JP2007537283A - Microspheres that contain protein and show injection performance at high concentrations of protein - Google Patents

Microspheres that contain protein and show injection performance at high concentrations of protein Download PDF

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Abstract

本発明は、実質的に非晶質のタンパク質微粒子の懸濁物を含有する微粒子の組成物に関し、この組成物は、１ｍｌのこの組成物につき少なくとも約５０ｍｇのこのタンパク質の濃度を提供し、そしてこのタンパク質は、少なくとも約２５，０００ダルトンの分子量を有する。生産方法に従って、この活性な因子は、溶解した相分離増強剤（ＰＳＥＡ）を含む水性溶媒または水混和性溶媒中に溶解されて、単一の液相中に溶液を形成する。この溶液は、液相−固相分離に供されて、実質的に非晶質であるか、または非結晶質であり、そして細いゲージの針を通して高濃度で注射可能である小さい球状を形成する活性な因子を生じる。本発明は、より高い分子量のタンパク質についての特別な用途を有する。The present invention relates to a composition of microparticles comprising a suspension of substantially amorphous protein microparticles, the composition providing a concentration of at least about 50 mg of the protein per ml of the composition, and The protein has a molecular weight of at least about 25,000 daltons. Depending on the production method, this active agent is dissolved in an aqueous or water-miscible solvent containing dissolved phase separation enhancer (PSEA) to form a solution in a single liquid phase. This solution is subjected to liquid-solid separation to form small spheres that are substantially amorphous or amorphous and that can be injected at high concentrations through a fine gauge needle. Produces an active factor. The present invention has particular application for higher molecular weight proteins.

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、出願番号第１０／８９４，４１０号（２００４年７月１９日出願）の一部継続出願であり、かつ米国仮特許出願番号第６０／５７０，２７４号（２００４年５月１２日出願）に基づく優先権を主張する（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用され、そして本明細書の一部をなす）。 (Cross-reference of related applications)
This application is a continuation-in-part of Application No. 10 / 894,410 (filed on July 19, 2004), and US Provisional Patent Application No. 60 / 570,274 (filed on May 12, 2004). ), Each of which is incorporated herein by reference in its entirety and forms part of this specification.

（技術分野）
本発明は、活性な因子の小粒子（好ましくは、形が実質的に球状である）の組成物に関する。この活性な因子は、好ましくは高分子量タンパク質であり、そしてより好ましくは高分子量タンパク質の実質的に非晶質の形態であり、そして最も好ましくは実質的に非晶質のモノクローナル抗体である。本発明は、高分子量タンパク質（高濃度のモノクローナル抗体が挙げられる）の注射可能か、または注入可能（ｓｙｒｉｎｇａｂｌｅ）な組成物を提供する性能を有し、従って臨床的有効量のこのような活性な因子を、低容量の組成物によって送達し、好ましくは１０ｍｌ以下の組成物によって送達し、そしてより好ましくは注射器の適用において代表的に見出される容量（皮下ボーラス注射による代表的な注入可能な低用量の注射が挙げられる）によって送達する能力を提供する。活性な因子の球状小粒子に関するこれらの組成物の生産方法および使用方法もまた、本発明によって企図される。この生産方法に従って、この活性な因子は、単一の液相中に溶液を形成する溶解した相分離増強因子（ＰＳＥＡ）を含む、水性溶媒または水混和性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｍｉｓｃｉｂｌｅ）の溶媒中に溶解される。次いでこの溶液は、固相を含む活性な因子、ＰＳＥＡおよび液相を含む溶媒を有する液相−固相分離に供される。この液相−固相分離は、多くの手段（例えば、溶液の温度の変化またはエネルギーの付加）で誘導され得る。この方法は、治療因子を必要とする被験体に送達され得る、治療因子の球状小粒子を形成するのに最も適切である。この方法はまた、高分子（特に、タンパク質のような熱不安定性である高分子（モノクローナル抗体物質が挙げられる））の固体の球状小粒子を形成するのに最も適切である。本発明は、注入可能な高分子を提供する性能を有する。 (Technical field)
The present invention relates to compositions of small particles (preferably substantially spherical in shape) of the active agent. This active agent is preferably a high molecular weight protein, and more preferably is a substantially amorphous form of the high molecular weight protein, and most preferably is a substantially amorphous monoclonal antibody. The present invention has the ability to provide injectable or syringable compositions of high molecular weight proteins (including high concentrations of monoclonal antibodies), and thus clinically effective amounts of such active The agent is delivered by a low volume composition, preferably by 10 ml or less of the composition, and more preferably the volume typically found in syringe applications (typically injectable low dose by subcutaneous bolus injection) Providing the ability to be delivered by injection). Methods of production and use of these compositions for active agent spherical small particles are also contemplated by the present invention. In accordance with this production method, this active factor is dissolved in an aqueous or water-miscible solvent, including dissolved phase separation enhancing factor (PSEA) that forms a solution in a single liquid phase. Is done. This solution is then subjected to a liquid-solid phase separation having an active agent comprising a solid phase, PSEA and a solvent comprising a liquid phase. This liquid-solid phase separation can be induced by a number of means, such as changing the temperature of the solution or adding energy. This method is most suitable for forming spherical small particles of a therapeutic agent that can be delivered to a subject in need of the therapeutic agent. This method is also most suitable for forming solid spherical small particles of macromolecules, particularly macromolecules that are thermolabile, such as proteins, including monoclonal antibody materials. The present invention has the ability to provide an injectable polymer.

（発明の背景）
過去に、数種の技術が、生体高分子のナノ粒子および微粒子の製造のために使用された。慣習的な技術としては、粒子形成のための噴霧乾燥およびミリングが挙げられ、そしてそれらが使用されて、５ミクロン以下のサイズの粒子が生成され得る。 (Background of the Invention)
In the past, several techniques have been used for the production of biopolymer nanoparticles and microparticles. Conventional techniques include spray drying and milling for particle formation, and they can be used to produce particles of size less than 5 microns.

特許文献１および特許文献２は、非晶質の複合体を生じるために、亜鉛と複合体を形成し、次いで超音波ノズルによって微粒子化され、そしてこの液滴を凍結するために、液体窒素中に噴射されることによる、組換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の固体形態の生成を記載する。その後この液体窒素は、−８０℃の温度でエバポレートされ得、そして得られた物質は、凍結乾燥される。   US Pat. Nos. 5,099,086 and 5,037,836 form a complex with zinc to produce an amorphous complex, then micronized by an ultrasonic nozzle, and in liquid nitrogen to freeze the droplets. Describes the production of a solid form of recombinant human growth hormone (hGH) upon injection. This liquid nitrogen can then be evaporated at a temperature of −80 ° C. and the resulting material is lyophilized.

微粒子およびミクロスフェアは、タンパク質、合成ポリマー、多糖類およびそれらの組み合わせを含み、１ミリメートル未満の直径を有し、より好ましくは１００ミクロン未満の直径を有し、そして最も好ましくは１０ミクロン未満の直径を有する固体かまたは半固体の粒子であり、これらの粒子は、種々の物質の形態をとり得る。ミクロスフェアは、多くの異なる用途（主に、分離物（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、診断薬、および薬物送達）に使用されてきた。   The microparticles and microspheres include proteins, synthetic polymers, polysaccharides and combinations thereof, have a diameter of less than 1 millimeter, more preferably less than 100 microns, and most preferably less than 10 microns. These are solid or semi-solid particles that can take the form of various substances. Microspheres have been used for many different applications, mainly separations, diagnostics, and drug delivery.

分離技術に使用されるミクロスフェアの最も周知である例は、合成起源または天然起源のいずれかのポリマー（例えば、ポリアクリルアミド、ヒドロキシアパタイトまたはアガロース）の形態をとるミクロスフェアである。制御された薬物送達の分野において、分子は、多くの場合、その後の放出のために球状小粒子中に組み込まれるか、または球状小粒子内にカプセル化されるか、または均質な（ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ）マトリックス中に組み込まれる。多くの異なる技術（相分離、溶媒エバポレーション、コアセルベーション（ｃｏａｓｃｅｒｖａｔｉｏｎ）、乳化、および噴霧乾燥が挙げられる）が慣習的に使用されて、合成ポリマー、天然のポリマー、タンパク質および多糖類からこれらのミクロスフェアが作製される。一般的に、これらのポリマーは、これらのミクロスフェアの支持構造を形成し、そして目的の薬物は、このポリマー構造中に組み込まれる。   The most well known examples of microspheres used in separation techniques are those that take the form of polymers of either synthetic or natural origin (eg polyacrylamide, hydroxyapatite or agarose). In the field of controlled drug delivery, molecules are often incorporated into spherical small particles for ensuing release, encapsulated within spherical small particles, or a monolithic matrix. Built in. Many different techniques, including phase separation, solvent evaporation, coacervation, emulsification, and spray drying, are conventionally used to make these from synthetic polymers, natural polymers, proteins and polysaccharides. Microspheres are made. In general, these polymers form the support structure for these microspheres, and the drug of interest is incorporated into the polymer structure.

標的薬物をカプセル化するために脂質を使用して調製される粒子が、現在利用可能である。リポソームは、単一もしくは複数のリン脂質および／またはコレステロールの二重層からなる球状粒子である。リポソームは、１００ナノメートル以上のサイズであり、そして種々の、水溶性かまたは脂溶性の薬物を保有し得る。例えば、複数の水性区画を囲んで粒子を形成する二重層膜中に配列される脂質は、Ｓｉｎｉｌ Ｋｉｍの特許文献３に記載されるように、その後の送達のために水溶性薬物をカプセル化するのに使用され得る。   Particles prepared using lipids to encapsulate target drugs are currently available. Liposomes are spherical particles consisting of a bilayer of single or multiple phospholipids and / or cholesterol. Liposomes are 100 nanometers or larger in size and can carry a variety of water-soluble or fat-soluble drugs. For example, lipids arranged in a bilayer membrane that surrounds multiple aqueous compartments to form particles encapsulate a water-soluble drug for subsequent delivery, as described in Sinil Kim, US Pat. Can be used to

球状ビーズは、長年、生化学者のためのツールとして市販されてきた。例えば、ビーズに結合体化した抗体は、特定のリガンドに対する結合特異性を有する比較的大きい粒子を生じる。抗体は、細胞の活性化についての細胞の表面上のレセプターに結合するために、慣習的に使用され、固相に結合されて免疫親和性による精製のための抗体コーティング粒子を形成し、そして長時間にわたってゆっくりと放出される治療因子を送達するために使用され得、この送達は、その因子を所望の部位に対して標的化するための、粒子に結合体化した組織特異的な抗体または腫瘍特異的な抗体を使用する。   Spherical beads have been commercially available for many years as a tool for biochemists. For example, antibodies conjugated to beads yield relatively large particles with binding specificity for a specific ligand. Antibodies are conventionally used to bind to receptors on the surface of cells for cell activation, bound to a solid phase to form antibody-coated particles for purification by immunoaffinity, and long A tissue-specific antibody or tumor conjugated to a particle that can be used to deliver a therapeutic agent that is slowly released over time, to target the agent to a desired site Use specific antibodies.

粒子（特に、薬物送達の分野、分離の分野および診断の分野における使用に適合され得る粒子）を作製するための新規の方法の開発に対する継続的な必要性が存在する。有用性の観点から最も望ましい粒子は、以下の特性を有する球状小粒子である：狭いサイズ分布、実質的に球状、実質的に活性な因子のみからなる、活性な因子の生化学的完全性および生物活性の保持。この粒子は、コーティングによってか、またはマイクロカプセル化によって粒子のさらなる安定化を可能にする、適切な固体を提供するべきである。さらに、球状小粒子の製造方法は、以下の望ましい特性を有する：簡便な製造、本質的に水性のプロセス、高い収率、およびその後のふるい分けを必要としないこと。   There is a continuing need for the development of new methods for making particles, particularly particles that can be adapted for use in the fields of drug delivery, separation and diagnostics. The most desirable particles from a utility standpoint are spherical small particles having the following properties: narrow size distribution, substantially spherical, biochemical integrity of the active agent, consisting essentially of the active agent, and Retention of biological activity. The particles should provide a suitable solid that allows further stabilization of the particles by coating or by microencapsulation. In addition, the method for producing spherical small particles has the following desirable properties: no need for simple production, essentially aqueous processes, high yields, and subsequent sieving.

タンパク質は、鎖の長さが高レベルの三次構造および／または四次構造を生じるのに十分であるアミノ酸の配列である。これは、「ペプチド」またはこのような構造を有さない他の低分子量薬物と区別される。   A protein is a sequence of amino acids whose chain length is sufficient to produce a high level of tertiary and / or quaternary structure. This is distinguished from “peptides” or other low molecular weight drugs that do not have such a structure.

抗体（免疫グロブリン）は、外来分子（抗原）または侵入する生物に対する応答において免疫系細胞（Ｂリンパ球）によって産生されるタンパク質である。抗体は、多くの場合、外来分子または外来細胞に対して非常に強固に結合し、それにより、ファゴサイトーシスまたは補体誘導性の溶解により、これらを不活化するか、または破壊のために印付けする。   Antibodies (immunoglobulins) are proteins produced by immune system cells (B lymphocytes) in response to foreign molecules (antigens) or invading organisms. Antibodies often bind very tightly to foreign molecules or cells, thereby inactivating them or marking them for destruction by phagocytosis or complement-induced lysis. Attach.

免疫グロブリン（Ｉｇ）は、抗体分子である。より高等な脊椎動物は、免疫応答においてそれぞれ異なる役割を担う５つのクラスの免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を有する。   Immunoglobulin (Ig) is an antibody molecule. Higher vertebrates have five classes of immunoglobulins (IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM) that each play a different role in the immune response.

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫系細胞（Ｂリンパ球）のただ１種のクローンから得られ、そしてただ１種の外来分子（抗原）の特異的部位を認識する、高度に特異的な精製された抗体（免疫グロブリン分子）である。モノクローナル抗体は、実験室操作（マウス、キメラ、ヒト化）によって大量生産され得る。用語「モノクローナル抗体」は、広い意味で使用され、そして具体的には、免疫グロブリンのＦｃ領域を有するモノクローナル抗体、多くのエピトープに対する特異性を有する抗体組成物、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、および単鎖分子、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を包含する。 Monoclonal antibodies (mAbs) are obtained from a single clone of immune system cells (B lymphocytes) and are highly specific purified that recognize specific sites of only one foreign molecule (antigen). Antibody (immunoglobulin molecule). Monoclonal antibodies can be produced in large quantities by laboratory manipulation (mouse, chimera, humanization). The term “monoclonal antibody” is used in a broad sense, and specifically includes a monoclonal antibody having the Fc region of an immunoglobulin, an antibody composition having specificity for many epitopes, a bispecific antibody. , Bispecific antibodies (diabodies), and single chain molecules, as well as antibody fragments (eg, Fab, F (ab ′) 2 , and Fv).

ポリクローナル抗体は、単一の外来分子（抗原）の多くの部位に対して特異的であるさまざまな抗体（免疫グロブリン分子）である。天然の免疫応答は、多クローン性である。   Polyclonal antibodies are a variety of antibodies (immunoglobulin molecules) that are specific for many sites of a single foreign molecule (antigen). The natural immune response is polyclonal.

トラップ分子と称される抗体は、２つの異なるレセプター構成要素と「Ｆｃ領域」といわれる抗体分子の一部分との融合体からなり、このことは、単一の構成要素の試薬によって提供される親和性を上回る顕著に増加した親和性を有する成長因子ブロッカーおよびサイトカインブロッカーの生成をもたらす。例えば、トラップ分子は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発された。   An antibody, referred to as a trap molecule, consists of a fusion of two different receptor components and a portion of the antibody molecule referred to as the “Fc region”, which is the affinity provided by a single component reagent. Resulting in the generation of growth factor blockers and cytokine blockers with significantly increased affinity above. For example, trap molecules have been developed by Regeneron Pharmaceuticals.

モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、細胞の１つのクローンから得られる抗体の実験室由来の集団であり、そして１つの特定の抗原部位への結合において高度に特異的である。これらは、ほぼ１５０ｋＤａ程度の大きいタンパク質であり、４つのポリペプチド鎖（それぞれ約２５ｋＤａの２つの軽鎖およびそれぞれ約５０ｋＤａの２つの重鎖）からなる。これらのサイズに起因して、モノクローナル抗体は、現在、一般的には静脈内注射によって送達される。   Monoclonal antibodies (mAbs) are laboratory-derived populations of antibodies obtained from one clone of cells and are highly specific for binding to one specific antigenic site. These are large proteins of the order of 150 kDa and consist of four polypeptide chains (two light chains of about 25 kDa each and two heavy chains of about 50 kDa each). Due to these sizes, monoclonal antibodies are now generally delivered by intravenous injection.

抗体は、多くの場合、治療効果を達成するために、比較的大きい容量で送達される必要がある。例えば、多くの抗体のための送達用量は、約１００〜８００ｍｇの間である。これらの大きい容量の物質の注射性能（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）は、かなりの処方物の問題および送達の問題を示す。このような大きい投薬量の小さい容量は、代表的に、高い粘度を有する；したがって、ほぼ１０ｍＬ〜２５０ｍＬ程度の大きい容量が、これを静脈内に送達するために必要とされる。静脈内送達は、患者にとって非常に不快であり、臨床設定を必要とし、そしてそれは、高価であり、かつ時間が掛かる。   The antibody often needs to be delivered in a relatively large volume to achieve a therapeutic effect. For example, the delivery dose for many antibodies is between about 100-800 mg. The injectability of these large volumes of materials presents considerable formulation and delivery problems. A small volume of such a large dosage typically has a high viscosity; therefore, a large volume on the order of approximately 10 mL to 250 mL is required to deliver it intravenously. Intravenous delivery is very uncomfortable for the patient, requires a clinical setting, and it is expensive and time consuming.

本発明に従う微粒子技術は、この市場に対して重要な利点を提供し得る。なぜなら注射の際に容易に溶解できる高濃縮された懸濁物の形成を可能にするからである。同様に、高分子量タンパク質を含む他の活性な因子は、本発明の利益を享受し得る。本発明は、高濃度かつ比較的小さい容量で送達され得る組成物（従って、注入性能（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）特性および注射性能特性を有する組成物）を記載する。本発明の前に、モノクローナル抗体、他の抗体、または約２５ｋＤａを超える分子量を有する他の高分子量タンパク質は、細いゲージの針（例えば、２０ゲージおよび標準的な注射器と組み合わせて使用される、より細い針）を使用して注射できなかった。本発明の前に、このようなタンパク質はまた、臨床的有効量のタンパク質を含む小さい容量（１０ｍｌ以下）で送達できなかった。これらの分子と組み合わせた微粒子技術の使用は、これまでに必要とされたように、これらの分子の高容量注射の問題を解決する。本発明はまた、小さい注射容量かつ短い送達時間で、高濃度のより低い分子量のタンパク質物質を送達する工程を支援するのに有用であり得る。   Fine particle technology according to the present invention may provide significant advantages for this market. This is because it enables the formation of highly concentrated suspensions that can be easily dissolved upon injection. Similarly, other active factors, including high molecular weight proteins, can benefit from the present invention. The present invention describes compositions that can be delivered in high concentrations and in relatively small volumes (thus compositions having injectable and injectable performance characteristics). Prior to the present invention, monoclonal antibodies, other antibodies, or other high molecular weight proteins having a molecular weight greater than about 25 kDa are used in combination with fine gauge needles (eg, 20 gauge and used in combination with standard syringes). Injection was not possible using a fine needle. Prior to the present invention, such proteins could also not be delivered in small volumes (10 ml or less) containing clinically effective amounts of protein. The use of microparticle technology in combination with these molecules solves the problem of high volume injection of these molecules as previously required. The present invention may also be useful to assist in delivering high concentrations of lower molecular weight protein substances with small injection volumes and short delivery times.

モノクローナル抗体を製造するプロセスは、時間の掛かるプロセスであり、このことが、モノクローナル抗体が高価な理由である。従って、ｍＡｂが非常に効率的かつ安全な様式で標的部位に正確に送達されることが、重要である。ｍＡｂであるか否かにかかわらず、容易に溶解する微粒子またはミクロスフェアの高収率の形成、それらそれぞれの化学的完全性の保持、およびｍＡｂのような物質の場合には、皮下、眼、または他の投与経路による送達を可能にし得る非常に良好な注射性能もまた、微粒子の調製および送達において重要である。
米国特許第５，６５４，０１０号明細書 米国特許第５，６６７，８０８号明細書 米国特許第５，４２２，１２０号明細書 The process of producing a monoclonal antibody is a time consuming process and this is why monoclonal antibodies are expensive. Therefore, it is important that the mAb be accurately delivered to the target site in a very efficient and safe manner. high yield formation of easily dissolved microparticles or microspheres, whether or not mAbs, retention of their respective chemical integrity, and in the case of substances such as mAbs, subcutaneous, ocular, Also very good injection performance, which may allow delivery by other routes of administration, is important in microparticle preparation and delivery.
US Pat. No. 5,654,010 US Pat. No. 5,667,808 US Pat. No. 5,422,120

本発明の局面または目的は、実質的に非晶質であるか、または非結晶質である抗体微粒子を提供することである。   An aspect or object of the present invention is to provide antibody microparticles that are substantially amorphous or amorphous.

本発明の別の局面または目的は、実質的に非晶質であるか、または非結晶質である抗体微粒子を含有する注入可能な組成物を提供することである。   Another aspect or object of the present invention is to provide an injectable composition containing antibody microparticles that are substantially amorphous or amorphous.

本発明のさらなる局面または目的は、タンパク質が、約２５，０００ダルトンおよびそれを上回る分子量を有する場合でさえ、約１０ｍｌ以下の組成物中の臨床的有効量のタンパク質を提供する注入可能な組成物を提供することである。   A further aspect or object of the present invention is to provide an injectable composition that provides a clinically effective amount of protein in a composition of about 10 ml or less, even when the protein has a molecular weight of about 25,000 daltons and above. Is to provide.

本発明のさらなる局面または目的は、活性な因子が少なくとも約２５，０００ダルトンの分子量を有する場合に特に有利な用途が見出される、臨床的有効量の１ｍｌあたり少なくとも約５０ｍｇの活性な因子を有する微粒子を提供することである。   A further aspect or object of the present invention is that microparticles having at least about 50 mg of active agent per ml of clinically effective amount find particularly advantageous use when the active agent has a molecular weight of at least about 25,000 daltons. Is to provide.

本発明の別の局面または目的は、高濃度の注射（例えば、皮下注射が挙げられるが、これに限定されない）による活性な因子の送達を介する臨床的に有効な様式で微粒子を使用する方法を提供することである。   Another aspect or object of the present invention is a method of using microparticles in a clinically effective manner via delivery of an active agent by high concentration injection (eg, including but not limited to subcutaneous injection). Is to provide.

本発明のさらなる局面または目的は、比較的高分子量のタンパク質物質の微粒子を調製するためのプロセスである。   A further aspect or object of the present invention is a process for preparing microparticles of relatively high molecular weight protein material.

本発明の別の局面または目的は、容易に溶解し（すなわち、生理的ｐＨにてＰＢＳ緩衝液中に約１０分以内の溶解性を示す一方で、化学的完全性を示し（すなわち、少なくとも約９０％の化合物が微粒子中で化学的にインタクトである））、そして注射性能（より具体的に、注入性能の形態）を示す（すなわち、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの懸濁物および過剰な力の使用を伴わない細いゲージの針による懸濁物の送達性能を形成する）、微粒子（好ましくは、ミクロスフェア）を提供することである。   Another aspect or object of the present invention is that it is readily soluble (ie, exhibits solubility within about 10 minutes in PBS buffer at physiological pH, while exhibiting chemical integrity (ie, at least about 90% of the compound is chemically intact in the microparticles)) and exhibits injection performance (more specifically, form of infusion performance) (ie use of at least 50 mg / ml suspension and excess force) Forming a suspension delivery performance with a fine gauge needle without a), microparticles (preferably microspheres).

本発明の他の局面、目的および利点は、以下の本発明の好ましい実施形態に従う説明から理解され、具体的にこれらの実施形態は、本明細書中に記載される種々の特徴の定まった組み合わせおよび定まっていない組み合わせを包含し、添付の図面に示される関連情報に関する。   Other aspects, objects and advantages of the present invention will be understood from the following description in accordance with preferred embodiments of the invention, specifically these embodiments being a defined combination of the various features described herein. And related information shown in the accompanying drawings, including undefined combinations.

（発明の要旨）
本発明は、高用量における注射可能な特性を有するタンパク質微粒子に関する。このタンパク質は、活性な因子であり、そしてこの微粒子は、実質的に非晶質であるか、または非結晶質である。これらの組成物によって、非常に高濃度の活性な因子は、非常に低容量において送達可能である。 (Summary of the Invention)
The present invention relates to protein microparticles having injectable properties at high doses. The protein is an active factor and the microparticles are substantially amorphous or amorphous. With these compositions, very high concentrations of active agent can be delivered in very low volumes.

本発明の活性な因子は、好ましくは、治療因子または診断因子であり得る活性な因子である。本発明の好ましい実施形態において、この活性な因子は、高分子タンパク質であり、このタンパク質としては、モノクローナル抗体が挙げられる。なお別の好ましい実施形態において、この活性な因子を含む粒子は、この因子を必要とする被験体に対する任意の適切な経路によるインビボ送達に適しており、この経路としては、他にこれらの型の高分子について可能ではない、皮下および／または眼の注射アプローチが挙げられる。   The active factor of the present invention is preferably an active factor that can be a therapeutic factor or a diagnostic factor. In a preferred embodiment of the invention, the active agent is a macromolecular protein, which includes a monoclonal antibody. In yet another preferred embodiment, the particles comprising the active agent are suitable for in vivo delivery by any suitable route to a subject in need of the agent, including other types of these Subcutaneous and / or ocular injection approaches are not possible for macromolecules.

本発明はまた、活性な因子の、微粒子、球状小粒子、またはミクロスフェアの生産方法および使用方法に関する。生産方法に従って、この活性な因子は溶解した相分離増強因子を含む溶媒中に溶解されて、単一の液相である溶液を形成する。上記溶媒は、好ましくは、水性溶媒または水混和性溶媒である。次いでこの溶液は、固相を含む活性な因子、およびＰＳＥＡおよび液相を含む溶媒を有する液相−固相分離に供される。この液相−固相分離は、多くの手段（例えば、溶液の温度を溶液の相転移温度以下に変化させること）で誘導され得る。   The present invention also relates to methods of producing and using fine particles, spherical small particles, or microspheres of the active agent. According to the production method, this active factor is dissolved in a solvent containing a dissolved phase separation enhancing factor to form a solution that is a single liquid phase. The solvent is preferably an aqueous solvent or a water miscible solvent. This solution is then subjected to a liquid-solid phase separation having an active agent comprising a solid phase and a solvent comprising PSEA and a liquid phase. This liquid phase-solid phase separation can be induced by a number of means (eg, changing the temperature of the solution below the phase transition temperature of the solution).

本発明の好ましい実施形態において、上記溶液を液相−固相分離に供する方法は、この溶液中の上記活性な因子の相転移温度以下までこの溶液を冷却することによる。その温度は、この溶液の凝固点を上回っても下回ってもよい。凝固点が相転移温度を上回る溶液に関して、この溶液は、溶液の凝固点を下げて、溶液を凍結させずに溶液中の相分離を起こさせるために凝固点降下剤（例えば、ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコール）を含有し得る。   In a preferred embodiment of the invention, the method of subjecting the solution to liquid-solid phase separation is by cooling the solution to below the phase transition temperature of the active agent in the solution. The temperature may be above or below the freezing point of this solution. For solutions where the freezing point is above the phase transition temperature, this solution can contain a freezing point depressant (eg, polyethylene glycol or propylene glycol) to lower the freezing point of the solution and cause phase separation in the solution without freezing the solution. May be contained.

本発明の相分離増強剤は、溶液が、活性な因子が凝固して不連続相として球状小粒子の懸濁物を形成する一方で、相分離増強剤が連続相中に溶解したままである相変化の工程に供される場合、上記溶液中の活性な因子の液相−固相分離を増強するか、または誘導する。すなわち、相分離増強剤は、相変化を受けないが、この活性な因子は、相変化を受ける。   The phase separation enhancer of the present invention is a solution in which the active agent coagulates to form a suspension of small spherical particles as a discontinuous phase, while the phase separation enhancer remains dissolved in the continuous phase. When subjected to a phase change process, it enhances or induces a liquid-solid phase separation of the active agent in the solution. That is, the phase separation enhancer does not undergo a phase change, but this active factor undergoes a phase change.

本発明における粒子を生産する方法はまた、形成された粒子のサイズおよび形を制御するために、粒子の液相−固相分離を制御する工程をさらに包含する。相分離を制御する方法は、イオン強度、ｐＨ、相分離増強剤の濃度、溶液中の活性な因子の濃度の制御、または溶液の温度における変化の速度を制御する工程を包含し、これらの制御は、相分離を誘導するために、相分離またはこれらのいずれか、もしくはいくつかの変化の、どちらかの前に行われる。   The method of producing particles in the present invention also further includes the step of controlling the liquid-solid phase separation of the particles in order to control the size and shape of the formed particles. Methods for controlling phase separation include the steps of controlling the rate of change in ionic strength, pH, concentration of phase separation enhancer, concentration of active agent in solution, or temperature of solution, and control these Is performed either before phase separation or any of these, or some changes, to induce phase separation.

