JPS62130695A - Production of galactooligo saccharide - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain a specific galactooligo saccharide in a high yield, by carrying out a reaction between beta-galactosidase obtained from a mold of a fungus belonging to the genus Cryptococcus and lactose or a substance containing lactose in the presence of a specific fungus. CONSTITUTION:In subjecting beta-galactosidase obtained from a mold of a fungus belonging to the genus Cryptococcus and lactose or a substance containing lactose to an enzymatic reaction, a fungus belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Lodderomyces or Hanseniaspora is present to improve 4'-galactosyl lactose shown by the formula and to make it difficult to by-produce rearranged oligosaccharides except the titled material.

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はガラクトオリゴ糖（ガラクトース残基を含むオ
リゴ糖〉の製造法に関し、さらに詳しくはクリプトコツ
カス（ＣｒＶｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　）属に属する微生物
を利用して〇−β−１〕−ガラクトピラノシル−（１→
４．）−０−β〜Ｄ−ガラクトピラノシルー（１→４）
−Ｄ−グルコースを製造する方法に関する。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention relates to a method for producing galactooligosaccharides (oligosaccharides containing galactose residues), and more specifically, a method for producing galactooligosaccharides (oligosaccharides containing galactose residues) using microorganisms belonging to the genus CrVptococcus. 〇-β-1]-galactopyranosyl-(1→
4. )-0-β~D-galactopyranosyl (1→4)
-Relating to a method for producing D-glucose.

「従来の技術」 近年、ガラクトオリゴ糖は腸内石川細菌であるビフィズ
ス菌の増殖因子として有効であると認められ、その製造
法が種々検問されている。"Prior Art" In recent years, galactooligosaccharides have been recognized as effective as growth factors for bifidobacteria, which are enteric Ishikawa bacteria, and various methods of producing them have been investigated.

ガラクトオリゴ糖を含む糖混合物の製造法としては、ラ
クトースを原料として特定の微生物を培養し、培養物中
にガラクトオリゴ糖を蓄積せしめる直接発酵法や、ラク
トースにβ−ガラクトシダーゼを作用させる酵素法が知
られている。Known methods for producing sugar mixtures containing galactooligosaccharides include a direct fermentation method in which specific microorganisms are cultured using lactose as a raw material and galactooligosaccharides are accumulated in the culture, and an enzymatic method in which β-galactosidase is applied to lactose. ing.

直接発酵法としては ■ｐ　ｃｎｉｃｉ　ｌ　ｌ　ｉｕｍ　　Ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍににる〇−β−Ｄ−Ｇａｌ−（１−６）−０−
β−Ｄ−Ｇａｌ−（１−＋４、　）　−Ｄ　−Ｇｌｃ（
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　１９６０．　ｖｏｌ、　９
゜ｐ１２５〜１２９） ■Ｓ　ｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　３　ｉｎｇｕｌａ
ｒｉｓによる〇−β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４．）−０−
β　−Ｄ−Ｇａｌ−（１−Ａ　　）−Ｄ　　　Ｇｌｃ、
Ｑ　−β　−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−〇−β　−Ｄ−
Ｇａｌ−（１→４）−０−β　−Ｄ−Ｑａｌ−（１−）
４　）　　　Ｄ　　　Ｇｌｃ（Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、１９６４．ｖｏｌ、４２．ｐ１３４１　〜１
３４４）■［３ａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｌ）、　Ｎ０１７７
８にＪ：るガラクトース、グルコース（β−Ｄ−結合）
からなる三糖類（特開昭５６−１１５７０６　） （以上、Ｑａｌはガラクトース残基、ＧＩＣはグルコー
ス残基を表わす） などの方法が報告されている。As for the direct fermentation method, ■p cnici l lium Chrysog
enum 〇-β-D-Gal-(1-6)-0-
β-D-Gal-(1-+4, )-D-Glc(
Tetrahedron, 1960. vol, 9
゜p125-129) ■S porobolomyces 3 ingula
〇-β-D-Gal-(1→4.)-0- by ris
β-D-Gal-(1-A)-D Glc,
Q -β -D-Gal-(1→4)-〇-β -D-
Gal-(1→4)-0-β-D-Qal-(1-)
4) D Glc (Can, J, Chemi
stry, 1964. vol, 42. p1341 ~1
344) ■ [3acillus Sl), N0177
8 J: galactose, glucose (β-D-bond)
Methods such as the trisaccharide consisting of (JP-A-56-115706) (hereinafter, Qal represents a galactose residue and GIC represents a glucose residue) have been reported.

一方、酵素法に関しては、ラクトースまたはラクトース
含有物にアスペルギルス・Ａリゼの生産したβ−ガラク
トシダーゼを作用させることにＪ−ッテ得られる一般式
Ｇａ１−　（Ｇａｌ）　ｎ　−Ｇｌｃ（式中、Ｑａｌは
ガラクト−ス残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎは１〜
４の整数を表わす）で示されるオリゴ糖や一般式０−β
−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４．）　−［０−β−Ｄ−Ｇａｌ
−（１→６）］　−Ｄ−Ｇｌｃ（式中Ｑａ＋はガラクト
ース残基、Ｇｌｃはグルコース残基）で示されるオリゴ
糖をビフィズス菌増殖因子どして用いることが提案され
ている（特公昭５８−２０２６６、特開昭５８−９９４
９７）。On the other hand, regarding the enzymatic method, the general formula Ga1- (Gal) n -Glc (wherein Qal is Galactose residue, Glc is glucose residue, n is 1-
represents an integer of 4) or the general formula 0-β
-D-Gal-(1→4.) -[0-β-D-Gal
-(1→6)] -D-Glc (in the formula, Qa+ is a galactose residue and Glc is a glucose residue) has been proposed to be used as a bifidobacteria growth factor (Japanese Patent Publication No. 58 -20266, JP-A-58-994
97).

［発明が解決しようとする問題点］ 上記従来の直接発酵法では、オリゴ糖の収率が低いか、
培養条件が限定されているなど、実用化の要請に応じら
れないものである。[Problems to be solved by the invention] In the conventional direct fermentation method described above, the yield of oligosaccharides is low;
The culture conditions are limited, so it cannot meet the demands of practical application.

また酵素法は、ラクトースにβ−ガラクトシダーゼを作
用させる時に起こるガラクトース基の転移反応によって
ガラクトオリゴ糖を生成させるものであるが、上記従来
の酵素法では反応生成物中にラクトースの分解生成物で
あるグルコースヤガラクトースなどの単糖がかなりの吊
金まれており、ガラクトオリゴ糖のみを精製するのが困
難であるとともに、上記従来法ではガラクトオリゴ糖が
１０数種程度生成してくるので、単位物質としてのガラ
クトオリゴ糖を分離することは極めて難しく、実用化す
る上で問題があった。In addition, in the enzyme method, galactooligosaccharide is produced by the transfer reaction of galactose groups that occurs when β-galactosidase acts on lactose, but in the conventional enzyme method described above, glucose, which is a decomposition product of lactose, is included in the reaction product. Monosaccharides such as yagalactose are highly suspended, making it difficult to purify only galactooligosaccharides, and the conventional method described above produces about 10 types of galactooligosaccharides. It is extremely difficult to separate sugars, and there have been problems in putting it into practical use.

