KR100678523B1 - A method for identifying an agonist or an inhibitor of a pro840 polypeptide - Google Patents

Abstract

인간을 포함한 포유동물의 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 자극하거나 억제하는 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 본원의 조성물로 진단, 예방 또는 치료할 수 있는 질환에는 창상과 같은 외상, 다양한 암, 및 죽상경화증과 심비대증을 포함한 혈관 질환이 포함된다. 또한, 본 발명은 신규 폴리펩티드, 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본원은 이 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열에 결합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. Disclosed are compositions and methods for stimulating or inhibiting angiogenesis and / or cardiovascularization in mammals, including humans. Diseases that can be diagnosed, prevented or treated with the compositions herein include traumas such as wounds, various cancers, and vascular diseases including atherosclerosis and cardiac hypertrophy. The invention also relates to novel polypeptides and nucleic acid molecules encoding the polypeptides. Also provided herein are vectors and host cells comprising this nucleic acid sequence, chimeric polypeptide molecules comprising a polypeptide of the invention bound to a heterologous polypeptide sequence, an antibody binding to a polypeptide of the invention, and a method of making a polypeptide of the invention. To provide.

혈관신생, 심혈관형성, PRO 폴리펩티드  Angiogenesis, Cardiovascularization, PRO Polypeptides

Description

PRO840 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제의 확인 방법{A METHOD FOR IDENTIFYING AN AGONIST OR AN INHIBITOR OF A PRO840 POLYPEPTIDE}A METHOD FOR IDENTIFYING AN AGONIST OR AN INHIBITOR OF A PRO840 POLYPEPTIDE}

도 1은 천연 서열 PRO179 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 1은 본원에서 "DNA16451-1388"로 지칭되는 클론이다.1 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO179 cDNA (SEQ ID NO: 1), wherein SEQ ID NO: 1 is a clone referred to herein as "DNA16451-1388".

도 2는 도 1에 나타낸 서열 1의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 2)를 나타낸다.2 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG.

도 3은 천연 서열 PRO238 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 3)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 3는 본원에서 "DNA35600-1162"로 지칭되는 클론이다.3 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO238 cDNA (SEQ ID NO: 3), wherein SEQ ID NO: 3 is a clone referred to herein as "DNA35600-1162".

도 4는 도 3에 나타낸 서열 3의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 4)를 나타낸다.4 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG.

도 5는 천연 서열 PRO364 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 5)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 5는 본원에서 "DNA47365-1206"으로 지칭되는 클론이다.5 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO364 cDNA (SEQ ID NO: 5), wherein SEQ ID NO: 5 is a clone referred to herein as “DNA47365-1206”.

도 6은 도 5에 나타낸 서열 5의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 6)를 나타낸다.FIG. 6 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 5 shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 6).

도 7은 천연 서열 PRO844 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 7)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 7은 본원에서 "DNA59838-1462"로 지칭되는 클론이다.FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO844 cDNA (SEQ ID NO: 7), wherein SEQ ID NO: 7 is a clone referred to herein as “DNA59838-1462”.

도 8은 도 7에 나타낸 서열 7의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서 열 8)를 나타낸다.8 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 7 shown in FIG.

도 9는 천연 서열 PRO846 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 9)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 9은 본원에서 "DNA44196-1353"으로 지칭되는 클론이다.9 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO846 cDNA (SEQ ID NO: 9), wherein SEQ ID NO: 9 is a clone referred to herein as "DNA44196-1353".

도 10은 도 9에 나타낸 서열 9의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 10)를 나타낸다.FIG. 10 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 9 shown in FIG.

도 11은 천연 서열 PRO1760 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 11)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 11은 본원에서 "DNA76532-1702"로 지칭되는 클론이다.FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1760 cDNA (SEQ ID NO: 11), wherein SEQ ID NO: 11 is a clone referred to herein as "DNA76532-1702".

도 12는 도 11에 나타낸 서열 11의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 12)를 나타낸다.FIG. 12 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 11 shown in FIG.

도 13은 천연 서열 PRO205 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 13)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 13은 본원에서 "DNA30868"로 지칭되는 클론이다.FIG. 13 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO205 cDNA (SEQ ID NO: 13), wherein SEQ ID NO: 13 is a clone referred to herein as "DNA30868".

도 14는 도 13에 나타낸 서열 13의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 14)를 나타낸다.FIG. 14 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 13 shown in FIG.

도 15는 천연 서열 PRO321 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 15)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 15는 본원에서 "DNA34433"으로 지칭되는 클론이다.15 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO321 cDNA (SEQ ID NO: 15), wherein SEQ ID NO: 15 is a clone referred to herein as "DNA34433".

도 16은 도 15에 나타낸 서열 15의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 16)를 나타낸다.FIG. 16 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 15 shown in FIG.

도 17은 천연 서열 PRO333 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 17)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 17은 본원에서 "DNA41374"로 지칭되는 클론이다.FIG. 17 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO333 cDNA (SEQ ID NO: 17), wherein SEQ ID NO: 17 is a clone referred to herein as “DNA41374”.

도 18은 도 17에 나타낸 서열 17의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 ( 서열 18)를 나타낸다.FIG. 18 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 17 shown in FIG. 17 (SEQ ID NO: 18).

도 19는 천연 서열 PRO840 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 19)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 19는 본원에서 "DNA53987"로 지칭되는 클론이다.FIG. 19 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO840 cDNA (SEQ ID NO: 19), wherein SEQ ID NO: 19 is a clone referred to herein as "DNA53987".

도 20은 도 19에 나타낸 서열 19의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 20)를 나타낸다.FIG. 20 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 19 shown in FIG. 19 (SEQ ID NO: 20).

도 21은 천연 서열 PRO877 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 21)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 21은 본원에서 "DNA58120"으로 지칭되는 클론이다.FIG. 21 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO877 cDNA (SEQ ID NO: 21), wherein SEQ ID NO: 21 is a clone referred to herein as "DNA58120".

도 22는 도 21에 나타낸 서열 21의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 22)를 나타낸다.FIG. 22 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 21 shown in FIG. 21 (SEQ ID NO: 22).

도 23은 천연 서열 PRO878 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 23)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 23는 본원에서 "DNA58121"로 지칭되는 클론이다.FIG. 23 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO878 cDNA (SEQ ID NO: 23), wherein SEQ ID NO: 23 is a clone referred to herein as "DNA58121".

도 24는 도 23에 나타낸 서열 23의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 24)를 나타낸다.FIG. 24 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 23 shown in FIG. 23 (SEQ ID NO: 24).

도 25는 천연 서열 PRO879 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 25)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 25는 본원에서 "DNA58122"로 지칭되는 클론이다.25 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO879 cDNA (SEQ ID NO: 25), wherein SEQ ID NO: 25 is a clone referred to herein as "DNA58122".

도 26은 도 25에 나타낸 서열 25의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 26)를 나타낸다.FIG. 26 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 25 shown in FIG. 25 (SEQ ID NO: 26).

도 27은 천연 서열 PRO882 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 27)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 27은 본원에서 "DNA58125"로 지칭되는 클론이다.FIG. 27 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO882 cDNA (SEQ ID NO: 27), wherein SEQ ID NO: 27 is a clone referred to herein as "DNA58125".

도 28은 도 27에 나타낸 서열 27의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 ( 서열 28)를 나타낸다.FIG. 28 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 27 shown in FIG. 27 (SEQ ID NO: 28).

도 29는 천연 서열 PRO885 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 29)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 29은 본원에서 "DNA58128"로 지칭되는 클론이다.FIG. 29 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO885 cDNA (SEQ ID NO: 29), wherein SEQ ID NO: 29 is a clone referred to herein as “DNA58128”.

도 30은 도 29에 나타낸 서열 29의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 30)를 나타낸다.FIG. 30 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 29 shown in FIG. 29 (SEQ ID NO: 30).

도 31은 천연 서열 PRO887 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 31)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 31은 본원에서 "DNA58130"으로 지칭되는 클론이다.FIG. 31 shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO887 cDNA (SEQ ID NO: 31), wherein SEQ ID NO: 31 is a clone referred to herein as "DNA58130".

도 32는 도 31에 나타낸 서열 31의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 32)를 나타낸다.FIG. 32 shows an amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 31 shown in FIG. 31 (SEQ ID NO: 32).

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A. 심장 질환 및 인자A. Heart Disease and Factors

약 5백만명의 미국인이 심부전을 앓고 있고, 해마다 약 400,000명의 심부전 환자가 새로 발생한다. 심부전은 미국에서 65세 이상의 사람이 입원하는 가장 높은 빈도의 단일 원인이다. 최근에, 급성 심근경색을 비롯한 급성 심장 질환의 진보된 관리 결과, 결국 만성 심부전으로 발전될 환자 집단이 팽창되고 있음을 알 수 있다. 1979년부터 1995년까지, 울혈성 심부전 (CHF)으로 인한 입원은 377,000명에서 872,000명으로 늘었고 (130% 증가), CHF로 인한 사망은 116% 증가되었다.About 5 million Americans have heart failure, and about 400,000 new heart failure patients occur each year. Heart failure is the single most common cause of hospitalization in people over 65 years of age in the United States. Recently, as a result of advanced management of acute heart disease, including acute myocardial infarction, it can be seen that the patient population is eventually expanding, which will eventually develop into chronic heart failure. From 1979 to 1995, hospitalizations for congestive heart failure (CHF) increased from 377,000 to 872,000 (130% increase), and CHF deaths increased 116%.

CHF는 좌심실 기능저하, 감소된 운동 내성, 손상된 삶의 질 및 매우 단축된 수명에 의해 특징지워지는 증후군이다. 심부전의 필수 조건은 심장이 체조직의 대사 요구를 총족시키기에 충분한 속도로 혈액을 펌프할 수 없다는 점 (달리 말하면 불충분한 심박출량)이다.CHF is a syndrome characterized by left ventricular dysfunction, reduced locomotor tolerance, impaired quality of life and very short lifespan. An essential condition for heart failure is that the heart cannot pump blood at a rate sufficient to meet the metabolic demands of body tissues (in other words, insufficient cardiac output).

심부전 환자의 심박출량을 상승시키는 데 있어서, 말초혈관수축, 증가된 심박수, 증가된 심수축성 및 증가된 혈장량을 비롯하여 적어도 4가지 주요 보충 기작이 활성화된다. 이들 효과는 교감신경계 및 레닌-안지오텐신계에 의해 주로 매개된다 (Eichlorn, American Journal of Medicine, 104: 163-169 (1998) 참조). 교감신경계로부터의 증가된 출량은 혈관긴장도, 심박수 및 수축성을 증가시킨다. 안지오텐신 II는 1) 혈관 평활근 수축을 직접 자극시키고, 2) 알도스테린 및 항이뇨 호르몬 분비를 자극하여 혈장량의 팽창을 촉진시키고, 3) 교감-매개 혈관긴장도를 자극시키고, 4) 혈관확장 활성 및 나트륨이뇨 활성을 나타내는 브래디키닌(Bradykinin)의 분해를 촉매함으로써 혈압을 상승시킨다 (Review by Brown and Vaughan, Circulation. 97: 1411-1420 (1998) 참조). 아래에 기재한 바와 같이, 안지오텐신 II는 근세포 괴사 (수축 기능을 손상시킴) 및 심장내섬유증 (이완 기능을 손상시키고, 몇몇 경우에서는 수축 기능을 손상시킴)을 촉진시킴으로써 심장에 대해 직접적으로 유해한 영향을 줄 수도 있다 (Weber, Circulation, 96: 4065-4082 (1998) 참조).In elevating cardiac output in heart failure patients, at least four major supplemental mechanisms are activated, including peripheral vasoconstriction, increased heart rate, increased cardiac contractility, and increased plasma volume. These effects are mainly mediated by the sympathetic nervous system and the renin-angiotensin system (see Eichlorn, American Journal of Medicine, 104: 163-169 (1998)). Increased output from the sympathetic nervous system increases vascular tone, heart rate and contractility. Angiotensin II 1) directly stimulates vascular smooth muscle contraction, 2) stimulates aldosterin and antidiuretic hormone secretion to promote swelling of plasma volume, 3) stimulates sympathetic-mediated vasospasm, 4) vasodilatory activity and Increases blood pressure by catalyzing the breakdown of Bradykinin, which exhibits natriuretic activity (see Review by Brown and Vaughan, Circulation. 97: 1411-1420 (1998)). As described below, angiotensin II directly affects the heart by facilitating myocyte necrosis (damaging contractile function) and intracardiac fibrosis (damaging relaxation function and in some cases impairing contractile function). (Weber, Circulation, 96: 4065-4082 (1998)).

울혈성 심부전 (CHF)의 일관성 있는 특징은 심장비대, 즉 기계적 자극 및 호르몬 자극에 의해 활성화되어 심장이 증가된 심박출량에 대한 수요에 적응할 수 있게 하는 심장의 이완이다 (Morgan and Baker. Circulation, 83: 13-25 (1991) 참조). 이 비대 반응은 고혈압, 대동맥협착증, 심근경색증, 심근병증, 판역류증 및 심장내단락과 같은 다양한 병리학적 증상 (이들은 모두 만성 혈액동력학적 과부하를 초래함)와 종종 관련되어 있다.A consistent feature of congestive heart failure (CHF) is cardiac hypertrophy, or cardiac relaxation, which is activated by mechanical and hormonal stimuli, allowing the heart to adapt to the demand for increased cardiac output (Morgan and Baker. Circulation, 83). : 13-25 (1991)). This hypertrophy reaction is often associated with a variety of pathological symptoms, all of which lead to chronic hemodynamic overload, such as hypertension, aortic stenosis, myocardial infarction, cardiomyopathy, valve reflux and intracardiac short circuits.

비대증은 일반적으로 종양 형성을 수반하지 않는 천연 증식과는 다른, 기간 또는 구조의 크기 증가로 정의된다. 심장의 비대증은 개별 세포 (근세포)의 질량의 증가, 또는 조직을 구성하는 세포 수의 증가 (과다형성), 또는 둘다의 증가로 인한 것이다. 배아 (embryo) 심장의 이완은 주로 근세포 수의 증가 (이것은 생후까지만 지속됨)에 달려 있는 반면, 생후 심근세포는 증식 능력을 상실한다. 개별 세포의 비대증을 통해 추가 증식이 일어난다.Hypertrophy is generally defined as an increase in the size of a period or structure, unlike natural proliferation that does not involve tumorigenesis. Hypertrophy of the heart is due to an increase in the mass of individual cells (muscle cells), or an increase in the number of cells constituting tissue (hyperplasia), or both. Relaxation of the embryo heart mainly depends on an increase in the number of myocytes (which lasts only after birth), whereas postnatal cardiomyocytes lose their proliferative capacity. Further proliferation occurs through hypertrophy of individual cells.

성숙 근세포의 비대증은 개별 근섬유에 가해지는 부하를 감소시키므로 손상된 심장 기능에 대한 단기 반응으로서 초기에는 유익하다. 그러나, 장기간 지속되는 심한 과부하로 인해 비대화된 세포가 퇴화되기 시작하고 결국 사멸한다 (Katz, "Heart Failure", in A.M. ed., Physiology of the Heart (New York: Raven Press, 1992) pp. 638-668). 심비대증은 심부전의 임상 경과에 있어서의 사망 및 이환에 영향을 주는 상당한 위험 인자이다 (Katz, Trends Cardiovasc. Med., 5: 37-44 (1995)). 심비대증의 원인 및 병리학에 대해 좀더 자세한 내용은 예를 들어, 문헌 (Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (W.B. Saunders Co., 1998), Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure")을 참조한다.Hypertrophy of mature myocytes is initially beneficial as a short-term response to impaired heart function because it reduces the load on individual muscle fibers. However, due to prolonged severe overload, hypertrophic cells begin to degenerate and eventually die (Katz, "Heart Failure", in AM ed., Physiology of the Heart (New York: Raven Press, 1992) pp. 638- 668). Cardiac hypertrophy is a significant risk factor affecting mortality and morbidity in the clinical course of heart failure (Katz, Trends Cardiovasc. Med., 5: 37-44 (1995)). For more information on the causes and pathologies of cardiac hypertrophy, see, for example, Heart Disease.A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (WB Saunders Co., 1998), Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure. See ").

세포 수준에서, 심장은 근세포와 일반적으로 비근세포라고 불리는 주변 지지세포로 구성되어 있다. 비근세포는 주로 섬유아세포/중간엽세포이지만 내피세포 및 평활근 세포도 포함한다. 실제로, 근세포가 대부분의 성숙 심근 덩어리를 구성하더라도 이들은 심장에 존재하는 총 세포수의 약 30%만을 차지한다. 성숙 심실 근세포는 호르몬 자극, 생리적인 자극, 혈액동력학적인 자극 및 병리적인 자극에 반응하여 비대 과정의 활성화를 통해 증가된 과부하에 적응할 수 있다. 이 반응의 특징은 동시다발적인 세포 분열, 및 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP)의 유전자를 비롯한 배아 유전자의 활성화 없이 근세포 크기가 증가되고 개별 심근세포의 수축성 단백질 함량이 증가되는 것이다 (Chien et al., FASEB J., 5: 3037-3046 (1991); Chien et al., Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95 (1993)). 세포외 매트릭스내, 및 심근내 관상동맥 주변에 있는 간질 콜라겐의 축적과 관련된 근세포 크기의 증가 결과로서 심근 질량이 증가한 것은 압력 과부하로 인한 인간의 좌심실 비대증에서 보고된 바 있다 (Caspari et al., Cardiovasc. Res., 11: 554-558 (1997); Schwarz et al., Am. J. Cardiol., 42: 895-903 (1978); Hess et al., Circulation, 63: 360-371 (1981); Pearlman et al., Lab. Invest., 46: 158-164 (1982)).At the cellular level, the heart is made up of myocytes and surrounding supporting cells, commonly called non-myocytes. Non-myocytes are predominantly fibroblasts / mesenchymal cells but also include endothelial cells and smooth muscle cells. In fact, even if myocytes make up most mature myocardial masses, they make up only about 30% of the total number of cells in the heart. Mature ventricular myocytes can adapt to increased overload through activation of hypertrophy processes in response to hormonal stimulation, physiological stimulation, hemodynamic stimulation and pathological stimulation. This response is characterized by increased myocyte size and increased contractile protein content of individual cardiomyocytes without simultaneous cell division and activation of embryonic genes, including genes of atrial natriuretic peptide (ANP) (Chien et al., FASEB J., 5: 3037-3046 (1991); Chien et al., Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95 (1993)). An increase in myocardial mass as a result of an increase in myocyte size associated with the accumulation of interstitial collagen in the extracellular matrix and around the myocardial coronary artery has been reported in human ventricular hypertrophy due to pressure overload (Caspari et al., Cardiovasc). Res., 11: 554-558 (1997); Schwarz et al., Am. J. Cardiol., 42: 895-903 (1978); Hess et al., Circulation, 63: 360-371 (1981); Pearlman et al., Lab. Invest., 46: 158-164 (1982)).

또한, 비근세포를 지지하는 세포에 의해 생성되는 측분비 인자도 심비대증의 발달에 관여할 수 있다고 제안된 바 있고, 다양한 비근세포로부터 생성된 비대 인자 (예를 들어, 백혈구 억제 인자 (LIF) 및 엔도텔린)도 확인되었다 (Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173 (1992); Kurzrock et al., Endocrine Reviews, 12: 208-217 (1991); Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2863-2867 (1989); Yanagisawa and Masaki, Trends Pharm. Sci., 10: 374-378 (1989); 미국 특허 제5,573,762호 (1996년 11월 12일 간행)). 심비대증의 잠재적인 매개자로 확인된 예시적인 추가 인자로는 카디오트로핀-1 (CT-1) (Pennica et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146 (1995)), 카테콜아민, 아드레노코르티코스테로이 드, 안지오텐신, 프로스타글란딘이 있다. It has also been suggested that lateral secretion factors produced by cells that support non-myocytes may also be involved in the development of cardiac hypertrophy, including hypertrophy factors (eg, leukocyte inhibitory factor (LIF) and Endothelin) (Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173 (1992); Kurzrock et al., Endocrine Reviews, 12: 208-217 (1991); Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci) USA, 86: 2863-2867 (1989); Yanagisawa and Masaki, Trends Pharm. Sci., 10: 374-378 (1989); US Pat. No. 5,573,762 (published November 12, 1996). Exemplary additional factors identified as potential mediators of cardiac hypertrophy include cardiotropin-1 (CT-1) (Pennica et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146 (1995)) , Catecholamines, adrenocorticosteroids, angiotensin, prostaglandins.

현재, 심비대증의 치료는 원인이 되는 심질환에 따라 다양하다. 카테콜아민, 아드레노코르티코스테로이드, 안지오텐신, 프로스타글란딘, LIF, 엔도텔린 (엔도텔린-1, -2 및 -3와 빅 엔도텔린을 포함함) 및 CT-1은 비대증의 잠재적인 매개자로 확인된 인자들이다. 예를 들어, 베타-아드레날린성 수용체 차단 약물 (베타-차단제, 예를 들어, 프로프라노롤, 티모롤, 테르타롤올, 카르테오롤, 나도롤, 베타소롤, 펜부토롤, 아세토부토롤, 아테노롤, 메토프로롤 및 카르베디롤 등) 및 베라파밀은 비대성 심근병증의 치료에 광범위하게 사용되어 왔다. 증상 (예: 가슴 통증) 및 운동 내성에 대한 베타-차단제의 유익한 효과는 주로 심박수의 감소와 그에 따르는 이완기의 연장 및 증가된 수동 심실 충만에 기인한다 (Thompson et al., Br. Heart J., 44: 488-98 (1980); Harrison et al., Circulation., 29: 84-98 (1964)). 베라파밀은 심실 충만을 향상시키고, 심근 허혈을 감소시킬 가능성이 있는 것으로 기재된 바 있다 (Bonow et al., Circulation, 72: 853-64 (1985)).Currently, the treatment of cardiac hypertrophy varies with the underlying heart disease. Catecholamines, adrenocorticosteroids, angiotensin, prostaglandins, LIF, endothelin (including endothelin-1, -2 and -3 and big endothelin) and CT-1 are factors identified as potential mediators of hypertrophy. For example, beta-adrenergic receptor blocking drugs (beta-blockers, for example propranolol, timolol, terrolol, carteolol, nadorol, betasolol, fenbutolol, acetobutorol, athe Norol, metoprolol and carvedilol) and verapamil have been widely used in the treatment of hypertrophic cardiomyopathy. The beneficial effects of beta-blockers on symptoms (eg chest pain) and exercise tolerance are mainly due to a decrease in heart rate and subsequent prolongation of diastolic and increased passive ventricular filling (Thompson et al., Br. Heart J., 44: 488-98 (1980); Harrison et al., Circulation., 29: 84-98 (1964)). Verapamil has been described as having the potential to improve ventricular filling and reduce myocardial ischemia (Bonow et al., Circulation, 72: 853-64 (1985)).

니페디핀 및 딜티아젬도 비대성 심근병증의 치료에 종종 사용된 바 있다 (Lorell et al., Circulation, 65: 499-507 (1982); Betocchi et al., Am. J. Cardiol., 78: 451-457 (1996)). 그러나, 니페디핀은 그의 강력한 혈관확장성 때문에 특히 배출 장애를 앓는 환자에게 해로울 수 있다. 디이소피라미드는 그의 수축력 감소성 때문에 증상을 완화시키는 데 사용된 바 있다 (Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999 (1982)). 그러나, 많은 환자에서 초기 효과가 시간에 따라 감소한다 (Wigle et al., Circulation., 92: 1680-1692 (1995)). 항고혈압성 약물 치료법은 상승된 혈압과 관련된 심비대증에 유익한 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다. 단독으로, 또는 배합되어 항고혈압 치료법에 사용되는 약물의 예로는 칼슘 길항제, 예를 들어, 니트렌디핀; 아드레날린성 수용체 차단제, 예를 들어, 상기 기재된 것들; 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴과 같은 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제; 이뇨제, 예를 들어, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로로펜아미드, 아세타졸아미드 및 인다파미드; 및 칼슘 채널 차단제, 예를 들어, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 및 니카르디핀이 있다.Nifedipine and diltiazem have also been used frequently for the treatment of hypertrophic cardiomyopathy (Lorell et al., Circulation, 65: 499-507 (1982); Betocchi et al., Am. J. Cardiol., 78: 451- 457 (1996)). However, nifedipine can be particularly harmful to patients suffering from drainage disorders because of its strong vasodilatability. Diisopyramid has been used to relieve symptoms because of its diminished contractility (Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999 (1982)). However, in many patients the initial effect decreases with time (Wigle et al., Circulation., 92: 1680-1692 (1995)). Antihypertensive drug therapies have been reported to have beneficial effects on cardiac hypertrophy associated with elevated blood pressure. Examples of drugs used alone or in combination to treat antihypertensive therapy include calcium antagonists such as nirenedipine; Adrenergic receptor blockers such as those described above; Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors such as quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril and ricinopril; Diuretics such as chlorothiazide, hydrochlorothiazide, hydroflumethazide, methylclothiazide, benzthiazide, dichlorophenamide, acetazolamide and indamide; And calcium channel blockers such as diltiazem, nifedipine, verapamil and nicardipine.

예를 들어, 딜티아젬 및 캡토프릴으로 고혈압을 치료하면 좌심실근 질량이 감소하고, 이완 기능의 도플러 (Doppler) 지수가 정상화되지 않았다 (Szlachcic et al., Am. J. Cardiol., 63: 198-201 (1989); Shahi et al., Lancet, 336: 458-461 (1990)). 이러한 발견은 과량의 간질 콜라겐이 좌심실 비대증의 퇴행 후에 남아 있을 수 있음을 나타내는 것으로 해석되었다 (Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992)). 상기 로시 (Rossi) 등은 실험 래트의 압력 과부하성 심비대증에서 심근세포비대증 및 간질 섬유증의 예방 및 퇴행에 대한 캡토프릴의 효과를 조사하였다. For example, treatment of hypertension with diltiazem and captopril reduces left ventricular muscle mass and did not normalize Doppler index of relaxation function (Szlachcic et al., Am. J. Cardiol., 63: 198). -201 (1989); Shahi et al., Lancet, 336: 458-461 (1990)). This finding was interpreted to indicate that excess interstitial collagen may remain after degeneration of left ventricular hypertrophy (Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992)). Rossi et al. Investigated the effect of captopril on the prevention and regression of cardiomyocyte hyperplasia and interstitial fibrosis in pressure overload cardiac hypertrophy in experimental rats.

심수축성을 직접 증가시키는 물질(근수축제)은 단기간에 심박출량을 향상시키기 때문에 처음에는 심부전을 앓는 환자에 효과적일 것으로 생각되었다. 그러나, 디고시제닌을 제외한 모든 근수축력 증가제는 단기간 동안 심장 기능을 향상시킨다고 하더라도, 장기간 동안 사망률을 증가시키는 것으로 밝혀진 바 있다 (Massie, Curr. Op. in Cardiology, 12: 209-217 (1997); Reddy et al., Curr. Opin. Cardiol., 12: 233-241 (1997)). 최근에 베타-아드레날린성 수용체 차단제는 심부전에 사용하도록 추천된 바 있다. 보고된 환자 생존률의 향상은 아직 입증되지 않았지만, 임상 시험의 연구 결과로부터 사망률을 증가시키지 않으면서 심장 기능을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한, CHF의 치료에 있어서 카디오트로핀-1 또는 그의 길항제, 또는 증식 호르몬 및(또는) 인슐린-유사 증식 인자-I의 용도에 관해서는 미국 특허 제5,935,924호, 제5,624,806호, 제5,661,122호 및 제5,610,134호와 WO 95/28173를 참조한다. 또다른 치료 방법은 심장이식이지만, 이것은 공여자 심장의 입수가능성에 의해 제한된다. A substance that directly increases cardiac contractility (muscular contractile) was initially thought to be effective in patients with heart failure because it improved cardiac output. However, all muscle contractile agents, except digoxigenin, have been shown to increase mortality for a long time, even if it improves cardiac function for a short time (Massie, Curr. Op. In Cardiology, 12: 209-217 (1997) Reddy et al., Curr. Opin.Cardiol., 12: 233-241 (1997)). Recently, beta-adrenergic receptor blockers have been recommended for use in heart failure. Although reported improvements in patient survival have not yet been demonstrated, studies from clinical trials suggest that cardiac function can be improved without increasing mortality. In addition, US Pat. Nos. 5,935,924, 5,624,806, 5,661,122 and 5 for the use of cardiotropin-1 or its antagonists, or proliferation hormones and / or insulin-like proliferation factor-I in the treatment of CHF. See 5,610,134 and WO 95/28173. Another treatment method is heart transplantation, but this is limited by the availability of the donor heart.

엔도텔린은 돼지 동맥의 내피세포 배양 상등액으로부터 단리되어 구조적으로 확인된, 21개의 아미노산을 포함하는 혈관수축 펩티드이다 (Yanagisawa et al., Nature, 332: 411-415 (1988)). 엔도텔린은 나중에 다양한 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 엔도텔린 길항제로서의 엔도텔린 항체는 심근경색증, 신부전 및 기타 질환의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 엔도텔린은 생체내에 존재하고 혈관수축 작용을 나타내기 때문에, 순환계의 조절에 관여하는 내인성 인자인 것으로 기대되고 있고, 고혈압, 심근경색증과 같은 심혈관 질환, 및 급성 신부전과 같은 신장 질환과 관련되어 있을 수 있다. 엔도텔린 길항제는 예를 들어, 미국 특허 제5,773,414호; 일본 특허 공개 제3130299/1991호; 유럽 특허 제457,195호; 유럽 특허 제460,679호; 및 유럽 특허 제552,489호에 기재되어 있다. 엔도텔린 수용체 길항제를 확인하기 위한 신규 엔도텔린 B 수용체는 미국 특허 제5,773,223호에 기재 되어 있다.Endothelin is a vasoconstrictive peptide comprising 21 amino acids, structurally isolated from the endothelial cell culture supernatant of porcine arteries (Yanagisawa et al., Nature, 332: 411-415 (1988)). Endothelin was later found to exhibit a variety of actions, and endothelin antibodies as endothelin antagonists have proven effective in the treatment of myocardial infarction, kidney failure and other diseases. Because endothelin is present in vivo and exhibits vasoconstrictive action, it is expected to be an endogenous factor involved in the regulation of the circulatory system and may be associated with cardiovascular diseases such as hypertension, myocardial infarction, and kidney diseases such as acute renal failure. have. Endothelin antagonists are described, for example, in US Pat. No. 5,773,414; Japanese Patent Laid-Open No. 3130299/1991; European Patent No. 457,195; European Patent No. 460,679; And European Patent 552,489. New endothelin B receptors for identifying endothelin receptor antagonists are described in US Pat. No. 5,773,223.

심부전에 대한 현재 치료법은 주로 캡토프릴과 같은 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 및 이뇨제를 사용하는 것이다. 이들 약물은 혈액동력학적 프로필 및 운동 내성을 향상시키고, CHF를 앓는 환자의 이환률 및 사망률을 감소시킨다 (Kramer et al., Circulation, 67(4): 807-816 (1983); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C., 2(4): 755-763 (1983): The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1435 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302 (1991)). 또한, 상기 약물은 고혈압, 좌심실 기능저하, 죽상경화성 혈관질환 및 당뇨병성 신병증을 치료하는 데 유용하다 (상기 Brown 및 Vaughan). 그러나, 입증된 효능에도 불구하고 ACE 억제제에 대한 반응은 제한되어 있다. 예를 들어, ACE 억제제는 심부전의 치료에 있어서 생존 기간을 연장시키면서 말기 심부전을 향한 진행을 늦추는 듯하지만, ACE 억제제로 치료받는 상당수의 환자가 기능성 클래스 III 심부전을 앓는다.Current treatments for heart failure are primarily the use of angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors such as captopril and diuretics. These drugs improve hemodynamic profile and exercise resistance and reduce morbidity and mortality in patients with CHF (Kramer et al., Circulation, 67 (4): 807-816 (1983); Captopril Multicenter Research Group, JACC, 2 (4): 755-763 (1983): The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316 (23): 1429-1435 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J Med., 325 (5): 293-302 (1991). The drug is also useful for treating hypertension, left ventricular dysfunction, atherosclerotic vascular disease and diabetic nephropathy (Brown and Vaughan). However, despite proven efficacy, the response to ACE inhibitors is limited. For example, ACE inhibitors appear to slow progression to end-stage heart failure in prolonging survival in the treatment of heart failure, but many patients treated with ACE inhibitors suffer from functional class III heart failure.

게다가, 기능성 및 운동 시간의 개선은 작을 뿐이고 사망률은 비록 감소되기는 하지만 여전히 높다 (CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1453 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302 (1991); Cohn et al., N. Engl. J. Med., 325(5): 303-310 (1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259(4): 539-544 (1988)). 그러므로, ACE 억제제는 60% 이상의 심부전 환자에서 일관성 있게 증상을 완화시킬 수 없는 듯하고 심부전의 사망률을 약 15-20%까지만 감소시키는 듯하다. 다른 부 작용은 상기 문헌 (Brown 및 Vaughan)을 참조한다.In addition, improvements in functionality and exercise time are only small and mortality rates are still high, although reduced (CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316 (23): 1429-1453 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325 (5): 293-302 (1991); Cohn et al., N. Engl. J. Med., 325 (5): 303-310 (1991); The Captopril- Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259 (4): 539-544 (1988)). Therefore, ACE inhibitors seem to be unable to consistently relieve symptoms in more than 60% of heart failure patients and only reduce the mortality rate of heart failure by about 15-20%. For other side effects see Brown and Vaughan, supra.

ACE 억제제에 대한 대안은 특정한 AT1 수용체 길항제에 의해 나타난다. 심혈관 질환 및 신장 질환의 치료에 있어서 이들 두 가지 방법의 효능을 비교하기 위해 임상 연구를 계획한다. 그러나, 동물 모델 데이타는 ACE/Ang II 경로가 심비대증에 분명히 관여하지만 심비대증에서 활성인 유일한 경로 또는 주요 경로가 아니라는 것을 제시하고 있다. 마우스 유전 "넉아웃" 모델은 상기 경로의 개별 성분을 시험하기 위해 만들어졌다. Ang II에 대한 주요 심장 수용체인 AT 서브 1A가 유전적으로 결실된 상기 한 모델에서, 이들 마우스는 AngII가 실험적으로 주어지는 경우 비대증을 발전시키지 않았다 (Ang II로 인한 비대증이 없음을 확신시켜 주는 기초적인 성공 모델임). 그러나, 대동맥이 이들 동물 (고혈압성 심장 스트레스 모델)에서 수축되는 경우, 심장은 여전히 비대하게 된다. 이것은 상기 수용체 (AT s서브 1A)에 의존하지 않는 별도의 신호 경로가 고혈압에서 활성화된다는 것을 암시한다. ACE 억제제는 이들 경로를 억제할 수 없는 것으로 추측된다 (Harada et al., Circulation, 97: 1952-1959 (1998) 참조). 또한, 심비대증의 과정 및 기작과 관련된 수수께끼에 관해서는 문헌 (Homcy, Circulation, 97: 1890-1892 (1998))을 참조한다. Alternatives to ACE inhibitors are indicated by specific AT1 receptor antagonists. Clinical studies are planned to compare the efficacy of these two methods in the treatment of cardiovascular and renal disease. However, animal model data suggest that the ACE / Ang II pathway is clearly involved in cardiac hypertrophy but is not the only or major pathway active in cardiac hypertrophy. Mouse genetic "knockout" models were created to test the individual components of the pathway. In this model where genetically deleted AT sub-1A, the major cardiac receptor for Ang II, these mice did not develop hypertrophy when AngII was given experimentally (basic success assuring there was no hypertrophy due to Ang II). Model). However, if the aorta is contracted in these animals (hypertensive cardiac stress model), the heart is still enlarged. This suggests that a separate signaling pathway that does not depend on the receptor (AT ssub 1A) is activated in hypertension. It is speculated that ACE inhibitors cannot inhibit these pathways (see Harada et al., Circulation, 97: 1952-1959 (1998)). See also Hommy, Circulation, 97: 1890-1892 (1998) for mysteries related to the process and mechanisms of cardiac hypertrophy.

약 750,000명의 환자가 해마다 급성 심근경색증 (AMI)를 앓고, 대략 미국인의 모든 사망 원인의 4분의 1이 AMI이다. 최근에, 혈전용해제, 예를 들어, 스트렙토키나제, 유로키나제 및 특히 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)는 심근경색증을 앓는 환자의 생존률을 상당히 증가시켰다. t-PA가 1.5시간 내지 4시간에 걸친 연속적인 정맥내 주입으로 투여된 경우, t-PA는 치료받은 환자의 69% 내지 90%에서 90분에 관상 개방성을 나타낸다 (Topol et al., Am. J. Cardiol., 61, 723-728 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 12: 581-587 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 14: 1566-1569 (1989)). 가장 높은 개방률은 고용량 또는 가속화된 투약 처방시 보고된 바 있다 (Topol et al., J. Am. Coll. Cardiol., 15: 922-924 (1990)). 또한, t-PA는 단회 볼루스로tj 투여될 수 있지만, 상대적으로 짧은 반감기 때문에 관주 치료법에 보다 더 적합하다 (Tebbe et al., Am. J. Cardiol., 64: 448-453 (1989)). t-PA 변이체, 구체적으로는 보다 긴 반감기와 보다 높은 피브린 특이성을 나타내도록 디자인된 t-PA 변이체인 TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA t-PA 변이체, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674 (1994))는 특히 볼루스 투여에 적합하다. 그러나, 이들 모든 진보에도 불구하고 환자 생존의 장기간 예후는 심비대증의 관찰 및 치료를 포함하는, 환자의 경색 후 관찰 및 치료에 주로 달려 있다.About 750,000 patients suffer from acute myocardial infarction (AMI) each year, and approximately one quarter of all deaths in Americans are AMI. Recently, thrombolytics such as streptokinase, urokinase and especially plasminogen activator (t-PA) have significantly increased the survival of patients with myocardial infarction. When t-PA was administered as a continuous intravenous infusion over 1.5 to 4 hours, t-PA showed coronary opening at 90 minutes in 69% to 90% of treated patients (Topol et al., Am. J. Cardiol., 61, 723-728 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 12: 581-587 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol. 14: 1566-1569 (1989). The highest open rates have been reported with high or accelerated dosage regimens (Topol et al., J. Am. Coll. Cardiol., 15: 922-924 (1990)). In addition, t-PA can be administered as a single bolus but is more suitable for irrigation therapy because of its relatively short half-life (Tebbe et al., Am. J. Cardiol., 64: 448-453 (1989)). . t-PA variants, specifically TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR (296-299) AAAA t-PA variants, Keyt et al, which are t-PA variants designed to show longer half-life and higher fibrin specificity) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674 (1994)) are particularly suitable for bolus administration. However, despite all these advances, the long-term prognosis of patient survival depends largely on the post-infarction observation and treatment of the patient, including the observation and treatment of cardiac hypertrophy.

B. 증식 인자B. Growth Factor

보고된 바에 의하면 다양한 천연 발생 폴리펩티드는 내피세포의 증식을 유도한다. 이들 폴리펩티드 중에는 염기성 및 산성 섬유아세포 증식 인자 (FGF) (Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989)), 혈소판-유도 내피세포 증식 인자 (PD-ECGF) (Ishikawa et al., Nature, 338: 557 (1989)) 및 혈관 내피세포 증식 인자 (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989); Ferrara and Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161: 851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198 (1989); EP 471, 754B (1996년 7월 31일 특허 결정)가 있다. It has been reported that various naturally occurring polypeptides induce proliferation of endothelial cells. Among these polypeptides are basic and acidic fibroblast growth factor (FGF) (Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989)), platelet-induced endothelial cell growth factor (PD-ECGF) (Ishikawa et al., Nature, 338: 557 (1989)) and vascular endothelial cell growth factor (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989); Ferrara and Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161: 851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198 (1989); EP 471, 754B (July 31, 1996 patent decision).

인간 VEGF (hVEGF) cDNA로 형질감염된 세포를 포함하는 배지는 모세혈관 내피세포의 증식을 촉진한 반면, 대조구 세포는 촉진하지 못하였다 (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989)). 여러 가지 추가 cDNA가 hVEGF의 121-, 189- 및 206-아미노산 동종체 (집합적으로 hVEGF-관련 단백질로도 불림)를 코딩하는 cDNA 라이브러리에서 확인되었다. 121-아미노산 단백질은 hVEGF의 잔기 116과 159사이에 44개 아미노산이 결실되었다는 점에서 hVEGF와 상이하다. 189-아미노산 단백질은 hVEGF의 잔기 116에서 24개 아미노산이 삽입됨으로써 hVEGF와 상이하며, 인간 혈관 투과성 인자 (hVPF)와 명백히 동일하다. 206-아미노산 단백질은 hVEGF의 잔기 116에서 41개 아미노산이 삽입됨으로써 hVEGF와 상이하다 (Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell Biochem., 47: 211(1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews, 13: 18(1992); Keck et al., Science, 246: 1309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem., 264: 20017 (1989); EP 370,989 (1990년 5월 30일 공개됨)).Medium containing cells transfected with human VEGF (hVEGF) cDNA promoted proliferation of capillary endothelial cells, whereas control cells did not (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989)). Several additional cDNAs have been identified in cDNA libraries encoding 121-, 189- and 206-amino acid homologues of hVEGF (collectively also called hVEGF-related proteins). The 121-amino acid protein differs from hVEGF in that 44 amino acids were deleted between residues 116 and 159 of hVEGF. The 189-amino acid protein differs from hVEGF by inserting 24 amino acids at residue 116 of hVEGF and is clearly identical to human vascular permeability factor (hVPF). The 206-amino acid protein differs from hVEGF by inserting 41 amino acids at residue 116 of hVEGF (Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell Biochem., 47 : 211 (1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews, 13: 18 (1992); Keck et al., Science, 246: 1309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem., 264: 20017 (1989); EP 370,989 (published May 30, 1990).

현재, 기존 내피로부터의 새로운 혈관의 형성을 수반하는 혈관신생이 다양한 질환의 발병기전에 관여한다는 것은 잘 확립되어 있다. 이들은 고형 종양 및 전이; 죽상경화증; 수정체후부 섬유증식증; 혈관종; 만성 염증; 증식성 망막병증 예컨대, 당뇨병성 망막병증과 같은 안내 신생혈관 증후군; 연령 관련 황반 퇴화증 (AMD); 신생혈관 녹내장; 이식된 각막 조직 및 기타 조직의 면역 거부; 류마티스성 관절염; 및 건선을 포함한다 (Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991); and Garner A., "Vascular Diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease, A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 제2판 (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710).At present, it is well established that angiogenesis involving the formation of new blood vessels from existing endothelium is involved in the pathogenesis of various diseases. These include solid tumors and metastases; Atherosclerosis; Posterior capsular fibrosis; Hemangioma; Chronic inflammation; Intraocular neovascular syndromes such as proliferative retinopathy such as diabetic retinopathy; Age-related macular degeneration (AMD); Neovascular glaucoma; Immune rejection of transplanted corneal tissue and other tissues; Rheumatoid arthritis; And psoriasis (Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991); and Garner A., "Vascular Diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease, A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710).

종양 증식의 경우, 혈관신생은 이상증식에서 종양으로 전이하는 데, 그리고 영양분을 증식하는 고형 종양에 공급하는 데 결정적인 역할을 하는 듯하다 (Folkman et al., Nature, 339: 58(1998)). 혈관신생은 정상 세포와 비교할 때 종양 세포가 증식 잇점 및 증식 자율성을 획득하게 한다. 따라서, 종양 절편의 미세혈관 밀도와, 유방암 뿐만 아니라 여러 가지 다른 암에 있어서의 환자 생존률 사이에 연관성이 관찰된 바 있다 (Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992)).In the case of tumor proliferation, angiogenesis appears to play a decisive role in metastasis from aberrant proliferation and in feeding nutrients to proliferating solid tumors (Folkman et al., Nature, 339: 58 (1998)). Angiogenesis allows tumor cells to acquire proliferation benefits and proliferation autonomy when compared to normal cells. Thus, an association has been observed between the microvascular density of tumor sections and patient survival in breast cancer as well as in several other cancers (Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992).

혈관신생의 양성 조절자를 검색한 결과, aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, 안지오제닌, IL-8 등을 포함한 많은 후보가 확인되었다 (상기 Folkman et al., J.B.C., 및 상기 Klagsbrun et al.,). 지금까지 확인된 음성 조절자에는 트롬보스판딘 (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628 (1990)), 프로락틴의 N-말단 단편 (16-킬로달톤) (Clapp et al., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), 안지오스타틴 (O'Reily et al., Cell, 79: 315-328 (1994)) 및 엔도스타틴 (O'Reily et al., Cell, 88: 277-285 (1996))이 포함된다.Searching for positive modulators of angiogenesis revealed a number of candidates, including aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, angiogenin, IL-8, and the like (Folkman et al., Supra). JBC, and Klagsbrun et al., Supra. Negative regulators identified to date include thrombospandine (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628 (1990)), the N-terminal fragment of prolactin (16-kilodalton) (Clapp et al., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), angiostatin (O'Reily et al., Cell, 79: 315-328 (1994)) and endostatin (O'Reily et al., Cell, 88: 277-285 (1996)).

최근 몇 년간의 연구 결과, 혈관 내피세포 증식을 자극시키는 데 뿐만 아니라 혈관 투과성 및 혈관신생을 유도하는 데 있어서 VEGF의 핵심 역할이 확립되었다 (Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)). 심지어 단일 VEGF 대립유전자의 손실이 배아에 치명적이라는 발견은 혈관계의 발달 및 분화에 있어서 이 인자가 하는 대체불가능한 역할을 암시한다. 게다가, VEGF는 종양 및 안내 질환과 관련된 혈관신생의 핵심 매개자로 보인다 (상기 Ferrara et al., Endocr. Rev.). VEGF의 mRNA는 조사한 인간 종양의 대다수에 의해 과발현된다 (Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol., 26: 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)).Recent studies have established a key role of VEGF in stimulating vascular endothelial cell proliferation, as well as inducing vascular permeability and angiogenesis (Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)). Even the discovery that loss of a single VEGF allele is fatal to the embryo suggests an irreplaceable role for this factor in the development and differentiation of the vascular system. In addition, VEGF appears to be a key mediator of angiogenesis associated with tumors and intraocular diseases (Ferrara et al., Endocr. Rev., supra). MRNA of VEGF is overexpressed by the majority of human tumors investigated (Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol., 26: 86-91 ( 1995); Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)).

또한, 안액내 VEGF의 농도 수준은 당뇨병성 망막병증 및 기타 허혈-관련 망막병증을 앓는 환자 혈관의 활발한 증식과 밀접하게 관련되어 있다 (Aiello et al., N. Engl. J. Med., 331: 1480-1487 (1994)). 게다가, 최근 연구는 AMD에 걸린 환자의 맥락 신생혈관막에서 VEGF의 국소화를 입증하였다 (Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37: 855-868 (1996)).In addition, the concentration levels of VEGF in ocular fluids are closely related to the active proliferation of blood vessels in patients with diabetic retinopathy and other ischemia-related retinopathy (Aiello et al., N. Engl. J. Med., 331: 1480-1487 (1994)). In addition, recent studies have demonstrated the localization of VEGF in the choroidal neovascular membrane of patients with AMD (Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37: 855-868 (1996)).

항-VEGF 중성화 황체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양세포주의 증식을 억제하고 (Kim et al., Nature, 362: 841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest., 95: 1789-1797 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res., 56: 4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res., 56: 921-924 (1996)), 허혈성 망막 질환의 모델에서 안내 혈관신생을 억제하기도 한다 (Adamis et al., Arch. Ophthalmol., 114: 66-71 (1996)). 그러므로, 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 VEGF 활성의 다른 억제제는 고형 종양 및 다양한 안내 혈관신생성 질환의 치료용 물질일 가능성이 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 1998년 1월 14에 공개된 유럽 특허 제817,648호 및 1998년 4월 3일 출원된 PCT/US98/06724에 기재되어 있다. Anti-VEGF neutralized corpus luteum inhibits proliferation of various human tumor cell lines in nude mice (Kim et al., Nature, 362: 841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest., 95: 1789) -1797 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res., 56: 4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res., 56: 921-924 (1996)), guidance in a model of ischemic retinal disease It also inhibits angiogenesis (Adamis et al., Arch. Ophthalmol., 114: 66-71 (1996)). Therefore, anti-VEGF monoclonal antibodies or other inhibitors of VEGF activity are likely to be substances for the treatment of solid tumors and various intraocular angiogenic diseases. Such antibodies are described, for example, in European Patent No. 817,648 published on January 14, 1998 and PCT / US98 / 06724, filed April 3, 1998.

일부 세포에 의해 발현되는 유전자 세트를 신속히 유도할 수 있는, 형질전이 종양유전자를 비롯한 여러 가지 다른 증식 인자 및 미토겐 (mitogen)이 존재한다 (Lau and Nathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6: 152-202 (1991)). 즉시-조기 유전자 또는 조기-반응 유전자라고 불리는 이들 유전자는 새로운 단백질 합성과는 독립적으로 증식 인자 및 미토겐과 접촉한 후 수분 내에 전사 활성화된다. 이들 즉시-조기 유전자 군은 분화 및 증식, 재생, 및 창상 치유와 같은 다양한 생물학적 과정의 조정에 필요한 세포외 분비 단백질을 코딩한다 (Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 233-235 (1991)).There are several other growth factors and mitogens, including transgenic oncogenes, which can quickly induce a set of genes expressed by some cells (Lau and Nathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6: 152-). 202 (1991)). These genes, called immediate-early or early-response genes, are transcriptionally activated within minutes after contact with proliferative factors and mitogen, independent of new protein synthesis. These immediate-early gene families encode extracellular secretory proteins required for the coordination of various biological processes such as differentiation and proliferation, regeneration, and wound healing (Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 233-235 (1991) )).

이 군에 속하는 매우 관련된 단백질에는 cef10 (Simmons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1178-1182 (1989)); 혈청 또는 혈소판-유도 증식 인자 (PDGF)에 의해 신속히 활성화되는 cyr61 (O'Brien et al., Mol. Cell Biol., 10: 3569-3577 (1990)); 형질전이 증식 인자 베타 (TGF-β)에 의해 활성화된 후 인간 혈관 내피세포에 의해 고농도로 분비되어 PDGF-유사 생물학적 및 면역학적 활성을 나타내고, 특정한 세포 표면 수용체(fisp-12 (Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 235-233 (1991))에 대해 PDGF와 경쟁하는 인간 결합 조직 증식 인자 (CTGF) (Bradham et al., J. Cell. Biol., 114: 1285-1294 (1991)); 인간 혈관 IBP-유사 증식 인자 (VIGF) (WO 96/17931); 및 골수아세포증-관련-바이러스-타입-1-유도 신모세포종에서 과발현되는 것으로 확인된, 정상적으로 성숙 신장 세포에 억류되어 있는 nov가 포함된다 (Joloit et al., Mol. Cell Biol., 12: 10-21 (1992)).Highly related proteins belonging to this group include cef 10 (Simmons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1178-1182 (1989)); Cyr 61 (O'Brien et al., Mol. Cell Biol., 10: 3569-3577 (1990)), which is rapidly activated by serum or platelet-induced growth factor (PDGF); Transformation is activated by proliferation factor beta (TGF-β) and then secreted by human vascular endothelial cells at high concentrations to show PDGF-like biological and immunological activity, and specific cell surface receptors ( fisp- 12 (Ryseck et al., Human Connective Tissue Growth Factor (CTGF) Competing with PDGF for Cell Growth Differ., 2: 235-233 (1991) (Bradham et al., J. Cell. Biol., 114: 1285-1294 (1991)) Human blood vessels IBP-like proliferation factor (VIGF) (WO 96/17931); and nov normally detained in mature kidney cells found to be overexpressed in myeloblastosis-associated-virus-type-1-induced blastoma (Joloit et al., Mol. Cell Biol., 12: 10-21 (1992)).

이들 즉시-조기 유전자의 발현은 증식 인자에 의해 일어나는 단계적 연쇄 반응에서 '제3 메신저"로 작용한다. 또한, 상기 유전자는 세포 증식이 공통 사건인 분화 및 창상 치유와 같은 복합적인 생물학적 과정을 통합하고 조정하는 데 필요한 것으로 생각된다.Expression of these immediate-early genes acts as a 'third messenger' in the cascaded chain reactions caused by proliferative factors, which also integrate complex biological processes such as differentiation and wound healing where cell proliferation is a common event. I think it is necessary to adjust.

추가적인 미토겐으로서 인슐린-유사 증식 인자 결합 단백질 (IGFBP)은 인슐린-유사 증식 인자 (IGF)와의 결합체로 섬유아세포 및 평활근 세포 표면 수용체와 IGF의 결합 증가를 자극하는 것으로 확인되었다 (Clemmons et al., J. Clin. Invest., 77: 1548 (1986)). 시험관내에서 다양한 IGF 작용에 대한 IGFBP의 억제 효과로는 지방세포에 의한 글루코스 수송의 자극, 연골세포에 의한 술페이트 혼입, 및 섬유아세포에 있어서의 티미드 혼입이 있다 (Zapf et al., J. Clin. Invest., 63: 1077 (1979)). 또한, 정상 세포에서 증식 인자-매개 미토겐 활성에 대한 IGFBP의 억제 효과가 나타났다.Insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) as an additional mitogen has been shown to stimulate increased binding of IGF to fibroblast and smooth muscle cell surface receptors in combination with insulin-like growth factor (IGF) (Clemmons et al., J. Clin. Invest., 77: 1548 (1986)). Inhibitory effects of IGFBP on various IGF actions in vitro include stimulation of glucose transport by adipocytes, sulfate incorporation by chondrocytes, and thymid incorporation in fibroblasts (Zapf et al., J. Clin. Invest., 63: 1077 (1979)). In addition, the inhibitory effect of IGFBP on proliferative factor-mediated mitogen activity in normal cells was shown.

C. 추가 치료에 대한 필요성C. Need for additional treatment

많은 질환 및 장애에 있어서 혈관 내피세포 증식 및 혈관신생의 역할을 볼 때, 이들 과정을 야기하는 한 가지 이상의 생물학적 효과를 감소 또는 억제시키는 방법이 있는 것이 바람직하다. 또한, 정상 및 질환 상태, 및 특히 암에서 병원성 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 있는 것이 바람직하다. 추가로, 특정한 측면에서, 심비대증의 치료에 일반적으로 적용가능한 치료법이 없기 때문에, 심근세포 비대증을 예방 또는 감소시킬 수 있는 인자의 확인은 병리생리학적 심장 증식을 억제하는 신규 치료법의 개발에 있어서 1차적으로 중요하다. 다양한 심혈관 질환 및 종양 질환을 위한 여러 가지 치료법이 있지만 추가적인 치료법이 여전히 필요하다.Given the role of vascular endothelial cell proliferation and angiogenesis in many diseases and disorders, it is desirable to have a method of reducing or inhibiting one or more biological effects that cause these processes. It is also desirable to have a method for detecting the presence of pathogenic polypeptides in normal and disease states, and particularly in cancer. In addition, in certain aspects, the identification of factors that can prevent or reduce cardiomyocyte hypertrophy, because there are no therapies generally applicable to the treatment of cardiac hypertrophy, may be useful in the development of new therapies that inhibit pathophysiological cardiac proliferation. It is important for me. There are many therapies for various cardiovascular and tumor diseases, but additional therapies are still needed.

<발명의 요약>Summary of the Invention

A. 실시양태A. Embodiments

따라서, 본 발명은 포유동물의 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 촉진 또는 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 일부 생물학적 활성의 촉진 및 억제를 시험하는 다양한 심혈관 검정에서 양성으로 시험된 단백질의 확인을 기초로 한다. 따라서, 본 단백질은 혈관신생의 촉진 또는 억제, 혈관 내피세포 증식의 억제 또는 자극, 혈관 내피세포의 증식 또는 증식의 자극, 종양 증식의 억제, 혈관신생-의존성 조직 증식의 억제, 혈관신생-의존성 조직 증식의 자극, 심비대증의 억제 및 심비대증의 자극과 같은 효과가 필요한 질환의 치료 (예방을 포함함) 및 진단, 예를 들어, 울혈성 심부전의 치료에 유용한 약물인 것으로 생각된다.Accordingly, the present invention relates to compositions and methods for promoting or inhibiting angiogenesis and / or cardiovascularization in mammals. The present invention is based on the identification of proteins tested positive in various cardiovascular assays that test for the promotion and inhibition of some biological activity. Thus, the present protein may promote or inhibit angiogenesis, inhibit or stimulate vascular endothelial cell proliferation, stimulate vascular endothelial cell proliferation or stimulation, suppress tumor growth, inhibit angiogenesis-dependent tissue proliferation, angiogenesis-dependent tissue. It is believed to be a useful drug for the treatment (including prevention) and diagnosis of diseases requiring effects such as stimulation of proliferation, inhibition of cardiac hypertrophy and stimulation of cardiac hypertrophy, for example, treatment of congestive heart failure.

한 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 PRO 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활 성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 PRO 폴리펩티드는 저장 안정성을 높이기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 PRO 폴리펩티드의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적합할 것이다. In one embodiment, the present invention provides a composition comprising a PRO polypeptide in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. In one aspect, the composition comprises a therapeutically effective amount of the polypeptide. In another aspect, the composition comprises additional active ingredients, namely cardiovascular agents, endothelial cell agents or angiogenesis or angiogenesis inhibitors, preferably angiogenesis or angiogenesis inhibitors. Preferably, the composition is sterile. The PRO polypeptide can be administered in the form of a preservable liquid pharmaceutical formulation to enhance storage stability. Preserved liquid pharmaceutical formulations may contain multiple doses of the PRO polypeptide and will therefore be suitable for repeated use.

추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.In a further embodiment, the present invention provides a method of making said composition useful for the treatment of cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease, comprising mixing a therapeutically effective amount of a PRO polypeptide with a pharmaceutically acceptable carrier. .

또다른 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 아고니스트 또는 길항제를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제, 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제는 저장 안정성을 높이기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적합할 것이다. In another embodiment, the present invention provides a composition comprising an agonist or antagonist of a PRO polypeptide in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. In one aspect, the composition comprises a therapeutically effective amount of agonist or antagonist. In another aspect, the composition comprises an additional active ingredient, namely a cardiovascular agent, an endothelial cell agent or an angiogenesis agent, or an angiogenesis inhibitor, preferably an angiogenesis agent or an angiogenesis inhibitor. Preferably, the composition is sterile. The PRO polypeptide agonist or antagonist may be administered in the form of a preservable liquid pharmaceutical formulation to enhance storage stability. Preserved liquid pharmaceutical formulations may contain multiple doses of a PRO polypeptide agonist or antagonist and would be suitable for repeated use.

추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량 의 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. In a further embodiment, the present invention provides a composition for the preparation of said composition useful for the treatment of cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease, comprising mixing a pharmaceutically acceptable carrier with a therapeutically effective amount of a PRO polypeptide agonist or antagonist. Provide a method.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 항-PRO 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 항체를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제, 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 조성물은 저장 안정성을 높이기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 항-PRO 항체의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적합할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 인간화된 항체 또는 단일쇄 항체이다.In another embodiment, the present invention relates to a composition comprising an anti-PRO antibody in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. In one aspect, the composition comprises a therapeutically effective amount of the antibody. In another aspect, the composition comprises an additional active ingredient, namely a cardiovascular agent, an endothelial cell agent or an angiogenesis agent, or an angiogenesis inhibitor, preferably an angiogenesis agent or an angiogenesis inhibitor. Preferably, the composition is sterile. The composition may be administered in the form of a preservable liquid pharmaceutical formulation to enhance storage stability. Preserved liquid pharmaceutical formulations may contain multiple doses of anti-PRO antibody and would be suitable for repeated use. In a preferred embodiment, the antibody is a monoclonal antibody, antibody fragment, humanized antibody or single chain antibody.

추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량의 항-PRO 항체를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. In a further embodiment, the invention provides a method of preparing said composition useful for the treatment of cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease, comprising mixing a pharmaceutically acceptable carrier with a therapeutically effective amount of an anti-PRO antibody. to provide.

추가 측면에서, 본 발명은 In a further aspect, the present invention

(a) PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 물질 조성물;(a) a substance composition comprising a PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof;

(b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및(b) a container containing said composition; And

(c) 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 있어서 상기 PRO 폴리펩티드, 또는 상기 PRO 폴리펩티드에 결합하는 항체일 수 있는 그의 아고니스트 또는 길항제의 용도를 언급하는, 상기 용기에 부착된 표지 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물(c) a label attached to said container, which refers to the use of said PRO polypeptide, or an agonist or antagonist thereof, which may be an antibody binding to said PRO polypeptide in the treatment of cardiovascular disease, endothelial disease or angiogenic disease or Package Inserts Included in the Container

을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함할 수 있다.To provide a product comprising a. The composition may comprise a therapeutically effective amount of the PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 In another embodiment, the present invention

(a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; 및(a) contacting the cell with a test compound to be screened under conditions suitable to induce a cellular response normally induced by the PRO polypeptide; And

(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계 (여기서, 상기 세포 반응의 유도는 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트라는 표시임)(b) confirming the induction of the cellular response to determine whether the test compound is an effective agonist, wherein the induction of the cellular response is an indication that the test compound is an effective agonist.

를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 아고니스트를 확인하는 방법을 제공한다.Provided is a method for identifying an agonist of a PRO polypeptide.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 In another embodiment, the present invention

(a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드에 의한 세포 증식의 자극에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; 및(a) contacting the cell with a test compound to be screened under conditions suitable for stimulation of cell proliferation by the PRO polypeptide; And

(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제인지를 결정하기 위해 상기 세포의 증식을 측정하는 단계 (여기서, 세포 증식의 자극은 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제라는 표시임)(b) measuring the proliferation of the cell to determine if the test compound is an effective antagonist, wherein stimulation of cell proliferation is an indication that the test compound is an effective antagonist

를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 길항제를 확인하는 방법을 제공한다.It provides a method of identifying an antagonist of a PRO polypeptide.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 시험 화합물과 폴리펩티드가 상호작용하는 조건하에서 시험 화합물을 충분한 시간동안 PRO 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 상기 PRO 폴리펩티드의 활성이 억제되지를 확인하는 단계를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 특정 측면에서, 상기 시험 화합물 또는 PRO 폴리펩티드는 고형 지지체 상에 부착되어 있다. 또다른 바람직한 측면에서, 부착되지 않은 성분은 탐지가능한 표지를 수반한다. 바람직한 측면에서, 본 방법은 In another embodiment, the present invention comprises contacting a test compound with a PRO polypeptide for a sufficient time under conditions that the test compound interacts with the polypeptide, and confirming that the activity of the PRO polypeptide is not inhibited. Provided are methods for identifying compounds that inhibit the activity of a polypeptide. In certain preferred aspects, the test compound or PRO polypeptide is attached on a solid support. In another preferred aspect, the unattached component carries a detectable label. In a preferred aspect, the method

(a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도된 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건 하에 PRO 폴리펩티드의 존재하에서 접촉시키는 단계; 및(a) contacting a cell with a test compound to be screened in the presence of a PRO polypeptide under conditions suitable for inducing a cellular response normally induced by the PRO polypeptide; And

(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계 (b) confirming the induction of the cellular response to determine whether the test compound is an effective agonist

를 포함한다.It includes.

또다른 바람직한 측면에서, 본 방법은 In another preferred aspect, the method

a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드에 의한 세포 증식의 자극에 적합한 조건하에 PRO 폴리펩티드의 존재하에서 접촉시키는 단계; 및a) contacting the test compound to be screened with the cells in the presence of the PRO polypeptide under conditions suitable for stimulation of cell proliferation by the PRO polypeptide; And

(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제인지를 결정하기 위해 상기 세포의 증식을 측정하는 단계(b) measuring the proliferation of the cells to determine if the test compound is an effective antagonist

를 포함한다.It includes.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 정상적으로 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 PRO 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는 것 으로, 여기서 상기 방법은 시험 화합물과 세포를 접촉시키고, 상기 PRO 폴리펩티드의 발현이 억제되는지를 확인하는 것을 포함한다. 바람직한 측면에서, 이 방법은 In another embodiment, the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits the expression of a PRO polypeptide in cells normally expressing the polypeptide, wherein the method comprises contacting a cell with a test compound and the PRO polypeptide Checking whether expression of is inhibited. In a preferred aspect, this method

(a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 상기 PRO 폴리펩티드의 발현을 허용하기에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; 및(a) contacting a cell with a test compound to be screened under conditions suitable to permit expression of said PRO polypeptide; And

(b) 상기 폴리펩티드의 발현 억제를 확인하는 단계(b) confirming the inhibition of expression of said polypeptide

를 포함한다.It includes.

추가 실시양태에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 확인된 화합물과 같은, PRO 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 제공한다.In a further embodiment, the invention provides compounds which inhibit the expression of PRO polypeptides, such as compounds identified by the above methods.

본 발명의 또다른 측면은 상기 기재한 방법에 의해 임의로 확인될 수 있는 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제에 관한 것이다.Another aspect of the invention relates to agonists or antagonists of PRO polypeptides which can be optionally identified by the methods described above.

상기 PRO 폴리펩티드의 한 가지 이상의 기능 또는 활성을 억제하는 PRO 폴리펩티드의 길항제의 한 유형은 항체이다. 따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 바람직한 측면에서, 상기 항체는 바람직하게는 비인간 상보성-결정-영역 (CDR) 잔기 및 인간 골격-영역 (FR) 잔기를 포함하는 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 표지될 수 있고 고상 지지체 상에 부착될 수 있다. 추가 측면에서, 상기 항체는 항체 단편, 단일쇄 항체 또는 인간화된 항체이다. 바람직하게는, 상기 항체는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.One type of antagonist of a PRO polypeptide that inhibits one or more functions or activities of the PRO polypeptide is an antibody. Thus, in another aspect, the invention provides an isolated antibody that binds to a PRO polypeptide. In a preferred aspect, the antibody is a monoclonal antibody, preferably comprising a non-human complementarity-determining-region (CDR) residue and a human backbone-region (FR) residue. The antibody can be labeled and attached to the solid support. In a further aspect, the antibody is an antibody fragment, single chain antibody or humanized antibody. Preferably, the antibody specifically binds to the polypeptide.

추가 측면에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드 핵산 서열에서 돌연변이의 존재 또는 부재를 확인하는 것을 포함하는, PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 있는 돌연 변이와 관련된 질환 또는 이 질환에 대한 민감성을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 돌연변이의 존재 또는 부재는 상기 질환 또는 상기 질환에 대한 민감성의 존재 또는 부재의 표시이다.In a further aspect, the present invention provides a method for diagnosing a disease or susceptibility to a mutation in a PRO polypeptide-encoding nucleic acid sequence comprising identifying the presence or absence of a mutation in a PRO polypeptide nucleic acid sequence. Wherein the presence or absence of said mutation is an indication of the presence or absence of said disease or susceptibility to said disease.

추가 측면에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플 및 (b) 동일한 세포형의 공지된 정상 조직 세포의 대조구 샘플에서 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현도를 분석하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 대조구 샘플과 비교할 때 시험 샘플의 보다 높은, 또는 보다 낮은 발현도는 상기 포유동물에서 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. 임의로, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현은 대조구 샘플과 비교할 때 시험 샘플에서 mRNA 또는 상기 폴리펩티드의 농도를 측정함으로써 확인할 수 있다. In a further aspect, the invention comprises analyzing the expression level of a gene encoding a PRO polypeptide in (a) a test sample of tissue cells obtained from a mammal and (b) a control sample of known normal tissue cells of the same cell type. The present invention provides a method for diagnosing cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease of a mammal, wherein a higher or lower expression level of a test sample when compared to a control sample is determined by the cardiovascular disease, endothelial cell in the mammal. Indicate the presence of a disease or angiogenic disease. Optionally, expression of the gene encoding a PRO polypeptide can be confirmed by measuring the concentration of mRNA or said polypeptide in a test sample as compared to the control sample.

추가 측면에서, 본 발명은 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플에서 PRO 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 시험 샘플에서 상기 PRO 폴리펩티드의 존재 또는 부재는 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다.In a further aspect, the present invention provides a method of diagnosing cardiovascular, endothelial or angiogenic disease of a mammal comprising detecting the presence or absence of a PRO polypeptide in a test sample of tissue cells obtained from the mammal. Wherein the presence or absence of the PRO polypeptide in the test sample indicates the presence of cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease of the mammal.

추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) 항-PRO 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키는 단계, 및 (b) 시험 샘플에서 상기 항체와 상기 PRO 폴리펩티드 사이의 결합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 결합체의 형성은 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. 상기 검출은 정성적 또는 정량적일 수 있고, 동일한 세포형의 공지된 정상 조직 세포의 대조구 샘플의 결합체 형성을 관찰하면서 비교함으로써 수행한다. 상기 시험 샘플에 형성된 보다 많은, 또는 보다 적은 양의 결합체는 시험 조직 세포가 얻어지는 포유동물에서 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. 바람직하게는, 상기 항체는 탐지가능한 표지를 수반한다. 결합체 형성은 예를 들어, 당분야에 공지된 광학 현미경, 유량 세포측정기 (flow cytometry), 플루오리메트리 (fluorimetry) 또는 다른 기술로 관찰할 수 있다. 상기 시험 샘플은 대개 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 수득한다. In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting conjugate formation between (a) contacting an anti-PRO antibody with a test sample of tissue cells obtained from a mammal, and (b) detecting conjugate formation between the antibody and the PRO polypeptide in the test sample. A method for diagnosing cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease in a mammal, comprising the step of forming a conjugate indicating the presence of cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease in a mammal. . The detection can be qualitative or quantitative and is performed by observing conjugate formation of a control sample of known normal tissue cells of the same cell type. More or less amount of conjugate formed in the test sample indicates the presence of cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease in the mammal from which the test tissue cell is obtained. Preferably, the antibody carries a detectable label. Binder formation can be observed, for example, by optical microscopy, flow cytometry, fluorimetry or other techniques known in the art. The test sample is usually obtained from an individual suspected of having cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 항-PRO 항체에 노출시키고 상기 항체가 상기 샘플의 성분에 결합하는 것을 확인하는 단계를 포함하는, 샘플에서 PRO 폴리펩티드의 존재를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 샘플은 PRO 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 세포를 포함하고, 상기 항체는 상기 세포에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체는 탐지가능하게 표지되어 있고(있거나) 고형 지지체에 부착되어 있다.In another embodiment, the present invention comprises exposing a sample suspected of comprising a PRO polypeptide to an anti-PRO antibody and confirming that the antibody binds to a component of the sample. Provide a way to check. In certain aspects, the sample comprises cells suspected of containing a PRO polypeptide and the antibody binds to the cells. Preferably, the antibody is detectably labeled and / or attached to a solid support.

추가 측면에서, 본 발명은 적당한 포장안에 항-PRO 항체 및 담체를 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환용 진단 키트를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 키트는 PRO 폴리펩티드의 존재를 검출하는 상기 항체를 사용하 기 위한 지시물을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 예를 들어, 완충액이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 암이다.In a further aspect, the present invention provides a diagnostic kit for cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease, comprising an anti-PRO antibody and a carrier in a suitable package. Preferably, such kits further comprise instructions for using the antibody to detect the presence of a PRO polypeptide. Preferably, the carrier is, for example, a buffer. Preferably, the cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease is cancer.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 질환은 심비대증, 창상 또는 화상과 같은 외상, 또는 암 유형이다. 추가 측면에서, 상기 포유동물은 혈관성형술, ACE 억제제 또는 화학요법제 (심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환이 암 유형인 경우)와 같은, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 약물에 노출된다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간, 바람직하게는 심비대증으로 발전할 위험이 있는 인간, 보다 바람직하게는 심근경색증을 앓는 인간이다.In another embodiment, the present invention provides a method of treating a mammalian cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease, comprising administering to a mammal an effective amount of a PRO polypeptide. Preferably, the disease is a type of trauma, such as cardiac hypertrophy, wound or burn, or cancer. In a further aspect, the mammal treats a cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease, such as angioplasty, an ACE inhibitor or a chemotherapeutic agent (if the cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease is a cancer type). Are exposed to the drug. Preferably, the mammal is a human, preferably a human at risk of developing cardiac hypertrophy, more preferably a human suffering from myocardial infarction.

또다른 바람직한 측면에서, 심비대증은 고농도 PGF_2α의 존재에 의해 특징지워진다. 별법으로, 심비대증은 심근경색증에 의해 유도될 수 있는데, 여기서 바람직하게는 상기 PRO 폴리펩티드의 투여는 심근경색 후 48시간내, 보다 바람직하게는 24시간내에 개시된다. In another preferred aspect, cardiac hypertrophy is characterized by the presence of high concentrations of PGF _2α . Alternatively, cardiac hypertrophy can be induced by myocardial infarction, wherein administration of the PRO polypeptide is preferably initiated within 48 hours, more preferably within 24 hours after myocardial infarction.

또다른 바람직한 실시양태에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증이고, 상기 PRO 폴리펩티드는 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제와 함께 투여한다. 이러한 목적에 바람직한 심혈관계 약제, 내피세 포계 약제 또는 혈관형성제는 항고혈압성 약물, ACE 억제제, 엔토텔린 수용체 길항제 및 혈전용해제로 구성된 군에서 선택된다. 혈전용해제를 투여하는 경우, 상기 약제를 투여한 후 PRO 폴리펩티드를 투여하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 혈전용해제는 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성화제이다.In another preferred embodiment, the cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease is cardiac hypertrophy and the PRO polypeptide is administered with a cardiovascular agent, an endothelial cell agent or an angiogenic agent. Preferred cardiovascular, endothelial, or angiogenic agents for this purpose are selected from the group consisting of antihypertensive drugs, ACE inhibitors, entotelin receptor antagonists and thrombolytics. When thrombolytics are administered, it is preferred to administer the PRO polypeptide after administering the agent. More preferably, the thrombolytic agent is a recombinant human tissue plasminogen activator.