本発明の好ましい実施形態において、上記球状小粒子は、粒子の形成後に連続相中のＰＳＥＡから分離される。なお別の好ましい実施形態において、分離の方法は、液体の媒体で粒子を含む溶液を洗浄することにより、この液体の媒体において、活性な因子は、この液体の媒体に溶解しないが、相分離増強剤は、この液体の媒体に溶解する。この液体洗浄媒体は、液体の媒体における活性な因子の溶解性を減少させる因子を含み得る。液体洗浄媒体はまた、１種以上の賦形剤を含み得る。これらの賦形剤は、この球状小粒子のためか、またはこの活性な因子もしくはキャリア因子のために安定剤として作用し得る。これらの賦形剤はまた、さらなる特性（例えば、この粒子からの活性な因子の制御された放出または生物学的組織によるこの活性な因子の改変された浸透）によって、この活性な因子またはこの粒子を染み込ませ得る。別の好ましい実施形態において、これらの小さい粒子は、ＰＳＥＡを含まないが、これらの粒子は、その後の処理工程のために、ＰＳＥＡ相からの分離前にＰＳＥＡ相の存在下で回収され得る。別の好ましい実施形態において、この溶液は、水性溶媒または水混和性溶媒を含む水溶液である。   In a preferred embodiment of the invention, the spherical small particles are separated from PSEA in the continuous phase after the formation of the particles. In yet another preferred embodiment, the separation method comprises washing the solution containing the particles with a liquid medium so that the active agent does not dissolve in the liquid medium, but the phase separation enhancement. The agent dissolves in this liquid medium. The liquid cleaning medium may include factors that reduce the solubility of the active agent in the liquid medium. The liquid cleaning medium may also include one or more excipients. These excipients may act as stabilizers for the spherical small particles or for the active factor or carrier factor. These excipients may also have either the active agent or the particle due to additional properties (eg, controlled release of the active agent from the particle or altered penetration of the active agent by biological tissue). Can be soaked. In another preferred embodiment, these small particles do not contain PSEA, but these particles can be recovered in the presence of the PSEA phase prior to separation from the PSEA phase for subsequent processing steps. In another preferred embodiment, the solution is an aqueous solution comprising an aqueous solvent or a water miscible solvent.

（好ましい実施形態の説明）
本発明は、多くの異なる形態の実施形態に従う。本発明の好ましい実施形態は、開示され、これに伴って、本開示は、本発明の原理の例示と見なされるべきであり、そして本発明の広範な局面を、この例証された実施形態に限定することを意図しないことが、理解される。 (Description of Preferred Embodiment)
The present invention follows many different forms of embodiments. Preferred embodiments of the present invention are disclosed, and as such, the present disclosure should be regarded as illustrative of the principles of the present invention, and the broad aspects of the present invention are limited to these illustrated embodiments. It is understood that it is not intended to.

必要に応じて、本発明の詳細な実施形態は、本明細書中に開示される；しかし、開示される実施形態は種々の形態で具現化され得る本発明の単なる例示であることが、理解されるべきである。従って、本明細書中に開示される特定の詳細は、限定として解釈されるべきではないが、単に特許請求の範囲のための基礎、および実質的に任意の適切な様式で、本発明を多様に用いる当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されるべきである。   As required, detailed embodiments of the present invention are disclosed herein; however, it is understood that the disclosed embodiments are merely exemplary of the invention that may be embodied in various forms. It should be. Accordingly, the specific details disclosed herein are not to be construed as limiting, but are merely a basis for the claims and various aspects of the invention may be disclosed in virtually any suitable manner. Should be construed as a representative basis for teaching those skilled in the art.

本発明は、タンパク質である活性な因子の、実質的に非晶質であるか、または非結晶質である小粒子の組成物に関する。特別な用途は、活性な因子が、少なくとも約２５，０００ダルトンの分子量を有する場合に見出される。生産方法に従って、この活性な因子は溶解した相分離増強因子を含む溶媒中に溶解されて、単一の液体の連続相である溶液を形成する。上記溶媒は、好ましくは、水性溶媒または水混和性溶媒である。次いでこの溶液は、例えば、この活性な因子の相転移温度以下まで溶液の温度を低下させることによって相変化に供され、それによって、この活性な因子は、液相−固相分離を受けて、不連続相を構成する実質的に非晶質であるか、または非結晶質である小粒子の懸濁物を形成するが、相分離増強剤は、連続相中に残存する。   The present invention relates to small particle compositions of active factors that are proteins, either substantially amorphous or amorphous. Special applications are found when the active agent has a molecular weight of at least about 25,000 daltons. According to the production method, this active factor is dissolved in a solvent containing a dissolved phase separation enhancing factor to form a solution that is a single liquid continuous phase. The solvent is preferably an aqueous solvent or a water miscible solvent. The solution is then subjected to a phase change, for example by lowering the temperature of the solution below the phase transition temperature of the active agent, whereby the active agent undergoes liquid-solid separation, Although forming a suspension of small particles that are substantially amorphous or non-crystalline constituting the discontinuous phase, the phase separation enhancer remains in the continuous phase.

本発明は、活性な因子の小粒子（好ましくは、形が実質的に球状である）の組成物に関する。この活性な因子は、好ましくは高分子量タンパク質であり、そしてより好ましくは高分子量タンパク質の実質的に非晶質の形態であり、そして最も好ましくは実質的に非晶質のモノクローナル抗体である。本発明は、高濃度の高分子量タンパク質（モノクローナル抗体が挙げられる）の注射可能か、または注入可能な組成物を提供する可能性を有し、従って、低容量の組成物で、好ましくは１０ｍｌ以下の組成物で、そしてより好ましくは代表的に標準的な注射器において見出される容量で臨床的有効量のこのような活性な因子を送達する性能を提供する。   The present invention relates to compositions of small particles (preferably substantially spherical in shape) of the active agent. This active agent is preferably a high molecular weight protein, and more preferably is a substantially amorphous form of the high molecular weight protein, and most preferably is a substantially amorphous monoclonal antibody. The present invention has the potential to provide injectable or injectable compositions of high concentrations of high molecular weight proteins (including monoclonal antibodies), and thus, in low volume compositions, preferably no more than 10 ml Providing the ability to deliver clinically effective amounts of such active agents in a volume, and more preferably in a volume typically found in standard syringes.

活性な因子の球状小粒子に関するこれらの組成物の生産方法および使用方法もまた、本発明によって企図される。生産方法に従って、この活性な因子は、溶解した相分離増強剤（ＰＳＥＡ）を含む水性溶媒または水混和性溶媒中に溶解されて、単一の液相中に溶液を形成する。次いでこの溶液は、固相を含む活性な因子、ならびにこの液相を含むＰＳＥＡおよび溶媒を含む液相−固相分離に供される。この液相−固相分離は、多くの手段（例えば、溶液の温度の変化またはエネルギーの付加）で誘導され得る。この方法は、治療因子を必要とする被験体に送達され得る治療因子の球状小粒子を形成するのに最も適切である。この方法はまた、高分子（特に、タンパク質（モノクローナル抗体物質が挙げられる）のような熱不安定性である高分子）の固体の球状小粒子を形成するのに最も適切である。本発明は、注入可能な 高分子を提供する性能を有する。   Methods of production and use of these compositions for active agent spherical small particles are also contemplated by the present invention. Depending on the production method, this active agent is dissolved in an aqueous or water-miscible solvent containing dissolved phase separation enhancer (PSEA) to form a solution in a single liquid phase. This solution is then subjected to a liquid phase-solid phase separation comprising the active agent comprising the solid phase and the PSEA containing the liquid phase and the solvent. This liquid-solid phase separation can be induced by a number of means, such as changing the temperature of the solution or adding energy. This method is most appropriate for forming spherical small particles of a therapeutic agent that can be delivered to a subject in need of the therapeutic agent. This method is also most suitable for forming solid spherical small particles of macromolecules, particularly macromolecules that are thermolabile, such as proteins (including monoclonal antibody materials). The present invention has the ability to provide an injectable polymer.

（活性な因子）
本発明の活性な因子は、治療因子または診断因子であり得るタンパク質である。好ましい活性な因子は、高分子量タンパク質である。好ましい因子は、タンパク質の非晶質の形態（非晶質の抗体が挙げられる）である。 (Active factor)
The active factor of the present invention is a protein that can be a therapeutic factor or a diagnostic factor. A preferred active factor is a high molecular weight protein. A preferred factor is an amorphous form of the protein, including amorphous antibodies.

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメント（特に、一般的に「Ｆａｂ」フラグメントまたは「Ｆａｂ」領域として公知である抗原結合フラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ））、単鎖抗体、ならびに組換え形態であるモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体もしくは他の抗体を包含し、そして名称「トラップ分子」で当該分野において現在認識されるものである。抗体とはまた、（例えば、コーティングまたはカプセル化（本明細書中に記載されるようなアプローチによるものを含む）によって）処理される抗体の上記の形態のいずれかをいう。   As used herein, the term “antibody” refers to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and antibody fragments (particularly, antigen binding fractions commonly known as “Fab” fragments or “Fab” regions). ), Single chain antibodies, as well as recombinant forms of monoclonal or polyclonal antibodies or other antibodies, and are currently recognized in the art under the name “trap molecule”. Antibody also refers to any of the above forms of antibody that are treated (eg, by coating or encapsulation, including by an approach as described herein).

トラップ分子は、２つの異なるレセプター構成要素と「Ｆｃ領域」といわれる抗体分子の一部分との融合体からなり、単一の構成要素の試薬によって提供されるトラップ分子を上回る、顕著に増加した親和性を有する成長因子ブロッカーおよびサイトカインブロッカーの生成をもたらす。   The trap molecule consists of a fusion of two different receptor components and a portion of an antibody molecule referred to as an “Fc region”, with significantly increased affinity over the trap molecule provided by a single component reagent. Which results in the generation of growth factor blockers and cytokine blockers.

以下の参考文献は、トラップ分子についてのさらなる情報を提供する：「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｔｒａｐｓ：Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｌｏｃｋｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｏｎ」；Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ ＡＮ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＬＲ、Ｒｕｄｇｅ ＪＳ、Ｗｏｎｇ Ｖ、Ｋｏｅｈｌｅｒ−Ｓｔｅｃ ＥＭ、Ｈａｒｔｎｅｔｔ Ｃ、Ｐｙｌｅｓ ＥＡ、Ｘｕ Ｘ、Ｄａｌｙ ＴＪ、Ｙｏｕｎｇ ＭＲ、Ｆａｎｄｌ ＪＰ、Ｌｅｅ Ｆ、Ｃａｒｖｅｒ Ｓ、ＭｃＮａｙ Ｊ、Ｂａｉｌｅｙ Ｋ、Ｒａｍａｋａｎｔｈ Ｓ、Ｈｕｔａｂａｒａｔ Ｒ、Ｈｕａｎｇ ＴＴ、Ｒａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉ Ｃ、Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ＧＤ、Ｓｔａｈｌ Ｎ；Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｎａｔ Ｍｅｄ（２００３）；第９巻、第１号：ｐ．４７−５２．「Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−Ｔｒａｐ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｂｕｒｄｅｎ、Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａｓｃｉｔｅｓ、ａｎｄ Ｃａｕｓｅｓ Ｄｒａｍａｔｉｃ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ａｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ」；Ｂｙｒｎｅ ＡＴ、Ｒｏｓｓ Ｌ、Ｈｏｌａｓｈ Ｊ、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｍ、Ｈｕ Ｌ、Ｈｏｆｍａｎｎ ＪＩ、Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ＧＤ、Ｊａｆｆｅ ＲＢ；Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００３）；第１５巻；第９（１５）号：ｐ．５７２１−８．「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｃａｌ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ａｎｔｒａｌ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｇｒｏｗｔｈ、ａｎｄ Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｉｍａｔｅ ｂｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｔｒａｐ Ｒ１Ｒ２」；Ｗｕｌｆｆ Ｃ、Ｗｉｌｓｏｎ Ｈ、Ｗｉｅｇａｎｄ ＳＪ、Ｒｕｄｇｅ ＪＳ、Ｆｒａｓｅｒ ＨＭ；Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００２）；第１４３巻、第７号：ｐ．２７９７−８０７。   The following references provide further information on trap molecules: “Cytokine Traps: Multi-Components, High-Affinity Blockers of Cytokine Action”; Economids AN, Carpenter LR, Rudge hS. Hartnett C, Piles EA, Xu X, Daly TJ, Young MR, Fandl JP, Lee F, Carver S, McNay J, Bailey K, Ramakanth S, Hutarat R, Huang TT, Hang TT, Nat Med (2003); Vol. 9, No. 1: p. 47-52. "Vascular Eendothelial Growth Factor-Trap Decreases Tumor Burden, Inhibits Ascites, and Causes Dramatic Vascular Remodeling in an Ovarian Cancer Model"; Byrne AT, Ross L, Holash J, Nakanishi M, Hu L, Hofmann JI, Yancopoulos GD, Jaffe RB; Journal: Clin Cancer Res (2003); Volume 15; Issue 9 (15): p. 5721-8. "Prevention of Thecal Angiogenesis, Antral Follicular Growth, and Ovulation in the Primate by Treatment with Vascular Endothelial Growth Factor Trap R1R2"; Wulff C, Wilson H, Wiegand SJ, Rudge JS, Fraser HM; Journal: Endocrinology (2002); 143 Volume 7, Number 7: p. 2797-807.

本発明の好ましい実施形態において、上記活性な因子は、天然である得るか、または合成であり得るモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｔａｂ）（商品名ＨｕｍｉｒａでＡｂｂｏｔから入手可能）、アブシキシマブ（商品名ＲｅｏＰｒｏでＣｅｎｔｏｃｏｒから入手可能）；ダクリズマブ（商品名ＺｅｎａｐａｚでＲｏｃｈｅから入手可能）、リツキシマブ（商品名ＲｉｔｕｘｉｎまたはＲｉｔｕｘａｎでＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能）、バシリキシマブ（商品名ＳｉｍｕｌｅｃｔでＮｏｖａｒｔｉｓから入手可能）、パリビズマブ（ｐａｌｉｖｚｕｍａｂ）（商品名ＳｙｎａｇｉｓでＭｅｄｉｍｍｕｎｅから入手可能）、インフリキシマブ（商品名ＲｅｍｉｃａｄｅでＣｅｎｔｏｃｏｒから入手可能）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｘｕｍａｂ）（商品名ＨｅｒｃｅｐｔｉｎでＧｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能）、ゲムツズマブ（商品名ＭｙｌｏｔａｒｇでＩＤＥＣから入手可能）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｚｕｔｕｍａｂ）（商品名ＣａｍｐａｔｈでＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ／ＩＬＥＸから入手可能）、およびイブリツモマブ（商品名ＺｅｖｕｌｉｎでＩＤＥＣから入手可能）。Ｇａｍｍａｇａｒｄ Ｌｉｑｕｉｄ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ、ＣＡから入手可能）は、使用できる状態に滅菌され、高度に精製され、かつ高度に濃縮された免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の液体調製物である。   In a preferred embodiment of the invention, the active agent is a monoclonal antibody that can be natural or synthetic. Examples of monoclonal antibodies include, but are not limited to: adalimumab (available from Abbott under the trade name Humira), abciximab (available from Centocor under the trade name ReoPro); daclizumab (trade name Zenapaz) Available from Roche), rituximab (available under the trade name Rituxin or Rituxan from IDEC / Genentech), basiliximab (available from Novartis under the trade name Simulect), palivizumab (available from Medunime under the trade name Synagis) Infliximab (available from Centocor under the trade name Remicade), trastuzumab (trastuxumab) (Available from Genentech under the trade name Herceptin), gemtuzumab (available from IDEC under the trade name Mylotarg), alemtuzumab (available from Millennium / ILEX under the trade name Campath), and Ibetsumomab (available from the trade name ZECulin) Possible). Gammagard Liquid (available from Baxter Healthcare Corporation, Westlake Village, Calif.) Is a liquid preparation of immunoglobulin G (IgG) antibodies that are sterilized, highly purified, and highly concentrated ready for use.

抗体「Ｆａｂ」フラクションまたは抗体「Ｆａｂ」領域の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＧＸ−６Ｂ４（現在、ＴｈｒｏｍｂｏＧｅｎｉｃｓ Ｌｔｄ ｏｆ Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄによって開発中）は、血小板粘着を阻害するＧＰｌｂに対する抗体であり、そして動脈血栓症における初期の工程を防止するための新規のアプローチであることが示される。ジゴキシン特異的Ｆａｂフラグメントは、ヒキガエルの毒物の中毒の処置において有益であることが報告された（Ｈｅａｒｔ．２００３；８９：１２−４７２、Ｔｏｘａｌｅｒｔ、１５：発行物１、１９９８）。ヒト化Ｆａｂフラグメントは、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞においてヒトＦｃ（ε）ＲＩαのＩｇＥ結合ドメインを認識することが示された（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１：第１２９巻、発行物１ ５−１２）。多価Ｆａｂフラグメントを使用する抗腫瘍放射免疫療法に関する他の情報は、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）８１、９７２−９８０に見出される。   Examples of antibody “Fab” fractions or antibody “Fab” regions include, but are not limited to: TGX-6B4 (currently under development by Throbombonics Ltd of Dublin, Ireland) is an antibody against GPlb that inhibits platelet adhesion and has been shown to be a novel approach to prevent early steps in arterial thrombosis It is. Digoxin-specific Fab fragments have been reported to be beneficial in the treatment of toad venom poisoning (Heart. 2003; 89: 12-472, Toxalert, 15: Issue 1, 1998). Humanized Fab fragments have been shown to recognize the IgE binding domain of human Fc (ε) RIα in COS and CHO cells (Journal of Biochemistry, 2001: 129, Issue 1 5-12). Other information regarding anti-tumor radioimmunotherapy using multivalent Fab fragments can be found in British Journal of Cancer (1999) 81, 972-980.

他の高分子量タンパク質の例としては、ＡＡＴ、Ｄｎａｓｅ、スーパーオキシドジスムターゼ、サブチリシンおよび他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。代表的に、高分子量は、タンパク質の特定の要求もしくは特定の特性またはその意図される使用に依存して、約２５，０００程度の分子量を有するタンパク質を示す。より低い分子量のタンパク質は、例えば、注射によって、高濃度で投与されるという同じ要求の範囲に対する、本発明の利益を享受し得る。このようなタンパク質は、当該分野において公知である；例えば、米国特許出願番号第１０／８９４，４１０号（２００４年７月１９日出願）および同第１０／８９６，３２６号（２００４年７月２１日出願）を参照のこと。   Examples of other high molecular weight proteins include, but are not limited to, AAT, Dnase, superoxide dismutase, subtilisin and other proteins. Typically, high molecular weight refers to a protein having a molecular weight on the order of about 25,000, depending on the specific requirements or specific properties of the protein or its intended use. Lower molecular weight proteins may benefit from the present invention over the same range of requirements that are administered at high concentrations, eg, by injection. Such proteins are known in the art; for example, US patent application Ser. Nos. 10 / 894,410 (filed Jul. 19, 2004) and 10 / 896,326 (July 21, 2004). See Japanese Application).

（微粒子、球状小粒子またはミクロスフェア）
本発明の微粒子またはミクロスフェアは、動的光散乱法（例えば、光相関分光法（ｐｈｏｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、レーザー回折、低角度レーザー光散乱（ＬＡＬＬＳ）、中角度レーザー光散乱（ｍｅｄｉｕｍｕ−ａｎｇｌｅ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＭＡＬＬＳ））によってか、光掩蔽法（ｌｉｇｈｔ ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ分析法）によってか、または他の方法（例えば、レオロジーまたは顕微鏡（光学または電子））によって測定される場合、好ましくは２００ミクロン未満の幾何学的な平均粒子サイズを有し、代表的には約０．０１μｍ〜約２００μｍ、代表的には約５０μｍ以下、より好ましくは０．１μｍ〜１０μｍ、さらにより好ましくは約０．５μｍ〜約５μｍ、および最も好ましくは約０．５μｍ〜約３μｍの幾何学的な平均粒子サイズを有する。 (Fine particles, spherical small particles or microspheres)
The microparticles or microspheres of the present invention can be obtained by using dynamic light scattering methods (eg, photocorrelation spectroscopy, laser diffraction, low angle laser light scattering (LALLS), medium-angle laser light scattering). ) (MALLS)), by light obscuration methods (eg Coulter analysis) or by other methods (eg rheology or microscopy (optical or electronic)), preferably Having a geometric average particle size of less than 200 microns, typically about 0.01 μm to about 200 μm, typically about 50 μm or less, more preferably 0.1 μm to 10 μm, and even more Preferably it has a geometric average particle size of about 0.5 μm to about 5 μm, and most preferably about 0.5 μm to about 3 μm.

上記球状小粒子またはミクロスフェアは、実質的に球状である。「実質的に球状」によって意味されることは、粒子の断面の最短の垂直軸に対する最長の垂直軸の長さの比が約１．５以下であることである。実質的に球状は、対称中心線を必要としない。さらに、この粒子は、表面のきめを有し得（例えば、粒子のサイズ全体と比較した場合の尺度に応じて小さい、線またはくぼみまたは***）、そしてなお実質的に球状である。より好ましくは、この粒子の、最長の軸と最短の軸との間の長さの比は、約１．３３以下である。最も好ましくは、この粒子の、最長の軸と最短の軸との間の長さの比は、約１．２５以下である。表面の接触は、保存の際にこの粒子の望ましくない集塊を最小化する、実質的に球状であるミクロスフェアにおいて最小化される。多くの結晶またはフレーク（ｆｌａｋｅ）は、集塊がイオン性相互作用または非イオン性相互作用によって生じ得る場合、広い表面の接触面積を可能にし得る平面を有する。球は、非常に小さい面積に対する接触を可能にする。   The spherical small particles or microspheres are substantially spherical. What is meant by “substantially spherical” is that the ratio of the length of the longest vertical axis to the shortest vertical axis of the cross section of the particle is about 1.5 or less. A substantially spherical shape does not require a symmetric centerline. In addition, the particles can have a surface texture (eg, lines or indentations or ridges that are small depending on the scale when compared to the overall size of the particles) and are still substantially spherical. More preferably, the length ratio of the particles between the longest axis and the shortest axis is about 1.33 or less. Most preferably, the particle has a length ratio between the longest axis and the shortest axis of about 1.25 or less. Surface contact is minimized in substantially spherical microspheres that minimize undesirable agglomeration of the particles upon storage. Many crystals or flakes have a plane that can allow a large surface contact area when agglomerates can be caused by ionic or non-ionic interactions. The sphere allows contact to a very small area.

この微粒子はまた、好ましくは実質的に同じ粒子サイズを有する。相対的に大きい粒子および小さい粒子の両方が存在する場合、広いサイズ分布を有する粒子は、より小さい粒子に、より大きい粒子の間の隙間を埋めることを可能にさせ、それによって、新しい接触表面を形成する。広いサイズ分布は、集塊を結合するために多くの接触機会をつくることによって、より大きな球を生じ得る。本発明の球状微粒子は、好ましくは狭いサイズ分布内にあり、それによって集塊と接触するための機会を最小化する。「狭いサイズ分布」によって意味されるものは、球状小粒子の１０パーセンタイルの体積粒径に対する９０パーセンタイルの球状小粒子の体積粒径の比が５以下である好ましい粒子サイズ分布である。より好ましくは、球状小粒子の１０パーセンタイルの体積粒径に対する９０パーセンタイルの球状小粒子の体積粒径は、３以下である。最も好ましくは、球状小粒子の１０パーセンタイルの体積粒径に対する９０パーセンタイルの球状小粒子の体積粒径の比は、２以下である。   The microparticles also preferably have substantially the same particle size. When both relatively large and small particles are present, particles with a wide size distribution allow smaller particles to fill the gaps between larger particles, thereby creating a new contact surface. Form. A wide size distribution can result in larger spheres by creating more contact opportunities to join agglomerates. The spherical microparticles of the present invention are preferably within a narrow size distribution, thereby minimizing the opportunity to contact the agglomerates. What is meant by “narrow size distribution” is a preferred particle size distribution in which the ratio of the volume particle size of 90th percentile spherical small particles to the volume particle size of 10th percentile spherical small particles is 5 or less. More preferably, the volume particle size of 90th percentile spherical small particles is 3 or less with respect to the volume particle size of 10th percentile of spherical small particles. Most preferably, the ratio of the volume particle size of 90th percentile spherical small particles to the volume particle size of 10th percentile spherical small particles is 2 or less.

幾何標準偏差（ＧＳＤ）もまた、狭いサイズ分布を示すために使用され得る。ＧＳＤの計算は、１５．９％未満および８４．１％未満の累積率における有効カットオフ径（ＥＣＤ）を決定する工程を包含する。ＧＳＤは、１５．９％未満のＥＣＤに対する８４．１７％未満のＥＣＤの比の平方根である。ＧＳＤは、ＧＳＤが２．５未満であり、より好ましくは１．８未満である場合に、狭いサイズ分布を有する。   Geometric standard deviation (GSD) can also be used to indicate a narrow size distribution. The calculation of GSD involves determining the effective cutoff diameter (ECD) at a cumulative rate of less than 15.9% and less than 84.1%. GSD is the square root of the ratio of less than 84.17% ECD to less than 15.9% ECD. The GSD has a narrow size distribution when the GSD is less than 2.5, more preferably less than 1.8.

本発明の好ましい形態において、微粒子中の活性な因子またはミクロスフェア中の活性な因子は、半結晶質か、または非結晶質か、または実質的に非晶質である。   In a preferred form of the invention, the active agent in the microparticles or the active agent in the microspheres is semi-crystalline, amorphous or substantially amorphous.

上記ミクロスフェアは、好ましくは、実質的に非晶質であるか、または非結晶質である活性な因子からなり、すなわち、これらは、非晶質であるか、または半結晶質形態である。本明細書中で使用される場合、「非晶質の」とは、この活性な因子のほぼ無秩序な固体形態をいい、ミクロスフェア内で、タンパク質の結晶格子または他の活性な因子の結晶格子は、存在せず、そして「半結晶質」とは、活性な因子のほぼ無秩序な固体形態をいい、このミクロスフェアの活性な因子の内容物は、この活性な因子の５０％未満の結晶格子形態からなる。   The microspheres preferably consist of active agents that are substantially amorphous or amorphous, i.e. they are amorphous or in a semi-crystalline form. As used herein, “amorphous” refers to the nearly disordered solid form of this active factor, and within the microsphere, the crystal lattice of proteins or other active factors. Is absent, and “semicrystalline” refers to a nearly disordered solid form of the active factor, the active factor content of the microsphere being less than 50% of the crystal lattice of the active factor It consists of forms.

代表的に、上記微粒子またはミクロスフェアは、実質的に非多孔性であり、そして０．５ｇ／ｃｍ３より大きい密度を有し、より好ましくは０．７５ｇ／ｃｍ３より大きい密度を有し、そして最も好ましくは約０．８５ｇ／ｃｍ３より大きい密度を有する。この密度についての好ましい範囲は、約０．５ｇ／ｃｍ３〜約２ｇ／ｃｍ３であり、そしてより好ましくは約０．７５ｇ／ｃｍ３〜約１．７５ｇ／ｃｍ３であり、さらにより好ましくは約０．８５ｇ／ｃｍ３〜約１．５ｇ／ｃｍ３である。本発明に従う実質的に非晶質であるか、または非結晶質である微粒子は、より容易に可溶化するか、またはそのように構成されない微粒子（例えば、結晶性微粒子）より速い溶解速度を示す。 Typically, the microparticles or microspheres are substantially non-porous and have a density greater than 0.5 g / cm 3 , more preferably greater than 0.75 g / cm 3 , And most preferably has a density greater than about 0.85 g / cm 3 . A preferred range for this density is from about 0.5 g / cm 3 to about 2 g / cm 3 , and more preferably from about 0.75 g / cm 3 to about 1.75 g / cm 3 , even more preferably About 0.85 g / cm 3 to about 1.5 g / cm 3 . Microparticles that are substantially amorphous or amorphous according to the present invention are more easily solubilized or exhibit faster dissolution rates than microparticles that are not so configured (eg, crystalline microparticles). .

