JP2008005735A - METHOD FOR PRODUCING alpha-D-GLUCOPYRANOSYLGLYCEROL - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの製造方法に関し、さらに詳しくはα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールをより安価に、且つ効率良く製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing α-D-glucopyranosylglycerol, and more particularly to a method for producing α-D-glucopyranosylglycerol at lower cost and efficiency.
α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは、低褐変性、低メイラード反応性、加熱安定性、非う蝕性、難消化性、高い保湿性を有する甘味物質として有用な物質である。従来、このα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（以下、ＧＧとも表記する）の製造方法としては、例えば、マルトオリゴ糖などを含有する糖類とグリセロールの混合物にカビ由来のα−グルコシダーゼを作用させることにより、グリセロールにグルコシル基を転移させて製造する方法（特許文献１）、清酒、味噌、みりん等の醸造物から抽出する方法、イソマルトース、マルチトールなどを四酢酸鉛や過ヨウ素酸塩でグリコール開裂したものを還元する方法、あるいはＫｏｅｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ反応により合成したβ−グルコシドをアノメリゼーションした後、β−グルコシダーゼでβ−グルコシドを加水分解する方法などが知られている。 α-D-Glucopyranosylglycerol is a substance useful as a sweet substance having low browning, low Maillard reactivity, heat stability, non-cariogenicity, indigestibility, and high moisture retention. Conventionally, as a method for producing this α-D-glucopyranosylglycerol (hereinafter also referred to as GG), for example, a fungus-derived α-glucosidase is allowed to act on a mixture of saccharide and glycerol containing maltooligosaccharide and the like. By glycosyl group transfer to glycerol (Patent Document 1), extraction from brewed products such as sake, miso, mirin, isomaltose, maltitol, etc. with lead tetraacetate or periodate glycol A method of reducing the cleaved one, a method of anomerizing β-glucoside synthesized by Koenigs-Knorr reaction, and then hydrolyzing β-glucoside with β-glucosidase are known.
上記既知方法の中でも、特許文献１に記載の方法が最も収率がよく工業的に優れた方法である。この方法で得られる酵素反応液中には、ＧＧの他にグルコース、グリセロール、イソマルトオリゴ糖なども残存しているため、前記特許文献１では、前記酵素反応液中のα−グルコシダーゼ活性を失活させた後、該反応液をイオン交換樹脂アンバーライトＭＢ−２処理および活性炭カラムクロマトグラフィーに付し、溶出液を濃縮することによりシロップ状の高純度のＧＧを得ている。 Among the known methods, the method described in Patent Document 1 has the highest yield and is industrially superior. In the enzyme reaction solution obtained by this method, glucose, glycerol, isomaltoligosaccharide and the like other than GG remain. Therefore, in Patent Document 1, the α-glucosidase activity in the enzyme reaction solution is deactivated. Then, the reaction solution was subjected to ion exchange resin Amberlite MB-2 treatment and activated carbon column chromatography, and the eluate was concentrated to obtain syrupy high-purity GG.
高純度のＧＧを得るための精製方法としては、アミノカラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、擬似移動床式クロマト分離装置などがあるが、アミノカラムクロマトグラフィーは、溶出液にアセトニトリルを用いるため、食品などに使用する場合に安全性に欠け、また精製効率が悪い。活性炭カラムクロマトグラフィーは精製効率がアミノカラムクロマトグラフィーよりは良いが、擬似移動床式クロマト分離装置に比べると格段に効率が悪い。もっとも効率の良い擬似移動床式クロマト分離装置は、高額な装置であり、充填剤の劣化等によるメンテナンスにもかなりの費用がかかる上に、ＧＧ含有反応液に共存するグルコースとグリセロールにより精製効率が落ちるという問題がある。 Examples of purification methods for obtaining high purity GG include amino column chromatography, activated carbon column chromatography, and pseudo moving bed type chromatographic separation device. Since amino column chromatography uses acetonitrile as the eluent, It is not safe when used in the process, and the purification efficiency is poor. Activated carbon column chromatography has better purification efficiency than amino column chromatography, but is much less efficient than simulated moving bed chromatographic separation equipment. The most efficient simulated moving bed chromatographic separation device is an expensive device, which requires considerable cost for maintenance due to deterioration of the packing material, etc., and has a purification efficiency due to glucose and glycerol coexisting in the GG-containing reaction solution. There is a problem of falling.
