JP2007535507A - アルブミン結合体の精製方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により、アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液中において、非結合アルブミンからアルブミン結合体を分離する方法に関する。当該溶液は、高塩分含有量をもつ水性緩衝液中において平衡にある疎水性カラムに充填され、当該カラムに低減する塩濃度勾配を適用し、そして当該溶出されたアルブミン結合体を回収する。

Description

（ａ）技術分野
本出願は、アルブミン結合体及び非結合アルブミンの双方を含む溶液からアルブミン結合体を分離する精製方法に関する。
（ｂ）先行技術の記載
国際特許公開第ＷＯ９５／１０３０２号、及び同第ＷＯ９９／２４０７４号は、アルブミンの結合体の形成を記載し、ここで着目の分子はそれに結合する反応性官能基を有し、当該反応官能基はアルブミンに共有的に結合するように構成され、それ故、結合体を形成する。これらの結合体は、生体内で形成され得るが、同様に生体外でも形成され得る。生体外における当該結合体の形成は、アルブミン溶液への反応性官能基に結合する分子の付加を伴って生じる。この反応の主要最終産物は、非結合アルブミン、当該アルブミン結合体、及び当該反応性官能基に結合される未反応分子である。
アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液からアルブミン結合体を精製する方法を提供することが、非常に望まれる。
本発明の概要
本発明に関して、アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液中、非結合アルブミンからアルブミン結合体を分離する方法であって、以下のステップ：
ａ）高塩分含有量をもつ水性緩衝液中で、平衡にある疎水性固形支持体上に、当該溶液を充填し；
ｂ）当該支持体に低減する塩分含有量勾配を適用し；そして
ｃ）溶出されるアルブミン結合体を回収する、
を含む当該方法を提供する。
本発明の好ましい態様において、当該アルブミン結合体は、それに共有結合するマイケル受容体を有する分子から成り、当該マイケル受容体はアルブミンに結合する、そしてより好ましくは、当該結合は当該マイケル受容体とアルブミンのシステイン３４との間にある。
本発明のより好ましい態様において、当該マイケル受容体はマレイミド基であり、より好ましくは、当該マレイミド基はマレイミド−プロピオン酸（ＭＰＡ）である。当該マイケル受容体は、場合により、リンカーを介して当該分子と結合する。当該リンカーは、好ましくは、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、２−［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、アミノエトキシエチルアミノコハク酸（ＡＥＥＡＳ）の如きヒドロキシエチルモチーフ；グリシン、３−アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、オクタン酸（ＯＡ）、４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）の如き１又は複数のアルキル鎖（Ｃ１〜Ｃ１０）モチーフからなる群より選択される。より好ましいリンカーは、ＯＡ、ＡＤＥ、ＡＥＡ、ＡＥＥＡ、及びＡＥＥＡＳである。２つのリンカーの組み合わせも、例えば、ＡＥＥＡ−ＥＤＡ、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ、ＡＥＥＡＳ−ＡＥＥＡＳ、及びＡＥＡ−ＡＥＥＡの如く使用され得る。
本発明の好ましい態様において、当該アルブミンは、血清アルブミン、組換えアルブミン、及びゲノム源のアルブミンからなる群より選択される。
本発明の好ましい態様において、当該アルブミンは、ヒトアルブミン、ラットアルブミン、マウスアルブミン、ブタアルブミン、ウシアルブミン、イヌアルブミン、及びウサギアルブミンからなる群より選択され、より好ましくは、ヒト血清アルブミンである。
本発明の好ましい態様において、当該アルブミンは、脂肪酸、金属イオン、アルブミンに対し高親和力を有する小分子、及び非制限的にグルコース、ラクトース、及びマンノースの如き糖からなる群より選択される少なくとも１つで修飾される。
本発明の好ましい態様において、当該分子は、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小有機分子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。当該ペプチドは、選択的に、少なくとも５７ダルトンの分子量を有する。当該ペプチドは、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＡＮＰ、Ｋ５、ダイノルフィン、ＧＲＦ、インシュリン、ナトリウム利尿ペプチド、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｃ−３４、及びＰＹＹを非制限的に含むことを意図される。当該小有機分子は、ビノレルビン、ゲムシタビン、及びパクリタキセルを非制限的に含むことを意図される。本発明のより好ましい態様において、当該分子がＤＮＡ、ＲＮＡ又は小有機分子であるとき、当該分子は、酸感受性共有結合又は蛋白質分解的開裂の影響を受けやすいペプチド配列を介して当該アルブミンに共結合し、それにより、アルブミンからの当該分子の分離、及び細胞内への当該分子の侵入が可能となる。
本発明の好ましい態様において、当該疎水性固形支持体は、疎水性樹脂を含むカラムであって、ここで、当該疎水性樹脂は、非制限的に、オクチルセファロース、フェニルセファロース、及びブチルセファロース、そしてより好ましくはブチルセファロースである。
本発明の他の態様において、疎水性固形支持体は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３Ｇ−Ａの如き疎水性リガンド、ポリスチレン／ジビニルベンゼン基質の如き支持体に関連するエーテル又はイソプロピル基を含む。
物質は、非荷電基質に固定化された疎水性リガンドとの疎水性相互作用の様々な強度に基づいて分離される。この技術は、出発緩衝剤において、中程度に高い塩濃度（１Ｍ）で、通常、実施される（塩が吸着作用を促進する）。溶出は、塩濃度において直線的又は段階的な低減により実施される。
当該吸着過程において使用される、リガンドの型、置換の程度、ｐＨ及び型及び塩濃度は、ＨＩＣ基質（疎水性相互作用クロマトグラフィー基質）の全体的性能（例えば、選択性及び限度容量）に関する多大な影響を有する。
当該溶媒は、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）における限度容量及び選択性に影響を与える最も重要なパラメーターの内の１つである。一般的に、当該吸着過程は、脱着過程より、より選択性が高い。それ故、ｐＨ、溶媒の型、塩の型、及び塩濃度に関して、当該出発緩衝剤を最適化することが重要である。当該サンプルに対する様々な「塩析」塩の付加は、ＨＩＣにおけるリガンド−蛋白質相互作用を促進する。塩濃度を増大するにつれて、結合蛋白質の量は、当該蛋白質の沈殿点まで増大される。塩の各型は、疎水性相互作用を促進する能力において異なる。疎水性相互作用に関する異なる塩の影響は、以下のよく知られたホフマイスター系列に従う。
Figure 2007535507
塩析効果の増大は疎水性相互作用を強め、一方、カオトロピック効果の増大はそれらを弱める。それ故、硫酸アンモニウムは、塩化ナトリウムより、より強い塩析効果を示す。ＨＩＣ用に通常使用される塩は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、硫酸ナトリウム（（Ｎａ）２ＳＯ４）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳ０４）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、及び酢酸アンモニウム（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）である。
ＨＩＣ吸着剤に結合する蛋白質は、中程度から高濃度の「塩析」塩により促進され、その多くは、天然球状タンパク質からのそれらの選択的排斥に起因して、蛋白質構造に関する安定化作用も有する、すなわち、当該塩と当該蛋白質表面との相互作用は熱力学的に不利である。当該塩濃度は、さらに低いリガンド−蛋白質相互作用を促進するために十分に高くあるべき（例えば、５００〜１０００ｍＭ）であるが、当該サンプル中の蛋白質の沈殿を生ずるより低くあるべきである。アルブミンの場合、当該塩濃度は、３Ｍ（モル／リットル）より低く保つべきである。当該塩析の主要機構は、水の表面張力の塩誘導増大からなる（Ｍｅｌａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｖａｔｈ，１９７７）。それ故、小型構造はエネルギー的により有利である、なぜならば、それはより小さい蛋白質−溶液の界面積と対応するからである。
興味深いことに、我々は、同条件下（すなわち、いずれかの対イオンを有するＳＯ４ ２−、ＰＯ４ ２−又はＣＨ３ＣＯＯ−からなる緩衝剤）、これらの塩が、非結合アルブミン（すなわち、メルカプトアルブミン、及びシステインでキャップされたアルブミン）と異なる方法で、本明細書中に記載の原則的に全ての結合アルブミンに関するそれらの塩析効果を示し、それ故、結合アルブミン対非結合アルブミン間の一貫したクロマトグラフ分離を可能とすることを見出した。すなわち、我々は、リガンドと非結合アルブミンとの間の相互作用よりリガンドと結合アルブミンとの間の相互作用を促進するために、より低い塩濃度が必要とされることを観察した。このクロマトグラフ分離は、（ａ）アルブミンの配列（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）、（ｂ）アルブミンの起源（すなわち、血しょう由来又は組み換え型）、（ｃ）当該結合分子の分子量、（ｄ）当該分子構造内のマイケル受容体（又はマレイミド基）の位置、（ｅ）ペプチド配列又は当該分子の化学的構造、及び（ｆ）結合分子の三次元構造、例えば、直線状対ループ構造に本質的に依存する。
本発明の好ましい態様において、当該水性緩衝液の塩は、十分な塩析効果を有する。十分な塩析効果を提供するために、当該塩は、好ましくは、非制限的に、リン酸塩、硫酸塩、及び酢酸塩である。より好ましくは、当該塩は、リン酸塩又は硫酸塩である。当該緩衝剤の陽イオンの選択は、あまり気にかけなくともよく、それ故、そのような陽イオンは、ＮＨ４ ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｍｇ２＋、及びＢａ２＋からなる群より非制限的に選択され得る。