또다른 바람직한 측면에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증이고, 급성 심근경색증의 치료를 위해 1차 혈관성형술 후 PRO 폴리펩티드를 투여하는데, 여기서 바람직하게는 상기 포유동물은 혈관성형술, 또는 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제에 추가로 노출시킨다. In another preferred aspect, the cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease is cardiac hypertrophy and the PRO polypeptide is administered after primary angioplasty for the treatment of acute myocardial infarction, wherein the mammal preferably comprises angioplasty, Or further exposed to a cardiovascular agent, an endothelial cell agent or an angiogenic agent.

또다른 바람직한 실시양태에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 암이고, 상기 PRO 폴리펩티드는 화학요법제, 증식 억제제 또는 세포독성제와 함께 투여한다.In another preferred embodiment, the cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease is cancer and the PRO polypeptide is administered in combination with a chemotherapeutic agent, proliferation inhibitor or cytotoxic agent.

추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물이 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 아고니스트와 함께 투여하는 경우가 바람직하다. In a further embodiment, the present invention relates to a method of treating a mammalian cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease comprising administering to a mammal an effective amount of a PRO polypeptide agonist. Preferably, the cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease is cardiac hypertrophy, trauma, cancer or age-related macular degeneration. It is also preferred if the mammal is a human and an effective amount of an angiogenesis or angiogenesis inhibitor is administered with the agonist.

추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물이 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 길항제와 함께 투여하는 경우가 바람직하다. In a further embodiment, the invention relates to a method of treating a mammalian cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease comprising administering to a mammal an effective amount of a PRO polypeptide antagonist. Preferably, the cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease is cardiac hypertrophy, trauma, cancer or age-related macular degeneration. It is also preferred if the mammal is a human and an effective amount of an angiogenesis or angiogenesis inhibitor is administered with the antagonist.

추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-PRO 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물이 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 상기 항체와 함께 투여하는 경우가 바람직하다. In a further embodiment, the present invention relates to a method of treating mammalian cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease, comprising administering to a mammal an effective amount of an anti-PRO antibody. Preferably, the cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disease is cardiac hypertrophy, trauma, cancer or age-related macular degeneration. It is also preferred if the mammal is a human and an effective amount of an angiogenesis or angiogenesis inhibitor is administered with the antibody.

추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 앓는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 유전자는 생체외 유전자 치료법을 통해 투여한다. 바람직한 추가 실시양태에서, 상기 유전자는 벡터, 보다 바람직하게는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터에 포함되어 있다. In a further embodiment, the present invention comprises administering to a mammal a nucleic acid molecule encoding (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide or (c) an antagonist of a PRO polypeptide, cardiovascular disease, endothelial cells A method of treating a mammal suffering from a disease or angiogenic disease, wherein said agonist or antagonist is an anti-PRO antibody. In a preferred embodiment, the mammal is a human. In another preferred embodiment, the gene is administered via ex vivo gene therapy. In a further preferred embodiment, the gene is included in a vector, more preferably an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a lentiviral vector or a retroviral vector.

또다른 측면에서, 본 발명은 본질적으로 프로모터, (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코 딩하는 핵산, 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비용 신호 서열로 이루어진 레트로바이러스 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자를 제공하는 것으로, 여기서 상기 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 구조 단백질과 결합되어 있다. 바람직하게는, 상기 신호 서열은 천연 PRO 폴리펩티드의 신호 서열과 같은 포유동물로부터 유래한 것이다.In another aspect, the invention consists essentially of a promoter, a nucleic acid encoding (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist polypeptide of a PRO polypeptide or (c) an antagonist of a PRO polypeptide, and a cell secretion signal sequence of said polypeptide. To provide a recombinant retrovirus particles comprising a retroviral vector consisting of, wherein the retroviral vector is associated with a retroviral structural protein. Preferably, the signal sequence is from a mammal such as the signal sequence of the native PRO polypeptide.

추가 실시양태에서, 본 발명은 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하고, 본질적으로 프로모터, (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산, 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비용 신호 서열로 이루어진 레트로바이러스 벡터도 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 생체외 생산 세포를 제공하는 것으로, 여기서 상기 생산 세포는 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 상기 구조 단백질과 결합되어 있는 레트로바이러스 벡터를 패키징한다.In a further embodiment, the invention expresses a retroviral structural protein and consists essentially of a nucleic acid encoding a promoter, (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist polypeptide of a PRO polypeptide or (c) an antagonist of a PRO polypeptide, and Provided is an ex vivo production cell comprising a nucleic acid construct comprising a retroviral vector consisting of a cell secretion signal sequence of a polypeptide, wherein the production cell is associated with the structural protein to produce recombinant retroviral particles. Package the viral vector.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 억제되고, 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고 상기 내피세포 증식은 종양 또는 망막질환과 관련되어 있다.In another embodiment, the invention inhibits endothelial cell proliferation of a mammal, comprising administering to the mammal (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. To provide a method wherein the endothelial cell proliferation of the mammal is inhibited and the agonist or antagonist may be an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human and the endothelial cell proliferation is associated with tumor or retinal disease.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함 하는, 포유동물의 내피세포 증식을 자극하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 자극되고 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.In another embodiment, the invention stimulates endothelial cell proliferation of a mammal, comprising administering to the mammal (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. To provide a method, wherein the endothelial cell proliferation of the mammal is stimulated and the agonist or antagonist may be an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 억제하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 억제되고, 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고 상기 심비대증은 심근경색증에 의해 유도된 것이다.In another embodiment, the invention provides a method of inhibiting cardiac hypertrophy in a mammal, comprising administering to the mammal (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. To provide wherein the cardiac hypertrophy of the mammal is inhibited, the agonist or antagonist may be an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human and the cardiac hypertrophy is induced by myocardial infarction.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 자극하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 자극되고 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 울혈성 심부전을 앓는 인간이다.In another embodiment, the invention is a method of stimulating a cardiac hypertrophy of a mammal comprising administering to the mammal (a) a PRO polypeptide, (b) an agonist of a PRO polypeptide or (c) an antagonist of a PRO polypeptide. To provide wherein the mammalian cardiac hypertrophy is stimulated and the agonist or antagonist may be an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human suffering from congestive heart failure.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 항-PRO 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 PRO 폴리펩티드에 의해 유도된 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고, 보다 바람직하게는 상기 포유동물은 종양 또는 망막질환을 앓는다.In another embodiment, the present invention provides a method of inhibiting angiogenesis induced by a PRO polypeptide in a mammal comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of an anti-PRO antibody. Preferably, the mammal is a human, more preferably the mammal suffers from a tumor or a retinal disease.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 PRO 폴리펩티드에 의해 유도된 혈관신 생을 자극하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고, 보다 바람직하게는 혈관신생은 조직 재생 또는 창상 치유를 촉진할 것이다.In another embodiment, the present invention provides a method of stimulating angiogenesis induced by a PRO polypeptide in a mammal, comprising administering a therapeutically effective amount of the PRO polypeptide to the mammal. Preferably, the mammal is a human, more preferably angiogenesis will promote tissue regeneration or wound healing.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882 또는 PRO885 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 억제하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 억제된다.In another embodiment, the present invention provides a method for inhibiting endothelial cell proliferation of a mammal comprising administering a PRO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882, or PRO885 polypeptide or agonist thereof to the mammal. Where the endothelial cell proliferation of the mammal is inhibited.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846 PRO878 또는 PRO879 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 자극하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 자극된다.In another embodiment, the present invention provides a method for stimulating endothelial cell proliferation of a mammal comprising administering a PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846 PRO878 or PRO879 polypeptide or agonist thereof to the mammal. Wherein the endothelial cell proliferation of the mammal is stimulated.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846 PRO878 또는 PRO879 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 억제하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 억제된다.In another embodiment, the present invention provides a method for inhibiting endothelial cell proliferation of a mammal comprising administering to the mammal an antagonist of a PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846 PRO878 or PRO879 polypeptide. Wherein the mammalian endothelial cell proliferation is inhibited.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882 또는 PRO885 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 자극하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 자극된다.In another embodiment, the present invention provides a method for stimulating endothelial cell proliferation in a mammal comprising administering to the mammal an antagonist of a PRO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882 or PRO885 polypeptide. Endothelial cell proliferation in the mammal is stimulated.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO205, PRO882 또는 PRO887 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증 을 유도하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 유도된다.In another embodiment, the present invention provides a method for inducing cardiac hypertrophy of a mammal, comprising administering a PRO205, PRO882, or PRO887 polypeptide or agonist thereof to the mammal, wherein the mammal's heart Hypertrophy is induced.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO238, PRO878 또는 PRO1760 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 감소시키 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 감소된다.In another embodiment, the present invention provides a method for reducing cardiac hypertrophy of a mammal, comprising administering a PRO238, PRO878, or PRO1760 polypeptide or agonist thereof to the mammal, wherein the mammal's heart Hypertrophy is reduced.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO238, PRO878 또는 PRO1760 폴리펩티드 의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 유도하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 유도된다.In another embodiment, the present invention provides a method for inducing cardiac hypertrophy of a mammal, comprising administering to the mammal an antagonist of PRO238, PRO878 or PRO1760 polypeptide, wherein the mammalian cardiac hypertrophy is Induced.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO205, PRO882 또는 PRO887 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 감소시키 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 감소된다.In another embodiment, the present invention provides a method for reducing cardiac hypertrophy of a mammal, comprising administering to the mammal an antagonist of a PRO205, PRO882 or PRO887 polypeptide, wherein the mammal's cardiac hypertrophy is Is reduced.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 항-PRO179, 항-PRO321, 항-PRO840, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO878 또는 항-PRO879 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 또는 PRO879 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈관신생을 억제하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 혈관신생은 억제된다.In another embodiment, the present invention comprises administering to a mammal a therapeutically effective amount of an anti-PRO179, anti-PRO321, anti-PRO840, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO878 or anti-PRO879 antibody. Provided are methods for inhibiting angiogenesis induced by PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 or PRO879 polypeptide, wherein the angiogenesis is inhibited.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 또는 PRO879 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈관신생을 자극하기 위한 방법을 제공 하는 것으로, 여기서 상기 혈관신생은 자극된다.In another embodiment, the present invention provides a method for stimulating angiogenesis induced by a polypeptide comprising administering a therapeutically effective amount of a PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 or PRO879 polypeptide to a mammal. To provide, wherein the angiogenesis is stimulated.

B. 추가 실시양태B. Additional Embodiments

본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.In another embodiment of the invention, the invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide.

한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원의 아미노산 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원의 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 다른 단편을 포함하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타 내는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.In one aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) the full length amino acid sequence disclosed herein, the amino acid sequence herein without a signal peptide, the extracellular domain of the transmembrane protein herein with or without signal peptide, or the full length amino acid disclosed herein. A DNA molecule encoding a PRO polypeptide comprising any other fragment specifically defined, or (b) at least about 80% sequence identity, preferably at least about 81% sequence, to (a) the complement of the DNA molecule Identity, more preferably at least about 82% sequence identity, more preferably at least about 83% sequence identity, more preferably at least about 84% sequence identity, more preferably at least about 85% sequence identity, more preferably At least about 86% sequence identity, more preferably at least about 87% sequence identity, more preferably at least about 88% sequence identity, More preferably at least about 89% sequence identity, more preferably at least about 90% sequence identity, more preferably at least about 91% sequence identity, more preferably at least about 92% sequence identity, more preferably about 93 At least% sequence identity, more preferably at least about 94% sequence identity, more preferably at least about 95% sequence identity, more preferably at least about 96% sequence identity, more preferably at least about 97% sequence identity, more It preferably comprises at least about 98% sequence identity, more preferably at least about 99% sequence identity.

다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 신호 펩티드가 없는 본원의 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원의 막횡단 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인의 코딩 서열, 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 다른 단편의 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.In another aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) the coding sequence of the full-length PRO polypeptide cDNA disclosed herein, the coding sequence of the PRO polypeptide herein without a signal peptide, the extracellular of the transmembrane PRO polypeptide herein with or without signal peptide. At least about 80% sequence identity with a DNA molecule comprising the coding sequence of a domain or the coding sequence of any other fragment specifically defined of the full-length amino acid sequence disclosed herein, or (b) the complement of said (a) DNA molecule , Preferably at least about 81% sequence identity, more preferably at least about 82% sequence identity, more preferably at least about 83% sequence identity, more preferably at least about 84% sequence identity, more preferably about 85% At least% sequence identity, more preferably at least about 86% sequence identity, more preferably at least about 87% sequence identity, more preferred Preferably at least about 88% sequence identity, more preferably at least about 89% sequence identity, more preferably at least about 90% sequence identity, more preferably at least about 91% sequence identity, more preferably at least about 92% Sequence identity, more preferably at least about 93% sequence identity, more preferably at least about 94% sequence identity, more preferably at least about 95% sequence identity, more preferably at least about 96% sequence identity, more preferably Comprises nucleotide sequences that exhibit at least about 97% sequence identity, more preferably at least about 98% sequence identity, more preferably at least about 99% sequence identity.

추가 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의 의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.In a further aspect, the invention provides a DNA molecule encoding the same mature polypeptide as (a) encoded by any human protein cDNA deposited with ATCC as disclosed herein, or (b) the complement of (a) the DNA molecule. At least about 80% sequence identity, preferably at least about 81% sequence identity, more preferably at least about 82% sequence identity, more preferably at least about 83% sequence identity, more preferably at least about 84% sequence identity , More preferably at least about 85% sequence identity, more preferably at least about 86% sequence identity, more preferably at least about 87% sequence identity, more preferably at least about 88% sequence identity, more preferably about At least 89% sequence identity, more preferably at least about 90% sequence identity, more preferably at least about 91% sequence identity, more preferably At least about 92% sequence identity, more preferably at least about 93% sequence identity, more preferably at least about 94% sequence identity, more preferably at least about 95% sequence identity, more preferably at least about 96% sequence identity And, more preferably, at least about 97% sequence identity, more preferably at least about 98% sequence identity, more preferably at least about 99% sequence identity.

또다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되었거나 막횡단 도메인이 불활성화된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이러한 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적인 단리된 핵산 분자를 제공하는 것으로, 여기서 이러한 폴리펩티드의 막횡단 도메인(들)은 본원에 개시되어 있다. 그러므로, 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인도 고려된다.In another aspect, the invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising, or complementary to, a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide from which a transmembrane domain is deleted or in which a transmembrane domain is inactivated. The transmembrane domain (s) of the polypeptide are disclosed herein. Therefore, soluble extracellular domains of the PRO polypeptides described herein are also contemplated.

또다른 실시양태는 임의로 항-PRO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 PRO 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 PRO 폴리펩티드 코딩 단편에 대한 혼성화 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브로서 사용할 수 있는 PRO 폴리펩티드 코딩 서열 또는 그의 상보체에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편의 길이는 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 60개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 70개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 80개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 90개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 110개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 120개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 130개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 140개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 150개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 160개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 170개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 180개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 190개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 200개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 250개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 300개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 350개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 400개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 450개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 500개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 600개 이상의 뉴클레 오티드, 보다 바람직하게는 약 700개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 800개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 900개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 1000개 이상의 뉴클레오티드이고, 이 내용에서 용어 "약"은 상기 언급한 길이의 플러스 또는 마이너스 10%의 뉴클레오티드 서열 길이를 의미한다. 다수의 잘 공지된 임의의 서열 정렬 프로그램을 이용하여 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 정렬하고 어떤 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한지를 결정하는 통상적인 방식으로 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규 단편을 확인할 수 있다. 본원에서는 이러한 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 모두를 고려한다. 또한, 이들 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 PRO 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PRO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PRO 폴리펩티드 단편도 고려한다.Another embodiment provides a PRO polypeptide coding sequence that can be used as a hybridization probe or an antisense oligonucleotide probe for a PRO polypeptide coding fragment that optionally encodes a fragment of a PRO polypeptide that encodes a polypeptide comprising a binding site for an anti-PRO antibody or It is about his complement. Such nucleic acid fragments generally have a length of at least about 20 nucleotides, preferably at least about 30 nucleotides, more preferably at least about 40 nucleotides, more preferably at least about 50 nucleotides, more preferably about 60 At least about nucleotides, more preferably at least about 70 nucleotides, more preferably at least about 80 nucleotides, more preferably at least about 90 nucleotides, more preferably at least about 100 nucleotides, more preferably about 110 At least about nucleotides, more preferably at least about 120 nucleotides, more preferably at least about 130 nucleotides, more preferably at least about 140 nucleotides, more preferably at least about 150 nucleotides, more preferably about 160 More than new Nucleotides, more preferably at least about 170 nucleotides, more preferably at least about 180 nucleotides, more preferably at least about 190 nucleotides, more preferably at least about 200 nucleotides, more preferably about 250 At least about nucleotides, more preferably at least about 300 nucleotides, more preferably at least about 350 nucleotides, more preferably at least about 400 nucleotides, more preferably at least about 450 nucleotides, more preferably about 500 At least about nucleotides, more preferably at least about 600 nucleotides, more preferably at least about 700 nucleotides, more preferably at least about 800 nucleotides, more preferably at least about 900 nucleotides, more preferably About 1000 or more Is a nucleotide of which the term "about" means a nucleotide sequence length of plus or minus 10% of the above-mentioned length. A number of well-known sequence alignment programs are used to align the PRO polypeptide-coding nucleotide sequences with other known nucleotide sequences and to determine which PRO polypeptide-coding nucleotide sequence fragment (s) are novel in a conventional manner. New fragments of polypeptide-encoding nucleotide sequences can be identified. All of these PRO polypeptide-encoding nucleotide sequences are considered herein. Also contemplated are PRO polypeptide fragments encoded by these nucleotide molecule fragments, preferably PRO polypeptide fragments comprising a binding site for an anti-PRO antibody.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 확인한 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다.In another embodiment, the invention provides an isolated PRO polypeptide encoded by any isolated nucleic acid sequence identified above.

일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원의 아미노산 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원의 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원의 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 단편을 포함하는 PRO 폴리펩티드와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.In some aspects, the invention specifically defines the full length amino acid sequence as disclosed herein, the amino acid sequence herein with or without signal peptide, the extracellular domain of the transmembrane protein of the present invention with or without signal peptide, or the full length amino acid sequence herein. At least about 80% sequence identity, preferably at least about 81% sequence identity, more preferably at least about 82% sequence identity, more preferably at least about 83% sequence identity, to a PRO polypeptide comprising any fragment Preferably at least about 84% sequence identity, more preferably at least about 85% sequence identity, more preferably at least about 86% sequence identity, more preferably at least about 87% sequence identity, more preferably about 88% Or more sequence identity, more preferably at least about 89% sequence identity, more preferably at least about 90% Sequence identity, more preferably at least about 91% sequence identity, more preferably at least about 92% sequence identity, more preferably at least about 93% sequence identity, more preferably at least about 94% sequence identity, more preferably Preferably at least about 95% sequence identity, more preferably at least about 96% sequence identity, more preferably at least about 97% sequence identity, more preferably at least about 98% sequence identity, more preferably at least about 99% An isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence exhibiting sequence identity.

추가 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이 상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.In a further aspect, the present invention provides at least about 80% sequence identity, preferably at least about 81% sequence identity, more preferably about amino acid sequence encoded by any human protein cDNA deposited with ATCC as disclosed herein At least 82% sequence identity, more preferably at least about 83% sequence identity, more preferably at least about 84% sequence identity, more preferably at least about 85% sequence identity, more preferably at least about 86% sequence identity, More preferably at least about 87% sequence identity, more preferably at least about 88% sequence identity, more preferably at least about 89% sequence identity, more preferably at least about 90% sequence identity, more preferably about 91 At least% sequence identity, more preferably at least about 92% sequence identity, more preferably at least about 93% sequence identity, More preferably at least about 94% sequence identity, more preferably at least about 95% sequence identity, more preferably at least about 96% sequence identity, more preferably at least about 97% sequence identity, more preferably about An isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence exhibiting at least 98% sequence identity, more preferably at least about 99% sequence identity.

추가 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원의 아미노산 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원의 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 단편을 포함하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교할 때 약 80% 이상의 양성, 바람직하게는 약 81% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.In a further aspect, the present invention relates to a fully defined amino acid sequence disclosed herein, an amino acid sequence herein without a signal peptide, an extracellular domain of the transmembrane protein of the present invention with or without a signal peptide, or a specifically defined full length amino acid sequence disclosed herein. At least about 80% positive, preferably at least about 81% positive, more preferably at least about 82% positive, more preferably at least about 83% positive, as compared to the amino acid sequence of the PRO polypeptide comprising any fragment Preferably at least about 84% positive, more preferably at least about 85% positive, more preferably at least about 86% positive, more preferably at least about 87% positive, more preferably at least about 88% positive, Preferably at least about 89% positive, more preferably at least about 90% positive, more preferably at least about 91% positive, More preferably at least about 92% positive, more preferably at least about 93% positive, more preferably at least about 94% positive, more preferably at least about 95% positive, more preferably at least about 96% positive, More preferably, it is directed to an isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence that records at least about 97% positive, more preferably at least about 98% positive, more preferably at least about 99% positive.

특정 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 서열 및(또는) 개시 메티오닌이 없으며 상기와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단 리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 동일한 것을 생산하는 방법도 본원에 기재되어 있는데, 여기서 상기 방법은 PRO 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건하에서 적당한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 그리고 세포 배양물로부터 상기 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.In certain aspects, the invention provides an isolated PRO polypeptide free of N-terminal signal sequence and / or initiating methionine and encoded by a nucleotide sequence encoding such an amino acid sequence. Also described herein are methods of producing the same, wherein the method comprises culturing a host cell comprising a vector comprising a suitable coding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, and from the cell culture the PRO polypeptide. Recovering.

또다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되었거나 불활성화된 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 동일한 것을 생산하는 방법도 본원에 기재되어 있는데, 여기서 상기 방법은 PRO 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건하에서 적당한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것, 그리고 세포 배양물로부터 상기 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.In another aspect, the invention provides an isolated PRO polypeptide from which the transmembrane domain has been deleted or inactivated. Also described herein are methods of producing the same, wherein the method comprises culturing a host cell containing a vector comprising a suitable nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, and producing the PRO polypeptide from a cell culture. Recovery.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 천연 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체 또는 소분자이다. In another embodiment, the present invention relates to agonists or antagonists of natural PRO polypeptides as defined herein. In specific embodiments, the agonist or antagonist is an anti-PRO antibody or small molecule.

추가 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키는 것, 그리고 상기 PRO 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 관찰하는 것을 포함하는, PRO 폴리펩티드에 대한 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PRO 폴리펩티드는 천연 PRO 폴리펩티드이다.In a further embodiment, the invention relates to a method of identifying an agonist or antagonist for a PRO polypeptide, comprising contacting the PRO polypeptide with a candidate molecule and observing the biological activity mediated by the PRO polypeptide. . Preferably, the PRO polypeptide is a native PRO polypeptide.

추가 실시양태에서, 본 발명은 담체와 함께 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드, PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체를 포함하는 물질 조성물에 관한 것이다. 임의로, 상기 담체는 제약학상 허용가능한 담체이다.In a further embodiment, the invention relates to a substance composition comprising a PRO polypeptide described herein, an agonist or antagonist of a PRO polypeptide, or an anti-PRO antibody in combination with a carrier. Optionally, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 또다른 실시양태는 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스 트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체에 반응하는 질환의 치료에 유용한 약제를 제조하기 위한, 상기 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체의 용도에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention provides a PRO polypeptide, an agonist or antagonist thereof, or a medicament useful for the treatment of a disease in response to an anti-PRO antibody, the PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof, Or to the use of an anti-PRO antibody.

본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재한 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 CHO 세포, 대장균, 효모 또는 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 추가로 제공하고, 상기 방법은 원하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것, 그리고 이 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.In a further embodiment of the invention, the invention provides a vector comprising a DNA encoding any of the polypeptides described herein. Host cells comprising any such vector are also provided. For example, the host cell can be a CHO cell, E. coli, yeast or baculovirus-infected insect cell. Also provided is a method of making any of the polypeptides described herein, the method comprising culturing the host cell under conditions suitable for expression of the desired polypeptide, and recovering the desired polypeptide from the cell culture.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드가 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 결합되어 있는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예로는 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드가 이뮤노글로불린의 에피토프 태그 서열 또는 Fc 영역에 결합되어 있는 것이 있다. In other embodiments, the present invention provides chimeric molecules wherein any polypeptide described herein is linked to a heterologous polypeptide or amino acid sequence. Examples of such chimeric molecules are those in which any polypeptide described herein is linked to the epitope tag sequence or Fc region of an immunoglobulin.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기 기재된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.In another embodiment, the present invention provides antibodies that specifically bind to polypeptides described above or below. Optionally, the antibody is a monoclonal antibody, humanized antibody, antibody fragment or single chain antibody.

다른 실시양태에서, 본 발명은 안티센스 프로브로서 게놈 서열 및 cDNA 뉴클레오티드 서열을 단리하는 데 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는 것으로, 여기서 상기 프로브는 상기 또는 하기 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열로부터 유도할 수 있다.In another embodiment, the present invention provides oligonucleotide probes useful for isolating genomic sequences and cDNA nucleotide sequences as antisense probes, wherein the probes can be derived from any nucleotide sequence described above or below.

본 발명은 혈관신생 및(또는) 심혈관형성의 촉진 또는 억제 효과가 필요한 포유동물에서 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 촉진하거나 억제하는 데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이것은 종양 질환 뿐만 아니라 심혈관 질환의 진단 및 치료를 포함한다.  The present invention relates to compositions and methods useful for promoting or inhibiting angiogenesis and / or cardiovascularization in mammals in need of an angiogenic and / or cardiovascularization promoting or inhibitory effect. This includes the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases as well as tumor diseases.

심장 질환 및 인자Heart disease and factors

약 5백만명의 미국인이 심부전을 앓고 있고, 해마다 약 400,000명의 심부전 환자가 새로 발생한다. 심부전은 미국에서 65세 이상의 사람이 입원하는 가장 높은 빈도의 단일 원인이다. 최근에, 급성 심근경색을 비롯한 급성 심장 질환의 진보된 관리 결과, 결국 만성 심부전으로 발전될 환자 집단이 팽창되고 있음을 알 수 있다. 1979년부터 1995년까지, 울혈성 심부전 (CHF)으로 인한 입원은 377,000명에서 872,000명으로 늘었고 (130% 증가), CHF로 인한 사망은 116% 증가되었다.About 5 million Americans have heart failure, and about 400,000 new heart failure patients occur each year. Heart failure is the single most common cause of hospitalization in people over 65 years of age in the United States. Recently, as a result of advanced management of acute heart disease, including acute myocardial infarction, it can be seen that the patient population is eventually expanding, which will eventually develop into chronic heart failure. From 1979 to 1995, hospitalizations for congestive heart failure (CHF) increased from 377,000 to 872,000 (130% increase), and CHF deaths increased 116%.

CHF는 좌심실 기능저하, 감소된 운동 내성, 손상된 삶의 질 및 매우 단축된 수명에 의해 특징지워지는 증후군이다. 심부전의 필수 조건은 심장이 체조직의 대사 요구를 총족시키기에 충분한 속도로 혈액을 펌프할 수 없다는 점 (달리 말하면 불충분한 심박출량)이다.CHF is a syndrome characterized by left ventricular dysfunction, reduced locomotor tolerance, impaired quality of life and very short lifespan. An essential condition for heart failure is that the heart cannot pump blood at a rate sufficient to meet the metabolic demands of body tissues (in other words, insufficient cardiac output).

추가 치료에 대한 필요성The need for additional treatment

많은 질환 및 장애에 있어서 혈관 내피세포 증식 및 혈관신생의 역할을 볼 때, 이들 과정을 야기하는 한 가지 이상의 생물학적 효과를 감소 또는 억제시키는 방법이 있는 것이 바람직하다. 또한, 정상 및 질환 상태, 및 특히 암에서 병원성 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 있는 것이 바람직하다. 추가로, 특정한 측면에서, 심비대증의 치료에 일반적으로 적용가능한 치료법이 없기 때문에, 심근세포 비대증을 예방 또는 감소시킬 수 있는 인자의 확인은 병리생리학적 심장 증식을 억제하는 신규 치료법의 개발에 있어서 1차적으로 중요하다. 다양한 심혈관 질환 및 종양 질환을 위한 여러 가지 치료법이 있지만 추가적인 치료법이 여전히 필요하다. Given the role of vascular endothelial cell proliferation and angiogenesis in many diseases and disorders, it is desirable to have a method of reducing or inhibiting one or more biological effects that cause these processes. It is also desirable to have a method for detecting the presence of pathogenic polypeptides in normal and disease states, and particularly in cancer. In addition, in certain aspects, the identification of factors that can prevent or reduce cardiomyocyte hypertrophy, because there are no therapies generally applicable to the treatment of cardiac hypertrophy, may be useful in the development of new therapies that inhibit pathophysiological cardiac proliferation. It is important for me. There are many therapies for various cardiovascular and tumor diseases, but additional therapies are still needed.

발명의 상세한 설명Detailed description of the invention

1. 정의1. Definition

어구 "심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환", "심혈관 장애, 내피세포 장애 및 혈관신생 장애", "심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환" 및 "심혈관 장애, 내피세포 장애 또는 혈관신생 장애"는 교환가능하게 사용되고, 동맥, 모세혈관, 정맥 및(또는) 림프관과 같은 혈관 자체의 질환 뿐만 아니라 부분적으로는 당뇨병과 같은, 혈관에 영향을 미치는 전신 질환을 말한다. 이는 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 자극하는 증상, 및 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 억제하는 증상을 포함한다. 이러한 질환에는 예를 들어, 죽상경화증, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이나우드병 및 레이나우드 증후군, 동맥류 및 동맥성 재발협착증과 같은 동맥 질환; 혈전성정맥염, 림프관염 및 림프부종과 같은 정맥 및 림프관 질환; 및 말초 혈관 질환, 혈관 종양 (예컨대, 혈관종 (모세혈관 및 해면), 사구 종 양, 모세혈관확장증, 세균성 혈관종증, 혈관내피종, 혈관육종, 혈관외피세포종, 카포시 육종, 림프관종 및 림프관육종)과 같은 암, 종양 혈관신생, 창상, 화상 및 기타 손상된 조직과 같은 외상, 이식물 고착, 흉터형성, 허혈성 재관류 손상, 류마티스성 관절염, 뇌혈관 질환, 급성 신부전과 같은 신장 질환 및 골다공증과 같은 기타 혈관 질환이 포함된다. 상기 질환에는 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 심비대증, 및 CHF와 같은 심부전도 포함된다.The phrases "cardiovascular disease, endothelial cell disease and angiogenic disease", "cardiovascular disorders, endothelial cell disorders and angiogenesis disorders", "cardiovascular disease, endothelial cell disease or angiogenic disorders" and "cardiovascular disorders, endothelial cell disorders or angiogenesis" Disorders "are used interchangeably and refer to systemic diseases affecting blood vessels, in part, such as diabetes, as well as diseases of the blood vessels themselves, such as arteries, capillaries, veins, and / or lymphatic vessels. This includes symptoms that stimulate angiogenesis and / or cardiovascularization, and symptoms that inhibit angiogenesis and / or cardiovascularization. Such diseases include, for example, arterial diseases such as atherosclerosis, hypertension, inflammatory vasculitis, Raynaud's disease and Raynaud's syndrome, aneurysms and arterial restenosis; Venous and lymphatic diseases such as thrombophlebitis, lymphangitis and lymphedema; And peripheral vascular disease, vascular tumors (eg, hemangioma (capillary and cavernous), glomerular tumor, capillary dilated disease, bacterial angiomatosis, hemangioendothelioma, hemangiosarcoma, hemangioendothelioma, Kaposi's sarcoma, lymphangioma and lymphangiosarcoma); Trauma such as cancer, tumor angiogenesis, wounds, burns and other damaged tissues, graft fixation, scarring, ischemic reperfusion injury, rheumatoid arthritis, cerebrovascular disease, kidney disease such as acute renal failure and other vascular diseases such as osteoporosis This includes. The disease also includes angina, myocardial infarction such as acute myocardial infarction, cardiac hypertrophy, and heart failure such as CHF.

본원에 사용된 "비대증"은 종양 형성을 수반하지 않는 자연적인 증식과는 독립적으로 기관 또는 구조의 질량이 증가된 것으로 정의된다. 기관 또는 조직의 비대증은 개별 세포의 질량 증가 (진정한 의미의 비대증) 또는 상기 조직을 구성하는 세포 수의 증가 (과다증식증), 또는 둘다에 기인한다. 심장과 같은 일부 기관은 생후 즉시 분열하는 능력을 상실한다. 따라서, "심비대증"은 세포 분열을 수반하지 않으며, 근세포 크기 및 수축 단백질 함량의 증가에 의해 특징지워지는, 성인의 심장 질량의 증가로 정의된다. 비대증을 유도하는 스트레스의 특징 (예컨대, 심근경색증에서와 같이 근세포의 증가된 전(前)하중, 후(後)하중, 근세포의 손실 또는 수축성 일차 우울증)은 반응성을 결정하는 데 결정적인 역할을 하는 듯하다. 심비대증의 초기 단계는 일반적으로 미토콘드리아 및 핵의 팽창 뿐만 아니라 근섬유 및 미토콘드리아의 크기 증가에 의해 형태학적으로 특징지워진다. 이 단계에서, 근세포는 정상세포보다 더 크지만 세포 조직화는 대부분 보존된다. 심비대증의 진행 단계에서, 미토콘드리아와 같은 특정 소기관의 크기 또는 수가 월등히 증가되어 있고, 새로운 수축 요소가 불규칙적인 방식으로 세포의 국소 구역에 첨가된다. 오랜 동안 비대화된 세포는 인접한 근섬유를 대체하고 정상적인 Z-밴드 표시의 분해를 야기하는 고도의 소엽막이 있는 현저히 팽창된 핵을 비롯하여 세포 조직화에 있어서 보다 분명한 붕괴를 보인다. 어구 "심비대증"은 근원적인 심질환과는 관계없이 심근의 다양한 구조적 손상도에 의해 특징지워지는, 이 질환의 모든 발전 단계를 포함하는 것으로 사용한다. 그러므로, 상기 용어는 고혈압, 대동맥 협착증, 또는 심근경색증과 같은 심비대증의 발달과 관련된 생리적인 증상도 포함한다.As used herein, "hypertrophy" is defined as an increase in the mass of an organ or structure independent of natural proliferation that does not involve tumor formation. Hypertrophy of an organ or tissue is due to an increase in the mass of individual cells (a hypertrophy in the true sense) or an increase in the number of cells making up the tissue (hyperproliferation), or both. Some organs, such as the heart, lose their ability to divide immediately after birth. Thus, "cardiac hypertrophy" is defined as an increase in the heart mass of an adult that does not involve cell division and is characterized by an increase in myocyte size and contractile protein content. Characteristics of stress that induce hypertrophy (eg, increased preload, postload, muscle loss, or contractile primary depression of muscle cells, as in myocardial infarction) appear to play a crucial role in determining responsiveness. . The early stages of cardiac hypertrophy are generally characterized morphologically by the expansion of the mitochondria and nucleus as well as the increase in the size of the muscle fibers and mitochondria. At this stage, myocytes are larger than normal cells but cell organization is largely preserved. In the progression of cardiac hypertrophy, the size or number of certain organelles, such as mitochondria, is greatly increased, and new contractile elements are added to the local zone of cells in an irregular manner. Over time, enlarged cells show a more pronounced disruption in cell organization, including significantly expanded nuclei with highly lobular membranes that replace adjacent muscle fibers and cause degradation of normal Z-band markings. The phrase "cardiac hypertrophy" is used to encompass all stages of development of this disease, characterized by varying degrees of structural damage to the myocardium regardless of the underlying heart disease. Therefore, the term also includes physiological symptoms associated with the development of cardiac hypertrophy, such as hypertension, aortic stenosis, or myocardial infarction.

"심부전"은 심장이 조직 대사의 요구에 필요한 속도로 혈액을 펌프하지 않는 경우의 심장 기능의 비정상성을 말한다. 심부전은 허혈성, 울혈성, 류마티스성 또는 특발성 형태를 포함한 다수의 인자에 의해 야기될 수 있다. "Heart failure" refers to abnormalities in heart function when the heart does not pump blood at the rate required for tissue metabolism needs. Heart failure can be caused by a number of factors including ischemic, congestive, rheumatic or idiopathic forms.

"울혈성 심부전" (CHF)은 심장이 산소를 포함한 혈액을 말초 조직에 전달하기에 적당한 심박 출량 (일정 시간에 걸쳐 심장에 의해 펌프되는 혈액 부피)을 점차적으로 공급할 수 없는 경우의 진행성 병적 상태이다. CHF가 진행됨에 따라, 구조적 및 혈액동력학적 손상이 일어난다. 이들 손상은 다양한 증상을 나타내지만 한 가지 특징적인 증상은 심실 비대증이다. CHF는 많은 다양한 심장 질환의 공통적인 결과이다."Congestive heart failure" (CHF) is a progressive pathological condition when the heart is unable to gradually supply adequate heart rate (blood volume pumped by the heart over time) to deliver blood containing oxygen to peripheral tissues. . As CHF progresses, structural and hemodynamic damage occurs. These injuries show various symptoms, but one characteristic symptom is ventricular hypertrophy. CHF is a common consequence of many different heart diseases.

"심근경색증"은 종종 중복성 관상 혈전증이 있는 관상 동맥의 죽상경화증으로부터 일반적으로 발생한다. 심근경색증은 두 가지 주요 유형, 즉 심근괴사가 심실벽의 전층을 수반하는 전층경색증, 및 괴사가 심실벽을 통해 심장외막까지 뻗어 있지 않고 심내막하층, 벽내심근층 또는 둘다를 수반하는 심내막하(비전층)경색증으로 나눌 수 있다. 심근경색증은 손상된 심장 구역 및 건강한 심장 구역에서 혈 액동력학적 효과의 변화 및 구조의 변이 둘다를 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 심근경색증은 심장의 최대 심박 출량 및 졸중 용적을 감소시킨다. 또한, 영향받지 않은 심장 구역에서 콜라겐 형성의 증가 뿐만 아니라 간극에서 일어나는 DNA 합성의 자극은 심근경색증과 관련되어 있다."Myocardial infarction" generally occurs from atherosclerosis of the coronary arteries, often with redundant coronary thrombosis. Myocardial infarction has two main types: pleural infarction, in which myocardial necrosis involves the entire layer of the ventricular wall, and subendocardia, in which the necrosis does not extend through the ventricular wall to the epicardium, but involves the endocardial layer, the intracardiac myocardial layer, or both. (Infrastructure) can be divided into infarction. Myocardial infarction is known to cause both changes in blood kinetic effects and changes in structure in damaged heart zones and healthy heart zones. Thus, for example, myocardial infarction reduces the maximum cardiac output and stroke volume of the heart. In addition, increased collagen formation in the unaffected heart zone as well as stimulation of DNA synthesis in the gaps are associated with myocardial infarction.

예를 들어, 증가된 총 말초저항으로 인한 지속성 고혈압에 있어서 심장에 가해지는 증가된 스트레스 또는 피로의 결과로서 초래된 심비대증은 오랫동안 "고혈압"과 관련되어 있다. 만성 압력 과부하의 결과로서 비대하게 된 심실의 특징은 손상된 이완 수행능력이다 (Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol., 4: 1500-1506 (1984); Smith et al., J. Am. Coll. Cardiol., 5: 869-874 (1985)). 지속성 좌심실 이완은 정상 또는 최정상 수축 기능에도 불구하고 초기의 본질적인 고혈압에서 관찰된 바 있다 (Hartford et al., Hypertension, 6: 329-338 (1984)). 그러나, 혈압 수준과 심비대증 사이의 밀접한 대응관계는 없다. 항고혈압 치료법에 반응하는 좌심실 기능의 개선이 인간에서 보고되어 있다 하더라도, 이뇨제 (히드로클로로티아지드), β-차단제 (프로프라놀롤) 또는 칼슘 채널 차단제 (딜티아젬)로 다양하게 치료받은 환자는 이완 기능의 향상 없이 좌심실 비대증의 반전을 보인 바 있다 (Inouye et al., Am. J. Cardiol., 53: 1583-7 (1984)).For example, cardiac hypertrophy resulting in increased stress or fatigue on the heart in persistent hypertension due to increased total peripheral resistance has long been associated with "hypertension". A feature of the enlarged ventricle that is enlarged as a result of chronic pressure overload is impaired relaxation performance. Coll. Cardiol., 5: 869-874 (1985)). Persistent left ventricular relaxation has been observed in early intrinsic hypertension despite normal or maximal contractile function (Hartford et al., Hypertension, 6: 329-338 (1984)). However, there is no close correspondence between blood pressure levels and cardiac hypertrophy. Although improvements in left ventricular function in response to antihypertensive therapy have been reported in humans, patients receiving various treatments with diuretics (hydrochlorothiazide), β-blockers (propranolol), or calcium channel blockers (diltiazem) Left ventricular hypertrophy has been shown without improvement (Inouye et al., Am. J. Cardiol., 53: 1583-7 (1984)).

심비대증과 관련된 또다른 복합성 심장 질환은 "비대증성 심근병증"이다. 이 질환은 형태적, 기능적 및 임상적 특징의 높은 다양성 (Maron et al., N. Engl. J. Med., 316: 780-789 (1987); Spirito et al., N. Engl. J. Med., 320: 749-755 (1989); Louie and Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis., 36: 275-308 (1994); Wigle et al., Circulation, 92: 1680-1692 (1995)), 및 모든 연령의 환자가 상기 질환을 앓는다는 사실에 의해 강조되는 이질성 (Spirito et al., N. Engl. J. Med., 336: 775-785 (1997))에 의해 특징지워진다. 비대증성 심근병증의 원인 인자도 다양하고 거의 알려져 있지 않다. 일반적으로, 근절 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 비대증성 심근병증과 관련되어 있다. 최근 데이타는 β-미요신 중쇄 돌연변이가 가족성 비대증성 심근병증 경우의 약 30 내지 40%의 원인일 수 있다고 제시한다 (Warkins et al., N. Engl. J. Med., 326: 1108-1114 (1992); Schwartz et al., Circulation, 91: 532-540 (1995); Marian and Roberts, Circulation, 92: 1336-1347 (1995); Thierfelder et al., Cell, 77: 701-712 (1994); Watkins et al., Nat. Gen., 11: 434-437 (1995)). β-미요신 중쇄 이외에 다른 위치의 유전자 돌연변이에는 심장 트로포닌 T. 알파 토포미요신, 심장 미요신 결합 단백질 C, 필수 미요신 경쇄 및 조절 미요신 경쇄가 포함된다 (Malik and Watkins. Curr. Opin. Cardiol., 12: 295-302 (1997) 참조).Another complex heart disease associated with cardiac hypertrophy is "hypertrophic cardiomyopathy". The disease is characterized by high diversity of morphological, functional and clinical features (Maron et al., N. Engl. J. Med., 316: 780-789 (1987); Spirito et al., N. Engl. J. Med , 320: 749-755 (1989); Louie and Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis., 36: 275-308 (1994); Wigle et al., Circulation, 92: 1680-1692 (1995)), and all It is characterized by heterogeneity (Spirito et al., N. Engl. J. Med., 336: 775-785 (1997)), which is emphasized by the fact that patients of age suffer from this disease. The causative agents of hypertrophic cardiomyopathy also vary and little is known. In general, mutations in genes encoding eradicating proteins are associated with hypertrophic cardiomyopathy. Recent data suggest that β-myosin heavy chain mutations may be responsible for about 30-40% of cases of familial hypertrophic cardiomyopathy (Warkins et al., N. Engl. J. Med., 326: 1108-1114) (1992); Schwartz et al., Circulation, 91: 532-540 (1995); Marian and Roberts, Circulation, 92: 1336-1347 (1995); Thierfelder et al., Cell, 77: 701-712 (1994) Watkins et al., Nat. Gen., 11: 434-437 (1995)). Gene mutations other than β-myosin heavy chains include cardiac troponin T. alpha topomycin, cardiac myosin binding protein C, essential myosin light chain and regulatory myosin light chain (Malik and Watkins. Curr. Opin. Cardiol., 12: 295-302 (1997).

판상부 "대동맥 협착증"은 오름대동맥의 협착에 의해 특징지워지는 유전성 혈관 질환이지만, 폐동맥을 포함한 다른 동맥도 영향받을 수 있다. 치료받지 않은 대동맥 협착증은 심장내 혈압을 상승시키고, 이 심장내 혈압 상승은 심근비대증을 초래해서 결국 심부전 및 사망에 이르게 한다. 이 질환의 발병기작은 완전히 이해되지 않았지만, 내측평활근의 비대증과 (아마도) 증식증이 이 질환의 두드러진 특징이다. 엘라스틴 유전자의 분자 변이체가 대동맥 협착증의 발달 및 발병기작에 관여하는 것으로 보고된 바 있다 (1997년 7월 22일 간행된 미국 특허 제5,650,282 호). Platelet "aortic stenosis" is a hereditary vascular disease characterized by stenosis of the ascending aorta, but other arteries, including the pulmonary artery, may also be affected. Untreated aortic stenosis raises intracardiac blood pressure, which leads to myocardial hypertrophy and eventually leads to heart failure and death. The pathogenesis of this disease is not fully understood, but hypertrophy and (possibly) hyperplasia of medial smooth muscle are prominent features of the disease. Molecular variants of the elastin gene have been reported to be involved in the development and pathogenesis of aortic stenosis (US Pat. No. 5,650,282, published July 22, 1997).

"판역류"는 심장 판막 질환을 초래하는 심장 질환의 결과로서 일어난다. 류마티스열과 같은 다양한 질환은 판막구와는 관계없는 수축 또는 당기기를 초래할 수 있지만, 다른 질환은 심내막염, 심내막 또는 방실구 내막의 염증 및 심장 수술을 초래할 수 있다. 판막 협착증의 협착 또는 판막의 결손 폐쇄와 같은 결함은 심강의 혈액 축적, 또는 판막을 지나는 혈액의 역류를 초래한다. 지속성 판막 협착증 또는 지속성 판막 부전은 치료하지 않으면 심비대증, 및 심근과 관련된 손상을 초래할 수 있는데, 이러한 손상은 결국 판막 교체를 필요로 한다."Reflux" occurs as a result of heart disease resulting in heart valve disease. Various diseases, such as rheumatic fever, can lead to contractions or pulls unrelated to the valves, but other diseases can lead to endocarditis, endocardial or atrioventricular inflammation and cardiac surgery. Defects, such as narrowing of the valve or narrowing of the valve, result in cardiac blood accumulation, or backflow of blood across the valve. Persistent valve stenosis or persistent valve insufficiency can lead to cardiac hypertrophy and damage associated with myocardium, if not treated, which in turn requires valve replacement.

본 발명은 심비대증이 수반될 수 있거나 수반될 수 없는 이들 모든 질환, 및 기타 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료를 포함한다.The present invention includes the treatment of all these diseases, which may or may not be accompanied by cardiac hypertrophy, and other cardiovascular, endothelial, and angiogenic diseases.

용어 "암", "암의" 및 "악성의"는 조절되지 않는 세포 증식이 전형적인 특징인 포유동물의 생리학적 상태를 말하거나 기술한다. 암의 예로는 선암종, 림프종, 모세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병을 비롯한 암이 있으나, 여기에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종, 췌장암, 교모세포종, 자궁암, 난소암, 간암 (예컨대, 간암종 및 간세포암), 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 침샘암, 신장암 (예컨대, 신세포암 및 윌름스 종양), 기저세포암, 흑색종, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 고환암, 식도암 및 다양한 유형의 머리와 목 암이 있다. 여기서 치료하기에 바람직한 암은 유방암, 결장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 및 상기에 기재한 혈관종양을 수반하는 다른 암이다. The terms “cancer”, “cancerous” and “malignant” refer to or describe the physiological state of a mammal in which uncontrolled cell proliferation is typical. Examples of cancer include, but are not limited to, cancers including adenocarcinoma, lymphoma, blastoma, melanoma, sarcoma, and leukemia. More specific examples of such cancers include squamous cell cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, gastrointestinal cancer, Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma, pancreatic cancer, glioblastoma, uterine cancer, ovarian cancer, liver cancer (e.g., hepatocellular carcinoma and hepatocellular carcinoma), Bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, salivary gland cancer, kidney cancer (e.g. renal cell carcinoma and Wilms' tumor), basal cell carcinoma, melanoma, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, testicular cancer, esophageal cancer and various There are types of head and neck cancers. Preferred cancers to be treated here are breast cancer, colon cancer, lung cancer, melanoma, ovarian cancer, and other cancers involving the vascular tumors described above.

본원에서 사용한 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방해하여 세포를 파괴시키는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re), 화학요법제, 및 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소와 같은 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 한다. As used herein, the term “cytotoxic agent” refers to a substance that destroys a cell by inhibiting or interfering with its function. This term includes toxins or fragments thereof, such as radioisotopes (eg, ¹³¹ I, ¹²⁵ I, ⁹⁰ Y and ¹⁸⁶ Re), chemotherapeutic agents, and enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants or animals. Shall be.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 폴산 길항제, 핵산 대사의 항-대사물질, 항생제, 피리미딘 동족체, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 퓨린 뉴클레오시드, 아민, 아미노산, 트리아졸 뉴클레오시드 또는 코르티코스테로이드가 있다. 구체적인 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁솔, 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 빈오렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 겨자가 있다. 이 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬제, 예컨대 타모시펜 및 오나프리스톤도 포함된다.A "chemotherapeutic agent" is a compound useful for the treatment of cancer. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents, folic acid antagonists, anti-metabolites of nucleic acid metabolism, antibiotics, pyrimidine analogs, 5-fluorouracil, cisplatin, purine nucleosides, amines, amino acids, triazole nucleosides or corticosteroids. There is. Specific examples include adriamycin, doxorubicin, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside (“Ara-C”), cyclophosphamide, thiotepa, busulfan, cytoxin, taxol, toxotere, methotrexate, cisplatin, mel Palan, vinblastine, bleomycin, etoposide, phosphamide, mitomycin C, mitoxantrone, vincristine, vinorelbine, carboplatin, teniposide, daunomycin, carminomycin, aminos Therein, dactinomycin, mitomycin, esperamicin (see US Pat. No. 4,675,187), melphalan and other related nitrogen mustard. This definition also includes hormonal agents that modulate or inhibit hormonal action on tumors such as tamoxifen and onnapristone.

본원에 사용된 "증식 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포, 예컨대 Wnt-과다발현 암세포의 증식을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 증식 억제제는 S기에 있는 종양세포의 비율을 상당히 감소시키는 것이다. 증식 억 제제의 예로는 (S기 이외의 상태에서) 세포 주기 진행을 차단하는 물질, 예컨대 G1-기 정체 및 M-기 정체를 유도하는 물질이 있다. 전형적인 M-기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제 (예컨대, 독소루비신, 다우노루비신, 에토포사이드 및 블레오마이신)가 있다. G1 정체를 유도하는 물질, 예컨대 타모시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제는 S-기 정체도 유도한다. 자세한 정보는 문헌 (The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders; Philadelphia, 1995), especially p.13)에서 찾을 수 있다. 추가적인 예로는 종양 괴사 인자 (TNF); 산성 또는 염기성 FGF 또는 간세포암 증식 인자 (FGF)의 혈관신생 활성을 억제 또는 중화할 수 있는 항체; 조직 인자, 단백질 C 또는 단백질 S (WO 91/01753, 1991년 2월 21일 공개)의 응고 활성을 억제하거나 중화할 수 있는 항체; 및 4D5 항체 (및 그의 기능적 등가물) (예를 들어, WO 92/22653)와 같이 HER2 수용체 (WO 89/06692)에 결합할 수 있는 항체가 있다. As used herein, “proliferative inhibitor” refers to a compound or composition that inhibits the proliferation of cells, such as Wnt-overexpressing cancer cells, in vitro or in vivo. Thus, proliferation inhibitors significantly reduce the proportion of tumor cells in S phase. Examples of proliferation inhibitors include substances that block cell cycle progression (out of phase S), such as those that induce G1-phase and M-phase identity. Typical M-group blockers include vincas (vincristine and vinblastine), taxol and topo II inhibitors (eg doxorubicin, daunorubicin, etoposide and bleomycin). Substances that induce G1 identity, such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil and ara-C, also induce S-group identity. For more information, see The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders; Philadelphia, 1995), especially p. 13). Further examples include tumor necrosis factor (TNF); Antibodies capable of inhibiting or neutralizing angiogenic activity of acidic or basic FGF or hepatocellular carcinoma growth factor (FGF); Antibodies capable of inhibiting or neutralizing the coagulation activity of tissue factor, protein C or protein S (WO 91/01753, published February 21, 1991); And antibodies capable of binding to the HER2 receptor (WO 89/06692) such as 4D5 antibodies (and their functional equivalents) (eg WO 92/22653).

"치료"는 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 발달을 예방하거나 상기 질환의 병리학을 바꾸기 위한 의도로 수행되는 것이다. 치료의 개념은 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 임의의 단계의 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 방지 (예방), 완화, 경감 및 치유를 포함한다. 따라서, "치료"는 치료적인 치료, 및 예방 또는 방지 처치 둘다를 말하는 것으로, 이 때 목 적은 심혈관 질환, 내피세포 질환, 및 비대증과 같은 혈관신생 질환을 예방하거나 늦추는 것이다. 치료가 필요한 대상은 상기 질환에 걸리기 쉬운 대상 또는 상기 질환을 예방할 대상 뿐만 아니라 이미 상기 질환을 앓는 대상을 포함한다. 상기 질환은 특발성, 심장친화성 또는 근육친화성 원인을 비롯한 임의의 원인, 또는 심근경색증과 같은 허혈이나 허혈성 발작으로부터 발생할 수 있다. "Treatment" is intended to prevent the development of cardiovascular disease, endothelial cell disease and angiogenic disease or to alter the pathology of the disease. The concept of treatment is used in its broadest sense and specifically includes the prevention (prevention), alleviation, alleviation and cure of cardiovascular disease, endothelial cell disease and angiogenic diseases of any stage. Thus, "treatment" refers to both therapeutic treatment and prophylactic or prophylactic treatment, where the goal is to prevent or slow angiogenic diseases such as cardiovascular disease, endothelial cell disease, and hypertrophy. Subjects in need of treatment include those susceptible to the disease or subjects to prevent the disease as well as those already suffering from the disease. The disease may arise from any cause, including idiopathic, cardiac or muscle affinity causes, or ischemic or ischemic attacks such as myocardial infarction.

"만성" 투여는 항-비대증성 효과와 같은 초기 효과를 장기간동안 유지하기 위해 급성 방식과는 반대인 연속 방식으로 약제(들)을 투여하는 것을 말한다. "Chronic" administration refers to administering the drug (s) in a continuous manner as opposed to the acute mode to maintain long-term initial effects such as anti-hypertrophic effects.

치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 양, 돼지 등을 포함한 포유동물로 분류된 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다."Mammal" for therapeutic purposes refers to any animal classified as a mammal, including humans, livestock and breeding animals, zoo animals, sport animals and pets such as dogs, horses, cats, cattle, sheep, pigs, and the like. . Preferably, the mammal is a human.

1종 이상의 추가 치료제와 "함께" 투여하는 것은 동시적인 투여 및 임의의 순서의 연속적인 투여를 포함한다. Administration "with" one or more additional therapeutic agents includes simultaneous administration and any order of continuous administration.

어구 "심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관신생 관련 약제"는 일반적으로 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환을 치료하는 데 작용하는 임의의 약물을 말한다. 심혈관계 약제의 예로는 혈관 질환에 작용하는 인자인 혈압, 심박동수, 심수축성, 및 내피근과 평활근의 생물학을 조절하여 혈관 항상성을 촉진하는 약제가 있다. 이들의 구체적인 예로는 안지오텐신-II, 수용체 길항제; 엔도텔린 수용체 길항제, 예컨대, BOSENTAN (상표명) 및 MOXONODIN (상표명); 인터페론-감마 (INF-γ); 데스-아스파르테이트-안지오텐신 I; 혈전용해제, 예컨대 스트렙토키나제, 유로키나제, t-PA, 및 보다 긴 반감기 및 매우 높은 피브린 특이성을 나타 내도록 특이적으로 디자인된 t-PA, TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR (296-299)AAAA t-PA 변이체, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 3670-3674 (1994)); 디고시제닌 및 β-아드레날린성 수용체 차단제와 같은 수축촉진제 또는 고혈압제, 예컨대 프로프라노롤, 티모롤, 테르타롤올, 카르테오롤, 나도롤, 베타소롤, 펜부토롤, 아세토부토롤, 아테노롤, 메토프로롤 및 카르베디롤; 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제, 예컨대, 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날아프릴, 라미프릴, 벤아제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴; 이뇨제, 예컨대, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 및 인다프아미드; 및 칼슘 채널 차단제, 예컨대, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀, 니카르디핀이 있다. 이 유형의 한 가지 바람직한 카테고리는 심비대증; 또는 고혈압, 대동맥 협착증 또는 심근경색증과 같은 심비대증을 발달시키는 생리학적 증상의 치료에 사용되는 치료제이다. The phrase “cardiovascular agent, endothelial cell agent or angiogenesis related agent” generally refers to any drug that acts to treat cardiovascular disease, endothelial cell disease and angiogenic disease. Examples of cardiovascular agents include drugs that promote blood vessel homeostasis by regulating blood pressure, heart rate, cardiac contractility, and biology of endothelial and smooth muscle, which are factors that act on vascular disease. Specific examples thereof include angiotensin-II, receptor antagonist; Endothelin receptor antagonists such as BOSENTAN ™ and MOXONODIN ™; Interferon-gamma (INF-γ); Des-aspartate- angiotensin I; Thrombolytics such as streptokinase, urokinase, t-PA, and t-PA, TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR (296-299) AAAA specifically designed to exhibit longer half-life and very high fibrin specificity t-PA variant, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 3670-3674 (1994)); Stimulators or hypertensives such as digoxigenin and β-adrenergic receptor blockers, such as propranolol, timolol, tertarolol, carteolol, nadorol, betasolol, fenbutolol, acetobutorol, atenolol, Metoprolol and carvedilol; Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors such as quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benzapril, fosinopril and risinopril; Diuretics such as chlorothiazide, hydrochlorothiazide, hydroflumetazide, methylchlorothiazide, benzthiazide, dichlorophenamide, acetazolamide and indafamide; And calcium channel blockers such as diltiazem, nifedipine, verapamil, nicardidipine. One preferred category of this type is cardiac hypertrophy; Or therapeutic agents for the treatment of physiological conditions that develop cardiac hypertrophy, such as hypertension, aortic stenosis or myocardial infarction.

"혈관형성제" 및 "내피세포계 약제"는 혈관신생 및(또는) 내피세포 증식 또는, 적용가능하다면 혈관생성을 촉진하는 활성제이다. 이것은 증식 호르몬, 인슐린-유사 증식 인자-I (IGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, 표피 증식 인자 (EGF), CTGF 및 그의 구성원, FGF, TGF-α및 TGF-β와 같은 창상 치유를 가속화하는 인자를 포함한다."Angiogenesis agents" and "endothelial agent" are active agents that promote angiogenesis and / or endothelial cell proliferation or, where applicable, angiogenesis. It accelerates wound healing such as proliferation hormones, insulin-like growth factor-I (IGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, epidermal growth factor (EGF), CTGF and its members, FGF, TGF-α and TGF-β. Contains arguments to

"혈관신생 억제제"는 혈관신생 또는 혈관생성을 억제하거나 암세포의 증식을 억제 또는 방해하는 활성제이다. 예로는 VEGF에 대한 항체와 같은, 상기 정의한 혈관형성제에 대한 항체 또는 다른 길항제가 있다. 추가적으로 이들은 세포치료 제, 예컨대, 세포독성제, 화학요법제, 증식 억제제, 아폽토시스제, 및 암을 치료하는 다른 약제 (예컨대, 항-HER-2, 항-CD20, 다른 생물활성제 및 유기 화학제)를 포함한다."Angiogenesis inhibitors" are active agents that inhibit angiogenesis or angiogenesis or inhibit or inhibit the proliferation of cancer cells. Examples are antibodies to angiogenesis agents or other antagonists as defined above, such as antibodies to VEGF. Additionally they are cytotherapeutics such as cytotoxic agents, chemotherapeutic agents, proliferative inhibitors, apoptosis agents, and other agents for treating cancer (eg, anti-HER-2, anti-CD20, other bioactive agents and organic chemistries). It includes.

제약학적 의미에서, 본 발명의 내용에서 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체와 같은 "치료 유효량"의 활성제는 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유효한 양을 말하고 실험적으로 결정할 수 있다. In the pharmaceutical sense, an "therapeutically effective amount" of an active agent, such as a PRO polypeptide, an agonist or antagonist thereof, or an anti-PRO antibody in the context of the present invention is effective for the treatment of cardiovascular, endothelial or angiogenic diseases in mammals. The amount can be spoken and determined experimentally.

본원에 사용된 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체와 같은 "유효량"의 활성제는 상기 목적을 수행하기에 유효한 양을 말하는데, 여기서 상기 양은 원하는 효과를 얻기 위해 실험적으로 결정할 수 있다.As used herein, an “effective amount” of an active agent, such as a PRO polypeptide, an agonist or antagonist thereof, or an anti-PRO antibody, refers to an amount effective to accomplish the purpose, wherein the amount can be determined experimentally to achieve the desired effect. .

"PRO 폴리펩티드" 및 "PRO"란 용어는 본 명세서에 사용된 바와 같이 바로 뒤에 숫자가 붙은 경우 다양한 폴리펩티드를 말하는데, 완전한 명칭(즉, PRO/숫자)은 본 명세서에 기재된 특정 폴리펩티드 서열을 말한다. 본 명세서에 사용된 "PRO/숫자 폴리펩티드" 및 "PRO/숫자" (여기서, 숫자는 실질적인 숫자로 표시됨)는 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체 (본 명세서에 추가로 정의됨)를 포함하는 용어이다. 본 명세서에 기재된 PRO 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 출처와 같은 다양한 출처로부터 단리될 수 있거나 재조합 또는 합성에 의해 제조될 수 있다.The terms "PRO polypeptide" and "PRO" as used herein refer to a variety of polypeptides, when immediately following a number, the full name (ie PRO / number) refers to a specific polypeptide sequence described herein. As used herein, "PRO / numeric polypeptide" and "PRO / numeric" (where numbers are represented by substantial numbers) are terms that include native sequence polypeptides and polypeptide variants (as further defined herein). The PRO polypeptides described herein can be isolated from various sources, such as human tissue or other sources, or can be produced recombinantly or synthetically.

"천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 자연으로부터 유도된 상응하는 PRO 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나 재조합 또는 합성 방법으로 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 구체적으로는 자연발생적으로 특정 PRO 폴리펩티드의 말단이 절단된 (truncated) 형태 또는 분비되는 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 이러한 폴리펩티드의 자연발생적 변이체 형태 (예컨대, 대체 스프라이싱된 형태) 및 자연발생적 대립 변이체를 포함한다. 본 발명의 여러 실시양태에서, 본 명세서에서 기재된 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 수반하는 도면에 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 개시 및 중지 코돈은 도면에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된다. 그러나, 본원에서 수반하는 도면에 개시된 PRO 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로 지칭되는 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나 있지만, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 위쪽 또는 아래쪽 부분에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 PRO 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로 사용될 수 있다."Native sequence PRO polypeptide" includes polypeptides having the same amino acid sequence as the corresponding PRO polypeptide derived from nature. Such native sequence PRO polypeptides can be isolated from nature or can be prepared by recombinant or synthetic methods. The term “natural sequence PRO polypeptide” specifically refers to a naturally occurring truncated or secreted form (eg, an extracellular domain sequence) of a particular PRO polypeptide, a naturally occurring variant form of such polypeptide (eg, , Alternative spliced forms) and naturally occurring allelic variants. In various embodiments of the present invention, a native sequence PRO polypeptide described herein is a mature or full length native sequence polypeptide comprising the full length amino acid sequence shown in the accompanying figures. Start and stop codons are indicated in bold and underlined in the figures. However, although the PRO polypeptides disclosed herein in the accompanying figures are shown to begin with methionine residues referred to in amino acid position 1 in the figures, other methionine residues located above or below amino acid position 1 in the figures are the starting amino acids of the PRO polypeptide. Can be used as a residue.

PRO 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 또는 세포질 도메인이 없는 PRO 폴리펩티드의 형태를 의미한다. PRO 폴리펩티드 ECD는 통상 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5% 미만으로 포함한다. 본 발명의 PRO 폴리펩티드에서 확인된 모든 막횡단 도메인은 당업계에서 소수성 도메인 유형을 밝히는 데 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된 것임을 이해해야 할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 다를 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 도메인의 말단에서 약 5개 아미노산내에 존재한다. 따라서, PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인은 임의로 실시예 및 상세한 설명에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인의 각 경계면에서 약 5개 이 하의 아미노산을 포함할 수 있고, 결합된 신호 펩티드가 있거나 없는 이러한 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 핵산은 본 발명에 포함된다.PRO polypeptide "extracellular domain" or "ECD" refers to a form of PRO polypeptide that is essentially free of transmembrane or cytoplasmic domains. PRO polypeptide ECD typically contains less than 1% of the transmembrane and / or cytoplasmic domains, preferably less than 0.5% of said domains. It will be understood that all transmembrane domains identified in the PRO polypeptides of the invention have been identified according to criteria commonly used to identify hydrophobic domain types in the art. The exact boundaries of the transmembrane domains may vary, but most are within about 5 amino acids at the ends of the domains first identified herein. Thus, the extracellular domain of a PRO polypeptide may optionally comprise up to about 5 amino acids at each interface of the transmembrane domain / extracellular domain identified in the Examples and the specification, and such polypeptide with or without bound signal peptide , And nucleic acids encoding them are included in the present invention.

본원에 개시된 다양한 PRO 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치는 본 명세서 및(또는) 수반하는 도면에 나타나 있다. 그러나, 신호 펩티드의 C-말단 경계는 다양할 수 있지만, 대부분 본원에서 처음 확인된 신호 펩티드 C-말단의 각 경계면에는 약 5개 이하의 아미노산이 존재할 수 있음을 알아야 하는데, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 당업계에서 아미노산 서열 요소의 타입을 확인하는 데 통상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다 (예를 들어, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) 및 von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). 게다가, 일부 경우에는 분비 폴리펩티드의 신호 서열의 절단이 전체적으로 통일성이 없어서 하나 이상의 분비 폴리펩티드를 생성시킨다는 것도 인지해야 한다. 신호 펩티드가 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단의 각 경계면에 있는 약 5개 이하의 아미노산내에서 절단된 경우, 이들 성숙 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다.The approximate location of the “signal peptides” of the various PRO polypeptides disclosed herein are shown herein and / or in the accompanying figures. However, although the C-terminal boundary of the signal peptide may vary, it should be appreciated that at most about 5 amino acids may be present at each interface of the signal peptide C-terminal first identified herein, wherein the C- Terminal boundaries can be identified according to criteria commonly used to identify the type of amino acid sequence element in the art (eg, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) and von Heinje et al., Nucl.Acids.Res. 14: 4683-4690 (1986)). In addition, it should be recognized that in some cases cleavage of the signal sequence of the secreting polypeptide is not entirely uniform resulting in one or more secreting polypeptides. If the signal peptide is cleaved within about 5 or less amino acids at each interface of the C-terminus of the signal peptide identified herein, these mature polypeptides, and polynucleotides encoding them, are also included in the present invention.

"PRO 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 앞서 또는 뒤에 정의된 활성 PRO 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 PRO 폴리펩티드 변이체로는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기 가 전장 천연 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단에 부가되거나 결실된 PRO 폴리펩티드가 있다. 통상, PRO 폴리펩티드 변이체는 본원에서 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상이다. 통상적으로, PRO 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 흔히 약 20개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 30개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 40개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 50개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 60개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 70 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 80 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 90 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 100 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 150 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 200 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 300 개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다.A "PRO polypeptide variant" refers to a full length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, a PRO polypeptide sequence without a signal peptide as disclosed herein, an extracellular domain of a PRO polypeptide with or without signal peptide as disclosed herein, or as disclosed herein. By active PRO polypeptide as defined before or after having at least about 80% amino acid sequence identity with any other fragment of the full length PRO polypeptide sequence. Such PRO polypeptide variants include, for example, PRO polypeptides wherein one or more amino acid residues are added or deleted at the N or C terminus of the full-length natural amino acid sequence. Typically, a PRO polypeptide variant is a full length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, a PRO polypeptide sequence without a signal peptide as disclosed herein, an extracellular domain of a PRO polypeptide with or without a signal peptide as disclosed herein, or as disclosed herein. Amino acid sequence identity with any other fragment of the full length PRO polypeptide sequence is at least about 80%, preferably at least about 81%, more preferably at least about 82%, more preferably at least about 83%, more preferably At least about 84%, more preferably at least about 85%, more preferably at least about 86%, more preferably at least about 87%, more preferably at least about 88%, more preferably at least about 89%, More preferably at least about 90%, more preferably at least about 91%, more preferably at least 92%, more preferably at least about 93%, more preferably at least about 94 At least about 95%, more preferably at least about 95%, more preferably at least about 96%, more preferably at least about 97%, more preferably at least about 98%, and most preferably at least about 99%. Typically, PRO variant polypeptides are at least about 10 amino acids in length, often at least about 20 amino acids, more often at least about 30 amino acids, more often at least about 40 amino acids, more often at least about 50 amino acids, More often at least about 60 amino acids, more often at least about 70 amino acids, more often at least about 80 amino acids, more often at least about 90 amino acids, more often at least about 100 amino acids, more often about 150 At least about amino acids, more often at least about 200 amino acids, more often at least about 300 amino acids or more.

아래에 나타낸 바와 같이, 표 1은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 완전한 원시 코드를 제공한다. 이 원시 코드는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공하는 UNIX 작동계 상에서 사용하기 위해 통상적으로 편집될 수 있다. As shown below, Table 1 provides the complete source code of the ALIGN-2 sequence comparison computer program. This source code can typically be edited for use on a UNIX operating system that provides an ALIGN-2 sequence comparison computer program.

추가로, 표 2A-2D는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 % 아미노산 서열 동일성 (표 2A-2B) 및 % 핵산 서열 동일성 (표 2C-2D)을 측정하기 위한 하기 기재된 방법을 사용하는 가설적인 실시예를 도시하며, 여기서, "PRO"는 관심있는 가정의 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드를 비교할 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "PRO-DNA"는 관심있는 가정의 PRO-코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자를 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.In addition, Tables 2A-2D hypothesize using the methods described below to determine% amino acid sequence identity (Table 2A-2B) and% nucleic acid sequence identity (Table 2C-2D) using the ALIGN-2 sequence comparison computer program. Illustrative examples, where "PRO" refers to the amino acid sequence of a PRO polypeptide of interest, "comparative protein" refers to the amino acid sequence of a polypeptide to which the "PRO" polypeptide of interest is to be compared, and "PRO-DNA" Represents the PRO-encoding nucleic acid sequence of the hypothesis of interest, "comparative DNA" represents the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule to which the "PRO-DNA" nucleic acid molecule of interest is to be compared, and "X", "Y" and "Z" respectively. Amino acid residues of different families are represented, and "N", "L" and "V" each represent nucleotides of different families.

<표 1>TABLE 1

<표 2A>TABLE 2A

<표 2B>TABLE 2B

<표 2C>TABLE 2C

<표 2D>TABLE 2D

본원에서 밝혀진 PRO 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 특정 PRO 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열들의 전 체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수도 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 도 248A-Q에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 도 248A-Q에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 다양하지 않다.“Amino acid sequence identity (%)” for a PRO polypeptide sequence as disclosed herein aligns a candidate sequence with a particular PRO polypeptide sequence and, where necessary, any conservative substitutions after introducing a gap to obtain a maximum of percent sequence identity. It is defined as the proportion of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid residues of a particular PRO polypeptide sequence without being considered part of. Alignment to determine percent amino acid sequence identity can be accomplished using a variety of methods known in the art, for example, readily available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Can be. One skilled in the art can determine suitable parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to maximize alignment over the entire length of the sequences being compared. However, for purposes herein,% amino acid sequence identity values may also be obtained using the sequence comparison computer program ALIGN-2, the complete source code for which the ALIGN-2 program is described in FIGS. 248A-Q. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was developed by Genentech, Inc., and the source code shown in FIGS. 248A-Q is stored as a user document of the U.S. Copyright Office (20559 Washington, DC), which code is registered in U.S. Copyright TXU510087 It is registered under the arc. The ALIGN-2 program is readily available through Genentech, Inc. (South San Francisco, Calif.) Or can be edited from the source code listed in Table 1. The ALIGN-2 program can be edited and used in a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set with the ALIGN-2 program and do not vary.

본원의 목적상 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.For the purposes herein, a given amino acid sequence identity (%) of a given amino acid sequence A to B, or a B to B (a given amino acid sequence B to a constant amino acid sequence identity (B) to B, or to B Can be expressed differently by a given amino acid sequence A having or including)).

X/Y ×100X / Y × 100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않 는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2A-2B는 "PRO"로 지칭하는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭하는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다. Where X is the number of amino acid residues recorded as equally matched by the sequence alignment program ALIGN-2 in the program alignment of A and B, and Y is the total number of amino acid residues in B. If the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, it will be appreciated that the amino acid sequence identity (A) of A to B is not equal to the amino acid sequence identity (B) of B to A. As an example of calculating amino acid sequence identity using this method, Tables 2A-2B show a method for calculating amino acid sequence identity (%) of an amino acid sequence referred to as a "comparative protein" to an amino acid sequence designated as "PRO".

달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 상기 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)을 이용하여 얻을 수도 있다. 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.Unless specifically stated otherwise, all% amino acid sequence identity values used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described above. However, amino acid sequence identity values (%) can also be obtained using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program It can be downloaded from the web site (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.) NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are for example unmasked = yes, Strand = All, Expected occurrence = 10, Minimum low complex length = 15/5, Multi-pass e-value = 0.01, Constant for multi-pass = 25, Dropoff for final gap alignment = 25 and Score matrix = BLOSUM62 It is set to the default value including.

NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.When NCBI-BLAST2 is used for amino acid sequence comparison, the amino acid sequence identity (%) of a given amino acid sequence A to B, or B to a given amino acid sequence B (for a given amino acid sequence B, to B, or to B) Or alternatively represented by a given amino acid sequence A having or including a certain percentage of amino acid sequence identity) is calculated as follows.