本発明者らは、ビフィズス菌増殖因子として有用である
と考えられているガラクトオリゴ糖の生産能の強い微生
物を求めて、広く自然界より微生物の検索を行った結果
、クラブ１−コツカス属に属する微生物を炭素源として
ラクトースを含有する培地で培養することにより、培養
物中に下記式で表わされる〇−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シルー（１→４）−〇−β−〇−ガラクトピラノシルー
（１→４）−Ｄ−グルコース（以下４′−ガラクトシル
ラクトースまたは４’−ＧＬという）を大量に蓄積する
こと、およびこの微生物の菌体から得られるβ−ガラク
トシダーゼとラクトースまたはその含有物とを反応させ
ることによりこのガラクトオリゴ糖を効率よく生産でき
ることを見い出したく特願昭５９−１０８５４７　、特
願昭６０−７６７６７、特願昭６０−２４８８８５　’
）。The present inventors conducted a wide search for microorganisms in the natural world in search of microorganisms with a strong ability to produce galactooligosaccharides, which are considered to be useful as bifidobacteria growth factors. By culturing in a medium containing lactose as a carbon source, 〇-β-D-galactopyranosyl (1→4)-〇-β-〇-galactopyranosyl expressed by the following formula is produced in the culture. Accumulating a large amount of (1→4)-D-glucose (hereinafter referred to as 4'-galactosyllactose or 4'-GL), and combining β-galactosidase obtained from the cells of this microorganism with lactose or its contents. To discover that this galacto-oligosaccharide can be efficiently produced by the reaction.
).

しかしながら、培養物中にガラクトオリゴ糖を蓄積する
上記方法では、培養物中に上記ガラクトオリゴ糖以外の
多糖を副生じ、上記ガラクトオリゴ糖の精製にあたり、
クロマｉ〜分離、限外口過などの操作が必要となり、実
用上未だ問題を残していた。However, in the above method of accumulating galactooligosaccharide in the culture, polysaccharides other than the above galactooligosaccharide are produced as by-products in the culture, and when purifying the above galactooligosaccharide,
Operations such as chroma separation and ultrafiltration were required, and problems still remained in practical use.

また、β−ガラクトシダーゼを用いる方法においても、
ラフＩ・−スの分解生成物であるグルコースやガラクト
ース、その他愛容体として存在している糖にガラクト−
ス基が転移するので、上記（１）式で表わされるガラク
トオリゴ糖以外の転移オリゴ糖が副生きれ、所望の上記
ガラクトオリゴ糖の収率増加に限界があった。Also, in the method using β-galactosidase,
Galacto-
Since the group is transferred, transferred oligosaccharides other than the galactooligosaccharide represented by the above formula (1) are left as by-products, and there is a limit to the increase in the desired yield of the above galactooligosaccharide.

本発明は上記の事実を考慮し、ビフィズス菌増殖因子と
して有用である上記（１）式で表わされるガラクトオリ
ゴ糖の収率の良い製造法を提供することを目的どづ−る
。In consideration of the above facts, the present invention aims to provide a method for producing a galactooligosaccharide represented by the above formula (1), which is useful as a Bifidobacteria growth factor, with a high yield.

し問題点を解決するための手段および作用コ本発明者ら
は上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ク
リプトコツカス属に属する微生物の菌体から得られるβ
−ガラク］〜シダーゼとラフ１〜−スまたはその含有物
とを酵素反応させる際に、ザツカロミセス（３ａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｃｓ　）属、シゾ＋ｊッカロミレ’Ｊ）、
　（３ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ　）属、ク
リベロマイレス（Ｋ　ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロデロミセス（Ｌ　ｏ
ｄｄｅｒｏｍｙｃｅＳ）属、ハンゼニアスポラ（１−１
ａｎｓｅ旧ａＪｌｏｒａ）属からなる群から選択される
少なくとも１種類の微生物を存在させることにより、目
的生成物であるガラクトオリゴ糖が高収率で得られるこ
とを見い出し本発明に至った。Means and Action for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive research to achieve the above object, and have found that β
When enzymatically reacting sidase with sidase and its contents,
aromyccs) genus, Schizophrenia 'J),
(3hizosaccharomyccs) genus, Kluyveromyces (K luyveromyces) genus,
Genus Candida, Loderomyces
dderomyceS), Hanseniaspora (1-1
The present inventors have discovered that the desired product, galacto-oligosaccharide, can be obtained in high yield by allowing at least one type of microorganism selected from the group consisting of the genus A.

すなわち、本発明に係るガラクｌ〜オリゴ糖の製造法は
、ザッカロミセス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅＳ）属
、シゾサッカロミセス（３ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｃｓ　）属、クリベロマイセス（Ｋ　ｌ１１１７Ｖ
ｅｒＯｍｙＣｅＳ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属
、ロデロミセス（Ｌ　ｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅＳ）属、ハ
ンゼニアスボラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属から
なる群から選択される少なくとも１種類の微生物と、ク
リプトコツカス（（’Ｈｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　）属
に属する微生物から得られるβ−ガラクトシダーゼとを
用いてラフ１〜−スまたはイの含イｉ物から上記（１）
式で表わされるガラクトオリゴ糖を製造＝７− Ｊ−ることを特徴とする。That is, the method for producing galacto-oligosaccharides according to the present invention is applicable to the production of galactyl-oligosaccharides of the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces
yccs), Kuliveromyces (K l1117V
At least one type of microorganism selected from the group consisting of the genus erOmyCeS, genus Candida, genus Loderomyces, and genus Hanseniaspora, and a microorganism belonging to the genus 'Hryptococcus. Using β-galactosidase, the above (1)
It is characterized by producing a galactooligosaccharide represented by the formula =7-J-.

これは、上記β−ガラクトシダーゼと併存させる微生物
が、反応の基質であるラクトース、目的生成物である４
′−ガラクトシルラクトースは消費せず、ラクトースの
分解あるいは４′−ガラクトシルラフ１〜−ス生成時に
生ずる単糖類（グルコース、ガラクトース）のみをよく
消費するために、ラクトースのガラクトース残基を転移
させる際の受容体としてはラクトースのみとなり、４′
−ガラクトシルラクトースの収率が向上し、それ以外の
転移オリゴ糖が副生じ難くなるものと■１察される。This is because the microorganism coexisting with the above-mentioned β-galactosidase contains lactose, which is the substrate for the reaction, and 4, which is the target product.
'-Galactosyllactose is not consumed, but only the monosaccharides (glucose, galactose) produced during the decomposition of lactose or the production of 4'-galactosyl lactose are used. Lactose is the only receptor, and 4'
-It is assumed that the yield of galactosyllactose is improved and other transferred oligosaccharides are less likely to be produced as by-products.

以下本発明について詳細に説明する。The present invention will be explained in detail below.