当該水性緩衝液は、好ましくは、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びリン酸マグネシウムであり、さらに好ましくは、硫酸アンモニウムである。
本発明の好ましい態様において、当該緩衝剤のｐＨは、３．０〜９．０であり；よりさらに好ましくは、６．０〜８．０であり、及びさらに好ましくは、当該ｐＨは７．０である。
本発明の好ましい態様において、当該緩衝剤及び疎水性固形支持体は、室温（約２５℃）又は４℃又はその間である。
表１は、ブチルセファロース樹脂を使用して、ＨＳＡ溶液から予備成形されたＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体結合体の精製のために、様々な塩の効果の例を示す（当該第１ＧＬＰ−１類似体の構造を、下記実施例１において記載する。）。
Figure 2007535507
当該用語「ペプチド」は、少なくとも５７キロダルトンの分子量を有するアミノ酸配列を意味することを意図される。当該ペプチド配列は、ＡＮＰの如き環状（ループ構造）となり得、インシュリンの如き複数のアミノ酸鎖を含み得、又はＫ５、ダイノルフィンＡ、Ｃ−３４、及びＧＬＰ−１の如き直線状を含み得る。
本明細書中の全引用文献の全内容を本願明細書中に援用する。
本発明の好ましい態様における詳細な説明
本発明に関して、アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液からアルブミン結合体の精製方法を提供する。
方法
対照（非結合）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及び予備形成アルブミン結合体の製造
マイケル受容体を有する各化合物を、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水中に（又は、もし当該化合物が難溶性であればＤＭＳＯ中に）１０ｍＭの濃度で可溶性にし、次いでＨＳＡの溶液（２５％，２５０ｍｇ／ｍｌ，Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の中へ１ｍＭまで希釈した。次いで、当該サンプルを３７℃で３０分間培養した。それらの精製に先立ち、各結合体溶液を、５ｍＭのオクタン酸ナトリウムからなる２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７）中、５％、５０ｍｇ／ｍｌＨＳＡまで希釈した。溶出勾配において使用される初期塩濃度は、当該混合溶液を希釈するための緩衝剤に追加され得る。好ましくは、当該塩の初期濃度は、約７５０〜約１７００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４である。
好ましい態様による精製手順
ＡＫＴＡ精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、各結合体を、２．５ｍｌ／分の流速で、５ｍＭのオクタン酸ナトリウム、及び７５０ｍＭ〜１．７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４からなる２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７）において平衡化されたブチルセファロース ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上に充填した。これらの条件下、非結合ＨＳＡと比較して２ｋＤａ超の分子量の追加を有するＨＳＡ結合体は、疎水性樹脂上に吸着され、一方、ほぼ全ての非結合ＨＳＡは、当該カラムの空隙用量の範囲内で溶出される。２ｋＤａ未満の分子量の追加について、より高い初期塩含有量が使用され得、その後、塩を低減する段階的勾配が使用される。各結合体を、４カラム容量にわたり、塩の連続的又は非連続的低減勾配（７５０〜０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）を適用することにより、さらに精製した。好ましい態様において、次いで、各精製された結合体を、脱塩し、そして、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心ろ過装置（３０ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用することにより、ダイアフィルトレーションにより濃縮した。最終的に、長期保存の間、各結合体溶液は、好ましくは、液体窒素中に浸し、及びＬａｂｃｏｎｃｏ凍結乾燥システム［ＦｒｅｅＺｏｎｅ（登録商標）４．５］を使用して凍結乾燥され、そして、−２０℃で保存される。
ＬＣ／ＥＭＳ分析の実施例
精製後、各結合体サンプルの１μｌは、好ましくは、ＬＣ／ＥＭＳ系に投入される。当該ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体を、システイン３４が遊離チオール型であるメルカプトアルブミン（６６，４４８Ｄａ）、プラス第１ＧＬＰ−１類似体のたった１つの分子量（３７１９．９Ｄａ）に相当する７０，１６０Ｄａの全容量を有する最も高い存在量の一種の検出より確認した。当該第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の構造は、下記の実施例１に記載される。この事を表２に示す。
Figure 2007535507
当該ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）結合体を、システイン３４が遊離チオール型であるメルカプトアルブミン（６６，４４８Ｄａ）、プラス第１ＧＲＦ類似体のたった１つの分子量（３６４８．２Ｄａ）に相当する７０，０８６Ｄａの全容量を有する最も高い存在量の一種の検出より確認した。当該第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）の構造は、下記の実施例２に記載される。この事を表３に示す。
Figure 2007535507
下記の実施例は、アルブミンと結合し本発明の方法により精製された、マイケル受容体のようなマレイミド基を有するいくつかの化合物を示す。
当該以下の実施例は、本発明を例証する目的であり、その範囲を限定するものではない。
当該以下の実施例において、勾配番号は、以下の勾配の詳細を言及し、ここでＣＶは、５０ｍｌのカラム容量を意味する。
勾配＃１：直線状７５０〜０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、４ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃２：段階的勾配１．７５Ｍ〜１．２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、０．５ＣＶに渡り、その後１．２Ｍ〜８７５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、５ＣＶに渡り、そして最後に８７５ｍＭ〜０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、０．５ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃３：直線状９００〜０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、４ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃４：段階的勾配１．５Ｍ〜１．１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、０．５ＣＶに渡り、その後１．１Ｍ〜３７５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、６ＣＶに渡り、そして最後に３７５ｍＭ〜０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、０．５ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃５：直線状７５０〜０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、２ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃６：段階的勾配１．７５Ｍ〜０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、６ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
勾配＃７：直線状７５０〜０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４であって、６ＣＶに渡り、２．５ｍｌ／分の流速。
実施例１
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、ｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１において、当該精製された結合体画分を、（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を低減する勾配間で、画分Ｂ（Ｆ８−９）として溶出し、一方、非結合アルブミンは、当該カラムの空隙容量の範囲内で溶出する（画分Ａ）。当該結合体画分を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）の３０ｋＤａろ過材で濃縮し、ＬＣ−ＥＭＳを使用して分析した。
実施例２
ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）結合体の精製
当該第１ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ｄＡｌａ２Ｇｌｎ８Ａｌａ１５Ｌｅｕ２７Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２において、当該精製された結合体画分は画分Ｂ（Ｆ６−Ｆ７）に現れ、一方、非結合アルブミンは、当該カラムの空隙容量の範囲内で溶出する（画分Ａ）。当該結合体画分を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）の３０ｋＤａろ過材で濃縮し、ＬＣ−ＥＭＳを使用して分析した。
実施例３