X/Y ×100X / Y × 100

여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.Where X is the number of amino acid residues that are reported to be matched identically by the sequence alignment program NCBI-BLAST2 in the NCBI-BLAST2 program alignment, and Y is the total number of amino acid residues in B. If the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, it will be appreciated that the amino acid sequence identity (%) of A to B is not equal to the amino acid sequence identity (%) of B to A.

아미노산 서열 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))를 이용하여 결정할 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해 아미노산 서열 동일성 값(%)은, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교되는 원하는 아미노산 서열 (즉, 원하는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 원하는 아미노산 서열이고 아미노산 서열 B는 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.Amino acid sequence identity values (%) can also be determined using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996)). Most of the WU-BLAST-2 search parameters are set to their default values. Those not set to the default values, ie adjustable parameters, are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word limit (T) = 11, and score matrix = BLOSUM62. To achieve the object herein,% amino acid sequence identity value is a desired amino acid sequence that is compared to the amino acid sequence of a desired PRO polypeptide having a sequence derived from a native PRO polypeptide (ie, a PRO variant as a sequence compared to a desired PRO polypeptide). The number of identical amino acid residues matched with the polypeptide) may be obtained by determining WU-BLAST-2, which is divided by the total amino acid residues of the desired PRO polypeptide. For example, a polypeptide comprising amino acid sequence A having at least 80% amino acid sequence identity with amino acid sequence B ", wherein amino acid sequence A is the desired amino acid sequence to compare and amino acid sequence B is the amino acid sequence of the desired PRO polypeptide.

"PRO 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO 변이체 핵산 서열"은 아래 정의된 바와 같은 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리핍티드 서열, 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 여타의 다른 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 보통 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리핍티드 서열, 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 여타의 다른 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. 변이체들은 천연 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.A "PRO variant polynucleotide" or "PRO variant nucleic acid sequence" is a nucleic acid molecule encoding an active PRO polypeptide as defined below, the full length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, full length native without signal peptide as disclosed herein A nucleic acid molecule having at least about 80% nucleic acid sequence identity with a nucleic acid sequence encoding any of the sequence PRO polypiped sequence, the extracellular domain of the PRO polypeptide disclosed herein, or any other fragment of the full length PRO polypeptide sequence disclosed herein. to be. Usually, PRO variant polynucleotides include a full length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, a full length native sequence PRO polypiped sequence without signal peptide as disclosed herein, the extracellular domain of a PRO polypeptide disclosed herein, or the full length PRO disclosed herein Nucleic acid sequence identity with a nucleic acid sequence encoding any of the other fragments of the polypeptide sequence is at least about 80%, preferably at least about 81%, more preferably at least about 82%, more preferably about 83% At least about 84%, more preferably at least about 85%, more preferably at least about 86%, more preferably at least about 87%, more preferably at least about 88%, more preferably Is at least about 89%, more preferably at least about 90%, more preferably at least about 91%, more preferably at least about 92%, more preferably at least about 93%, more Preferably at least about 94%, more preferably at least about 95%, more preferably at least about 96%, more preferably at least about 97%, more preferably at least about 98%, most preferably at least about 99 Will be more than%. Variants do not encompass the entire natural nucleotide sequence.

보통 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약 30개 이상의 뉴클레오티 드, 더 흔히는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 210 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.Usually PRO variant polynucleotides are at least about 30 nucleotides in length, more often at least about 60 nucleotides, more often at least about 90 nucleotides, more often at least about 120 nucleotides, more often about 150 At least about nucleotides, more often at least about 180 nucleotides, more often at least about 210 nucleotides, more often at least about 240 nucleotides, more often at least about 270 nucleotides, more often at least about 300 nucleotides, more Often at least about 450 nucleotides, more often at least about 600 nucleotides, more often at least about 900 nucleotides or more.

본원에서 확인된 PRO 코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 특정 PRO 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당분야에 숙련된 자들은 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기 위한 적당한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 핵산 서열 동일성 값 (%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수도 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 다양하지 않다. With respect to the PRO coding nucleic acid sequences identified herein, “% nucleic acid sequence identity” refers to the alignment of a particular PRO nucleic acid sequence with a candidate sequence and, if necessary, the introduction of a gap to obtain a maximum of sequence identity, followed by It is defined as the proportion of nucleotides of the candidate sequence that are identical to nucleotides. Alignment to determine percent nucleic acid sequence identity can be accomplished using a variety of methods known in the art, such as readily available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Can be. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared. However, for purposes herein,% nucleic acid sequence identity values can also be obtained using the sequence comparison computer program ALIGN-2, the complete source code for which the ALIGN-2 program is described in Table 1 below. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was developed by Genentech, Inc., and the source code shown in Table 1 is kept as a user document of the U.S. Copyright Office (20559 Washington, DC), which is coded under U.S. Copyright Registration TXU510087. It is registered. The ALIGN-2 program is readily available through Genentech, Inc. (South San Francisco, Calif.) Or can be edited from the source code listed in Table 1. The ALIGN-2 program can be edited and used in a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set with the ALIGN-2 program and do not vary.

본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.For the purposes herein, nucleic acid sequence identity (%) of a given nucleic acid sequence C to D, or D for a given nucleic acid sequence D (constant nucleic acid sequence identity (%) to a D, or D for a given nucleic acid sequence D) Can be expressed differently by a given nucleic acid sequence C containing or including).

W/Z ×100W / Z × 100

여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2C-2D는 "PRO-DNA"로 지칭하는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭하는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다. Where W is the number of nucleotides recorded as equally matched by the sequence alignment program ALIGN-2 in the program alignment of C and D, and Z is the total number of nucleotides in D. If the length of nucleic acid sequence C is not equal to the length of nucleic acid sequence D, it will be appreciated that the nucleic acid sequence identity (C) of C to D is not equal to the nucleic acid sequence identity (D) of D to C. As an example of nucleic acid sequence identity calculations, Tables 2C-2D show methods for calculating nucleic acid sequence identity (%) of nucleic acid sequences referred to as "comparative DNA" to nucleic acid sequences referred to as "PRO-DNA".

달리 구체적으로 명시하지 않는 한, 핵산 서열 동일성 (%)은 하기 기재된 서열 비교 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있다. 그러나, 핵산 서열 동일성 (%)은 하기 기재된 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.Unless specifically stated otherwise, nucleic acid sequence identity (%) can be obtained using the sequence comparison program ALIGN-2 described below. However,% nucleic acid sequence identity can also be calculated using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 described below (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program can be downloaded from the website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are, for example, unmask = yes, strand = all, expected occurrence = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0.01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gap alignment = 25 and score matrix = BLOSUM62.

NCBI-BLAST2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.When NCBI-BLAST2 is used for nucleic acid sequence comparison, the nucleic acid sequence identity (%) of a given nucleic acid sequence C to D, or to D (for a given nucleic acid sequence D, D, or D) Can be expressed differently by a given nucleic acid sequence C having or including a certain percentage (%) of nucleic acid sequence is calculated as follows.

W/Z ×100W / Z × 100

여기서, W는 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.Where W is the number of nucleotides recorded as equally matched by the sequence alignment program NCBI-BLAST2 in the program alignment and Z is the total number of nucleotides in D. If the length of nucleic acid sequence C is not equal to the length of nucleic acid sequence D, it will be appreciated that the nucleic acid sequence identity (C) of C to D is not equal to the nucleic acid sequence identity (D) of D to C.

추가로, 핵산 서열 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))를 이용하여 결정할 수도 있 다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해 핵산 서열 동일성 값(%)은, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 원하는 PRO 폴리펩티드의 핵산 서열과 비교되는 원하는 핵산 서열 (즉, 원하는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 원하는 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 총 뉴클레오티드 수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 원하는 핵산 서열이고 핵산 서열 B는 원하는 PRO 폴리펩티드의 핵산 서열이다.Additionally,% nucleic acid sequence identity values may be determined using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996)). Most of the WU-BLAST-2 search parameters are set to their default values. Those not set to the default values, ie adjustable parameters, are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word limit (T) = 11, and score matrix = BLOSUM62. To achieve the purpose herein,% nucleic acid sequence identity value is a PRO variant as the desired nucleic acid sequence to be compared with the nucleic acid sequence of the desired PRO polypeptide having a sequence derived from the native PRO polypeptide (ie, the sequence being compared with the desired PRO polypeptide). The same number of nucleotides that can be matched to the polypeptide) may be obtained by determining WU-BLAST-2, which is divided by the total number of nucleotides of the desired PRO polypeptide encoding nucleic acid molecule. For example, a polypeptide comprising nucleic acid sequence A having at least 80% nucleic acid sequence identity with nucleic acid sequence B ", wherein nucleic acid sequence A is the desired nucleic acid sequence to compare and nucleic acid sequence B is the nucleic acid sequence of the desired PRO polypeptide.

다른 실시양태에서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 4), 도 6 (서열 6), 도 8 (서열 8), 도 10 (서열 10), 도 12 (서열 12), 도 14 (서열 14), 도 16 (서열 16), 도 18 (서열 18), 도 20 (서열 20), 도 22 (서열 22), 도 24 (서열 24), 도 26 (서열 26), 도 28 (서열 28), 도 30 (서열 30) 및 도 32 (서열 32) 각각에 나타낸 전장 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO 변이체 폴리펩티드는 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.In other embodiments PRO variant polynucleotides are preferably shown in Figure 2 (SEQ ID NO: 2), Figure 4 (SEQ ID NO: 4), Figure 6 (SEQ ID NO: 6), Figure 8 (SEQ ID NO: 8), Figure 10 (SEQ ID NO: 2) under stringent hybridization and wash conditions. 10 (SEQ ID NO: 12), FIG. 14 (SEQ ID NO: 14), FIG. 16 (SEQ ID NO: 16), FIG. 18 (SEQ ID NO: 18), FIG. 20 (SEQ ID NO: 20), FIG. 22 (SEQ ID NO: 22), FIG. 24 (SEQ ID NO: 24). Encoding an active PRO polypeptide capable of hybridizing to the nucleotide sequence encoding the full length PRO polypeptide shown in FIG. 26 (SEQ ID NO: 26), FIG. 28 (SEQ ID NO: 28), FIG. 30 (SEQ ID NO: 30), and FIG. 32 (SEQ ID NO: 32). Is a nucleic acid molecule. The PRO variant polypeptide may be one encoded by a PRO variant polynucleotide.

상기한 바와 같이 수행되는 서열 비교의 내용에서 "양성"이란 용어는 동일하 지는 않으나 성질이 유사한 비교되는 서열의 아미노산 잔기를 의미한다. 원하는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 원하는 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 원하는 아미노산 잔기의 바람직한 치환체 (하기 표 3에 정의된 바와 같음)이다. In the context of sequence comparisons performed as described above, the term "positive" means amino acid residues of the compared sequences that are not identical but have similar properties. Amino acid residues that record positive values for the desired amino acid residues are either the same as the desired amino acid residues or are preferred substituents of the desired amino acid residues (as defined in Table 3 below).

본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.For purposes herein, a given amino acid sequence B has a positive value (%) of B and a given amino acid sequence A for B (with a given amino acid sequence B, a constant positive value (%) for B and B). Or otherwise represented by a given amino acid sequence A comprising), is calculated as follows.

X/Y ×100X / Y × 100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. Where X is the number of amino acid residues in the program alignment of A and B that records the positive value defined above by the sequence alignment program ALIGN-2, and Y is the total number of amino acid residues in B. If the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, it will be appreciated that the positive value (%) of A for B is not equal to the positive value (%) of B for A.

본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. PRO 폴리펩티드 자연 환경의 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.“Isolated,” as used to describe the various polypeptides disclosed herein, means that the polypeptide has been identified, isolated and / or recovered from its natural environmental elements. Contaminant elements of the polypeptide's natural environment generally interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the polypeptide is purified to (1) sufficient to obtain at least 15 residues of the N terminal or internal amino acid sequence using a spinning cup sequencer, or (2) Coomassie blue or preferably silver staining. Can be purified to show only one band in SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions. PRO Polypeptides Isolated polypeptides include polypeptides present in recombinant cells since at least one element of the natural environment will not be present. However, normally isolated polypeptide will be obtained by one or more purification steps.

PRO 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 또는 항-PRO 항체를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자란 PRO-코딩 핵산의 천연 출처 또는 항-PRO-코딩 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 관련되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 천연적으로 관련되어 있는 모든 성분과의 결합으로부터 자유로운 상태이다. 단리된 PRO-코딩 핵산 분자 또는 단리된 항-PRO-코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와는 다른 상태이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 PRO-코딩 핵산 분자 또는 항-PRO-코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 상기 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 경우, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 항-PRO 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자에는 통상적으로 PRO 폴리펩티드 또는 항-PRO 항체를 발현하는 세포에 함유된 PRO-핵산 분자 또는 항-PRO핵산 분자가 포함된다. An “isolated” nucleic acid encoding an PRO polypeptide or an “isolated” nucleic acid molecule encoding an anti-PRO antibody is one or more contaminants commonly associated with a natural source of PRO-encoding nucleic acid or a natural source of anti-PRO-encoding nucleic acid. Nucleic acid molecules identified and separated from nucleic acid molecules. Preferably, the isolated nucleic acid is free from binding with all naturally related components. An isolated PRO-encoding nucleic acid molecule or an isolated anti-PRO-encoding nucleic acid molecule is in a state different from the form or state found in nature. Thus, isolated nucleic acid molecules are distinguished from PRO-encoding nucleic acid molecules or anti-PRO-encoding nucleic acid molecules present in natural cells. However, for example, when the nucleic acid molecule is present at a different chromosome position from natural cells, an isolated nucleic acid molecule encoding a PRO polypeptide or an isolated nucleic acid molecule encoding an anti-PRO antibody is typically a PRO polypeptide or anti- PRO-nucleic acid molecules or anti-PROnucleic acid molecules contained in cells expressing PRO antibodies are included.

용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모 터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.The term "regulatory sequence" is a DNA sequence necessary for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism. Suitable regulatory sequences for prokaryotes include, for example, promoters, optionally operator sequences, and ribosomal binding sites. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals, and enhancers.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다. Nucleic acids are “operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. For example, the DNA of a presequence or secretion leader is operably linked to the DNA of the polypeptide when expressed as a shear protein, which is in the form before the polypeptide is secreted, and the promoter or enhancer affects the transcription of the polypeptide sequence. Is operably linked to the coding sequence, and the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence when positioned to facilitate translation. In general, "operably linked" means that the DNA sequences to be linked are located contiguously, and in the case of a secretory leader, not only are located contiguous, but also within the same reading frame. However, enhancers do not have to be contiguous. Linking is accomplished by ligation at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, the synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with conventional practice.

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보 다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.The "stringency" of the hybridization reaction can be readily determined by one skilled in the art and is generally an experimental calculation that depends on probe length, wash temperature, salt concentration. In general, longer probes require higher temperatures for proper annealing, while shorter probes require lower temperatures. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when complementary strands are present in an environment below their melting temperature. The higher the degree of desired homology between the probe and the hybridizable sequence, the higher the relative temperature that can be used. Therefore, the higher the relative temperature, the more severe the reaction conditions, while the lower the relative temperature, the less severe the reaction conditions. For further information and explanation regarding the stringency of the hybridization reaction, see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).

본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "엄격도가 높은 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어, 42 ℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50 % (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다."Strict conditions" or "high stringency conditions" as defined herein mean (1) 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% sodium dode at low ionic strength and high temperature, e.g. 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) /0.1% bovine serum containing formamide, eg, 42 ° C., 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate, under conditions using actual sulphate, or (2) upon hybridization Conditions using a modifier such as 50% (volume / volume) formamide made from albumin / 0.1% picol / 0.1% polyvinylpyrrolidone, (3) 50% formamide, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 Sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 × Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate Used at 42 ° C., 0.2 × SSC (sodium chloride / sodium citrate) at 42 ° C., and 55 Washed in 50% formamide, to perform a high-stringency wash with 0.1 x SSC containing EDTA at a 55 ℃.

"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989)에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 세기 및 %SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정액 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다."Medium stringency conditions" are those described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989, and are less stringent than hybridization conditions (e.g., , Temperature, ionic strength and% SDS). Examples of moderate stringency conditions include 20% formamide, 5 x SSC (150 mM sodium chloride, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 x Denhardt solution, 10% dextran sulfate and 20 The solution is incubated at 37 ° C. overnight in a solution containing mg / ml of truncated salmon sperm denatured DNA, followed by washing the filter with 1 × SSC at about 37-50 ° C. Those skilled in the art will know how to adjust the temperature, ionic strength, and the like necessary to match factors such as probe length and the like.

본원에 사용된 "에피토프 태그를 붙인"란 용어는 "태그 폴리펩티드"에 결합된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. "태그 폴리펩티드"가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 결합되는 PRO 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 아주 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 잔기).As used herein, the term “epitope tagged” refers to a chimeric polypeptide comprising a PRO polypeptide bound to a “tag polypeptide”. The "tag polypeptide" has enough residues to provide enough epitope to be made but short enough to not interfere with the activity of the PRO polypeptide to which it is bound. It is desirable that the tag polypeptide is so unique that its antibody does not substantially crosslink with other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have 6 or more amino acid residues and usually have about 8-50 amino acid residues (preferably about 10-20 residues).

PRO 변이체의 내용에서 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연발생 PRO 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PRO 단백질의 형태(들)을 말한다.In the context of a PRO variant, “active” or “active” refers to the form (s) of the PRO protein that retains the biological and / or immunological activity of the naturally occurring or naturally occurring PRO polypeptide.

본원에 개시된 스크리닝 검정법으로 확인할 수 있는 PRO 폴리펩티드에 대한 길항작용을 할 수 있는 분자 (예컨대, 유기 또는 무기 소분자, 펩티드 등)의 내용에서 "생물학적 활성"이란 본원에서 확인한 PRO 폴리펩티드와 결합하거나 결합체를 형성할 수 있거나, 혹은 달리 말하면 다른 세포 단백질과 PRO 폴리펩티드의 상호작 용을 방해하거나 아니면 PRO 폴리펩티드의 전사 또는 번역을 억제하는 분자의 능력을 말하는 데 사용된다. 특히, 바람직한 생물학적 활성은 동맥, 모세혈관, 정맥 및(또는) 림프관의 질환 및 암 뿐만 아니라 당뇨병과 같은, 혈관에 영향을 미치는 전신 질환에 작용하는 심비대증성 활성을 포함한다. In the context of molecules capable of antagonizing a PRO polypeptide (eg, organic or inorganic small molecules, peptides, etc.) as identified by the screening assays disclosed herein, "biological activity" refers to or forms a conjugate with the PRO polypeptide identified herein. Or, in other words, it is used to refer to a molecule's ability to interfere with the interaction of another cellular protein with a PRO polypeptide or to inhibit transcription or translation of the PRO polypeptide. In particular, preferred biological activities include cardiac hypertrophic activity that acts on diseases of arteries, capillaries, veins and / or lymphatics, as well as systemic diseases affecting blood vessels, such as diabetes.

용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어, 적용가능하다면 분열촉진 활성 또는 혈관신생 활성 중 하나 이상의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. PRO 폴리펩티드의 길항제는 세포 수용체와 PRO 폴리펩티드의 결합을 방해함으로써, PRO 폴리펩티드에 의해 활성화되는 세포를 무능력화시키거나 살해함으로써, 또는 세포 수용체와 PRO 폴리펩티드의 결합 후 혈관 내피세포 활성화를 방해함으로써 작용할 수 있다. PRO 폴리펩티드 길항제에 의한 이러한 모든 활성은 본 발명의 목적상 동일한 것으로 간주될 것이다. 상기 길항제는 PRO 폴리펩티드의 분열촉진 활성, 혈관신생 활성 또는 기타 생물학적 활성을 억제하므로, 예를 들어, 종양 및 특히 고형 악성 종양, 류마티스성 관절염, 건선, 죽상경화증, 당뇨병성 망막병증 및 기타 망막병증, 수정체후 섬유증식증, 연령-관련 황반 퇴화증, 신생혈관 녹내장, 혈관종, 갑상선 과다증식증 (그레이브스병을 포함함), 각막 및 기타 조직 이식, 및 만성 염증을 포함하여 원하지 않는 과도한 혈관신생이 특징인 질환 또는 질환의 치료에 유용하다. 또한, 길항제는 원하지 않는 과도한 혈관 투과성이 특징인 질환 또는 질환, 예컨대 뇌종양과 관련된 부종, 악성과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐 염증, 신증후군, 심낭유출 (예를 들어, 심낭염과 관련된 것) 및 흉막유출의 치료에 유용하다. 이와 비슷하게 용어 "아고니스트"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 흉내내는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 아고니스트 또는 길항제 분자로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 PRO 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다. The term “antagonist” is used in its broadest sense and partially, completely blocks, inhibits or neutralizes the biological activity of the natural PRO polypeptides disclosed herein, eg, one or more of, if applicable, fission promoting or angiogenic activity. Collectively referred to as all molecules. Antagonists of PRO polypeptides can act by interfering with the binding of cellular receptors to PRO polypeptides, by disabling or killing cells activated by the PRO polypeptides, or by interfering with vascular endothelial activation after binding of the cellular receptors and PRO polypeptides. . All such activities by PRO polypeptide antagonists will be considered identical for the purposes of the present invention. The antagonist inhibits the mitogenic activity, angiogenic activity or other biological activity of the PRO polypeptide, so that for example tumors and in particular solid malignancies, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic retinopathy and other retinopathy, Disorders characterized by undesired excessive angiogenesis, including post lens lens fibrosis, age-related macular degeneration, neovascular glaucoma, angioma, hyperthyroidism (including Graves' disease), cornea and other tissue transplantation, and chronic inflammation Or for the treatment of diseases. In addition, the antagonist may be a disease or condition characterized by undesirably excessive vascular permeability, such as edema associated with brain tumors, ascites associated with malignancy, Mages syndrome, pulmonary inflammation, nephrotic syndrome, pericardial outflow (eg, associated with pericarditis) Useful for the treatment of pleural effusion. Similarly, the term "agonist" is used in its broadest sense and refers to all molecules that mimic the biological activity of the native PRO polypeptides disclosed herein. Suitable agonist or antagonist molecules include, in particular, antibodies or fragments of agonists or antagonists, fragments or amino acid sequence variants of native PRO polypeptides, peptides, small organic molecules, and the like.

"소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 정의된다."Small molecule" is defined herein as having a molecular weight of less than about 500 Daltons.

본원에 사용된 용어 "PRO 폴리펩티드 수용체"란 PRO 폴리펩티드에 대한 세포 수용체, 통상적으로 혈관 내피세포 상에서 발견되는 세포-표면 수용체 뿐만 아니라 PRO 폴리펩티드에 결합하는 능력을 보유하는 그의 변이체를 말한다. As used herein, the term “PRO polypeptide receptor” refers to a cellular receptor for a PRO polypeptide, typically a cell-surface receptor found on vascular endothelial cells, as well as variants thereof that retain the ability to bind to a PRO polypeptide.

"항체" (Ab) 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 구조적 특징이 동일한 당단백질이다. 항체는 특정 항체에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 항원 특이성이 없는 기타 항체-유사 분자 둘다를 포함한다. 예를 들어, 항원 특이성이 없는 항체-유사 분자인 폴리펩티드는 림프계에서 낮은 농도로 생산되고 골수종에서 높은 농도로 생산된다. 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 온전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2종 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (원하는 생물학적 활성을 나타내는 경우)을 포괄하지만, 여기에 제한되지 않는다. "Antibodies" (Ab) and "immunoglobulins" (Ig) are glycoproteins with identical structural features. Antibodies exhibit binding specificity for certain antibodies, but immunoglobulins include both antibodies and other antibody-like molecules without antigen specificity. For example, polypeptides that are antibody-like molecules without antigen specificity are produced at low concentrations in the lymphatic system and at high concentrations in myeloma. The term “antibody” is used in its broadest sense and specifically refers to intact monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies) formed from two or more intact antibodies, and antibody fragments (desired In the case of exhibiting biological activity), but not limited thereto.

"천연 항체" 및 "천연 이뮤노글로불린"은 대개 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유결합성 이황화 결합에 의해 중쇄에 결합되어 있지만, 이황화 결합의 수는 다양한 이뮤노글로불린 동종형의 중쇄 사이에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 공간을 두고 떨어져 있는 쇄내 이황화 가교도 갖는다. 각 중쇄의 한 말단에는 많은 불변 도메인 다음의 가변 도메인 (V_H)이 있다. 각 경쇄의 한 쪽 말단에는 가변 도메인 (V_L)이 있고 다른 쪽 말단에는 불변 도메인이 있는데, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 접점을 형성하는 것으로 생각된다."Natural antibodies" and "natural immunoglobulins" are usually heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 daltons, composed of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H). Each light chain is bound to the heavy chain by one covalent disulfide bond, but the number of disulfide bonds varies between the heavy chains of various immunoglobulin isoforms. Each heavy and light chain also has regularly spaced apart intrachain disulfide bridges. At one end of each heavy chain is the variable domain (V _H ) following many constant domains. At one end of each light chain there is a variable domain (V _L ) and at the other end there is a constant domain, where the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. . Particular amino acid residues are believed to form a junction between the light chain and heavy chain variable domains.

용어 "가변"이란 가변 도메인의 일부가 항체들 사이에 서열상 광범위하게 상이하여 특정 항원과 각 특정 항체의 결합, 및 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 특이성에 사용된다는 것을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 골고루 분포되어 있지는 않다. 가변은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘다에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 과다가변 영역이라고 불리는 세 개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 높은 보존부는 골격 영역 (FR)이라고 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 3개의 CDR에 의해 연결된, β-시트 구조를 주로 취하는 4개의 FR 영역을 포함는데, 여기서 상기 3개의 CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 몇몇 경우에는 β-시크 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 아주 가깝게 모여 있고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에 있어서 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.The term "variable" refers to the fact that some of the variable domains differ widely in sequence between antibodies to be used for the binding of a specific antigen to each specific antibody and for the specificity of each specific antibody to a particular antigen. However, the variability is not evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. The variable is concentrated in three segments called complementarity-determining regions (CDRs) or hypervariable regions in both the light and heavy chain variable domains. The higher conserved regions of the variable domains are called the framework regions (FR). The variable domains of each of the natural heavy and light chains comprise four FR regions that predominantly take on the β-sheet structure, linked by three CDRs, where the three CDRs form a loop connecting the β-sheet structure, and several In the case, it forms part of the β-chic structure. The CDRs of each chain are very close together by the FR region and, together with the CDRs of the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibody (Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, See pages 647-669 (1991). The constant domains are not directly involved in binding the antibody to the antigen, but exhibit various effector functions such as the involvement of the antibody in antibody-dependent cytotoxicity.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10):1057-1062 (1995); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.An “antibody fragment” comprises a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding region or variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') ₂ and Fv fragments; Diabodies; Linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995); single-chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments, and the like.

항체를 파파인 (Papain) 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.Papain digestion of the antibody produces two identical antigen binding fragments, namely each "Fab" fragment with a single antigen binding site, and the remaining "Fc" fragments that reflect the ability to readily crystallize. Treatment of pepsin results in an F (ab ') ₂ fragment that has two antigen binding sites and still can cross-link antigen.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서 각 가변 도메인의 CDR 3개는 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다."Fv" is the minimum antibody fragment that contains a complete antigen recognition and antigen binding site. This region consists of a dimer consisting of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain that are tightly covalently bonded. In this structure, the three CDRs of each variable domain interact to form an antigen binding site on the surface of the V _H -V _L dimer. In conclusion, six CDRs confer antigen binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of the Fv containing only three CDRs specific for the antigen) has affinity than the entire binding site but has the ability to recognize and bind the antigen.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함 유한다. Fab' 단편은 몇 개의 잔기가 항체 힌지 (Hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 첨가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 말한다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.In addition, the Fab fragment contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab 'fragments differ from Fab fragments in that several residues have been added to the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain comprising one or more cysteines derived from the antibody hinge (Hinge) region. Fab'-SH herein refers to Fab 'in which the cysteine residue (s) of the constant domains bear free thiol groups. F (ab ') ₂ antibody fragments were originally produced as a pair of Fab' fragments with hinge cysteines between Fab 'fragments. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.

임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 항체의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.The "light chain" of an antibody (immunoglobulin) derived from any vertebrate species can be classified into one of two distinctly different types called kappa (κ) and lambda (λ) based on the amino acid sequence of the constant domain of the antibody. Can be.

이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 다양한 클래스로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 다양한 이뮤노글로불린류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 다양한 이뮤노글로불린류의 서브유닛 구조 및 3차원적 구조는 잘 공지되어 있다.Immunoglobulins can be classified into various classes depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains. Immunoglobulins have five main classes of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, some of which are further subclassed (isotypes), for example IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2. Can be classified. The heavy chain constant domains corresponding to the various immunoglobulins are called α, δ, ε, γ, and μ, respectively. Subunit structures and three-dimensional structures of various immunoglobulins are well known.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적인 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 말하는데, 즉 한 집단을 이루는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 매우 특이적이다. 게다가, 전형적으로 다양한 결정인자 (에피토프)에 대한 다양한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 집단과는 반대로 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 모노클로날 항체의 특이성 이외에도, 이들은 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식자 "모노클로날"은 실질적인 동종 항체 집단으로부터 수득한 항체의 특성을 나타내지만, 임의의 구체적 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al., Nature, 256: 459 (1975))에 처음 기재된 하이브리도마 방법으로 만들 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 예를 들어, 문헌 (Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다. The term "monoclonal antibody" as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homologous antibodies, ie the individual antibodies that make up a population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in small amounts. Monoclonal antibodies are very specific for a single antigenic site. In addition, each monoclonal antibody is directed against a single determinant on an antigen, as opposed to a typical (polyclonal) antibody population that typically includes a variety of antibodies against various determinants (epitopes). In addition to the specificity of monoclonal antibodies, they are advantageous in that they are synthesized by hybridoma culture that is not contaminated by other immunoglobulins. The modifier "monoclonal" characterizes the antibody obtained from a substantial homogeneous antibody population, but should not be construed as requiring production of the antibody by any specific method. For example, the monoclonal antibodies used according to the invention can be made by the hybridoma method first described in Kohler et al., Nature, 256: 459 (1975), or by recombinant DNA methods (eg , US Pat. No. 4,816,567). "Monoclonal antibodies" are described, for example, in Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991). It may also be isolated from phage antibody libraries using the techniques described in.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린)를 포함하는데, 상기 키메라 항체에서 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래한 항체 또는 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일 또는 상동성이 있지만, 상기 쇄의 나머지는 또다른 종으로부터 유래한 항체 또는 또다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편 (이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 경우)의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있다 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).Monoclonal antibodies herein specifically include “chimeric” antibodies (immunoglobulins) in which a portion of the heavy and / or light chains belong to a particular species or to a specific antibody class or subclass from a particular species. Although identical or homologous to the corresponding sequence of the antibody, the remainder of the chain refers to antibodies from another species or fragments of such antibodies as well as antibodies belonging to another antibody class or subclass (if they exhibit the desired biological activity). Identical or homologous to the corresponding sequence of US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984).

비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린쇄, 또는 그의 단편 (예컨대, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수령자의 CDR이 원하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 비인간종 (공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR 잔기로 바뀐 인간 이뮤노글로불린 (수령자 항체)이다. 몇몇 경우에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv FR 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화된 항체는 수령자 항체 및 이입된 CDR 또는 골격 서열 둘다에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 항체 수행능력을 개량하고 최대화하기 위해 추가로 이러한 수식을 한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 1종 이상, 및 전형적으로는 2종의 가변 도메인으로 구성되어 있을 것이고, 여기서 상기 가변 도메인내의 CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 이뮤노글로불린의 CDR 영역에 상응하고, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR 여역이다. 또한, 인간화된 항체는 바람직하게는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 일부를 포함할 것이다. 더 상세한 것을 위해서는, 문헌 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 322: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struc. Biol., 2: 593-596 (1992))을 참조한다. 인간화된 항체는 항체의 항원-결합 영역이 원하는 항원으로 마카크 원숭이를 면역화시켜 제조한 항체로부터 유도된 PRIMATIZED (상표명) 항체를 포함한다. A “humanized” form of a non-human (eg, murine) antibody is a chimeric immunoglobulin, an immunoglobulin chain, or fragment thereof comprising a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin (eg, Fv, Fab, Fab ', F (ab') ₂ or other antigen-binding subsequences). In most cases, the humanized antibody is a human immunoglobulin (recipient antibody) in which the recipient's CDRs have been replaced with CDR residues of a non-human species (donor antibody), such as a mouse, rat or rabbit, having the desired specificity, affinity and capacity. In some cases, Fv FR residues of human immunoglobulins are replaced with corresponding nonhuman residues. In addition, humanized antibodies may comprise residues that are not found in both the recipient antibody and the imported CDR or framework sequences. Further modifications are made to improve and maximize antibody performance. In general, a humanized antibody will consist substantially of one or more, and typically two, variable domains, wherein all or substantially all of the CDR regions within said variable domain correspond to the CDR regions of non-human immunoglobulins. And all or substantially all of the FR region is the FR region of the human immunoglobulin sequence. In addition, the humanized antibody will preferably comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically a portion of a human immunoglobulin. For further details, see Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 322: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struc. Biol. , 2: 593-596 (1992). Humanized antibodies include PRIMATIZED antibodies derived from antibodies wherein the antigen-binding region of the antibody is prepared by immunizing macaque monkeys with the desired antigen.

"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드쇄에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 V_H와 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는데, 이 링커는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성하게 한다. sFv를 조사하기 위해서는, 문헌 (Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. (Springer-Verlag: New York, 1994), pp. 269-315)을 참조한다."Single-chain Fv" or "sFv" antibody fragments comprise the V _H and V _L domains of an antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Preferably, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the V _H and V _L domains, which allows the sFv to form the desired structure for antigen binding. To examine sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. (Springer- Verlag: New York, 1994), pp. 269-315.

용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩티드쇄 (V_H-V_L)에 있는 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보적 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 문헌 (EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))에 보다 상세하게 기재되어 있다.The term "diabody" refers to a small antibody with two antigen binding sites, comprising a heavy chain variable domain (V _H ) linked to a light chain variable domain (V _L ) in the same polypeptide chain (V _H -V _L ). Say a short story. By using linkers that are too short to pair two domains on the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of the other chain to create two antigen binding sites. Diabodies are described, for example, in more detail in EP 404,097, WO93 / 11611 and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

"단리된" 항체란 자신의 천연 환경의 성분으로부터 확인되어 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료적 용도를 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량%를 초과하는 정도까지, 가장 바람직하게는 99 중량%를 초과하는 정도까지 정제되거나, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 시퀀서를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도까지 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 나타날 정도까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포내의 제자리 (in situ) 항체를 포함하는데, 이는 그 항체의 천연 환경에 있는 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.An “isolated” antibody is one that has been identified, isolated and / or recovered from components of its natural environment. Contaminant components of its natural environment are substances that interfere with diagnostic or therapeutic uses of antibodies and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody is purified (1) to more than 95% by weight, most preferably to more than 99% by weight as measured by the Lowry method, or (2) to a spinning cup ( spinning cup) purified to a degree sufficient to obtain at least 15 N-terminal or internal amino acid residues using a sequencer, or (3) SDS under reduced or non-reducing conditions using Coomassie blue, or preferably silver staining. It will be purified to the extent that it appears as one band by -PAGE. Isolated antibody includes an in situ antibody in the recombinant cell since at least one component in the antibody's natural environment will not be present. However, isolated antibodies will generally be purified by one or more purification steps.

"표지 (label)"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 검출될 수 있거나 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다. 탐지가능한 표지로 작용할 수 있는 레디오뉴클리드는 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67, Bi-212 및 Pd-109를 포함한다. 표지는 독소와 같은 탐지불가능한 것일 수도 있다."Label" as used herein refers to a detectable compound or composition that is conjugated directly or indirectly to an antibody to produce an "labeled" antibody. The label can be detected by itself (radioisotope label or fluorescent label) or, in the case of an enzyme label, can catalyze the chemical change of the detectable substrate compound or composition. Radionuclides that can act as detectable labels are, for example, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67, Bi-212 and Pd-109 It includes. The label may be an undetectable such as a toxin.

"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 여기서, 고려되는 고상의 예는 부분적으로 또는 전체적으로 유리로 형성된 것 (예를 들어, 조절된 세공 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 검정용 플레이트의 웰일 수 있으며, 다른 실시양 태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어, 친화 크로마토그래피 컬럼)일 수 있다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 개별 입자의 비연속적 고상도 포함한다."Solid phase" means a non-aqueous matrix to which an antibody of the invention may be attached. Here, examples of solid phases contemplated are those formed partially or entirely of glass (eg controlled pore glass), polysaccharides (eg agarose), polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol and silicone Etc. In certain embodiments, depending on the content, the solid phase may be the well of an assay plate, and in other embodiments the solid phase may be a purification column (eg, an affinity chromatography column). The term also encompasses discontinuous solid phases of individual particles, such as those described in US Pat. No. 4,275,149.

"리포좀"은 약물 (예를 들어, 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.A “liposome” is a small vesicle composed of various forms of lipids, phospholipids, and / or surfactants useful for delivering a drug (eg, a PRO polypeptide disclosed herein or an antibody thereto) to a mammal. The components of the liposomes are typically aligned in bilayer form, similar to the lipid alignment of the biofilm.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 (어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 보다는, 원하는 결합 특이성을 나타내는 (즉, "이종성") 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 결합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신내 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 이뮤노글로불린으로부터 얻을 수 있다. As used herein, the term “immunoadhesin” refers to an antibody-like molecule that combines the effector function of an immunoglobulin constant domain and the binding specificity of a heterologous protein (adhesin). Structurally, immunoadhesin comprises a combination of immunoglobulin constant domain sequences and amino acid sequences that exhibit the desired binding specificity (ie, "heterologous") rather than the antigen recognition and binding site of the antibody. The adhesin portion of an immunoadhesin molecule is typically a contiguous amino acid sequence comprising at least the binding site of a receptor or ligand. Immunoglobulin constant domain sequences in immunoadhesin may be any such as IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 subtypes, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM From immunoglobulins.

II. 본 발명의 조성물 및 방법II. Compositions and Methods of the Invention

A. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 변이체 A. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, and PRO887 Variants

본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 폴리펩티드 이외에, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 변이체도 제조될 수 있는 것으로 생각된다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 DNA에 도입하고(하거나), 원하는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 합성하여 제조할 수 있다. 당업자라면 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 멤브레인 앵커링 특성의 변화와 같은, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 번역후 프로세싱을 바꿀 수 있다는 것을 이해할 것이다.In addition to the full-length native sequences PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 polypeptides described herein, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, It is contemplated that PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 variants may also be produced. The PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 variants provide the appropriate nucleotide changes to the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205 , Into PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 DNA and / or to the desired PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878 , PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides can be synthesized. Those skilled in the art will appreciate that amino acid changes may include PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, such as changes in the number or position of glycosylation sites or changes in membrane anchoring properties. It will be appreciated that the post-translational processing of the PRO885 and PRO887 can be changed.

본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887; 또는 본원에 기재된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 여러 도메인에 있어서의 변이는 예를 들어, 미국 특 허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이유발 기술 및 지침 중 임의의 것을 이용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887과 비교할 때 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 아미노산 서열의 변화를 초래하는, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 하나 이상의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 도메인에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 변이시킨다. 원하는 활성에 악영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 서열을 공지된 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 아미노산 서열의 변화를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어, 류신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산의 삽입 또는 결실일 수 있다. 허용되는 변이는 서열내 아 미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 활성에 대해 생성된 변이체를 시험함으로써 결정할 수 있다.Full-length native sequences PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 as described herein; Or variations in the various domains of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 described herein are described, for example, in US Pat. And any of the conservative and non-conservative mutagenesis techniques and instructions disclosed in US Pat. No. 5,364,934. The mutation is compared with the natural sequences PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 when the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, which result in changes in the amino acid sequence of PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 It may be a substitution, deletion or insertion of one or more codons encoding PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Optionally, by substituting any other amino acid for one or more amino acids present in one or more of the domains PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 Variation Amino acid residues that can be inserted, substituted or deleted without adversely affecting the desired activity include PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or The sequence of PRO887 can be determined by comparing the sequence of known homologous protein molecules and minimizing changes in amino acid sequence in regions of high homology. Amino acid substitutions may be the result of substitution of one amino acid with another amino acid having similar structural and / or chemical properties, eg, replacement of leucine with serine, ie, conservative substitution of amino acids. Insertion or deletion may optionally be insertion or deletion of about 1 to 5 amino acids. Acceptable variations can be determined by systematically inserting, deleting or replacing amino acids in the sequence and testing the resulting variants for activity exhibited by full length or mature native sequences.

구체적인 실시양태에서, 관심있는 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 3에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 3에 예시적 치환으로 지칭되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다. In specific embodiments, conservative substitutions of interest are shown in Table 3 under the heading of preferred substitutions. When the biological activity is changed by such substitutions, more substantial changes, referred to as exemplary substitutions in Table 3 below or described in more detail below with respect to amino acid species, were introduced and the products were screened.

<표 3>TABLE 3

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성에서의 실질적인 수식은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어, 쉬이트 또는 나선 구조로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 용적이 큰 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변화시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:Substantial modifications in the functional or immunological identity of the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are determined by (a) Significantly alters the effect of maintaining the structure of the polypeptide backbone, for example, as a sheet or helical structure, (b) maintaining the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) maintaining a bulky side chain By selecting a substitution. Naturally occurring residues are divided into the following groups according to common side chain properties:

(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;(1) hydrophobic: norleucine, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;(2) neutral hydrophilic: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;(3) acidic: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;(4) basic: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및 (5) residues affecting chain orientation: gly, pro; And

(6) 방향족; trp, tyr, phe.(6) aromatic; trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 상기 군 중 하나의 구성원을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환된 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.Non-conservative substitutions will replace a member of one of the groups for another kind. In addition, such substituted residues may be introduced at conservative substitution sites or more preferably at the remaining (non-conserved) sites.

올리고뉴클레오티드 매개 (부위 특이적) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 변이시킬 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발법 [Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al., Gene,34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 적용하여 본 발명의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 변이체 DNA를 생성시킬 수 있다.Mutations can be made using methods known in the art such as oligonucleotide mediated (site specific) mutagenesis, alanine scanning and PCR mutagenesis. Site specific mutagenesis [Carter et al., Nucl. Acids Res. , 13 : 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. , 10 : 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al., Gene , 34 : 315 (1985)], restriction selection mutagenesis [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA , 317 : 415 (1986)] or other well-known techniques can be applied to cloned DNA to provide the present invention's PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879 , PRO882, PRO885 or PRO887 variant DNA can be generated.

또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 실시하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 베타-탄소 상의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 구조를 바꿀 가능성이 적기 때문에 이들 중 대표적인 바람직한 스캐닝 아미노산이다[Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 가장 흔한 아미노산이기 때문에 특히 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.Scanning amino acid assays can also be performed to identify one or more amino acids along adjacent sequences. Preferred scanning amino acids are relatively small neutral amino acids. Such amino acids include alanine, glycine, serine and cysteine. Alanine is a representative preferred scanning amino acid among them because it is less likely to remove the side chain on the beta-carbon and alter the backbone structure of the variant (Cunningham and Wells, Science , 244 : 1081-1085 (1989)). Alanine is also particularly preferred because it is the most common amino acid. In addition, alanine is frequently found both in buried and exposed locations [Creighton, The Proteins , (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. Mol. Biol. , 150 : 1 (1976). If alanine substitutions do not produce adequate amounts of variants, isotopic amino acids can be used.

B. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 수식 B. Formula of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 공유결합 수식은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 수식의 한 형태는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 선별된 측쇄, N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이중관능제를 사용한 유도체화는 예를 들어, 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 및 항-PRO887 항체를 정제하는 방법에 사용하기 위한 불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO를 가교결합시키거나, 그 반대로 가교결합시키는 데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이중관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이중관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.Covalent formulas of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 are included within the scope of the present invention. One form of a covalent formula modulates PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 with selected side chain, N-terminal or C-terminal residues. Reacting an organic derivatizing agent with a target amino acid residue of a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. Derivatizations with bifunctional agents are for example anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti- Crosslink PRO to an insoluble support matrix or surface, or vice versa, for use in a method of purifying PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 and anti-PRO887 antibodies. It is useful to combine. Commonly used crosslinkers include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters such as 4-azidosalicylic acid ester, Homobifunctional imidoesters, including disuccinimidyl esters such as 3,3'-dithiobis (succinimidylpropionate), bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,8-octane and Materials such as methyl-3-[(p-azidophenyl) dithio] propioimidate.

다른 수식으로는 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화시키는 것; 프롤린 및 리신의 히드록실화; 세릴 또는 트레오닐 잔기 중 히드록실기의 인산화; 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄 중 알파-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)]; N-말단 아민의 아세틸화; 및 C-말단 카르복실기의 아미드화가 있다.Other modifications include the deamidation of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively; Hydroxylation of proline and lysine; Phosphorylation of hydroxyl groups in seryl or threonyl residues; Methylation of alpha-amino groups in lysine, arginine and histidine side chains [TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties , WH Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983); Acetylation of N-terminal amines; And amidation of C-terminal carboxyl groups.

본 발명의 범위에 포함되는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 공유결합 수식의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원에서 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실(잠재적인 글리코실화 부위를 제거하거나, 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써 달성됨) 및(또는) 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 성질 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 질적 변화를 포함한다. Other types of covalent formulas of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides within the scope of the present invention Changes in glycosylation patterns. “Changes in the natural glycosylation pattern” herein refers to one or more carbohydrates found in the native sequences PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Deletion of residues (achieved by removing potential glycosylation sites or by deleting glycosylation by chemical and / or enzymatic methods) and / or native sequences PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205 , Addition of one or more glycosylation sites that are not present in PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. The term also encompasses qualitative changes in glycosylation of natural proteins, including changes in the nature and proportions of the various carbohydrate residues present.

글리코실화 부위를 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887폴리펩티드에 부가하는 것은 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 부가하거나, 상기 천연 서열 폴리펩티드를 상기 잔기로 치환시켜 달성할 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 아미노산 서열은 특히, 원하는 아미노산으로 번역될 코돈을 생성시키도록 미리 선택된 염기 에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통하여 임의로 변경시킬 수 있다.Adding a glycosylation site to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide can be achieved by changing the amino acid sequence . The change may, for example, add one or more serine or threonine residues to the native sequence PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887, This can be achieved by substituting the native sequence polypeptide with the residue (for O-linked glycosylation sites). The amino acid sequences PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are particularly selected at bases which are pre-selected to generate codons to be translated into the desired amino acids. Can be arbitrarily altered through changes in the DNA level by mutating DNA encoding the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 polypeptides. have.

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어, 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.Other means of increasing the number of carbohydrate moieties on a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides may be used to chemically bind glycosides to the polypeptide. Or coupling by enzymes. Such methods are described, for example, in WO 87/05330 published September 11, 1987 and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. , pp. 259-306 (1981).

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로, 효소에 의해, 또는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소적 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350(1987)].Removal of carbohydrate moieties present in PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides can be chemically, enzymatically, or glycosylated. It can be achieved by mutational substitution of codons encoding amino acid residues that serve as targets for. Chemical deglycosylation techniques are known in the art and are described, for example, in Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. , 259 : 52 (1987) and Edge et al., Anal. Biochem. , 118 : 131 (1981). Enzymatic cleavage of carbohydrate residues on a polypeptide can be accomplished using various endoglycosidases and exoglycosidases [Thotakura et al., Meth. Enzymol. , 138 : 350 (1987).

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 공유결합 수식의 다른 종류는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 결합시키는 것을 포함한다.Other types of covalent formulas of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are described in US Patent Nos. 4,640,835, 4,496,689, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882 in the manner described in Nos. 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 or 4,179,337. , PRO885 and PRO887 polypeptides to one of a variety of nonproteinaceous polymers, such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol or polyoxyalkylene.

또한, 본 발명의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 결합된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 수식될 수 있다. In addition, the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 of the present invention is PRO179, PRO238, It can be modified in such a way as to form chimeric molecules comprising PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887.

본 발명의 한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 결합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그 형태의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체, 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)]; 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.In one embodiment of the present invention, such chimeric molecules comprise a tagged polypeptide that provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind, and a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO333, PRO840, Combinations of PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Epitope tags are generally located at the amino or carboxyl termini of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. The presence of these epitope-tagged forms of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be detected using an antibody against a tagged polypeptide. Can be. In addition, the introduction of epitope tags allows for affinity purification using anti-tag antibodies, or other types of affinity matrices that bind to the epitope tags, and then the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840 , PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be easily purified. Various tag polypeptides and their respective antibodies are known in the art. Examples include poly-histidine or poly-histidine-glycine tags; flu HA tagged polypeptide and antibody 12CA5 thereof [Field et al., Mol. Cell. Biol. , 8 : 2159-2165 (1988); c-myc tag and 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto (Evan et al., Molecular and Cellular Biology , 5 : 3610-3636 (1985)); And herpes simplex virus glycoprotein D (gD) tag and its antibodies (Paborsky et al., Protein Engineering , 3 (6): 547-553 (1990)). Other tag polypeptides include Flag-peptide [Hopp et al., BioTechnology , 6 : 1204-1210 (1988)], KT3 epitope peptide [Martin et al., Science , 255 : 192-194 (1992)], alpha-tubulin Epitope peptides [Skinner et al., J. Biol. Chem. , 266 : 15163-15166 (1991)] and the T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 87 : 6393-6397 (1990).

다른 한 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 결합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태("이뮤노어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 이러한 결합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 결합체는 바람직하게는 Ig 분자내 1개 이상의 가변성 영역 대신에 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 폴리펩티드의 가용성(결실 또는 불활성화된 막횡단 도메인) 형태의 치환체를 포함한다. 특히 바람직한 한 실시태양에서, 이뮤노글로불린 결합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 결합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다. In another embodiment, the chimeric molecule is PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 and specific for immunoglobulins or immunoglobulins. Combinations of regions. In the case of the divalent form of the chimeric molecule (also referred to as "immunoadhesin"), this conjugate may be the Fc region of an IgG molecule. This Ig conjugate is preferably composed of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 polypeptides instead of one or more variable regions in the Ig molecule. Substituents in the form of soluble (deleted or inactivated transmembrane domains). In one particularly preferred embodiment, the immunoglobulin conjugate comprises a hinge, CH2 and CH3, or a hinge, CH1, CH2 and CH3 region of an IgG1 molecule. For a method of producing immunoglobulin conjugates, see US Pat. No. 5,428,130, published June 27, 1995.

C. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 제조 C. Manufacture of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887

본 발명은 본원에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887로 불리는 폴리펩티드를 코딩하는, 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. 별도의 발현 라운드에서 생산된 단백질의 PRO 숫자는 다를 수 있지만, UNQ 수는 임의의 해당 DNA 및 코딩된 단백질 특유의 것이며, 변하지 않을 것이다. 그러나, 본원에서는 간단하게, DNA16451-1388, DNA35600-1162, DNA47365-1206, DNA59838-1462, DNA44196-1353, DNA76532-1702, DNA30868, DNA34433, DNA41374, DNA53987, DNA58120, DNA58121, DNA58122, DNA58125, DNA58128 또는 DNA58130에 의해 코딩된 단백질 뿐만 아니라 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 상기 정의에 포함된 다른 천연 상동체 및 변이체를 이들의 출처 및 제조 방식과 상관없이 각각 "PRO179", "PRO238", "PRO364", "PRO844", "PRO846", "PRO1760", "PRO205", "PRO321", "PRO333", "PRO840", "PRO877", "PRO878", "PRO879", "PRO882", "PRO885" 또는 "PRO887"로 불를 것이다.The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to herein as PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. To provide. In particular, identifying cDNAs encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, as described in more detail in the Examples below. And isolated. The PRO number of proteins produced in separate rounds of expression may vary, but UNQ numbers are specific to any given DNA and encoded protein and will not change. However, here, simply, DNA16451-1388, DNA35600-1162, DNA47365-1206, DNA59838-1462, DNA44196-1353, DNA76532-1702, DNA30868, DNA34433, DNA41374, DNA53987, DNA58120, DNA58121, DNA58122, DNA58125, DNA58128 or DNA58130 In addition to the proteins encoded by the other natural homologues and variants included in the above definitions of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO887 "PRO179", "PRO238", "PRO364", "PRO844", "PRO846", "PRO1760", "PRO205", "PRO321", "PRO333", "PRO840" It will be called "PRO877", "PRO878", "PRO879", "PRO882", "PRO885" or "PRO887".

이하에 설명되는 내용은 주로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 제조하는 것도 고려된다. 예를 들어, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 이용하는 직접 펩티드 합성법으로 제조할 수 있다 [문헌 (Stewart et al., Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963))을 참조함]. 시험관내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스 펩티드 합성기( Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 다양한 일부를 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합함으로써 전장 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 제조할 수 있다.The following description mainly involves transformation with a vector containing nucleic acids encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides. Or it relates to a method for producing PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 by culturing the transfected cells. Of course, it is also contemplated to prepare PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides using other methods known in the art. . For example, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide sequences or fragments thereof are prepared by direct peptide synthesis using solid phase technology See Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis , WH Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 85 : 2149-2154 (1963). Reference]. In vitro protein synthesis can be performed using manual or automated methods. Automated synthesis can be performed using, for example, an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) according to the manufacturer's instructions. By chemically synthesizing various parts of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 separately and combining them using chemical or enzymatic methods Full length PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides can be prepared.

i. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA의 단리i . Isolation of DNA coding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PRO179, 인간 PRO238, 인간 PRO364, 인간 PRO844, 인간 PRO846, 인간 PRO1760, 인간 PRO205, 인간 PRO321, 인간 PRO333, 인간 PRO840, 인간 PRO877, 인간 PRO878, 인간 PRO879, 인간 PRO882, 인간 PRO885 또는 인간 PRO887을 코딩하는 DNA는 실시예에 기재된 바와 같은, 인체 조직으로부터 유래한 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. 또한, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 올리고뉴클레오티드 합성으로 수득할 수 있다.DNA encoding the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides may be selected from the following classes: PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205 MRNAs encoding, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be obtained from cDNA libraries prepared from tissues that are believed to possess and express them at detectable levels. Thus, human PRO179, human PRO238, human PRO364, human PRO844, human PRO846, human PRO1760, human PRO205, human PRO321, human PRO333, human PRO840, human PRO877, human PRO878, human PRO879, human PRO882, human PRO885 or human PRO887 DNA encoding may be conveniently obtained from a cDNA library derived from human tissue, as described in the Examples. In addition, genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are obtained from genomic libraries or by oligonucleotide synthesis. can do.

라이브러리는 원하는 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 디자인된 프로브 (예를 들어, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자 를 단리하는 별법은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].The library can be a probe designed to identify a desired gene or a protein encoded by the gene (e.g., PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, Screened using an antibody against a PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide or an oligonucleotide consisting of about 20 to 80 or more bases). Screening of cDNAs or genomic libraries using selected probes is performed using standard methods, for example, as described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989). Can be done. An alternative to isolate genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 is by using the PCR method [Sambrook et al. , Supra ; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995).

하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 원하지 않는 결과를 최소화하기 위해서 길이가 충분하고 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리의 DNA와 혼성화시 검출될 수 있도록 표지하는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, ³²P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도의 엄격도 및 높은 엄격도를 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에서 제공된다.The following examples illustrate techniques for screening cDNA libraries. Oligonucleotide sequences selected as probes should be sequences of sufficient length and clarity to minimize unwanted results. Oligonucleotides are preferably labeled so that they can be detected upon hybridization with the DNA of the library being screened. Labeling methods are known in the art and include the use of radiolabels, biotinylation or enzyme labels, such as ³² P-labeled ATP. Stringency and hybridization conditions including the high stringency of the medium is provided in the literature (Sambrook et al., Supra).

상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이타베이스 또는 다른 독점 서열 데이타베이스에 기탁되어 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 상동성을 측정하기 위해 다양한 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예컨대, ALIGN, DNAstar 및 INHERIT를 사용하여 서열 정렬을 통해 결정할 수 있다. The sequences identified in the library screening method can be aligned in comparison to other known sequences that can be deposited and obtained in public databases such as GenBank or other proprietary sequence databases. Sequence identity (at the amino acid or nucleotide level) within a defined region of a molecule or across the full length sequence is determined through sequence alignment using computer software programs, such as ALIGN, DNAstar and INHERIT, that use various algorithms to determine homology. Can be.

단백질 코딩 서열이 있는 핵산은 먼저 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고, 필요하다면, 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 연장 방법을 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이 브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않는 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.If the nucleic acid in the protein coding sequence is first necessary to use the estimated amino acid sequence disclosed herein, and the reference to detect the precursor using conventional methods of primer extension as described in (Sambrook et al., Supra), selected cDNA or Genomic libraries can be obtained by screening and processing intermediates of mRNA that are not reverse transcribed into cDNA.

ii. 숙주 세포의 선별 및 형질전환ii. Selection and Transformation of Host Cells

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 생산을 위해, 숙주 세포를 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지에서 배양한다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.For production of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887, the host cells are transfected with the expression or cloning vectors described herein or The cells are transformed and cultured in a conventional nutrient medium modified to be suitable for promoter induction, transformant selection, or gene amplification encoding a desired sequence. Those skilled in the art can select culture conditions such as medium, temperature, pH, etc. without performing unnecessary experiments. In general, principles, protocols and practice techniques for maximizing the productivity of cell cultures are described in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach , M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., May be found in the above document.

형질감염 방법, 예를 들어, CaPO₄ 처리 및 일렉트로포레이션은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 이용하여 수행한다. 원핵세포 또는 실질적인 세포벽을 함유하는 다른 세포의 경우, 일반적으로 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리, 또는 일렉트로포레이션을 이용한다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용한다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주계 형질감염의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:949(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행한다. 그러나, 세포내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어, 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 온전한 세포와의 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온(polycation), 예를 들어, 폴리브렌 또는 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.Transfection methods such as CaPO ₄ treatment and electroporation are known to those skilled in the art. Depending on the host cell used, transformation is carried out using standard techniques suitable for the cell. For other cells that contain substantial cell wall, or a prokaryotic cell, in general, the literature uses a calcium treatment using calcium chloride method as described in (Sambrook et al., Supra), or electroporation. Infection with Agrobacterium tumefaciens has been described in certain plant cells as described in Shaw et al., Gene , 23 : 315 (1983) and WO 89/05859 published June 29, 1989. Used for transformation. For mammalian cells without such cell walls, the calcium phosphate precipitation method of Graham and van der Eb, Virology , 52 : 456-457 (1978) can be used. General characteristics of mammalian cell host-based transfections are described in US Pat. No. 4,399,216. Transformation into yeast is generally described by Van Solingen et al., J. Bact. 130 : 949 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) , 76 : 3829 (1979)]. However, other methods of introducing DNA into cells, such as intranuclear microinjection, electroporation, bacterial protoplast fusion with intact cells, or polycations such as polybrene or polyornithine can also be used. Can be. For several techniques for transformation of mammalian cells, see Keown et al., Methods in Enzymology , 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature , 336: 348-352 (1988). do.

본원에서 벡터내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어, 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어, 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적당한 원핵생물 숙주 세포는 에셔리키아(Eshcerichia), 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella)와 같은 장내세균 (Enterobacteriaceae), 비. 서브틸리스 (subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P)와 같은 바실러스 (Bacillus), 피. 아에루기노사 (aeruginosa)와 같은 슈도모나스 (Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 수식될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4, 및 1990년 8월 7일 간행된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 돌연변이체인 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 다른 핵산 폴리머 라제 반응이 적합하다.Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors herein include prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cells. Suitable prokaryotic cells are sedative bacteria, eg, gram negative or gram positive organisms, such as E. coli. E. coli including, Enterobacter bacteria seae (Enterobacteriaceae), such as (E. coli), but not always limited thereto. A variety of teeth. E. coli strains, for example, 2. E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537). E. coli strains W3110 (ATCC 27,325) and K5 772 (ATCC 53,635) are readily available. Other suitable prokaryotic host cells are Eshcerichia , for example E. coli . E. coli, Enterobacter (Enterobacter), El Winiah (Erwinia), keulrep when Ella (Klebsiella), Proteus (Proteus), Salmonella (Salmonella), e.g., Salmonella typhimurium (typhimurium), Serratia marcescens (Serratia), for example, . g., Serratia dry process intestinal bacteria (Enterobacteriaceae), such as a non-kanseu (marcescans) and Shigella (Shigella). Subtilis and b. Bacillus , p. Such as licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P described in DD 266,710, published April 12, 1989). Rugi the Oh and a Pseudomonas (Pseudomonas), and Streptomyces (Streptomyces), such as industrial (aeruginosa). These examples are illustrative only and not intended to be limiting. Strain W3110 is a particularly preferred host or host because it is a common host strain for recombinant DNA product fermentation. Preferably, the host cell secretes minimal amounts of proteolytic enzymes. For example, strain W3110 can be modified to result in a mutation of the gene encoding the host's endogenous protein, an example of such a host having an E. E. coli W3110 strain 1A2, E. with a complete genotype tonA ptr3. E. coli W3110 strain 9E4, E. coli with the full genotype tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan ^r . E. coli W3110 strain 27C7 (ATCC 55,244), E. coli with the complete genotype tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degPOmpT rbs7 ilvG kan ^r . E. coli W3110 strain 37D6, strain 37D6 with a non-kanamycin resistant degP deletion mutation. E. coli W3110 strain 40B4, and the Periplasm protease mutant disclosed in US Pat. No. 4,946,783, published August 7, 1990. E. coli strains. Alternatively, in vitro cloning methods such as PCR or other nucleic acid polymerase reactions are suitable.

원핵세포 이외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵미생물이 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어, 케이. 락티스 (lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), 케이. 프라질리스 (fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 테르모톨레란스 (thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa; Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어, 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어, 에이. 니둘란스 (nidulans) (Ballance et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (niger) (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 있다. 본원에는 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 이 효모에는 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 증식할 수 있는 효모가 있으나 이에 한정되지 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 기재되어 있다.In addition to prokaryotic cells, eukaryotic microbes such as fibrous fungi or yeast are suitable for vectors encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Cloning or expression host. Saccharomyces cerevisiae is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. Other microorganisms include Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature , 290: 140 [1981]; EP 139,383, published May 2, 1985); Kluyveromyces host (US Pat. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio / Technology , 9: 968-975 (1991)), eg, K. Lactis (lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574;.. Louvencourt et al, J. Bacteriol, 737 [1983]), Kay. Plastic jilriseu (fragilis) (ATCC 12,424), K. Bulgaria kusu (bulgaricus) (ATCC 16,045), K. Wike lamina (wickeramii) (ATCC 24,178), K. Waltii (ATCC 56,500), K. Drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology , 8: 135 (1990)), K. Thermotolerans and K. Marxianus ; Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. , 28: 265-278 [1988]); Candida (Candida); Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces , eg, ciwaniomyses occidentalis (EP 394,538, published October 31, 1990); And fibrous fungi such as neurospora, Penicillium , Tolypocladium (WO 91/00357 published January 10, 1991) and Aspergillus hosts, eg For example, a. Nidul lance (nidulans) (Ballance et al ,, Biochem Res Commun Biophys, 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al, Gene, 26:..... 205-221 [1983]; Yelton et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81: 1470-1474 [1984]) and A. Needle germanium (niger): a (Kelly and Hynes, EMBO J., 4 475-479 [1985]). Herein it is suitable for a methyl auxotrophic yeast, and the yeast century Cronulla (Hansenula), Candida (Candida), the claw exciter Mosquera (Kloeckera), blood teeth, saccharose to my process, Sat. rulrop sheath (Torulopsis) and also torulra ( Rhodotorula ), but is not limited to yeast capable of growing on methanol, selected from the genus consisting of. For a list of specific species that are examples of these types of yeast, see C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs , 269 (1982).

글리코실화된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환 된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양액에서 증식시키기 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 당업계의 숙련가라면 적합한 숙주 세포를 선택할 수 있다.Suitable host cells for the expression of nucleic acids encoding glycosylated PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are derived from multicellular organisms. . Examples of invertebrate cells include insect cells and plant cells, such as Drosophila S2 and Spodofterra Sf9. Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) cells and COS cells. More specific examples include monkey kidney CV1 cell line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), human embryonic kidney cell line (293 cells or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J Gen Virol. , 36:59 (1997)), Chinese Hamster Ovary Cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 77: 4216 (1980)), Mouse Sertoli Cells ( TM4, Mather, Biol. Reprod. , 23: 243-251 (1980)), human lung cells (W138, ATCC CCL 75), human hepatocytes (Hep G2, HB 8065) and mouse mammary tumors (MMT 060562, ATCC CCL51) This includes. One skilled in the art can select a suitable host cell.

iii. 복제가능 벡터의 선별 및 사용iii. Selection and use of replicable vectors

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 DNA를 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 서열이 분비되는 경우, 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적당한 벡터의 제작은 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.Nucleic acids (eg, cDNA or genomic DNA) encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are cloned (DNA Amplification) or insert into a replicable vector for expression. Various vectors can be easily obtained. For example, the vector may be in the form of a plasmid, cosmid, viral particles or phage. Suitable nucleic acid sequences can be inserted into the vector by various methods. In general, DNA is inserted into suitable restriction endonuclease site (s) using techniques known in the art. When sequences are secreted, vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, origins of replication, one or more marker genes, enhancer elements, promoters, and transcription termination sequences. Construction of suitable vectors comprising one or more of these components uses standard ligation techniques known to those skilled in the art.

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887은 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위가 있는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터내로 삽입된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 장내독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비의 경우, 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)를 포함함), 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179), 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포에서 발현시키는 경우, 포유동물 신호 서열, 예를 들어, 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터 유래된 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질을 분비시킬 수 있다.PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be produced by direct recombination methods as well as N- of mature proteins or polypeptides. It can be produced as a fusion polypeptide with a heterologous polypeptide, which can be another polypeptide or signal sequence with a specific cleavage site at the end. In general, the signal sequence may be a component of a vector or may encode PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 inserted into the vector. May be part of the DNA. The signal sequence can be, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, signal sequences include, for example, yeast invertase leader, α factor leader (including Saccharomyces and Kluyveromyces α-factor leader (US Pat. No. 5,010,182)), acid phosphatase leader, Seed. C. albicans glucoamylase leader (EP 362,179 published April 4, 1990), or the signal sequence described in WO 90/13646 published November 15, 1990. When expressed in mammalian cells, the protein may be secreted using mammalian signal sequences, eg, signal sequences derived from secretory polypeptides of the same or related species and viral secretion leaders.

발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 하나 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ의 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는 데 유용하다. Both expression and cloning vectors contain nucleic acid sequences that allow the vector to replicate in one or more selected host cells. Such sequences are known for various bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication of plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, 2 μm of plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are used to clone vectors in mammalian cells. Useful for

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선별가능한 마커로도 불리는 선별 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결핍을 보충하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 입수할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩하는데, 예를 들어, 바실러스 (Bacillus)의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자가 있다. Expression and cloning vectors will typically contain a selection gene, also called a selectable marker. Representative selection genes are from (a) proteins that confer resistance to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, neomycin, methotrexate, or tetracycline, (b) proteins that supplement trophic deficiency, or (c) complex media. There are genes encoding proteins that supply important nutrients that are not available, for example Bacillus , which encodes a D-alanine racemase.

포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어, DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 사용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 없는 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판이 함유된 배지에서 증식할 수 없는 효모의 돌연변이주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. Examples of selectable markers suitable for mammalian cells can accommodate nucleic acids encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. One that enables the identification of resident cells, for example DHFR or thymidine kinase. When wild type DHFR is used, a suitable host cell is a CHO cell line without DHFR activity, see Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 77: 4216 (1980). Suitable selection genes for use in yeast are the trp1 gene present in yeast plasmid YRp7 [Stinchcomb et al., Nature , 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene , 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene , 10: 157 (1980)]. The trp1 gene provides a selection marker for mutant strains of yeast that cannot proliferate in medium containing tryptophan (eg, ATCC 44076 or PEP4-1) [Jones, Genetics , 85: 12 (1977)].

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA로 합성되는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, Nucleic Acid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 프로모터 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]가 있다. 또한, 세균계에서 사용되는 프로모터는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결합된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 포함할 것이다.Expression and cloning vectors are generally operable to nucleic acid sequences encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 synthesized with mRNA. It contains a promoter that is bound to it. Promoters recognized by various potential host cells are known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include the β-lactamase and lactose promoter systems [Chang et al., Nature , 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature , 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system [Goeddel, Nucleic Acid Res. , 8: 4057 (1980); EP 36,776, and hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 80: 21-25 (1983). In addition, promoters used in the bacterial system are operably linked to DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Will include the Shine-Dalgarno (SD) sequence.

효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리 오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.Examples of promoter sequences suitable for use in yeast hosts are described by 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. , 255: 2073 (1980)] or other glycolysis enzymes [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. , 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry , 17: 4900 (1978)], for example enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose- Promoters for 6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triosphosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase.

증식 조건에 의해 조절되는 전사의 다른 장점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제73,657호에 더 기재되어 있다. Other yeast promoters, which are inducible promoters with other advantages of transcription controlled by proliferative conditions, include alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degrading enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, glyceraldehyde- Promoter region for 3-phosphate dehydrogenase, and enzymes that act on maltose and galactose use. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in EP 73,657.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 핵산 전사는 예컨대, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 제2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 프로모터; 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터; 및 열-충격 프로모터로에 의해 조절되는데, 단, 상기 프로모터는 숙주 세포와 상용가능하다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 nucleic acid transcription from a vector in a mammalian host cell, for example, polyoma virus, poultry virus (UK 2,211,504 published July 5, 1989), adenoviruses (eg, adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and monkey virus 40 Promoters obtained from the genome of a virus such as (SV40); Heterologous mammalian promoters such as actin promoters or immunoglobulin promoters; And heat-shock promoters, provided that the promoters are compatible with the host cell.

고등 진핵세포에 의한 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있 다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는, 약 10 내지 300 bp DNA의 시스-액팅 요소이다. 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 후측에 있는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후측에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 있다. 인핸서는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.Transcription of DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 by higher eukaryotic cells by inserting an enhancer sequence into the vector Can be increased. Enhancers are generally cis-acting elements of about 10 to 300 bp DNA that act on the promoter to increase transcription. Many enhancer sequences are known to be derived from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer derived from a eukaryotic virus. Examples include the SV40 enhancer (bp 100-270) at the back of the origin of replication, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer at the back of the origin of replication, and adenovirus enhancers. Enhancer splices into vectors at 5 'or 3' positions of sequences coding for PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 However, it is preferably located at the 5 'site from the promoter.

또한, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵세포나 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 종종, 3' 비번역 영역으로부터 얻어진다. 이들 영역은 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 포함한다. In addition, expression vectors for use in eukaryotic host cells (multinuclear cells derived from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans or other multicellular organisms) will include sequences necessary for transcription termination and mRNA stabilization. Such sequences are typically obtained from the 5 'and, often, 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNAs or cDNAs. These regions are transcribed as polyadenylation fragments in the untranslated portion of mRNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Nucleotide fragments.

재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 합성에 적용하는 데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.Other methods, vectors and hosts suitable for application to the synthesis of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in recombinant vertebrate cell culture. Cells are described in Goting et al., Nature , 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature , 281: 40-46 (1979); EP 117,060 and EP 117,058.

iv. 유전자 증폭/발현의 검출iv. Detection of Gene Amplification / Expression

유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어, 통상의 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블로팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 돗 블로팅 (DNA 분석), 또는 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 제자리 (in situ) 혼성화를 통해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄, 및 DNA-RNA 혼성 이중쇄 또는 DNA-단백질 이중쇄를 비롯한 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 상기 항체는 표지할 수 있고, 상기 이중쇄를 표면에 결합시켜 표면 상에 이중쇄가 형성될 때 이중쇄에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있는 경우에는 상기 검정법을 수행할 수 있다.Gene amplification and / or expression may be, for example, conventional Southern blotting, Northern blotting to quantify transcription of mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 77: 5201-5205 (1980)], dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization with appropriately labeled probes based on the sequences provided herein. have. Alternatively, antibodies can be used that recognize specific double chains, including DNA double strands, RNA double strands, and DNA-RNA hybrid double strands or DNA-protein double strands. The assay can be carried out when the antibody can be labeled and the presence of the antibody bound to the double chain can be detected when the double chain is bound to the surface to detect the double chain formed on the surface.

별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석을 통해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 본원에 제공된 DNA 서열을 기초로 한 합 성 펩티드, 또는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA에 결합되어 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.Alternatively, gene expression can be measured through immunological methods such as immunohistochemical staining of cells or tissue sections and analysis of cell culture or body fluids for direct quantification of expression of gene products. Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or analysis of sample solutions can be monoclonal or polyclonal antibodies and can be prepared in any mammal. Conveniently, synthesis based on the native sequence PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, DNA sequence provided herein To an exogenous sequence that binds to a peptide or to a DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 to encode a specific antibody epitope. Antibodies can be prepared.

v. 폴리펩티드의 정제v. Purification of Polypeptides

폴리펩티드 형태의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887은 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 상기 폴리펩티드가 멤브레인에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어, Triton-X (상표명) 100)을 사용하거나 효소를 사용한 절단을 통해 멤브레인으로부터 유리시킬 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단으로 분해시킬 수 있다.PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in polypeptide form can be recovered from the culture medium or host cell lysate. When the polypeptide binds to the membrane, it can be liberated from the membrane using a suitable detergent solution (eg, Triton-X ™ 100) or via cleavage with an enzyme. Cells used for the expression of nucleic acids encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides were subjected to freeze-thaw cycles, sonication. It can be degraded by various physical or chemical means, such as mechanical grinding or cell lysate.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예는 이온 교환 컬럼 상 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어, DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 (Sephadex) G- 75를 사용한 겔 여과; IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 에피토프 태그 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어, 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 특성에 따라 달라질 것이다.It may be desirable to purify PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides from recombinant cellular proteins or polypeptides. Examples of suitable purification methods include fractionation on an ion exchange column; Ethanol precipitation; Reverse phase HPLC; Chromatography on silica or cation exchange resins such as DEAE, chromatographic focusing; SDS-PAGE; Ammonium sulfate precipitation; Gel filtration using, for example, Sephadex G-75; Protein A Sepharose column to remove contaminants such as IgG; And metal chelating columns for binding epitope tag forms of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides. Various methods of protein purification can be used and such methods are known in the art and are described, for example, in Deutscher, Methods in Enzymology , 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice , Springer-Verlag, New York (1982). The purification step (s) selected is, for example, the production method used and the specific PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or It will depend on the nature of the PRO887.

D. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 용도D. Uses of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 Polypeptides

i. 심혈관과 관련된 활성, 내피세포와 관련된 활성 및 혈관신생 활성에 대한 검정i. Assays for cardiovascular activity, endothelial activity and angiogenic activity

다양한 검정법을 이용하여 심혈관과 관련된 활성, 내피세포와 관련된 활성 및 혈관신생 활성에 대해 본원의 폴리펩티드를 시험할 수 있다. 이러한 검정법은 하기 실시예에 기재된 것을 포함한다. Various assays can be used to test the polypeptides herein for cardiovascular activity, endothelial activity, and angiogenic activity. Such assays include those described in the Examples below.

미국 특허 제5,773,414호에 개시된, 엔도텔린 길항제 활성에 대한 시험용 검정법에는 수용체 검정법에서 요오드화된 엔도텔린-1 결합을 억제하는 상기 폴리펩티드의 능력을 시험하는 래트 심장 심실 결합 검정법, 토끼 신장 동맥 혈관 평활근 세포를 사용하여 방사선표지된 엔도텔린-1의 온전한 세포 결합을 시험하는 엔도텔린 수용체 결합 검정법, 제2 메신저의 세포내 농도를 측정하여 Rat-1 세포에서 기능 활성을 측정하는 이노시톨 포스페이트 축적 검정법, 배양된 혈관 평활근에서 엔도텔린으로 자극된 아라키돈산 유리를 감소시키는 첨가 화합물의 능력을 측정하는 아라키돈산 유리 검정법, 및 수컷 뉴질랜드 토끼의 내피세포를 사용한 시험관내 (단리된 혈관) 연구, 및 스프라그-돌리 래트를 사용한 생체내 연구가 있다. Assays for endothelin antagonist activity, disclosed in US Pat. No. 5,773,414, include rat heart ventricular binding assay, rabbit renal artery vascular smooth muscle cells, which tests the ability of the polypeptide to inhibit iodinated endothelin-1 binding in a receptor assay. Endothelin receptor binding assay to test intact cell binding of radiolabeled endothelin-1, inositol phosphate accumulation assay to measure functional activity in Rat-1 cells by measuring intracellular concentration of second messenger, cultured blood vessels Arachidonic acid free assay, which measures the ability of additive compounds to reduce endocrine-stimulated arachidonic acid free in smooth muscle, and in vitro (isolated vascular) studies using endothelial cells from male New Zealand rabbits, and Sprague-Dawley rats There is an in vivo study used.

조직 재생 활성 검정법에는 WO 95/16035 (뼈 연골, 힘줄); WO 95/05846 (신경, 신경세포); 및 WO 91/07491 (피부, 내피세포)에 기재된 것이 있으나 여기에 제한되지 않는다.Tissue regeneration activity assays include WO 95/16035 (bone cartilage, tendons); WO 95/05846 (nerve, neurons); And WO 91/07491 (skin, endothelial cells), but are not limited thereto.

창상-치유 활성 검정법에는 예를 들어, 문헌 (Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol., 71: 382-384 (1978))에 의해 변형된, 문헌 (Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, eds (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pp. 71-112)에 기재된 검정법이 있다. Wound-healing activity assays include, for example, Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, modified by Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol., 71: 382-384 (1978). , DT, eds (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pp. 71-112).

엔도텔린 B₁ (ETB₁) 수용체 폴리펩티드에 결합하고 신호 전달 활성을 조절하는 PRO 폴리펩티드와 관련된 시험 화합물을 스크리닝하는 검정법은 엔도텔린 B₁ 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 단계, 이 세포를 시험 후보물질에 노출시키는 단계, 및 예컨대, 미국 특허 제5,773,223호에 기재된 바와 같이 엔도텔린 B₁ 수용체 신호 전달 활성을 측정하는 단계를 포함한다. Assays for screening test compounds associated with PRO polypeptides that bind to endothelin B ₁ (ETB ₁ ) receptor polypeptide and modulate signal transduction activity provide a host cell transformed with DNA encoding the endothelin B ₁ receptor polypeptide. Exposing the cells to test candidates, and measuring endothelin B ₁ receptor signal transduction activity as described, for example, in US Pat. No. 5,773,223.

여러 가지 심비대증 검정법이 있다. 시험관내 검정법으로는 성숙 래트의 심 근세포의 퍼짐을 유도하는 것이 있다. 이 검정법에서, 본질적으로 문헌 (Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells" in Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, ed. (Berlin:Springer-Verlag, 1990), pp. 36-60)에 상세히 기재된 방법의 변법에 따라 단일 (수컷 스프라그-돌리) 래트로부터 심실 근세포를 단리한다. 이 방법은 성숙 심실 근세포의 단리를 허용하고, 이 방법을 이용하면 이들 세포가 막대 모양의 표현형으로 장기간 배양된다. 페닐에프린 및 프로스타글란딘 F_2α(PGF_2α)는 이들 성숙 세포에서 퍼짐 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 그 다음으로, 심비대증의 다양한 잠재적 억제제로 PGF_2α 또는 PGF_2α 동족체 (예컨대, 플루프로스테놀)에 의해 유도된 근세포 퍼짐의 억제를 시험한다. There are several cardiac hypertrophy assays. In vitro assays induce the spread of cardiomyocytes of mature rats. In this assay, essentially (Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells" in Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, HM Piper, ed. (Berlin: Springer-Verlag, 1990), pp. 36- Ventricular myocytes are isolated from single (male Sprague-Dawley) rats according to a variant of the method detailed in 60). This method allows for isolation of mature ventricular myocytes, which allows these cells to be cultured for a long time in a rod-shaped phenotype. _{Phenylephrine} and prostaglandin F _2α (PGF _2α ) have been shown to induce spreading responses in these mature cells. Next, various potential inhibitors of cardiac hypertrophy are tested for the inhibition of myocyte spreading induced by PGF _2α or PGF _2α homologues (eg, fluprostenol).

생체내 검정법의 한 예는 생체내에서 플루프로스테놀에 의해 유도된 심비대증의 억제에 대한 시험이다. 이 제약학적 모델은 플루프로스테놀 (PGF_2α의 아고니스트 동족체)의 피하 주사에 의해 래트에서 유도된 심비대증을 억재하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 시험한다. 심근경색증에 의해 유도된 병적 심비대증을 앓는 래트는 그들의 심근에서 임상적으로 추출가능한 고농도의 PGF_2α를 갖는 것으로 공지되어 있다 (Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.), 271:H2197-H2208 (1996)). 따라서, 생체내에서 심근 성장에 대한 플루프로스테놀의 효과를 억제할 수 있는 인자는 심비대증의 치료에 유용할 수 있다. 심비대증에 대한 PRO 폴리펩 티드의 효과는 PRO 폴리펩티드를 수용하지 않은 플루프로스테놀-처리 래트에 대한 심장, 심실 및 좌심실의 중량 (체중에 의해 표준화됨)을 측정하여 결정한다. One example of an in vivo assay is a test for the inhibition of cardiac hypertrophy induced by fluprostenol in vivo. This pharmaceutical model tests the ability of a PRO polypeptide to inhibit cardiac hypertrophy induced in rats by subcutaneous injection of _fluprostenol (an agonist homologue of PGF _2α ). Rats with pathological cardiac hypertrophy induced by myocardial infarction are known to have high concentrations of PGF _2α clinically extractable from their myocardium (Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.) , 271: H2197-H2208 (1996)). Thus, factors that can inhibit the effects of fluprostenol on myocardial growth in vivo may be useful for the treatment of cardiac hypertrophy. The effect of PRO polypeptides on cardiac hypertrophy is determined by measuring the weight of the heart, ventricle and left ventricle (standardized by weight) on fluprostenol-treated rats that did not receive PRO polypeptide.

생체내 검정법의 또다른 예는 압력-과부하 심비대증 검정법이다. 생체내 시험을 위해, 통상적으로 시험 동물의 복부 대동맥을 수축시켜 압력-과부하 심비대증을 유도한다. 전형적인 프로토콜에서, 래트 (예컨대, 수컷 위스타 또는 스프라그-돌리)를 마취 처리하고, 각 래트의 복부 대동맥을 횡경막 바로 아래에서 좁힌다 (Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33: 985-94 (1995)). 대동맥을 절개 수술하여 노출시키고, 돗바늘을 혈관 옆에 배치한다. 바늘 주위의 견사로 봉합하여 대동맥을 수축시키는데, 상기 견사는 즉시 제거되고 바늘의 직경까지 대동맥의 루멘 (lumen)을 줄인다. 이 방법은 예를 들어, 문헌 (Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992) and O' Rourke and Reibel, P.S.E.M.B., 200: 95-100 (1992))에 기재되어 있다.Another example of an in vivo assay is a pressure-overload cardiac hypertrophy assay. For in vivo testing, the abdominal aorta of the test animal is usually constricted to induce pressure-loaded cardiac hypertrophy. In a typical protocol, rats (eg, male Wistar or Sprague-Dawley) are anesthetized and the abdominal aorta of each rat is narrowed just below the diaphragm (Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33: 985-94 (1995)). The aorta is surgically exposed and placed with a needle next to the vessel. Sutures with a silk thread around the needle constricts the aorta, which is immediately removed and reduces the lumen of the aorta to the diameter of the needle. This method is described, for example, in Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992) and O 'Rourke and Reibel, PSEMB, 200: 95-100 (1992). .

또다른 생체내 검정법에서, 실험적으로 유도된 심근경색증 (MI) 후의 심비대증에 대한 효과를 측정한다. 래트에서 좌관상동맥 결찰로 급성 MI를 유도하고 심전도 검사로 확인한다. 겉보기 수술한 동물군도 대조 동물로서 준비한다. 초기 데이타는 체중에 대한 심장 중량의 비율이 18% 증가된 것으로 입증된 MI를 앓는 동물군에 심비대증이 존재함을 나타낸다 (상기 Lai et al.). 심비대증의 후보 차단제, 예컨대, PRO 폴리펩티드를 사용한 이들 동물의 치료는 시험된 후보물질의 치료 잠재력에 대한 가치 있는 정보를 제공한다. 스프라그-돌리 래트를 사용한 심비대증 유도에 대한 이러한 검정 시험은 미국 특허 제5,773,415호에 더 자세히 개시되 어 있다.In another in vivo assay, the effect on cardiac hypertrophy following experimentally induced myocardial infarction (MI) is measured. In rats, acute MI is induced by left coronary artery ligation and confirmed by electrocardiogram. Apparently operated animals are also prepared as control animals. Initial data indicate the presence of cardiac hypertrophy in the group of animals with MI, which demonstrated a 18% increase in heart weight to weight ratio (Lai et al., Supra). Treatment of these animals with candidate blockers of cardiac hypertrophy, such as PRO polypeptides, provides valuable information about the therapeutic potential of the candidates tested. This assay test for induction of cardiac hypertrophy using Sprague-Dawley rats is described in more detail in US Pat. No. 5,773,415.

암의 경우, 잘 공지된 다양한 동물 모델을 사용하여 암의 발달 및 병리과정에 있어서 본원에서 확인한 유전자의 역할을 더 이해하고, 항체 및 소분자 길항제와 같은 천연 PRO 폴리펩티드의 다른 길항제를 비롯한 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 이러한 모델의 생체내 성질은 인간 환자에서 반응을 구체적으로 예측할 수 있게 한다. 종양 및 암 (예를 들어, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델에는 비재조합 동물 및 재조합 (형질전환) 동물이 포함된다. 비재조합 동물에는 예를 들어, 설치류 (예컨대, 뮤린 동물)가 포함된다. 이러한 모델은 표준 기술, 예를 들어, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐 하의 이식, 또는 오르토핀 이식 (예컨대, 결장 조직에 이식된 결장 암세포)을 이용하여 종양 세포를 유전적 동계의 마우스 내로 도입하여 만들 수 있다 (예컨대, 1997년 9월 18일 공개된 PCT 공개 제WO97/33551호 참조). 종양학 연구에 가장 흔히 사용되는 동물종은 아마도 면역결핍 마우스, 구체적으로는 누드 마우스이다. 흉선 저형성증 또는 무형성증을 앓는 누드 마우스가 인간 종양 이종이식을 위한 숙주로서 성공적으로 작용할 수 있었다는 사실 때문에 상기 누드 마우스는 이 목적에 많이 사용된다. 상동염색체 열성 nu 유전자가 예를 들어, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL을 포함한, 매우 많고 다양한 유사유전자형 (congenic) 누드 마우스 종내로 도입되었다. 추가로, 누드 마우스 이외에 유전적 면역 결핍을 앓는 다양한 기타 동물을 육종하여 왔고, 이를 종양 이종이식의 수용 자로 사용하여 왔다. 보다 자세한 것을 위해서는 예를 들어, 문헌 (The Nude Mouse in Ocology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991))을 참조한다.For cancer, various well-known animal models can be used to further understand the role of genes identified herein in the development and pathology of cancer, and to provide efficacy of candidate therapeutics, including other antagonists of natural PRO polypeptides such as antibodies and small molecule antagonists. Can be tested. The in vivo nature of this model makes it possible to specifically predict responses in human patients. Animal models of tumors and cancers (eg, breast cancer, colon cancer, prostate cancer, lung cancer, etc.) include non-recombinant and recombinant (transformed) animals. Non-recombinant animals include, for example, rodents (eg, murine animals). Such models use standard techniques such as subcutaneous injection, tail vein injection, spleen transplantation, intraperitoneal transplantation, transplantation under renal capsules, or orthopine transplantation (eg, colon cancer cells transplanted into colon tissue). It can be made by introducing into genetically syngeneic mice (see, eg, PCT Publication No. WO97 / 33551, published September 18, 1997). The animal species most commonly used for oncology studies is probably immunodeficient mice, specifically nude mice. Nude mice are commonly used for this purpose because of the fact that nude mice with thymic hypoplasia or aplasia could successfully serve as hosts for human tumor xenografts. Homologous recessive nu genes include, for example, ASW, A / He, AKR, BALB / c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I / st, NC, NFR, NFS, It has been introduced into a large number of different congenic nude mouse species, including NFS / N, NZB, NZC, NZW, P, RIII and SJL. In addition, various other animals suffering from genetic immunodeficiency in addition to nude mice have been bred and used as recipients of tumor xenografts. See, for example, The Nude Mouse in Ocology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991).

이러한 동물내로 도입된 세포는 예컨대, 상기 기재한 종양세포주, 예를 들어, B104-1-1 세포주 (neu 원종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras-형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2 (ATCC HTB-37); 또는 적당하게 잘 분화된 등급 II 인간 결장 아데노암세포주인 HT-29 (ATCC HTB-38)와 같은 공지된 종양(암) 세포주 또는 종양 및 암으로부터 유래할 수 있다. 종양세포 또는 암세포 샘플은 액체 질소 중의 동결 및 저장을 수반하는 표준 조건을 이용하여 외과수술을 한 환자로부터 수득할 수 있다 (Karmali et al., Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983)). Cells introduced into such animals include, for example, the tumor cell lines described above, such as the B104-1-1 cell line (stable NIH-3T3 cell line transfected with the neu oncogene); ras-transfected NIH-3T3 cells; Caco-2 (ATCC HTB-37); Or known tumor (cancer) cell lines or tumors and cancers, such as HT-29 (ATCC HTB-38), a suitably differentiated grade II human colon adenocarcinoma cell line. Tumor cells or cancer cell samples can be obtained from patients undergoing surgery using standard conditions involving freezing and storage in liquid nitrogen (Karmali et al., Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983) ).

종양세포는 다양한 방법으로 누드 마우스와 같은 동물내로 도입할 수 있다. 마우스의 피하 (s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고형 덩어리, 투관침의 사용에 의한 침생검 또는 세포 현탁액으로서 피하 이식할 수 있다. 고형 덩어리 또는 투관침 이식의 경우, 적당한 크기의 종양 조직 단편을 피하 공간내로 도입한다. 세포 현탁액은 원발성 종양세포주 또는 안정한 종양세포주로부터 새로 준비하고 피하 주사한다. 또한, 종양세포는 진피하 이식으로서 주사할 수 있다. 이 위치에서, 접종물 (inoculum)은 피부 결합 조직의 하부와 피하 조직 사이에 놓는다.Tumor cells can be introduced into animals, such as nude mice, in a variety of ways. The subcutaneous (s.c.) space of mice is well suited for tumor transplantation. Tumors can be implanted subcutaneously as solid masses, needle biopsies using trocars or cell suspensions. For solid lumps or trocar implants, tumor tissue fragments of appropriate size are introduced into the subcutaneous space. Cell suspensions are freshly prepared and subcutaneously injected from primary tumor cells or stable tumor cell lines. Tumor cells can also be injected as a subdermal graft. In this position, an inoculum is placed between the lower part of the dermal connective tissue and the subcutaneous tissue.

유방암의 동물 모델은 본질적으로 문헌 (Drebin et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 83: 9129-9133 (1986))에 기재된 바와 같이 예를 들어, 래트 신경모세 포종 세포 (이 세포로부터 neu 종양유전자를 처음 단리함) 또는 neu-형질전환된 NIH-3T3 세포를 누드 마우스에 이식하여 만들 수 있다. Animal models of breast cancer are essentially, for example, rat neuroblastoma cells (the cells) as described in Drebin et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 83: 9129-9133 (1986). First isolated neu oncogene) or neu -transformed NIH-3T3 cells can be made by transplanting into nude mice.

유사하게, 결장암의 동물 모델은 결장암 세포를 동물, 예컨대, 누드 마우스에서 계대배양하여 이들 동물 모델에서 종양이 나타나게함으로써 만들 수 있다. 누드 마우스에서 인간 결장암의 동소이식 모델은 예컨대, 문헌 (Wang et al., Cancer Research. 54: 4726-4728 (1994) and Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995))에 기재되어 있다. 이 모델은 안티캔서사 (AntiCancer, Inc., San Diego, California)에 의해 시판되는 소위 "METAMOUSE" (상표명)를 기초로 한 것이다.Similarly, animal models of colon cancer can be made by passing colon cancer cells in an animal, such as a nude mouse, so that tumors appear in these animal models. Allograft models of human colon cancer in nude mice are described, eg, in Wang et al., Cancer Research. 54: 4726-4728 (1994) and Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995). It is. This model is based on the so-called "METAMOUSE" (trade name) sold by AntiCancer, Inc., San Diego, California.

동물에서 발생하는 종양은 적출하여 시험관내에서 배양할 수 있다. 이어서, 시험관내 배양물로부터 수득한 세포를 동물에서 계대배양할 수 있다. 이러한 종양은 다른 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 작용할 수 있다. 별법으로, 계대배양으로부터 생성된 종양은 단리할 수 있고, 예비-계대 세포, 및 1회 이상의 계대배양 후 단리된 세포로부터 수득한 RNA는 원하는 유전자의 분별 발현에 대해 분석할 수 있다. 이러한 계대 기술은 임의의 공지된 종양세포주 또는 암세포주를 사용하여 수행할 수 있다. Tumors arising in the animal can be extracted and cultured in vitro. The cells obtained from the in vitro culture can then be passaged in animals. Such tumors can serve as targets for other tests or drug screening. Alternatively, tumors resulting from passage can be isolated and RNA obtained from pre-passage cells and cells isolated after one or more passages can be analyzed for fractional expression of the desired gene. This passage technique can be performed using any known tumor cell line or cancer cell line.

예를 들면, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 다양한 물질의 항-종양 활성을 연구하기 위한 매우 조절가능한 모델계를 제공하는 BALB/c 수컷 마우스 (DeLeo et al., J. Exp. Med., 146: 720 (1997))의 화학적으로 유도된 섬유육종이다 (Palladino et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987)). 간단하게, 종양세 포는 시험관내에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있다. 동물내로 주사하기 전, 세포주를 세척하고 약 10x10⁶ 내지 10x10⁷ 세포/ml의 세포 밀도로 완충액에 현탁시킨다. 그 다음으로, 동물을 10 내지 100 ㎕의 세포 현탁액으로 피하 감염시켜 1 내지 3주 후에 종양이 나타나게 한다. For example, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21, and WEHI-164 provide BALB / c male mice (DeLeo et al., J. Exp. Med., 146: 720 (1997)), chemically induced fibrosarcoma (Palladino et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987)). In brief, tumor cells can be grown in cell culture in vitro. Prior to injection into animals, cell lines are washed and suspended in buffer at a cell density of about 10 × 10 ⁶ to 10 × 10 ⁷ cells / ml. Next, animals are subcutaneously infected with 10-100 μl of cell suspension to allow tumors to appear after 1-3 weeks.

추가로, 가장 철저히 연구된 실험 종양 중 하나인 마우스의 루이스 (Lewis) 폐 (3LL) 암을 연구 종양 모델로서 사용할 수 있다. 이 종양 모델에 있어서의 효능은 소세포성 폐암 (SCC)으로 진단받은 인간 환자의 치료에 있어서 유리한 효과와 연관성이 있다. 이 종양은 병에 걸린 마우스로부터 수득한 종양 단편, 또는 배양 중인 세포를 주사할 때 정상 마우스내로 도입할 수 있다 (Zupi et al., Br. J. Cancer. 41: suppl. 4, 30 (1998)). 종양이 심지어 단일 세포의 주사로부터 시작될 수 있으며 매우 높은 비율의 감염된 종양세포가 생존한다는 것이 입증되었다. 이 종양 모델에 대한 추가 정보를 위해서는 문헌 (Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986))을 참조한다.In addition, Lewis lung (3LL) cancer in mice, one of the most thoroughly studied experimental tumors, can be used as a study tumor model. Efficacy in this tumor model is associated with beneficial effects in the treatment of human patients diagnosed with small cell lung cancer (SCC). This tumor can be introduced into normal mice when injected with tumor fragments obtained from diseased mice, or cells in culture (Zupi et al., Br. J. Cancer. 41: suppl. 4, 30 (1998) ). Tumors can even begin with injection of single cells and it has been demonstrated that a very high percentage of infected tumor cells survive. For further information on this tumor model, see Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986).

이식된 종양이 있는 동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 측정하는 한 방법은 치료 전 및 후의 종양 크기를 측정하는 것이다. 통상적으로, 이식된 종양 크기는 2차원 또는 3차원의 슬라이드 칼리퍼 (caliper)로 측정한다. 2차원에 제한된 측정은 종양의 크기를 정확하게 반영하지 못하므로 대개 수학식을 사용하여 상응하는 부피로 전환한다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 부정확하다. 약물 후보의 치료 효과는 치료-유도 증식 지연 및 특정 증식 지연으로 더 잘 표현할 수 있다. 종양 증식의 표현에 있어서 또다른 중요 변수는 두 배의 종양 부피가 되는데 걸리는 시간이다. 종양 증식의 계산 및 표현을 위한 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 문헌 (Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p.301)에 의해 보고된 프로그램도 이용가능하다. 그러나, 치료 후 세포괴사 및 면역 반응은 실재로 적어도 초기에 종양 크기를 증가시킨다. 그러므로, 이들 변화는 형태 계측 방법 및 유량 세포측정 분석을 병행하여 조심스럽게 관찰할 필요가 있다. One method of measuring the efficacy of test compounds in animal models with transplanted tumors is to measure tumor size before and after treatment. Typically, the implanted tumor size is measured by a two- or three-dimensional slide caliper. Measurements limited to two dimensions do not accurately reflect the size of the tumor and are usually converted to the corresponding volume using equations. However, the measurement of tumor size is very inaccurate. The therapeutic effect of drug candidates can be better expressed as treatment-induced proliferation delay and specific proliferation delay. Another important variable in the expression of tumor proliferation is the time it takes to double tumor volume. Computer programs for the calculation and expression of tumor proliferation, such as by Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p.301). Reported programs are also available. However, cell necrosis and immune response after treatment actually increase tumor size at least initially. Therefore, these changes need to be carefully observed in parallel with the morphometric method and the flow cytometry analysis.

또한, 재조합 (형질전환) 동물 모델은 형질전환 동물을 제조하는 표준 기술을 이용하여 본원에서 확인된 PRO 유전자의 코딩 일부를 원하는 동물의 게놈내로 도입시켜 만들 수 있다. 형질전환 조작용 표적으로 작용할 수 있는 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 기타 비인간 영장류, 예컨대, 개코원숭이, 침팬지 및 원숭이를 포함하나, 여기에 제한되지 않는다. 형질전이유전자를 이러한 동물내로 도입하는, 당업계에 공지된 기술에는 전핵 미세주입 (미국 특허 제4,873,191호); 생식세포주내로의 레트로바이러스-매개 유전자 전달 (예컨대, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-615 (1985)); 배아 줄기 세포에 있어서의 유전자 표적화 (gene targeting) (Thompson et al., Cell, 56: 313-321 (1989)); 배아의 일렉트로포레이션 (Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 (1983)); 및 정자-매개 유전자 전달 (Lavitrano et al., Cell, 57: 717-73 (1989))이 포함된다. 보다 자세한 것은 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.In addition, recombinant (transformed) animal models can be made by introducing some of the coding of the PRO genes identified herein into the genome of the desired animal using standard techniques for making transgenic animals. Animals that can serve as targets for transformation manipulation include, but are not limited to, mice, rats, rabbits, guinea pigs, sheep, goats, pigs, and other nonhuman primates such as baboons, chimpanzees, and monkeys. Techniques known in the art for introducing transgenes into such animals include pronuclear microinjection (US Pat. No. 4,873,191); Retrovirus-mediated gene delivery into germline lines (eg, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-615 (1985)); Gene targeting in embryonic stem cells (Thompson et al., Cell, 56: 313-321 (1989)); Electroporation of embryos (Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 (1983)); And sperm-mediated gene delivery (Lavitrano et al., Cell, 57: 717-73 (1989)). See, for example, US Pat. No. 4,736,866.

본 발명의 목적상, 형질전환 동물에는 일부 세포에만 형질전이유전자가 있는 동물 ("모자이크 동물")이 포함된다. 형질전이유전자는 단일 형질전이유전자 또는 콘카타머 (concatamer), 예컨대, 헤드-대-헤드 또는 헤드-대-테일 텐덤으로서 삽입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6232-636 (1992))의 기술에 따라 형질전이유전자를 특정 세포형내로 선별적으로 도입하는 것도 가능하다. 형질전환 동물내 형질전이유전자의 발현은 표준 기술로 관찰할 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 이용하여 형질전이유전자의 삽입을 확인할 수 있다. 이어서, 제자리 혼성화 (in situ hybridization), 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 mRNA 발현도를 조사할 수 있다. 추가로, 상기 형질전환 동물에서 종양 또는 암 발달의 증상을 더 조사한다. For the purposes of the present invention, transgenic animals include animals in which only a few cells have a transgene ("mosaic animals"). The transgene may be inserted as a single transgene or concatamer, such as a head-to-head or head-to-tail tandem. For example, it is also possible to selectively introduce transgenes into specific cell types according to the technique of Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6232-636 (1992). . Expression of transgenes in transgenic animals can be observed by standard techniques. For example, Southern blot analysis or PCR amplification can be used to confirm the insertion of the transgene. The mRNA expression can then be examined using techniques such as in situ hybridization, northern blot analysis, PCR or immunocytochemistry. In addition, the symptoms of tumor or cancer development in the transgenic animals are further investigated.

별법으로, 본원에서 확인된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아세포내로 도입된 것과 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변이 게놈 DNA 사이의 상동 재조합 결과로서, 상기 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 결손 또는 변이 유전자를 갖는 "넉아웃" 동물을 제작할 수 있다. 예를 들면, 확립된 기술에 따라 특정 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 상기 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실할 수 있거나, 삽입을 관찰하는 데 사용할 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또다른 유전자로 대체될 수 있다. 전형적으로, 벡터는 (5' 및 3' 말단 둘다에서) 변이되지 않은 수백 킬로베이스의 플랭킹 DNA를 포함한다. 상동 재조합 벡터의 설명에 대해서는 예컨대, 문헌 (Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987))을 참조한다. 벡터를 (예를 들어, 일렉트로포레이션으로) 배아 줄기 세포주내로 도입하고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동 재조합된 세포를 선별한다 (예를 들어, Li et al., Cell. 69: 915 (1992) 참조). 그 다음으로, 선별된 세포를 동물 (예컨대, 마우스 또는 래트)의 포배내에 주사하여 침전 키메라를 형성한다 (예컨대, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (IRL: Oxford, 1987), pp. 113-152 참조). 그 다음, 키메라 배아를 적당한 가임신 암컷 양육 동물 내에 이식할 수 있고, 이 배아로 인해 "넉아웃" 동물이라는 용어가 생겨났다. 표준 기술를 이용하여 상동 재조합 DNA가 생식세포내에 있는 새끼를 확인할 수 있고, 이 새끼를 사용하여 모든 세포가 상동 재조합 DNA를 함유하는 동물을 육종할 수 있다. 예를 들어, 넉아웃 동물의 특징은 일부 병적 상태에 대한 방어 능력, 및 PRO 폴리펩티드의 부재로 인한 병적 상태의 발달일 수 있다. Alternatively, as a result of homologous recombination between the endogenous gene encoding the PRO polypeptide identified herein and the variant genomic DNA encoding the same polypeptide as introduced into the embryonic cell of an animal, having a deletion or variant gene encoding said PRO polypeptide. Can create "knockout" animals. For example, according to established techniques, cDNA encoding a particular PRO polypeptide can be used to clone genomic DNA encoding the PRO polypeptide. Some of the genomic DNA encoding a particular PRO polypeptide can be deleted or replaced with another gene, such as a gene encoding a selectable marker that can be used to observe insertions. Typically, the vector comprises hundreds of kilobases of flanking DNA that are not mutated (both at the 5 'and 3' ends). For a description of homologous recombination vectors, see, eg, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987). Vectors are introduced into embryonic stem cell lines (eg, by electroporation) and cells in which the introduced DNA is homologously recombined with endogenous DNA are selected (eg, Li et al., Cell. 69: 915 (1992). ) Reference). Selected cells are then injected into the blastocysts of animals (eg mice or rats) to form precipitated chimeras (eg, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. EJ Robertson, ed. (IRL). : Oxford, 1987), pp. 113-152). Chimeric embryos can then be transplanted into suitable fertility female rearing animals, which has resulted in the term "knockout" animals. Standard techniques can be used to identify pups whose homologous recombinant DNA is in germ cells, and can be used to breed animals in which all cells contain homologous recombinant DNA. For example, knockout animals may be characterized by their ability to defend against some pathological conditions, and the development of pathological conditions due to the absence of PRO polypeptides.

자연발생적인 동물 종양의 치료에 있어서 본원에서 확인한 PRO 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 기타 약물 후보물질의 효능도 시험할 수 있다. 이러한 연구에 적합한 표적은 고양이 구강 편평 세포암 (SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 이 종에서 보고된 구강암의 60% 이상을 차지하는 가장 흔한 고양이 구강 악성종양인 고침습 악성 종양이다. 이러한 저발생 전이가 단지 이 종양이 있는 고양이의 짧은 수명을 반영할 수 있다고 하더라도, 상기 종양은 거의 다른 부위로 전이되지 않는다. 이들 종양은 주로 고양이 구강의 해부구조 때문에 통상적으로 외과수술로 치료되지 않는다. 현재, 이 종양에 대한 효과적인 치료법은 없다. 연구로 들어가기 전, 각 고양이는 완전한 임상 조사 및 생검을 하고, 전산화 단층촬영술 (CT)로 스캐닝한다. 설하 구강 편평 세포 종양으로 진단받은 고양이는 연구에서 제외한다. 혀가 이러한 종양의 결과로 마비될 수 있고, 치료로 종양을 없앨 수 있다 하더라도, 동물은 스스로 먹을 수 없다. 각 고양이를 보다 장시간 동안 반복해서 치료한다. 종양의 사진을 치료 기간동안 매일 촬영한 후, 각각을 재조사한다. 치료 후, 각 고양이를 또다른 CT 스캔한다. 그 후, CT 스캔 및 흉부 방사선상은 8주마다 평가한다. 대조구와 비교할 때 생존, 반응 및 독성의 차이점에 대해 데이타를 평가한다. 양성 반응은 종양 퇴행, 바람직하게는 삶의 질 향상 및(또는) 늘어난 수명의 증거를 요구할 수 있다. The efficacy of antibodies and other drug candidates that specifically bind to the PRO polypeptides identified herein in the treatment of naturally occurring animal tumors can also be tested. A suitable target for this study is feline oral squamous cell carcinoma (SCC). Feline oral SCC is a highly invasive malignant tumor, the most common feline oral malignancy, accounting for over 60% of oral cancers reported in this species. Although such hypogenic metastases can only reflect the short lifespan of a cat with this tumor, the tumor does not metastasize to almost any other site. These tumors are usually not treated surgically, primarily because of the anatomy of the cat's mouth. At present, there is no effective treatment for this tumor. Before entering the study, each cat is subjected to a complete clinical investigation and biopsy and scanned by computed tomography (CT). Cats diagnosed with sublingual oral squamous cell tumors are excluded from the study. Although the tongue can become paralyzed as a result of these tumors and the tumor can be removed by treatment, the animal cannot eat itself. Treat each cat repeatedly for a longer period of time. Photos of the tumor are taken daily during the treatment period and each is reviewed. After treatment, each CT is scanned another CT. The CT scan and chest radiographs are then evaluated every 8 weeks. Data is assessed for differences in survival, response and toxicity compared to the control. Positive reactions may require evidence of tumor regression, preferably improved quality of life and / or extended lifespan.

추가로, 섬유육종; 선암종; 림프종; 연골종; 또는 개, 고양이 및 개코원숭이의 평활근육종과 같은 기타 자연발생적 동물 종양도 시험할 수 있다. 이들 중, 개 및 고양이의 유방 선암종은 그의 외관 및 행동이 사람의 유방 선암종과 매우 유사하기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이 모델의 용도는 동물에서 이러한 형태의 종양 발생이 드물기 때문에 제한된다. In addition, fibrosarcoma; Adenocarcinoma; Lymphoma; Chondroma; Or other naturally occurring animal tumors, such as smooth muscle sarcomas of dogs, cats and baboons. Of these, breast adenocarcinomas of dogs and cats are the preferred models because their appearance and behavior are very similar to human breast adenocarcinomas. However, the use of this model is limited because this type of tumor development is rare in animals.

당업계에 공지된 다른 시험관내 및 생체내 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 시험도 본원에 적합하다. Other in vitro and in vivo cardiovascular, endothelial and angiogenic tests known in the art are also suitable herein.

ii. 조직 분포ii. Tissue distribution

본원에서 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법의 결과는 다른 연구, 예컨대, 다양한 인간 조직의 mRNA 발현을 측정하는 것으로 입증할 수 있다. The results of the cardiovascular, endothelial and angiogenic assays herein can be demonstrated by measuring mRNA expression in other studies, such as various human tissues.

전술한 바와 같이, 다양한 조직에 있어서의 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에 제공된 서열을 기초로 한 적당한 표지 프로브를 사용하여 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), 돗 블롯팅 (DNA 분석) 또는 제자리 혼성화로 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄 및 DNA-RNA 하이브리드 이중쇄나 DNA-단백질 이중쇄를 포함한 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. As noted above, gene amplification and / or gene expression in various tissues can be determined using conventional Southern blotting, Northern blotting to quantify the transcription of mRNA using appropriate labeling probes based on the sequences provided herein. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), dot blotting (DNA analysis) or in situ hybridization. Alternatively, antibodies can be used that recognize specific double chains, including DNA double strands, RNA double strands, and DNA-RNA hybrid double strands or DNA-protein double strands.

별법으로, 다양한 조직의 유전자 발현은 면역학적 방법, 예컨대, 조직 절편의 면역조직학적 염색; 및 세포 배양물 또는 체액의 검정을 통해 측정하여 유전자 산물의 발현을 직접 정량할 수 있다. 면역조직학적 염색 및(또는) 샘플액의 검정에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연-서열 PRO 폴리펩티드, 또는 본원에 제공된 DNA 서열이나 특정 항체 에피토프를 코딩하는, PRO DNA에 결합된 외인성 서열을 기초로 한 합성 펩티드에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체를 생성시키기 위한 일반 기술, 및 제자리 혼성화를 위한 특별한 프로토콜은 하기에 제공된다.Alternatively, gene expression of various tissues can be determined by immunological methods such as immunohistochemical staining of tissue sections; And by assaying cell culture or body fluids, the expression of gene products can be quantified directly. Antibodies useful for immunohistostaining and / or assaying of sample solutions may be monoclonal or polyclonal and may be prepared in any mammal. Conveniently, antibodies to synthetic-species based on native-sequence PRO polypeptides or exogenous sequences bound to PRO DNA encoding the DNA sequences provided herein or specific antibody epitopes can be prepared. General techniques for generating antibodies and specific protocols for in situ hybridization are provided below.

iii. 항체 결합 연구iii. Antibody Binding Study

심혈관, 내피세포 및 혈관신생 연구의 결과는 항체 결합 연구로 더 입증할 수 있는데, 상기 항체 결합 연구에서 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법에서 사용된 내피세포 또는 다른 세포에 대한 PRO 폴리펩티드의 효과를 억제하는 항-PRO 항체의 능력을 시험한다. 예시적 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인 간화된 항체, 이중특이적 항체 및 헤테로컨쥬게이트 항체가 포함되고, 이 항체들의 제조는 하기에 기재할 것이다.The results of cardiovascular, endothelial and angiogenesis studies can be further demonstrated by antibody binding studies, which inhibit the effects of PRO polypeptides on endothelial cells or other cells used in cardiovascular, endothelial and angiogenesis assays in the antibody binding studies. To test the ability of anti-PRO antibodies. Exemplary antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, humanized antibodies, bispecific antibodies and heteroconjugate antibodies, the preparation of which antibodies will be described below.

항체 결합 연구는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대, 경쟁적 결합 검정법, 직간접 샌드위치 검정법 및 면역침전 검정법을 이용하여 수행할 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987), pp. 147-158).Antibody binding studies can be performed using any known assay method, such as competitive binding assays, direct or indirect sandwich assays and immunoprecipitation assays (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987)). , pp. 147-158).

경쟁적 결합 검정법은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물의 능력에 의존한다. 상기 시험 샘플에 있는 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물의 양과 반비례한다. 결합하게 되는 표준물의 양을 측정하기 쉽게 하기 위해, 바람직하게는 경쟁 전 또는 후에 항체를 불용화시켜서 상기 항체에 결합하는 표준물 및 분석물을 비결합 상태로 남은 표준물 및 분석물로부터 편리하게 분리할 수 있다. Competitive binding assays rely on the ability of a labeled standard to compete with a test sample analyte to bind a limited amount of antibody. The amount of target protein in the test sample is inversely proportional to the amount of standard that will bind to the antibody. In order to make it easier to determine the amount of standard to be bound, the standard and analyte that bind to the antibody are preferably insolubilized conveniently, preferably by insolubilizing the antibody before or after competition. can do.

샌드위치 검정법은 검출할 단백질의 상이한 면역원성 부위 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 두 항체를 사용한다. 샌드위치 검정법에서, 시험 샘플 분석물은 고형 지지체에 부착된 제1항체와 결합한 후, 제2 항체가 상기 분석물에 결합하여 불용성 3부 결합체를 형성한다 (예를 들면, 미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체는 그 자체가 검출가능한 잔기로 표지되거나 (직접 샌드위치 검정법), 검출가능한 잔기로 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 검정법). 예를 들면, 샌드위치 검정법의 한 유형은 검출가능한 잔기가 효소인 ELISA 검정법이다.The sandwich assay uses two antibodies that can each bind to different immunogenic sites or epitopes of the protein to be detected. In a sandwich assay, a test sample analyte binds to a first antibody attached to a solid support, and then a second antibody binds to the analyte to form an insoluble three-part conjugate (see, eg, US Pat. No. 4,376,110). . The second antibody can be measured using an anti-immunoglobulin antibody that is itself labeled with a detectable moiety (direct sandwich assay) or labeled with a detectable moiety (indirect sandwich assay). For example, one type of sandwich assay is an ELISA assay wherein the detectable moiety is an enzyme.

면역조직화학의 경우, 조직 샘플은 신선한 것이거나 동결된 것일 수 있고, 또는 파라핀에 함몰시키고 예를 들어, 포르말린과 같은 방부제로 고정시킬 수 있다. For immunohistochemistry, tissue samples may be fresh or frozen, or may be submerged in paraffin and fixed with a preservative such as, for example, formalin.

iv. 세포를 사용한 종양 검정법iv. Tumor Assays Using Cells

종양과 같은 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 질환의 세포-기재 검정법 및 동물 모델은 본원의 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법의 발견을 입증하는 데, 그리고 추가로 본원에서 확인된 유전자와, 원하지 않는 심혈관 세포, 내피세포 및 혈관신생 세포 증식의 발달 및 병리과정 사이의 관계를 이해하는 데 이용할 수 있다. 원하지 않은 심혈관 세포, 내피세포 및 혈관신생 세포 증식, 예컨대, 종양 세포의 발달 및 병리과정에 있어서 본원에서 확인된 유전자 산물의 역할은 본원의 PRO 폴리펩티드에 의해 자극되거나 억제되는 것으로 확인된 세포 또는 세포주를 사용하여 시험할 수 있다. 이러한 세포에는 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 것들이 포함된다.Cell-based assays and animal models of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases such as tumors demonstrate the discovery of the cardiovascular, endothelial and angiogenic assays herein, and further include genes identified herein and unwanted cardiovascular It can be used to understand the relationship between the development and pathology of cell, endothelial and angiogenic cell proliferation. The role of the gene products identified herein in the development and pathology of unwanted cardiovascular cells, endothelial cells and angiogenic cells, such as tumor cells, may be directed to cells or cell lines identified as being stimulated or inhibited by the PRO polypeptides herein. Can be tested. Such cells include, for example, those described in the Examples below.

다른 방법에서, 특정한 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환과 관련된 것으로 공지된 세포 유형의 세포를 본원의 cDNA로 형질감염시키고, 과도한 증식을 유도하거나 증식을 억제하는 이들 cDNA의 능력을 분석한다. 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환이 암인 경우, 적합한 종양세포에는 예를 들어, B104-1-1 세포주 (neu 원종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및 ras-형질감염된 NIH-3T3 세포와 같은 안정한 종양 세포주가 포함되는데, 이 종양 세포주를 원하는 유전자로 형질감염시켜 종양 증식에 대해 관찰할 수 있다. 그 다음으 로, 이러한 형질감염된 세포주는 형질전환된 세포의 증식에 대한 세포활동 억제 활성 또는 세포독성 활성을 발휘하거나, 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC)을 매개하여 종양세포 증식을 억제하는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는 데 사용할 수 있다. 본원에서 확인된 유전자의 코딩 서열로 형질감염된 세포는 암과 같은 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료용 약물 후보물질을 확인하는 데 사용할 수도 있다.In another method, cells of cell types known to be associated with certain cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases are transfected with cDNA herein and the ability of these cDNAs to induce or inhibit excessive proliferation is analyzed. When cardiovascular disease, endothelial cell disease and angiogenic disease are cancers, suitable tumor cells include, for example, B104-1-1 cell line (stable NIH-3T3 cell line transfected with the neu protogene) and ras -transfected NIH-3T3. Stable tumor cell lines, such as cells, are included, which can be transfected with the desired gene to observe for tumor proliferation. These transfected cell lines then exert a cytotoxic or cytotoxic activity against the proliferation of the transformed cells or mediate the inhibition of tumor cell proliferation by mediating the cytotoxicity (ADCC) of antibody-dependent cells. It can be used to test the ability of a clonal antibody, monoclonal antibody or antibody composition. Cells transfected with the coding sequences of the genes identified herein can also be used to identify drug candidates for the treatment of cardiovascular diseases such as cancer, endothelial cell disease and angiogenic diseases.

또한, 안정한 세포주가 바람직하다 하더라도, 형질전환 동물 (상기 기재됨)의 종양으로부터 유래된 1차 배양물을 본원의 세포 사용 검정법에 사용할 수 있다. 형질전환 동물로부터 연속 세포주를 유도하는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 (1985) 참조).In addition, although stable cell lines are preferred, primary cultures derived from tumors of transgenic animals (described above) can be used in the cell use assays herein. Techniques for deriving continuous cell lines from transgenic animals are well known in the art (see, eg, Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 (1985)).

v. 유전자 치료법v. Gene therapy

본원의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 폴리펩티딜 아고니스트 및 폴리펩티딜 길항제는 본 발명에 따라 상기 폴리펩티드를 발현시켜 사용할 수 있는데, 이것은 흔히 유전자 치료법이라 불린다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 Polypeptides, Polypeptidyl Agonists and Polypeptidyl Antagonists According to the Invention The polypeptide can be expressed and used, commonly called gene therapy.

환자 세포내로 핵산 (임의로는 벡터에 포함되어 있음)을 도입하는 두 가지 방법, 즉 생체내 및 생체외 방법이 있다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 대개 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드가 필요한 부위, 즉 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 합성 부위, 및 알려져 있다면, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 생물학적 활성이 필요한 부위 (예, 창상)에서 환자 내로 직접 주사한다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 적출하고, 핵산을 이들 단리된 세포내로 도입한 다음, 형질전환된 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 예를 들어, 환자내로 이식되는 다공성 막내에 캡슐화시켜 환자에게 투여한다 (예컨대, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 핵산을 생존가능한 세포 내로 도입하는 데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포내로 전달되는지 생체내에서 의도한 숙주 세포내로 전달되는지에 따라 다양하다. 시험관내에서 포유동물 세포내로 핵산을 전달하기에 적합한 기술에는 리포좀의 사용, 일렉트로포레이션, 미세주입, 형질도입 (transduction), 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전법 등이 포함된다. 형질도입은 세포 수용체와 복제-결함성 재조합 바이러스 (바람직하게는 레트로바이러스) 입자를 결합시킨 후, 상기 입자에 함유된 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 통상적으로 사용되는 백터는 레트로바이러스이다.There are two ways of introducing nucleic acid (optionally included in the vector) into the patient cell, in vivo and ex vivo. For in vivo delivery, the nucleic acid is usually a site requiring PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, i.e. PRO179, PRO238, Synthetic sites of PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, and if known, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, Injection directly into a patient at a site (eg, a wound) where a biological activity of the PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide is required. For ex vivo treatment, cells of a patient are removed, nucleic acids are introduced into these isolated cells, and then the transformed cells are administered directly to the patient, or encapsulated in a porous membrane that is implanted into the patient, for example, to the patient. Administration (see, eg, US Pat. Nos. 4,892,538 and 5,283,187). There are a variety of techniques available for introducing nucleic acids into viable cells. This technique varies depending on whether the nucleic acid is delivered into cells cultured in vitro or into the intended host cell in vivo. Techniques suitable for delivering nucleic acids into mammalian cells in vitro include the use of liposomes, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation, and the like. Transduction involves binding a cell receptor to a replication-defective recombinant virus (preferably retrovirus) particle and then introducing the nucleic acid contained in the particle into the cell. A vector commonly used for ex vivo delivery of genes is a retrovirus.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터 또는 바이러스가 아닌 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)) 및 지질-매개 전달계 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임, 예컨대, Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996) 참조)가 포함된다. 유전자 치료법에 사용하기에 가장 바람직한 벡터는 바이러스, 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에는 1종 이상의 전사 프로모터/인핸서 또는 좌위-정의 요소(들), 또는 얼터네이티브 스플리싱 (alternative splicing), 핵 RNA 유출 또는 메신저의 번역 후 수식과 같은 다른 방식으로 유전자 발현을 조절하는 기타 요소가 포함된다. 또한, 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터가 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 존재하에 전사되는 경우, 상기 벡터에는 상기 유전자에 작동가능하게 결합되어 번역 개시 서열로 작용하는 핵산 분자가 포함된다. 또한, 이러한 벡터 구조물에는 패키징 신호, 긴 말단 반복부 (LTR) 또는 그의 일부, 사용되는 바이러스에 적합한 음성 가닥 프라이머 결합 부위 (이들이 바이러스 벡터에 이미 존재하지 않는 경우)가 포함된다. 또한, 이러한 벡터에는 전형적으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포로부터의 상기 폴리펩티드의 분비를 위한 신호 서열이 포함된다. 바람직하게는, 이 목적을 위한 신호 서열은 포유동물의 신호 서열, 가장 바람직하게는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드용 천연 신호 서열이다. 임의로, 상기 벡터 구조물에는 한 개 이상의 제한효소 부위 및 번역 종결 서열 뿐만 아니라 폴리아데닐화를 지시하는 신호도 포함될 수 있다. 예를 들면, 이러한 벡터에는 전형적으로 5'LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성 기점, 및 3'LTR 또는 그의 일부가 포함될 것이다. 양이온성 지질, 폴리라이신 및 덴드리머와 같은 바이러스가 아닌 기타 벡터를 사용할 수 있다. Currently preferred in vivo nucleic acid delivery techniques include viral vectors or non-viral vectors (eg, adenoviruses, lentiviruses, herpes simplex I virus or adeno-associated virus (AAV)) and lipid-mediated delivery systems (lipid-mediated delivery of genes). Useful lipids include, for example, DOTMA, DOPE and DC-Chol, see, eg, Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996)). Most preferred vectors for use in gene therapy are viruses, most preferably adenoviruses, AAV, lentiviruses or retroviruses. Viral vectors, such as retroviral vectors, include one or more transcriptional promoters / enhancers or locus-defining element (s), or alternatively genes in alternative ways such as alternative splicing, nuclear RNA efflux, or post-translational modification of messengers. Other elements that control expression are included. In addition, viral vectors such as retroviruses are transcribed in the presence of genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptides. In this case, the vector includes a nucleic acid molecule operably linked to the gene to serve as a translation initiation sequence. Such vector constructs also include packaging signals, long terminal repeats (LTRs) or portions thereof, negative strand primer binding sites suitable for the virus used, if they are not already present in the viral vector. Such vectors also typically contain a secretion of the polypeptide from a host cell comprising a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. Signal sequences for are included. Preferably, the signal sequence for this purpose is a mammalian signal sequence, most preferably PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 Or a natural signal sequence for a PRO887 polypeptide. Optionally, the vector construct may include one or more restriction enzyme sites and translation termination sequences as well as signals indicative of polyadenylation. For example, such vectors will typically include 5'LTR, tRNA binding sites, packaging signals, second strand DNA synthesis origin, and 3'LTR or portions thereof. Other vectors other than viruses such as cationic lipids, polylysine and dendrimers can be used.

몇몇 경우에서, 표적 세포를 목표로 하는 물질, 예컨대, 세포 표면 막단백질 또는 표적 세포에 대해 특이적인 항체, 표적 세포의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 세포내이입 (endocytosis)과 관련된 세포 표면 막단백질에 결합하는 단백질은 예컨대, 켑시드 단백질 또는 특정한 세포 유형에 친화적인 그의 단편, 시클링시 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 위치결정을 목표로 하고 세포내 반감기를 증가시키는 단백질을 표적화하고(거나) 용이하게 받아들이는 데 사용될 수 있다. 수용체-매개 세포내이입의 기술은 예를 들어, 문헌 (Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990))에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 표시 (marking) 및 유전자 치료법 프로토콜의 검토를 위해서는 문헌 (Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992))을 참조한다. 또한, WO93/25673 및 본원에서 언급한 문헌들을 참조한다.In some cases, it is desirable to provide the nucleic acid source with a substance that targets the target cell, such as a cell surface membrane protein or an antibody specific for the target cell, a ligand for a receptor of the target cell, and the like. When liposomes are used, proteins that bind to cell surface membrane proteins associated with endocytosis are, for example, wexid proteins or fragments thereof that are friendly to a particular cell type, antibodies to proteins that undergo internalization upon cycling, and It can be used to target and / or easily accept proteins that target intracellular positioning and increase intracellular half-life. Techniques for receptor-mediated endocytosis are described, for example, in Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). For a review of currently known gene marking and gene therapy protocols, see Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992). See also WO93 / 25673 and the references mentioned herein.

레트로바이러스 입자 및 구조 단백질을 만드는 데 적합한 유전자 치료법 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,681,746호에서 찾을 수 있다.Suitable gene therapies and methods for making retroviral particles and structural proteins can be found, for example, in US Pat. No. 5,681,746.

vi. 진단수단으로서의 유전자 용도vi. Gene Use as a Diagnostic Tool

본 발명은 진단수단으로서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 용도에 관한 것이기도 하다. 돌연변이 형태의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 검출하는 것은 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 돌연변이가 종양을 일으킬 수 있기 때문에 종양과 같은 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환, 또는 이들 질환에 대한 감수성을 진달할 수 있게 할 것이다. The present invention also relates to the use of a gene encoding a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide as diagnostic means. Detecting mutant forms of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides can be detected by PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760 Cardiovascular diseases such as tumors, endothelial cell disease and angiogenic diseases, or susceptibility to these diseases because mutations in the polypeptides, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can cause tumors Will be able to progress.

인간 PRO179, 인간 PRO238, 인간 PRO364, 인간 PRO844, 인간 PRO846, 인간 PRO1760, 인간 PRO205, 인간 PRO321, 인간 PRO333, 인간 PRO840, 인간 PRO877, 인간 PRO878, 인간 PRO879, 인간 PRO882, 인간 PRO885 또는 인간 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 돌연변이를 수반하는 개체는 다양한 기술로 DNA 수준에서 검출할 수 있다. 진단용 핵산은 혈액, 소변, 침, 조직 생검 및 부검 물질과 같은 환자의 세포로부터 수득할 수 있다. 게놈 DNA는 검출에 직접 사용할 수 있고, 또는 분석 전에 PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986))을 이용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA는 상기와 동일한 목적에 사용할 수도 있다. 예로서, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 를 코딩하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 돌연변이체를 확인 및 분석할 수 있다. 예컨대, 결실 및 삽입은 정상 유전형과 비교할 때 증폭된 생성물의 크기 변화로 검출할 수 있다. 점돌연변이는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 방사선표지된 RNA, 또는 별법으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 방사선표지된 안티센스 DNA 서열과 증폭된 DNA를 혼성화시켜 확인할 수 있다. 완전히 일치하는 서열은 RNase A 절단, 또는 융점의 차이를 통해 일치하지 않는 이중쇄와 구별할 수 있다. Coding polypeptides human PRO179, human PRO238, human PRO364, human PRO844, human PRO846, human PRO1760, human PRO205, human PRO321, human PRO333, human PRO840, human PRO877, human PRO878, human PRO879, human PRO882, human PRO885 or human PRO887 Individuals carrying mutations in the gene can be detected at the DNA level by various techniques. Diagnostic nucleic acids can be obtained from cells of a patient such as blood, urine, saliva, tissue biopsy and autopsy material. Genomic DNA can be used directly for detection or can be enzymatically amplified using PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)) prior to analysis. RNA or cDNA can also be used for the same purpose as described above. For example, PRO179, PRO238 using PCR primers complementary to nucleic acids encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides. Polypeptide mutants, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be identified and analyzed. For example, deletions and insertions can be detected as changes in the size of the amplified product as compared to normal genotypes. Point mutations are radiolabeled RNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, or alternatively PRO179, PRO238, Amplified DNA can be identified by hybridizing radiolabeled antisense DNA sequences encoding PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides. Fully matched sequences can be distinguished from mismatched double chains through RNase A cleavage, or differences in melting points.

DNA 서열 차이를 기초로 한 유전자 시험은 변성제가 있거나 없이 겔에서 DNA 단편의 전기영동 이동에 있어서의 변화를 검출하여 달성할 수 있다. 소규모 서열 결실 및 삽입은 고해상 전기영동으로 관찰할 수 있다. 다양한 서열의 DNA 단편은 변성 포름아미딘 농도구배 겔에서 구별할 수 있는데, 여기서 여러 가지 DNA 단편의 이동성은 이들의 특정 융점 또는 부분 융점에 따라 겔의 다양한 위치에서 지연된다 (예컨대, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985) 참조).Genetic testing based on DNA sequence differences can be accomplished by detecting changes in electrophoretic migration of DNA fragments in gels with or without denaturing agents. Small sequence deletions and insertions can be observed by high resolution electrophoresis. DNA fragments of various sequences can be distinguished in denatured formamidine gradient gels, where the mobility of the various DNA fragments is delayed at various locations in the gel according to their specific melting or partial melting points (eg, Myers et al. , Science, 230: 1242 (1985).

특정 위치에서의 서열 변화는 예를 들어, RNase 및 S1 보호 방법 또는 화학적 절단 방법과 같은 뉴클리아제 보호 검정법에 의해 나타날 수도 있다 (Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985)).Sequence changes at specific positions may also be indicated by nuclease protection assays such as, for example, RNase and S1 protection methods or chemical cleavage methods (Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985)).

따라서, 혼성화, RNase 보호법, 화학적 절단법, 직접 DNA 시퀀싱, 제한효소의 사용, 예컨대 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), 및 게놈 DNA의 서던 블롯팅과 같은 방법으로 특정 DNA 서열을 검출할 수 있다.Thus, specific DNA sequences can be detected by methods such as hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing, use of restriction enzymes such as restriction fragment length polymorphism (RFLP), and Southern blotting of genomic DNA.

vii. PRO 폴리펩티드 농도를 검출하는 용도vii. Use to detect PRO polypeptide concentration

통상적인 겔 전기영동 및 DNA 시퀀싱 이외에도 제자리 분석 (in situ analysis)으로 돌연변이체를 검출할 수도 있다. In addition to conventional gel electrophoresis and DNA sequencing, mutants can also be detected by in situ analysis.

PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현은 종양 형성과 관련된 혈관 질환 또는 혈관형성과 연관성이 있을 수 있다. PRO 폴리펩티드에 신호 서열이 있고, mRNA가 내피세포에서 많이 발현되고 평활근세포에서 보다적은 농도로 발현되는 경우, 이는 PRO 폴리펩티드가 혈청에 존재함을 나타낸다. 따라서, 이 PRO 폴리펩티드의 바뀐 농도가 이러한 질환의 표시일 수 있기 때문에 항-PRO 폴리펩티드 항체는 종양 형성과 관련된 혈관 질환 또는 혈관형성을 진단하는 데 사용할 수 있다. Expression of nucleic acids encoding PRO polypeptides may be associated with vascular disease or angiogenesis associated with tumor formation. If the PRO polypeptide has a signal sequence and mRNA is expressed in endothelial cells and at a lower concentration in smooth muscle cells, this indicates that the PRO polypeptide is present in serum. Thus, anti-PRO polypeptide antibodies can be used to diagnose vascular disease or angiogenesis associated with tumor formation since altered concentrations of this PRO polypeptide may be indicative of such a disease.

경쟁적 검정법도 사용할 수 있는데, 여기서 상기 PRO 폴리펩티드에 특이적인 항체는 고형 지지체에 부착시키고, 표지된 PRO 폴리펩티드 및 숙주로부터 유래된 샘플은 상기 고형 지지체를 통과시키고, 상기 고형 지지체에 부착된 표지의 검출량은 샘플 중의 PRO 폴리펩티드의 양과 상관관계가 있을 수 있다. Competitive assays can also be used, wherein an antibody specific for the PRO polypeptide is attached to a solid support, a sample from the labeled PRO polypeptide and the host is passed through the solid support, and the amount of detection of the label attached to the solid support is There may be a correlation with the amount of PRO polypeptide in the sample.

viii. 염색체 맵핑(Chromosome mapping)viii. Chromosome mapping

본 발명의 서열은 염색체 확인에도 가치가 있다. 본 서열은 개별 인간 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되어 상기 특정 위치와 혼성화할 수 있다. 게다가, 현재 염색체 상의 특정 부위를 확인할 필요가 있다. 현재, 실제 서열 데이타 (반복부 다형성)를 기초로 한 소수의 염색체 표시 시약을 사용하여 염색체에서의 위치를 표시할 수 있다. 본 발명에 따라 DNA를 염색체에 맴핑하는 것은 상기 DNA 서열과 질환과 관련된 유전자를 연관시키는 데 있어서 중요한 첫 단계이다.The sequences of the present invention are also valuable for identifying chromosomes. This sequence can be specifically targeted to a specific location on an individual human chromosome to hybridize with that particular location. In addition, there is a current need to identify specific sites on the chromosome. At present, a small number of chromosomal marking reagents based on actual sequence data (repeat polymorphism) can be used to mark positions on chromosomes. Mapping DNA to chromosomes according to the present invention is an important first step in associating the DNA sequence with genes associated with the disease.

간단하게 말하면, cDNA로부터 PCR 프라이머 (바람직하게는 15-25 bp)를 제조함으로써 서열을 염색체에 맴핑할 수 있다. 3'-비번역 영역에 대한 컴퓨터 분석은 게놈 DNA에서 한 개 이상의 엑손에 걸쳐 있지 않은 프라이머를 신속히 선별하는 데 을 이용하므로 증폭 과정이 복잡해진다. 그 다음으로, 이들 프라이머는 개별 인간 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 상기 프라이머에 상응하는 인간 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 제공할 것이다. In simple terms, sequences can be mapped to chromosomes by making PCR primers (preferably 15-25 bp) from cDNA. Computational analysis of the 3'-untranslated region complicates the amplification process by using to quickly select primers that do not span more than one exon in genomic DNA. These primers are then used for PCR screening of somatic hybrids containing individual human chromosomes. Only hybrids containing human genes corresponding to the primers will provide amplified fragments.

체세포 하이브리드의 PCR 맴핑은 특정 DNA를 특정 염색체에 할당하는 신속한 방법이다. 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 쓰는 본 발명을 이용하여, 유사한 방식으로 특정 염색체 또는 큰 게놈 클론 집단으로부터 수득한 단편 판넬로 서브로칼리제이션(sublocalization)할 수 있다. 염색체에 맴핑하는 데 유사하게 사용할 수 있는 다른 맴핑 방법에는 제자리 혼성화, 표지된 유량-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝, 및 염색체-특정 cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 혼성화에 의한 예비선별이 포함된다.PCR mapping of somatic hybrids is a quick way to assign specific DNA to specific chromosomes. Using the same oligonucleotide primers, the present invention can be used to sublocalize into fragment panels obtained from a particular chromosome or large genomic clone population in a similar manner. Other mapping methods that can be similarly used to map to chromosomes include in situ hybridization, prescreening using labeled flow-classified chromosomes, and prescreening by hybridization to produce chromosome-specific cDNA libraries.

cDNA 클론과 중기 염색체 스프레드의 형광 제자리 혼성화 (FISH)는 한 단계로 정확한 염색체 위치를 알아내는 데 이용할 수 있다. 이 기술은 500 또는 600 개의 염기만큼 짧은 cDNA를 사용할 수 있지만, 2,000 bp보다 큰 클론은 단순 검출에 충분한 신호 강도로 유일한 염색체 위치에 결합할 가능성이 보다 높다. FISH는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 유래한 클론의 사용을 필요로 하고, 이 클론은 길수록 더 좋다. 예를 들어, 2,000 bp는 좋고, 4,000 bp는 더 좋지만, 4,000 bp 이상은 시간과 좋은 결과의 적당한 비율을 얻는 데 필요한 것은 아닌 것 같다. 이 기술의 검토를 위해서는 문헌 (Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques (Pergamin Press, New York, 1988))을 참조한다.Fluorescent in situ hybridization (FISH) of cDNA clones and mid-term chromosomal spreads can be used to locate the exact chromosome in one step. This technique can use cDNAs as short as 500 or 600 bases, but clones larger than 2,000 bp are more likely to bind to unique chromosomal positions with signal strength sufficient for simple detection. FISH requires the use of clones derived from genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides. Longer clones are better. For example, 2,000 bp is good, 4,000 bp is better, but more than 4,000 bp doesn't seem to be necessary to get the right ratio of time and good results. For a review of this technique, see Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques (Pergamin Press, New York, 1988).

일단 서열이 정확한 염색체 위치에 맴핑되면, 염색체에서의 서열의 물리적 위치는 유전적 맴 데이타와 상관성이 있을 수 있다. 이러한 데이타는 예를 들어, 문헌 (V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (존 홉킨스 유니버시티 웰치 메디칼 라이브러리로부터 온라인으로 이용가능함))에서 찾을 수 있다. 그 다음으로, 동일한 염색체 영역에 맴핑된 유전자와 질환 사이의 관계를 링키지 분석 (linkage analysis) (물리적으로 인접한 유전자의 동시유전)을 통해 확인한다. Once the sequence is mapped to the correct chromosome location, the physical location of the sequence on the chromosome may be correlated with genetic member data. Such data can be found, for example, in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (available online from John Hopkins University Welch Medical Library). Next, the relationship between the genes mapped to the same chromosomal region and the disease is confirmed by linkage analysis (cogeneity of physically adjacent genes).

그 다음, 병에 걸린 개체와 병에 걸리지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이점을 결정할 필요가 있다. 만약 돌연변이가 병에 걸린 일부 또는 모든 개체에서 관찰되지만, 임의의 정상 개체에서는 관찰되지 않으면, 이 돌연변이는 질환의 원인일 수 있다.Next, it is necessary to determine the difference in cDNA or genomic sequence between the diseased and uninfected individuals. If the mutation is observed in some or all individuals with disease, but not in any normal individual, this mutation may be the cause of the disease.

물리적 맴핑 및 유전적 맴핑 기술의 현재 해상력으로 볼 때, 질환과 관련된 염색체 영역에 정확히 위치한 cDNA는 50 내지 500개 (이것은 맴핑 해상력이 1 메가 염기이고 20 kb 당 한 개의 유전자가 있다고 가정할 경우임)의 잠재적인 원인 유전자들 중 하나일 수 있다.Given the current resolution of physical and genetic mapping techniques, 50-500 cDNAs are located precisely in the chromosomal region associated with the disease (assuming that they have 1 megabase of mapping and one gene per 20 kb). May be one of the potential causal genes for

ix. 약물 후보물질에 대한 스크리닝 검정법ix. Screening Assays for Drug Candidates

본 발명은 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 흉내내는 화합물 (아고니스트), 또는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 효과를 방해하는 물질 (길항제)을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법도 포함한다. 길항제 약물 후보물질에 대한 스크리닝 검정법은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드와 결합하거나, 결합체를 형성하는 화합물, 또는 다른 세포 단백질과 코딩된 폴리펩티드의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인할 수 있도록 디자인한다. 이러한 스크리닝 검정법은 소분자 약물 후보물질을 확인하기에 특히 적합하게 하는, 대량으로 화학적 라이브러리를 스크리닝할 수 있는 검정법을 포함할 것이다.  The present invention provides compounds (agonists) that mimic PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, or PRO179, PRO238, PRO364 And screening compounds to identify substances (antagonists) that interfere with the effects of the PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides. Screening assays for antagonist drug candidates include the following: PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, or PRO887 polypeptides Are designed to identify compounds that bind to, form a conjugate, or interfere with the interaction of the encoded polypeptide with other cellular proteins. Such screening assays will include assays that can screen chemical libraries in large quantities, making them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates.

상기 검정법은 단백질-단백질 결합 검정법, 생화학적 스크리닝 검정법, 면역검정법 및 세포를 사용한 검정법을 비롯하여 다양한 형식으로 수행할 수 있고, 이들의 특징은 당업계에 잘 규명되어 있다. The assay can be performed in a variety of formats, including protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays and assays with cells, and their characteristics are well known in the art.

길항제에 대한 모든 검정법은 약물 후보물질이 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드와 상호작용하기에 충분한 조건하에서 충분한 시간동안 이들 두 성분이 접촉하는 것을 요구한다는 점에서 같다. All assays for antagonists include PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 where drug candidates are encoded by the nucleic acids identified herein. The same is true in that these two components require contacting for a sufficient time under conditions sufficient to interact with the polypeptide.

결합 검정법에서, 상기 상호작용은 결합이고, 형성된 결합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 또는 약물 후보물질은 공유결합 또는 비공유결합 부착에 의해 고상, 예컨대, 마이크로타이터 플레이트 상에 부착되어 있다. 비공유결합 부착은 일반적으로 고체 표면을 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조하여 달성한다. 별법으로, 부착될 항체, 예를 들어, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대해 특이적인 모노클로날 항체는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 고체 표면에 부착시키는 데 사용할 수 있다. 상기 검정은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비부착된 성분을 부착된 성분, 예컨대, 부착된 성 분을 함유하는 코팅 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 완결될 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어, 세척하여 제거하고, 고체 표면 상에 부착된 결합체를 검출한다. 본래 부착되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 수반하는 경우, 표면 상에 부착된 표지의 검출은 결합체 형성이 일어났음을 나타낸다. 본래 부착되지 않은 성분이 표지를 수반하지 않는 경우, 결합체 형성은 예컨대, 부착된 결합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다. In a binding assay, the interaction is a bond and the conjugate formed can be isolated or detected in the reaction mixture. In specific embodiments, a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide or drug candidate encoded by a gene identified herein Is attached on a solid phase, such as a microtiter plate, by covalent or non-covalent attachment. Non-covalent attachment is generally achieved by coating and drying the solid surface with a solution of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. Alternatively, monoclonal specific for the antibody to be attached, eg, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide. Antibodies can be used to attach PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides to a solid surface. The assay is performed by adding an unattached component that can be labeled with a detectable label to a coating surface containing an attached component, such as an attached component. When the reaction is complete, unreacted components are removed, for example, by washing, and the binder attached on the solid surface is detected. If the component not originally attached carries a detectable label, detection of the label attached on the surface indicates that the formation of the conjugate occurred. If a component that is not originally attached does not involve a label, the formation of the conjugate can be detected using, for example, a labeled antibody that specifically binds to the attached conjugate.

후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 특정 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 상기 폴리펩티드와 후보 화합물의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 공지된 방법으로 검정할 수 있다. 이러한 검정법에는 예를 들어, 교차-결합, 동시-면역침전, 및 농도구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시-정제와 같은 전통적인 방법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 (Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991))에 개시된 바와 같은 필드 (Fields) 및 공동-연구자들의 문헌 (Fields and Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991))에 기재된 효모 유전계를 사용하여 관찰할 수 있다. 효모 GAL4와 같은 많은 전사 활성자는 물리적으로 구별되는 두 개의 조절 도메인으로 구성되어 있는데, 하나는 DNA-결합 도메인으로 작용하고 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현계 (일반적으로 " 투-하이브리드 시스템"으로 불림)는 이 특성을 이용하여 두 가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 한 개의 하이브리드 단백질은 표적 단백질이 GAL-4의 DNA-결합 도메인에 결합된 것이고, 또다른 하이브리드 단백질은 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 결합된 것이다. GAL4-활성화 프로모터의 조절하의 GAL1-lacZ 레포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 달려 있다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 클론은 β-갈락토시다제에 대한 정색 기질로 검출한다. 투-하이브리드 기술을 이용하여 두 개의 특정 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (MATCHMAKER(상표명))가 클론텍으로부터 시판된다. 이 계는 이들 상호작용에 중요한 핀포인트 아미노산 잔기 뿐만 아니라 특정한 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맴핑하는 데에도 사용할 수 있다. Candidate compounds interact but bind to specific PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides encoded by the genes identified herein If not, the interaction of the polypeptide with the candidate compound can be assayed by known methods for detecting protein-protein interactions. Such assays include, for example, traditional methods such as cross-linking, co-immunoprecipitation, and co-purification via gradient or chromatographic columns. In addition, protein-protein interactions are described by Fields and Co-Researchers as disclosed in Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Observed using the yeast genetic system described in Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991). Can be. Many transcriptional activators, such as yeast GAL4, consist of two physically distinct regulatory domains, one acting as a DNA-binding domain and the other as a transcription-activating domain. The yeast expression system described in this document (commonly referred to as the "two-hybrid system") uses this property to use two hybrid proteins, one hybrid protein of which the target protein is directed to the DNA-binding domain of GAL-4. Another hybrid protein is one in which the candidate activating protein is bound to an activation domain. Expression of the GAL1- lac Z reporter gene under the control of the GAL4-activating promoter depends on the reconstitution of GAL4 activity via protein-protein interactions. Clones containing interacting polypeptides are detected with a color substrate for β-galactosidase. A complete kit (MATCHMAKER ™) is available from Clontech to confirm protein-protein interactions between two specific proteins using two-hybrid techniques. This system can be used to map not only pinpoint amino acid residues important for these interactions, but also protein domains involved in specific protein interactions.

본원에서 확인된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물은 하기와 같이 시험할 수 있다. 통상적으로, 상기 유전자의 산물과 세포내 또는 세포외 성분을 함유한 반응 혼합물은 이들 두 생성물을 상호작용시키고 결합시키는 조건하에서 충분한 시간동안 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응은 시험 화합물의 존재 및 부재하에 수행한다. 또한, 위약을 제3 반응 혼합물에 첨가하여 양성 대조구로 사용할 수 있다. 상기 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (결 합체 형성)은 상기에 기재한 바와 같이 관찰한다. 대조 반응물(들)에는 결합체가 형성되지만 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에는 결합체가 형성되지 않는 것은 시험 화합물이 후보 화합물과 그의 반응 파트너의 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다. Mutation of genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides and other intracellular or extracellular components identified herein Compounds that interfere with the action can be tested as follows. Typically, reaction mixtures containing the product of the gene and intracellular or extracellular components are prepared for a sufficient time under conditions that interact and bind these two products. To test the ability of the candidate compound to inhibit binding, the reaction is performed in the presence and absence of the test compound. A placebo can also be added to the third reaction mixture to use as a positive control. The binding (conjugation formation) between the test compound present in the mixture and the intracellular or extracellular component is observed as described above. A binder is formed in the control reactant (s) but no binder is formed in the reaction mixture containing the test compound, indicating that the test compound interferes with the interaction of the candidate compound with its reaction partner.