本発明の微粒子またはミクロスフェアは、高含有量の上記活性な因子を示し得る。微粒子を調製する多くの他の方法に必要とされる、かなりの量の充填剤または同様の賦形剤に対する必要性は、存在しないが、特定の目的を達成するために所望されるような物質が、活性な因子に加えて含まれ得る。例えば、多くの用途において、このミクロスフェアは、この粒子の９５重量％以上を含む。代表的に、この活性な因子は、この粒子の約２０重量％〜１００重量％で存在し、好ましくは約５０重量％〜約１００重量％で存在し、より好ましくは約８０重量％〜約１００重量％で存在し、さらにより好ましくは約９０重量％〜約１００重量％で存在する。本明細書中で範囲を記載する場合、それは、その中に任意の範囲または任意の範囲の組み合わせを含むことが、意味される。   The microparticles or microspheres of the present invention may exhibit a high content of the above active factors. There is no need for significant amounts of fillers or similar excipients required for many other methods of preparing microparticles, but materials as desired to achieve a particular purpose Can be included in addition to the active factor. For example, in many applications, the microspheres contain 95% or more by weight of the particles. Typically, the active agent is present from about 20% to 100% by weight of the particle, preferably from about 50% to about 100%, more preferably from about 80% to about 100%. It is present in weight percent, even more preferably from about 90 weight percent to about 100 weight percent. When ranges are described herein, it is meant to include any range or combination of ranges therein.

本発明のさらなる局面は、上記微粒子またはミクロスフェアが、賦形剤の封入を伴うか、またはこれを伴わずに、上記活性な因子の生化学的完全性および生物活性を保持することである。   A further aspect of the invention is that the microparticles or microspheres retain the biochemical integrity and biological activity of the active agent with or without inclusion of excipients.

（粒子のインビボ送達）
本発明における活性な因子を含む微粒子、球状小粒子またはミクロスフェアは、この因子を必要とする被験体に対する注射可能な経路によるインビボ送達に適している。好ましい送達経路は、注射可能であり、これとしては、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鞘内、硬膜外、動脈内、関節内などが挙げられる。他の送達経路（例えば、局所、経口、直腸、経鼻、肺、膣、口腔粘膜、舌下、経皮、経粘膜、耳または眼内）は、実施され得るが、代表的に、本発明の利点は、注射用途について、より明らかである。注入可能な送達経路は、本発明の目的のために最も好ましい。最も重要なことには、この微粒子またはミクロスフェアは、高分子量のタンパク質または活性な因子にもかかわらず、注射器中に吸引され得、そして細い針を通して注射され得る。好ましい送達経路は、細い針による注射であり、これらとしては、皮下、眼などが挙げられる。細い針によってとは、少なくとも２０ゲージのサイズの針、代表的には約２２ゲージと約３０ゲージ以上との間のサイズの針が意味される。有利には、この細い針は、少なくとも２４ゲージと同じ細さ、より有利には少なくとも２６ゲージと同じ細さ、そしてよりさらに有利には少なくとも２８ゲージと同じ細さであり得る。 (In vivo delivery of particles)
Microparticles, spherical small particles or microspheres containing an active agent in the present invention are suitable for in vivo delivery by an injectable route to a subject in need of this agent. A preferred delivery route is injectable, including intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intrathecal, epidural, intraarterial, intraarticular and the like. Other delivery routes (eg, topical, oral, rectal, nasal, pulmonary, vaginal, oral mucosa, sublingual, transdermal, transmucosal, otic or intraocular) can be implemented, but typically the present invention The advantages of are more apparent for injection applications. Injectable delivery routes are most preferred for the purposes of the present invention. Most importantly, the microparticles or microspheres can be aspirated into a syringe and injected through a fine needle, regardless of the high molecular weight protein or active factor. A preferred delivery route is injection with a fine needle, which includes subcutaneous, ocular and the like. By a fine needle is meant a needle that is at least 20 gauge in size, typically between about 22 gauge and about 30 gauge or more. Advantageously, the fine needle may be at least as fine as 24 gauge, more preferably at least as fine as 26 gauge, and even more advantageously at least as fine as 28 gauge.

上記微粒子またはミクロスフェアは、注射される組成物の１ｍｌあたり少なくとも約５０ｍｇのタンパク質の濃度で注射され得る。例えば、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇのタンパク質は、多くの用途について約１０ｍｌを超えず、そして通常少なくとも約２ｍｌの送達容量で注射可能である、また、この送達は、通常の注射時間の間に行われる。代表的に、このような時間は、長くても約２０秒以下である。   The microparticles or microspheres can be injected at a concentration of at least about 50 mg protein per ml of composition to be injected. For example, from about 100 mg to about 800 mg of protein does not exceed about 10 ml for many applications, and is usually injectable in a delivery volume of at least about 2 ml, and this delivery occurs during normal injection times . Typically, such a time is at most about 20 seconds or less.

本明細書中に示される粒子の処方のための方法は、所望されるか、または必要とされるような賦形剤または他の成分もしくは添加剤を伴うか、またはこれらを伴わない粒子の処方を提供する。添加剤を使用せずにタンパク質自体からタンパク質の微粒子またはミクロスフェアを製造することはまた、本発明のアプローチであり、そして同時に使用についての優れた利点を提供する。   The methods for particle formulation presented herein include particle formulation with or without excipients or other ingredients or additives as desired or required. I will provide a. Producing protein microparticles or microspheres from the protein itself without the use of additives is also an approach of the present invention and at the same time provides excellent advantages for use.

（微粒子を作製するための方法）
（連続相）
活性な因子の微粒子またはミクロスフェアを調製する本発明の方法は、単一の液相中の第１の溶媒に溶解された活性な因子および相分離増強剤を有する溶液を提供する工程で始まる。この溶液は、有機溶媒または混和性有機溶媒の混合物を含む有機系であり得る。この溶液はまた、水性媒体もしくは水混和性の有機溶媒もしくは水混和性の有機溶媒の混合物またはそれらの組み合わせを含む水性ベースの溶液であり得る。この水性媒体は、水、通常の生理食塩水、緩衝液、緩衝化した生理食塩水などであり得る。適切な水混和性の有機溶媒としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）、２−ピロリジノン（２−ピロリドン）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、酢酸、乳酸、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、３−ペンタノール、ｎ−プロパノール、ベンジルアルコール、グリセロール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−８、ＰＥＧ−９、ＰＥＧ−１２、ＰＥＧ−１４、ＰＥＧ−１６、ＰＥＧ−１２０、ＰＥＧ−７５、ＰＥＧ−１５０、ポリエチレングリコールエステル、ＰＥＧ−４ジラウレート、ＰＥＧ−２０ジラウレート、ＰＥＧ−６イソステアレート、ＰＥＧ−８パルミトステアレート、ＰＥＧ−１５０パルミトステアレート、ポリエチレングリコールソルビタン、ＰＥＧ−２０ソルビタンイソステアレート、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテル、ＰＥＧ−３ジメチルエーテル、ＰＥＧ−４ジメチルエーテル、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、アルギン酸ポリプロピレン、ＰＰＧ−１０ブタンジオール、ＰＰＧ−１０メチルグルコースエーテル、ＰＰＧ−２０メチルグルコースエーテル、ＰＰＧ−１５ステアリルエーテル、プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、プロピレングリコールラウレート、およびグリコフロール（ｇｌｙｃｏｆｕｒｏｌ）（テトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテル）、アルカン（例えば、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン）、またはそれらの組み合わせ。 (Method for producing fine particles)
(Continuous phase)
The inventive method of preparing active agent microparticles or microspheres begins with providing a solution having an active agent and a phase separation enhancer dissolved in a first solvent in a single liquid phase. This solution can be an organic system comprising an organic solvent or a mixture of miscible organic solvents. The solution can also be an aqueous based solution comprising an aqueous medium or a water miscible organic solvent or a mixture of water miscible organic solvents or combinations thereof. The aqueous medium can be water, normal saline, buffer, buffered saline, and the like. Suitable water miscible organic solvents include, but are not limited to: N-methyl-2-pyrrolidinone (N-methyl-2-pyrrolidone), 2-pyrrolidinone (2-pyrrolidone), 1, 3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), dimethyl sulfoxide, dimethylacetamide, acetic acid, lactic acid, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol, 3-pentanol, n-propanol, benzyl alcohol, glycerol, tetrahydrofuran (THF), polyethylene glycol (PEG), PEG-4, PEG-8, PEG-9, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-120, PEG-75, PEG-150, polyethylene glycol ester, PEG-4 Laurate, PEG-20 dilaurate, PEG-6 isostearate, PEG-8 palmitostearate, PEG-150 palmitostearate, polyethylene glycol sorbitan, PEG-20 sorbitan isostearate, polyethylene glycol monoalkyl ether, PEG- 3 dimethyl ether, PEG-4 dimethyl ether, polypropylene glycol (PPG), polypropylene alginate, PPG-10 butanediol, PPG-10 methyl glucose ether, PPG-20 methyl glucose ether, PPG-15 stearyl ether, propylene glycol dicaprylate / dica Plates, propylene glycol laurate, and glycofurol (tetrahydrofurfuryl alcohol) Polyethylene glycol ether), alkanes (such as propane, butane, pentane, hexane, heptane, octane, nonane, decane), or a combination thereof.

上記単一の連続相は、第１の溶媒に可溶性であるか、または第１の溶媒と混和性である相分離増強剤の溶液を最初に提供することによって調製され得る。次いでこの溶液に、活性な因子が添加される。この活性な因子は、この溶液に直接添加され得るか、またはこの活性な因子は、最初に第２の溶媒中に溶解され得、次いでこの溶液に添加され得る。この第２の溶媒は、第１の溶媒と同じ溶媒であり得るか、またはこれは、上記の一覧から選択され、そして上記溶液と混和性である別の溶媒であり得る。活性な因子が、周囲温度以下でこの溶液に添加されることが、好ましく、これは、熱不安定性の分子（例えば、特定のタンパク質）について特に重要である。「周囲温度」によって示されるものは、約２０℃〜約４０℃前後の室温の温度である。しかし、この系はまた、加熱が活性な因子の活性の有意な減少を生じない限り、この系における活性な因子の溶解性を増加させるために加熱され得る。   The single continuous phase can be prepared by first providing a solution of a phase separation enhancer that is soluble in or miscible with the first solvent. The active factor is then added to this solution. The active agent can be added directly to the solution, or the active agent can be first dissolved in a second solvent and then added to the solution. This second solvent can be the same solvent as the first solvent or it can be another solvent selected from the above list and miscible with the solution. It is preferred that the active agent be added to the solution below ambient temperature, which is particularly important for heat labile molecules (eg certain proteins). What is indicated by “ambient temperature” is a room temperature temperature of about 20 ° C. to about 40 ° C. However, the system can also be heated to increase the solubility of the active factor in this system, as long as heating does not cause a significant decrease in the activity of the active factor.

（相分離増強剤）
本発明の相分離増強剤（ＰＳＥＡ）は、上記溶液が、相分離の工程に供されるとき、この溶液からの活性な因子の液相−固相分離を増強するか、または誘導し、この工程において、この活性な因子は、固体または半固体になって、不連続相として球状小粒子の懸濁物を形成する一方で、この相分離増強剤は、連続相に溶解したままである。この相分離増強剤は、この溶液が相分離状態に提供されるとき、活性な因子の溶解性を減少させる。適切な相分離増強剤としては、この溶液に溶解するか、またはこの溶液と混和性である、ポリマーまたはポリマーの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。適切なポリマーの例としては、直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマー、コポリマーおよびブロックコポリマーが挙げられる。これらのポリマーは、水溶性、半水溶性、水混和性、または不溶性であり得る。 (Phase separation enhancer)
The phase separation enhancer (PSEA) of the present invention enhances or induces liquid phase-solid phase separation of active agents from the solution when the solution is subjected to a phase separation step. In the process, the active agent becomes a solid or semi-solid, forming a suspension of small spherical particles as a discontinuous phase, while the phase separation enhancer remains dissolved in the continuous phase. This phase separation enhancer reduces the solubility of the active agent when the solution is provided in a phase separated state. Suitable phase separation enhancers include, but are not limited to, a polymer or mixture of polymers that are soluble in or miscible with the solution. Examples of suitable polymers include linear or branched polymers, copolymers and block copolymers. These polymers can be water soluble, semi-water soluble, water miscible, or insoluble.

本発明の好ましい形態において、上記相分離増強剤は、水溶性または水混和性である。使用され得るポリマーの型としては、炭水化物ベースのポリマー、多価脂肪族アルコール、ポリ（ビニル）ポリマー、ポリアクリル酸、多価有機酸、ポリアミノ酸、コポリマーおよびブロックコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７またはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８のようなポロキサマー）、ｔｅｒｔ−ポリマー、ポリエーテル、天然に存在するポリマー、ポリアミド、界面活性剤、ポリエステル、分枝状ポリマーおよび環状ポリマー、ならびにポリアルデヒドが挙げられる。   In a preferred form of the invention, the phase separation enhancer is water soluble or water miscible. The types of polymers that can be used include carbohydrate-based polymers, polyhydric aliphatic alcohols, poly (vinyl) polymers, polyacrylic acid, polyvalent organic acids, polyamino acids, copolymers and block copolymers (eg, Pluronic F127 or Pluronic F68). Poloxamers), tert-polymers, polyethers, naturally occurring polymers, polyamides, surfactants, polyesters, branched and cyclic polymers, and polyaldehydes.

好ましいポリマーは、活性な因子の粒子の投与の意図される経路のための薬学的添加剤として受容可能であるポリマーである。好ましいポリマーは、薬学的に受容可能な添加剤（例えば、種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ ２００、ＰＥＧ ３００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ８０００、ＰＥＧ １００００、ＰＥＧ ２００００など）および種々の分子量のポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８およびＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７またはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８））である。なお別の好ましいポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。なお別の好ましいポリマーは、ヒドロキシエチルデンプンである。他の両親媒性ポリマーはまた、単独かまたは組み合わせて使用され得る。上記相分離増強剤はまた、非ポリマー（例えば、プロピレングリコールおよびエタノールの混合物）であり得る。   Preferred polymers are those that are acceptable as pharmaceutical additives for the intended route of administration of the active agent particles. Preferred polymers are pharmaceutically acceptable additives (eg, polyethylene glycol (PEG) of various molecular weights (eg, PEG 200, PEG 300, PEG 3350, PEG 8000, PEG 10000, PEG 20000, etc.) and various molecular weights. Poloxamers (eg, poloxamer 188 and Pluronic F127 or Pluronic F68). Yet another preferred polymer is polyvinylpyrrolidone (PVP). Yet another preferred polymer is hydroxyethyl starch. Other amphiphilic polymers can also be used alone or in combination. The phase separation enhancer can also be a non-polymer (eg, a mixture of propylene glycol and ethanol).

（液相−固相分離）
上記溶液における活性な因子の液相−固相分離は、当該分野において公知である任意の方法（例えば、温度の変化（上昇または低下のいずれか）、圧力の変化、ｐＨの変化、溶液のイオン強度の変化、活性な因子の濃度の変化、相分離増強剤の濃度の変化、溶液の容量オスモル濃度の変化、これらの組み合わせなど）によって誘導され得る。 (Liquid-solid phase separation)
Liquid phase-solid phase separation of active agents in the solution may be any method known in the art (eg, temperature change (either increase or decrease), pressure change, pH change, solution ions A change in strength, a change in the concentration of the active agent, a change in the concentration of the phase separation enhancer, a change in the osmolality of the solution, combinations thereof, etc.

本発明の好ましい実施形態において、上記相変化は、温度誘導性の相変化である。多くの実施形態において、この温度誘導性の相変化は、温度を上記溶液中の活性な因子の相転移温度以下に下げることによって達成される。   In a preferred embodiment of the invention, the phase change is a temperature induced phase change. In many embodiments, this temperature-induced phase change is achieved by lowering the temperature below the phase transition temperature of the active agent in the solution.

図１は、溶媒、ＰＳＥＡおよび活性な因子を含有する溶液についての二元系相図１０である。この図は、溶液の温度に対して活性な因子の濃度をプロットする。上記ＰＳＥＡの濃度は、一定に保たれる。   FIG. 1 is a binary phase diagram 10 for a solution containing solvent, PSEA, and active agent. This figure plots the concentration of active factor against the temperature of the solution. The PSEA concentration is kept constant.

図１の図表は、以下を有する：飽和曲線１２；過飽和曲線１４；それらの間の準安定領域１６；全ての構成要素が液相中にあり、この系が均質な、単一の液相にある場合、飽和曲線より下の第１の領域１８；およびこの系が、活性な因子の固相ならびにＰＳＥＡおよび溶媒の液相を有する二相系である場合、過飽和曲線より上の第２の領域２０。この相図は、系の温度および純粋な液相中の構成要素の相対濃度、液相−固相ならびにこれらの２つの相の間の転移を取り巻く状態を決定するのに役立つ。   The diagram of FIG. 1 has: a saturation curve 12; a supersaturation curve 14; a metastable region 16 between them; all the components are in the liquid phase and the system is in a homogeneous, single liquid phase In some cases, a first region 18 below the saturation curve; and a second region above the supersaturation curve if the system is a two-phase system with a solid phase of active agent and a liquid phase of PSEA and solvent. 20. This phase diagram helps to determine the temperature surrounding the system and the relative concentrations of the components in the pure liquid phase, the state surrounding the liquid-solid phase and the transition between these two phases.

本明細書中に開示されるように、上記活性な因子の微粒子またはミクロスフェアの調製は、溶液が存在し得る任意の固相と平衡状態にある場合、主に、点Ａにて飽和に達する不飽和溶液（図１中の点Ａ’）からの冷却を包含する。さらなる冷却において、この溶液が所定の温度での平衡溶解度に対応するものよりも活性な因子を含む場合、ある状態に到達する；従って、この溶液は、過飽和状態になる。この固相の自発的な形成は、点Ｂに到達するまで、生じない。点Ｂは、準安定区域の境界線上の点である。この準安定区域の幅は、最大に達し得る不十分な冷却ΔＴｍａｘ＝Ｔ２−Ｔ１によってか、または過飽和ΔＣｍａｘ＝Ｃ＊ ２−Ｃ＊ １によって表わされ得る。これら２つの表示は、熱力学方程式： As disclosed herein, the preparation of the active agent microparticles or microspheres reaches saturation primarily at point A when the solution is in equilibrium with any solid phase in which it may be present. Includes cooling from an unsaturated solution (point A ′ in FIG. 1). On further cooling, a state is reached if the solution contains factors more active than those corresponding to the equilibrium solubility at a given temperature; therefore, the solution becomes supersaturated. This spontaneous formation of the solid phase does not occur until point B is reached. Point B is a point on the boundary line of the metastable zone. The width of this metastable zone can be represented by insufficient cooling ΔT max = T 2 −T 1 that can reach a maximum or by supersaturation ΔC max = C * 2 −C * 1 . These two representations represent the thermodynamic equation:

Figure 2007537283
である。
Figure 2007537283
 It is.

経路Ａ’−Ａ−Ｂは、準安定な溶液を調製する多重熱法（ｐｏｌｙｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｔｈｏｄ）を表わす。等温プロセスにおいて、出発点は、Ａ’’である。一定温度において濃度を増加させることによって、飽和は、点Ａにて再び達成される。点Ｃまでの濃度の等温性増加（例えば、溶媒エバポレーションによってか、活性な因子のシード添加／添加による）は、再び準安定性の限界に達するまで、この溶液を準安定領域に移動させる。準安定限界（ｍｅｔａｓｔａｂｌｅ ｌｉｍｉｔ）を超える場合、この溶液は、不安定となり、そして直ちに自発的な固相の形成を生じる。   Path A'-AB represents a polythermal method for preparing a metastable solution. In the isothermal process, the starting point is A ''. Saturation is again achieved at point A by increasing the concentration at a constant temperature. An isothermal increase in concentration up to point C (eg by solvent evaporation or by seeding / addition of active agent) moves the solution to the metastable region until the metastability limit is reached again. When the metastable limit is exceeded, the solution becomes unstable and immediately results in spontaneous solid phase formation.

等温的に得られた値（ΔＣｍａｘ）Ｔ＝Ｃ＊ ３−Ｃ＊ ２は、多重熱的に得られたΔＴｍａｘ＝Ｔ３−Ｔ２の対応する値と異なり得る。準安定区域の境界線に近づく場合、固体粒子の形成のために必要な時間は、準安定限界に達するまで、減少する。 The value (ΔC max ) obtained isothermally T = C * 3- C * 2 may differ from the corresponding value of ΔT max = T 3 -T 2 obtained thermally. When approaching the metastable zone boundary, the time required for solid particle formation decreases until the metastable limit is reached.

多重熱プロセスにおいて、冷却速度は、制御速度にて行われて、粒子のサイズおよび形を制御する。制御速度によって意味されるものは、約０．２℃／分〜約５０℃／分であり、より好ましくは０．２℃／分〜３０℃／分である。変化の速度は、一定であるかまたは線形、非線形であるか、間欠性であるか、またはプログラム化された速度（複数の相のサイクルを有する）であり得る。この粒子は、この溶液中のＰＳＥＡから分離され得、そして以下に考察されるように洗浄されることによって精製され得る。   In the multiple heat process, the cooling rate is performed at a controlled rate to control the size and shape of the particles. What is meant by the control rate is about 0.2 ° C./min to about 50 ° C./min, more preferably 0.2 ° C./min to 30 ° C./min. The rate of change can be constant, linear, non-linear, intermittent, or programmed rate (having multiple phase cycles). The particles can be separated from the PSEA in the solution and purified by washing as discussed below.

本発明は、活性な因子が、液体状態から固体状態になる一方で、ＰＳＥＡおよび溶媒は、相変化を受けず、そして液体のままである場合、相変化を生じるために活性な因子の濃度、ＰＳＥＡの濃度、温度またはこれらの任意の組み合わせを調整する工程を企図する。相変化を増強するか、促進するか、制御するかまたは抑制するためにｐＨ、イオン強度、重量オスモル濃度などを変化させる工程がまた、企図される。凝固点が比較的高いか、または凝固点が、相転移温度を上回る溶液に関して、この溶液は、系を凝固させずにこの系における相変化を可能にするためにこの系の凝固点を下げる凝固点降下剤（例えば、プロピレングリコール、スクロース、エチルレングリコール、アルコール（例えば、エタノール、メタノール）または凝固点降下剤の水性混合物）を含む。このプロセスはまた、温度が系の凝固点以下に減少されるように行われ得る。本明細書中に記載されるプロセスは、特に、熱不安定性である分子（例えば、タンパク質）に適している。   The present invention provides that the active agent goes from a liquid state to a solid state, while PSEA and the solvent are not subject to a phase change and, if left liquid, the concentration of the active factor to produce a phase change A step of adjusting the concentration of PSEA, temperature or any combination thereof is contemplated. Also contemplated are steps of changing pH, ionic strength, osmolality, etc. to enhance, promote, control or inhibit phase change. For solutions that have a relatively high freezing point or a freezing point above the phase transition temperature, this solution is a freezing point depressant that lowers the freezing point of the system to allow phase change in the system without allowing the system to solidify ( For example, propylene glycol, sucrose, ethylene glycol, alcohol (eg, ethanol, methanol) or an aqueous mixture of freezing point depressants). This process can also be performed such that the temperature is reduced below the freezing point of the system. The processes described herein are particularly suitable for molecules that are thermolabile (eg, proteins).

（任意の賦形剤）
本発明の微粒子は、１種以上の賦形剤を含み得る。これらの賦形剤は、さらなる特性（例えば、この微粒子もしくはこの活性な因子もしくはキャリア因子の増加した安定性、この微粒子からの活性な因子の制御された放出または生物学的組織によるこの活性な因子の改変された浸透）によって、この活性な因子またはこの粒子を染み込ませ得る。適切な賦形剤としては、炭水化物（例えば、トレハロース、スクロース、マンニトール）、カチオン（例えば、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋）、アニオン（例えば、ＳＯ４ ２−）、アミノ酸（例えば、グリシン）、脂質、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、トリグリセリド、胆汁酸またはそれらの塩（例えば、コール酸またはその塩（例えば、コール酸ナトリウム）；デオキシコール酸またはその塩）、脂肪酸エステル、およびＰＳＥＡのポリマーとしての機能を下回るレベルで存在するポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。賦形剤が使用される場合、この賦形剤は、溶液の相図にあまり影響しない。 (Optional excipient)
The microparticles of the present invention can include one or more excipients. These excipients may have additional properties (eg, increased stability of the microparticles or the active factor or carrier factor, controlled release of the active factor from the microparticles, or the active factor by biological tissue). The active agent or the particles can be impregnated by modified permeation of Suitable excipients include carbohydrates (e.g., trehalose, sucrose, mannitol), cationic (e.g., Zn 2 +, Mg 2+, Ca 2+), anions (e.g., SO 4 2-), amino acids (e.g., glycine) , Lipids, phospholipids, fatty acids, surfactants, triglycerides, bile acids or their salts (eg, cholic acid or its salts (eg, sodium cholate); deoxycholic acid or its salts), fatty acid esters, and PSEA Examples include, but are not limited to, polymers that are present at levels below the polymer function. If an excipient is used, it does not significantly affect the solution phase diagram.

（粒子を分離する工程および洗浄する工程）
本発明の好ましい実施形態において、上記微粒子またはミクロスフェアは、上記溶液中の相分離増強剤からこれらを分離することによって回収される。なお別の好ましい実施形態において、分離の方法は、液体媒体で微粒子またはミクロスフェアを含む溶液を洗浄することにより、この液体媒体において、活性な因子は、この液体媒体に溶解しないが、相分離増強剤は、この液体媒体に溶解する。いくつかの洗浄方法は、ダイアフィルトレーションによるか、遠心分離によって行われ得る。この液体媒体は、水性媒体または有機溶媒であり得る。低い水溶性を有する活性な因子に関して、この液体媒体は、水性媒体またはこの活性な因子の水溶性を減少させる因子（例えば、２価のカチオン）を含む水性媒体であり得る。高い水溶性を有する活性な因子（例えば、多くのタンパク質）に関して、有機溶媒またはタンパク質沈殿剤（例えば、硫酸アンモニウム）を含む水性溶媒が、使用され得る。 (Steps for separating and washing particles)
In a preferred embodiment of the invention, the microparticles or microspheres are recovered by separating them from the phase separation enhancer in the solution. In yet another preferred embodiment, the method of separation involves washing a solution containing microparticles or microspheres in a liquid medium so that in this liquid medium active agents are not dissolved in the liquid medium but phase separation enhancement. The agent dissolves in this liquid medium. Some washing methods can be performed by diafiltration or by centrifugation. The liquid medium can be an aqueous medium or an organic solvent. For active agents with low water solubility, the liquid medium can be an aqueous medium or an aqueous medium that includes a factor that reduces the water solubility of the active agent (eg, a divalent cation). For active agents with high water solubility (eg many proteins), organic solvents or aqueous solvents with protein precipitating agents (eg ammonium sulfate) can be used.

本発明の好ましい実施形態において、上記微粒子またはミクロスフェアは、上記溶液中において相分離増強剤からこれらを分離することによって回収される。なお別の好ましい実施形態において、分離の方法は、液体媒体で微粒子またはミクロスフェアを含む溶液を洗浄することにより、この液体媒体において、活性な因子は、この液体の媒体に溶解しないが、相分離増強剤は、この液体媒体に溶解する。いくつかの洗浄方法は、ダイアフィルトレーションによるか、または遠心分離によって行われ得る。この液体の媒体は、水性媒体または有機溶媒であり得る。低い水溶性を有する活性な因子に関して、この液体の媒体は、水性媒体またはこの活性な因子の水溶性を減少させる因子（例えば、２価のカチオン）を含む水性媒体であり得る。高い水溶性を有する活性な因子（例えば、多くのタンパク質）に関して、有機溶媒またはタンパク質沈殿剤（例えば、硫酸アンモニウム）を含む水性溶媒が、使用され得る。   In a preferred embodiment of the invention, the microparticles or microspheres are recovered by separating them from the phase separation enhancer in the solution. In yet another preferred embodiment, the method of separation involves washing a solution containing microparticles or microspheres in a liquid medium so that the active agent does not dissolve in the liquid medium, but phase separation The enhancer dissolves in this liquid medium. Some washing methods can be performed by diafiltration or by centrifugation. The liquid medium can be an aqueous medium or an organic solvent. With respect to an active agent having low water solubility, the liquid medium can be an aqueous medium or an aqueous medium containing an agent that reduces the water solubility of the active agent (eg, a divalent cation). For active agents with high water solubility (eg many proteins), organic solvents or aqueous solvents with protein precipitating agents (eg ammonium sulfate) can be used.

液体媒体として使用するのに適切な有機溶媒の例としては、連続相に適するとして上記で特定されるような有機溶媒が挙げられ、そしてより好ましくは塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ペンタンなどが挙げられる。これらの溶媒のいずれかの混合物を使用することもまた、企図される。１つの好ましい混合物（ｂｌｅｎｄ）は、塩化メチレンまたは塩化メチレンとアセトンとの１：１の混合物である。これらの液体媒体は、例えば、凍結乾燥、エバポレーション、または乾燥による容易な除去のために、低い沸点を有することが好ましい。   Examples of organic solvents suitable for use as a liquid medium include organic solvents as specified above as suitable for the continuous phase, and more preferably methylene chloride, chloroform, acetonitrile, ethyl acetate, methanol, Examples include ethanol and pentane. It is also contemplated to use a mixture of any of these solvents. One preferred blend is methylene chloride or a 1: 1 mixture of methylene chloride and acetone. These liquid media preferably have a low boiling point for easy removal, for example by lyophilization, evaporation or drying.