（Ｉ）本発明に用いるβ−ガラクトシダーゼ（イ）由来
する微生物 本発明で用いるβ−ガラクトシダーゼはクリプトコツカ
ス属に属する微生物の菌体内で生産される。該微生物の
一例としてクリプトコツカス・ローレンテイ・バラエテ
ィ・ローレンテイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｕ
ｒｅｎＮｉ　ｖａｒ、１ａｕｒｅｎｔｉｉ　　）　ＯＫ
Ｎ　−４（以下ＯＫＮ　−４という）は、本発明者らに
より栃木県那須郡の土壌中Ｊ：り発見された菌種であり
、工業技術院微生物工業技術研究所へ微工研菌寄第７６
２９号として寄託されている。(I) β-galactosidase used in the present invention (A) Microorganism derived from β-galactosidase used in the present invention is produced within the cells of a microorganism belonging to the genus Cryptococcus. An example of the microorganism is Cryptococcus laurentii var. laurentii (Cryptococcus 1au).
renNi var, 1aurentii) OK
N-4 (hereinafter referred to as OKN-4) is a bacterial species discovered in the soil of Nasu District, Tochigi Prefecture by the present inventors, and was submitted to the National Institute of Microbiological Technology, Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology. 76
It has been deposited as No. 29.

ＯＫＮ　−４は次の菌学的性質を有する。OKN-4 has the following mycological properties.

なお、以下に記載の菌学的諸性質の試験は、■Ｊ　、　
Ｌｏｄｄｅｒ　：　Ｔｈｅ　　Ｙｅａｓｔ　（１９７０
）■飯塚広、後藤昭二：酵ｌｕの分類同定法（１９６９
）■長谷用弐治；微生物の分類と同定（１９７５）に準
拠し、また分類方法はＪ　、　１−ｏｄｄｅｒ　：　Ｔ
ｈｅＹ　ｅａｓｔ　（１９７０）に準拠して行なった。The tests for mycological properties described below are conducted by ■J,
Lodder: The Yeast (1970
) Hiroshi Iizuka, Shoji Goto: Classification and identification method of yeast lu (1969
) ■ Based on Yoji Hase; Classification and Identification of Microorganisms (1975), and the classification method is J, 1-odder: T
It was carried out according to heY east (1970).

［ＯＫＮ　−４の菌学的性質］ ’＜ａ　＞各培地における生育状態 ＭＹ液体培地＝２５℃３日間培養で、細胞の形態は球、
楕円形、伸長形 大ぎさは（３，０〜５．３）　Ｘ （４，０〜５．３）μ 多極出芽、１ｓｌｅｔ状の皮膜形 成 培地はにごり沈澱を形成 ＭＹ寒天４２’Ｈ地：２５℃１か月培養で、コロニーは
淡いオレンジ色から黄褐色 光沢があり、軟質で、粘稠で ある。[Mycological properties of OKN-4] '<a>Growth status in each medium MY liquid medium = Cultured at 25°C for 3 days, cell morphology was spherical,
Oval, elongated size: (3,0~5.3) x (4,0~5.3)μ Multipolar budding, 1slet-shaped film formation medium forms cloudy precipitate MY agar 42'H ground: After culturing at 25°C for 1 month, the colonies are pale orange to yellowish brown, shiny, soft, and viscous.

スライド培養：ポテト・デキストローズ培地で菌糸、偽
菌糸は形成しない。Slide culture: Hyphae and pseudohyphae are not formed in potato dextrose medium.

（ｂ）子のう胞子の形成： 通常の胞子形成培地上では認 められない。(b) Formation of ascospores: Not detected on normal sporulation medium. I can't stand it.

（Ｃ）射出胞子の形成： ＭＹ寒天平面培養で認められ ない。(C) Formation of extruded spores: Recognized in MY agar flat culture do not have.

（ｄ　）生理的性質 （１）最適生育条件：　　１１＋−１ｅ〜７、温度３０
℃（２）生育の範囲：　　ｐＨ３〜９、温度２０〜４０
℃（３）硝酸塩の同化：同化しない （４）脂肪の分解：分解しない （５）尿素の分解：分解する （６）ゼラチンの液化：液化しない （７＞カロチノイドの生成：生成しないか生成してもご
く僅か （８）有機酸の生成：生成しない （９）デンプン様多糖類の生成：生成する００）ビタミ
ンの要求性：ビタミン欠培地で生育しない （１０アルブヂンの分解：分解する （１２）シクロへキシミド耐ｆ１：生育しない（ｔ３）
３７℃での生育：生育する 卸５０％グルコースＭＷ　母エキス培地での生育：生育
しない （ｅ）各炭素源に対する同化性 １）　Ｄ−アラビノース　　　　　　　＋２）　Ｌ−ア
ラビノース　　　　　　　＋３）　Ｄ−リボース　　　
　　　　　　」−４）　Ｄ−キシロース　　　　　　　
　→−５）　Ｄ−グルコース　　　　　　　　＋６）　
Ｄ−ガラク１〜−ス　　　　　　　＋７）［−ラムノー
ス　　　　　　　　」−８）Ｌ−ソルボース　　　　　
　　　＋９）麦芽糖　　　　　　　　　　　　＋１０）
ショ糖　　　　　　　　　　　十１１）乳糖　　　　　
　　　　　　　　＋１２）メリビオース　　　　　　　
　　＋１３）セロビオ−−ス　　　　　　　　　＋１４
）１ヘレハロース　　　　　　　　　＋１５）ラフィノ
ース　　　　　　　　　＋１６）メレジトース　　　　
　　　　　＋１７）α−メチル−Ｄ−グルコシド　　＋
１８）可溶性デンプン　　　　　　　　±１９）イヌリ
ン　　　　　　　　　　　＝２０）エタノール　　　　
　　　　　　＋２１）アトニット　　　　　　　　　　
＋２２）エリトリット　　　　　　　　　　＋２３）イ
ノジット　　　　　　　　　　＋２４）Ｄ−マンニット
　　　　　　　　＋２５）Ｄ−ソルビット　　　　　　
　　＋２６）ズルシット　　　　　　　　　　＋２７）
グリセリン　　　　　　　　　＋２８）ＤＬ−乳酸塩　
　　　　　　　　−２９）］ハク酸塩　　　　　　　　
　　十３０）クエン酸塩　　　　　　　　　　−３１）
サリシン　　　　　　　　　　　＋（＋：よく同化する
　士：同化が疑わしいｍ：同化しない） なお、糖類に対する発酵性はない。(d) Physiological properties (1) Optimal growth conditions: 11+-1e~7, temperature 30
°C (2) Growth range: pH 3-9, temperature 20-40
°C (3) Nitrate assimilation: not assimilated (4) fat decomposition: not decomposed (5) urea decomposition: decomposed (6) gelatin liquefaction: not liquefied (7> carotenoid production: not produced or produced (8) Production of organic acids: Not produced (9) Production of starch-like polysaccharides: Produced 00) Requirement for vitamins: Does not grow in vitamin-deficient medium (10) Decomposition of albudin: Decomposed (12) Cyclo Heximide resistance f1: No growth (t3)
Growth at 37°C: Growth 50% glucose MW Growth in mother extract medium: No growth (e) Assimilation of each carbon source 1) D-arabinose +2) L-arabinose +3) D-ribose
'-4) D-xylose
→-5) D-glucose +6)
D-galac 1~-su +7) [-rhamnose''-8) L-sorbose
+9) Maltose +10)
Sucrose 111) Lactose
+12) Melibiose
+13) Cellobiose +14
) 1 helehalose + 15) raffinose + 16) melezitose
+17) α-Methyl-D-glucoside +
18) Soluble starch ±19) Inulin =20) Ethanol
+21) Atonit
+22) Erythrite +23) Inojito +24) D-Mannit +25) D-Sorvit
+26) Zurshit +27)
Glycerin +28) DL-lactate
-29)] Huccinate
130) Citrate -31)
Salicin + (+: Assimilates well; M: Assimilation is doubtful; m: Does not assimilate) Note that it has no fermentability for sugars.

