form so that the major form of the 100 gene and its ASV can be detected simultaneously. (Sawaday Technology) was designed.
The cancer cell line-derived total RNA used in the present invention was provided by the Cancer Center (see the brief description in the drawing of FIG. 2), and the normal cell-derived total RNA was obtained from the Human Rapid Scan (Ori -gene) (see the brief description of the drawing in FIG. 1). In addition, when performing RT-PCR, a mixture of all cDNAs derived from normal cells and cancer cells was prepared as a positive control (FIG. 2, PC). Normal cell tissues (bone marrow, Brain / cerebellum, fetal brain, fetal liver, heart, kidney, lung, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, spleen, testis, thyroid, trachea, uterus, large intestine (mucosal inner surface), small intestine, spinal cord, stomach, ovary, skin , Gallbladder, adipose tissue) cDNA was purchased from Clontech.
ＲＴ−ＰＣＲの結果、正常細胞において検出されたＰＣＲ産物のバンドサイズと癌細胞において検出されたＰＣＲ産物のバンドサイズを、ポジティブコントロール（図２、ＰＣ）において検出されたバンドの位置を参照しながら比較を行い、臓器特異的に発現している遺伝子の確認を行なった。確認されたＰＣＲ産物のバンド位置から、メジャーフォームとは異なる位置に出現するバンドをＡＳＶ由来のバンドとし、臓器特異性のあるＡＳＶ由来のバンドをアガロースゲルから切り出して、定法に従って、その塩基配列を決定した。決定したＡＳＶの塩基配列は、マップソフトest2genome（EMBOSS is “The European Molecular Biology Open Software Suite”）を用いてゲノム配列に対しマッピングを行い、メジャーフォームのエクソン、イントロン構造と比較して、ＡＳＶのゲノム構造を決定した。 As a result of RT-PCR, the band size of the PCR product detected in normal cells and the band size of the PCR product detected in cancer cells are referred to the position of the band detected in the positive control (FIG. 2, PC). A comparison was made to confirm genes expressed in an organ-specific manner. From the confirmed band position of the PCR product, a band appearing at a position different from the major form is defined as an ASV-derived band, an organ-specific ASV-derived band is cut out from the agarose gel, and the base sequence is determined according to a standard method. Decided. The determined ASV base sequence is mapped to the genome sequence using the map software est2genome (EMBOSS is “The European Molecular Biology Open Software Suite”), and compared to the exon and intron structure of the major form, the ASV genome The structure was determined.
ＢＳＴ１＿ＡＳＶ配列情報の取得
実施例２に示す方法により、膵臓癌特異的にｍＲＮＡ発現が確認されたＢＳＴ１遺伝子の選択的スプライスバリアントであるＢＳＴ１＿ＡＳＶを同定した。
（１）ＢＳＴ１＿ＡＳＶ塩基配列の決定
ＢＳＴ１＿ＡＳＶのｃＤＮＡを同定するため、がんセンターよりご供与頂いた各癌細胞株全ＲＮＡをもとに作製したｃＤＮＡに対して、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
ＢＳＴ１＿ｈ．ｆ１：５’−ＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号５）
ＢＳＴ１＿ｔ．ｒ１：５’−ＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＴＡＧＡＧＣＡＡＣＡＣ（配列番号６）
Acquisition of BST1_ASV sequence information BST1_ASV, a selective splice variant of the BST1 gene whose mRNA expression was confirmed specifically in pancreatic cancer, was identified by the method shown in Example 2.
(1) Determination of BST1_ASV base sequence In order to identify the cDNA of BST1_ASV, PCR was performed on the cDNA prepared from the total RNA of each cancer cell line donated by the Cancer Center using the following primers. It was.