非結合ＨＳＡの１ｍｌの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤（ｐＨ７．０）の９ｍｌ中に希釈された１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌの非結合ＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。ほぼ全てのアルブミン分子が当該空隙容量内で溶出し、そして、蛋白質種は、（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配の間、２８０ｎｍで観察されなかった。図３は、得られた分離曲線を示す。
実施例４
ｒＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列を実施例１に示す。
５ｍｌ、５％のｒＨＳＡ（組み換え型ＨＳＡ、ｎｅｗ ｃｅｎｔｕｒｙ 培養グレード）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤５ｍｌ中に希釈された２００μＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４において、当該精製された結合体画分は画分Ｂ（Ｆ７−Ｆ８−Ｆ９）に現れる。
実施例５
ＨＳＡの１０ｍｌの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤の４０ｍｌ中に希釈された１０ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。ほぼ全てのアルブミン分子が、空隙容量内で溶出し、そして、蛋白質種は、（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配の間、２８０ｎｍで観察されなかった。図５は、得られた分離曲線を示す。
実施例６
ＨＳＡ：Ｋ５類似体（配列番号３）結合体の精製
当該Ｋ５類似体は、Ａｃ−Ｋ５Ｌｙｓ８（ε−ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
４ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１６ｍｌ中に希釈された１ｍＭのＫ５類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６において、当該精製された結合体画分は、アルブミンとともに画分Ａに、及び画分Ｂ（Ｆ６−Ｆ７−Ｆ８）に現れる。
実施例７
ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）結合体の精製
当該第１インシュリン誘導体は、Ｂ１の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、以下の図１に表される。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７において、当該精製された結合体画分は画分Ｂ（Ｆ６−Ｆ７−Ｆ８）に現れる。
実施例８
ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）結合体の精製
当該第２インシュリン誘導体は、Ａ１の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、上記実施例７における図１に表される。
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図８において、当該精製された結合体画分は画分Ｂ（Ｆ６−Ｆ７−Ｆ８）に現れる。
実施例９
ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）結合体の精製
当該第１Ｃ３４類似体は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−Ｃ３４−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図９において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例１０
ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号７）結合体の精製
当該第２Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１０において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例１１
ＨＳＡ：第３Ｃ３４類似体（配列番号８）結合体の精製
当該第３Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ１３（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１１において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例１２
ｌ−システインの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤の２ｍｌ中のｌ−システインの１２１ｍｇの精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１２は、得られた分離曲線を示し、ここで、Ｌ−システインは当該カラムの空隙容量範囲内で溶出する（Ｆ３）。
実施例１３
Ｌ−システイン：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列を、実施例１において示す。
１２１ｍｇのＬ−システインと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２ｍｌ中に希釈された３６．３６ｍｇの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１３は、得られた分離曲線を示し、ここで、余分なＬ−システインはＦ３に溶出され（カラム空隙容量）、当該Ｌ−システイン：第１ＧＬＰ−１類似体結合体は、０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４において、溶出する。
実施例１４
ＨＳＡ：第２ＧＬＰ−１Ｆ類似体（配列番号９）結合体の精製
当該第２ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１４において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例１５
ＨＳＡ：第３ＧＬＰ−１類似体（配列番号１０）結合体の精製
当該第３ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の緩衝剤１０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１５において、当該精製された結合体画分は、画分Ｆ２に現れる。
実施例１６
ＨＳＡ：第４ＧＬＰ−１類似体（配列番号１１）結合体の精製
当該第４ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ２６（ε−ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第４ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１６において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例１７
ＨＳＡ：第５ＧＬＰ−１類似体（配列番号１２）結合体の精製
当該第５ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３４（ε−ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第５ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１７において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例１８
ＨＳＡ：第１エキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）類似体（配列番号１３）結合体の精製
当該第１エキセンディン−４類似体は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４−（１−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１エキセンディン−４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１８において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例１９
ＨＳＡ：第２エキセンディン類似体（配列番号１４）結合体の精製
当該第２エキセンディン−４類似体は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４（９−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
３．５ｍｌ、２５％のＨＳＡ Ｃｏｒｔｅｘと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２１．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２エキセンディン−４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図１９において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例２０
ＨＳＡ：ＭＰＡの精製
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された２ｍＭのＭＰＡとの反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２０において、当該メルカプトアルブミンの画分は画分Ａ（Ｆ５）に現れ、キャップド（ｃａｐｐｅｄ）アルブミンは、画分Ｂ（Ｆ７−Ｆ８）に現れる。当該結合体画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）の３０ｋＤａろ過材で濃縮した。
実施例２１
ＨＳＡの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。勾配＃１及び＃５とは違い、勾配＃２を使用するとき、複合アルブミン及び非結合アルブミンの双方は、サンプルの充填の間、当該疎水性樹脂上に吸着する。図２１は、Ｆ４及びＦ５がメルカプトアルブミンの豊富な場合、並びにＦ６、Ｆ７、及びＦ８がキャップドアルブミンの豊富な場合に得られた分離曲線を示す。
実施例２２
ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号３）結合体の精製