そこで本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼ活性を失活させて得られるＧＧを含む溶液（以下、ＧＧ反応液とも表記する。）に、糖化酵素（例えば、グルコアミラーゼ）を作用させて、残存しているマルトオリゴ糖類を加水分解することで、ＧＧの減少なしに、ＧＧ、グルコース、グリセロールのほぼ三成分になることを見出した（以下、加水分解後に得られる溶液を加水分解液とも表記する）。
さらに本発明者らは、グルコース及びグリセロールの資化性を持つ酵母の中でもＧＧを資化しない酵母を見出し、加水分解液を添加した培養液中でこの酵母を培養すると、グルコースとグリセロールが除去された高純度のＧＧ溶液が得られることを見出した。
本発明は、上記知見に基づき、さらに検討して完成したものである。
Accordingly, as a result of intensive studies, the present inventors have found that a solution containing GG obtained by reacting α-glucosidase with a mixture of saccharides and glycerol containing at least maltooligosaccharide and then inactivating the α-glucosidase activity ( Hereinafter, a saccharification enzyme (for example, glucoamylase) is allowed to act on the GG reaction solution to hydrolyze the remaining maltooligosaccharide, thereby reducing GG, glucose, and glycerol without reducing GG. It has been found that it has almost three components (hereinafter, a solution obtained after hydrolysis is also referred to as a hydrolysis solution).
Furthermore, the present inventors have found a yeast that does not assimilate GG among yeasts that assimilate glucose and glycerol, and when this yeast is cultured in a culture solution to which a hydrolysis solution has been added, glucose and glycerol are removed. It was found that a highly pure GG solution was obtained.
The present invention has been completed by further study based on the above findings.
すなわち、本発明は、
［１］少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とするα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの製造方法、
［２］糖化酵素が、オリゴ糖のα結合を加水分解するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを加水分解しない酵素である前記［１］に記載の製造方法、
［３］糖化酵素が、グルコアミラーゼである前記［１］に記載の製造方法、
［４］微生物が、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物である前記［１］に記載の製造方法、
［５］ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である［４］に記載の製造方法、および
［６］酵素反応後、さらに培養終了液から培地成分を除去する前記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法、
に関する。
That is, the present invention
[1] preparing a solution containing α-D-glucopyranosylglycerol obtained by reacting α-glucosidase with a mixture of saccharide and glycerol containing at least maltooligosaccharide and then inactivating the α-glucosidase; The maltooligosaccharide remaining in the solution is hydrolyzed with a saccharifying enzyme, and after that or simultaneously with hydrolysis, a microorganism that assimilates glucose and glycerol but does not assimilate α-D-glucopyranosylglycerol is added and cultured. A process for producing α-D-glucopyranosylglycerol,
[2] The production method according to [1], wherein the saccharifying enzyme is an enzyme that hydrolyzes an α-bond of an oligosaccharide but does not hydrolyze α-D-glucopyranosylglycerol.
[3] The production method according to [1], wherein the saccharifying enzyme is glucoamylase,
[4] The production method according to the above [1], wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Pichia.
[5] The production method according to [4], wherein the microorganism belonging to the genus Pichia is Pichia pastoris, and [6] After the enzyme reaction, the medium component is further removed from the culture end solution [1] ] To the production method according to any one of [5],
About.
本発明方法は、煩雑な処理や高額なランニングコストの必要がなく、ＧＧを安価に製造することができる。ＧＧは呈味がよく、安定性に優れており、近年多くの機能性が明らかとなってきていることから、より安価に製造することで、さらに広範な利用が期待できる。 The method of the present invention does not require complicated processing and expensive running costs, and can produce GG at low cost. Since GG has good taste, excellent stability, and many functionalities have been clarified in recent years, it can be expected to be used more widely by producing it at a lower cost.
本発明のα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの製造方法は、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とする。 The method for producing α-D-glucopyranosylglycerol of the present invention is obtained by reacting α-glucosidase with a mixture of a saccharide containing at least maltooligosaccharide and glycerol, and then inactivating the α-glucosidase. A solution containing D-glucopyranosylglycerol is prepared, malto-oligosaccharide remaining in the solution is hydrolyzed with a saccharifying enzyme, and after that or simultaneously with hydrolysis, glucose and glycerol are assimilated, but α-D-glucose is used. It is characterized by adding and culturing a microorganism that does not assimilate pyranosylglycerol.