만약 PRO 폴리펩티드가 코-마이토겐 ConA의 존재 하에 내피세포의 증식을 자극하는 능력을 갖는다면, 이 능력을 이용하는 스크리닝 방법의 한 예가 있다. 구체적으로는, 증식 검정법에서 인간 배꼽정맥 내피세포를 수득하여 96-웰 평편-바닥 배양 플레이트에서 배양하고 (Costar, Cambridge, MA), 세포의 증식을 촉진하기에 적합한 반응 혼합물, 즉 Con-A를 함유한 혼합물 (Calbiochem, La Jolla, CA)로 보충한다. Con-A 및 스크리닝할 화합물을 첨가하고 37℃에서 배양한 후, ³H-티미딘을 펄스를 통해 배양물에 넣고 유리 섬유 필터 (phD:; Cambridge Technology, Watertown, MA) 위에서 세포를 모았다. 액체 신틸레이션 카운터 (Beckman Instrument, Irvine, CA)를 사용하여 삼중 배양물의 평균 ³H-티미딘 삽입양 (cpm)을 계산한다. 상당한 ³H-티미딘 삽입은 내피세포 증식의 자극을 나타낸다. If the PRO polypeptide has the ability to stimulate the proliferation of endothelial cells in the presence of co-mytogen ConA, there is an example of a screening method using this ability. Specifically, human umbilical vein endothelial cells are obtained in a proliferation assay and cultured in 96-well flat-bottom culture plates (Costar, Cambridge, Mass.) And a reaction mixture suitable for promoting the proliferation of cells, namely Con-A. Supplement with the containing mixture (Calbiochem, La Jolla, CA). After adding Con-A and the compound to be screened and incubated at 37 ° C., ³ H-thymidine was added to the culture via pulses and cells were collected on a glass fiber filter (phD :; Cambridge Technology, Watertown, Mass.). A liquid scintillation counter (Beckman Instrument, Irvine, Calif.) Is used to calculate the average ³ H-thymidine insertion (cpm) of the triple culture. Significant ³ H-thymidine insertions indicate stimulation of endothelial cell proliferation.

길항제를 검정하기 위해, 상기 검정법을 수행하나, 이 검정법에서 PRO 폴리펩티드를 스크리닝할 화합물과 함께 첨가하고, PRO 폴리펩티드의 존재하에서 ³(H)-티미딘 삽입을 억제하는 화합물의 능력은 상기 화합물이 PRO 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타낸다. 별법으로, 길항제는 경쟁적인 억제 검정법에 적당한 조건하에 서 PRO 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막결합 PRO 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 결합시켜 검출할 수 있다. 상기 PRO 폴리펩티드는 방사능과 같은 것으로 표지할 수 있으므로, 수용체에 결합된 PRO 폴리펩티드의 수를 세어 잠재적인 길항제의 효능을 측정할 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 다수의 방법, 예컨대, 리간드 패닝 및 FACS 분류로 확인할 수 있다 (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)). 바람직하게는, 발현 클로닝을 이용하는데, 여기서 폴리아데닐화된 RNA는 PRO 폴리펩티드에 반응하는 세포로부터 제조하고, 이 RNA로부터 만들어진 cDNA 라이브러리는 군으로 나누어 PRO 폴리펩티드에 반응하지 않는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시키는 데 사용한다. 유리 슬라이드 위에 자란 형질감염된 세포를 표지된 PRO 폴리펩티드에 노출시킨다. PRO 폴리펩티드는 부위-특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 포섭 (inclusion)을 비룻한 다양한 방법으로 표지할 수 있다. 고정 및 인큐베이션 후, 상기 슬라이드를 방사능 사진으로 분석한다. 양성 집단을 확인하고 하위집단을 준비한 후, 상호작용성 하위-집단화 (pooling) 및 재스크리닝 방법을 사용하여 다시 형질감염시킴으로써 최종적으로 잠정적인 수용체를 코딩하는 단일 클론을 얻는다. To assay the antagonist, the above assay is performed, but in this assay the ability of a compound to add a PRO polypeptide along with the compound to be screened and to inhibit ³ (H) -thymidine insertion in the presence of the PRO polypeptide is such that the compound is PRO Indicates that it is an antagonist to the polypeptide. Alternatively, the antagonist can be detected by binding the PRO polypeptide and potential antagonist with a membrane bound PRO polypeptide receptor or recombinant receptor under conditions suitable for competitive inhibition assays. Since the PRO polypeptide can be labeled as radioactivity, the number of PRO polypeptides bound to the receptor can be counted to determine the potency of the potential antagonist. Genes encoding receptors can be identified by a number of methods known in the art, such as ligand panning and FACS classification (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1 (2): Chapter 5 (1991)). Preferably, expression cloning is used, wherein the polyadenylated RNA is prepared from cells that respond to the PRO polypeptide, and the cDNA library made from the RNA is divided into groups to characterize COS cells or other cells that do not respond to the PRO polypeptide. Used to infect Transfected cells grown on glass slides are exposed to labeled PRO polypeptide. PRO polypeptides can be labeled in a variety of ways, including iodide or inclusion of recognition sites for site-specific protein kinases. After fixation and incubation, the slides are analyzed with radiographs. After identifying the positive populations and preparing the subpopulations, transfection is again carried out using interactive sub-pooling and rescreening methods to obtain a single clone that finally encodes a potential receptor.

수용체 확인을 위한 대안으로서, 표지된 PRO 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물과 광친화-결합시킬 수 있다. 가교결합된 물질을 PAGE로 해상하고 X-선 막에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 결합체를 잘라내어 펩티드 단편으로 해상하고, 단백질 미세-시퀀싱할 수 있다. 잠정적인 수용체를 코 딩하는 유전자를 확인하기 위해, 미세-시퀀싱으로부터 얻은 아미노산 서열을 이용하여 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 쓰이는 축퇴 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 디자인할 수 있다. As an alternative for receptor identification, the labeled PRO polypeptide can be photoaffinity-bound with cell membranes or extracts expressing receptor molecules. The crosslinked material is resolved by PAGE and exposed to the X-ray membrane. Labeled conjugates containing receptors can be cut out, resolved into peptide fragments, and protein microsequenced. To identify genes encoding potential receptors, amino acid sequences obtained from micro-sequencing can be used to design a set of degenerate oligonucleotide probes for screening cDNA libraries.

길항제에 대한 또다른 검정법에서, 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 준비물은 후보 화합물의 존재하에서 표지된 PRO 폴리펩티드와 함께 인큐베이션한다. 그 다음으로, 이 상호작용을 상승시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다. In another assay for antagonists, the mammalian cell or membrane preparation expressing the receptor is incubated with the labeled PRO polypeptide in the presence of the candidate compound. Next, the ability of the compound to elevate or block this interaction can be measured.

심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료에 유용한 조성물에는 표적 유전자 산물의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중-나선 분자 등이 포함되나, 여기에 제한되지 않는다. Compositions useful for the treatment of cardiovascular, endothelial and angiogenic diseases include antibodies, small organic and inorganic molecules, peptides, phosphopeptides, antisense and ribozyme molecules, triplets that inhibit the expression and / or activity of target gene products. -Spiral molecules and the like, but are not limited thereto.

잠재적인 길항제의 보다 구체적인 예로는 PRO 폴리펩티드와 이뮤노글로불린 의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 구체적으로는 인간 항체 및 항체 단편 뿐만 아니라, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체, 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 이러한 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화된 항체를 비롯한 항체가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 별법으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어, 수용체를 인식하나 효과를 나타내지 않아 PRO 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 PRO 폴리펩티드의 돌연변이 형태일 수 있다. More specific examples of potential antagonists include oligonucleotides that bind to fusions of PRO polypeptides and immunoglobulins, and specifically human antibodies and antibody fragments, as well as polyclonal and monoclonal antibodies, antibody fragments, single chain antibodies. Antibodies, including, but not limited to, anti-idiotype antibodies, and chimeric or humanized antibodies of such antibodies or fragments. Alternatively, the potential antagonist may be a mutant form of a closely related protein, eg, a PRO polypeptide that recognizes a receptor but has no effect and competitively inhibits the action of the PRO polypeptide.

또다른 잠재적인 PRO 폴리펩티드 길항제 또는 아고니스트는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구조물인데, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술은 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA나 RNA를 통해 유전자 발현을 조절하는 데 사용할 수 있으며, 이들 방법 둘다는 DNA 또는 RNA와 폴리뉴클레오티드의 결합을 기초로 한다. 예를 들면, 본원의 성숙 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩부는 길이가 약 10 내지 40 bp인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 데 사용한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사 (triple helix - Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991) 참조)에 관여하는 유전자의 영역에 상보적이어서 PRO 폴리펩티드의 전사 및 생성을 방해하도록 디자인한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA와 혼성화하여 mRNA 분자가 PRO 폴리펩티드로 번역되는 것을 차단한다 (안티센스-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). 상기 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 PRO 폴리펩티드의 생성을 억제할 수도 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 번역-개시 부위, 예컨대, 약 -10과 +10 위치 사이의 서열로부터 유래한 올리고디옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다. Another potential PRO polypeptide antagonist or agonist is an antisense RNA or DNA construct made using antisense technology, where the antisense RNA or DNA molecule hybridizes with the target mRNA to interfere with protein translation, thereby directly blocking the translation of the mRNA. Do it. Antisense techniques can be used to regulate gene expression via triple-helix formation or antisense DNA or RNA, both of which are based on the binding of polynucleotides with DNA or RNA. For example, the 5 'coding portion of a polynucleotide sequence encoding a mature PRO polypeptide herein is used to design antisense RNA oligonucleotides that are about 10 to 40 bp in length. DNA oligonucleotides are described in transcription (triple helix-Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (see 1991), which is complementary to the region of the gene involved to disrupt the transcription and production of the PRO polypeptide. Antisense RNA oligonucleotides hybridize with mRNA in vivo to block the translation of mRNA molecules to PRO polypeptides (antisense-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca) Raton, FL, 1988). The oligonucleotides may be delivered to cells to express antisense RNA or DNA in vivo to inhibit the production of PRO polypeptides. When using antisense DNA, oligodioxyribonucleotides derived from the translation-initiation site of the target gene nucleotide sequence, such as between about -10 and +10 positions, are preferred.

안티센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 일반적으로 약 5개 염기 이상, 약 10개 염기 이상, 약 15개 염기 이상, 약 20개 염기 이상, 약 25개 염기 이상, 약 30개 염기 이상, 약 35개 염기 이상, 약 40개 염기 이상, 약 45개 염기 이상, 약 50 개 염기 이상, 약 55개 염기 이상, 약 60개 염기 이상, 약 65개 염기 이상, 약 70개 염기 이상, 약 75개 염기 이상, 약 80개 염기 이상, 약 85개 염기 이상, 약 90개 염기 이상, 약 95개 염기 이상, 약 100개 염기 이상, 또는 그 이상이다. Antisense RNA or DNA molecules are generally at least about 5 bases, at least about 10 bases, at least about 15 bases, at least about 20 bases, at least about 25 bases, at least about 30 bases, about 35 bases. At least about 40 bases, at least about 45 bases, at least about 50 bases, at least about 55 bases, at least about 60 bases, at least about 65 bases, at least about 70 bases, at least about 75 bases, At least about 80 bases, at least about 85 bases, at least about 90 bases, at least about 95 bases, at least about 100 bases, or more.

잠재적인 길항제에는 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 PRO 폴리펩티드의증식 인자나 다른 관련 결합 부위에 결합하는 소분자가 있다. 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 있으나, 이에 제한되지 않는다.Potential antagonists include small molecules that bind to the active site, receptor binding site, or growth factor or other related binding site of the PRO polypeptide. Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules, preferably soluble peptides, and synthetic bipeptidyl organic or inorganic compounds.

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소계 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적인 표적 RNA와의 서열 특이적 혼성화에 이은 핵산내부분해성 절단 (endonucleolytic cleavage)을 통해 작용한다. Ribozymes are enzymatic RNA molecules capable of catalyzing the specific cleavage of RNA. Ribozymes act through sequence specific hybridization with complementary target RNAs followed by endonucleolytic cleavage.

잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위는 공지된 기술로 확인할 수 있다. 더 자세한 내용은 문헌 (Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), and PCT 공개 번호 제WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개됨))을 참조한다. Specific ribozyme cleavage sites in potential RNA targets can be identified by known techniques. For further details, see Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), and PCT Publication No. WO 97/33551 (published September 18, 1997).

전사를 억제하는 데 사용되는 삼중-나선 형성에 있어서의 핵산 분자는 단일 가닥이고 디옥시뉴클레오티드로 구성된다. 이들 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 일반적으로 퓨린 또는 피리미딘의 꽤 큰 스트레취가 이중쇄의 한 가닥에 존재ㅎ해야 하는 호그스틴 (Hoogsteen) 염기-짝짓기 규칙을 통해 삼중-나선 형성을 촉진하도록 디자인한다. 보다 자세한 내용은 문헌 (상기 PCT 공개 번호 제WO 97/33551호)을 참조한다.Nucleic acid molecules in triple-helix formation used to inhibit transcription are single stranded and consist of deoxynucleotides. The base composition of these oligonucleotides is generally designed to promote triple-helix formation through the Hogsteen base-pairing rule where a fairly large stretch of purine or pyrimidine must be present on one strand of the double chain. See PCT Publication No. WO 97/33551, supra, for further details.

이들 소분자는 본원에서 논의된 하나 이상의 임의의 스크리닝 검정법 및(또 는) 당업자에 잘 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술로 확인할 수 있다.These small molecules can be identified by one or more of the screening assays discussed herein and / or by any other screening technique well known to those skilled in the art.

x. 치료받아야 하는 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 형태x. Types of Cardiovascular, Endothelial, and Angiogenic Diseases to be Treated

본원에 기재된 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법에서 활성을 나타내는 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 및(또는) 심혈관계에 위치하는 것으로 확인된 그의 유전자 산물은 당뇨병과 같이 혈관에 영향을 주는 전신질환을 포함하여 다양한 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료에 사용할 수 있다. 이들의 치료 용도에는 동맥, 모세혈관, 정맥, 및(또는) 림프관의 질환이 포함된다. 치료의 예로는 근육 소모병의 치료, 골다공증의 치료, 이식물 주위의 세포 증식을 자극하여 의도한 부위와 이식물의 부착을 용이하게 하는 이식물 고정에 있어서 보조, 조직 또는 혈청내 IGF의 안정성 증가 및, 적용가능하다면, IGF 수용체에 대한 결합 증가 (IGF가 시험관내에서 인간 골수 적혈구 및 과립성 전구세포 증식을 촉진하는 것으로 나타나기 때문임)가 있다. PRO polypeptides exhibiting activity in the cardiovascular, endothelial and angiogenic assays described herein, their agonists or antagonists, and / or their gene products identified to be located in the cardiovascular system are systemic diseases that affect blood vessels such as diabetes. It can be used for the treatment of various cardiovascular diseases, endothelial cell diseases and angiogenic diseases, including. Their therapeutic uses include diseases of arteries, capillaries, veins, and / or lymphatic vessels. Examples of treatment include increased stability of IGF in adjuvant, tissue or serum in the treatment of muscle wasting, in the treatment of osteoporosis, in implant fixation that stimulates cell proliferation around the implant to facilitate attachment of the intended site and the implant. , If applicable, increased binding to the IGF receptor (since IGF appears to promote human bone marrow erythrocytes and granular progenitor cell proliferation in vitro).

PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제는 적혈구조혈 또는 과립구조혈을 자극하는 데; 조직, 예컨대 결합조직, 피부, 골, 연골, 근육, 폐 또는 신장의 재증식과 관련된 창상 또는 조직 재생 및 관련 치료를 자극하는 데; 혈관신생을 촉진하는 데; 내피세포의 이동을 자극하거나 억제하는 데; 및 혈관 평활근의 증식 및 내피세포 생성을 상승시키는 데 사용할 수도 있다. PRO 폴리펩티드 또는 길항제에 의해 매개되는 혈관신생의 증가는 허혈 조직, 및 관상 협착증을 수반하는 심장의 측부 관상 발달에 이롭다. 길항제는 이러한 폴리펩티드의 작용을 억제하는 데 사용하는데, 예를 들어, PRO 폴리펩티드가 창상 치유 또는 폐섬유증 과정동안 과도한 결합 조직의 생성을 촉진한다면 이러한 생성을 제한하는 데 사용한다. 이것은 급성 심근경색증 및 심부전의 치료를 포함할 것이다.PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof, stimulates erythropoietic or granulocyte; Stimulating wound or tissue regeneration and related treatment associated with re-proliferation of tissue such as connective tissue, skin, bone, cartilage, muscle, lung or kidney; To promote angiogenesis; To stimulate or inhibit endothelial cell migration; And to increase vascular smooth muscle proliferation and endothelial cell production. An increase in angiogenesis mediated by PRO polypeptides or antagonists is beneficial for ischemic tissue, and lateral coronary development of the heart accompanied by coronary stenosis. Antagonists are used to inhibit the action of such polypeptides, for example if PRO polypeptides promote the production of excess connective tissue during wound healing or pulmonary fibrosis processes. This will include the treatment of acute myocardial infarction and heart failure.

게다가, 본 발명은 근원적인 원인과 관계없이 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 투여하여 근원적인 원인과 관계없이 심비대증을 치료하는 것에 관한 것이다. 목적이 인간 환자의 치료라면, PRO 폴리펩티드로는 재조합 인간 PRO 폴리펩티드 (rhPRO 폴리펩티드)가 바람직하다. 심비대증의 치료는 임의의 다양한 단계에서 수행할 수 있는데, 상기 심비대증은 심근경색증, 고혈압, 비대증성 심근병증 및 판역류를 비롯한 다양한 병리적 상태로부터 발생할 수 있다. 치료는 근원적인 심장 질환과 관계 없이 심근의 구조적인 손상이 있거나 없는 심비대증의 모든 진행 단계까지 확장된다.Moreover, the present invention relates to the treatment of cardiac hypertrophy regardless of the underlying cause by administering a therapeutically effective amount of a PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof, regardless of the underlying cause. If the goal is the treatment of a human patient, a recombinant human PRO polypeptide (rhPRO polypeptide) is preferred as the PRO polypeptide. Treatment of cardiac hypertrophy can be performed at any of a variety of stages, which can arise from a variety of pathological conditions, including myocardial infarction, hypertension, hypertrophic cardiomyopathy and platelet flow. Treatment extends to all stages of cardiac hypertrophy, with or without structural damage to the myocardium, regardless of the underlying heart disease.

분자 자체를 사용할지, 아니면 이 분자에 대한 길항제와 반대로 작용하는, 임의의 특정 증상에 대한 그의 아고니스트를 사용할지를 결정하는 것은 본원의 분자가 심혈관형성, 내피세포 생성 또는 혈관신생을 촉진하는지, 아니면 이들 상태를 억제하는지에 주로 달려 있다. 예를 들어, 분자가 혈관신생을 촉진하면, 그의 길항제는 혈관신생을 제한하거나 방해하는 것이 필요한 질환의 치료에 유용하다. 이러한 질환의 예로는 혈관종과 같은 혈관 종양; 종양 혈관신생; 당뇨병성 망막병증 또는 미성숙 소아 망막병증, 또는 황반퇴행성 및 증식성 유리체망막병증과 관련된 망막, 맥락막, 각막에서의 혈관신생; 류마티스성 관절염; 크론병, 죽상경화증, 난소 과자극증후군, 건선, 혈관신생과 관련된 자궁내막증, 풍선 혈관성형술 후의 재발협착증, 예컨대 수술 후 형성되는 켈로이드에서 나타나는 반흔 조직의 과다형성, 심근경색증 후의 섬유증, 또는 폐섬유증과 관련된 섬유 손상이 있다.Determining whether to use the molecule itself or its agonist for any particular symptom, which acts opposite to the antagonist to this molecule, is whether the molecule of the present invention promotes cardiovascularization, endothelial cell production or angiogenesis, or It mainly depends on whether you suppress these states. For example, if a molecule promotes angiogenesis, its antagonist is useful for the treatment of diseases in which it is necessary to limit or hinder angiogenesis. Examples of such diseases include vascular tumors such as hemangiomas; Tumor angiogenesis; Angiogenesis in the retina, choroid, cornea associated with diabetic retinopathy or immature childhood retinopathy, or macular degenerative and proliferative vitreoretinopathy; Rheumatoid arthritis; Crohn's disease, atherosclerosis, ovarian hyperstimulation syndrome, psoriasis, endometriosis associated with angiogenesis, restenosis after balloon angioplasty, such as hyperplasia of scar tissue in keloids formed after surgery, fibrosis after myocardial infarction, or There is related fiber damage.

그러나, 만약 상기 분자가 혈관신생을 억제하면, 이 분자는 상기 질환의 치료에 직접 사용할 수 있다.However, if the molecule inhibits angiogenesis, the molecule can be used directly in the treatment of the disease.

한편, 상기 분자가 혈관신생을 자극하면, 말초 혈관 질환, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이나우드병 및 레이나우드 증후군, 동맥류, 대동맥 재발협착증, 혈전성정맥염, 림프관염, 림프부종, 창상 치유 및 조직 회복, 허혈, 재관류 손상, 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 만성 심장 질환, 울혈성 심부전과 같은 심부전 및 골다공증과 같이 혈관신생이 바람직한 질환을 위해 그 자체 (또는 그의 아고니스트)를 사용할 수 있다.On the other hand, if the molecule stimulates angiogenesis, peripheral vascular disease, hypertension, inflammatory vasculitis, Raynaud's disease and Raynaud's syndrome, aneurysm, aortic restenosis, thrombophlebitis, lymphangitis, lymphedema, wound healing and tissue recovery, It may use itself (or its agonists) for diseases where angiogenesis is desirable, such as ischemia, reperfusion injury, angina pectoris, myocardial infarction such as acute myocardial infarction, chronic heart disease, heart failure such as congestive heart failure and osteoporosis.

그러나, 만약 상기 분자가 혈관신생을 억제하면, 상기 분자의 길항제는 혈관신생이 바람직한 상기 질환의 치료에 사용할 수 있다.However, if the molecule inhibits angiogenesis, the antagonist of the molecule can be used to treat the disease in which angiogenesis is desired.

특정한 형태의 질환이 하기에 기재되어 있는데, 여기서 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 혈관-관련 약물 표적화에 유용한 것으로서, 또는 하기 질환의 치료 또는 예방용 치료 표적으로서 작용가능하다. 죽상경화증은 동맥벽내 지질 축적, 평활근 세포의 증식 및 섬유 조직의 형성으로 인한 동맥의 내막 비후화 플라크의 축적에 의해 특징지워지는 질환이다. 상기 질환은 임의의 기관에 있는 대동맥, 중동맥 및 소동맥에 영향을 줄 수 있다. 내피세포 및 혈관 평활근 세포 기능의 변화는 이들 플라크의 축적 및 퇴행을 조절하는 데 중요한 역활을 하는 것으로 알려져 있다. Certain forms of disease are described below, wherein the PRO polypeptides or antagonists thereof herein are useful for vascular-related drug targeting or can act as therapeutic targets for the treatment or prophylaxis of the following diseases. Atherosclerosis is a disease characterized by the accumulation of endothelial thickening plaques in the arteries due to lipid accumulation in the arterial wall, the proliferation of smooth muscle cells and the formation of fibrous tissue. The disease can affect the aorta, middle and small arteries in any organ. Changes in endothelial and vascular smooth muscle cell function are known to play an important role in regulating the accumulation and degeneration of these plaques.

고혈압은 전신 동맥, 폐동맥 또는 문맥계의 상승된 혈압에 의해 특징지워진 다. 상승된 혈압은 손상된 내피세포 기능 및(또는) 혈관 질환으로부터 초래되거나, 손상된 내피세포 기능 및(또는) 혈관 질환을 초래할 수 있다.Hypertension is characterized by elevated blood pressure in the systemic, pulmonary or portal vein. Elevated blood pressure may result from impaired endothelial function and / or vascular disease, or may result in impaired endothelial function and / or vascular disease.

염증성 혈관염에는 거대 세포 동맥염, 타카야수 (Takayasu's) 동맥염, 결절성 다발동맥염 (미세혈관병증 형태를 포함함), 가와사키병 (Kawasaki's disease), 현미경 다발염, 베게너 (Wegener's) 육아종증, 및 다양한 감염-관련 혈관 질환 (헤노호-쉐라인 (Henoch-Schonlein) 자반증을 포함함)이 포함된다. 바뀐 내피세포 기능은 이들 질환에서 중요한 것으로 나타났다. Inflammatory vasculitis includes giant cell arteritis, Takayasu's arteritis, nodular polyarteritis (including microangiopathy forms), Kawasaki's disease, microscopic polyarthritis, Wegener's granulomatosis, and various infection-related Vascular diseases (including Henoch-Schonlein purpura). Altered endothelial function has been shown to be important in these diseases.

레이나우드병 및 레이나우드 증후군은 추위에 노출시 사지를 통해 순환의 비정상적인 간헐적 손상에 의해 특징지워진다. 바뀐 내피세포 기능은 이 질환에서 중요한 것으로 보인다. Raynaud's disease and Raynaud's syndrome are characterized by abnormal intermittent damage of the circulation through the limbs when exposed to cold. Altered endothelial function seems to be important in this disease.

동맥류는 바뀐 내피세포 및(또는) 혈관 평활근 세포와 관련된 동맥계 또는 정맥계의 낭상형 또는 방추형 팽창이다.Aneurysms are cystic or fusiform expansions of the arterial or venous system associated with altered endothelial and / or vascular smooth muscle cells.

동맥 재발협착증 (동맥벽의 재발협착증)은 내피세포 및 혈관 평활근 세포의 기능 및 증식에 있어서의 변화의 결과로서 혈관성형술 후에 발생할 수 있다.Arterial restenosis (restenosis of the artery wall) can occur after angioplasty as a result of changes in the function and proliferation of endothelial cells and vascular smooth muscle cells.

혈전성정맥염, 림프관염은 바뀐 내피세포 기능으로부터 초래할 수 있고(거나), 바뀐 내피세포 기능을 초래할 수 있는 정맥 및 림프관 각각의 염증성 질환이다. 유사하게, 림프부종은 내피세포 기능으로부터 발생되는 손상된 림프 혈관을 수반하는 질환이다. Thrombophlebitis, lymphangitis is an inflammatory disease of the venous and lymphatic vessels that can result from altered endothelial function and / or result in altered endothelial function. Similarly, lymphedema is a disease involving damaged lymph vessels resulting from endothelial cell function.

양성 및 악성 혈관 종양 족은 혈관계 세포 요소의 비정상적인 증식 및 증식에 의해 특징지워진다. 예컨대, 림프관종은 신생아에서 흔히 발생하는 선천성 림 프관 기형(종종 낭성임)인 림프계의 양성 종양이다. 낭성 종양은 인접한 조직내까지 증식하는 경향이 있다. 낭성 종양은 대개 자궁 및 겨드랑 부위에서 발생한다. 이들은 사지의 연조직에서도 발생할 수 있다. 주요 증상은 부풀어 있고 종종 그물모양 구조인 림프관, 및 결합조직에 의해 둘러쌓인 림프구이다. 림프관종은 부적절하게 결합된 배아 림프관 또는 이들의 결핍에 의해 발생되는 것으로 생각된다. 손상된 국소 림프 배출이 그 결과이다 (Griener et al., Lymphology, 4: 140-144 (1971)).Benign and malignant vascular tumor families are characterized by abnormal proliferation and proliferation of vascular system cell elements. For example, lymphangioma is a benign tumor of the lymphatic system that is a congenital lymphatic vessel malformation (often cystic) that commonly occurs in newborns. Cystic tumors tend to proliferate into adjacent tissues. Cystic tumors usually develop in the uterus and axillary areas. They can also occur in the soft tissues of the extremities. The main symptoms are swelling and often lymphatic vessels, which are reticulated, and lymphocytes surrounded by connective tissue. Lymphangioma is thought to be caused by improperly coupled embryonic lymphatic vessels or their deficiency. Impaired local lymphatic drainage is the result (Griener et al., Lymphology, 4: 140-144 (1971)).

본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 또다른 용도는 종양이 증식하고(거나) 전이할 수 있게 하는 종양의 혈관형성을 수반하는 종양 혈관신생의 예방에 있다. 이 과정은 새로운 혈관의 증식에 달려 있다. 종양 혈관신생을 수반하는 종양 및 관련 질환의 예로는 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 결장직장암, 간암, 난소암, 난포막종, 남성배세포종, 자궁암, 자궁내막암, 자궁내막 증식증, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막종, 머리 및 목 암, 비강인두암, 후두암, 간모세포종, 카포시 육종, 흑색종, 피부암, 혈관종, 해면혈관종, 혈관모세포종, 췌장암, 망막모세포종, 성상세포종, 교모세포종, 슈반종, 핍지교종, 수모세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요도육종, 갑상선암, 윌름스종양, 신장세포암, 전립선암, 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 부종 (뇌종양과 관련된 것과 같은 부종) 및 메이그스 증후군 (Meigs's syndrome)이 있다. Another use of the PRO polypeptides or their antagonists herein is in the prevention of tumor angiogenesis involving angiogenesis of tumors that allow tumors to proliferate and / or metastasize. This process depends on the growth of new blood vessels. Examples of tumors and associated diseases involving tumor angiogenesis include breast cancer, lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, liver cancer, ovarian cancer, follicular oma, andrmal cell tumor, uterine cancer, endometrial cancer, endometrial hyperplasia, endometriosis, fibrosis Sarcoma, chorionic carcinoma, head and neck cancer, nasal pharyngeal cancer, laryngeal cancer, hepatoblastoma, Kaposi's sarcoma, melanoma, skin cancer, hemangioma, cavernous hemangioma, hemangioblastoma, pancreatic cancer, retinoblastoma, astrocytoma, glioblastoma, schwanma , Medulloblastoma, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, osteosarcoma, leiomyosarcoma, urethral sarcoma, thyroid cancer, Wilms' tumor, renal cell carcinoma, prostate cancer, abnormal vascular proliferation associated with nevus, edema (edema as associated with brain tumors) and may There is Meigs's syndrome.

연령-관련 황반퇴화증 (AMD)은 나이가 든 집단에서 심각한 시각 손실을 일으키는 주원인이다. AMD 삼출 형태의 특징은 맥락 혈관신생 및 망막 색소 상피세포 탈착이다. 맥락 혈관신생이 예후에 있어서 급격한 악화와 관련되어 있기 때문에, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 AMD의 심각도를 완화시키는 데 유용한 것으로 기대된다. Age-related macular degeneration (AMD) is a major cause of severe vision loss in older populations. The features of the AMD exudation form are choroidal neovascularization and retinal pigment epithelial cell detachment. Because choroidal neovascularization is associated with a sharp exacerbation in prognosis, PRO polypeptides or antagonists thereof are expected to be useful for alleviating the severity of AMD.

창상 치유 및 조직 회복과 같은 외상의 치유 역시 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그들의 길항제의 또다른 용도이다. 새로운 혈관의 형성 및 퇴행은 조직 치유 및 회복에 필수적이다. 이 카테고리에는 화상, 절개 및 궤양의 치료에 있어서의 창상 치유와 조직 회복 및 교체 뿐만 아니라 골, 연골, 힘줄, 인대 및(또는) 신경 조직 증식 또는 재생이 포함된다. 골이 정상적으로 형성되지 않는 환경하에서 연골 및(또는) 골 증식을 유도하는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 인간 및 다른 동물에서 골 골절, 및 연골 손상 또는 결함의 치료에 적용된다. PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 포함하는 제제는 개방성 골절 뿐만 아니라 폐쇄성 골절 완화에 사용할 수 있고, 인공 관절의 고정을 개선시키는 데 사용할 수도 있다. 골생성제에 의해 유도된 새로운 골 형성은 선천성 두개안면 결함, 외상에 의해 유도된 두개안면 결함, 종양성 두개안면 결함, 또는 절개에 의해 유도된 두개안면 결함의 회복에 기여하고, 미용 성형 수술에도 유용하다.The healing of trauma, such as wound healing and tissue repair, is another use of the PRO polypeptides or their antagonists herein. Formation and degeneration of new blood vessels is essential for tissue healing and recovery. This category includes bone healing, cartilage, tendons, ligaments and / or nerve tissue proliferation or regeneration as well as wound healing and tissue repair and replacement in the treatment of burns, incisions and ulcers. PRO polypeptides or antagonists thereof that induce cartilage and / or bone proliferation under conditions in which bones do not form normally are applied in the treatment of bone fractures and cartilage damage or defects in humans and other animals. Formulations comprising a PRO polypeptide or antagonist thereof may be used to relieve closed fractures as well as open fractures, and may be used to improve fixation of artificial joints. New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the recovery of congenital craniofacial defects, traumatic induced craniofacial defects, neoplastic craniofacial defects, or incisional craniofacial defects. useful.

PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 압력 궤양, 혈관 부족과 관련된 궤양, 수술 및 외상적 창상 등을 비롯한, 그러나 여기에 제한되지 않는 비-치유 창상의 보다 개선된 또는 보다 빠른 폐쇄를 촉진하는 데 유용할 수도 있다.The PRO polypeptide or antagonist thereof may be useful for promoting better or faster closure of non-healing wounds, including but not limited to pressure ulcers, ulcers associated with vascular insufficiency, surgery and traumatic wounds, and the like. .

PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 기관 (예컨대, 췌장, 간, 장, 신장, 피부 또는 내피), 근육 (평활근, 골격근 또는 심근), 및 혈관 (혈관 내피 포함함) 조 직과 같은 다른 조직의 생성 또는 재생, 또는 이러한 조직을 구성하는 세포의 증식 촉진에 대한 활성을 나타낼 수도 있다. 원하는 효과 중에는 섬유성 반흔형성의 억제 또는 조절에 의해 정상 조직을 재생하는 것이다. PRO polypeptides or antagonists thereof produce or regenerate organs (e.g., pancreas, liver, intestine, kidney, skin or endothelial), muscles (smooth muscle, skeletal muscle or myocardium), and other tissues such as blood vessels (including vascular endothelial) Alternatively, the cells may exhibit activity for promoting the proliferation of cells constituting such tissues. Among the desired effects are the regeneration of normal tissues by inhibition or control of fibrotic scarring.

본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 소화관 보호 또는 재생, 및 폐 또는 간 섬유증, 다양한 조직의 재관류 손상 및 전신적인 사이토카인 손상으로부터 발생하는 질환의 치료에 유용할 수도 있다. 또한, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 전구 조직 또는 전구 세포로부터의 상기 조직의 분화를 촉진 또는 억제하는 데 유용할 수 있거나, 상기 조직의 증식을 억제하는 데 유용할 수 있다.The PRO polypeptides or antagonists herein may be useful for protecting or regenerating the digestive tract and for treating diseases resulting from pulmonary or liver fibrosis, reperfusion injury of various tissues and systemic cytokine damage. In addition, a PRO polypeptide or antagonist thereof may be useful for promoting or inhibiting the differentiation of said tissue from progenitor tissue or progenitor cells, or may be useful for inhibiting proliferation of said tissue.

PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 치주질환의 치료 및 다른 치아-회복 과정에 사용할 수도 있다. 이러한 약제는 골-형성 세포를 끌어당기거나, 골-형성 세포의 증식을 자극하거나, 골-형성 세포 전구체의 분화를 유도하는 환경을 제공할 수 있다. 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 골 및(또는) 연골 회복의 자극을 통해 골다공증 또는 골관절염의 치료에 유용할 수 있거나, 염증, 또는 염증 과정에 의해 매개되는 조직 파괴 (콜라게나제 활성, 파골세포 활성 등) 과정의 차단을 통해 골다공증 또는 골관절염의 치료에 유용할 수도 있는데, 이는 혈관이 골 교체 및 증식의 조절에 중요한 역할을 하기 때문이다. PRO polypeptides or antagonists thereof can also be used in the treatment of periodontal disease and other tooth-recovery processes. Such agents may provide an environment that attracts bone-forming cells, stimulates proliferation of bone-forming cells, or induces differentiation of bone-forming cell precursors. The PRO polypeptides or antagonists thereof herein may be useful for the treatment of osteoporosis or osteoarthritis through stimulation of bone and / or cartilage repair, or tissue destruction mediated by inflammation or inflammatory processes (collagenase activity, osteoclast activity Etc.) may be useful in the treatment of osteoporosis or osteoarthritis, because the blood vessels play an important role in regulating bone replacement and proliferation.

본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제에 기인할 수 있는 조직 재생 활성의 또다른 카테고리는 힘줄/인대 형성이다. 이러한 조직이 정상적으로 형성되지 않는 환경에서 힘줄/인대-유사 조직 또는 다른 조직 형성을 유도하는 단백질은 인간 및 다른 동물에서 힘줄 또는 인대 누액, 기형, 및 다른 힘줄 또는 인대 결함의 치유에 사용할 수 있다. 이러한 제제는 골 또는 다른 조직에 힘줄 또는 인대를 고정시키는 것을 개선시키고 힘줄 또는 인대 조직의 결함을 회복시키는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 힘줄 또는 인대 조직의 손상을 예방하는 데 사용할 수 있다. 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 조성물에 의해 유도된 새로운 힘줄/인대-유사 조직 형성은 선천성 힘줄 또는 인대 결함, 외상에 의해 유도된 힘줄 또는 인대 결함, 또는 다른 유래의 기타 힘줄 또는 인대 결함에 기여하고, 힘줄 또는 인대의 부착 또는 회복을 위한 미용 성형 수술에도 유용하다. 본원의 조성물은 힘줄 또는 인대 형성 세포를 끌어당기거나, 힘줄 또는 인대 형성 세포의 증식을 자극하거나, 힘줄 또는 인대 형성 세포의 전구체의 분화를 유도하거나, 생체외에서 힘줄/인대 세포 또는 전구체의 증식을 유도하는 환경을 제공함으로써 조직을 회복시키는 생체내 복구를 가능케 한다. 본원의 조성물은 건염, 수근관증후군 및 기타 힘줄 또는 인대 결함의 치료에 유용할 수도 있다. 상기 조성물은 당업계에 잘 공지된 담체로서 적당한 매트릭스 및(또는) 분포획제를 포함할 수도 있다. Another category of tissue regeneration activity that may be attributable to the PRO polypeptides herein or antagonists thereof is tendon / ligament formation. Proteins that induce tendon / ligament-like tissue or other tissue formation in environments where these tissues do not normally form can be used to heal tendon or ligament leakage, malformations, and other tendon or ligament defects in humans and other animals. Such agents can be used to improve fixation of tendons or ligaments to bone or other tissues and to repair defects of tendons or ligament tissues, as well as to prevent damage to tendons or ligament tissues. New tendon / ligament-like tissue formation induced by the compositions of the PRO polypeptides herein or their antagonists contributes to congenital tendon or ligament defects, tendon or ligament defects induced by trauma, or other tendon or ligament defects derived from other It is also useful in cosmetic surgery for the attachment or recovery of tendons or ligaments. The compositions herein attract a tendon or ligament-forming cell, stimulate the proliferation of a tendon or ligament-forming cell, induce differentiation of a precursor of a tendon or ligament-forming cell, or induce proliferation of a tendon / ligament cell or precursor in vitro By providing an environment that allows for in vivo repair to restore tissue. The compositions herein may be useful for the treatment of tendinitis, carpal tunnel syndrome and other tendon or ligament defects. The composition may comprise a suitable matrix and / or distribution agent as carriers well known in the art.

PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 신경세포의 증식, 및 신경조직과 뇌조직의 재생, 즉 기계적 및 외상적 질환 뿐만 아니라 신경세포 또는 신경조직의 퇴화, 사멸, 또는 외상을 수반하는 중추 및 말초 신경계 질환 및 신경병증의 치료에 유용할 수도 있다. 보다 구체적으로, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 말초 신경 손상, 말초 신경병증 및 국소 신경병증과 같은 말초 신경계 질환, 및 알쯔하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성측삭경화증 및 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군과 같은 중추 신경계 질환의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명에 따라 치료가능한 추가 질환에는 기계적 및 외상적 질환, 예컨대 척수 질환, 머리 외상, 및 졸중과 같은 뇌혈관 질환이 포함된다. 화학치료법 또는 다른 의학적 치료법으로부터 발생한 말초 신경병증은 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 사용하여 치료할 수도 있다. PRO polypeptides or antagonists thereof are central and peripheral nervous system diseases and nerves that involve the proliferation of nerve cells and the regeneration of nerve and brain tissues, ie mechanical and traumatic diseases as well as degeneration, death, or trauma of nerve cells or nerve tissues. It may be useful for the treatment of conditions. More specifically, the PRO polypeptide or antagonist thereof is a peripheral neurological disease such as peripheral nerve damage, peripheral neuropathy and focal neuropathy, and Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis and Shy-Drager It may be useful for the treatment of diseases of the central nervous system such as) syndrome. Additional diseases treatable according to the present invention include mechanical and traumatic diseases such as cerebrovascular diseases such as spinal cord disease, head trauma, and stroke. Peripheral neuropathy arising from chemotherapeutic or other medical therapies may also be treated using the PRO polypeptides herein or antagonists thereof.

허혈-재관류 손상은 또다른 질환이다. 내피세포 기능저하는 허혈-재관류 손상 후에 일어나는 후유증의 개시 및 조절 둘다에 중요할 수 있다. Ischemia-reperfusion injury is another disease. Endothelial cell dysfunction can be important for both initiation and control of sequelae that occur after ischemia-reperfusion injury.

류마티스성 관절염은 또다른 질환이다. 맥관계를 통한 혈관 증식 및 염증세포의 표적화는 류마티스성 관절염 및 혈청반응-음성 형태의 관절염의 병리과정에 중요한 성분이다.Rheumatoid arthritis is another disease. Vascular proliferation and targeting of inflammatory cells through the vascular system are important components in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and sero-negative forms of arthritis.

심비대증을 앓는 환자에게 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 투여하면 심비대증의 진행을 예방하고, 무증상 환자의 사망을 비롯해 갑작스러운 사망을 피할 수도 있다. 광범위한 좌심실 심비대증 (성인의 경우에는 35mm 이상의 최대 벽 두께, 또는 어린이의 경우에는 비교가능한 값)으로 진단받은 환자의 경우, 및 심장 상의 혈액동력학적 과부하가 상당히 강한 경우에는 상기 예방 요법이 특히 필요하다.Administration of a PRO polypeptide or antagonist thereof to a patient with cardiac hypertrophy may prevent the progression of cardiac hypertrophy and avoid sudden death, including death of asymptomatic patients. This prevention therapy is particularly necessary for patients diagnosed with a wide range of left ventricular cardiac hypertrophy (maximum wall thickness of 35 mm or more in adults, or comparable values in children), and when hemodynamic overload on the heart is quite strong. .

PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 실질적으로 비대증성 심근병증으로 진단받은 일부 환자에서 발달하는 심방세동의 관리에 유용할 수도 있다.PRO polypeptides or antagonists thereof may be useful for the management of atrial fibrillation that develops in some patients substantially diagnosed with hypertrophic cardiomyopathy.

추가 질환에는 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 및 울혈성 심부전과 같은 심부전이 포함된다. 추가적인 비종양성 질환에는 건선, 당뇨병성 망막병증, 및 미숙아 망막병증을 포함한 기타 증식성 망막병증, 수정체후부 섬유증식 증, 신생혈관 녹내장, 갑상선 과다증식증 (그레이브스병을 포함함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 신증후군, 전자간증, 복수증, 심낭삼출증 (심낭과 관련된 것과 같은 것) 및 흉막삼출증이 포함된다.Additional diseases include angina, myocardial infarction, such as acute myocardial infarction, and heart failure, such as congestive heart failure. Additional non-tumor diseases include psoriasis, diabetic retinopathy, and other proliferative retinopathy, including prematurity retinopathy, posterior capsular fibrosis, neovascular glaucoma, hyperthyroidism (including Graves' disease), corneas, and other tissue transplants. Chronic inflammation, pulmonary inflammation, nephrotic syndrome, preeclampsia, ascites, pericardial effusion (such as that associated with the pericardium) and pleural effusion.

상기의 관점에서, 내피세포 기능, 증식 및(또는) 형태를 바꾸거나 손상을 주는 것으로 보이는, 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제는 상기 기재한 다수의 질환 또는 모든 질환의 병인 및 발병기전에 중요한 역할을 하는 것 같으므로, 이들 과정을 증대시키거나 억제하기 위한 치료 표적으로서, 또는 이들 질환에 있어서 혈관-관련 약물 표적화에 작용할 수 있다. In view of the above, the PRO polypeptides, agonists or antagonists described herein, which appear to alter or impair endothelial function, proliferation and / or morphology, are the pathogenesis and pathogenesis of many or all of the diseases described above. As it seems to play an important role in, it can act as a therapeutic target for augmenting or inhibiting these processes or in vascular-related drug targeting in these diseases.

xi. 투여 프로토콜, 스케줄, 투여량 및 제제xi. Dosing protocols, schedules, dosages and formulations

본원의 분자 및 그의 아고니스트와 길항제는 상기에 기재한 다양한 질환 및 장애의 예방제 및 치료제로서 제약학적으로 유용하다.Molecules herein and agonists and antagonists thereof are pharmaceutically useful as prophylactic and therapeutic agents for the various diseases and disorders described above.

PRO 폴리펩티드, 아고니스트 또는 길항제의 치료 조성물은 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 적당한 순도의 원하는 분자를 임의로 제약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))와 혼합하여 저장용으로 제조한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 양 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 방부제, 예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암노늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레졸; 저분자량 (약 10개 잔기 이하)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 및 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 금속 착화물 (예컨대, Zn-단백질 착화물); 및(또는) TWEEN (상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. Therapeutic compositions of PRO polypeptides, agonists or antagonists can optionally contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer of the desired molecule in the form of a lyophilized formulation or aqueous solution (Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)) for storage. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to recipients in the amounts and concentrations employed, and include buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; Antioxidants including ascorbic acid and methionine; Preservatives such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol, butyl or benzyl alcohol, alkyl parabens such as methyl or propyl paraben, catechol, resorcinol , Cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol; Low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; Proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; Hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; Amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; Monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, and dextrins; Chelating agents such as EDTA; Sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; Salt-forming counter ions such as sodium; Metal complexes (eg, Zn-protein complexes); And / or non-ionic surfactants such as TWEEN ™, PLURONICS ™ or polyethylene glycol (PEG).

이러한 담체의 다른 예로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 완충 물질, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질이 있고, 상기 전해질의 예로는 프로타민 술페이트, 디소듐 히드로겐 포스페이트, 포타슘 히드로겐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연염, 실리카 콜로이드, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기재 물질 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 국소 형태 또는 겔-기재 형태의 길항제용 담체로는 소듐 카르복시메틸셀룰로스 또는 메틸셀룰로스와 같은 폴리사카라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 나무 왁스 알콜이 있다. 모든 투여를 위해, 통상적인 데포 형태를 적당하게 사용한다. 이러한 형태로는 예를 들어, 마이크로캡슐, 나노-캡슐, 리포좀, 반창고, 흡입 형태, 비강 분무, 설하 정제 및 서방 제제가 있다. PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제는 전형적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도의 상기 비히클로 제제화될 것이다. Other examples of such carriers include ion exchangers, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins such as human serum albumin, buffer substances such as phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, and partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids. , Water, salts or electrolytes, examples of which are protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride, zinc salt, silica colloid, magnesium trisilicate, polyvinyl pyrrolidone, cellulose- Base materials and polyethylene glycols. Carriers for antagonists in topical or gel-based form include polysaccharides such as sodium carboxymethylcellulose or methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyacrylates, polyoxyethylene-polyoxypropylene-block polymers, polyethylene glycols and There is wood wax alcohol. For all administrations, conventional depot forms are suitably used. Such forms include, for example, microcapsules, nano-capsules, liposomes, plasters, inhaled forms, nasal sprays, sublingual tablets and sustained release formulations. PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof will typically be formulated with the vehicle at a concentration of about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml.

다른 제제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 형성된 제품내로 혼입하는 것을 포함한다. 이러한 제품은 내피세포의 증식 및 혈관신생을 조절하는 데 사용될 수 있다. 또한, 종양 침윤 및 전이도 상기 제품으로 조절할 수 있다.Other agents include incorporating the PRO polypeptide or antagonist thereof into the formed product. Such products can be used to regulate the proliferation and angiogenesis of endothelial cells. In addition, tumor invasion and metastasis can also be controlled with these products.

생체내 투여에 사용되는 PRO 폴리펩티드 또는 길항제는 멸균되어야 한다. 이는 동결 건조 및 재구성 이전 또는 이후에 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 달성될 수 있다. 전신 투여하는 경우, 상기 PRO 폴리펩티드는 통상 동결 건조 형태로 또는 용액 중에 보관할 것이다. 동결 건조된 형태인 경우, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 통상 사용시 적합한 희석제와의 재구성을 위해 다른 성분과의 배합물 형태로 제제화한다. PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 액상 제제의 예에는 피하 주사용 단일 투여 바이알내에 채워진 멸균, 투명, 무색의 무방부 용액제가 있다. 반복 사용에 적합한 방부 처리 제약 조성물은 주로 처방전 및 폴리펩티드 유형에 따라,PRO polypeptides or antagonists used for in vivo administration must be sterile. This can be readily accomplished by filtration through sterile filtration membranes before or after freeze drying and reconstitution. For systemic administration, the PRO polypeptide will usually be stored in lyophilized form or in solution. When in lyophilized form, the PRO polypeptide or antagonist thereof is formulated in combination with other ingredients for reconstitution with a suitable diluent in normal use. Examples of liquid formulations of PRO polypeptides or antagonists thereof are sterile, clear, colorless, unprotected solutions filled in single dose vials for subcutaneous injection. Preservative pharmaceutical compositions suitable for repeat use are primarily dependent on prescription and polypeptide type,

a) PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제,a) PRO polypeptide, agonist or antagonist thereof,

b) 폴리펩티드 또는 기타 분자가 용액 중에서 최대로 안정될 수 있는 pH(바람직하게는 약 4 내지 8)를 유지할 수 있는 완충액,b) a buffer capable of maintaining a pH (preferably about 4 to 8) at which the polypeptide or other molecule can be most stable in solution,

c) 교반에 의해 유도되는 응집 현상에 대해 폴리펩티드 또는 분자를 일차적으로 안정화시키는 세정제 및 계면활성제,c) detergents and surfactants that primarily stabilize the polypeptide or molecule against aggregation phenomenon induced by agitation,

d) 등장화제(isotonifier),d) isotonic agents,

e) 페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드)의 군으로부터 선택되는 방부제, 및e) preservatives selected from the group of phenols, benzyl alcohols and benzethonium halides (eg chlorides), and

f) 물f) water

을 함유할 수 있다.It may contain.

사용되는 세정제가 비이온성인 경우, 세정제는 예를 들면, 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트(등록상표)(POLYSORBATE), 트윈(등록상표)(TWEEN) 20, 80 등) 또는 폴록사머(예를 들면, 폴록사머(등록상표)(POLOXAMER) 188)일 수 있다. 비이온성 계면활성제를 사용하면 폴리펩티드의 변성을 일으키지 않으면서 제제를 전단 표면 스트레스에 노출시킬 수 있다. 또한, 이러한 계면활성제 함유 제제는 폐 투여에 사용되는 것과 같은 에어로졸 장치, 및 바늘이 없는 제트 주사기 (needleless jet injector gun; EP 제257,956호 참조)로 투여될 수 있다.If the detergent used is nonionic, the detergent may be, for example, polysorbate (e.g., polysorbate® (POLYSORBATE), tween® (TWEEN) 20, 80, etc.) or poloxamer (Eg, POLOXAMER) 188). The use of nonionic surfactants allows the agent to be exposed to shear surface stress without causing denaturation of the polypeptide. Such surfactant-containing formulations may also be administered in aerosol devices such as those used for pulmonary administration, and in needleless jet injector guns (see EP 257,956).

등장화제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 액상 조성물의 등장성을 유지하도록 하기 위해 존재할 수 있으며, 그 예에는 폴리히드릭 당 알콜, 바람직하게는 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 트리히드릭 또는 그 이상의 당 알콜이 있다. 이들 당 알콜은 단독으로 또는 배합된 상태로 사용될 수 있다. 별법으로, 염화나트륨 또는 기타 적합한 무기염이 용액을 등장액으로 만드는 데 사용될 수 있다.Isotonic agents may be present to maintain the isotonicity of the liquid composition of the PRO polypeptide or antagonist, such as polyhydric sugar alcohols, preferably glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol Trihydric or higher sugar alcohols. These sugar alcohols may be used alone or in combination. Alternatively, sodium chloride or other suitable inorganic salt can be used to make the solution isotonic.

완충액은 예를 들어, 원하는 pH에 따라 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 또는 포스페이트 완충액 등일 수 있다. 본 발명의 액상 제제 중 한 유형의 pH는 약 4 내지 8, 바람직하게는 대략 생리적 pH로 완충된다.The buffer can be, for example, acetate, citrate, succinate or phosphate buffer, etc., depending on the desired pH. The pH of one type of liquid formulation of the present invention is buffered at about 4-8, preferably approximately physiological pH.

페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드) 등의 방부제는 사용가능한 공지된 항미생물제이다.Preservatives such as phenol, benzyl alcohol and benzethonium halides (eg chloride) are known antimicrobial agents that can be used.

통상, 치료용 PRO 폴리펩티드 조성물은 멸균 투입구가 있는 용기, 예를 들어, 정맥내 주사용 백, 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 바이알내에 넣는다. 바람직하게는, 상기 제제는 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.) 또는 근육내 (i.m.) 주사로 반복 투여하거나, 또는 비강내 또는 폐내 전달에 적합한 에어로졸 제제로서 투여한다 (페내 전달의 경우에는 유럽 특허 제257,956호 참조).Typically, a therapeutic PRO polypeptide composition is placed in a container with a sterile inlet, for example an intravenous bag, a vial having a stopper through which a hypodermic needle can penetrate. Preferably, the formulation is administered repeatedly by intravenous (iv), subcutaneous (sc) or intramuscular (im) injection, or as an aerosol formulation suitable for intranasal or pulmonary delivery (European patent for intradermal delivery). No. 257,956).

또한, PRO 폴리펩티드는 서방성 제제의 형태로 투여될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예에는 상기 단백질을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형품 형태, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 문헌 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982))에 기재된 바와 같은 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호 및 EP 제58,481호), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(Langer et al., 상기 문헌), Lupron Depot(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 제133,988호)이 포함된다.PRO polypeptides can also be administered in the form of sustained release preparations. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the protein, which matrices are in the form of shaped articles, such as films or microcapsules. Examples of sustained-release matrices include polyester, Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982) Hydrogels as described in (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate)), polylactides (US Pat. Nos. 3,773,919 and EP 58,481), L-glutamic acid and gamma ethyl-L- Copolymers of glutamate (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), non-degradable ethylene-vinyl acetate (Langer et al., Supra), Lupron Depot® (lactic acid-glycolic acid aerial) Degradable lactic acid-glycolic acid copolymers, such as injectable microspheres consisting of coalescein and leuprolide acetate, and poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP 133,988).

에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동 안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 단백질이 장기간동안 체내에 남아있는 경우, 상기 단백질은 37 ℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 감소되고 면역원성이 변화될 수 있다. 단백질의 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 술프히드릴 잔기의 수식, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발을 통해 안정화시킬 수 있다.Polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid release molecules for more than 100 days, while some hydrogels release proteins for shorter periods of time. If the encapsulated protein remains in the body for a long time, the protein may denature or aggregate when exposed to moisture at 37 ° C. to reduce biological activity and alter immunogenicity. Rational strategies can be designed depending on the mechanism involved for stabilizing proteins. For example, if the aggregation mechanism is found to be intramolecular SS bond formation through thio-disulfide interchange, modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, control of moisture content, use of appropriate additives and specificity Stabilization through the development of a polymeric matrix composition.

또한, 서방성 PRO 폴리펩티드 조성물에는 리포좀에 의해 포획된 PRO 폴리펩티드가 포함될 수 있다. PRO 폴리펩티드를 함유하는 리포좀은 문헌 (DE 제3,218,121호; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); EP 제52,322호; EP 제36,676호; EP 제88,046호; EP 제143,949호; EP 제142,641호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호; 미국 특허 제4,544,545호; 및 EP 제102,324호)에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 통상, 리포좀은 지질 함량이 약 30 몰%의 콜레스테롤보다 더 높고, 선택된 비율을 조정하여 최적의 치료를 할 수 있는 작은 크기의(약 200 내지 800Å) 단일 적층형이다.In addition, the sustained release PRO polypeptide composition may include a PRO polypeptide captured by liposomes. Liposomes containing PRO polypeptides are described in DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese Patent Application Nos. 83-118008; US Patent 4,485,045; US Patent No. 4,544,545; and EP 102,324). Typically, liposomes have a lipid content higher than about 30 mole percent cholesterol and are small sized (about 200-800 mm 3) single laminations that can be adjusted for optimal treatment.

PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 치료 유효량은 물론, 치료할 (예방 포함) 병리적 증상, 투여 방법, 치료에 사용되는 화합물의 유형, 관련된 임의의 보조 치료법, 환자의 연령, 환자의 체중, 일반적인 의학적 상태, 병력 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이며, 그 결정은 전문의가 능숙하게 할 것이다. 따라서, 치료자는 최대의 치료 효과를 얻는 데 필요한 투여량을 결정하고 투여 경로를 변화시킬 필요가 있다. PRO 폴리펩티드의 숙주 범위가 좁은 경우, 인간 PRO 폴리펩티드를 포함하는 제제가 인간 환자의 치료에 바람직하며, 천연 서열의 인간 PRO 폴리펩티드를 포함하는 제제가 더욱 바람직하다. 임상의는 투여량이 해당 증상의 치료에 필요한 효과를 얻을 때까지 PRO 폴리펩티드를 투여할 것이다. 예를 들어, 치료 목적이 CHF의 치료인 경우, 상기 투여량은 CHF와 관련된 진행성 심비대증을 억제하는 양이다. 이 치료법의 진행은 초음파 심전도검사를 수행하여 용이하게 관찰할 수 있다. 이와 유사하게, 비대증성 심근병증을 앓고 있는 환자의 경우, PRO 폴리펩티드는 임상 실험을 기초로 하여 투여할 수 있다.The therapeutically effective amount of a PRO polypeptide or antagonist thereof, as well as the pathological condition to be treated (including prevention), the method of administration, the type of compound used for treatment, any adjuvant therapy involved, the age of the patient, the weight of the patient, the general medical condition, a medical history It will depend on such factors as the decision and the decision will be proficient by a specialist. Thus, the therapist needs to determine the dosage required to obtain the maximum therapeutic effect and to change the route of administration. Where the host range of PRO polypeptides is narrow, preparations comprising human PRO polypeptides are preferred for the treatment of human patients, preparations comprising human PRO polypeptides in their native sequence are more preferred. The clinician will administer the PRO polypeptide until the dosage achieves the effect necessary for the treatment of the condition. For example, if the therapeutic goal is treatment of CHF, the dose is an amount that inhibits progressive cardiac hypertrophy associated with CHF. The progress of this therapy can be easily observed by performing an ultrasound electrocardiogram. Similarly, for patients suffering from hypertrophic cardiomyopathy, the PRO polypeptide can be administered based on clinical trials.

상기 지침에 따라, 효과적인 투여량은 통상 약 0.001 내지 약 1.0mg/kg이며, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1mg/kg이다.According to the above instructions, the effective dosage is usually about 0.001 to about 1.0 mg / kg, more preferably about 0.01 to 1.0 mg / kg, most preferably about 0.01 to 0.1 mg / kg.

성인 고혈압 치료를 위해 비경구 투여하는 경우, 체중 1kg당 PRO 폴리펩티드를 약 0.01 내지 50mg, 바람직하게는 0.05 내지 20mg, 가장 바람직하게는 1 내지 20mg씩 주사 형태로 일일 1 내지 3회에 걸쳐 정맥내 주사 투여하는 것이 유리하다. 경구 투여의 경우, 체중 1kg당 약 5mg 내지 1g, 바람직하게는 10 내지 100mg의 PRO 폴리펩티드 분자를 일일 1 내지 3회 투여하는 것이 바람직하다. 내독소의 오염은, 예를 들면, 단백질 1mg당 0.5ng 미만의 안전한 수준으로 최소화되어야 함을 알아야 한다. 게다가, 인간에게 투여하는 경우, 제제는 FDA 및 생물학적 표준에서 요구하 는 멸균성, 발열성, 총체적 안전성 및 순도를 총족시키는 것이 바람직하다.In parenteral administration for the treatment of adult hypertension, intravenous injections are administered once or three times daily in the form of injections of about 0.01 to 50 mg, preferably 0.05 to 20 mg, most preferably 1 to 20 mg of PRO polypeptide per kg of body weight. It is advantageous to administer. For oral administration, it is preferred to administer about 5 mg to 1 g, preferably 10 to 100 mg, of PRO polypeptide molecules 1-3 times daily per kg body weight. It should be noted that contamination of endotoxins should be minimized, for example, to a safe level of less than 0.5 ng per mg of protein. In addition, when administered to humans, it is desirable that the formulation meets the sterility, pyrogenicity, overall safety and purity required by the FDA and biological standards.

조직의 재생에 사용되는 PRO 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물의 투약법은 주치의가 폴리펩티드의 작용을 변화시키는 다양한 인자, 예컨대, 형성시키길 원하는 조직의 중량, 손상 부위, 손상된 조직의 상태, 상처의 크기, 손상된 조직의 유형(예를 들어, 뼈), 환자의 연령, 성별 및 식이 요법, 임의의 감염의 심각성, 투여 시간 및 기타 임상적 인자를 고려하여 결정할 것이다. 투여량은 재구성에 사용되는 매트릭스의 유형, 및 다른 단백질이 제약 조성물에 포함되었는지에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, IGF-I과 같은 기타 공지된 증식 인자를 최종 조성물에 첨가하는 것도 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 치료의 진행은 예컨대, X-선, 조직형태학적 측정 및 테트라싸이클린 표지를 통해 조직과 뼈의 성장 및(또는) 회복을 주기적으로 측정함으로써 관찰할 수 있다.Dosage of a pharmaceutical composition containing a PRO polypeptide used for tissue regeneration involves various factors that change the action of the polypeptide, such as the weight of the tissue desired to be formed, the site of damage, the condition of the damaged tissue, the size of the wound, the damaged The type of tissue (eg bone), the age, sex and diet of the patient, the severity of any infection, the time of administration and other clinical factors will be determined. Dosages may vary depending on the type of matrix used for reconstitution and whether other proteins are included in the pharmaceutical composition. For example, the addition of other known growth factors, such as IGF-I, to the final composition may also affect the dosage. The progress of treatment can be observed by periodically measuring the growth and / or recovery of tissues and bones, for example via X-rays, histological measurements and tetracycline labels.

PRO 폴리펩티드, 아고니스트 또는 길항제는 공지된 방법, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 뇌내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 안내, 동맥내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 주사 또는 관주, 또는 하기 기재되는 바와 같은 서방계를 통해 투여된다. 또한, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 국소 및 전신 치료 효과를 나타내기 위해 종양 내부, 종양 주변, 손상부 내부 또는 손상부 주변 경로를 통해 적당하게 투여할 수 있다. 예를 들면, 난소암 치료시 복강내 투여가 특히 유용할 것으로 생각된다.PRO polypeptides, agonists or antagonists are known methods, for example, intravenous, intramuscular, intracranial, intraperitoneal, intramedullary, subcutaneous, intraocular, intraarterial, synovial, intramenoral, oral, topical or inhalation routes. By injection or by irrigation, or via the sustained release system as described below. In addition, PRO polypeptides or antagonists thereof may be suitably administered via intratumoral, peritumor, intratracheal or pericardial routes to produce local and systemic therapeutic effects. For example, intraperitoneal administration is believed to be particularly useful in the treatment of ovarian cancer.

펩티드 또는 소분자가 길항제 또는 아고니스트로 사용되는 경우, 이는 액체 또는 고체의 형태로 포유동물에게 경구 또는 비경구적 투여하는 것이 바람직하다.If the peptide or small molecule is used as an antagonist or agonist, it is preferably administered orally or parenterally to the mammal in the form of a liquid or solid.

염을 형성하고 본원의 하기에 유용한 분자의 약리학상 허용되는 염의 예는 알칼리 금속염(예를 들면, 나트륨염, 칼륨염), 알칼리 토금속염(예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염), 암모늄염, 유기 염기염(예를 들면, 피리딘염, 트리에틸아민염), 무기산염(예를 들면, 염산염, 황산염, 질산염), 및 유기산의 염(예를 들면, 아세테이트, 옥살레이트, p-톨루엔술포네이트)이 포함된다.Examples of pharmacologically acceptable salts of molecules that form salts and are useful herein below include alkali metal salts (eg, sodium salts, potassium salts), alkaline earth metal salts (eg calcium salts, magnesium salts), ammonium salts, organics Base salts (e.g., pyridine salts, triethylamine salts), inorganic acid salts (e.g. hydrochlorides, sulfates, nitrates), and salts of organic acids (e.g. acetates, oxalates, p-toluenesulfonates) This includes.

뼈, 연골, 힘줄 또는 인대 재생에 유용한 본원의 조성물의 경우, 치료 방법에는 조성물을 이식재 또는 장치로서 국소, 전신 또는 국부 투여하는 것이 포함된다. 투여할 때, 사용되는 치료 조성물은 발열원이 없고 생리적으로 허용가능한 형태이다. 또한, 조성물은 바람직하게는 캡슐화되거나, 뼈, 연골 또는 조직 손상 부위에 전달하기 위한 점액질 형태로 주사될 수 있다. 국소 투여가 상처 치유 및 조직 복구에 적합할 수 있다. 바람직하게는 뼈 및(또는) 연골 형성의 경우, 단백질 함유 조성물을 뼈 및(또는) 연골 손상 부위에 전달할 수 있고, 발생중인 뼈 및 연골을 위한 구조를 제공하며, 바람직하게는 신체에 재흡수될 수 있는 매트릭스가 상기 조성물에 포함될 것이다. 이러한 매트릭스는 기타 이식 의학 분야에 현재 사용되고 있는 물질 형태일 수 있다.For compositions herein useful for bone, cartilage, tendon or ligament regeneration, methods of treatment include topical, systemic or topical administration of the composition as an implant or device. When administered, the therapeutic compositions used are pyrogen free and physiologically acceptable forms. In addition, the compositions are preferably encapsulated or injected in the form of mucus for delivery to bone, cartilage or tissue damage sites. Topical administration may be suitable for wound healing and tissue repair. Preferably in the case of bone and / or cartilage formation, the protein-containing composition can be delivered to the bone and / or cartilage damage site, providing a structure for developing bone and cartilage, and preferably being reabsorbed by the body. Matrix that can be included will be included in the composition. Such matrices may be in the form of substances currently used in other implantable medicine fields.

매트릭스 재료의 선택은 생체상용성, 생분해성, 기계적 특성, 외양 및 계면성에 기초를 둔다. 상기 조성물의 구체적인 용도에 따라 적합한 제제화 방법이 정해질 것이다. 상기 조성물의 잠재적 매트릭스는 생분해성일 수 있으며, 화학적으로 정의된 칼슘 술페이트, 트리칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 폴리안하이드라이드일 수 있다. 기타 잠재적 재료는 생분해성이 며, 뼈 또는 피하 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 정의된 것이다. 다른 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 다른 잠재적 매트릭스는 비분해성이며, 소결된 히드록시아파타이트, 바이오글래스, 알루미네이트 또는 기타 세라믹과 같은 화학적으로 정의된 것이다. 매트릭스는 폴리락트산과 히드록시아파타이트, 또는 콜라겐과 트리칼슘 포스페이트와 같은 임의의 상기 재료의 배합물로 구성될 수 있다. 바이오세라믹은 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물 중에서 변화될 수 있으며, 공극 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생분해성의 변화를 위해 가공될 수 있다.The choice of matrix material is based on biocompatibility, biodegradability, mechanical properties, appearance and interfacial properties. Suitable formulation methods will depend upon the specific use of the composition. The latent matrix of the composition may be biodegradable and may be chemically defined calcium sulfate, tricalcium phosphate, hydroxyapatite, polylactic acid, polyglycolic acid and polyanhydride. Other potential materials are biodegradable and are biologically well defined, such as bone or subcutaneous collagen. The other matrix consists of pure protein or extracellular matrix components. Other potential matrices are non-degradable and are chemically defined, such as sintered hydroxyapatite, bioglass, aluminate or other ceramics. The matrix may consist of a combination of any of the above materials, such as polylactic acid and hydroxyapatite, or collagen and tricalcium phosphate. Bioceramic can be varied in compositions such as calcium-aluminate-phosphate and can be processed for changes in pore size, particle size, particle shape and biodegradability.

구체적인 한 실시양태는 직경이 150 내지 800㎛인 다공성 입자 형태인 락트산과 글리콜산 (50:50(몰 중량)의 공중합체이다. 어떤 분야에서는 카르복시메틸 셀룰로스 또는 자가이식 응혈과 같은 격리제를 사용하여 폴리펩티드 조성물이 매트릭스로부터 분리되는 것을 방지하는 것이 유용할 것이다.One specific embodiment is a copolymer of lactic acid and glycolic acid (50:50 (molar weight) in the form of porous particles having a diameter of 150 to 800 μm. In some applications, isolation agents such as carboxymethyl cellulose or autologous coagulation are used. It will be useful to prevent the polypeptide composition from separating from the matrix.

적합한 격리제 족은 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스를 비롯한 알킬셀룰로스(히드록시알킬셀룰로스를 포함함)와 같은 셀룰로스성 물질이며, 카르복시메틸셀룰로스(CMC)의 양이온염이 바람직하다. 다른 바람직한 격리제에는 히알루론산, 알긴산나트륨, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리옥시에틸렌 옥시드, 카르복시비닐 중합체 및 폴리(비닐 알콜)이 포함된다. 본원에 유용한 격리제의 양은 제제의 총 중량을 기준으로 0.5 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%이며, 이는 폴리펩티드(또는 그의 길항제)가 중합체 매트릭스로부터 탈착되는 것을 방지 하고 조성물을 적절히 취급하는 데 필요한 양이지만, 부모세대의 세포가 매트릭스를 침윤하지 않게 함으로써 폴리펩티드(또는 그의 길항제)가 부모세대 세포의 골형성 활성을 보조하는 기회를 제공하는 양은 아니다.Suitable sequestrant groups are cellulosic materials such as alkylcellulose (including hydroxyalkylcellulose), including methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and carboxymethylcellulose, Preferred are cation salts of carboxymethylcellulose (CMC). Other preferred sequestrants include hyaluronic acid, sodium alginate, poly (ethylene glycol), polyoxyethylene oxide, carboxyvinyl polymer and poly (vinyl alcohol). The amount of sequestrant useful herein is from 0.5 to 20% by weight, preferably from 1 to 10% by weight, based on the total weight of the formulation, which prevents the polypeptide (or antagonist thereof) from desorbing from the polymer matrix and properly handles the composition. The amount necessary to do so is not an amount that provides the opportunity for the polypeptide (or its antagonist) to assist in the osteogenic activity of the parental cell by preventing parental cells from infiltrating the matrix.

xii. 병용 치료법xii. Combination Therapy

해당 질환을 예방 또는 치료함에 있어서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제의 효과는, 활성제를 연속 투여하거나, 활성제를 동일한 조성물 중에서 또는 별개의 조성물로서 상기 목적에 효과적인 다른 약제와 병용함으로써 개선시킬 수 있다.The effects of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, agonists or antagonists in preventing or treating the disease, It can be improved by continuous administration of the active agent, or by combining the active agent with other agents effective in this purpose, either in the same composition or as separate compositions.

예를 들어, 심비대증을 치료할 경우, PRO 폴리펩티드 치료법은 공지된 심근세포 비대증 인자의 억제제, 예를 들면, 페닐에프린과 같은 α-아드레날린계 아고니스트의 억제제; 보센탄(등록상표)(BOSENTAN) 및 목소노딘(등록상표)(MOXONODIN)과 같은 엔도텔린-1 억제제; CT-1에 대한 억제제(미국 특허 제5,679,543호); LIF에 대한 억제제; ACE 억제제; 데스-아스파테이트-안지오텐신 Ⅰ 억제제(미국 특허 제5,773,415호) 및 안지오텐신 Ⅱ 억제제)의 투여와 병행할 수 있다.For example, when treating cardiac hypertrophy, PRO polypeptide therapy includes known inhibitors of cardiomyocyte hypertrophy factors such as α-adrenergic agonists such as phenylephrine; Endothelin-1 inhibitors such as bosentan® (BOSENTAN) and moxonodine® (MOXONODIN); Inhibitors to CT-1 (US Pat. No. 5,679,543); Inhibitors for LIF; ACE inhibitors; May be combined with the administration of a des-aspartate-angiotensin I inhibitor (US Pat. No. 5,773,415) and an angiotensin II inhibitor.

고혈압과 관련된 심비대증의 치료를 위해, PRO 폴리펩티드는 β-아드레날린계 수용체 차단제, 예컨대, 프로프라노롤, 티모롤, 테르타롤올, 카르테오롤, 나도롤, 베타소롤, 펜부토롤, 아세토부토롤, 아테노롤, 메토프로롤 및 카르베디롤; ACE 억제제, 예컨대, 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 또는 리시노프릴; 이뇨제, 예를 들면, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지 드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 또는 인다파미드; 및(또는) 칼슘 채널 차단제, 예컨대, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 또는 니카르디핀과 함께 투여할 수 있다. 본원에서 일반명으로 확인된 치료제를 포함하는 제약 조성물은 시판되는 것이며, 투여량, 투여, 부작용, 금기사항 등에 대한 제조자의 지시에 따라 투여될 것이다(Physicians' Desk Reference (Medical Economics Data Production Co.: Montvale, N. J., 1997), 51판 참조).For the treatment of cardiac hypertrophy associated with hypertension, PRO polypeptides are β-adrenergic receptor blockers such as propranolol, timolol, tertarolol, carteolol, nadorol, betasolol, fenbutolol, acetobutorol , Atenolol, metoprolol and carvedilol; ACE inhibitors such as quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril or ricinophril; Diuretics such as chlorothiazide, hydrochlorothiazide, hydroflumethazide, methylclothiazide, benzthiazide, dichlorphenamide, acetazolamide or indamide; And / or calcium channel blockers such as diltiazem, nifedipine, verapamil or nicardipine. Pharmaceutical compositions comprising therapeutic agents identified by the generic name herein are commercially available and will be administered according to the manufacturer's instructions for dosage, administration, side effects, contraindications, etc. (Physicians' Desk Reference (Medical Economics Data Production Co .: Montvale, NJ, 1997), 51st edition).