以上の菌学的性質により本菌株はクリプトコツカス・ロ
ーレンティ・バラエティ・ローレンテイに属するものと
同定された。Based on the above mycological properties, this strain was identified as belonging to Cryptococcus laurentii variety laurentii.

本発明で使用するβ−ガラトクシダーゼが由来する微生
物としてはＯＫＮ　−４はその一例であり、その自然的
及び人工的変異株は勿論、クリプトコツカス属に属する
微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼは総て本発明方
法において使用することができる。OKN-4 is an example of a microorganism from which the β-galatoxidase used in the present invention is derived, as well as its natural and artificial mutant strains, as well as β-galactosidase derived from microorganisms belonging to the genus Cryptococcus. All can be used in the method of the invention.

上記微生物の培養は、通常用いられる固体培地、液体培
地のどちらを用いてもよいが液体培地の方が好ましい。For culturing the above-mentioned microorganisms, either a commonly used solid medium or a liquid medium may be used, but a liquid medium is preferable.

微生物の培養に使用される培地は、炭素源としては微生
物が同化し得る炭素源を用いることが可能であるが、好
ましくはラクトース、または全乳、脱脂乳のようにラク
トースを一成分として含有する物質、ソルビット、ラク
ヂットなどて・ある。窒素源どしては、酵母エキス、カ
ゼイン、コーンスヂーブリカー、大豆粉、綿実粉、小麦
グルテン、ペプトン、肉エキスなどの窒素化合物や（Ｎ
Ｈ４）２　ＳＯ４、ＮＨ４ＣＱ、、尿素などの無機窒素
化合物を、無機塩類としてナトリウム塩類、カリウム塩
類、マグネシウム塩類、リン酸塩類などを適宜に用いる
ことができる。さらにビタミン類や微量金属塩を追加し
て使用菌の生育を良好ならしめることができる。The medium used for culturing microorganisms can use a carbon source that can be assimilated by the microorganisms, but preferably contains lactose or lactose as one component, such as whole milk or skim milk. There are substances, sorbitol, lacqueret, etc. Nitrogen sources include nitrogen compounds such as yeast extract, casein, cornstarch liquor, soybean flour, cottonseed flour, wheat gluten, peptone, meat extract, etc.
H4)2 Inorganic nitrogen compounds such as SO4, NH4CQ, and urea can be appropriately used, and sodium salts, potassium salts, magnesium salts, phosphates, etc. can be used as inorganic salts. Furthermore, vitamins and trace metal salts can be added to improve the growth of the bacteria used.

炭素源の濃度は１〜４０重量％の範囲で、培養温度は２
０〜４０℃、培養液のｐＨは２〜９の範囲内で、培養時
間は１〜６日間程度である。静置培養または通気撹拌、
撮とう培養のいずれの方法でも行なうことかできる。The concentration of carbon source ranged from 1 to 40% by weight, and the culture temperature was 2.
The temperature is 0 to 40°C, the pH of the culture solution is within the range of 2 to 9, and the culture time is about 1 to 6 days. Static culture or aeration agitation,
It can be carried out using either photography or culturing methods.

（ロ）β′−ガラクトシダーじ 上記微生物の菌体内で生産されたβ−ガラクトシダーゼ
は、該微生物の培養を終了した培養液から遠心分離１ま
たはケイ藻土口過などの分離手段によって得られた微生
物の菌体、およびその菌体を凍結した凍結菌体、乾燥手
段によって１９られる乾燥菌体、菌体を物即的手段によ
って破壊した菌体残渣、その乾燥物、そして菌体および
菌体残渣から抽出手段によって抽出した水溶性物質、塩
析法、透析法、担体吸着法、電気泳動法、ゲル口過法な
どの手段を用いて精製した精製酵素、あるいはこれら酵
素または菌体を公知の固定化手段によって固定化した固
定化酵素、固定化菌体、固定化増殖菌体として用いるこ
とができる。(b) β'-galactosidase β-galactosidase produced within the cells of the above-mentioned microorganism is obtained from the culture solution after culturing the microorganism by centrifugation 1 or diatomaceous filtration or other separation means. Microbial cells, frozen microbial cells obtained by freezing the microbial cells, dried bacterial cells obtained by drying means, bacterial cell residues obtained by destroying the bacterial cells by immediate physical means, dried products thereof, and bacterial cells and bacterial cell residues. water-soluble substances extracted by extraction methods, purified enzymes purified using methods such as salting-out method, dialysis method, carrier adsorption method, electrophoresis method, gel filtration method, or known immobilization of these enzymes or bacterial cells. It can be used as an immobilized enzyme, immobilized bacterial cells, or immobilized proliferating bacterial cells that have been immobilized by means of immobilization.

（ＩＩ）併存させる微生物 上記β−ガラクトシダーゼと４７１存させる微生物は、
サツカロミセス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ）属、
シゾサッカロミセス（Ｓ　ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｃｓ　）属、クリベロマイセス（Ｋ　ｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属、カンシタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロ
デロミセス（１−ｏｄｄｅｒｏｍｙｃｃｓ　）属、ハン
ゼニアスボラ（ｌ−１ａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ　）属
からなる群から選択された微生物であり、下記の保存菌
株を用いることができる。(II) Microorganisms to coexist The microorganisms to coexist with the above β-galactosidase are:
Saccharomyccs genus,
Schizosaccharomyces (S hizosaccharomyces)
yccs), Kluyvermyces (K luyver)
The microorganism is selected from the group consisting of the genera S. omyces, Candida, 1-odderomyccs, and 1-1 anseniaspora, and the following preserved strains can be used.