（原料溶液の準備）
本発明の第一工程は、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液（ＧＧ反応液）を準備する工程である。
少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類としては、例えばデンプンやアミロースにアミラーゼを作用させることによって得られるマルトオリゴ糖を含む糖類が好適に挙げられる。ここにマルトオリゴ糖としては、例えばマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなど、グルコースが２〜７個α−１，４−グルコシド結合したオリゴ糖が挙げられる。
少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類に対するグリセロールの使用比率は特に限定されない。
(Preparation of raw material solution)
The first step of the present invention includes α-D-glucopyranosylglycerol obtained by reacting α-glucosidase with a mixture of saccharide and glycerol containing at least maltooligosaccharide and then inactivating the α-glucosidase. This is a step of preparing a solution (GG reaction solution).
As the saccharide containing at least maltooligosaccharide, for example, a saccharide containing maltooligosaccharide obtained by allowing amylase to act on starch or amylose can be preferably mentioned. Examples of malto-oligosaccharides include oligosaccharides in which 2 to 7 α-1,4-glucoside bonds of glucose, such as maltose, maltotriose, maltotetraose and maltopentaose, are used.
The ratio of glycerol to saccharide containing at least maltooligosaccharide is not particularly limited.
一方、α−グルコシダーゼとしては、カビ由来のα−グルコシダーゼが好ましく、特にアスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などの生産するα−グルコシダーゼが好ましい。また、この酵素は、精製酵素であっても、粗精製酵素であってもよい。
マルトオリゴ糖とグリセロールとの酵素反応は常法に従って行なうことができ、例えばｐＨ４〜６で、かつ４０〜６０℃で好適に実施することができる。酵素反応時間は、特に限定されないが、通常１２〜４８時間である。
酵素反応後、反応液を加熱することによりα−グルコシダーゼを失活させることができる。このようにして得た溶液（ＧＧ反応液）中には、ＧＧ以外にもグリセロール、グルコース、オリゴ糖などが存在する。
On the other hand, as α-glucosidase, α-glucosidase derived from fungi is preferable, and α-glucosidase produced by Aspergillus oryzae, Aspergillus niger or the like is particularly preferable. Further, this enzyme may be a purified enzyme or a crudely purified enzyme.
The enzymatic reaction between maltooligosaccharide and glycerol can be carried out according to a conventional method, for example, preferably at pH 4 to 6 and at 40 to 60 ° C. The enzyme reaction time is not particularly limited, but is usually 12 to 48 hours.
After the enzyme reaction, α-glucosidase can be inactivated by heating the reaction solution. In the solution thus obtained (GG reaction solution), there are glycerol, glucose, oligosaccharide and the like in addition to GG.
なお、ＧＧ反応液中に含まれるＧＧは、α−Ｄ−グルコピラノシル基がグリセロールの１位又は２位に置換した化合物であり、式１：
（糖化酵素との反応）
本発明の第２工程は、原料溶液である上記ＧＧ反応液中に残存するオリゴ糖を糖化酵素で加水分解する反応である。この反応により、残存するオリゴ糖が分解し、ＧＧ、グリセロール、グルコースのほぼ３成分からなる溶液となる。
(Reaction with saccharifying enzyme)
The second step of the present invention is a reaction in which the oligosaccharide remaining in the GG reaction solution, which is a raw material solution, is hydrolyzed with a saccharifying enzyme. By this reaction, the remaining oligosaccharide is decomposed to form a solution composed of almost three components, GG, glycerol and glucose.