上記液体媒体はまた、超臨界流体（例えば、液体二酸化炭素またはその超臨界点に近い流体）であり得る。超臨界流体は、相分離増強剤（特に、いくつかのポリマー）に対して適切な溶媒であり得るが、タンパク質粒子に対しては非溶媒である。超臨界流体は、それ自体でか、または共溶媒と共に使用され得る。以下の超臨界流体が、使用され得る：液体ＣＯ２、エタン、またはキセノン。潜在的な共溶媒は、アセトニトリル、ジクロロメタン、エタノール、メタノール、水、または２−プロパノールであり得る。 The liquid medium can also be a supercritical fluid (eg, liquid carbon dioxide or a fluid near its supercritical point). The supercritical fluid may be a suitable solvent for the phase separation enhancer (especially some polymers) but is non-solvent for protein particles. The supercritical fluid can be used by itself or with a co-solvent. The following supercritical fluids can be used: liquid CO 2, ethane or xenon. The potential co-solvent can be acetonitrile, dichloromethane, ethanol, methanol, water, or 2-propanol.

本明細書中に記載されるＰＳＥＡから上記微粒子またはミクロスフェアを分離するのに使用される液体媒体は、この液体媒体中の上記活性な因子の溶解度を減少させる因子を含み得る。この微粒子またはミクロスフェアの収率を最大化するために、この粒子がこの液体媒体中で最小限の溶解度を示すことが最も望ましい。いくつかのタンパク質（例えば、インスリン）に関して、溶解性の減少は、２価陽イオンの添加（例えば、タンパク質に対するＺｎ２＋）によって達成され得る。複合体を形成するために使用され得る他のイオンとしては、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋などが挙げられるが、これらに限定されない。複合体の溶解性は、水溶液中の複合体のダイアフィルトレーションを可能にするために十分低い。 The liquid medium used to separate the microparticles or microspheres from the PSEA described herein can include factors that reduce the solubility of the active agent in the liquid medium. Most desirably, the particles exhibit minimal solubility in the liquid medium in order to maximize the yield of the microparticles or microspheres. For some proteins (eg, insulin), a decrease in solubility can be achieved by the addition of a divalent cation (eg, Zn 2+ to the protein). Other ions that can be used to form the complex include, but are not limited to, Ca 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ , Fe 3+, and the like. The solubility of the complex is low enough to allow diafiltration of the complex in aqueous solution.

上記液体媒体はまた、１種以上の賦形剤を含み得、これらの賦形剤は、さらなる特性（例えば、これまでに議論したような微粒子および／または活性因子もしくはキャリア因子の増加した安定性、この粒子からの活性な因子の制御された放出、または生物学的組織によるこの活性な因子の改変された浸透）によって、この活性な因子またはこの微粒子を染み込ませ得る。本発明の別の形態において、この微粒子またはミクロスフェアは、溶液を含むＰＳＥＡから分離されない。   The liquid medium may also include one or more excipients, which may have additional properties (eg, increased stability of microparticles and / or active or carrier factors as previously discussed). The active agent or the microparticles can be impregnated by controlled release of the active agent from the particle, or modified penetration of the active agent by biological tissue). In another form of the invention, the microparticles or microspheres are not separated from the PSEA containing solution.

（水性ベースのプロセス）
別の好ましい実施形態において、本発明の系の製造プロセスは、水性溶媒または水混和性溶媒を備える水性系の製造プロセスである。適切な水混和性溶媒の例としては、連続相について上記で特定された水混和性溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。水性ベースのプロセスを使用する１つの利点は、この溶液が、緩衝化され得、そして活性な因子を保護するために生化学的な安定化を提供する賦形剤を含み得ることである。このことは、この活性な因子がタンパク質である場合に特に有利である。 (Water-based process)
In another preferred embodiment, the manufacturing process of the system of the present invention is an aqueous system manufacturing process comprising an aqueous solvent or a water miscible solvent. Examples of suitable water miscible solvents include, but are not limited to, the water miscible solvents identified above for the continuous phase. One advantage of using an aqueous based process is that the solution can be buffered and contain excipients that provide biochemical stabilization to protect the active agent. This is particularly advantageous when the active factor is a protein.

（予備製造された微粒子のマイクロカプセル化）
本発明の微粒子またはミクロスフェアは、マイクロカプセル化粒子を形成するためにマトリックスの壁形成（ｗａｌｌ−ｆｏｒｍｉｎｇ）物質内にさらにカプセル化され得る。このマイクロカプセル化は、当該分野で公知の任意のプロセスによって達成され得る。好ましい実施形態において、本発明の微粒子またはミクロスフェアのマイクロカプセル化は、以下に記載されるような、乳化／溶媒抽出プロセスによって達成される。このマトリックスは、この活性な因子に徐放特性を与え得、この特性は、所望の治療用途に従って数分間から数時間、数日間または数週間持続する放出速度を生じる。このマイクロカプセル化微粒子またはマイクロカプセル化ミクロスフェアはまた、この活性な因子の遅延放出処方物を生成し得る。微粒子およびミクロスフェアを作製するさらなる方法は、本願中に示される。 (Microencapsulation of pre-manufactured fine particles)
The microparticles or microspheres of the present invention can be further encapsulated within a matrix wall-forming material to form microencapsulated particles. This microencapsulation can be achieved by any process known in the art. In a preferred embodiment, microencapsulation of the microparticles or microspheres of the present invention is accomplished by an emulsification / solvent extraction process, as described below. The matrix can impart sustained release properties to the active agent, which results in a release rate that lasts from minutes to hours, days or weeks, depending on the desired therapeutic application. The microencapsulated microparticles or microencapsulated microspheres can also produce a delayed release formulation of the active agent. Additional methods for making microparticles and microspheres are set forth herein.

この乳化／溶媒抽出プロセスにおいて、乳化は、２つの不混和性の相（連続相および不連続相（これらは、分散相としても知られている））を混合してエマルションを形成することによって得られる。好ましい実施形態において、この連続相は、水層（すなわち水の相）であり、そしてこの不連続相は、有機相（すなわち油の相）であって、水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルションを形成する。この不連続相は、微細な懸濁物または油中固体（Ｓ／Ｏ）相を形成する微細な分散のいずれかとして本発明の固体粒子の分散物をさらに含み得る。この有機相は、好ましくは水不混和性であるか、または部分的に水混和性の有機溶媒である。水相に対する有機相の重量の比は、約１：９９〜約９９：１であり、より好ましくは１：９９〜約４０：６０であり、そして最も好ましくは約２：９８〜約１：３であり、またはこれらの中の任意の範囲であるか、もしくは範囲の組み合わせである。好ましい実施形態において、水相に対する有機相の比は、約１：３である。本発明のこの局面は、油相が連続相を形成し、そして水相が不連続相を形成する、逆エマルションは、すなわち油中水型エマルション（Ｗ／Ｏ）の利用を、さらに企図する。このことは、２つより多い相を有するエマルション（例えば、油中水中油型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ）エマルション（Ｏ／Ｗ／Ｏ）または水中油中水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルション（Ｗ／Ｏ／Ｗ））の利用を、さらに企図する。   In this emulsification / solvent extraction process, emulsification is obtained by mixing two immiscible phases (continuous and discontinuous phases, also known as dispersed phases) to form an emulsion. It is done. In a preferred embodiment, the continuous phase is an aqueous layer (ie water phase) and the discontinuous phase is an organic phase (ie oil phase) comprising an oil-in-water (O / W) emulsion. Form. This discontinuous phase may further comprise a dispersion of solid particles of the invention as either a fine suspension or a fine dispersion that forms a solid-in-oil (S / O) phase. This organic phase is preferably a water-immiscible or partially water-miscible organic solvent. The weight ratio of organic phase to aqueous phase is about 1:99 to about 99: 1, more preferably 1:99 to about 40:60, and most preferably about 2:98 to about 1: 3. Or any range within these or a combination of ranges. In a preferred embodiment, the ratio of organic phase to aqueous phase is about 1: 3. This aspect of the invention further contemplates the use of inverse emulsions, ie water-in-oil emulsions (W / O), where the oil phase forms a continuous phase and the water phase forms a discontinuous phase. This is because emulsions with more than two phases (eg oil-in-water-in-oil emulsion (O / W / O) or water-in-water-in-oil-in-oil). The use of oil-in-water emulsions (W / O / W)) is further contemplated.

本発明に対するこのバリエーションの好ましい実施形態において、乳化／溶媒抽出プロセスを使用するマイクロカプセル化のプロセスは、これまでに記載された方法および壁形成物質を含む有機相によって予備製造された（ｐｒｅ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）微粒子またはミクロスフェアを調製する工程で始まる。この予備製造された微粒子またはミクロスフェアは、壁形成物質の有機相中に分散されて、油相中に予備製造された微粒子またはミクロスフェアの分散物を含む油中固体型（Ｓ／Ｏ）相を形成する。好ましい実施形態において、この分散は、微粒子またはミクロスフェアおよび有機相の混合物をホモジナイズすることによって生成される。水性媒体は、この連続相を形成する。この場合において、水相でＳ／Ｏ相を乳化することによって形成されるエマルション系は、水中油中固体型（ｓｏｌｉｄ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）（Ｓ／Ｏ／Ｗ）エマルション系である。   In a preferred embodiment of this variation to the present invention, the process of microencapsulation using an emulsification / solvent extraction process was pre-fabricated with the method described previously and an organic phase comprising a wall-forming material. ) Start with the process of preparing microparticles or microspheres. The pre-manufactured microparticles or microspheres are dispersed in the organic phase of the wall-forming material and a solid-in-oil (S / O) phase comprising a pre-manufactured microparticle or microsphere dispersion in the oil phase. Form. In a preferred embodiment, the dispersion is generated by homogenizing a mixture of microparticles or microspheres and an organic phase. The aqueous medium forms this continuous phase. In this case, the emulsion system formed by emulsifying the S / O phase in the aqueous phase is a solid-in-oil-in-water (S / O / W) emulsion system. .

上記壁形成物質とは、個々か、または組み合わせて、マトリックスの構造の本質を形成し得る物質をいう。生物分解性壁形成物質が、好ましい（特に、注射可能な適用のために）。このような物質の例としては、ポリ−ラクチド／ポリ−グリコリドポリマー（ＰＬＧＡ’ｓ）、ポリエチレングリコール結合体化ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）、およびトリグリセリドのファミリーが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＬＧＡまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧが使用される実施形態において、好ましくは、ＰＬＧＡは、ポリ−グリコリドに対するポリ−ラクチドの、１００：０〜０：１００の比、より好ましくは約９０：１０〜約１５：８５の比、および最も好ましくは約５０：５０の比を有する。一般的に、ポリマー中のポリ−ラクチドに対するポリ−グリコリドの比が高ければ、マイクロカプセル化粒子は、より親水性であり、より速い水和およびより速い分解を生じる。種々の分子量のＰＬＧＡもまた、使用され得る。一般的に、ポリマー中のポリ−グリコリドおよびポリ−ラクチドの同じ比に関して、ＰＬＧＡの分子量が高ければ、この活性な因子の放出は、よりゆっくりであり、そしてこのマイクロカプセル化粒子またはスフェアのサイズの分布は、より広くなる。   The wall-forming substance refers to a substance that can form the essence of the structure of the matrix individually or in combination. Biodegradable wall forming materials are preferred (especially for injectable applications). Examples of such materials include, but are not limited to, poly-lactide / poly-glycolide polymers (PLGA's), polyethylene glycol conjugated PLGA (PLGA-PEG), and triglyceride families. In embodiments where PLGA or PLGA-PEG is used, preferably the PLGA is a poly-lactide to poly-glycolide ratio of 100: 0 to 0: 100, more preferably about 90:10 to about 15:85. And most preferably a ratio of about 50:50. In general, the higher the ratio of poly-glycolide to poly-lactide in the polymer, the more hydrophilic the microencapsulated particles, resulting in faster hydration and faster degradation. Various molecular weights of PLGA can also be used. In general, for the same ratio of poly-glycolide and poly-lactide in the polymer, the higher the molecular weight of PLGA, the slower the release of the active agent and the size of the microencapsulated particle or sphere. The distribution becomes wider.

マイクロカプセル化が実施される場合、水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションまたは水中油中固体型（Ｓ／Ｏ／Ｗ）エマルションの有機相（油相）中の有機溶媒は、水不混和性または部分的に水不混和性であり得る。「水不混和性溶媒」によって意味されるものは、１：１の比で水溶液と混合した場合（Ｏ／Ｗ）に、界面のメニスカスを形成する溶媒である。適切な水不混和性溶媒としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炭素数が５以上である置換もしくは非置換の、直鎖状アルカン、分枝状アルカンまたは環状アルカン、炭素数が５以上である置換もしくは非置換の、直鎖状アルケン、分枝状アルケンまたは環状アルケン、炭素数が５以上である置換もしくは非置換の、直鎖状アルキン、分枝状アルキンまたは環状アルキン；芳香族炭化水素、完全か、または部分的にハロゲン化した炭化水素、エーテル、エステル、ケトン、モノ−、ジ−もしくはトリ−グリセリド、ネイティブな油、アルコール、アルデヒド、酸、アミン、直鎖状シリコーンまたは環状シリコーン、ヘキサメチルジシロキサン、またはこれらの溶媒の任意の組み合わせ。ハロゲン化溶媒としては、四塩化炭素、塩化メチレン、クロロホルム、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、トリクロロエタン、ヒドロフルオロカーボン、塩素化ベンゼン（モノ、ジ、トリ）、トリクロロフルオロメタンが挙げられるが、これらに限定されない。特に適切な溶媒は、塩化メチレン、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、キシレンおよび酢酸エチルである。「部分的に水混和性の溶媒」によって意味されるものは、１つの濃度において水不混和性であり、そしてより低い別の濃度においてにおいて水混和性である溶媒である。これらの溶媒は、水混和性が制限されており、そして自発的エマルションを形成し得る溶媒である。部分的に水混和性である溶媒の例は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、プロピレンカーボネート、ベンジルアルコール、および酢酸エチルである。   When microencapsulation is performed, the organic solvent in the organic phase (oil phase) of the oil-in-water (O / W) emulsion or solid-in-oil-in-water (S / O / W) emulsion is water immiscible or It may be partially water immiscible. What is meant by “water-immiscible solvent” is a solvent that forms a meniscus at the interface when mixed with an aqueous solution in a 1: 1 ratio (O / W). Suitable water-immiscible solvents include, but are not limited to: substituted or unsubstituted, straight chain, branched alkane or cyclic alkane having 5 or more carbon atoms, A substituted or unsubstituted linear alkene, branched alkene or cyclic alkene having 5 or more, a substituted or unsubstituted linear alkyne, branched alkyne or cyclic alkyne having 5 or more carbon atoms; aroma Group hydrocarbons, fully or partially halogenated hydrocarbons, ethers, esters, ketones, mono-, di- or triglycerides, native oils, alcohols, aldehydes, acids, amines, linear silicones or Cyclic silicone, hexamethyldisiloxane, or any combination of these solvents. Examples of the halogenated solvent include, but are not limited to, carbon tetrachloride, methylene chloride, chloroform, tetrachloroethylene, trichloroethylene, trichloroethane, hydrofluorocarbon, chlorinated benzene (mono, di, tri), and trichlorofluoromethane. Particularly suitable solvents are methylene chloride, chloroform, diethyl ether, toluene, xylene and ethyl acetate. What is meant by "partially water miscible solvent" is a solvent that is water immiscible at one concentration and water miscible at another lower concentration. These solvents are solvents that have limited water miscibility and can form spontaneous emulsions. Examples of solvents that are partially water miscible are tetrahydrofuran (THF), propylene carbonate, benzyl alcohol, and ethyl acetate.

界面活性化合物は、例えば、有機相の湿潤特性を増加させるためにマイクロカプセル化の局面に関連して添加され得る。界面活性化合物は、水相、有機相、ならびに水性媒体および有機溶液の両方に対する乳化プロセス前、またはエマルションへの乳化プロセス後に添加され得る。界面活性化合物の使用は、カプセル化されていないか、または部分的にカプセル化された球状小粒子の数を減少させ得、このことは、放出の間の上記活性な因子の初期のバースト（ｂｕｒｓｔ）の減少を生じる。これらの界面活性化合物は、化合物の溶解性に依存して、有機相、または水相、または有機相および水相の両方に対して添加され得る。   Surfactant compounds can be added in connection with the microencapsulation aspect, for example, to increase the wetting properties of the organic phase. The surface active compound may be added before the emulsification process for the aqueous phase, the organic phase, and both the aqueous medium and the organic solution, or after the emulsification process into the emulsion. The use of surface active compounds can reduce the number of small, non-encapsulated, or partially encapsulated spherical small particles, which means that an initial burst of the active agent during release. ). These surface active compounds can be added to the organic phase, or the aqueous phase, or both the organic and aqueous phases, depending on the solubility of the compound.

用語「界面活性化合物」によって意味されるものは、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤または生物学的な界面活性分子のような化合物である。これらの界面活性化合物は、どのような場合であっても、約０．０１重量％未満〜約３０重量％、より好ましくは約０．０１重量％〜約１０重量％、またはこれらの任意の範囲または範囲の組み合わせで、水相または有機相またはエマルションに含まれるべきである。   What is meant by the term "surfactant compound" is a compound such as an anionic surfactant, a cationic surfactant, a zwitterionic surfactant, a nonionic surfactant or a biological surfactant molecule It is. These surface-active compounds are in any case less than about 0.01% to about 30%, more preferably from about 0.01% to about 10%, or any range thereof. Or a combination of ranges should be included in the aqueous or organic phase or emulsion.

適切なアニオン性界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラウリル酸カリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸アルキルポリオキシエチレン、アルギン酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸およびそれらの塩、グリセリルエステル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コール酸および他の胆汁酸（例えば、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸）ならびにそれらの塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなど）。   Suitable anionic surfactants include, but are not limited to: potassium laurate, sodium lauryl sulfate, sodium dodecyl sulfate, alkyl polyoxyethylene sulfate, sodium alginate, dioctyl sodium sulfosuccinate, phosphatidylcholine, phosphatidyl. Glycerol, phosphatidylinosine, phosphatidylserine, phosphatidic acid and their salts, glyceryl ester, sodium carboxymethylcellulose, cholic acid and other bile acids (eg cholic acid, deoxycholic acid, glycocholic acid, taurocholic acid, glycodeoxycholic acid ) And salts thereof (for example, sodium deoxycholate).

適切なカチオン性界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：四級アンモニウム化合物（例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルジメチルベンジルアンモニウム、塩酸アシルカルニチン、またはハロゲン化アルキルピリジニウム。アニオン性界面活性剤として、リン脂質が、使用され得る。適切なリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾリン脂質、卵のリン脂質もしくは大豆のリン脂質またはそれらの組み合わせが挙げられる。これらのリン脂質は、塩であっても、脱塩されていてもよいし、水素化されていても部分的に水素化されていてもよく、天然か、半合成かまたは合成であってもよい。   Suitable cationic surfactants include, but are not limited to: quaternary ammonium compounds (eg, benzalkonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, lauryldimethylbenzylammonium chloride, acylcarnitine hydrochloride, or Alkylpyridinium halides, phospholipids can be used as anionic surfactants such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, lysophospholipid, Egg phospholipids or soybean phospholipids, or combinations thereof, which may be salted, desalted or hydrogenated Min to may have been hydrogenated, nature or may be semi-synthetic or synthetic.

適切な非イオン性界面活性剤としては、以下が挙げられる：ポリキシエチルエチレン脂肪アルコールエーテル（ＭａｃｒｏｇｏｌおよびＢｒｉｊ）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（Ｍｙｒｊ）、ソルビタンエステル（Ｓｐａｎ）、モノステアリン酸グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、アリールアルキルポリエーテルアルコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロキサマー）、ポロキサミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、および多糖類（デンプンおよびデンプン誘導体（例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、メチルセルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および非晶質セルロースが挙げられる）。本発明の好ましい形態において、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのコポリマーであり、そして好ましくはプロピレングリコールとエチレングリコールとのブロックコポリマーである。このようなポリマーは、商品名ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（時にはＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ともいわれる）で販売され、そしてＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｒｕｇｅｒを含むいくつかの供給業者によって販売される。とりわけ、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルとしては、短いアルキル鎖を有するものが挙げられる。このような界面活性剤の一例は、ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔによって製造されるＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標）ＨＳ １５（ポリエチレン−６６０−ヒドロキシステアレート）である。生物学的な表面活性分子としては、アルブミン、カゼイン、ヘパリン、ヒルジン、ヘタスターチまたは他の適切な生物適合性因子のような分子が挙げられる。   Suitable nonionic surfactants include: polyoxyethyl ethylene fatty alcohol ethers (Macrogor and Brij), polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters (polysorbate), polyoxyethylene fatty acid esters (Myrj), sorbitan esters (Span), glycerol monostearate, polyethylene glycol, polypropylene glycol, cetyl alcohol, cetostearyl alcohol, stearyl alcohol, arylalkyl polyether alcohol, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (poloxamer), poloxamine, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone , And polysaccharides (starch and starch derivatives such as hydroxyethyl starch (H S), methylcellulose, hydroxycellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and amorphous cellulose) In a preferred form of the invention, the nonionic surfactant is a polyoxyethylene and polyoxypropylene Copolymers, and preferably block copolymers of propylene glycol and ethylene glycol, such polymers are sold under the trade name POLOXAMER (sometimes also referred to as PLURONIC®) and are available in several numbers including Spectrum Chemical and Ruger. In particular, polyoxyethylene fatty acid esters include those having short alkyl chains. An example of a surfactant is SOLUTOL® HS 15 (polyethylene-660-hydroxystearate) manufactured by BASF Aktigensellschaft, which includes albumin, casein, heparin, hirudin, Molecules such as hetastarch or other suitable biocompatible factors.

本発明のマイクロカプセル化の選択の好ましい形態において、水相は、界面活性化合物としてタンパク質を含む。好ましいタンパク質は、アルブミンである。このタンパク質はまた、賦形剤として機能し得る。タンパク質が界面活性化合物でない実施形態において、他の賦形剤は、エマルション中に含まれ得、乳化プロセスの前または後のいずれかにおいて添加され得る。適切な賦形剤としては、糖類、二糖類、および糖アルコールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい二糖類は、スクロースであり、そして好ましい糖アルコールはマンニトールである。   In a preferred form of the microencapsulation selection of the present invention, the aqueous phase comprises protein as a surface active compound. A preferred protein is albumin. The protein can also function as an excipient. In embodiments where the protein is not a surfactant compound, other excipients can be included in the emulsion and can be added either before or after the emulsification process. Suitable excipients include, but are not limited to, saccharides, disaccharides, and sugar alcohols. A preferred disaccharide is sucrose and a preferred sugar alcohol is mannitol.

さらに、チャネリング剤（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の使用は、最終生成物の水浸透速度を増加させ得る。水浸透速度を増加は、マトリックスが存在する場合、水和速度を改変することによって、マトリックスからの活性な因子の初期放出動態の改変、ならびにマトリックスの分解速度および分解依存性の放出動態の改変を生じる。カプセル化の間にチャネリング剤としてＰＥＧを使用することは、ＰＥＧが相分離増強剤として使用される球状小粒子の製造の間の洗浄プロセスのうちの、除去工程部分について有利であり得る。さらに、連続相の塩分およびｐＨは、このポリマーおよび得られる微粒子またはミクロスフェアの性質に影響を及ぼすために変えられ得、この性質としては、マトリックスの充填密度、表面の電荷、ぬれ、空隙率、粘性、粒子サイズ分布、ならびにマトリックスからのカプセル化治療因子の初期のバーストおよび放出動態が挙げられる。連続相の塩分はまた、２つの相の混和性を減少させるために使用され得る。適切な塩としては、水溶性のリン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、および炭酸塩、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。塩が使用される実施形態において、塩濃度は、０Ｍ〜１０Ｍの範囲であり、より好ましくは１ｍＭ〜１Ｍの範囲であり、および最も好ましくは２０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である。ｐＨは、１〜１１の範囲であり、より好ましくは２．５〜９の範囲であり、そして最も好ましくは６〜８の範囲である。   In addition, the use of channeling agents (eg, polyethylene glycol (PEG)) can increase the water penetration rate of the final product. Increasing the water penetration rate alters the initial release kinetics of the active agent from the matrix, as well as the matrix degradation rate and degradation dependent release kinetics, by modifying the hydration rate when the matrix is present. Arise. The use of PEG as a channeling agent during encapsulation can be advantageous for the removal step portion of the washing process during the production of spherical small particles where PEG is used as a phase separation enhancer. Further, the salinity and pH of the continuous phase can be altered to affect the properties of the polymer and the resulting microparticles or microspheres, including matrix packing density, surface charge, wetting, porosity, Viscosity, particle size distribution, and initial burst and release kinetics of the encapsulated therapeutic agent from the matrix. Continuous phase salinity can also be used to reduce the miscibility of the two phases. Suitable salts include, but are not limited to, water soluble phosphates, sulfates, acetates, and carbonates, Tris, MES, HEPES. In embodiments where salt is used, the salt concentration is in the range of 0M to 10M, more preferably in the range of 1 mM to 1M, and most preferably in the range of 20 mM to 200 mM. The pH is in the range of 1-11, more preferably in the range of 2.5-9, and most preferably in the range of 6-8.

有機相（油相）中の微粒子またはミクロスフェアを分散させる工程の後、水性媒体（水相）の連続相は、例えば、均質化または超音波処理によって、この有機相の不連続相と激しく混合されて、未発達のマイクロカプセル化粒子の乳化小滴を含むエマルションを形成する。この水性の連続相は、乳化小滴からの有機溶媒の急な抽出を最小化するために、水相と有機相とを混合する前に、有機相に使用される有機溶媒を用いて飽和され得る。この乳化プロセスは、実施される場合には、混合物がその液体の性質を維持し得る任意の温度で行われ得る。エマルション安定性は、有機相または水相中の界面活性化合物の濃度の関数であるか、または界面活性化合物が乳化プロセス後にエマルションに添加される場合には、このエマルション中の界面活性化合物の濃度の関数である。これは、このエマルション系（未発達のマイクロカプセル化粒子）の小滴のサイズ、ならびにマイクロカプセル化粒子のサイズおよびサイズ分布を決定する因子の１つである。マイクロカプセル化粒子のサイズ分布に影響する他の因子は、連続相の粘性、不連続相の粘性、乳化の間のせん断力、界面活性化合物型および濃度、ならびに油／水の比である。   After the step of dispersing fine particles or microspheres in the organic phase (oil phase), the continuous phase of the aqueous medium (aqueous phase) is vigorously mixed with the discontinuous phase of this organic phase, for example by homogenization or sonication To form an emulsion containing emulsified droplets of undeveloped microencapsulated particles. This aqueous continuous phase is saturated with the organic solvent used in the organic phase before mixing the aqueous and organic phases to minimize the rapid extraction of the organic solvent from the emulsified droplets. obtain. This emulsification process, if performed, can be performed at any temperature at which the mixture can maintain its liquid nature. Emulsion stability is a function of the concentration of the surface active compound in the organic or aqueous phase or, if a surface active compound is added to the emulsion after the emulsification process, the concentration of the surface active compound in this emulsion. It is a function. This is one of the factors that determines the size of the droplets of this emulsion system (undeveloped microencapsulated particles) and the size and size distribution of the microencapsulated particles. Other factors that influence the size distribution of the microencapsulated particles are continuous phase viscosity, discontinuous phase viscosity, shear force during emulsification, surfactant compound type and concentration, and oil / water ratio.

乳化後、エマルションは、硬化媒体（ｈａｒｄｅｎｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍｕ）中に移される。この硬化媒体は、未発達のマイクロカプセル化粒子から不連続相中の溶媒を抽出し、乳化小滴の近傍内の予備製造された微粒子またはミクロスフェアの周囲に、固形のポリマーマトリックスを有する固形のマイクロカプセル化粒子の形成を生じる。Ｏ／ＷまたはＳ／Ｏ／Ｗ系の実施形態において、この硬化媒体は、水性媒体であり、この水性媒体は、界面活性化合物、もしくは増粘剤、または他の賦形剤を含み得る。このマイクロカプセル化粒子は、好ましくは球状であり、そして約０．６〜約３００μｍ、およびより好ましくは約０．８〜約６０μｍの粒子サイズを有する。さらに、好ましくは、このマイクロカプセル化粒子は、粒子サイズの狭い分布を有する。不連続相の抽出時間を減少させるために、加熱または減圧が、この硬化媒体に適用され得る。未発達のマイクロカプセル化粒子からの不連続相の抽出速度は、不連続相の迅速な除去（例えば、エバポレーション（沸騰効果））が、マトリックスの連続性の破壊を生じるので、最終的な固形のマイクロカプセル化粒子中の空隙率の程度において重要な因子である。   After emulsification, the emulsion is transferred into a hardening medium. This curing medium extracts the solvent in the discontinuous phase from the undeveloped microencapsulated particles and forms a solid with a solid polymer matrix around the pre-fabricated microparticles or microspheres in the vicinity of the emulsified droplets. This results in the formation of microencapsulated particles. In embodiments of the O / W or S / O / W system, the curing medium is an aqueous medium, which may contain a surface active compound, or a thickener, or other excipient. The microencapsulated particles are preferably spherical and have a particle size of about 0.6 to about 300 μm, and more preferably about 0.8 to about 60 μm. Furthermore, preferably the microencapsulated particles have a narrow distribution of particle sizes. Heating or vacuum can be applied to the curing medium to reduce the extraction time of the discontinuous phase. The rate of extraction of the discontinuous phase from the undeveloped microencapsulated particles is such that the rapid removal of the discontinuous phase (eg, evaporation (boiling effect)) results in a break in the continuity of the matrix, resulting in a final solid This is an important factor in the degree of porosity in the microencapsulated particles.