BST1_h. f1: 5′-AGGAGAGAAGGGGAGTGGAGGAAGC (SEQ ID NO: 5)
BST1_t. r1: 5′-GGCTGGAGGAGGGTTAGAGCAACAC (SEQ ID NO: 6)
ＰＣＲの条件は以下に示す。
使用酵素 : ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ＿ｔａｑ
使用機種 :
Biometra T-GRADIENT
反応液組成 : １０ × ＬＡ Ｂｕｆｆｅｒ １．５μｌ
ｄＮＴＰ ＭＩＸ （２．５ｍＭ ｅａｃｈ） ２．４μｌ
プライマー（ＢＳＴ１＿ｈ．ｆ１） ２．４μｌ
（ＢＳＴ１＿ｔ．ｒ１） ２．４μｌ
ＬＡ Ｔａｑ＋Ｔａｑ ＡＢ（＊） ０．３μｌ
（＊）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ ａｎｔｉ−Ｔａｑ ｈｉｇｈ（TOYOBO）と各Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを等量ずつ混合し、室温で１５分間静置した
鋳型ＤＮＡ ０．５μｌ
蒸留水 ５．５μｌ
総量 １５μｌ
サイクル条件は、９５℃ で保持した後、９５℃３０秒、６８℃２分３０秒、６８℃２分を３５サイクル行い、４℃で保持した。
PCR conditions are shown below.
Enzyme used: TAKARA LA_taq
Model used:
Biometra T-GRADIENT
Reaction solution composition: 10 × LA Buffer 1.5 μl
dNTP MIX (2.5mMeach) 2.4μl
Primer (BST1_h.f1) 2.4 μl
(BST1_t.r1) 2.4 μl
LA Taq + Taq AB (*) 0.3 μl
(*) Monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high (TOYOBO) and each Taq polymerase were mixed in equal amounts and allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
Template DNA 0.5 μl
Distilled water 5.5μl
Total volume 15μl
The cycle condition was maintained at 95 ° C., followed by 35 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 2 minutes and 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes, and was maintained at 4 ° C.
正常細胞（図１）および癌細胞（図２）各々に関し、得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行い、メジャーフォームとは異なるサイズに位置し、かつ、膵臓癌特異的に検出されるバンドを切り出し、定法によりクローニングおよび配列決定を行なった。配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（Applied Biosystems社）遺伝子解析試薬を用いてサンプルを調製し、３７３０ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems社）を使用して解析を行なった。同定されたＢＳＴ１＿ＡＳＶの塩基配列を配列番号１、およびアミノ酸配列を配列番号２として示す。また、ＢＳＴ１メジャーフォームの塩基配列を配列番号３として示す。また、メジャーフォームとＡＳＶのアライメントを図３に示す。 For each of normal cells (FIG. 1) and cancer cells (FIG. 2), the obtained PCR product is subjected to agarose gel electrophoresis and is located in a size different from the major form and is detected specifically for pancreatic cancer Was excised and cloned and sequenced by conventional methods. For sequencing, a sample was prepared using ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) gene analysis reagent, and analysis was performed using 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). The base sequence of the identified BST1_ASV is shown as SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 2. The base sequence of BST1 major form is shown as SEQ ID NO: 3. FIG. 3 shows the alignment between the major form and the ASV.
（２）ＢＳＴ１＿ＡＳＶの膵臓癌特異性に関する検討
ＢＳＴ１＿ＡＳＶが膵臓癌特異的に発現していることについて、上記プライマー（配列番号５および６）とは異なるプライマーを用いて再度確認を行なった。
ＢＳＴ１＿ＡＳＶをコードする塩基配列は、メジャーフォームをコードする塩基配列のうち、開始コドンのＡから数えて１５番目〜１８８番目までの配列を欠いている。従って、ＡＳＶのこの領域に対して設計したプライマーは、メジャーフォームにはアニールせず、ＡＳＶに対してのみアニールし、ＡＳＶのみを特異的に増幅させることができる（図４を参照のこと）。そこで、そのようなプライマーを順方向（配列番号８）または逆方向（配列番号７）に用いてＰＣＲを行なった。
(2) Examination of pancreatic cancer specificity of BST1_ASV The fact that BST1_ASV is specifically expressed in pancreatic cancer was confirmed again using a primer different from the above primers (SEQ ID NOs: 5 and 6).