糖化酵素（グルコアミラーゼ）は、マルトオリゴ糖などの基質の非還元性末端グルコース残基から順に加水分解する。グルコアミラーゼには酵母やカビ由来のものがあるが、ＧＧを分解しないものであれば使用可能であり、中でもアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）やリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）などの生産するグルコアミラーゼが好適である。また、α−グルコシダーゼの作用で生成する副産物としてイソマルトオリゴ糖があり、そのα−１，６結合を加水分解するプルラナーゼ等を併用してもよい。 Saccharification enzyme (glucoamylase) hydrolyzes in order from the non-reducing terminal glucose residue of a substrate such as maltooligosaccharide. Some glucoamylases are derived from yeast or mold, but can be used as long as they do not degrade GG. Among them, glucoamylases produced by Aspergillus niger and Rhizopus nieveus are available. Is preferred. Further, as a by-product generated by the action of α-glucosidase, there is isomaltooligosaccharide, and pullulanase that hydrolyzes the α-1,6 bond may be used in combination.
作用条件は特に限定されないが、例えば、反応温度は、２０〜５０℃が好ましいが、反応温度６０℃でも酵素反応には支障がない。反応液の液性は、ｐＨ３〜６、特にｐＨ４〜５が好ましい。また、グルコアミラーゼの添加量は、ＧＧ反応液に含まれる固形分を基質とし、４０℃、２４時間反応させた場合、５０％（ｗ／ｗ）以下の基質に対し、基質グラム（ｇ）あたり３０Ｕ以上、好ましくは６０Ｕ以上（１Ｕは、０．５６％可溶性澱粉溶液９ｍｌに希釈酵素液１ｍｌを加え、４０℃、ｐＨ４．５で３０分反応させた時に、グルコース１０ｍｇ相当の還元力を与える酵素量とする）であれば十分目的を達成することができる。
反応後の加水分解液には、ＧＧの他にグルコース、グリセロール、及びわずかに残存しているオリゴ糖類などが含まれる。
The operating conditions are not particularly limited. For example, the reaction temperature is preferably 20 to 50 ° C., but the enzyme reaction is not hindered even at a reaction temperature of 60 ° C. The liquidity of the reaction solution is preferably pH 3-6, particularly pH 4-5. In addition, the amount of glucoamylase added per gram (g) of substrate per 50% (w / w) or less of the substrate when the solid content contained in the GG reaction solution is used as a substrate and reacted at 40 ° C. for 24 hours. 30 U or more, preferably 60 U or more (1 U is an enzyme that gives a reducing power equivalent to 10 mg of glucose when 1 ml of diluted enzyme solution is added to 9 ml of 0.56% soluble starch solution and reacted at 40 ° C. and pH 4.5 for 30 minutes. The amount can be sufficiently achieved.
The hydrolyzed solution after the reaction contains, in addition to GG, glucose, glycerol, and a slightly remaining oligosaccharide.
（微生物の培養）
続く第３工程は、微生物を用いて加水分解溶液中で微生物を培養してグルコース及びグリセロールを除去する工程である。
本発明で使用可能な微生物は、ＧＧを分解することなく、グルコース及びグリセロールの資化性を有していれば良く、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、エンテロバクター・エアロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シトロバクター・フロンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）などである。ピキア・パストリスは、一般的にはメタノール資化性酵母として知られているが、グルコース及びグリセロール資化性も有しており、本発明者らは鋭意検討の結果、グルコース及びグリセロール、ＧＧの存在する培養液中でピキア・パストリスを培養すると、先にグルコースを資化し、次いでグリセロールを資化し、ＧＧをまったく資化しないということを初めて確認した。なお、本発明の実施例で使用した微生物（酵母）は、ピキア・パストリスの標準株で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構にＮＢＲＣ Ｎｏ．１０７７７として寄託されており、容易に入手することができる。
(Microbial culture)
The subsequent third step is a step of culturing the microorganism in a hydrolysis solution using the microorganism to remove glucose and glycerol.
The microorganism that can be used in the present invention only needs to have the ability to assimilate glucose and glycerol without degrading GG. For example, Pichia pastoris, Enterobacter aerogenes, Clostridium butyricum, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii and the like. Pichia pastoris is generally known as a methanol-assimilating yeast, but also has an ability to assimilate glucose and glycerol. As a result of intensive studies, the present inventors have found the presence of glucose, glycerol and GG. It was confirmed for the first time that Pichia pastoris was first assimilated glucose, then glycerol, and not assimilated GG at all, when Pichia pastoris was cultured in the culture medium. The microorganism (yeast) used in the examples of the present invention is a standard strain of Pichia pastoris, and NBRC No. It is deposited as 10777 and is readily available.