■サッカ「Ｉミセス・レレビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　）ＩＦＱ　−０３０９ ■シゾサッカロミセス・マリデボランスＳ　ｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｔ　１ｄｅｖｏｒａｎ
ｓ）Ｉ　Ｆ　Ｏ−１６０８ ■クリベロマイセス・ドロソフィラルム（Ｋ　ｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）Ｉ　
Ｆ　Ｏ−１０１２ ■カンジダ・ブラシカ （Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ）Ｉ　Ｆ　Ｏ−
１６６４ ■ロデロミセス・工ロンギスポルス （ｌ　ｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒ
ｕｓ）Ｉ　Ｆ　Ｏ−１６７６ ■ハンゼニアスポラ・オスモフィラ （Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ　ｏｓｍｏｐｈｉｌａ）
］　Ｆ　Ｏ−１７５４ 上記菌体は、予め固体培地、液体培地などで培養した１
種類以上の菌体の培養物をそのまま用いることができる
が、微生物の培養を終了した培養液から遠心分離または
ケイ藻土口過などの分離手段によって得られた微生物の
菌体、およびその菌１６一 体を凍結した凍結菌体、凍結乾燥手段によって得られる
凍結乾燥菌体、菌体を公知の固定化手段によって固定化
した固定化菌体、固定化増殖菌体として用いてもよい。■Saccharomyces cerevisiae
) IFQ -0309 ■Schizosaccharomyces maridevorans S hizos
accharomyces mat 1devoran
s) I F O-1608 ■ Kluyveromyces drosophilarum (K luyv
eromyces drosophilarum)I
FO-1012 ■Candida brassicae I FO-
1664 ■L odderomyces elongisporus
us) I F O-1676 ■ Hanseniaspora osmophila
] FO-1754 The above bacterial cells were cultured in advance in a solid medium, liquid medium, etc.
Cultures of more than one type of microbial cells can be used as they are, but microbial cells obtained by centrifugation or diatomaceous filtration or other separation means from the culture solution after microbial culture, and the microbial cells 16 It may be used as frozen microbial cells obtained by freezing the whole, freeze-dried microbial cells obtained by freeze-drying, immobilized microbial cells obtained by immobilizing microbial cells by known immobilization means, or immobilized proliferating microbial cells.

（Ｉｌｌ）反応条件 本発明に用いる上記β−ガラクトシダーゼおよび菌体の
量は、反応条件によって適宜好ましい量を加えることが
できる。(Ill) Reaction Conditions The amounts of the β-galactosidase and bacterial cells used in the present invention can be adjusted as appropriate depending on the reaction conditions.

本発明に用いる反応温度およびｐＨは、本発明に使用す
る微生物が生存できるか、若しくは微生物の持つ酵素群
が失活しない温度およびｐＨが用いられる。通常、温度
は２５〜４５℃、ｐｌ−１は２．５〜７．０の範囲であ
る。The reaction temperature and pH used in the present invention are such that the microorganisms used in the present invention can survive or the enzymes possessed by the microorganisms are not deactivated. Typically, the temperature is in the range of 25 to 45°C and the pl-1 is in the range of 2.5 to 7.0.

反応時間は、反応条件によって異なるが、６時間から７
日程度である。The reaction time varies depending on the reaction conditions, but is 6 to 7 hours.
It is about 1 day.

ラクトースまたはラクトース含有物の濃度は、ラクトー
ス分として通常、１〜４０重量％が用いられる。The concentration of lactose or lactose-containing material is usually 1 to 40% by weight based on the lactose content.

反応が終了した反応液は、必要に応じて遠心分離または
ケイ藻土口過等により固形分を除去し、また必要に応じ
て公知の精製手段を用いてさらに４′−ガラク１へシル
ラクトースを精製する。After the reaction, the solid content is removed from the reaction solution by centrifugation or diatomaceous earth filtration as necessary, and sillactose is further added to 4'-galac 1 using known purification means as necessary. refine.

本発明方法によれば、４′−ガラクトシルラクトースの
収率が高く、また副生成物も極めて少ないので、ｌ’ｉ
ｆ製操作が極めて容易である。酵素および菌体を固定化
しておけば、分離精製操作がさらに一段と容易なものと
なる。According to the method of the present invention, the yield of 4'-galactosyllactose is high and the amount of by-products is extremely small.
The f-manufacturing operation is extremely easy. If the enzyme and bacterial cells are immobilized, the separation and purification operations will become even easier.

［実施例］ 以下に、本発明の実施例を示ず。[Example] Examples of the present invention are not shown below.

下記の実施例および比較例における糖類の定量は、高速
液体クロマトグラフィー（ポンプは日立製作所製６５５
型、検出器は昭和電工製５Ｅ−３１、カラムはＬ　１ｃ
ｈｒｏｓｏｒｂ　−Ｎ　１−（２（５，ｃｚｍ　）　Ｃ
ｉｃａＭｅｒｋ製、溶媒はアセトニ［〜リル：水−６５
　：　３５を用い、流速は０．７ｍ　ｌ！　／ｍｉｎ　
）を実施し、ピーク面積より求めた。The quantitative determination of sugars in the following Examples and Comparative Examples was performed using high performance liquid chromatography (the pump was 655 manufactured by Hitachi, Ltd.).
The model and detector are Showa Denko 5E-31, and the column is L 1c.
hrosorb-N 1-(2(5,czm)C
Manufactured by icaMerk, solvent is acetonylate:water-65
: 35 and the flow rate was 0.7 ml! /min
) and calculated from the peak area.

実施例１　β−ガラクトシダーゼの調製（１）菌体の生
産 下記の組成の培地１００ｍ１！を５００ｍ１！容三角フ
ラスコに仕込み、１２０℃で２０分間殺菌後冷却し、ク
リプトコツカス・ローレンデイ・バラエティ・ローレン
ティＯＫＮ　−／１株を植菌し、３０’Ｃで１日間振ど
う培養して種菌とした。Example 1 Preparation of β-galactosidase (1) Production of bacterial cells 100 ml of medium with the following composition! 500m1! The mixture was placed in an Erlenmeyer flask, sterilized at 120°C for 20 minutes, cooled, and inoculated with Cryptococcus laurendii variety OKN -/1 strain. did.

培地組成 ラフ１〜−ス　　　　　　　　　　　　５０　（ＩＮＨ
４Ｃ１！　　　　　　　　　　　　　２　（ＪＫＨ２Ｐ
Ｏ４０，８ｇ Ｎａ　２　ＨＰＯ４・１２＋−１２００，３（］ＭｇＳ
Ｏ４・７１−１２０　　　　　　０．０２ｇ酵母エキス
　　　　　　　　　　　　３ｇ水　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１９゜ｐｌ−１６，０ 本培養は上記と同様の培養条件で種菌を２．５ｍＣ接種
し、３０℃で２日間、毎分１６０回転で振どう培養した
。培養終了後、１００　ｍｌ！の培養液から遠心分離（
５０００ｒｐｍ　１０分間）して菌体を集め、蒸溜水に
て５回洗浄後、水ｉｅｍｐ、に再懸濁した。この菌体懸
濁液の酵素活性はＯ−二ｉ〜ロフェニルーβ−Ｄ−ガラ
クトビラノザイド（以下０ＮＰＧという。）を基質とし
て０．６Ｕ／　ｍＱであった。（この菌体を以下菌体Ａ
という。） なお、０ＮＰＧに対する力価は、５　ｍＭの０ＮｐＱ　
１．ＯｍＱ、　、　マツクルベン（Ｍａｃｌｌｖａｉｎ
ｅ　）緩衝液（１）　Ｈ５，０）　　２．０　ｍＱ　１
Ｍ素溶液１．ＯｍＱを混合し、４０℃で３０分間反応さ
せた後、１．０ＭのＮａ　２　ＣＯ３１，ＯｍＱを添加
して反応を停止させ、生成したＯ−ニトロフェノールを
波長４２０ｎｍにおける吸収より測定した。１分間に１
μモルの０ＮＰＧを分解する能力を１ユニツト（Ｕ）と
した。Medium composition rough 1~-50 (INH
4C1! 2 (JKH2P
O40,8g Na2HPO4・12+-1200,3(]MgS
O4・71-120 0.02g yeast extract 3g water
19゜pl-16.0 For the main culture, 2.5mC of inoculum was inoculated under the same culture conditions as above, and cultured at 30°C for 2 days with shaking at 160 revolutions per minute. After culturing, 100 ml! Centrifugation (
5,000 rpm for 10 minutes), the bacterial cells were collected, washed five times with distilled water, and then resuspended in water iemp. The enzyme activity of this bacterial cell suspension was 0.6 U/mQ using O-2i-lopheny-β-D-galactobyranozide (hereinafter referred to as 0NPG) as a substrate. (This bacterial cell is hereinafter referred to as bacterial cell A.
That's what it means. ) The titer against 0NPG is 5 mM 0NpQ.
1. OmQ, Macllvain
e) Buffer solution (1) H5,0) 2.0 mQ 1
M elementary solution 1. After mixing OmQ and reacting at 40°C for 30 minutes, 1.0M Na 2 CO31, OmQ was added to stop the reaction, and the produced O-nitrophenol was measured from absorption at a wavelength of 420 nm. 1 per minute
The ability to decompose μmol of 0NPG was defined as 1 unit (U).