The base sequence encoding BST1_ASV lacks the 15th to 188th sequences from the start codon A in the base sequence encoding the major form. Thus, primers designed for this region of ASV can anneal only to ASV without annealing to the major form, and specifically amplify only ASV (see FIG. 4). Therefore, PCR was performed using such a primer in the forward direction (SEQ ID NO: 8) or the reverse direction (SEQ ID NO: 7).
以下に配列を示すプライマーのうち、ＢＳＴ１＿ｈ．ｆ１（配列番号５）およびＢＳＴ１＿ｓｖ１．ｒ１（配列番号７）で示されるプライマーセットは、ＡＳＶに特異的なプライマー（配列番号７）を逆方向に設定してＢＳＴ１＿ＡＳＶを特異的に増幅するためのセットであり、また、ＢＳＴ１＿ｓｖ１．ｆ１（配列番号８）およびＢＳＴ１＿ｅ２．ｒ１（配列番号９）で示されるプライマーセットは、ＡＳＶに特異的なプライマーを順方向に設定してＢＳＴ１＿ＡＳＶを特異的に増幅するためのセットである（図４を参照のこと）。
５’側ＢＳＴ１＿ＡＳＶ特異的検出用プライマー
ＢＳＴ１＿ｈ．ｆ１：５’−ＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号５）
ＢＳＴ１＿ｓｖ１．ｒ１：５’−ＧＣＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＧ−３’（配列番号７）
３’側ＢＳＴ１＿ＡＳＶ特異的検出用プライマー
ＢＳＴ１＿ｓｖ１．ｆ１：５’−ＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣＡ−３’（配列番号８）
ＢＳＴ１＿ｅ２．ｒ１：５’−ＴＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＴ−３’（配列番号９）
Of the primers shown below, BST1_h. f1 (SEQ ID NO: 5) and BST1_sv1. The primer set shown by r1 (SEQ ID NO: 7) is a set for specifically amplifying BST1_ASV by setting a primer (SEQ ID NO: 7) specific to ASV in the reverse direction, and BST1_sv1. f1 (SEQ ID NO: 8) and BST1_e2. The primer set represented by r1 (SEQ ID NO: 9) is a set for specifically amplifying BST1_ASV by setting a primer specific to ASV in the forward direction (see FIG. 4).
5'-side BST1_ASV-specific detection primer BST1_h. f1: 5′-AGGAGAGAAGGGGAGTGGAGGAAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
BST1_sv1. r1: 5′-GCTGTGCAGTTCTTGTTCCCCTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
3 ′ side BST1_ASV-specific detection primer BST1_sv1. f1: 5′-CGATGGCGGCCCAGGGGAACA-3 ′ (SEQ ID NO: 8)
BST1_e2. r1: 5′-TGAGGGCAGCACGGAGCAGGGGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 9)
ＰＣＲの条件は以下に示す。
使用酵素 : ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ＿ｔａｑ
使用機種 :
Biometra T-GRADIENT
反応液組成 : １０ × ＬＡ Ｂｕｆｆｅｒ １．０μｌ
ｄＮＴＰ ＭＩＸ （２．５ｍＭ ｅａｃｈ） １．６μｌ
プライマー（ＢＳＴ１＿ｈ．ｆ１） １．６μｌ
（ＢＳＴ１＿ｔ．ｒ１） １．６μｌ
ＬＡ Ｔａｑ＋Ｔａｑ ＡＢ（＊） ０．４μｌ
（＊）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ ａｎｔｉ−Ｔａｑ ｈｉｇｈ（TOYOBO）と各Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを等量ずつ混合し、室温で１５分間静置した
鋳型ＤＮＡ ０．５μｌ
蒸留水 ５．５μｌ
総量 １０μｌ
サイクル条件は、９６℃ で保持した後、９６℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃１分３０秒を３５サイクル行い、７２℃２分、４℃で保持した。
配列番号５および７のプライマーを用いた確認実験の結果を図５および６に、配列番号８および９のプライマーを用いた確認実験の結果を図７および８に示す。
PCR conditions are shown below.