培養条件は特に限定されないが、例えば最終固形分濃度３〜１０％になるように調整した加水分解溶液に、微生物の生育に必要な成分（例えば、ペプトン、麦芽エキス、酵母エキスなどの培地成分）を添加し、ピキア・パストリスなどの微生物を植菌して培養を行う。残存する糖類を適宜分析し、グルコースとグリセロールがなくなれば、さらに加水分解液を固形分濃度３〜１０％になるように添加し、培養することを繰り返せば、培養液中のＧＧ濃度を上げることができる。 The culture conditions are not particularly limited, but for example, components necessary for the growth of microorganisms (for example, medium components such as peptone, malt extract, yeast extract) in a hydrolysis solution adjusted to a final solid content concentration of 3 to 10% And inoculate microorganisms such as Pichia pastoris and culture. Analyze the remaining saccharides as appropriate. If glucose and glycerol disappear, add a hydrolyzate to a solid concentration of 3-10% and repeat the culture to increase the GG concentration in the culture. Can do.
なお、第２工程の酵素による残存オリゴ糖の加水分解と、第３工程の微生物によるグルコースとグリセロールの除去は同時に行うこともできる。即ち、ＧＧ反応液を最終固形分濃度３〜１０％になるように添加した培地中にグルコアミラーゼなどの酵素を添加し、同時にピキア・パストリスなどの微生物を植菌して、適当な温度で培養を行えば、残存するオリゴ糖の除去が可能である。 The hydrolysis of the remaining oligosaccharide by the enzyme in the second step and the removal of glucose and glycerol by the microorganism in the third step can be performed simultaneously. That is, an enzyme such as glucoamylase is added to a medium in which a GG reaction solution is added to a final solid content concentration of 3 to 10%, and at the same time, microorganisms such as Pichia pastoris are inoculated and cultured at an appropriate temperature. The remaining oligosaccharide can be removed.
上記で得られた培養終了液から、微生物を除去することにより、高濃度のＧＧ溶液が得られる。微生物の除去は、遠心分離、ろ過などの常法により行なうことができる。微生物を除去した後の溶液は、必要に応じて、活性炭カラムクロマトグラフィー及びイオン交換カラムクロマトグラフィーなどを用いて培地成分等を除去することで、ＧＧの純度を高めることができる。 By removing microorganisms from the culture completion solution obtained above, a high-concentration GG solution can be obtained. The removal of the microorganisms can be performed by conventional methods such as centrifugation and filtration. The solution after removing the microorganisms can enhance the purity of GG by removing medium components and the like using activated carbon column chromatography, ion exchange column chromatography, and the like, if necessary.
次に本発明の実施例を具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で使用したピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、製品評価技術基盤機構にＮＢＲＣ Ｎｏ．１０７７７として寄託されている。 Next, examples of the present invention will be specifically described, but the present invention is not limited to these examples. In addition, Pichia pastoris (Pichia pastoris) used in the examples is NBRC No. Deposited as 10777.
［ＧＧ反応液の調製］
７０％（ｗ／ｗ）マルトトリオースシロップ３００ｍｌに６０％（ｗ／ｖ）グリセロール４００ｍｌ及びカビ（Ａｓｐ． ｎｉｇｅｒ）由来のα−グルコシダーゼ製剤（トランスグルコシダーゼＬ−アマノ、天野エンザイム製）２ｍｌを添加後、攪拌しながら４０℃で２４時間反応させた。次いで７０％（ｗ／ｗ）マルトトリオースシロップ３００ｍｌを追添し、攪拌しながら４０℃で２４時間反応させた。この反応液を８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、ＧＧ反応液を得た。
[Preparation of GG reaction solution]
After adding 400 ml of 60% (w / v) glycerol and 2 ml of α-glucosidase preparation (transglucosidase L-Amano, Amano Enzyme) derived from Asp. Niger to 300 ml of 70% (w / w) maltotriose syrup The mixture was reacted at 40 ° C. for 24 hours with stirring. Next, 300 ml of 70% (w / w) maltotriose syrup was added and reacted at 40 ° C. for 24 hours with stirring. This reaction solution was heated at 80 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme to obtain a GG reaction solution.