（２）酵素の精製 上記の方法で培養した菌体２０９ｇ（湿重量）を蒸溜水
でよく洗浄した後、１６０ｍｍの酢酸エチルと４０ｍＱ
の２０　ｍＭリン酸緩衝液（ＤＩ−１５，８）を加え、
よく懸濁し、４°Ｃで２４４時間往復振うした。得られ
た菌体を蒸溜水でよく洗浄した後、蒸溜水に懸濁し、８
００＋１１１１．の菌体懸濁液を得た。これを氷水中で
マントン・ゴーリング菌体破砕機により破砕（８０００
ｐｓｉ　１０回通液）した後、遠心分＠　（５０００ｐ
ｐｍ　１０分間〉して菌体破砕液を得た。菌体破砕液中
＝２０− の細胞壁両分を蒸溜水でさらに１回洗浄した後、凍結乾
燥し、２７．６（ｌの凍結乾燥品を得た。この細胞壁画
分の酵素活性は、０ＮＰＧを基質として１０Ｕ／Ｇであ
った。(2) Purification of enzyme After thoroughly washing 209 g (wet weight) of bacterial cells cultured in the above method with distilled water, add 160 mm of ethyl acetate and 40 mQ
Add 20 mM phosphate buffer (DI-15,8),
The mixture was thoroughly suspended and shaken reciprocally at 4°C for 244 hours. After thoroughly washing the obtained bacterial cells with distilled water, they were suspended in distilled water and
00+1111. A bacterial cell suspension was obtained. This was crushed in ice water using a Manton-Goering cell crusher (8000
psi (10 times), then centrifuge @ (5000p
pm for 10 minutes> to obtain a bacterial cell disruption solution. Both parts of the cell wall in the cell disruption solution = 20 - were washed once again with distilled water and then lyophilized to obtain a lyophilized product of 27.6 (l). The enzyme activity of this cell wall part was 0NPG. was used as a substrate at 10 U/G.

次に、上記細胞壁画分の凍結乾燥品２７，６（］を６６
９０９ｇのマツクルベン緩衝液＜　　１）Ｈ６，０）で
懸濁し、ザイモリエース２Ｏ−Ｔ（生化学工業製）を０
．０１重量％となるＪ：うに添加し、３０°Ｃで３時間
往復振とうし、酵素を可溶化させた。反応後、得られた
溶液を東洋濾紙（商品名）Ｎｏ、２で口過し、０液を蒸
溜水に対し１昼夜透析した。透析後、凍結乾燥により４
．０ｇの粗酵素品を得た。この粗酵素の活性は、０ＮＰ
Ｇを基質として２５Ｕ／（ｌであった。Next, the freeze-dried product 27,6 () of the cell wall fraction was 66
Suspend in 909g of Matsukluben buffer <1)H6,0) and add Zymolyase 2O-T (Seikagaku Corporation) to 0.
．． J: was added to the sea urchin to give a concentration of 0.1% by weight, and the enzyme was solubilized by shaking reciprocally at 30°C for 3 hours. After the reaction, the resulting solution was passed through Toyo Roshi (trade name) No. 2, and the 0 solution was dialyzed against distilled water for 1 day and night. After dialysis, 4
．． 0g of crude enzyme product was obtained. The activity of this crude enzyme is 0NP
The amount was 25 U/(l) using G as a substrate.