乳化プロセスの好ましい実施形態において、乳化プロセスが実施される場合には、この乳化プロセスは、バッチプロセスの代わりに連続的な様式で行われる。図４１は、このことに関して使用され得る連続的乳化反応器の設計を示す。   In a preferred embodiment of the emulsification process, if an emulsification process is performed, the emulsification process is performed in a continuous manner instead of a batch process. FIG. 41 shows a continuous emulsification reactor design that can be used in this regard.

カプセル化が実施される他の実施形態において、上記活性な因子の微粒子またはミクロスフェアをカプセル化する硬化した壁形成ポリマーマトリックスは、遠心分離および／または濾過（ダイアフィルトレーションを含む）によって、さらに回収され、そして水で洗浄される。残りの液相は、凍結乾燥またはエバポレーションのようなプロセスによってさらに除去され得る。   In other embodiments in which encapsulation is performed, the hardened wall-forming polymer matrix encapsulating the active agent microparticles or microspheres is further separated by centrifugation and / or filtration (including diafiltration). It is collected and washed with water. The remaining liquid phase can be further removed by processes such as lyophilization or evaporation.

微粒子またはミクロスフェアは、表面官能基の特性を制御することによって粒子の特性を標的化された特性に修正するために選択された高分子電解質の少なくとも１つ以上の層中にカプセル化され得る。このような微粒子は、粒子の表面の特性に影響を及ぼすために、反対の電荷のポリマー（ポリイオン）と共に水性媒体中に浸される。これらの粒子が、ζ電位測定によって決定されるような負の電荷を有する場合、このポリマーの第１の層は、正である。これらの粒子が、最初に正の電荷を有する場合、この第１のポリマー層は、負である。この第１の層の沈着は、水、緩衝液、またはいくつかの水混和性の有機溶媒を含む水溶液中で行われ得る。   The microparticles or microspheres can be encapsulated in at least one or more layers of a polyelectrolyte selected to modify the properties of the particles to the targeted properties by controlling the properties of the surface functional groups. Such microparticles are immersed in an aqueous medium with an oppositely charged polymer (polyion) to affect the surface properties of the particles. If these particles have a negative charge as determined by zeta potential measurement, the first layer of the polymer is positive. If these particles initially have a positive charge, this first polymer layer is negative. This first layer deposition may be performed in an aqueous solution comprising water, buffer, or some water-miscible organic solvent.

コロイド性の不安定なタンパク質微粒子の場合には、溶解性を減少させる他の因子が、導入され得る。溶解性を減少させる低分子量の因子／粘度増強因子（例えば、アルコール、グリセロールなど）およびポリマー（例えば、水溶性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヘタスターチ、デキストランなど）は、この目的のために使用され得る。コーティング物質とのインキュベーションは、粒子の溶解性を制御するために、室温および、より低い温度にて行われ得る。   In the case of colloidally unstable protein microparticles, other factors that reduce solubility can be introduced. Low molecular weight / viscosity enhancing factors (eg, alcohol, glycerol, etc.) and polymers (eg, water soluble polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone (PVP), hetastarch, dextran, etc.) that reduce solubility Can be used for. Incubation with the coating material can be performed at room temperature and at lower temperatures to control the solubility of the particles.

粒子は、必要とされる量の時間（数分間〜数時間）の間、上記ポリマーと一緒にインキュベートされ得る。次いでコーティングされた粒子の懸濁物は、遠心分離またはダイアフィルトレーションのいずれかによって過剰な非結合性のポリマーから単離され得る。これらの粒子は、好ましくは水溶液または上記の溶解性を減少させる因子を含む溶液のいずれかにおいて、残留するポリマーから洗浄される。温度は、活性物質およびコーティング物質の溶解性に基づいて最適化される。   The particles can be incubated with the polymer for the required amount of time (minutes to hours). The suspension of coated particles can then be isolated from excess unbound polymer either by centrifugation or diafiltration. These particles are washed from the remaining polymer, preferably in either an aqueous solution or a solution containing a factor that reduces the solubility described above. The temperature is optimized based on the solubility of the active and coating materials.

洗浄工程が完了した後、反対の電荷を有するポリマーの次の層が、導入される。この手順は、これまでのサイクルにあるように繰り返され得る。沈着したポリマー層の数は、所望される用途に依存し得る。この数は、例えば、表面改変のための１つの層と、必要とされる溶解速度に依存する徐放用途のための１０〜２０の二重層とで変えられ得る。   After the washing process is complete, the next layer of polymer with the opposite charge is introduced. This procedure can be repeated as in previous cycles. The number of deposited polymer layers can depend on the desired application. This number can vary, for example, with one layer for surface modification and 10-20 bilayers for sustained release applications depending on the required dissolution rate.

使用され得るポリマーとしては、以下の一覧が挙げられるが、これらに限定されない：ポリスチレンスルホネート（ＰＳＳ）および塩酸ポリアリルアミン（ＰＡＨ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）（ＰＤＤＡ）、および生体適合性ポリマー（例えば、デキストラン硫酸、キトサン、硫酸キトサン、ポリリジン、ゼラチン、アルギナート、プロタミン、硫酸プロタミン、キサンタンガムなど）、およびまた荷電した脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンなど）。   Polymers that can be used include, but are not limited to, the following: polystyrene sulfonate (PSS) and polyallylamine hydrochloride (PAH), polyacrylic acid (PAA), poly (diallyldimethylammonium chloride) (PDDA) , And biocompatible polymers (eg, dextran sulfate, chitosan, chitosan sulfate, polylysine, gelatin, alginate, protamine, protamine sulfate, xanthan gum, etc.) and also charged lipids (eg, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, etc.).

交互吸着（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ）アプローチにおいて、ポリイオンの第１の層はまた、この系中に存在するポリマー（例えば、ＰＥＧ）の除去を伴わずに、粒子の制御された沈殿の最後に添加され得る。さらに、脂質構造体（例えば、リポソーム）は、反対に荷電したポリマーによる交互の沈着において使用され得、そして荷電した脂質と非荷電の脂質との間の比は、この殻の透過性を最小限にするために最適化され得る。いくつかの場合では、２価のカチオン（例えば、亜鉛）の存在下において交互吸着アセンブリを行うことが好まれ得る。   In the alternative layer-by-layer approach, the first layer of polyion is also present at the end of the controlled precipitation of particles without removal of the polymer (eg PEG) present in the system. Can be added. In addition, lipid structures (eg, liposomes) can be used in alternating deposition with oppositely charged polymers, and the ratio between charged and uncharged lipids minimizes the permeability of this shell. Can be optimized to In some cases it may be preferred to perform the alternating adsorption assembly in the presence of a divalent cation (eg, zinc).

（実施例１）
この実施例は、注入可能な抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアの５００μｌバッチを調製するための基本的な手順を提供する。このモノクローナル抗体の５００μｌの１０個のバッチは、エッペンドルフチューブにおいて以下のように調製される：
４０ｍＭ酢酸アンモニウム（ＡＡ）緩衝液（ｐＨ＝６．５）の調製。４０ｍＭのＡＡ緩衝液は、１リットルの脱イオンＨ２Ｏに３．０８グラムのＡＡ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を溶解することによって調製される。このＡＡは、容易に溶解し、そして約６．４のｐＨを有する緩衝溶液を形成する。このｐＨを希釈水酸化アンモニウムによってｐＨ＝６．５に調整する。 Example 1
This example provides a basic procedure for preparing a 500 μl batch of microspheres of injectable anti-factor VIII monoclonal antibody. Ten batches of 500 μl of this monoclonal antibody are prepared in an Eppendorf tube as follows:
Preparation of 40 mM ammonium acetate (AA) buffer (pH = 6.5). 40 mM AA buffer is prepared by dissolving 3.08 grams of AA (Spectrum) in 1 liter of deionized H 2 O. This AA dissolves easily and forms a buffer solution having a pH of about 6.4. The pH is adjusted to pH = 6.5 with diluted ammonium hydroxide.

５００ｍＬの４０ｍＭ ＡＡ緩衝溶液中の１０％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８の調製。５０グラムのＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（ＢＡＳＦ）は、５００ｍＬの４０ｍＭ ＡＡ緩衝液（工程１に記載されるような）に溶解される（ただし、ｐＨ調整は、この時点で必要ではない）。この量のＰｏｌｏｘａｍｅｒの溶解は、数回の添加によって行われ得る。最終ｐＨは、ｐＨ約６．４付近である。この溶液は、０．２２フィルターを用いて濾過され、そして冷蔵で保持される。   Preparation of 10% Poloxamer 188 in 500 mL of 40 mM AA buffer solution. 50 grams of Poloxamer 188 (BASF) is dissolved in 500 mL of 40 mM AA buffer (as described in Step 1) (although pH adjustment is not necessary at this point). This amount of Poloxamer can be dissolved by several additions. The final pH is around pH 6.4. This solution is filtered using a 0.22 filter and kept refrigerated.

緩衝液の交換。２ ＰＤ１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、５ｍＬのタンパク質に対して使用される。カラムの総容量は、３．５ｍＬであり、そしてこれは、各２．５ｍＬを超えない交換が推奨される。各カラムは、２５ｍＬ未満の４０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液によってリンスされて、この緩衝液によってカラムが飽和される必要がある。その後、２．５ｍＬのリン酸緩衝液中の抗第ＶＩＩＩ因子が、このカラム中に挿入される。次いでさらに１ｍＬのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液が、挿入されて、このカラムを満たす。このタンパク質は、さらに２．５ｍＬの４０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液を注射することによって収集される。 Buffer exchange. 2 PD10 desalting column (Amersham Biosciences) is used for 5 mL of protein. The total volume of the column is 3.5 mL, and this is recommended for exchange not exceeding 2.5 mL each. Each column should be rinsed with less than 25 mL of 40 mM NH 4 OAc buffer to saturate the column with this buffer. Thereafter, anti-factor VIII in 2.5 mL of phosphate buffer is inserted into the column. A further 1 mL of NH 4 OAc buffer is then inserted to fill the column. This protein is collected by injecting an additional 2.5 mL of 40 mM NH 4 OAc buffer.

好ましい透析カセットは、３〜１２ｍＬの総容量および１０，０００ダルトンのＭＷカットオフを有する１ Ｐｉｅｒｃｅであり、５ｍＬの上記タンパク質に対する緩衝液を置換する。このカセットを、脱イオンＨ２Ｏと共に使用する前に、（例えば、１８Ｇ１／２の針を有する５ｍＬ〜１０ｍＬの注射器を使用することによって）水和する。最初に、空気がこのカセット中に注射されて、メンブレンの壁が分離される。その後、このサンプルが、注射される。空気がこのカセットから引き抜かれて、より良好なサンプルとメンブレンとの接触が有される。最後に、フロート（ｆｌｏａｔ）がこのカセット上に添加され、そしてこのカセットは、低速で回転する。経験則として、それぞれの緩衝液交換は、少なくとも １０倍容量であるべきである。 A preferred dialysis cassette is 1 Pierce with a total volume of 3-12 mL and a MW cutoff of 10,000 Dalton, replacing 5 mL of buffer for the protein. The cassette is hydrated (eg, by using a 5-10 mL syringe with an 18G1 / 2 needle) prior to use with deionized H 2 O. Initially, air is injected into the cassette to separate the membrane walls. This sample is then injected. Air is withdrawn from the cassette to have better sample-membrane contact. Finally, a float is added over the cassette and the cassette rotates at low speed. As a rule of thumb, each buffer exchange should be at least 10 times the volume.

タンパク質濃度。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定すること、および検量線によって決定される。必要に応じて、このタンパク質は、所望の作業濃度に従って緩衝液を含み得る。   Protein concentration. Protein concentration is determined by measuring absorbance at 280 nm and a calibration curve. If desired, the protein can include a buffer according to the desired working concentration.

１０％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ溶液のｐＨは、酢酸によってｐＨ＝６．０およびｐＨ＝６．１に調整される。５ｍＬのこのタンパク質は、５００μｌの１０個のバッチに分割される。その後、１０００μＬの４０ｍＭ ＡＡ中の１０％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（ｐＨ＝６．０）が、５個のエッペンドルフチューブに添加され、そして１０００μＬの４０ｍＭ ＡＡ中の１０％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（ｐＨ＝６．１）が、他の５個のエッペンドルフチューブに添加される。これらの溶液は、穏やかなボルテックスおよび手動での混合によって、十分に混合される。これらの溶液は、透明な状態〜わずかに濁った状態を呈するはずである。これらのサンプルは、ゆっくりと冷却を行うために、１時間〜２時間（約４℃）、インキュベートされる。これらのサンプルは、ドライアイス／エタノール混合物によって冷却され、そして一晩、凍結乾燥されるか、または−８０℃の冷蔵庫中におかれて、全ての脱イオンＨ２Ｏが除去される。 The pH of the 10% Poloxamer solution is adjusted to pH = 6.0 and pH = 6.1 with acetic acid. 5 mL of this protein is divided into 10 batches of 500 μl. Thereafter, 10% Poloxamer 188 (pH = 6.0) in 1000 μL of 40 mM AA was added to 5 Eppendorf tubes, and 10% Poloxamer 188 (pH = 6.1) in 1000 μL of 40 mM AA was added. Add to the other 5 Eppendorf tubes. These solutions are thoroughly mixed by gentle vortexing and manual mixing. These solutions should exhibit a clear to slightly turbid state. These samples are incubated for 1 to 2 hours (about 4 ° C.) for slow cooling. These samples are cooled with a dry ice / ethanol mixture and lyophilized overnight or placed in a −80 ° C. refrigerator to remove all deionized H 2 O.

一旦全ての脱イオンＨ２Ｏが除去されると、１ｍＬのＭｅＣｌ２／５％アセトンが、各エッペンドルフチューブ中の乾燥サンプルに添加される。混合が進み、そして遠心分離が、６０００ＲＰＭ〜８０００ＲＰＭで３分間行われる。この上清は、この遠心分離物から慎重に取り除かれ、そしてデカントされる。洗浄が、さらに２回繰り返される。 Once all the deionized H 2 O has been removed, 1 mL of MeCl 2 /5% acetone is added to the dry sample in each Eppendorf tube. Mixing proceeds and centrifugation is performed at 6000 RPM to 8000 RPM for 3 minutes. The supernatant is carefully removed from the centrifugate and decanted. The washing is repeated two more times.

最後の洗浄が完了された後、この上清はデカントされ、そしてさらなる溶媒は、粉末の懸濁物を回避するために、低濃度の、非常に穏やかなＮ２の流れを使用することによって除去される。この乾燥チューブは、凍結乾燥器中におかれて、残りの溶媒が除去され、そして抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアが、回収される。 After the last wash is completed, the supernatant is decanted and additional solvent is removed by using a low concentration, very gentle N 2 stream to avoid powder suspension. Is done. The drying tube is placed in a lyophilizer to remove the remaining solvent and the anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres are collected.

（実施例２）
この実施例は、エッペンドルフチューブにおける抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの５００μｌバッチの調製のために基本的な手順を提供する。 (Example 2)
This example provides a basic procedure for the preparation of a 500 μl batch of anti-CD34 monoclonal antibody microspheres in an Eppendorf tube.

４０ｍＭ酢酸アンモニウム（ＡＡ）緩衝液（ｐＨ＝６．０）の調製。４０ｍＭのＡＡ緩衝液は、１リットルの脱イオンＨ２Ｏに３．０８グラムのＡＡ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を溶解することによって調製される。このＡＡは、容易に溶解し、そして約６．４のｐＨを有する緩衝溶液を形成する。このｐＨを希酢酸によってｐＨ＝６．０に調整する。 Preparation of 40 mM ammonium acetate (AA) buffer (pH = 6.0). 40 mM AA buffer is prepared by dissolving 3.08 grams of AA (Spectrum) in 1 liter of deionized H 2 O. This AA dissolves easily and forms a buffer solution having a pH of about 6.4. The pH is adjusted to pH = 6.0 with dilute acetic acid.

５００ｍＬの４０ｍＭ ＡＡ緩衝溶液中の１５％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８の調製。７５グラムのＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（ＢＡＳＦ）は、５００ｍＬの４０ｍＭ ＡＡ緩衝液（工程１に記載されるような）に溶解される（ただし、ｐＨ調整は、この時点で必要ではない）。この量のＰｏｌｏｘａｍｅｒの溶解は、数回の添加によって行われ得る。最終ｐＨは、ｐＨ約６．４付近である。この溶液は、０．２２フィルターを用いて濾過され、そして冷蔵で保持される。   Preparation of 15% Poloxamer 188 in 500 mL of 40 mM AA buffer solution. 75 grams of Poloxamer 188 (BASF) is dissolved in 500 mL of 40 mM AA buffer (as described in Step 1) (although pH adjustment is not necessary at this point). This amount of Poloxamer can be dissolved by several additions. The final pH is around pH 6.4. This solution is filtered using a 0.22 filter and kept refrigerated.

緩衝液の交換。２ ＰＤ１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、５ｍＬのタンパク質に対して使用される。カラムの総容量は、３．５ｍＬである。各カラムは、２５ｍＬ未満の４０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液によってリンスされて、この緩衝液によってカラムが飽和される。その後、２．５ｍＬのリン酸緩衝液中の抗ＣＤ３４が、このカラム中に挿入される。次いでさらに１ｍＬのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液が、挿入されて、このカラムを満たす。このタンパク質は、さらに２．５ｍＬの４０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液を注射することによって収集される。３〜１２ｍＬの総容量および１０，０００ＭＷのＭＷカットオフを有する１ Ｐｉｅｒｃｅ透析カセットが使用されて、５ｍＬのこのタンパク質に対して緩衝液を置換する。このサンプルが、注射される。フロートがこのカセット上に添加され、そしてこのカセットは、低速で回転するために使用される。 Change buffer. 2 PD10 desalting column (Amersham Biosciences) is used for 5 mL of protein. The total volume of the column is 3.5 mL. Each column is rinsed with less than 25 mL of 40 mM NH 4 OAc buffer, which saturates the column. Thereafter, anti-CD34 in 2.5 mL phosphate buffer is inserted into the column. A further 1 mL of NH 4 OAc buffer is then inserted to fill the column. This protein is collected by injecting an additional 2.5 mL of 40 mM NH 4 OAc buffer. A 1 Pierce dialysis cassette with a total volume of 3-12 mL and a MW cutoff of 10,000 MW is used to replace the buffer for 5 mL of this protein. This sample is injected. A float is added over the cassette and the cassette is used to rotate at low speed.

タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定すること、および検量線によって決定される。必要に応じて、このタンパク質は、所望の作業濃度に従い緩衝液によって希釈される。この手順のための作業濃度は、１．８ｍｇ／ｍｌと決定される（最終濃度は、０．９ｍｇ／ｍｌ）。   Protein concentration is determined by measuring absorbance at 280 nm and a calibration curve. If necessary, the protein is diluted with buffer according to the desired working concentration. The working concentration for this procedure is determined to be 1.8 mg / ml (final concentration is 0.9 mg / ml).

１５％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ溶液のｐＨは、酢酸によってｐＨ＝５．８およびｐＨ＝５．９に調整される。５ｍＬのこのタンパク質は、５００μｌの１０個のバッチに分割される。５００μＬの４０ｍＭ ＡＡ中の１５％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（ｐＨ＝５．８）が、５個のエッペンドルフチューブに添加され、そして５００μＬの４０ｍＭ ＡＡ中の１５％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（ｐＨ＝５．９）が、他の５個のエッペンドルフチューブに添加される。   The pH of the 15% Poloxamer solution is adjusted with acetic acid to pH = 5.8 and pH = 5.9. 5 mL of this protein is divided into 10 batches of 500 μl. 15% Poloxamer 188 (pH = 5.8) in 500 μL 40 mM AA was added to 5 Eppendorf tubes and 15% Poloxamer 188 (pH = 5.9) in 500 μL 40 mM AA was added to the other Add to 5 Eppendorf tubes.

これらの溶液は、穏やかなボルテックスおよび手動での混合によって、十分に混合され、これらの溶液は、透明な状態〜わずかに濁った状態を呈する。これらのサンプルは、１時間〜２時間（約４℃）、ボール中でインキュベートされ、ゆっくりとした冷却が行われる。   These solutions are thoroughly mixed by gentle vortexing and manual mixing, and these solutions exhibit a clear to slightly turbid state. These samples are incubated in a bowl for 1 to 2 hours (about 4 ° C.) and slowly cooled.

これらのサンプルは、全ての脱イオンＨ２Ｏを除去するためにドライアイス／エタノール混合物によって急速に冷却され、そして一晩、凍結乾燥されるか、またはこれらのサンプルは、−８０℃の冷蔵庫中におかれる。一旦全ての脱イオンＨ２Ｏが除去されると、１ｍＬのＭｅＣｌ２／５％アセトンが、各エッペンドルフチューブに添加され、次いで十分に混合され、そして６０００ＲＰＭ〜８０００ＲＰＭで３分間遠心分離される。この上清は、デカントされ、この洗浄が、さらに２回繰り返される。 These samples are rapidly cooled with a dry ice / ethanol mixture to remove all deionized H 2 O and lyophilized overnight, or these samples are placed in a −80 ° C. refrigerator. Smelled. Once all the deionized H 2 O has been removed, 1 mL of MeCl 2 /5% acetone is added to each Eppendorf tube, then thoroughly mixed and centrifuged at 6000 RPM to 8000 RPM for 3 minutes. The supernatant is decanted and this wash is repeated two more times.

最後の洗浄が完了された後、この上清はデカントされ、そしてさらなる溶媒は、低濃度の、非常に穏やかなＮ２の流れを使用して除去される。このほぼ乾燥したチューブは、凍結乾燥器中におかれて残りの溶媒が除去され、そして抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアが、回収される。 After the last wash is complete, the supernatant is decanted and additional solvent is removed using a low concentration, very gentle N 2 stream. The nearly dried tube is placed in a lyophilizer to remove the remaining solvent and the anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres are collected.

（実施例３）
この実施例は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒを溶媒として用い、冷却下でのミクロスフェア形成を伴う抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアの調製を記載する。４０ｍＭリン酸緩衝液中の抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体（ｐＨ＝７．０、５．３〜５．５の濃度）（塩化ナトリウムを含まず）は、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって提供された。抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体は、約１５０ｋＤの分子量を有するマウスモノクローナル抗体であり、そして精製目的で使用される。５ｍＬのこのモノクローナル抗体（５．３ｍｇ／ｍＬの濃度）を、０．２２を通して濾過し、そして透析カセットを使用して４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝６．５）に対して透析した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍの光学密度における吸光度を測定することによって決定した。１０％溶液のＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ＮＦ（Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）から入手可能）を、ｐＨ＝６．０で調製し、そして０．２２ミクロンのフィルターによって濾過した。酢酸アンモニウムは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）によって提供された。透析カセット「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ」（１０，０００の分子量カットオフおよび３〜１２ｍＬのサンプル容量）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって提供された。このモノクローナル抗体溶液の０．５ｍＬのアリコートを、２０個の１ｍＬのミクロチューブに挿入した。１ｍＬの１０％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ溶液を、０．５ｍＬの抗第ＶＩＩＩ因子（５．３ｍｇ／ｍＬ）を含む各チューブに添加し、そしてこの溶液を、室温で穏やかに混合し、そして２９℃で３０分間インキュベートした。 (Example 3)
This example describes the preparation of anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres using Poloxamer as a solvent and microsphere formation under cooling. Anti-Factor VIII monoclonal antibody (concentration of pH = 7.0, 5.3-5.5) in 40 mM phosphate buffer (without sodium chloride) was obtained from Baxter Healthcare Corporation (Bioscience Division, Hayward, Calif.). Provided by. Anti-factor VIII monoclonal antibody is a mouse monoclonal antibody having a molecular weight of about 150 kD and is used for purification purposes. 5 mL of this monoclonal antibody (5.3 mg / mL concentration) was filtered through 0.22 and dialyzed against 40 mM ammonium acetate buffer (pH = 6.5) using a dialysis cassette. Protein concentration was determined by measuring absorbance at an optical density of 280 nm. A 10% solution of Poloxamer 188 NF (Ltrol F68) (available from BASF Corporation (Florham Park, NJ)) was prepared at pH = 6.0 and filtered through a 0.22 micron filter. Ammonium acetate was provided by Spectrum Chemicals (Gardena, CA). The dialysis cassette “Slide-A-Lyzer” (10,000 molecular weight cutoff and 3-12 mL sample volume) was provided by Pierce (Rockford, IL). A 0.5 mL aliquot of this monoclonal antibody solution was inserted into 20 1 mL microtubes. 1 mL of 10% Poloxamer solution is added to each tube containing 0.5 mL of anti-factor VIII (5.3 mg / mL) and the solution is gently mixed at room temperature and incubated at 29 ° C. for 30 minutes did.

その後、これらの溶液を、４℃で１時間インキュベートした。冷却の間に、この透明な溶液は、モノクローナル抗体から構成されるミクロスフェアを形成して濁った。その後、ミクロスフェア中へのタンパク質の取り込み量を、以下の方法で決定した：このミクロスフェア懸濁物のアリコートを除去し、このミクロスフェアを、遠心分離によってこの溶液から分離し、そして上清中のタンパク質濃度を、２８０ｎｍの光学密度における吸光度を測定することによって決定した。インキュベーション後、これらのチューブを、急速冷凍し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥後、これらの乾燥粉末は、抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアおよびポロキサマーを含んだ。   These solutions were then incubated for 1 hour at 4 ° C. During cooling, the clear solution became cloudy forming microspheres composed of monoclonal antibodies. The amount of protein uptake into the microspheres was then determined by the following method: An aliquot of the microsphere suspension was removed, the microspheres were separated from the solution by centrifugation, and in the supernatant. The protein concentration of was determined by measuring the absorbance at an optical density of 280 nm. After incubation, these tubes were snap frozen and lyophilized. After lyophilization, these dry powders contained anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres and poloxamers.

このポロキサマーを、９５％塩化メチレンおよび５％アセトンの１ｍＬの溶液を各チューブに添加し、遠心分離し、そしてその上清を除去することによって除去した。この洗浄手順を、３回繰り返した。この湿ったペレットを、窒素ガスを使用して乾燥し、そして残りの溶媒を、減圧を使用して除去した。これらの乾燥粉末を、光学顕微鏡下で観察した。光学顕微鏡画像（図１）および偏光顕微鏡画像（図２）は、０．５〜５ミクロンのサイズ範囲の球状粒子を示す。これらのサンプルを、ＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ４８００，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）に送った。   The poloxamer was removed by adding a 1 mL solution of 95% methylene chloride and 5% acetone to each tube, centrifuging, and removing the supernatant. This washing procedure was repeated three times. The wet pellet was dried using nitrogen gas and the remaining solvent was removed using vacuum. These dry powders were observed under an optical microscope. The light microscope image (FIG. 1) and the polarization microscope image (FIG. 2) show spherical particles in the size range of 0.5-5 microns. These samples were sent to SEM (Hitachi S4800, Electron Microscopy Center, Northeastern University, Boston MA).

抗第ＶＩＩＩ因子抗体のミクロスフェアのサンプルを、ＳＥＭ試料取り付け具に、両側が伝導性の炭素付着性タブ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｉｄｅｄ ｃａｒｂｏｎ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｔａｂ）を使用して取り付けた。白金／パラジウム ８０：２０の薄い（１０〜１５ｎｍ）伝導層を、Ｄｅｎｔｏｎ ＤＶ−５０２真空エバポレーターを使用するエバポレーションを介してサンプルに適用した。その後これらのサンプルは、画像化され、そして２〜３ｋＶの加速電圧を使用してＨｉｔａｃｈｉ Ｓ−４８００ Ｆｉｅｌｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ＳＥＭ上にデジタル記録された。走査電子顕微鏡写真（図３）は、０．５〜６ミクロンのサイズ範囲の球状粒子を示す。   Samples of anti-factor VIII antibody microspheres were attached to the SEM specimen fixture using a double-sided carbon adhesive tab. A thin (10-15 nm) conductive layer of platinum / palladium 80:20 was applied to the sample via evaporation using a Denton DV-502 vacuum evaporator. These samples were then imaged and digitally recorded on a Hitachi S-4800 Field Emission SEM using an acceleration voltage of 2-3 kV. The scanning electron micrograph (FIG. 3) shows spherical particles in the size range of 0.5-6 microns.