［製造例１］
ＧＧ反応液の固形分が７％（ｗ／ｗ）になるように希釈し、これにカビであるリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）由来のグルコアミラーゼ製剤（グルクザイムＡＦ６、天野エンザイム製）をＧＧ反応液の固形分１ｇ当たりに６、３０、６０または９０Ｕとなるように添加し、それぞれｐＨ５、４０℃で２４時間反応させた。
これらの反応液中に存在する三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロールおよびＧＧを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣは、カラムにＳｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ１０１（Ｎ）（島津製作所製）を用い、カラム温度は５０℃とし、溶出液は水を用い、流速は毎分０．６ｍｌ、検出器に示差屈折率計を用いた。
結果は、図１の通りである。図１からグルコアミラーゼ製剤を固形分（基質）１ｇあたり３０Ｕ以上であれば十分効果が得られることがわかる。
[Production Example 1]
A GG reaction solution is diluted with a solid content of 7% (w / w), and a glucoamylase preparation (Gluczyme AF6, manufactured by Amano Enzyme) derived from the mold Rhizopus niveus is added to the GG reaction solution. Was added at a pH of 6, 30, 60 or 90 U per gram of the solid content, and reacted at pH 5 and 40 ° C. for 24 hours, respectively.
Trisaccharides, disaccharides, glucose, glycerol and GG present in these reaction solutions were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). For HPLC, Shim-pack SCR101 (N) (manufactured by Shimadzu Corporation) is used for the column, the column temperature is 50 ° C., the eluent is water, the flow rate is 0.6 ml / min, and the differential refractometer is used for the detector. Using.
The result is as shown in FIG. It can be seen from FIG. 1 that a sufficient effect can be obtained if the glucoamylase preparation is 30 U or more per 1 g of the solid content (substrate).
［製造例２］
ＧＧ反応液２０ｍｌを固形分が３０％（ｗ／ｗ）になるように希釈して、カビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）由来のグルコアミラーゼ製剤（グルクザイムＡＦ６、天野エンザイム製）０．１４ｇを添加して、３０℃で２４時間反応させ、加水分解液を得た。この加水分解液に栄養培地成分（０．５％ペプトン、０．３％麦芽エキス、０．３％酵母エキス；いずれも最終濃度ｗ／ｖ）を添加して、固形分が最終的に３％（ｗ／ｖ）になるように希釈し、培養液を調製した。酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を植菌後、３０℃で１２０時間振とう培養を行った。その間の三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロールおよびＧＧの経時的変化を実施例１と同様に調べた。
結果は図２の通りである。図中、濃度（％）は全固形分量を１００％としたときの各成分の濃度の相対的な濃度を示す。図２から明らかな通り、２４時間後から培養液中のグルコース、グリセロールが減少し始め、１２０時間後には殆んどなくなっていることがわかる。
[Production Example 2]
20 ml of GG reaction solution was diluted to a solid content of 30% (w / w), 0.14 g of a glucoamylase preparation (Gluczyme AF6, manufactured by Amano Enzyme) derived from mold (Rhizopus niveus) was added, and 30 It was made to react at 24 degreeC for 24 hours, and the hydrolysis liquid was obtained. Nutrient medium components (0.5% peptone, 0.3% malt extract, 0.3% yeast extract; both final concentrations w / v) are added to this hydrolyzed solution, and the solid content finally becomes 3%. The culture solution was prepared by diluting to (w / v). After inoculating the yeast Pichia pastoris, shaking culture was performed at 30 ° C. for 120 hours. In the meantime, changes with time of trisaccharide, disaccharide, glucose, glycerol and GG were examined in the same manner as in Example 1.
The result is as shown in FIG. In the figure, the concentration (%) indicates the relative concentration of each component when the total solid content is 100%. As is apparent from FIG. 2, it can be seen that glucose and glycerol in the culture broth began to decrease after 24 hours and almost disappeared after 120 hours.
１２０時間後培養した後の培養液をイオン交換カラムクロマトグラフィー及び活性炭カラムクロマトグラフィーに付してＧＧ以外の他の残存成分を除去した。溶出液を減圧濃縮し、固形分７０％で純度８５％のＧＧシロップを約３ｇ得た。 The culture solution after culturing for 120 hours was subjected to ion exchange column chromatography and activated carbon column chromatography to remove the remaining components other than GG. The eluate was concentrated under reduced pressure to obtain about 3 g of GG syrup having a solid content of 70% and a purity of 85%.