さらにこの粗酵素品を２０　Ｊｙｌリン酸緩衝液（ｐＨ
５，８）　３４０ｍＱに溶解し、予め同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−セファデックスＡ　−５０（５０ｍｍφ
×７４０ｍｍＨ）カラムに吸着させ、次いで同緩衝液（
０〜１．０ＭＮａ　ＣＱグラディエンド）ニア７０ｍＱ
／Ｈｒの流速で溶出した。活性両分９００ｍ　Ｑを蒸溜
水に対し透析後、凍結乾燥し、１．７５　Ｑの粗酵索を
得た。さらにこれを２Ｏｎ＋Ｍのリン酸緩衝液（ｐＩ−
４５，８）　２４　ｍＱ、　テ溶解し、氷水中で１時間
放置して白色の沈澱物を除去し、上澄液２４ｍＱのうち
４　　ｍＱを２０　ｍＭのリン酸緩衝液（１）ｌ−１５
，８）で予め平衡化したトーヨーパールＨＷ　−５５Ｓ
のカラム（２２ｍｍφｘ　７５０ｍｍＨ）に注入して吸
着させ、その後、同緩衝液１．０　ｍＱ　／ｍｉｎで溶
出した。この操作を６回繰り返して合計１０８ｍ１１の
活性画分を得た後、これを蒸溜水にて透析し、凍結乾燥
したところ、９．０　ｍｇの精製酵素を得た。この酵素
はディスク電気泳動法で単一のバンドを示しＩＣＯ精製
酵素の酵素活性は０ＮＰＧを基質として４．８６１Ｊ／
ｍＱであった。（この精製酵素を以下精製酵素Ｂという
。） （３）固定化菌体の調製 （１）で調製した菌体懸濁液１６ｍＱにアクリルアミド
モノマー３．０！＋　、　Ｎ、　Ｎ’−メヂレンビスア
クリルアミド０，１６　Ｇ　、５重量％Ｎ、　Ｎ、　ｘ
′Ｎ’−テトラメヂレンジアミン溶液２　　ｍＱ、　　
２．５重量％過硫酸カリウム溶液２ｍ９．を加え、Ｏ′
Ｃで２０分反応させ、ポリアクリルアミドゲルを調製し
た。これをカッターで細砕し、約５．０ｍｍＸ　１．Ｏ
ｍｍφの顆粒に成型した後、純水でよく洗浄して凍結乾
燥したちの１．８ｇを固定化菌体として用いた。この菌
体の０ＮＰＧ活性は９．ＯＵ　／　ｇであった。（この
固定化菌体を以下固定化菌体Ｃという。）実施例２　併
存微生物の調製及び４−ＧＬの生産（１）サツカロミセ
ス・セレビシェの調製サツカロミセス・セレビシェ　Ｉ
　Ｆ　Ｏ−０３０９をＭＹ寒天斜面培地で３０℃、３日
間前培養した後、５００　ｍＱ三角フラスコにグルコー
ス１ｏ重量％、酵母エキスＯ，／１重量％、ポリペプト
ン０．４重量％、ＫＨ２ＰＯ４０，１重量％から成ル培
地１００　ｍＱ　ヲ入れ滅菌したものに一白金耳植菌し
、３０℃で４８時間、毎分１６０回転で振どう培養した
。培養後遠心分離機にて菌体を回収し、純水で２回洗浄
後、水２０　ｍＱに懸濁した。Furthermore, this crude enzyme product was added to 20 Jyl phosphate buffer (pH
5,8) DEAE-Sephadex A-50 (50 mmφ) dissolved in 340 mQ and equilibrated with the same buffer in advance
x 740 mmH) column, and then the same buffer solution (
0~1.0MNa CQ Gradient) Near 70mQ
Elution was performed at a flow rate of /Hr. After dialyzing 900 mQ of the active fraction against distilled water, it was freeze-dried to obtain a crude fermentation cord of 1.75 Q. Furthermore, this was added to 2On+M phosphate buffer (pI-
45,8) Dissolve 24 mQ, leave it in ice water for 1 hour to remove the white precipitate, and add 4 mQ of the 24 mQ supernatant to 20 mM phosphate buffer (1) l-15.
Toyo Pearl HW-55S pre-equilibrated with ,8)
was injected into a column (22 mmφ x 750 mmH) for adsorption, and then eluted with the same buffer at 1.0 mQ/min. This operation was repeated six times to obtain a total of 108 ml of active fraction, which was then dialyzed against distilled water and freeze-dried to obtain 9.0 mg of purified enzyme. This enzyme showed a single band in disk electrophoresis, and the enzymatic activity of the ICO purified enzyme was 4.861 J/1 using 0NPG as a substrate.
It was mQ. (This purified enzyme is hereinafter referred to as purified enzyme B.) (3) Preparation of immobilized bacterial cells Add 16 mQ of the bacterial cell suspension prepared in (1) to 3.0 mL of acrylamide monomer! +, N, N'-methylene bisacrylamide 0,16 G, 5% by weight N, N, x
'N'-tetramethylenediamine solution 2 mQ,
2ml of 2.5% by weight potassium persulfate solution9. and O′
A polyacrylamide gel was prepared by reacting at C for 20 minutes. Grind this into pieces with a cutter, approximately 5.0mm x 1. O
After molding into granules of mmφ, they were thoroughly washed with pure water and freeze-dried, and 1.8 g of the granules were used as immobilized bacterial cells. The 0NPG activity of this bacterial cell is 9. It was OU/g. (This immobilized bacterial cell is hereinafter referred to as immobilized bacterial cell C.) Example 2 Preparation of coexisting microorganisms and production of 4-GL (1) Preparation of Satucharomyces cerevisiae Satucharomyces cerevisiae I
After pre-cultivating FO-0309 on a MY agar slant medium at 30°C for 3 days, a 500 mQ Erlenmeyer flask was charged with 10 wt% glucose, 1 wt% yeast extract, 0.4 wt% polypeptone, and 1 wt% KH2PO40. % to 100 mQ of a sterilized culture medium was inoculated with one platinum loop, and cultured at 30° C. for 48 hours with shaking at 160 revolutions per minute. After culturing, the bacterial cells were collected using a centrifuge, washed twice with pure water, and then suspended in 20 mQ of water.

（２）　４’−Ｇ　Ｌの生産 実施例１で得られたβ−ガラク１〜シダーゼ群（菌体Ａ
、精製酵素Ｂ、固定化酵素Ｃ）を、１０重呈％ラクトー
ス（酵母エキス０．１重量％含有、１ＩＨ５，５）　１
００ｍ１ｊ当り、ＯＮ　Ｐ　Ｇ活性で４．５Ｕ加え、さ
らに］−記（＋）で調製したサツカロミセス・セレビシ
ェＩＦＯ−０３０９の菌体懸濁液を、反応液１００ｍρ
当り１　　ｍＱ添加し、４０℃で２４時間および４８時
間反応させた。反応後の糖含有量を高速液体クロマトグ
ラフィー法にて定量した時の結果を第１表に示した。単
糖および転移オリゴ糖の生成は殆どなく、また多糖の生
成もみられず、高収率で４’−ＧＬが得られた。(2) Production of 4'-G L β-galac 1 to sidase group (bacterial cell A
, purified enzyme B, immobilized enzyme C), 10% lactose (containing 0.1% by weight of yeast extract, 1IH5,5) 1
Add 4.5 U of ON PG activity per 00ml, and add the bacterial cell suspension of Satucharomyces cerevisiae IFO-0309 prepared in [- (+)] to 100mρ of the reaction solution.
1 mQ/ml was added, and the reaction was carried out at 40°C for 24 and 48 hours. Table 1 shows the results of quantifying the sugar content after the reaction by high performance liquid chromatography. There was almost no production of monosaccharides and transferred oligosaccharides, and no production of polysaccharides was observed, and 4'-GL was obtained in high yield.

−２４一 実施例３　　（７）存固定化菌体の調製および４′〜Ｇ
Ｌの生産 （＋）サツカロミセス・セレビシェの固定化実施例２の
（１）で調製したサツカロミセス・セレビシェ　ｌ　Ｆ
Ｑ　−０３０９の菌体懸濁液２０ｍＱにアクリルアミド
モノマー３．０（１、Ｎ　、　Ｎ’−メヂレンビスアク
リルアミド０，１６　ｇ　、５重量％Ｎ、Ｎ。-24 Example 3 (7) Preparation of existing immobilized bacterial cells and 4'-G
Production of L (+) Immobilization of Satucharomyces cerevisiae Satucharomyces cerevisiae prepared in (1) of Example 2 l F
Acrylamide monomer 3.0 (0.16 g of 1,N,N'-methylene bisacrylamide, 5% by weight N,N) was added to 20 mQ of bacterial cell suspension of Q-0309.

Ｎ’、　Ｎ’−テトラメヂレンジアミン溶液２ｍＱ、２
．５重量％過硫酸カリウム２ｍ９．を加え、０℃で２０
分反応させポリアクリルアミドゲルを調製した。N', N'-tetramethylenediamine solution 2mQ, 2
．． 5% by weight potassium persulfate 2m9. and incubate at 0℃ for 20
A polyacrylamide gel was prepared by reacting for several minutes.