비대증성 심근병증의 치료에 있어서 병용 치료법에 바람직한 후보물질로는 β-아드레날린계 차단 약물(예를 들면, 프로프라노롤, 티모롤, 테르타롤올, 카르테오롤, 나도롤, 베타소롤, 펜부토롤, 아세토부토롤, 아테노롤, 메토프로롤 및 카르베디롤), 베라파밀, 디페디핀 또는 딜티아젬이 있다. 고혈압과 관련된 비대증의 치료는 칼슘 채널 차단제, 예컨대, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 또는 니카르디핀; β-아드레날린계 차단제; 이뇨제, 예컨대, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 또는 인다파미드; 및(또는) ACE 억제제, 예컨대, 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 또는 리시노프릴을 사용하는 고혈압 억제성 약물 치료법을 이용할 필요가 있다.Preferred candidates for combination therapy in the treatment of hypertrophic cardiomyopathy include β-adrenergic blockers (e.g., propranolol, timolol, terrolol, carteolol, nadorol, betasolol, fenbuto) Rolls, acetobutorol, atenolol, metoprolol and carvedilol), verapamil, dipedipine or diltiazem. Treatment of hypertrophy associated with hypertension may include calcium channel blockers such as diltiazem, nifedipine, verapamil or nicardipine; β-adrenergic blockers; Diuretics such as chlorothiazide, hydrochlorothiazide, hydroflumetazide, methylclothiazide, benzthiazide, dichlorfenamide, acetazolamide or indamide; And / or antihypertensive drug therapies using ACE inhibitors such as quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril or ricinophrill.

다른 증상의 경우, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 뼈 및(또는) 연골 결함, 상처, 또는 해당 조직의 치료에 유익한 다른 제제와 병용할 수 있다. 이러한 제제에는 EGF, PDGF, TGF-α 또는 TGF-β, IGF, FGF, 및 CTGF와 같은 다양한 증식 인자가 포함된다.For other symptoms, the PRO polypeptide or antagonist thereof may be combined with bone and / or cartilage defects, wounds, or other agents beneficial for the treatment of the tissue. Such agents include various growth factors such as EGF, PDGF, TGF-α or TGF-β, IGF, FGF, and CTGF.

또한, 암의 치료에 사용되는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 상기 기재된 바와 같은 세포 독성제, 화학요법제 또는 증식-억제제와 병용할 수 있다. 또한, 암 치료의 경우, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 연속 투여하거나, 상기 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 투여를 방사선 조사, 또는 방사성 물질의 투여를 포함하는 방사선 치료와 병행하는 것이 적합하다.In addition, PRO polypeptides or antagonists thereof used in the treatment of cancer may be used in combination with cytotoxic agents, chemotherapeutic agents or proliferation-inhibiting agents as described above. In addition, for the treatment of cancer, it is suitable to continuously administer the PRO polypeptide or its antagonist, or to combine the administration of the PRO polypeptide or its antagonist with radiation, including radiation or the administration of a radioactive substance.

PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제와 병용되는 치료제의 유효량은 내과의사 또는 수의사의 재량에 달려있을 것이다. 치료할 증상이 최대로 치료되도록 투여량을 정하고 조절한다. 예를 들면, 고혈압 치료의 경우, 유효량은 이뇨제 또는 강심제의 용도, 및 고혈압 또는 저혈압, 신장 손상 등과 같은 증상을 고려하는 것이 이상적이다. 부가적으로, 투여량은 사용될 치료제의 유형 및 치료받는 환자의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 통상, 사용되는 양은 해당 치료제가 PRO 폴리펩티드 없이 투여되는 경우와 동일한 양일 것이다.An effective amount of therapeutic agent in combination with a PRO polypeptide or antagonist thereof will be at the discretion of the physician or veterinarian. Dosages and adjustments are made to maximize the symptoms to be treated. For example, in the treatment of hypertension, an effective amount is ideally considering the use of diuretics or cardiac agents, and symptoms such as hypertension or hypotension, kidney damage and the like. In addition, the dosage will vary depending on factors such as the type of therapeutic agent to be used and the type of patient being treated. Typically, the amount used will be the same amount as when the therapeutic is administered without a PRO polypeptide.

xiii. 제품xiii. product

상기 기재된 질환의 진단 또는 치료에 유용한 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 함유하는 키트와 같은 제품은 적어도 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 이 용기에는 증상의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균 입구 (access port) (예를 들어, 이 용기는 정맥 주사용액 백(bag)이거나, 피하 주사기 바늘이 뚫을 수 있는 마개가 달린 바이알일 수 있음)가 있을 수 있다. 상기 조성물 중의 활성제는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제이다. 용기 위에 있거나 용기에 부착되어 있는 표지는 상기 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료에 사용된다는 것을 지시한다. 이 제품은 또한 인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이 제품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 쓰여 있는 패키지 삽입물을 비롯한, 상업적 관점 및 사용자의 관점에서 볼 때 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이 제품은 상기 기재된 바와 같은 다른 활성제를 함유하는 제2 또는 제3 용기를 포함할 수 있다.Containing PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, agonists or antagonists thereof useful for the diagnosis or treatment of the diseases described above. Products such as kits include at least a container and a label. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, and test tubes. The container may be formed from various materials such as glass or plastic. This container contains a composition that is effective for diagnosing or treating symptoms, and may be a sterile access port (e.g., the container may be an intravenous bag or a vial with a stopper that can be penetrated by a hypodermic syringe needle). Can be). The active agent in the composition is PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide, agonist or antagonist thereof. The label on or attached to the container indicates that the composition is used for the diagnosis or treatment of the selected condition. The product may also further comprise a second container comprising a pharmaceutically acceptable buffer such as phosphate-buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. The product may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and package inserts with instructions for use. The product may also include a second or third container containing other active agents as described above.

E. 항체E. Antibodies

본 발명에 따른 가장 유망한 약물 후보 중 일부는 본원에서 확인된 유전자 산물의 생성을 억제하고(하거나), 유전자 산물의 활성을 감소시킬 수 있는 항체 및 항체 단편이다.Some of the most promising drug candidates according to the present invention are antibodies and antibody fragments that can inhibit the production of the gene products identified herein and / or reduce the activity of the gene products.

i. 폴리클로날 항체i. Polyclonal antibodies

폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어, 면역화제 및, 필요한 경우, 면역보강제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 수회의 피하 또는 복강내 주사를 통해 포유동물에게 주사한다. 면역화제는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화될 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 들 수 있으나, 여기에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 면역보강제의 예로는 프로이드 완전 면역보강제 및 MPL-TDM 면역보강제 (모노포스포릴 지질 A 또는 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)가 있다. 면역화 방법은 불필요한 실험 없이도 당업자가 선별할 수 있다.Methods of making polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. Polyclonal antibodies can be produced in mammals, for example, by injecting one or more injections of an immunizing agent and, if necessary, an adjuvant. In general, the immunizing agent and / or adjuvant is injected into the mammal via several subcutaneous or intraperitoneal injections. Immunizing agents can include PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides or fusion proteins thereof. It may be useful to conjugate the immunizing agent to a protein known to be immunogenic in the mammal to be immunized. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine tyroglobulin and soybean trypsin inhibitor. Examples of adjuvant that can be used are Freud's complete adjuvant and MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A or synthetic trehalose dicholinomycolate). Immunization methods can be selected by those skilled in the art without unnecessary experimentation.

ii. 모노클로날 항체ii. Monoclonal antibodies

별법으로, 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 통상적으로 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 상기 림프구는 시험관내에서 면역처리될 수 있다.Alternatively, anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878 The anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibodies can be monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma methods as described in Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In hybridoma methods, mice, hamsters, or other suitable host animals are typically immunized with an immunizing agent to induce lymphocytes capable of producing or producing antibodies that specifically bind to the immunizing agent. Alternatively, the lymphocytes can be immunized in vitro.

면역화제는 일반적으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인체 기원의 세포를 원하는 경우에는 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되나, 비인간 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 융합제를 사용하여 림프구와 무한증식 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 무한증식 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인체 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 무한증식 세포의 증식 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적당한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 모세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 증식을 억제시킨다.Immunizing agents will generally comprise a PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide or a fusion protein thereof. Generally, peripheral blood lymphocytes (“PBLs”) are used when cells of human origin are desired, but spleen cells or lymph node cells are used when non-human mammal sources are desired. Subsequently, lymphocytes and endogenous cell lines are fused to form hybridoma cells using a suitable fusing agent such as polyethylene glycol (Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Infinite growth cell lines are largely transformed mammalian cells, especially myeloma cells of rodent, bovine and human origin. In general, rat or mouse myeloma cell lines are used. The hybridoma cells may preferably be cultured in a suitable culture medium containing one or more substances that inhibit the proliferation or survival of unfused, endogenous cells. For example, if the parent cell lacks hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT), the culture medium for hybridoma will typically include hypoxanthine, aminopterin and thymidine ("HAT medium"). These substances inhibit the proliferation of HGPRT-deficient cells.

바람직한 무한증식 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고발현도를 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다. 보다 바람직한 무한증식 세포주는 예를 들어, 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 뮤린 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 세포주 및 마우스-사람 헤테로골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체의 생산용으로 기재된 바 있다 (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).Preferred endogenous cell lines are those that fuse efficiently, maintain stable high expression of antibodies by selected antibody-producing cells, and are sensitive to media such as HAT medium. More preferred endogenous cell lines are, for example, murine myeloma cell lines available from the Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, CA, USA) and the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). to be. Human myeloma cell lines and mouse-human heteromyeloma cell lines have also been described for the production of human monoclonal antibodies (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).

그 다음으로, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체의 존재를 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역검정법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 검정법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석을 통해 측정한다. 이러한 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 스캐쳐드 (Scatchard) 분석 (Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980))으로 측정할 수 있다.Next, the culture medium in which the hybridoma cells are cultured is monocloned for the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides. The presence of raw antibodies can be analyzed. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or through in vitro binding assays such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Measure Such techniques and assays are known in the art. The binding affinity of monoclonal antibodies can be measured, for example, by Scatchard analysis (Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980)).

원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 방법으로 클론을 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, 상기문헌)으로 배양한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들면, 둘벨코스 수식 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지가 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양할 수 있다.After identifying the desired hybridoma cells, the clones are subcloned by the limiting dilution method and cultured by the standard method (Goding, supra). Suitable culture media for this purpose include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium or RPMI-1640 medium. Alternatively, hybridoma cells can be cultured in vivo as ascites tumors in an animal.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피와 같은 통상의 이뮤노글로불린 정제 방법으로 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제할 수 있다.Monoclonal antibodies secreted by subclones are incubated by conventional immunoglobulin purification methods such as, for example, protein A-Sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography. It can be isolated and purified from media or ascites.

또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법으로도 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법 (예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 이용하여 쉽게 단리하고 시퀀싱할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. DNA는 일단 단리되면 발현 백터에 넣을 수 있고, 이어서, 이뮤노글로불린 단백질을 별도로 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, 예를 들어, DNA는 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열을 삽입시킴으로써 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 문헌), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 수식할 수 있다. 상기 비이뮤노글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대신에 치환되거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대신에 치환되어 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.Monoclonal antibodies can also be prepared by recombinant DNA methods such as those described in US Pat. No. 4,816,567. DNA encoding the monoclonal antibodies of the invention can be easily isolated using conventional methods (e.g., using oligonucleotide probes that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the murine antibody). Can be sequenced. The hybridoma cells of the present invention serve as a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector and then transfected into a host cell, such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not separately produce immunoglobulin proteins, in a recombinant host cell. Monoclonal antibodies can be synthesized. Also, for example, DNA can be inserted into a non-immunoglobulin polypeptide by inserting a sequence encoding human heavy and light chain constant domains instead of homologous murine sequences (US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Supra). All or a portion of the coding sequence for a covalently linked immunoglobulin coding sequence. Such non-immunoglobulin polypeptides may be substituted in place of the constant domains of the antibodies of the invention or substituted in place of the variable domains of one antibody-binding site of the antibodies of the invention to generate chimeric bivalent antibodies.

항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되 어 있다. 예를 들어, 한 방법은 이뮤노글로불린 경쇄와 수식된 중쇄의 재조합 발현시킨다. 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서, 일반적으로 중쇄의 Fc 영역 중 임의의 지점에서 말단을 절단한다. 별법으로, 가교결합을 방지하기 위해서, 관련 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시키거나 결실시킨다.The antibody may be a monovalent antibody. Methods of making monovalent antibodies are known in the art. For example, one method recombinantly expresses an immunoglobulin light chain and a modified heavy chain. In order to prevent heavy chain crosslinking, the terminal is generally cut at any point in the Fc region of the heavy chain. Alternatively, to prevent crosslinking, the related cysteine residues are substituted or deleted with other amino acid residues.

또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 생성하기 위한 항체의 절단은 당업계에 통상적으로 알려진 기술을 이용하여 달성할 수 있다.In vitro methods are also suitable for the preparation of monovalent antibodies. Cleavage of antibodies to generate antibody fragments, particularly Fab fragments, can be accomplished using techniques commonly known in the art.

iii. 인간 항체 및 인간화된 항체iii. Human and Humanized Antibodies

항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 항체는 추가로 인간화된 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화된 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역 글로불린, 이뮤노글로불린쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 인간화된 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 특이성, 친화도 및 능력이 원하는 만큼 높은 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 CDR의 잔기로 바꾼 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 골격 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 바꾼다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체에서도 발견되지 않고 도입되는 CDR 또는 골격 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 이뮤노글로불린의 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 영역에 상응한다. 또한, 인간화된 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).Anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti- PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibodies may further comprise humanized antibodies or human antibodies. Humanized forms of non-human (eg, murine) antibodies include chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (eg, Fv, Fab, Fab ', F) that contain minimal sequences derived from non-human immunoglobulins. (ab ') ₂ or other antigen binding sequence of the antibody). Humanized antibodies include human immunoglobulins (replacement of residues in the complementarity determining regions (CDRs) of the recipient with residues in the CDRs of non-human species (donor antibodies) such as mice, rats or rabbits as high as specificity, affinity and ability are desired. Receptor antibody). In some cases, the Fv framework residues of human immunoglobulins are replaced by corresponding nonhuman residues. Humanized antibodies may also include residues that are not found in the recipient antibody and also not found in the imported CDR or framework sequences. In general, a humanized antibody will comprise substantially all of one or more, generally two or more variable domains, where all or substantially all CDR regions correspond to regions of non-human immunoglobulins and all or substantially all FR regions Corresponds to the region of the human immunoglobulin consensus sequence. Humanized antibodies will also comprise immunoglobulin constant regions (Fc), generally at least a portion of the constant regions of human immunoglobulins (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et. al., Nature, 332: 323-327 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 유래된 항체에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신에 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 사용함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화된 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 동족 부위로부터 유래된 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.Methods for humanizing nonhuman antibodies are well known in the art. In general, humanized antibodies include one or more amino acid residues introduced into an antibody derived from a non-human source. These nonhuman amino acid residues are often referred to as "import" residues and are typically obtained from an "import" variable domain. Humanization is essentially performed by the method of Winter et al. (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature) by using rodent CDRs or CDR sequences instead of the corresponding sequences of human antibodies. , 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)). Thus, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies (US Pat. No. 4,816,567) in which substantially fewer intact human variable domains are substituted by corresponding sequences from non-human species. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues are substituted with residues derived from the cognate sites of rodent antibodies.

인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991)). 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 마찬가지로, 형질전환 동물, 예를 들어, 마우스에 인간 이뮤노글로불린 좌위를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있는데, 여기서 내인성 이뮤노글로불린 유전자는 부분 또는 완전 불활성화된다. 항원 투여 후, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레파토리를 비롯한 모든 점에 있어서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 이 방법은 예를 들어, 문헌 (미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호) 및 과학 간행물 (Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994), Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))에 기재되어 있다.Human antibodies can also be prepared using various techniques known in the art, including phage display libraries (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991)). In addition, techniques such as Coul et al. And Boerner can also be used to prepare human monoclonal antibodies (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al. ., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991)] Similarly, human antibodies can be prepared by introducing human immunoglobulin loci into transgenic animals, eg, mice, wherein endogenous Immunoglobulin genes are partially or completely inactivated After antigen administration, human antibody production was observed, which was very similar to the antibodies observed in humans in all respects, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. See, for example, US Pat. Nos. 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, and scientific publications (Marks et al., Bio / Technology 10). 779-783 (1992); Lonberg et al. Nature 368, 856-859 (1994), Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

iv. 이중특이적 항체iv. Bispecific antibodies

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 나타내는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 이 경우, 결합 특이성 중 하나는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대한 결합 특이성이고, 다른 하나는 임의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질, 수용체 또는 수용체 서브유닛에 결합 특이성이다.Bispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized antibodies that exhibit binding specificity for at least two different antigens. In this case, one of the binding specificities is the binding specificity for the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, and the other It is binding specificity to other antigens, preferably cell surface proteins, receptors or receptor subunits.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2 쌍의 이뮤노글로불린 중쇄/경쇄의 동시발현을 기초로 하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 나타낸다 (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화 크로마토그래피 단계로 달성된다. 유사한 방법이 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌(Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991))에 기재되어 있다.Methods of making bispecific antibodies are known in the art. Typically, recombinant production of bispecific antibodies is based on the coexpression of two pairs of immunoglobulin heavy / light chains, where the two heavy chains exhibit different specificities (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 ( 1983). Due to the random classification of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a possible mixture of ten different antibody molecules, only one of which has an accurate bispecific structure. Purification of the correct molecule is generally accomplished with an affinity chromatography step. Similar methods are described in WO 93/08829 (published May 13, 1993) and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

원하는 결합 특이성을 나타내는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열과 결합시킬 수 있다. 이 결합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 결합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 상기 결합체 중 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 결합체 및, 원한다면, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체내로 공동 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌(Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210(1986))을 참조한다.Antibody variable domains (antibody-antigen binding sites) that exhibit the desired binding specificities can be combined with immunoglobulin constant domain sequences. This linkage is preferably a linkage with an immunoglobulin heavy chain constant domain comprising at least a portion of a hinge, CH2 and CH3 region. It is preferred that a first heavy chain constant region (CH1) comprising a site necessary for light chain binding is present in at least one of the conjugates. The immunoglobulin heavy chain conjugate and, if desired, the DNA encoding the immunoglobulin light chain are inserted into separate expression vectors and cotransfected into the appropriate host organism. For more details on producing bispecific antibodies, see, eg, Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210 (1986).

v. 이종 접합 항체v. Heterozygous antibody

이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용함으로써, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 있다.Heteroconjugate antibodies consist of two covalently bound antibodies. Such antibodies can be used, for example, to target immune system cells to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980), and for the treatment of HIV infection (WO 91/00360, US 92/200373, and EP agents). 03089). It is contemplated that heterozygous antibodies can be prepared in vitro using methods known in synthetic protein chemistry, including methods using crosslinkers. For example, immunotoxins can be prepared by using disulfide exchange reactions or by forming thioether bonds. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolates and methyl-4-mercaptobutyrimidadate and reagents disclosed in US Pat. No. 4,676,980.

vi. 이펙터 기능 조작vi. Effector function operation

예를 들어, 암치료에 있어서 항체의 효과를 증대하기 위해, 본 발명의 항체의 이펙터 기능을 수식하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 내부화 능력이 향상되고(되거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)이 증대될 수 있다(문헌 (Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992))을 참조한다). 또한, 문헌 (Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))에 기재된 헤테로이중관능성 가교제를 사용하여 상승된 항-종양 활성을 나타내는 동종이량체 항체를 제조할 수도 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 포함하는 항체를 조작하여 항체의 보체 용해성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989) 참조).For example, it may be desirable to modify the effector function of the antibodies of the invention in order to enhance the effect of the antibody in treating cancer. For example, cysteine residues can be introduced into the Fc region to form interchain disulfide bonds in this region. Homodimeric antibodies thus produced may have enhanced internalization capacity and / or enhanced complement-mediated cell death and antibody-dependent intracellular cytotoxicity (ADCC) (Caron et al., J. Exp Med). , 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). It is also possible to prepare homodimeric antibodies that exhibit elevated anti-tumor activity using the heterobifunctional crosslinking agent described in Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, an antibody comprising a double Fc region can be engineered to enhance the complement solubility and ADCC ability of the antibody (see Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).

vii. 면역결합체vii. Immunoconjugate

또한, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제, 독소(예를 들어, 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소(즉, 방사성결합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역결합체에 관한 것이다. The invention also relates to cytotoxic agents such as chemotherapeutic agents, toxins (eg, enzymatically active bacteria, fungi, plant or animal toxins, or fragments thereof) or radioactive isotopes (ie, radioactive) To an immunoconjugate comprising an antibody bound to the conjugate).

상기 면역결합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴 멜론(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사결합체 항체의 제조에 사용할 수 있다. 예에는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re가 포함된다.Chemotherapeutic agents useful for the production of such immunoconjugates are described above. Enzymatically active toxins and fragments thereof that may be used include diphtheria A chain, unbound active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (derived from Pseudomonas aeruginosa ), lysine A chain, abrin A chain, modeline A chain, alpha- sarsine , Aleurites fordii protein, diantine protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII and PAP-S), bitter melon ( momordica charantia ) inhibitor, cousin Leucine, crotin , sapaonaria officinalis inhibitors, gelonin , mitogelin, restrictin, phenomycin, enomycin, and trichotheneses. Several radionuclides can be used for the preparation of radioconjugate antibodies. Examples include ²¹² Bi, ¹³¹ I, ¹³¹ In, ⁹⁰ Y and ¹⁸⁶ Re.

다양한 이중관능성 단백질-커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이중관능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 결합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드와 항체를 결합시키는 예시적 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조).Various bifunctional protein-coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), bifunctional derivatives of imidoesters (eg For example, dimethyl adipimidate HCl), active esters (e.g. disuccinimidyl suverate), aldehydes (e.g. glutaraldehyde), bis-azido compounds (e.g. bis (p) -Azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium derivatives (for example bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (for example tolyene 2,6-diisocyanate), And bis-active fluorine compounds (eg, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) can be used to make conjugates of antibodies and cytotoxic agents. For example, lysine immunotoxins can be prepared as described in Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent that binds radionucleotides with antibodies (see WO 94/11026). ).

또다른 실시태양에서, 항체는 종양 예비표적화에 사용되는 "수용체"(예를 들어, 스트렙타비딘)에 결합시킬 수 있는데, 여기서 항체-수용체 결합체를 환자에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환으로부터 결합하지 않은 결합체를 제거한 후, 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 결합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.In another embodiment, the antibody may bind to a "receptor" (eg, streptavidin) used for tumor pretargeting, wherein the antibody-receptor conjugate is administered to the patient and then circulated using a chelating agent. After removal of the unbound binder from the drug, the "ligand" (eg, avidin) bound to the cytotoxic agent (eg, radionucleotide) is administered.

viii. 이뮤노리포좀viii. Immunoliposomes

본원에서 개시된 항체는 이뮤노리포좀으로서 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌 (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허 제5,013,556호)에 개시되어 있다.The antibodies disclosed herein may also be formulated as immunoliposomes. Liposomes comprising this antibody can be prepared using methods known in the art, for example, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); and US Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545). Liposomes with increased circulation time are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG로부터 유도된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법으로 생성시킬 수 있다. 일정한 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 압출시켜 직경이 원하는 크기인 리포좀을 수득한다. 문헌 (Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 결합시킬 수 있다. 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신(Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다 (Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989) 참조).Particularly useful liposomes can be produced by reverse phase evaporation using lipid compositions containing phosphatidylcholine, cholesterol, and phosphatidylethanolamine (PEG-PE) derived from PEG. Liposomes are extruded through filters of constant pore size to yield liposomes of desired size in diameter. Fab 'fragments of the antibodies of the invention can be bound to liposomes via disulfide-interchange reactions as described in Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982). . Chemotherapeutic agents (eg, Doxorubicin) are optionally included in liposomes (see Gabriel et al., J. National Cancer Inst., 81 (19): 1484 (1989)).

ix. 항체의 제약 조성물ix. Pharmaceutical Compositions of Antibodies

상기 및 하기의 다양한 질환을 치료하기 위해, 본원에서 확인된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 기재된 스크리닝 검정법에 의해 확인된 기타 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.Specific to the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides identified herein for treating the above and below various diseases And other molecules identified by the screening assay described above can be administered in the form of a pharmaceutical composition.

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 가 세포내 폴리펩티드이고 항체 전체가 억제제로 사용되는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌 (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)) 참조).Internalized antibodies are preferred when the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are intracellular polypeptides and the whole antibody is used as an inhibitor. Do. However, lipofection or liposomes may also be used to deliver the antibody or antibody fragment intracellularly. If antibody fragments are used, the smallest inhibitory fragment that specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. For example, based on the variable-region sequences of antibodies, peptide molecules can be designed that have the ability to bind target protein sequences. Such peptides can be chemically synthesized and / or prepared using recombinant DNA techniques (see, eg, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993). ) Reference).

또한, 본원의 제제는 치료할 특정 증상에 따라 필요한 경우 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 그의 기능을 증대시키는 물질, 예를 들어, 세포독성제, 시토킨, 화학요법제, 또는 증식-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.In addition, the formulations herein may comprise one or more active compounds, preferably compounds with complementary activities that do not adversely affect each other, as necessary depending on the particular condition to be treated. Alternatively, or in addition, the composition may comprise a substance that enhances its function, such as a cytotoxic agent, cytokine, chemotherapeutic agent, or proliferation-inhibiting agent. Such molecules are suitably formulated in amounts that are effective for the purpose intended.

활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합 기술을 통해 제조된 것, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 형태의 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)에 개시되어 있다.The active ingredient is prepared, for example, through coacervation or interfacial polymerization techniques, for example a colloidal drug delivery system (eg liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nano Capsules) or hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules in the form of macroemulsions and poly- (methylmethacrylate) microcapsules. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막 을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.The formulations to be used for in vivo administration must be sterile. This is readily accomplished by filtration through sterile filtration membranes.

서방성 제제도 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 있는데, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, LUPRON DEPOT(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시킬 수 있지만, 일부 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 상기 항체는 37 ℃에서 습기에 노출시, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 상실하고 그의 면역원성이 변화될 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 수식, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발을 통해 안정화를 달성할 수 있다.Sustained release formulations may also be prepared. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are in the form of shaped articles, eg, films, or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactide (US Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid And a copolymer of γ ethyl-L-glutamate, a non-degradable ethylene-vinyl acetate, a degradable lactic acid-glycolic acid copolymer, for example LUPRON DEPOT® (lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate Injectable microspheres), and poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid. Polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid can release molecules for more than 100 days, but some hydrogels release proteins for shorter periods of time. If the encapsulated antibody remains in the body for a long time, the antibody may denature or aggregate upon exposure to moisture at 37 ° C. to lose biological activity and change its immunogenicity. For stabilization, rational strategies can be designed according to the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is found to be intermolecular SS bond formation through thio-disulfide interchange, modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, control of moisture content, use of appropriate additives and specific polymer matrices Stabilization can be achieved through the development of the composition.

x. 항체를 사용한 치료 방법x. Treatment Methods with Antibodies

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대한 항체는 상기 언급한 바와 같은 다양한 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다고 생각된다.Antibodies to the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides can be used for various cardiovascular diseases, endothelial cell diseases and blood vessels as mentioned above. It is believed that it can be used to treat neoplastic diseases.

상기 항체는 볼루스로서의 정맥내 투여, 또는 장기간의 연속 관주, 예컨대, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로와 같은 공지된 방법으로 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.The antibody may be administered intravenously as a bolus, or known methods such as prolonged continuous irrigation, such as intramuscular, intraperitoneal, intramedullary, subcutaneous, intraarticular, synovial, intramedullary, oral, topical or inhalation routes. To mammals, preferably humans. Intravenous administration of the antibody is preferred.

다른 치료법이 본 발명의 상기 항체 투여와 병행될 수 있다. 예를 들어, 항체가 암을 치료하는 경우, 상기 항체로 치료받는 환자는 방사선 치료를 병행하여 받을 수도 있다. 별법으로, 또는 추가로, 화학요법제를 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지시에 따라, 또는 당업계 전문 숙련인에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 문헌 (Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992)에 기재되어 있다. 화학요법제는 항체의 투여 전 또는 후에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 타목시펜 또는 에비스타(등록상표)(EVISTA)와 같은 항-에스트로겐 화합물, 또는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물(EP 제616812호 참조)을 공지된 투여량으로 항체와 함께 투여할 수 있다.Other therapies may be combined with the administration of the antibodies of the invention. For example, when the antibody treats cancer, the patient treated with the antibody may receive radiation therapy in parallel. Alternatively, or in addition, the chemotherapeutic agent may be administered to the patient. Preparation and dosing schedules for such chemotherapeutic agents can be empirically determined according to the manufacturer's instructions or by one of ordinary skill in the art. In addition, the schedule for the preparation and administration of such chemotherapeutic agents is described in Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992. Chemotherapeutic agents may be administered before or after administration of the antibody, or may be administered simultaneously. Anti-estrogen compounds, such as tamoxifen or Evista® (EVISTA), or anti-progesterone compounds, such as onapristone (see EP 616812), may be administered with the antibody in known dosages.

또한, 항체가 암의 치료에 사용되는 경우, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 VEGF 수용체 중 하나 이상과 결합하는 항체와 같은 기타 종양 관련 항원에 대한 항체를 투여하는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 이들은 상기 기재된 약제를 포함한 다. 또한, 항체는 연속 투여되거나, 방사선 조사 또는 방사활성 물질의 투여와 같은 방사의학 치료와 병행하여 투여되는 것이 적합하다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 항원과 동일한 항원, 또는 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에 동시 투여할 수 있다. 종종, 환자에 1종 이상의 사이토카인을 환자에게 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원의 항체를 증식 억제제와 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 우선 증식 억제제를 투여한 후 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 본 발명의 항체의 우선 투여도 고려할 수 있다. 증식 억제제의 적당한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 증식 억제제와 본원 항체의 복합 작용(상승작용)으로 인하여 투여량이 저하될 수 있다.It may also be desirable to administer antibodies to other tumor associated antigens, such as antibodies that bind to one or more of ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, or VEGF receptors when the antibody is used in the treatment of cancer. In addition, these include the agents described above. In addition, the antibody is suitably administered continuously or in combination with radiomedical therapies such as radiation or administration of radioactive substances. Alternatively, or in addition, two or more antibodies that bind the same antigen as the antigens disclosed herein, or two or more different antigens, may be administered to the patient simultaneously. Often, it may also be beneficial to administer to the patient one or more cytokines. In a preferred embodiment, the antibodies herein can be administered simultaneously with the proliferation inhibitor. For example, administration of a proliferation inhibitor may be followed by administration of an antibody of the invention. However, simultaneous administration or preferential administration of the antibodies of the invention can also be considered. Appropriate dosages of the proliferation inhibitor are those currently used, and the dosage may be lowered due to the combined action (synergy) of the proliferation inhibitor and the antibody herein.

한 실시양태에서, 종양의 혈관 신생은 병용 치료시 공격받는다. 항-PRO 폴리펩티드 항체 및 기타 항체(예를 들면, 항-VEGF)는 종양의 괴사 또는 그의 전이 병소를 관찰하여 결정된 치료 유효량으로 종양을 앓고 있는 환자에게 투여한다. 이 치료법은 유익한 효과가 더 이상 관찰되지 않거나 임상 검사가 종양 또는 임의의 전이 병소의 흔적을 나타내지 않을 때까지 지속한다. 이어서, TNF를 단독으로, 또는 알파-, 베타- 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린(heregulin), 항-헤레굴린 항체, D-인자, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 또는 종양에서 미세혈관 응고를 촉진하는 물질(예를 들면, 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체 또는 C4b 결합 단백질; 1991년 2월 21일에 공개된 WO 제91/01753호 참조)과 같은 보조제와 함께 투여하거나, 열 또는 방사 선 치료와 병행하여 투여한다.In one embodiment, angiogenesis of the tumor is attacked in combination treatment. Anti-PRO polypeptide antibodies and other antibodies (eg, anti-VEGF) are administered to a patient suffering from the tumor in a therapeutically effective amount determined by observing the necrosis of the tumor or its metastatic lesion. This therapy lasts until no beneficial effect is observed anymore or clinical examination shows no signs of tumor or any metastatic lesion. TNF alone, or alpha-, beta- or gamma-interferon, anti-HER2 antibody, heregulin, anti-herregulin antibody, D-factor, interleukin-1 (IL-1), interleukin- 2 (IL-2), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), or a substance that promotes microvascular coagulation in a tumor (eg, anti-protein C antibody, anti-protein S antibody, or C4b binding protein (See WO 91/01753 published February 21, 1991) or in combination with heat or radiation therapy.

상기 보조제는 그 효과가 다양하기 때문에, 종래의 방법으로 매트릭스 스크리닝을 통해 종양에 대한 보조제의 효과를 비교하는 것이 바람직하다. 항-PRO 폴리펩티드 항체 및 TNF의 투여는 원하는 임상 효과가 성취될 때까지 반복한다. 별법으로, 항-PRO 폴리펩티드 항체는 TNF 및 임의로 보조제와 함께 투여된다. 고형 종양이 사지, 또는 대순환으로부터 분리되기 쉬운 다른 위치에서 발견되는 경우, 본원의 치료제를 분리된 종양 또는 기관에 투여한다. 다른 실시양태에서, 항-FGF 또는 항-PDGF 중화 항체와 같은 FGF 또는 PDGF 길항제를 항-PRO 폴리펩티드 항체와 함께 환자에게 투여한다. 바람직하게는, 항-PRO 폴리펩티드 항체를 사용한 치료는 상처 치유 또는 원하는 혈관형성 기간 동안 중지할 수 있다.Since the effects of the adjuvant vary, it is desirable to compare the effect of the adjuvant on the tumor through matrix screening by conventional methods. Administration of the anti-PRO polypeptide antibody and TNF is repeated until the desired clinical effect is achieved. Alternatively, the anti-PRO polypeptide antibody is administered with TNF and optionally adjuvant. If solid tumors are found in the limbs or other locations that are likely to separate from the large circulation, the therapeutic agents herein are administered to isolated tumors or organs. In other embodiments, an FGF or PDGF antagonist, such as an anti-FGF or anti-PDGF neutralizing antibody, is administered to the patient along with an anti-PRO polypeptide antibody. Preferably, treatment with an anti-PRO polypeptide antibody can be stopped during wound healing or the desired angiogenesis period.

심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 예방 또는 치료에 있어서, 본원 항체의 적당한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료할 질환의 유형, 질환의 심각성 및 진행 과정, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 이 항체는 한번 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 투여하는 것이 바람직하다.In the prevention or treatment of cardiovascular disease, endothelial cell disease and angiogenic disease, the appropriate dosage of the antibody of the present application is defined as the type of disease to be treated, the severity and progression of the disease, whether the antibody is administered for prophylactic or therapeutic purposes as defined above. Administration will depend on prior treatment, the patient's clinical history and response to the antibody, and the judgment of the attending physician. The antibody is preferably administered to the patient via one or a series of treatments.

예를 들어, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 약 1㎍/kg 내지 15mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 20mg/kg)의 항체가 1회 이상의 개별 투여 또는 연속 관주를 통해 환자에게 투여될 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량 또는 주간 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 또는 그 이상이다. 증상에 따 라 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 질환의 증상을 원하는만큼 억제할 때까지 반복 또는 지속한다. 그러나, 다른 투여량이 효과적일 수도 있다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 검정법(예를 들면, 방사성 종양 영상화)으로 쉽게 관찰할 수 있다.For example, depending on the type and severity of the disease, about 1 μg / kg to 15 mg / kg (eg 0.1 to 20 mg / kg) of antibody may be initially administered to the patient via one or more individual or continuous irrigation. Candidate dose. Typical daily or weekly dosages range from about 1 μg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the factors mentioned above. Depending on the symptom, for repeated administration over several days, treatment is repeated or continued until the symptoms of the disease are suppressed as desired. However, other dosages may be effective. The progress of this therapy can be easily observed by conventional techniques and assays (e.g., radiological tumor imaging).

xi. 항체를 포함하는 제품xi. Products Containing Antibodies

항체 및 표지을 포함하는 용기가 있는 제품도 제공된다. 이러한 제품은 상기 기재된 바와 같으며, 그 활성 성분은 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 항체이다.Also provided is a product with a container containing the antibody and label. Such products are as described above, the active ingredients of which are anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti -PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibody.

xii. 항체를 사용한 종양의 진단 및 예후xii. Diagnosis and Prognosis of Tumors Using Antibodies

특정 종양에서 과다 발현되는 증식 수용체와 같은 세포-표면 단백질은 약물 후보 또는 종양(예를 들어, 암) 치료에 대한 훌륭한 표적이지만, 항체가 사용되는 증상이 암인 경우, 상기 항체는 PRO 폴리펩티드와 함께 종양의 진단 및 예후에도 사용할 수 있다. 예를 들면, PRO 폴리펩티드에 대해 유도된 항체는 종양의 진단제 또는 예후제로 사용할 수 있다.Cell-surface proteins, such as proliferative receptors that are overexpressed in certain tumors, are excellent targets for the treatment of drug candidates or tumors (eg cancer), but if the condition in which the antibody is used is cancer, then the antibody is accompanied by a tumor with the PRO polypeptide. It can also be used for diagnosis and prognosis. For example, antibodies directed against PRO polypeptides can be used as diagnostic or prognostic agents of tumors.

예를 들어, 항체 단편을 비롯한 항체는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자의 발현을 정성적으로, 또는 정량적으로 검출하는 데 사용할 수 있다. 항체는 예를 들어, 형광 표지와 같은 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것이 바람직하며, 항체의 결합은 광학현미경법, 세포유량측정법 (flow cytometry), 플루오리메트리 또는 당업계에 공지된 다른 기술로 관찰할 수 있다. 이러한 결합 검정 법은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행한다.For example, antibodies, including antibody fragments, can be used to qualitatively or quantitatively detect the expression of a gene comprising a gene encoding a PRO polypeptide. The antibody is preferably attached with a detectable label, such as, for example, a fluorescent label, and the binding of the antibody is accomplished by optical microscopy, flow cytometry, fluorometry or other techniques known in the art. Can be observed. This binding assay is performed essentially as described above.

마커 유전자 산물에 대한 항체 결합의 제자리 (in situ) 검출은, 예를 들어, 면역형광현미경 또는 면역전자현미경을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 조직학적 시료를 환자로부터 분리하고, 바람직하게는 상기 생물학적 샘플에 항체를 올려놓음으로써 표지된 항체를 상기 시료와 반응시킨다. 또한, 이 방법은 조사된 조직내 마커 유전자 산물의 분포를 알 수 있게 해준다. 다양한 조직학적 방법을 제자리 검출에 쉽게 이용할 수 있음이 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다.In situ detection of antibody binding to the marker gene product can be performed using, for example, immunofluorescence microscopy or immunoelectron microscopy. For this purpose, the histological sample is separated from the patient and the labeled antibody is reacted with the sample, preferably by placing the antibody on the biological sample. The method also allows for the distribution of marker gene products in the tissues examined. It will be apparent to those skilled in the art that various histological methods are readily available for in situ detection.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.The following examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌의 개시 내용은 본원에 포함되는 것으로 한다.The disclosures of all patents and documents cited herein are intended to be incorporated herein.

실시예Example

실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, Manassas, VA)이다. 달리 언급되지 않는 한, 본 발명은 상기 기재된 문헌 및 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis(IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991)에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 이용하였다.Commercial reagents mentioned in the examples were used according to the manufacturer's instructions unless otherwise indicated. The source of cells identified by the ATCC accession number throughout the following examples and specification is the American Type Culture Collection (Manassas, VA). Unless stated otherwise, the present invention is described in the literature and literature described above (Sambrook et al., Supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989); Innis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc .: NY, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis ( IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991) used standard methods of recombinant DNA technology.

실시예 1: 신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 cDNA를 확인하기 위한 세포외 도메인 상동성 스크리닝 Example 1 Extracellular Domain Homology Screening to Identify Novel Polypeptides and cDNAs Encoding It

스위스-프롯(Swiss-Prot) 공개 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 신호 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. EST 데이타베이스는 공개 데이타베이스 (예를 들면, 진뱅크(GenBank))와 비공개 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ™ (인사이트 파마슈티칼스(Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 검색은 EST 서열의 6개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "프랩(phrap)" (Phil Green, University of Washington, 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다.The EST database was searched using the extracellular domain (ECD) sequences (including secretion signal sequences, if present) from about 950 known secreted proteins from the Swiss-Prot published database. The EST database includes public databases (e.g., GenBank) and private databases (e.g., LIFESEQ ™ (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.). As a comparison of the ECD protein sequences to the six frame translations of the EST sequences, the computer program WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) was used. Comparators with Blast scores of at least 70 (or in some cases 90) that do not encode are clustered and consensus DNA sequences using the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA). Assembled.

이러한 세포외 도메인 상동성 스크린을 이용하여, 컨센서스 DNA 서열을 프랩을 사용하여 확인된 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 또한, 수득한 컨센서스 DNA 서열을 종종 (항상은 아니지만) 가능한 한 상기 논의한 EST 서열원을 사용 하여 컨센서스 서열을 가능한 길게 신장시키기 위해 BLAST 또는 BLAST-2와 프랩의 반복 사이클을 이용하였다.Using this extracellular domain homology screen, consensus DNA sequences were assembled against other EST sequences identified using the flaps. In addition, repeated cycles of BLAST or BLAST-2 and flaps were used to stretch the consensus DNA sequence obtained as often as possible (but not always) using the EST sequence members discussed above as far as possible.

이어서, 상기한 바와 같이 수득한 컨센서스 서열을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, PCR로 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하기 위해 사용하고 PRO 폴리펩티드에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하기 위해 고안된다. 프로브 서열은 대개 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우, 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 사용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.Subsequently, oligonucleotides were synthesized based on the consensus sequences obtained as described above, and used to identify cDNA libraries containing the sequences of interest by PCR and to isolate clones of the full-length coding sequence for the PRO polypeptide. Used as. Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to provide PCR products of about 100 to 1000 bp in length. Probe sequences are usually 40 to 55 bp in length. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1 to 1.5 kbp. To screen several libraries for full length clones, DNAs from these libraries were screened by PCR amplification using PCR primer pairs according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Then, clones encoding the gene of interest were isolated using one of the probe oligonucleotide and primer pairs by using a positive library.

cDNA 클론을 단리시키기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, SalI 헤미키나제화된 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991))을 참조한다)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.The cDNA library used to isolate the cDNA clones was constructed by standard methods using commercially available reagents such as reagents from Invitrogen (San Diego, CA). The cDNA was primed with oligo dT with a NotI site, ligated to the SalI hemikinase-adapted adapter, cleaved with NotI, sorted to the appropriate size by gel electrophoresis, and appropriate cloning vector (eg, pRKB). Or pRKD; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not include a SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991), and cloned in a predetermined direction to the only XhoI and NotI sites in .

실시예 2: 아밀라제 스크리닝을 이용한 cDNA 클론의 단리Example 2: Isolation of cDNA Clones Using Amylase Screening

1. 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제작 1. Construction of oligo dT primed cDNA libraries

인비트로젠 (캘리포니아주, 샌디에고)사의 시약 및 프로토콜 (Fast Track 2)을 사용하여 인간 조직으로부터 mRNA를 단리하였다. 미국 메릴랜드주 게터스버그 소재의 라이프테크놀로지사 (Life Technologies)의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System)을 이용하여, 상기 RNA를 사용하여 벡터 pRK5D에 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중 가닥 cDNA의 크기를 1000 bp보다 크도록 선택하고, SalI/NotI 링커 부착 cDNA를 XhoI/NotI 절단 벡터에 클로닝하였다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 효소 부위, XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위를 순서대로 포함하는 클로닝 벡터이다.MRNA was isolated from human tissue using Invitrogen (San Diego, Calif.) Reagents and protocols (Fast Track 2). The RNA was used to generate oligo dT primed cDNA libraries on vector pRK5D using reagents and protocols from Life Technologies, Gettersburg, Maryland, (Super Script Plasmid System). In this process, the size of the double stranded cDNA was chosen to be greater than 1000 bp and the SalI / NotI linker attached cDNA was cloned into the XhoI / NotI cleavage vector. pRK5D is a cloning vector comprising a sp6 transcription initiation site, a SfiI restriction enzyme site, and a XhoI / NotI cDNA cloning site in that order.

2. 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제작 2. Construction of Random Primed cDNA Libraries

1차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 제공하기 위해 2차 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 1차 라이브러리 (상기한 바와 같음)로부터 Sp6 RNA를 생성시키고, 라이프 테크놀로지(Life Technologies)사의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System, 상기한 바와 같음)을 사용하여 상기 RNA로 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중가닥 cDNA를 500 내지 1000 bp의 크기로 만들고, NotI 어댑터에 평활한 상태로 연결시키고, SfiI로 절단하여 SfiI/NotI 절단 벡터에 클로닝하였다. pSST-AMY.0은 cDNA 클로닝 부위 및 마우스 아밀라제 서열 (성숙 서열, 분비 신호 없음) 앞에 효모 알콜 데히드로게나제 프로모터를 갖고 클로닝 부위 뒤에 효모 알콜 데히드로게나제 터미네이터를 갖는 클로닝 벡터이다. 따라서, 프레임내에 아밀라제 서열과 결합된, 상기 벡터내에 클로닝된 cDNA는 적절하게 형질감염된 효모 콜로니로부터 아밀라제를 분비시킬 수 있다.Secondary cDNA libraries were generated to preferentially provide the 5 'end of the primary cDNA clone. Generate Sp6 RNA from the primary library (as described above) and generate a randomly primed cDNA library with the RNA using Life Technologies' reagent and protocol (Super Script Plasmid System, as described above) I was. In this process, the double stranded cDNA was sized from 500 to 1000 bp, smoothed to the NotI adapter, cleaved with SfiI and cloned into the SfiI / NotI cleavage vector. pSST-AMY.0 is a cloning vector with a yeast alcohol dehydrogenase promoter in front of the cDNA cloning site and mouse amylase sequence (mature sequence, no secretion signal) and a yeast alcohol dehydrogenase terminator after the cloning site. Thus, cDNA cloned into the vector, bound to the amylase sequence in a frame, can secrete amylase from appropriately transfected yeast colonies.

3. 형질전환 및 검출 3. Transformation and detection

상기 단락 2에 기재된 라이브러리로부터의 DNA를 얼음 위에서 냉각시켜 전기수용성 (electorcompetent) DH10B 세균 (Life Technologies) 20 ml을 첨가하였다. 이어서, 세균 및 벡터 혼합물을 이어서 제조자의 지시에 따라 일렉트로포레이션시켰다. 이어서, SOC 배지 (Life Technologies) 1 ml을 첨가하고 혼합물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 형질전환체를 암피실린 함유 표준 150 mm LB 플레이트 20개에 플레이팅하고 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 양성 콜로니를 플레이트로부터 분리하여 표준 프로토콜, 예를 들어, CsCl-농도구배법을 이용하여 DNA를 세균 펠렛으로부터 단리하였다. 정제된 DNA를 사용하여 다음과 같은 효모 프로토콜을 수행하였다.DNA from the library described in paragraph 2 above was cooled on ice and 20 ml of electrocompetent DH10B bacteria (Life Technologies) was added. The bacterial and vector mixture was then electroporated according to the manufacturer's instructions. Then 1 ml of SOC medium (Life Technologies) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The transformants were then plated into 20 ampicillin containing standard 150 mm LB plates and incubated at 37 ° C. for 16 hours. Positive colonies were separated from the plates and DNA was isolated from bacterial pellets using standard protocols, such as CsCl-concentration. Purified DNA was used to carry out the following yeast protocol.

효모 방법은 다음 세개의 카테고리로 분류된다: 1) 플라스미드/cDNA 조합 벡터를 사용한 효모의 형질전환, 2) 아밀라제를 분비하는 효모 클론의 검출 및 단리 및 3) 효모 콜로니로부터 삽입체의 직접 PCR 증폭, 서열분석 및 추가의 분석을 위한 DNA의 정제.Yeast methods fall into three categories: 1) transformation of yeast using plasmid / cDNA combination vectors, 2) detection and isolation of yeast clones secreting amylases, and 3) direct PCR amplification of inserts from yeast colonies, Purification of DNA for Sequencing and Further Analysis.

사용된 효모는 HD56-5A (ATCC-90785)이었다. 이 균주는 MAT 알파, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL⁺, SUC⁺, GAL⁺의 유전자형을 나타낸다. 바람직하게는, 번역 후 경로가 없는 효모 변이체를 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 sec71, sec72, sec62, 바람직하게는 말단이 잘린 sec71에서 전좌(translocation)로 인한 결핍 대립유전자를 가질 수 있다. 별법으로, 상기 유전자의 정상적인 작동을 방해하거나, 상기 번역 후 경로에 관련된 다른 단백질 (예를 들어, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p 또는 SSA1p-4p) 또는 이들 단백질의 결합체 형성을 방해하는 길항제 (안티센스 뉴클레오티드 및(또는) 리간드 포함)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.The yeast used was HD56-5A (ATCC-90785). This strain shows genotypes of MAT alpha, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL ⁺ , SUC ⁺ , GAL ⁺ . Preferably, yeast variants without post-translational pathways can be used. Such variants may have deficiency alleles due to translocation at sec71, sec72, sec62, preferably at truncated sec71. Alternatively, an antagonist that interferes with the normal functioning of the gene or interferes with the formation of another protein involved in the post-translational pathway (e.g., SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p or SSA1p-4p) or a conjugate of these proteins ( Antisense nucleotides and / or ligands).

형질전환은 문헌 (Gietz et al., Nucl. Acid. Res., 20:1425 (1992))에 개시된 프로토콜을 기초로 하여 수행하였다. 이어서, 형질전환된 세포를 아가로부터 YEPD 복합 배지 브로쓰 100 ml에 접종하고 30℃에서 밤새 배양하였다. YEPD 브로쓰를 문헌 [Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 밤새 배양한 배양액을 신선한 YEPD 브로쓰 500 ml로 약 2 x 10⁶ 세포/ml (약 OD₆₀₀ = 0.1)까지 희석하여 약 1 x 10⁷ 세포/ml (약 OD₆₀₀ = 0.4 - 0.5)로 재배양하였다.Transformation was performed based on the protocol disclosed in Gitz et al., Nucl.Acid.Res., 20: 1425 (1992). Transformed cells were then inoculated from agar into 100 ml of YEPD complex medium broth and incubated overnight at 30 ° C. YEPD broths are described in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). Overnight cultures are diluted to about 2 x 10 ⁶ cells / ml (about OD ₆₀₀ = 0.1) with 500 ml of fresh YEPD broth and rearranged to about 1 x 10 ⁷ cells / ml (about OD ₆₀₀ = 0.4-0.5) It was.

세포를 회수한 다음, 형질전환을 준비하였는데, 소르발 (Sorval) GS3 로터의 GS3 로터 바틀로 옮겨서 5,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고, 50 ml 팔콘 튜브에서 멸균수로 재현탁시켜 벡크만 (Beckman) GS-6KR 원심분리기에 서 3,500 rpm으로다시 원심분리하여였다. 상등액을 버리고, 세포를 LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5, 100 mM Li₂OOCCH₃)로 세척하여 LiAc/TE (2.5 ml)에 재현탁시켰다.Cells were recovered and then transformed and prepared for transfer to a GS3 rotor bottle of Sorval GS3 rotor, centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes, discarded the supernatant, and resuspended in sterile water in a 50 ml Falcon tube. It was again centrifuged at 3,500 rpm in a Beckman GS-6KR centrifuge. The supernatant was discarded and cells were resuspended in LiAc / TE (2.5 ml) by washing with LiAc / TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5, 100 mM Li ₂ OOCCH ₃ ).

마이크로 원심분리 튜브에서, 준비한 세포 100 ㎕를 신선한 변성 단일 가닥 연어 고환 DNA (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재 Lofstrand Lab)와 형질전환 DNA 1 ㎍ (부피 < 10 ㎕)를 혼합하여 형질전환을 수행하였다. 혼합물을 볼텍싱으로 잠깐 혼합한 후, 40% PEG/TE 600 ㎕ (40% 폴리에틸렌 글리콜-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li₂OOCCH₃, pH 7.5)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 부드럽게 혼합하고 30분 동안 교반하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 42℃에서 15분 동안 열 쇼크를 세포에 가하고, 반응 용기를 12,000 rpm, 마이크로원심분리기에서 5 내지 10초 동안 원심분리하여 상등액을 버리고 TE 500 ㎕ (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5)에 재현탁시킨 후 재원심분리하였다. 세포를 TE 1 ml로 희석하고 분취액 200 ㎕를 150 mm 증식 플레이트 (VWR)에 미리 제조된 선별 배지 상에 도말하였다.In a microcentrifuge tube, 100 μl of the prepared cells were transformed by mixing freshly denatured single stranded salmon testis DNA (Lofstrand Lab, Gaithersburg, Md.) With 1 μg of transformed DNA (vol <10 μl). After the mixture was briefly mixed by vortexing, 600 μl of 40% PEG / TE (40% polyethylene glycol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li ₂ OOCCH ₃ , pH 7.5) was added. The mixture was gently mixed and incubated at 30 ° C. with stirring for 30 minutes. Heat shock was then added to the cells at 42 ° C. for 15 minutes, the reaction vessel was centrifuged at 12,000 rpm for 5-10 seconds in a microcentrifuge to discard the supernatant and 500 μl of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7). Resuspended in .5) and recentrifuged. Cells were diluted with 1 ml of TE and 200 μl aliquots were plated onto preselected medium in 150 mm growth plates (VWR).

별법으로, 수회에 걸친 소규모 반응 대신에 시약량을 증가시키면서 1회의 대규모 반응을 이용하여 형질전환을 수행하였다.Alternatively, transformation was carried out using one large scale reaction with increasing reagent volume instead of several small scale reactions.

사용된 선별 배지는 문헌 (Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994))에 기재된 바와 같이 제조된, 우라실이 없는 합성 완전 덱스트로스 아가 (SCD-Ura)이었다. 형질전 환체를 30℃에서 2 내지 3일 동안 배양하였다.The selection medium used was a synthetic full deck without uracil, prepared as described by Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). Stross agar (SCD-Ura). Transgenic bodies were incubated at 30 ° C. for 2-3 days.

아밀라제를 분비하는 콜로니의 검출은 적색 전분을 선별 증식 배지에 포함시켜 수행하였다. 문헌 (Biely et al., Anal. Biochem., 172:176-179 (1988))에 기재된 바와 같은 방법에 따라 전분을 적색 염료 (반응성 Red-120, Sigma)와 결합시켰다. 결합된 전분을 최종 농도 0.15% (w/v)로 SCD-Ura 아가 플레이트에 첨가하고, 인산칼륨을 사용하여 pH 7.0으로 완충시켰다 (최종 농도 50 내지 100 mM).Detection of amylase secreting colonies was performed by including red starch in the selective growth medium. Starch was combined with a red dye (reactive Red-120, Sigma) according to the method as described in Biely et al., Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988). Bound starch was added to SCD-Ura agar plates at a final concentration of 0.15% (w / v) and buffered to pH 7.0 with potassium phosphate (final concentration 50-100 mM).

양성 콜로니를 선별하여 새로운 선별 배지 (150 mm 플레이트 상의)에 스트리킹함으로써 잘 단리하여 동정가능한 단일 콜로리를 수득하였다. 적색 전분을 완충된 SCD-Ura 아가에 직접 첨가하여 아밀라제 분비에 대해 양성인 잘 단리된 단일 콜로니를 검출하였다. 전분을 분해하여 눈으로 직접 확인할 수 있는 양성 콜로니 주위에 투명 원광(halo)을 생성시키는 능력을 지닌 양성 콜로니를 선별하였다.Positive colonies were selected and streaked in fresh selection medium (on 150 mm plates) to obtain well isolated single colonies. Red starch was added directly to the buffered SCD-Ura agar to detect well isolated single colonies positive for amylase secretion. Positive colonies were selected that had the ability to degrade starch and produce transparent halo around positive colonies that could be directly identified by eye.

4. PCR 증폭에 의한 DNA의 단리 4. Isolation of DNA by PCR Amplification

양성 콜로니를 단리할 때, 그 일부를 이쑤시개로 떼어 내어 96웰 플레이트에 있는 멸균수 30 ㎕에 희석하였다. 이때, 양성 콜로니를 동결시켜 후속 분석을 위해 보관하거나 즉시 증폭하였다. 0.5 ㎕ 클렌택 (Klentaq, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Clontech), 10 mM dNTP 4.0 ㎕ (Perkin Elmer-Cetus), 클렌텍 완충액 (Clontech) 2.5 ㎕, 전방향 올리고뉴클레오티드 1 0.25 ㎕, 역방향 올리고뉴클레오티드 2 0.25 ㎕, 증류수 12.5 ㎕를 포함하는 25 ㎕ 부피의 PCR 반응에 세포의 분취액 5 ㎕를 주형으로 사용하였다. 전방향 올리고뉴클레오티드 1의 서열은 다음과 같다:When the positive colonies were isolated, a portion of them were removed with a toothpick and diluted in 30 μl of sterile water in a 96 well plate. At this time, positive colonies were frozen and stored for subsequent analysis or immediately amplified. 0.5 μl Clentech (Klentaq, Clontech, Palo Alto, Calif.), 4.0 μl 10 mM dNTP (Perkin Elmer-Cetus), 2.5 μl Clentech buffer, 0.25 μl forward oligonucleotide 1, reverse oligonucleotide 2 5 μl aliquots of the cells were used as a template in a 25 μl volume PCR reaction containing 0.25 μl and 12.5 μl of distilled water. The sequence of forward oligonucleotide 1 is as follows:

5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (서열 33)5'-TGTAAAACGACGGCCAGT TAAATAGACCTGCAATTATTAATCT -3 '(SEQ ID NO: 33)

역방향 올리고뉴클레오티드 2의 서열은 다음과 같다:The sequence of reverse oligonucleotide 2 is as follows:

5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' (서열 34)5'-CAGGAAACAGCTATGACC ACCTGCACACCTGCAAATCCATT -3 '(SEQ ID NO: 34)

이어서, PCR을 다음과 같이 수행하였다.Then, PCR was performed as follows.

a. 92℃에서 5분 동안 변성시킴,a. Denaturation at 92 ° C. for 5 minutes,

b. 92℃에서 30초 동안 변성, 59℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,b. Denatured at 92 ° C. for 30 seconds, annealed at 59 ° C. for 30 seconds, and extended three times at 72 ° C. for 60 seconds,

c. 92℃에서 30초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,c. Denature for 30 seconds at 92 ℃, annealing for 30 seconds at 57 ℃, stretching for 60 seconds at 72 ℃, three times,

d. 92℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 25회 실시,d. 25 cycles of denaturation at 92 ° C. for 30 seconds, annealing at 55 ° C. for 30 seconds, and extension at 72 ° C. for 60 seconds,

e. 4℃에서 유지시킴.e. Maintained at 4 ° C.

올리고뉴클레오티드의 밑줄친 영역은 ADH 프로모터 영역 및 아밀라제 영역에 각각 어닐링되고, 삽입체가 존재하지 않을 경우 벡터 pSST-AMY.O으로부터 307 bp 영역을 증폭하였다. 통상적으로, 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 처음 18개의 뉴클레오티드는 서열 분석 프라이머의 어닐링 부위를 포함한다. 따라서, 공(empty) 벡터로부터 얻은 PCR 반응의 총 생성물은 343 bp이었다. 그러나, 신호 서열이 결합된 cDNA는 상당히 긴 뉴클레오티드 서열을 생성시켰다.The underlined regions of the oligonucleotides were annealed to the ADH promoter region and the amylase region, respectively, and amplified the 307 bp region from the vector pSST-AMY.O when no insert was present. Typically, the first 18 nucleotides of the 5 'end of the oligonucleotide comprise the annealing site of the sequencing primer. Thus, the total product of the PCR reaction obtained from the empty vector was 343 bp. However, cDNA to which the signal sequence was bound produced a fairly long nucleotide sequence.

PCR 후, 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충 시스템을 사용한 1% 아가로스 겔 상 아가로스 겔 전기영동으로 반응액 의 분취액 5 ㎕를 조사하였다. 400 bp보다 큰 강력한 하나의 PCR 산물을 생성하는 클론을 96 키아퀵 (Qiaquick) PCR 클린-업 (clean-up) 컬럼 (미국 캘리포니아주 채스워쓰 소재의 Qiagen Inc.)으로 정제한 후 DNA 시퀀싱으로 더 분석하였다.After PCR, 5 μl aliquots of the reaction solution were examined by agarose gel electrophoresis on 1% agarose gel using the Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer system described in Sambrook et al., Supra. Clones that generate one powerful PCR product larger than 400 bp are purified by 96 Qiaquick PCR clean-up columns (Qiagen Inc., Chasworth, CA) and further subjected to DNA sequencing. Analyzed.

실시예 3: 신호 연산법 분석을 이용한 cDNA 클론의 단리Example 3: Isolation of cDNA Clone Using Signal Computation Analysis

제넨테크, 인크사 (Genentech, Inc., South San Franscisco, CA)에서 개발한 비공개 신호 서열 검색 연산법을 이용하여, 다양한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 공개(예를 들어, Genbank) 및(또는) 비공개(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) 데이타베이스로부터의 EST 및 밀집되고 조립된 EST 단편에서 확인하였다. 신호 서열 연산법은 목적 서열 또는 서열 단편의 5'-말단에 있는 첫번째 및 임의로 두번째 메티오닌 코돈(ATG) 주변의 DNA 뉴클레오티드의 특성을 기초로 하여 분비 신호 점수를 계산한다. 첫번째 ATG 다음의 뉴클레오티드는 임의의 정지 코돈 없이 35개 이상의 분명한 아미노산을 코딩해야 한다. 첫번째 ATG는 소정의 아미노산을 갖는 경우, 두번째 ATG는 조사하지 않았다. 이 요건을 충족시키지 못하는 경우, 후보 서열의 점수는 계산하지 않았다. EST 서열이 분명한 신호 서열을 포함하는지를 결정하기 위해, 분비 신호와 관련된 것으로 알려진 7개의 센서(평가 파라미타) 한 세트를 사용하여 상기 DNA 및 ATG 코돈 주변의 아미노산 서열의 점수를 매겼다. 이 연산법을 사용하여 많은 폴리펩티드-코딩 핵산 서열을 확인하였다.Using proprietary signal sequence retrieval algorithms developed by Genentech, Inc., South San Franscisco, Calif., Nucleic acid sequences encoding various polypeptides are disclosed (eg, Genbank) and / or). EST from a closed (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, Calif.) Database and identified in dense and assembled EST fragments. Signal sequencing calculates secretion signal scores based on the properties of the DNA nucleotides around the first and optionally second methionine codons (ATGs) at the 5'-end of the desired sequence or sequence fragment. The nucleotide following the first ATG should encode at least 35 distinct amino acids without any stop codons. If the first ATG had a given amino acid, the second ATG was not examined. If this requirement is not met, the score of the candidate sequence was not calculated. To determine if the EST sequence contained a clear signal sequence, a set of seven sensors (evaluation parameters) known to be associated with the secretion signal was used to score the amino acid sequences around the DNA and ATG codons. This algorithm was used to identify many polypeptide-encoding nucleic acid sequences.

실시예 4: 인간 PRO179를 코딩하는 cDNA 클론의 단리Example 4: Isolation of cDNA Clone Encoding Human PRO179

cDNA 서열은 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 스크리닝으로 단리하였다. 상기 스크리닝에서 단리된 cDNA 서열은 BLAST 및 FastA 서열 정렬을 통해 다양한 앤지오포이틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상동한 서열을 포함하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이 cDNA 서열은 본원에서 DNA10028 및(또는) DNA25250으로 지칭된다. cDNA sequences were isolated by screening as described in Example 2 above. The cDNA sequence isolated in this screening was found to contain sequences homologous to nucleotide sequences encoding various angiopoytin proteins via BLAST and FastA sequence alignments. This cDNA sequence is referred to herein as DNA10028 and / or DNA25250.

그 다음으로, 서열 상동성을 기초로 하여 DNA10028 분자의 서열로부터 올리고뉴클레오티드 프로브를 만들고, 이 프로브를 사용하여 상기 실시예 2의 단락 1에 기재된 바와 같이 제작된 인간 태아의 간 라이브러리 (LIB6)를 스크리닝하였다. 클로닝 벡터는 XhoI 및 NotI 부위가 각각 하나인 pRK5B (SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5B의 전구체임; Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991))이고, 절단된 cDNA 크기는 2800 bp 미만이었다. Next, oligonucleotide probes are made from the sequence of DNA10028 molecules based on sequence homology, and the probes are used to screen the human fetal liver library (LIB6) constructed as described in paragraph 1 of Example 2 above. It was. The cloning vector is pRK5B with one XhoI and NotI site each (precursor of pRK5B without SfiI site; Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) and cleaved cDNA size is less than 2800 bp It was.

상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 시퀀싱을 통하여 PRO179의 전장 DNA 서열 및 PRO179에 대한 유도된 단백질 서열을 얻었다. DNA16451-1388의 전장 뉴클레오티드 서열은 도 1 (서열 1)에 나타내었다. 클론 DNA16451-1388은 뉴클레오티드 위치 37 내지 39에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 1417 내지 1419에서 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 460개 아미노산이다 (도 2, 서열 2). 도 2에 나타낸 전장 PRO179 단백질의 예측된 분자량은 약 53,637 달톤이고, pI는 약 6.61이다. DNA sequencing of the isolated clones as described above yielded the full-length DNA sequence of PRO179 and the derived protein sequence for PRO179. The full length nucleotide sequence of DNA16451-1388 is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Clones DNA16451-1388 contain a single open reading frame with a clear translation initiation site at nucleotide positions 37 to 39 and a clear stop codon at nucleotide positions 1417 to 1419 (FIG. 1). The expected polypeptide precursor is 460 amino acids in length (FIG. 2, SEQ ID NO: 2). The predicted molecular weight of the full-length PRO179 protein shown in FIG. 2 is about 53,637 Daltons and the pi is about 6.61.

도 2 (서열 2)에 나타낸 전장 PRO179 서열의 분석은 도 2에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 여기서 이들 중요 폴리펩 티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타낸 것이다. 전장 PRO179 서열 (도 2; 서열 2)의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 16이고; 류신 지퍼 패턴의 아미노산 위치가 약 120 내지 약 142, 및 약 127 내지 약 149이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 23 내지 약 27, 약 115 내지 약 119, 약 296 내지 약 300, 및 약 357 내지 약 361이고; 피브리노겐 베타쇄 및 감마쇄 C-말단 도메인의 아미노산 위치가 약 271 내지 약 310, 약 312 내지 약 322, 약 331 내지 약 369, 및 약 393 내지 약 424임을 입증한다. Analysis of the full-length PRO179 sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) demonstrates the presence of various important polypeptide domains, as shown in FIG. 2, where the location of these important polypeptide domains is shown roughly as above. Analysis of the full length PRO179 sequence (FIG. 2; SEQ ID NO: 2) shows that the amino acid position of the signal peptide is about 1 to about 16; The amino acid position of the leucine zipper pattern is about 120 to about 142, and about 127 to about 149; The amino acid positions of the N-glycosylation sites are about 23 to about 27, about 115 to about 119, about 296 to about 300, and about 357 to about 361; It demonstrates that the amino acid positions of the fibrinogen beta chain and gamma chain C-terminal domains are about 271 to about 310, about 312 to about 322, about 331 to about 369, and about 393 to about 424.

클론 DNA16451-1388은 1998년 4월 14일자로 ATCC에 기탁하였고, ATCC 제209776호의 기탁번호를 부여받았다. 서열을 고려할 때, 기탁된 클론은 정확한 서열을 포함하고 있고, 본원에서 제공하는 서열은 공지된 시퀀싱 기술을 기초로 한 것이다. Clones DNA16451-1388 were deposited with the ATCC on April 14, 1998 and were assigned accession number of ATCC 209776. Given the sequence, the deposited clone contains the correct sequence, and the sequences provided herein are based on known sequencing techniques.

전장 PRO179 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 PRO179 폴리펩티드가 앤지오포이에틴족의 단백질과 상당히 유사하므로, PRO179가 앤지오포이에틴족의 신규 구성원일 수 있음을 암시한다. 보다 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버젼 35.45 스위스프롯 35)의 분석은 PRO179 아미노산 서열과 하기 데이호프 서열 사이에 상당한 상동성이 있음을 입증한다: AF004326_1, P_R94605, HSU83508_1, P_R94603, P_R94317, AF025818_1, HSY16132_1, P_R65760, I37391 및 HUMRSC192_1.Amino acid sequence analysis of the full-length PRO179 polypeptide suggests that PRO179 may be a new member of the angiopoietin family because the PRO179 polypeptide is quite similar to the proteins of the angiopoietin family. More specifically, analysis of the Dayhof database (version 35.45 Swissplot 35) demonstrates a significant homology between the PRO179 amino acid sequence and the following Dayhof sequence: AF004326_1, P_R94605, HSU83508_1, P_R94603, P_R94317, AF025818_1, HSY16132_1 , P_R65760, I37391 and HUMRSC192_1.

실시예 5: 인간 PRO238을 코딩하는 cDNA 클론의 단리Example 5: Isolation of cDNA Clone Encoding Human PRO238

상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30908이라 지칭하였 다. DNA30908 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 원하는 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO238에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 또한, 상기 컨센서스 DNA30908 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 제작하였다.Consensus DNA sequences were assembled for other EST sequences using the phrap described in Example 1 above. This consensus sequence was referred to herein as DNA30908. Based on the DNA30908 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) cDNA library containing the desired sequence by PCR and 2) as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence for PRO238. In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe was constructed from the consensus DNA30908 sequence.

여러 라이브러리를 스크리닝하여 전장 클론원을 얻기 위해, 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)의 방법에 따라 하기 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 그 다음으로, 양성 라이브러리는 하기 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하기 PCR 프라이머 중 하나를 사용하여 PRO238 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는 데 사용하였다. To screen the various libraries to obtain full-length clones, the DNA of the library was screened by PCR amplification using the following PCR primer pairs according to the method of Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. A positive library was then used to isolate clones encoding the PRO238 gene using one of the following probe oligonucleotides and the following PCR primers.

상기 방법에서 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:Oligonucleotide sequences used in the method are as follows:

전방향 PCR 프라이머 1:Omnidirectional PCR primer 1:

5'-GGTGCTAAACTGGTGCTCTGTGGC-3' (서열 35)5'-GGTGCTAAACTGGTGCTCTGTGGC-3 '(SEQ ID NO: 35)

전방향 PCR 프라이머 2:Omnidirectional PCR primer 2:

5'-CAGGGCAAGATGAGCATTCC-3' (서열 36)5'-CAGGGCAAGATGAGCATTCC-3 '(SEQ ID NO: 36)

역방향 PCR 프라이머Reverse PCR primers

5'-TCATACTGTTCCATCTCGGCACGC-3' (서열 37)5'-TCATACTGTTCCATCTCGGCACGC-3 '(SEQ ID NO: 37)

혼성화 프로브:Hybridization Probe:

5'-AATGGTGGGGCCCTAGAAGAGCTCATCAGAGAACTCACCGCTTCTCATGC-3' (서열 38)5'-AATGGTGGGGCCCTAGAAGAGCTCATCAGAGAACTCACCGCTTCTCATGC-3 '(SEQ ID NO: 38)

cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하 였다. cDNA 클론을 단리하는 데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠사 (San Diego, CA)의 시약과 같은 시판되는 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. cDNA는 NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 대략 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.RNA for constructing the cDNA library was isolated from human fetal liver tissue. The cDNA library used to isolate the cDNA clone was constructed by standard methods using commercially available reagents such as reagents from Invitrogen (San Diego, Calif.). The cDNA was primed with oligo dT containing the NotI site, bound to the SalI hemikinase adapter to the blunt end, cleaved with NotI, roughly sorted according to size by gel electrophoresis, and then subjected to a suitable cloning vector (eg For example, pRKB or pRKD; pRKB5 is a precursor of pRK5D without the SfiI site; cloned in a direction determined to a single XhoI and NotI site of Homles et al., Science, 253: 1278-1280 (1991).

상기와 같이 단리된 클론 DNA를 시퀀싱하여 PRO238의 전장 DNA 서열 [본원에서 DNA35600-1162로 지칭됨] (도 3, 서열 3) 및 PRO238의 유도된 단백질 서열을 얻었다. The cloned DNA isolated as above was sequenced to obtain the full length DNA sequence of PRO238 (referred to herein as DNA35600-1162) (FIG. 3, SEQ ID NO: 3) and the derived protein sequence of PRO238.

DNA35600-1162의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 3 (서열 3)에 나타내었다. 클론 DNA35600-1162는 뉴클레오티드 위치 134-136에 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 1064-1066의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하고 있다 (도 3). 예측된 폴리펩티드 전구체의 길이는 310 개의 아미노산이고 (도 4; 서열 4), 대략적인 분자량은 약 33,524 달톤이고 pI는 약 9.55이다.The total nucleotide sequence of DNA35600-1162 is shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 3). Clone DNA35600-1162 contains a single open reading frame that has a clear translation initiation site at nucleotide positions 134-136 and terminates at the stop codon at nucleotide positions 1064-1066 (FIG. 3). The predicted polypeptide precursor is 310 amino acids in length (FIG. 4; SEQ ID NO: 4), has an approximate molecular weight of about 33,524 daltons and a pi of about 9.55.