［製造例３］
ＧＧ反応液に栄養培地成分（０．５％ペプトン、０．３％麦芽エキス、０．３％酵母エキス；いずれも最終濃度ｗ／ｖ）を添加して、ＧＧ反応液を固形分が５％（ｗ／ｖ）になるように希釈した。この培養液４０ｍｌに、リゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）由来のグルコアミラーゼ製剤（グルクザイムＡＦ６、天野エンザイム製）を固形分１ｇに対して６０Ｕとなるように添加し、さらにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を植菌し、３０℃で振とう培養を行った。７２時間後、培養液をＨＰＬＣで分析した。ＧＧ濃度は約１％でグルコース及びグリセロールは完全に消費されていた。
[Production Example 3]
Add nutrient medium components (0.5% peptone, 0.3% malt extract, 0.3% yeast extract; both final concentrations w / v) to the GG reaction solution, and the GG reaction solution has a solid content of 5%. Diluted to (w / v). A glucoamylase preparation (Gluczyme AF6, manufactured by Amano Enzyme) derived from Rhizopus niveus is added to 40 ml of this culture solution so that the solid content is 60 U, and Pichia pastoris is further planted. Bacteria and cultured with shaking at 30 ° C. After 72 hours, the culture was analyzed by HPLC. The GG concentration was about 1%, and glucose and glycerol were completely consumed.
［製造例４］
製造例３で得られた培養液（培養３日目）にＧＧ反応液を、培養液に対し固形分３％（ｗ／ｖ）相当になるように添加し、３０℃で振とう培養した。４８時間後（培養開始後５日目）にグルコースおよびグリセロールの消費を確認した後、ＧＧ反応液を同様に固形分２％相当を添加し、４８時間培養した。４８時間後（培養開始後７日目）にさらにＧＧ反応液を固形分１．５％（ｗ／ｖ）相当を添加し、７２時間培養した。培養開始後の培養液中の各成分の濃度をＨＰＬＣで分析したときの経時的な変化は図３の通りである。
図３から分かるように、培養開始後１０日目のＧＧ濃度は約２．４７％、ＧＧ純度は全固形分中約６４％であった。
[Production Example 4]
The GG reaction solution was added to the culture solution obtained in Production Example 3 (cultivation day 3) so that the solid content was equivalent to 3% (w / v), and cultured at 30 ° C. with shaking. After confirming the consumption of glucose and glycerol 48 hours later (5 days after the start of culture), the GG reaction solution was similarly added with a solid content equivalent to 2% and cultured for 48 hours. 48 hours later (7 days after the start of culture), the GG reaction solution was further added with a solid content equivalent to 1.5% (w / v) and cultured for 72 hours. FIG. 3 shows the changes over time when the concentration of each component in the culture solution after the start of culture is analyzed by HPLC.
As can be seen from FIG. 3, the GG concentration on the 10th day after the start of the culture was about 2.47%, and the GG purity was about 64% in the total solid content.
［製造例５］
製造例４で得られた培養液を遠心分離により酵母を沈殿させ、上清を常法に従い活性炭クロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフィーで精製した。この溶出液を濃縮し、固形分７０％で純度約８５％のＧＧシロップ約１ｇを得た。
[Production Example 5]
The culture solution obtained in Production Example 4 was centrifuged to precipitate yeast, and the supernatant was purified by activated carbon chromatography and ion exchange chromatography according to a conventional method. The eluate was concentrated to obtain about 1 g of GG syrup having a solid content of 70% and a purity of about 85%.
本発明は、低褐変性、低メイラード反応性、加熱安定性、非う蝕性、難消化性、高い保湿性を有する甘味物質であるＧＧを高い純度にかつ工業的に有利に製造することができる。 The present invention can produce GG, which is a sweet substance having low browning, low Maillard reactivity, heat stability, non-cariogenicity, indigestibility, and high moisture retention, with high purity and industrially advantageously. it can.
Claims (6)
The production method according to any one of claims 1 to 5, wherein a medium component is further removed from the culture end solution after the enzyme reaction.
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