偏光が等方性のサンプルを通過する場合、これらのサンプルは、全ての結晶軸が完全に等価であるので、サンプルがどのような方向を向いているのかにかかわらず、この偏光に対する効果を有さない。この効果は、完全消光または等方性消光（ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）として公知であり、そしてこれは、高度な対称性を有する結晶（例えば、立方晶系）に対して起こる。非結晶質の、非晶質サンプルは、同じ挙動を与える。この偏光顕微鏡画像は、明るい円光に囲まれた暗い円としてミクロスフェアを示す。これらの画像は、サンプルの方向性に依存せず、そして球状の形および非晶質の構造を示す。   When polarized light passes through an isotropic sample, these samples have an effect on this polarization, regardless of what direction the sample is oriented, because all crystal axes are completely equivalent. No. This effect is known as complete quenching or isotropic extinction, and this occurs for crystals with a high degree of symmetry (eg, cubic systems). Amorphous, amorphous samples give the same behavior. This polarization microscope image shows the microsphere as a dark circle surrounded by bright circular light. These images are independent of the sample orientation and show a spherical shape and an amorphous structure.

（実施例４）
この実施例は、実施例３に従って調製された抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアのゲル電気泳動を示す。Ｔｒｉｓ−酢酸ゲル（３−８％、１．５ｍｍ×１０ウェル）、Ｔｒｉｓ−酢酸ＳＤＳ泳動緩衝液、ＮｕＰａｇｅ ＬＤＳサンプル緩衝液、１２個の分子量の標準のマーカー、および「ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ」乾燥溶液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって提供された。ゲル電気泳動は、タンパク質およびペプチドの分離および特徴付け、ならびにタンパク質の分子量の推定のために、広範に使用される分析技術である。 Example 4
This example shows gel electrophoresis of microspheres of anti-factor VIII monoclonal antibody prepared according to Example 3. Tris-acetate gel (3-8%, 1.5 mm × 10 wells), Tris-acetate SDS running buffer, NuPage LDS sample buffer, 12 molecular weight standard markers, and “SimpleBlue SafeStain” dry solution, Provided by Invitrogen (Carlsbad, CA). Gel electrophoresis is a widely used analytical technique for the separation and characterization of proteins and peptides, and the estimation of protein molecular weight.

抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアを、実施例３に従って調製し、そして３７℃にてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．４）に溶解した。４０μｌの３つの異なるバッチを、並行して泳動した。４０μｌのネイティブな抗第ＶＩＩＩ因子溶液を、コントロールとして、並行して泳動した。泳動時間は、１時間であり、そして電圧は、１５０ｍＶであった。   Anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres were prepared according to Example 3 and dissolved in phosphate buffered saline (pH = 7.4) at 37 ° C. Three different batches of 40 μl were run in parallel. 40 μl of native anti-factor VIII solution was run in parallel as a control. The run time was 1 hour and the voltage was 150 mV.

図４は、２つのゲルの画像を示し、これらの画像は、この溶解したモノクローナル抗体（ミクロスフェアから放出された）が、ネイティブなモノクローナル抗体と比較した場合に、ゲル中で同様に移動したことを示す。全てのサンプルは、１５０ｋＤの分子量マーカーまで移動し、このことは、タンパク質サイズが、処方の結果として変化しなかったことを示す。染色強度もまた同様であり、そしてゲルのウェル中の染色物は、存在せず、このことは、分子の凝集が最小限であることを示す。   FIG. 4 shows images of the two gels, which show that this lysed monoclonal antibody (released from the microspheres) migrated similarly in the gel when compared to the native monoclonal antibody. Indicates. All samples migrated to a 150 kD molecular weight marker, indicating that the protein size did not change as a result of the formulation. The staining intensity is similar, and there is no staining in the wells of the gel, indicating minimal aggregation of molecules.

（実施例５）
この実施例は、ＰＥＧ／ＰＶＰを溶媒として用い、加熱下でのミクロスフェア形成を伴う抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアの調製を記載する。Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）の４０ｍＭリン酸緩衝液（塩化ナトリウムを含まない）中の抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体を、ミクロスフェア形態中においた。１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％ ＰＥＧ／ＰＶＰ（ｗ／ｖ）溶液（ｐＨ＝５．６）を、３３５０ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、４０，０００ダルトンのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および酢酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）から入手可能）を使用して調製した。 (Example 5)
This example describes the preparation of anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres using PEG / PVP as a solvent and microsphere formation under heating. Anti-factor VIII monoclonal antibody in 40 mM phosphate buffer (without sodium chloride) from Baxter Healthcare Corporation (Bioscience Division, Hayward, Calif.) Was placed in microsphere form. A 25% PEG / PVP (w / v) solution (pH = 5.6) in 100 mM sodium acetate buffer was added to 3350 Dalton polyethylene glycol (PEG), 40,000 Dalton polyvinylpyrrolidone (PVP) and sodium acetate ( (Available from Spectrum Chemicals (Gardena, Calif.)).

４００μｌの２５％ ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液を、８００μｌの抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体溶液（５．３ｍｇ／ｍＬの濃度）に室温で添加した。これらの溶液を、混合し、そして６５℃で３０分間インキュベートした。６５℃でのインキュベート後、これらの溶液を、冷水中でのインキュベーションによって、約２０℃まで急速に冷却（クエンチ）した。冷却の際、この透明な溶液は、モノクローナル抗体から構成されるミクロスフェアを形成して混濁した。この懸濁物を遠心分離し、そしてその上清を除去した。過剰なＰＥＧ／ＰＶＰを、脱イオン水で洗浄することによって除去した。   400 μl of 25% PEG / PVP solution was added to 800 μl of anti-factor VIII monoclonal antibody solution (5.3 mg / mL concentration) at room temperature. These solutions were mixed and incubated at 65 ° C. for 30 minutes. After incubation at 65 ° C., these solutions were rapidly cooled (quenched) to about 20 ° C. by incubation in cold water. Upon cooling, the clear solution became turbid, forming microspheres composed of monoclonal antibodies. The suspension was centrifuged and the supernatant was removed. Excess PEG / PVP was removed by washing with deionized water.

図５は、この実施例の手順に従って調製されたミクロスフェアの走査電子顕微鏡画像を示す。このミクロスフェアのサンプルを調製し、そしてＡＭＲＡＹ ＡＭＲ−１０００走査電子顕微鏡（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって分析した。このサンプルを、炭素ベースの付着を使用する炭素タブ上に貼り付け、そしてＳＥＭ試料位置に取り付けた。このサンプルを、白金／パラジウム ８０：２０の薄い被膜によって減圧下でコーティングした。図９に示した走査電子顕微鏡写真は、１〜３μｍのサイズ範囲の球状粒子を示す。   FIG. 5 shows a scanning electron microscope image of microspheres prepared according to the procedure of this example. Samples of the microspheres were prepared and analyzed by AMRAY AMR-1000 scanning electron microscope (Electron Microscopy Center, Northeastern University, Boston, Mass.). This sample was affixed onto a carbon tab using carbon-based deposition and attached to the SEM sample location. The sample was coated under reduced pressure with a thin film of platinum / palladium 80:20. The scanning electron micrograph shown in FIG. 9 shows spherical particles in the size range of 1 to 3 μm.

レーザー光散乱による粒子サイズ分布（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ ２３０、Ｍｉａｍｉ ＦＬ）を、この実施例に従って調製したミクロスフェアの水性懸濁物に対して行った。この粒子サイズの分布は狭く、９０％を超える粒子が、２μｍより小さかった。さらに、数、表面積、および体積による粒子サイズ分布を重ね合わせ、これは、全ての粒子が、明らかな凝集物を有さずに、ほぼ同じサイズであること示す。図６を参照のこと。   Particle size distribution by laser light scattering (Beckman Coulter LS 230, Miami FL) was performed on an aqueous suspension of microspheres prepared according to this example. The particle size distribution was narrow, with more than 90% of the particles being smaller than 2 μm. In addition, the particle size distribution by number, surface area, and volume is superimposed, indicating that all particles are approximately the same size with no apparent aggregates. See FIG.

（実施例６）
この実施例において、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアを、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ溶媒を用いて調製し、そして冷却を、ミクロスフェア 形成において使用した。抗ＣＤ３４モノクローナル抗体は、約１４６ｋＤの分子量を有するマウスＩｇＧ１λモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体は、Ｉｓｏｌｅｘ（登録商標）３００ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍおよびＩｓｏｌｅｘ（登録商標）３００ｉ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と組み合わせて、細胞外の治療（例えば、幹細胞の選択）に使用される。幹細胞選択システムおよび幹細胞処理は、ＣＤ３４ネガティブな腫瘍を有する患者における骨髄機能廃絶療法後の造血再構築が意図される、ＣＤ３４＋細胞が豊富な集団を得るために、自己の末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）産物を加工するのに適用される。 (Example 6)
In this example, anti-CD34 monoclonal antibody microspheres were prepared using Poloxamer solvent, and cooling was used in microsphere formation. The anti-CD34 monoclonal antibody is a mouse IgG1λ monoclonal antibody having a molecular weight of about 146 kD. This monoclonal antibody is combined with the Isolex® 300 Magnetic Cell Selection System and the Isolex® 300i Magnetic Cell Selection System (Baxter Healthcare Corporation) for the selection of extracellular therapy (eg, for stem cell use). . The stem cell selection system and stem cell processing is used to obtain autologous peripheral blood progenitor cells (PBPC) to obtain a population enriched in CD34 + cells intended for hematopoietic reconstitution after bone marrow abolition therapy in patients with CD34 negative tumors. ) Applied to process products.

０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００１％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ｐＨ＝５．５および２．３〜２．５ｍｇ／ｍＬの濃度）は、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって提供された。５ｍＬのこのモノクローナル抗体（２．２ｍｇ／ｍＬの濃度）を、０．２２μｍを通して濾過し、そして４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝６．０）に対して透析した。Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ＮＦ（Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）から入手可能）の１５％溶液（この溶液は、ｐＨ＝６．０である）を調製し、そして０．２２μｍのフィルターによって濾過した。酢酸アンモニウムは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）によって提供された。透析カセット「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ」（１０，０００の分子量カットオフおよび３〜１２ｍＬのサンプル容量）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって提供された。このモノクローナル抗体溶液の０．５ｍＬのアリコートを、２０個の１ｍＬのミクロチューブに挿入した。０．５ｍＬの１５％ Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ溶液を、０．５ｍＬの抗ＣＤ３４（２．０ｍｇ／ｍＬ）を含む各チューブに添加し、そしてこの溶液を、室温で穏やかに混合し、そして２９℃で３０分間インキュベートした。   Anti-CD34 monoclonal antibody (pH = 5.5 and 2.3-2.5 mg / mL concentration) in 0.02M sodium phosphate buffer containing 0.15M sodium chloride and 0.001% Tween 80 Provided by Healthcare Corporation (Bioscience Division, Hayward, CA). 5 mL of this monoclonal antibody (2.2 mg / mL concentration) was filtered through 0.22 μm and dialyzed against 40 mM ammonium acetate buffer (pH = 6.0). A 15% solution of Poloxamer 188 NF (Ltrol F68) (available from BASF Corporation (Florham Park, NJ)) (this solution has a pH = 6.0) was prepared and filtered through a 0.22 μm filter. . Ammonium acetate was provided by Spectrum Chemicals (Gardena, CA). The dialysis cassette “Slide-A-Lyzer” (10,000 molecular weight cutoff and 3-12 mL sample volume) was provided by Pierce (Rockford, IL). A 0.5 mL aliquot of this monoclonal antibody solution was inserted into 20 1 mL microtubes. Add 0.5 mL of 15% Poloxamer solution to each tube containing 0.5 mL of anti-CD34 (2.0 mg / mL) and mix the solution gently at room temperature and incubate at 29 ° C. for 30 minutes did.

その後、これらの溶液を、４℃で１時間インキュベートした。冷却の間に、この透明な溶液は、モノクローナル抗体から構成されるミクロスフェアを形成して濁った。その後、ミクロスフェア中へのタンパク質の取り込み量を、以下の方法で決定した：このミクロスフェア懸濁物のアリコートを除去し、このミクロスフェアを、遠心分離によってこの溶液から分離し、そして上清中のタンパク質濃度を、２８０ｎｍの光学密度における吸光度を測定することによって決定した。インキュベーション後、これらのチューブを、急速冷凍し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥後、これらの乾燥粉末は、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアおよびポロキサマーを含んだ。   These solutions were then incubated for 1 hour at 4 ° C. During cooling, the clear solution became cloudy forming microspheres composed of monoclonal antibodies. The amount of protein uptake into the microspheres was then determined by the following method: An aliquot of the microsphere suspension was removed, the microspheres were separated from the solution by centrifugation, and in the supernatant. The protein concentration of was determined by measuring the absorbance at an optical density of 280 nm. After incubation, these tubes were snap frozen and lyophilized. After lyophilization, these dry powders contained anti-CD34 monoclonal antibody microspheres and poloxamers.

このポロキサマーを、９５％塩化メチレンおよび５％アセトンの１ｍＬの溶液を各チューブに添加し、次いで遠心分離し、そしてその上清を除去することによって除去した。この洗浄手順を、３回繰り返した。これらの湿ったペレットを、窒素ガスを使用して乾燥し、そして残りの溶媒を、減圧を使用して除去した。これらの乾燥粉末を、光学顕微鏡下で観察し、そしてサンプルを、ＳＥＭに送った。光学顕微鏡画像（図７）は、０．５〜５ミクロンのサイズ範囲の球状粒子を示す。抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの走査電子顕微鏡写真を、上記の実施例４に記載されるように観察した（図９）。   The poloxamer was removed by adding a 1 mL solution of 95% methylene chloride and 5% acetone to each tube, then centrifuging and removing the supernatant. This washing procedure was repeated three times. These wet pellets were dried using nitrogen gas and the remaining solvent was removed using vacuum. These dry powders were observed under an optical microscope and samples were sent to SEM. The light microscope image (FIG. 7) shows spherical particles in the size range of 0.5-5 microns. Scanning electron micrographs of anti-CD34 monoclonal antibody microspheres were observed as described in Example 4 above (FIG. 9).

空力学的な飛行時間測定（ＴＳＩ Ａｅｒｏｓｉｚｅｒ）によって粒子サイズ分布を、この実施例に従って調製した抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの５ｍｇの乾燥粉末に対して行った。数によるこの粒子サイズの分布は狭く、１．３μｍの空気動力学的直径の平均サイズを伴い、９５％の粒子が、３．６μｍより小さかった（図１０）。   Particle size distribution by aerodynamic time-of-flight measurement (TSI Aerosizer) was performed on 5 mg dry powder of anti-CD34 monoclonal antibody microspheres prepared according to this example. This particle size distribution by number was narrow, with an average size of aerodynamic diameter of 1.3 μm, with 95% of the particles being smaller than 3.6 μm (FIG. 10).

（実施例７）
実施例６の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの立体配座安定性もまた、モニタリングした。実施例６に記載されるような条件において、４０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液中の１．５ｍＬの抗ＣＤ３４（ｐＨ＝６．０および１．６ｍｇ／ｍＬの濃度）を、４０ｍＭ酢酸アンモニウム（２５℃でｐＨ＝６．０）中の１．５ｍＬの１５％ポロキサマーと混合した。３μＬの蛍光色素８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸（ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＡＮＳ）の１０ｍＭ溶液を添加した。この溶液を穏やかに混合して、蛍光測定用セルに移した。 (Example 7)
The conformational stability of the microspheres of the anti-CD34 monoclonal antibody of Example 6 was also monitored. Under conditions as described in Example 6, 1.5 mL of anti-CD34 (pH = 6.0 and 1.6 mg / mL concentration) in 40 mM ammonium acetate buffer was added to 40 mM ammonium acetate (at 25 ° C.). mixed with 1.5 mL of 15% poloxamer (pH = 6.0). 3 μL of the fluorescent dye 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid (ANS) 10 mM solution was added. This solution was gently mixed and transferred to a fluorescence measuring cell.

抗ＣＤ３４抗体の立体配座安定性を、タンパク質のトリプトファン残基およびチロシン残基の内因性の蛍光ならびにＡＮＳ色素の外因性の蛍光を使用することによってモニタリングした。蛍光測定用セル中の粒子の形成後に、２５０ｎｍにおける光励起の弾性散乱の５００ｎｍにおける第２のオーバートーン（ｏｖｅｒｔｏｎｅ）の検出を使用した。この実施例を、Ｐｅｌｔｉｅｒ−耐熱性マルチセルホルダーアクセサリーを備えたＣａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｂｉｏｍｅｌｔ蛍光分光光度計を使用して行った。このサンプルを、２５℃で１分間インキュベートし、１分間あたり０．０６℃の割合で３１℃まで加熱し、１分間あたり５℃の割合で２℃まで冷却し、そしてこの温度で１時間インキュベートした。コントロールサンプルは、４０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ＝６．０）中の１０μＭ ＡＮＳ、７．５％ポロキサマー（ｐＨ＝６．０）、および４０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ＝６．０）中の１０μＭ ＡＮＳを含む０．８ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を含んだ。   The conformational stability of the anti-CD34 antibody was monitored by using the intrinsic fluorescence of the tryptophan and tyrosine residues of the protein and the extrinsic fluorescence of the ANS dye. After formation of the particles in the fluorescence measurement cell, detection of a second overtone at 500 nm of photon-excited elastic scattering at 250 nm was used. This example was performed using a Cary Eclipse Biomelt fluorescence spectrophotometer equipped with a Peltier-heat resistant multicell holder accessory. The sample was incubated at 25 ° C. for 1 minute, heated to 31 ° C. at a rate of 0.06 ° C. per minute, cooled to 2 ° C. at a rate of 5 ° C. per minute, and incubated at this temperature for 1 hour . The control sample contains 10 μM ANS in 40 mM ammonium acetate (pH = 6.0), 7.5% poloxamer (pH = 6.0), and 10 μM ANS in 40 mM ammonium acetate (pH = 6.0). Included 8 mg / mL anti-CD34 monoclonal antibody.

図１２は、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体の立体配置の安定性の蛍光モニタリング結果を示す。蛍光のデータは、このタンパク質の立体配座が、ミクロスフェア形成の間にインタクトなままであったことを支持する。   FIG. 12 shows the fluorescence monitoring results of the stability of the configuration of the anti-CD34 monoclonal antibody. Fluorescence data support that this protein conformation remained intact during microsphere formation.

（実施例８）
この実施例に従って、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアを、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ溶媒またはＰＥＧ／ＰＶＰ溶媒によって調製し、そしてこの調製に加熱を組み込んだ。０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００１％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ｐＨ＝５．５および２．３〜２．５ｍｇ／ｍＬの濃度）は、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって提供された。２．５ｍＬのサンプル容量の脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手可能）を使用して、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝６．３）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）に対して５ｍＬの抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を透析した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍの光学密度における吸光度を測定することによって決定した。このモノクローナル抗体溶液の０．５ｍＬのアリコートを、１０個の１ｍＬミクロチューブ中に挿入し、そして１５％Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ＮＦ（Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）の０．３ｍＬアリコートを、０．５ｍＬの抗ＣＤ３４（２．１ｍｇ／ｍＬ）を含むチューブに添加した。この溶液を、室温で穏やかに混合し、そして７０℃で３０分間インキュベートした。 (Example 8)
According to this example, anti-CD34 monoclonal antibody microspheres were prepared with Poloxamer solvent or PEG / PVP solvent, and heating was incorporated into this preparation. Anti-CD34 monoclonal antibody (pH = 5.5 and 2.3-2.5 mg / mL concentration) in 0.02M sodium phosphate buffer containing 0.15M sodium chloride and 0.001% Tween 80 Provided by Healthcare Corporation (Bioscience Division, Hayward, CA). Using a 2.5 mL sample volume desalting column (available from Amersham Bioscience (Piscataway, NJ)) against 40 mM ammonium acetate buffer (pH = 6.3) (Spectrum Chemicals, Gardena, Calif.) 5 mL of anti-CD34 monoclonal antibody was dialyzed. Protein concentration was determined by measuring absorbance at an optical density of 280 nm. A 0.5 mL aliquot of this monoclonal antibody solution was inserted into 10 1 mL microtubes and a 0.3 mL aliquot of 15% Poloxamer 188 NF (Lutrol F68, BASF Corporation, Florida Park, NJ) Added to a tube containing 5 mL of anti-CD34 (2.1 mg / mL). This solution was mixed gently at room temperature and incubated at 70 ° C. for 30 minutes.

７０℃でのインキュベーション後、この溶液を、冷水中でのインキュベーションによって２３℃まで急速に冷却（クエンチ）した。冷却の際、この透明な溶液は、モノクローナル抗体から構成されるミクロスフェアを形成して混濁した。この懸濁物を遠心分離し、そしてその上清を除去した。過剰なポロキサマーを、脱イオン水で洗浄することによって除去した。光学顕微鏡画像（図８）は、０．５〜５μｍのサイズ範囲の球状粒子を示す。   After incubation at 70 ° C., the solution was rapidly cooled (quenched) to 23 ° C. by incubation in cold water. Upon cooling, the clear solution became turbid, forming microspheres composed of monoclonal antibodies. The suspension was centrifuged and the supernatant was removed. Excess poloxamer was removed by washing with deionized water. The optical microscope image (FIG. 8) shows spherical particles in the size range of 0.5-5 μm.

（実施例９）
この実施例において、溶媒としてＰＥＧ／ＰＶＰを用い、そして冷却下でのミクロスフェア形成を伴う抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの調製が、記載される。０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００１％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ｐＨ＝５．５および２．３〜２．５ｍｇ／ｍＬの濃度）は、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって提供された。３３５０Ｄａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、４０，０００Ｄａのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および酢酸ナトリウムは、全てＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）によって提供された。 Example 9
In this example, the preparation of anti-CD34 monoclonal antibody microspheres using PEG / PVP as a solvent and with microsphere formation under cooling is described. Anti-CD34 monoclonal antibody (pH = 5.5 and 2.3-2.5 mg / mL concentration) in 0.02M sodium phosphate buffer containing 0.15M sodium chloride and 0.001% Tween 80 Provided by Healthcare Corporation (Bioscience Division, Hayward, CA). 3350 Da of polyethylene glycol (PEG), 40,000 Da of polyvinyl pyrrolidone (PVP) and sodium acetate were all provided by Spectrum Chemicals (Gardena, CA).

ｌ００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％ ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液（ｐＨ＝５．６）を、調製し、そして０．２２μｍのフィルターによって濾過した。５ｍＬのこのモノクローナル抗体（２．２ｍｇ／ｍＬの濃度）を、０．２２μｍのフィルターによって濾過し、そしてＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって提供された透析カセット「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ」（１０，０００の分子量カットオフおよび３〜１２ｍＬのサンプル容量）を使用して透析した。このモノクローナル抗体を、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝６．０）に対して透析した。その後、２００μｌの２５％ ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液（ｗ／ｖ）を、５００μｌの抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（２．０ｍｇ／ｍＬの濃度）に添加し、そしてこの溶液を、室温で穏やかに混合し、そして２９℃で３０分間インキュベートした。このプロセスは、実施例６に記載されるように継続するが、この工程は、９５％塩化メチレン／５％アセトン溶液を用いた洗浄によって、ポロキサマーとは反対にＰＥＧ／ＰＶＰを除去するためであった。   A 25% PEG / PVP solution (pH = 5.6) in 100 mM sodium acetate buffer was prepared and filtered through a 0.22 μm filter. 5 mL of this monoclonal antibody (concentration of 2.2 mg / mL) was filtered through a 0.22 μm filter and the dialysis cassette “Slide-A-Lyzer” (10,000) provided by Pierce (Rockford, IL). Dialyzed using a molecular weight cut-off and 3-12 mL sample volume). This monoclonal antibody was dialyzed against 40 mM ammonium acetate buffer (pH = 6.0). 200 μl of 25% PEG / PVP solution (w / v) was then added to 500 μl of anti-CD34 monoclonal antibody (concentration of 2.0 mg / mL) and the solution was gently mixed at room temperature and 29 Incubated for 30 minutes at ° C. The process continues as described in Example 6, but this step was to remove PEG / PVP as opposed to poloxamer by washing with 95% methylene chloride / 5% acetone solution. It was.

（実施例１０）
この実施例は、実施例６に従って調製されたモノクローナル抗体のミクロスフェアの粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）を示す。高解像度粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）分析を、Ｃｕ Ｋα放射線（ｒａｄｉｔｉｏｎ）（ＳＳＣＩ、Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を使用した長い高精度焦点のＸ線管を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ ＸＲＤ−６０００ Ｘ線粉末回折計を用いて得た。 (Example 10)
This example shows powder X-ray diffraction (XRPD) of a monoclonal antibody microsphere prepared according to Example 6. High resolution powder X-ray diffraction (XRPD) analysis was performed using a Shimadzu XRD-6000 X-ray powder diffractometer with a long, high-focus X-ray tube using Cu Ka radiation (SSCI, West Lafayette, IN). I got it.

この管の電圧、およびアンペア数を、それぞれ、４０ｋＶおよび４０ｍＡに設定した。発散スリットおよび散乱スリットを、１°に設定し、そして受光スリットを、０．１５ｍｍに設定した。あるいは、発散スリットおよび散乱スリットを、０．５°に設定し、そして受光スリットを、０．１５ｍｍに設定した。回折される放射線を、ＮａＩシンチレーション検出器によって検出した。１〜２０° ２θの、１分間あたり０．５°でのθ〜２θの連続的スキャン（０．０２ステップあたり４．８秒）を、使用した。シリコーン標準を分析して、この機器の調整を確認した。データを、収集し、そしてＸＲＤ−６０００ ｖ．４．１を使用して分析した。ヘキサトリアコンタン：シリコーンの８０：２０混合物からなる低角度標準を実行し、良好に定義される「ｄ」値について、より低い角度におけるこの機器の高解像度を実証した。   The tube voltage and amperage were set to 40 kV and 40 mA, respectively. The divergence and scattering slits were set at 1 ° and the receiving slit was set at 0.15 mm. Alternatively, the divergence and scattering slits were set to 0.5 ° and the receiving slit was set to 0.15 mm. Diffracted radiation was detected by a NaI scintillation detector. A continuous scan of θ-2θ at 0.5 ° per minute from 1-20 ° 2θ (4.8 seconds per 0.02 step) was used. A silicone standard was analyzed to confirm adjustment of the instrument. Data was collected and XRD-6000 v. Analyzed using 4.1. A low angle standard consisting of an 80:20 mixture of hexatriacontane: silicone was run, demonstrating the high resolution of this instrument at a lower angle for a well-defined “d” value.

図１１は、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアおよびヘキサトリアコンタン：シリコーンの８０：２０混合物のＸＲＰＤパターンを示す。ヘキサトリアコンタン：シリコーンの混合物のＸＲＰＤは、結晶状態を示す独特のピークを有する一方で、抗体ミクロスフェアのＸＲＰＤパターンは、連続的であり、そして明確なピークを有さず、このことは、非晶質の、非結晶質状態の典型である。   FIG. 11 shows the XRPD pattern of an anti-CD34 monoclonal antibody microsphere and an 80:20 mixture of hexatriacontane: silicone. While the XRPD of the hexatriacontane: silicone mixture has a unique peak that indicates the crystalline state, the XRPD pattern of the antibody microspheres is continuous and does not have a distinct peak, indicating that Typical of the crystalline, amorphous state.

Figure 2007537283
この結果は、高濃度のこれらのタンパク質ミクロスフェアが、吸引され得、そして首尾よく１０ポンドのハム片中に注射され得ることを示す。
Figure 2007537283
 This result indicates that high concentrations of these protein microspheres can be aspirated and successfully injected into a 10 pound piece of ham.

（実施例１１）
抗ＣＤ３４を、本発明に従って（実施例２にほぼ従って）ミクロスフェア中に処方した。このミクロスフェアを、表Ｉに示す濃度にて５％ ＰＥＧ ３３５０の溶液中に懸濁した。懸濁したミクロスフェアのある容量を、注射器中に吸引し、そして２５ゲージの注射可能の針を通して４ポンドの市販のブタ肩肉中に送達した。それぞれの注射を、目詰まりせずに２０秒以下で行った。この実施例における注入能力の結果は、２５ゲージの針を通して注射器中にこのミクロスフェア懸濁物を吸引し、そして注射器の内容物をこのブタに完全に注射する能力を示し、この結果は、表Ｉに記録される。
（表Ｉ） (Example 11)
Anti-CD34 was formulated in microspheres (substantially according to Example 2) according to the present invention. The microspheres were suspended in a solution of 5% PEG 3350 at the concentrations shown in Table I. A volume of suspended microspheres was aspirated into a syringe and delivered through a 25 gauge injectable needle into a 4 pound commercial pig shoulder. Each injection was made in 20 seconds or less without clogging. The infusion performance results in this example show the ability to aspirate the microsphere suspension through the 25 gauge needle into the syringe and to completely inject the contents of the syringe into the pig. I is recorded.
(Table I)

Figure 2007537283
表Ｉに報告した結果は、高濃度のこれらのタンパク質ミクロスフェアが、細い（２５ゲージ）針の中に吸引され、そしてそこから首尾よく注射され得ることを示す。このことは、皮膚を通し、そして筋肉中への、皮下環境における注射性能の徴候を提供する。
Figure 2007537283
 The results reported in Table I indicate that high concentrations of these protein microspheres can be aspirated into a fine (25 gauge) needle and successfully injected therefrom. This provides an indication of injection performance in the subcutaneous environment through the skin and into the muscle.