도 4 (서열 4)에 나타낸 전장 PRO238 서열의 분석 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인 각각의 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적인 것이다. 전장 PRO238 서열 (도 4; 서열 4)의 분석 결과는 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 21 이고; 막횡단 도메인의 아미노산 위치가 약 102 내지 119 및 약 278 내지 약 292이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 228 내지 약 232이고; 글리코스아미노글리칸 부착 부위의 아미노산 위치가 약 47 내지 약 51이고; 티로신 키나제 인산화 부위의 아미노산 위치가 약 145 내지 약 153이고; N-미리스토일화 부위의 아미노산 위치가 약 44 내지 약 50, 약 105 내지 약 111, 약 238 내지 약 244, 약 242 내지 248, 및 약 291 내지 약 297이고; 아미드화 부위의 아미노산 위치가 약 265 내지 269이고; 원핵세포막 지단백질 지질 부착 부위의 아미노산 위치가 약 6 내지 17임을 입증한다. 클론 DNA35600-1162는 1997년 10월 16일자로 기탁되었고, ATCC 209370의 기탁 번호를 부여받았다.Analysis of the full length PRO238 sequence shown in FIG. 4 (SEQ ID NO: 4) demonstrates the presence of various important polypeptide domains, as shown in FIG. 4, wherein the location of each of these important polypeptide domains is approximate as described above. Analysis of the full length PRO238 sequence (FIG. 4; SEQ ID NO: 4) shows that the amino acid positions of the signal peptide are about 1 to 21; Amino acid positions of the transmembrane domain are from about 102 to 119 and from about 278 to about 292; The amino acid position of the N-glycosylation site is from about 228 to about 232; The amino acid position of the glycosaminoglycan attachment site is about 47 to about 51; The amino acid position of the tyrosine kinase phosphorylation site is from about 145 to about 153; The amino acid positions of the N-myristoylation sites are about 44 to about 50, about 105 to about 111, about 238 to about 244, about 242 to 248, and about 291 to about 297; The amino acid position of the amidation site is between about 265 and 269; It is demonstrated that the amino acid position of the prokaryotic membrane lipoprotein lipid attachment site is about 6-17. Clone DNA35600-1162 was deposited on October 16, 1997 and was assigned an accession number of ATCC 209370.

전장 PRO238 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 PRO238의 일부가 리덕타제, 특히 옥시도리덕타제와 상당한 상동성을 나타내므로, 상기 PRO238이 신규 리덕타제일 수 있음을 암시한다.Amino acid sequencing of the full length PRO238 polypeptide suggests that PRO238 may be a novel reductase since some of the PRO238 exhibits significant homology with reductases, particularly oxidoreductases.

실시예 6: 인간 PRO364를 코딩하는 cDNA 클론의 단리Example 6: Isolation of cDNA Clone Encoding Human PRO364

발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 종양 괴사 인자 (TNFR) 족 폴리펩티드의 구성원과 상동성을 보이는 인사이트 EST 서열 (Incyte EST No. 3003460)을 찾아내었다.An expression EST sequence (Incyte EST No) that searches for an expression sequence tag (EST) DNA database (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.) And shows homology with members of the tumor necrosis factor (TNFR) family of polypeptides. 3003460).

BLAST (Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)) 및 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)의 반복 주기를 이용하여, Incyte EST 3003460 및 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 "<consen01>"이라 지칭되었으며, 또한 DNA44825라 지칭되었다. 1) 원하는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고 2) PRO364에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해, DNA44825 및 "<consen01>" 컨센서스 서열을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머의 길이는 통상적으로 20 내지 30개의 뉴클레오티드이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 디자인한다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 여러 라이브러리를 스크리닝하여 전장 클론을 얻기 위해, 상기 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 그 후, 양성 라이브러리는 하기 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하기 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 원하는 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는 데 사용하였다.Using repeated cycles of BLAST (Altshul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) and "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington), Incyte EST 3003460 and other EST sequences were used. Consensus DNA sequences were assembled. This consensus sequence was referred to herein as "<consen01>" and also referred to as DNA44825. Oligonucleotide probes based on DNA44825 and "<consen01> consensus sequences, for 1) identifying cDNA libraries containing desired sequences by PCR and 2) using probes to isolate clones of the full-length coding sequence for PRO364. Was synthesized. Forward and reverse PCR primers are typically 20 to 30 nucleotides in length and are often designed to yield PCR products about 100 to 1000 bp in length. The length of the probe sequence is typically 40 to 55 bp. To screen the various libraries to obtain full length clones, the DNA of the library was screened by PCR amplification using PCR primer pairs as described above in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Positive libraries were then used to isolate clones encoding the desired genes using one of the following probe oligonucleotides and primer pairs below.

하기 PCR 프라이머쌍 (전방향 및 후방향)을 합성하였다:The following PCR primer pairs (forward and backward) were synthesized:

전방향 PCR 프라이머 (44825.fl):Omnidirectional PCR Primer (44825.fl):

5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3' (서열 39)5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3 '(SEQ ID NO: 39)

전방향 PCR 프라이머 (44825.f2):Omnidirectional PCR Primer (44825.f2):

5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3'(서열 40)5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3 '(SEQ ID NO: 40)

전방향 PCR 프라이머 (44825.GITR.f):Omnidirectional PCR Primer (44825.GITR.f):

5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3' (서열 41)5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3 '(SEQ ID NO: 41)

역방향 PCR 프라이머 (44825.rl):Reverse PCR Primer (44825.rl):

5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3' (서열 42)5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3 '(SEQ ID NO: 42)

역방향 PCR 프라이머 (44825.r2):Reverse PCR Primer (44825.r2):

5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3' (서열 43)5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3 '(SEQ ID NO: 43)

역방향 PCR 프라이머 (44825.GITR.r):Reverse PCR Primer (44825.GITR.r):

5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3' (서열 44)5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3 '(SEQ ID NO: 44)

추가로, 뉴클레오티드 서열이 하기와 같은 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA44825 컨센서스 서열로부터 제조하였다:In addition, synthetic oligonucleotide hybridization probes with the following nucleotide sequences were prepared from the DNA44825 consensus sequence:

혼성화 프로브 (44825.p1):Hybridization Probe (44825.p1):

5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3' (서열 45)5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3 '(SEQ ID NO: 45)

혼성화 프로브 (44825.GITR.p):Hybridization Probe (44825.GITR.p):

5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3' (서열 46)5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 46)

여러 라이브러리를 스크리닝하여 전장 클론원을 얻기 위해, 상기와 같은 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 양성 라이브러리는 하기 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하기 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO364 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는 데 사용하였다.In order to screen the various libraries to obtain full-length clones, the DNA of the libraries was screened by PCR amplification using such PCR primer pairs. Positive libraries were used to isolate clones encoding the PRO364 gene using one of the following probe oligonucleotides and the following PCR primers.

cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 RNA는 인간 골수 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 시판하는 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalI 헤미키나아제화된 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotI으로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 대략적으로 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.RNA for making cDNA libraries was isolated from human bone marrow tissue. The cDNA library used to isolate the cDNA clones was constructed by standard methods using reagents commercially available from companies such as Invitrogen (San Diego, Calif.). Priming the cDNA with oligo dT containing the NotI site, binding blunt ends to SalI hemikinase-ized adapters, cleaving with NotI, roughly sorting by size with gel electrophoresis, followed by suitable cloning vectors (eg For example, pRKB or pRKD; pRKB5 is a precursor of pRK5D without the SfiI site; cloned in a direction determined to a single XhoI and NotI site of Homles et al., Science, 253: 1278-1280 (1991).

cDNA 클론을 확인하고 전체 서열을 시퀀싱하였다. DNA47365-1206의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 5 (서열 5)에 나타내었다. 클론 DNA47365-1206은 뉴클레오티드 위치 121 내지 123에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 844 내지 846에서 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 5; 서열 5). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 241개의 아미노산이고, 예상 분자량은 약 26,000 달톤이며, 추정된 pI는 약 6.34이다. 전장 PRO364 단백질은 도 6 (서열 6)에 나타내었다.cDNA clones were identified and the entire sequence was sequenced. The total nucleotide sequence of DNA47365-1206 is shown in Figure 5 (SEQ ID NO: 5). Clone DNA47365-1206 contains a single open reading frame with a clear translation initiation site at nucleotide positions 121-123 and a stop codon at nucleotide positions 844-846 (FIG. 5; SEQ ID NO: 5). The expected polypeptide precursor is 241 amino acids in length, the expected molecular weight is about 26,000 Daltons, and the estimated pi is about 6.34. Full length PRO364 protein is shown in Figure 6 (SEQ ID NO: 6).

도 6 (서열 6)에 나타낸 전장 PRO364 서열의 분석은 도 6에 나타낸 바와 같이 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타나있다. 전장 PRO364 서열 (도 6; 서열 6)의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 25이고; 막횡단 도메인일 가능성이 높은 도메인의 아미노산 위치가 약 162 내지 약 180이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 146 내지 약 150이고; N-미리스토일화 부위의 아미노산 위치가 약 5 내지 약 11, 약 8 내지 약 14, 약 25 내지 약 31, 약 30 내지 약 36, 약 33 내지 약 39, 약 118 내지 약 124, 약 122 내지 약 128, 및 약 156 내지 약 162이고; 원핵세포막 지단백질 지질 부착 부위의 아미노산 위치가 약 166 내지 약 177이고; 류신 지퍼 패턴의 아미노산 위치가 약 171 내지 약 193임을 입증한다. 클론 DNA47365-1206은 1997년 11월 7일에 ATCC에 기탁하였고, ATCC 209436의 기탁 번호를 부여받았다. 기탁된 클론은 본원에 제공된 서열보다 사실상 더 정확한 서열을 갖는 것임을 알아야 한다.Analysis of the full-length PRO364 sequence shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 6) demonstrates the presence of an important polypeptide domain as shown in FIG. 6, wherein the location of the important polypeptide domain is shown approximately above. Analysis of the full length PRO364 sequence (FIG. 6; SEQ ID NO: 6) shows that the amino acid position of the signal peptide is about 1 to about 25; The amino acid position of the domain likely to be the transmembrane domain is from about 162 to about 180; The amino acid position of the N-glycosylation site is from about 146 to about 150; The amino acid position of the N-myristoylation site is about 5 to about 11, about 8 to about 14, about 25 to about 31, about 30 to about 36, about 33 to about 39, about 118 to about 124, about 122 to about 128, and about 156 to about 162; The amino acid position of the prokaryotic membrane lipoprotein lipid attachment site is from about 166 to about 177; It demonstrates that the amino acid position of the leucine zipper pattern is about 171 to about 193. The clone DNA47365-1206 was deposited with the ATCC on November 7, 1997 and was given an accession number of ATCC 209436. It should be appreciated that the deposited clones have sequences that are actually more accurate than the sequences provided herein.

전장 PRO364 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 종양 괴사 인자 수용체 족의 구성원과 상당한 상동성이 있으므로, PRO364가 종양 괴사 인자 수용체 족의 신규 구성원일 수 있음을 암시한다. PRO364의 세포내 도메인은, TRAF2 결합에 필요한 것으로 보이면서 TNFR2내에 존재하기도 하는 CD30 수용체내의 최소 도메인과 유사한 모티프 (아미노산 207-214 영역내에 있음)를 포함한다. TNFR 족의 특징인 3개의 분명한 세포외 시스테인-풍부 도메인 (CDR)이 존재하는데 (Naismith and Sprang, Trends Biochem. Sci., 23: 74-79 (1998)), 이들 중 3번째 CDR의 시스테인 갯수는 TNFR 족 CDR의 전형적인 시스테인 갯수인 4 또는 6개가 아니라 3개이다. PRO364과 마우스의 GITR (아래에 기재되어 있음)을 비교할 때, 마우스의 GITR은 CRD1에 5개의 시스테인을 포함하는데 반해, PRO364 아미노산 서열은 CRD1에 8개의 시스테인을 포함하고, 마우스의 GITR에는 N-결합 글리코실화 부위일 가능성이 높은 4개의 도메인이 존재하는 반면, ECD에는 N-결합 글리코실화 부위일 가능성이 높은 1개의 도메인이 존재한다. Amino acid sequencing of the full length PRO364 polypeptide suggests that PRO364 may be a new member of the tumor necrosis factor receptor family because a portion of the polypeptide is highly homologous to members of the tumor necrosis factor receptor family. The intracellular domain of PRO364 contains a motif similar to the minimal domain in the CD30 receptor that is present in TNFR2 (in the amino acid 207-214 region) that appears to be necessary for TRAF2 binding. There are three distinct extracellular cysteine-rich domains (CDRs) characteristic of the TNFR family (Naismith and Sprang, Trends Biochem. Sci., 23: 74-79 (1998)), of which the number of cysteines in the third CDR is The typical cysteine number of TNFR family CDRs is three, not four or six. When comparing PRO364 and mouse GITR (described below), mouse GITR contains 5 cysteines in CRD1, whereas PRO364 amino acid sequence contains 8 cysteines in CRD1 and N-links to GITR in mice. There are four domains that are most likely to be glycosylation sites, while in ECD there is one domain that is more likely to be N-linked glycosylation sites.

전장 PRO364 폴리펩티드의 잠정적인 아미노산 서열과, 이 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상세히 조사해보면, 문헌(Nocenti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 6216-6221 (1997))에 보고된 마우스 GITR 단백질과 상 동성이 있음이 입증된다. 따라서, PRO364는 상기 문헌에 보고된 마우스 GITR 단백질의 상응하는 단백질일 수 있다.A detailed investigation of the tentative amino acid sequence of the full-length PRO364 polypeptide and the nucleotide sequence encoding this amino acid sequence can be found in Nocenti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 6216-6221 (1997). There is evidence for homology with the reported mouse GITR protein. Thus, PRO364 may be the corresponding protein of the mouse GITR protein reported in the literature.

실시예 7: 인간 PRO844를 코딩하는 cDNA 클론의 단리Example 7: Isolation of cDNA Clone Encoding Human PRO844

발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, LP와의 서열 동일성을 보이는 EST를 찾아내었다. 본원에서 제공한 정보 및 발견을 기초로 하여 폐암세포 라이브러리 (309-LUNGTUT09) 중에서 이 EST에 대한 클론인 인사이트 클론 2657496을 더 조사하였다. Expression sequence tag (EST) DNA databases (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.) Were searched to find ESTs showing sequence identity with LP. Based on the information and findings provided herein, the Insight Clone 2657496, a clone to this EST, was further investigated in the Lung Cancer Cell Library (309-LUNGTUT09).

cDNA 클론을 확인하고 전체 서열을 시퀀싱하였다. DNA59838-1462의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 7 (서열 7)에 나타내었다. 클론 DNA59838-1462는 뉴클레오티드 위치 5-7에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 338-340에서 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 7; 서열 7). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 111개의 아미노산이고, 예상 분자량은 약 12,050 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.45이다. 전장 PRO844 단백질은 도 8 (서열 8)에 나타내었다.cDNA clones were identified and the entire sequence was sequenced. The total nucleotide sequence of DNA59838-1462 is shown in Figure 7 (SEQ ID NO: 7). Clone DNA59838-1462 contains a single open reading frame with a clear translation initiation site at nucleotide positions 5-7 and a stop codon at nucleotide positions 338-340 (FIG. 7; SEQ ID NO: 7). The expected polypeptide precursor is 111 amino acids in length, the expected molecular weight is about 12,050 Daltons, and the estimated pi is about 5.45. Full length PRO844 protein is shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 8).

도 8 (서열 8)에 나타낸 전장 PRO844 서열의 분석은 도 8에 나타낸 바와 같이 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타나있다. 전장 PRO844 서열 (도 8; 서열 8)의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 19이고; N-미리스토일화 부위의 아미노산 위치가 약 23 내지 약 29, 약 27 내지 약 33, 약 32 내지 약 38, 및 약 102 내지 약 108이고; WAP-타입 '4-이황화 코어' 도메인 신호 부위의 아미노산 위치가 약 49 내지 약 63임을 입증한다. Analysis of the full-length PRO844 sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 8) demonstrates the presence of an important polypeptide domain as shown in FIG. 8, wherein the location of the important polypeptide domain is shown approximately above. Analysis of the full length PRO844 sequence (FIG. 8; SEQ ID NO: 8) shows that the amino acid position of the signal peptide is about 1 to about 19; The amino acid positions of the N-myristoylation sites are about 23 to about 29, about 27 to about 33, about 32 to about 38, and about 102 to about 108; It demonstrates that the amino acid position of the WAP-type '4-disulfide core' domain signal site is about 49 to about 63.

클론 DNA59838-1462는 1998년 6월 16일에 ATCC에 기탁하였고, ATCC 209976의 기탁 번호를 부여받았다. 기탁된 클론은 본원에 제공된 것보다 실제로 더 정확한 서열을 포함하고 있다는 것을 인지해야 한다.Clone DNA59838-1462 was deposited with the ATCC on June 16, 1998 and was assigned an accession number of ATCC 209976. It should be appreciated that deposited clones actually contain more accurate sequences than those provided herein.

전장 PRO844 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과는 상기 폴리펩티드가 세린 프로테아제 억제제와 상당한 동일성을 나타내므로, PRO844가 신규 프로테아제 억제제일 수 있음을 암시한다. 보다 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버젼 35.45 스위스프롯 35)의 분석 결과는 PRO844 아미노산 서열과 적어도 하기 데이호프 서열 사이에 상당한 상동성이 있음을 입증한다: ALK1_HUMAN, P_P82403, P_P82402, ELAF_HUMAN 및 P_P60950.Amino acid sequence analysis of the full-length PRO844 polypeptide suggests that PRO844 may be a novel protease inhibitor, as the polypeptide shows significant identity with a serine protease inhibitor. More specifically, analysis of the Dayhof database (version 35.45 Swissplot 35) demonstrates a significant homology between the PRO844 amino acid sequence and at least the following Dayhof sequence: ALK1_HUMAN, P_P82403, P_P82402, ELAF_HUMAN and P_P60950.

실시예 8: 인간 PRO846을 코딩하는 cDNA 클론의 단리Example 8: Isolation of cDNA Clone Encoding Human PRO846

상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap를 사용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA39949 및 "<consen1322>"라 지칭되었다. 1) 원하는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고 2) PRO846에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해, DNA39949 컨센서스 서열 및 "<consen1322>" 서열을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)는 DNA39949 및 "<consen1322>" 컨센서스 서열을 기초로 하여 합성하였다. 추가로, 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브는 컨센서스 DNA30908 서열로부터 제작하였다. Phrap was used to assemble consensus DNA sequences for other EST sequences as described in Example 1 above. This consensus sequence was referred to herein as DNA39949 and "<consen1322>". Oligonucleotides based on the DNA39949 consensus sequence and the "<consen1322>" sequence for 1) identifying cDNA libraries containing the desired sequences by PCR and 2) using probes to isolate clones of the full-length coding sequence for PRO846. Was synthesized. PCR primers (forward and reverse) were synthesized based on the DNA39949 and "<consen1322>" consensus sequences. In addition, synthetic oligonucleotide hybridization probes were constructed from consensus DNA30908 sequences.

여러 라이브러리를 스크리닝하여 전장 클론을 얻기 위해, 상기 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 그 후, 양성 라이브러리는 하기 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하기 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 PRO846 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는 데 사용하였다.To screen the various libraries to obtain full length clones, the DNA of the library was screened by PCR amplification using PCR primer pairs as described above in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. A positive library was then used to isolate clones encoding the PRO846 gene using one of the following probe oligonucleotides and the following primer pairs.

상기 방법에서 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:The oligonucleotide sequence used in the method is as follows:

전방향 PCR 프라이머 (39949.fl):Omnidirectional PCR primer (39949.fl):

5'-CCCTGCAGTGCACCTACAGGGAAG-3' (서열 47)5'-CCCTGCAGTGCACCTACAGGGAAG-3 '(SEQ ID NO: 47)

역방향 PCR 프라이머 (39949.r1):Reverse PCR Primer (39949.r1):

5'-CTGTCTTCCCCTGCTTGGCTGTGG-3'(서열 48).5'-CTGTCTTCCCCTGCTTGGCTGTGG-3 '(SEQ ID NO: 48).

추가로, 뉴클레오티드 서열이 하기와 같은 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA39949 서열로부터 제작하였다:In addition, synthetic oligonucleotide hybridization probes with the following nucleotide sequences were constructed from the consensus DNA39949 sequence:

혼성화 프로브 (39949.p1):Hybridization Probe (39949.p1):

5'-GGTGCAGGAAGGGTGGGATCCTCTTCTCTCGCTGCTCTGGCCACATC-3' (서열 49).5'-GGTGCAGGAAGGGTGGGATCCTCTTCTCTCGCTGCTCTGGCCACATC-3 '(SEQ ID NO: 49).

cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 RNA는 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다 (LIB227). cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 시판하는 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalI 헤미키나아제화된 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotI으로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 대략적으로 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터( 예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.RNA for making cDNA libraries was isolated from human fetal kidney tissue (LIB227). The cDNA library used to isolate the cDNA clones was constructed by standard methods using reagents commercially available from companies such as Invitrogen (San Diego, Calif.). Priming the cDNA with oligo dT containing the NotI site, binding blunt ends to SalI hemikinaseized adapters, cleaving with NotI, roughly sorting by size with gel electrophoresis, and then using a suitable cloning vector (eg For example, pRKB or pRKD; pRKB5 is a precursor of pRK5D without the SfiI site; cloned in a direction determined to a single XhoI and NotI site of Homles et al., Science, 253: 1278-1280 (1991).

상기와 같이 단리된 클론의 DNA 시퀀싱을 통해 PRO846에 대한 전장 DNA 서열 [본원에서 DNA44196-1353으로 지칭됨] (도 9, 서열 9) 및 PRO846에 대한 유도된 단백질 서열을 얻었다. DNA sequencing of the clones isolated as above yielded the full length DNA sequence for PRO846 (referred to herein as DNA44196-1353) (FIG. 9, SEQ ID NO: 9) and the derived protein sequence for PRO846.

DNA44196-1353의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 9 (서열 9)에 나타내었다. 클론 DNA44196-1353은 뉴클레오티드 위치 25-27에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 1021-1023에서 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 9). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 332개의 아미노산이고, 예상 분자량은 약 36,143 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.89이다 (도 10, 서열 10). The entire nucleotide sequence of DNA44196-1353 is shown in Figure 9 (SEQ ID NO: 9). Clones DNA44196-1353 contain a single open reading frame with a clear translation initiation site at nucleotide positions 25-27 and a stop codon at nucleotide positions 1021-1023 (FIG. 9). The expected polypeptide precursor is 332 amino acids in length, the expected molecular weight is about 36,143 Daltons, and the estimated pi is about 5.89 (FIG. 10, SEQ ID NO: 10).

도 10 (서열 10)에 나타낸 전장 PRO846 서열의 분석은 도 10에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타나있다. 전장 PRO846 서열 (도 10; 서열 10)의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 17이고; 막횡단 도메인의 아미노산 위치가 약 248 내지 약 269이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 96 내지 약 100이고; 피브리노겐 베타쇄 및 감마쇄 C-말단 도메인의 아미노산 위치가 약 104 내지 약 114이고; Ig 유사 V-타입 도메인의 아미노산 위치가 약 13 내지 약 128임을 입증한다. 클론 DNA44196-1353은 1998년 5월 6일자로 ATCC에 기탁하였고, ATCC 209847의 기탁 번호를 부여받았다.Analysis of the full-length PRO846 sequence shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 10) demonstrates the presence of various important polypeptide domains, as shown in FIG. 10, where the location of the important polypeptide domain is shown approximately above. Analysis of the full length PRO846 sequence (FIG. 10; SEQ ID NO: 10) shows that the amino acid position of the signal peptide is about 1 to about 17; The amino acid position of the transmembrane domain is from about 248 to about 269; The amino acid position of the N-glycosylation site is about 96 to about 100; The amino acid position of the fibrinogen beta chain and gamma chain C-terminal domain is about 104 to about 114; It demonstrates that the amino acid position of the Ig-like V-type domain is about 13 to about 128. Clones DNA44196-1353 were deposited with the ATCC on May 6, 1998, and were assigned an accession number of ATCC 209847.

실시예 9: 인간 PRO1760을 코딩하는 cDNA 클론의 단리Example 9: Isolation of cDNA Clone Encoding Human PRO1760

상기 실시예 3에 기재된 신호 서열 알고리즘을 이용하여 인사이트 데이타베이스로부터 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 다음으로, 상동성이 있는지를 확인하기 위해, 상기 EST 클러스터 서열을 공개된 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및 비공개된 EST DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 비롯한 다양한 발효 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 하나 이상의 EST를 전립선 종양 라이브러리로부터 얻었다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996))를 사용하여 상동성 검색을 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (또는 일부 경우에는 90) 이상인 EST를 모으고, "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) 프로그램을 이용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열은 본원에서 DNA58798로 지칭된다.The EST cluster sequence was found from the insight database using the signal sequence algorithm described in Example 3 above. Next, to confirm homology, the EST cluster sequences were transferred to published EST databases (e.g., Genbank) and private EST DNA databases (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto). , CA), including various fermentation sequence tag (EST) databases. One or more ESTs were obtained from a prostate tumor library. Homology searches were performed using the computer programs BLAST or BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)). ESTs with a BLAST score of 70 (or in some cases 90) or higher, which do not encode known proteins, were collected and assembled into consensus DNA sequences using the "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) program. The consensus sequence obtained therefrom is referred to herein as DNA58798.

DNA58798 컨센서스 서열과 인사이트 EST 3358745 사이에 상동성이 있는 서열이 있음을 확인하였기 때문에, 이 EST를 포함하는 클론을 구입하였고, cDNA 인서트를 얻어 시퀀싱하였다. 상기 인서트는 전장 단백질을 코딩하는 것으로 본원에서 밝혀졌다. 이 cDNA 인서트의 서열은 도 11 (서열 11)에 나타내었고 본원에서 DNA76532-1702로 지칭된다.Since there was a homologous sequence between the DNA58798 consensus sequence and Insight EST 3358745, a clone containing this EST was purchased and the cDNA insert was obtained and sequenced. The insert has been found herein to encode a full length protein. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 11 (SEQ ID NO: 11) and is referred to herein as DNA76532-1702.

클론 DNA76532-1702는 뉴클레오티드 위치 60-62에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 624-626에서 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 11). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 188개의 아미노산이다 (도 12; 서열 12). 도 12에 나타낸 전장 PRO1760 단백질의 예상 분자량은 약 21,042 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.36이다. Clone DNA76532-1702 contains a single open reading frame with a clear translation initiation site at nucleotide positions 60-62 and a stop codon at nucleotide positions 624-626 (FIG. 11). The expected polypeptide precursor is 188 amino acids in length (FIG. 12; SEQ ID NO: 12). The expected molecular weight of the full length PRO1760 protein shown in FIG. 12 is about 21,042 Daltons, and the estimated pI is about 5.36.

도 12 (서열 12)에 나타낸 전장 PRO1760 서열의 분석은 도 12에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타나있다. 전장 PRO1760 서열의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 20이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 121 내지 약 125, 및 약 171 내지 175이고; 티로신 키나제 인산화 부위의 아미노산 위치가 약 25 내지 약 32이고; N-미리스토일화 부위의 아미노산 위치가 약 54 내지 약 60, 및 약 160 내지 166임을 입증한다. 클론 DNA76532-1702는 1998년 11월 17일자로 ATCC에 기탁하였고, ATCC 203473의 기탁 번호를 부여받았다.Analysis of the full-length PRO1760 sequence shown in FIG. 12 (SEQ ID NO: 12) demonstrates the presence of various important polypeptide domains, as shown in FIG. 12, wherein the location of the important polypeptide domain is shown approximately above. Analysis of the full length PRO1760 sequence shows that the amino acid position of the signal peptide is about 1 to about 20; The amino acid position of the N-glycosylation site is about 121 to about 125, and about 171 to 175; The amino acid position of the tyrosine kinase phosphorylation site is about 25 to about 32; It demonstrates that the amino acid positions of the N-myristoylation sites are about 54 to about 60, and about 160 to 166. The clone DNA76532-1702 was deposited with the ATCC on November 17, 1998 and was given an accession number of ATCC 203473.

도 12 (서열 12)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하여 데이호프 데이타베이스 (버젼 35.45 스위스프롯 35)를 분석한 결과는 PRO1760 아미노산 서열과 하기 데이호프 서열 사이에 서열 동일성이 있음을 입증한다: CELT07F12-2, T22J18-16, ATF1C12_3, APE3_YEAST, P_W22471, SAU56908_1, SCPA_STRPY, ATACOO423817, SAPURCLUS_2 및 AF041468_9.Analysis of the Dayhof database (version 35.45 Swissplot 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis of the full length sequence shown in FIG. 12 (SEQ ID NO: 12) shows sequence identity between the PRO1760 amino acid sequence and the following Dayhof sequence Demonstrates: CELT07F12-2, T22J18-16, ATF1C12_3, APE3_YEAST, P_W22471, SAU56908_1, SCPA_STRPY, ATACOO423817, SAPURCLUS_2 and AF041468_9.

실시예 10: 신생아 심비대증의 자극 (검정 1)Example 10 Stimulation of Neonatal Cardiac Hypertrophy (Test 1)

이 검정법은 신생아의 심비대증을 자극하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다. 1일된 할란 스프라그 돌리 래트 (Harlan Sprague Dawley rat)로부터 심근세포를 수득하였다. 1일째에 세포(7.5×10⁴/ml의 밀도, 180㎕, 혈청<0.1%, 새로이 단리됨)를 DMEM/F12+4% FCS로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 1일째, 시험 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플 또는 증식 배지만을 함유하는 시험 샘플 (음성 대조구) (20 ㎕/웰)을 상기 웰에 직접 첨가하였다. 그 다음으로, 2일째 날에 PGF (20 ㎕/웰)를 10^-6 M의 최종 농도까지 첨가하였다. 그 다음으로, 4일째 날에 상기 세포를 염색하고 5일째 날에 가시적으로 관찰하여 기록하였는데, 여기서 (음성 대조구와 비교할 때) 크기가 증가되지 않은 세포는 0.0으로 기록하고, (음성 대조구와 비교할 때) 크기의 증가가 작거나 중간정도인 세포는 1.0으로 기록하였고, (음성 대조구와 비교할 때) 크기의 증가가 큰 세포는 2.0으로 기록하였다. 이 검정법에 있어서의 양성 결과는 1.0 이상이다.This assay is designed to measure the ability of PRO polypeptides to stimulate cardiac hypertrophy in newborns. Cardiomyocytes were obtained from Harlan Sprague Dawley rats, 1 day old. On day 1 cells (density of 7.5 × 10 ⁴ / ml, 180 μl, serum <0.1%, freshly isolated) were added to 96-well plates precoated with DMEM / F12 + 4% FCS. On day 1, test samples containing test PRO polypeptides or test samples (negative controls) containing only growth medium (20 μl / well) were added directly to the wells. Then, on day 2, PGF (20 μl / well) was added to a final concentration of 10 ⁻⁶ M. The cells were then stained on day 4 and visually observed and recorded on day 5, where cells that did not increase in size (compared to negative controls) were recorded as 0.0 and compared to negative controls. Cells with a small or moderate increase in size were recorded at 1.0 and cells with a large increase in size (relative to the negative control) were recorded at 2.0. The positive result in this assay is 1.0 or more.

PRO882는 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 이 검정법에서 양성이었다.PRO882 was positive in this assay as shown in Table 4 below.

<표 4>TABLE 4

PRO번호PRO number 농도/희석Concentration / dilution 크기에 있어서의 상대적인 증가 (음성 대조구와 비교한 경우)Relative increase in size (compared to negative control) PRO882PRO882 0.01%0.01% 33 PRO882PRO882 0.01%0.01% 33 PRO882PRO882 0.10%0.10% 44 PRO882PRO882 0.10%0.10% 44 PRO882PRO882 1.00%1.00% 66 PRO882PRO882 1.00%1.00% 66 PRO882PRO882 0.01%0.01% 33 PRO882PRO882 0.10%0.10% 4.54.5 PRO882PRO882 1.00%1.00% 66 PRO882PRO882 1.00%1.00% 5.55.5 PRO882PRO882 2.6 nM2.6 nM 5.755.75

실시예 11: 혈관 내피세포 증식 인자( VEGF)에 의해 자극된 내피세포 증식의 억제 (검정 9) Example 11: Inhibition of endothelial cell proliferation stimulated by vascular endothelial cell proliferation factor (VEGF) (assay 9)

VEGF에 의해 자극된 내피세포의 증식을 억제하는 다양한 PRO 폴리펩티드의 능력을 시험하였다. 내피세포 증식의 억제 효과가 유익한 경우, 즉 종양 증식을 억제할 경우, 이 검정법에서 양성으로 확인된 폴리펩티드는 포유동물의 내피세포 증식을 억제하는 데 유용하다.The ability of various PRO polypeptides to inhibit proliferation of endothelial cells stimulated by VEGF was tested. When the inhibitory effect of endothelial cell proliferation is beneficial, i.e., inhibiting tumor proliferation, polypeptides identified as positive in this assay are useful for inhibiting endothelial cell proliferation in mammals.

구체적으로, 소의 부신 피질 모세혈관 내피세포 (ACE) (1차 배양으로부터 최대 12-14회 패시지를 거친 세포)를 100 ㎕ 당 500 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 검정용 배지에는 포도당 농도가 낮은 DMEM, 10% 소혈청, 2mM 글루타민 및 1X 페니실린/스트렙토마이신/펀지존이 포함되어 있다. 대조구 웰로는 (1) ACE 세포를 첨가하지 않은 것, (2) ACE 세포만 있는 것, (3) ACE 세포 + 5 ng/ml FGF, (4) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF, (5) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF + 1 ng/ml TGF-베타, 및 (6) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF + 5 ng/ml LIF가 있다. 폴리-His로 표지된 PRO 폴리펩티드 시험 샘플 (100㎕ 부피)을 상기 웰에 첨가하였다 (각각 1%, 0.1% 및 0.01%로 희석된 것). 세포 배양액을 37℃ 및 5% CO₂에서 6 내지 7일 동안 배양하였다. 배양 후, 웰로부터 배지를 제거하고, 세포를 1X PBS로 세척하였다. 이어서, 산 포스파타제 반응 혼합물 (100㎕: 0.1M 아세트산나트륨, pH 5.5, 0.1% 트리톤 X-100, 10mM p-니트로페닐 포스페이트)을 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 1N NaOH 10㎕를 첨가하여 반응을 멈추게 하였다. 405nm의 마이크로플레이트 판독기에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.Specifically, bovine adrenal cortical capillary endothelial cells (ACE) (cells undergoing up to 12-14 passages from primary culture) were plated in 96-well plates at 500 cells / well per 100 μl. The assay medium contains low glucose concentrations of DMEM, 10% bovine serum, 2 mM glutamine and 1X penicillin / streptomycin / puncture zone. Control wells include (1) no ACE cells, (2) ACE cells only, (3) ACE cells + 5 ng / ml FGF, (4) ACE cells + 3 ng / ml VEGF, (5) ACE cells + 3 ng / ml VEGF + 1 ng / ml TGF-beta, and (6) ACE cells + 3 ng / ml VEGF + 5 ng / ml LIF. PRO polypeptide test samples (100 μl volume) labeled with poly-His were added to the wells (diluted to 1%, 0.1% and 0.01%, respectively). Cell cultures were incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 6-7 days. After incubation, the medium was removed from the wells and the cells were washed with 1 × PBS. An acid phosphatase reaction mixture (100 μl: 0.1 M sodium acetate, pH 5.5, 0.1% Triton X-100, 10 mM p-nitrophenyl phosphate) was added to each well. After 2 hours of incubation at 37 ° C., 10 μl of 1N NaOH was added to stop the reaction. Optical density (OD) was measured on a 405 nm microplate reader.

PRO 폴리펩티드의 활성은 자극되지 않은 세포에 대한, VEGF (3 ng/ml)에 의 해 자극된 증식 (OD 405nm에서 산 포스파타제 활성을 측정하여 산출함)의 억제율로서 계산하였다. TGF-베타는 VEGF에 의해 자극된 ACE 세포 증식을 70 내지 90% 억제하기 때문에, 1 ng/ml에서 측정된 활성 기준으로서 TGF-베타를 사용하였다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 결과는 암 치료시 및, 구체적으로는, 종양의 혈관신생 억제시 PRO 폴리펩티드가 유용하다는 것을 암시한다. 표 5에 기재된 숫자 값 (상대적 억제율)은 자극받지 않은 세포에 대한, VEGF에 의해 자극된 증식의 억제율을 계산하고, 상기 억제율을 VEGF에 의해 자극된 ACE 세포 증식을 70 내지 90% 억제하는 것으로 알려진 TGF-β (1 ng/ml)로 얻은 억제율로 나누어 산출한 값이다. PRO 폴리펩티드가 VEGF에 의해 자극된 내피세포 증식을 30% 이상 억제시키면 (상대적인 억제율 30% 이상), 양성 결과로 간주한다.The activity of the PRO polypeptide was calculated as the inhibition rate of proliferated (calculated by measuring acid phosphatase activity at OD 405 nm) stimulated by VEGF (3 ng / ml) on unstimulated cells. Since TGF-beta inhibits 70-90% of VEGF stimulated ACE cell proliferation, TGF-beta was used as the activity criterion measured at 1 ng / ml. The results as shown in Table 5 below suggest that PRO polypeptides are useful in the treatment of cancer and, specifically, in the inhibition of neovascularization of tumors. The numerical values (relative inhibition) listed in Table 5 calculate the inhibition rate of VEGF-stimulated proliferation on unstimulated cells, and said inhibition rate is known to inhibit 70-90% of VEGF-stimulated ACE cell proliferation. It is calculated by dividing by the inhibition rate obtained with TGF-β (1 ng / ml). If the PRO polypeptide inhibits at least 30% of endothelial cell proliferation stimulated by VEGF (at least 30% relative inhibition), it is considered a positive result.

<표 5>TABLE 5

VEGF에 의해 자극된 내피세포 증식의 억제Inhibition of endothelial cell proliferation stimulated by VEGF PRO 명칭PRO name PRO 농도PRO concentration 상대적인 억제율(%)Relative Inhibition Rate (%) PRO333 PRO333 PRO333PRO333 PRO333 PRO333 0.01% 0.10% 1.00%0.01% 0.10% 1.00% 97.0 90.0 63.097.0 90.0 63.0 PRO877 PRO877 PRO877 PRO877 PRO877 PRO877PRO877 PRO877 PRO877 PRO877 PRO877 PRO877 0.01% 0.01% 0.10% 0.10% 1.00% 1.00%0.01% 0.01% 0.10% 0.10% 1.00% 1.00% 101.0 108.0 86.0 99.0 46.0 46.0101.0 108.0 86.0 99.0 46.0 46.0 PRO879 PRO879 PRO879PRO879 PRO879 PRO879 0.01% 0.01% 0.10%0.01% 0.01% 0.10% 100.0 105.0 97.0100.0 105.0 97.0 PRO879 PRO879 PRO879PRO879 PRO879 PRO879 0.10% 1.00% 1.00%0.10% 1.00% 1.00% 101.0 55.0 66.0101.0 55.0 66.0 PRO882 PRO882 PRO882PRO882 PRO882 PRO882 0.01% 0.10% 1.00%0.01% 0.10% 1.00% 96.0 86.0 70.096.0 86.0 70.0 PRO885 PRO885 PRO885PRO885 PRO885 PRO885 0.01% 0.10% 1.00%0.01% 0.10% 1.00% 100.0 93.0 64.0100.0 93.0 64.0

실시예 12: 내피세포에 있어서의 c-fos 유도 (검정 34)Example 12 c-fos induction in endothelial cells (assay 34)

이 검정법은 PRO 폴리펩티드가 내피세포의 c-fos를 유도하는 능력이 있는지를 측정하기 위해 고안된 것이다. 이 검정에서 양성으로 확인된 PRO 폴리펩티드는 예를 들어, 창상 치유 등을 비롯한 혈관신생이 유리한 증상 또는 질환의 치료에 유용할 것으로 기대된다 (이들 PRO 폴리펩티드의 아고니스트도 마찬가지임). 이 검 정에서 양성으로 확인된 PRO 폴리펩티드의 길항제는 악성 종양의 치료에 유용할 것으로 기대된다.This assay is designed to determine whether a PRO polypeptide is capable of inducing endothelial c-fos. PRO polypeptides identified as positive in this assay are expected to be useful in the treatment of symptoms or diseases in which angiogenesis is beneficial, including, for example, wound healing (as is the agonist of these PRO polypeptides). Antagonists of PRO polypeptides positively identified in this assay are expected to be useful for the treatment of malignant tumors.

증식 배지 (GHT가 없는 50% Ham's F12: 낮은 농도의 포도당, 및 글리신이 없는 50% DMEM: NaHCO₃, 1% 글루타민, 10mM HEPES, 10% PBS, 10 ng/ml bFGF를 포함함) 중의 인간의 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)를 1×10⁴의 세포 밀도로 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅한 다음날, 증식 배지를 제거함으로써 세포에게 영양분을 공급하지 않고, 세포를 웰 당 100㎕의 시험 샘플 및 대조구 (양성 대조구: 증식 배지; 음성 대조구: 10mM HEPES, 140mM NaCl, 4%(w/v) 만니톨, pH 6.8)로 처리하였다. 이 세포를 37℃, 5% CO₂ 하에서 30분 동안 배양하였다. 샘플을 제거하고, 하기 기재된 시약/완충액을 입수할 수 있는 bDNA 키트의 프로토콜 (Chiron Diagnostics, 카탈로그 번호 6005-037)의 1부에 기재된 방법을 수행하였다.Human in growth medium (50% Ham's F12 without GHT: low concentrations of glucose, and 50% DMEM without glycine: NaHCO ₃ , 1% glutamine, 10 mM HEPES, 10% PBS, 10 ng / ml bFGF) Umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Cell Systems) were plated on 96-well microtiter plates at a cell density of 1 × 10 ⁴ . The day after plating, cells were cultured without removing the proliferation medium, and cells were transferred to 100 μl of test sample and control (positive control: proliferation medium; negative control: 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 4% (w / w). v) mannitol, pH 6.8). The cells were incubated at 37 ° C., 5% CO _{2 for} 30 minutes. The sample was removed and the method described in part 1 of the protocol of the bDNA kit (Chiron Diagnostics, Cat. No. 6005-037) where the reagents / buffers described below were available.

간략히 설명하면, 시험에 필요한 TM 용해 완충액 및 프로브의 양을 제조자에 의해 제공되는 정보를 기초로 계산하였다. 적당한 양의 해동된 프로브를 TM 용해 완충액에 첨가하였다. 캡쳐 혼성화 완충액 (Capture Hybridization Buffer)을 실온까지 가온하였다. bDNA 스트립을 금속 스트립 홀더에 설치하고, 100㎕의 캡쳐 혼성화 완충액을 필요한 각 b-DNA 웰에 첨가한 후 30분 이상 동안 인큐베이션하였다. 세포를 함유하는 시험 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 진공 매니폴드를 사용하여 배지를 서서히 제거하였다. 프로브가 함유된 100㎕의 용해 혼성화 완충 액을 피펫으로 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 빠르게 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 마이크로타이터 어댑터 헤드가 장착된 볼텍스 혼합기 위에 놓고, #2로 설정한 상태에서 1분 동안 볼텍싱하였다. 80㎕의 용해물을 분취하여 캡쳐 혼성화 완충액을 함유하는 bDNA 웰에 첨가한 후, 피펫을 사용하여 위와 아래를 잘 혼합하였다. 이 플레이트를 53℃에서 16시간 이상 동안 인큐베이션하였다.Briefly, the amount of TM lysis buffer and probe required for the test was calculated based on the information provided by the manufacturer. Appropriate amount of thawed probe was added to TM Lysis Buffer. Capture Hybridization Buffer was warmed to room temperature. bDNA strips were placed in a metal strip holder and 100 μl of capture hybridization buffer was added to each required b-DNA well and incubated for at least 30 minutes. After the test plate containing the cells was removed from the incubator, the medium was slowly removed using a vacuum manifold. 100 μl of lysis hybridization buffer containing probes was quickly added to each well of the microtiter plate by pipette. The plate was then incubated at 55 ° C. for 15 minutes. The plate was removed from the incubator and placed on a vortex mixer equipped with a microtiter adapter head and vortexed for 1 minute while set to # 2. 80 μl of lysate was aliquoted and added to the bDNA wells containing the capture hybridization buffer, and then the pipette was mixed well up and down. This plate was incubated at 53 ° C. for at least 16 hours.

그 다음날, bDNA 키트 프로토콜의 2부에 기재된 방법을 수행하였다. 구체적으로, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 벤치 위에 놓고 10분 동안 냉각시켰다. 필요한 첨가물의 부피는 제조자에 의해 제공되는 정보를 기초로 계산하였다. 증폭 농축물을 AL 혼성화 완충액으로 1:100 희석하여 증폭 워킹 용액 (Amplifier Working Solution)을 제조하였다. 혼성화 혼합물을 상기 플레이트로부터 제거하고 워시 (Wash) A로 2회 세척하였다. 50㎕의 증폭 워킹 용액을 각 웰에 첨가하고, 각 웰을 53℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 10분 동안 냉각시켰다. 표지 농축물 (40 pmole/마리)을 AL 혼성화 완충액으로 1:100 희석하여 표지 프로브 워킹 용액 (Label Probe Working Solution)을 제조하였다. 10분간 냉각시킨 후, 증폭 혼성화 혼합물을 제거하고, 이 플레이트를 워시 A로 2회 세척하였다. 50㎕의 표지 프로브 워킹 용액을 각 웰에 첨가하고, 각 웰을 53℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 10분 동안 냉각시킨 후, 기질 (Substrate)을 실온까지 가온하였다. 3 ㎕의 기질 증진제 (Substrate Enhancer)를 검정에 필요한 각 기질 1 ml에 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 냉각시킨 후, 표지 혼성화 혼합물을 제거하고, 이 플레이트를 워시 A로 2회, 그리고 워시 D로 3회 세척하였다. 증진제가 포함된 50㎕의 기질 용액을 각 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 적당한 조도계 (Luminometer)에서 RLU를 판독하였다.The next day, the method described in part 2 of the bDNA kit protocol was performed. Specifically, the plate was removed from the incubator and placed on a bench and allowed to cool for 10 minutes. The required volume of additive was calculated based on the information provided by the manufacturer. The amplification concentrate was diluted 1: 100 with AL hybridization buffer to prepare an Amplifier Working Solution. Hybridization mixture was removed from the plate and washed twice with Wash A. 50 μl of amplification working solution was added to each well and each well was incubated at 53 ° C. for 30 minutes. The plate was then removed from the incubator and then cooled for 10 minutes. Label Probe Working Solution was prepared by diluting the label concentrate (40 pmole / mari) 1: 100 with AL hybridization buffer. After cooling for 10 minutes, the amplification hybridization mixture was removed and the plate was washed twice with Wash A. 50 μl of labeled probe working solution was added to each well and each well was incubated at 53 ° C. for 15 minutes. After cooling for 10 minutes, the substrate was allowed to warm to room temperature. 3 μl Substrate Enhancer is added to 1 ml of each substrate required for the assay, the plates are allowed to cool for 10 minutes, then the label hybridization mixture is removed and the plates are washed twice with Wash A, and with Wash D. Wash three times. 50 μl of substrate solution with enhancer was added to each well. The plate was incubated at 37 ° C. for 30 minutes and the RLU was read on a suitable Luminometer.

2회 측정하여 평균을 내고, 편차 상수를 결정하였다. 음성 대조구 (상기 기재된 바와 같은 HEPES 완충액)의 값보다 증가된 것으로 측정된 활성은 화학발광 단위 (RLU)로 나타내었다. 그 결과는 하기 표 6에 기재하였고, PRO 폴리펩티드가 음성 대조구보다 2배 이상의 값을 나타낸다면 양성으로 간주하였다. 음성 대조구 = 1.00% 희석시 1.00 RLU, 양성 대조구 = 1.00% 희석시 8.39 RLU.Two measurements were taken and averaged to determine the deviation constant. Activity measured as increased above the value of the negative control (HEPES buffer as described above) is expressed in chemiluminescent units (RLU). The results are shown in Table 6 below, and were considered positive if the PRO polypeptide showed a value two or more times greater than the negative control. Negative control = 1.00 RLU at 1.00% dilution, positive control = 8.39 RLU at 1.00% dilution.

<표 6>TABLE 6

실시예 13: F2a에 의해 유도된 신생아의 심비대증의 악화Example 13: Exacerbation of Cardiac Hypertrophy in Newborns Induced by F2a

이 검정법은 신생아의 심비대증을 자극하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다. 이 검정에서 양성으로 확인된 PRO 폴리펩티드는 다양한 심부전 질환의 치료에 유용할 것으로 기대된다. This assay is designed to measure the ability of PRO polypeptides to stimulate cardiac hypertrophy in newborns. PRO polypeptides identified as positive in this assay are expected to be useful for the treatment of various heart failure diseases.

1일된 할란 스프라그 돌리 래트 (Harlan Sprague Dawley rat)로부터 심근세포를 수득하였다. 1일째에 세포(7.5×10⁴/ml의 밀도, 180㎕, 혈청<0.1%, 새로이 단리됨)를 DMEM/F12+4% FCS로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 1일째, 시험 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플 (20 ㎕/웰)을 상기 웰에 직접 첨가하였다. 그 다음으로, 2일째 날에 PGF (20 ㎕/웰)를 10^-6 M의 최종 농도까지 첨가하였다. 그 다음으로, 4일째 날에 상기 세포를 염색하고 5일째 날에 가시적으로 관찰하여 기록하였다. 가시적인 스코어는 세포 크기를 기초로 한 것인데, 여기서 음성 대조구와 비교할 때 크기가 증가되지 않은 세포는 0.0으로 기록하고, 음성 대조구와 비교할 때 크기의 증가가 작거나 중간정도인 세포는 1.0으로 기록하였고, 음성 대조구와 비교할 때 크기의 증가가 큰 세포는 2.0으로 기록하였다. 1.0 이상의 스코어는 양성으로 간주하였다.Cardiomyocytes were obtained from Harlan Sprague Dawley rats, 1 day old. On day 1 cells (density of 7.5 × 10 ⁴ / ml, 180 μl, serum <0.1%, freshly isolated) were added to 96-well plates precoated with DMEM / F12 + 4% FCS. On day 1, a test sample (20 μl / well) containing the test PRO polypeptide was added directly to the wells. Then, on day 2, PGF (20 μl / well) was added to a final concentration of 10 ⁻⁶ M. Next, the cells were stained on day 4 and visually recorded on day 5. Visible scores are based on cell size, where cells that did not increase in size were recorded as 0.0 compared to negative controls, and cells with small or medium increases in size as 1.0 compared to negative controls. In comparison with the negative control, cells with large increase in size were recorded as 2.0. Scores of 1.0 or greater were considered positive.

칼슘 농도가 검정 반응에 결정적이기 때문에 PBS를 포함시키지 않았다. 플레이트를 DMEM/F12 + 4% FCS (200 ㎕/웰)로 코팅하였다. 검정 배지에는 DMEM/F12 (2.44 mg의 중탄산염이 포함되어 있음), 10 ㎍/ml의 트랜스페린, 1 ㎍/ml의 인슐린, 1 ㎍/ml의 아프로티닌, 2 mmol/L의 글루타민, 100 U/ml의 페니실린 G, 100 ㎍ /ml의 스트렙토마이신이 포함되어 있다. 만니톨 (4%)을 함유하는 단백질 완충액은 1/10 (0.4%) 및 1/100 (0.04%)에서 양성 신호 (스코어 3.5)를 나타내었으나, 1/1000 (0.004%)에서는 나타내지 않았다. 그러므로, 만니톨을 함유하는 시험 샘플 완충액은 시험하지 않았다. PRO205, PRO882 및 PRO887 폴리펩티드가 이 검정에서 양성이었다.PBS was not included because calcium concentration is critical for the assay reaction. Plates were coated with DMEM / F12 + 4% FCS (200 μl / well). Assay medium contains DMEM / F12 (containing 2.44 mg bicarbonate), 10 μg / ml transferrin, 1 μg / ml insulin, 1 μg / ml aprotinin, 2 mmol / L glutamine, 100 U / ml Penicillin G, 100 ㎍ / ml of streptomycin is included. Protein buffer containing mannitol (4%) showed a positive signal (score 3.5) at 1/10 (0.4%) and 1/100 (0.04%), but not at 1/1000 (0.004%). Therefore, test sample buffers containing mannitol were not tested. PRO205, PRO882 and PRO887 polypeptides were positive in this assay.

실시예 14: 성인 심비대증의 억제 (검정 42)Example 14 Inhibition of Adult Cardiac Hypertrophy (Test 42)

이 검정은 성인 심비대증의 억제를 측정하기 위해 고안되었다. 이 검정에서 양성으로 확인된 PRO 폴리펩티드는 심비대증과 관련된 심장 질환의 치료에 유용할 수 있다.This assay is designed to measure the inhibition of adult cardiac hypertrophy. PRO polypeptides identified as positive in this assay may be useful for the treatment of heart disease associated with cardiac hypertrophy.

심실 근세포를 성숙 할란 스프라그 돌리 래트 (250 g)로부터 새롭게 단리하고, 이 세포 180 ㎕를 플레이팅하였다 (2000/웰). 2일째 날에, 시험 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플 (20 ㎕)을 첨가하였다. 5일째, 상기 세포를 고정한 후 염색하였다. 세포의 ANP 메세지 증가를 수시간 후 PCR로 측정할 수도 있다. 결과는 세포 크기의 가시적 스코어를 기초로 한 것이다: 0 = 억제 없음, -1 = 약간 억제함, -2 = 강하게 억제함. 0 이하의 스코어를 양상으로 간주한다. 활성 기준은 양성 대조구인 0.1 mM의 페닐레프린 (PE)의 활성에 상응한다. 검정 배지에는 M199 (변형된 것-글루타민 없음), NaHCO₃, 페놀 레드, 100 nM 인슐린으로 보충됨, 0.2%의 BSA, 5 mM 크레아틴, 2 mM L-카르니틴, 5 mM 타우린, 100 U/ml의 페니실린 G, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 (CCT 배지)이 포함되어 있다. 96 웰 플레이트에서 60개의 내부 웰만을 사용하였다. 이들 중 6개의 웰을 음성 및 양성 (PE) 대조구로 사용하였다. Ventricular myocytes were freshly isolated from mature Harlan Sprague Dawley rats (250 g) and 180 μl of these cells were plated (2000 / well). On day 2, a test sample (20 μl) containing the test PRO polypeptide was added. On day 5, the cells were fixed and stained. The increase in ANP message of the cells can also be measured by PCR after several hours. The results are based on the visible score of cell size: 0 = no inhibition, -1 = slightly inhibited, -2 = strongly inhibited. Scores of 0 or less are considered aspects. The activity criterion corresponds to the activity of 0.1 mM phenylephrine (PE), a positive control. Assay medium contained M199 (modified-no glutamine), NaHCO ₃ , phenol red, supplemented with 100 nM insulin, 0.2% BSA, 5 mM creatine, 2 mM L-carnitine, 5 mM taurine, 100 U / ml Penicillin G, 100 μg / ml streptomycin (CCT medium) is included. Only 60 internal wells were used in a 96 well plate. Six of these wells were used as negative and positive (PE) controls.

PRO878 폴리펩티드는 상기 검정에서 0 미만의 스코어를 나타내었다.PRO878 polypeptide showed a score below 0 in this assay.

실시예 15: 내피세포 아폽토시스의 유도 (검정 73)Example 15: Induction of endothelial cell apoptosis (assay 73)

내피세포의 아폽토시스를 유도하는 PRO 폴리펩티드의 능역을 인간 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)에서 시험하였다. 이 검정에서 양성은 내피세포의 아폽토시스의 유도가 유리한 혈관 질환 뿐만 아니라 종양을 치료하는 데 있어서 폴리펩티드의 유용함을 나타낸다. The ability of PRO polypeptides to induce apoptosis of endothelial cells was tested in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Cell Systems). Positive in this assay indicates the utility of the polypeptide in treating tumors as well as vascular disease in which induction of apoptosis of endothelial cells is beneficial.

100 ng/ml의 VEGF로 보충된 0% 혈청 배지가 든 96-웰 포맷을 사용하여 내피세포의 아폽토시스를 유도하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 인간 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)에서 시험하였다 (HUVEC 세포는 플레이팅 표면으로부터 쉽게 떨어지기 때문에 웰에서 하는 모든 피펫팅은 가능한 약하게 해애 함).The ability of the PRO polypeptide to induce endothelial apoptosis using a 96-well format with 0% serum medium supplemented with 100 ng / ml VEGF was tested in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Cell Systems) (HUVEC Since cells are easily separated from the plating surface, all pipetting done in the well is as weak as possible).

배지를 흡입하여 제거하고 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 1 x 트립신 5 ml를 T-175 플라스크내의 상기 세포에 첨가하고, 이들 세포가 플레이트로부터 떨어질 때까지 (약 5-10분) 세포를 방치한다. 5 ml의 증식 배지를 첨가하여 트립신 작용을 중지시켰다. 이 세포를 4℃, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 배지를 제거하고, 세포를 10% 혈청이 든 배지 10 ml (Cell System, 1 x 페니실린/스트렙토마이신을 함유함)에 재현탁시켰다.The medium was aspirated off and the cells washed once with PBS. 5 ml of 1 x trypsin is added to the cells in the T-175 flask and the cells are left until these cells are removed from the plate (about 5-10 minutes). 5 ml of growth medium was added to stop the trypsin action. The cells were centrifuged at 4 ° C., 1000 rpm for 5 minutes. The medium was removed and cells were resuspended in 10 ml of medium with 10% serum (containing Cell System, 1 × penicillin / streptomycin).

세포를 총 부피가 100 ㎕ (밀도 2 x 10⁴ 세포/웰)가 되도록 10% 혈청 (CSG- 배지, Cell System)이 함유된 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Amersham Life Science, cytostar-T Scintillating microplate, RPNG160, 멸균되고, 조직 배양 처리되고, 개별적으로 포장됨) 상에 플레이팅하였다. 시험 폴리펩티드 샘플 각각을 한 샘플당 1%, 0.33% 및 0.11%로 3번 희석하여 첨가하였다. 세포가 없는 웰을 블랭크로 사용하고, 세포만을 함유하는 웰을 음성 대조구로 사용하였다. 50 ㎕의 3 x 스타우로스포린 원액을 1:3으로 연속 희석하여 양성 대조구로 사용하였다. 아폽토시스를 유도하는 시험 PRO 폴리펩티드의 능력은 아폽토시스를 검출하는 칼슘 및 인지질 결합 단백질의 구성원인 아넥신-V를 사용하여 측정하였다. 96-well microtiter plate (Amersham Life Science, cytostar-T Scintillating microplate) containing 10% serum (CSG-media, Cell System) so that cells have a total volume of 100 μl (density 2 × 10 ⁴ cells / well) , RPNG160, sterile, tissue cultured and individually packaged). Each test polypeptide sample was added three times diluted to 1%, 0.33% and 0.11% per sample. Wells without cells were used as blanks and wells containing only cells were used as negative controls. 50 μl of 3 × staurosporin stock was serially diluted 1: 3 to serve as a positive control. The ability of the test PRO polypeptide to induce apoptosis was measured using Annexin-V, a member of the calcium and phospholipid binding proteins to detect apoptosis.

0.2 ml의 아넥신 V - 바이오틴 원액 용액 (100 ㎍/ml)을 4.6 ml의 2 x Ca²⁺ 결합 완충액 및 2.5% BSA (1 : 25로 희석된 것)로 희석하였다. 희석된 아넥신 V - 바이오틴 용액 50 ㎕를 최종 농도가 1.0 ㎍/ml가 되도록 각 웰에 첨가하였다 (대조구는 제외시킴). 이 샘플을 아넥신-바이오틴과 함께 10 내지 15분 동안 인큐베이션한 후, ³⁵S-스트렙타비딘을 직접 첨가하였다. ³⁵S-스트렙타비딘을 2 x Ca²⁺ 결합 완충액 및 2.5% BSA로 희석하고, 최종 농도가 3 x 10⁴ cpm/웰이 되도록 모든 웰에 첨가하였다. 그 다음으로, 상기 플레이트를 봉합하고, 1000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 2시간 동안 궤도 진탕기 상에 놓았다. 1450 마이크로베타 트릴룩스 (Microbeta Trilux, Wallac) 상에서 분석하였다. 결과를 표 7에 나타내었는데, 여기서 배경률은 음성 대조구의 분당 카운트 양 (%)을 나타낸다. 배경률보다 30% 이상 높은 것은 양성으로 간주하였다.0.2 ml of Annexin V-biotin stock solution (100 μg / ml) was diluted with 4.6 ml of 2 × Ca ²⁺ binding buffer and 2.5% BSA (diluted 1:25). 50 μl of diluted Annexin V-Biotin solution was added to each well to a final concentration of 1.0 μg / ml (excluding control). This sample was incubated with Annexin-Biotin for 10-15 minutes, then ³⁵ S-streptavidin was added directly. ³⁵ S-streptavidin was diluted with 2 × Ca ²⁺ binding buffer and 2.5% BSA and added to all wells to a final concentration of 3 × 10 ⁴ cpm / well. The plates were then sutured, centrifuged at 1000 rpm for 15 minutes and placed on an orbital shaker for 2 hours. Analysis was performed on 1450 Microbeta Trilux, Wallac. The results are shown in Table 7, where the background rate represents the amount of counts per minute of the negative control (%). More than 30% higher than the background rate was considered positive.

PRO333, PRO364 및 PRO879는 상기 기재된 검정에서 양성 결과를 나타내엇다.PRO333, PRO364 and PRO879 showed positive results in the assay described above.

<표 7>TABLE 7

내피세포 아폽토시스의 유도Induction of Endothelial Apoptosis PRO 명칭PRO name PRO 농도PRO concentration 배경률Background rate PRO333PRO333 0.11%0.11% 61.7%61.7% PRO333PRO333 0.33%0.33% 37.6%37.6% PRO364PRO364 2.99 nM2.99 nM 19.3%19.3% PRO364PRO364 8.99 nM8.99 nM 6.9%6.9% PRO364PRO364 27.23 nM27.23 nM 31.5%31.5% PRO879PRO879 1.00%1.00% 64.2%64.2% PRO879PRO879 0.11%0.11% 65.5%65.5% PRO879PRO879 0.33%0.33% 14.7%14.7%

실시예 16: LIF + 엔도텔린-1 (ET-1)에 의해 유도된 신생아 심비대증의 억제 (검정 74) Example 16: Inhibition of Neonatal Cardiac Hypertrophy Induced by LIF + Endothelin-1 (ET-1) (Test 74)

이 검정은 본 발명의 PRO 폴리펩티드가 LIF 및 엔도텔린-1 (ET-1)에 의해 유도된 신생아 심비대증을 억제하는 능력을 나타내는지를 알아보기 위한 것이다. 본 검정에서 양성 반응을 보이는 시험 화합물은 원하지 않는 심근비대증을 특징으로 하거나 상기 심근비대증과 관련된 심부전 질환 및 장애의 치료에 유용할 것이다. This assay is to determine whether the PRO polypeptides of the present invention exhibit the ability to inhibit neonatal cardiac hypertrophy induced by LIF and endothelin-1 (ET-1). Test compounds that test positive in this assay will be useful for the treatment of heart failure diseases and disorders characterized by or associated with undesired myocardial hypertrophy.

1일 된 할란 스프라그 돌리 래트의 심근세포 (7.5 x 10⁴/ml 농도의 180 ㎕, 혈청 < 0.1, 새로 단리함)를 1일째에 DMEM/F12 + 4% FCS으로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 그 다음으로, 2일째 된 날에 20 ㎕ 부피의 시험 PRO 폴리펩티드 샘플 또는 증식 배지만 (음성 대조구)을 상기 웰에 직접 첨가하였다. 이어서, 3일째 날에 LIF + ET-1을 상기 웰에 첨가하였다. 세포를 2일 동안 배양한 후 염색하고, 이어서 그 다음날에 가시적으로 스코어를 기록하였다. 이 검정에서 PRO 폴리펩티드로 처리된 근세포가 비처리된 근세포보다 눈으로 관찰시 평균적으로 더 작거나 그 수가 더 적으면 양성으로 기록하였다. PRO238 및 PRO1760 폴리펩티드가 이 검정에서 양성 반응을 나타내었다. Cardiomyocytes (180 μl at 7.5 × 10 ⁴ / ml concentration, serum <0.1, freshly isolated) from 1 day old Harlan Sprague Dawley rats were pre-coated with DMEM / F12 + 4% FCS on day 1 96-well plate Was added. Next, on day 2, a 20 μl volume of test PRO polypeptide sample or propagation medium (negative control) was added directly to the wells. Then on day 3 LIF + ET-1 was added to the wells. Cells were incubated for 2 days and then stained, and then scored visually the next day. In this assay, if the myocytes treated with the PRO polypeptide were smaller or fewer in average on visual observation than untreated myocytes, they were positive. PRO238 and PRO1760 polypeptides tested positive in this assay.

실시예 17: 내피관 형성 - 스프라우트 (Sprout) 형성의 자극 (검정 86)Example 17 Endothelial Tube Formation-Stimulation of Sprout Formation (Test 86)

이 검정은 PRO 폴리펩티드가 외인성 증식 인자의 부재하에 내피세포의 액포 및 루멘 형성을 촉진하는 능력을 보이는지를 알아보기 위한 것이다. 이 검정에서 양성 반응을 보이는 PRO 폴리펩티드는 예컨대, 세포흡수작용 (pinocytosis), 이온 펌핑, 관 투과성 및(또는) 연접 (Junction) 형성의 자극이 유리한 경우를 비롯하여 내피세포의 액포 및(또는) 루멘 형성이 유리한 질환의 치료에 유용할 것으로 기대된다. This assay is to determine whether the PRO polypeptide exhibits the ability to promote vacuole and lumen formation of endothelial cells in the absence of exogenous growth factors. PRO polypeptides that test positive in this assay are vesicular and / or lumen formation of endothelial cells, including, for example, stimulation of pinocytosis, ion pumping, vascular permeability, and / or junction formation. It is expected to be useful for the treatment of this favorable disease.

HUVEC 세포 (패시지 < 일차 배양으로부터 8차 배양)를 ml당 6 x 10⁵ 세포 밀도로 타입 I 래트 꼬리 콜라겐과 혼합하고 (최종 농도 2.6 mg/ml), PRO 폴리펩티드의 존재하에 세포가 형성되는 동안에 액포를 염색하기 위해, 1 μM의 6-FAM-FITC 염료 및 1% FBS가 함유된 M199 배양 배지를 웰당 50 ㎕씩 플레이팅하였다. 그 다음으로, 이 세포를 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 실온에서 3.7%의 포르말린으로 10분 동안 고정시키고, M199 배지로 5회 세척한 후, 4℃에서 밤새동안 Rh-팔로이딘으로 염색하고, 이어서 4 μM의 DAPI로 핵을 염색하였다. 이 검정에서 양성 결과는 2 이하이다 [1 = 세포가 모두 원형, 2 = 세포가 길어짐, 3= 세포가 일부 연결된 튜브를 형성함, 4 = 세포가 복합 관상 네트워크를 형성함].HUVEC cells (passage <primary culture from primary culture) are mixed with type I rat tail collagen at 6 x 10 ⁵ cell density per ml (final concentration 2.6 mg / ml) and vacuoles during cell formation in the presence of PRO polypeptide. To stain, 50 μl per well of M199 culture medium containing 1 μM of 6-FAM-FITC dye and 1% FBS was plated. The cells were then incubated at 37 ° C., 5% CO ₂ for 48 hours, fixed at room temperature with 3.7% formalin for 10 minutes, washed 5 times with M199 medium and then Rh- overnight at 4 ° C. Staining with paloidine was followed by nuclei staining with 4 μM of DAPI. Positive results in this assay were 2 or less [1 = cells all round, 2 = cells longer, 3 = cells formed some connected tubes, 4 = cells formed complex coronary networks].

이 검정에서 PRO179 폴리펩티드가 양성 반응을 보였다.PRO179 polypeptide was positive in this assay.

실시예 18: 내피세포 아폽토시스의 유도 (ELISA) (검정 109)Example 18: Induction of Endothelial Cell Apoptosis (ELISA) (assay 109)

96-웰 포맷을 사용하여, 100 ng/ml의 VEGF, 0.1% BSA, 1X 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 0% 혈청 배지 중의 인간 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)에서 PRO 폴리펩티드가 내피세포의 아폽토시스를 유도하는 능력을 시험하였다. 이 검정에 있어서의 양성 결과는 폴리펩티드가 예를 들어, 종양 증식의 억제를 비롯하여 원하지 않는 내피세포 증식과 관련된 다양한 임의의 증상을 치료하는 데 유용하다는 것을 나타낸다. 사용된 96-웰 플레이트는 팔콘사 (Falcon, No.3072)에서 제조하였다. 96-웰 플레이트의 코팅은 PBS 용액 중의 0.2% 젤라틴 100 ㎕로 30분이 넘게 젤라틴화가 일어나도록 함으로써 제조하였다. 젤라틴 혼합물을 흡입 제거한 후, 최종 농도가 2×10⁴세포/ml가 되도록 HUVE 세포(웰당 100㎕ 부피)를 10% 혈청 함유 배지에 플레이팅하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 원하는 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플을 첨가하였다.Using a 96-well format, PRO polypeptide was expressed in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Cell Systems) in 0% serum medium supplemented with 100 ng / ml of VEGF, 0.1% BSA, 1X penicillin / streptomycin. The ability to induce apoptosis was tested. Positive results in this assay indicate that the polypeptide is useful for treating any of a variety of symptoms associated with unwanted endothelial cell proliferation, including, for example, inhibition of tumor proliferation. The 96-well plates used were prepared by Falcon (No.3072). Coatings of 96-well plates were prepared by allowing gelatinization to occur for more than 30 minutes with 100 μl of 0.2% gelatin in PBS solution. After aspirating off the gelatin mixture, HUVE cells (100 μl volume per well) were plated in 10% serum containing medium so that the final concentration was 2 × 10 ⁴ cells / ml. After incubating the cells for 24 hours, a test sample containing the desired PRO polypeptide was added.

100 ng/ml의 VEGF, 0.1% BSA, 1X 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 0% 혈청 배지 (Cell Systems) 100㎕를 모든 웰에 첨가하였다. PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플을 3개의 희석액 (1%, 0.33% 및 0.11%)에 첨가하였다. 세포가 없는 웰을 블랭크로 사용하고, 세포만 있는 웰을 음성 대조구로 사용하였다. 양성 대조구로서 스타우로스포린 3 X 원액 50 ㎕의 1:3 연속 희석액을 사용하였다. 세포를 24 내지 35시간 동안 배양한 후 ELISA를 수행하였다.100 μl of 0% serum medium (Cell Systems) supplemented with 100 ng / ml VEGF, 0.1% BSA, 1 × penicillin / streptomycin was added to all wells. Test samples containing PRO polypeptide were added to three dilutions (1%, 0.33% and 0.11%). Cell-free wells were used as blanks and cells-only wells were used as negative controls. As a positive control, 50 μl of staurosporin 3 × stock solution was used as a 1: 3 serial dilution. After incubating the cells for 24 to 35 hours, ELISA was performed.

베링거 매뉴얼 [Boehringer, 세포 사멸 검출 ELISA 플러스, 카탈로그 번호 1 920 685]에 따라 용액을 제조하여 아폽토시스의 정도를 측정하기 위해 ELISA를 이용하였다. 샘플 제조 : 96 웰 플레이트를 1000 rpm (200g)으로 10분 동안 원심분리하고, 신속히 거꾸로 뒤집어 상등액을 제거한 후, 종이 타올 위에 플레이트를 거꾸로 뒤집은 상태로 방치하여 나머지 상등액을 제가하였다. 200 ㎕의 1X 용해 완충액을 각각의 웰에 첨가하고, 진탕시키지 않으면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 20 ㎕의 용해액 (세포질 분획)을 스트렙타비딘으로 코팅된 MTP로 옮겼다. 80 ㎕의 면역시약 혼합물을 각 웰내의 20 ㎕ 용해액에 첨가하였다. 상기 MTP를 접착성 호일로 덮은 후, 궤도 진탕기 (200 rpm) 위에 놓고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 흡입하여 상층액을 제거하고, 각 웰당 250 ㎕의 1X 인큐베이션 완충액을 사용하여 웰을 3회 세척하였다 (상기 완충액은 흡입에 의해 제거됨). 기질 용액 (100 ㎕)을 각 웰에 첨가하고, 발색이 분광 분석에 충분할 때까지 (대략 10 내지 20분 후) 250 rpm, 실온의 궤도 진탕기에서 인큐베이션하였다. 96 웰 판독기를 사용하여 492 nm를 기준 파장으로 405 nm에서 판독하였다. PIN32 (대조구 완충액)에 대해 얻어진 값을 100%로 설정하였다. 130%를 초과하는 샘플을 아폽토시스 유도에 대한 양성 반응으로 간주하였다. 이 검정에서 PRO846 및 PRO844 폴리펩티드가 양성으로 나타났다.The solution was prepared according to the Boehringer manual (Boehringer, Cell Death Detection ELISA Plus, Cat. No. 1 920 685) and ELISA was used to measure the degree of apoptosis. Sample Preparation: The 96 well plate was centrifuged at 1000 rpm (200 g) for 10 minutes, quickly reversed to remove the supernatant, and the plate was left upside down on a paper towel to remove the remaining supernatant. 200 μl of 1 × Lysis Buffer was added to each well and incubated for 30 minutes at room temperature without shaking. Plates were centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes and 20 μl of lysate (cytoplasmic fraction) was transferred to streptavidin-coated MTP. 80 μl of the immunoreagent mixture was added to 20 μl lysate in each well. The MTP was covered with adhesive foil, then placed on an orbital shaker (200 rpm) and incubated for 2 hours at room temperature. After 2 hours, the supernatant was aspirated to remove and the wells were washed three times using 250 μl 1 × incubation buffer per well (the buffer was removed by aspiration). Substrate solution (100 μl) was added to each well and incubated on a 250 rpm, room temperature shaker until color development was sufficient for spectroscopic analysis (after approximately 10-20 minutes). 492 nm was read at 405 nm as a reference wavelength using a 96 well reader. The value obtained for PIN32 (control buffer) was set to 100%. More than 130% of samples were considered positive for induction of apoptosis. PRO846 and PRO844 polypeptides were positive in this assay.