Enzyme used: TAKARA LA_taq
Model used:
Biometra T-GRADIENT
Reaction solution composition: 10 × LA Buffer 1.0 μl
dNTP MIX (2.5mMeach) 1.6μl
Primer (BST1_h.f1) 1.6 μl
(BST1_t.r1) 1.6 μl
LA Taq + Taq AB (*) 0.4 μl
(*) Monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high (TOYOBO) and each Taq polymerase were mixed in equal amounts and allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
Template DNA 0.5 μl
Distilled water 5.5μl
Total volume 10μl
Cycle conditions were maintained at 96 ° C., followed by 35 cycles of 96 ° C. for 30 seconds, 62 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute and 30 seconds, and held at 72 ° C. for 2 minutes and 4 ° C.
The results of the confirmation experiment using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 7 are shown in FIGS. 5 and 6, and the results of the confirmation experiment using the primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 are shown in FIGS.
以上の結果から、ＢＳＴ１メジャーフォームは、膵臓を含めた検討したほとんどの正常細胞において発現しており（図１）、癌細胞では、膵臓癌細胞（図２、レーン１１〜１３、１５）の４種と扁平上皮癌細胞（口腔癌由来の細胞株、図２、レーン３４）の１種にその発現が確認された（図２）。一方、ＢＳＴ１＿ＡＳＶは、正常細胞については骨髄において発現される可能性が示されているが（図１、レーン２２のＮＤで示すバンド）、このバンドはＡＳＶ特異的なプライマーでは検出されていないため（図５および図７、レーン２２）、プライマーによる非特異的増幅産物であると考えられる。それ以外の正常細胞における発現は検出されなかった（図１，５，７）。一方、癌細胞では、ＢＳＴ１＿ＡＳＶの発現は、膵臓癌細胞（膵管系膵癌由来の細胞株）（図２，６，８、レーン１２，１３，１５）と扁平上皮癌細胞（口腔癌由来の細胞株）（図２，６，８、レーン３４）の１種において確認され、それ以外の組織由来の癌細胞では検出できなかった。
すなわち、正常な膵臓においてＢＳＴ１＿ＡＳＶは発現しておらず、癌化して初めて膵臓に発現が認められることから、膵臓癌特異的な腫瘍マーカーとして利用可能であると判断できる。
From the above results, BST1 major form is expressed in most normal cells examined including pancreas (FIG. 1), and in cancer cells, 4 of pancreatic cancer cells (FIG. 2, lanes 11 to 13, 15). The expression was confirmed in one of the species and squamous cell carcinoma cells (cell line derived from oral cancer, FIG. 2, lane 34) (FIG. 2). On the other hand, BST1_ASV has been shown to be expressed in bone marrow for normal cells (FIG. 1, the band indicated by ND in lane 22), but this band is not detected by an ASV-specific primer ( FIG. 5 and FIG. 7, lane 22) are considered to be non-specific amplification products by primers. Expression in other normal cells was not detected (FIGS. 1, 5, and 7). On the other hand, in cancer cells, BST1_ASV is expressed in pancreatic cancer cells (cell lines derived from pancreatic ductal pancreatic cancer) (FIGS. 2, 6, 8, lanes 12, 13, 15) and squamous cell carcinoma cells (cell lines derived from oral cancer). ) (FIGS. 2, 6, 8 and lane 34), and it was not detectable in cancer cells derived from other tissues.
That is, BST1_ASV is not expressed in normal pancreas, and since expression is recognized in the pancreas only after canceration, it can be determined that it can be used as a tumor marker specific to pancreatic cancer.
参考文献
Adkinsら, Mol Cell Proteomics. 12:947-955,
2002
Anderson及びAnderson, Mol Cell Proteomics.