（実施例１２）
９０重量％より多い組換えヒトインスリンを含むインスリンミクロスフェアを、本発明に従うミクロスフェア中に処方した。このインスリンミクロスフェアを、表Ｉに示す濃度で５％ ＰＥＧ ３３５０の溶液中に懸濁した。１ｍＬの懸濁したミクロスフェアを、注射器中に吸引し、そして２８ゲージのインスリン針を通して１０ポンドの市販のスモークハム中に送達した。それぞれの注射は、目詰まりせずに２０秒以下で行った。この実施例における注射器能力の結果は、２８ゲージの針を通して注射器中にこのミクロスフェア懸濁物を吸引する能力を示し、そしてこの実施例における注射性能は、注射器の内容物をこのハムに完全に注射する能力を示す。この結果は、表Ｉに記録される。
（表１） (Example 12)
Insulin microspheres containing more than 90% by weight of recombinant human insulin were formulated into microspheres according to the present invention. The insulin microspheres were suspended in a solution of 5% PEG 3350 at the concentrations shown in Table I. 1 mL of suspended microspheres was aspirated into a syringe and delivered through a 28 gauge insulin needle into 10 pounds of commercial smoked ham. Each injection was performed in 20 seconds or less without clogging. The syringe performance results in this example show the ability to aspirate the microsphere suspension through the 28 gauge needle into the syringe, and the injection performance in this example demonstrates that the syringe contents are completely transferred to the ham. Indicates ability to inject. This result is recorded in Table I.
(Table 1)

Figure 2007537283
表Ｉに報告した結果は、高濃度のこれらのタンパク質ミクロスフェアが、細い（２８ゲージ）針の中に吸引され、そしてそこから１０ポンドのハム片に首尾よく注射され得ることを示す。この後者の工程は、皮下環境における注射性能のおおまかな徴候を提供する。３００ｍｇ／ｍｌの注射を、５．８ニュートンの力で行った。
Figure 2007537283
 The results reported in Table I indicate that high concentrations of these protein microspheres can be aspirated into a thin (28 gauge) needle and from there can be successfully injected into a 10 pound piece of ham. This latter step provides a rough indication of injection performance in the subcutaneous environment. A 300 mg / ml injection was made with a force of 5.8 Newtons.

（実施例１３）
インスリンの微粒子またはミクロスフェアは、一般的方法によって調製される。１６．６７％のＰＥＧ ３３５０を含むｐＨ５．６５（０．０３３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液）で緩衝化した溶液を、調製した。亜鉛結晶性インスリンの濃縮されたスラリーを、撹拌しながらこの溶液に添加した。最終的な溶液中のインスリン濃度は、０．８３ｍｇ／ｍＬであった。この溶液を、約８５℃〜９０℃に加熱した。このインスリンの結晶は、この温度で５分以内に完全に溶解した。インスリン球状小粒子は、溶液の温度が制御した速度で減少する場合、約６０℃で形成し始めた。ＰＥＧの濃度が増加するにつれて、インスリン球状小粒子の収量は、増加した。このプロセスは、１．４μｍの平均を有する種々のサイズ分布を伴って、微粒子またはミクロスフェアを産生した。 (Example 13)
Insulin microparticles or microspheres are prepared by conventional methods. A solution buffered with pH 5.65 (0.033 M sodium acetate buffer) containing 16.67% PEG 3350 was prepared. A concentrated slurry of zinc crystalline insulin was added to this solution with stirring. The insulin concentration in the final solution was 0.83 mg / mL. This solution was heated to about 85 ° C to 90 ° C. The insulin crystals were completely dissolved within 5 minutes at this temperature. Insulin spherical small particles began to form at about 60 ° C. when the temperature of the solution decreased at a controlled rate. As the concentration of PEG increased, the yield of insulin spherical small particles increased. This process produced microparticles or microspheres with various size distributions having an average of 1.4 μm.

形成されたインスリンの微粒子またはミクロスフェアを、このミクロスフェアが溶解しない条件下でダイアフィルトレーションを介してこのミクロスフェアを洗浄することによって、ＰＥＧから分離した。このインスリンミクロスフェアを、Ｚｎ２＋を含む水溶液を使用して上記懸濁物から洗浄した。このＺｎ２＋イオンは、インスリンの溶解性を減少させ、そして収量を減少させ、そしてミクロスフェアの凝塊形成を生じる溶解を防止する。 The formed insulin microspheres or microspheres were separated from the PEG by washing the microspheres via diafiltration under conditions in which the microspheres did not dissolve. The insulin microspheres were washed from the suspension using an aqueous solution containing Zn 2+ . The Zn 2+ ions reduce insulin solubility and reduce yield and prevent dissolution resulting in microsphere agglomeration.

（実施例１４）
本発明はまた、本発明の好ましい注入可能な送達経路に特に適した、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）の球状小粒子を調製するために使用され得る。ＡＡＴは、約４４ｋＤａの分子量を有する。この実施例は、ＡＡＴ球状小粒子のジャケット付カラムバッチの調製（１０〜３００ｍｇの規模）について報告する。 (Example 14)
The present invention can also be used to prepare spherical small particles of α-1-antitrypsin (AAT) that are particularly suitable for the preferred injectable delivery route of the present invention. AAT has a molecular weight of about 44 kDa. This example reports on the preparation of a jacketed column batch of AAT spherical small particles (10-300 mg scale).

１６％のＰＥＧ ３３５０および０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を含む１０ｍＭ酢酸アンモニウムによってｐＨ６．０に緩衝化した溶液を、ジャケット付ビーカー中で磁性撹拌子を用いて混合し、そして３０℃に加熱した。このビーカーの温度を、循環式の水浴を使用して制御した。組換えＡＡＴ（ｒＡＡＴ）の濃縮溶液を、撹拌しながらこの溶液に添加し、そしてそのｐＨを６．０に調整した。最終的な溶液中のｒＡＡＴ濃度は、２ｍｇ／ｍｌであった。ｒＡＡＴは、この溶液の組成におけるこの温度で完全に溶解した。この容器の全内容物を、ジャケット付カラムに移し、そして２５〜３０℃に加熱した。このカラムのためにこの循環式の水浴を、−５℃まで降下するように設定した。このカラムおよび内容物を、１分間あたり約１℃の割合で、約４℃の温度まで冷却した。このｒＡＡＴ球状小粒子は、この冷却工程の間に形成した。このミクロスフェア懸濁物を、ガラス結晶皿中で凍結させ、そして凍結乾燥して、水および緩衝液を除去した。   A solution buffered to pH 6.0 with 10 mM ammonium acetate containing 16% PEG 3350 and 0.02% Pluronic F-68 is mixed with a magnetic stir bar in a jacketed beaker and heated to 30 ° C. did. The beaker temperature was controlled using a circulating water bath. A concentrated solution of recombinant AAT (rAAT) was added to this solution with stirring and the pH was adjusted to 6.0. The final rAAT concentration in the solution was 2 mg / ml. rAAT was completely dissolved at this temperature in the composition of the solution. The entire contents of the vessel were transferred to a jacketed column and heated to 25-30 ° C. The circulating water bath was set to drop to -5 ° C for the column. The column and contents were cooled to a temperature of about 4 ° C. at a rate of about 1 ° C. per minute. The rAAT spherical small particles formed during the cooling process. The microsphere suspension was frozen in a glass crystal dish and lyophilized to remove water and buffer.

凍結乾燥後のタンパク質球状小粒子からＰＥＧを抽出するために、ＰＥＧ／タンパク質の固形物を、塩化メチレン（ＭｅＣｌ２）で洗浄した。利用した別の洗浄用媒体は、塩化メチレン：アセトン １：１、または塩化メチレン：ペンタン １：１であった。この洗浄手順を、最初の容量の洗浄で合計３回繰り返した。最終的なペレットを、小さい容量のアセトンまたはペンタンに懸濁し、そして窒素ガスに直接曝すことによってか、またはロータリーエバポレーションによってかのいずれかで乾燥した。 The PEG / protein solid was washed with methylene chloride (MeCl 2 ) to extract PEG from small protein spherical particles after lyophilization. Another cleaning medium utilized was methylene chloride: acetone 1: 1 or methylene chloride: pentane 1: 1. This washing procedure was repeated a total of 3 times with the first volume of washing. The final pellet was suspended in a small volume of acetone or pentane and dried either by direct exposure to nitrogen gas or by rotary evaporation.

（実施例１５）
この実施例において、ＡＡＴ球状小粒子（２００〜２０００ｍｇの規模）は、ジャケット付容器バッチの調製である。この型の調製を、ジャケット付カラムと同じであるが、より大きい容量に適合し得る処方の組成物を使用して行い、そしてこの調製は、よりスケールアップに適していた。この規模において、この処方物を、ジャケット付容器（通常は５００〜１０００ｍｌ）中のＡ字型のパドル型インペラー（Ａ−ｓｈａｐｅｄ ｐａｄｄｌｅ ｓｔｙｌｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）によって、７５ｒｐｍで混合し、そして３０℃まで加熱した。この容器の温度を、循環式の水浴を使用して制御した。同じ容器中の溶液を保持しながら、水浴の供給源を、３０℃のバス〜２℃のバスに切り替えた。この容器および内容物を、１分間あたり約１℃の割合で、４℃の温度まで冷却した。このｒＡＡＴ球状小粒子は、この冷却工程の間に形成した。この温度を、熱電対を使用してモニタリングし、そしてこの懸濁物が４℃に達したとき、この懸濁物をこの温度付近で、さらに３０分間保持した。保持工程の後、この球状小粒子の懸濁物を、約４℃にてダイアフィルトレーションを介して濃縮して、約７５％のポリマーおよび約７５％の容量を取り除いた。残った球状小粒子の懸濁物を、予め冷却した凍結乾燥トレイ中に薄い層として凍結し、そして凍結乾燥して、水および残った緩衝液を除去した。 (Example 15)
In this example, AAT spherical small particles (on a scale of 200-2000 mg) are the preparation of jacketed container batches. This type of preparation was done using a composition of the same formulation as the jacketed column but capable of accommodating larger volumes, and this preparation was more suitable for scale-up. At this scale, the formulation was mixed at 75 rpm with an A-shaped paddle style impeller in a jacketed container (usually 500-1000 ml) and heated to 30 ° C. The temperature of the vessel was controlled using a circulating water bath. The water bath source was switched from a 30 ° C. bath to a 2 ° C. bath while holding the solution in the same vessel. The vessel and contents were cooled to a temperature of 4 ° C. at a rate of about 1 ° C. per minute. The rAAT spherical small particles formed during the cooling process. The temperature was monitored using a thermocouple, and when the suspension reached 4 ° C., the suspension was held near this temperature for an additional 30 minutes. After the holding step, the spherical small particle suspension was concentrated via diafiltration at about 4 ° C. to remove about 75% polymer and about 75% volume. The remaining spherical small particle suspension was frozen as a thin layer in a pre-cooled lyophilization tray and lyophilized to remove water and remaining buffer.

このタンパク質球状小粒子を、有機溶媒と共に遠心分離することによって（実施例１８に記載されるように）か、または超臨界流体（ＳＣＦ）抽出によってかのいずれかで、残りの乾燥したポリマーから分離した。ＳＣＦ抽出のために、この乾燥した物質を、ＣＯ２によって（室温で）２５００ｐｓｉまで加圧される高圧抽出チャンバー中に移した。一旦作動圧力に達すると、エタノールは、７０：３０のＣＯ２：エタノール混合物として吸気口の流体の流れに導入された。この超臨界流体は、この球状小粒子を残したままこのポリマーを溶解した。このプロセスの終結において、このシステムは、エタノールを流され、そしてゆっくりと圧力が下げられた。 The protein spherical small particles are separated from the rest of the dried polymer, either by centrifuging with an organic solvent (as described in Example 18) or by supercritical fluid (SCF) extraction. did. For SCF extraction, the dried material was transferred by CO 2 in a high pressure extraction chamber to be pressurized to (room temperature) 2500 psi. Once operating pressure was reached, ethanol was introduced into the inlet fluid stream as a 70:30 CO 2 : ethanol mixture. The supercritical fluid dissolved the polymer while leaving the spherical small particles. At the end of the process, the system was flushed with ethanol and the pressure was slowly reduced.

（実施例１６）
球状小粒子を、実施例１５および１６に記載されるように製造し、そして歩留まりを決定した。冷却プロセスを完了した後、この懸濁物の少量のアリコートを、取り除き、そしてこれを、０．２μｍの注射器フィルターによって濾過して、固体の球状小粒子を除去した。溶液中に残っているｒＡＡＴであるこの濾過物の吸光度を、ＵＶ分光光度計を使用して２８０ｎｍにおいて決定した。その後このｒＡＡＴ濃度を、標準曲線から計算した。この％の変換を、以下： (Example 16)
Spherical small particles were produced as described in Examples 15 and 16 and the yield was determined. After completing the cooling process, a small aliquot of the suspension was removed and it was filtered through a 0.2 μm syringe filter to remove the solid spherical small particles. The absorbance of this filtrate, the rAAT remaining in solution, was determined at 280 nm using a UV spectrophotometer. The rAAT concentration was then calculated from the standard curve. Following this% conversion:

Figure 2007537283
のように計算した。
Figure 2007537283
 It was calculated as follows.

上記の表に示されるように、高い％のＡＡＴタンパク質を、プロセスの規模に関係なく、球状小粒子に変換した。   As shown in the table above, high% AAT protein was converted to small spherical particles regardless of process size.

（実施例１７）
この実施例は、異なるプロセスの規模のエアロサイザー（Ａｅｒｏｓｉｚｅｒ）データにおける、ＡＡＴ粒子の粒子サイズ分布を示す。最終的なＡＡＴの乾燥粉末球状小粒子のサンプルを、飛行時間測定によって粒子サイズを測定するＴＳＩ Ａｅｒｏｓｉｚｅｒ ３２２５において分析した。これらの測定値から、異なる割合の体積粒径を、このＡＡＴ球状小粒子の粒子サイズ分布を実証するために計算し、そしてこの体積粒径を、本発明の方法以外の方法によって製造された粒子と比較するために使用した。 (Example 17)
This example shows the particle size distribution of AAT particles in Aerosizer data for different process scales. Final AAT dry powder spherical small particle samples were analyzed in a TSI Aerosizer 3225 which measures particle size by time-of-flight measurement. From these measurements, different proportions of the volume particle size were calculated to demonstrate the particle size distribution of the AAT spherical small particles, and the volume particle size was calculated using particles other than the method of the present invention. Used to compare with.

Figure 2007537283
５〜１０ｍｇのサンプルを、ゲルカプセル中に秤量し、そして１分間あたり６０リットルの流速（ＬＰＭ）にてＣｙｃｌｏｈａｌｅｒ Ｄｒｙ Ｐｏｗｄｅｒ Ｉｎｈａｌｅｒを使用するＡｎｄｅｒｓｅｎ Ｃａｓｃａｄｅ Ｉｍｐａｃｔｏｒ中に適用した。球状小粒子を、全ての衝突または段階から回収し、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、そして逆相ＨＰＬＣを使用して定量化した。このデータを分析し、そして幾何標準偏差（ＧＳＤ）を、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）に記載されるように計算した。このデータは、狭いサイズ分布を実証した。
Figure 2007537283
 5-10 mg of sample was weighed into a gel capsule and applied in an Andersen Cascade Impactor using a Cyclohaler Dry Powder Inhaler at a flow rate (LPM) of 60 liters per minute. Spherical small particles were recovered from all collisions or steps, dissolved in 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and quantified using reverse phase HPLC. This data was analyzed and the geometric standard deviation (GSD) was calculated as described in United States Pharmacopeia (USP). This data demonstrated a narrow size distribution.

Figure 2007537283
上に示される全ての分布パラメーターは、本発明の製造方法から生じる優れた粒子サイズ分布を実証した。
Figure 2007537283
 All the distribution parameters shown above demonstrated an excellent particle size distribution resulting from the production method of the present invention.

（実施例１８）
この実施例は、ＡＡＴの生物活性の保持を示す。比活性を決定するために、上記ｒＡＡＴ球状小粒子を、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に室温で溶解した。得られた溶液を、Ｃ末端にｐ−ニトロアニリド基を含む合成ペプチドを加水分解する、ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）の能力を阻害するｒＡＡＴの性能を測定するアッセイによって分析した。次いでｒＡＡＴ球状小粒子の同じ溶液を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用してタンパク質濃度についてアッセイした。コントロールのｒＡＡＴ出発物質溶液もまた、両方のアッセイによって分析した。この活性のアッセイは、１サンプルあたり１ｍｇ／ｍｌのタンパク質の濃度に基づく活性を決定するために開発されたので、この活性の値を、ＢＣＡによって決定される実際のタンパク質濃度に基づいて補正し、比活性値を得た。 (Example 18)
This example demonstrates the retention of AAT biological activity. In order to determine the specific activity, the rAAT spherical small particles were dissolved in 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0) at room temperature. The resulting solution was analyzed by an assay that measures the ability of rAAT to inhibit the ability of porcine pancreatic elastase (PPE) to hydrolyze a synthetic peptide containing a p-nitroanilide group at the C-terminus. The same solution of rAAT spherical small particles was then assayed for protein concentration using the bicinchoninic acid (BCA) assay. Control rAAT starting material solutions were also analyzed by both assays. Since this activity assay was developed to determine activity based on a concentration of 1 mg / ml protein per sample, the value of this activity was corrected based on the actual protein concentration determined by BCA, Specific activity values were obtained.

Figure 2007537283
従って、この比活性は、ＡＡＴの球状小粒子中への製造後の、生物活性の保持を実証した。
Figure 2007537283
 This specific activity therefore demonstrated the retention of biological activity after production of AAT into small spherical particles.

（実施例１９）
この実施例は、溶媒としてＰＥＧまたはＰｏｌｏｘａｍｅｒを用い、そして冷却下でのミクロスフェア形成を伴うヒト化モノクローナル抗体のミクロスフェアの調製を記載する。４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中の４ｍｇ／ｍＬヒト化モノクローナル抗体（抗ＣＤ２５モノクローナル抗体）の１ｍＬ溶液（ｐＨ＝５．９）を、１ｍＬのＰＥＧ ３３５０ Ｄａ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）から入手可能）の３０％（ｗ／ｖ）溶液と水中で混合した。あるいは、この溶液を、１ｍＬのポロキサマー １８８ ＮＦ（Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８）（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪ）から入手可能）の３０％（ｗ／ｖ）溶液と水中で混合した。この混合物を、３５℃で１０分間、水浴中でインキュベートし、次いで１分間あたり約０．７℃の割合で２℃まで冷却した。 Example 19
This example describes the preparation of humanized monoclonal antibody microspheres using PEG or Poloxamer as the solvent and with microsphere formation under cooling. A 1 mL solution (pH = 5.9) of 4 mg / mL humanized monoclonal antibody (anti-CD25 monoclonal antibody) in 40 mM ammonium acetate buffer, 1 mL of PEG 3350 Da (available from Spectrum Chemicals (Gardena, Calif.)). Mixed with 30% (w / v) solution in water. Alternatively, this solution was mixed in water with 1 mL of a 30% (w / v) solution of poloxamer 188 NF (Ltrol F68) (available from BASF Corporation (Florham Park, NJ)). The mixture was incubated in a water bath for 10 minutes at 35 ° C. and then cooled to 2 ° C. at a rate of about 0.7 ° C. per minute.

その後、このサンプルを、光学顕微鏡において、１０×および１００×の倍率で観察し、そしてこのサンプルは、いずれかのポリマーを使用した球状粒子の形成を示した。このミクロスフェアのほとんどは、約２ミクロンの直径であるようだが、より小さいものもあった。直径が５ミクロンより大きいミクロスフェアは、ほとんどなかった。   The sample was then observed in a light microscope at 10 × and 100 × magnification, and the sample showed the formation of spherical particles using either polymer. Most of the microspheres appeared to be about 2 microns in diameter, but some were smaller. There were few microspheres with diameters greater than 5 microns.

（実施例２０）
この実施例は、ＡＡＴの構造的完全性の保持を示す。制御された相分離（ＣＰＳ）技術の異なる重要な点の１つは、粒子形成の間に水性系を利用し、そして他の負荷を誘導する条件（例えば、上昇した温度、せん断など）を回避する穏やかな条件下での粒子の形成である。粒子工学の分野において、主要な関心事は、製造の間のタンパク質の安定性および保存安定性である。主な分解経路（例えば、酸化、アミド分解および特にタンパク質の凝塊形成）は、タンパク質処方物の副作用（免疫原性が挙げられる）の原因であると考えられる。従って、規制の関連事項は、最終的な粒子処方物における分解産物の非常に低いレベルを必要とする。ＨＰＬＣ、物理化学的特徴付け（例えば、ＣＤおよびＤＳＣ）を、タンパク質の改変が形成の間に生じたか否かを決定するために利用した。 (Example 20)
This example demonstrates the retention of AAT structural integrity. One of the different important aspects of controlled phase separation (CPS) technology is that it utilizes an aqueous system during particle formation and avoids other loading-induced conditions (eg, elevated temperature, shear, etc.) The formation of particles under mild conditions. In the field of particle engineering, a major concern is protein stability and storage stability during manufacture. The main degradation pathways (eg, oxidation, amidolysis and especially protein agglomeration) are thought to be responsible for the side effects of protein formulations, including immunogenicity. Therefore, regulatory matters require very low levels of degradation products in the final particle formulation. HPLC, physicochemical characterization (eg, CD and DSC) was utilized to determine if protein modifications occurred during formation.

円偏光二色性（ＣＤ）は、摂動に供されたタンパク質の構造上の変化の評価、または操作したタンパク質の構造の親タンパク質に対する比較のために最も一般的に使用される方法である。ＣＤ法は、タンパク質の折り畳み、ならびにタンパク質の二次構造および三次構造を評価している。   Circular dichroism (CD) is the most commonly used method for assessing structural changes in perturbed proteins or for comparing engineered protein structure to the parent protein. The CD method evaluates protein folding and the secondary and tertiary structure of the protein.

二次構造は、「遠紫外」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）におけるＣＤ分光法によって決定され得る。これらの波長において、発色団は、それが正常に折り畳まれた環境中に位置する場合、ペプチド結合である。α−へリックス、β−シート、およびランダムコイル構造は、それぞれ、ＣＤスペクトルの特徴的な形および強度を生じる。従って、任意のタンパク質中に存在するそれぞれの二次構造型のおおよその割合は、その遠紫外ＣＤスペクトルを分析することによって、それぞれの構造の型についての分かれた複数のこのような参照スペクトルの合計として決定され得る。   Secondary structure can be determined by CD spectroscopy in the “far UV” spectral region (190-250 nm). At these wavelengths, a chromophore is a peptide bond when it is located in a normally folded environment. The α-helix, β-sheet, and random coil structures each yield a characteristic shape and intensity of the CD spectrum. Thus, the approximate percentage of each secondary structure type present in any protein is the sum of multiple such reference spectra separated for each structure type by analyzing its far ultraviolet CD spectrum. Can be determined as

「近紫外」スペクトル領域（２５０〜３５０ｎｍ）におけるタンパク質のＣＤスペクトルは、三次構造の特定の局面に対して感受性であり得る。これらの波長において、発色団は、芳香族アミノ酸およびジスルフィド結合であり、そしてこれらが生成するＣＤシグナルは、タンパク質の三次構造全体に対して感受性である。２５０〜２７０ｎｍの領域中のシグナルは、フェニルアラニン残基に起因し、２７０〜２９０ｎｍのシグナルは、チロシンに起因し、そして２８０〜３００ｎｍのシグナルは、トリプトファンに起因する。ジスルフィド結合は、近紫外スペクトル全体にわたって広範な弱いシグナルを生じる。   The CD spectrum of a protein in the “near ultraviolet” spectral region (250-350 nm) can be sensitive to certain aspects of tertiary structure. At these wavelengths, the chromophores are aromatic amino acids and disulfide bonds, and the CD signal they generate is sensitive to the overall tertiary structure of the protein. The signal in the 250-270 nm region is due to phenylalanine residues, the 270-290 nm signal is due to tyrosine, and the 280-300 nm signal is due to tryptophan. Disulfide bonds produce a wide range of weak signals throughout the near ultraviolet spectrum.

ｒＡＡＴストック溶液およびリン酸緩衝液中の球状小粒子（ｐＨ７．４、Ｔ＝２５℃、０．０５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度）から放出されたＡＡＴの遠紫外ＣＤスペクトルを、図１３に示す。それぞれのスペクトルは、１０回の走査の平均を示す。   The far ultraviolet CD spectrum of AAT released from spherical small particles (pH 7.4, T = 25 ° C., 0.05 mg / mL protein concentration) in rAAT stock solution and phosphate buffer is shown in FIG. Each spectrum represents the average of 10 scans.

遠紫外ＣＤスペクトルは、区別不能であり、ＡＡＴの球状小粒子中への製造が、ＡＡＴのその後の放出において、出発ＡＡＴ物質の構造と同じ構造を有するＡＡＴ分子を生じたことを実証する。   The far-UV CD spectrum is indistinguishable, demonstrating that production of AAT into spherical small particles yielded AAT molecules with the same structure as that of the starting AAT material in the subsequent release of AAT.

球状小粒子を、ｐＨ８．０の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解し、そして逆相ＨＰＬＣによって分析した。出発ｒＡＡＴタンパク質のコントロール溶液と比較した場合、クロマトグラムの外見において明らかな違いは、存在しない。   Spherical small particles were dissolved in 0.2M Tris-HCl pH 8.0 and analyzed by reverse phase HPLC. There is no obvious difference in the appearance of the chromatogram when compared to the starting rAAT protein control solution.

ＨＰＬＣシステム：
ＨＰＬＣカラム−Ｐｈｅｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ、５ミクロン、Ｃ４、３００Ａ、２５０×４．６ｍｍ
Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２９６５ポンプ／オートサンプラー
波長− ２８０ｎｍ
注射容量− ７５ｕｌ
濃度の勾配：
移動相１：水中の０．１％ ＴＦＡ
移動相２：水中の９０％（ｃ／ｖ）アセトニトリル中の０．０８５％ ＴＦＡ
実行時間− ６０分間
流速− １．０ｍｌ／分
ＤＳＣダイアグラムを、作製した。図１５〜図２５ｂを参照のこと。 HPLC system:
HPLC column-Pheomenex Jupiter, 5 microns, C4, 300A, 250 x 4.6 mm
Waters Alliance 2965 pump / autosampler wavelength-280nm
Injection volume-75ul
Concentration gradient:
Mobile phase 1: 0.1% TFA in water
Mobile phase 2: 0.085% TFA in 90% (c / v) acetonitrile in water
Run time-60 minutes Flow rate-1.0 ml / min A DSC diagram was generated. See Figures 15-25b.

（実施例２１）
この実施例は、ＡＡＴ出発物質の保存安定性に対するＡＡＴ球状小粒子の保存安定性を報告する。球状小粒子を、室温および４℃における、１週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、ならびに１２ヶ月間の保存後の、生物活性の保持について分析した（実施例１７に記載されるアッセイを使用して）。（図１７ｂおよび図１７ｃ）。このバルク物質（ｂｕｌｋ ｍａｔｅｒｉａｌ）は、透析し、次いで凍結乾燥したｒＡＡＴ出発溶液である。それぞれの時点および保存状態に関して、二連のサンプルが存在し、これらを、それぞれ二連でアッセイした。 (Example 21)
This example reports the storage stability of AAT spherical small particles relative to the storage stability of AAT starting material. Spherical small particles were analyzed for retention of biological activity after storage for 1 week, 1 month, 2 months, 3 months, 6 months, and 12 months at room temperature and 4 ° C. (Example 17) Using the assay described in). (FIGS. 17b and 17c). This bulk material is a rAAT starting solution that is dialyzed and then lyophilized. There were duplicate samples for each time point and storage state, which were each assayed in duplicate.

（実施例２２）
Ｄｎａｓｅ球状小粒子を調製した。ＤＮａｓｅは、約３８ｋＤａの分子量を有する。処方例：以下の溶液：（ｌｍｇ／ｍｌストックからの）０．１８ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ、（２５％ストックからの）１８．２％ ＰＥＧ ３３５０、（１Ｍストックからの）９ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．１５）。この懸濁物を、−８０℃の冷凍庫で冷却し、そして一旦凍結させ、この懸濁物を、マニホールド式凍結乾燥器上で凍結乾燥し、次いでＭｅＣｌ２／アセトンを伴う遠心分離によって洗浄した。 (Example 22)
Dnase spherical small particles were prepared. DNase has a molecular weight of about 38 kDa. Formulation Example: The following solutions: 0.18 mg / ml DNase (from 1 mg / ml stock), 18.2% PEG 3350 (from 25% stock), 9 mM ammonium acetate (from 5. 1 stock), pH 5.15 . The suspension was cooled in a −80 ° C. freezer and frozen once, the suspension was lyophilized on a manifold lyophilizer and then washed by centrifugation with MeCl 2 / acetone.