これをカッターで細砕し、約５．Ｏｍｍｘ　　１．０ｍ
ｍφの顆粒に成型した後、純水でよく洗浄した。湿重量
で２７ｇの固定化菌体が得られた。Shred this with a cutter, about 5. Omm x 1.0m
After molding into mφ granules, they were thoroughly washed with pure water. A wet weight of 27 g of immobilized bacterial cells was obtained.

（２）　４’−Ｇ　Ｌの生産 実施例１で調製した固定化菌体Ｃ（ＯＮＰＧ活性４．５
Ｕ　）をβ−ガラクトシダーゼとして、また、サツカロ
ミセス・セレビシェとしては上記（１）の固定化菌体を
反応液１００ｍＱ当り　１．５ｇ使用して、実施例２の
（２）と同一条件で反応させ、４′−ＧＬを生産した。(2) Production of 4'-GL Immobilized bacterial cells C prepared in Example 1 (ONPG activity 4.5
U) was used as β-galactosidase, and as Satucharomyces cerevisiae, 1.5 g of the immobilized bacterial cells of (1) above were used per 100 mQ of reaction solution, and the reaction was carried out under the same conditions as in (2) of Example 2. 4'-GL was produced.

、２４時間目の糖含量は、単糖Ｏｍり／ｍＱ、ラクトー
ス５９ｍＭ　ｍ１１．．４−　Ｇ　Ｌ　３０ｍＭ　ｍＣ
１転移オリゴ糖Ｏｍａ／　ｍＱであった。, the sugar content at 24 hours was: monosaccharide Om/mQ, lactose 59mM m11. ．． 4-GL 30mM mC
1 transfer oligosaccharide Oma/mQ.

実施例４　その他の微生物の調製および４’−Ｇ　Ｌの
生産 （１）その伯の微生物の調製 サツカロミセス・セレビシェ　Ｉ　Ｆ　Ｏ−０３０９の
代りに第２表に示す微生物を実施例２の（１）と同様に
培養した。Example 4 Preparation of other microorganisms and production of 4'-GL (1) Preparation of the microorganisms shown in Example 2 (1) It was cultured in the same way.

（２）４’−ＧＬの生産 β−ガラクトシダーゼとして実施例１で調製した固定化
菌体Ｃを用い、上記（１）で培養した微生物を添加し、
実施例２と同一条件で反応させた。(2) Production of 4'-GL Using the immobilized bacterial cells C prepared in Example 1 as β-galactosidase, adding the microorganism cultured in the above (1),
The reaction was carried out under the same conditions as in Example 2.

２４時間後の糖含有量を第２表に示した。いずれも、単
糖および転移オリゴ糖の生成は少なく、高収率で４．’
　−Ｇ　Ｌが得られた。The sugar content after 24 hours is shown in Table 2. In both cases, the production of monosaccharides and transferred oligosaccharides is small, and the yield is high. '
-GL was obtained.

実施例１で得られたβ−ガラクトシダー１群を、１０重
量％ラクトース（Ｍ？母エキス０．１重量％含右、ｐＨ
５，５）　１００ｎ＋９．当り、０ＮＰＧ活性で４．５
Ｕ加え、４０℃、毎分１６０回転の条件でロータリーシ
ェーカーで振とうしながら２４時間またＣま４８時間反
応した。反応終了後の糖含伍を高速液体クロマトグラフ
ィー法にて定量した結果を第３表に示した。A group of β-galactosida obtained in Example 1 was mixed with 10% by weight of lactose (M? Mother extract containing 0.1% by weight, pH
5,5) 100n+9. per hit, 0NPG activity 4.5
U was added, and the mixture was reacted for 24 hours while shaking on a rotary shaker at 40° C. and 160 revolutions per minute, and for 48 hours. Table 3 shows the results of quantifying the sugar content after the reaction by high performance liquid chromatography.

この結果と上記実施例２〜４とを比較すれば、クリプト
コツカス属に属する微生物から得られたβ−ガラクトシ
ダーゼと上記併存菌体とを併用することにより、４′−
ガラクトシルラクトースの収率および選択性を高めるこ
とができることが判る。Comparing this result with Examples 2 to 4 above, it is found that by using β-galactosidase obtained from a microorganism belonging to the genus Cryptococcus in combination with the above-mentioned coexisting bacterial cells, 4'-
It can be seen that the yield and selectivity of galactosyllactose can be increased.

［発明の効宋］ 以上説明した通り、本発明のガラクトオリゴ等の製造法
によれば、ビフィズス菌増殖因子として有用である前記
（１）式で表わされるガラクトオリゴ糖を収率良く、高
い選択率で得ることができる。したがって、後に続く精
製工程が極めて簡単になり、実用化する上で多大な効果
をもたらすものである。[Effects of the Invention] As explained above, according to the method for producing galactooligo etc. of the present invention, the galactooligosaccharide represented by the above formula (1), which is useful as a bifidobacteria growth factor, can be produced in good yield and with high selectivity. Obtainable. Therefore, the subsequent purification process becomes extremely simple, which brings about a great effect in practical use.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロデ
ロミセス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼニア
スポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属からなる群か
ら選択される少なくとも１種類の微生物と、クリプトコ
ッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物
から得られるβ−ガラクトシダーゼとを用いてラクトー
スまたはその含有物から下記式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるＯ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−
Ｄ−グルコースを製造することを特徴とするガラクトオ
リゴ糖の製造法。(1) Saccharomyces
Genus, Shizosaccharomyces
myces), Kluyvero
β- obtained from at least one type of microorganism selected from the group consisting of the genus Myces, Candida, Lodderomyces, and Hanseniaspora, and a microorganism belonging to the Cryptococcus genus. O-β-D-galactopyranosyl-(1→
4) -O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-
A method for producing galactooligosaccharides, which comprises producing D-glucose. （２）クリプトコッカス属に属する微生物が、クリプト
コッカス・ローレンティ・バラエティ・ローレンティ（
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｕｒｅｎｔｉｉ　ｖａ
ｒ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）ＯＫＮ−４である特許請求の
範囲第（１）項に記載のガラクトオリゴ糖の製造法。(2) Microorganisms belonging to the genus Cryptococcus are Cryptococcus laurentii var. laurentii (
Cryptococcus laurentii va
r. laurentii) OKN-4, according to claim (1). （３）サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｖｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロデ
ロミセス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼニア
スポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属からなる群か
ら選択される少なくとも１種類の微生物が固定化されて
いる特許請求の範囲第（１）項または第（２）項に記載
のガラクトオリゴ糖の製造法。(3) Saccharomyces
Genus, Shizosaccharomyces
myces), Kluyvero
Claim (1), wherein at least one microorganism selected from the group consisting of the genus Mvces, the genus Candida, the genus Lodderomyces, and the genus Hanseniaspora is immobilized. Or the method for producing a galactooligosaccharide according to item (2). （４）β−ガラクトシダーゼが固定化されている特許請
求の範囲第（１）項乃至第（３）項のいずれかに記載の
ガラクトオリゴ糖の製造法。(4) The method for producing a galactooligosaccharide according to any one of claims (1) to (3), in which β-galactosidase is immobilized.