11:845-867, 2002
Ausubelら, Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, New
York. 1987
Beckerら, Methods. Enzymol., 194:182-184,
1990
Bondanszkyら, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York 1996
Chen及びOkayama, BioTechniques. 6:632-638, 1988
Cohenら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114, 1972
Elroy-Stein及びMoss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6743-6747, 1990
Eppsteinら, Proc Natl Acad Sci USA. 82:3688-6892, 1985
Gennaroら: The science and practice of pharmacy. Lippincott, Williams &
Wilkins, Philadelphia, PA. 2000
Godingら, Academic Press, San Diego. 492 pp. 1996
Harlow及びLane, Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor. 726 pp, 1988
Harlow及びLane, Using antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory PRess, Cold Spring Harbor, New York. 1999
Hinnenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75：1929-1933, 1978
Hirataら, FEBS Lett. 19: 356: 244-248, 1994
Hwangら, Proc Natl Acad Sci USA. 77:4030-4034, 1980
Itohら, J. Bacteriol., 153:163-168, 1983
Ishiharaら, Int. Immunol. 8: 1395-1404, 1996
Ishikawaら, J. Clin. Oncol., 28:723-728, 1998
Jonesら, Nature. 321:522-525, 1986
Kaishoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5325-5329, 1994
Kozborら, J Immunol. 133:3001-3005, 1984
Martin及びPapahadjopoulos, J Biol Chem. 257:286-288, 1982
Milsteinら, Nature. 305:537-540, 1983
Morrisonら, Genetically engineered antibody molecules and their application.
Ann NY Acad Sci. 507:187-198, 1987
Prestaら, Curr Opin Biotechnol. 3:394-398, 1992
Riechmannら, Nature. 332:323-327, 1988
Sambrook, J. Molecular cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. 1989
Schadeら, The production of avian (egg yold) antibodies: IgY. The report and
recommendations of ECVAM workshop. Alternatives to Laboratory Animals (ATLA).
24:925-934, 1996
Schook, L.B. 1987. Monoclonal antibody production techniques and
applications. Marcel Dekker, Inc., New York. 336 pp.
Schroederら, The peptide, Academic Press, New York 1965
Shigekawa及びDower BioTechniques. 6:742-751, 1988
Verhoeyen及びWinter Science 239:1534-1536,
1988
References
Adkins et al., Mol Cell Proteomics. 12: 947-955,
2002
Anderson and Anderson, Mol Cell Proteomics.
11: 845-867, 2002
Ausubel et al., Current protocols in molecular biology.John Wiley & Sons, New
York. 1987
Becker et al., Methods. Enzymol., 194: 182-184,
1990
Bondanszky et al., Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York 1996
Chen and Okayama, BioTechniques. 6: 632-638, 1988
Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114, 1972
Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6743-6747, 1990
Eppstein et al., Proc Natl Acad Sci USA. 82: 3688-6892, 1985
Gennaro et al: The science and practice of pharmacy. Lippincott, Williams &
Wilkins, Philadelphia, PA. 2000
Goding et al., Academic Press, San Diego. 492 pp. 1996
Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor. 726 pp, 1988
Harlow and Lane, Using antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory PRess, Cold Spring Harbor, New York. 1999
Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933, 1978
Hirata et al., FEBS Lett. 19: 356: 244-248, 1994
Hwang et al., Proc Natl Acad Sci USA. 77: 4030-4034, 1980
Itoh et al., J. Bacteriol., 153: 163-168, 1983
Ishihara et al., Int. Immunol. 8: 1395-1404, 1996
Ishikawa et al., J. Clin. Oncol., 28: 723-728, 1998
Jones et al., Nature. 321: 522-525, 1986
Kaisho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5325-5329, 1994
Kozbor et al., J Immunol. 133: 3001-3005, 1984
Martin and Papahadjopoulos, J Biol Chem. 257: 286-288, 1982
Milstein et al., Nature. 305: 537-540, 1983
Morrison et al., Genetically engineered antibody molecules and their application.