試みた最初の濃度は、０．ｌｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅおよび２０％ ＰＥＧ ３３５０であった。３７℃から０℃までの冷却を試みた後に、沈殿を得ることはできなかったが、別の量のＤＮａｓｅを添加して、上記の濃度を得た。この溶液を、−８０℃の冷凍庫で冷却し、そして一旦凍結させ、この溶液を、マニホールド式凍結乾燥器上で凍結乾燥した。ＭｅＣｌ２／アセトンを伴う遠心分離によって洗浄した。試みた最初の濃度は、０．ｌｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅおよび２０％ ＰＥＧ ３３５０であった。３７℃から０℃までの冷却を試みた後に、沈殿を得ることはできなかったが、別の量のＤＮａｓｅを添加して、上記の濃度を得た。この溶液を、−８０℃の冷凍庫で冷却し、そして一旦凍結させ、この溶液を、マニホールド式凍結乾燥器上で凍結乾燥した。ＭｅＣｌ２／アセトンを伴う遠心分離によって洗浄した。（図３８、図３９）。 The initial concentration attempted was 0. 1 mg / ml DNase and 20% PEG 3350. After trying to cool from 37 ° C. to 0 ° C., a precipitate could not be obtained, but another amount of DNase was added to obtain the above concentration. The solution was cooled in a −80 ° C. freezer and frozen once, and the solution was lyophilized on a manifold lyophilizer. Washed by centrifugation with MeCl 2 / acetone. The initial concentration attempted was 0. 1 mg / ml DNase and 20% PEG 3350. After trying to cool from 37 ° C. to 0 ° C., a precipitate could not be obtained, but another amount of DNase was added to obtain the above concentration. The solution was cooled in a −80 ° C. freezer and frozen once, and the solution was lyophilized on a manifold lyophilizer. Washed by centrifugation with MeCl 2 / acetone. (FIGS. 38 and 39).

活性（ＤＮａｓｅ−Ｉについての、Ｓｉｇｍａから購入したＤＮＡ−メチルグリーンを使用したアッセイ）。出発物質についての理論上の活性は、７７５Ｋｕ／ｍｇのタンパク質として記載される。ストック溶液を、０．１４５ｍｇ／ｍｌのタンパク質であると決定した。この濃度を、０．０１９９ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように５ｍｌに希釈した。この活性は、７７５Ｋｕ／ｍｇ＊０．０１９９ｍｇ／ｍｌ＝１５．４６Ｋｕ／ｍｌとなるはずである。 Activity (Assay for DNase-I using DNA-methyl green purchased from Sigma). The theoretical activity for the starting material is described as 775 Ku / mg protein. The stock solution was determined to be 0.145 mg / ml protein. This concentration was diluted to 5 ml to a final concentration of 0.0199 mg / ml. This activity should be 775 Ku / mg * 0.0199 mg / ml = 15.46 Ku / ml.

Figure 2007537283
理論上の活性に対する比較：球状小粒子／理論上の活性＊１００％＝活性の％：
１４．５５Ｋｕ／ｍｌ ／ １５．４６Ｋｕ／ｍｌ＊１００％＝９４．１％。
Figure 2007537283
 Comparison to theoretical activity: small spherical particles / theoretical activity * 100% =% of activity:
14.55 Ku / ml / 15.46 Ku / ml * 100% = 94.1%.

（実施例２３）
スーパーオキシドジスムターゼ（約３２ｋＤａの分子量）球状小粒子を、調製する。（５ｍｇ／ｍｌストックからの）０．６８ｍｇ／ｍｌ ＳＯＤ、（３１．２５％ストックからの）２４．１５％ ＰＥＧ ３３５０、（１Ｍストックからの）９．ｌｍＭ 酢酸アンモニウム、最終ｐＨ＝４．９９の溶液を水酸化アンモニウムおよび酢酸で調整した。これらの溶液を、４０℃から０℃まで、５０分間かけて冷却（１分間あたり約０．８℃）し、そして沈殿は、約２５℃で開始した。この懸濁物を、液体窒素中で急速冷凍し、そしてマニホールド式凍結乾燥器上で凍結乾燥し、次いでＭｅＣｌ２／アセトンを伴う遠心分離によって洗浄した。（図４０、図４１）。 (Example 23)
Superoxide dismutase (approximately 32 kDa molecular weight) spherical small particles are prepared. 8. 0.68 mg / ml SOD (from 5 mg / ml stock), 24.15% PEG 3350 (from 31.25% stock), (from 1M stock) A solution of 1 mM ammonium acetate, final pH = 4.99 was adjusted with ammonium hydroxide and acetic acid. The solutions were cooled from 40 ° C. to 0 ° C. over 50 minutes (about 0.8 ° C. per minute) and precipitation started at about 25 ° C. The suspension was flash frozen in liquid nitrogen and lyophilized on a manifold lyophilizer and then washed by centrifugation with MeCl 2 / acetone. (FIGS. 40 and 41).

４０℃から０℃まで、５０分間かけて冷却（１分間あたり約０．８℃）した。沈殿は、約２５℃で始まった。液体窒素中で急速冷凍し、そしてマニホールド式凍結乾燥器上で凍結乾燥した。ＭｅＣｌ２／アセトンを伴う遠心分離によって洗浄した。球状小粒子が、形成され、そして大部分のアセトンが保持された。 Cooled from 40 ° C. to 0 ° C. over 50 minutes (approximately 0.8 ° C. per minute). Precipitation started at about 25 ° C. Quick frozen in liquid nitrogen and lyophilized on a manifold lyophilizer. Washed by centrifugation with MeCl 2 / acetone. Spherical small particles were formed and most of the acetone was retained.

（実施例２４）
サブチリシン（約３５，２３０ダルトンの分子量）球状小粒子は、非ポリマー性相分離増強剤を使用して調製される。最初の系の連続相は、非ポリマー性相分離増強剤を含み、冷却の間にタンパク質の相分離を誘導し得る。サブチリシン球状小粒子は、任意のポリマーの使用を伴わずに、プロピレングリコールとエタノールとの混合物を使用して、本発明に従って形成され得る。この系において、プロピレングリコールは、凝固点降下剤として機能し、そしてエタノールは、相分離増強剤として機能する。プロピレングリコールはまた、球状小粒子の球状形状の形成を支援する。 (Example 24)
Subtilisin (molecular weight of about 35,230 daltons) spherical small particles are prepared using a non-polymeric phase separation enhancer. The continuous phase of the initial system contains a non-polymeric phase separation enhancer and can induce phase separation of the protein during cooling. Subtilisin spherical small particles can be formed according to the present invention using a mixture of propylene glycol and ethanol without the use of any polymer. In this system, propylene glycol functions as a freezing point depressant and ethanol functions as a phase separation enhancer. Propylene glycol also assists in forming the spherical shape of small spherical particles.

３５％プロピレングリコール中の２０ｍｇ／ｍＬサブチリシン溶液−１０％ホルメート−０．０２％ ＣａＣｌ２を、調製した。次いで３５％プロピレングリコール−サブチリシン溶液を、混合しながら６７％エタノールに加えた。この溶液は、室温で透明なままであった。しかし、−２０℃で１時間冷却した場合、粒子の懸濁物を形成した。遠心分離してこの粒子を収集し、そして９０％エタノールで洗浄した後、コールター粒径分析を、懸濁物の流体として無水エタノールを使用して行った。この粒子は、２．２ミクロンの平均直径を有する分離した粒子に一致するコールターの結果を与え、そして９５％の粒子は、０．４６ミクロンと３．９４ミクロンとの間であった。光学顕微鏡の評価は、実質的に球状の粒子を示すこれらの結果を裏付けた。この粒子のＳＥＭ分析は、コールターの結果を裏付けた。 A 20 mg / mL subtilisin solution in 35% propylene glycol—10% formate—0.02% CaCl 2 was prepared. The 35% propylene glycol-subtilisin solution was then added to 67% ethanol with mixing. This solution remained clear at room temperature. However, when cooled at −20 ° C. for 1 hour, a suspension of particles formed. After centrifuging to collect the particles and washing with 90% ethanol, Coulter particle size analysis was performed using absolute ethanol as the suspension fluid. The particles gave a Coulter result consistent with separated particles having an average diameter of 2.2 microns and 95% of the particles were between 0.46 microns and 3.94 microns. Optical microscope evaluations confirmed these results showing substantially spherical particles. SEM analysis of the particles confirmed the Coulter results.

溶液中のサブチリシンのサブチリシン球状小粒子への変換後におけるサブチリシン酵素活性の保持を、比色定量アッセイによって確認した。球状小粒子についての活性の理論上の総ユニットは、冷却前のエタノール−サブチリシン−プロピレングリコール溶液においてアッセイしたサブチリシンの総ユニット数から、（サブチリシン粒子の分離後の）上清に見出される総ユニット数を差し引くことによって計算した。％として表わされる理論上のユニット数で除算されたサブチリシン球状小粒子について見出される実際の総ユニット数は、粒子形成後のサブチリシン活性の保持を表わす。この計算によって、理論上のサブチリシン活性の１０７％が、このサブチリシン球状小粒子の形成後に保持された。   Retention of subtilisin enzyme activity after conversion of subtilisin in solution to subtilisin spherical small particles was confirmed by a colorimetric assay. The theoretical total units of activity for small spherical particles is the total number of units found in the supernatant (after separation of the subtilisin particles) from the total number of subtilisin units assayed in the ethanol-subtilisin-propylene glycol solution before cooling. Calculated by subtracting. The actual total number of units found for subtilisin spherical small particles divided by the theoretical number of units expressed as% represents the retention of subtilisin activity after particle formation. By this calculation, 107% of the theoretical subtilisin activity was retained after the formation of the subtilisin spherical small particles.

本明細書中に開示される実施形態は種々の形態において具現化され得る本発明の単なる例示であることが、理解されるべきである。従って、本明細書中に開示される具体的な詳細は、限定として解釈されるべきではなく、単に、特許請求の範囲の基礎、および事実上、任意の適切な様式で本発明を様々に利用する当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されるべきである。記載された本発明の実施形態は、本発明の原理のいくつかの適用の例示であり、そして本明細書中で個別に開示されるか、または特許請求される特徴の組み合わせを含む改変は、なされ得る。   It should be understood that the embodiments disclosed herein are merely illustrative of the invention that may be embodied in various forms. Accordingly, the specific details disclosed herein are not to be construed as limiting, but merely as a basis for the claims and various uses of the invention in any suitable manner. Should be construed as a representative basis for teaching those skilled in the art. The described embodiments of the invention are illustrative of some applications of the principles of the invention, and modifications including combinations of features individually disclosed or claimed herein are Can be made.

図１は、実施例３に記載される通りに調製された抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアの光学顕微鏡画像を示す。FIG. 1 shows a light microscopic image of microspheres of anti-factor VIII monoclonal antibody prepared as described in Example 3. 図２は、実施例３に記載される通りに調製された抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアの偏光顕微鏡画像を提供する。FIG. 2 provides a polarized microscopic image of microspheres of anti-factor VIII monoclonal antibody prepared as described in Example 3. 図３は、実施例３に記載される通りに見た抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアの走査電子顕微鏡写真を提供する。FIG. 3 provides a scanning electron micrograph of the anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres viewed as described in Example 3. 図４は、実施例４に記載されるような抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体（出発物質および溶解したミクロスフェア）のゲル電気泳動画像を示す。FIG. 4 shows a gel electrophoresis image of an anti-factor VIII monoclonal antibody (starting material and dissolved microspheres) as described in Example 4. 図５は、実施例５に記載される通りに見た抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアの走査電子顕微鏡写真を示す。FIG. 5 shows a scanning electron micrograph of the anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres viewed as described in Example 5. 図６は、実施例５に記載されるような抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のミクロスフェアの数、表面積および体積分布による粒子サイズ分布を報告する。FIG. 6 reports the particle size distribution by number, surface area and volume distribution of the anti-factor VIII monoclonal antibody microspheres as described in Example 5. 図７は、実施例６に記載される通りに調製された抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの光学顕微鏡画像を提供する。FIG. 7 provides a light microscopic image of microspheres of anti-CD34 monoclonal antibody prepared as described in Example 6. 図８は、実施例８に記載される通りに調製された抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの光学顕微鏡画像である。FIG. 8 is a light microscopic image of microspheres of anti-CD34 monoclonal antibody prepared as described in Example 8. 図９は、実施例６に記載される通りに調製された抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの走査電子顕微鏡写真である。FIG. 9 is a scanning electron micrograph of anti-CD34 monoclonal antibody microspheres prepared as described in Example 6. 図１０は、実施例６に記載される通りに調製された抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアの数の分布による粒子サイズ分布を報告する。FIG. 10 reports the particle size distribution according to the distribution of the number of microspheres of anti-CD34 monoclonal antibody prepared as described in Example 6. 図１１は、実施例１０に記載されるような抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェア（２スリット構造を有する）およびヘキサトリアコンタン：ケイ素混合物の、粉末Ｘ線回折を示す。FIG. 11 shows powder X-ray diffraction of anti-CD34 monoclonal antibody microspheres (having a 2-slit structure) and hexatriacontane: silicon mixture as described in Example 10. 図１２は、実施例７に記載されるようなポロキサマーを伴う、冷却の間の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体のミクロスフェアに関する立体配置安定性の蛍光モニタリングを報告する。FIG. 12 reports fluorescence monitoring of configuration stability for anti-CD34 monoclonal antibody microspheres during cooling with poloxamers as described in Example 7. 図１３は、温度に対して活性な因子の濃度をプロットする二元系相図である。FIG. 13 is a binary phase diagram plotting the concentration of an active factor against temperature. 図１４は、冷却温度プロフィールである。FIG. 14 is a cooling temperature profile. 図１５は、球状小粒子中に調製された場合の、インスリンの化学的安定性の全体的な維持を示すＨＰＬＣ分析である。FIG. 15 is an HPLC analysis showing the overall maintenance of insulin chemical stability when prepared in spherical small particles. 図１６ａおよび１６ｂは、バッチ間の再現性を実証する概略図である。Figures 16a and 16b are schematics demonstrating reproducibility between batches. 図１７ａは、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）についての円偏光二色性（ＣＤ）プロットである。FIG. 17a is a circular dichroism (CD) plot for α-1-antitrypsin (AAT). 図１７ｂは、実施例２１における室温での保存時間に対する活性のプロットである。FIG. 17b is a plot of activity versus storage time at room temperature in Example 21. 図１７ｃは、実施例２１における４℃での保存時間に対する活性のプロットである。FIG. 17 c is a plot of activity versus storage time at 4 ° C. in Example 21. 図１８は、ＤＳＣプロットである。FIG. 18 is a DSC plot. 図１９は、ＤＳＣプロットである。FIG. 19 is a DSC plot. 図２０は、ＤＳＣプロットである。FIG. 20 is a DSC plot. 図２１は、ＤＳＣプロットである。FIG. 21 is a DSC plot. 図２２は、ＤＳＣプロットである。FIG. 22 is a DSC plot. 図２３は、ＤＳＣプロットである。FIG. 23 is a DSC plot. 図２４は、ＤＳＣプロットである。FIG. 24 is a DSC plot. 図２５は、ＤＳＣプロットである。FIG. 25 is a DSC plot. 図２６は、ＤＳＣプロットである。FIG. 26 is a DSC plot. 図２７は、ＤＳＣプロットである。FIG. 27 is a DSC plot. 図２８ａおよび図２８ｂは、ＤＳＣプロットである。28a and 28b are DSC plots. 図２９は、ＨＦＡ−１３４ａにおけるインスリンの安定性のデータを示すチャートである。FIG. 29 is a chart showing insulin stability data in HFA-134a. 図３０は、３種の吸入デバイスを使用して、インスリンの空気力学的な性能を比較するチャートである。FIG. 30 is a chart comparing the aerodynamic performance of insulin using three inhalation devices. 図３１は、２５℃で保存されたインスリン出発物質と比較した、インスリン球状小粒子の安定性のデータのチャートである。FIG. 31 is a chart of insulin spherical small particle stability data compared to an insulin starting material stored at 25 ° C. 図３２は、３７℃で保存されたインスリン出発物質と比較した、インスリン球状小粒子の安定性のデータのチャートである。FIG. 32 is a chart of insulin spherical small particle stability data compared to an insulin starting material stored at 37 ° C. 図３３は、２５℃で保存されたインスリン出発物質と比較した、インスリン球状小粒子の安定性のデータのチャートである。FIG. 33 is a chart of insulin spherical small particle stability data compared to an insulin starting material stored at 25 ° C. 図３４は、３７℃で保存されたインスリン出発物質と比較した、インスリン球状小粒子の安定性のデータのチャートである。FIG. 34 is a chart of insulin spherical small particle stability data compared to an insulin starting material stored at 37 ° C. 図３５は、２５℃で保存されたインスリン出発物質と比較した、インスリン球状小粒子の安定性のデータのチャートである。FIG. 35 is a chart of insulin spherical small particle stability data compared to an insulin starting material stored at 25 ° C. 図３６は、３７℃で保存されたインスリン出発物質と比較した、インスリン球状小粒子の安定性のデータのチャートである。FIG. 36 is a chart of insulin spherical small particle stability data compared to an insulin starting material stored at 37 ° C. 図３７は、Ｃｙｃｌｏｈａｌｅｒ ＤＰＩを使用する、インスリンの空気力学的な安定性の棒グラフである。FIG. 37 is a bar graph of insulin aerodynamic stability using the Cyclohaler DPI. 図３８は、Ｄａｎｅｓ球状小粒子の光学顕微鏡写真である。FIG. 38 is an optical micrograph of Danes spherical small particles. 図３９は、ＤＮａｓｅの酵素活性のチャートである。FIG. 39 is a chart of the enzyme activity of DNase. 図４０は、ＳＯＤ球状小粒子の光学顕微鏡写真である。FIG. 40 is an optical micrograph of SOD spherical small particles. 図４１は、ＳＯＤ球状小粒子についての酵素学的データのチャートである。FIG. 41 is a chart of enzymological data for SOD spherical small particles. 図４２ａ〜図４２ｂは、連続的乳化反応器の略図であり、図４２Ａは、乳化前に連続相または分散相に界面活性化合物が添加される場合の連続的乳化反応器の略図であり、そして図４２Ｂは、乳化後に連続相または分散相に界面活性化合物が添加される場合の連続的乳化反応器の略図である。42a-42b are schematic diagrams of a continuous emulsification reactor, FIG. 42A is a schematic diagram of a continuous emulsification reactor when a surface active compound is added to the continuous phase or dispersed phase prior to emulsification, and FIG. 42B is a schematic diagram of a continuous emulsification reactor when a surfactant compound is added to the continuous phase or dispersed phase after emulsification.

Claims (43)

実質的に非晶質のタンパク質微粒子の懸濁物を含有する微粒子の注射可能な組成物であって、該組成物が、１ｍｌの該組成物あたり少なくとも約５０ｍｇの該タンパク質の濃度を提供し、そして該タンパク質が、少なくとも約２５，０００ダルトンの分子量を有する、微粒子の注射可能な組成物。 An injectable composition of microparticles comprising a suspension of substantially amorphous protein microparticles, wherein the composition provides a concentration of at least about 50 mg of the protein per ml of the composition; And a microparticulate injectable composition, wherein the protein has a molecular weight of at least about 25,000 daltons. 前記タンパク質微粒子が、抗体を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the protein microparticles comprise antibodies. 前記タンパク質微粒子が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the protein microparticle is a monoclonal antibody. 前記タンパク質微粒子が、ミクロスフェアである、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the protein microparticles are microspheres. 前記タンパク質微粒子が、非結晶質である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the protein microparticles are amorphous. 前記タンパク質微粒子が、以下、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、トラップ分子、単鎖抗体、それらの組換え形態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるモノクローナル抗体構成要素を含む、請求項１に記載の組成物。 The protein microparticle comprises a monoclonal antibody component selected from the group consisting of a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, an antibody fragment, a trap molecule, a single chain antibody, a recombinant form thereof, and a combination thereof. A composition according to 1. 臨床的有効量の前記組成物のタンパク質が、約１０ｍｌ以下の該組成物中に分散される、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein a clinically effective amount of the protein of the composition is dispersed in about 10 ml or less of the composition. 一用量の前記組成物のタンパク質が、約１０ｍｌ以下の該組成物中に分散される、請求項６に記載の組成物。 7. The composition of claim 6, wherein a dose of the protein of the composition is dispersed in no more than about 10 ml of the composition. 前記タンパク質は、約５０ミクロン以下の平均粒子サイズを有し、かつ約５０ミクロン以下の平均粒子サイズを有し続け、そして前記注射可能な組成物が、２０ゲージまたはそれより細い注射針を通過する、請求項６に記載の組成物。 The protein has an average particle size of about 50 microns or less and continues to have an average particle size of about 50 microns or less, and the injectable composition passes through a 20 gauge or thinner needle. The composition according to claim 6. 前記微粒子が、約５０ミクロン以下の平均粒子サイズを有する結晶性の微粒子より速い、注射に対する溶解速度を示し、そして前記注射可能な組成物が、２０ゲージまたはそれより細い注射針を通過する、請求項１に記載の組成物。 The microparticles exhibit a faster dissolution rate for injection than crystalline microparticles having an average particle size of about 50 microns or less, and the injectable composition passes through a 20 gauge or thinner needle. Item 2. The composition according to Item 1. 少なくとも約９０％の前記タンパク質が、前記微粒子においてタンパク質として化学的にインタクトである、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein at least about 90% of the protein is chemically intact as a protein in the microparticle. 前記微粒子が、コーティングを含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the microparticle comprises a coating. 前記コーティングが、マトリックス内に前記微粒子をカプセル化する、請求項１２に記載の組成物。 13. The composition of claim 12, wherein the coating encapsulates the microparticles within a matrix. 前記コーティングが、多層の電解質によってカプセル化する、請求項１２に記載の組成物。 13. The composition of claim 12, wherein the coating is encapsulated by a multilayer electrolyte. 請求項１２に記載の組成物であって、前記微粒子が、賦形剤をさらに含む、組成物。 The composition according to claim 12, wherein the microparticles further comprise an excipient. 抗体を含むミクロスフェアであって、該抗体が、実質的に非晶質である、ミクロスフェア。 A microsphere comprising an antibody, wherein the antibody is substantially amorphous. 前記微粒子が、非結晶質である、請求項１６に記載の微粒子。 The fine particles according to claim 16, wherein the fine particles are amorphous. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１６に記載の微粒子。 The microparticle according to claim 16, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 前記微粒子が、約５０ミクロン以下の粒子サイズを有するミクロスフェアである、請求項１６に記載の微粒子。 17. The microparticle of claim 16, wherein the microparticle is a microsphere having a particle size of about 50 microns or less. 前記微粒子が、モノクローナル抗体、抗体、モノクローナル抗体フラグメント、トラップ分子、単鎖抗体、それらの組換え形態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるモノクローナル抗体を含む、請求項１６に記載の微粒子。 17. The microparticle of claim 16, wherein the microparticle comprises a monoclonal antibody selected from the group consisting of monoclonal antibodies, antibodies, monoclonal antibody fragments, trap molecules, single chain antibodies, recombinant forms thereof, and combinations thereof. 前記抗体が、少なくとも約２５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１６に記載の微粒子。 17. The microparticle of claim 16, wherein the antibody has a molecular weight of at least about 25,000 daltons. 前記微粒子が、コーティングを含む、請求項１６に記載の微粒子。 The microparticle of claim 16, wherein the microparticle comprises a coating. 前記コーティングが、マトリックス内に前記微粒子をカプセル化する、請求項２２に記載の微粒子。 23. The microparticle of claim 22, wherein the coating encapsulates the microparticle in a matrix. 前記コーティングが、多層の電解質によってカプセル化する、請求項２２に記載の微粒子。 23. The microparticle of claim 22, wherein the coating is encapsulated by a multilayer electrolyte. コーティングが、賦形剤によって前記微粒子をカプセル化する、請求項１６に記載の微粒子。 17. The microparticle of claim 16, wherein the coating encapsulates the microparticle with an excipient. 前記抗体が、前記ミクロスフェアの総重量に基づいて約２０重量％〜約１００重量％の該ミクロスフェアを含む、請求項１６に記載の微粒子。 17. The microparticle of claim 16, wherein the antibody comprises from about 20% to about 100% by weight of the microsphere based on the total weight of the microsphere. 高濃度において細いゲージの針での注射性能を有し、実質的に非晶質の抗体微粒子を含有する、組成物。 A composition having injection performance with a fine gauge needle at high concentrations and containing substantially amorphous antibody microparticles. 前記微粒子が、非結晶質である、請求項２７に記載の組成物。 28. The composition of claim 27, wherein the microparticles are amorphous. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２７に記載の組成物。 28. The composition of claim 27, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 前記微粒子が、約５０ミクロン以下の粒子サイズを有するミクロスフェアである、請求項２７に記載の組成物。 28. The composition of claim 27, wherein the microparticles are microspheres having a particle size of about 50 microns or less. タンパク質微粒子が、以下、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント、トラップ分子、それらの組換え形態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるモノクローナル抗体構成要素を含む、請求項２７に記載の組成物。 28. The composition of claim 27, wherein the protein microparticles comprise a monoclonal antibody component selected from the group consisting of a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody fragment, a trap molecule, a recombinant form thereof, and combinations thereof hereafter. object. 前記抗体が、少なくとも約２５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項２７に記載の組成物。 28. The composition of claim 27, wherein the antibody has a molecular weight of at least about 25,000 daltons. 請求項２７に記載の組成物であって、該組成物が、前記微粒子上にコーティングをさらに含む、組成物。 28. The composition of claim 27, wherein the composition further comprises a coating on the microparticles. 請求項２７に記載の組成物であって、前記微粒子が、賦形剤をさらに含む、組成物。 28. The composition of claim 27, wherein the microparticle further comprises an excipient. 微粒子を調製するプロセスであって、抗体構成要素と水溶性であるかまたは水混和性溶媒に可溶性であるポリマーとを水溶液中で混合して、実質的に非晶質の抗体構成要素の組成物を提供する工程、および該組成物から微粒子を形成する工程を包含する、プロセス。 A process for preparing microparticles, wherein an antibody component and a polymer that is water soluble or soluble in a water miscible solvent are mixed in an aqueous solution to form a substantially amorphous antibody component composition And a step of forming microparticles from the composition. 前記組成物の温度を変化させる工程をさらに包含する、請求項３５に記載のプロセス。 36. The process of claim 35, further comprising changing the temperature of the composition. 前記温度を変化させる工程が、前記組成物の温度を下げる、請求項３５に記載のプロセス。 36. The process of claim 35, wherein changing the temperature lowers the temperature of the composition. 前記温度を変化させる工程が、前記組成物の温度を上げる、請求項３５に記載のプロセス。 36. The process of claim 35, wherein changing the temperature raises the temperature of the composition. 前記微粒子を形成する工程が、前記組成物から前記ポリマーを除去する工程を包含する、請求項３５に記載のプロセス。 36. The process of claim 35, wherein forming the microparticles comprises removing the polymer from the composition. 前記抗体構成要素が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント、トラップ分子、それらの組換え形態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３５に記載のプロセス。 36. The process of claim 35, wherein the antibody component is selected from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, monoclonal antibody fragments, trap molecules, recombinant forms thereof, and combinations thereof. 抗体の高濃縮された組成物を注射器の針を通して投与するための方法であって、以下：
抗体とポリマーとを水溶液中で混合して、抗体溶液を提供する工程および該溶液から微粒子を形成する工程；
１ｍｌの組成物あたり少なくとも約５０ｍｇの抗体の濃度である約１０ｍｌ以下の懸濁物として細いゲージの針を有する注射器ユニット中に該微粒子を充填する工程；ならびに
該注射器を通して該懸濁物を注射することによって個体に該用量の該微粒子を投与する工程、
を包含する、方法。 A method for administering a highly concentrated composition of antibodies through a needle of a syringe, comprising:
Mixing an antibody and a polymer in an aqueous solution to provide an antibody solution and forming microparticles from the solution;
Filling the microparticles into a syringe unit having a fine gauge needle as a suspension of no more than about 10 ml at a concentration of at least about 50 mg antibody per ml composition; and injecting the suspension through the syringe Administering the dose of the microparticles to an individual by
Including the method. 前記抗体構成要素が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント、トラップ分子、それらの組換え形態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。 42. The method of claim 41, wherein the antibody component is selected from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, monoclonal antibody fragments, trap molecules, recombinant forms thereof, and combinations thereof. 前記充填する工程および投与する工程の針が、２０ゲージまたはそれより細い、請求項４１に記載の方法。 42. The method of claim 41, wherein the filling and dispensing needles are 20 gauge or thinner.
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