当該第２Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その構造は実施例１０に示される。
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２２において、メルカプトアルブミンは画分Ａ（Ｆ５）に現れ、そしてキャップドアルブミン及び精製された複合アルブミンは、画分Ｂ（Ｆ７−Ｆ８）に現れる。
実施例２３
ＨＳＡ：第１ダイノルフィンＡ類似体（配列番号１５）結合体の精製
当該第１ダイノルフィンＡ類似体は、ＤｙｎＡ（１−１３）（ＭＰＡ）−ＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ダイノルフィンＡ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２３において、当該精製された複合画分は画分Ａ（Ｆ１１−Ｆ１２）に現れる。
実施例２４
ＨＳＡ：第１ＡＮＰ類似体（配列番号１６）結合体の精製
当該第１ＡＮＰ類似体は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−ＡＮＰ（９９−１２６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＡＮＰ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２４において、当該精製された複合画分は画分Ａ（Ｆ１４）に現れる。
実施例２５
ＨＳＡ：第２ダイノルフィン類似体（配列番号１７）結合体の精製
当該第２ダイノルフィン類似体は、ＤｙｎＡ（７−１３）Ｌｙｓ１３（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２ダイノルフィンＡ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２５において、当該精製された複合画分は画分Ａ（Ｆ９）に現れる。
実施例２６
ＨＳＡ：ＡＣＥ阻害剤（配列番号１８）結合体の精製
本実施例に使用されるＡＣＥ阻害剤は、アセチル−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−シクロヘキシルスタチル（ｓｔａｔｙｌ）−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭのＡＣＥ阻害剤との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃２を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２６において、当該精製された複合画分は画分Ａ（Ｆ１４）に現れる。
実施例２７
ＨＳＡ：第６ＧＬＰ−１類似体（配列番号１９）結合体の精製
当該第６ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ２３（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第６ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２７において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例２８
ＨＳＡ：第７ＧＬＰ−１類似体（配列番号２０）結合体の精製
当該第７ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ１８（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第７ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２８において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例２９
ＨＳＡ：第８ＧＬＰ−１類似体（配列番号２１）結合体の精製
当該第８ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ２６（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第８ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図２９において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３０
ＨＳＡ：第９ＧＬＰ−１類似体（配列番号２２）結合体の精製
当該第９ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３７）Ｌｙｓ２７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第９ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３０において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３１
ＨＳＡ：第１０ＧＬＰ−１類似体（配列番号２３）結合体の精製
当該第１０ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１０ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３１において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３２
ＨＳＡ：第１１ＧＬＰ−１類似体（配列番号２４）結合体の精製
当該第１１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３２において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３３
ＨＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）結合体の精製
当該第３エキセンディン−４類似体は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４−（１−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３エキセンディン−４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３３において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３４
ＨＳＡ：第１２ＧＬＰ−１類似体（配列番号２６）結合体の精製
当該第１２ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）Ｌｙｓ３４（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の構造を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１２ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３４において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３５
ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）結合体の精製
当該第１インシュリン誘導体は、Ｂ１の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、その構造を実施例７において詳述する。
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３５において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３６
ＨＳＡ：第３インシュリン誘導体（配列番号２７）結合体の精製
当該第３インシュリン誘導体は、Ｂ１の位置上でＯＡ−ＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
４ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２１ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３６において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３７
ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）結合体の精製
当該第２インシュリン誘導体は、Ａ１の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３７において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３８
ＨＳＡ：第４インシュリン誘導体（配列番号２８）結合体の精製
当該第４インシュリン誘導体は、Ｂ２９の位置上でＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、実施例７に示される図１において表される。
３ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第４インシュリン誘導体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３８において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例３９
ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）結合体の精製
当該第１ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ｄＡｌａ２Ｇｌｎ８Ａｌａ１５Ｌｅｕ２７Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列を実施例２において示す。
３．７ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図３９において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例４０
ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）結合体の精製
当該第２ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第２ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４０において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例４１