Ann NY Acad Sci. 507: 187-198, 1987
Presta et al., Curr Opin Biotechnol. 3: 394-398, 1992
Riechmann et al., Nature. 332: 323-327, 1988
Sambrook, J. Molecular cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. 1989
Schade et al., The production of avian (egg yold) antibodies: IgY. The report and
recommendations of ECVAM workshop. Alternatives to Laboratory Animals (ATLA).
24: 925-934, 1996
Schook, LB 1987. Monoclonal antibody production techniques and
applications. Marcel Dekker, Inc., New York. 336 pp.
Schroeder et al., The peptide, Academic Press, New York 1965
Shigekawa and Dower BioTechniques. 6: 742-751, 1988
Verhoeyen and Winter Science 239: 1534-1536,
1988
本発明により、癌の中でも早期発見が困難であった膵臓癌の検診において、特異的な検出マーカーを提供することが可能となる。また、本発明の腫瘍マーカーを利用することで、膵臓癌特異的に制癌化合物などを送達することも可能となり、膵臓癌における新たな治療法をも提供し得る。 According to the present invention, it is possible to provide a specific detection marker in screening for pancreatic cancer, which was difficult to detect at an early stage among cancers. In addition, by using the tumor marker of the present invention, it becomes possible to deliver an anticancer compound and the like specifically for pancreatic cancer, and a new therapeutic method for pancreatic cancer can also be provided.
Claims (12)
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示される配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓癌細胞に特異的に存在するポリペプチド A BST1_ASV polypeptide or a salt thereof comprising the following polypeptide (a) or (b):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the sequence represented by SEQ ID NO: 2 and specifically present in pancreatic cancer cells
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013003625A3 (en) * | 2011-06-28 | 2013-09-06 | Oxford Biotherapeutics Ltd. | Antibodies to adp-ribosyl cyclase 2 |
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| CN111971091A (en) * | 2018-04-13 | 2020-11-20 | 柏林化学股份公司 | anti-BST 1 antibodies for prevention or treatment of myelodysplastic syndrome |
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013003625A3 (en) * | 2011-06-28 | 2013-09-06 | Oxford Biotherapeutics Ltd. | Antibodies to adp-ribosyl cyclase 2 |
| JP2014522645A (en) * | 2011-06-28 | 2014-09-08 | オックスフォード ビオトヘラペウトイクス エルティーディー． | Antibody to ADP ribosyl cyclase 2 |
| US9175092B2 (en) | 2011-06-28 | 2015-11-03 | Oxford Biotherapeutics Ltd | Antibodies to bone marrow stromal antigen 1 |
| US9447178B2 (en) | 2011-06-28 | 2016-09-20 | Oxford Biotherapeutics Ltd. | Therapeutic and diagnostic target |
| US9732160B2 (en) | 2011-06-28 | 2017-08-15 | Oxford Biotherapeutics Ltd | Methods of treating acute myeloid leukemia with antibodies to bone marrow stromal antigen 1 |
| EA031181B1 (en) * | 2011-06-28 | 2018-11-30 | Оксфорд Байотерепьютикс Лтд. | Antibody or an antigen binding fragment thereof that specifically binds to bst1, nucleic acids encoding chains thereof, host cell and method provided for making this antibody and use thereof for treating cancer and inflammatory diseases |
| US10239956B2 (en) | 2011-06-28 | 2019-03-26 | Oxford Biotherapeutics Ltd | Nucleic acid encoding bone marrow stromal antigen 1 antibody |
| KR102058185B1 (en) | 2011-06-28 | 2019-12-20 | 옥스포드 바이오테라퓨틱스 리미티드 | Antibodies to adp-ribosyl cyclase 2 |
| US10982005B2 (en) | 2011-06-28 | 2021-04-20 | Oxford Biotherapeutics Ltd | Antibodies to bone marrow stromal antigen 1 |
| CN111971091A (en) * | 2018-04-13 | 2020-11-20 | 柏林化学股份公司 | anti-BST 1 antibodies for prevention or treatment of myelodysplastic syndrome |
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