실시예 19: 제자리 혼성화 (Example 19: In Situ Hybridization ( In situIn situ Hybridization) Hybridization)

제자리 혼성화는 세포 및 조직 표본 내의 핵산 서열을 검출하고 위치를 파악하게 하는 강력한 다용도 기술이다. 예를 들어, 유전자 발현 부위의 확인, 전사체 의 조직 분포 분석, 바이러스 감염의 확인 및 감염 위치의 파악, 특정 mRNA 합성에 있어서의 변화, 및 염색체 맴핑의 보조에 유용할 수 있다.In situ hybridization is a powerful and versatile technique that enables the detection and localization of nucleic acid sequences in cell and tissue samples. For example, it may be useful for identification of gene expression sites, analysis of tissue distribution of transcripts, identification of viral infections and identification of infection sites, changes in specific mRNA synthesis, and assistance in chromosomal mapping.

PCR로 얻은 ³³P-표지된 리보프로브를 사용하여 문헌 (Lu and Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994))의 프로토콜의 최적화된 버전에 따라 제자리 혼성화를 수행하였다. 요컨대, 포르말린에 의해 고정되어 파라핀에 파묻힌 인간 조직을 절단하고, 파라핀을 제거한 후, 37℃에서 15분 동안 단백질 분해효소 K (20 g/ml)로 단백질을 제거하고, 제자리 혼성화를 위해 상기 문헌 (Lu and Gillett)에 기재된 바와 같이 더 처리하였다. PCR 산물로부터 [³³P]-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 얻고 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 상기 슬라이드를 코닥 (Kodak) NTB2 (상표명) 핵 트랙 에멀젼 (nuclear track emulsion)에 담그고 4주 동안 노출시켰다.In situ hybridization was performed using ³³ P-labeled riboprobes obtained by PCR according to an optimized version of the protocol of Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994). In short, human tissues immobilized in formalin and embedded in paraffin were cleaved, paraffin removed, and proteins removed with protease K (20 g / ml) for 15 minutes at 37 ° C., and in situ hybridization (see Further treatment as described in Lu and Gillett). Antisense riboprobe labeled with [ ³³ P] -UTP was obtained from the PCR product and hybridized overnight at 55 ° C. The slides were immersed in Kodak NTB2 ™ nuclear track emulsion and exposed for 4 weeks.

<³³P-리보프로브 합성>< ³³ P-riboprobe synthesis>

³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mmol) 6.0 ㎕ (125 mCi)를 고속 진공기 (speed vacuum)하에서 건조시켰다. 하기 성분을 건조된 ³³P-UTP가 포함된 각 튜브에 첨가하였다:6.0 μl (125 mCi) of ³³ P-UTP (Amersham BF 1002, SA <2000 Ci / mmol) was dried under a speed vacuum. The following ingredients were added to each tube containing dried ³³ P-UTP:

2.0㎕ 5x 전사 완충액2.0 μl 5x transcription buffer

1.0㎕ DTT (100mM)1.0 μl DTT (100 mM)

2.0㎕ NTP 혼합물 (2.5mM: 각각 10mM인 GTP, CTP 및 ATP 10㎕ + 10㎕ H₂O)2.0 μl NTP mixture (2.5 mM: 10 μl GTP, CTP and ATP 10 μm each + 10 μl H ₂ O)

1.0㎕ UTP (50μM)1.0 μL UTP (50 μM)

1.0㎕ RNAsin1.0 μL RNAsin

1.0㎕ DNA 주형 (l㎍)1.0 μl DNA template (l μg)

1.0㎕ H₂01.0 μL H ₂ 0

1.0㎕ RNA 중합효소 (PCR 산물의 경우에는 통상 T3 = AS, T7 = S)1.0 μl RNA polymerase (typically T3 = AS, T7 = S for PCR products)

상기 튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 총 1.0㎕의 RQ1 DNase를 첨가한 후, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 총 90㎕의 TE (10mM Tris(pH 7.6) 및 lmM EDTA(pH 8.0))를 첨가하고, 상기 혼합물을 피펫으로 DE81 페이퍼 위에 떨어뜨렸다. 나머지 용액을 마이크로콘 (Microcon)-50 (상표명) 한외여과 유닛에 로딩하고, 프로그램 10을 사용하여 6분 동안 회전시켰다. 이 여과 유닛을 제2 튜브 위에 거꾸로 올려놓고, 프로그램 2를 사용하여 3분 동안 회전시켰다. 최종적으로 회수 회전시키기 전, 총 100㎕의 TE를 첨가하고, 이어서 최종 생성물 1㎕를 피펫으로 DE81 페이퍼 상에 떨어뜨리고, 6ml의 바이오플라워(Bioflour) Ⅱ로 계수하였다.The tube was incubated at 37 ° C. for 1 hour. A total of 1.0 μl of RQ1 DNase was added and then incubated at 37 ° C. for 15 minutes. A total of 90 μl of TE (10 mM Tris (pH 7.6) and lmM EDTA (pH 8.0)) were added and the mixture was pipetted onto the DE81 paper. The remaining solution was loaded into a Microcon-50 ™ ultrafiltration unit and spun for 6 minutes using program 10. This filtration unit was placed upside down on the second tube and spun for 3 minutes using program 2. A total of 100 μl of TE was added before the final recovery rotation, and then 1 μl of the final product was pipetted onto the DE81 paper and counted with 6 ml Bioflour II.

프로브를 TBE/우레아 겔 상에서 전기영동하였다. 1 내지 3㎕의 프로브 또는 5㎕의 RNA Mrk Ⅲ를 3㎕의 로딩 완충액에 첨가하였다. 95℃ 가열 블록 (heat block)에서 3분 동안 가열한 후, 즉시 겔을 얼음 위에 놓았다. 겔의 웰을 세척한 후, 샘플을 로딩하고 180 내지 250 볼트에서 45분 동안 전기영동하였다. 겔을 사란 (SARAN (상표명) 브랜드) 랩으로 싸고, 이를 -70℃ 냉동고에서 1시간 내지 밤새 동안 신호 증강 스크린 (intensifying screen) 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.Probes were electrophoresed on TBE / urea gels. 1-3 μl of probe or 5 μl of RNA Mrk III was added to 3 μl of loading buffer. After 3 minutes of heating in a 95 ° C. heat block, the gel was immediately placed on ice. After washing the wells of the gel, the samples were loaded and electrophoresed for 45 minutes at 180-250 volts. Gels were wrapped in Saran (SARAN ™ brand) wraps and exposed to XAR films on a signal intensifying screen for 1 hour to overnight in a -70 ° C freezer.

<³³ P-혼성화> < ³³ P-hybridization>

A. 동결된 절편의 예비처리A. Pretreatment of Frozen Sections

냉동고로부터 슬라이드를 꺼내 알루미늄 트레이 위에 놓고 실온에서 5분 동안 해동시켰다. 축합을 감소시키기 위해, 상기 트레이를 55℃, 인큐베이터에 5분 동안 놓아 두었다. 슬라이드를 발연 후드 (fume hood)에서 얼음 상 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시키고, 실온에서 0.5 x SSC (25ml 20 x SSC + 975ml SQ H₂O)로 5분 동안 세척하였다. 단백질을 37℃에서 10분 동안 단백질 분해효소 K 0.5 ㎍/ml로 제거한 후 (예열된, RNase가 없는 RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml 원액 12.5㎕), 상기 절편을 실온에서 10분 동안 0.5x SSC로 세척하였다. 이 단편을 70%, 95%, 100% 에탄올에서 각각 2분 동안 탈수하였다.The slides were removed from the freezer and placed on an aluminum tray and thawed at room temperature for 5 minutes. To reduce condensation, the trays were placed in an incubator at 55 ° C. for 5 minutes. Slides were fixed in fume hood for 4 minutes with 4% paraformaldehyde on ice and washed for 5 minutes at 0.5 x SSC (25 ml 20 x SSC + 975 ml SQ H ₂ O) at room temperature. Proteins were removed with 0.5 μg / ml of protease K at 37 ° C. for 10 minutes (12.5 μl of 10 mg / ml stock solution in 250 ml of pre-warmed, RNase-free RNase buffer), and then the sections were washed with 0.5 × SSC for 10 minutes at room temperature. Washed. This fragment was dehydrated in 70%, 95%, 100% ethanol for 2 minutes each.

B. 파라핀에 묻힌 절편의 예비처리B. Pretreatment of sections buried in paraffin

상기 슬라이드로부터 파라핀을 제거하고, SQ H₂O에 놓아 두고 실온에서 2 x SSC로 각각 5분씩 2회 세척하였다. 인간 배아 (embryo) 조직의 경우에는 단백질 분해효소 K (RNase가 없는 RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml 용액 500㎕, 37℃, 15분) 20㎕/ml를 사용하여 절편으로부터 단백질을 제거하고, 포르말린 조직의 경우에는 8x 단백질 분해효소 K (RNase 완충액 250ml 중의 100㎕, 37℃, 30분)를 사용하여 절편으로부터 단백질을 제거하였다. 그 후, 상기 기재된 바와 같이 0.5 x SSC로 세척하고 단백질을 제거하였다.Paraffin was removed from the slides, placed in SQ H ₂ O and washed twice with 2 × SSC for 5 minutes each at room temperature. For human embryo tissue, 20 μl / ml of protease K (500 μl of 10 mg / ml solution in 250 ml of RNase buffer without RNase, 37 ° C., 15 min) was used to remove protein from the sections and formalin tissue. In the case, 8x protease K (100 μl in 250 ml of RNase buffer, 37 ° C., 30 minutes) was used to remove the protein from the sections. Thereafter, washing with 0.5 x SSC as described above and protein was removed.

C. 예비혼성화C. Prehybridization

상기 슬라이드를 박스 (Box) 완충액 (4 x SSC, 50% 포름아미드)으로 포화된 여과지에 의해 구획이 나누어진 플라스틱 상자에 놓았다. 50㎕의 혼성화 완충액 (덱스트란 술페이트 3.75g + SQ H₂O 6ml)을 조직 위에 떨어뜨리고 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2분 동안 마이크로웨이브 오븐에서 가열하였다. 얼음 위에서 냉각시킨 후, 포름아미드 18.75ml, 20x SSC 3.75ml 및 SQ H₂O 9ml를 첨가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.The slides were placed in plastic boxes partitioned by filter paper saturated with Box buffer (4 × SSC, 50% formamide). 50 μl of hybridization buffer (3.75 g dextran sulfate plus 6 ml SQ H ₂ O) was dropped onto the tissue and vortexed and then heated in a microwave oven for 2 minutes with the lid loosened. After cooling on ice, 18.75 ml of formamide, 3.75 ml of 20 × SSC and 9 ml of SQ H ₂ O were added and the tissue was well vortexed and then incubated at 42 ° C. for 1-4 hours.

D. 혼성화D. Hybridization

슬라이드당 1.0 x 10⁶cpm의 프로브 및 tRNA (50mg/ml 원액) 1.0㎕를 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 상기 슬라이드를 얼음 위에서 냉각시키고, 슬라이드당 혼성화 완충액 48㎕를 첨가하였다. 볼텍싱한 후, ³³P 혼합물 50㎕를 슬라이드 상 예비혼성화 시료 50㎕에 첨가하였다. 이 슬라이드를 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다.1.0 μl of 1.0 × 10 ⁶ cpm probe and tRNA (50 mg / ml stock) per slide were heated at 95 ° C. for 3 minutes. The slides were cooled on ice and 48 μl of hybridization buffer added per slide. After vortexing, 50 μl of the ³³ P mixture was added to 50 μl of the prehybridization sample on the slide. This slide was incubated at 55 ° C. overnight.

E. 세척E. Wash

실온에서 2 x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척한 후 (20x SSC 400ml + 0.25M EDTA 16ml, 최종 부피=4L), 37℃에서 30분 동안 RNase A로 처리하였다 (RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml RNase 500㎕ = 20㎍/ml). 슬라이드를 실온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척하였다. 엄격한 세척 조건은 하기와 같다: 55℃, 0.1x SSC 및 EDTA에서 2시간 (20x SSC 20ml + EDTA 16ml, 최종 부피 = 4L).After washing twice at room temperature with 2 × SSC, EDTA twice for 10 minutes (20 × SSC 400ml + 0.25M EDTA 16ml, final volume = 4L), treated with RNase A for 30 minutes at 37 ° C. (10mg / ml in 250ml of RNase buffer) RNase 500 μl = 20 μg / ml). The slides were washed twice with 10 × 2 × SSC, EDTA at room temperature. Stringent washing conditions are as follows: 2 hours at 55 ° C., 0.1 × SSC and EDTA (20 × SSC 20ml + EDTA 16ml, final volume = 4L).

F. 올리고뉴클레오티드F. Oligonucleotides

본원에 개시된 DNA 서열 중 3개에 대해 제자리 분석을 수행하였다. 이러한 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:In situ analysis was performed on three of the DNA sequences disclosed herein. Oligonucleotides used in this assay are as follows:

(1) DNA47365-1206 (O364) (TNF 수용체 동족체) (1) DNA47365-1206 (O364) (TNF receptor homologue)

p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAC CCG AGC ATG GCA CAG CAC-3' (서열 50)p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAC CCG AGC ATG GCA CAG CAC-3 '(SEQ ID NO: 50)

p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT CCC AGC CGC CCC TTC TC-3' (서열 51)p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT CCC AGC CGC CCC TTC TC-3 '(SEQ ID NO: 51)

(2) DNA30868 (PRO205) (폴리스타틴 동족체)(2) DNA30868 (PRO205) (polystatin homologue)

p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AGA GAC AGG GCA AGC AGA ATG-3' (서열 52)p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AGA GAC AGG GCA AGC AGA ATG-3 '(SEQ ID NO: 52)

p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GAA GGG GAT GAC TGG AGG AAC-3' (서열 53)p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GAA GGG GAT GAC TGG AGG AAC-3 '(SEQ ID NO: 53)

(3) DNA41374 (PRO333) (CD33 동족체)(3) DNA41374 (PRO333) (CD33 homologue)

5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTC CAC AGA ACC TCG CCA TCA-3' (서열 54)5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTC CAC AGA ACC TCG CCA TCA-3 '(SEQ ID NO: 54)

5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGG GGC AAG ACT CAC AAG CAG-3' (서열 55)5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGG GGC AAG ACT CAC AAG CAG-3 '(SEQ ID NO: 55)

G. 결과G. Results

본원에 개시된 상기 3개의 DNA 서열에 대해 제자리 분석을 수행하였다. 이 분석으로부터 하기 결과를 얻었다.In situ analysis was performed on the three DNA sequences disclosed herein. The following results were obtained from this analysis.

(1) DNA47365-1206 (PRO364) (TNF 수용체 동족체)(1) DNA47365-1206 (PRO364) (TNF receptor homologue)

태아의 척추체 근내막 앞면에서 발현되었다. 태아 망막에서도 발현되었다. 그러나, 태아의 신경세포에서 낮은 수준으로 발현되었다. 기타 모든 조직에서는 발현되지 않았다.It was expressed in the frontal endometrium of the fetal vertebral body. It is also expressed in fetal retina. However, they were expressed at low levels in fetal neurons. It was not expressed in all other tissues.

(2) DNA30868 (PRO205) (폴리스타틴 동족체)(2) DNA30868 (PRO205) (polystatin homologue)

태아 조직의 척수, 자율신경절, 장신경, 천추총, 말초 및 두개 신경에서 발현되었다. 기타 모든 태아 및 성인 조직에서는 발현되지 않았다. It was expressed in the spinal cord, autonomic ganglia, intestinal nerve, sacral plexus, peripheral and cranial nerves of fetal tissue. Not expressed in all other fetal and adult tissues.

검사한 태아 조직 (12-16주)은 태반, 탯줄, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 소체벽, 자궁 및 하지이다.Fetal tissue examined (12-16 weeks) includes placenta, umbilical cord, liver, kidneys, adrenal gland, thyroid gland, lungs, heart, large blood vessels, esophagus, stomach, small intestine, spleen, thymus, pancreas, brain, eyes, spinal cord and body wall , Uterus and lower extremities.

성인 조직은 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부이다.Adult tissues are liver, kidneys, adrenal glands, myocardium, aorta, spleen, lymph nodes, pancreas, lungs and skin.

(3) DNA41374(PRO333)(CD33 동족체)(3) DNA41374 (PRO333) (CD33 homologue)

이 분자는 면역자극성인 것으로 보인다 (T 림프구 공자극 검정 중 동일 방식으로 혼합된 림프구 반응에서 T 림프구 증식을 촉진함). 이 분자의 분포 패턴은 이 연구 초기에 이용가능한 조직을 비롯한 제한된 조직 스크리닝으로 조사하였다. 조사한 다수의 조직 중 흉선 T 림프구에서 약간 분산된 발현을 검출하였다 (비장 및 림프절은 조사하지 않음). 이 결과는 후속 제자리 혼성화 연구에서 확인되었다. 상기 제자리 혼성화 연구의 결과는 비인간 영장류 흉선, 및 T 림프구 특이적 인 영역 중 인간 편도에서 유사하게 낮은 발현도를 나타내었다. 상기 제한된 분포 패턴은 항원 발현 세포 (수상세포 집단 등)와 같은 T 림프구와 밀접하게 관련되어 있는 T 림프구 또는 T 세포에 의한 발현을 암시한다. 림프구 염증이 상당한 염증 인간 조직 및 반응성 여포 형성의 존재하에, 상당수의 T 림프구가 함유된 영역에서 검출가능한 발현은 없었다.This molecule appears to be immunostimulatory (promotes T lymphocyte proliferation in mixed lymphocyte responses in the same manner during the T lymphocyte costimulatory assay). The distribution pattern of this molecule was examined by limited tissue screening, including available tissue early in the study. Slightly dispersed expression in thymic T lymphocytes was detected among the many tissues examined (spleen and lymph nodes not examined). This result was confirmed in subsequent in situ hybridization studies. The results of this in situ hybridization study showed a similarly low expression in the non-human primate thymus, and the human amygdala in the T lymphocyte specific region. This limited distribution pattern suggests expression by T lymphocytes or T cells that are closely related to T lymphocytes, such as antigen expressing cells (such as dendritic cell populations). Lymphocyte inflammation was significant in the presence of inflammatory human tissue and reactive follicle formation, and there was no detectable expression in the region containing a significant number of T lymphocytes.

이러한 분포 차이 (즉, 흉선 및 편도의 T 림프구 영역에서는 발현되지만, T 림프구의 염증이 있는 영역에서는 발현되지 않음)는 하기 가능성을 암시한다:This distribution difference (ie, expressed in the T lymphocyte region of the thymus and tonsil, but not in the inflamed region of T lymphocytes) suggests the following possibilities:

1. 흉선 및 편도의 림프절에는 존재하지만 염증 조직에는 존재하지 않는 T 림프구 하위 집단에서 선택된(제한된) 발현이 있다. 성숙되지 않은 비수임 T 림프구는 편도 및 흉선 둘다에 존재하나, 만성 염증 조직에서는 주요 집단이 아닐 가능성이 있다.1. There are selected (limited) expressions in T lymphocyte subpopulations that are present in lymph nodes of the thymus and tonsils but not in inflammatory tissues. Unmatured non-committed T lymphocytes are present in both tonsils and thymus but are unlikely to be a major population in chronic inflammatory tissues.

2. T 림프구에 있어서의 발현이 T 림프구가 있는 조직에서 약하거나 상이하게 검출되는 것은 여러 가지 T 림프구 세포 집단 유형을 반영한다기 보다는 상기 조직 절편 중의 RNA 질을 반영하는 것이다.2. Expression in T lymphocytes detected weakly or differently in tissues with T lymphocytes reflects the quality of RNA in the tissue sections rather than reflecting various T lymphocyte cell population types.

3. 흉선 및 편도에 있어서의 발현은 림프구로부터의 발현이 아니라, 조사된 염증 폐 또는 장에 존재하지 않는, T 림프구와 밀접하게 관련되어 있는 특정 세포 집단으로부터의 발현이다. 상기 세포 집단일 가능성이 있는 한 가지 세포 집단으로는 수상세포 하위집단이 있다.3. Expression in the thymus and tonsils is not from lymphocytes, but from specific cell populations that are closely related to T lymphocytes that are not present in the inflammatory lung or intestine investigated. One cell population that may be the cell population is a dendritic cell subpopulation.

비인간 영장류에 있어서, 흉선 림프구에서 약한 분산 발현이 있었다. In non-human primates, there was a weak scatter expression in thymic lymphocytes.

후속 연구에서, 하기 결과가 보고되었다:In subsequent studies, the following results were reported:

염증 폐 (만성 림프구성 폐렴 및 육아종성 폐렴): 대조구 센스 프로브에 비해 간질에서 약한 신호 내지 음성 신호가 관찰되었고, 정상 침팬지 흉선 (인간 흉선은 이용불가능함) 및 인간 편도에서 약한 발현이 있었다. 정상 침팬지 흉선 및 인간 편도 중, 소포주위 연변층을 비롯한 이러한 구조의 T 림프구 영역 및 가슴샘의존층 (paracortex)에서 주로 발현되었다. Inflammatory lungs (chronic lymphocytic pneumonia and granulomatous pneumonia): weak to negative signals were observed in epilepsy compared to control sense probes, with weak expression in normal chimp thymus (human thymus not available) and human tonsils. In normal chimpanzee thymus and human amygdala, it was mainly expressed in the T lymphocyte region and paracortex of this structure, including the periplasmic marginal layer.

염증성 장 질환 (8명의 환자 표본), 만성 염증 및 정상 폐 (6명의 환자 표본), 만성 경화증 신염 (1명의 환자 표본), 만성 및 급성 염증 및 경변 간 (10개의 표본 다중블록), 정상 및 건성 피부, 및 말초 림프절 (비반응성) 등의 인간 조직에서 검출가능한 발현이 있었다.Inflammatory bowel disease (8 patient samples), chronic inflammation and normal lung (6 patient samples), chronic sclerosis nephritis (1 patient sample), chronic and acute inflammation and cirrhosis liver (10 sample multiblocks), normal and dry There was detectable expression in the skin and in human tissues such as peripheral lymph nodes (non-reactive).

실시예 20: 혼성화 프로브로서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 용도 Example 20: Use of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 as Hybridization Probe

하기 방법에는 혼성화 프로브로서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 용도가 기재되어 있다.The following method describes the use of nucleotide sequences encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 as hybridization probes.

전장 또는 성숙 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 코딩 서열을 포함하는 DNA (각각 도 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31과, 각각 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로 각각 나타내어짐) 또는 그의 단편은 인간 조직 cDNA 라이브러리 또 는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동한 DNA (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 자연 발생 변이체를 코딩하는 DNA와 같은 것)를 스크리닝하기 위한 프로브로 사용한다.DNA containing coding sequence of full length or maturation PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 (respectively 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 and 31 and SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, respectively , 23, 25, 27, 29 and 31, respectively, or fragments thereof are homologous DNAs in human tissue cDNA libraries or human tissue genome libraries (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, (Such as DNA encoding naturally occurring variants of PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887) as probes for screening.

상기 두 라이브러리 DNA 중 하나를 함유하는 필터는 엄격도가 높은 하기 조건하에서 혼성화시키고 세척한다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 유도된 방사선표지된 프로브를 50% 포름아미드, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% 소듐 피로술페이트, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2x 덴하츠 용액 (Denhard's solution) 및 10% 덱스트란 술페이트가 함유된 42℃, 용액에서 20시간동안 상기 필터에 혼성화시켰다. Filters containing one of the two library DNAs hybridize and wash under the following stringent conditions. Radiolabeled probes derived from genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides were treated with 50% formamide, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrosulfate, 50 mM sodium phosphate, pH 6.8, 42 ° C. containing 2 × Denhard's solution and 10% dextran sulfate, in the filter for 20 hours in solution Hybridized.

그 다음으로, 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 전장 천연 서열을 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 보이는 DNA를 확인할 수 있다.Next, standard techniques known in the art can be used to identify DNA that encodes the full-length native sequence and DNA that exhibits the desired sequence identity.

실시예 21: 대장균에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현Example 21 Expression of Nucleic Acids Encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in E. Coli

이 실시예는 대장균에서 재조합 발현시켜 글리코실화되지 않은 형태의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 제조하는 것을 기술하고 있다.This example demonstrates recombinant expression in Escherichia coli to produce the non-glycosylated forms of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. It is describing.

먼저, 선별된 PCR 프라이머를 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 (각각 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31)을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시켰다. 상기 프라이머는 선별된 발현 벡터에 있는 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 포함해야 한다. 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 적당한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라시클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (대장균으로부터 유래됨; 문헌 (Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1997) 참조)가 있다. 상기 벡터는 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 그 다음으로, PCR로 증폭시킨 서열을 상기 벡터와 결찰시켰다. 바람직하게는, 상기 벡터는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더 (첫 6개의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위), PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 영역, 람다 전사 종결 신호 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다. First, using the selected PCR primers PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 respectively) DNA sequences encoding 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 and 31) were amplified. The primer should include a restriction enzyme site corresponding to the restriction enzyme site in the selected expression vector. Various expression vectors can be used. An example of a suitable vector is pBR322 (derived from E. coli; see Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1997)) comprising ampicillin and tetracycline resistance genes. The PCR amplified sequence was then ligated with the vector, preferably, the vector was antibiotic resistant gene, trp promoter, poly-His leader (first six STII codons, poly-His sequence). And enterokinase cleavage sites), regions coding for PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887, lambda transcription termination signal and argU gene Will comprise a sequence encoding.

그 후, 결찰 혼합물은 상기 샘브룩 등의 문헌 (Sambrook et al.,)에 기재된 방법을 사용하여 선별된 대장균 균주를 형질전환시키는 데 사용하였다. LB 플레이트 위에서 증식하는 대장균의 능력으로 형질전환체를 확인한 후, 항생제 내성 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 단리하고, 제한효소 분석 및 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.The ligation mixture was then used to transform selected E. coli strains using the method described by Sambrook et al., Supra. After confirming the transformants with the ability of E. coli to proliferate on LB plates, antibiotic resistant colonies were selected. Plasmid DNA was isolated and confirmed by restriction enzyme analysis and DNA sequencing.

선별된 클론은 항생제가 함유된 LB 브로쓰와 같은 배양액에서 밤새 배양할 수 있다. 이어서, 밤새 배양한 배양물을 사용하여 대량 배양을 접종하였다. 그 다음으로, 발현 프로모터가 작동되고 있는 동안 세포를 원하는 광학 밀도까지 배양하였다.Selected clones can be grown overnight in a culture such as LB broth with antibiotics. Then, overnight cultures were used to inoculate mass culture. Next, the cells were incubated to the desired optical density while the expression promoter was running.

몇 시간동안 세포를 배양한 후, 원심분리로 세포를 모았다. 원심분리에 의해 얻어진 세포 펠렛은 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용하여 용해시킬 수 있고, 이어서 용해된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 강한 결합을 허용하는 조건하에 금속-킬레이팅 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다.After incubating the cells for several hours, the cells were collected by centrifugation. Cell pellets obtained by centrifugation can be lysed using a variety of materials known in the art, followed by lysis of PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, A PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptide can be purified using a metal-chelating column under conditions that allow strong binding of this polypeptide.

PRO238, PRO364 및 PRO1760은 상기 방법에 의해 폴리-His로 표지된 (tagged) 형태로 대장균에서 성공적으로 발현되었다.PRO238, PRO364 and PRO1760 were successfully expressed in E. coli in the form of a t-labeled poly-His by the above method.

실시예 22: 포유동물 세포에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현 Example 22 Expression of Nucleic Acids Encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in Mammalian Cells

이 실시예에는 포유동물 세포에서 재조합 발현시켜 글리코실화된 형태일 가능성이 있는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 제조하는 것이 기재되어 있다.This example includes PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 which are likely to be in the glycosylated form by recombinant expression in mammalian cells. The preparation is described.

벡터, pRK5 (1989년 3월 15일 공개된 유럽 특허 제307, 247호 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 DNA는 상기 샘브룩 등의 문헌에 기재된 바와 같은 결찰 방법을 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 코딩하는 DNA의 삽입을 허용하는 선별된 제한효소로 pRK5와 결찰시켰다. 생성된 벡터를 pRK5-(PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 코딩하는 DNA)라고 불렀다. The vector, pRK5 (see European Patent No. 307, 247 published March 15, 1989) was used as the expression vector. Optionally, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 DNA can be obtained using ligation methods as described in Sambrook et al. PRK5 was ligated with selected restriction enzymes that allowed insertion of DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. The resulting vector was called pRK5- (DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887).

한 실시양태에서, 선별된 숙주 세포는 293 세포이다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)는 소태아 혈청 및, 임의로 영양 성분 및(또는) 항생제가 함유된 DMEM과 같은 배지가 든 조직 배양 플레이트에서 전면배양시켰다. 약 10 ㎍의 pRK-5 DNA (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA)는 VA RNA 유전자 (Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982))를 코딩하는 DNA 1 ㎍과 혼합하고, 완충액 500 ㎕ (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl₂)에 용해시켰다. 500 ㎕의 용액 (50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄)을 상기 혼합물에 적가하고, 25℃에서 10분동안 침전물을 형성시켰다. 상기 침전물을 현탁시키고 상기 293 세포에 첨가한 후, 37℃에서 약 4시간동안 방치하였다. 배양 배지를 흡입 제거하고, PBS 중의 20% 글리세롤을 30초동안 첨가하였다. 그 다음으 로, 이 293 세포를 혈청이 없는 배지로 세척하고, 새 배지를 첨가한 후, 상기 세포를 약 5일동안 인큐베이션하였다.In one embodiment, the selected host cell is 293 cells. Human 293 cells (ATCC CCL 1573) were cultured in tissue culture plates containing fetal bovine serum and medium such as DMEM, optionally containing nutrients and / or antibiotics. About 10 μg of pRK-5 DNA (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887) is a VA RNA gene ( Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)) were mixed with 1 μg of DNA encoding and dissolved in 500 μl of buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl ₂ ). 500 μl of solution (50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO ₄ ) was added dropwise to the mixture and a precipitate formed at 25 ° C. for 10 minutes. The precipitate was suspended and added to the 293 cells, then left at 37 ° C. for about 4 hours. The culture medium was aspirated off and 20% glycerol in PBS was added for 30 seconds. The 293 cells were then washed with serum free medium, fresh medium was added, and the cells were incubated for about 5 days.

대략적으로 형질감염 24시간 후, 상기 배양 배지를 제거하고 배양 배지만으로 바꾸거나, 200 μCi/ml의 ³⁵S-시스테인 및 200 μCi/ml의 ³⁵S-메티오닌을 함유하는 배양 배지로 바꾸었다. 12시간동안 인큐베이션한 후, 적응용 배지를 모으고, 회전 필터 상에서 농축시키고, 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조하고 일정 기간동안 필름에 노출시켜 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있었다. 형질감염된 세포를 함유하는 배양물을 더 인큐베이션시키고 (혈청이 없는 배지에서 인큐베이션시킴), 이 배지를 선별된 생물검정에서 시험하였다.Approximately 24 hours after transfection, the culture medium was removed and replaced with culture medium only, or with culture medium containing 200 μCi / ml ³⁵ S-cysteine and 200 μCi / ml ³⁵ S-methionine. After incubation for 12 hours, the adaptation medium was collected, concentrated on a rotary filter and loaded on a 15% SDS gel. The treated gel can be dried and exposed to the film for a period of time to confirm the presence of the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides. there was. Cultures containing the transfected cells were further incubated (incubated in serum free medium) and the medium was tested in selected bioassays.

별법으로, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자는 문헌 (Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981))에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 사용하여 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있다. 293 세포를 회전 플라스크에서 최대 밀도까지 배양하고, 700 ㎍의 pRK5 (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA)를 첨가하였다. 원심분리하여 상기 회전 플라스크로부터 세포를 먼저 농축시 키고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 몇 시간동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초동안 처리하고, 조직 배양 배지로 세척하고, 조직 배양 배지, 5 ㎍/ml의 소 인슐린 및 0.1 ㎍/ml의 소 트랜스페린이 함유된 회전 플라스크내로 다시 도입하였다. 약 수일 후, 상태가 변한 배지를 원심분리하고 여과하여 세포 및 세포 데브리스 (debris)를 제거하였다. 그 다음으로, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 발현 유전자를 함유하는 샘플을 농축시키고, 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피와 같은 임의의 선별된 방법으로 정제할 수 있다.Alternatively, the genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are described in Somparyrac et al., Proc. Natl. The dextran sulfate method described in Acad. Sci., 12: 7575 (1981)) can be used to transiently introduce 293 cells. Incubate 293 cells to maximum density in a rotary flask and encode 700 μg pRK5 (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887) DNA) was added. Cells were first concentrated by centrifugation and washed with PBS. DNA-dextran precipitates were incubated on cell pellets for several hours. Cells were treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue culture medium and introduced back into a rotating flask containing tissue culture medium, 5 μg / ml bovine insulin and 0.1 μg / ml bovine transferrin. After about a few days, the changed media was centrifuged and filtered to remove cells and cell debris. Next, the samples containing the expression genes encoding the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are concentrated and dialyzed And / or may be purified by any selected method, such as column chromatography.

또다른 실시양태에서, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5 (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA) 핵산은 CaPO₄ 또는 DEAE-덱스트란과 같은 공지된 시약을 사용하여 CHO 세포내로 형질감염시킬 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 세포 배양물을 인큐베이션하고, 배지를 배양 배지 (단독), 또는 ³⁵S-메티오닌과 같은 방사선표지가 함유된 배지로 바꿀 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 존재 를 확인한 후, 배양 배지를 혈청이 없는 배지로 바꿀 수 있다. 바람직하게는, 배양물을 약 6일동안 인큐베이션한 후, 상태가 변한 배지를 모았다. 그 다음으로, 발현된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 함유하는 배지를 농축하고 임의의 선별된 방법으로 정제할 수 있다.In another embodiment, genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be expressed in CHO cells. pRK5 (DNA encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887) nucleic acid is known as CaPO ₄ or DEAE-dextran Reagents can be used to transfect into CHO cells. As described above, the cell culture can be incubated and the medium replaced with culture medium (alone), or with a media containing radiolabels such as ³⁵ S-methionine. After confirming the presence of the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides, the culture medium can be changed to a medium without serum. Preferably, the cultures are incubated for about 6 days, after which the medium with the changed state is collected. Next, the medium containing the expressed PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 is concentrated and by any selected method. It can be purified.

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는, 에피토프 태그가 결합되어 있는 유전자도 숙주 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자는 pRK5 벡터로부터 얻을 수 있다. 서브클론 인서트를 PCR 증폭시켜 바큘로바이러스 발현 벡터내의 폴리-His 태그와 같은 선별된 에피토프 태그와 인프레임으로 결합시킬 수 있다. 이어서, 폴리-His 태그가 결합되어 있는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자 인서트는 안정한 클론의 선별을 위한 DHFR과 같은 선별 마커를 함유하는 SV40 유래 벡터내로 서브클로닝시킬 수 있다. 최종적으로, CHO 세포를 상기 SV40 유래 벡터로 (상기와 같이) 형질감염시킬 수 있다. 발현을 확인하기 위해, 상기와 같이 표지할 수 있다. 그 후, 폴리-His 태그가 결합되어 있는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 발현 유전자를 함유하는 배양 배지를 농축하고 Ni²⁺-킬레이트 친화 크로마토그래피와 같은 임의의 선별된 방법으로 정제할 수 있다.The epitope-tagged genes encoding the PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides can also be expressed in host CHO cells. Can be. Genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 can be obtained from the pRK5 vector. Subclonal inserts can be PCR amplified to bind in-frame with selected epitope tags, such as poly-His tags in baculovirus expression vectors. Subsequently, the gene inserts encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887, with the poly-His tag attached, Subcloning into an SV40 derived vector containing a selection marker such as DHFR for selection can be made. Finally, CHO cells can be transfected (as above) with the SV40 derived vector. To confirm expression, it can be labeled as above. Then, containing the expression gene encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 to which the poly-His tag is bound The culture medium can be concentrated and purified by any selected method, such as Ni ²⁺ -chelate affinity chromatography.

상기에 기재된 방법으로 PRO179, PRO364, PRO840, PRO844, PRO846 및 PRO205을 CHO 세포에서 안정하게 발현시켰다. 또한, PRO364 및 PRO846을 일시적인 형질감염 방법으로 CHO 세포에서 발현시켰다.PRO179, PRO364, PRO840, PRO844, PRO846 and PRO205 were stably expressed in CHO cells by the method described above. In addition, PRO364 and PRO846 were expressed in CHO cells by transient transfection methods.

실시예 23: PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현 Example 23 Expression of Nucleic Acids Encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887

효모에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자의 재조합 발현이 하기 방법에 기재되어 있다.Recombinant expression of genes encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in yeast are described in the following methods.

먼저, ADH2/GAPDH 프로모터의 조절하에 세포내에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 생성시키거나, 상기 폴리펩티드를 세포외로 분비시키기 위한 발현 벡터를 제작하였다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA 및 프로모터를 선별된 플라스미드내의 적당한 제한효소 부위내에 삽입시켜 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자를 세포내에서 직접 발현시켰다. 분비시키기 위해서는, ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 신호 펩티드 또는 포유동물의 신호 펩티드, 예를 들어, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호(리더) 서열, 및 (필요하다면) PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자의 발현을 위한 링커 서열을 코딩하는 DNA와 함께, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA를 선별된 플라스미드내로 클로닝할 수 있다. First, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 polypeptides are produced intracellularly under the control of the ADH2 / GAPDH promoter, or An expression vector was constructed to secrete the polypeptide extracellularly. DNAs and promoters encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are inserted into the appropriate restriction enzyme sites in the selected plasmid Genes encoding, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 were expressed directly in cells. For secretion, the ADH2 / GAPDH promoter, native PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 signal peptide or mammalian signal peptide, For example, yeast alpha-factor or invertase secretion signal (leader) sequence, and (if necessary) PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885, with DNA encoding the linker sequence for the expression of the gene encoding PRO885 or PRO887 Alternatively, the DNA encoding PRO887 can be cloned into selected plasmids.

이어서, 효모 균주 AB110과 같은 효모 세포를 상기 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 선별된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상등액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리함으로써 분석한 후, 코마시에 블루 염색으로 겔을 염색할 수 있다.Yeast cells, such as yeast strain AB110, can then be transformed with the expression plasmid and cultured in selected fermentation medium. Transformed yeast supernatants can be analyzed by precipitation with 10% trichloroacetic acid and separated by SDS-PAGE, followed by staining of the gel with Coomassie blue staining.

그 후, 재조합 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887는 단리하고, 원심분리하여 발효 배지로부터 효모 세포를 제거한 후 선별된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시킴으로써 정제할 수 있다. 선별된 컬럼 크로마토그 래피 수지를 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 함유하는 농축물을 더 정제할 수 있다.Thereafter, recombinant PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are isolated and centrifuged to remove yeast cells from the fermentation medium. Purification can be accomplished by concentrating the medium using selected cartridge filters. Selected column chromatography resins can be used to further purify concentrates containing PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. Can be.

실시예 24: 바큘로바이러스에 감염된 곤충 세포에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현 Example 24 Expression of Nucleic Acids Encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in Insect Cells Infected with Baculovirus

바큘로바이러스에 감염된 곤중 세포에서 재조합 발현시키는 하기 방법이 기재되어 있다.The following method is described for recombinant expression in baculovirus infected gonocytes.

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터내에 함유된 에피토프 태그의 상류 서열과 결합시켰다. 이러한 에피토프 태그로는 폴리-His 태그 및 이뮤노글로불린 태그 (IgG의 Fc 영역 등)가 있다. pVL1393 (Novagen)과 같은 시판되는 플라스미드로부터 유래한 플라스미드를 비롯한 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 간단히 말하면, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 서열, 또는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 코딩 서열 중 원하는 일부 영역 [예컨대, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열, 또는 세포외 단백질인 경우, 성숙 단백질을 코딩하는 서열]은 5' 및 3' 영역과 상보적인 프라이머를 사용한 PCR로 증폭시켰다. 5' 프라이머는 플랭킹 (선별된) 제한효소 부위를 도입시킬 수 있다. 이어서, 생성물을 상기 선별된 제한효소로 절단하고, 발현 벡터내로 서브클로닝시켰다.Sequences encoding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are compared with the upstream sequence of the epitope tag contained in the baculovirus expression vector. Combined. Such epitope tags include poly-His tags and immunoglobulin tags (such as the Fc region of IgG). Various plasmids can be used, including plasmids derived from commercially available plasmids such as pVL1393 (Novagen). Simply put, sequences coding PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887, or PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, Some of the desired regions of the coding sequence of PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 (eg, sequences encoding extracellular domains of transmembrane proteins, or extracellular proteins, The sequence encoding the mature protein] was amplified by PCR using primers complementary to the 5 'and 3' regions. The 5 'primer can introduce flanking (selected) restriction enzyme sites. The product was then digested with the selected restriction enzymes and subcloned into the expression vector.

리포펙틴 (GIBO-BRL로부터 시판됨)을 사용하여 상기 플라스미드 및 바큘로골드 (상표명) 바이러스 DNA (Pharmingen)를 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda, "Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711) 내로 동시에 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 얻었다. 28℃에서 4 내지 5일동안 인큐베이션한 후, 배출된 바이러스를 모아 추가 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford: Oxford University Press, 1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.Lipofectin (commercially available from GIBO-BRL) was used to transfer the plasmid and baculogold ™ viral DNA (Pharmingen) into Spodoptera frugiperda (“Sf9”) cells (ATCC CRL 1711). Simultaneous transfection yielded recombinant baculovirus. After incubation at 28 ° C. for 4-5 days, the released virus was collected and used for further amplification. Viral infection and protein expression were performed as described in O'Reilley et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford: Oxford University Press, 1994).

그 다음으로, 발현된 폴리-His 태그-[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887]을 예컨대, 하기와 같이 Ni²⁺-킬레이트 친화 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 문헌 (Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993))에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 추출물을 얻었다. 간단히 말해, Sf9 세포를 세척하고, 초음파처리 완충액 (25 mM Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고, 상등액을 로딩 완충액 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)으로 50배 희석하고 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 비드 부피가 5 ml인 Ni²⁺-NTA 아가 로스 컬럼 (Qiagen으로부터 시판됨)을 준비하고, 25 ml의 물로 세척한 후, 25 ml의 로딩 완충액으로 평형시켰다. 여과된 세포 추출물을 분당 0.5 ml로 상기 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 로딩 완충액으로 기준치 A₂₈₀까지 세척하였는데, 상기 기준치는 분획이 모아지기 시작하는 점이다. 다음으로, 상기 컬럼은 비특이적으로 결합되어 있는 단백질을 용출하는 2차 세척 완충액 (50 mM 포스페이트; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 세척하였다. 다시 기준치 A₂₈₀에 도달한 후, 상기 컬럼을 2차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM 이미다졸 농도구배로 전개시켰다. 1 ml 분획을 모으고, SDS-PAGE, 및 은 염색 또는 Ni²⁺-NTA가 접합되어 있는 알칼리성 포스파타제 (Qiagen)을 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 용출된 His₁₀-태그-[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887] 각각을 함유하는 분획을 모으고 로딩 완충액에 대해 투석하였다.Next, the expressed poly-His tag- [PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887], for example, as follows: It can be purified by Ni ²⁺ -chelate affinity chromatography. Extracts were obtained from recombinant virus-infected Sf9 cells as described in Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Briefly, Sf9 cells are washed, resuspended in sonication buffer (25 mM Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl ₂ ; 0.1 mM EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl) and the supernatant Diluted 50 times with loading buffer (50 mM phosphate, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.8) and filtered through 0.45 μm filter. A Ni ²⁺ -NTA agarose column (commercially available from Qiagen) with a bead volume of 5 ml was prepared, washed with 25 ml of water and then equilibrated with 25 ml of loading buffer. Filtered cell extracts were loaded into the column at 0.5 ml per minute. The column was washed with loading buffer to baseline A _280, at which point fractions began to collect. Next, the column was washed with secondary wash buffer (50 mM phosphate; 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 6.0) eluting nonspecifically bound protein. After reaching baseline A ₂₈₀ again, the column was developed with a gradient of 0-500 mM imidazole in secondary wash buffer. 1 ml fractions were collected and analyzed by SDS-PAGE, and Western blot using silver staining or alkaline phosphatase (Qiagen) conjugated with Ni ²⁺ -NTA. Fractions containing each of the eluted His ₁₀ -tags [PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887] are collected and placed in the loading buffer. Dialysis.

별법으로, IgG-태그-[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887]은 예컨대, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 비롯한 공지된 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제할 수 있다.Alternatively, IgG-tag- [PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887], for example, Protein A or Protein G column chromatography. Purification can be carried out using known chromatography techniques, including chromatography.

실제적으로 0.5 내지 2 L 규모로 발현시켰지만, 보다 큰 규모의 발현 (예컨대, 8 L)을 위해서는 용이하게 규모를 증가시킬 수 있다. 단백질의 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열과 결합되어 있는 IgG 구 조물 (이뮤노어드헤신) 또는 폴리-His 태그가 결합되어 있는 형태로서 단백질을 발현시켰다. Although actually expressed on a scale of 0.5 to 2 L, scale can be easily increased for larger scale expression (eg 8 L). The protein was expressed as an IgG construct (immunoadhesine) or poly-His tag bound in which the extracellular region of the protein is bound to an IgGl constant region sequence comprising a hinge, CH2 and CH3 domains.

PCR 증폭 후, 각 코딩 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터 (IgG 결합체의 경우에는 pb.PH.IgG이고, 폴리-His 태그가 결합되어 있는 단백질의 경우에는 pb.PH.His.c)내로 서브클로닝시키고, 리포펙틴 (Gibco BRL)을 사용하여 상기 벡터 및 바큘로골드 (등록상표) 바큘로바이러스 DNA (Pharmingen)를 105 스포돕테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)내로 동시에 형질감염시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His는 His 또는 Fc 태그 서열을 포함하도록 폴리링커 영역이 변형된, 시판되는 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393 (Pharmingen)이다. 세포는 10% FBS (Hyclone)가 함유된 Hink's TNM-FH 배지에서 배양하였다. 세포를 28℃에서 5일동안 인큐베이션하였다. 상등액을 모은 후, Sf9 세포를 10% FBS가 함유된 Hink's TNM-FH 배지에서 약 10의 감염다중도 (MOI)로 감염시킴으로써 제1 바이러스 증폭에 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일동안 인큐베이션하였다. 상등액을 모으고, 1 ml의 상등액을 히스티딘 태그가 있는 단백질의 경우에는 25 ml의 Ni²⁺-NTA 비드 (Qiagen)에 배치 결합시키고, IgG 태그가 있는 단백질의 경우에는 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia)에 배치 결합시킨 후, 코마시에 블루 염색을 통해 단백질 표준물의 공지된 농도와 비교하는 SDS-PAGE 분석을 수행함으로써 바큘로바이러스 발현 벡터내 구조물의 발현도를 측정하였다. After PCR amplification, each coding sequence is subcloned into a baculovirus expression vector (pb.PH.IgG for IgG conjugates and pb.PH.His.c for proteins with poly-His tags bound). , The lipofectin (Gibco BRL) was used to simultaneously transduce the vector and baculogold® baculovirus DNA (Pharmingen) into 105 Spodogerra pruperfera (“Sf9”) cells (ATCC CRL 1711). Infected. pb.PH.IgG and pb.PH.His are commercially available baculovirus expression vectors pVL1393 (Pharmingen), wherein the polylinker region has been modified to include His or Fc tag sequences. Cells were cultured in Hink's TNM-FH medium containing 10% FBS (Hyclone). Cells were incubated at 28 ° C. for 5 days. After collecting the supernatants, Sf9 cells were used for first virus amplification by infecting Hink's TNM-FH medium containing 10% FBS with about 10 infection multiplicity (MOI). Cells were incubated at 28 ° C. for 3 days. Collect the supernatant, batch bind 1 ml of supernatant to 25 ml Ni ²⁺ -NTA beads (Qiagen) for histidine-tagged proteins, and protein-A Sepharose CL-4B for IgG-tagged proteins After batch binding to beads (Pharmacia), the expression level of the constructs in the baculovirus expression vectors was determined by performing an SDS-PAGE analysis comparing the known concentrations of protein standards via Coomassie blue staining.

제1 바이러스 증폭 상등액을 사용하여 ESF-921 배지 (발현계 LLC)에서 배양 된 Sf9 세포의 회전 배양물 (500 ml)을 약 0.1의 감염다중도로 감염시켰다. 세포를 28℃에서 3일동안 인큐베이션하였다. 상등액을 모아 여과하였다. 필요하다면, 회전 배양물의 발현이 확인될 때까지 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다. Rotated cultures (500 ml) of Sf9 cells cultured in ESF-921 medium (expression system LLC) were infected using a first virus amplified supernatant with an infection multiplicity of about 0.1. Cells were incubated at 28 ° C. for 3 days. The supernatant was collected and filtered. If necessary, batch binding and SDS-PAGE analysis was repeated until expression of the rotating culture was confirmed.

형질감염된 세포로부터 얻은, 성질이 변한 배지 (0.5 내지 3 L)를 원심분리로 세포를 제거하여 모으고, 0.22 마이크론 필터를 통해 여과하였다. 폴리-His 태그가 있는 구조물의 경우, 단백질 구조물은 Ni²⁺-NTA 컬럼 (Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 정제하기 전, 이미다졸을 5 mM의 농도까지 상기 배지에 첨가하였다. 상기 배지는 4℃에서 4-5 ml/분의 유속으로 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸이 함유된 20 mM 헤페스 (Hepes, pH 7.4) 완충액으로 평형시킨 Ni²⁺-NTA 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M의 이미다졸을 함유하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 그 후, 고도로 정제된 단백질은 25 ml의 G25 수퍼파인 (Superfine; Pharmacia) 컬럼을 사용하여 저장 완충액 (10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨, pH 6.8)내로 탈염시키고 -80℃에서 저장하였다.Changed media (0.5-3 L) obtained from the transfected cells were collected by centrifugation to remove the cells and filtered through a 0.22 micron filter. For constructs with poly-His tags, protein constructs were purified using Ni ²⁺ -NTA columns (Qiagen). Prior to purification, imidazole was added to the medium to a concentration of 5 mM. The medium was loaded on a Ni ²⁺ -NTA column equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 buffer containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole at a flow rate of 4-5 ml / min at 4 ° C. After loading, the column was washed with equilibration buffer and the protein was eluted with equilibration buffer containing 0.25 M imidazole. The highly purified protein was then desalted into storage buffer (10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol, pH 6.8) using 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) column and stored at -80 ° C. .

단백질의 이뮤노어드헤신 (Fc 함유) 구조물은 상태가 변한 배지로부터 하기와 같이 정제하였다. 상태가 변한 배지를 20 mM의 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형시킨 5 ml의 단백질 A 컬럼 (Pharmacia)에 로딩하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 철저히 세척한 다음, 100 mM의 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질은 1 ml의 분획을 1 M 트리스 완충액 (pH 9)이 함유된 튜브내에서 모음으로써 즉시 중화시켰다. 그 후, 고도로 정제된 단백질을 상기 폴리- His 태그-단백질의 경우와 같이 저장 완충액내로 탈염시켰다. 단백질의 균질성은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 (PEG) 전기영동, 및 에드만 (Edman) 분해에 의한 N-말단 아미노산 시퀀싱으로 확인하였다.The immunoadhesin (containing Fc) constructs of the protein were purified as follows from the medium with changed state. The altered medium was loaded onto a 5 ml Protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8). After loading, the column was washed thoroughly with equilibration buffer and then eluted with 100 mM citric acid (pH 3.5). The eluted protein was immediately neutralized by collecting 1 ml fractions in a tube containing 1 M Tris buffer (pH 9). The highly purified protein was then desalted into storage buffer as in the case of the poly-His tag-protein. Homogeneity of the protein was confirmed by SDS polyacrylamide gel (PEG) electrophoresis, and N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation.

PRO205, PRO321, PRO840, PRO846, PRO885 및 PRO887은 상기 방법으로, 바큘로바이러스-감염된 곤충 Sf9 세포에서 성공적으로 발현시켰다. PRO205, PRO321, PRO840, PRO846, PRO885 and PRO887 were successfully expressed in this method in baculovirus-infected insect Sf9 cells.

별법으로, 하이-5 세포를 사용하는 경우에는 변형된 바큘로바이러스 방법을 사용할 수 있다. 이 방법에서, 원하는 서열을 코딩하는 DNA를 Pfu (Stratagene)과 같은 적당한 계로 증폭시키고, 바큘로바이러스 발현 벡터에 포함되어 있는 에피토프 태그의 5'-상류와 결합시킨다. 이러한 에피토프 태그로는 폴리-His 태그 및 이뮤노글로불린 태그 (IgG의 Fc 영역과 유사함)가 있다. pIE1-1 (Novagen)과 같은 시판되는 플라스미드로부터 유래된 플라스미드를 비롯한 다양한 플라스미드가 사용가능하다. 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서 바큘로바이러스 ie1 프로모터로부터 재조합 단백질을 기본 농도로 발현시키기 위해 pIE1-1 및 pIE1-2 벡터를 디자인하였다. 상기 플라스미드는 다중 클로닝 부위의 배향에 있어서만 다르고, hr5 인핸서 요소 뿐만 아니라 감염되지 않은 곤중 세포내의 ie1-매개 유전자 발현에 중요한 것으로 공지되어 있는 모든 프로모터 서열을 포함하고 있다. pIE1-1 및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하고 있고 융합 단백질을 생성하는 데 사용할 수 있다. 간단히 말해서, 원하는 서열 또는 원하는 일부 서열 (예컨대, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)은 5' 및 3' 영역에 상응하는 프라이머를 사용한 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 플랭킹 (선택된) 제한효소 부위를 도입시킬 수 있 다. 그 다음으로, 상기 선택된 제한효소로 생성물을 절단하고 발현 벡터내로 서브클로닝하였다. 예를 들어, pIE1-1의 유도체는 원하는 서열의 3'-하류에 인간 IgG의 Fc 영역 (pb.PH.IgG) 또는 8개의 히스티딘 (pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터 제작물은 시퀀싱하여 확인하였다.Alternatively, a modified baculovirus method can be used when using high-5 cells. In this method, the DNA encoding the desired sequence is amplified with a suitable system such as Pfu (Stratagene) and combined with the 5'-upstream of the epitope tag included in the baculovirus expression vector. Such epitope tags include poly-His tags and immunoglobulin tags (similar to the Fc region of IgG). Various plasmids are available, including plasmids derived from commercially available plasmids such as pIE1-1 (Novagen). PIE1-1 and pIE1-2 vectors were designed to express recombinant proteins at baseline concentrations from the baculovirus ie1 promoter in stably transformed insect cells. The plasmid differs only in the orientation of multiple cloning sites and includes all promoter sequences that are known to be important for ie1-mediated gene expression in uninfected intracellular cells as well as the hr5 enhancer element. pIE1-1 and pIE1-2 contain translation initiation sites and can be used to generate fusion proteins. In brief, the desired sequence or some desired sequence (eg, the sequence encoding the extracellular domain of the transmembrane protein) was amplified by PCR using primers corresponding to the 5 'and 3' regions. The 5 'primer can introduce flanking (selected) restriction enzyme sites. The product was then cleaved with the selected restriction enzyme and subcloned into the expression vector. For example, derivatives of pIE1-1 may comprise an Fc region (pb.PH.IgG) or eight histidine (pb.PH.His) tags of human IgG 3'-downstream of the desired sequence. Preferably, the vector construct was identified by sequencing.

하이-5 세포를 CO₂ 및 페니실린/스트렙토마이신이 없는 27℃ 조건하에서 50%의 전면생장률까지 배양하였다. 각 150 mm 플레이트의 경우, 서열을 포함하는 pIE 기재의 벡터 30 ㎍을 1 ml의 Ex-셀 배지 (배지: Ex-셀 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences #14401-78P (주의: 이 배지는 광에 민감함))와 혼합하고, 다른 튜브에서 100 ㎕의 셀펙틴 (셀펙틴 (GibcoBRL #10362-010) (볼텍싱하여 혼합함))을 1 ml의 Ex-셀 배지와 혼합하였다. 상기 두 용액을 합하고 실온에서 15분동안 인큐베이션하였다. 8 ml의 Ex-셀 배지를 2 ml의 DNA/셀펙틴 혼합물에 첨가하고, 이것을 Ex-셀 배지로 한번 세척한 하이-5 세포 위에 가하였다. 그 다음으로, 이 플레이트를 실온의 암실에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 이어서, DNA/셀펙틴 혼합물을 흡입 제거하고, 세포를 Ex-셀 배지로 한번 세척하여 잔존하는 셀펙틴을 제거하고, 30 ml의 새로운 Ex-셀 배지를 첨가한 다음, 세포를 28℃에서 3일동안 인큐베이션하였다. 상등액을 모으고, 히스티딘 태그된 단백질의 경우에는 1 ml의 상등액을 25 ml의 Ni²⁺-NTA 비드 (Qiagen)에 배치 결합시키고, IgG 태그된 단백질의 경우에는 1 ml의 상등액을 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia)에 배치 결합시킨 후, 코마시에 블루 염색에 의한 단백질 표준물의 공지된 농도와 비교하는 SDS-PAGE 분석 을 수행함으로써 바큘로바이러스 발현 벡터내 서열의 발현을 측정하였다.High-5 cells were cultured to 27% confluent growth under 27 ° C. free of CO ₂ and penicillin / streptomycin. For each 150 mm plate, 30 μg of the pIE based vector containing the sequence was added to 1 ml of Ex-cell medium (medium: Ex-cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences # 14401-78P) (Note: this medium Is sensitive to light) and 100 μl of cefectin (Gelcotin (GibcoBRL # 10362-010) (vortex mixed)) was mixed with 1 ml of Ex-cell medium in another tube. The two solutions were combined and incubated for 15 minutes at room temperature. 8 ml of Ex-cell medium was added to 2 ml of DNA / Secfectin mixture, which was added onto high-5 cells washed once with Ex-cell medium. This plate was then incubated for 1 hour in the dark at room temperature. The DNA / Selfectin mixture is then aspirated off, the cells are washed once with Ex-cell medium to remove remaining cellfectin, 30 ml of fresh Ex-cell medium is added, and the cells are then stored at 28 ° C. for 3 days. During incubation. Collect the supernatant, bind 1 ml of supernatant to 25 ml Ni ²⁺ -NTA beads (Qiagen) for histidine tagged proteins and 1 ml of supernatant for IgG tagged proteins to protein-A sepharose After batch binding to CL-4B beads (Pharmacia), expression of sequences in baculovirus expression vectors was measured by performing SDS-PAGE analysis comparing the known concentrations of protein standards by Coomassie blue staining.

형질감염된 세포 (0.5 내지 3 L)로부터 상태가 변한 배지를 원심분리하여 모아 세포를 제거하고, 0.22 마이크론 필터를 통해 여과하였다. 폴리-His 태그된 제작물의 경우에는, Ni²⁺-NTA 컬럼 (Qiagen)을 사용하여 서열을 포함하는 단백질을 정제한다. 정제하기 전, 이미다졸을 5 mM 농도까지 상기 배지에 첨가하였다. 상기 배지를 48℃에서 4-5 ml/분의 유속으로 Ni²⁺-NTA 컬럼 [20 mM 헤페스 완충액 (pH 7.4, 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유함)으로 평형된 것] 위에 펌핑하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고, 단백질을 0.25 M 이미다졸이 함유된 평형 완충액으로 용출하였다. 그 다음으로, 고도로 정제된 단백질은 25 ml G25 수퍼파인 (Superfine, Pharmacia) 컬럼을 사용하여 저장 완충액 (10 mM 헤페스, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유함, pH 6.8)내로 탈염시키고, -80℃에 저장하였다.Changed media from transfected cells (0.5-3 L) were collected by centrifugation to remove cells and filtered through a 0.22 micron filter. For poly-His tagged constructs, Ni ²⁺ -NTA columns (Qiagen) are used to purify the protein comprising the sequence. Prior to purification, imidazole was added to the medium up to 5 mM concentration. The medium was pumped onto a Ni ²⁺ -NTA column (equilibrated with 20 mM Hepes buffer (containing pH 7.4, 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole)) at a flow rate of 4-5 ml / min at 48 ° C. It was. After loading, the column was washed with equilibration buffer and the protein was eluted with equilibration buffer containing 0.25 M imidazole. Next, the highly purified protein is desalted into storage buffer (containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol, pH 6.8) using a 25 ml G25 Superfine, Pharmacia column, − Store at 80 ° C.

단백질의 이뮤노어드헤신 (Fc 포함함) 제작물을 하기와 같이 상태가 변한 배지로부터 정제하였다. 상기 배지를 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형시킨 단백질 A 컬럼 (Pharmacia) 상에 펌핑하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 철저히 세척한 후, 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질은 1 ml의 분획을 275 ml의 1 M 트리스 완충액 (pH 9)이 함유된 튜브내로 모음으로써 즉시 중화시켰다. 그 다음으로, 상기 폴리-His 태그된 단백질의 경우와 같이 고도로 정제된 단백질을 저장 완충액내로 탈염시켰다. 서열의 균질성은 SDS 폴 리아크릴아미드 겔, 에드만 분해에 의한 N-말단 서열 시퀀싱 및 필요하거나 원한다면 다른 분석 방법으로 조사하였다. An immunoadhesin (including Fc) construct of the protein was purified from the medium in a changed state as follows. The medium was pumped onto a Protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8. After loading, the column was washed thoroughly with equilibration buffer and then eluted with 100 mM citric acid (pH 3.5). Eluted protein was immediately neutralized by collecting 1 ml fractions into tubes containing 275 ml of 1 M Tris buffer (pH 9). Next, highly purified protein was desalted into storage buffer as in the case of the poly-His tagged protein. Sequence homogeneity was investigated by SDS polyacrylamide gels, N-terminal sequence sequencing by Edman degradation and other analytical methods if desired or desired.

PRO179, PRO205, PRO321, PRO333, PRO364, PRO844, PRO846, PRO877, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO1760을 상기 기재된 방법으로 하이-5 세포에서 발현시켰다.PRO179, PRO205, PRO321, PRO333, PRO364, PRO844, PRO846, PRO877, PRO879, PRO882, PRO885 and PRO1760 were expressed in high-5 cells by the method described above.

실시예 25: PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 결합하는 항체의 제조Example 25 Preparation of Antibody Binding to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887과 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 하기 실시예에서 기술한다.Preparation of monoclonal antibodies capable of specifically binding with PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 in the Examples below Describe.

모노클로날 항체의 제조 기술은 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어, 상기 골딩 (Golding)의 문헌에 기재되었다. 사용할 수 있는 면역원으로는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 포함하는 정제된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 융합 단백질, 및 세포 표면 상에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 코딩하는 유전자를 발현하는 세포가 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 면역원을 선별할 수 있다.Techniques for the preparation of monoclonal antibodies are known in the art and are described, for example, in Golding, supra. Available immunogens include purified PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, including PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 Fusion Proteins, and PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, There are cells that express genes encoding PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887. One skilled in the art can select immunogens without undue experimentation.

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 면역원을 완전 프로인트 (Freund's) 면역보강제에 유화시키고 1 내지 100 마이크로그램의 양을 피하 또는 복강내 투여함으로써 Balb/c와 같은 마우스를 면역화시켰다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 immunogens are emulsified in Freund's immunoadjuvant and 1 to 100 micrograms Mice such as Balb / c were immunized by subcutaneous or intraperitoneal administration of sheep.

별법으로, 상기 면역원을 MPL-TDM 면역보강제 (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시키고, 동물의 뒷발 패드내에 주사하였다. 그 다음으로 10 내지 12일 후, 면역화된 마우스를 선별된 면역보강제에 유화된 추가 면역원으로 부스팅하였다. 그 후, 수주동안 마우스를 추가적으로 면역 주사하여 부스팅시킬 수도 있다. 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 항체를 검출하는 ELISA 검정에서 시험하기 위해, 안와후 출혈을 통해 혈청 샘플을 마우스로부터 주기적으로 수득할 수 있다. Alternatively, the immunogen was emulsified in MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) and injected into the hind paw pad of the animal. After 10-12 days, the immunized mice were then boosted with additional immunogens emulsified in the selected adjuvant. The mice may then be boosted by additional immunoinjection for several weeks. Anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321, anti-PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti- Serum samples can be obtained periodically from mice via post-orbital bleeding for testing in ELISA assays detecting PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 antibodies.

적당한 항체 역가를 검출한 후, 항체에 대해 "양성" 반응을 보이는 동물에게 최종적으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 정맥내 주사할 수 있다. 3 내지 4일 후, 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 채취한다. 그 다음으로, 상기 비장 세포를 P3X63AgU.1 (ATCC No. CRL1597)와 같은 선별된 뮤린 골수종 세포주와 융합시킨다 (35% 폴리에틸렌 글리콜을 사용함). 이 융합의 결과, 융합되지 않은 세포, 육종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제 하는 HAT 배지를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅할 수 있는 하이브리도마 세포를 얻었다.After detecting the appropriate antibody titers, the animals finally showing "positive" response to the antibody are finally PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 Alternatively, PRO887 can be injected intravenously. After 3-4 days, mice are sacrificed and spleen cells are harvested. The spleen cells are then fused with selected murine myeloma cell lines such as P3X63AgU.1 (ATCC No. CRL1597) (using 35% polyethylene glycol). As a result of this fusion, hybridoma cells that can be plated on 96-well tissue culture plates containing HAT medium that inhibit the proliferation of unfused cells, sarcoma hybrids and spleen cell hybrids were obtained.

PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 대한 상기 하이브리도마 세포의 반응성을 ELISA에서 스크리닝할 것이다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포는 당업자라면 판별할 수 있다. Reactivity of these hybridoma cells to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 will be screened in ELISA. “Positive” hybridoma cells that secrete the desired monoclonal antibody to PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 or PRO887 are those skilled in the art. Can be determined.

양성 하이브리도마 세포를 유전적 동계의 Balb/c 마우스내에 복강내 주사하여 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 얻을 수 있다. 별법으로, 상기 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 배양할 수 있다. 상기 복수에 함유되어 있는 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전에 이어 겔-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질 A 또는 단백질 G와 항체의 결합을 기초로 하는 친화 크로마토그래피를 사용할 수 있다. Positive hybridoma cells were intraperitoneally injected into genetic syngeneic Balb / c mice to induce anti-PRO179, anti-PRO238, anti-PRO364, anti-PRO844, anti-PRO846, anti-PRO1760, anti-PRO205, anti-PRO321 Ascites containing anti-PRO333, anti-PRO840, anti-PRO877, anti-PRO878, anti-PRO879, anti-PRO882, anti-PRO885 or anti-PRO887 monoclonal antibodies can be obtained. Alternatively, the hybridoma cells can be cultured in tissue culture flasks or roller bottles. The monoclonal antibodies contained in the plurality may be purified using ammonium sulfate precipitation followed by gel-exclusion chromatography. Alternatively, affinity chromatography based on the binding of the protein A or protein G with the antibody can be used.

<물질의 기탁><Deposition of substance>

하기 물질(들)을 아메리칸 컬쳐 콜렉션 (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC))에 기탁하였다.The following material (s) were deposited in the American Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC)).

물질matter ATCC 기탁 번호ATCC Deposit Number 기탁일Deposit date DNA16451-1388DNA16451-1388 209776209776 1998년 4월 14일April 14, 1998 DNA35600-1162DNA35600-1162 209370209370 1997년 10월 16일October 16, 1997 DNA47365-1206DNA47365-1206 209436209436 1997년 11월 7일November 7, 1997 DNA59838-1462DNA59838-1462 209976209976 1998년 6월 16일June 16, 1998 DNA44196-1353DNA44196-1353 209847209847 1998년 5월 6일May 6, 1998 DNA76532-1702DNA76532-1702 203473203473 1998년 11월 17일November 17, 1998 DNA34433DNA34433 209719209719 1998년 3월 31일March 31, 1998 DNA53987DNA53987 209858209858 1998년 5월 12일May 12, 1998

기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙(부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허락시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시(이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙(37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.The deposit was made under the provisions of the Budapest Treaty and its rules (Budapest Treaty) on the international approval of microbial deposits under the patent procedure. This ensures maintenance of the viable culture of the deposit for 30 years from the date of deposit. The deposits will be sold from ATCC under the Convention of the Budapest Treaty under the agreement between Genentech Inc and ATCC, upon the grant of the relevant US patent or upon the publication of a US or foreign patent application (when it is first). To ensure the permanent and non-limiting distribution of water culture progeny, and to the US Patent and Trademark Commissioner in 35 USC §122 and the rules of the US Patent and Trademark Commissioner (including 37 CFR §1.14, in particular see 886 OG 638). Progenie's sale is assured to those who have the right to do so.

본 출원의 양수인은 적합한 조건하에서 배양시 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 이를 통지하면 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.The assignee of the present application agrees that upon incubation under appropriate conditions, if the culture of the deposited material is killed, lost or damaged, the notification will promptly replace the material with another identical material. The sale of deposited materials should not be construed as an authorization of the governments to carry out the invention in violation of the rights granted under the patent law.

앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태가 본 발명의 특정 측면의 한 예시로 서 의도되는 것이므로 본 발명은 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 수식이 당업계 숙련자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.The foregoing description is considered to be sufficient to enable one skilled in the art to practice the invention. Since the deposited embodiments are intended as an illustration of certain aspects of the invention, the invention is not limited to the scope of the deposited structures, and any functionally equivalent structures are within the scope of the invention. The deposit of a substance herein does not mean that the disclosure contained herein is inappropriate for carrying out any aspect, including the best mode of the invention, and is intended to limit the scope of the claims to the specific description set forth in the specification. It should not be interpreted. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein above are apparent to those skilled in the art and will be within the scope of the appended claims.

본 발명은 포유동물의 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 촉진 또는 억제하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 단백질은 혈관신생의 촉진 또는 억제, 혈관 내피세포 증식의 억제 또는 자극, 혈관 내피세포의 증식 또는 증식의 자극, 종양 증식의 억제, 혈관신생-의존성 조직 증식의 억제, 혈관신생-의존성 조직 증식의 자극, 심비대증의 억제 및 심비대증의 자극과 같은 효과가 필요한 질환의 치료 (예방을 포함함) 및 진단, 예를 들어, 울혈성 심부전의 치료에 유용한 약물을 제공한다.The present invention provides compositions and methods for promoting or inhibiting angiogenesis and / or cardiovascularization in mammals. Proteins according to the invention promote or inhibit angiogenesis, inhibit or stimulate vascular endothelial cell proliferation, stimulate vascular endothelial cell proliferation or proliferation, inhibit tumor proliferation, inhibit angiogenesis-dependent tissue proliferation, angiogenesis-dependent Provided are drugs useful for the treatment (including prevention) and diagnosis of diseases requiring effects such as stimulation of tissue proliferation, inhibition of cardiac hypertrophy and stimulation of cardiac hypertrophy, for example, treatment of congestive heart failure.

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Claims (8)

(a) 세포와 스크리닝할 시험화합물을 서열번호 20 (SEQ ID NO: 20)의 아미노산 서열을 갖는 PRO840 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포반응의 유도에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; (a) contacting a cell with a test compound to be screened under conditions suitable for induction of a cellular response normally induced by a PRO840 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 20); (b) 상기 시험화합물이 효과적인 아고니스트인지를 결정하기 위해 상기 세포반응의 유도를 확인하는 단계 (이는 시험화합물이 효과적인 아고니스트임을 표시함)를 포함하는 PRO840 폴리펩티드의 아고니스트를 확인하는 방법.(b) confirming the induction of the cellular response to determine if the test compound is an effective agonist, which indicates that the test compound is an effective agonist. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 의하여 정상적으로 유도되는 세포반응이 세포증식의 자극인 방법. The method of claim 1, wherein the cellular response normally induced by the polypeptide is stimulation of cell proliferation. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 의하여 정상적으로 유도되는 세포반응이 내피세포에서의 c-fos의 유도인 것인 방법. The method of claim 1, wherein the cellular response normally induced by the polypeptide is induction of c-fos in endothelial cells. (a) 시험화합물을 서열번호 20 (SEQ ID NO:20)의 아미노산 서열을 갖는 PRO840 폴리펩티드와 그들이 상호작용할 수 있는 조건하에서 충분한 시간 동안 접촉시키고,  (a) contacting the test compound with a PRO840 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 20) for a sufficient time under conditions such that they can interact, (b) 상기 폴리펩티드의 활성이 억제되는지를 확인하는 것을 포함하는, PRO 840 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물의 확인방법.(b) A method of identifying a compound that inhibits the activity of a PRO 840 polypeptide, comprising determining whether the activity of the polypeptide is inhibited. (a) 세포와 스크리닝할 시험화합물을 서열번호 20 (SEQ ID NO: 20)의 아미노산 서열을 갖는 PRO840 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포반응을 유도하기에 적합한 조건하에 PRO840 폴리펩티드의 존재하에서 접촉시키는 단계; (a) contacting the test compound to be screened with the cells in the presence of the PRO840 polypeptide under conditions suitable to induce a cellular response normally induced by the PRO840 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 20); (b) 상기 시험화합물이 효과적인 길항제인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계(b) confirming the induction of the cellular response to determine whether the test compound is an effective antagonist 를 포함하는 PRO840 폴리펩티드의 길항제를 확인하는 방법.Method for identifying an antagonist of a PRO840 polypeptide comprising a. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 의하여 정상적으로 유도되는 세포반응이 세포증식의 자극인 방법. The method of claim 5, wherein the cellular response normally induced by the polypeptide is stimulation of cell proliferation. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 의하여 정상적으로 유도되는 세포반응이 내피세포에서의 c-fos의 유도인 것인 방법. The method of claim 5, wherein the cellular response normally induced by the polypeptide is induction of c-fos in endothelial cells. 세포와 시험화합물을 서열번호 20 (SEQ ID NO: 20)의 아미노산 서열을 갖는 PRO840 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 조건하에 접촉시키고, 상기 폴리펩티드의 발현이 억제되는지를 확인하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드를 정상적으로 발현하는 세포에서 상기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물의 확인방법. Contacting the cell and the test compound under conditions suitable for expressing the PRO840 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 20) and confirming that the polypeptide expression is inhibited normally A method for identifying a compound that inhibits expression of the polypeptide in expressing cells.

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