ＨＳＡ：第３ＧＲＦ類似体（配列番号３０）結合体の精製
当該第３ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ｄＡｌａ２Ｇｌｎ８ｄＡｒｇ１１Ａｌａ１５Ｌｅｕ２７Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第３ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４１において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例４２
ＨＳＡ：第４ＧＲＦ類似体（配列番号３１）結合体の精製
当該第４ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ｄＡｌａ２Ｌｙｓ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％のＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第４ＧＲＦ類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４２において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例４３
ＨＳＡ：第１３ＧＬＰ−１類似体 ＣＪＣ １３６５（配列番号３２）結合体の精製
当該第１３ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（９−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
３．５ｍｌ、２５％のＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２１．５ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１３ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４３において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例４４
ＨＳＡラクトース：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は上記実施例１において示される。
４ｍｌ、２５％のラクトサミネート（ｌａｃｔｏｓａｍｉｎａｔｅ）されたアルブミン（３７℃、ｐＨ７．０で過剰なラクトースと予備培養されたＨＳＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成された緩衝剤の４ｍｌ中の２００μＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４４において、当該精製されたラクトサミネート複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例４５
ＨＳＡ：第１Ｔ２０類似体（配列番号３３）結合体の精製
当該第１Ｔ２０類似体は、Ａｃ−Ｔ２０（１−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０ｍｌ中の１ｍＭの第１Ｔ２０類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４５において、当該精製された複合画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例４６
ＨＳＡ：第１Ｔ１２４９類似体（配列番号３４）結合体の精製
当該第１Ｔ１２４９類似体は、Ａｃ−Ｔ１２４９（１−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１０．５ｍｌ中の１ｍＭの第１Ｔ１２４９類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４６において、当該精製された複合画分は画分Ｆ４に現れる。
実施例４７
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８−Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、この配列は、実施例１において示される。
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１２．５ｍｌ中の第１ＧＬＰ−１類似体の予備成形された結合体の１１４．４５ｍｇの精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４７は、画分Ｆ２において見出された当該結合体と共に得られた分離曲線を示す。
実施例４８
ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）の精製
当該第１Ｃ３４類似体は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−Ｃ３４−ＣＯＮＨ２であり、この配列は、実施例９において示される。
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１２．５ｍｌ中の第１Ｃ３４類似体の予備成形された結合体の１１４．４５ｍｇの精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４８は、画分Ｆ２において見出された当該結合体と共に得られた分離曲線を示す。
実施例４９
ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）の精製
当該第２ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ（１−２９）ＬＹＳ３０（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、この配列は、上記実施例４０において示される。
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０の、１２．５ｍｌ中の第２ＧＲＦ類似体の予備成形された結合体の１２５．５３ｍｇの精製を、上記勾配＃５を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図４９は、画分Ｆ２において見出された当該結合体と共に得られた分離曲線を示す。
実施例５０
ＨＳＡ：ビノレルビン類似体（配列番号３５）結合体の精製
当該ビノレルビン類似体は、以下の構造中に示されるように、それに結合するＡＥＥＡ−ＭＰＡを有するビノレルビン類似体である。
Figure 2007535507
２．５ｍｌ、２５％のＨＳＡ、及び２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成されたｐＨ７．０の緩衝剤の２２．５ｍｌ中における１ｍＭのビノレルビン類似体から生成された結合体の精製を、上記勾配＃４を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５０において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。当該結合体画分を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）の３０ｋＤａろ過材で濃縮した。
実施例５１
Ｌ−システインの精製
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１５００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の２２．５ｍｌ中の２．５ｍｌ、４０ｍＭのＬ−システインの精製を、上記勾配＃４を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５１において、当該カラムの空隙容量の範囲内において溶出するＬ−システインと共に得られた分離曲線を示す。
実施例５２
Ｌ−システイン：ビノレルビン類似体（配列番号３５）結合体の精製
当該ビノレルビン類似体は、実施例５０に示される構造中に示されるように、それに結合するＡＥＥＡ−ＭＰＡを有するビノレルビンの分子である。
２．５ｍｌ、４０ｍＭのＬ−システインと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４２２．５ｍｌ中の１ｍＭのビノレルビン類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃４を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５２において、画分Ｆ８、Ｆ９、及びＦ１０の範囲内の当該Ｌ−システイン結合体の溶出と共に得られる分離曲線を示す。
実施例５３
ＲＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）結合体の精製
当該第３エキセンディン−４類似体は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４−（１−３９）Ｌｙｓ４０（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は実施例３３に示される。
１１ｍｌ、５％のＲＳＡ（ラット血清アルブミン）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１１ｍｌ中の２００μＭの第３エキセンディン−４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５３において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例５４
ＨＳＡ：第４Ｃ３４類似体（配列番号３６）結合体の精製
当該第４Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ１３（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第４Ｃ３４類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５４において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例５５
ＨＳＡ：第５Ｃ３４類似体（配列番号３７）結合体の精製
当該第５Ｃ３４類似体は、Ｃ３４（１−３４）Ｌｙｓ３５（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第５Ｃ３４類似体とから生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５５において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例５６
ＨＳＡ：第６Ｃ３４類似体（配列番号３８）結合体の精製
当該第６Ｃ３４類似体は、ＭＰＡ−Ｃ３４（１−３４）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第６Ｃ３４類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５６において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例５７
ＨＳＡ：第７Ｃ３４類似体（配列番号３９）結合体の精製
当該第７Ｃ３４類似体は、Ａｃ−Ｃ３４（１−３４）Ｇｌｕ２Ｌｙｓ６Ｌｙｓ７Ｇｌｕ９Ｇｌｕ１０Ｌｙｓ１３Ｌｙｓ１４Ｇｌｕ１６Ｇｌｕ１７Ｌｙｓ２０Ｌｙｓ２１Ｇｌｕ２３Ｇｌｕ２４Ｌｙｓ２７Ｇｌｕ３１Ｌｙｓ３４Ｌｙｓ３５Ｌｙｓ３６（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第７Ｃ３４類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５７において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例５８
ＨＳＡ：第８Ｃ３４類似体（配列番号４０）結合体の精製
当該第８Ｃ３４類似体は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−Ｃ３４（１−３４）Ｇｌｕ２Ｌｙｓ６Ｌｙｓ７Ｇｌｕ９Ｇｌｕ１０Ｌｙｓ１３Ｌｙｓ１４Ｇｌｕ１６Ｇｌｕ１７Ｌｙｓ２０Ｌｙｓ２１Ｇｌｕ２３Ｇｌｕ２４Ｌｙｓ２７Ｇｌｕ３１Ｌｙｓ３４Ｌｙｓ３５−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１３ｍｌ中の１ｍＭの第８Ｃ３４類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５８において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例５９
ＨＳＡ：第１ＰＹＹ類似体（配列番号４１）結合体の精製
当該第１ＰＹＹ類似体は、ＰＹＹ（３−３６）Ｌｙｓ４（ε−ＯＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
１．５ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の６ｍｌ中の１ｍＭの第１ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図５９において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６０
ＨＳＡ：第２ＰＹＹ類似体（配列番号４２）結合体の精製
当該第２ＰＹＹ類似体は、ＭＰＡ−ＯＡ−ＰＹＹ（３−３６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
１．５ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の６ｍｌ中の１ｍＭの第２ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６０において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６１
ＨＳＡ：第５インシュリン誘導体（配列番号４３）結合体の精製
当該第５インシュリン誘導体は、Ｂ２９の位置上においてＡＥＥＡＳ−ＡＥＥＡＳ−ＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１５ｍｌ中の１ｍＭの第５インシュリン誘導体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６１において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６２
ＨＳＡ：第６インシュリン誘導体（配列番号４４）結合体の精製
当該第６インシュリン誘導体は、Ｂ１の位置上においてＡＥＥＡＳ−ＡＥＥＡＳ−ＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１５ｍｌ中の１ｍＭの第６インシュリン誘導体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６２において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６３
ＨＳＡ：第７インシュリン誘導体（配列番号４５）結合体の精製
当該第７インシュリン誘導体は、Ｂ２９の位置上においてＯＡ−ＭＰＡを有するヒトインシュリンであり、上記実施例７に示される図１において表される。
２ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１５ｍｌ中の１ｍＭの第７インシュリン誘導体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６３において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６４
ＨＳＡ：第３ＰＹＹ類似体（配列番号４６）結合体の精製
当該第３ＰＹＹ類似体は、ＭＰＡ−ＰＹＹ（３−３６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
３ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１８ｍｌ中の１ｍＭの第３ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６４において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６５
ＨＳＡ：第４ＰＹＹ類似体（配列番号４７）結合体の精製
当該第４ＰＹＹ類似体は、ＭＰＡ−ＰＹＹ（３−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
３ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１８ｍｌ中の１ｍＭの第４ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６５において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６６
ＨＳＡ：第５ＰＹＹ類似体（配列番号４８）結合体の精製
当該第５ＰＹＹ類似体は、ＭＰＡ−ＰＹＹ（２２−３６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
６ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の３６ｍｌ中の１ｍＭの第５ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６６において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６７
ＨＳＡ：第６ＰＹＹ類似体（配列番号４９）結合体の精製
当該第６ＰＹＹ類似体は、Ａｃｅｔｙｌ−ＰＹＹ（２２−３６）Ｌｙｓ３７（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
６ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の３６ｍｌ中の１ｍＭの第６ＰＹＹ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６７において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６８
ＨＳＡ：第２ＡＮＰ類似体（配列番号５０）結合体の精製
当該第２ＡＮＰ類似体は、ＭＰＡ−ＡＮＰ（９９−１２６）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１４ｍｌ中の１ｍＭの第２ＡＮＰ類似体との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６８において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例６９
ＨＳＡ：第３ＡＮＰ類似体（配列番号５１）結合体の精製
当該第３ＡＮＰ類似体は、Ｓｅｒ９９と結合するＭＡＬ−ｄＰＥＧ４（登録商標）（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ，ＵＳＡ）と反応されるＡＮＰ（９９−１２６）である。当該得られたＡＮＰ類似体は、ＭＰＡ−ＥＥＥＥＰ−ＡＮＰ（９９−１２６）であって、ここでＥＥＥＥＰは、エトキシ・エトキシ・エトキシ・エトキシプロピオン酸であり、当該ＡＮＰ類似体は以下の配列を有する。
Figure 2007535507
１ｍｌ、２５％のＨＳＡと、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び９００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の１４ｍｌ中の１ｍＭのＣＪＣ１６８１との反応から生成された結合体の精製を、上記勾配＃３を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図６９Ａ及び６９Ｂにおいて、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例７０
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１．７５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃６を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７０において、当該精製された結合体画分は画分Ｂに現れる。
実施例７１
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１．７５Ｍの硫酸マグネシウムの９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃６を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７１において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例７２
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
７５０ｍＭの硫酸アンモニウムの例において、１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７２において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例７３
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
１．７５Ｍのリン酸アンモニウムの例において、１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び１．７５Ｍのリン酸アンモニウムの９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃６を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７３において、当該精製された結合体画分は画分Ｂに現れる。
実施例７４
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１（７−３６）ｄＡｌａ８Ｌｙｓ３７（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例１において示される。
７５０ｍＭのリン酸アンモニウムの例において、１ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭのリン酸アンモニウムの９ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−１類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７４において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例７５
ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−２類似体は、ＧＬＰ−２（１−３３）Ｇｌｙ２Ｌｙｓ３４（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、以下の配列を有する。
Figure 2007535507
２ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤の１４ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−２類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７５において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
実施例７６
ＲＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）結合体の精製
当該第１ＧＬＰ−２類似体は、ＧＬＰ−２（１−３３）Ｇｌｙ２Ｌｙｓ３４（ε−ＭＰＡ）−ＣＯＮＨ２であり、その配列は、上記実施例７５に示される。
９ｍｌ、２５％、２５０ｍｇ／ｍｌのＲＳＡ（ラット血清アルブミン）と、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）、５ｍＭのカプリル酸ナトリウム、及び７５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４から作成される緩衝剤の１４ｍｌ中に希釈された１ｍＭの第１ＧＬＰ−２類似体との反応により生成された結合体の精製を、上記勾配＃１を使用して、ブチルセファロースのカラムで実施した。図７６において、当該精製された結合体画分は画分Ｆ２に現れる。
本発明はそれらの特定の態様に関連して記載されるが、さらなる改良が可能であり、本出願は、一般的に、本発明の原則に加えて、本発明のいずれの変更、使用又は適応をも含むことを意図され、本発明の属する分野において知られた又は慣習的な手順に含まれるくらい近いような、及び上記の本質的特徴に適用され得るような、並びに当該添付の請求項の範囲に含まれるような本発明の開示からの出発物の如きものを含むと理解されるだろう。
図１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）の精製を示す。 図３は、本発明の方法の好ましい態様による、非結合ＨＳＡの精製を示す。 図４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ｒＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図５は、本発明の方法の好ましい態様による、ＨＳＡｃｏｒｔｅｘの精製を示す。 図６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：Ｋ５類似体（配列番号３）の精製を示す。 図７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）の精製を示す。 図８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）の精製を示す。 図９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）の精製を示す。 図１０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号７）の精製を示す。 図１１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３Ｃ３４類似体（配列番号８）の精製を示す。 図１２は、本発明の方法の好ましい態様によるＬ−システインの精製を示す。 図１３は、本発明の方法の好ましい態様による、Ｌ−システイン：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図１４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＧＬＰ−１類似体（配列番号９）の精製を示す。 図１５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＧＬＰ−１類似体（配列番号１０）の精製を示す。 図１６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＧＬＰ−１類似体（配列番号１１）の精製を示す。 図１７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５ＧＬＰ−１類似体（配列番号１２）の精製を示す。 図１８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１エキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４類似体（配列番号１３）の精製を示す。 図１９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２エキセンディン−４類似体（配列番号１４）の精製を示す。 図２０は、本発明の方法の好ましい態様によるＨＳＡ：ＭＰＡの精製を示す。 図２１は、本発明の方法の好ましい態様によるＨＳＡの精製を示す。 図２２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２Ｃ３４類似体（配列番号３）の精製を示す。 図２３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ダイノルフィンＡ類似体（配列番号１５）の精製を示す。 図２４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＡＮＰ類似体（配列番号１６）の精製を示す。 図２５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ダイノルフィンＡ類似体（配列番号１７）の精製を示す。 図２６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：ＡＣＥ阻害剤（配列番号１８）の精製を示す。 図２７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６ＧＬＰ−１類似体（配列番号１９）の精製を示す。 図２８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第７ＧＬＰ−１類似体（配列番号２０）の精製を示す。 図２９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第８ＧＬＰ−１類似体（配列番号２１）の精製を示す。 図３０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第９ＧＬＰ−１類似体（配列番号２２）の精製を示す。 図３１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１０ＧＬＰ−１類似体（配列番号２３）の精製を示す。 図３２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１１ＧＬＰ−１類似体（配列番号２４）の精製を示す。 図３３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）の精製を示す。 図３４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１２ＧＬＰ−１類似体（配列番号２６）の精製を示す。 図３５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１インシュリン誘導体（配列番号４）の精製を示す。 図３６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３インシュリン誘導体（配列番号２７）の精製を示す。 図３７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２インシュリン誘導体（配列番号５）の精製を示す。 図３８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４インシュリン誘導体（配列番号２８）の精製を示す。 図３９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＲＦ類似体（配列番号２）の精製を示す。 図４０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）の精製を示す。 図４１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＧＲＦ類似体（配列番号３０）の精製を示す。 図４２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＧＲＦ類似体（配列番号３１）の精製を示す。 図４３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１３ＧＬＰ−１類似体 ＣＪＣ １３６５（配列番号３２）の精製を示す。 図４４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡラクトース：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図４５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｔ２０類似体（配列番号３３）の精製を示す。 図４６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１Ｔ１２４９類似体（配列番号３４）の精製を示す。 図４７は、本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図４８は、本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第１Ｃ３４類似体（配列番号６）の精製を示す。 図４９は、本発明の方法の好ましい態様による、化合物ＨＳＡ：第２ＧＲＦ類似体（配列番号２９）の精製を示す。 図５０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：ビノレルビン類似体結合体（配列番号３５）の精製を示す。 図５１は、本発明の方法の好ましい態様によるＬ−システインの精製を示す。 図５２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体Ｌ−システイン：ビノレルビン類似体（配列番号３５）の精製を示す。 図５３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＲＳＡ：第３エキセンディン−４類似体（配列番号２５）の精製を示す。 図５４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４Ｃ３４類似体（配列番号３６）の精製を示す。 図５５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５Ｃ３４類似体（配列番号３７）の精製を示す。 図５６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６Ｃ３４類似体（配列番号３８）の精製を示す。 図５７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第７Ｃ３４類似体（配列番号３９）の精製を示す。 図５８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第８Ｃ３４類似体（配列番号４０）の精製を示す。 図５９は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＰＹＹ類似体（配列番号４１）の精製を示す。 図６０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＰＹＹ類似体（配列番号４２）の精製を示す。 図６１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５インシュリン誘導体（配列番号４３）の精製を示す。 図６２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６インシュリン誘導体（配列番号４４）の精製を示す。 図６３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第７インシュリン誘導体（配列番号４５）の精製を示す。 図６４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＰＹＹ類似体（配列番号４６）の精製を示す。 図６５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第４ＰＹＹ類似体（配列番号４７）の精製を示す。 図６６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第５ＰＹＹ類似体（配列番号４８）の精製を示す。 図６７は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第６ＰＹＹ類似体（配列番号４９）の精製を示す。 図６８は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第２ＡＮＰ類似体（配列番号５０）の精製を示す。 図６９（Ａ−Ｂ）は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第３ＡＮＰ類似体 ＣＪＣ １６８１（配列番号５１）の精製を示す。 図７０は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図７１は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図７２は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図７３は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図７４は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−１類似体（配列番号１）の精製を示す。 図７５は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＨＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）の精製を示す。 図７６は、本発明の方法の好ましい態様による、結合体ＲＳＡ：第１ＧＬＰ−２類似体（配列番号５２）の精製を示す。

Claims (22)

  1. アルブミン結合体及び非結合アルブミンを含む溶液中、非結合アルブミンからアルブミン結合体を分離する方法であって、以下のステップ：
    ａ）高塩分含有量をもつ水性緩衝液中で、平衡にある疎水性固形支持体上に、上記溶液を充填し；
    ｂ）上記支持体に低減する塩分含有量勾配を適用し；そして
    ｃ）溶出されるアルブミン結合体を回収する、
    を含む前記方法。
  2. 前記アルブミン結合体が、それに共有結合するところのマイケル受容体を有する分子から成り、当該マイケル受容体がアルブミンに結合する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記結合が、前記マイケル受容体と前記アルブミンのシステイン３４との間にある、請求項２に記載の方法。
  4. 前記マイケル受容体がマレイミド基である、請求項２に記載の方法。
  5. 前記マレイミド基がマレイミド−プロピオン酸（ＭＰＡ）である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記アルブミンが、血清アルブミン、組換えアルブミン、及びゲノム源由来のアルブミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記アルブミンが、ヒトアルブミン、ラットアルブミン、マウスアルブミン、ブタアルブミン、ウシアルブミン、イヌアルブミン、及びウサギアルブミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記アルブミンが、脂肪酸、金属イオン、アルブミンに対し高親和力を有する小分子、及び糖からなる群より選択される少なくとも１つで修飾される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記糖が、グルコース、ラクトース、及びマンノースからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記分子が、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小有機分子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
  12. 前記ペプチドが、少なくとも５７ダルトンの分子量を有する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ペプチドが、ＧＬＰ−１、ＡＮＰ、Ｋ５、ダイノルフィン、ＧＲＦ、インシュリン、ナトリウム利尿ペプチド、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｃ−３４、ＳＣ−３５、ＰＹＹ、及びそれらの類似体からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記小有機分子が、ビノレルビン、ゲムシタビン、及びパクリタキセルからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記分子が、酸感受性共有結合又は蛋白質分解的開裂の影響を受けやすいペプチド配列を介して前記アルブミンに共有結合し、それにより、前記分子とアルブミンの分離、及び細胞内への当該分子の侵入が可能となる、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記疎水性固形支持体が疎水性樹脂を含むカラムである、請求項１に記載の方法。
  17. 前記疎水性樹脂が、オクチルセファロース、フェニルセファロース、及びブチルセファロースからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記疎水性樹脂がブチルセファロースである、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記塩が十分な塩析効果を有する、請求項１に記載の方法。
  20. 前記塩が、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びリン酸マグネシウムからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  21. 前記塩が、リン酸アンモニウム又は硫酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
  22. 前記塩が硫酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
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